CN117396606A - 用于抑制线粒体偕胺肟还原组分1（marc1）表达的组合物和方法 - Google Patents
用于抑制线粒体偕胺肟还原组分1（marc1）表达的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本文提供了抑制MARC1表达的寡核苷酸。还提供了包含所述寡核苷酸的组合物及其用途，特别是涉及治疗与MARC1表达相关的疾病、病症和/或状况的用途。
Description
背景技术
肝脏在脂质代谢中起关键作用。正常肝脏脂质代谢的异常与多种肝脏疾病或病症的发展相关，例如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、其随后进展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和潜在的其他晚期肝脏异常。
NAFLD是最常见的肝脏疾病之一，全球患病率不断增加(Loomba R.,&Sanyal A.J.(2013)NAT REV GASTROENTEROL HEPATOL 10(11):686-90)。NAFLD的特征在于一系列临床和病理严重程度，范围从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、纤维化、肝硬化、肝细胞癌(HCC)和肝功能衰竭(Bessone F等人,(2019)CELL MOLLIFE SCI 76(1):99-128)。NAFLD的特征在于，在没有大量饮酒以及没有肝脏中脂肪的其他原因如用药、饥饿和病毒性疾病的情况下，肝脏中存在脂肪(Chalasani,N.等人,(2012)HEPATOLOGY(Baltimore,Md.),55(6),2005–23)。另外，当疾病进展为NASH时，患者发生肝外并发症，特别是心血管疾病(CVD)的风险也会增加，这是该患者群体中最常见的死亡原因之一。导致NAFLD的肝脏脂质代谢异常也会推动致动脉粥样化血脂异常的进展，其中升高的血浆甘油三酯(TG)、胆固醇和脂蛋白颗粒浸润动脉壁，随后发展成动脉粥样硬化斑块(LoombaR&Sanyal AJ(2013)NAT REV GASTROENTEROL HEPATOL 10(11):686-90)。因此，对于开发和使用用于治疗NAFLD的疗法的需求仍然未得到满足。
发明内容
本发明部分地基于降低肝脏中的MARC1(线粒体偕胺肟还原组分1(MitochondrialAmidoxime Reducing Component 1))表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的发现。具体来说，鉴定了MARC1 mRNA内的靶序列，并且生成了能与这些靶序列结合并抑制MARC1 mRNA表达的寡核苷酸。如本文所证明的，所述寡核苷酸抑制人和非人灵长类动物(NHP)肝脏中的MARC1表达。
在一方面，本发明提供了用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
在所述RNAi寡核苷酸的一些实施方案中，(i)所述有义链的长度为15至50或18至36个核苷酸，任选地长度为36个核苷酸；任选地(ii)所述反义链的长度为15至30个核苷酸，任选地长度为22个核苷酸；并且任选地(iii)所述双链体区域的长度为至少19个核苷酸或至少20个核苷酸。
在所述RNAi寡核苷酸的一些实施方案中，所述有义链的3’端包含表示为S1-L-S2的茎-环，其中(i)S1与S2互补，任选地其中S1和S2的长度各自为1-10个核苷酸且具有相同的长度，任选地其中S1和S2的长度各自为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，进一步任选地其中S1和S2的长度为6个核苷酸；并且(ii)L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环，任选地其中L为三环或四环，任选地其中该四环包含序列5’-GAAA-3’，任选地其中所述茎-环包含序列5’-GCAGCCGAAAGGCUGC-3’(SEQ ID NO:1681)。
在所述RNAi寡核苷酸的一些实施方案中，所述反义链在3’末端包含长度为一个或多个核苷酸的突出端序列，任选地其中所述突出端包含嘌呤核苷酸，任选地其中所述突出端序列的长度为2个核苷酸，任选地其中所述突出端选自AA、GG、AG和GA，任选地其中所述突出端为GG。
在所述RNAi寡核苷酸的一些实施方案中，所述寡核苷酸的至少一个核苷酸与一个或多个靶向配体缀合，任选地其中：
(a)每个靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质；(b)所述茎环包含与该茎环的一个或多个核苷酸缀合的一个或多个靶向配体；(c)所述一个或多个靶向配体与所述环的一个或多个核苷酸缀合，任选地其中所述环包含从5’至3’编号为1-4的4个核苷酸，其中位置2、3和4的核苷酸各自包含一个或多个靶向配体，其中所述靶向配体相同或不同；(d)每个靶向配体包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分，任选地其中该GalNAc部分是单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分；并且/或者(e)所述茎-环的L的至多4个核苷酸各自与单价GalNAc部分缀合。在所述RNAi寡核苷酸的一些实施方案中，所述靶向配体包含至少一个GalNAc部分并且靶向人类肝脏细胞(例如，人类肝细胞)。
在所述RNAi寡核苷酸的一些实施方案中，所述有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606。
在所述RNAi寡核苷酸的一些实施方案中，所述有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1609和1645；
(b)分别为SEQ ID NO:1610和1646；
(c)分别为SEQ ID NO:1611和1647；
(d)分别为SEQ ID NO:1612和1648；
(e)分别为SEQ ID NO:1613和1649；
(f)分别为SEQ ID NO:1614和1650；
(g)分别为SEQ ID NO:1615和1651；
(h)分别为SEQ ID NO:1616和1652；
(i)分别为SEQ ID NO:1617和1653；
(j)分别为SEQ ID NO:1618和1654；
(k)分别为SEQ ID NO:1619和1655；
(l)分别为SEQ ID NO:1620和1656；
(m)分别为SEQ ID NO:1621和1657；
(n)分别为SEQ ID NO:1622和1658；
(o)分别为SEQ ID NO:1623和1659；
(p)分别为SEQ ID NO:1624和1660；
(q)分别为SEQ ID NO:1625和1661；
(r)分别为SEQ ID NO:1626和1662；
(s)分别为SEQ ID NO:1627和1663；
(t)分别为SEQ ID NO:1628和1664；
(u)分别为SEQ ID NO:1628和1665；
(v)分别为SEQ ID NO:1630和1666；
(w)分别为SEQ ID NO:1631和1667；
(x)分别为SEQ ID NO:1632和1668；
(y)分别为SEQ ID NO:1633和1669；
(z)分别为SEQ ID NO:1634和1670；
(aa)分别为SEQ ID NO:1635和1671；
(bb)分别为SEQ ID NO:1636和1672；
(cc)分别为SEQ ID NO:1637和1673；
(dd)分别为SEQ ID NO:1638和1674；
(ee)分别为SEQ ID NO:1639和1675；
(ff)分别为SEQ ID NO:1640和1676；
(gg)分别为SEQ ID NO:1641和1677；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1642和1678。
在实施方案中，提供了用于抑制MARC1的表达的双链RNAi寡核苷酸(dsRNAi)，其中所述dsRNA包含有义链和反义链，所述反义链包含与MARC1 RNA转录物互补的互补区域，其中所述有义链包含5′-mGs-mG-mC-mU-mA-mG-mA-fG-fA-fA-fG-mA-mA-mA-mG-mU-mU-mA-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC-3’(SEQ ID NO:1615)的序列和所有修饰，并且其中所述反义链包含5′-MePhosphonate-4O-mUs-fUs-fUs-fA-fA-mC-fU-mU-mU-fC-mU-mU-mC-fU-mC-mU-mA-mG-mC-mCs-mGs-mG-3′(SEQ ID NO:1651)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG和mU＝2’-OMe核糖核苷；fA、fC、fG和fU＝2’-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中
在实施方案中，提供了用于抑制MARC1的表达的双链RNAi寡核苷酸(dsRNAi)，其中所述dsRNA包含有义链和反义链，所述反义链包含与MARC1 RNA转录物互补的互补区域，其中所述有义链包含5′-mAs-mG-mA-mA-mC-mG-mA-fA-fA-fG-fU-mU-mA-mU-mA-mU-mG-mG-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC-3’(SEQ ID NO:1632)的序列和所有修饰，并且其中所述反义链包含5′-MePhosphonate-4O-mUs-fUs-fCs-fC-fA-mU-fA-mU-mA-fA-mC-mU-mU-fU-mC-mG-mU-mU-mC-mUs-mGs-mG-3′(SEQ ID NO:1668)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG和mU＝2’-OMe核糖核苷；fA、fC、fG和fU＝2’-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中
在实施方案中，提供了用于抑制MARC1的表达的双链RNAi寡核苷酸(dsRNAi)，其中所述dsRNA包含有义链和反义链，所述反义链包含与MARC1 RNA转录物互补的互补区域，其中所述有义链包含5′-mAs-mA-mG-mU-mU-mG-mA-fC-fU-fA-fA-mA-mC-mU-mU-mG-mA-mA-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC-3’(SEQ ID NO:1640)的序列和所有修饰，并且其中所述反义链包含5′-MePhosphonate-4O-mUs-fUs-fUs-fU-fC-mA-fA-mG-mU-fU-mU-mA-mG-fU-mC-mA-mA-mC-mU-mUs-mGs-mG-3′(SEQ ID NO:1676)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG和mU＝2’-OMe核糖核苷；fA、fC、fG和fU＝2’-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中
在实施方案中，提供了用于抑制MARC1的表达的双链RNAi寡核苷酸(dsRNAi)，其中所述dsRNA包含有义链和反义链，所述反义链包含与MARC1 RNA转录物互补的互补区域，其中所述有义链包含5′-mUs-mG-mU-mG-mA-mA-mU-fA-fA-fA-fU-mG-mG-mA-mA-mG-mC-mU-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC-3’(SEQ ID NO:1625)的序列和所有修饰，并且其中所述反义链包含5′-MePhosphonate-4O-mUs-fUs-fAs-fG-fC-mU-fU-mC-mC-fA-mU-mU-mU-fA-mU-mU-mC-mA-mC-mAs-mGs-mG-3′(SEQ ID NO:1661)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG和mU＝2’-OMe核糖核苷；fA、fC、fG和fU＝2’-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中
不受理论的束缚，本文所述的寡核苷酸可用于治疗其中MARC1酶扮演因果角色的疾病、病症或状况。
在一方面，本发明提供了包含本文所述的RNAi寡核苷酸和药学上可接受的载体、递送剂或辅料的药物组合物。
在一方面，本发明提供了包含本文所述的RNAi、可选的药学上可接受的载体和包装插页的试剂盒，所述包装插页包括关于向患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者进行施用，任选地关于治疗NAFLD、NASH或酒精性脂肪性肝炎(ASH)的说明书。
在一方面，本发明提供了本文所述的RNAi寡核苷酸在制备药物中的用途，该药物用于治疗与MARC1表达相关的疾病、病症或状况，任选地用于治疗与肝细胞中的MARCl表达相关的疾病或状况，任选地用于治疗NAFLD、NASH或ASH，任选地与第二组合物或治疗剂联合使用。
附图说明
图1提供的图形描绘了在用1nM靶向MARC1基因的不同区域的DsiRNA处理24小时后，在内源性表达人MARC1(也称为MTARCl)的Huh7细胞中剩余的人MARC1 mRNA的百分比(％)。设计并筛选了384种DsiRNA。使用两个引物对来测量MARC1(SEQ ID NO：1684-1687)，并且使用HPRT管家基因(SEQ ID NO：1688和1689)对样品之间的表达进行归一化。
图2提供的图形描绘了用GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸处理后，外源性表达人MARC1的小鼠(流体动力学注射模型)肝脏中剩余的人MARC1 mRNA的百分比(％)。向小鼠皮下给予2mg/kg的在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中配制的所示GalNAc-MARC1寡核苷酸。给药后三天，向小鼠流体动力学注射(HDI)编码人MARC1的DNA质粒。从18小时后收集的肝脏测定人MARC1 mRNA的水平。箭头指示选择用于验证的寡核苷酸。
图3提供的图形描绘了用基于图2中的结果选择用于验证的人GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸处理后，外源性表达人MARC1的小鼠(流体动力学注射模型)肝脏中剩余的人MARC1mRNA的百分比(％)。向小鼠皮下给予2mg/kg的在PBS中配制的所示GalNAc-MARC1寡核苷酸。给药后三天，向小鼠HDI编码MARC1的DNA质粒。从18小时后收集的肝脏测定人MARC1 mRNA的水平。
图4提供的图形描绘了选择用于NHP研究的GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸的剂量响应。测量用人GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸以三种剂量(0.1mg/kg、0.3mg/kg和1mg/kg)处理后，外源性表达人MARC1的小鼠(流体动力学注射模型)肝脏中剩余的人MARC1 mRNA的百分比(％)。给药后三天，向小鼠HDI编码MARC1的DNA质粒。从18小时后收集的肝脏测定人MARC1mRNA的水平。
图5和图6提供的图形描绘了相对于用PBS处理的小鼠，对于饲喂DIO-NASH饮食或Lean Chow饮食并用8个每周剂量的所示GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸(3mg/kg)或对照GLP-l肽(Jesper Lau等人，J.Med.Chem.(2015)；58，7370-80，化合物22)(GLP-1‘22’)(10nmol/kg)治疗的小鼠，第56天采集的样品中肝脏甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)的水平。将相对(图5)和总(图6)TG和TC水平与DIO-NASH媒介物对照进行比较。***＝p＜0.001，*＝p＜0.05。
图7提供的图形描绘了相对于用PBS处理的小鼠，对于饲喂DIO-NASH饮食或LeanChow饮食并用8个每周剂量的所示6alNAc缀合的MARC1寡核苷酸(3mg/kg)或6LP-1‘22’(10nmol/kg)作为对照进行治疗的小鼠，其样品中的NAFLD活动性评分。评分基于研究结束时的NAFLD评分来计算。
图8提供的图形描绘了相对于用PBS处理的小鼠，对于饲喂DIO-NASH饮食或LeanChow饮食并用8个每周剂量的所示GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸(3mg/kg)或GLP-1‘22’(10nmol/kg)治疗的小鼠，其样品中的脂肪变性评分。评分基于研究结束时的脂肪变性评分来计算。
图9A和图9B提供的图形对于饲喂DIO-NASH饮食或Lean Chow饮食并用8个每周剂量的所示GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸(10nmol/kg)(3mg/kg)或PBS处理的小鼠，量化了脂肪变性分数(即给定区域中肝脏脂肪变性的百分比(％))(图9A)和具有脂滴的肝细胞的百分比(％)(图9B)。***＝p＜0.001(相对于D10-NASH媒介物处理)。
图10提供的图形描绘了对于饲喂DIO-NASH饮食并用所示GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸(10nmol/kg)、PBS处理的或饲喂Lean-Chow饮食的小鼠，其肝脏样品中的α-SMA水平。***＝p＜0.001，*＝p＜0.05(相对于DIO-NASH媒介物处理)。
图11提供的示意图描绘了使用GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸的非人灵长类动物(NHP)研究的给药和样本采集时间表。
图12是示例性的带缺口的四环寡核苷酸结构的示意图。
具体实施方式
MARC1(线粒体偕胺肟还原组分1、含有钼辅因子硫化酶C-末端结构域的蛋白1、含有Moco硫化酶C-末端结构域的蛋白1、MOSC1、含有MOSC结构域的蛋白1、MTARC1)是催化各种代谢过程中N-氧化分子的还原反应的蛋白质。虽然MARC1的生物学功能和机制尚有待阐明，但在MARC1中已经鉴定了保护受试者免于硬化的共同错义变体。这种变体的携带者还具有较低的血液胆固醇水平和减少的肝脏脂肪，表明MARC1可能是NAFLD、NASH和ASH的有效治疗靶点。应当理解，MARC1中的遗传多态性影响从出生起在所有身体组织中的MARC1表达和/或功能，其中MARC1在不同器官中以不同水平广泛表达。如本文所述，特异性靶向肝细胞中的MARC1的寡核苷酸不仅在体外和体内抑制MARC1表达，而且还在NASH小鼠模型中提供治疗效果。具体来说，MARC1表达的降低减少了具有脂滴的肝细胞的数目和脂肪变性分数。另外，在NASH模型中，MARC1抑制减少了肝纤维化的数种调节物。这些不同的改善的疾病结果证明了MARC1抑制的治疗功效，特别是在肝细胞中。
综合起来，并且不受理论的束缚，MARC1的拮抗/抑制，特别是在肝细胞中(例如，通过MARC1靶向的RNAi寡核苷酸)，可以降低NAFLD、NASH和酒精性脂肪性肝炎(ASH)的风险和严重程度。这种方法的最佳实现方式可以是通过肝脏中MARC1表达的特异性和靶向降低，而表达MARC1的其他器官、组织或细胞则基本不受影响。从这个意义上来讲，本发明可以提供改进的治疗方式，因为其特异性靶向肝脏中的mRNA产生。
根据一些方面，本发明提供了降低肝脏中的MARC1表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸被设计用于治疗与肝脏中的MARC1表达相关的疾病。在一些方面，本发明提供了通过降低特定细胞(例如，肝细胞)或器官(例如，肝脏)中的MARC1表达来治疗与总MARC1表达相关的疾病的方法。
MARC1表达的寡核苷酸抑制剂
MARC1靶序列
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)靶向包含MARC1 mRNA的靶序列。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸靶向MARC1 mRNA序列内的靶序列。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸对应于MARC1 mRNA序列内的靶序列。在一些实施方案中，该寡核苷酸或其部分、片段或链(例如，双链(ds)RNAi寡核苷酸的反义链或指导链)与包含MARC1 mRNA的靶序列结合或退火，从而抑制MARC1表达。
在一些实施方案中，为了在体内抑制MARC1表达的目的，所述寡核苷酸靶向MARC1靶序列。在一些实施方案中，靶向MARC1靶序列的寡核苷酸抑制MARC1表达的量或程度与该寡核苷酸的效力相关。在一些实施方案中，靶向MARC1靶序列的寡核苷酸抑制MARC1表达的量或程度与用该寡核苷酸治疗的、患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者或患者中治疗益处的量或程度相关。
通过检查编码MARC1的mRNA的核苷酸序列，包括多个不同物种(例如，人、食蟹猴和小鼠；参见，例如，实施例2)的mRNA的核苷酸序列，并且作为体外和体内测试(参见，例如，实施例2-5)的结果，已发现MARC1 mRNA的某些核苷酸序列比其他序列更易发生基于寡核苷酸的抑制，因此可用作本文寡核苷酸的靶序列。在一些实施方案中，本文所述寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的有义链包含MARC1靶序列。在一些实施方案中，本文所述寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的有义链的部分或区域包含MARC1靶序列。在一些实施方案中，MARC1靶序列包含SEQ ID NO：1-384中任一者的序列，或由SEQ ID NO：1-384中任一者的序列组成。在一些实施方案中，MARC1靶序列包含SEQ ID NO：234、298、356或376所示的序列或由SEQ IDNO：234、298、356或376所示的序列组成。
MARC1靶向序列
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)具有与MARC1 mRNA(例如，在MARC1 mRNA的靶序列内)互补的互补区域，以用于靶向细胞中的MARC1 mRNA并抑制和/或降低MARC1表达的目的。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含MARC1靶向序列(例如，dsRNA寡核苷酸的反义链或指导链)，该靶向序列具有通过互补(Watson-Crick)碱基配对与MARC1靶序列结合或退火的互补区域。靶向序列或互补区域通常具有合适的长度和碱基含量，以使得寡核苷酸(或其链)能够与MARC1 mRNA结合或退火，从而达到抑制和/或降低MARC1表达的目的。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约28、至少约29或至少约30个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为约12至约30(例如，12至30、12至22、15至25、17至21、18至27、19至27或15至30)个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为24个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的序列互补的靶序列或互补区域，并且该靶向序列或互补区域的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的序列互补的靶序列或互补区域，并且该靶向序列或互补区域的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：769-1152中任一者的序列互补的靶序列或互补区域，并且该靶向序列或互补区域的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：769-1152中任一者的序列互补的靶序列或互补区域，并且该靶向序列或互补区域的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：769-1152中任一者的序列互补的靶序列或互补区域，并且该靶向序列或互补区域的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：769-1152中任一者的序列互补的靶序列或互补区域，并且该靶向序列或互补区域的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO：769-1152中任一者的序列互补的靶序列或互补区域，并且该靶向序列或互补区域的长度为24个核苷酸。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含与MARC1靶序列完全互补的靶向序列或互补区域(例如，双链寡核苷酸的反义链或指导链)。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域与MARC1靶序列为部分互补。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与MARC1靶序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与MARC1靶序列为部分互补的靶向序列或互补区域。
在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：234、298、356或376中所示的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的序列为部分互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：234、298、356或376中所示的序列为部分互补的靶向序列或互补区域。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含与MARC1 mRNA内的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为约12至约30个核苷酸(例如，长度为12至30、12至28、12至26、12至24、12至20、12至18、12至16、14至22、16至20、18至20或18至19个核苷酸)。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与MARC1 mRNA内的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与MARC1mRNA内的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与MARC1 mRNA内的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为20个核苷酸。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，任选地其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：234、298、356或376中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：769-1152中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1002、1066、1124和1144中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为20个核苷酸。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的靶向序列或互补区域与SEQ ID NO：1-384中任一者的连续核苷酸序列互补并且跨越反义链的整个长度。在一些实施方案中，该寡核苷酸的靶向序列或互补区域与SEQ ID NO：1-384的连续核苷酸序列互补并且跨越反义链的整个长度的一部分。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含互补区域(例如，在dsRNA的反义链上)，该互补区域与跨越SEQ ID NO：769-1152中任一者所示的序列的核苷酸1-19或1-20的连续核苷酸段至少部分(例如，完全)互补。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含与相应的MARC1靶序列具有一个或多个碱基对(bp)错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域可以与相应的MARC1靶序列具有最多约1个、最多约2个、最多约3个、最多约4个、最多约5个等错配，条件是该靶向序列或互补区域在适当杂交条件下与MARC1 mRNA结合或退火的能力和/或该寡核苷酸抑制MARC1表达的能力得到维持。或者，靶向序列或互补区域可以与相应的MARC1靶序列具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配，条件是该靶向序列或互补区域在适当杂交条件下与MARC1 mRNA结合或退火的能力和/或该寡核苷酸抑制MARC1表达的能力得到维持。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有1个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有2个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有3个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有4个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有5个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有多于一个错配(例如，2、3、4、5个或更多个错配)的靶向序列或互补区域，其中至少2个(例如，全部)错配是连续定位的(例如，连续的2、3、4、5个或更多个错配)，或者其中所述错配散布在整个靶向序列或互补区域中。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与相应靶序列具有多于一个错配(例如，2、3、4、5个或更多个错配)的靶向序列或互补区域，其中至少2个(例如，全部)错配是连续定位的(例如，连续的2、3、4、5个或更多个错配)，或者其中至少一个或多个非错配的碱基对位于所述错配之间，或其组合。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域与相应MARC1靶序列可具有最多约1个、最多约2个、最多约3个、最多约4个、最多约5个等错配。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域与相应MARC1靶序列可具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：234、298、356或376中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域与相应MARC1靶序列可具有最多约1个、最多约2个、最多约3个、最多约4个、最多约5个等错配。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：234、298、356或376中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中该靶向序列或互补区域与相应MARC1靶序列可具有不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个错配。
寡核苷酸的类型
多种寡核苷酸类型和/或结构可用于在本文的方法中靶向MARC1，包括但不限于RNAi寡核苷酸、反义寡核苷酸(AS0)、miRNA等。本文或别处描述的任何寡核苷酸类型均预期用作框架以并入本文的MARC1靶向序列，以用于抑制MARC1表达的目的。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸通过在切酶(Dicer)参与的上游或下游加入RNA干扰(RNAi)途径来抑制MARC1表达。例如，已经开发出RNAi寡核苷酸，其每条链具有约19-25个核苷酸的大小，并具有至少一个1至5个核苷酸的3’-突出端(参见，例如，第8，372，968号美国专利)。还开发了更长的寡核苷酸，其被切酶加工以生成活性RNAi产物(参见，例如，第8，883，996号美国专利)。进一步的工作产生了延伸的dsRNA，其中至少一条链的至少一端延伸超出双链体靶向区域，包括其中一条链包含热力学稳定四环结构的结构(参见，例如，第8，513，207和8，927，705号美国专利，以及公开号为WO 2010/033225的国际专利申请)。此类结构可包括单链(ss)延伸(在分子的一侧或两侧)以及双链(ds)延伸。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸在切酶参与(例如，切酶切割)的下游加入RNAi途径。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸是切酶底物。在一些实施方案中，在内源切酶加工后，产生能够降低MARC1表达的、长度为19-23个核苷酸的双链核酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸在反义链的3’端具有突出端(例如，长度为1、2或3个核苷酸)。在一些实施方案中，该寡核苷酸(例如，siRNA)包含与靶RNA呈反义的21个核苷酸的指导链和互补的过客链，其中这两条链退火以形成19-bp双链体和位于任一或两个3’端的2个核苷酸的突出端。还可用更长的寡核苷酸设计，包括具有23个核苷酸的指导链和21个核苷酸的过客链的寡核苷酸，其中在分子的右侧(过客链的3’端/指导链的5’端)具有平端，且在分子的左侧(过客链的5’端/指导链的3’端)具有两个核苷酸的3’-指导链突出端。在此类分子中，存在21bp双链体区域。参见，例如，第9，012，138、9，012，621和9，193，753号美国专利。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度均在约17至36(例如，17至36、20至25或21-23)个核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含长度为19-30个核苷酸的反义链和长度为19-50个核苷酸的有义链，其中反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度均在约19-22个核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施方案中，有义链和反义链长度相等。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，使得在有义链或反义链上，或者在有义链和反义链两者上存在3’-突出端。在一些实施方案中，对于具有长度均在约21-23个核苷酸范围内的有义链和反义链的寡核苷酸，有义链、反义链或有义链和反义链两者上的3’-突出端的长度为1或2个核苷酸。在一些实施方案中，该寡核苷酸具有22个核苷酸的指导链和20个核苷酸的过客链，其中在分子的右侧(过客链的3’端/指导链的5’端)具有平端，且在分子的左侧(过客链的5’端/指导链的3’端)具有2个核苷酸的3’-指导链突出端。在此类分子中，存在20bp双链体区域。
与本文的组合物和方法一起使用的其他寡核苷酸设计包括：16-聚体siRNA(参见，例如，NUCLEIC ACIDS IN CHEMISTRY AND BIOLOGY，Blackburn(编)，ROYAL SOCIETY OFCHEMISTRY，2006)、shRNA(例如，具有19bp或更短的茎；参见，例如，Moore等人(2010)METHODS MOL.BIOL.629：141-158)、平端siRNA(例如，长度为19bp；参见，例如，Kraynack&Baker(2006)RNA 12：163-176)、不对称siRNA(aiRNA；参见，例如，Sun等人(2008)NAT.BIOTECHNOL.26：1379-82)、不对称较短双链体siRNA(参见，例如，Chang等人(2009)MOL.THER.17：725-32)、叉siRNA(参见，例如，Hohjoh(2004)FEBS LETT.557：193-98)、单链siRNA(Elsner(2012)NAT.BIOTECHNOL.30：1063)、哑铃形环状siRNA(参见，例如，Abe等人(2007)J.AM.CHEM.SOC.129：15108-09)以及小的内部分段干扰RNA(siRNA；参见，例如，Bramsen等人(2007)NUCLEIC ACIDS RES.35：5886-97)。可以在一些实施方案中使用以降低或抑制MARC1表达的寡核苷酸结构的其他非限制性实例是微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和短siRNA(参见，例如，Hamilton等人(2002)EMBO J.21：4671-79；还参见公开号为2009/0099115的美国专利申请)。
另外，在一些实施方案中，本文中用于降低或抑制MARC1表达的寡核苷酸是单链的(ss)。此类结构可包括但不限于单链RNAi分子。最近的努力已经证明了单链RNAi分子的活性(参见，例如，Matsui等人(2016)MOL.THER.24：946-55)。然而，在一些实施方案中，本文的寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷酸是具有核碱基序列的单链寡核苷酸，当以5’至3’方向书写时，该核碱基序列包含特定核酸的被靶向区段的反向互补序列并且被适当地修饰(例如，作为gapmer)以诱导其靶RNA在细胞中的RNA酶H介导的切割，或者(例如，作为mixmer)抑制靶mRNA在细胞中的翻译。供此处使用的ASO可以以本领域已知的任何合适的方式进行修饰，包括，例如，如第9，567，587号美国专利中所示(包括，例如，长度，核碱基(嘧啶、嘌呤)的糖部分，以及核碱基的杂环部分的改变)。此外，数十年来，ASO已被用于降低特定靶基因的表达(参见，例如，Bennett等人(2017)ANNU.REV.PHARMACOL.57：81-105)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸与MARC1 mRNA共享互补区域。在一些实施方案中，反义寡核苷酸靶向被标识为NM_001251935.1的人MARC1基因的各个区域。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15-50个核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15-25个核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸与SEQ ID NO：1-384中的任一者互补。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为至少19个连续核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为至少20个连续核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸与靶序列有1、2或3个核苷酸不同。
双链寡核苷酸
在一些方面，本发明提供了用于靶向MARC1 mRNA并抑制MARC1表达(例如，通过RNAi途径)的双链(ds)RNAi寡核苷酸，其包含有义链(本文中也称为过客链)和反义链(本文中也称为指导链)。在一些实施方案中，有义链和反义链是单独的链，并且不是共价连接的。在一些实施方案中，有义链和反义链共价连接。在一些实施方案中，有义链和反义链形成双链体区域，其中有义链和反义链或其部分以互补方式(例如，通过Watson-Crick碱基配对)彼此结合。
在一些实施方案中，有义链具有第一区域(R1)和第二区域(R2)，其中R2包含第一亚区(S1)、四环或三环(L)和第二亚区(S2)，其中L位于S1与S2之间，并且其中S1和S2形成第二双链体(D2)。D2可具有不同的长度。在一些实施方案中，D2的长度为约1-6bp。在一些实施方案中，D2的长度为2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5或4-5bp。在一些实施方案中，D2的长度为1、2、3、4、5或6bp。在一些实施方案中，D2的长度为6bp。
在一些实施方案中，有义链的R1和反义链形成第一双链体(D1)。在一些实施方案中，D1的长度为至少约15(例如，至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21)个核苷酸。在一些实施方案中，D1的长度在约12至30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、15至22、18至22、18至25、18至27、18至30或21至30个核苷酸)。在一些实施方案中，D1的长度为至少12个核苷酸(例如，长度为至少12、至少15、至少20、至少25或至少30个核苷酸)。在一些实施方案中，D1的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，D1的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，包含有义链和反义链的D1不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，包含有义链和反义链的D1跨越有义链或反义链或两者的整个长度。在某些实施方案中，包含有义链和反义链的D1跨越有义链和反义链两者的整个长度。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含具有SEQ ID NO：769-1152中任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO：1153-1536的互补序列的反义链。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含具有SEQ ID NO：1-384中任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO：385-768的互补序列的反义链。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有SEQ IDNO：1537-1570中任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO：1573-1606的互补序列的反义链，如表4和表6中所排列的。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，该有义链和反义链包含选自以下的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO：1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO：1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO：1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO：1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO：1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO：1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO：1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO：1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO：1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO：1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO：1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO：1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO：1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO：1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO：1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO：1553和1589；
(r)分别别为SEQ ID NO：1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO：1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO：1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO：1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO：1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，该有义链和反义链包含选自以下的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO:1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO:1553和1589。
在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO:1543的序列并且反义链包含SEQ IDNO:1579的序列。
在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO:1560的序列并且反义链包含SEQ IDNO:1596的序列。
在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO:1568的序列并且反义链包含SEQ IDNO:1604的序列。
在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO:1553的序列并且反义链包含SEQ IDNO:1589的序列。
应当理解，在一些实施方案中，在描述寡核苷酸(例如，dsRNAi寡核苷酸)或其他核酸的结构时可以参考序列表中呈现的序列。在这样的实施方案中，与指定序列相比，实际的寡核苷酸或其他核酸可具有一个或多个替代核苷酸(例如，DNA核苷酸的RNA对应物或RNA核苷酸的DNA对应物)和/或一个或多个经修饰的核苷酸和/或一个或多个经修饰的核苷酸间键合和/或一个或多个其他修饰，而仍然保留与指定序列基本相同或相似的互补性质。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含25个核苷酸的有义链和27个核苷酸的反义链，当受到切酶作用时，其产生并入成熟RISC中的反义链。在一些实施方案中，所述25个核苷酸的有义链包含选自SEQ ID NO:769-1152的序列。在一些实施方案中，所述27个核苷酸的反义链包含选自SEQ ID NO:1153-1536的序列。在一些实施方案中，该寡核苷酸的有义链长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)。在一些实施方案中，该寡核苷酸的有义链长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)。在一些实施方案中，该寡核苷酸的有义链包含选自SEQ ID NO:1537-1570的核苷酸序列，其中该核苷酸序列长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)。在一些实施方案中，该寡核苷酸的有义链包含选自SEQ ID NO:1537-1570的核苷酸序列，其中该核苷酸序列长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)具有与另一5’端相比热力学稳定性较差的一个5’端。在一些实施方案中，提供了不对称寡核苷酸，其在有义链的3’端包括平端并在反义链的3’端包括3’-突出端。在一些实施方案中，反义链上的3’-突出端的长度为约1-8个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。在一些实施方案中，该寡核苷酸在反义(指导)链的3’端具有包含两(2)个核苷酸的突出端。然而，其他突出端也是可能的。在一些实施方案中，突出端是包含1至6个核苷酸，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度的3’-突出端。然而，在一些实施方案中，突出端是包含1至6个核苷酸，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度的5’-突出端。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1-384中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，以及长度为1至6个核苷酸的5’-突出端。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含有义链，该有义链包含选自SEQ ID NO:1537-1570的核苷酸序列，其中该寡核苷酸包含长度为1至6个核苷酸的5’-突出端。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含反义链，该反义链包含选自SEQ ID NO:1573-1606的核苷酸序列，其中该寡核苷酸包含长度为1至6个核苷酸的5’-突出端。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链包含选自SEQ ID NO:1537-1570的核苷酸序列，该反义链包含选自SEQ ID NO:1573-1606的核苷酸序列，其中该寡核苷酸包含长度为1至6个核苷酸的5’-突出端。
在一些实施方案中，反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸被修饰。在一些实施方案中，反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸与靶mRNA(例如，MARC1 mRNA)互补。在一些实施方案中，反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸不与靶mRNA互补。在一些实施方案中，本文寡核苷酸的反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸是不配对的。在一些实施方案中，本文寡核苷酸的反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸包含未配对的GG。在一些实施方案中，本文寡核苷酸的反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸不与靶mRNA互补。在一些实施方案中，寡核苷酸的每个3’端上的两(2)个末端核苷酸是GG。在一些实施方案中，本文寡核苷酸的每个3’端上的两(2)个末端GG核苷酸之一或两者不与靶mRNA互补。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1-384中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中本文寡核苷酸的反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸包含未配对的GG。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含反义链，该反义链包含选自SEQ ID NO:385-768的核苷酸序列，其中该寡核苷酸的反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸包含未配对的GG。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链包含选自SEQ ID NO:1537-1570的核苷酸序列，该反义链包含选自SEQ ID NO:1573-1606的核苷酸序列，其中该寡核苷酸的反义链3’端上的两(2)个末端核苷酸包含未配对的GG。
在一些实施方案中，在构成本文寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。如果在有义链与反义链之间存在多于一个错配，则它们可以连续地定位(例如，连续的2个、3个或更多个)，或者散布在整个互补区域中。在一些实施方案中，有义链的3’端包含一个或多个错配。在一些实施方案中，在有义链的3’端处并入两(2)个错配。在一些实施方案中，本文寡核苷酸的有义链3’端处的碱基错配或区段去稳定化改善或增加了该寡核苷酸的效力。在一些实施方案中，本文寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO：1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO：1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO：1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO：1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO：1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO：1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO：1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO：1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO：1570和1606，
其中在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，该有义链和反义链包含选自以下的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO：1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO：1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO：1553和1589，
其中在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。
反义链
在一些实施方案中，本文寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的反义链被称为“指导链”。例如，反义链与RNA诱导的沉默复合物(RISC)接合并与Argonaute蛋白如Ago2结合，或者与一种或多种类似因子接合或结合，并指导靶基因的沉默，该反义链被称为指导链。在一些实施方案中，包含与指导链互补的互补区域的有义链在本文中被称为“过客链”。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含长度为最多约50个核苷酸(例如，长度为最多50个、最多40个、最多35个、最多30个、最多27个、最多25个、最多21个、最多19个、最多17个或最多12个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为至少约12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少22个、至少25个、至少27个、至少30个、至少35个或至少38个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度在约12至约40(例如，12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至22、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)个核苷酸范围内的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为15至30个核苷酸的反义链。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸的反义链为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为22个核苷酸的反义链。
在一些实施方案中，本文公开的用于靶向MARC1的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含反义链，该反义链包含如SEQ ID NO：1153-1536中任一者所示的序列或由如SEQ IDNO：1153-1536中任一者所示的序列组成。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含如SEQ ID NO：1153-1536中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的用于靶向MARC1的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含如SEQ ID NO：1573-1606中任一者所示的序列或由如SEQ ID NO：1573-1606中任一者所示的序列组成。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含如SEQ ID NO：1573-1606中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的用于靶向MARC1的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含如SEQ ID NO：1579、1596、1604和1589中任一者所示的序列或由如SEQ ID NO：1579、1596、1604和1589中任一者所示的序列组成。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含如SEQ ID NO：1579、1596、1604和1589中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含选自SEQ ID NO：385-768的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含选自SEQ ID NO：618、682、740和760的核苷酸序列。
有义链
在一些实施方案中，本文公开的用于靶向MARC1 mRNA并抑制MARC1表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含如SEQ ID NO：1-384中任一者所示的有义链序列。在一些实施方案中，本文公开的用于靶向MARC1 mRNA并抑制MARC1表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含如SEQ ID NO：769-1152中任一者所示的有义链序列。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸具有有义链，该有义链由如SEQ ID NO：769-1152中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸组成。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸具有有义链，该有义链由如SEQ ID NO：1-384中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或至少19个)连续核苷酸组成。在一些实施方案中，本文公开的用于靶向MARC1 mRNA并抑制MARC1表达的寡核苷酸包含如SEQ ID NO：1537-1570中任一者所示的有义链序列。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸具有有义链，该有义链由如SEQ ID NO：1537-1570中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸组成。在一些实施方案中，本文公开的用于靶向MARC1 mRNA并抑制MARC1表达的寡核苷酸包含如SEQ ID NO：1543、1560、1568和1553中任一者所示的有义链序列。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸具有有义链，该有义链包含如SEQ ID NO：1543、1560、1568和1553中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的用于靶向MARC1 mRNA并抑制MARC1表达的寡核苷酸包含如SEQ ID NO：234、298、356和376中任一者所示的有义链序列。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸具有有义链，该有义链包含如SEQ ID NO：234、298、356和376中任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或至少19个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含长度为最多约50个核苷酸(例如，长度为最多50个、最多40个、最多36个、最多30个、最多27个、最多25个、最多21个、最多19个、最多17个或最多12个核苷酸)的有义链(或过客链)。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度为至少约12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少25个、至少27个、至少30个、至少36个或至少38个核苷酸)的有义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度在约12至约50(例如，12至50、12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至21、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)个核苷酸范围内的有义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度为15至50个核苷酸的有义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度为18至36个核苷酸的有义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的有义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度为36个核苷酸的有义链。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链，在该有义链的3’端包含茎-环结构。在一些实施方案中，该茎-环通过链内碱基配对而形成。在一些实施方案中，有义链在其5’端包含茎-环结构。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为2个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为3个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为4个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为5个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为6个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为7个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为8个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为9个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为10个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为11个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为12个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为13个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，该茎-环的茎包含长度为14个核苷酸的双链体。
在一些实施方案中，茎-环提供寡核苷酸免遭降解(例如，酶促降解)的保护，促进或改善向靶细胞、组织或器官(例如，肝脏)的靶向和/或递送，或以上两者。例如，在一些实施方案中，茎-环的环由包含一个或多个修饰的核苷酸组成，所述修饰促进、改善或增加对靶mRNA(例如，MARC1 mRNA)的靶向，对靶基因表达(例如，MARC1表达)的抑制，和/或向靶细胞、组织或器官(例如，肝脏)中的递送、摄取和/或渗透，或其组合。在一些实施方案中，茎-环本身或对茎-环的修饰不影响或基本上不影响寡核苷酸固有的基因表达抑制活性，但促进、改善或增加寡核苷酸的稳定性(例如，提供针对降解的保护)和/或其向靶细胞、组织或器官(例如，肝脏)的递送、摄取和/或渗透。在某些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链，该有义链包含(例如，在其3’端)如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为最多约10个核苷酸(例如，长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的连接的核苷酸的单链环。在一些实施方案中，环(L)的长度为3个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为4个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为5个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为6个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为7个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为8个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为9个核苷酸。在一些实施方案中，环(L)的长度为10个核苷酸。
在一些实施方案中，所述四环包含序列5’-GAAA-3’。在一些实施方案中，所述茎环包含序列5’-GCAGCCGAAAGGCUGC-3’(SEQ ID NO：1681)。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含与SEQ IDNO：1-384中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，并且该寡核苷酸包含有义链，该有义链包含(例如，在其3’端)如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为最多约10个核苷酸(例如，长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的单链环。在一些实施方案中，该寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，并且该寡核苷酸包含有义链，该有义链包含(例如，在其3’端)如下所示的茎-环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为4个核苷酸的单链环。
在一些实施方案中，具有如本文所述的结构S1-L-S2的茎-环的环(L)是三环。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，以及三环。在一些实施方案中，该三环包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸、配体(例如，递送配体)及其组合。
在一些实施方案中，具有如上所述的结构S1-L-S2的茎-环的环(L)是如第10，131，912号美国专利中所述的四环，该专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，以及四环。在一些实施方案中，该四环包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸、配体(例如，递送配体)及其组合。
双链体长度
在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为至少12个(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个)核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为12个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为13个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为14个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为15个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为16个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为17个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为24个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为25个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为26个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为27个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为28个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为29个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为30个核苷酸。在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，有义链与反义链之间的双链体跨越有义链或反义链的整个长度。在一些实施方案中，有义链与反义链之间的双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606，其中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。
在一些实施方案中，有义链与反义链之间的双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO:1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO:1553和1589，其中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。
寡核苷酸末端
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中任一条链或两条链的末端包含平端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链和反义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有突出端的不对称双链体区域。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中任一条链或两条链的末端包含含有一个或多个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，构成突出端的所述一个或多个核苷酸是未配对的核苷酸。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链的3’末端和反义链的5’末端包含平端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链的5’末端和反义链的3’末端包含平端。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中任一条链或两条链的3’末端包含含有一个或多个核苷酸的3’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链包含含有一个或多个核苷酸的3’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中反义链包含含有一个或多个核苷酸的3’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链和反义链均包含含有一个或多个核苷酸的3’-突出端。
在一些实施方案中，3’-突出端的长度为约一(1)至二十(20)个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为约一(1)至十九(19)、一(1)至十八(18)、一(1)至十七(17)、一(1)至十六(16)、一(1)至十五(15)、一(1)至十四(14)、一(1)至十三(13)、一(1)至十二(12)、一(1)至十一(11)、一(1)至十(10)、一(1)至九(9)、一(1)至八(8)、一(1)至七(7)、一(1)至六(6)、一(1)至五(5)、一(1)至四(4)、一(1)至三(3)或约一(1)至两(2)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为(1)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为两(2)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为三(3)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为四(4)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为五(5)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为六(6)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为七(7)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为八(8)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为九(9)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十(10)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十一(11)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十二(12)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十三(13)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十四(14)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十五(15)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十六(16)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十七(17)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十八(18)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为十九(19)个核苷酸。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为二十(20)个核苷酸。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中该反义链包含3’-突出端，其中该寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606，并且其中所述反义链包含长度为约一(1)至二十(20)个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)的3’-突出端，任选地其中该3’-突出端的长度为两(2)个核苷酸。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中该反义链包含3’-突出端，其中该寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO:1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO:1553和1589，并且其中所述反义链包含长度为约一(1)至二十(20)个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)的3’-突出端，任选地其中该3’-突出端的长度为两(2)个核苷酸。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中任一条链或两条链的5’末端包含含有一个或多个核苷酸的5’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链包含含有一个或多个核苷酸的5’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中反义链包含含有一个或多个核苷酸的5’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链和反义链均包含含有一个或多个核苷酸的5’-突出端。
在一些实施方案中，5’-突出端的长度为约一(1)至二十(20)个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为约一(1)至十九(19)、一(1)至十八(18)、一(1)至十七(17)、一(1)至十六(16)、一(1)至十五(15)、一(1)至十四(14)、一(1)至十三(13)、一(1)至十二(12)、一(1)至十一(11)、一(1)至十(10)、一(1)至九(9)、一(1)至八(8)、一(1)至七(7)、一(1)至六(6)、一(1)至五(5)、一(1)至四(4)、一(1)至三(3)或约一(1)至两(2)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为(1)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为两(2)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为三(3)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为四(4)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为五(5)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为六(6)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为七(7)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为八(8)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为九(9)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十(10)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十一(11)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十二(12)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十三(13)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十四(14)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十五(15)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十六(16)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十七(17)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十八(18)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为十九(19)个核苷酸。在一些实施方案中，5’-突出端的长度为二十(20)个核苷酸。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中该反义链包含5’-突出端，其中该寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606，并且其中所述反义链包含长度为约一(1)至二十(20)个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)的5’-突出端，任选地其中该5’-突出端的长度为两(2)个核苷酸。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中该反义链包含5’-突出端，其中该寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO:1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO:1553和1589，并且其中所述反义链包含长度为约一(1)至二十(20)个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)的5’-突出端，任选地其中该5’-突出端的长度为两(2)个核苷酸。
在一些实施方案中，构成有义链和/或反义链的3’末端或5’末端的一个或多个(例如，2、3、4、5个或更多个)核苷酸被修饰。例如，在一些实施方案中，反义链的3’末端的一个或两个末端核苷酸被修饰。在一些实施方案中，反义链的3’末端的最后一个核苷酸被修饰，使得其包含2’修饰，或者其包含2’-O-甲氧基乙基。在一些实施方案中，反义链的3’末端的最后一个或两个末端核苷酸与靶标互补。在一些实施方案中，反义链的3’末端的最后一个或两个核苷酸不与靶标互补。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中有义链的3’末端包含本文所述的茎-环，并且反义链的3’末端包含本文所述的3’-突出端。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含形成本文所述的带缺口的四环结构的有义链和反义链，其中有义链的3’末端包含茎-环，其中该环是本文所述的四环，并且其中反义链的3’末端包含本文所述的3’-突出端。在一些实施方案中，3’-突出端的长度为两(2)个核苷酸。在一些实施方案中，构成3’-突出端的两(2)个核苷酸均包含鸟嘌呤(G)核碱基。通常，构成反义链的3’-突出端的核苷酸之一或两者不与靶标互补。图12中提供了示例性的带缺口的四环结构。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含图12中所示的带缺口的四环结构。
寡核苷酸修饰
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含修饰。寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以以多种方式进行修饰，以改善或控制特异性、稳定性、递送、生物利用度、核酸酶降解抗性、免疫原性、碱基配对性质、RNA分布和细胞摄取以及与治疗或研究用途相关的其他特征。
在一些实施方案中，所述修饰是经修饰的糖。在一些实施方案中，该修饰是5’-末端磷酸酯基团。在一些实施方案中，该修饰是经修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，该修饰是经修饰的碱基。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸可包含本文所述的任一种修饰或其任何组合。例如，在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含至少一种经修饰的糖、5’-末端磷酸酯基团、至少一种经修饰的核苷酸间键合和至少一种经修饰的碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606，其中所述寡核苷酸包含至少一种经修饰的糖、5’-末端磷酸酯基团、至少一种经修饰的核苷酸间键合和至少一种经修饰的碱基。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含至少一种经修饰的糖、5’-末端磷酸酯基团、至少一种经修饰的核苷酸间键合和至少一种经修饰的碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO:1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO:1553和1589，其中所述寡核苷酸包含至少一种经修饰的糖、5’-末端磷酸酯基团、至少一种经修饰的核苷酸间键合和至少一种经修饰的碱基。
寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)上的修饰数目和这些核苷酸修饰的位置可影响寡核苷酸的性质。例如，可以通过将寡核苷酸与脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体缀合或将其包围在脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体中来在体内递送所述寡核苷酸。然而，当寡核苷酸不受LNP或类似载体保护时，至少一些核苷酸被修饰可能是有利的。因此，在一些实施方案中，寡核苷酸的所有或基本上所有核苷酸均被修饰。在一些实施方案中，超过一半的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，少于一半的核苷酸被修饰。在一些实施方案中，构成寡核苷酸的所有核苷酸的糖部分在2’位置被修饰。所述修饰可以是可逆的或不可逆的。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸具有足以产生所需特性(例如，针对酶促降解的保护、在体内施用后靶向所需细胞的能力和/或热力学稳定性)的修饰核苷酸数目和类型。
糖修饰
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含经修饰的糖。在一些实施方案中，经修饰的糖(本文中也称为糖类似物)包括经修饰的脱氧核糖或核糖部分，其中，例如，一个或多个修饰发生在糖的2’、3’、4’和/或5’碳位置处。在一些实施方案中，经修饰的糖还可以包括非天然替代碳结构，例如存在于锁定核酸(“LNA”；参见，例如，Koshkin等人(1998)TETRAHEDON 54:3607-30)、未锁定的核酸(“UNA”；参见，例如，Snead等人(2013)MOL.THER-NUCL.ACIDS2:e103)和桥连核酸(“BNA”；参见，例如，Imanishi&Obika(2002)CHEM COMMUN.(CAMB)21:1653-59)中的那些结构。
在一些实施方案中，糖中的核苷酸修饰包括2’-修饰。在一些实施方案中，2’-修饰可以是2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氟代(2’-F)、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)或2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)。在一些实施方案中，该修饰是2’-F、2’-OMe或2’-MOE。在一些实施方案中，糖中的修饰包括糖环的修饰，其可以包括糖环的一个或多个碳的修饰。例如，核苷酸的糖的修饰可以包括糖的2’-氧与糖的1’-碳或4’-碳连接，或者2’-氧与1’-碳或4’-碳经由亚乙基或亚甲基桥连接。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有缺少2’-碳至3’-碳的键的无环糖。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有硫醇基团，例如在糖的4’位置。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个或更多个)。在一些实施方案中，该寡核苷酸的有义链包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个或更多个)。在一些实施方案中，该寡核苷酸的反义链包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个)。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸的有义链的所有核苷酸均被修饰。在一些实施方案中，该寡核苷酸的反义链的所有核苷酸均被修饰。在一些实施方案中，该寡核苷酸的所有核苷酸(即，有义链和反义链两者)均被修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含2’-修饰(例如，2’-F或2’-OMe、2’-MOE和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸)。
在一些实施方案中，本发明提供了具有不同修饰模式的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含具有如实施例和序列表中阐述的修饰模式的有义链以及具有如实施例和序列表中阐述的修饰模式的反义链。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有被2’-F修饰的核苷酸的反义链。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含反义链，该反义链包含被2’-F和2’-OMe修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸包含具有被2’-F修饰的核苷酸的有义链。在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸包含有义链，该有义链包含被2’-F和2’-OMe修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含有义链，该有义链的约10-15％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的核苷酸包含2’-氟代修饰。在一些实施方案中，有义链的约11％的核苷酸包含2-氟代修饰。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸包含反义链，该反义链的约25-35％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的核苷酸包含2’-氟代修饰。在一些实施方案中，反义链的约32％的核苷酸包含2’-氟代修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸的约15-25％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％的核苷酸包含2’-氟代修饰。在一些实施方案中，dsRNAi寡核苷酸中约19％的核苷酸包含2’-氟代修饰。
在一些实施方案中，有义链的位置8、9、10或11中的一个或多个被2’-F基团修饰。在一些实施方案中，有义链的位置3、8、9、10、12、13和17中的一个或多个被2’-F基团修饰。在一些实施方案中，反义链的位置2、3、4、5、7、10和14中的一个或多个被2’-F基团修饰。在一些实施方案中，位置2、3、4、5、7、8、10、14、16和19中的一个或多个被2’-F基团修饰。在一些实施方案中，有义链中位置1-7和12-20处的每个核苷酸处的糖部分被2’-OMe修饰。在一些实施方案中，有义链中位置1-7、12-27和31-36处的每个核苷酸处的糖部分被2’-OMe修饰。在一些实施方案中，有义链中位置6、9、11-13、15、17、18和20-22处的每个核苷酸处的糖部分被2’-OMe修饰。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606，其中有义链的位置8、9、10或11中的一个或多个位置被2’-F基团修饰。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO:1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO:1553和1589，其中有义链的位置8、9、10或11中的一个或多个位置被2’-F基团修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置2、5和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置1、2、5和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置2、4、5和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置1、2、3、5、7和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置2、3、4、5、7和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置1、2、3、5、10和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置2、3、4、5、10和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置2、3、5、7、10和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置2、3、4、5、7、10和14处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置2、3、4、5、7、8、10、14、16和19处的每个核苷酸的糖部分被2’-F修饰，并且该反义链的其余每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22处的糖部分被2’-F修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22处的糖部分被2’-OMe修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22处的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链，该有义链的位置8-11处的糖部分被2’-F修饰。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链，该有义链的位置3、8、9、10、12、13和17处的糖部分被2’-F修饰。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链，该有义链的位置1-7和12-17或12-20处的糖部分被2’OMe修饰。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链，该有义链的位置1-7、12-27和31-36处的糖部分被2’OMe修饰。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链，该有义链的位置1-7和12-17或12-20处的每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链，该有义链的位置1-2、4-7、11、14-16和18-20处的糖部分被2’OMe修饰。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链，该有义链的位置1-2、4-7、11、14-16和18-20处的每个核苷酸的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链，该有义链的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36处的糖部分被2’-F修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链，该有义链的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36处的糖部分被2’-OMe修饰。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含有义链，该有义链的位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36处的糖部分被选自2’-O-炔丙基、2’-O-丙基氨基、2’-氨基、2’-乙基、2’-氨基乙基(EA)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)、2’-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2’-O-NMA)和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2’-FANA)的修饰所修饰。
5’-末端磷酸酯
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中该反义链包含5’-末端磷酸酯。在一些实施方案中，RNAi寡核苷酸的5’-末端磷酸酯基团增强与Ago2的相互作用。然而，包含5’-磷酸酯基团的寡核苷酸可能容易经由磷酸酶或其他酶降解，这可能限制它们在体内的表现和/或生物利用度。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包括对这样的降解有抗性的5’磷酸酯类似物。在一些实施方案中，该磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯，或其组合。在某些实施方案中，寡核苷酸链的5’末端附接至模拟天然5’-磷酸酯基团的静电性质和空间性质的化学部分(“磷酸酯模拟物”)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606，其中所述寡核苷酸包含5’-末端磷酸酯，任选地5’-末端磷酸酯类似物。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO:1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO:1553和1589，其中所述寡核苷酸包含5’-末端磷酸酯，任选地5’-末端磷酸酯类似物。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)在糖的4’-碳位置处具有磷酸酯类似物(称为“4’-磷酸酯类似物”)。参见，例如，公开号为WO 2018/045317的国际专利申请。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸在5’-末端核苷酸处包含4’-磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4’-碳处)或其类似物。在其他实施方案中，4’-磷酸酯类似物是硫代甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫代甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子结合至糖部分或其类似物的4’-碳。在某些实施方案中，4’-磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯。在一些实施方案中，氧基甲基膦酸酯由式–O–CH2–PO(OH)2、–O–CH2–PO(OR)2或-O-CH2-PO(OH)(R)表示，其中R独立地选自-H、-CH3、烷基、-CH2CH2CN、-CH2OCOC(CH3)3、-CH2OCH2CH2Si(CH3)3或保护基。在某些实施方案中，该烷基是CH2CH3。更典型地，R独立地选自-H、-CH3或-CH2CH3。在一些实施方案中，R’为–CH3。在一些实施方案中，该4’-磷酸酯类似物是5’-甲氧基膦酸酯-4’-氧基。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸包含反义链，该反义链在5’-末端核苷酸处包含4’-磷酸酯类似物，其中5’-末端核苷酸包含以下结构：
5’-甲氧基膦酸酯-4’-氧基-2’-O-甲基尿苷硫代磷酸酯[MePhosphonate-4O-mUs]
经修饰的核苷酸间键合
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含经修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，磷酸酯修饰或取代产生包含至少约1个(例如，至少1个、至少2个、至少3个或至少5个)经修饰的核苷酸间键合的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸包含约1至约10个(例如，1至10、2至8、4至6、3至10、5至10、1至5、1至3或1至2个)经修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰的核苷酸间键合。
经修饰的核苷酸间键合可以是二硫代磷酸酯键、硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、硫代烷基膦酸酯键、硫代烷基磷酸三酯键、亚磷酰胺键、膦酸酯键或硼代磷酸酯(boranophosphate)键。在一些实施方案中，本文公开的任一种寡核苷酸的至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置3和4、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的一个或多个之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的每一个之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606，其中所述寡核苷酸包含经修饰的核苷酸间键合。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸在有义链的位置1和2、反义链的位置1和2、反义链的位置2和3、反义链的位置20和21以及反义链的位置21和22中的每一个之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO:1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO:1553和1589，
其中所述寡核苷酸包含经修饰的核苷酸间键合。
碱基修饰
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含一个或多个经修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的核碱基(本文中也称为碱基类似物)在核苷酸糖部分的1’位置处连接。在某些实施方案中，经修饰的核碱基是含氮碱基。在一些实施方案中，经修饰的核碱基不含氮原子。参见，例如，公开号为2008/0274462的美国专利申请。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含通用碱基。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸不含核碱基(无碱基的)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606，其中所述寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含通用碱基。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸不含核碱基(无碱基的)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO:1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO:1553和1589，其中所述寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施方案中，通用碱基是杂环部分，该杂环部分位于经修饰的核苷酸中核苷酸糖部分的1’位置处，或者位于核苷酸糖部分取代中的等同位置处，以致于当存在于双链体中时，其可以放置于超过一种类型的碱基的对面，而基本上不改变双链体的结构。在一些实施方案中，相比于与靶核酸(例如，MARC1 mRNA)完全互补的参考单链核酸(例如，寡核苷酸)，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，该双链体的Tm低于与互补核酸形成的双链体。在一些实施方案中，当与其中通用碱基已被碱基代替以生成单个错配的参考单链核酸相比时，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，该双链体的Tm高于与包含该错配碱基的核酸形成的双链体。
通用结合核苷酸的非限制性实例包括但不限于肌苷、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(参见，公开号为2007/0254362的美国专利申请；Van Aerschot等人(1995)NUCLEIC ACIDS RES23:4363-4370；Loakes等人(1995)NUCLEICACIDS RES23:2361-66；以及Loakes&Brown(1994)NUCLEIC ACIDS RES22:4039-43)。
靶向配体
在一些实施方案中，希望将本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)靶向至一种或多种细胞或细胞类型、组织、器官或解剖区域或区室。这样的策略可以有助于避免对所治疗的生物体的不良影响和/或避免寡核苷酸过度流失到不会从该寡核苷酸或其作用(例如，MARC1表达的抑制或降低)受益的细胞、组织、器官或解剖区域或区室。因此，在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)被修饰，以促进向特定细胞或细胞类型、组织、器官或解剖区域或区室的靶向和/或递送(例如，促进寡核苷酸向肝脏的递送)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与一个或多个靶向配体缀合的至少一个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606，其中所述寡核苷酸包含与至少一个核苷酸缀合的靶向配体。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含与一个或多个靶向配体缀合的至少一个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO:1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO:1553和1589，其中所述寡核苷酸包含与至少一个核苷酸缀合的靶向配体。
在一些实施方案中，靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白质或蛋白质的一部分(例如，抗体或抗体片段)或脂质。在某些实施方案中，靶向配体是包含至少一个GalNAc部分的碳水化合物。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的1个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自与单独的靶向配体(例如，GalNAc部分)缀合。在一些实施方案中，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自与单独的靶向配体缀合。在一些实施方案中，靶向配体与有义链或反义链任一端的2至4个核苷酸缀合(例如，靶向配体与有义链或反义链5’或3’末端上的2至4个核苷酸的突出端或延伸部分缀合)，使得靶向配体类似于牙刷的刷毛，而寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可在有义链的5’或3’末端包含茎-环，并且该茎的环的1、2、3或4个核苷酸可单独地与靶向配体缀合。在一些实施方案中，本发明提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)在有义链的3’末端包含茎-环，其中该茎-环的环包含三环或四环，并且其中构成该三环或四环的3或4个核苷酸分别单独地与靶向配体缀合。在一些实施方案中，本发明提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)在有义链的3’末端包含茎-环，其中该茎-环的环包含四环，并且其中该四环的3个核苷酸单独地与靶向配体缀合。
GalNAc是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的高亲和力碳水化合物配体，ASGPR主要在肝细胞的表面上表达，并且在结合、内化及随后清除含有末端半乳糖或GalNAc残基的循环糖蛋白(脱唾液酸糖蛋白)方面起主要作用。GalNAc部分与本公开的寡核苷酸的缀合(间接的或直接的)可用来将这些寡核苷酸靶向细胞上表达的ASGPR。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)与至少一个或多个GalNAc部分缀合，其中所述GalNAc部分将该寡核苷酸靶向至在人肝脏细胞(例如，人肝细胞)上表达的ASGPR。在一些实施方案中，GalNAc部分将寡核苷酸靶向肝脏。
在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)直接或间接地与单价GalNAc部分缀合。在一些实施方案中，该寡核苷酸直接或间接地与多于一个单价GalNAc缀合(即，与2、3或4个单价GalNAc部分缀合，并且通常与3或4个单价GalNAc部分缀合)。在一些实施方案中，寡核苷酸与一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分缀合。在一些实施方案中，二价、三价或四价GalNAc部分经由分支连接体与寡核苷酸缀合。在一些实施方案中，单价GalNAc部分与第一核苷酸缀合，并且二价、三价或四价GalNAc部分经由分支连接体与第二核苷酸缀合。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的一(1)个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自与GalNAc部分缀合。在一些实施方案中，四环的两(2)至四(4)个核苷酸各自与单独的GalNAc部分缀合。在一些实施方案中，三环的一(1)至三(3)个核苷酸各自与单独的GalNAc部分缀合。在一些实施方案中，靶向配体与有义链或反义链任一端的两(2)至四(4)个核苷酸缀合(例如，配体与有义链或反义链5’或3’末端上的两(2)至四(4)个核苷酸的突出端或延伸部分缀合)，使得GalNAc部分类似于牙刷的刷毛，而寡核苷酸类似于牙刷。在一些实施方案中，GalNAc部分与有义链的核苷酸缀合。例如，三(3)或四(4)个GalNAc部分可以与有义链的四环中的核苷酸缀合，其中每个GalNAc部分与一(1)个核苷酸缀合。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含四环，其中该四环(L)是腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)核苷酸的任意组合。在一些实施方案中，所述四环(L)包含经由本文所述的任何连接体与该四环的任何一个或多个鸟嘌呤(G)核苷酸附接的单价GalNAc部分，如下所示(X＝杂原子)：
在一些实施方案中，所述四环(L)具有经由本文所述的任何连接体与该四环的任何一个或多个腺嘌呤核苷酸附接的单价GalNAc，如下所示(X＝杂原子)：
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含与鸟嘌呤(G)核苷酸附接的单价GalNAc部分，称为[ademG-GalNAc]或2’-氨基二乙氧基甲醇-鸟嘌呤-GalNAc，如下所示：
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含与腺嘌呤核苷酸附接的单价GalNAc部分，称为[ademA-GalNAc]或2’-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所示：
下面针对从5’至3’包含核苷酸序列GAAA的环示出了这类缀合的实例(L＝连接体，X＝杂原子)。例如，这样的环可以存在于本文提供的有义链的位置27-30处。在化学式中，用来描述与寡核苷酸链连接的连接点。
可以使用适当的方法或化学(例如，点击化学)将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，使用点击连接体将靶向配体与构成本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的核苷酸缀合。在一些实施方案中，使用基于缩醛的连接体将靶向配体与本文所述的任一种寡核苷酸的核苷酸缀合。基于缩醛的连接体例如在公开号为WO2016/100401的国际专利申请中公开。在一些实施方案中，该连接体是不稳定的连接体。然而，在其他实施方案中，该连接体是稳定的。下面示出了从5’至3’包含核苷酸GAAA的环的实例，其中使用缩醛连接体将GalNAc部分附接至该环的核苷酸。例如，这样的环可以存在于任一有义链的位置27-30处。在化学式中，是与寡核苷酸链连接的连接点。
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如所提到的，可以使用各种适当的方法或化学合成技术(例如，点击化学)将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，使用点击连接体将靶向配体与核苷酸缀合。在一些实施方案中，使用基于缩醛的连接体将靶向配体与本文所述的任一种寡核苷酸的核苷酸缀合。基于缩醛的连接体例如在公开号为WO 2016/100401的国际专利申请中公开。在一些实施方案中，该连接体是不稳定的连接体。然而，在其他实施方案中，该连接体是稳定的连接体。
在一些实施方案中，在靶向配体(例如，GalNAc部分)与寡核苷酸之间提供双链体延伸(例如，长度最多3、4、5或6bp)。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)不具有与之缀合的GalNAc。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606，其中所述寡核苷酸包含与核苷酸缀合的至少一个GalNAc部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO:1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO:1553和1589，其中所述寡核苷酸包含与核苷酸缀合的至少一个GalNAc部分。
用于降低MARC1表达的示例性寡核苷酸
在一些实施方案中，本发明提供的用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含有义链和反义链，其中构成有义链和反义链的所有核苷酸均被修饰，其中反义链包含与SEQ ID NO:1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中该互补区域的长度为至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，反义链的5’-末端核苷酸包含5’-甲氧基膦酸酯-4’-氧基-2’-O-甲基尿苷[MePhosphonate-4O-mU]，如本文所述。在一些实施方案中，反义链的5’-末端核苷酸包含硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，反义链和有义链包含一个或多个2’-氟(2’-F)和2’-O-甲基(2’-OMe)修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，反义链包含四(4)个硫代磷酸酯键，而有义链包含一(1)个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，反义链包含五(5)个硫代磷酸酯键，而有义链包含一(1)个硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有SEQ IDNO:769-1152中任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO:1153-1536的互补序列的反义链。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有SEQ IDNO:1537-1570中任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO:1573-1606的互补序列的反义链。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含具有SEQ IDNO:1609-1642中任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO:1645-1678的互补序列的反义链。
在一些实施方案中，本文提供的用于降低MARC1表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含：
有义链，其包含在位置8-11处的2’-F修饰的核苷酸，在位置1-7、12-27和31-36处的2’-OMe修饰的核苷酸，在位置28、29和30处的GalNAc缀合的核苷酸；以及在位置1和2之间的硫代磷酸酯键；
反义链，其包含在位置2、3、4、5、7、10和14处的2’-F修饰的核苷酸，在位置1、6、8、9、11-13和15-22处的2’-OMe，在位置1和2、位置2和3、位置3和4、位置20和21及位置21和22之间的硫代磷酸酯键，以及在位置1处的包含4'-磷酸酯类似物的5’-末端核苷酸，任选地其中该5’-末端核苷酸包含5’-甲氧基膦酸酯-4’-氧基-2’-O-甲基尿苷[MePhosphonate-4O-mU]；其中反义链的位置1-20与有义链的位置1-20形成双链体区域，其中有义链的位置21-36形成茎-环，其中位置27-30形成该茎-环的环，任选地其中位置27-30包含四环，其中反义链的位置21和22包含突出端，并且其中有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含：
有义链，其包含在位置8-11处的2’-F修饰的核苷酸，在位置1-7、12-27和31-36处的2’-OMe修饰的核苷酸，在位置28、29和30处的GalNAc缀合的核苷酸；以及在位置1和2之间的硫代磷酸酯键；
反义链，其包含在位置2、3、4、5、7、10和14处的2’-F修饰的核苷酸，在位置1、6、8、9、11-13和15-22处的2’-OMe，在位置1和2、位置2和3、位置3和4、位置20和21及位置21和22之间的硫代磷酸酯键，以及在位置1处的包含4’-磷酸酯类似物的5’-末端核苷酸，任选地其中该5’-末端核苷酸包含5’-甲氧基膦酸酯-4’-氧基-2’-O-甲基尿苷[MePhosphonate-40-mU]；其中反义链的位置1-20与有义链的位置1-20形成双链体区域，其中有义链的位置21-36形成茎-环，其中位置27-30形成该茎-环的环，任选地其中位置27-30包含四环，其中反义链的位置21和22包含突出端，并且其中有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：1543和1579；
(b)分别为SEQ ID NO：1560和1596；
(c)分别为SEQ ID NO：1568和1604；以及，
(d)分别为SEQ ID NO：1553和1589。
在一些实施方案中，本发明提供的用于降低MARC1表达的靶向MARC1的寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链包含如SEQ ID NO：1543所示的核苷酸序列，该反义链包含如SEQ ID NO：1579所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的用于降低MARC1表达的靶向MARC1的寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链包含如SEQ ID NO：1560所示的核苷酸序列，该反义链包含如SEQ ID NO：1596所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的用于降低MARC1表达的靶向MARC1的寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链包含如SEQ ID NO：1568所示的核苷酸序列，该反义链包含如SEQ ID NO：1604所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的用于降低MARC1表达的靶向MARC1的寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链包含如SEQ ID NO：1553所示的核苷酸序列，该反义链包含如SEQ IDNO：1589所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：618所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：682所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：740所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：760所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：618所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域和在3’末端的茎-环，其中该茎-环被表示为S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARCl的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：682所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域和在3’末端的茎-环，其中该茎-环被表示为S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：740所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域和在3’末端的茎-环，其中该茎-环被表示为S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：760所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域和在3’末端的茎-环，其中该茎-环被表示为S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：618所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域，其中所述与反义链互补的互补区域如SEQ ID NO：234所示，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：682所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域，其中所述与反义链互补的互补区域如SEQ ID NO：298所示，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：740所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域，其中所述与反义链互补的互补区域如SEQ ID NO：356所示，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：760所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域，其中所述与反义链互补的互补区域如SEQ ID NO：376所示，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：618所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域和在3’末端的茎-环，其中所述与反义链互补的互补区域如SEQ ID NO：234所示，其中所述茎-环被表示为S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：682所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域和在3’末端的茎-环，其中所述与反义链互补的互补区域如SEQ ID NO：298所示，其中所述茎-环被表示为S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：740所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域和在3’末端的茎-环，其中所述与反义链互补的互补区域如SEQ ID NO：356所示，其中所述茎-环被表示为S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，用于降低MARC1表达的靶向MARC1的dsRNAi寡核苷酸包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，其中该互补区域如SEQ ID NO：760所示，以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与反义链互补的互补区域和在3’末端的茎-环，其中所述与反义链互补的互补区域如SEQ ID NO：376所示，其中所述茎-环被表示为S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
在一些实施方案中，本发明提供了用于降低MARC1表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中该寡核苷酸包含根据以下的有义链和反义链：
有义链：
5’-mX-S-mX-mX-mX-mX-mX-mX-fX-fX-fX-fX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’；
杂交至：
反义链：
5’-[MePhosphonate-40-mX]-S-fX-S-fX-S-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-S-mX-S-mX-3’；
其中mX＝2’-O-甲基修饰的核苷酸，fX＝2’-氟代修饰的核苷酸，-S-＝硫代磷酸酯键，-＝磷酸二酯键，[MePhosphonate-40-mX]＝5’-甲氧基膦酸酯-4-氧基修饰的核苷酸，并且ademA-GalNAc＝附接至腺嘌呤核苷酸的GalNAc。
在一些实施方案中，本发明提供了用于降低MARC1表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，其中该寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：1609和1645；
(b)分别为SEQ ID NO：1610和1646；
(c)分别为SEQ ID NO：1611和1647；
(d)分别为SEQ ID NO：1612和1648；
(e)分别为SEQ ID NO：1613和1649；
(f)分别为SEQ ID NO：1614和1650；
(g)分别为SEQ ID NO：1615和1651；
(h)分别为SEQ ID NO：1616和1652；
(i)分别为SEQ ID NO：1617和1653；
(j)分别为SEQ ID NO：1618和1654；
(k)分别为SEQ ID NO：1619和1655；
(l)分别为SEQ ID NO：1620和1656；
(m)分别为SEQ ID NO：1621和1657；
(n)分别为SEQ ID NO：1622和1658；
(o)分别为SEQ ID NO：1623和1659；
(p)分别为SEQ ID NO：1624和1660；
(q)分别为SEQ ID NO：1625和1661；
(r)分别为SEQ ID NO：1626和1662；
(s)分别为SEQ ID NO：1627和1663；
(t)分别为SEQ ID NO：1628和1664；
(u)分别为SEQ ID NO：1628和1665；
(v)分别为SEQ ID NO：1630和1666；
(w)分别为SEQ ID NO：1631和1667；
(x)分别为SEQ ID NO：1632和1668；
(y)分别为SEQ ID NO：1633和1669；
(z)分别为SEQ ID NO：1634和1670；
(aa)分别为SEQ ID NO：1635和1671；
(bb)分别为SEQ ID NO：1636和1672；
(cc)分别为SEQ ID NO：1637和1673；
(dd)分别为SEQ ID NO：1638和1674；
(ee)分别为SEQ ID NO：1639和1675；
(ff)分别为SEQ ID NO：1640和1676；
(gg)分别为SEQ ID NO：1641和1677；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO：1642和1678。
在一些实施方案中，本发明提供的用于降低MARC1表达的靶向MARC1的寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链包含如SEQ ID NO：1615所示的核苷酸序列，该反义链包含如SEQ ID NO：1651所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的用于降低MARC1表达的靶向MARC1的寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链包含如SEQ ID NO：1632所示的核苷酸序列，该反义链包含如SEQ ID NO：1668所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的用于降低MARC1表达的靶向MARC1的寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链包含如SEQ ID NO：1640所示的核苷酸序列，该反义链包含如SEQ ID NO：1676所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供的用于降低MARCl表达的靶向MARC1的寡核苷酸包含有义链和反义链，该有义链包含如SEQ ID NO：1625所示的核苷酸序列，该反义链包含如SEQ IDNO：1661所示的核苷酸序列。
制剂
已经开发了多种用于寡核苷酸用途的制剂(例如，药物制剂)。例如，可以使用使降解最小化、促进递送和/或摄取、或为制剂中的寡核苷酸提供另一种有益性质的制剂将寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)递送至受试者或细胞环境。在一些实施方案中，本文提供了包含降低MARC1表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的组合物。可以适当地配制这样的组合物，使得当施用于受试者时，无论是施用到靶细胞的直接环境中还是全身施用，都有足够部分的寡核苷酸进入细胞以降低MARC1表达。如本文所公开的，可以使用任何种类的合适的寡核苷酸制剂来递送寡核苷酸以减少MARC1。在一些实施方案中，将寡核苷酸配制在缓冲溶液如PBS溶液、脂质体、胶束结构和壳体中。本文所述的任何寡核苷酸不仅可以作为核酸提供，而且还可以以药学上可接受的盐的形式提供。
具有阳离子脂质的寡核苷酸制剂可用来促进寡核苷酸向细胞中的转染。例如，可以使用阳离子脂质，如lipofectin、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如，聚赖氨酸)。合适的脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine(Life Technologies)、NC388(RibozymePharmaceuticals，Inc.，Boulder，Colo.)或FuGene 6(Roche)，所有这些都可以根据制造商的说明来使用。
因此，在一些实施方案中，制剂包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，辅料包含脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米颗粒，或者可以以其他方式配制以供施用至有需要的受试者的细胞、组织、器官或身体(参见，例如，Remington：THE SCIENCEAND PRACTICE OF PHARMACY，第22版，Pharmaceutical Press，2013)。
在一些实施方案中，本文的制剂包含辅料。在一些实施方案中，辅料为组合物赋予活性成分的改善的稳定性、改善的吸收、改善的溶解度和/或治疗增强。在一些实施方案中，辅料是缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或媒介物(例如，缓冲溶液、凡士林、二甲基亚砜或矿物油)。在一些实施方案中，将寡核苷酸冻干以延长其保质期，然后在使用(例如，施用至受试者)前制成溶液。因此，包含任一种本文所述寡核苷酸的组合物中的辅料可以是冻干保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或塌陷温度调节剂(例如，葡聚糖、FicollTM或明胶)。
在一些实施方案中，将药物组合物配制为与其预期的给药途径兼容。给药途径的实例包括肠胃外(例如，静脉内、肌肉内、腹膜内、皮内、皮下)、口服(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、经粘膜和直肠给药。
适合注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(当水溶性时)或分散体以及用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或PBS。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。在许多情况下，优选地在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。无菌注射溶液可以如下制备：根据需要将所需量的寡核苷酸与上文列举的成分中的一种或其组合引入所选溶剂中，随后过滤除菌。
在一些实施方案中，组合物可含有至少约0.1％或更多的治疗剂(例如，用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸)，尽管活性成分的百分比可在总组合物的重量或体积的约1％至约80％之间或更多。制备此类药物制剂的本领域技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、给药途径、产品保质期以及其他药理学考虑因素等因素，并且因此，多种剂量和治疗方案可能是可取的。
使用方法
降低MARC1表达
在一些实施方案中，本发明提供了用于使细胞或细胞群体接触或向其递送有效量的本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)以降低MARC1表达的方法。在一些实施方案中，通过测量细胞中MARC1 mRNA、MARC1蛋白或MARC1活性的量或水平的降低来确定MARC1表达的降低。这些方法包括本文描述的和本领域普通技术人员已知的那些方法。
本文提供的方法可用于任何合适的细胞类型。在一些实施方案中，细胞是表达MARC1 mRNA的任何细胞(例如，肝细胞)。在一些实施方案中，细胞是从受试者获得的原代细胞。在一些实施方案中，该原代细胞已经历有限次数的传代，使得该细胞基本上保持其天然表型性质。在一些实施方案中，寡核苷酸所递送至的细胞是离体或体外的(即，可以被递送至培养中的细胞或细胞所在的生物体)。
在一些实施方案中，使用本领域已知的核酸递送方法向细胞或细胞群体递送本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，所述方法包括但不限于注射含有寡核苷酸的溶液，用被寡核苷酸覆盖的颗粒轰击，将细胞或细胞群体暴露于含有寡核苷酸的溶液，或在寡核苷酸的存在下对细胞膜进行电穿孔。可以使用本领域已知的用于将寡核苷酸递送至细胞的其他方法，例如脂质介导的载体转运、化学介导的转运和阳离子脂质体转染如磷酸钙等。
在一些实施方案中，MARC1表达的降低通过评价与MARC1表达相关的细胞或细胞群体的一种或多种分子、性质或特性的测定或技术来确定，或者通过评价直接指示细胞或细胞群体中的MARC1表达的分子(例如，MARC1 mRNA或MARC1蛋白)的测定或技术来确定。在一些实施方案中，通过将与寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中的MARC1表达与适当对照(例如，未与该寡核苷酸接触或与对照寡核苷酸接触的适当细胞或细胞群体)进行比较来评价本文提供的寡核苷酸降低MARC1表达的程度。在一些实施方案中，预先确定对照细胞或细胞群体中MARC1表达的对照量或水平，使得不需要在每次进行该测定或技术时都测量对照量或水平。预先确定的水平或值可以采取多种形式。在一些实施方案中，预先确定的水平或值可以是单个截断值，如中值或平均值。
在一些实施方案中，使本文所述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)接触或递送至细胞或细胞群体导致未与该寡核苷酸接触或与对照寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中的MARC1表达降低。在一些实施方案中，MARC1表达的降低是相对于MARC1表达的对照量或水平约1％或更低、约5％或更低、约10％或更低、约15％或更低、约20％或更低、约25％或更低、约30％或更低、约35％或更低、约40％或更低、约45％或更低、约50％或更低、约55％或更低、约60％或更低、约70％或更低、约80％或更低或者约90％或更低。在一些实施方案中，MARC1表达的对照量或水平是尚未与本文的寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中MARC1 mRNA和/或MARC1蛋白的量或水平。在一些实施方案中，在任何有限的时间段或时间量(例如，分钟、小时、天、周、月)之后评估根据本文的方法将本文的寡核苷酸递送至细胞或细胞群体的效果。例如，在一些实施方案中，在使寡核苷酸接触或递送至细胞或细胞群体后至少约4小时、约8小时、约12小时、约18小时、约24小时；或至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约21天、约28天、约35天、约42天、约49天、约56天、约63天、约70天、约77天或约84天或更长时间，在细胞或细胞群体中测定MARC1表达。在一些实施方案中，在使寡核苷酸接触或递送至细胞或细胞群体后至少约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月或更长时间，在细胞或细胞群体中测定MARC1表达。
在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)以转基因的形式递送，该转基因被工程改造为在细胞中表达该寡核苷酸或构成该寡核苷酸的链(例如，其有义链和反义链)。在一些实施方案中，使用被工程改造为表达本文公开的任何寡核苷酸的转基因来递送本文的寡核苷酸。转基因可以使用病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、痘病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)或非病毒载体(例如，质粒或合成mRNA)来递送。在一些实施方案中，转基因可以直接注射至受试者。
治疗方法
本发明提供了用作药物，特别是供治疗与MARC1表达相关的疾病、病症和状况的方法使用的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)。本发明还提供了用于或适合用于治疗将会受益于降低MARC1表达的受试者(例如，患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的人)的寡核苷酸。在一些方面，本发明提供了用于或适合用于治疗患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者的寡核苷酸。本发明还提供了用于或适合用于制备用于治疗与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的药物或药物组合物的寡核苷酸。在一些实施方案中，供使用或适合使用的寡核苷酸靶向MARC1 mRNA并降低MARC1表达(例如，经由RNAi途径)。在一些实施方案中，供使用或适合使用的寡核苷酸靶向MARC1 mRNA并降低MARC1 mRNA、MARC1蛋白和/或MARC1活性的量或水平。
另外，在本文方法的一些实施方案中，选择患有或易患与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者来用本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)进行治疗。在一些实施方案中，所述方法包括选择具有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的标志物(例如，生物标志物)或容易具有该标志物(例如，但不限于，MARC1 mRNA、MARC1蛋白或其组合)的个体。同样地，并且如下文所详述的，本发明提供的方法的一些实施方案包括诸如以下的步骤：测量或获得MARC1表达的标志物(例如，MARC1mRNA)的基线值，然后将这样获得的值与一个或多个其他基线值或在向受试者施用寡核苷酸后获得的值进行比较，以评估治疗的有效性。
本发明还提供了用本文提供的寡核苷酸治疗患有、疑似患有或有风险发展为与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者的方法。在一些方面，本发明提供了使用本文的寡核苷酸治疗或减弱与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的发作或进展的方法。在其他方面，本发明提供了使用本文提供的寡核苷酸在患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者中实现一种或多种治疗益处的方法。在本文方法的一些实施方案中，通过施用治疗有效量的任意一种或多种本文提供的寡核苷酸来治疗受试者。在一些实施方案中，治疗包括降低MARC1表达。在一些实施方案中，对受试者进行治疗性治疗。在一些实施方案中，对受试者进行预防性治疗。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的一种或多种寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用至患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得该受试者中的MARC1表达降低，从而治疗该受试者。在一些实施方案中，受试者中MARC1 mRNA的量或水平降低。在一些实施方案中，受试者中MARC1蛋白的量或水平降低。在一些实施方案中，受试者中MARC1活性的量或水平降低。
在本文方法的一些实施方案中，将本文提供的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含该寡核苷酸的药物组合物施用至患有与MARC1相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用一种或多种寡核苷酸或药物组合物之前的MARC1表达相比，该受试者中的MARC1表达降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述一种或多种寡核苷酸或药物组合物或接受一种或多种对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的MARC1表达相比，该受试者中的MARC1表达降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的一种或多种寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含该一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用至患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该寡核苷酸或药物组合物之前的MARC1 mRNA的量或水平相比，该受试者中MARC1 mRNA的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述一种或多种寡核苷酸或药物组合物或接受一种或多种对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中MARC1 mRNA的量或水平相比，该受试者中MARC1 mRNA的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的一种或多种寡核苷酸或包含该一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用至患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该寡核苷酸或药物组合物之前的MARC1蛋白的量或水平相比，该受试者中MARC1蛋白的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述一种或多种寡核苷酸或药物组合物或接受一种或多种对照寡核苷酸或药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中MARC1蛋白的量或水平相比，该受试者中MARC1蛋白的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的一种或多种寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含该一种或多种寡核苷酸的药物组合物施用至患有与MARC1相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该寡核苷酸或药物组合物之前的MARC1活性的量或水平相比，该受试者中MARC1基因活性/表达的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中MARC1活性的量或水平相比，该受试者中MARC1活性的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
用于测定受试者中或来自受试者的样品中的MARC1表达、MARC1 mRNA、MARC1蛋白、MARC1活性或与MARC1表达调节相关或受MARC1表达调节影响的生物标志物(例如，血浆生物标志物)的量或水平的合适方法是本领域已知的。此外，本文呈现的实施例说明了用于测定MARC1表达的方法。
在一些实施方案中，在从受试者获得或分离的细胞(例如，肝细胞)、细胞群体或一组细胞(例如，类器官)、器官(例如，肝脏)、血液或其成分(例如，血浆)、组织(例如，肝组织)、样品(例如，肝脏活检样品)或任何其他适当的生物材料中，MARC1表达、MARC1 mRNA、MARCl蛋白、MARC1活性或与MARC1表达调节相关或受MARC1表达调节影响的生物标志物的量或水平或其任何组合降低。在一些实施方案中，在多于一种类型的细胞(例如，肝细胞和一种或多种其他类型的细胞)、多于一组细胞、多于一种器官(例如，肝脏和一种或多种其他器官)、多于一种血液成分(例如，血浆和一种或多种其他血液成分)、多于一种类型的组织(例如，肝脏组织和一种或多种其他类型的组织)或多于一种类型的样品(例如，肝脏活检样品和一种或多种其他类型的活检样品)中，MARC1表达、MARC1mRNA、MARC1蛋白、MARC1活性或与MARC1表达调节相关或受MARC1表达调节影响的生物标志物的量或水平或其任何组合降低。
由于其高特异性，本文提供的寡核苷酸(例如，dsRNAi寡核苷酸)特异性地靶向细胞和组织或器官(例如，肝脏中)的靶基因的mRNA(例如，MARC1 mRNA)。在预防疾病时，靶基因可以是疾病开始或维持所需的基因，或者已被鉴定为与患上该疾病的较高风险相关的基因。在治疗疾病时，可以使寡核苷酸与表现出或负责介导疾病的细胞、组织或器官(例如，肝脏)接触。例如，同与MARC1表达相关病症或状况相关的野生型(即，天然)或突变基因的全部或部分基本相同的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以接触或引入感兴趣的细胞或组织类型，如肝细胞或其他肝脏细胞。
与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的实例包括但不限于非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)或代谢综合征。在一些实施方案中，该疾病是NAFLD。在一些实施方案中，该疾病是NASH。在一些实施方案中，该疾病是ASH。
在一些实施方案中，受试者中肝脏脂肪变性的量或水平降低。在一些实施方案中，受试者中肝脏纤维化的量或水平降低。在一些实施方案中，受试者中胆固醇的量或水平降低。在一些实施方案中，受试者中甘油三酯的量或水平降低。在一些实施方案中，受试者中丙氨酸氨基转移酶的量或水平降低。在一些实施方案中，受试者中天冬氨酸氨基转移酶的量或水平降低。在一些实施方案中，受试者中以下各项的任意组合降低或改变：MARC1表达，MARC1 mRNA的量或水平，MARC1蛋白的量或水平，MARC1活性的量或水平，TG的量或水平，胆固醇的量或水平和/或总胆固醇与HDL胆固醇之比，肝脏脂肪变性的量或水平，肝脏纤维化的量或水平，丙氨酸氨基转移酶的量或水平，和天冬氨酸氨基转移酶的量或水平。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的寡核苷酸或包含该寡核苷酸的药物组合物施用至患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该寡核苷酸或药物组合物之前的肝脏纤维化的量或水平相比，该受试者中肝脏纤维化的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中肝脏纤维化的量或水平相比，该受试者中肝脏纤维化的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的寡核苷酸或包含该寡核苷酸的药物组合物施用至患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该寡核苷酸或药物组合物之前的肝脏脂肪变性的量或水平相比，该受试者中肝脏脂肪变性的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中肝脏脂肪变性的量或水平相比，该受试者中肝脏脂肪变性的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的寡核苷酸或包含该寡核苷酸的药物组合物施用至患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该寡核苷酸或药物组合物之前的丙氨酸氨基转移酶的量或水平相比，该受试者中丙氨酸氨基转移酶的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中丙氨酸氨基转移酶的量或水平相比，该受试者中丙氨酸氨基转移酶的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的寡核苷酸或包含该寡核苷酸的药物组合物施用至患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该寡核苷酸或药物组合物之前的天冬氨酸氨基转移酶的量或水平相比，该受试者中天冬氨酸氨基转移酶的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中天冬氨酸氨基转移酶的量或水平相比，该受试者中天冬氨酸氨基转移酶的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的寡核苷酸或包含该寡核苷酸的药物组合物施用至患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该寡核苷酸或药物组合物之前的甘油三酯的量或水平相比，该受试者中甘油三酯的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中甘油三酯的量或水平相比，该受试者中甘油三酯的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在本文方法的一些实施方案中，将本文的寡核苷酸或包含该寡核苷酸的药物组合物施用至患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者，使得与施用该寡核苷酸或药物组合物之前的胆固醇的量或水平相比，该受试者中胆固醇(例如，总胆固醇、LDL胆固醇和/或HDL胆固醇)的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。在一些实施方案中，与未接受所述寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中胆固醇的量或水平相比，该受试者中胆固醇的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或超过99％。
在一些实施方案中，靶基因可以是来自任何哺乳动物的靶基因，如人靶标。任何靶基因可以按照本文所述的方法进行沉默。
本文所述的方法通常涉及向受试者施用有效量的本文寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，即产生或生成期望的治疗结果的量。治疗上可接受的量可以是治疗性地治疗疾病或病症的量。针对任一受试者的适当剂量将取决于某些因素，包括受试者的体型、体表面积、年龄、待施用的组合物、组合物中的活性成分、施用时间和途径、一般健康状况以及同时施用的其他药物。
在一些实施方案中，经肠(例如，口服、通过胃饲管、通过十二指肠饲管、经由胃造口术或经直肠)、肠胃外(例如，皮下注射、静脉内注射或输注、动脉内注射或输注、骨内输注、肌肉内注射、脑内注射、脑室内注射、鞘内)、局部(例如，表皮、吸入、通过滴眼剂或通过粘膜)或通过直接注射到靶器官(例如，受试者的肝脏)中向受试者施用本文的任一种组合物(例如，包含本文所述的RNAi寡核苷酸的组合物)。通常，本文的寡核苷酸经静脉内或皮下施用。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或包含该寡核苷酸的药物组合物单独或联合施用。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸同时、依次(以任何顺序)或间歇地联合施用。例如，两种寡核苷酸可以同时共同施用。或者，可以施用一种寡核苷酸，并在任意时间长度(例如，一小时、一天、一周或一个月)后施用第二寡核苷酸。
在一些实施方案中，待治疗的受试者是人类或非人灵长类动物或其他哺乳动物受试者。其他示例性受试者包括家养动物，如狗和猫；家畜，如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及诸如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠等动物。
试剂盒
在一些实施方案中，本发明提供了包含本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)和使用说明书的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含本文的寡核苷酸，以及包含该试剂盒和/或其任何组分的使用说明的包装插页。在一些实施方案中，该试剂盒在合适的容器中包含本文的寡核苷酸、一种或多种对照，以及各种缓冲液、试剂、酶和本领域公知的其他标准成分。在一些实施方案中，该容器包含至少一个小瓶、孔、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，所述寡核苷酸放置于其中，并且在一些情况下，适当地等分。在提供附加组分的一些实施方案中，该试剂盒包含放置该组分的附加容器。试剂盒还可包括用于容纳寡核苷酸的装置，以及为了商业销售而严密限制的任何其他试剂。这样的容器可以包括其中保留有所需小瓶的注塑或吹塑的塑料容器。这些容器和/或试剂盒可以包括带有使用说明和/或警告的标签。
在一些实施方案中，试剂盒包含本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)，以及药学上可接受的载体，或包含该寡核苷酸的药物组合物以及关于治疗有需要的受试者中与MARC1表达相关的疾病、病症或状况或延迟其进展的说明书。
定义
如本文所用的，术语“反义寡核苷酸”涵盖基于核酸的分子，其具有与全部或部分靶mRNA互补的序列，特别是种子序列，从而能够与mRNA形成双链体。因此，如本文所用的，术语“反义寡核苷酸”可被称为“基于互补核酸的抑制剂”。
如本文所用的，“大约”或“约”当应用于一个或多个感兴趣的值时，是指与规定的参考值类似的值。在某些实施方案中，“约”是指落入规定参考值在任一方向上(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少之内的值范围，除非另有说明或从上下文中可以明显看出(该数字超过可能值的100％的情况除外)。
如本文所用的，“施用”、“给药”及类似用语是指以药理学上有用(例如，治疗受试者的疾病、病症或状况)的方式向受试者提供物质(例如，寡核苷酸)。
如本文所用的，“减弱”、“减轻”及类似用语是指降低或有效阻止。作为非限制性实例，本文的一种或多种治疗可以降低或有效阻止受试者中NAFLD或NASH的发作或进展。这种减弱可以通过以下事实来例证：例如，NAFLD、NASH或ASH的一个或多个方面(例如，症状，组织特征，以及细胞活性、炎症活性或免疫活性，等等)降低，脂肪性肝病的一个或多个方面没有可检测到的进展(恶化)，或者在受试者中没有可检测到的NAFLD、NASH或ASH的方面(而这些方面本来预期是可检测到的)。
如本文所用的，“互补”是指两个核苷酸之间(例如，在两个相对的核酸上或在单条核酸链的相对区域上)的结构关系，其允许这两个核苷酸彼此形成碱基对。例如，与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的一个核酸的嘌呤核苷酸可以通过彼此形成氢键而碱基配对在一起。在一些实施方案中，互补的核苷酸可以以Watson-Crick方式或以允许形成稳定双链体的任何其他方式碱基配对。在一些实施方案中，两个核酸可具有彼此互补的多个核苷酸的区域以形成互补区域，如本文所述。
如本文所用的，“脱氧核糖核苷酸”是指与核糖核苷酸相比，在其戊糖的2’位置处具有氢而不是羟基的核苷酸。经修饰的脱氧核糖核苷酸是具有除2’位置以外的原子的一个或多个修饰或取代的脱氧核糖核苷酸，包括糖、磷酸基团或碱基的修饰或取代，或者它们之中的修饰或取代。
如本文所用的，“双链寡核苷酸”或“ds寡核苷酸”是指基本上呈双链体形式的寡核苷酸。在一些实施方案中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对在共价分离的核酸链的反向平行核苷酸序列之间形成。在一些实施方案中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对在共价连接的核酸链的反向平行核苷酸序列之间形成。在一些实施方案中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对由折叠(例如，通过发夹)的单核酸链形成，以提供碱基配对在一起的互补反向平行核苷酸序列。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含彼此完全形成双链体的两条共价分离的核酸链。然而，在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分形成双链体的两条共价分离的核酸链(例如，在一端或两端具有突出端)。在一些实施方案中，双链寡核苷酸包含部分互补的反向平行核苷酸序列，因此可以具有一个或多个错配，其可以包括内部错配或末端错配。
如本文所用的，关于核酸(例如，寡核苷酸)的“双链体”是指通过两个反向平行核苷酸序列的互补碱基配对而形成的结构。
如本文所用的，“辅料”是指可包含在组合物中的非治疗剂，例如，用以提供或有助于所需的稠度或稳定效果。
如本文所用的，“肝细胞”是指肝脏实质组织的细胞。这些细胞约占肝脏质量的70％-85％，并产生血清白蛋白、FBN和凝血酶原组的凝血因子(因子3和4除外)。肝细胞谱系细胞的标志物包括但不限于运甲状腺素蛋白(Ttr)、谷氨酰胺合成酶(Glul)、肝细胞核因子1a(Hnf1a)和肝细胞核因子4a(Hnf4a)。成熟肝细胞的标志物可包括但不限于细胞色素P450(Cyp3a11)、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)、葡萄糖6-磷酸(G6p)、白蛋白(Alb)和OC2-2F8。参见，例如，Huch等人(2013)NATURE 494:247-50。
如本文所用的，“肝毒性剂”是指本身对肝脏有毒或可被加工形成对肝脏有毒的代谢物的化学化合物、病毒或其他物质。肝毒性剂可包括但不限于四氯化碳(CCl4)、对乙酰氨基酚(扑热息痛)、氯乙烯、砷、氯仿、非甾体抗炎药(如阿司匹林和保泰松)。
如本文所用的，术语“MARC1”是指线粒体偕胺肟还原组分1。MARC1是催化分子的还原反应的蛋白质。“MARC1”还可以指编码该蛋白质的基因。
如本文所用的，“不稳定的连接体”是指可被切割(例如，通过酸性pH)的连接体。“稳定的连接体”是指不能被切割的连接体。
如本文所用的，“肝脏炎症”或“肝炎”是指这样的身体状况，其中肝脏变得肿胀、功能障碍和/或疼痛，尤其是由于损伤或感染，如可能由暴露于肝毒性剂而引起。症状可包括黄疸(皮肤或眼睛发黄)、疲劳、虚弱、恶心、呕吐、食欲减退和体重减轻。肝脏炎症如果不治疗，可进展为纤维化、肝硬化、肝功能衰竭或肝癌。
如本文所用的，“肝纤维化”“肝脏纤维化”或“肝脏的纤维化”是指细胞外基质蛋白在肝脏中的过度积累，细胞外基质蛋白可包括由炎症和肝脏细胞死亡产生的胶原蛋白(I、III和IV)、FBN、粗纤维调节素(undulin)、弹性蛋白、层粘连蛋白、透明质酸和蛋白聚糖。肝纤维化如果不治疗，可进展为肝硬化、肝功能衰竭或肝癌。
如本文所用的，“环”是指核酸(例如，寡核苷酸)的未配对区域，其侧翼为该核酸的两个反向平行区域，这两个区域彼此充分互补，使得在适当的杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中，在细胞中)，位于未配对区域侧翼的这两个反向平行区域杂交形成双链体(称为“茎”)。
如本文所用的，“经修饰的核苷酸间键合”是指与包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键合相比，具有一个或多个化学修饰的核苷酸间键合。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是非天然存在的键合。通常，经修饰的核苷酸间键合赋予其中存在该经修饰的核苷酸间键合的核酸一种或多种期望的性质。例如，经修饰的核苷酸间键合可以改善热稳定性、降解抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所用的，“经修饰的核苷酸”是指与选自腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的相应参考核苷酸相比，具有一个或多个化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸在其糖、核碱基和/或磷酸基团中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有与相应的参考核苷酸缀合的一个或多个化学部分。通常，经修饰的核苷酸赋予其中存在该经修饰的核苷酸的核酸一种或多种期望的性质。例如，经修饰的核苷酸可以改善热稳定性、降解抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所用的，“带缺口的(nicked)四环结构”是指RNAi寡核苷酸的结构，其特征在于单独的有义(过客)链和反义(指导)链，其中有义链具有与反义链互补的互补区域，并且其中至少一条链，通常是有义链，具有被配置为稳定在该至少一条链内形成的相邻茎区的四环。
如本文所用的，“寡核苷酸”是指短核酸(例如，长度短于约100个核苷酸)。寡核苷酸可以是单链的(ss)或ds。寡核苷酸可以具有或不具有双链体区域。作为一组非限制性实例，寡核苷酸可以是但不限于小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、切酶底物干扰RNA(DsiRNA)、反义寡核苷酸、短siRNA或ss siRNA。在一些实施方案中，双链(dsRNA)是RNAi寡核苷酸。
如本文所用的，“突出端”是指末端非碱基配对核苷酸，其由一个链或区域延伸超出与该一个链或区域形成双链体的互补链的末端而产生。在一些实施方案中，突出端包含从寡核苷酸的5’末端或3’末端处的双链体区域延伸的一个或多个未配对的核苷酸。在某些实施方案中，突出端是寡核苷酸的反义链或有义链上的3’-或5’-突出端。
如本文所用的，“磷酸酯类似物”是指模拟磷酸酯基团的静电性质和/或空间性质的化学部分。在一些实施方案中，磷酸酯类似物模拟生物系统中磷酸酯基团的静电性质和/或空间性质。在一些实施方案中，磷酸酯类似物位于寡核苷酸的5’-末端核苷酸处，而不是通常容易被酶促去除的5’-磷酸酯。在一些实施方案中，5’-磷酸酯类似物含有磷酸酶抗性连接。磷酸酯类似物的实例包括但不限于5’-膦酸酯，如5’-亚甲基膦酸酯(5’-MP)和5’-(E)-乙烯基膦酸酯(5’-VP)。在一些实施方案中，寡核苷酸在5’-末端核苷酸处的糖的4’-碳位置处具有磷酸酯类似物(称为“4’-磷酸酯类似物”)。4’-磷酸酯类似物的实例是氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4’-碳处)或其类似物。参见，例如，第2019-0177729号美国专利公开。已经针对寡核苷酸的5’端开发了其他修饰(参见，例如，第WO 2011/133871号国际专利申请；第8，927，513号美国专利；和Prakash等人(2015)NUCLEIC ACIDS RES.43：2993-3011)。
如本文所用的，基因(例如，MARC1)的“表达降低”是指与适当的参考(例如，参考细胞、细胞群体、样品或受试者)相比，细胞、细胞群体、样品或受试者中RNA转录物(例如，MARC1 mRNA)或由该基因编码的蛋白质的量或水平降低，和/或该基因的活性的量或水平降低。例如，与未用本文的寡核苷酸处理的细胞相比，使细胞与该寡核苷酸(例如，包含反义链的寡核苷酸，该反义链具有与包含MARC1 mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列)接触的行为可以导致MARC1 mRNA、蛋白质和/或活性的量或水平降低(例如，经由通过RNAi途径对MARC1 mRNA的降解)。类似地，并且如本文所用的，“降低表达”是指导致基因(例如，MARC1)的表达降低的行为。
如本文所用的，“MARC1表达的降低”是指与适当的参考(例如，参考细胞、细胞群体、样品或受试者)相比，细胞、细胞群体、样品或受试者中MARC1 mRNA、MARC1蛋白和/或MARC1活性的量或水平的降低。
如本文所用的，“互补区域”是指核酸(例如，寡核苷酸)的核苷酸序列，其与反向平行核苷酸序列充分互补，以允许这两个核苷酸序列在适当的杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中、在细胞中等)杂交。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含具有与mRNA靶序列互补的互补区域的靶向序列。
如本文所用的，“核糖核苷酸”是指具有核糖作为其戊糖的核苷酸，其在其2’位置处含有羟基。经修饰的核糖核苷酸是具有除2’位置以外的原子的一个或多个修饰或取代的核糖核苷酸，包括核糖、磷酸基团或碱基的修饰或取代，或者它们之中的修饰或取代。
如本文所用的，“RNAi寡核苷酸”是指(a)具有有义(过客)链和反义(指导)链的双链寡核苷酸，其中反义链或反义链的一部分被Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶在靶mRNA(例如，MARC1 mRNA)的切割中使用，或者(b)具有单反义链的单链寡核苷酸，其中该反义链(或该反义链的一部分)被Ago2核酸内切酶在靶mRNA(例如，MARC1 mRNA)的切割中使用。
如本文所用的，“链”是指通过核苷酸间键合(例如，磷酸二酯键或硫代磷酸酯键)连接在一起的单个、连续的核苷酸序列。在一些实施方案中，链具有两个游离端(例如，5’端和3’端)。
如本文所用的，“受试者”是指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人。在一个实施方案中，受试者是人或NHP。此外，“个体”或“患者”可以与“受试者”互换使用。
如本文所用的，“合成的”是指(例如，使用机器(例如，固态核酸合成仪))人工合成的或另外并非源自通常产生该分子的天然来源(例如，细胞或生物体)的核酸或其他分子。
如本文所用的，“靶向配体”是指这样的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)：其选择性地结合感兴趣的组织或细胞的同源分子(例如，受体)，并且可与另一种物质缀合以便将该另一种物质靶向至感兴趣的组织或细胞。例如，在一些实施方案中，靶向配体可以与寡核苷酸缀合，以便将该寡核苷酸靶向至特定感兴趣的组织或细胞。在一些实施方案中，靶向配体选择性地结合细胞表面受体。因此，在一些实施方案中，当靶向配体与寡核苷酸缀合时，通过与细胞表面上表达的受体的选择性结合和细胞对包含该寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物的内体内化，促进该寡核苷酸向特定细胞中的递送。在一些实施方案中，靶向配体经由连接体与寡核苷酸缀合，该连接体在细胞内化之后或期间被切割，使得该寡核苷酸在细胞中从靶向配体上释放。在一些实施方案中，靶向配体包含至少一个GalNAc部分并且靶向肝脏和人类肝脏细胞(例如，人类肝细胞)。
如本文所用的，“四环”是指增加通过核苷酸侧翼序列杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。稳定性的增加可检测为相邻茎双链体的解链温度(Tm)的增加，该Tm高于由随机选择的核苷酸序列组成的一组相当长度的环平均预期的相邻茎双链体的Tm。例如，四环可以赋予包含长度至少为2个碱基对(bp)的双链体的发夹在10mM Na2HPO4中至少约50℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约58℃、至少约60℃、至少约65℃或至少约75℃的Tm。在一些实施方案中，四环可以赋予包含长度至少为2个碱基对(bp)的双链体的发夹在10mM NaH2PO4中至少约50℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约58℃、至少约60℃、至少约65℃或至少约75℃的Tm。在一些实施方案中，四环可以通过堆积相互作用稳定相邻茎双链体中的bp。另外，四环中核苷酸之间的相互作用包括但不限于非Watson-Crick碱基配对、堆积相互作用、氢键键合和接触相互作用(Cheong等人(1990)NATURE 346：680-82；Heus&Pardi(1991)SCIENCE253：191-94)。在一些实施方案中，四环包含3至6个核苷酸或由3至6个核苷酸组成，并且通常为4至5个核苷酸。在某些实施方案中，四环包含3、4、5或6个核苷酸或由3、4、5或6个核苷酸组成，其可以被修饰或可以未被修饰(例如，其可以与靶向部分缀合或可以不与靶向部分缀合)。在一个实施方案中，四环由4个核苷酸组成。任何核苷酸都可以在四环中使用，并且此类核苷酸的标准IUPAC-IUB符号可以如Cornish-Bowden(1985)NUCLEIC ACIDS RES.13：3021-30中所述使用。例如，字母“N”可以用来表示任何碱基可以在该位置，字母“R”可以用来表示A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可以在该位置，而“B”可以用来表示C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)可以在该位置。四环的实例包括UNCG家族的四环(例如，UUCG)、6NRA家族的四环(例如，GAAA)和CUUG四环(Woese等人(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87：8467-71；Antao等人(1991)NUCLEIC ACIDS RES.19：5901-05)。DNA四环的实例包括d(GNNA)家族的四环(例如，d(GTTA))、d(GNRA)家族的四环、d(GNAB)家族的四环、d(CNNG)家族的四环和d(TNCG)家族的四环(例如，d(TTCG))。参见，例如，Nakano等人(2002)BIOCHEM.41：14281-92；Shinji等人(2000)NIPPONKAGAKKAI KOEN YOKOSHU 78：731。在一些实施方案中，四环被包含在带缺口的四环结构内。
如本文所用的，“治疗”或“处理”是指向有需要的受试者提供医护的行为，例如，通过向受试者施用治疗剂(例如，本文的寡核苷酸)，以供改善受试者关于现有状况(例如，疾病、病症)的健康和/或福祉，或者预防或降低发生状况的可能性。在一些实施方案中，治疗涉及降低受试者所经历的状况(例如，疾病、病症)的至少一种体征、症状或促成因素的频率或严重程度。
实施例
虽然已经参考以下实施例中阐述的具体实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以做出各种改变，并且可以替代等同物。此外，以下实施例以示例的方式提供，而并非旨在以任何方式限制本发明的范围。另外，可以进行修改以使情况、材料、物质的组成、过程、一个或多个过程步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都旨在处于本发明的范围内。使用了本领域公知的标准技术或下面具体描述的技术。
实施例1：双链RNAi寡核苷酸的制备
寡核苷酸合成和纯化
在先前实施例中描述的双链RNAi(dsRNA)寡核苷酸使用本文所述的方法来化学合成。一般而言，除了使用已知的亚磷酰胺合成(参见，例如，Hughes和Fllington(2017)ColdSpring Harb Perspect Biol.9(1)：a023812；Beaucage S.L.，Caruthers M.H.Studies onNucleotide Chemistry V：Deoxynucleoside Phosphoramidites-A New Class of KeyIntermediates for Deoxypolynucleotide Synthesis.Tetrahedron Lett.1981；22：1859-1862.doi：10.1016/S0040-4039(01)90461-7)之外，还使用针对19-23聚体siRNA描述的固相寡核苷酸合成方法(参见，例如，Scaringe等人(1990)Nucleic AcidsRes.18：5433-5441以及Usman等人(1987)J.Am.Chem.Soc.109：7845-7845；另见，第5,804,683、5,831,071、5,998,203、6,008,400、6,111,086、6,117,657、6,353,098、6,362,323、6,437,117和6,469,158号美国专利)合成dsRNAi寡核苷酸。将具有19聚体核心序列的dsRNAi寡核苷酸格式化为具有25聚体有义链和27聚体反义链的构建体，以允许通过RNAi机器进行加工。19聚体核心序列与MARC1 mRNA中的区域互补。
按照标准方法(Integrated DNA Technologies；Coralville，IA)合成各条RNA链并进行HPLC纯化。例如，使用固相亚磷酰胺化学法合成RNA寡核苷酸，使用标准技术(Damha&Olgivie(1993)Methods Mol.Biol.20：81-114；Wincott等人(1995)Nucleic AcidsRes.23：2677-2684)在NAP-5柱(Amersham Pharmacia Biotech；Piscataway，NJ)上脱保护并脱盐。使用离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)在Amersham Source 15Q柱(1.0cm×25cm；Amersham Pharmacia Biotech)上使用15min步进线性梯度纯化寡聚体。梯度从90∶10缓冲液A∶B到52∶48缓冲液A∶B变化，其中缓冲液A为100mM Tris pH 8.5，而缓冲液B为100mMTris pH 8.5，1M NaCl。在260nm处监测样品，并且将对应于全长寡核苷酸种类的峰收集、合并、在NAP-5柱上脱盐并冻干。单链RNA寡聚体冻干储存或于-80℃储存在无核酸酶水中。
在Beckman PACE 5000(Beckman Coulter，Inc.；Fullerton，CA)上通过毛细管电泳(CE)测定每种寡聚体的纯度。CE毛细管的内径为100μm，并含有ssDNA 100R Gel(Beckman-Coulter))。通常，将约0.6nmol的寡核苷酸注入毛细管中，在444V/cm的电场中运行，并根据260nm处的UV吸光度进行检测。变性Tris-硼酸盐-7M-尿素电泳缓冲液购自Beckman-Coulter。获得了寡核糖核苷酸，经CE评估其纯度至少为90％，用于以下描述的实验中。在Voyager DETM Biospectometry WorkStation(Applied Biosystems；Foster City，CA)上，按照制造商推荐的方案，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法验证化合物身份。获得了所有寡聚体的相对分子质量，通常在预期分子质量的0.2％以内。
双链体的制备
将单链RNA寡聚体重悬(例如，以100μM浓度)于由100mM乙酸钾、30mM HEPES组成的双链体缓冲液(pH 7.5)中。将互补的有义链和反义链以等摩尔量混合，以产生例如50μM双链体的最终溶液。将样品在RNA缓冲液(Integrated DNA Technologies(IDT))中加热至100℃持续5分钟，并在使用前冷却至室温。dsRNA寡核苷酸储存于-20℃。
实施例2：靶向MARC1的双链RNAi寡核苷酸的生成
MARC1 mRNA靶序列的鉴定
MARC1是参与催化N-氧化分子的酶。为了生成针对MARC1表达的RNAi寡核苷酸抑制剂，使用基于计算机的算法通过计算确定适合测定通过RNAi途径对MARC1表达的抑制的MARC1 mRNA靶序列。该算法提供RNAi寡核苷酸指导(反义)链序列，每个序列都具有与人MARC1 mRNA(例如，SEQ ID NO：1692；表1)的合适的MARC1靶序列互补的互补区域。通过该算法确定的一些指导链序列还与猴MARC1 mRNA(SEQ ID NO：1693，表1)的相应MARC1靶序列互补。包含与具有核苷酸序列相似性的同源MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域的MARC1 RNAi寡核苷酸预计具有靶向同源MARC1 mRNA的能力。
表1：人和猴MARC1 mRNA的序列
| 物种 | 参考序列# | SEQ ID NO |
| 人(Hs) | NM_022746.4 | 1692 |
| 食蟹猴(Mf) | XM_005540898.2 | 1693 |
如实施例1中所述生成RNAi寡核苷酸(格式化为DsiRNA寡核苷酸)用于体外评价。每个DsiRNA均以相同的修饰模式生成，并且每个都具有独特的指导链，该指导链具有与SEQID NO：1-384表示的MARC1靶序列互补的互补区域。有义和反义DsiRNA的修饰包括以下(X＝任何核苷酸；m＝2’-O-甲基修饰的核苷酸；r＝核糖基修饰的核苷酸)：
有义链：
反义链：
基于细胞的体外试验
使用基于细胞的体外试验测量表2中每种经修饰的DsiRNA减少MARC1 mRNA的能力。简言之，在多孔细胞培养板的单独孔中用表2中列出的每种DsiRNA以1nM转染表达内源人MARC1基因的人肝细胞(Huh7)。用经修饰的DsiRNA转染后，将细胞保持24小时，然后使用基于的qPCR测定来确定经转染的细胞中剩余MARC1 mRNA的量。使用两个qPCR测定——3’测定(正向-(SEQ ID NO：1684)，反向-(SEQ ID NO：1685)，探针-/56-FAM/AAAGGTGC T/Zen/CAGGAGGATGGTTGT/3IABkFQ(SEQ ID NO：1694))和5’测定(正向-(SEQ ID NO：1686)，反向-(SEQ ID NO：1687)，探针-/56-FAM/TCAAAACGC/ZEN/CCACCACAAATGCA/3IABkFQ(SEQ ID NO：1695))——测定MARC1 mRNA水平，如使用与6-羧基-荧光素(FAM)缀合的PCR探针测量，并相对于HPRT管家基因进行归一化(正向-(SEQ ID NO：1688)，反向-(SEQ ID NO：1689)；探针-5HEX/ATGGTCAAG/ZEN/GTCGCAAGCTTGCTGGT/31ABkFQ/-3’(SEQ ID NO：1696)。对每个引物对测定剩余RNA百分比，如表2和图1中所示。与模拟转染的细胞相比，导致DsiRNA转染的细胞中剩余的MARC1 mRNA少于或等于10％的DsiRNA被认为是DsiRNA“命中”。评价表2中列出的DsiRNA抑制MARC1表达的能力的基于Huh7细胞的试验鉴定了数种候选DsiRNA。
总而言之，这些结果表明，设计用于靶向人MARC1 mRNA的DsiRNA抑制细胞中的MARC1表达，如通过DsiRNA转染的细胞中相对于对照细胞中MARC1 mRNA的减少量所确定的。这些结果证明，包含DsiRNA的核苷酸序列可用于生成RNAi寡核苷酸以抑制MARC1表达。此外，这些结果证明，多个MARC1mRNA靶序列适合RNAi介导的MARC1表达的抑制。
表2.Huh7细胞中MARC1 mRNA的分析
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实施例3：MARC1的体内RNAi寡核苷酸抑制
实施例2中的体外筛选试验验证了靶向MARC1的寡核苷酸敲减靶mRNA的能力。为了确认RNAi寡核苷酸在体内敲减MARC1的能力，使用了HDI小鼠模型。使用在实施例2中确定的DsiRNA的子集来生成相应的双链RNAi寡核苷酸，所述双链RNAi寡核苷酸包含带缺口的四环GalNAc缀合结构(本文中称为“GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸”或“GalNAc-MARC1寡核苷酸”)，具有36-聚体过客链和22-聚体指导链(表4)。此外，包含过客链和指导链的核苷酸序列具有不同模式的经修饰的核苷酸和硫代磷酸酯键(有义链SEQ ID NO：1609-1642；反义链SEQ ID NO：1645-1678)。构成四环的核苷酸中的三个各自缀合至GalNAc部分(CAS#14131-60-3)。每条链的修饰模式如下所示：
有义链：
5’-mX-S-mX-mX-mX-mX-mX-mX-fX-fX-fX-fX[-mX-]16-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3’。
杂交至：
反义链：
5’-[MePhosphonate-4O-mX]-S-fX-S-fX-S-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-S-mX-S-mX-3’。
或者，表示为：
有义链：[mXs][mX][mX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][fX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mX][mX][mX][mX][mX][mX]
杂交至：
反义链：[MePhosphonate-40-mXs][fXs][fXs][fX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][mX][mX][mX][mX][mXs][mXs][mX]
(修饰关键词：表3)。
在被工程改造为在小鼠肝脏的肝细胞中瞬时表达人MARC1 mRNA的小鼠中评价表4中的寡核苷酸。简言之，以2mg/kg的剂量向6-8周龄雌性CD-1小鼠(n＝4-5)皮下施用在PBS中配制的所示Ga1NAc缀合的MARC1寡核苷酸。对照组小鼠(n＝5)仅施用PBS。三天后(72小时)，对小鼠HDI编码在普遍存在的巨细胞病毒(CMV)启动子序列控制下的完全人MARC1基因(SEQ ID NO：1682)的DNA质粒(25μg)。引入DNA质粒后一天，收集HDI小鼠的肝脏样品。如实施例2中所述，对从这些HDI小鼠获得的总RNA进行qRT-PCR分析以确定MARC1 mRNA水平。测量人mRNA的mRNA水平。使用DNA质粒上包含的NeoR基因将这些值对转染效率进行归一化。
表4.用于HDI筛选的GalNAc缀合的MARC1 RNAi寡核苷酸
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图2中的结果证明，设计用于靶向人MARC1 mRNA的GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸抑制HDI小鼠中的人MARC1 mRNA表达，如通过相对于仅用PBS处理的对照HDI小鼠，来自用GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸处理的HDI小鼠的肝脏样品中人MARC1 mRNA表达量的减少所确定的。
使用从表4选择的寡核苷酸，在如图3所示的重复试验中进一步验证了图2中测试的GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸的子集。这些试验验证了每种GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸的敲减效率，并选择了四种寡核苷酸进行进一步分析。
具体而言，使用四种GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸(MARCl-0736、MARC1-965、MARC1-1983和MARC1-2016)进行了给药研究。如上所述对小鼠进行HDI，并用0.1mg/kg、0.3mg/kg或1mg/kg的寡核苷酸进行处理。一天后收集肝脏，并测量MARC1表达以确定有效剂量(图4)。所有GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸在1mg/kg剂量下都能够降低MARC1表达。总体而言，HDI研究鉴定了数种潜在的GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸，以用于抑制肝脏中的MARC1表达。
实施例4：DIO-NASH疾病模型中MARC1的RNAi寡核苷酸抑制
为了研究GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸对诸如NAFLD和NASH等肝脏疾病的治疗效果，使用了饮食诱导的肥胖(DIO)-NASH模型(Kristiansen，M.等人，2016.WJH.8(16)：673-684)。该模型表现出与NASH类似的组织病理学和临床终点，并通过高脂肪、果糖和胆固醇饮食启动。在该NASH鼠模型中测试了两种具有不同敲减水平的小鼠特异性替代GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸(表5B)。给小鼠饲喂Lean Chow(11％脂肪、24％蛋白质和65％碳水化合物；Altromin 1324，Brogaarden，丹麦)，或由40％脂肪、22％果糖和2％胆固醇组成的NASH饮食(D09100310，Research Diets)36周(DIO-NASH)。在用寡核苷酸和GLP-1受体激动剂治疗之前，根据通过Collal(即胶原蛋白)水平(数据未示出)确定的其纤维化状态将小鼠随机分组至食物对照、PBS对照、GLP-1‘22’、MARC1-1113(SEQ ID NO：1643和1679)和MARC1-1575(SEQID NO：1644和1680)治疗组。在第36周开始每周同时皮下给药，并用3mg/kg的MARC1-1113、3mg/kg的MARC1-1575、10nmol/kg的GLP-1‘22’或PBS对照(“DIO-NASH媒介物”)治疗小鼠持续8周。GLP-1受体激动剂(GLP-1‘22’)是一种长效GLP-1受体激动剂，在这些研究中用作基准。研究开始后第0、7、14、21、28、35、42和49天(即DIO-NASH或Lean Chow饮食的第36周)给予注射。DIO-NASH媒介物对照、MARC1-1113和MARC1-1575小鼠在整个研究期间以相似的步调增加其相对体重(表5A)。正如预期的那样，Lean-Chow显示出较慢的体重增加速度，而GLP-1‘22’对照与研究开始时相比显示出相对体重下降。
表5A提供了在饮食诱导的肥胖(DIO)-NASH模型中，在用靶向小鼠MARC1的GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸或长效GLP-1受体激动剂(GLP-1‘22’)治疗的整个过程中小鼠的体重，GLP-1‘22’用作疾病消退的阳性对照。体重是相对于起始体重而言的。给小鼠饲喂DIO-NASH(AMLN饮食)或Lean-Chow饮食。
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给药第8周后，采集血浆并分析血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)。该模型的表现符合预期，如通过GLP-1‘22’对照降低ALT、AST和TC水平所测量的。与PBS处理的DIO-NASH小鼠相比，用GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸治疗DIO-NASH小鼠没有改变血浆ALT、AST、TG或TC水平(数据未示出)。第8周时收集肝脏组织、称重并进行处理以供分析。正如预期的那样，与NASH媒介物组相比，在研究结束时，用GLP-1‘22’治疗的Lean Chow小鼠和DIO-NASH小鼠的肝脏重量均较低。然而，在用媒介物对照或GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸治疗的DIO-NASH小鼠中没有观察到肝脏重量的差异(数据未示出)。与DIO-NASH媒介物对照相比，在MARC1-1113和MARC1-1575治疗的小鼠中，肝脏中的TG水平均降低(图5和图6)。进一步测量了NAFLD活动性。NAFLD活动性评分用于衡量与NAFLD治疗同时发生的疾病特征的变化，并且通过对肝脏样品进行染色并使用Kleiner等人概述的临床标准(Kleiner等人，2005.Hepa tology.41：1313-1321)确定该评分来测量。MARC1-1113寡核苷酸在DIO-NASH模型中表现出改善的NAFLD评分(图7)。类似地，用MARC1-1113寡核苷酸治疗减少了动物中的脂肪变性(计算为具有脂滴的肝细胞的百分比)(图8)，但没有观察到肝细胞气球样变或小叶炎症的减少(数据未示出)，如通过Kleiner等人描述的组织病理学分析所确定的。在MARC1-1113治疗的小鼠中观察到减少的脂肪变性分数(即组织学样品中脂肪变性的测量面积分数)和具有脂滴的肝细胞，如使用Kleiner等人描述的方法通过组织病理学分析的定量所确定的(图9A和图9B)。炎症和纤维化似乎不会随着治疗而改变，因为在治疗组之间没有观察到炎症细胞数目、炎症灶、CD45、CD11b、纤维化、门静脉周围纤维化、肝窦纤维化或Colla的差异(数据未示出)。然而，通过MARC1-1113治疗减少了星状细胞活化标志物α-SMA(肝纤维化的早期指标)，证明虽然没有观察到总体纤维化的减少，但用MARC1-1113治疗减轻了纤维化的发展(图10)。最后，对一组与MARC1表达、脂肪变性、胆固醇代谢、纤维化、磷脂酰胆碱和潜在生物标志物相关的基因进行了qPCR(表5B)。在MARC1-1113治疗后，观察到数种脂肪变性相关基因的表达降低：Fasn、AcacA、AcacB和ApoB。另外，在MARC1-1113治疗后，也观察到数种纤维化的早期调节物和潜在生物标志物基因的减少，包括：Colla1、Tgfb、Timp1、Mmp9、Mmp2和Fabp1。这些发现证明，MARCl抑制减少了调节脂肪变性和纤维化发展的基因。
总之，DIO-NASH研究证明了使用GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸抑制肝MARC1的治疗效果。
表5B：MARC1治疗的DIO-NASH小鼠中基因表达的总结
实施例5-NHP中MARC1表达的RNAi寡核苷酸抑制和研究
对HDI小鼠研究中鉴定的有效GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸测定了其在NHP中的靶向效率。具体而言，在非幼稚食蟹猴(Macaca fascicularis)中评价了表6中列出的GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸。在该研究中，将猴子分组，使得其平均体重(约2.5kg)在对照组与实验组之间可比。每个队列包含全部雄性受试者。在研究第0、28、54和86天，以1mg/kg或4mg/kg的剂量皮下施用GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸。如图11中的研究方案所示，在给药前两周(第-14天)、给药日(第1天)以及给药后第15、29、57和113天采集血液样品。在研究第-13、27、55和111天采集超声引导的芯针肝脏活检物。在每个时间点，对来自肝脏活检样品的总RNA进行qRT-PCR分析，以测量用寡核苷酸处理的猴子中相对于用相当体积的PBS处理的猴子中的MARC1 mRNA。为了对数据进行归一化，相对于参考基因PPIB进行了测量。使用从IDT购买的以下SYBR测定材料来评价MARC1基因表达：正向-SEQ ID NO：1690，反向-SEQ ID NO：1691。使用从ThermoFisher Scientific购买的以下TaqMan qPCR探针来评价PPIB基因表达：Rh02802984ml。用表6中列出的GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸处理NHP抑制了肝脏中的MARC1表达，如相对于用PBS处理的NHP，来自用寡核苷酸处理的NHP的肝脏样品中MARC1mRNA量的减少(表7)所确定的。
表6.用于NHP研究的单剂量GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸
| 名称 | 有义链(SEQ ID No) | 反义链(SEQ ID NO) |
| MARC1-0736 | 1615 | 1651 |
| MARC1-0965 | 1632 | 1668 |
| MARC1-1983 | 1640 | 1676 |
| MARC1-2016 | 1625 | 1661 |
表7提供了用GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸处理后剩余的NHP MARC1 mRNA的百分比(％)。根据图11中所示的给药方案，以1mg/kg或4mg/kg用四剂所示寡核苷酸处理NHP。在所示天数(第0、28、56和112天)采集的肝脏中测定肝脏中剩余mRNA的百分比(％)。在处理组之间没有观察到体重差异。
表7.来自寡核苷酸处理的NHP的肝脏样品中的MARC1 mRNA
在第27、55和111天测量与磷脂酰胆碱代谢相关的基因表达(DGAT1、DGAT2、MTTP、APOB、CHKA、CHKB、PCYT1A、CEPT1、PEMT、PCYT2、ETNK、FMO3、ACC2、FASN和FABP)，显示在PBS和GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸处理的NHP之间没有变化(数据未示出)。在第14、29、57和113天测量循环脂质，在PBS和GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸处理的NHP之间没有观察到TG、胆固醇、LDLc、HDLc或ApoB100的差异(数据未示出)。类似地，也没有观察到肝酶的差异，包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)或γ-谷氨酰转移酶(GGT)(数据未示出)。
总而言之，这些结果表明，设计用于靶向人MARC1 mRNA的GalNAc缀合的MARC1寡核苷酸抑制肝脏中的体内MARC1表达(如通过肝脏MARC1 mRNA量的减少所确定的)。
实施例6-在体外减少MARC1 mRNA对脂质积累的影响
使用原代人肝细胞(PHH)在体外评估了通过减少MARC1 mRNA对脂质积累的影响。
简而之，使用长期维持培养基(Xiang等人，Science 364，399-402，2019)将表达内源人MARC1基因的PHH培养27天。在25个单独的实验中总共使用了7个PHH供体。
第7天，用30nM Dharmacon ON-TARGET加人MARC1siRNA(L-019358-02-0010)或非靶向siRNA(D-001810-10-20)转染PHH。第24天，用0或800μM的BSA缀合的游离脂肪酸(FFA)混合物处理细胞，该混合物由油酸、亚油酸、α亚油酸和棕榈酸组成。第27天，收获细胞以获取mRNA或用4％甲醛固定细胞。
通过qRT-PCR测定MARC1(TaqManTM Gene Expression Assays#4331182，Hs00224227_m1)和管家基因TBP(Hs00427620_m1)的表达水平。与非靶向siRNA相比，MARC1siRNA减少了MARC1 mRNA，在0和800μM FFA处理后分别剩余平均18％和14％的MARC1 mRNA(表8)。
使用尼罗红对固定的细胞进行染色以量化脂质积累(Diaz等人，Micron 39，819-824，2008)。通过中性脂质荧光(540-15nm/600-20nm)除以磷脂荧光(540-15nm/640-20nm)来计算尼罗红比率。为了对实验间的数据进行归一化，使用以下方程式将非靶向siRNA值设置为0％(对于0μM FFA处理)和100％(对于800μM FFA处理)：脂质积累的百分比＝((尼罗红比率x-尼罗红比率非靶向0μM FFA)/(尼罗红比率非靶向800μM FFA-尼罗红比率非靶向0μM FFA))x100。
在表8中，脂质积累和MARC1 RNA显示为在用MARC1 siRNA转染并用0或800μM FFA处理后，在25个独立实验中，在7个PHH供体中剩余的百分比。0μM时的非靶向对照值被设置为0％，而800μM时的非靶向对照值被设置为100％。双向ANOVA分析证明了显著的脂肪和siRNA主效应。**通过Sidak多重比较检验，与脂肪处理内的非靶向siRNA相比，p＜0.01。n/a＝由于RNA分离不成功而无法获得值。
与非靶向siRNA相比，MARC1 siRNA在0和800μM FFA下分别将脂质积累显著(p＜0.01)减少了27％和35％(表8)。结论是，MARC1的敲减显著降低了经培养的PHH中基础和FFA诱导的脂质积累。
表8：MARC1 siRNA对PHH中的脂质积累和mRNA的影响。
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序列表
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实施方案列表
1.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
2.实施方案1的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的长度为15至50个核苷酸。
3.实施方案1或2的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的长度为18至36个核苷酸。
4.实施方案1至3中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链的长度为15至30个核苷酸。
5.实施方案1至4中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链的长度为22个核苷酸，并且其中反义链和所述有义链形成长度为至少19个核苷酸、任选地长度为至少20个核苷酸的双链体区域。
6.实施方案1至5中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述互补区域的长度为至少19个连续核苷酸，任选地长度为至少20个核苷酸。
7.实施方案1至6中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的3’端包含表示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环。
8.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含反义链和长度为15至50个核苷酸的有义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
9.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为15至50个核苷酸的有义链和长度为15至30个核苷酸的反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
10.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含反义链和长度为15至50个核苷酸的有义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为19个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
11.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含反义链和长度为18至36个核苷酸的有义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为19个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
12.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为18至36个核苷酸的有义链和长度为22个核苷酸的反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为19个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
13.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为18至36个核苷酸的有义链和长度为22个核苷酸的反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述有义链的3’端包含表示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为19个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
14.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为36个核苷酸的有义链和长度为22个核苷酸的反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述有义链的3’端包含表示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为19个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
15.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为36个核苷酸的有义链和长度为22个核苷酸的反义链，其中所述有义链和所述反义链形成长度为至少19个核苷酸、任选地长度为20个核苷酸的双链体区域，其中所述有义链的3’端包含表示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为19个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
16.用于降低MARC1表达的双链RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含：
(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有与MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域选自SEQ ID NO：385-768，以及
(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与所述反义链互补的互补区域，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在所述反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
17.实施方案16的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的3’端包含表示为S1-L-S2的茎-环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环。
18.实施方案7和13-17中任一项的RNAi寡核苷酸，其中L为三环或四环。
19.实施方案18的RNAi寡核苷酸，其中L为四环。
20.实施方案19的RNAi寡核苷酸，其中所述四环包含序列5’-GAAA-3’。
21.实施方案18-20中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述S1和S2的长度为1-10个核苷酸并且具有相同的长度。
22.实施方案21的RNAi寡核苷酸，其中S1和S2的长度为1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸或10个核苷酸。
23.实施方案22的RNAi寡核苷酸，其中S1和S2的长度为6个核苷酸。
24.实施方案18至23中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述茎-环包含序列5’-GCAGCCGAAAGGCUGC-3’(SEQ ID NO:1681)。
25.实施方案1-24中任一项的RNAi寡核苷酸，其包含带缺口的四环结构。
26.实施方案1-24中任一项的RNAi寡核苷酸，其在有义链的3’末端与反义链的5’末端之间包含缺口。
27.实施方案1-26中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链和有义链不共价连接。
28.实施方案1至15和17-27中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链在3’末端包含长度为一个或多个核苷酸的突出端序列。
29.实施方案16-28中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述突出端包含嘌呤核苷酸。
30.实施方案29的RNAi寡核苷酸，其中所述3’-突出端序列的长度为2个核苷酸。
31.实施方案30的RNAi寡核苷酸，其中所述3’-突出端选自AA、GG、AG和GA。
32.实施方案31的RNAi寡核苷酸，其中所述突出端是GG或AA。
33.实施方案31的RNAi寡核苷酸，其中所述突出端是GG。
34.前述实施方案中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
35.实施方案34的RNAi寡核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸包含2’-修饰。
36.实施方案35的RNAi寡核苷酸，其中所述2’-修饰是选自2’-氨基乙基、2’-氟代、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸的修饰。
37.实施方案34至36中任一项的RNAi寡核苷酸，其中构成所述寡核苷酸的所有核苷酸均被修饰，任选地其中所述修饰是选自2’-氟代和2’-O-甲基的2’-修饰。
38.实施方案34-37中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的约10-15％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的核苷酸包含2’-氟代修饰。
39.实施方案34-38中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链的约25-35％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的核苷酸包含2’-氟代修饰。
40.实施方案34-39中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的约25-35％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的核苷酸包含2’-氟代修饰。
41.实施方案34-40中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含从5’至3’为位置1-36的36个核苷酸，其中位置8-11包含2’-氟代修饰。
42.实施方案34-41中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链包含从5’至3’为位置1-22的22个核苷酸，并且其中位置2、3、4、5、7、10和14包含2’-氟代修饰。
43.实施方案34-42中任一项的RNAi寡核苷酸，其中其余的核苷酸包含2’-O-甲基修饰。
44.前述实施方案中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键合。
45.实施方案44的RNAi寡核苷酸，其中所述至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键。
46.实施方案45的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链(i)在位置1与2之间以及位置2与3之间；或(ii)在位置1与2之间、位置2与3之间以及位置3与4之间包含硫代磷酸酯键，其中位置从5’至3’被编号为1-4。
47.实施方案45或64的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链的长度为22个核苷酸，并且其中所述反义链在位置20与21之间以及位置21与22之间包含硫代磷酸酯键，其中位置从5’至3’被编号为1-22。
48.实施方案1-47中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链在5’末端包含磷酸化核苷酸，其中所述磷酸化核苷酸选自尿苷和腺苷。
49.实施方案48的RNAi寡核苷酸，其中所述磷酸化核苷酸是尿苷。
50.前述实施方案中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链的5’-核苷酸的糖的4’-碳包含磷酸酯类似物。
51.实施方案50的RNAi寡核苷酸，其中所述磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯，任选地其中所述磷酸酯类似物是包含5’-甲氧基膦酸酯-4’-氧基的4’-磷酸酯类似物。
52.前述实施方案中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一个核苷酸与一个或多个靶向配体缀合。
53.实施方案42的RNAi寡核苷酸，其中每个靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质。
54.实施方案17-53中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述茎环包含与该茎环的一个或多个核苷酸缀合的一个或多个靶向配体。
55.实施方案54的RNAi寡核苷酸，其中所述一个或多个靶向配体与所述环的一个或多个核苷酸缀合。
56.实施方案55的RNAi寡核苷酸，其中所述环包含从5’至3’编号为1-4的4个核苷酸，其中位置2、3和4的核苷酸各自包含一个或多个靶向配体，其中所述靶向配体相同或不同。
57.实施方案52-56中任一项的RNAi寡核苷酸，其中每个靶向配体包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
58.实施方案57的RNAi寡核苷酸，其中所述GalNAc部分是单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。
59.实施方案17至58中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述茎-环的L的至多4个核苷酸各自与单价GalNAc部分缀合。
60.实施方案1-59中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述互补区域在所述反义链的核苷酸位置2-8处与所述MARC1 mRNA靶序列完全互补，其中核苷酸位置从5’至3’编号。
61.实施方案1-59中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述互补区域在所述反义链的核苷酸位置2-11处与所述MARC1 mRNA靶序列完全互补，其中核苷酸位置从5’至3’编号。
62.实施方案1至61中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含SEQ ID NO:1537-1570中任一者的核苷酸序列。
63.实施方案1至62中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链包含SEQ ID NO:1573-1606中任一者的核苷酸序列。
64.实施方案1至63中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO：1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO：1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO：1570和1606。
65.实施方案1至64中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含SEQ ID NO：1543所示的核苷酸序列，其中所述反义链包含SEQ ID NO：1579所示的核苷酸序列。
66.实施方案1至64中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含SEQ ID NO：1560所示的核苷酸序列，其中所述反义链包含SEQ ID NO：1596所示的核苷酸序列。
67.实施方案1至64中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含SEQ ID NO：1568所示的核苷酸序列，其中所述反义链包含SEQ ID NO：1604所示的核苷酸序列。
68.实施方案1至64中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含SEQ ID NO：1553所示的核苷酸序列，其中所述反义链包含SEQ ID NO：1589所示的核苷酸序列。
69.实施方案1-61中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链的长度为22个核苷酸。
70.实施方案69的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链包含选自SEQ ID NO：1579、1596、1604和1589的核苷酸序列。
71.实施方案1-61和69-70中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含选自SEQ ID NO：234、298、356和376的核苷酸序列。
72.实施方案1-61和69-71中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的长度为36个核苷酸。
73.实施方案72的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含选自SEQ ID NO：1543、1560、1568和1553的核苷酸序列。
74.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中构成所述有义链和反义链的所有核苷酸均被修饰，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
75.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中构成所述有义链和反义链的所有核苷酸均被修饰，其中所述反义链的5’-核苷酸的糖的4’-碳包含磷酸酯类似物，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
76.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中构成所述有义链和反义链的所有核苷酸均被修饰，其中所述反义链的5’-核苷酸的糖的4’-碳包含磷酸酯类似物，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
77.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中构成所述有义链和所述反义链的所有核苷酸均被修饰，其中所述反义链和所述有义链包含一个或多个2’-氟代和2’-O-甲基修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯键，其中所述反义链的5’-核苷酸的糖的4’-碳包含磷酸酯类似物，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
78.实施方案1-77中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含SEQ ID NO：1609-1642中任一者的核苷酸序列。
79.实施方案1-78中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链包含SEQ ID NO：1645-1678中任一者的核苷酸序列。
80.实施方案1-79中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：1609和1645；
(b)分别为SEQ ID NO：1610和1646；
(c)分别为SEQ ID NO：1611和1647；
(d)分别为SEQ ID NO：1612和1648；
(e)分别为SEQ ID NO：1613和1649；
(f)分别为SEQ ID NO：1614和1650；
(g)分别为SEQ ID NO：1615和1651；
(h)分别为SEQ ID NO:1616和1652；
(i)分别为SEQ ID NO:1617和1653；
(j)分别为SEQ ID NO:1618和1654；
(k)分别为SEQ ID NO:1619和1655；
(l)分别为SEQ ID NO:1620和1656；
(m)分别为SEQ ID NO:1621和1657；
(n)分别为SEQ ID NO:1622和1658；
(o)分别为SEQ ID NO:1623和1659；
(p)分别为SEQ ID NO:1624和1660；
(q)分别为SEQ ID NO:1625和1661；
(r)分别为SEQ ID NO:1626和1662；
(s)分别为SEQ ID NO:1627和1663；
(t)分别为SEQ ID NO:1628和1664；
(u)分别为SEQ ID NO:1628和1665；
(v)分别为SEQ ID NO:1630和1666；
(w)分别为SEQ ID NO:1631和1667；
(x)分别为SEQ ID NO:1632和1668；
(y)分别为SEQ ID NO:1633和1669；
(z)分别为SEQ ID NO:1634和1670；
(aa)分别为SEQ ID NO:1635和1671；
(bb)分别为SEQ ID NO:1636和1672；
(cc)分别为SEQ ID NO:1637和1673；
(dd)分别为SEQ ID NO:1638和1674；
(ee)分别为SEQ ID NO:1639和1675；
(ff)分别为SEQ ID NO:1640和1676；
(gg)分别为SEQ ID NO:1641和1677；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1642和1678。
81.实施方案1-80中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和反义链分别包含SEQ ID NO:1615和1651所示的核苷酸序列。
82.实施方案1-80中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和反义链分别包含SEQ ID NO:1632和1668所示的核苷酸序列。
83.实施方案1-80中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和反义链分别包含SEQ ID NO:1640和1676所示的核苷酸序列。
84.实施方案1-80中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和反义链分别包含SEQ ID NO:1625和1661所示的核苷酸序列。
85.用于抑制MARC1的表达的RNAi寡核苷酸，其中所述dsRNA包含有义链和反义链，所述反义链包含与MARC1 RNA转录物互补的互补区域，其中所述有义链包含5′-mGs-mG-mC-mU-mA-mG-mA-fG-fA-fA-fG-mA-mA-mA-mG-mU-mU-mA-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC-3’(SEQ ID NO:1615)的序列和所有修饰，并且其中所述反义链包含5′-MePhosphonate-4O-mUs-fUs-fUs-fA-fA-mC-fU-mU-mU-fC-mU-mU-mC-fU-mC-mU-mA-mG-mC-mCs-mGs-mG-3′(SEQ ID NO:1651)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG和mU＝2’-OMe核糖核苷；fA、fC、fG和fU＝2’-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中/>
86.用于抑制MARC1的表达的RNAi寡核苷酸，其中所述dsRNA包含有义链和反义链，所述反义链包含与MARC1 RNA转录物互补的互补区域，其中所述有义链包含5′-mAs-mG-mA-mA-mC-mG-mA-fA-fA-fG-fU-mU-mA-mU-mA-mU-mG-mG-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC-3’(SEQ ID NO:1632)的序列和所有修饰，并且其中所述反义链包含5′-MePhosphonate-4O-mUs-fUs-fCs-fC-fA-mU-fA-mU-mA-fA-mC-mU-mU-fU-mC-mG-mU-mU-mC-mUs-mGs-mG-3′(SEQ ID NO:1668)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG和mU＝2’-OMe核糖核苷；fA、fC、fG和fU＝2’-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中
87.用于抑制MARC1的表达的RNAi寡核苷酸，其中所述dsRNA包含有义链和反义链，所述反义链包含与MARC1 RNA转录物互补的互补区域，其中所述有义链包含5′-mAs-mA-mG-mU-mU-mG-mA-fC-fU-fA-fA-mA-mC-mU-mU-mG-mA-mA-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC-3’(SEQ ID NO:1640)的序列和所有修饰，并且其中所述反义链包含5′-MePhosphonate-4O-mUs-fUs-fUs-fU-fC-mA-fA-mG-mU-fU-mU-mA-mG-fU-mC-mA-mA-mC-mU-mUs-mGs-mG-3′(SEQ ID NO:1676)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG和mU＝2’-OMe核糖核苷；fA、fC、fG和fU＝2’-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中/>
88.用于抑制MARC1的表达的双链RNAi寡核苷酸(dsRNAi)，其中所述dsRNA包含有义链和反义链，所述反义链包含与MARC1 RNA转录物互补的互补区域，其中所述有义链包含5′-mUs-mG-mU-mG-mA-mA-mU-fA-fA-fA-fU-mG-mG-mA-mA-mG-mC-mU-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC-3’(SEQ ID NO:1625)的序列和所有修饰，并且其中所述反义链包含5′-MePhosphonate-4O-mUs-fUs-fAs-fG-fC-mU-fU-mC-mC-fA-mU-mU-mU-fA-mU-mU-mC-mA-mC-mAs-mGs-mG-3′(SEQID NO:1661)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG和mU＝2’-OMe核糖核苷；fA、fC、fG和fU＝2’-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中
89.实施方案1-88中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是切酶底物。
90.实施方案1-88中任一项的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是切酶底物，该切酶底物在内源切酶加工后产生能够降低哺乳动物细胞中的MARC1表达的、长度为19-23个核苷酸的双链核酸。
91.用于治疗患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的前述实施方案中任一项的RNAi寡核苷酸或其药物组合物，从而治疗所述受试者。
92.药物组合物，其包含实施方案1至90中任一项的RNAi寡核苷酸和药学上可接受的载体、递送剂或辅料。
93.将寡核苷酸递送至受试者的方法，该方法包括向受试者施用实施方案92的药物组合物。
94.用于降低细胞、细胞群体或受试者中的MARC1表达的方法，该方法包括以下步骤：
i.使所述细胞或细胞群体与实施方案1至90中任一项的RNAi寡核苷酸或实施方案92的药物组合物接触；或者
ii.向所述受试者施用实施方案1至90中任一项的RNAi寡核苷酸或实施方案92的药物组合物。
95.实施方案94的方法，其中降低MARC1表达包括降低MARC1 mRNA的量或水平，MARC1蛋白的量或水平，或以上两者。
96.实施方案94或95的方法，其中所述受试者患有与MARC1表达，例如肝脏中的MARC1表达相关的疾病、病症或状况。
97.实施方案96的方法，其中所述受试者患有与肝脏中的MARC1表达相关的疾病、病症或状况。
98.实施方案97的方法，其中所述受试者患有与肝细胞中的MARC1表达相关的疾病、病症或状况。
99.实施方案91或96至98的方法，其中所述与MARC1表达相关的疾病、病症或状况是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和酒精性脂肪性肝炎(ASH)。
100.实施方案91和94至99中任一项的方法，其中所述RNAi寡核苷酸或药物组合物与第二组合物或治疗剂联合施用。
101.用于治疗患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含有义链和反义链的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述反义链包含与SEQ ID NO：1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
102.用于治疗患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含选自表4或表6中所列行的有义链和反义链的RNAi寡核苷酸或其药物组合物，从而治疗所述受试者。
103.用于治疗患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含有义链和反义链的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO：1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO：1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO：1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO：1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO：1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO：1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO：1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO：1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO：1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO：1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO：1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO：1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO：1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO：1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO：1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO：1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO：1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO：1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO：1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO：1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO：1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO：1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO：1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO：1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO：1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO：1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO：1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO：1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO：1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO：1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO：1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO：1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO：1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO：1570和1606。
104.实施方案103的方法，其中所述有义链包含SEQ ID NO:1543所示的核苷酸序列，其中所述反义链包含SEQ ID NO:1579所示的核苷酸序列。
105.实施方案103的方法，其中所述有义链包含SEQ ID NO:1560所示的核苷酸序列，其中所述反义链包含SEQ ID NO:1596所示的核苷酸序列。
106.实施方案103的方法，其中所述有义链包含SEQ ID NO:1568所示的核苷酸序列，其中所述反义链包含SEQ ID NO:1604所示的核苷酸序列。
107.实施方案103的方法，其中所述有义链包含SEQ ID NO:1553所示的核苷酸序列，其中所述反义链包含SEQ ID NO:1589所示的核苷酸序列。
108.用于治疗患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含有义链和反义链的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1609和1645；
(b)分别为SEQ ID NO:1610和1646；
(c)分别为SEQ ID NO:1611和1647；
(d)分别为SEQ ID NO:1612和1648；
(e)分别为SEQ ID NO:1613和1649；
(f)分别为SEQ ID NO:1614和1650；
(g)分别为SEQ ID NO:1615和1651；
(h)分别为SEQ ID NO:1616和1652；
(i)分别为SEQ ID NO:1617和1653；
(j)分别为SEQ ID NO:1618和1654；
(k)分别为SEQ ID NO:1619和1655；
(l)分别为SEQ ID NO:1620和1656；
(m)分别为SEQ ID NO:1621和1657；
(n)分别为SEQ ID NO:1622和1658；
(o)分别为SEQ ID NO:1623和1659；
(p)分别为SEQ ID NO:1624和1660；
(q)分别为SEQ ID NO:1625和1661；
(r)分别为SEQ ID NO:1626和1662；
(s)分别为SEQ ID NO:1627和1663；
(t)分别为SEQ ID NO:1628和1664；
(u)分别为SEQ ID NO:1628和1665；
(v)分别为SEQ ID NO:1630和1666；
(w)分别为SEQ ID NO:1631和1667；
(x)分别为SEQ ID NO:1632和1668；
(y)分别为SEQ ID NO:1633和1669；
(z)分别为SEQ ID NO:1634和1670；
(aa)分别为SEQ ID NO:1635和1671；
(bb)分别为SEQ ID NO:1636和1672；
(cc)分别为SEQ ID NO:1637和1673；
(dd)分别为SEQ ID NO:1638和1674；
(ee)分别为SEQ ID NO:1639和1675；
(ff)分别为SEQ ID NO:1640和1676；
(gg)分别为SEQ ID NO:1641和1677；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1642和1678。
109.实施方案108的方法，其中所述有义链包含SEQ ID NO:1615所示的核苷酸序列，其中所述反义链包含SEQ ID NO:1651所示的核苷酸序列。
110.实施方案108的方法，其中所述有义链包含SEQ ID NO:1632所示的核苷酸序列，其中所述反义链包含SEQ ID NO:1668所示的核苷酸序列。
111.实施方案108的方法，其中所述有义链包含SEQ ID NO:1640所示的核苷酸序列，其中所述反义链包含SEQ ID NO:1676所示的核苷酸序列。
112.实施方案108的方法，其中所述有义链包含SEQ ID NO:1625所示的核苷酸序列，其中所述反义链包含SEQ ID NO：1661所示的核苷酸序列。
113.实施方案101至112中任一项的方法，其中所述与MARC1表达相关的疾病、病症或状况是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或酒精性脂肪性肝炎(ASH)。
114.实施方案1至90中任一项的RNAi寡核苷酸或实施方案92的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与MARC1表达相关的疾病、病症或状况，任选地用于治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或酒精性脂肪性肝炎(ASH)。
115.实施方案1至90中任一项的RNAi寡核苷酸或实施方案92的药物组合物，其用于或适合用于治疗与MARC1表达相关的疾病、病症或状况，任选地用于治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或酒精性脂肪性肝炎(ASH)。
116.实施方案1至90中任一项的RNAi寡核苷酸或实施方案92的药物组合物，其用于或适合用于治疗与肝脏中的MARC1表达相关的疾病、病症或状况，用于治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或酒精性脂肪性肝炎(ASH)。
117.试剂盒，其包含实施方案1至90中任一项的RNAi寡核苷酸、可选的药学上可接受的载体和包装插页，所述包装插页包括关于向患有与MARC1表达相关的疾病、病症或状况的受试者进行施用的说明书。
118.实施方案114的用途，实施方案115的供使用或适合使用的RNAi寡核苷酸或药物组合物，或实施方案116的试剂盒，其中所述与MARC1表达相关的疾病、病症或状况是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或酒精性脂肪性肝炎(ASH)。
Claims (15)
1.用于抑制MARC1的表达的双链RNAi寡核苷酸(dsRNAi)，其中所述dsRNAi包含有义链和反义链，其中所述有义链包含
5′-mGs-mG-mC-mU-mA-mG-mA-fG-fA-fA-fG-mA-mA-mA-mG-mU-mU-mA-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC-3’(SEQ ID NO:1615)的序列和所有修饰，并且其中所述反义链包含
5′-MePhosphonate-4O-mUs-fUs-fUs-fA-fA-mC-fU-mU-mU-fC-mU-mU-mC-fU-mC-mU-mA-mG-mC-mCs-mGs-mG-3′(SEQ ID NO:1651)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG和mU＝2’-OMe核糖核苷；fA、fC、fG和fU＝2’-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中ademA-GalNAc＝
2.用于抑制MARC1的表达的双链RNAi寡核苷酸(dsRNAi)，其中所述dsRNAi包含有义链和反义链，其中所述有义链包含
5′-mAs-mG-mA-mA-mC-mG-mA-fA-fA-fG-fU-mU-mA-mU-mA-mU-mG-mG-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC-3’(SEQ ID NO:1632)的序列和所有修饰，并且其中所述反义链包含
5′-MePhosphonate-4O-mUs-fUs-fCs-fC-fA-mU-fA-mU-mA-fA-mC-mU-mU-fU-mC-mG-mU-mU-mC-mUs-mGs-mG-3′(SEQ ID NO:1668)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG和mU＝2’-OMe核糖核苷；fA、fC、fG和fU＝2’-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中ademA-GalNAc＝
3.用于抑制MARC1的表达的双链RNAi寡核苷酸(dsRNAi)，其中所述dsRNAi包含有义链和反义链，其中所述有义链包含
5′-mAs-mA-mG-mU-mU-mG-mA-fC-fU-fA-fA-mA-mC-mU-mU-mG-mA-mA-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC-3’(SEQ ID NO:1640)的序列和所有修饰，并且其中所述反义链包含
5′-MePhosphonate-4O-mUs-fUs-fUs-fU-fC-mA-fA-mG-mU-fU-mU-mA-mG-fU-mC-mA-mA-mC-mU-mUs-mGs-mG-3′(SEQ ID NO:1676)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG和mU＝2’-OMe核糖核苷；fA、fC、fG和fU＝2’-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中ademA-GalNAc＝
4.用于抑制MARC1的表达的双链RNAi寡核苷酸(dsRNAi)，其中所述dsRNAi包含有义链和反义链，其中所述有义链包含
5′-mUs-mG-mU-mG-mA-mA-mU-fA-fA-fA-fU-mG-mG-mA-mA-mG-mC-mU-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-mG-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC-3’(SEQ ID NO:1625)的序列和所有修饰，并且其中所述反义链包含
5′-MePhosphonate-4O-mUs-fUs-fAs-fG-fC-mU-fU-mC-mC-fA-mU-mU-mU-fA-mU-mU-mC-mA-mC-mAs-mGs-mG-3′(SEQ ID NO:1661)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG和mU＝2’-OMe核糖核苷；fA、fC、fG和fU＝2’-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中ademA-GalNAc＝
5.用于降低MARC1表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:1-384中任一者的MARC1 mRNA靶序列互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸，与所述MARC1 mRNA靶序列相差不超过3个核苷酸。
6.根据权利要求5所述的RNAi寡核苷酸，其包含：
(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有与MARC1mRNA靶序列互补的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域选自SEQ ID NO:385-768，以及
(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，其包含与所述反义链互补的互补区域，其中所述反义链和有义链是单独的链，它们形成在所述反义链的3’末端具有1-4个核苷酸的突出端的不对称双链体区域。
7.根据权利要求5中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中：
(i)所述有义链的长度为15至50或18至36个核苷酸，任选地长度为36个核苷酸；任选地
(ii)所述反义链的长度为15至30个核苷酸，任选地长度为22个核苷酸；并且任选地
(iii)所述双链体区域的长度为至少19个核苷酸或至少20个核苷酸。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的3’端包含表示为S1-L-S2的茎-环，其中
(i)S1与S2互补，任选地其中S1和S2的长度各自为1-10个核苷酸并且具有相同的长度，任选地其中S1和S2的长度各自为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，进一步任选地其中S1和S2的长度为6个核苷酸；并且
(ii)L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环，任选地其中L为三环或四环，任选地其中该四环包含序列5’-GAAA-3’，任选地其中所述茎-环包含序列5’-GCAGCCGAAAGGCUGC-3’(SEQ ID NO:1681)。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一个核苷酸与一个或多个靶向配体缀合，任选地其中：
(a)每个靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质；
(b)所述茎环包含与该茎环的一个或多个核苷酸缀合的一个或多个靶向配体；
(c)所述一个或多个靶向配体与所述环的一个或多个核苷酸缀合，任选地其中所述环包含从5’至3’编号为1-4的4个核苷酸，其中位置2、3和4的核苷酸各自包含一个或多个靶向配体，其中所述靶向配体相同或不同；
(d)所述靶向配体是肝细胞靶向配体，并且每个靶向配体包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分，任选地其中该GalNAc部分是单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分；并且/或者
(e)所述靶向配体是肝细胞靶向配体，并且所述茎-环的L的至多4个核苷酸各自与单价GalNAc部分缀合。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中：
(i)所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸，任选地其中所述经修饰的核苷酸包含2’-修饰，任选地其中：
(a)所述2’-修饰是选自2’-氨基乙基、2’-氟代、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基和2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯糖核酸的修饰，任选地其中所述修饰选自2’-氟代和2’-O-甲基，任选地其中所述寡核苷酸的所有核苷酸均被修饰，其中所述修饰为2’-氟代和2’-O-甲基；
(b)所述有义链的约10-15％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的核苷酸包含2’-氟代修饰；
(c)所述反义链的约25-35％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的核苷酸包含2’-氟代修饰；
(d)所述寡核苷酸的约25-35％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的核苷酸包含2’-氟代修饰；
(e)所述有义链包含从5’至3’为位置1-36的36个核苷酸，其中位置8-11包含2’-氟代修饰；
(f)所述反义链包含从5’至3’为位置1-22的22个核苷酸，并且其中位置2、3、4、5、7、10和14包含2’-氟代修饰；并且/或者
(g)其余的核苷酸包含2’-O-甲基修饰，并且/或者
(ii)所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键合，任选地其中所述至少一个经修饰的核苷酸间键合是硫代磷酸酯键，任选地其中：
(a)所述反义链(i)在位置1与2之间以及位置2与3之间；或(ii)在位置1与2之间、位置2与3之间以及位置3与4之间包含硫代磷酸酯键，其中位置从5’至3’被编号为1-4；并且/或者
(b)所述反义链的长度为22个核苷酸，并且其中所述反义链在位置20与21之间以及位置21与22之间包含硫代磷酸酯键，其中位置从5’至3’被编号为1-22，并且/或者
(iii)所述反义链在5’末端包含磷酸化核苷酸，其中所述磷酸化核苷酸选自尿苷和腺苷，任选地其中所述磷酸化核苷酸为尿苷，并且/或者
(iv)所述反义链的5’-核苷酸的糖的4’-碳包含磷酸酯类似物，任选地其中所述磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯，任选地其中所述磷酸酯类似物是包含5’-甲氧基膦酸酯-4’-氧基的4’-磷酸酯类似物，并且/或者
(v)所述反义链在3’末端包含长度为一个或多个核苷酸的突出端序列，任选地其中所述突出端包含嘌呤核苷酸，任选地其中所述突出端序列的长度为2个核苷酸，任选地其中所述突出端选自AA、GG、AG和GA，任选地其中所述突出端为GG。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1537和1573；
(b)分别为SEQ ID NO:1538和1574；
(c)分别为SEQ ID NO:1539和1575；
(d)分别为SEQ ID NO:1540和1576；
(e)分别为SEQ ID NO:1541和1577；
(f)分别为SEQ ID NO:1542和1578；
(g)分别为SEQ ID NO:1543和1579；
(h)分别为SEQ ID NO:1544和1580；
(i)分别为SEQ ID NO:1545和1581；
(j)分别为SEQ ID NO:1546和1582；
(k)分别为SEQ ID NO:1547和1583；
(l)分别为SEQ ID NO:1548和1584；
(m)分别为SEQ ID NO:1549和1585；
(n)分别为SEQ ID NO:1550和1586；
(o)分别为SEQ ID NO:1551和1587；
(p)分别为SEQ ID NO:1552和1588；
(q)分别为SEQ ID NO:1553和1589；
(r)分别为SEQ ID NO:1554和1590；
(s)分别为SEQ ID NO:1555和1591；
(t)分别为SEQ ID NO:1556和1592；
(u)分别为SEQ ID NO:1557和1593；
(v)分别为SEQ ID NO:1558和1594；
(w)分别为SEQ ID NO:1559和1595；
(x)分别为SEQ ID NO:1560和1596；
(y)分别为SEQ ID NO:1561和1597；
(z)分别为SEQ ID NO:1562和1598；
(aa)分别为SEQ ID NO:1563和1599；
(bb)分别为SEQ ID NO:1564和1600；
(cc)分别为SEQ ID NO:1565和1601；
(dd)分别为SEQ ID NO:1566和1602；
(ee)分别为SEQ ID NO:1567和1603；
(ff)分别为SEQ ID NO:1568和1604；
(gg)分别为SEQ ID NO:1569和1605；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1570和1606；或者，
其中所述有义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1609和1645；
(b)分别为SEQ ID NO:1610和1646；
(c)分别为SEQ ID NO:1611和1647；
(d)分别为SEQ ID NO:1612和1648；
(e)分别为SEQ ID NO:1613和1649；
(f)分别为SEQ ID NO:1614和1650；
(g)分别为SEQ ID NO:1615和1651；
(h)分别为SEQ ID NO:1616和1652；
(i)分别为SEQ ID NO:1617和1653；
(j)分别为SEQ ID NO:1618和1654；
(k)分别为SEQ ID NO:1619和1655；
(l)分别为SEQ ID NO:1620和1656；
(m)分别为SEQ ID NO:1621和1657；
(n)分别为SEQ ID NO:1622和1658；
(o)分别为SEQ ID NO:1623和1659；
(p)分别为SEQ ID NO:1624和1660；
(q)分别为SEQ ID NO:1625和1661；
(r)分别为SEQ ID NO:1626和1662；
(s)分别为SEQ ID NO:1627和1663；
(t)分别为SEQ ID NO:1628和1664；
(u)分别为SEQ ID NO:1628和1665；
(v)分别为SEQ ID NO:1630和1666；
(w)分别为SEQ ID NO:1631和1667；
(x)分别为SEQ ID NO:1632和1668；
(y)分别为SEQ ID NO:1633和1669；
(z)分别为SEQ ID NO:1634和1670；
(aa)分别为SEQ ID NO:1635和1671；
(bb)分别为SEQ ID NO:1636和1672；
(cc)分别为SEQ ID NO:1637和1673；
(dd)分别为SEQ ID NO:1638和1674；
(ee)分别为SEQ ID NO:1639和1675；
(ff)分别为SEQ ID NO:1640和1676；
(gg)分别为SEQ ID NO:1641和1677；以及，
(hh)分别为SEQ ID NO:1642和1678。
12.用于抑制MARC1的表达的双链RNAi寡核苷酸(dsRNAi)，其中所述dsRNAi包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，并且其中
(i)所述有义链和反义链分别包含SEQ ID NO:1615和1651所示的核苷酸序列；
(ii)所述有义链和反义链分别包含SEQ ID NO:1632和1668所示的核苷酸序列；
(iii)所述有义链和反义链分别包含SEQ ID NO:1640和1676所示的核苷酸序列；或者
(iv)所述有义链和反义链分别包含SEQ ID NO:1625和1661所示的核苷酸序列。
13.药物组合物，其包含根据权利要求1-12中任一项所述的RNAi寡核苷酸和药学上可接受的载体、递送剂或辅料。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的RNAi寡核苷酸或根据权利要求13所述的药物组合物作为药物的用途，所述药物用于治疗与MARC1表达相关的疾病、病症或状况，任选地用于治疗与肝细胞中的MARC1表达相关的疾病或状况。
15.根据权利要求14所述的RNAi寡核苷酸作为药物的用途，所述药物用于治疗选自非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和酒精性脂肪性肝炎(ASH)的疾病。
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