KR20240046843A - 알파-1 항트립신 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
알파-1 항트립신 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시내용은 dsRNA, 예를 들어, 다이서 기질 siRNA(DsiRNA) 제제의 사용을 통해 α-1 항트립신 표적 RNA 및 단백질 수준을 감소시키는 데 유용한 화합물, 조성물, 및 방법에 관한 것이다.
Description
알파 1-항트립신(A1AT, 또는 SERPINA1, 또는 Serpina1, 또는 AAT)은 세르핀 슈퍼패밀리에 속하는 프로테아제 억제제이다. 이는 일반적으로 혈청 트립신 억제제로 공지되어 있다. 알파 1-항트립신은 다양한 프로테아제를 억제하기 때문에 알파-1 프로테아제 억제제(A1PI)로도 지칭된다(Gettins P.G. 등, Chem Rev 102: 4751-804). 이는 염증 세포, 특히 호중구 엘라스타제 효소로부터 조직을 보호하고 1.5-3.5 그램/리터의 혈액 내 기준 범위를 갖지만 급성 염증 시 여러 배 상승된 수준이 발생할 수 있다(Kushner 및 Mackiewicz, Acute-phase proteins: molecular biology, biochemistry and clinical applications (CRC Press); 1993, Chapter 1, pp. 3-19). AAT가 없으면, AAT와 효소 엘라스타제 사이의 균형이 무너져 손상을 유발할 수 있다. 일반적으로 효소 엘라스타제는 감염과 싸우는 데 중요한 역할을 하지만 너무 많으면 건강한 조직 또한 해칠 수 있다. 고농도에서는 폐의 내막 및 폐포에 손상을 유발하며, 보다 구체적으로 이러한 상황에서 엘라스타제는 폐의 탄력에 기여하는 엘라스틴을 자유롭게 분해하여 성인에서 폐기종 또는 COPD(만성 폐쇄성 폐질환) 및 어린이에서 간경변(Gadek JE 등, Lung, 1990, 168 Suppl:552-64; Birrer P, Agents Actions Suppl., 1993, 40:3-12)과 같은 호흡기 합병증을 일으킨다. 또한, AAT 결핍은 간에 이환하여 불량한 기능을 야기하고 간경변 및 간암의 위험을 증가시킬 수 있다. 생후 첫 30년 동안 AAT 결핍이 있는 사람의 경우 간 질환이 폐 질환보다 더 흔하다(Gadek JE 등, Lung, 1990). 일부 개체에서, AAT 결핍은 피부에 자주 붉고 고통스러운 결절을 유발할 수 있다. AAT 유전자 사본 중 하나 또는 둘 모두에 돌연변이가 있는 개체는 알파-1 항-트립신 결핍증을 앓을 수 있으며, 이는 폐기종 발병(DeMeo DL, 및 Silverman EK (March 2004), Alpha1-antitrypsin deficiency. 2: genetic aspects of alpha(1)-antitrypsin deficiency: phenotypes and genetic modifiers of emphysema risk, Thorax 59 (3): 259-64)또는 폐 및 간에서 정상보다 큰 엘라스타제 활성으로 인한 만성 간 질환의 위험을 제시한다. SERPINA1 은 염색체 14q32에 국한되어 있으며 SERPINA1 유전자의 75개 초과의 돌연변이가 식별되었으며 많은 경우 임상적으로 유의한 효과가 있다(Silverman E.K., Sandhaus RA (2009), Alpha1-Antitrypsin Deficiency, New Engl및 Journal of Medicine 360 (26): 2749-57). 중증 결핍의 가장 흔한 원인인 PiZ는 342번 위치에서 글루탐산에서 리신으로 돌연변이(dbSNP: rs28929474)를 야기하는 단일 염기쌍 치환인 반면, PiS는 264번 위치에서 글루탐산에서 발린으로 돌연변이(dbSNP: rs17580)로 인해 유발된다.
이환된 개체에서, 알파-1 항트립신의 결핍은 야생형, 기능적 알파-1 항트립신의 결핍이다. 그러나 일부 경우에 개체가 유의한 양의 알파-1 항트립신을 생산하지만 생산되는 알파-1 항트립신 단백질의 일부가 잘못 접혀 있거나 단백질의 고유 기능을 손상시키거나 제거하는 돌연변이를 함유한다. 일부 경우에, 개체는 합성 부위에서 신체 내 작용 부위로 적절하게 수송될 수 없는 잘못 접힌 단백질을 생산한다.
알파-1 항트립신 결핍으로 인한 간 질환은 이러한 잘못 접힌 단백질로 인해 유발될 수 있다. 돌연변이체(mutant) 형태의 알파-1 항트립신(예를 들어, 342번 위치(가공 전 형태의 366번 위치)에 글루타메이트에서 리신으로의 돌연변이가 있는 일반적인 PiZ 변이체)은 간 세포에서 생산되고(간의 간세포는 일반적으로 대량의 순환하는 AAT를 생산함) 잘못 접힌 구성에서 이러한 형태는 세포 밖으로 쉽게 수송되지 않는다. 이는 간 세포 내 잘못 접힌 단백질의 축적을 야기하고(돌연변이체 Z 단백질의 가장 큰 부담이 있는 사람들이 궁극적으로 세포 사멸을 초래하는 세포 내 손상의 연속단계(cascade)를 앓을 수 있는 간세포; 이러한 간세포 세포 사멸 및 재생의 만성 결국 섬유증 및 기관 손상을 야기할 수 있음) 만성 간 질환, 간 염증, 간경변증, 간 섬유증 및/또는 간세포 암종을 포함지만 이에 제한되지 않는 간의 하나 이상의 질환 또는 장애를 유발할 수 있다 (Rudnick DA, 및 Perlmutter DH., Alpha-1-antitrypsin deficiency: a new paradigm for hepatocellular carcinoma in genetic liver disease, Hepatology; 2005,42 (3): 514-21). AAT 결핍이 있는 개체에서 나타날 수 있는 다른 증상은 하기를 포함할 수 있다: 숨가쁨, 가래(phlegm)/가래(sputum) 생산과 과도한 기침, 쌕쌕거림, 운동 능력 감소 및 지속적인 저에너지 상태 또는 피로, 숨을 들이쉴 때 증가하는 흉통. 이러한 증상은 만성이거나 감기나 독감과 같은 급성 호흡기 감염과 함께 발생할 수 있다. 드문 경우에, AAT는 지방층염(panniculitis)이라고 불리는 피부 질환을 일으켜 딱딱한 반점 및 붉고 고통스러운 덩어리를 유발할 수 있다(Gadek JE 등, Lung, 1990).
현재 알파-1 항트립신 결핍과 관련된 간 질환 환자를 성공적으로 치료할 수 있는 옵션은 거의 없으며, 이러한 옵션은 간염 백신 접종, 지지 요법 및 유해 제제(예를 들어, 알코올 및 NSAID)의 회피를 포함하지만 이들 중 어느 것도 표적 요법을 제공하지 않는다. 알파-1 항트립신의 대체는 이러한 환자에서 간 질환에 영향을 미치지 않지만 간 이식이 효과적일 수 있다. 따라서, 알파-1 항트립신 결핍과 관련된 간 질환이 있는 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 대한 필요성이 남아있다.
요약
본 개시내용은 간에서 알파-1 항트립신(α-1 항트립신 또는 A1AT 또는 SERPINA1) 발현을 감소시키는 기능을 하는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)의 발견에 부분적으로 기반한다. 구체적으로, α-1 항트립신 mRNA 내의 표적 서열이 식별되었고 이들 표적 서열에 결합하고 α-1 항트립신 mRNA 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드가 생성되었다. 본원에서 입증된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 간에서 뮤린 α-1 항트립신 발현, 및/또는 원숭이 및 인간 α-1 항트립신 발현을 억제하였다. 이론에 얽매이지 않고, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 폐 염증, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 폐기종 및/또는 만성 간 질환, 예를 들어, 만성 간 질환, 간 염증, 간경변증, 간 섬유증 및/또는 간세포 암종)를 치료하는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 α-1 항트립신의 돌연변이와 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 데 유용하다. α-1 항트립신 발현을 감소시키는 올리고뉴클레오티드는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제9,458,457호에 기재되어 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 α-1 항트립신(A1AT)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 15-30개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 및 15-50개 뉴클레오티드의 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대한 상보성 영역을 포함하고, 임의로 여기서 센스 가닥은 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
임의의 전술한 또는 관련된 양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 1 및 2, 각각;
(b) 서열번호 3 및 4, 각각;
(c) 서열번호 5 및 6, 각각;
(d) 서열번호 7 및 8, 각각;
(e) 서열번호 9 및 10, 각각;
(f) 서열번호 11 및 12, 각각;
(g) 서열번호 13 및 14, 각각;
(h) 서열번호 15 및 16, 각각;
(i) 서열번호 17 및 18, 각각;
(j) 서열번호 19 및 20, 각각;
(k) 서열번호 21 및 22, 각각;
(l) 서열번호 23 및 24, 각각;
(m) 서열번호 25 및 26, 각각;
(n) 서열번호 27 및 28, 각각;
(o) 서열번호 29 및 30, 각각; 및
(p) 서열번호 31 및 32, 각각.
다른 양태에서, 본 개시내용은 α-1 항트립신(A1AT)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 15-30개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 및 15-50개 뉴클레오티드의 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 서열번호 26에 제시된 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고 센스 가닥은 서열번호 25에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 α-1 항트립신(A1AT)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 15-30개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 및 15-50개 뉴클레오티드의 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 서열번호 26에 제시된 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고 센스 가닥은 서열번호 105에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
임의의 전술한 또는 관련된 양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 이중 가닥 영역을 형성하고, 여기서 안티센스 가닥은 길이가 19개 내지 30개 뉴클레오티드이다. 다른 양태에서, 안티센스 가닥은 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열과 2개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
임의의 전술한 또는 관련된 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 양태에서, 변형된 뉴클레오티드가 2'-변형을 포함한다. 일부 양태에서, 2'-변형은 2'-플루오로 변형, 2'-O-메틸 변형, 또는 둘 모두로부터 선택된다.
임의의 전술한 또는 관련된 양태에서, 안티센스 가닥은 22개의 뉴클레오티드를 포함하고 센스 가닥은 36개의 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 안티센스 및 센스 가닥은 5' 에서 3'로 번호가 매겨지고, 하기 위치 중 하나 이상이 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 6, 8, 11-13, 15, 17, 또는 19-22번 위치. 다른 양태에서, 하기 위치 중 하나 이상이 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 3, 5, 8-11, 13, 15, 또는 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2-5, 7, 9, 10, 14, 16, 또는 18번 위치. 또 다른 양태에서, 하기 위치 중 하나 이상이 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8-11, 13, 15, 17, 18, 또는 20-22번 위치; 하기 위치 중 하나 이상이 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13 및 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 12, 14, 16 및 19번 위치. 다른 양태에서, 하기 위치 중 하나 이상이 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8, 9, 11-13, 15, 18, 또는 20-22번 위치; 하기 위치 중 하나 이상이 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13 또는 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 10, 14, 16, 17 또는 19번 위치.
임의의 전술한 또는 관련된 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 1 및 2번 위치, 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치, 안티센스 가닥의 2 및 3번 위치, 안티센스 가닥의 3 및 4번 위치, 안티센스 가닥의 20 및 21번 위치, 및 안티센스 가닥의 21 및 22번 위치 각각 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다.
임의의 전술한 또는 관련된 양태에서, 안티센스 가닥의 제1 위치의 우리딘은 포스페이트 유사체를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 1번 위치에 하기 구조를 포함한다:
.
임의의 전술한 또는 관련된 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티에 부착된다.
임의의 전술한 또는 관련된 양태에서, 센스 가닥은 S1-L-S2로 제시된 스템-루프(stem-loop)를 포함하고, S1은 S2에 상보적이고, L은 3-5개 뉴클레오티드 길이의 S1과 S2 사이에 루프를 형성한다. 일부 양태에서, L은 테트라루프이다. 일부 양태에서, 테트라루프는 서열 5’-GAAA’3’을 포함한다. 일부 양태에서, 센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 중 하나 이상이 1가 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 양태에서 -GAAA- 서열은 하기의 구조를 포함한다:
,
식 중:
L은 결합, 클릭 화학 핸들, 또는 치환 및 비치환된 알킬렌, 치환 및 비치환된 알케닐렌, 치환 및 비치환된 알키닐렌, 치환 및 비치환된 헤테로알킬렌, 치환 및 비치환 헤테로알케닐렌, 치환 및 비치환된 헤테로알키닐렌, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 20개 길이의 포함하는(inclusive), 연속적, 공유 결합된 원자의 링커를 나타내고; X는 O, S, 또는 N이다. 일부 양태에서, L은 아세탈 링커이다. 일부 양태에서, X는 O이다.
다른 양태에서, -GAAA- 서열은 하기의 구조를 포함한다:
.
다른 양태에서, 본 개시내용은 α-1 항트립신(A1AT)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 15-30개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 및 15-50개 뉴클레오티드의 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 서열번호 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102 및 104에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대한 상보성 영역을 포함하고, 임의로 센스 가닥은 서열번호 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 및 103에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
임의의 전술한 또는 관련된 양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 33 및 34, 각각;
(b) 서열번호 35 및 36, 각각;
(c) 서열번호 37 및 38, 각각;
(d) 서열번호 39 및 40, 각각;
(e) 서열번호 41 및 42, 각각;
(f) 서열번호 43 및 44, 각각;
(g) 서열번호 45 및 46, 각각;
(h) 서열번호 47 및 48, 각각;
(i) 서열번호 49 및 50, 각각;
(j) 서열번호 51 및 52, 각각;
(k) 서열번호 53 및 54, 각각;
(l) 서열번호 55 및 56, 각각;
(m) 서열번호 57 및 58, 각각;
(n) 서열번호 59 및 60, 각각;
(o) 서열번호 61 및 62, 각각;
(p) 서열번호 63 및 64, 각각;
(q) 서열번호 65 및 66, 각각;
(r) 서열번호 67 및 68, 각각;
(s) 서열번호 69 및 70, 각각;
(t) 서열번호 71 및 72, 각각;
(u) 서열번호 73 및 74, 각각;
(v) 서열번호 75 및 76, 각각;
(w) 서열번호 77 및 78, 각각;
(x) 서열번호 79 및 80, 각각;
(y) 서열번호 81 및 82, 각각;
(z) 서열번호 83 및 84, 각각;
(aa) 서열번호 85 및 86, 각각;
(bb) 서열번호 87 및 88, 각각;
(cc) 서열번호 89 및 90, 각각;
(dd) 서열번호 91 및 92, 각각;
(ee) 서열번호 93 및 94, 각각;
(ff) 서열번호 95 및 96, 각각;
(gg) 서열번호 97 및 98, 각각;
(hh) 서열번호 99 및 100, 각각;
(ii) 서열번호 101 및 102, 각각; 및,
(jj) 서열번호 103 및 104, 각각.
추가 양태에서, 본 개시내용은 A1AT의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 26에 제시된 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 서열번호 105로 제시된 서열을 갖는 센스 가닥을 포함하고,
센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8-11, 13, 15, 17, 18, 또는 20-22번 위치가 2'-O-메틸로 변형되고, 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13 및 17번 위치 및 안티센스 가닥의 위치 2, 3, 5, 7, 12, 14, 16 및 19번 위치는 모두 2'-플루오로로 변형되고;
여기서 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 1과 2번 위치, 안티센스 가닥의 1과 2번 위치, 안티센스 가닥의 2와 3번 위치, 안티센스 가닥의 3과 4번 위치, 안티센스 가닥의 20과 21번 위치, 및 안티센스 가닥의 21과 22번 위치 각각 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖고;
여기서 올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 1번 위치에 하기 구조를 포함하고:
센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 각각은 1가 GalNAc 모이어티에 접합되고, 여기서 -GAAA- 서열은 하기의 구조를 포함한다:
.
추가 양태에서, 본 개시내용은 A1AT의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 103의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 서열번호 104의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥, 안티센스 가닥은 A1AT RNA 전사체에 대한 상보성 영역을 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 하기 구조를 갖는 접합체의 형태이다:
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 조성물은 Na+ 반대이온(counterion)을 포함한다. 추가 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 알파 1 항트립신(A1AT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열과 4개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 길이가 19개 내지 35개의 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 이중 가닥 영역의 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고, 여기서 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오티드 및 2'-플루오로-변형된 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 dsRNA는 하나 이상의 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티에 부착된다. 일부 양태에서, 안티센스 가닥은 길이가 19개 내지 30개의 뉴클레오티드이고, 센스 가닥은 길이가 32개 내지 80개의 뉴클레오티드이고 테트라루프를 포함한다. 일부 양태에서, 센스 가닥은 서열번호 25에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 센스 가닥은 서열번호 105에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 안티센스 가닥은 서열번호 104에 제시된 서열을 포함하고, 센스 가닥은 서열번호 103에 제시된 서열을 포함한다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 dsRNA 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 조성물은 Na+ 반대이온을 포함한다. 다른 양태에서, 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 전달하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드, dsRNA 제제 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드, 조성물, 또는 dsRNA 제제는 상기 대상체에서 간 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 전달되며, 상기 간 질환 또는 장애는 만성 간 질환, 간 염증, 간경변증, 간 섬유증 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드, 조성물, 또는 dsRNA 제제는 대상체에게 정맥내 또는 피하로 투여된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 포유동물에서 표적 α-1 항트립신 mRNA의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드, dsRNA 제제 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 표적 α-1 항트립신 mRNA의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 지질 나노입자(LNP)로 제형화된다.
임의의 전술한 또는 관련된 양태에서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 dsRNA 제제가 하루에 상기 포유동물의 킬로그램 당 1 마이크로그램 내지 5밀리그램, 킬로그램 당 100 마이크로그램 내지 0.5 밀리그램, 킬로그램 당 0.001 내지 0.25 밀리그램, 킬로그램 당 0.01 내지 20 마이크로그램, 킬로그램 당 0.01 내지 10 마이크로그램, 킬로그램 당 0.10 내지 5마이크로그램, 및 킬로그램 당 0.1 내지 2.5 마이크로그램으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여량으로 투여된다.
임의의 전술한 또는 관련된 양태에서, α-1 항트립신 mRNA 수준은 올리고뉴클레오티드, 조성물 또는 dsRNA 제제가 상기 포유동물에게 투여된 후 적어도 3일 후에 상기 포유동물의 조직에서 적어도 70%의 양(%로 표현됨)만큼 감소된다. 일부 양태에서, 조직은 간 조직이다.
임의의 전술한 또는 관련된 양태에서, 상기 투여 단계는 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 주입, 피하 주사, 경피, 에어로졸, 직장, 질, 국소, 경구, 및 흡입 전달로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드, dsRNA 제제 또는 조성물을 상기 대상체에서 간 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 간 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하고, 상기 간 질환 또는 장애는 만성 간 질환, 간 염증, 간경변증, COPD, 폐기종 간 섬유증 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 동물은 인간이다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드, dsRNA 제제 또는 조성물, 및 이를 필요로 하는 대상체에서 α-1 항트립신 발현을 감소시키기 위한 지침을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 양태에서, 대상체는 간 질환 또는 장애를 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 α-1 항트립신 발현을 감소시키기 위한 약제의 제조에서 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드, dsRNA 제제 또는 조성물의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 대상체는 간 질환 또는 장애를 갖는다.
도 1은 표 2에 제공된 바와 같이 1, 0.1, 또는 0.01nM의 표시된 SERPINA1 RNAi 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 24시간 후에 Huh7 세포에 남아 있는 인간 SERPINA1 mRNA의 백분율(%)을 도시하는 그래프를 제공한다. 샘플은 모의 형질감염된(mock transfected) 대조군으로 정규화되었다.
도 2a는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)-접합된 이중 가닥 RNAi(dsRNAi) 올리고뉴클레오티드인 SERPINA1-1459의 서열 및 화학적 변형 패턴을 도시하는 개략도를 제공한다. 2'-OMe = 2'-O-메틸; 2'-F = 2'-플루오로. 도 2a는 등장 순서대로 각각 서열번호 103-104를 개시한다.
도 2b-2c 는 SERPINA1-1459 올리고뉴클레오티드(도 2a에 도시된 바와 같음)(도 2b) 및 결정된 최대 유효 용량의 절반(ED50)(도 2c)의 용량 반응을 도시하는 그래프를 제공한다. 혈청에 남아 있는 인간 Z-AAT 단백질의 백분율(%)은 PBS 처리된 마우스에서 Z-AAT 단백질의 %에 대해 PBS에서 제형화된 1, 3 또는 10 mg/kg (n=5)의 SERPINA1-1459를 피하 주사한 후 표시된 시간에 PiZ 마우스에서 측정되었다. 언페어드 t 테스트(unpaired t test)에 의한 *= P ≤ 0.05; 언페어드 t 테스트에 의한 **= P ≤ 0.01; 언페어드 t 테스트에 의한 ***= P ≤ 0.001; 언페어드 t 테스트에 의한 ****= P < 0.0001
도 3은 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 남아있는 인간 SERPINA1 mRNA의 백분율(%)을 도시하는 그래프를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주, 12주 또는 49주령에 시작되었고 연구 완료 시(각각 27주, 34주 또는 71주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 식염수-처리된 대조군에 비해 * = P < 0.05; 식염수-처리된 대조군에 비해 **** = P ≤ 0.0001.
도 4는 도 3에 기재된 바와 같이 처리된 PiZ 마우스의 혈액에 남아있는 인간 Z-AAT 단백질의 백분율(%)을 도시하는 그래프를 제공한다. 혈액은 연구 4, 8, 12, 16, 20주차에, 및 연구 종료시에 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 식염수-처리된 대조군에 비해 * = P < 0.05; 식염수-처리된 대조군에 비해 *** = P ≤ 0.001; 식염수-처리된 대조군에 비해 **** = P ≤ 0.0001
도 5는 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 남아있는 인간 Z-AAT 단백질을 측정하는 웨스턴 블롯 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주령에 시작되었고 연구 완료 시(27주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 6은 도 5의 웨스턴 블롯을 기반으로 측정된 인간 Z-AAT 단백질 수준을 정량화한 그래프를 제공한다. 식염수-처리된 대조군에 비해 * = P < 0.05; 식염수-처리된 대조군에 비해 **** = P ≤ 0.0001.
도 7은 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 남아있는 총 인간 Z-AAT 단백질(총 A1AT 단백질 항체를 사용하여 측정)을 측정하는 면역조직화학 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주령에 시작되었고 연구 완료 시(27주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 기준선 샘플은 5주령의 마우스로부터 수집되었다.
도 8은 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 인간 Z-AAT 중합체 부하를 측정하는 면역조직화학 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주령에 시작되었고 연구 완료 시(27주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 기준선 샘플은 5주령의 마우스로부터 수집되었다.
도 9는 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 인간 Z-AAT 중합체 부하를 측정하는 면역조직화학 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 49주령에 시작되었고 연구 완료 시(71주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 기준선 샘플은 49주령의 마우스로부터 수집되었다.
도 10은 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 간 세포내 소구체 형성을 측정하는 주기적 산-쉬프-디아스타제(Periodic acid-Schiff-diastase) (PAS-D) 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주령에 시작되었고 연구 완료 시(27주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 기준선 샘플은 5주령의 마우스로부터 수집되었다.
도 11은 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 세포 증식(Ki67)을 측정하는 면역조직화학 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주령에 시작되었고 연구 완료 시(27주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 기준선 샘플은 5주령의 마우스로부터 수집되었다.
도 12는 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 간 섬유증(시리우스 레드 염색)의 면역조직화학 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주령에 시작되었고 연구 완료 시(27주령) 말단 간 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 기준선 샘플은 5주령의 마우스로부터 수집되었다.
도 13은 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459를 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 알라닌 아미노전이효소(ALT), 아스파르테이트 아미노전이효소(AST) 및 알칼리성 포스파타제의 수준을 도시하는 그래프를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주, 12주 또는 49주령에 시작되었고 연구 완료 시(각각 27주, 34주 또는 71주령) 말단 혈액 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 식염수-처리된 대조군에 비해 * = P < 0.05; 식염수-처리된 대조군에 비해 **** = P ≤ 0.0001.
도 14는 SERPINA1-1459로 처리된 PiZ 마우스에서 SERPINA1 mRNA, 혈청 Z-AAT 단백질, 간 Z-AAT 단백질 및 간 소구체의 용량-의존적 녹다운을 도시하는 그래프를 나타낸다. 치료는 5주령에 시작되었고 0, 0.3, 1 또는 3mg/kg SERPINA1-1459의 4회 투여 후 18주령에 시료(specimen)가 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 15 는 4주마다 한번 0, 0.3, 1 또는 3 mg/kg SERPINA1-1459의 4회 투여 후 PiZ 마우스의 간의 산-쉬프-디아스타제 (PAS-D) 염색에 의한 용량-의존 간 세포내 소구 형성을 측정하는 간 조직 샘플의 이미지를 제공한다. 치료는 5주령에 시작되었고 18주령에 말단 간 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 16은 SERPINA1-1459의 단일 1, 3, 또는 10 mg/kg 피하(SC) 투여로 치료된 비인간 영장류(NHP)의 평균 및 개별 체중을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 17a는 SERPINA1-1459의 단일 1, 3, 또는 10 ㎎/㎏ 피하 (SC) 투여 후 NHP에서 혈액에 남아있는 (즉, 순환 A1AT 단백질) A1AT 단백질의 백분율(%)을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 17b는 SERPINA1-1459의 단일 1, 3, 또는 10 ㎎/㎏ 피하 (SC) 투여 후 NHP에서 혈액에 남아있는 (즉, 순환 A1AT 단백질) A1AT 단백질의 백분율(%)을 도시하는 그래프를 제공한다. 혈청은 29일, 57일, 85일 및 127일차에 수집되었다. 대조군 혈청(투여 전 수집)이 사용되었다.
도 18은 0, 30, 100, 또는 300 mg/kg의 SERPINA1-1459(4주마다; 4회 투여)의 반복 투여 후 시노몰구스 마카크(cynomolgus macaque)에서 순환하는 A1AT 단백질 농도를 도시하는 그래프를 보여준다. A1AT 단백질은 어린 원숭이와 젊은 성체 원숭이에서 87일차에, 어린 원숭이에서 141일차에 측정되었다. 대조군 혈청(미처리)을 사용하였다.
도 19는 0, 20, 60 또는 180 mg/kg의 SERPINA1-1459(4주마다; 10회 투여)의 반복 투여 후 시노몰구스 마카크의 간에서 남아 있는 SERPINA1 mRNA의 백분율(%)을 도시하는 그래프를 제공한다. "주요 연구 군"은 최종 용량 투여 후 2일에 부검되었고 "R"은 SERPINA1-1459의 마지막 투여 후 8주차에 대상체가 부검된 회수 부검물을 나타낸다.
도 20은 닉킹된(nicked) 테트라루프 구조의 개략도를 제공한다.
도 2a는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)-접합된 이중 가닥 RNAi(dsRNAi) 올리고뉴클레오티드인 SERPINA1-1459의 서열 및 화학적 변형 패턴을 도시하는 개략도를 제공한다. 2'-OMe = 2'-O-메틸; 2'-F = 2'-플루오로. 도 2a는 등장 순서대로 각각 서열번호 103-104를 개시한다.
도 2b-2c 는 SERPINA1-1459 올리고뉴클레오티드(도 2a에 도시된 바와 같음)(도 2b) 및 결정된 최대 유효 용량의 절반(ED50)(도 2c)의 용량 반응을 도시하는 그래프를 제공한다. 혈청에 남아 있는 인간 Z-AAT 단백질의 백분율(%)은 PBS 처리된 마우스에서 Z-AAT 단백질의 %에 대해 PBS에서 제형화된 1, 3 또는 10 mg/kg (n=5)의 SERPINA1-1459를 피하 주사한 후 표시된 시간에 PiZ 마우스에서 측정되었다. 언페어드 t 테스트(unpaired t test)에 의한 *= P ≤ 0.05; 언페어드 t 테스트에 의한 **= P ≤ 0.01; 언페어드 t 테스트에 의한 ***= P ≤ 0.001; 언페어드 t 테스트에 의한 ****= P < 0.0001
도 3은 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 남아있는 인간 SERPINA1 mRNA의 백분율(%)을 도시하는 그래프를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주, 12주 또는 49주령에 시작되었고 연구 완료 시(각각 27주, 34주 또는 71주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 식염수-처리된 대조군에 비해 * = P < 0.05; 식염수-처리된 대조군에 비해 **** = P ≤ 0.0001.
도 4는 도 3에 기재된 바와 같이 처리된 PiZ 마우스의 혈액에 남아있는 인간 Z-AAT 단백질의 백분율(%)을 도시하는 그래프를 제공한다. 혈액은 연구 4, 8, 12, 16, 20주차에, 및 연구 종료시에 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 식염수-처리된 대조군에 비해 * = P < 0.05; 식염수-처리된 대조군에 비해 *** = P ≤ 0.001; 식염수-처리된 대조군에 비해 **** = P ≤ 0.0001
도 5는 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 남아있는 인간 Z-AAT 단백질을 측정하는 웨스턴 블롯 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주령에 시작되었고 연구 완료 시(27주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 6은 도 5의 웨스턴 블롯을 기반으로 측정된 인간 Z-AAT 단백질 수준을 정량화한 그래프를 제공한다. 식염수-처리된 대조군에 비해 * = P < 0.05; 식염수-처리된 대조군에 비해 **** = P ≤ 0.0001.
도 7은 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 남아있는 총 인간 Z-AAT 단백질(총 A1AT 단백질 항체를 사용하여 측정)을 측정하는 면역조직화학 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주령에 시작되었고 연구 완료 시(27주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 기준선 샘플은 5주령의 마우스로부터 수집되었다.
도 8은 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 인간 Z-AAT 중합체 부하를 측정하는 면역조직화학 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주령에 시작되었고 연구 완료 시(27주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 기준선 샘플은 5주령의 마우스로부터 수집되었다.
도 9는 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 인간 Z-AAT 중합체 부하를 측정하는 면역조직화학 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 49주령에 시작되었고 연구 완료 시(71주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 기준선 샘플은 49주령의 마우스로부터 수집되었다.
도 10은 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 간 세포내 소구체 형성을 측정하는 주기적 산-쉬프-디아스타제(Periodic acid-Schiff-diastase) (PAS-D) 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주령에 시작되었고 연구 완료 시(27주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 기준선 샘플은 5주령의 마우스로부터 수집되었다.
도 11은 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 세포 증식(Ki67)을 측정하는 면역조직화학 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주령에 시작되었고 연구 완료 시(27주령) 간 말단 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 기준선 샘플은 5주령의 마우스로부터 수집되었다.
도 12는 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459의 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 간 섬유증(시리우스 레드 염색)의 면역조직화학 이미지를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주령에 시작되었고 연구 완료 시(27주령) 말단 간 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 기준선 샘플은 5주령의 마우스로부터 수집되었다.
도 13은 22주 기간에 걸쳐 4주마다 한번 3 mg/kg SERPINA1-1459를 6회 투여 후 PiZ 마우스의 간에서 알라닌 아미노전이효소(ALT), 아스파르테이트 아미노전이효소(AST) 및 알칼리성 포스파타제의 수준을 도시하는 그래프를 제공한다 (즉, 0일차의 초기 투여, 및 4, 8, 12, 16 및 20주차의 투여). 치료는 5주, 12주 또는 49주령에 시작되었고 연구 완료 시(각각 27주, 34주 또는 71주령) 말단 혈액 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다. 식염수-처리된 대조군에 비해 * = P < 0.05; 식염수-처리된 대조군에 비해 **** = P ≤ 0.0001.
도 14는 SERPINA1-1459로 처리된 PiZ 마우스에서 SERPINA1 mRNA, 혈청 Z-AAT 단백질, 간 Z-AAT 단백질 및 간 소구체의 용량-의존적 녹다운을 도시하는 그래프를 나타낸다. 치료는 5주령에 시작되었고 0, 0.3, 1 또는 3mg/kg SERPINA1-1459의 4회 투여 후 18주령에 시료(specimen)가 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 15 는 4주마다 한번 0, 0.3, 1 또는 3 mg/kg SERPINA1-1459의 4회 투여 후 PiZ 마우스의 간의 산-쉬프-디아스타제 (PAS-D) 염색에 의한 용량-의존 간 세포내 소구 형성을 측정하는 간 조직 샘플의 이미지를 제공한다. 치료는 5주령에 시작되었고 18주령에 말단 간 샘플이 수집되었다. 식염수 처리된 마우스가 대조군으로 사용되었다.
도 16은 SERPINA1-1459의 단일 1, 3, 또는 10 mg/kg 피하(SC) 투여로 치료된 비인간 영장류(NHP)의 평균 및 개별 체중을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 17a는 SERPINA1-1459의 단일 1, 3, 또는 10 ㎎/㎏ 피하 (SC) 투여 후 NHP에서 혈액에 남아있는 (즉, 순환 A1AT 단백질) A1AT 단백질의 백분율(%)을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 17b는 SERPINA1-1459의 단일 1, 3, 또는 10 ㎎/㎏ 피하 (SC) 투여 후 NHP에서 혈액에 남아있는 (즉, 순환 A1AT 단백질) A1AT 단백질의 백분율(%)을 도시하는 그래프를 제공한다. 혈청은 29일, 57일, 85일 및 127일차에 수집되었다. 대조군 혈청(투여 전 수집)이 사용되었다.
도 18은 0, 30, 100, 또는 300 mg/kg의 SERPINA1-1459(4주마다; 4회 투여)의 반복 투여 후 시노몰구스 마카크(cynomolgus macaque)에서 순환하는 A1AT 단백질 농도를 도시하는 그래프를 보여준다. A1AT 단백질은 어린 원숭이와 젊은 성체 원숭이에서 87일차에, 어린 원숭이에서 141일차에 측정되었다. 대조군 혈청(미처리)을 사용하였다.
도 19는 0, 20, 60 또는 180 mg/kg의 SERPINA1-1459(4주마다; 10회 투여)의 반복 투여 후 시노몰구스 마카크의 간에서 남아 있는 SERPINA1 mRNA의 백분율(%)을 도시하는 그래프를 제공한다. "주요 연구 군"은 최종 용량 투여 후 2일에 부검되었고 "R"은 SERPINA1-1459의 마지막 투여 후 8주차에 대상체가 부검된 회수 부검물을 나타낸다.
도 20은 닉킹된(nicked) 테트라루프 구조의 개략도를 제공한다.
25 내지 35개 뉴클레오티드의 가닥 길이를 보유한 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제는 포유동물 세포에서 표적 유전자 발현의 효과적인 억제제로서 기재되어 있다(Rossi 등, 미국 특허 출원 번호 2005/0244858 및 US 2005/0277610). 이러한 길이의 dsRNA 제제는 RNA 간섭(RNAi) 경로의 다이서 효소에 의해 처리되는 것으로 믿어지며, 이러한 작용제는 "다이서 기질 siRNA"("DsiRNA") 작용제로 칭해진다. DsiRNA 제제의 추가 변형된 구조는 이전에 기재되었다(Rossi 등, 미국 특허 출원 번호 2007/0265220). 효과적인 확장 형태의 다이서 기질도 최근에 기재되었다(Brown, US 8,349,809, US 10,370,655 및 US 2010/0173974). α-1 항트립신을 표적으로 하는 개선된 핵산 제제가 본원에 제공된다. α-1 항트립신을 표적으로 하는 것들이 구체적으로 예시되어 있다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 간에서 α-1 항트립신 또는 SERPINA1 발현을 감소시키는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)를 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 간에서 α-1 항트립신 발현과 관련된 질환을 치료하도록 설계된다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 세포(예를 들어, 간 세포) 또는 기관(예를 들어, 간)에서 α-1 항트립신 발현을 감소시킴으로써 α-1 항트립신 발현과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 α-1 항트립신(A1AT)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32에 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31, 각각에 제시된 바와 같은 5'에서 3'으로의 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드가 2'-변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 2'-변형은 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 α-1 항트립신(A1AT)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 26에 제시된 5'에서 3'의 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 서열번호 25에 제시된 5'에서 3'의 서열을 갖는 센스 가닥을 포함한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 α-1 항트립신(A1AT)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 26에 제시된 5'에서 3'의 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 서열번호 105에 제시된 5' 에서 3'의 서열을 갖는 센스 가닥을 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드가 2'-변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 2'-변형은 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 5'에서 3'로 번호가 매겨진 36개의 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 5에서 3'로 번호가 매겨진 22개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하기 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 6, 8, 11-13, 15, 17, 또는 19-22 위치. 일부 구현예에서, 하기 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 3, 5, 8-11, 13, 15, 또는 17 번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2-5, 7, 9, 10, 14, 16, 또는 18번 위치.
특정 구현예에서, 하기 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1-3, 5, 8, 10-12, 14, 15, 17, 19, 또는 22번 위치. 일부 구현예에서, 하기 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 3, 5, 8-11, 13, 15, 또는 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2-4, 6, 7, 9, 13, 16, 18, 20, 또는 21번 위치.
특정 구현예에서, 하기 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8, 9, 11-13, 15, 18, 또는 20-22번 위치. 일부 구현예에서, 하기 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13, 또는 17번 위치 및/또는 위치 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 10, 14, 16, 17 또는 19번 위치.
특정 구현예에서, 하기 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8-11, 13, 15, 17, 18 또는 20-22번 위치. 일부 구현예에서, 하기 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13, 또는 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 12, 14, 16, 또는 19번 위치.
특정 추가 구현예에서, 하기 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1-7 및 12-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 6, 8-13 및 15-22번 위치. 일부 구현예에서, 하기 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 8-11번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2-5, 7 및 14번 위치.
일부 구현예에서, 하기 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 9, 11, 13, 15, 17, 18, 또는 20-22번 위치. 일부 구현예에서, 하기 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13 및 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 14, 16 및 19번 위치
특정 구현예에서, 본 개시내용은 α-1 항트립신 (A1AT)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102 및 104 및 서열번호 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 및 103 각각으로부터 선택된 서열을 포함하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 각각 센스 가닥의 1 및 2번 위치, 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치, 안티센스 가닥의 2 및 3번 위치, 안티센스 가닥의 3 및 4번 위치, 안티센스 가닥의 20 및 21번 위치, 및 안티센스 가닥의 21 및 22번 위치 간 포스포로티오에이트 연결을 갖는다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 1번 위치에 있는 우리딘은 포스페이트 유사체를 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 1번 위치에 하기 구조를 포함한다:
.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 S1-L-S2로 기재된 스템-루프를 포함하는 센스 가닥을 포함하고, S1은 S2에 상보적이고, L은 길이가 3-5개 뉴클레오티드의 S1과 S2 사이에 루프를 형성하고, 임의로 L은 테트라루프이다. 일부 구현예에서, 테트라루프는 서열 5’-GAAA-3’을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 중 하나 이상이 1가 GalNAc 모이어티에 접합된다.
상기 개시된 구현예 중 임의의 것에서, -GAAA- 서열은 하기의 구조를 포함하고:
,
식 중:
L은 결합, 클릭 화학 핸들, 또는 치환 및 비치환된 알킬렌, 치환 및 비치환된 알케닐렌, 치환 및 비치환된 알키닐렌, 치환 및 비치환된 헤테로알킬렌, 치환 및 비치환 헤테로알케닐렌, 치환 및 비치환된 헤테로알키닐렌, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 20개 길이의 포함하는, 연속적, 공유 결합된 원자의 링커를 나타내고; X는 O, S, 또는 N이다.
특정 구현예에서, L은 아세탈 링커이다. 일부 구현예에서, X는 O이다.
일부 구현예에서, -GAAA- 서열은 하기의 구조를 포함한다:
.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 및 Na+ 반대이온을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 도 2a에 도시된 바와 같은 화학 구조를 갖는 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 A1AT의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하고, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 26에 제시된 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 서열번호 105에 제시된 서열을 갖는 센스 가닥을 포함하고,
센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8-11, 13, 15, 17, 18, 또는 20-22번 위치 모두는 2'-O-메틸로 변형되고, 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13 및 17번 위치 및 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 12, 14, 16 및 19번 위치 모두는 2'-플루오로로 변형되고;
여기서 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 1과 2번 위치, 안티센스 가닥의 1과 2번 위치, 안티센스 가닥의 2와 3번 위치, 안티센스 가닥의 3과 4번 위치, 안티센스 가닥의 20과 21번 위치, 및 안티센스 가닥의 21과 22번 위치 각각 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖고;
여기서 올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 1번 위치에 하기 구조를 포함한다:
센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 각각은 하기의 구조; 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 1가 GalNAc 모이어티에 접합된다:
.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 올리고뉴클레오티드를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기재된 조성물 또는 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 상기 대상체에서 간 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 전달되며, 상기 간 질환 또는 장애는 만성 간 질환, 간 염증, 간경변증, 간 섬유증 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 특정 예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 조성물은 정맥내로 또는 피하로 대상체에게 투여된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 A1AT의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 26에 제시된 서열을 포함하는 안티센스 가닥 및 서열번호 105에 제시된 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하고,
센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8-11, 13, 15, 17, 18, 또는 20-22번 위치 모두는 2'-O-메틸로 변형되고, 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13 및 17번 위치 및 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 12, 14, 16 및 19번 위치 모두는 2'-플루오로로 변형되고;
올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 1과 2번 위치, 안티센스 가닥의 1과 2번 위치, 안티센스 가닥의 2와 3번 위치, 안티센스 가닥의 3과 4번 위치, 안티센스 가닥의 20과 21번 위치, 및 안티센스 가닥의 21과 22번 위치 각각 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖고;
여기서 올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 1번 위치에 하기 구조를 포함하고:
여기서 센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 각각은 하기의 구조를 포함하는 1가 GalNAc 모이어티에 접합된다:
.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 A1AT의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 26에 제시된 서열을 포함하는 안티센스 가닥 및 서열번호 105에 제시된 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하고,
센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8, 9, 11-13, 15, 18, 또는 20-22번 위치 모두는 2'-O-메틸로 변형되고, 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13 및 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 10, 14, 16, 17 또는 19번 위치 모두는 2'-플루오로로 변형된다.
여기서 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 1과 2번 위치, 안티센스 가닥의 1과 2번 위치, 안티센스 가닥의 2와 3번 위치, 안티센스 가닥의 3과 4번 위치, 안티센스 가닥의 20과 21번 위치, 및 안티센스 가닥의 21과 22번 위치 각각 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖고;
여기서 올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 1번 위치에 하기 구조를 포함하고:
여기서 센스 가닥 상의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 각각은 하기의 구조를 포함하는 1가 GalNAc 모이어티에 접합된다:
.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 Na+ 반대이온을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 포유동물에서 표적 α-1 항트립신 mRNA의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 본원에 기재된 바와 같이 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 표적 α-1 항트립신 mRNA의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 지질 나노입자(LNP)로 제형화된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 하루에 상기 포유동물의 킬로그램당 1마이크로그램 내지 5 밀리그램, 킬로그램당 100 마이크로그램 내지 0.5 밀리그램, 킬로그램 당 0.001 내지 0.25 밀리그램, 킬로그램 당 0.01 내지 20 마이크로그램, 킬로그램 당 0.01 내지 10 마이크로그램, 킬로그램 당 0.10 내지 5 마이크로그램, 및 킬로그램 당 0.1 내지 2.5 마이크로그램 으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여량으로 투여된다.
일부 구현예에서, α-1 항트립신 mRNA 수준은 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드가 상기 포유동물에게 투여된 후 적어도 3일 후에 상기 포유동물의 조직에서 적어도 70%의 양(%로 표현됨)만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 상기 조직은 간 조직이다.
특정 구현예에서, 상기 투여 단계는 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 주입, 피하 주사, 경피, 에어로졸, 직장, 질, 국소, 경구 및 흡입 전달로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 방식을 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 간 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기에 충분한 양의 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 간 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 대상체에서, 상기 간 질환 또는 장애는 만성 간 질환, 간 염증, 간경변증, 간 섬유증 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다.
α-1 항트립신 발현의 올리고뉴클레오티드 억제제
α-1 항트립신 표적 서열
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 α-1 항트립신 mRNA를 포함하는 표적 서열을 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 부분, 단편 또는 가닥(예를 들어, 이중-가닥(ds) RNAi 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥)은 α-1 항트립신 mRNA를 포함하는 표적 서열에 결합하거나 어닐링하고, 이에 의해 α-1 항트립신 발현을 억제한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 α-1 항트립신 발현을 억제할 목적으로 α-1 항트립신 표적 서열에 표적화된다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 표적 서열을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 α-1 항트립신 발현 억제의 양 또는 정도는 올리고뉴클레오티드의 효능과 상관관계가 있다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 표적 서열을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 α-1 항트립신 발현 억제의 양 또는 정도는 올리고뉴클레오티드로 처리된 α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체 또는 환자의 치료적 이점의 양 또는 정도와 상관관계가 있다.
여러 상이한 종(예를 들어, 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스 및 래트; 예를 들어, 실시예 2 및 3 참조)의 mRNA를 포함하는 α-1 항트립신을 암호화하는 mRNA의 염기서열 검사를 통해 및 시험관내 및 생체내 테스트의 결과(예를 들어, 실시예 2-8 참조)로서, α-1 항트립신 mRNA의 특정 뉴클레오티드 서열이 올리고뉴클레오티드 계 억제에 대해 다른 것보다 더 순응적이고 따라서 본원에서 뉴클레오티드에 대한 표적 서열로서 유용하다는 것이 발견되었다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)의 센스 가닥은 α-1 항트립신 표적 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)의 센스 가닥의 일부 또는 영역은 α-1 항트립신 표적 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 표적 서열은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 표적 서열은 서열번호 25의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
α-1 항트립신 표적화 서열
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 세포 내에서 α-1 항트립신 mRNA를 표적화하고 α-1 항트립신 발현을 억제 및/또는 감소시키기 위한 목적으로 (예를 들어, α-1 항트립신 mRNA의 표적 서열 내에서) α-1 항트립신 mRNA에 대한 상보성의 영역을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 상보성 (왓슨-크릭) 염기 쌍형성(base pairing)에 의해 α-1 항트립신 표적 서열에 결합하거나 또는 어닐링하는 상보성 영역을 갖는 α-1 항트립신 표적화 서열 (예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥)을 포함한다. 표적화 서열 또는 상보성 영역은 일반적으로 α-1 항트립신 발현을 억제 및/또는 감소시킬 목적으로 올리고뉴클레오티드(또는 그의 가닥)를 α-1 항트립신 mRNA에 결합 또는 어닐링할 수 있도록 적합한 길이 및 염기 함량이다. 일부 구현예에서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 적어도 약 12개, 적어도 약 13개, 적어도 약 14개, 적어도 약 15개, 적어도 약 16개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 적어도 약 20개, 적어도 약 21개, 적어도 약 22개, 적어도 약 23개, 적어도 약 24개, 적어도 약 25개, 적어도 약 26개, 적어도 약 27개, 적어도 약 28개, 적어도 약 29개 또는 적어도 약 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 약 12 내지 약 30개 (예를 들어, 12 내지 30개, 12 내지 22개, 15 내지 25개, 17 내지 21개, 18 내지 27개, 19 내지 27개, 또는 15 내지 30개) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 약 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드 이다. 일부 구현예에서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 18개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 19개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 20개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 21개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 22개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 23개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 24개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31 중 어느 하나의 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 18개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31 중 어느 하나의 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 19개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31 중 어느 하나의 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 20개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31 중 어느 하나의 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 21개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31 중 어느 하나의 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 길이가 22개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 α-1 항트립신 표적 서열에 완전히 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역 (예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥)을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 α-1 항트립신 표적 서열에 부분적으로 상보적이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 α-1 항트립신의 서열에 완전히 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 α-1 항트립신의 서열에 부분적으로 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31 중 어느 하나의 서열에 완전히 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 25에 제시된 서열에 완전히 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31 중 어느 하나의 서열에 부분적으로 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 25에 제시된 서열에 부분적으로 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 α-1 항트립신 mRNA를 포함하는 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하며, 여기서 뉴클레오티드의 연속 서열은 길이가 약 12 내지 약 30개의 뉴클레오티드(예를 들어, 12 내지 30, 12 내지 28, 12 내지 26, 12 내지 24, 12 내지 20, 12 내지 18, 12 내지 16, 14 내지 22, 16 내지 20, 18 내지 20 또는 18 내지 19개의 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 α-1 항트립신 mRNA를 포함하는 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하며, 여기서 뉴클레오티드의 연속 서열은 길이가 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 α-1 항트립신 mRNA를 포함하는 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하며, 여기서 뉴클레오티드의 연속 서열은 길이가 19개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 α-1 항트립신 mRNA를 포함하는 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하며, 여기서 뉴클레오티드의 연속 서열은 길이가 20개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 뉴클레오티드의 인접 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 여기서 표적화 영역 또는 상보성 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31에서 선택되고, 임의로 여기서 뉴클레오티드의 인접 서열은 길이가 19개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 인접 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 여기서 표적화 영역 또는 상보성 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31에서 선택되고, 여기서 뉴클레오티드의 연속 서열은 길이가 19개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 인접 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 여기서 표적화 영역 또는 상보성 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31에서 선택되고, 여기서 뉴클레오티드의 연속 서열은 길이가 20개 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)의 표적화 서열 또는 상보성 영역은 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보성이고, 여기서 표적화 서열 또는 상보성 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택되고 안티센스 가닥의 전체 길이에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 표적화 서열 또는 상보성 영역은 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적이며, 여기서 표적화 서열 또는 상보성 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택되고, 안티센스 가닥의 전체 길이의 일부에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31 중 어느 하나에 제시된 서열의 뉴클레오티드 1-20에 걸쳐 있는 뉴클레오티드의 인접 스트레치에 적어도 부분적으로 (예를 들어, 완전히) 상보적인 상보성 영역 (예를 들어, dsRNA의 안티센스 가닥 상에)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 상응하는 α-1 항트립신 표적 서열과 하나 이상의 염기쌍 (bp) 불일치(mismatch)를 갖는 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 상응하는 α-1 항트립신 표적 서열과 최대 약 1, 최대 약 2, 최대 약 3, 최대 약 4, 최대 약 5 등의 불일치를 가질 수 있는데, 단, 적절한 혼성화 조건 하에서 α-1 항트립신 mRNA에 결합하거나 어닐링하는 표적화 서열 또는 상보성 영역의 능력 및/또는 α-1 항트립신 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드의 능력이 유지되어야 한다. 대안적으로, 표적화 서열 또는 상보성 영역은, 적절한 혼성화 조건 하에서 α-1 항트립신 mRNA에 결합하거나 어닐링하는 표적화 서열 또는 상보성 영역의 능력 및/또는 α-1 항트립신 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드의 능력이 유지되는 한, 상응하는 α-1 항트립신 표적 서열과 1 이하, 2 이하, 3 이하, 4 이하, 또는 5 이하의 불일치를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 상응하는 표적 서열과 1개의 불일치를 갖는 상보성의 표적 서열 또는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 상응하는 표적 서열과 2개의 불일치를 갖는 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 상응하는 표적 서열과 3개의 불일치를 갖는 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 상응하는 표적 서열과 4개의 불일치를 갖는 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 상응하는 표적 서열과 5개의 불일치를 갖는 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 상응하는 표적 서열과 하나 이상의 불일치 (예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 불일치)를 갖는 상보성의 표적 서열 또는 영역을 포함하며, 여기서 불일치의 적어도 2 (예를 들어, 모두)가 연속적으로 위치되거나 (예를 들어, 일렬로 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 불일치), 또는 불일치가 상보성의 표적 서열 또는 영역 전체에 걸쳐 산재된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 상응하는 표적 서열과 하나 이상의 불일치(예를 들어, 연이어 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 불일치)를 갖는 상보성의 표적화 서열 또는 영역을 포함하며, 여기서 불일치의 적어도 2(예를 들어, 모두)는 연속적으로 위치되거나(예를 들어, 연이어 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 불일치), 또는 적어도 하나 이상의 비-불일치 염기쌍은 불일치 사이에 위치되거나, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 여기서 표적화 영역 또는 상보성 영역은 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택되고, 여기서 표적화 서열 또는 상보성 영역은 상응하는 α-1 항트립신 표적 서열과 최대 약 1, 최대 약 2, 최대 약 3, 최대 약 4, 최대 약 5 등의 불일치를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 여기서, 표적화 영역 또는 상보성 영역은 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택되고, 여기서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 상응하는 α-1 항트립신 표적 서열과 1 이하, 2 이하, 3 이하, 4 이하 또는 5 이하의 불일치를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 여기서 표적화 영역 또는 상보성 영역은 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택되고, 여기서 표적화 서열 또는 상보성 영역은 상응하는 α-1 항트립신 표적 서열과 최대 약 1, 최대 약 2, 최대 약 3, 최대 약 4, 최대 약 5 등의 불일치를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 여기서, 표적화 영역 또는 상보성 영역은 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택되고, 여기서, 표적화 서열 또는 상보성 영역은 상응하는 α-1 항트립신 표적 서열과 1 이하, 2 이하, 3 이하, 4 이하 또는 5 이하의 불일치를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 유형
다양한 올리고뉴클레오티드 유형 및/또는 구조가 RNAi 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), miRNA 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본원의 발명의 방법에서 α-1 항트립신을 표적화하는데 유용하다. 본원 또는 다른 곳에 기재된 임의의 올리고뉴클레오티드 유형은 α-1 항트립신 발현을 억제하기 위한 목적으로 본원의 α-1 항트립신 표적화 서열을 혼입하기 위한 프레임워크로서 사용하기 위해 고려된다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 다이서 관여의 상류 또는 하류의 RNA 간섭(RNAi) 경로와 결합하여 α-1 항트립신 발현을 억제한다. 예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드는 약 19-25 뉴클레오티드의 크기를 갖는 각각의 가닥과 1 내지 5 뉴클레오티드의 적어도 하나의 3' 오버행을 갖는 것으로 개발되었다(예를 들어, 미국 특허 제8,372,968호 참조). 또한 다이서에 의해 처리되어 활성 RNAi 생성물을 생성하는 더 긴 올리고뉴클레오티드가 개발되었다(예를 들어, 미국 특허 제8,883,996호 참조). 추가로 작업하여, 적어도 하나의 가닥의 적어도 하나의 말단이 듀플렉스 표적화 영역을 넘어 연장되는 확장된 dsRNA를 생산하였으며, 이는 가닥 중 하나가 열역학적으로 안정화되는 테트라루프 구조를 포함하는 구조를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제 8,513,207호 및 제 8,927,705호, 뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 제WO 2010/033225호 참조). 이러한 구조는 단일 가닥 (ss) 연장부 (분자의 한 면 또는 양 면) 뿐만 아니라 이중 가닥 (ds) 연장부를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 다이서의 관여(예를 들어, 다이서 절단)의 하류의 RNAi 경로와 결합한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 3' 말단에 오버행 (예를 들어, 길이가 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드)을 갖는다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)는 표적 RNA에 대해 안티센스인 21-뉴클레오티드 가이드 가닥 및 상보적 패신저 가닥을 포함하며, 양 가닥은 어닐링되어 19-bp 듀플렉스 및 2개의 뉴클레오티드 오버행을 3' 말단 중 하나 또는 둘 모두에서 형성한다. 23개의 뉴클레오티드의 가이드 가닥 및 21개의 뉴클레오티드의 패신저 가닥을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 더 긴 올리고뉴클레오티드 설계가 또한 이용가능하며, 분자의 우양태에 평활 말단(blunt end)(패신저 가닥의 3' 말단/가이드 가닥의 5' 말단) 및 분자의 좌양태에 2개의 뉴클레오티드 3'-가이드 가닥 오버행(패신저 가닥의 5' 말단/가이드 가닥의 3' 말단)이 있다. 이러한 분자들에서, 21 bp 듀플렉스 영역이 있다. 예를 들어, 미국 특허 제9,012,138호; 제9,012,621호 및 제9,193,753호를 참조한다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 17 내지 36개 (예를 들어, 17 내지 36개, 20 내지 25개 또는 21-23개) 뉴클레오티드의 범위 내에 있는 센스 및 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 19-22 뉴클레오티드 범위 내에 있는 센스 및 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥은 길이가 동일하다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥, 또는 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두에 3'-오버행이 있도록 센스 및 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 길이가 약 21-23개 뉴클레오티드 범위 내에 있는 센스 및 안티센스 가닥을 모두 갖는 올리고뉴클레오티드에 대해, 센스, 안티센스 또는 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두의 3' 오버행은 길이가 1 또는 2개 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 22개의 뉴클레오티드의 가이드 가닥 및 20개의 뉴클레오티드의 패신저 가닥을 가지며, 분자의 우양태에 평활 말단(패신저 가닥의 3' 말단/가이드 가닥의 5' 말단) 및 분자의 좌양태에 2개의 뉴클레오티드 3'-가이드 가닥 오버행(패신저 가닥의 5' 말단/가이드 가닥의 3' 말단)이 있다. 이러한 분자들에서, 20 bp 듀플렉스 영역이 있다.
본원의 조성물 및 방법과 사용하기 위한 다른 올리고뉴클레오티드 디자인은 하기를 포함한다: 16량체 siRNA(예를 들어, Nucleic Acids in Chemistry and Biology. Blackburn (ed.), Royal Society of Chemistry, 2006 참조), shRNA(예를 들어, 길이가 19bp 인 것; 예를 들어, Moore 등 (2010) Methods Mol. Biol. 629:141-158 참조), 평활 siRNA(예를 들어, 길이가 19bp 인 것, 예를 들어, Kraynack & Baker (2006) RNA 12:163-176 참조), 비대칭 siRNA(aiRNA; 예를 들어, Sun 등 (2008) Nat. Biotechnol. 26:1379-1382 참조), 비대칭 더 짧은-듀플렉스 siRNA(예를 들어, Chang 등 (2009) Mol. Ther. 17:725-32 참조), 포크(fork) siRNA(예를 들어, Hohjoh (2004) FEBS Lett. 557:193-198 참조), ss siRNA(Elsner (2012) Nat. Biotechnol. 30:1063), 덤벨 모양의 원형 siRNA(예를 들어, Abe 등 (2007) J. Am. Chem. Soc. 129:15108-09 참조), 및 작은 내부 분절된 간섭 RNA(siRNA; 예를 들어, Bramsen 등 (2007) Nucleic Acids Res. 35:5886-97 참조). α-1 항트립신의 발현을 감소 또는 억제하기 위해 일부 구현예에서 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 구조의 추가의 비제한적 예는 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 짧은 siRNA이다(예를 들어, Hamilton 등 (2002) EMBO J. 21:4671-79 참조; 또한, 미국 특허 출원 공개 번호 제2009/0099115호 참조).
여전히, 일부 구현예에서, 본원에서 α-1 항트립신 발현을 감소 또는 억제하기 위한 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 (ss)이다. 이러한 구조는 단일가닥 RNAi 분자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 최근의 노력은 ss RNAi 분자의 활성을 입증하였다(예를 들어, Matsui 등 (2016) Mol. Ther. 24:946-55 참조). 그러나, 일부 구현예에서, 본원에서 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5' 에서 3' 방향으로 기록될 때, 특정 핵산의 표적화된 분절의 역 보체를 포함하고, 세포 내의 이의 표적 RNA의 RNaseH-매개된 절단을 유도하기 위해 (예를 들어, 갭머로서) 또는 세포 내의 표적 mRNA의 번역을 억제하기 위해 (예를 들어, 믹머로서) 적합하게 변형된 핵염기 서열을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드이다. 본원에서 사용하기 위한 ASO는, 예를 들어, 미국 특허 제9,567,587호에 나타낸 바와 같이 (예를 들어, 핵염기의 길이, 당 모이어티 (피리미딘, 퓨린), 및 핵염기의 헤테로시클릭 부분의 변경을 포함함) 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방식으로 변형될 수 있다. 또한, ASO는 특정 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔다 (예를 들어, Bennett 등 (2017) Annu. Rev. Pharmacol. 57:81-105 참조).
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 α-1 항트립신 mRNA와 상보성 영역을 공유한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31을 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 15-50개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 15-25개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 22개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나에 상보적이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가 적어도 20개의 연속 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 서열과 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이하다.
이중 가닥 올리고뉴클레오티드
센스 가닥(본원에서 패신저 가닥으로도 지칭됨) 및 안티센스 가닥(본원에서 가이드 가닥으로도 지칭됨)을 포함하는 (예를 들어, RNAi 경로를 통해) α-1 항트립신 mRNA를 표적화하고 α-1 항트립신 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 (ds) RNAi 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 별개의 가닥이고 공유적으로 연결되지 않는다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 공유적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 듀플렉스 영역을 형성하고, 여기서 센스 가닥 및 안티센스 가닥, 또는 이의 부분은 상보적 방식으로 (예를 들어, 왓슨-크릭 염기 쌍형성에 의해) 서로 결합한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 제1 영역(R1) 및 제2 영역(R2)을 갖고, 여기서 R2는 제1 서브영역(S1), 테트라루프(L) 또는 트리루프(triL), 및 제2 서브영역(S2)을 포함하고, L 또는 triL은 S1과 S2 사이에 위치하고, S1 및 S2는 제2 듀플렉스(D2)를 형성한다. D2는 다양한 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, D2는 길이가 약 1-6 bp이다. 일부 구현예에서, D2는 길이가 2-6, 3-6, 4-6, 5-6, 1-5, 2-5, 3-5 또는 4-5 bp이다. 일부 구현예에서, D2는 길이가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 bp이다. 일부 구현예에서, D2는 길이가 6 bp이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 R1은 제1 듀플렉스(D1)를 형성한다. 일부 구현예에서, D1은 길이가 적어도 약 15개(예를 들어, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개 또는 적어도 21개)의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, D1은 길이가 약 12 내지 30개의 뉴클레오티드 범위(예를 들어, 12 내지 30, 12 내지 27, 15 내지 22, 18 내지 22, 18 내지 25, 18 내지 27, 18 내지 30 또는 21 내지 30개의 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 구현예에서, D1은 길이가 적어도 12개의 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 12개 , 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 또는 적어도 30개의 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 구현예에서, D1은 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, D1은 길이가 20개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 D1은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 전체 길이에 걸쳐 있지 않다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 D1은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 또는 둘 모두의 전체 길이에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 D1은 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 모두의 전체 길이에 걸쳐 있다.
일부 구현예에서, 표 1에 정렬된 바와 같이, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 또는 31의 어느 하나의 서열을 갖는 센스 가닥 및 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 30 또는 32에서 선택된 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 하기로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다:
(a) 서열번호 25 및 26, 각각;
(b) 서열번호 27 및 28, 각각;
(c) 서열번호 29 및 30 각각;
(d) 서열번호 31 및 32, 각각;
(e) 서열번호 97 및 98, 각각;
(f) 서열번호 99 및 100 각각;
(g) 서열번호 101 및 102 각각; 및,
(h) 서열번호 103 및 104 각각.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호 31의 서열을 포함하고 안티센스 가닥은 서열번호 32의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호 25의 서열을 포함하고 안티센스 가닥은 서열번호 26의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 서열번호 25의 서열을 포함하고 안티센스 가닥은 서열번호 105의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 서열 목록에 제시된 서열은 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드) 또는 다른 핵산의 구조를 설명하는데 언급될 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 이러한 구현예에서, 실제 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵산은 명시된 서열과 본질적으로 동일하거나 유사한 상보적 특성을 유지하면서 명시된 서열과 비교할 때 하나 이상의 대안적인 뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 뉴클레오티드의 RNA 대응물 또는 RNA 뉴클레오티드의 DNA 대응물) 및/또는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드간 연결 및/또는 하나 이상의 다른 변형을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 25-뉴클레오티드 센스 가닥 및 다이서 효소에 의해 작용될 때 성숙 RISC에 혼입되는 안티센스 가닥을 초래하는 27-뉴클레오티드 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥은 27개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드)보다 길다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥은 25개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드)보다 길다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 또는 31로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 27개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드)보다 길다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 또는 31로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 25개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드)보다 길다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 다른 5' 말단에 비해 열역학적으로 덜 안정한 하나의 5' 말단을 갖는다. 일부 구현예에서, 센스 가닥의 3' 말단에 평활 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단에 3'-오버행을 포함하는 비대칭 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥 상의 3'-오버행은 길이가 약 1-8개의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 (가이드) 가닥의 3' 말단 상에 2개의 (2) 뉴클레오티드를 포함하는 오버행을 갖는다. 그러나 다른 오버행이 가능하다. 일부 구현예에서, 오버행은 길이가 1 내지 6개의 뉴클레오티드, 임의로 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 6개의 뉴클레오티드, 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 3'-오버행이다. 그러나, 일부 구현예에서, 오버행은 길이가 1 내지 6개의 뉴클레오티드, 임의로 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 6개의 뉴클레오티드, 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 5'-오버행이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 길이가 1 내지 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 5'-오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 30, 또는 32로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 1 내지 6개의 뉴클레오티드 길이를 포함하는 5'-오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 서열 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 30, 또는 32로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 길이가 1 내지 6 뉴클레오티드를 포함하는 5'-오버행을 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 3' 말단 상의 2개의 (2) 말단 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 3' 말단 상의 2개의 (2) 말단 뉴클레오티드는 표적 mRNA (예를 들어, α-1 항트립신 mRNA)와 상보적이다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 3' 말단 상의 2개의 (2) 말단 뉴클레오티드는 표적 mRNA와 상보적이지 않다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 3' 말단 상의 2개의 (2) 말단 뉴클레오티드는 쌍을 이루지 않는다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 3' 말단 상의 2개의 (2) 말단 뉴클레오티드는 쌍을 이루지 않은 GG를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 3' 말단 상의 2개의 (2) 말단 뉴클레오티드는 표적 mRNA에 상보적이지 않다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 각각의 3' 말단 상의 2개의 (2) 말단 뉴클레오티드는 GG이다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드의 각각의 3' 말단 상의 하나 또는 2개의 (2) 말단 GG 뉴클레오티드 둘 모두는 표적 mRNA와 상보적이지 않다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 인접 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하며, 여기서 표적화 영역 또는 상보성 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31로부터 선택되고, 여기에서 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 3' 말단 상의 2개의 (2) 말단 뉴클레오티드는 쌍을 이루지 않은 GG를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 30, 또는 32로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 3' 말단 상의 2개의 (2) 말단 뉴클레오티드는 쌍을 이루지 않은 GG를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 30, 또는 32로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 3' 말단 상의 2개의 (2) 말단 뉴클레오티드는 쌍을 이루지 않은 GG를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 센스 및 안티센스 가닥 사이에 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5) 불일치(들)가 존재한다. 센스 및 안티센스 가닥 사이에 하나 초과의 불일치가 있는 경우, 이들은 연속적으로 (예를 들어, 연이어 2, 3 또는 그 이상) 위치되거나 상보성 영역 전체에 걸쳐 산재될 수 있다. 일부 구현예에서, 센스 가닥의 3' 말단은 하나 이상의 불일치를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 (2) 불일치가 센스 가닥의 3' 말단에 혼입된다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥의 3' 말단에서 분절의 염기 불일치 또는 불안정화는 올리고뉴클레오티드의 효능을 개선시키거나 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 25 및 26, 각각;
(b) 서열번호 27 및 28, 각각;
(c) 서열번호 29 및 30, 각각;
(d) 서열번호 31 및 32, 각각;
(e) 서열번호 97 및 98, 각각;
(f) 서열번호 99 및 100, 각각;
(g) 서열번호 101 및 102, 각각; 및
(h) 서열번호 103 및 104, 각각;
센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 불일치(들)가 있다.
안티센스 가닥
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)의 안티센스 가닥은 "가이드 가닥"으로 지칭된다. 예를 들어, 안티센스 가닥으로서 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)와 결합하고 Ago2와 같은 아르고노트(Argonaute) 단백질에 결합하거나 하나 이상의 유사한 인자와 결합하고, 표적 유전자의 침묵을 지시하는 안티센스 가닥은 가이드 가닥으로 지칭된다. 일부 구현예에서, 가이드 가닥에 대한 상보성 영역을 포함하는 센스 가닥은 본원에서 "패신저 가닥"으로 지칭된다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 최대 약 50개의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 최대 50개, 최대 40개, 최대 35개, 최대 30개, 최대 27개, 최대 25개, 최대 21개, 최대 19개, 최대 17개 또는 최대 12개의 뉴클레오티드 길이)의 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 12개의 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 19개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 25개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 35개 또는 적어도 38개의 뉴클레오티드 길이)의 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 12 내지 약 40개 (예를 들어, 12 내지 40개, 12 내지 36개, 12 내지 32개, 12 내지 28개, 15 내지 40개, 15 내지 36개, 15 내지 32개, 15 내지 28개, 17 내지 22개, 17 내지 25개, 19 내지 27개, 19 내지 30개, 20 내지 40개, 22 내지 40개, 25 내지 40개 또는 32 내지 40개)의 뉴클레오티드 범위의 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 15 내지 30 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 안티센스 가닥은 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 22개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함한다.
일부 구현예에서, α-1 항트립신을 표적화하기 위한 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 30, 또는 32 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 12개의 (예를 들어, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 또는 적어도 22 또는 적어도 23) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 30, 또는 32 중 어느 하나에 제시된 서열의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신을 표적화하기 위한 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 30, 또는 32 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 적어도 12개의 (예를 들어, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22 또는 적어도 23) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 30 또는 32 중 어느 하나에 제시된 서열의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신을 표적화하기 위해 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 30, 또는 32 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 12개의 (예를 들어, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개 또는 적어도 23개) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 30, 또는 32 중 어느 하나에 제시된 서열의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
센스 가닥
일부 구현예에서, α-1 항트립신 mRNA를 표적화하고 α-1 항트립신 발현을 억제하기 위한 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나에 제시된 센스 가닥 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 12개의 (예를 들어, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개 또는 적어도 23개) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나에 제시된 서열의 연속적인 뉴클레오티드로 이루어진 센스 가닥을 갖는다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 mRNA를 표적화하고 α-1 항트립신 발현을 억제하기 위해 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나에 제시된 센스 가닥 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 12개 (예를 들어, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개 또는 적어도 23개)의 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나에 제시된 서열의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 센스 가닥을 갖는다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 mRNA를 표적화하고 α-1 항트립신 발현을 억제하기 위해 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나에 제시된 센스 가닥 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 또는 31 중 어느 하나에 제시된 서열의 적어도 약 12개 (예를 들어, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개 또는 적어도 23개)의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 센스 가닥을 갖는다
일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 최대 약 50개의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 최대 50개, 최대 40개, 최대 36개, 최대 30개, 최대 27개, 최대 25개, 최대 21개, 최대 19개, 최대 17개 또는 최대 12개의 뉴클레오티드 길이)의 센스 가닥 (또는 패신저 가닥)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 12개의 (예를 들어, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 19개, 적어도 21개, 적어도 25개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 36개 또는 적어도 38개 뉴클레오티드 길이) 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 약 12 내지 약 50개의 (예를 들어, 12 내지 50, 12 내지 40, 12 내지 36, 12 내지 32, 12 내지 28, 15 내지 40, 15 내지 36, 15 내지 32, 15 내지 28, 17 내지 21, 17 내지 25, 19 내지 27, 19 내지 30, 20 내지 40, 22 내지 40, 25 내지 40 또는 32 내지 40) 뉴클레오티드 길이의 범위의 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 15 내지 50개의 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 18 내지 36개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 36개의 뉴클레오티드 길이의 센스 가닥을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 센스 가닥의 3' 말단에 스템-루프 구조를 포함하는 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프는 가닥내 염기 쌍형성에 의해 형성된다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 이의 5' 말단에서 스템-루프 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 2개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 3개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 4개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 5개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 6개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 7개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 8개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 9개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 10개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 11개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 12개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 13개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다. 일부 구현예에서, 스템-루프의 스템은 14개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스를 포함한다.
일부 구현예에서, 스템-루프는 분해에 대한 올리고뉴클레오티드 보호(예를 들어, 효소 분해)를 제공하고, 표적 세포, 조직 또는 기관(예를 들어, 간), 또는 둘 모두에 대한 표적화 및/또는 전달을 용이하게 하거나 개선한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 스템-루프의 루프는 표적 mRNA (예를 들어, α-1 항트립신 mRNA)에 대한 표적화, 표적 유전자 발현 (예를 들어, α-1 항트립신 발현)의 억제, 및/또는 표적 세포, 조직 또는 기관 (예를 들어, 간)으로의 전달, 흡수, 및/또는 투과, 또는 이들의 조합을 용이하게 하거나, 개선하거나, 증가시키는 하나 이상의 변형을 포함하는 뉴클레오티드로 이루어진다. 일부 구현예에서, 스템-루프 자체 또는 스템-루프에 대한 변형(들)은 올리고뉴클레오티드의 고유 유전자 발현 억제 활성에 영향을 미치거나 실질적으로 영향을 미치지 않지만, 올리고뉴클레오티드의 안전성(예를 들어, 분해에 대한 보호 제공) 및 표적 세포, 조직 또는 기관(예를 들어, 간)으로의 전달, 흡수, 및/또는 침투를 용이하게 하거나, 개선하거나, 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 (예를 들어, 이의 3' 말단에) S1-L-S2로 제시된 스템-루프를 포함하는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 S1은 S2에 상보적이고, 여기서 L은 최대 약 10개의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드 길이)의 S1과 S2 사이의 연결된 뉴클레오티드의 단일-가닥 루프를 형성한다. 일부 구현예에서, 루프 (L)는 길이가 3개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 루프 (L)는 길이가 4개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 루프 (L)는 길이가 5개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 루프 (L)는 길이가 6개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 루프 (L)는 길이가 7개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 루프 (L)는 길이가 8개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 루프 (L)는 길이가 9개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 루프 (L)는 길이가 10개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 여기서 표적화 영역 또는 상보성 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택되고, 올리고뉴클레오티드는 S1-L-S2로 제시된 스템-루프를 포함하는 (예를 들어, 이의 3' 말단에) 센스 가닥을 포함하며, 여기서 S1은 S2에 상보적이고, 여기서 L은 최대 약 10개의 뉴클레오티드 길이(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드 길이)의 S1과 S2 사이에 단일-가닥 루프를 형성한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 여기서 표적화 영역 또는 상보성 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택되고, 올리고뉴클레오티드는 S1-L-S2로 제시된 스템-루프를 포함하는 (예를 들어, 이의 3' 말단에) 센스 가닥을 포함하며, 여기서 S1은 S2에 상보적이고, 여기서 L은 4개의 뉴클레오티드 길이의 S1과 S2 사이에 단일-가닥 루프를 형성한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 구조 S1-L-S2를 갖는 스템-루프의 루프(L)는 트리루프이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 여기서 표적화 영역 또는 상보성 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31 및 트리루프부터 선택된다. 일부 구현예에서, 트리루프는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 리간드 (예를 들어, 전달 리간드), 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기에 기재된 구조 S1-L-S2를 갖는 스템-루프의 루프(L)는 테트라루프이다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 연속 서열에 상보적인 표적화 서열 또는 상보성 영역을 포함하고, 여기서 표적화 영역 또는 상보성 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31 및 테트라루프로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 테트라루프는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 리간드(예를 들어, 전달 리간드), 및 이들의 조합을 포함한다.
듀플렉스 길이
일부 구현예에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 적어도 12개(예를 들어, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 또는 적어도 21개)의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 12-30개의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 12 내지 30, 12 내지 27, 12 내지 22, 15 내지 25, 18 내지 30, 18 내지 22, 18 내지 25, 18 내지 27, 18 내지 30, 19 내지 30 또는 21 내지 30개의 뉴클레오티드 길이)의 범위이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 12개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 13개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 14개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 15개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 16개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 17개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 18개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 19개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 20개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 21개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 22개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 23개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 24개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 26개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 27개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 28개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 29개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 길이가 30개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 전체 길이에 걸쳐 있지 않다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 사이의 듀플렉스는 센스 또는 안티센스 가닥 중 어느 하나의 전체 길이에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 듀플렉스는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 모두의 전체 길이에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 서열번호 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 및 103, 및 서열번호 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102 및 104으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 25 및 26, 각각;
(b) 서열번호 27 및 28, 각각;
(c) 서열번호 29 및 30, 각각;
(d) 서열번호 31 및 32, 각각;
(e) 서열번호 97 및 98, 각각;
(f) 서열번호 99 및 100, 각각;
(g) 서열번호 101 및 102, 각각; 및,
(h) 서열번호 103 및 104, 각각,
여기서, 센스 및 안티센스 가닥 사이에 형성된 듀플렉스는 12-30 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 12 내지 30, 12 내지 27, 12 내지 22, 15 내지 25, 18 내지 30, 18 내지 22, 18 내지 25, 18 내지 27, 18 내지 30, 19 내지 30 또는 21 내지 30 뉴클레오티드 길이)의 범위이다
올리고뉴클레오티드 말단
일부 구현예에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 하나 또는 둘 모두의 가닥의 말단은 평활 말단을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 하나 또는 둘 모두의 가닥의 말단은 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 오버행을 포함하는 하나 이상의 뉴클레오티드는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥의 3' 말단 및 안티센스 가닥의 5' 말단은 평활 말단을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥의 5' 말단 및 안티센스 가닥의 3' 말단은 평활 말단을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 가닥 중 하나 또는 둘 모두의 3' 말단은 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 3'-오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 3'-오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 3'-오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥 및 안티센스 가닥 모두는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 3'-오버행을 포함한다.
일부 구현예에서, 3'-오버행은 약 1개 내지 20개의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 약 20개의 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 구현예에서, 3' 오버행은 길이가 약 1 (1) 내지 19 (19), 1 (1) 내지 18 (18), 1 (1) 내지 17 (17), 1 (1) 내지 16 (16), 1 (1) 내지 15 (15), 1 (1) 내지 14 (14), 1 (1) 내지 13 (13), 1 (1) 내지 12 (12), 1 (1) 내지 11 (11), 1 (1) 내지 10 (10), 1 (1) 내지 9 (9), 1 (1) 내지 8 (8), 1 (1) 내지 7 (7), 1 (1) 내지 6 (6), 1 (1) 내지 5 (5), 1 (1) 내지 4 (4), 1 (1) 내지 3 (3) 또는 약 1 (1) 내지 2개의(2) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 (1)개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 2개의 (2) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 3개의 (3) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 4개의 (4) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 5개의 (5) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 6개의 (6) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 7개의 (7) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 8개의 (8) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 9개의 (9) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 10개의 (10) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 11개의 (11) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 12개의 (12) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 13개의 (13) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 14개의 (14) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 15개의 (15) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 16개의 (16) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 17개의 (17) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 18개의 (18) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 19개의 (19) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 20개의 (20) 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 3'-오버행을 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 서열번호 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 및 103 및 서열번호 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102 및 104에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 3'-오버행을 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 25 및 26, 각각;
(b) 서열번호 27 및 28, 각각;
(c) 서열번호 29 및 30 각각; 및,
(d) 서열번호 31 및 32, 각각,
여기서 안티센스 가닥은 길이가 약 1개 (1) 내지 20개의 (20) (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 약 20개의 뉴클레오티드 길이) 뉴클레오티드인 3'-오버행을 포함하고, 임의로 여기서 3'-오버행은 길이가 2개의 (2) 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 가닥 중 하나 또는 둘 모두의 5' 말단은 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 5'-오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 5'-오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 5'-오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥 및 안티센스 가닥 모두는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 5'-오버행을 포함한다.
일부 구현예에서, 5'-오버행은 약 1개 (1) 내지 20개 (20) 의 뉴클레오티드 길이 (예를 들어, 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 약 20개의 뉴클레오티드 길이)이다. 일부 구현예에서, 5' 오버행은 길이가 약 1 (1) 내지 19 (19), 1 (1) 내지 18 (18), 1 (1) 내지 17 (17), 1 (1) 내지 16 (16), 1 (1) 내지 15 (15), 1 (1) 내지 14 (14), 1 (1) 내지 13 (13), 1 (1) 내지 12 (12), 1 (1) 내지 11 (11), 1 (1) 내지 10 (10), 1 (1) 내지 9 (9), 1 (1) 내지 8 (8), 1 (1) 내지 7 (7), 1 (1) 내지 6 (6), 1 (1) 내지 5 (5), 1 (1) 내지 4 (4), 1 (1) 내지 3 (3) 또는 약 1 (1) 내지 2개의(2) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 (1)개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 2개의 (2) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 3개의 (3) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 4개의 (4) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 5개의 (5) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 6개의 (6) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 7개의 (7) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 8개의 (8) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 9개의 (9) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 10개의 (10) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 11개의 (11) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 12개의 (12) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 13개의 (13) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 14개의 (14) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 15개의 (15) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 16개의 (16) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 17개의 (17) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 18개의 (18) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 19개의 (19) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 5'-오버행은 길이가 20개의 (20) 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 5'-오버행을 포함하고, 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 25 및 26, 각각;
(b) 서열번호 27 및 28, 각각;
(c) 서열번호 29 및 30 각각; 및,
(d) 서열번호 31 및 32, 각각,
여기서 안티센스 가닥은 길이가 약 1 내지 20개(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 약 20개의 뉴클레오티드 길이)의 뉴클레오티드인 5'-오버행을 포함하고, 임의로 여기서 5'-오버행은 길이가 2개의 (2) 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 센스 및/또는 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단을 포함하는 1개 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상) 뉴클레오티드가 변형된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 3' 말단의 1 또는 2개의 말단 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드는 변형되며, 예를 들어, 2' 변형, 예를 들어, 2'-O-메톡시에틸을 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 3' 말단의 마지막 1 또는 2개의 말단 뉴클레오티드는 표적과 상보적이다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 3' 말단의 마지막 1 또는 2개의 뉴클레오티드는 표적과 상보적이지 않다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥의 3' 말단은 본원에 기재된 스템-루프를 포함하고 안티센스 가닥의 3' 말단은 본원에 기재된 3'-오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 센스 가닥 및 본원에 기재된 닉킹된(nicked) 테트라루프 구조를 형성하는 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥의 3' 말단은 스템-루프를 포함하고, 여기서 루프는 본원에 기재된 테트라루프이고, 여기서 안티센스 가닥의 3' 말단은 본원에 기재된 3'-오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 3'-오버행은 길이가 2개의 (2) 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 3'-오버행을 포함하는 2개의 (2) 뉴클레오티드는 둘 모두 구아닌 (G) 핵염기를 포함한다. 전형적으로, 안티센스 가닥의 3'-오버행을 포함하는 뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두는 표적 mRNA와 상보적이지 않다. 예시적인 올리고뉴클레오티드 구조가 도 20에 제공된다.
올리고뉴클레오티드 변형
일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 변형을 포함한다. 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 특이성, 안정성, 전달, 생체이용률, 뉴클레아제 분해로부터의 내성, 면역원성, 염기-쌍형성 특성, RNA 분포 및 세포 흡수 및 치료 또는 연구 용도와 관련된 다른 특징을 개선하거나 제어하기 위해 다양한 방식으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형은 변형된 당이다. 일부 구현예에서, 변형은 5'-말단 포스페이트 기이다. 일부 구현예에서, 변형은 변형된 뉴클레오티드간 연결이다. 일부 구현예에서, 변형은 변형된 염기이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 변형 중 어느 하나 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 당, 5'-말단 포스페이트 기, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결, 및 적어도 하나의 변형된 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 25 및 26, 각각;
(b) 서열번호 27 및 28, 각각;
(c) 서열번호 29 및 30 각각; 및,
(d) 서열번호 31 및 32, 각각,
여기서 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 당, 5'-말단 포스페이트 기, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결, 및 적어도 하나의 변형된 염기를 포함한다.
올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)에 대한 변형의 수 및 이들 뉴클레오티드 변형의 위치는 올리고뉴클레오티드의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 지질 나노입자(LNP) 또는 유사한 담체에서 이들에 접합하거나 이들을 포괄함으로써 생체 내에서 전달될 수 있다. 그러나, 올리고뉴클레오티드가 LNP 또는 유사한 담체에 의해 보호되지 않는 경우, 변형될 뉴클레오티드의 적어도 일부에 유리할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 전부 또는 실질적으로 전부가 변형된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드의 절반 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드의 절반 초과가 변형된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 모든 뉴클레오티드의 당 모이어티는 2' 위치에서 변형된다. 변형은 가역적이거나 비가역적일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 올리고뉴클레오티드는 원하는 특징 (예를 들어, 효소 분해로부터의 보호, 생체내 투여 후 원하는 세포를 표적화하는 용량, 및/또는 열역학적 안정성)을 유발하기에 충분한 수 및 유형의 변형된 뉴클레오티드를 갖는다.
당 변형
일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 변형된 당을 포함한다. 일부 구현예에서, (본원에서 당 유사체로도 언급되는) 변형된 당은 변형된 디옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함하며, 여기서, 예를 들어, 하나 이상의 변형은 당의 2', 3', 4' 및/또는 5' 탄소 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 변형된 당은 또한 비-천연 대안적 탄소 구조, 예컨대, 잠긴 핵산("LNA"; 예를 들어, Koshkin 등 (1998) TETRAHEDON 54:3607-30 참조), 잠금 해제된 핵산("UNA"; 예를 들어, Snead 등 (2013) Mol. Ther-Nucl. Acids 2:e103 참조) 및 브릿지된 핵산("BNA"; 예를 들어, Imanishi & Obika (2002) CHEM COMMON. (CAMB) 21:1653-59 참조)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 당에서의 뉴클레오티드 변형은 2'-변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 2'-변형은 2'-O-프로파길, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-플루오로(2'-F), 2'-아미노에틸(EA), 2'-O-메틸(2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸](2'- O-NMA) 또는 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산(2'-FANA)일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-F, 2'-OMe 또는 2'-MOE이다. 일부 구현예에서, 당에서의 변형은 당 고리의 하나 이상의 탄소의 변형을 포함할 수 있는 당 고리의 변형을 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 당의 변형은 당의 2'-산소가 당의 1'-탄소 또는 4'-탄소에 연결되거나, 2'-산소가 에틸렌 또는 메틸렌 브릿지를 통해 1'-탄소 또는 4'-탄소에 연결되는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-탄소에서 3'-탄소 결합이 없는 비환식 당을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는, 예를 들어, 당의 4' 위치에 티올기를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 적어도 약 1개의 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 1, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 또는 그 초과)를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥은 적어도 약 1개의 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 1, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 또는 그 초과)를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥은 적어도 약 1개의 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 1, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 또는 그 초과)를 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드(즉, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 모두)가 변형된다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-변형 (예를 들어, 2′-F 또는 2′-OMe, 2′-MOE, 및 2′-데옥시-2′-플루오로-β-d-아라비노핵산)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 상이한 변형 패턴을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 실시예 및 서열 목록에 제시된 변형 패턴을 갖는 센스 가닥 및 실시예 및 서열 목록에 제시된 변형 패턴을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 2'-F로 변형된 뉴클레오티드를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 2'-F 및 2'-OMe로 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 2'-F로 변형된 뉴클레오티드를 갖는 센스 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드는 2'-F 및 2'-OMe로 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 센스 가닥을 포함한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥의 8, 9, 10 또는 11번 위치 중 하나 이상은 2'-F 기로 변형된다. 일부 구현예에서, 센스 가닥의 3, 8, 9, 10, 12, 13 및 17번 위치 중 하나 이상은 2'-F 기로 변형된다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 2, 3, 4, 5, 7, 10 및 14번 위치 중 하나 이상은 2'-F 기로 변형된다. 일부 구현예에서, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 16 및 19번 위치 중 하나 이상은 2'-F 기로 변형된다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 내의 1-7번 및 12-20번 위치의 뉴클레오티드 각각에 있는 당 모이어티는 2'-OMe로 변형된다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 내의 1-7, 12-27 및 31-36번 위치의 뉴클레오티드 각각에 있는 당 모이어티는 2'-OMe로 변형된다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 내의 6, 9, 11-13, 15, 17, 18 및 20-22번 위치의 뉴클레오티드 각각에 있는 당 모이어티는 2'-OMe로 변형된다. 일부 구현예에서, 하기 위치 중 하나 이상은 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 6, 8, 11-13, 15, 17, 또는 19-22번 위치. 일부 구현예에서, 하기 위치 중 하나 이상은 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 3, 5, 8-11, 13, 15 또는 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2-5, 7, 9, 10, 14, 16 또는 18번 위치.
일부 구현예에서, 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13 및 17번 위치의 뉴클레오티드는 2'-F 기로 변형된다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 12, 14, 16 및 19번 위치의 뉴클레오티드는 2'-F 기로 변형된다. 일부 구현예에서, 센스 가닥 내의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 및 31-36번 위치의 뉴클레오티드는 2'-OMe로 변형된다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥 내의 1, 4, 6, 8-11, 13, 15, 17, 18 및 20-22번 위치의 뉴클레오티드는 2'-OMe로 변형된다. 일부 구현예에서, 하기 위치의 뉴클레오티드는 2'-O-Me로 변형된다: 센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 및 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8-11, 13, 15, 17, 18, 및 20-22번 위치. 일부 구현예에서, 하기 위치의 뉴클레오티드는 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 3, 8, 9, 10, 12, 13 및 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 12, 14, 16 및 19번 위치.
일부 구현예에서, 하기 위치 중 하나 이상이 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1-7 및 12-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 6, 8-13 및 15-22번 위치. 일부 구현예에서, 하기 위치 중 하나 이상이 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 8-11번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2-5, 7 및 14번 위치.
일부 구현예에서, 하기 위치 중 하나 이상이 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8-11, 13, 15, 17, 18, 또는 20-22번 위치. 일부 구현예에서, 하기 위치 중 하나 이상이 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13 및 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 12, 14, 16 및 19번 위치.
일부 구현예에서, 하기 위치 중 하나 이상이 2'-O-메틸로 변형된다: 센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8, 9, 11-13, 15, 18, 또는 20-22번 위치. 일부 구현예에서, 하기 위치 중 하나 이상이 2'-플루오로로 변형된다: 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13 또는 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 10, 14, 16, 17 또는 19번 위치.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 25 및 26, 각각;
(b) 서열번호 27 및 28, 각각;
(c) 서열번호 29 및 30 각각; 및,
(d) 서열번호 31 및 32, 각각,
센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13, 또는 17번 위치 중 하나 이상의 위치는 2'-F 기로 변형된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드에 당 모이어티를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 당 모이어티는 2'-F로 변형되거나 2'-O-프로파길, 2'-O-프로필아민, 2'-아미노, 2'-에틸, 2'-아미노에틸(EA), 2'-O-메틸(2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE), 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸](2'-O-NMA), 및 2'-데옥시-2'-플루오로-β-d-아라비노핵산(2'-FANA)로 이루어진 군으로부터 선택된 변형으로 변형된다.
5'-말단 포스페이트
일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥은 5'-말단 포스페이트를 포함한다. 일부 구현예에서, RNAi 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 포스페이트 기는 Ago2와의 상호작용을 향상시킨다. 그러나, 5'-포스페이트 기를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 포스파타제 또는 다른 효소를 통한 분해에 취약할 수 있으며, 이는 생체 내에서 이들의 성능 및/또는 생체이용률을 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 이러한 분해에 저항성인 5' 포스페이트의 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트, 비닐포스포네이트 또는 말로닐포스포네이트, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 가닥의 5' 말단은 천연 5'-포스페이트 기("포스페이트 모방체(mimic)")의 정전기적 및 입체 특성을 모방한 화학적 모이어티에 부착된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 및 31, 및 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 25 및 26, 각각;
(b) 서열번호 27 및 28, 각각;
(c) 서열번호 29 및 30 각각; 및,
(d) 서열번호 31 및 32, 각각,
여기서 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 포스페이트, 임의로 5'-말단 포스페이트 유사체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 당의 4'-탄소 위치에 포스페이트 유사체 ("4'-포스페이트 유사체"로 지칭됨)를 갖는다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제WO 2018/045317호를 참조한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 뉴클레오티드에서 4'-포스페이트 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 포스페이트 유사체는 옥시메틸기의 산소 원자가 당 모이어티 (예를 들어, 이의 4'-탄소에서) 또는 이의 유사체에 결합된 옥시메틸포스포네이트이다. 다른 구현예에서, 4'-포스페이트 유사체는 티오메틸기의 황 원자 또는 아미노 메틸기의 질소 원자가 당 모이어티 또는 이의 유사체의 4'-탄소에 결합된 티오메틸포스포네이트 또는 아미노메틸포스포네이트이다. 일부 구현예에서, 4'-포스페이트 유사체는 옥시메틸포스포네이트이다. 일부 구현예에서, 옥시메틸포스포네이트는 화학식 -O-CH2-PO(OH)2,-O-CH2-PO(OR)2, 또는 -O-CH2-POOH(R)로 표현되고, 여기서 R은 독립적으로 H, CH3, 알킬기, CH2CH2CN, CH2OCOC(CH3)3, CH2OCH2CH2Si (CH3)3 또는 보호기로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 알킬 기는 CH2CH3이고, 보다 전형적으로, R은 독립적으로 H, CH3 또는 CH2CH3으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R은 CH3이다. 일부 구현예에서, 4'-포스페이트 유사체는 4'-옥시메틸포스포네이트이다
일부 구현예에서, 4'-포스페이트 유사체는 4'-(메틸 메톡시포스포네이트)이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 뉴클레오티드에서 4'-포스페이트 유사체를 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 5'-말단 뉴클레오티드는 하기 구조를 포함한다:
4'-O-모노메틸포스포네이트-2'O-메틸우리딘 포스포로티오에이트[메포스포네이트-4O-mUs] [MeMOP]
변형된 뉴클레오티드간 연결
일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 변형된 뉴클레오티드 간 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 포스페이트 변형 또는 치환은 적어도 약 1 (예를 들어, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 5)개의 변형된 뉴클레오티드 간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나는 약 1 내지 약 10개 (예를 들어, 1 내지 10개, 2 내지 8개, 4 내지 6개, 3 내지 10개, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개 또는 1 내지 2개)의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로디티오에이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티오노알킬포스포트리에스테르 연결, 포스포아미다이트 연결, 포스포네이트 연결 또는 보라노포스페이트 연결일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 센스 가닥의 1 및 2번 위치, 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치, 안티센스 가닥의 2 및 3번 위치, 안티센스 가닥의 3 및 4번 위치, 안티센스 가닥의 20 및 21번 위치, 및 안티센스 가닥의 21 및 22번 위치 중 하나 이상 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 1 및 2번 위치, 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치, 안티센스 가닥의 2 및 3번 위치, 안티센스 가닥의 20 및 21번 위치, 및 안티센스 가닥의 21 및 22번 위치 각각 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 25 및 26, 각각;
(b) 서열번호 27 및 28, 각각;
(c) 서열번호 29 및 30 각각; 및,
(d) 서열번호 31 및 32, 각각,
그리고 여기서 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
염기 변형
일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 핵염기 (본원에서 염기 유사체로도 지칭됨)는 뉴클레오티드 당 모이어티의 1' 위치에서 연결된다. 일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 질소성 염기이다. 일부 구현예에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 2008/0274462 호를 참조한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 보편적인 염기(universal base)를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 핵염기 (탈염기(abasic))를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 25 및 26, 각각;
(b) 서열번호 27 및 28, 각각;
(c) 서열번호 29 및 30 각각; 및,
(d) 서열번호 31 및 32, 각각,
여기서 올리고뉴클레오티드 는 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함한다.
일부 구현예에서, 보편적인 염기는 변형된 뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드 당 모이어티의 1' 위치, 또는 뉴클레오티드 당 모이어티 치환에서의 동등한 위치에 위치된 헤테로시클릭 모이어티이고, 이는, 듀플렉스에 존재할 때, 듀플렉스의 구조를 실질적으로 변경시키지 않고 하나의 유형 초과의 염기에 대향하여 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 (예를 들어, α-1 항트립신 mRNA)에 완전히 상보적인 참조 단일-가닥 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)에 비해, 보편적인 염기를 함유하는 단일-가닥 핵산은 상보적 핵산으로 형성된 듀플렉스보다 더 낮은 Tm을 갖는 표적 핵산과 듀플렉스를 형성한다. 일부 구현예에서, 보편적인 염기가 염기로 대체되어 단일 불일치를 생성하는 기준 단일-가닥 핵산과 비교할 때, 보편적인 염기를 함유하는 단일-가닥 핵산은 불일치된 염기를 포함하는 핵산으로 형성된 듀플렉스보다 더 높은 Tm을 갖는 표적 핵산과 듀플렉스를 형성한다.
보편적인-결합 뉴클레오티드의 비제한적인 예는 이노신, 1-β-D-리보푸라노실-5-니트로인돌 및/또는 1-β-D-리보푸라노실-3-니트로피롤을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(미국 특허 출원 공개 제 2007/0254362호; Van Aerschot 등 (1995) Nucleic Acids Res. 23:4363-4370; Loakes 등 (1995) Nucleic Acids Res. 23:2361-66; 및 Loakes & Brown (1994) Nucleic Acids Res. 22:4039-43를 참조한다).
표적화 리간드
일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)를 하나 이상의 세포 또는 세포 유형, 조직, 기관, 또는 해부학적 영역 또는 구획으로 표적화하는 것이 바람직하다. 이러한 전략은 올리고뉴클레오티드 또는 이의 효과(예를 들어, α-1 항트립신 발현의 억제 또는 감소)로부터 유익하지 않을 세포, 조직, 기관, 또는 해부학적 영역 또는 구획에 대한 올리고뉴클레오타이드의 과도한 손실을 회피하는 데 도움이 될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 특정 세포 또는 세포 유형, 조직, 기관, 또는 해부학적 영역 또는 구획으로의 표적화 및/또는 전달을 용이하게 하도록 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 간으로의 전달을 용이하게 하도록) 변형된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화 리간드(들)에 접합된 적어도 하나의 뉴클레오티드(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 뉴클레오티드)를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 25 및 26, 각각;
(b) 서열번호 27 및 28, 각각;
(c) 서열번호 29 및 30, 각각; 및,
(d) 서열번호 31 및 32, 각각,
여기서 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 뉴클레오티드에 접합된 표적화 리간드를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 리간드는 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 단백질의 일부(예를 들어, 항체 또는 항체 단편), 또는 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 GalNAc 모이어티를 포함하는 탄수화물이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)의 1개 이상 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 뉴클레오티드는 각각 별개의 표적화 리간드 (예를 들어, GalNAc 모이어티)에 접합된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 2 내지 4개의 뉴클레오티드는 각각 별개의 표적화 리간드에 접합된다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 표적화 리간드가 칫솔의 칫솔모(bristle)와 닮고 올리고뉴클레오티드가 칫솔과 닮도록, 센스 또는 안티센스 가닥의 어느 한 말단에서 2 내지 4개의 뉴클레오티드에 접합된다(예를 들어, 표적화 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 상의 2 내지 4개의 뉴클레오티드 오버행 또는 연장부에 접합된다). 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에 스템-루프를 포함할 수 있고, 스템의 루프의 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드는 표적화 리간드에 개별적으로 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 센스 가닥의 3' 말단에 스템-루프를 포함하고, 여기서 스템-루프의 루프는 트리루프 또는 테트라루프를 포함하고, 여기서 각각 트리루프 또는 테트라루프를 포함하는 3 또는 4개의 뉴클레오티드는 표적화 리간드에 개별적으로 접합된다.
GalNAc는 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 대한 고친화성 탄수화물 리간드로서, 주로 간세포 표면에 발현되며 말단 갈락토스 또는 GalNAc 잔기(아시알로당단백질)를 함유하는 순환 당단백질을 결합, 내재화 및 후속 제거하는 데 주요한 역할을 한다. 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드에 대한 GalNAc 모이어티의 (간접적 또는 직접적) 접합은 세포 상에서 발현된 ASGPR에 이들 올리고뉴클레오티드를 표적화하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 하나 이상의 GalNAc 모이어티에 접합되고, 여기서 GalNAc 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 인간 간 세포 (liver cell) (예를 들어, 인간 간세포(hepatocyte)) 상에서 발현된 ASGPR에 표적화한다. 일부 구현예에서, GalNAc 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 간으로 표적화한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 1가 GalNAc 모이어티에 직접 또는 간접적으로 접합된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 초과의 1가 GalNAc에 직접 또는 간접적으로 접합된다 (즉, 2, 3 또는 4개의 일가 GalNAc 모이어티에 접합되고, 전형적으로 3 또는 4개의 일가 GalNAc 모이어티에 접합된다). 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2가 GalNAc, 3가 GalNAc 또는 4가 GalNAc 모이어티에 접합된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)의 1개 (1) 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 뉴클레오티드는 각각 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 구현예에서, 테트라루프의 2개 (2) 내지 4개 (4)의 뉴클레오티드는 각각 별개의 GalNAc 모이어티에 접합된다. 일부 구현예에서, 트리루프의 1개 (1) 내지 3개 (3)의 뉴클레오티드는 각각 별개의 GalNAc 잔기에 접합된다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 GalNAc 부분이 칫솔의 칫솔모와 닮고 올리고뉴클레오티드가 칫솔과 닮도록, 센스 또는 안티센스 가닥의 어느 하나의 말단에서 2개 (2) 내지 4개 (4)의 뉴클레오티드에 접합된다 (예를 들어, 리간드는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단 상의 2개 (2) 내지 4개 (4)의 뉴클레오티드 오버행 또는 연장부에 접합된다). 일부 구현예에서, GalNAc 모이어티는 센스 가닥의 뉴클레오티드에 접합된다. 예를 들어, 3개 (3) 또는 4개 (4)의 GalNAc 모이어티는 각 GalNAc 모이어티가 1개 (1)의 뉴클레오티드에 접합되는 센스 가닥의 테트라루프 내의 뉴클레오티드에 접합될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 테트라루프를 포함하며, 여기서 테트라루프 (L)은 아데닌 (A) 및 구아닌 (G) 뉴클레오티드의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 테트라루프 (L)은 하기 도시된 바와 같이 본원에 기재된 임의의 링커를 통해 테트라루프의 임의의 하나 이상의 구아닌 (G) 뉴클레오티드에 부착된 1가 GalNAc 모이어티를 포함한다 (X=헤테로원자):
일부 구현예에서, 테트라루프 (L)는 하기 도시된 바와 같이 본원에 기재된 임의의 링커를 통해 테트라루프의 임의의 하나 이상의 아데닌 뉴클레오티드에 부착된 1가 GalNAc를 갖는다 (X=헤테로원자):
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 하기 도시된 바와 같이 [ademG-GalNAc] 또는 2'-아미노디에톡시메탄올-구아닌-GalNAc로 지칭되는 구아닌 (G) 뉴클레오티드에 부착된 일가 GalNAc 모이어티를 포함한다:
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 하기 도시된 바와 같이 [ademA-GalNAc] 또는 2'-아미노디에톡시메탄올-아데닌-GalNAc로 지칭되는 아데닌 뉴클레오티드에 부착된 1가 GalNAc 모이어티를 포함한다:
이러한 접합의 예는 5'에서 3'으로 뉴클레오티드 서열 GAAA(L = 링커, X = 헤테로원자)를 포함하는 루프에 대해 하기에 나타나 있다. 이러한 루프는 예를 들어, 도 20에 나타낸 바와 같이 본원에 제공된 센스 가닥의 27-30번 위치에 존재할 수 있다. 화학식에서, 는 올리고뉴클레오티드 가닥에 대한 부착점을 설명하는 데 사용된다.
적절한 방법 또는 화학(예를 들어, 클릭 화학)을 사용하여 표적화 리간드를 뉴클레오티드에 연결시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 클릭 링커를 사용하여 본원에서 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 구현예에서, 아세탈계 링커는 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 뉴클레오티드에 표적화 리간드를 접합하기 위해 사용된다. 아세탈계 링커는 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제 WO2016/100401호에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 링커는 불안정성 링커이다. 그러나, 다른 구현예에서, 링커는 안정하다. 5' 에서 3' 뉴클레오티드 GAAA를 포함하는 루프에 대한 예가 하기에 나타나 있으며, GalNAc 모이어티 아세탈 링커를 사용하여 루프의 뉴클레오티드에 부착된다. 이러한 루프는 예를 들어, 도 20에 나타낸 바와 같이 본원에 제공된 센스 가닥의 27-30번 위치에 존재할 수 있다. 화학식에서, 는 올리고뉴클레오티드 가닥에 대한 부착점을 설명하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 테트라루프를 갖는 센스 가닥을 포함하며, 4개 (4)의 GalNAc 모이어티는 테트라루프를 포함하는 뉴클레오티드에 접합되고, 각각의 GalNAc 모이어티는 1개 (1)의 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 GalNAc-접합된 뉴클레오티드를 포함하는 테트라루프를 갖는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 테트라루프는 하기 구조를 포함한다:
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 테트라루프를 갖는 센스 가닥을 포함하며, 3개 (3)의 GalNAc 모이어티는 테트라루프를 포함하는 뉴클레오티드에 접합되고, 각각의 GalNAc 모이어티는 1개 (1)의 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 GalNAc-접합된 뉴클레오티드를 포함하는 테트라루프를 갖는 센스 가닥을 포함하며, 여기서 테트라루프는 하기 구조를 포함한다:
언급된 바와 같이, 다양한 적절한 방법 또는 화학 합성 기술(예를 들어, 클릭 화학)을 사용하여 표적화 리간드를 뉴클레오티드에 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 클릭 링커를 사용하여 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 구현예에서, 아세탈계 링커는 사용되어 표적화 리간드를 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 뉴클레오티드에 접합시킨다다. 아세탈계 링커는 예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/100401에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 링커는 불안정한 링커이다. 그러나, 다른 구현예에서, 링커는 안정한 링커이다.
일부 구현예에서, 표적화 리간드 (예를 들어, GalNAc 모이어티)와 올리고뉴클레오티드 사이에 듀플렉스 연장 (예를 들어, 최대 3, 4, 5 또는 6 bp 길이)이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 그에 접합된 GalNAc를 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 25 및 26, 각각;
(b) 서열번호 27 및 28, 각각;
(c) 서열번호 29 및 30 각각; 및,
(d) 서열번호 31 및 32, 각각,
여기서 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드에 접합된 적어도 하나의 GalNAc 모이어티를 포함한다.
α-1 항트립신 발현을 감소시키기 위한 예시적인 올리고뉴클레오티드
일부 구현예에서, 본 개시내용은 α-1 항트립신 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)를 제공하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 하기에 따른 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다:
센스 가닥: 5’ -[mAs][mA][fA][mC][mC][mC][mU][fU][fU][fG][mU][fC][fU][mU][mC] [mU][fU][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][ademG-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]- 3’ (서열번호 101);
은 하기와 혼성화된다:
안티센스 가닥: 5' [메포스포네이트-4O-mUs][fUs][fUs][mA][fA][mG][fA][mA][mG][mA] [mC][fA][mA][fA][mG][fG][mG][mU][fU][mUs][mGs][mG]-3’ (서열번호 104);
여기서 mX= 2’-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, fX =2’- 플루오로 변형된 뉴클레오티드, -S- = 포스포로티오에이트 연결, - = 포스포디에스테르 연결, [메포스포네이트-4O-mX] = 5’-메톡시포스포네이트-4-옥시 변형된 뉴클레오티드, 및 ademA-GalNAc = 아데닌 뉴클레오티드에 부착된 GalNAc, 및 ademG-GalNAc = 구아닌 뉴클레오티드에 부착된 GalNAc이다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥은 하기로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호 33 및 34, 각각;
(b) 서열번호 35 및 36, 각각;
(c) 서열번호 37 및 38, 각각;
(d) 서열번호 39 및 40, 각각;
(e) 서열번호 41 및 42, 각각;
(f) 서열번호 43 및 44, 각각;
(g) 서열번호 45 및 46, 각각;
(h) 서열번호 47 및 48, 각각;
(i) 서열번호 49 및 50, 각각;
(j) 서열번호 51 및 52, 각각;
(k) 서열번호 53 및 54, 각각;
(l) 서열번호 55 및 56, 각각;
(m) 서열번호 57 및 58, 각각;
(n) 서열번호 59 및 60, 각각;
(o) 서열번호 61 및 62, 각각;
(p) 서열번호 63 및 64, 각각;
(q) 서열번호 65 및 66, 각각;
(r) 서열번호 67 및 68, 각각;
(s) 서열번호 69 및 70, 각각;
(t) 서열번호 71 및 72, 각각;
(u) 서열번호 73 및 74, 각각;
(v) 서열번호 75 및 76, 각각;
(w) 서열번호 77 및 78, 각각;
(x) 서열번호 79 및 80, 각각;
(y) 서열번호 81 및 82, 각각;
(z) 서열번호 83 및 84, 각각;
(aa) 서열번호 85 및 86, 각각;
(bb) 서열번호 87 및 88, 각각;
(cc) 서열번호 89 및 90, 각각;
(dd) 서열번호 91 및 92 각각;
(ee) 서열번호 93 및 94, 각각;
(ff) 서열번호 95 및 96, 각각;
(gg) 서열번호 97 및 98, 각각;
(hh) 서열번호 99 및 100, 각각;
(ii) 서열번호 101 및 102, 각각; 및,
(jj) 서열번호 103 및 104, 각각.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 서열번호 103의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 서열번호 104의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 서열번호 103의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 서열번호 104의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 및 RNAi 올리고뉴클레오티드)를 제공하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 하기 구조를 갖는 접합의 형태이다:
제형
올리고뉴클레오티드의 사용을 위해 다양한 제형(예를 들어, 약학 제형)이 개발되었다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 분해를 최소화하고, 전달 및/또는 흡수를 용이하게 하거나, 또는 제형 내의 올리고뉴클레오티드에 또 다른 유익한 특성을 제공하는 제형을 사용하여 대상체 또는 세포 환경에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신의 발현을 감소시키는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 조성물은, 표적 세포의 직접 환경 또는 전신적으로 대상체에 투여되는 경우, 올리고뉴클레오티드의 충분한 부분이 α-1 항트립신 발현을 감소시키기 위해 세포에 들어가도록 적합하게 제형화될 수 있다. 임의의 다양한 적합한 올리고뉴클레오티드 제형은 본원에 개시된 바와 같은 α-1 항트립신의 환원을 위한 올리고뉴클레오티드를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 완충 용액, 예컨대 포스페이트 완충 식염수 용액, 리포좀, 미셀 구조, 및 캡시드에서 제형화된다. 본원에 기재된 임의의 올리고뉴클레오티드는 핵산으로서 뿐만 아니라 약학적으로 허용되는 염의 형태로 제공될 수 있다.
양이온성 지질을 갖는 올리고뉴클레오티드의 제형은 사용되어 세포 내로의 올리고뉴클레오티드의 형질감염을 용이하기 할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질, 예컨대 리포펙틴, 양이온성 글리세롤 유도체, 및 폴리양이온성 분자(예를 들어, 폴리리신)가 사용될 수 있다. 적합한 지질은 올리고펙타민, 리포펙타민(Life Technologies), NC388(Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colo.), 또는 FuGene 6(Roche)을 포함하며, 이들 모두는 제조사의 지침에 따라 사용될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 제형은 지질 나노입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 부형제는 리포솜, 지질, 지질 복합체, 마이크로구체, 마이크로입자, 나노구체 또는 나노입자를 포함하거나, 그렇지 않으면 이를 필요로 하는 대상체의 세포, 조직, 기관 또는 신체에 투여하기 위해 제형화될 수 있다(예를 들어, Remington: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, 22nd edition, Pharmaceutical Press, 2013를 참조한다).
일부 구현예에서, 본원의 제형은 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 부형제는 활성 성분의 개선된 안정성, 개선된 흡수, 개선된 용해도 및/또는 치료적 향상을 조성물에 부여한다. 일부 구현예에서, 부형제는 완충제(예를 들어, 시트르산나트륨, 나트륨 포스페이트, 트리스 염기 또는 수산화나트륨) 또는 비히클(예를 들어, 완충 용액, 바셀린, 디메틸 술폭시드, 또는 광유)이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 그의 저장 수명을 연장하기 위해 동결건조된 다음 사용(예를 들어, 대상체에 투여) 전에 용액으로 제조된다. 따라서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 조성물의 부형제는 동결보호제(예를 들어, 만니톨, 락토스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈) 또는 붕괴 온도 변형제(예를 들어, 덱스트란, Ficoll™ 또는 젤라틴)일 수 있다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구(예를 들어, 정맥내, 근육내, 복강내, 피내, 피하), 경구(예를 들어, 흡입), 경피(예를 들어, 국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다.
주사용으로 적합한 약학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨과 같은 다가알코올을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 멸균 주사용 용액은, 요구되는 바와 같이, 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합을 갖는 선택된 용매 중에 필요한 양으로 올리고뉴클레오티드를 혼입시키고, 이어서 여과된 멸균에 의해 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 약 0.1%의 치료제 (예를 들어, α-1 항트립신 발현을 감소시키기 위한 RNAi 올리고뉴클레오티드) 또는 그 이상을 함유할 수 있지만, 활성 성분(들)의 백분율은 전체 조성물의 중량 또는 부피의 약 1% 내지 약 80% 이상일 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 유통기한, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려와 같은 인자가 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당업자에게 고려될 것이고, 이와 같이, 다양한 투여량 및 치료 레지멘이 바람직할 수 있다.
사용 방법
α-1 항트립신 발현을 감소
일부 구현예에서, 본 개시내용은 α-1 항트립신 발현을 감소시키기 위해 본원에 제공된 유효량의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)를 세포 또는 세포 집단에 접촉시키거나 전달하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현의 감소는 세포 내의 α-1 항트립신 mRNA, α-1 항트립신 단백질 또는 α-1 항트립신 활성의 양 또는 수준의 감소를 측정함으로써 결정된다. 방법은 본원에 기재되고 당업자에게 공지된 것을 포함한다.
본원에 제공된 방법은 임의의 적절한 세포 유형에서 유용하다. 일부 구현예에서, 세포는 α-1 항트립신 mRNA를 발현하는 임의의 세포(예를 들어, 간세포)이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 수득된 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 1차 세포는 세포가 이의 천연 표현형 특성을 실질적으로 유지하도록 제한된 수의 계대를 겪었다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드가 전달되는 세포는 생체외 또는 시험관내이다 (즉, 배양 중인 세포 또는 세포가 상주하는 유기체에 전달될 수 있음).
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 용액의 주사, 올리고뉴클레오티드에 의해 덮인 입자에 의한 충격, 올리고뉴클레오티드를 함유하는 용액에 세포 또는 세포 집단을 노출시키거나, 또는 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 세포막의 전기천공법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 핵산 전달 방법을 사용하여 세포 또는 세포 집단에 전달된다. 올리고뉴클레오티드를 세포로 전달하기 위한 당업계에 공지된 다른 방법, 예컨대 지질-매개 담체 수송, 화학적-매개 수송, 및 칼슘 포스페이트와 같은 양이온성 리포솜 형질감염 등이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현의 감소는 α-1 항트립신 발현과 관련된 세포 또는 세포 집단의 하나 이상의 분자, 특성 또는 특징을 평가하는 검정 또는 기술에 의해, 또는 세포 또는 세포 집단 (예를 들어, α-1 항트립신 mRNA 또는 α-1 항트립신 단백질)에서 α-1 항트립신 발현을 직접 나타내는 분자를 평가하는 검정 또는 기술에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드가 α-1 항트립신 발현을 감소시키는 정도는 올리고뉴클레오티드와 접촉한 세포 또는 세포 집단에서 α-1 항트립신 발현을 적절한 대조군 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드와 접촉하거나 대조군 올리고뉴클레오티드와 접촉하지 않은 세포의 적절한 세포 또는 세포 집단)과 비교함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, 대조군 세포 또는 세포 집단에서의 α-1 항트립신 발현의 대조군 양 또는 수준은 미리 결정되어, 검정 또는 기술이 수행되는 모든 경우에서 대조군 양 또는 수준이 측정될 필요가 없다. 미리 결정된 수준 또는 값은 다양한 형태를 취할 수 있다. 일부 구현예에서, 미리 결정된 수준 또는 값은 중앙값 또는 평균과 같은 단일 컷-오프 값일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)를 세포 또는 세포 집단에 접촉 또는 전달하는 것은 올리고뉴클레오티드와 접촉되지 않거나 대조군 올리고뉴클레오티드와 접촉되지 않은 세포 또는 세포 집단에서 α-1 항트립신 발현의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현의 감소는 α-1 항트립신 발현의 대조군 양 또는 수준에 비해 약 1% 이하, 약 5% 이하, 약 10% 이하, 약 15% 이하, 약 20% 이하, 약 25% 이하, 약 30% 이하, 약 35% 이하, 약 40% 이하, 약 45% 이하, 약 50% 이하, 약 55% 이하, 약 60% 이하, 약 70% 이하, 약 80% 이하, 또는 약 90% 이하이다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현의 대조군 양 또는 수준은 본원에서 올리고뉴클레오티드와 접촉하지 않은 세포 또는 세포 집단에서 α-1 항트립신 mRNA 및/또는 α-1 항트립신 단백질의 양 또는 수준이다. 일부 구현예에서, 본원의 방법에 따른 본원의 올리고뉴클레오타이드의 세포 또는 세포 집단으로의 전달의 효과는 임의의 유한 기간 또는 양의 시간 (예를 들어, 분, 시간, 일, 주, 개월) 후에 평가된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현은 세포 또는 세포 집단에 올리고뉴클레오티드를 접촉 또는 전달한 후, 세포 또는 세포의 집단에서 적어도 약 4시간, 약 8시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간; 또는 적어도 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 21일, 약 28일, 약 35일, 약 42일, 약 49일, 약 56일, 약 63일, 약 70일, 약 77일, 또는 약 84일 또는 그 이상 후에 결정된다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현은 올리고뉴클레오티드를 세포 또는 세포 집단에 접촉 또는 전달한 후 적어도 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 또는 약 6개월 또는 그 이상의 세포 또는 세포 집단에서 결정된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 가닥(예를 들어, 이의 센스 및 안티센스 가닥)을 세포에서 발현하도록 조작된 이식유전자의 형태로 전달된다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 본원에 개시된 임의의 올리고뉴클레오티드를 발현하도록 조작된 이식유전자를 사용하여 전달된다. 이식유전자는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 단순 포진 바이러스) 또는 비-바이러스 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 합성 mRNA)를 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 대상체에 직접 주사될 수 있다.
치료 방법
본 개시내용은 α-1 항트립신의 발현과 관련된 질환, 장애 및 병태의 치료를 위한 방법에 사용하기 위한 약제로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)를 제공한다. 본 개시내용은 또한 α-1 항트립신 발현의 감소로부터 유익할 대상체(예를 들어, α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 인간)를 치료하기 위한 사용을 위한 또는 사용에 적합한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 α-1 항트립신의 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체를 치료하기 위한 사용을 위한 또는 사용을 위해 조정된 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 개시내용은 또한 α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위한 약제 또는 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 또는 사용을 위해 적응가능한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 사용을 위한 또는 사용에 적합한 올리고뉴클레오티드는 α-1 항트립신 mRNA를 표적화하고 (예를 들어, RNAi 경로를 통해) α-1 항트립신 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 사용을 위한, 또는 사용에 적합한 올리고뉴클레오티드는 α-1 항트립신 mRNA를 표적화하고 α-1 항트립신 mRNA, α-1 항트립신 단백질 및/또는 α-1 항트립신 활성의 양 또는 수준을 감소시킨다.
또한, 본원의 방법의 일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 이에 취약한 대상체는 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)로의 치료를 위해 선택된다. 일부 구현예에서, 방법은 α-1 항트립신 발현과 관련되거나 이에 취약한 질환, 장애 또는 병태, 예컨대 이에 제한되지 않는 α-1 항트립신 mRNA, α-1 항트립신 단백질, 또는 이들의 조합에 대한 마커(예를 들어, 바이오마커)를 갖는 개체를 선택하는 것을 포함한다. 유사하게, 그리고 하기에서 상세히 설명되는 바와 같이, 본 개시내용에 의해 제공되는 방법의 일부 구현예는 α-1 항트립신 발현(예를 들어, α-1 항트립신 mRNA)의 마커에 대한 기준선 값을 측정하거나 수득하는 단계, 및 이어서 다른 기준선 값 또는 치료 효과를 평가하기 위해 대상체가 올리고뉴클레오티드를 투여받은 후에 수득한 하나 이상의 값과 이러한 획득된 값을 비교하는 단계와 같은 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드로 α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖거나, 가질 것으로 의심되거나, 또는 발생할 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 본원의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태의 발병 또는 진행을 치료하거나 약화시키는 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체에서 하나 이상의 치료적 이점을 달성하는 방법을 제공한다. 본원의 방법의 일부 구현예에서, 대상체는 본원에 제공된 임의의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 치료적 유효량을 투여함으로써 치료된다. 일부 구현예에서, 치료는 α-1 항트립신 발현을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 치료적으로 치료된다. 일부 구현예에서, 대상체는 예방적으로 치료된다.
일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 환자는 적어도 하나의 돌연변이체 대립유전자를 포함한다. 돌연변이체 대립유전자는 유전되고, 따라서 환자는 α-1 항트립신을 암호화하는 돌연변이체 대립유전자의 1개 또는 2개의 카피를 가질 수 있다. M 유전자/대립유전자는 α-1 항트립신 유전자의 가장 일반적인 대립유전자이고, 이는 정상 수준의 α-1 항트립신 단백질을 생성한다. Z 유전자/대립유전자는 유전자의 가장 일반적인 변이체이며 α-1 항트립신 결핍을 유발한다. 일부 구현예에서, Z 대립유전자는 E342K 돌연변이의 존재로 인한 것이다. S 유전자/대립 유전자는 α-1 항트립신 결핍을 유발하는 또 다른 덜 일반적인 변이체이다. 일부 구현예에서, S 대립유전자는 E264V 돌연변이의 존재로 인한 것이다.
일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태는 Z 대립유전자의 1개의 카피 및 M 대립유전자의 1개의 카피 (즉, PiMZ 환자로 지칭되는 Z 대립유전자 이형접합체)의 존재로 인한 것이다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태는 Z 대립유전자의 2개의 카피 (즉, PiZZ 환자로 지칭되는 Z 대립유전자 동형접합체)의 존재로 인한 것이다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태는 S 대립유전자의 1개의 카피 및 M 대립유전자의 1개의 카피 (즉, PiSZ 환자로 지칭되는 S 대립유전자 이형접합체)의 존재로 인한 것이다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, 본원의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드), 또는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물은 α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체에 투여되어, α-1 항트립신 발현이 대상체에서 감소되어, 대상체를 치료한다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 mRNA의 양 또는 수준은 대상체에서 감소된다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 단백질의 양 또는 수준은 대상체에서 감소된다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 활성의 양 또는 수준은 대상체에서 감소된다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드) 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물은 α-1 항트립신과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여되어 α-1 항트립신 발현이 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 또는 약학적 조성물의 투여 전의 α-1 항트립신 발현과 비교할 때 대상체에서 적어도 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 99% 초과만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 또는 약학적 조성물을 받지 않거나 대조군 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 또는 약학적 조성물 또는 치료를 받지 않는 대상체 (예를 들어, 기준 또는 대조군 대상체)에서 α-1 항트립신 발현과 비교하여, 대상체에서 α-1 항트립신 발현은 적어도 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 99% 초과만큼 감소된다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들 또는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들을 포함하는 약학적 조성물은 α-1 항트립신과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여되어, α-1 항트립신 mRNA의 양 또는 수준이 올리고뉴클레오티드 또는 약학적 조성물의 투여 전의 α-1 항트립신 mRNA와 비교할 때 대상체에서 적어도 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 99% 초과만큼 감소된다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 mRNA의 양 또는 수준은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들 또는 약학적 조성물을 수용하지 않거나 대조군 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들, 약학적 조성물 또는 치료를 수용하지 않는 대상체 (예를 들어, 기준 또는 대조군 대상체)에서 α-1 항트립신 mRNA의 양 또는 수준과 비교할 때, 대상체에서 적어도 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 99% 초과만큼 감소된다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드) 또는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들을 포함하는 약학적 조성물은 α-1 항트립신과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여되어, α-1 항트립신 단백질의 양 또는 수준이 올리고뉴클레오티드 또는 약학적 조성물의 투여 전의 α-1 항트립신 단백질과 비교할 때 대상체에서 적어도 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 99% 초과만큼 감소된다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 단백질의 양 또는 수준은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들 또는 약학적 조성물을 받지 않거나 대조군 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드들 또는 약학적 조성물 또는 치료를 받지 않는 대상체 (예를 들어, 기준 또는 대조군 대상체)에서 α-1 항트립신 단백질의 양 또는 수준과 비교할 때, 대상체에서 적어도 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 99% 초과만큼 감소된다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드) 또는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들을 포함하는 약학적 조성물은 α-1 항트립신과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체에게 투여되어, α-1 항트립신 활성/발현의 양 또는 수준이 올리고뉴클레오티드 또는 약학적 조성물의 투여 전의 α-1 항트립신 활성의 양 또는 수준과 비교할 때 대상체에서 적어도 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 99% 초과만큼 감소된다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 활성의 양 또는 수준은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들 또는 약학적 조성물을 받지 않거나 대조군 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드들 또는 약학적 조성물 또는 치료를 받지 않는 대상체 (예를 들어, 기준 또는 대조군 대상체)에서 α-1 항트립신 활성의 양 또는 수준과 비교할 때, 대상체에서 적어도 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 99% 초과만큼 감소된다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드), 또는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들을 포함하는 약학적 조성물은 α-1 항트립신과 관련된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상체에 투여되어 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)를 투여 전의 AST 수준에 비해 감소시킨다. 본원의 방법의 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드), 또는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들을 포함하는 약학적 조성물은 α-1 항트립신과 관련된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상체에 투여되어 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)를 투여 전의 ALT 수준에 비해 감소시킨다. 본원의 방법의 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드), 또는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들을 포함하는 약학적 조성물은 α-1 항트립신과 관련된 질환, 장애 또는 상태를 갖는 대상체에 투여되어 알칼리성 포스파타제를 투여 전의 알칼리성 포스파타제 수준에 비해 감소시킨다.
대상체 또는 대상체로부터의 샘플에서 α-1 항트립신 발현, α-1 항트립신 mRNA, α-1 항트립신 단백질, α-1 항트립신 활성, 또는 α-1 항트립신 발현의 양 또는 수준, 또는 α-1 항트립신 발현의 조절과 관련되거나 영향을 받는 바이오마커(예를 들어, 혈장 바이오마커)를 결정하는 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 본원에 제시된 실시예는 α-1 항트립신 발현을 결정하는 방법을 예시한다.
일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현, α-1 항트립신 mRNA, α-1 항트립신 단백질, α-1 항트립신 활성, 또는 α-1 항트립신 발현 조절에 관련되거나 이에 의해 영향을 받는 바이오마커, 또는 이의 임의의 조합의 양 또는 수준은 세포 (예를 들어, 간세포), 세포 집단 또는 세포 군 (예를 들어, 오가노이드), 기관 (예를 들어, 간), 혈액 또는 이의 분획 (예를 들어, 혈장), 조직 (예를 들어, 간 조직), 샘플 (예를 들어, 간 생검 샘플), 또는 대상체로부터 수득되거나 단리된 임의의 다른 적절한 생물학적 물질에서 감소된다. 일부 구현예에서, α-1 항트립신 발현, α-1 항트립신 mRNA, α-1 항트립신 단백질, α-1 항트립신 활성, 또는 α-1 항트립신 발현의 조절에 관련되거나 이에 의해 영향을 받는 바이오마커, 또는 이들의 임의의 조합의 양 또는 수준은 하나 이상의 세포 유형 (예를 들어, 간세포 및 하나 이상의 다른 유형(들)의 세포), 하나 이상의 세포 군, 하나 이상의 기관 (예를 들어, 간 및 하나 이상의 다른 기관(들)), 하나 이상의 혈액 분획 (예를 들어, 혈장 및 하나 이상의 다른 혈액 분획(들)), 하나 이상의 유형의 조직 (예를 들어, 간 조직 및 하나 이상의 유형(들)의 조직), 또는 하나 이상의 유형의 샘플(예를 들어, 간 생검 샘플 및 하나 이상의 유형(들)의 생검 샘플)에서 감소된다.
이들의 높은 특이성으로 인해, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, dsRNAi 올리고뉴클레오티드)는 세포 및 조직(들), 또는 기관(들)(예를 들어, 간)의 표적 유전자(예를 들어, α-1 항트립신 mRNA)의 mRNA를 특이적으로 표적화한다. 질환 예방에 있어서, 표적 유전자는 질환의 시작 또는 유지를 위해 필요하거나, 또는 질환에 걸릴 위험이 더 높은 것으로 확인된 유전자일 수 있다. 질환을 치료함에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 질환을 나타내거나 매개할 책임이 있는 세포, 조직(들), 또는 기관(들)(예를 들어, 간)과 접촉하게 될 수 있다. 예를 들어, α-1 항트립신 발현과 관련된 장애 또는 병태와 관련된 야생형(즉, 고유) 또는 돌연변이된 유전자의 전부 또는 일부와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드)가 간세포 또는 다른 간 세포와 같은 관심 세포 또는 조직 유형과 접촉하거나 또는 이에 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 유전자는 인간 표적과 같은 임의의 포유동물로부터의 표적 유전자일 수 있다. 임의의 표적 유전자는 본원에 기재된 방법에 따라 침묵될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 전형적으로 대상체에게 유효량의 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드), 즉 바람직한 치료 결과를 생산하거나 생성하는 양을 투여하는 것을 포함한다. 치료적으로 허용되는 양은 질환 또는 장애를 치료적으로 치료하는 양일 수 있다. 어느 하나의 대상체에 대한 적절한 투여량은 대상체의 크기, 체표면적, 연령, 투여될 조성물, 조성물 중의 활성 성분(들), 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하는 특정 인자에 따라 달라질 것이다.
일부 구현예에서, 대상체는 본 발명의 조성물 중 어느 하나(예를 들어, 본원에 기재된 RNAi 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물)를 장내(예를 들어, 경구, 위 공급 튜브에 의해, 십이지장 공급 튜브에 의해, 위내 또는 직장을 통해)로, 비경구(예를 들어, 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입, 동맥 내 주사 또는 주입, 골내 주입, 근육 내 주사, 뇌내 주사, 뇌실내 주사, 경막 내), 국소(예를 들어, 진피, 흡입, 점안액을 통해, 또는 점막을 통해), 또는 표적 기관(예를 들어, 대상체의 간)으로의 직접 주사에 의해 투여된다. 전형적으로, 본원의 올리고뉴클레오티드는 정맥 내로 또는 피하로 투여된다.
일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드(예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드), 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물은 단독으로 또는 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 동시에, 순차적으로(임의의 순서로), 또는 간헐적으로 조합하여 투여된다. 예를 들어, 2개의 올리고뉴클레오티드가 동시에 공동 투여될 수 있다. 대안적으로, 1개의 올리고뉴클레오티드가 투여되고 임의의 양의 시간 후에(예를 들어, 1시간, 1일, 1주 또는 1개월) 제2 올리고뉴클레오티드가 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료될 대상체는 인간 또는 인간이 아닌 영장류 또는 기타 포유동물 대상체이다. 다른 예시적인 대상체는 개 및 고양이와 같은 가축; 말, 소, 돼지, 양, 염소 및 닭과 같은 가축; 및 마우스, 래트, 기니피그 및 햄스터와 같은 동물을 포함한다.
키트
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드), 및 사용을 위한 지침을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 본원의 올리고뉴클레오티드, 및 키트 및/또는 이의 임의의 구성요소의 사용을 위한 지침을 포함하는 패키지 삽입물을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 적합한 용기에서, 본원의 올리고뉴클레오티드, 하나 이상의 대조군, 및 당업계에 널리 공지된 다양한 완충제, 시약, 효소 및 다른 표준 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 용기는 올리고뉴클레오티드가 배치되는 적어도 하나의 바이알, 웰, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 주사기, 또는 다른 용기 수단을 포함하고, 일부 예에서, 적합하게 분취된다. 추가의 구성요소가 제공되는 일부 구현예에서, 키트는 이 구성요소가 배치되는 추가의 용기를 함유한다. 키트는 또한 상업적 판매를 위해 올리고뉴클레오티드 및 임의의 다른 시약을 밀실(close confinement) 내에 함유하는 수단을 포함할 수 있다. 이러한 용기는 그 안에 원하는 바이알이 유지되는 주사 또는 블로우-성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 용기 및/또는 키트는 사용 및/또는 경고에 대한 지침들과 함께 라벨링을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, RNAi 올리고뉴클레오티드), 및 약학적으로 허용되는 담체, 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물 및 이를 필요로 하는 대상체에서 α-1 항트립신 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태의 진행을 치료 또는 지연시키기 위한 지침을 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
정의
본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 mRNA, 특히 시드 서열의 전부 또는 일부에 상보적인 서열을 갖고 이에 의해 mRNA와 듀플렉스를 형성할 수 있는 핵산계 분자를 포괄한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 "상보적 핵산계 억제제"로 지칭될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 관심 값들에 적용되는 "대략" 또는 "약"은 언급된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 일부 구현예에서, "약"은 달리 명시되지 않거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한 (이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외하고) 언급된 기준 값의 어느 한 방향으로 (그 초과 또는 그 미만) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "투여하다(administer)", "투여하는(administering)", "투여(administration)" 등은 약리학적으로 유용한(예를 들어, 대상체에서의 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위해) 물질(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)을 대상체에 제공하는 것을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "약화시키다(attenuate)", "약화시키는(attenuating)", "약화(attenuation)" 등은 감소 또는 효과적으로 정지시키는 것을 지칭한다. 비제한적인 예로서, 본원의 치료 중 하나 이상은 간 및/또는 폐 질환의 발병 또는 진행을 감소시키거나 효과적으로 정지시킬 수 있다. 간 질환은 대상체에서 만성 간 질환, 간 염증, 간경변증, 간 섬유증 및/또는 간세포 암종을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 폐 질환은 천식, 기관지확장증, 호흡부전, 혈관염, 폐 염증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐 기종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 약화는, 대상체에서 이들이 달리 예상되는 경우, 예를 들어, 만성 간질환, 간 염증, 간경변증, 간 섬유증, 간세포암종, 폐 염증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 및/또는 폐기종의 하나 이상의 양태(예를 들어, 증상, 조직 특징, 및 세포, 염증, 또는 면역학적 활성 등)에서의 감소, 만성 간질환, 간 염증, 간경변증, 간 섬유증, 간세포암종, 폐 염증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 및/또는 폐 폐기종의 하나 이상의 양태의 검출가능한 진행(악화)이 없거나, 만성 간질환, 간 염증, 간경변증, 간 섬유증, 간세포암종, 폐 염증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 및/또는 폐기종의 검출가능한 양태가 없는 것에 의해 예시될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상보적"은 2개의 뉴클레오티드가 서로 염기쌍을 형성하도록 허용하는 2개의 뉴클레오티드(예를 들어, 2개의 반대 핵산 상에 또는 단일 핵산 가닥의 반대 영역 상에) 사이의 구조적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 반대 핵산의 피리미딘 뉴클레오티드와 상보적인 하나의 핵산의 퓨린 뉴클레오티드는 서로 수소 결합을 형성하여 염기쌍을 이룰 수 있다. 일부 구현예에서, 상보적 뉴클레오티드는 왓슨-크릭 방식 또는 안정한 듀플렉스의 형성을 허용하는 임의의 다른 방식으로 염기쌍을 이룰 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 서로 상보적인 다중 뉴클레오티드 영역을 가져 상보성 영역을 형성할 수 있다.
본원에 사용된 "데옥시리보뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드와 비교할 때 오탄당 당의 2' 위치에서 하이드록실 대신 수소를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 데옥시리보뉴클레오티드는 당, 포스페이트 기 또는 염기의 변형 또는 치환을 포함하여 2' 위치가 아닌 원자의 하나 이상의 변형 또는 치환을 갖는 데옥시리보뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 "이중 가닥 올리고뉴클레오티드" 또는 "ds 올리고뉴클레오티드"는 실질적으로 듀플렉스 형태인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 영역(들)의 상보적 염기-쌍형성은 공유적으로 분리된 핵산 가닥의 뉴클레오티드의 역평행 서열 사이에 형성된다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 영역(들)의 상보적 염기-쌍형성은 공유적으로 연결된 핵산 가닥의 뉴클레오티드의 역평행 서열 사이에 형성된다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 듀플렉스 영역(들)의 상보적 염기-쌍형성은 함께 염기쌍을 이루는 뉴클레오티드의 상보적 역평행 서열을 제공하기 위해 접힌 (예를 들어, 헤어핀을 통해) 단일 핵산 가닥으로부터 형성된다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 서로 완전히 듀플렉스화된 2개의 공유적으로 분리된 핵산 가닥을 포함한다. 그러나, 일부 구현예에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 듀플렉스화(예를 들어, 한쪽 또는 양쪽 말단에 오버행을 가짐)된 2개의 공유적으로 분리된 핵산 가닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드의 역평행 서열을 포함하고, 따라서 내부 불일치 또는 말단 불일치를 포함할 수 있는 하나 이상의 불일치를 가질 수 있다.
본원에 사용된 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)과 관련하여 "듀플렉스"는 뉴클레오티드의 2개의 역평행 서열의 상보적 염기 쌍형성을 통해 형성된 구조를 지칭한다.
본원에 사용된 "부형제"는 예를 들어 원하는 농도 또는 안정화 효과를 제공하거나 이에 기여하기 위해 조성물에 포함될 수 있는 비-치료제를 지칭한다.
본원에 사용된 "간세포" 또는 "간세포들"은 간의 실질 조직의 세포를 지칭한다. 이들 세포는 간 질량의 약 70%-85%를 구성하고 응고 인자(인자 3 및 4 제외)의 혈청 알부민, FBN 및 프로트롬빈 군을 제조한다. 간세포 계통 세포의 마커는 트랜스티레틴(Ttr), 글루타민 합성효소(Glul), 간세포 핵 인자 1a(Hnf1a) 및 간세포 핵 인자 4a(Hnf4a)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 성숙 간세포에 대한 마커는 사이토크롬 P450(Cyp3a11), 푸마릴아세토아세테이트 하이드로라제(Fah), 글루코스 6-포스페이트(G6p), 알부민(Alb) 및 OC2-2F8을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌 [Huch 등 (2013) NATURE 494:247-50]을 참조한다.
본원에 사용된 "간독성 제제"는 그 자체가 간에 독성이 있거나 간에 독성이 있는 대사물을 형성하도록 가공될 수 있는 화학적 화합물, 바이러스 또는 기타 물질을 지칭한다. 간독성 제제는 사염화탄소(CCl4), 아세트아미노펜(파라세타몰), 염화비닐, 비소, 클로로포름, 비스테로이드성 항염증 약물(예컨대 아스피린 및 페닐부타존)을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않다.
본원에 사용된 용어 "SERPINA1" 또는 "A1AT" 또는 "알파 1-항트립신"은 세르핀 슈퍼패밀리에 속하는 프로테아제 억제제를 의미한다. 용어 "SERPINA1"은 달리 언급되지 않는 한 모든 이소형을 지칭하는 것으로 의도된다. "SERPINA1"은 또한 단백질을 코딩하는 유전자를 지칭할 수 있다. 이는 일반적으로 혈청 트립신 억제제로 알려져 있다. 알파 1-항트립신은 또한 알파-1 프로테나제 억제제(A1PI)로 지칭되는데, 이는 매우 다양한 프로테아제를 억제하기 때문이다(Gettins P G. Chem Rev 102:4751-04). 이는 염증 세포의 효소, 특히 호중구 엘라스타아제로부터 조직을 보호하고, 1.5-3.5 그램/리터의 혈액 내 기준 범위를 가지지만, 여러 배의 상승된 수준은 급성 염증 시에 발생할 수 있다 (Kushner, Mackiewicz, Acute-phase glycoproteins: molecular biology, biochemistry, and clinical applications, (CRC Press). pp. 3-19). AAT가 없을 경우, 호중구 엘라스타제는 폐의 탄력에 기여하는 엘라스틴을 자유롭게 분해하여 폐기종 또는 성인의 COPD(만성 폐쇄성 폐질환) 및 성인과 소아의 간경변증과 같은 호흡기 합병증을 유발한다. AAT 유전자의 하나 또는 둘 모두의 카피에서 돌연변이를 갖는 개체는 폐 및 간에서 정상적인 엘라스타제 활성보다 더 큰 것으로 인해 폐기종 또는 만성 간 질환의 발생 위험으로 나타나는 알파-1 항-트립신 결핍을 겪을 수 있다.
상기에 언급된 바와 같이, α-1 항트립신 발현과 관련된 특정 질환 상태에서 개체는 유의한 양의 α-1 항트립신을 생산하지만 생산되는 α-1 항트립신 단백질의 유의한 부분이 잘못 접혀 있거나 단백질의 기능을 손상시키는 돌연변이를 함유한다. 이러한 특정한 경우에, 개체는 합성 부위에서 신체 내 작용 부위로 적절하게 수송될 수 없는 잘못 접힌 단백질을 생산하고 있다.
α-1 항트립신 결핍으로 인한 간 질환은 이러한 잘못 접힌 단백질에 의해 유발될 수 있다. 돌연변이체 형태의 α-1 항트립신 (예를 들어, 342번 위치 (가공 전 형태의 366번 위치)에 글루타메이트에서 리신으로의 돌연변이가 있는 일반적인 PiZ 변이체)은 간 세포에서 생산되고 (간 내의 간세포는 일반적으로 대량의 순환하는 AAT를 생산함), 잘못 접힌 배열에서, 이러한 형태는 세포 밖으로 쉽게 수송되지 않는다. 이는 간 세포 내의 잘못 접힌 단백질의 축적을 야기하고, 만성 간 질환, 간 염증, 간경변증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 암종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 간의 하나 이상의 질환 또는 장애를 유발할 수 있다.
본원에 사용된 "불안정한 링커"는 (예를 들어, 산성 pH에 의해) 절단될 수 있는 링커를 지칭한다. "상당히 안정적인 링커"는 절단될 수 없는 링커를 의미한다.
본원에 사용된 "간 염증" 또는 "간염"은 특히 간독성 제제에 대한 노출에 의해 유발될 수 있는 손상 또는 감염의 결과로 간이 부어오름, 기능 장애 및/또는 통증이 있는 신체적 병태를 지칭한다. 증상은 황달(피부 또는 눈의 황변), 피로, 쇠약, 메스꺼움, 구토, 식욕 감소 및 체중 감소를 포함할 수 있다. 간 염증을 치료하지 않고 방치하면 섬유증, 간경변증, 간부전 또는 간암으로 진행할 수 있다.
본원에 사용된 "간 섬유증(liver fibrosis)" "간 섬유증(Liver Fibrosis)" 또는 "간의 섬유증(fibrosis of the liver)"은 염증 및 간 세포 사멸로부터 기인하는 콜라겐 (I, III 및 IV), FBN, 운둘린, 엘라스틴, 라미닌, 히알루로난 및 프로테오글리칸을 포함할 수 있는 세포외 기질 단백질의 간에서의 과도한 축적을 지칭한다. 간 섬유증을 치료하지 않고 방치하면 간경변증, 간부전 또는 간암으로 진행할 수 있다.
본원에 사용된 "루프"는 적절한 혼성화 조건 하에서(예를 들어, 포스페이트 완충제 내, 세포 내), 쌍을 이루지 않은 영역의 측면에 있는 2개의 역평행 영역이 혼성화하여 듀플렉스(스템으로 지칭됨)를 형성하도록, 서로 충분히 상보적인 핵산의 2개의 역평행 영역에 의해 측면에 있는 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 쌍을 이루지 않은 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 "대사 증후군" 또는 "대사 간 질환"은 하기의 의학적 병태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 관련된 의학적 병태 및 관련된 병리의 군집을 특징으로 하는 질환을 지칭한다: 복부 비만, 상승된 혈압, 상승된 공복 혈장 글루코스, 높은 혈청 트리글리세라이드, 간 섬유증, 및 낮은 수준의 고밀도 지단백(HDL) 수준. 본원에 사용된 용어 대사 증후군 또는 대사 간 질환은 문서 전반에 걸쳐 사용된 병태들의 확장된 리스트와 함께, 대사 증후군 및 대사 간 질환과 관련된 다양한 직접적 및 간접적 징후, 질환 및 병리를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "변형된 뉴클레오티드간 연결"은 포스포디에스테르 결합을 포함하는 기준 뉴클레오티드간 연결과 비교할 때 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드간 연결을 지칭한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 비-천연 발생 연결이다. 전형적으로, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 변형된 뉴클레오티드간 연결이 존재하는 핵산에 하나 이상의 바람직한 특성을 부여한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드간 연결은 열 안정성, 분해 저항성, 뉴클레아제 저항성, 용해도, 생체 이용률, 생체 활성, 감소된 면역원성 등을 개선할 수 있다.
본원에 사용된 "변형된 뉴클레오티드"는 상응하는 기준 뉴클레오티드와 비교할 때 아데닌 리보뉴클레오티드, 구아닌 리보뉴클레오티드, 시토신 리보뉴클레오티드, 우라실 리보뉴클레오티드, 아데닌 데옥시리보뉴클레오티드, 구아닌 데옥시리보뉴클레오티드, 시토신 데옥시리보뉴클레오티드 및 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 비-천연 발생 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 이의 당, 핵염기 및/또는 포스페이트 기에 하나 이상의 화학적 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 상응하는 기준 뉴클레오티드에 접합된 하나 이상의 화학적 모이어티를 갖는다. 전형적으로, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드가 존재하는 핵산에 하나 이상의 바람직한 특성을 부여한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 열 안정성, 분해 저항성, 뉴클레아제 저항성, 용해도, 생체 이용률, 생체 활성, 감소된 면역원성 등을 개선할 수 있다.
본원에 사용된 "닉킹된 테트라루프 구조"는 분리된 센스(패신저) 및 안티센스(가이드) 가닥을 특징으로 하는 RNAi 올리고뉴클레오티드의 구조를 지칭하며, 센스 가닥은 안티센스 가닥과 상보성 영역을 가지며, 가닥 중 적어도 하나, 일반적으로 센스 가닥은 적어도 하나의 가닥 내에 형성된 인접 스템 영역을 안정화하도록 구성된 테트라루프를 갖는다.
본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 짧은 핵산(예를 들어, 길이가 약 100개 미만의 뉴클레오티드)을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥(ss) 또는 ds일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 듀플렉스 영역을 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있다. 일련의 비제한적인 예로, 올리고뉴클레오티드는 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 다이서 기질 간섭 RNA(DsiRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 siRNA 또는 ss siRNA일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 (dsRNA)는 RNAi 올리고뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 "오버행"은 한 가닥 또는 영역이 듀플렉스를 형성하는 상보적 가닥의 말단을 넘어 연장되는 한 가닥 또는 영역으로부터 생성된 말단 비-염기 쌍형성 뉴클레오티드(들)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 오버행은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에서 듀플렉스 영역으로부터 연장되는 하나 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 오버행은 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 상의 3' 또는 5' 오버행이다.
본원에 사용된 "포스페이트 유사체"는 포스페이트 기의 정전기적 및/또는 입체적 특성을 모방하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 일부 구현예에서, 포스페이트 유사체는 종종 효소적 제거에 취약한 5'-포스페이트 대신 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오티드에 위치한다. 일부 구현예에서, 5' 포스페이트 유사체는 포스파타제-저항성 연결을 함유한다. 포스페이트 유사체의 예는 5' 포스포네이트, 예컨대 5' 메틸렌 포스포네이트(5'-MP) 및 5'-(E)-비닐포스포네이트(5'-VP)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 5'-말단 뉴클레오티드에서 당의 4'-탄소 위치에 포스페이트 유사체("4'-포스페이트 유사체"로 지칭됨)를 갖는다. 4'-포스페이트 유사체의 예는 옥시메틸기의 산소 원자가 당 모이어티(예를 들어, 이의 4'-탄소에서) 또는 이의 유사체에 결합된 옥시메틸포스포네이트이다. 예를 들어, 미국 가특허 출원 번호 제 62/383,207호(2016년 9월 2일 출원) 및 제 62/393,401호(2016년 9월 12일 출원)를 참조한다. 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 대한 다른 변형이 개발되었다(예를 들어, 국제 특허 출원 번호 제WO 2011/133871호; 미국 특허 번호 제8,927,513호; 및 Prakash 등 (2015) Nucleic Acids Res. 43:2993-3011 참조).
본원에 사용된 유전자 (예를 들어, α-1 항트립신)의 "감소된 발현"은 적절한 기준 (예를 들어, 기준 세포, 세포 집단, 샘플 또는 대상체)과 비교할 때, 유전자에 의해 암호화되는 RNA 전사체 (예를 들어, α-1 항트립신 mRNA) 또는 단백질의 양 또는 수준의 감소 및/또는 세포, 세포 집단, 샘플 또는 대상체 내의 유전자의 활성의 양 또는 수준의 감소를 지칭한다. 예를 들어, 세포를 본원의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, α-1 항트립신 mRNA를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드)와 접촉시키는 행위는 올리고뉴클레오티드로 처리되지 않은 세포와 비교할 때 α-1 항트립신 mRNA, 단백질 및/또는 활성의 양 또는 수준 (예를 들어, RNAi 경로에 의한 α-1 항트립신 mRNA의 분해를 통해)의 감소를 초래할 수 있다. 유사하게, 그리고 본원에 사용된 "발현 감소"는 유전자(예를 들어, α-1 항트립신)의 감소된 발현을 초래하는 행위를 지칭한다.
본원에 사용된 "α-1 항트립신 발현의 감소"는 적절한 기준(예를 들어, 기준 세포, 세포 집단, 샘플, 또는 대상체)과 비교할 때 세포, 세포 집단, 샘플 또는 대상체에서 α-1 항트립신 mRNA, α-1 항트립신 단백질 및/또는 α-1 항트립신 활성의 양 또는 수준의 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 "상보성 영역"은 적절한 혼성화 조건 하에서(예를 들어, 포스페이트 완충제 내, 세포 내 등) 뉴클레오티드의 2개의 서열 사이의 혼성화를 허용하기에 뉴클레오티드의 역평행 서열에 충분히 상보적인 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원의 올리고뉴클레오티드는 mRNA 표적 서열에 상보성 영역을 갖는 표적화 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "리보뉴클레오티드"는 이의 2' 위치에 히드록실기를 함유하는 오탄당으로서 리보스를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 리보뉴클레오티드는 리보스, 포스페이트기 또는 염기의 변형 또는 치환을 포함하여 2' 위치가 아닌 원자의 하나 이상의 변형 또는 치환을 갖는 리보뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 "RNAi 올리고뉴클레오티드"는 (a) 안티센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 일부는 표적 mRNA (예를 들어, α-1 항트립신 mRNA)의 절단에서 아르고노트 2 (Ago2) 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는 센스 가닥 (패신저) 및 안티센스 가닥 (가이드)을 갖는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 또는 (b) 안티센스 가닥 (또는 그 안티센스 가닥의 일부)는 표적 mRNA (예를 들어, α-1 항트립신 mRNA)의 절단에서 Ago2 엔도뉴클레아제에 의해 사용되는 단일 안티센스 가닥을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에 사용된 "가닥"은 뉴클레오티드 간 연결(예를 들어, 포스포디에스테르 연결 또는 포스포로티오에이트 연결)을 통해 함께 연결된 뉴클레오티드의 단일, 연속 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 가닥은 2개의 유리 말단(예를 들어, 5' 말단 및 3' 말단)을 갖는다.
본원에 사용된 "대상체"는 마우스, 래빗 및 인간을 포함하는 임의의 포유동물을 의미한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 또는 NHP이다. 또한, "개체" 또는 "환자"는 "대상체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "합성"은 인공적으로 합성되는(예를 들어, 기계(예를 들어, 고체-상태 핵산 합성기)를 사용하여) 또는 그렇지 않으면 분자를 정상적으로 생산하는 천연 공급원(예를 들어, 세포 또는 유기체)으로부터 유도되지 않는 핵산 또는 다른 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 "표적화 리간드"는 관심 조직 또는 세포의 동족 분자(예를 들어, 수용체)에 선택적으로 결합하고, 관심 조직 또는 세포에 다른 물질을 표적화할 목적으로 다른 물질에 접합가능한 분자(예를 들어, 탄수화물, 아미노 당, 콜레스테롤, 폴리펩티드 또는 지질)를 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 올리고뉴클레오티드를 관심 세포 또는 특정 조직으로 표적화하기 위한 목적으로 올리고뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 세포 표면 수용체에 선택적으로 결합한다. 따라서, 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드에 접합될 때 표적화 리간드는 세포의 표면 상에 발현된 수용체에 대한 선택적 결합 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 복합체의 세포에 의한 엔도솜 내재화를 통해 특정 세포로의 올리고뉴클레오티드의 전달을 용이하게 한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드는 세포 내재화 후에 또는 세포 내재화 동안 절단되는 링커를 통해 올리고뉴클레오티드에 접합되어, 올리고뉴클레오티드가 세포 내의 표적화 리간드로부터 방출되게 한다.
본원에 사용된 "테트라루프(tetraloop)"는 뉴클레오티드의 측면에 있는 서열의 혼성화에 의해 형성된 인접 듀플렉스의 안정성을 증가시키는 루프를 지칭한다. 안정성의 증가는 뉴클레오티드의 무작위로 선택된 서열로 이루어진 필적하는 길이의 일련의 루프로부터 평균적으로 예상되는 인접 스템 듀플렉스의 Tm보다 높은 인접 스템 듀플렉스의 용융 온도(Tm)의 증가로서 검출가능하다. 예를 들어, 테트라루프는 10 mM Na2HPO4 중 적어도 약 50℃, 적어도 약 55℃, 적어도 약 56℃, 적어도 약 58℃, 적어도 약 60℃, 적어도 약 65℃ 또는 적어도 약 75℃의 Tm을 적어도 2개의 염기쌍(bp) 길이의 듀플렉스를 포함하는 헤어핀에 부여할 수 있다. 일부 구현예에서, 테트라루프는 10 mM NaH2PO4 중 적어도 약 50℃, 적어도 약 55℃, 적어도 약 56℃, 적어도 약 58℃, 적어도 약 60℃, 적어도 약 65℃ 또는 적어도 약 75℃의 Tm을 적어도 2개의 염기쌍(bp) 길이의 듀플렉스를 포함하는 헤어핀에 부여할 수 있다. 일부 구현예에서, 테트라루프는 상호 작용의 적층에 의해 인접한 스템 듀플렉스에서 bp를 안정화시킬 수 있다. 또한, 테트라루프에서의 뉴클레오티드 사이의 상호작용은 비-왓슨-크릭(non-Watson-Crick) 염기 쌍형성, 적층 상호작용, 수소 결합 및 접촉 상호작용(Cheong 등 (1990) NATURE 346:680-82; Heus & Pardi (1991) SCIENCE 253:191-94)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 테트라루프는 3 내지 6개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지고 전형적으로 4 내지 5개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 테트라루프는 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 이루어지며, 이는 변형될 수 있거나 또는 변형되지 않을 수 있다(예를 들어, 표적화 모이어티에 접합될 수 있거나 접합되지 않을 수 있다). 일부 구현예에서, 테트라루프는 4개의 뉴클레오티드로 이루어진다. 임의의 뉴클레오티드가 테트라루프에 사용될 수 있고, 이러한 뉴클레오티드에 대한 표준 IUPAC-IUB 심볼은 문헌 Cornish-Bowden (1985) NUCLEIC ACIDS RES. 13:3021-30]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문자 "N"은 임의의 염기가 그 위치에 있을 수 있다는 것을 의미하는 데 사용될 수 있고, 문자 "R"은 A(아데닌) 또는 G(구아닌)가 그 위치에 있을 수 있다는 것을 보여주는 데 사용될 수 있고, "B"는 C(시토신), G(구아닌) 또는 T(티민)가 그 위치에 있을 수 있다는 것을 보여주는 데 사용될 수 있다. 테트라루프의 예는 테트라루프의 UNCG 패밀리 (예를 들어, UUCG), 테트라루프의 GNRA 패밀리 (예를 들어, GAAA), 및 CUUG 테트라루프 (Woese 등 (1990) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 87:8467-71; Antao 등 (1991) NUCLEIC ACIDS RES. 19:5901-05). DNA 테트라루프의 예는 테트라루프의 d(GNNA) 패밀리(예를 들어, d(GTTA), 테트라루프의 d(GNRA) 패밀리, 테트라루프의 d(GNAB) 패밀리, 테트라루프의 d(CNNG) 패밀리, 및 테트라루프의 d(TNCG) 패밀리(예를 들어, d(TTCG))를 포함한다. 예를 들어, Nakano 등 (2002) BIOCHEM. 41:14281-92; Shinji 등 (2000) NIPPON KAGAKKAI KOEN YOKOSHU 78:731를 참조한다. 일부 구현예에서, 테트라루프는 닉킹된 테트라루프 구조 내에 함유된다.
본원에 사용된 "치료하다" 또는 "치료하는"는 예를 들어, 기존의 병태(예를 들어, 환, 장애)에 대한 대상체의 건강 및/또는 안녕을 개선하거나 병태의 발생 가능성을 예방하거나 감소시키기 위해, 대상체에 치료제(예를 들어, 본원의 올리고뉴클레오티드)를 투여함으로써, 이를 필요로 하는 대상체에 대해 치료를 제공하는 행위를 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료는 대상체에 의해 경험되는 병태(예를 들어, 질환, 장애)의 적어도 하나의 징후, 증상 또는 기여 인자의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 포함한다.
실시예
실시예 1: RNAi 올리고뉴클레오티드의 제조
올리고뉴클레오티드 합성 및 정제
전술한 예에 기재된 올리고뉴클레오티드(RNAi 올리고뉴클레오티드)는 본원에 기재된 방법을 사용하여 화학적으로 합성된다. 일반적으로, RNAi 올리고뉴클레오티드는 19-23량체 siRNA에 대해 기재된 바와 같은 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 방법(예를 들어, Scaringe 등 (1990) NUCLEIC ACIDS RES. 18:5433-41 및 Usman 등 (1987) J. Am. Chem. Soc. 109:7845-45 참조; 또한, 미국 특허 번호 5,804,683; 5,831,071; 5,998,203; 6,008,400; 6,111,086; 6,117,657; 6,353,098; 6,362,323; 6,437,117 6,469,158 참조)을 사용하고 공지된 포스포아미다이트 합성을 사용하여 합성된다(예를 들어, Hughes 및 Ellington (2017) Cold Spring Harb Perspect Biol. 9(1):a023812; 및, Beaucage S.L., 및 Caruthers M.H., Studies on Nucleotide Chemistry V: Deoxynucleoside Phosphoramidites―A New Class of Key Intermediates for Deoxypolynucleotide Synthesis, TETRAHEDRON LETT. 1981;22:1859-62 참조).
개별 RNA 가닥을 합성하고, 표준 방법(Integrated DNA Technologies; Coralville, IA)에 따라 HPLC 정제하였다. 예를 들어, 표준 기술(Damha & Olgivie (1993) METHODS MOL. BIOL. 20:81-114; Wincott 등 (1995) NUCLEIC ACIDS RES. 23:2677-84)을 사용하여 NAP-5 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) 상에서 탈보호 및 탈염된 고체상 포스포라미다이트 화학을 사용하여 RNA 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 올리고머를 15분 단계-선형 구배를 사용하여 Amersham Source 15Q 컬럼 (1.0 cm × 25 cm; Amersham Pharmacia Biotech) 상에서 이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피 (IE-HPLC)를 사용하여 정제하였다. 구배는 90:10 완충액 A:B에서 52:48 완충액 A:B으로 변화하였으며, 완충액 A는 100 mM 트리스 pH 8.5이고 완충액 B는 100 mM 트리스 pH 8.5, 1 M NaCl이다. 샘플을 260 nm에서 모니터링하고, 전장 올리고뉴클레오티드 종에 상응하는 피크를 수집하고, 풀링하고, NAP-5 컬럼 상에서 탈염시키고, 동결건조시켰다.
각각의 올리고머의 순도를 Beckman PACE 5000 (Beckman Coulter, Inc.; Fullerton, CA) 상에서 모세관 전기영동 (CE)으로 결정하였다. CE 모세관은 100 μm 내경을 가지며 ssDNA 100R 겔 (Beckman-Coulter)을 함유한다. 전형적으로, 약 0.6 nmole의 올리고뉴클레오티드를 모세관 내로 주사하고, 444 V/cm의 전기장에서 실행하고, 260 nm에서 UV 흡광도에 의해 검출하였다. 변성 트리스-보레이트-7 M-우레아 실행 완충제를 베크만-쿨터(Beckman-Coulter)로부터 구입하였다. 하기 기재된 실험에 사용하기 위해 CE에 의해 평가된 바와 같이 적어도 90% 순수한 올리고리보뉴클레오타이드를 수득하였다. 화합물 동일성을 제조사의 권장 프로토콜에 따라 Voyager DE™ Biospectometry Work Station(Applied Biosystems; Foster City, CA)에서 매트릭스 보조-레이저 탈착 이온화 비행 시간(time-of-flight) (MALDI-TOF) 질량 분광법으로 검증하였다. 모든 올리고머의 상대 분자 질량을 종종 예상 분자 질량의 0.2% 이내에서 수득하였다.
듀플렉스 제조
단일 가닥 RNA 올리고머를 100mM 칼륨 아세테이트, 30mM HEPES, pH 7.5로 이루어진 듀플렉스 완충제에 재현탁시켰다 (예를 들어, 100μM 농도에서). 상보적인 센스 및 안티센스 가닥을 동일한 몰량으로 혼합하여 예를 들어 50μM 듀플렉스의 최종 용액을 생성하였다. 샘플을 RNA 완충제(IDT)에서 5' 동안 100℃로 가열하고 사용 전에 실온으로 냉각되도록 하였다. RNAi 올리고뉴클레오티드는 -20℃에서 보관되었다. 단일 가닥 RNA 올리고머는 동결건조되거나 -80℃에서 뉴클레아제가 없는 물에 보관되었다.
표 1: SERPINA1을 표적화하는 DsiRNA (비변형)
표 1에 제공된 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 36량체 패신저 가닥 및 22량체 가이드 가닥을 갖는 닉킹된 테트라루프 구조를 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 생산하였다. 구체적으로, 표 3에 제공된 SERPINA1 RNAi 올리고뉴클레오티드의 패신저 가닥 및 가이드 가닥 각각은 변형된 뉴클레오티드 및 포스포로티오에이트 연결(서열번호 33-102)의 독특한 패턴을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드 및 포스포로티오에이트 연결의 패턴은 하기에 기재되어 있다:
패턴 A (SM1047/ASM1508)
센스 가닥:
[mXs][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][mX][fX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][mX][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
안티센스 가닥:
[포스포네이트-4O-mUs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX] [mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mGs][mG]
패턴 B (SM988/ASM1266)
센스 가닥:
[mXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][fX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mX][mG][mC][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
안티센스 가닥:
[포스포네이트-4O-mUs] [fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][mX]
[mX][fX][mX][fX] [fX][mX][fX][mXs][mGs][mG]
패턴 C (SM1218/ASM1508)
센스 가닥:
[mXs][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][mX][fX][fX][mX] [mX][mX][fX][mX[mX][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC]
안티센스 가닥:
[포스포네이트-4O-mUs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX] [fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mGs][mG]
패턴 D (SM1178/ASM1266)
센스 가닥:
[mXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][fX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mA][mG][mC][mC][prgG-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][prgA-peg-GalNAc][mG][mG][mC]
안티센스 가닥:
[포스포네이트-4O-mUs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][mX] [mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mXs][mGs][mG]
패턴 E (SM1217/ASM1508)
센스 가닥:
[mXs][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][mX][fX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][mX][mX][mG][mC][mA][mG][mC][mC][ademG-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
안티센스 가닥:
[메포스포네이트-4O-mXs][fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mGs][mG]
패턴 F (SM1217/ASM1704)
센스 가닥:
[mXs][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][fX][fX][mX][fX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][mX][mX][mG][mC][mA][mG][mC][mC][ademG-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]
안티센스 가닥:
[메포스포네이트-4O-mXs] [fXs][fXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mGs][mG]
표 2. 변형 키
표 3: SERPINA1을 표적화하는 변형된 올리고뉴클레오티드
실시예 2:
시험관내 A1AT/SERPINA1
발현의 RNAi 올리고뉴클레오티드 억제
N-아세틸갈락토사민(GalNAc)에 접합된 SERPINA1-특이적 작은 간섭 RNA(siRNA)가 개발되었다. SERPINA1 RNAi 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭(RNAi) 전략(McManus M. T., 및 P. A. Sharp. 2002. 'Gene silencing in mammals by small interfering RNAs', Nat Rev Genet, 3(10): 737-47)을 사용하여 알파-1 항트립신 결핍(A1ATD)이 있는 대상체에서 SERPINA1 mRNA와 돌연변이 알파-1 항트립신(Z-AAT) 단백질 축적을 간에서 감소시킨다. 이는 GalNAc에 접합된 매우 강력한 siRNA를 사용함으로써 달성되고, 이는 피하(SC) 투여 후 간세포에 의해 선택적으로 흡수되어 간에서 Z-AAT 단백질의 농도를 감소시킨다. 간에서 응집된 Z-AAT 단백질의 손상된 분해는 Z-AAT 단백질 및 A1ATD-관련 간 질환의 독성 축적을 초래한다. 따라서, SERPINA1 유전자 발현을 표적화함으로써 간에서 Z-AAT 단백질의 수준을 직접적으로 감소시키는 것은 치료적 이점을 제공할 수 있는 잠재력을 갖는다.
본 연구의 목적은 인간 간암종 세포주 HuH-7에서 시험관 내 인간 SERPINA1 전사체를 표적화하는 SERPINA1 RNAi 올리고뉴클레오티드(변형 패턴 A-D를 가짐)의 활성을 비교하는 것이었다.
물질 및 방법
테스트 물품 제조
표 3에 기재된 SERPINA1 RNAi 올리고뉴클레오티드를 강한 음이온 교환 크로마토그래피(Chemgenes, Wilmington MA)를 사용하여 정제된 고체상 합성을 통해 제조하였다. 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI MS)을 사용하여 서열 동일성을 확인했다. RNA 듀플렉스는 260 nm에서 UV 흡광도로 농도-정규화하였다.
HuH-7 세포의 세포 배양 및 형질감염
인간 간세포 암종 세포주 HuH-7(Japanese Collection of Research Bioresources JCRB, 일본)은 10% FBS(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)가 있는 DMEM(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 유지되었다. 세포는 37℃ 및 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 유지되었다. 리포펙타민 RNAi MAX (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) 및 지정된 테스트 물품을 OptiMEM(ThermoFisher Scientific)에 희석했다. 희석된 테스트 물품(표 3)과 희석된 시약을 혼합하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 복합체를 형성하였다. 이 복합체를 세포에 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. HuH-7 세포는 제조사의 프로토콜에 따라 OptiMEM 배지(ThermoFisher Scientific)에서 3가지 농도의 지정된 테스트 물품과 리포펙타민 RNAiMAX (ThermoFisher Scientific)를 사용하여 역 형질감염되었다. 테스트 물품의 최종 농도는 1, 0.1 및 0.01 nM이었다. 최종 세포 농도는 96웰 해자 플레이트(ThermoFisher Scientific)에서 2 x 104 세포/웰이었다.
RNA 추출 및 cDNA 합성
형질감염 복합체로 24시간 인큐베이션 후, 세포를 1X PBS로 1회 세척한 다음 iScript RT-qPCR 용해 완충제(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 용해시켰다. 용해물의 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 고용량 cDNA 역전사 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 역전사하였다.
실시간(Real-time) qPCR 및 데이터 분석
합성된 cDNA를 iQ Power Mix(Bio-Rad, Hercules, CA)가 있는 정량적 PCR에 사용하였다. 프라이머 및 프로브는 Integrated DNA Technology (Coralville, IA)에서 구입하였다. qPCR 반응은 CFX-384 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA)에서 실행하였고 데이터는 DDCt) 방법을 사용하여 분석하였다. 유전자 발현 데이터를 모의 형질감염된 샘플에 대해 정규화하였다.
결과 및 결론
다중 접합체는 HuH-7 세포에서 SERPINA1 발현의 양호한 녹다운을 보여주었다(도 1).
실시예 3: 마우스에서 SERPINA1-1459의 약동학적 효능, 용량-반응 및 기간의 평가
실시예 2의 결과를 기반으로, 서열번호 105의 센스 가닥 및 서열번호 25의 안티센스 가닥을 갖는 SERPINA1-1459를 추가 연구를 위해 선택하였다. SERPINA1-1459는 변형 패턴 F (도 2a에 도시된 바와 같이, 서열번호 103에 제시된 센스 가닥 및 서열번호 104에 제시된 안티센스 가닥)로 생성하였다. 본 실시예 및 하기의 실시예에서, "SERPINA1-1459"는 이들 변형된 서열을 지칭한다. 구체적으로, 본 연구는 돌연변이체 인간 SERPINA1 유전자를 보유하고 인간 Z-AAT 단백질을 발현하는 알파-1-항트립신 결핍(A1ATD)의 PiZ 마우스 모델에 단일 볼루스 피하(SC) 주사 후 변형된 SERPINA1-1459 활성의 약동학적 효능, 용량-반응 및 기간을 평가하기 위해 설계되었다.
구체적으로, 간 인간 Z-AAT 단백질을 발현하는 수컷 PiZ 마우스를 세인트 루이스 대학의 Dr. J. Teckman (Carlson 등, Accumulation of PiZ antitrypsin causes liver damage in transgenic mice, (May 1989), JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 83(4):1183-90; Rudnick 등, HEPATOLOGY, Vol. 39, No. 4, 2004)의 실험실에 의해 제공된 균주로부터의 마우스를 사용하여 확립된 번식 콜로니로부터 수득하였다. 마우스(4주령)를 임의로 실험실 음식(chow) 및 물에 대한 접근과 함께, 병원균이 없는 특정 사육(husbandry) 조건 하에 유지하였다. 수컷 PiZ 마우스를 연구 시작 시 연구군(군당 n=5)으로 무작위화하였다.
각각의 테스트 물품을 1, 3, 또는 10 mg/kg 투여 군에 대해 각각 0.1, 0.3, 또는 1.0 mg/mL의 농도로 PBS에서 희석하였다. 투여 부피를 투약 당일(1일차) SC 투여 전에 취한 마우스의 개별 체중을 기반으로 계산하였다. 투여 제형은 일회용 1.0 mL 주사기를 사용하여 마우스의 등에 투여하였다. 연구 1일차에 마우스는 0(포스페이트-완충 식염수[PBS]), 1, 3, 또는 10 mg/kg SERPINA1-1459의 단일 피하(SC) 주사를 받았다. 비히클 대조군 마우스에 테스트 물품(10 mL/kg)과 동일한 부피 및 방법론으로 PBS를 투여하였다.
혈액 샘플을 투여 전 및 연구 전반에 걸쳐 매주 수집하였다(1 및 3 mg/kg 투여 군에 대해 8주 및 PBS 및 10 mg/kg 투여 군에 대해 10주). 대조군 파라미터는 투여 전 측정으로부터의 것이다. 꼬리 정맥에서 혈액 샘플을 수집했다. 96웰 v-바닥 플레이트의 각 웰은 인간 A1AT SimpleStep ELISA 키트(Abcam, Cambridge, MA)의 98μL의 희석제 NS로 미리 채워졌다. 마우스를 가열 램프 아래에서 미리 데운 다음 구속기에 배치하였다. 꼬리 정맥에 작은 구멍을 내고 20μL 단일 채널 피펫을 사용하여 2μL의 혈액을 제거하였다. 200 μL 단일 채널 피펫을 사용하여 샘플을 완전히 혼합했다. 샘플을 분취하고 -80℃에서 보관했다. 간에서 SERPINA1-1459 활성에 대한 바이오마커인 혈청 Z-AAT 농도를 혈청 샘플에서 효소 연결 면역흡수 검정(ELISA)로 측정하였다.
검정 당일, 혈액 샘플을 얼음 위에서 해동하고 희석제 NS(최종 희석: 1:5,000)에서 추가로 희석했다. 인간 알파 1 항트립신 검출을 위한 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트 (Abcam, Cambridge, MA, 카탈로그 번호 ab189579)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 50 μL의 희석된 혈액에서 Z-AAT 단백질 농도를 측정했다. 샘플을 ELISA로 이중으로 분석했다. SERPINA1-1459 처리 후 순환 Z-AAT 단백질 농도의 감소를 투여 전 및 시간-일치 PBS Z-AAT 단백질 농도에 대한 순환 Z-AAT 단백질 농도의 감소 백분율로 계산하였다.
SERPINA1-1459의 투여(도 2a)는 도 2b에 나타낸 바와 같이, 1 ㎎/㎏ 투여 군에 대한 단일 SC 투여 후 1주 후에 최대 감소를 갖는 순환 Z-AAT 단백질 농도의 활발하고(robust) 용량-관련 감소를 초래하였다. 이 때, 기준선 대비 순환 Z-AAT 단백질 농도의 최대 감소는 2.1배 (51% 감소, P ≤ 0.01)였다. 순환 Z-AAT 단백질 농도의 최대 감소는 3 mg/kg 및 10 mg/kg 투여군에 대한 단일 SC 투여 후 2주였다. 이 때, 기준선 대비 순환 Z-AAT 단백질 농도의 최대 감소는 3 mg/kg 투여군 및 10 mg/kg 투여군 (P < 0.0001, 두 군 모두)에 대해 각각 6.6배 (85% 감소) 및 33.3배 (97% 감소)였다. Z-AAT 단백질의 순환 농도는 각각 1, 3, 및 10 ㎎/㎏ 투여군에서 3, 7, 또는 9주 후에 기준선 농도로 서서히 복귀하였다. SERPINA1-1459에 의한 마우스에서 순환 Z-AAT 단백질 농도의 감소를 위한 반-최대 유효 용량(ED50)은 PiZ 마우스에서 1 ㎎/㎏인 것으로 추정되었다(도 2c). 따라서, SERPINA1-1459 투여 후에 관찰된 순환 Z-AAT 수준의 감소는 최대 반응의 관점에서 및 그 반응의 기간의 관점에서 둘 모두 용량-관련되었다.
A1ATD 환자의 간 질환의 진행은 간세포에서 Z-AAT의 점진적인 축적에 연결된다. SERPINA1-1459는 PiZZ(중증 알파 1-항트립신 결핍) 환자에서 간 질환의 진행을 늦추거나, 중단하거나, 또는 역전시킬 수 있는 유의미한 치료적 개입을 생산할 수 있는 잠재력을 갖는다. 따라서, SERPINA1-1459는 간 질환을 갖는 PiZZ 환자를 위한 생명을 구하는 치료적 개입을 나타낼 수 있다.
실시예 4: SERPINA1-1459 처리 후 A1ATD-관련 간 질환 표현형에 대한 간 인간 Z-AAT 녹다운의 효능 평가
A1ATD-관련 간 질환 표현형에 대한 인간 Z-AAT 녹다운의 효능을 평가하기 위해, SERPINA1-1459의 효능을 수컷 및 암컷 PiZ 마우스에서 평가하였다(실시예 3에 기재된 바와 같음).
구체적으로, 마우스(5-49주령)는 실험실 음식 및 물에 임의로 접근할 수 있는 특정 병원체가 없는 사육 조건에서 유지되었다. 총 44마리의 PiZ 마우스가 처음 연구에 할당되었다. 마우스 유전자형의 최종 확인은 9마리의 마우스가 인간 SERPINA1 유전자를 발현하지 않아 연구에서 제외되었음을 밝혔다. 마우스에게 22주 기간 동안 4주마다 한번 6회 SC 용량의 3 mg/kg SERPINA1-1459를 제공했다(즉, 0일차에 초기 투여 및 4, 8, 12, 16 및 20주차에 투여). 투여는 각각 27주, 34주 또는 71주령에 연구를 종료한 5주, 12주 및 49주령 수컷 및 암컷 PiZ 마우스에서 시작되었다.
물질 및 방법
RT-qPCR에 의한 SERPINA1 mRNA 측정
인간 Z-AAT 단백질의 세포내 보유, 증가된 세포 증식을 야기하는 상응하는 재생 자극, 및 진행성 간 섬유화를 포함하여, PiZ 마우스 모델에서 보존되는 것으로 이전에 나타난 A1ATD-관련 간 질환의 특징에 대한 효능 및 SERPINA1 mRNA 녹다운의 측정을 위해 말단 간 조직을 수집하였다(Rudnick 등 등, HEPATOLOGY, Vol. 39, No. 4, 2004; Marcus 등 Hepatol Res. 2010 June ; 40(6): 641-653.; Tang 등 Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 311: G156-G165, 2016.). 트랜스아미나제를 포함하는 혈청 화학 파라미터의 측정을 위해 말단 혈청 샘플을 수집하였다. 구체적으로, 대략 50 mg의 샘플을 조직용해제 II (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 0.75 mL 페놀/구아니딘계 QIAzol 용해 시약 (Qiagen, Valencia, CA)에서 균질화하였다. 균질물을 1-브로모-3-클로로프로페인 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 추출하였다. MagMax Technology (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 0.2 mL의 수성상에서 RNA를 제조사의 지침에 따라 추출하였다. RNA를 260 및 280 나노미터에서 분광법을 사용하여 정량화하였다. RT-qPCR 프라이머 및 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA)로부터의 프로브 및 ThermoFisher Scientific(Waltham, MA) 및 BioRad Laboratories(Hercules, CA)로부터의 시약을 사용하여 하우스키핑 유전자 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Hprt)에 대한 정규화로 SERPINA1 mRNA 수준을 측정하였다. SERPINA1-1459 처리군에서 SERPINA1 mRNA 감소의 정도를 연령이 일치하는 마우스로부터의 식염수-처리된 대조군의 평균 발현 수준에 대한 발현 백분율(Hprt로 정규화됨)로서 계산하였고, 식염수-처리된 대조군에서 SERPIN1 mRNA 발현은 100%로 설정하였다. 평균 ± 표준편차의 그래프가 생성되었고, 데이터를 GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA)을 사용하여 분석하였다. 연령이 일치하는 마우스로부터의 식염수-처리된 대조군에 대해 SERPINA1-1459-처리군 내의 SERPINA1 mRNA 수준(Hprt로 정규화됨)을 비교하기 위해 언페어드 t 테스트를 수행하였다. 확인을 위해 PCR을 두 번 실행하였다.
A1AT ELISA
제조사의 지침에 따라 인간 알파 1 항트립신(SERPINA1) ELISA 키트(Abcam, Cambridge, MA)를 사용하여 50 μL 희석 혈액 샘플(ELISA 키트의 검정 완충제로 전혈을 1:5,000 희석)에서 인간 Z-AAT 단백질 농도를 이중으로 측정했다. PiZ 마우스는 인간 Z-AAT 단백질만 발현하므로 인간 특이적 항-A1AT 항체는 순환 인간 Z-AAT 단백질 수준의 척도이다. SERPINA1-1459-처리군 중의 인간 Z-AAT 단백질 농도의 감소는 투여전 인간 Z-AAT 농도에 대한, 및 수컷 및 암컷에 대해 독립적으로 동일한 날에 연령이 일치하는 (식염수-처리된)대조군의 평균 발현 수준에 대한 발현 백분율로서 계산되었고, 여기서 대조군 군 중의 인간 Z-AAT 단백질 농도는 100%로 설정되었다. 평균 ± 표준 편차의 그래프를 생성하고 GraphPad Prism(GraphPad Software, La Jolla, CA)을 사용하여 데이터를 분석했다. 동일한 시점에서 연령이 일치하는 마우스의 식염수 처리 대조군과 비교하여 SERPINA1-1459-처리군의 인간 Z-AAT 단백질 수준을 비교하기 위해 언페어드 t 테스트를 수행하였다.
인간 Z-AAT 단백질의 웨스턴 블롯
조직 용해물을 T-PER 조직 단백질 추출 시약 및 프로테아제 억제제 칵테일 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)이 포함된 조직용해제 II (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 제조하였다. 총 단백질 농도는 BCA 단백질 검정 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)으로 측정하였고, 추정된 동일한 단백질 농도는 NuPAGE 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)으로 분해하였다. 전기영동된 단백질을 iBlot Dry Blotting System (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, Odyssey Blocking Buffer (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE)로 차단하여 비특이적 결합을 예방하였다. 이어서, 막을 래빗 항-인간 A1AT 항체 (Abcam, Cambridge, MA) 및 마우스 항-글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소 항체 (Abcam, Cambridge, MA)로 인큐베이션하였다. 항-래빗 IRDye 680 및 항-마우스 IRDye 800 2차 항체 (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE)를 검출에 사용하였고, 신호 강도를 Odyssey Infrared Imaging System (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE)을 사용하여 측정하였다. PiZ 마우스는 인간 Z-AAT 단백질만 발현하므로 인간 특이적 항-A1AT ELISA는 순환 인간 Z-AAT 단백질 수준의 척도이다. SERPINA1-1459-처리군 중의 인간 Z-AAT 단백질 농도의 감소는 투여전 인간 Z-AAT 농도에 대한, 및 수컷 및 암컷에 대해 독립적으로 동일한 날에 연령이 일치하는 (식염수-처리된)대조군의 평균 발현 수준에 대한 발현 백분율로서 계산되었고, 여기서 대조군 군 중의 인간 Z-AAT 단백질 농도는 100%로 설정되었다. 평균 ± 표준 편차의 그래프를 생성하고 GraphPad Prism(GraphPad Software, La Jolla, CA)을 사용하여 데이터를 분석했다. 연령이 일치하는 마우스의 식염수 처리 대조군과 비교하여 SERPINA1-1459-처리군의 인간 Z-AAT 단백질 수준을 비교하기 위해 언페어드 t 테스트를 수행하였다.
면역조직화학
간 조직을 수집하고, 10% 중성-완충 포르말린에서 밤새 고정시킨 다음, 70% 에탄올로 옮겼다. 파라핀 포매 및 슬라이드 제조는 Mass Histology Service (Worcester, MA)에서 완료하였다. 디아스타제-소화 (PAS-D)를 사용한 주기적 산 쉬프 염색 및 시리우스 레드 (Abcam, Cambridge, MA) 염색을 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 면역조직화학(IHC) 실험을 위해, 파라핀 절편을 탈파라핀화 및 재수화시켰다. A1AT, 인간 Z-AAT 중합체, 및 Ki67 IHC 샘플에 대해 열-매개 항원 회수(시트레이트 완충제, pH 6.0)를 수행하였다. 내인성 과산화효소 및 알칼리성 포스파타제를 BLOXALL 용액(Vector Laboratories, Burlingame, CA)으로 차단하였다. 래빗 모노클로날 항-A1AT 항체 (1:500 희석, Abcam, Cambridge, MA), 마우스 모노클로날 항-Z-AAT 중합체 2C1 항체 (1:50, Hycult Biotech, Wayne, PA), 및 래빗 모노클로날 항-Ki67 항체 (1:100 희석, Abcam, Cambridge, MA)를 SignalStain® 항체 희석제 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA)에 희석시키고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PiZ 마우스는 인간 Z-AAT 단백질만을 발현하므로, 인간 특이적 항-A1AT 항체는 인간 Z-AAT 단백질 수준의 척도이다. 1차 항체의 결합은 SignalStain® DAB Substrate Kit(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)와 함께 염소 항-래빗 IgG HRP 항체(Antibodies-online, Atlanta, GA) 또는 염소 항-마우스 IgG HRP 항체(Abcam, Cambridge, MA)를 사용하여 검출하였다. 결과는 Olympus VS-ASW 이미지 분석 소프트웨어를 사용한 OlympusBX61VS 슬라이드 스캐너를 사용하여 시각화하였다.
간 효소 분석
최종 혈액 수집은 혈액 화학 파라미터 측정을 위해 혈청으로 가공되었다. 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 및 알칼리성 포스파타제 수준은 IDEXX BioResearch Laboratories(Grafton, MA)로 측정하였다. 평균 ± 표준 편차의 그래프를 생성하고 GraphPad Prism(GraphPad Software, La Jolla, CA)을 사용하여 데이터를 분석하였다. SERPINA1-1459-처리군의 ALT, AST 또는 ALP 수준을 연령이 일치하는 마우스의 식염수 처리 대조군과 비교하기 위해 언페어드 t 테스트를 수행하였다.
결과
SERPINA1-1459의 반복 투여는 PiZ 마우스에서 SERPINA1 mRNA 발현을 유의하게 감소시켰다(도 3에 나타냄). 4주마다 6회 용량의 SERPINA1-1459를 투여하면 5주(P < 0.0001) 및 12주(P ≤ 0.05) 늙은 PiZ 마우스에서 SERPINA1 mRNA 발현이 유의하게 감소하였다. 49주령 PiZ 마우스는 군당 마우스 수가 적어 통계적 유의성을 계산할 수 없었다.
SERPINA1-1459의 반복 투여는 PiZ 마우스에서 순환 인간 Z-AAT 단백질 수준을 유의하게 감소시켰다(ELISA에 의해 측정된 바와 같음, 도 4). 인간 Z-AAT 수준은 SERPINA1-1459의 단일 투여 후에 감소되었고, 이러한 감소는 5, 12, 및 49주령 PiZ 마우스에서 SERPINA1-1459의 4주마다 5회 추가 투여만큼 유지되었다.
SERPINA1-1459의 반복 투여는 간 조직 샘플의 웨스턴 블롯 및 IHC에 의해 입증된 바와 같이 5 내지 27주령까지 처리된 PiZ 마우스에서 순환 인간 Z-AAT 단백질 수준을 상당히 감소시켰다. 인간 Z-AAT 단백질은 SERPINA1-1459 처리된 마우스에서 웨스턴 블롯(도 5 및 도 6)에 의해 검출가능하지 않았고, 간 조직의 IHC(도 7)에서 효과적으로 감소되었다. 12주 및 49주령에 시작한 처리를 받은 마우스에서 유사한 감소가 관찰되었고, 각각 34주 및 71주차에 조직을 수집하였다 (데이터는 나타내지 않음).
SERPINA1-1459를 사용한 PiZ 마우스 치료는 A1AT-관련 간 병리를 감소시킨다
PiZZ 환자에서, 돌연변이체 인간 Z-AAT 단백질은 간세포에서 동종중합체로서 잘못 접힘 및 응집 경향이 있다. 이 응집된 단백질의 손상된 분해는 생성된 A1ATD-관련 간 질환을 가진 일부 환자의 간에서 인간 Z-AAT의 독성 축적을 초래한다. 인간 Z-AAT 중합체-특이적 항체를 사용한 IHC (Tan 등 Int J Biochem Cell Biol. 2015 Jan; 58:81-91)은 5주령에서 시작한 PiZ 마우스를 SERPINA1-1459로 처리하면 간에서 인간 Z-AAT 중합체 부하를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 입증한다(도 8).
추가로, SERPINA1-1459 처리는 49주령에 시작하여 처리된 PiZ 마우스의 간에서 높은 인간 Z-AAT 중합체 부하를 효과적으로 감소시켰다(도 9).
PiZ 마우스 간세포의 소포체(ER)에서 돌연변이체 인간 Z-AAT의 조직병리학적 특징은 디아스타제 저항성(PAS-D)인 과요오드산 쉬프(Periodic Acid Schiff)로 염색되는 세포내 소구체이다(Rudnick 등, 등, HEPATOLOGY, Vol. 39, No. 4, 2004; Perlmutter 등, PEDIATRIC RESEARCH Vol. 60, No. 2, 2006). 5주령에 시작한 PiZ 마우스를 SERPINA1-1459로 처리하면 간 소구체 형성의 효과적인 억제를 초래하였다(도 10).
PiZ 마우스에서 돌연변이체 인간 Z-AAT 단백질의 세포 내 체류는 세포 증식을 증가시키는 재생 자극과 관련이 있다 (Rudnick 등, 등, HEPATOLOGY, Vol. 39, No. 4, 2004). 5주령에 시작한 SERPINA1-1459로 처리된 PiZ 마우스는 대조군 처리된 마우스와 비교하여 증식에 대한 세포 마커인 Ki-67에 대한 면역조직화학에 의해 평가된 세포 증식의 효과적인 감소를 나타냈다(도 11).
PiZ 마우스 간의 만성 손상은 연령에 따라 진행성 간 섬유증과 관련이 있는 것으로 나타났다(Brunt 등, J PEDIATR GASTROENTEROL NUTR. 2010 November; 51(5): 626-630). 27주령 PiZ 마우스 간의 시리우스 레드 염색은 SERPINA1-1459로 처리한 마우스의 간에서 현저하게 감소된 간섬유화의 발달을 나타낸다(도 12).
PiZ 마우스에서 SERPINA1 mRNA의 지속적인 녹다운은 잘 견뎌졌다. 5, 12 또는 49주령에 시작되는 SERPINA1-1459로 처리된 PiZ 마우스는 ALT, AST 또는 알칼리성 포스파타제를 포함하는 중요한 혈청 생화학 파라미터의 상승된 수준을 유발하지 않았다(도 13).
전체적으로, 이들 결과는 PiZ 마우스에서 SERPINA1 mRNA의 지속된 녹다운이 트랜스아미나제 활성을 포함한 혈청 생화학 값의 이상 없이 잘 견뎌졌음을 입증한다.
실시예 5: SERPINA1-1459로 처리된 PiZ 마우스에서
SERPINA1
mRNA 및 인간 Z-AAT 단백질의 용량 의존적 녹다운은 간 소구체의 감소와 상관관계가 있다
본 연구의 목적은 돌연변이체 인간 Z-AAT 단백질을 발현하는 PiZ 마우스에서 간 소구체를 적어도 50% 감소시키는 데 필요한 SERPINA1-1459에 의한 SERPINA1 mRNA 녹다운의 수준을 평가하는 것이었다. 구체적으로, 마우스 (5주령)에게 4주마다 한 번씩 0, 0.3, 1, 또는 3 mg/kg SERPINA1-1459의 4 SC 투여를 제공하였다.
SERPINA1 mRNA 뿐만 아니라 순환 및 간 인간 Z-AAT 단백질 수준은 SERPINA1-1459의 최종 투여 1주일 후에 용량-의존적 방식으로 유의하게 감소되었다 (도 14). SERPINA1-1459의 최종 투여 1주일 후에 간 소구체에서 유사한 용량-의존적 감소가 관찰되었다(도 14). 1 또는 3 mg/kg SERPINA1-1459의 4회 투여 후 간 소구체의 적어도 50% 감소가 관찰되었다.
인간에서 볼 수 있는 바와 같이, PiZ 마우스 간세포의 ER에서 돌연변이체 인간 Z-AAT의 조직병리학적 특징(signature)은 디아스타제 저항성(PAS-D)인 과요오드산 쉬프(Periodic Acid Schiff)로 염색되는 세포내 소구체이다(Rudnick 등, 2004, Analyses of hepatocellular proliferation in a mouse model of alpha-1-antitrypsin deficiency, HEPATOLOGY, 39: 1048-55.; Perlmutter 등, 2006, Pathogenesis of chronic liver injury and hepatocellular carcinoma in alpha-1-antitrypsin deficiency, PEDIATR RES 60(2):233-8). 생후 5주령에 시작한 PiZ 마우스를 SERPINA1-1459로 처리하면 간 소구체 형성의 용량-의존적 억제가 일어났다(도 15).
실시예 6: 시노몰구스 마카크에 단일 볼루스 피하(SC) 주사 후 SERPINA1-1459의 약동학적 효능, 용량 반응 및 작용 지속 기간의 평가.
이 연구의 주요 목적은 시노몰구스 마카크에 단일 볼루스 피하(SC) 주사 후 SERPINA1-1459의 약동학적 효능, 용량 반응 및 기간을 결정하는 것이었다. 이차 목적은 표준 혈액학 및 임상 혈액 화학(CBC) 매개변수, 체중 및 적절한 시점에서의 잠재적인 주사 부위 반응을 모니터링하여 내약성의 예비 평가를 얻는 것이었다.
암컷 시노몰구스 마카크는 연구 절차를 수행하기 전 적어도 일주일 동안 순응된 찰스 리버 연구소(Charles River Laboratories, MA)에서 수용되었다. PMI 영양 국제 인증 영장류 식단은 지정된 절차 동안을 제외하고 매일 2회 동물에게 제공되었다. 물은 모든 동물들이 자유롭게 이용할 수 있었다. 동물들은 사회적으로 거주했고 환경 부양을 제공했다. 프로토콜-지정 최종 연구(169일)에서, 모든 원숭이들은 건강하였고 그들의 테스트 서식지로 돌아갔다.
간단히 말해서, 2세에서 4세 사이의 비-자연적(non-naive) 암컷 시노몰구스 마카크의 3개의 군(n=5, 각 군)은 1 mg/kg(군 1), 3 mg/kg(군 2) 또는 10 mg/kg(군 3)의 SERPINA1-1459의 단일 SC 볼루스 주사를 받았다. 주사 부위를 투여 후 3일 동안 염증에 대해 면밀히 모니터링하였다. 임상 관찰을 매일 기록했다.
혈액 샘플은 24주 연구 내내 매주 수집하고 혈청 및 혈장으로 가공하였다. 구체적으로, 모든 동물은 혈액 수집 절차 전에 밤새 공복이었다. 임상 혈액 화학(CBC) 및 혈액학 매개변수는 투여 전 및 48시간 샘플을 사용하여 Charles River에서 수행하였다. 혈청 및 혈장은 2mL 혈액 샘플로부터 Charles River에서 가공하고 다수의 저장 바이알로 분할하고 액체 질소에서 급속 냉동하였다. CBC 및 혈액학에 사용된 샘플을 제외한 모든 샘플은 드라이아이스에 담아 Dicerna Pharmaceuticals에 배송하였다. 혈청 A1AT 단백질 농도는 Dicerna Pharmaceuticals에서 ELISA로 정량화하였다. 다른 모든 샘플은 -80℃에서 보관하였다.
대조군 매개변수는 -5, -3일차의 투여 전 측정 및 1일차의 주사 직전 측정에서 가져왔다. 간에서 SERPINA1-1459 활성에 대한 바이오마커인 혈청 알파-1 항트립신(A1AT) 농도는 혈청 샘플에서 ELISA로 측정했다.
일일 임상 관찰, 임상 혈액 화학 및 혈액학 매개변수는 현저하지 않았고 투여 전 대조군과 다르지 않았다(데이터는 나타나지 않음). 체중은 이 연령의 암컷 원숭이에 대한 정상적인 과거 성장 범위와 일치하는 방식으로 연구 전반에 걸쳐 증가했으며 임의의 시점에서 군 간에 다르지 않았다(도 16; 왼쪽 패널은 평균 백분율 변화 ± SEM을 보여주고 오른쪽 패널은 개별 동물 값을 보여준다). 주사 부위에서 임의의 용량 수준에서 임의의 동물에서 염증 반응 또는 기타 반응이 관찰되지 않았다. 종합하면, 이러한 결과는 최대 10 mg/kg SERPINA1-1459의 단일 SC 투여가 비인간 영장류에서 잘 견뎌졌음을 시사한다.
인간 알파 1 항트립신 검출을 위한 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트 (Abcam, Cambridge, MA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 25 μL의 혈청에서 A1AT 단백질 농도를 측정했다. 샘플을 ELISA로 이중으로 분석했다. SERPINA1-1459 처리 후 혈청 A1AT 단백질 농도의 감소는 투여 전 A1AT 혈청 단백질 농도의 감소 백분율로 계산되었다.
SERPINA1-1459의 투여는 단일 SC 투여 후 4주 후에 최대 감소와 함께, 모든 군에서 순환 A1AT 단백질 농도의 활발하고 용량-관련 감소를 초래하였다. 이때, 기준선 대비 순환 A1AT 단백질 농도의 최대 감소는 1 mg/kg 군에서 2.2배(55% 감소), 3 mg/kg 군에서 4.8배(79% 감소), 10 mg/kg 군(P < 0.0001, 모든 군)에서 6.7배(84% 감소)였다(도 17a). 4주차에 관찰된 최대 약동학적 효과는 1 mg/kg 군에서 7주 및 3 mg/kg 및 10 mg/kg 투여군에서 8주 동안 유지되었고, 그 후 A1AT의 순환 농도는 기준선 농도로 서서히 복귀하였다. 1 mg/kg-투여군에서, A1AT 단백질 농도는 투여 후 대략 18주 동안 기준선으로 복귀하였다. 3 mg/kg 및 10 mg/kg 투여군에서, 기준선 농도는 연구 종료시 각각 기준선 혈청 A1AT 농도의 86% 및 62%에 도달하는 연구 마지막 날(24주) 이전에 도달하지 않았다. 70-80%의 순환 A1AT가 간세포에 의해 생산된다는 것이 보고되었고 (Janciauskiene 등 Respiratory Medicine (2011) 105, 1129e1139), 따라서 10 mg/kg 군에서 달성된 84% 감소가 달성 가능한 최대 효과에 가까웠을 가능성이 있다(도 17a 및 17b). 이는 약동학적 반응이 3 mg/kg 및 10 mg/kg 투여군에 대해 비례하는 투여 미만이었다는 관찰에 의해 추가로 뒷받침된다. 그러나, 1 mg/kg 투여군에 대한 결과는 SERPINA1-1459의 반-최대 효능 용량(ED50)이 비-인간 영장류에서 대략 1 mg/kg임을 시사한다.
토론 및 결론
일일 임상 관찰, CBC 및 혈액학은 현저하지 않았고 투여 전 대조군과 다르지 않았다. 체중은 연구 전반에 걸쳐 각 투여 군에서 증가했으며 임의의 시점에서 군 간에 다르지 않았다. 주사 후 72시간까지 임의의 용량 수준에서 임의의 동물에서 주사 부위 반응이 관찰되지 않았다. 종합하면, 이러한 관찰은 최대 10 mg/kg SERPINA1-1459의 단일 SC 투여가 비인간 영장류에서 잘 견뎌졌음을 시사한다. 또한, SERPINA1-1459의 투여는 모든 투여군의 원숭이에서 순환 A1AT 단백질 농도의 활발하고 용량-관련 감소를 초래하였다.
PiZZ 환자의 일부에서 관찰되는 간-병리학에 대한 효과적인 치료는 높은 미충족 의학적 필요성을 나타낸다(Lomas, DA. New therapeutic targets for alpha-1 antitrypsin deficiency. Chronic obstructive pulmonary diseases (Miami, Fla.). 2018;5(4): 233-43). SERPINA1-1459는 SERPINA1 mRNA 및 A1AT 단백질 수준을 선택적으로 감소시킴으로써 간 Z-AAT 단백질 축적을 감소시키도록 설계된 siRNA 치료제이다. 간세포에 의해 생산된 A1AT는 순환계로 분비되므로, A1AT 혈청 농도는 직접 간 샘플링이 없을 때 SERPINA1-1459의 효능을 평가하는데 유용한 바이오마커를 나타낸다.
A1ATD 환자의 간 질환의 진행은 간세포에서 Z-AAT의 점진적인 축적에 연결된다 (Teckman, J.H., 2013 COPD. 2013 Mar;10 Suppl 1:35-43). SERPINA1-1459는 PiZZ 환자에서 간 질환의 진행을 늦추거나 중단거나 역전시킬 수 있는 유의미한 치료적 개입을 생산할 수 있는 잠재력을 갖는다. 따라서, SERPINA1-1459는 간 질환을 갖는 PiZZ 환자를 위한 생명을 구하는 치료적 개입을 나타낼 수 있다.
실시예 7: SERPINA1-1459로 처리된 시노몰구스 마카크에서 A1AT 단백질의
용량-의존적 녹다운
연구의 이 단계의 목적은, 이 반복-용량 독성 연구에서 30, 100 또는 300 ㎎/㎏의 4회 SC 투여가 주어진 시노몰구스 원숭이에서 87일차 및 141일차 순환 A1AT 단백질 농도의 감소에 의해 평가되는 바와 같은 SERPINA1-1459의 약동학적 효과를 결정하는 것이었다. 젊은 성인(대략 42개월령) 및 어린(대략 15개월령) 원숭이에게 연구 1일차에 SERPINA1-1459를 투여하고 28일마다 다시 투여했다.
인간 알파 1 항트립신 (SERPINA1) ELISA 키트 (Abcam, Cambridge, MA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 25μL 혈청 샘플 중의 A1AT 단백질 농도를 이중으로 측정하였다. SERPINA1-1459 처리군의 A1AT 단백질 농도의 감소는 같은 날 수컷 및 암컷에 대해 독립적으로 연령이 일치하는 (멸균 식염수-처리된) 대조군의 평균 발현 수준에 대한 발현 백분율로서 계산하였으며, 여기서 대조군 내의 A1AT 단백질 농도는 100%로 설정되었다.
평균의 평균 ± 표준 오차 그래프를 생성하고 GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA)을 사용하여 데이터를 분석하였다. SERPINA1-1459-처리군의 A1AT 단백질 농도를 동일한 시점의 연령이 일치하는 대조군의 농도와 비교하기 위해 언페어드 t 테스트를 수행하였다. 통계적 유의성은 원숭이가 3마리 이상인 군에서만 계산하였다.
SERPINA1-1459의 A1AT 단백질 농도에 대한 억제 효과는 도 18에 나타내었다. 87일차에 수집한 혈액 내의 순환 A1AT 단백질 농도의 약동학적 분석은 각각 57.3% 내지 83.8%의 젊은 성인 및 어린 원숭이에서 감소를 나타낸다. 무치료 기간 종료 시, 어린 원숭이에서 순환 A1AT 단백질 농도의 57.8% 내지 75.8%의 감소가 지속되었다. 순환 A1AT 단백질 농도의 감소에 있어서 어떠한 유의미한 차이가 수컷 및 암컷 어린 원숭이 사이에서 관찰되지 않았고; 그러나, 순환 A1AT 단백질 농도는 수컷 어린-성체 원숭이에서보다 암컷에서 더 큰 정도로 감소되었다. SERPINA1-1459 처리는 수컷 어린-성체 원숭이에 비해 수컷 어린 원숭이에서 순환 A1AT 단백질 농도의 더 큰 감소를 초래하였다. 용량-반응이 분명하지 않았다.
3개월의 투여 기간의 말기(87일차)에 수집된 혈액 내 순환 A1AT 단백질 농도의 약동학적 분석은 어린-성체 및 유아 원숭이에서 대략 70% 내지 80% 감소를 나타낸다. 처리가 없는 기간의 종료 시(141일)에, 어린 원숭이에서 순환 A1AT 단백질 농도의 대략 65% 감소가 지속되었다. 약동학적 효과에서 유의미한 용량, 성별 또는 연령-관련 차이는 뚜렷하지 않았다.
실시예 8: 장기 SERPINA1-1459 치료의 용량-반응은
SERPINA1
mRNA 녹다운 및 치료 내약성을 입증한다
이 연구의 목적은 시노몰구스 원숭이에서 SERPINA1-1459의 9개월 반복-투여(4주마다, 10회 투여) 피하 주사의 약동학적 효과를 결정하는 것이었다.
수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이 군에 대조군(식염수) 또는 20, 60 또는 180mg/kg SERPINA1-1459를 피하(SC) 주사했다. 각 군은 255일차에 부검을 받은 주요 연구 동물 및 253일차에 투여 후 치료가 중단된 회복 동물(R)을 모두 포함했다. 이 동물을 309일차(투여 후 8주)에 부검했다. SERPINA1-1459는 총 10회 투여로 9개월에 걸쳐 28일마다 피하 투여되었다. 매월 SC 투여는 각 투여 세션 2일 전에 수집된 체중을 기반으로 했다.
수컷 및 암컷 간 샘플은 검증되지 않은 방법을 사용한 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 사용하여 SERPINA1 mRNA 발현을 측정함으로써 모든 투여군에서 주요 연구 및 회복 부검에서 분석하였다.
SERPINA1-1459의 약동학(PD)을 모든 처리군에서 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이로부터 간에서 분석하였다(도 19). SERPINA1 mRNA 발현은 모든 SERPINA1-1459-투여군의 말기(주요 연구) 및 회복 시점 둘 모두에서 대조군에서 발견되는 수준의 5% 미만으로 감소되었다. 대조군 동물의 가변성(18 - 188% 범위)에도 불구하고, SERPINA1-1459의 강력한 활성은 20 mg/㎏을 투여한 회복 동물을 제외하고, 말기 및 회복 시점에서 시노몰구스 원숭이에서 SERPINA1-1459의 모든 용량 수준에서 SERPINA1 mRNA 발현의 유의한 감소에 의해 입증되었다. 수컷 원숭이와 암컷 원숭이 사이에는 발현 또는 활성에서 뚜렷한 차이가 없었다. 주요 및 회수 시점 사이에 SERPINA1 mRNA 발현에서 유의한 차이는 없었으며, 이는 mRNA 발현에서 회복이 없음을 시사한다. 9개월(10회 투여)에 걸친 SERPINA1-1459의 피하 반복-투여 투여(repeat-dose administration)는 최대 180 mg/kg의 수준에서 시노몰구스 원숭이에서 잘 견뎌졌다.
추가 인용
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oligonucleotide"
<400> 78
ugugguacaa cuuuuuaaca gg 22
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<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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oligonucleotide"
<400> 79
uuaaaaaguu guaccacuca gcagccgaaa ggcugc 36
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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oligonucleotide"
<400> 80
ugagugguac aacuuuuuaa gg 22
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<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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aaaaguugua ccacucagaa gcagccgaaa ggcugc 36
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uucugagugg uacaacuuuu gg 22
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guuuaacauc cagcacugua gcagccgaaa ggcugc 36
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uacagugcug gauguuaaac gg 22
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uuuaacaucc agcacuguaa gcagccgaaa ggcugc 36
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cuguccauua cuggaaccua gcagccgaaa ggcugc 36
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uagacauggg uauggccucu gg 22
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uuuaagaaga caaaggguuu gg 22
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aaacccuuug ucuucuuaaa gcagccgaaa ggcugc 36
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<212> RNA
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uuuaagaaga caaaggguuu gg 22
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<211> 36
<212> RNA
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aaacccuuug ucuucuuaaa gcagccgaaa ggcugc 36
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aaacccuuug ucuucuuaaa gcagccgaaa ggcugc 36
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uuuaagaaga caaaggguuu gg 22
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<212> RNA
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aaugccaccg ccaucuucua gccgaaaggc 30
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<212> RNA
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uagaagaugg cgguggcauu gg 22
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uagacauggg uauggccucu gg 22
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<222> (1)..(19)
<223> a, c, u, g, unknown or other
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnna gcagccgaaa ggcugc 36
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<211> 36
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<222> (1)..(20)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 113
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gcagccgaaa ggcugc 36
<210> 114
<211> 30
<212> RNA
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnna gccgaaaggc 30
<210> 115
<211> 30
<212> RNA
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<222> (1)..(19)
<223> a, c, u, g, unknown or other
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnna gccgaaaggc 30
<210> 116
<211> 36
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> a, c, u, g, unknown or other
<400> 116
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gcagccgaaa ggcugc 36
Claims (56)
- α-1 항트립신(A1AT)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드로서, 15-30개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 및 15-50개 뉴클레오티드의 센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대한 상보성 영역을 포함하고, 임의로 상기 센스 가닥은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드:
(a) 서열번호 1 및 2, 각각;
(b) 서열번호 3 및 4, 각각;
(c) 서열번호 5 및 6, 각각;
(d) 서열번호 7 및 8, 각각;
(e) 서열번호 9 및 10, 각각;
(f) 서열번호 11 및 12, 각각;
(g) 서열번호 13 및 14, 각각;
(h) 서열번호 15 및 16, 각각;
(i) 서열번호 17 및 18, 각각;
(j) 서열번호 19 및 20, 각각;
(k) 서열번호 21 및 22, 각각;
(l) 서열번호 23 및 24, 각각;
(m) 서열번호 25 및 26, 각각;
(n) 서열번호 27 및 28, 각각;
(o) 서열번호 29 및 30, 각각; 및
(p) 서열번호 31 및 32, 각각. - α-1 항트립신(A1AT)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드로서, 15-30개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 및 15-50개 뉴클레오티드의 센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 26에 제시된 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고 상기 센스 가닥은 서열번호 25에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
- 제3항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 이중 가닥 영역을 형성하고, 상기 안티센스 가닥이 길이가 19 내지 30개 뉴클레오티드인, 올리고뉴클레오티드.
- 제3항에 있어서, 상기 안티센스 가닥이 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열과 2개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
- 제6항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 변형된, 올리고뉴클레오티드.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드가 2'-변형을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
- 제8항에 있어서, 상기 2'-변형이 2'-플루오로 변형, 2'-O-메틸 변형, 또는 둘 모두로부터 선택된, 올리고뉴클레오티드.
- 1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥이 22개의 뉴클레오티드를 포함하고 센스 가닥이 36개의 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 안티센스 및 센스 가닥이 5' 에서 3'로 번호가 매겨지고, 센스 가닥의 1, 2, 4, 6, 7, 12, 14, 16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 6, 8, 11-13, 15, 17, 또는 19-22번 위치 중 하나 이상이 2'-O-메틸로 변형되는, 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥이 22개의 뉴클레오티드를 포함하고 센스 가닥이 36개의 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥이 5' 에서 3'로 번호가 매겨지고, 센스 가닥의 3, 5, 8-11, 13, 15, 또는 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2-5, 7, 9, 10, 14, 16, 또는 18번 위치 중 하나 이상이 2'-플루오로로 변형되는, 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥이 22개의 뉴클레오티드를 포함하고 센스 가닥이 36개의 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 안티센스 및 센스 가닥이 5' 에서 3'로 번호가 매겨지고, 센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8-11, 13, 15, 17, 18, 또는 20-22번 위치 중 하나 이상이 2'-O-메틸로 변형되고; 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13 및 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 12, 14, 16 및 19번 위치 중 하나 이상이 2'-플루오로로 변형되는, 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥이 22개의 뉴클레오티드를 포함하고 센스 가닥이 36개의 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 안티센스 및 센스 가닥이 5' 내지 3'로 번호가 매겨지고, 센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8, 9, 11-13, 15, 18, 또는 20-22번 위치 중 하나 이상이 2'-O-메틸로 변형되고; 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13, 또는 17번 위치 및/또는 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 10, 14, 16, 17 또는 19번 위치 중 하나 이상이 2'-플루오로로 변형되는, 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
- 제14항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 연결인, 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 1 및 2번 위치, 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치, 안티센스 가닥의 2 및 3번 위치, 안티센스 가닥의 3 및 4번 위치, 안티센스 가닥의 20 및 21번 위치, 및 안티센스 가닥의 21 및 22번 위치 각각 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖는, 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 제1 위치의 우리딘은 포스페이트 유사체를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
- 제17항에 있어서, 안티센스 가닥의 1번 위치에 하기 구조를 포함하는, 올리고뉴클레오티드:
. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥은 S1-L-S2로 제시된 스템-루프를 포함하고, S1은 S2에 상보적이고, L은 S1과 S2 사이에 3-5개 뉴클레오티드 길이의 루프를 형성하고, 임의로 L은 테트라루프인, 올리고뉴클레오티드.
- 제19항에 있어서, 상기 테트라루프는 서열 5'-GAAA'3'를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 모이어티에 부착되는, 올리고뉴클레오티드.
- 제20항에 있어서, 센스 가닥의 -GAAA- 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드는 1가 GalNAc 모이어티에 접합되는, 올리고뉴클레오티드.
- 제22항 또는 22항에 있어서, 상기 -GAAA- 서열은 하기 구조를 포함하는, 올리고뉴클레오티드:
식 중:
L은 결합, 클릭 화학 핸들, 또는 치환 및 비치환된 알킬렌, 치환 및 비치환된 알케닐렌, 치환 및 비치환된 알키닐렌, 치환 및 비치환된 헤테로알킬렌, 치환 및 비치환 헤테로알케닐렌, 치환 및 비치환된 헤테로알키닐렌, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 20개 길이의 포함하는(inclusive), 연속적, 공유 결합된 원자의 링커를 나타내고; X는 O, S, 또는 N임. - 제23항에 있어서, L은 아세탈 링커인, 올리고뉴클레오티드.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, X는 O인, 올리고뉴클레오티드.
- 제20항 및 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 -GAAA- 서열은 하기의 구조를 포함하는, 올리고뉴클레오티드:
. - α-1 항트립신(A1AT)의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드로서, 15-30개 뉴클레오티드의 안티센스 가닥 및 15-50개 뉴클레오티드의 센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 , 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102 및 104에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대한 상보성 영역을 포함하고, 임의로 상기 센스 가닥은 서열번호 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 및 103에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
- 제27항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드:
(a) 서열번호 33 및 34, 각각;
(b) 서열번호 35 및 36, 각각;
(c) 서열번호 37 및 38, 각각;
(d) 서열번호 39 및 40, 각각;
(e) 서열번호 41 및 42, 각각;
(f) 서열번호 43 및 44, 각각;
(g) 서열번호 45 및 46, 각각;
(h) 서열번호 47 및 48, 각각;
(i) 서열번호 49 및 50, 각각;
(j) 서열번호 51 및 52, 각각;
(k) 서열번호 53 및 54, 각각;
(l) 서열번호 55 및 56, 각각;
(m) 서열번호 57 및 58, 각각;
(n) 서열번호 59 및 60, 각각;
(o) 서열번호 61 및 62, 각각;
(p) 서열번호 63 및 64, 각각;
(q) 서열번호 65 및 66, 각각;
(r) 서열번호 67 및 68, 각각;
(s) 서열번호 69 및 70, 각각;
(t) 서열번호 71 및 72, 각각;
(u) 서열번호 73 및 74, 각각;
(v) 서열번호 75 및 76, 각각;
(w) 서열번호 77 및 78, 각각;
(x) 서열번호 79 및 80, 각각;
(y) 서열번호 81 및 82, 각각;
(z) 서열번호 83 및 84, 각각;
(aa) 서열번호 85 및 86, 각각;
(bb) 서열번호 87 및 88, 각각;
(cc) 서열번호 89 및 90, 각각;
(dd) 서열번호 91 및 92, 각각;
(ee) 서열번호 93 및 94, 각각;
(ff) 서열번호 95 및 96, 각각;
(gg) 서열번호 97 및 98, 각각;
(hh) 서열번호 99 및 100, 각각;
(ii) 서열번호 101 및 102, 각각; 및,
(jj) 서열번호 103 및 104, 각각. - A1AT의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드로서, 서열번호 26에 제시된 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 서열번호 105에 제시된 서열을 갖는 센스 가닥을 포함하고,
센스 가닥의 1, 2, 4-7, 11, 14-16, 18-26, 또는 31-36번 위치 및 안티센스 가닥의 1, 4, 6, 8-11, 13, 15, 17, 18, 또는 20-22번 위치 모두는 2'-O-메틸로 변형되고, 센스 가닥의 3, 8-10, 12, 13 및 17번 위치 및 안티센스 가닥의 2, 3, 5, 7, 12, 14, 16 및 19번 위치 모두는 2'-플루오로로 변형되고;
상기 올리고뉴클레오티드는 센스 가닥의 1 및 2번 위치, 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치, 안티센스 가닥의 2 및 3번 위치, 안티센스 가닥의 3 및 4번 위치, 안티센스 가닥의 20 및 21번 위치, 및 안티센스 가닥의 21 및 22번 위치 각각 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖고;
상기 올리고뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 1번 위치에 하기 구조를 포함하고:
식 중 센스 가닥의 -GAAA- 서열의 뉴클레오티드 각각은 1가 GalNac 모이어티에 접합되고, 상기 -GAAA- 서열은 하기의 구조를 포함하는, 올리고뉴클레오티드:
. - A1AT의 발현을 감소시키기 위한 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 103의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 서열번호 104의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 A1AT RNA 전사체에 상보성 영역을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 하기의 구조를 갖는 접합체의 형태인, 올리고뉴클레오티드:
. - 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
- 제31항에 있어서, Na+ 반대이온을 추가로 포함하는, 조성물.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 올레고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
- 알파 1 항트립신 (A1AT)의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 상기 dsRNA는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열과 4개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 길이가 19 내지 35개의 뉴클레오티드인, 이중 가닥 리보핵산 제제.
- 제34항에 있어서, 이중 가닥 영역의 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고, 상기 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오티드 및 2'-플루오로-변형된 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 dsRNA는 하나 이상의 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 모이어티에 부착되는, dsRNA 제제.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 길이가 19 내지 30개의 뉴클레오티드이고, 상기 센스 가닥은 길이가 32 내지 80개의 뉴클레오티드이고 테트라루프를 포함하는, dsRNA 제제.
- 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥이 서열번호 25에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
- 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 104에 제시된 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥은 서열번호 103에 제시된 서열을 포함하는, dsRNA 제제.
- 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제를 포함하는 조성물.
- 제39항에 있어서, Na+ 반대이온을 추가로 포함하는, 조성물.
- 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 조성물.
- 올리고뉴클레오티드를 대상체로 전달하는 방법으로서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조성물, 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드, 조성물 또는 dsRNA 제제가 상기 대상체에서 간 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 전달되며, 상기 간 질환 또는 장애는 만성 간 질환, 간 염증, 간경변, 간 섬유증 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
- 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드, 조성물 또는 dsRNA 제제가 대상체에 정맥 내 또는 피하로 투여되는, 방법.
- 포유동물에서 표적 α-1 항트립신 mRNA의 발현을 감소시키는 방법으로서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조성물, 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 포유동물에서 표적 α-1 항트립신 mRNA의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 지질 나노입자(LNP)로 제형화되는, 방법.
- 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 dsRNA 제제가 하루에 상기 포유동물의 킬로그램 당 1 마이크로그램 내지 5밀리그램, 킬로그램 당 100 마이크로그램 내지 0.5 밀리그램, 킬로그램 당 0.001 내지 0.25 밀리그램, 킬로그램 당 0.01 내지 20 마이크로그램, 킬로그램 당 0.01 내지 10 마이크로그램, 킬로그램 당 0.10 내지 5 마이크로그램, 및 킬로그램 당 0.1 내지 2.5 마이크로그램으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여량으로 투여되는, 방법.
- 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, α-1 항트립신 mRNA 수준이 상기 포유동물에 올리고뉴클레오티드, 조성물 또는 dsRNA 제제가 투여된 후 적어도 3일 후에 상기 포유동물의 조직에서 적어도 70%의 양(%로 표현됨)만큼 감소되는, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 조직이 간 조직인, 방법.
- 제42항 내지 제44항 및 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계가 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 주입, 피하 주사, 경피, 에어로졸, 직장, 질, 국소, 경구, 및 흡입 전달로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로를 포함하는, 방법.
- 동물에서 간 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조성물, 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에서 상기 간 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기에 충분한 양으로 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 간 질환 또는 장애는 만성 간 질환, 간 염증, 간경변, COPD, 폐기종 간 섬유증 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 동물은 인간인, 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조성물, 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물, 및 α-1 항트립신 발현 감소를 필요로 하는 대상체에서 α-1 항트립신 발현을 감소시키기 위한 지침을 포함하는 키트.
- α-1 항트립신 발현 감소를 필요로 하는 대상체에서 α-1 항트립신 발현을 감소시키기 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드, 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조성물, 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제, 또는 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
- 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 대상체가 간 질환 또는 장애를 갖는, 키트 또는 용도.
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