JP4095895B2 - Ｒｎａ干渉を媒介する短鎖ｒｎａ分子 - Google Patents

Description

本発明は、ＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化などの標的特異的な核酸改変を媒介するのに必要な二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの配列および構造的特徴に関する。

「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡインターフェアランス）」（ＲＮＡｉ）は、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）にｄｓＲＮＡを注入すると、送達したｄｓＲＮＡと配列が高度に相同的な遺伝子の特異的サイレンシングが起こるという発見後、造り出された用語である（Fireら、1998）。その後、ＲＮＡｉは、昆虫、カエル（Oelgeschlagerら、2000）、ならびに、マウスを含むその他の動物（Svobodaら、2000；WiannyおよびZernicka-Goetz, 2000）でも観察されており、ヒトにも存在すると考えられる。ＲＮＡｉは、植物における共抑制および真菌における抑制の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）機構と密接に関連しており（Catalanottoら、2000；CogoniおよびMacino, 1999；Dalmayら、2000；KettingおよびPlasterk, 2000；Mourrainら、2000；Smardonら、2000）、また、ＲＮＡｉ機構の構成要素には、共抑制による転写後サイレンシングに必要なものもある（Catalanottoら、2000；Dernburgら、2000；KettingおよびPlasterk, 2000）。これについては、近年再考されている（Bass, 2000；BosherおよびLabouesse, 2000；Fire, 1999；PlasterkおよびKetting, 2000；Sharp, 1999；SijenおよびKooter, 2000）。また、Plant Molecular Biology、第４３巻、２／３号（2000）全体も参照されたい。

植物では、ＰＴＧＳに加えて、導入されたトランスジーンも、シトシンのＲＮＡ指令ＤＮＡメチル化を介した転写遺伝子サイレンシングを誘導することができる（Wassenegger, 2000の文献を参照）。植物では、３０ｂｐという短いゲノム標的がＲＮＡ指令方式でメチル化される（Pelissier, 2000）。ＤＮＡメチル化は哺乳動物にも存在する。

ＲＮＡｉおよび共抑制の天然の機能は、活性となったとき、宿主細胞に異常ＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを産生するレトロトランスポゾンやウイルスなどの可動性遺伝的エレメントによる侵入に対してゲノムを保護することであると考えられる（Jensenら、1999；Kettingら、1999；Ratcliffら、1999；Tabaraら、1999）。特異的ｍＲＮＡ分解により、トランスポゾンおよびウイルスの複製が阻止されるが、ＰＴＧＳを抑制するタンパク質を発現させることにより、この過程を克服または阻止することができる（Lucyら、2000；Voinnetら、2000）。

ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡとの同一性の領域内でしか相同性ＲＮＡの特異的分解を誘発しない（Zamoreら、2000）。ｄｓＲＮＡは２１〜２３塩基のＲＮＡ断片にプロセシングされ、標的ＲＮＡ切断部位は、通常、２１〜２３塩基の間隔である。従って、２１〜２３塩基の断片が、標的認識のためのガイド（guide）ＲＮＡであると考えられてきた（Zamoreら、2000）。これらの短いＲＮＡは、細胞溶解の前にｄｓＲＮＡでトランスフェクトしたキイロショウジョウバエシュナイダー２細胞から調製した抽出物でも検出されている（Hammondら、2000）が、配列特異的ヌクレアーゼ活性を呈示する画分も、残留ｄｓＲＮＡの大きな画分を含んでいた。ｍＲＮＡ切断の指示における２１〜２３塩基断片の役割は、プロセシングされたｄｓＲＮＡから単離された２１〜２３塩基断片が、特異的ｍＲＮＡ分解をある程度まで媒介することができるという研究結果によってさらに支持される（Zamoreら、2000）。類似サイズのＲＮＡ分子は、ＰＴＧＳを示す植物組織にも蓄積する（HamiltonおよびBaulcombe, 1999）。

ここで、本発明者は、確立されたショウジョウバエｉｎ ｖｉｔｒｏ系（Tuschlら、1999；Zamoreら、2000）を用いて、ＲＮＡｉの機構をさらに探究した。本発明者は、２１および２２塩基の短いＲＮＡが、３’突出末端と塩基対合すると、配列特異的ｍＲＮＡ分解のガイドＲＮＡとして作用することを証明する。３０ｂｐの短いｄｓＲＮＡは、もはや２１および２２塩基のＲＮＡにプロセシングされることはないため、この系でＲＮＡｉを媒介することはできない。さらに、本発明者は、２１および２２塩基という短鎖の干渉作用を有するＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に対する標的ＲＮＡ切断部位を特定し、ｄｓＲＮＡプロセシングの方向が、生成されるｓｉＲＮＰエンドヌクレアーゼ複合体により、センスまたはアンチセンス標的ＲＮＡが切断されうるか否かを決定する証拠を提供する。ｓｉＲＮＡはまた、転写調節、例えば、ＤＮＡメチル化を指示することによって哺乳動物遺伝子のサイレンシングのための重要なツールにもなりうる。

ヒトin vivo細胞培養系（ＨｅＬａ細胞）でさらに実験したところ、好ましくは１９〜２５塩基長の二本鎖ＲＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を有することがわかった。従って、ショウジョウバエからの結果とは対照的に、２４および２５塩基長の二本鎖ＲＮＡ分子もＲＮＡｉに有効である。

本発明の目的は、標的特異的ＲＮＡ干渉またはＤＮＡメチル化のような他の標的特異的な核酸改変を媒介することができる新規の物質を提供することであり、この物質は、従来の技術による物質と比べて、効力および安全性が改善されている。

上記課題は、各ＲＮＡ鎖が１９〜２５、特に１９〜２３塩基長を有し、かつ、該ＲＮＡ分子が、標的特異的な核酸改変、特にＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化を媒介することが可能な、単離された二本鎖ＲＮＡ分子により解決される。少なくとも１本の鎖が、好ましくは１〜５塩基、さらに好ましくは１〜３塩基、最も好ましくは２塩基からなる３’突出部を有する。他方の鎖は、平滑末端であるか、あるいは、６塩基以下の３’突出部を有する。また、ｄｓＲＮＡの両鎖が厳密に２１または２２塩基の場合には、両末端が平滑である（０塩基の突出部）とき、ある程度のＲＮＡ干渉を観察することができる。ＲＮＡ分子は、細胞抽出物中に存在する不純物、例えば、ショウジョウバエ胚を実質的に含まない合成ＲＮＡ分子であることが好ましい。さらに、ＲＮＡ分子は、好ましくは、非標的特異的不純物、特に非標的特異的ＲＮＡ分子、例えば、細胞抽出物中に存在する不純物を実質的に含まない。

さらには、本発明は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞における標的特異的な核酸改変、特にＲＮＡｉを媒介することを目的とした、各ＲＮＡ鎖が１９〜２５塩基長を有する単離された二本鎖ＲＮＡ分子の使用に関する。

驚くべきことに、特に、３’突出末端を有する短い合成二本鎖ＲＮＡ分子が、ＲＮＡｉの配列特異的媒介物質であり、有効な標的ＲＮＡ切断を媒介し、その際、この切断部位は、短鎖ＲＮＡが指示（ガイド；guide）する範囲の領域の中心近くに位置することがわかった。

ＲＮＡ分子の各鎖は、２０〜２２塩基長（または哺乳動物細胞では２０〜２５塩基長）を有するのが好ましく、各鎖の長さは同じでも異なっていてもよい。好ましくは、３’突出部は、１〜３塩基の範囲にあり、この突出部の長さは、鎖によって同じでも異なっていてもよい。ＲＮＡ鎖は、３’ヒドロキシル基を有するのが好ましい。５’末端は、好ましくは、リン酸、二リン酸、三リン酸またはヒドロキシル基を含む。最も有効なｄｓＲＮＡは、１〜３塩基、特に２塩基の３’突出部がｄｓＲＮＡの両端に存在するように、対合した２本の２１塩基の鎖から構成される。

ｓｉＲＮＡにより指示される標的ＲＮＡ切断反応は、高度に配列特異的である。しかし、ｓｉＲＮＡの全ての位置が等しく標的認識に寄与するわけではない。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心におけるミスマッチが最も重要で、標的ＲＮＡ切断をほとんど破壊する。これに対し、一本鎖標的ＲＮＡと相補的なｓｉＲＮＡ鎖の３’ヌクレオチド（例えば、位置２１）は、標的認識の特異性に寄与しない。さらに、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖だけが標的認識を指示するため、標的ＲＮＡと同じ極性を有するｓｉＲＮＡの非対合２塩基３’突出部の配列は、標的ＲＮＡ切断に重要ではない。従って、一本鎖突出塩基（ヌクレオチド）から、アンチセンスｓｉＲＮＡの最後から２番目の位置（例えば、位置２０）だけが標的センスｍＲＮＡと一致する必要がある。

驚くべきことに、本発明の二本鎖ＲＮＡ分子は、血清または細胞培養用の増殖培地において高いｉｎ ｖｉｖｏ安定性を呈示する。安定性をさらに高めるため、３’突出部を分解に対して安定化させる、例えば、これらが、プリンヌクレオチド、特にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドからなるように、選択することができる。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’−デオキシチミジンによるウリジン２塩基の３’突出部の置換は許容されるものであり、ＲＮＡ緩衝の効率に影響しない。また、２’ヒドロキシルの欠如により、組織培地中の突出部のヌクレアーゼ耐性が有意に増強される。

本発明の特に好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチド類似体は、標的特異的活性、例えば、ＲＮＡｉ媒介活性が実質的に影響を受けない位置、例えば、二本鎖ＲＮＡ分子の５’末端および／または３’末端の領域内に配置することができる。特に、修飾ヌクレオチド類似体を組み込むことにより、突出部を安定化させることができる。

好ましいヌクレオチド類似体は、糖または骨格鎖修飾リボヌクレオチドから選択する。しかし、核酸塩基が修飾されたリボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基ではなく、下記のように天然に存在しない核酸塩基を含むリボヌクレオチドも好適であることに留意すべきである：すなわち、天然に存在しない核酸塩基としては、５位置で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンなどである。好ましい糖修飾リボヌクレオチドでは、Ｈ、ＯＲ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２またはＣＮからなる群より選択される基で２’ＯＨ基を置換するが、ここで、Ｒは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。好ましい骨格鎖修飾リボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドを結合するホスホエステル基を、例えば、ホスホチオエート基の修飾基で置換する。前述した修飾を組み合わせてもよいことに留意されたい。

標的特異的ＲＮＡｉおよび／またはＤＮＡメチル化を媒介するためには、本発明の二本鎖ＲＮＡ分子の配列は、核酸標的分子に対し十分な同一性を有していなければならない。好ましくは、この配列は、ＲＮＡ分子の二本鎖部分における所望の標的分子に対して、少なくとも５０％、特に少なくとも７０％の同一性を有する。さらに好ましくは、同一性は、ＲＮＡ分子の二本鎖部分において少なくとも８５％、最も好ましくは１００％である。予め決定した核酸標的分子、例えば、ｍＲＮＡ標的分子に対する二本鎖ＲＮＡ分子の同一性は、下記のように決定することができる：

（式中、Ｉは、同一性のパーセンテージであり、ｎは、ｄｓＲＮＡ分子の二本鎖部分における同一塩基数であり、Ｌは、ｄｓＲＮＡの二本鎖部分と標的との配列重複部分の長さである）。

これ以外に、３’突出部、特に、１〜３塩基長を有する突出部を含む二本鎖ＲＮＡ分子の標的配列に対する同一性も決定することができる。この場合、配列同一性は、標的配列に対して、好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８５％である。例えば、二本鎖の３’突出部からの塩基、５’および／または３’末端からの２以下の塩基は、活性を有意に失うことなく修飾することができる。

本発明の二本鎖ＲＮＡ分子は、下記のステップを含む方法によって作製することができる：
（ａ）各々が１９〜２５塩基長、例えば１９〜２３塩基長を有する２本のＲＮＡ鎖を合成するステップであって、このＲＮＡ鎖は二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができるものであり、好ましくは少なくとも１本が１〜５塩基の３’突出部を有する、上記ステップ、
（ｂ）二本鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下で合成ＲＮＡ鎖を結合させるステップであって、得られる二本鎖ＲＮＡ分子は標的特異的な核酸改変、特にＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化を媒介することが可能なものである、上記ステップ。

ＲＮＡ分子を合成する方法は、当業者には公知である。本発明では、特に、VermaおよびEckstein（1998）に記載されている化学的合成方法を例示する。

一本鎖ＲＮＡは、合成ＤＮＡ鋳型、または組換え細菌から単離したＤＮＡプラスミドからの酵素の転写により作製することができる。典型的には、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなファージＲＮＡポリメラーゼを用いる（MilliganおよびUhlenbeck（1989））。

本発明の別の態様は、以下のステップを含む、細胞または生物における標的特異的な核酸改変、特にＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化を媒介する方法に関する：
（ａ）標的特異的な核酸改変が起こりうる条件下で、上記細胞または生物を本発明の二本鎖ＲＮＡ分子と接触させるステップ、
（ｂ）上記二本鎖ＲＮＡと実質的に対応する配列部分を有する標的核酸に対する、上記二本鎖ＲＮＡにより引き起こされる標的特異的な核酸改変を媒介するステップ。

好ましくは、接触ステップ（ａ）は、標的細胞（例えば細胞培養物中の、例えば単離した標的細胞）、単細胞微生物、または多細胞生物内の標的細胞もしくは複数の標的細胞に、二本鎖ＲＮＡ分子を導入することを含む。さらに好ましくは、導入ステップは、例えば、リポソームキャリアまたは注射によるキャリア媒介の送達を含む。

本発明の方法を用いて、ＲＮＡ干渉を媒介することが可能な細胞または生物における遺伝子の機能を決定する、あるいは、細胞または生物における遺伝子の機能を調節することさえできる。上記細胞は、好ましくは真核細胞または細胞系、例えば植物細胞または動物細胞（哺乳動物細胞など）、例えば胚細胞、多能性幹細胞、腫瘍細胞、例えば奇形癌細胞またはウイルス感染細胞である。上記生物は、好ましくは真核生物、例えば、植物または動物、例えば哺乳動物、特にヒトなどである。

本発明のＲＮＡ分子が指令する対象となる標的遺伝子は、病理的状態と関連するものでもよい。例えば、遺伝子は、病原体関連遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子、腫瘍関連遺伝子または自己免疫疾患関連遺伝子としうる。標的遺伝子はまた、組換え細胞または遺伝的に改変された生物において発現された異種遺伝子であってもよい。このような遺伝子の機能を決定または調節する、特に阻害することにより、農業または医学もしくは獣医学の分野で有用な情報および治療利益が得られると考えられる。

ｄｓＲＮＡは、通常、医薬組成物として投与される。この投与は、核酸を所望の標的細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで導入する公知の方法により実施される。通常用いられる遺伝子伝達法として、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクション、ならびに、ウイルス法が挙げられる（Graham, F.L.およびvan der Eb, A.J.（1973）Virol. 52, 456；McCutchan, J.H.およびPagano, J.S.（1968）J. Natl. Cancer Inst. 41, 351；Chu, G.ら（1987）Nucl. Acids Res. 15, 1311；Fraley, Rら（1980）J. Biol. Chem. 255, 10431；Capechi, M.R.（1980）Cell 22, 479）。細胞へのＤＮＡの導入方法の技術群に、近年、カチオンリポソームの使用が加わった（Felgner, P.L.ら（1987）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413）。市販されているカチオン脂質製剤として、例えば、Ｔｆｘ５０（Promega）またはリポフェクトアミン２０００（Life Technologies）がある。

従って、本発明はまた、有効物質として前述した少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子と、薬学的キャリアを含む医薬組成物に関する。この組成物は、ヒト医学または獣医学における診断および治療用途に用いることができる。

診断または治療用途の場合、組成物は、溶剤（例えば注射液）、クリーム剤、軟膏、錠剤、懸濁剤などの形態とすることができる。組成物は、好適な方法、例えば注射、経口、局所、鼻内、直腸投与などにより、投与することができる。キャリアは、好適な薬学的キャリアであればいずれでもよい。好ましくは、ＲＮＡ分子が標的細胞に侵入する効率を高めることができるキャリアを用いる。このようなキャリアの好適な例として、リポソーム、特にカチオンリポソームが挙げられる。さらに好ましい投与方法は注射である。

ＲＮＡｉ法のさらに好ましい用途は、真核細胞、またはヒト以外の真核生物、好ましくは哺乳動物細胞もしくは生物、最も好ましくはヒト細胞、例えばＨｅＬａもしくは２９３などの細胞系、またはげっ歯類、例えばラットおよびマウスの機能分析である。予め決定した標的遺伝子と相同的である好適な二本鎖ＲＮＡ分子、または好適な二本鎖ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を用いたトランスフェクションにより、標的細胞（例えば、細胞培養物）または標的生物において、特異的ノックアウト表現型を獲得することができる。驚くべきことに、短い二本鎖ＲＮＡ分子が存在しても、宿主細胞または宿主生物からのインターフェロン応答は起こらない。

従って、本発明のさらに別の目的は、少なくとも１つの内因性標的遺伝子の少なくとも部分的に欠失した発現を含む標的遺伝子特異的ノックアウト表現型を示す真核細胞またはヒト以外の真核生物であり、この細胞または生物は、少なくとも１つの内因性標的遺伝子の発現を阻害することが可能な少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子、あるいは、少なくとも１つの内因性標的遺伝子の発現を阻害することが可能な少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを用いてトランスフェクトされている。本発明により、ＲＮＡｉの特異性のために、複数の異なる内因性遺伝子の標的特異的ノックアウトが可能となることに留意すべきである。

細胞またはヒト以外の生物、特にヒト細胞または非ヒト哺乳動物の遺伝子特異的ノックアウト表現型は、分析方法、例えば遺伝子発現プロフィールおよび／またはプロテオームの分析などの、複雑な生理学的過程の機能および／または表現型分析に用いることができる。例えば、培養細胞中で、選択的スプライシング過程の調節因子と推定されるヒト遺伝子のノックアウト表現型を作製することができる。このような遺伝子として、特に、ＳＲスプライシング因子ファミリーのメンバー、例えば、ＡＳＦ／ＳＦ２，ＳＣ３５、ＳＲｐ２０、ＳＲｐ４０またはＳＲｐ５５が挙げられる。さらに、ＣＤ４４のように、予め決定した、選択的にスプライシングされる遺伝子のｍＲＮＡプロフィールに対するＳＲタンパク質の作用を分析することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドを含むチップを用いたハイスループット方法により、分析を実施する。

ＲＮＡｉによるノックアウト技法を用いて、標的細胞または標的生物における内因性標的遺伝子の発現を阻害することができる。内因性標的遺伝子は、標的タンパク質、または標的タンパク質の変異体もしくは突然変異形態をコードする内因性標的核酸、例えば、遺伝子またはｃＤＮＡによって相補することができ、このような核酸は、場合によっては、検出可能なペプチドまたはポリペプチドをコードする別の核酸配列、例えばアフィニティータグ、特に多重アフィニティータグと融合させてもよい。標的遺伝子の変異体または突然変異形態は、これらが、１または複数のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失により、アミノ酸レベルで内因性遺伝子産物とは異なる遺伝子産物をコードする点で、内因性標的遺伝子とは異なる。変異体または突然変異形態は、内因性標的遺伝子と同じ生物活性を有しうる。これに対し、変異体または突然変異形態は、内因性標的遺伝子の生物活性とは異なる生物活性、例えば、部分的に欠失した活性、完全に欠失した活性、増強された活性などを有していてもよい。

相補は、外因性核酸によりコードされるポリペプチド、例えば、標的タンパク質とアフィニティータグを含む融合タンパク質と、標的細胞において内因性遺伝子をノックアウトする二本鎖ＲＮＡ分子を共発現させることにより、達成することができる。この共発現は、外因性核酸によりコードされるポリペプチド、例えば、タグで修飾した標的タンパク質と、二本鎖ＲＮＡ分子の両方を発現する好適な発現ベクターを用いて、あるいは、発現ベクターの組合せを用いて、達成することができる。標的細胞において新たに合成されたタンパク質およびタンパク質複合体は、外因性遺伝子産物、例えば、修飾された融合タンパク質を含むことになる。ＲＮＡｉ二本鎖分子による外因性遺伝子産物発現の抑制を防止するため、外因性核酸をコードする塩基配列において、ＤＮＡレベルで（アミノ酸レベルでの突然変異誘発を含むまたは含まない）、二本鎖ＲＮＡ分子と相同的な配列の部分を改変することができる。あるいは、内因性標的遺伝子を、他の種、例えばマウス由来の対応する塩基配列により相補してもよい。

本発明の細胞または生物の好ましい用途は、遺伝子発現プロフィールおよび／またはプロテオームの分析である。特に好ましい実施形態では、１または複数の標的タンパク質の変異体または突然変異体形態の分析を実施するが、その際、前述したような外因性標的核酸により、この変異体または突然変異体形態を上記細胞または生物に再導入する。内因性遺伝子のノックアウトと、突然変異した、例えば部分的に欠失した外因性標的を用いることによる救済の組合せには、ノックアウト細胞の使用と比べて利点がある。さらに、この方法は、標的タンパク質の機能ドメインを同定するのに特に適している。さらに好ましい実施形態では、少なくとも２つの細胞または生物の、例えば遺伝子発現プロフィールおよび／またはプロテオームおよび／または表現型の特徴を比較する。これらの生物は、下記のものから選択する：
（ｉ）標的遺伝子阻害を含まない対照細胞または対照生物、
（ｉｉ）標的遺伝子阻害を含む細胞または生物、および
（ｉｉｉ）標的遺伝子阻害と、外因性標的核酸による標的遺伝子の相補を含む細胞または生物。

本発明の方法および細胞は、薬理学的物質の同定および／または特定決定、例えば、試験物質のコレクションからの新規な薬理学的物質の同定ならびに／または既知薬理学的物質の作用および／もしくは副作用の機構の特性決定を行なう手法にも適している。

従って、本発明はまた、下記の（ａ）〜（ｃ）を含む、少なくとも１つの標的タンパク質に作用する薬理学的物質の同定および／または特性決定システムに関する：
（ａ）上記標的タンパク質をコードする少なくとも１つの内因性標的遺伝子を発現することができる、真核細胞またはヒト以外の真核生物、
（ｂ）上記少なくとも１つの内因性標的遺伝子の発現を阻害することができる、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子、および
（ｃ）薬理学的特性を同定および／または特性決定しようとする、試験物質または試験物質のコレクション。

さらに、前記システムは、好ましくは、下記の（ｄ）を含む：
（ｄ）上記標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体もしくは突然変異形態をコードする少なくとも１つの外因性標的核酸であって、この外因性標的核酸は、二本鎖ＲＮＡ分子による発現の阻害が、上記内因性標的遺伝子の発現より実質的に低いという点で、該内因性標的遺伝子とは核酸レベルで異なるものである、上記外因性標的核酸。

さらに、ＲＮＡノックアウト相補方法は、調製目的、例えば真核細胞、特に哺乳動物細胞、さらに具体的にはヒト細胞由来のタンパク質またはタンパク質複合体のアフィニティー精製に用いることもできる。本発明のこの実施形態では、外因性標的核酸は、アフィニティータグと融合した標的タンパク質をコードするのが好ましい。

上記調製方法を用いて、高分子量のタンパク質複合体を精製することができ、これらの複合体は、質量が、好ましくは１５０ｋＤ以上、さらに好ましくは５００ｋＤ以上であり、これらは、場合に応じて、ＲＮＡのような核酸を含んでいてもよい。具体的例として、Ｕ４／Ｕ６ ｓｎＲＮＰ粒子の２０ｋＤ、６０ｋＤおよび９０ｋＤタンパク質からなるヘテロ三量体タンパク質複合体、分子量が１４、４９、１２０、１４５および１５５ｋＤの５つのタンパク質からなる１７Ｓ Ｕ２ ｓｎＲＮＰ由来のスプライシング因子ＳＦ３ｂ、ならびに、Ｕ４、Ｕ５およびＵ６ ｓｎＲＮＡ分子と約３０のタンパク質を含む２５Ｓ Ｕ４／Ｕ６／Ｕ５ ｔｒｉ−ｓｎＲＮＰ粒子（分子量は約１．７ＭＤ）が挙げられる。

この方法は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞における機能的プロテオーム分析に適している。

以下の図面および実施例を参照にしながら、本発明をさらに詳しく説明する。

図面の説明
図１：３８ｂｐという短い二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介することができる。

（Ａ）Ｐｐ−ｌｕｃ ｍＲＮＡをターゲッティングするのに用いたｄｓＲＮＡのグラフ。２９〜５０４ｂｐの範囲にある３系統の平滑末端ｄｓＲＮＡを調製した。ｄｓＲＮＡのセンス鎖の第１ヌクレオチドの位置は、Ｐｐ−ｌｕｃ ｍＲＮＡ（ｐ１）の開始コドンを基準として示した。

（Ｂ）ＲＮＡ干渉アッセイ（Tuschlら、1999）。標的Ｐｐ−ｌｕｃと対照Ｒｒ−ｌｕｃ活性の比は、バッファー対照（黒棒）に対して正規化した。ｄｓＲＮＡ（５ｎＭ）をショウジョウバエ溶解物において２５℃で１５分プレインキュベートした後、７−メチル−グアノシン−キャップを有するＰｐ−ｌｕｃおよびＲｒ−ｌｕｃ ｍＲＮＡ（約５０ｐＭ）を添加した。インキュベーションをさらに１時間継続した後、二重ルシフェラーゼアッセイ（Promega）により分析した。データは、少なくとも４回の独立した実験からの平均値±標準偏差である。

図２：２９ｂｐのｄｓＲＮＡは、もはや２１〜２３塩基の断片にプロセシングされない。ショウジョウバエ溶解物における内部^３２Ｐ標識ｄｓＲＮＡ（５ｎＭ）のプロセシングからの２１〜２３ｍｅｒ形成の時間経過。ｄｓＲＮＡの長さおよび供給源を示す。ＲＮＡサイズマーカー（Ｍ）が左レーンにロードされており、断片のサイズを示す。時間０で認められる２つのバンドは、不完全に変性したｄｓＲＮＡによるものである。

図３：短いｄｓＲＮＡは、ｍＲＮＡ標的を１回しか切断しない。

（Ａ）ショウジョウバエ溶解物におけるｐ１３３系統の１０ｎＭ ｄｓＲＮＡと一緒に、キャップを^３２Ｐで標識した１０ｎＭセンスまたはアンチセンスＲＮＡを１時間インキュベートすることにより生成された安定な５’切断産物の変性ゲル電気泳動。長さマーカーは、キャップ標識した標的ＲＮＡの部分的ヌクレアーゼＴ１消化および部分的アルカリ加水分解（ＯＨ）により作製した。ｄｓＲＮＡによりターゲッティングされる領域は、両側が黒棒として示される。長さが１１１ｂｐのｄｓＲＮＡでは、優勢切断部位同士の間隔は、２０〜２３塩基であることがわかる。水平方向の矢印は、ＲＮＡｉによるものではない非特異的切断を示す。

（Ｂ）センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ上の切断部位の位置。キャップを有する１７７塩基のセンスおよび１８０塩基のアンチセンス標的ＲＮＡの配列は、逆平行配向をしており、相補配列が互いに向き合っている。様々なｄｓＲＮＡによりターゲッティングされる領域は、センスおよびアンチセンス標的配列の間に位置する様々な色の棒によって示す。切断部位は丸で示す：大きな丸は強い切断を、小さな丸は弱い切断をそれぞれ示す。^３２Ｐ放射性標識リン酸基は、星印で示す。

図４：ＲＮａｓｅＩＩＩ様機構により２１および２２塩基のＲＮＡ断片を作製する。

（Ａ）ｄｓＲＮＡプロセシング後の約２１塩基ＲＮＡの配列。ｄｓＲＮＡプロセシングにより作製した約２１塩基のＲＮＡ断片を定方向にクローニングした後、配列決定した。ｄｓＲＮＡのセンス鎖に由来するオリゴリボヌクレオチドを青色の線で示し、アンチセンス鎖に由来するものを赤色の線で示す。同じ配列が複数のクローンに存在する場合には太い棒を用い、右側の数字は頻度を示す。ｄｓＲＮＡが媒介する標的ＲＮＡ切断部位はオレンジ色の丸で示し、大きな丸は強い切断を、また小さな丸は弱い切断をそれぞれ表す（図３Ｂ参照）。センス鎖の上部にある丸はセンス標的内の切断部位を、ｄｓＲＮＡの下にある丸はアンチセンス標的内の切断部位をそれぞれ示す。５以下の更なるヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡの３’末端由来の約２１塩基断片に確認された。これらのヌクレオチドは、主としてＣ、ＧまたはＡ残基のランダムな組合せであり、ｄｓＲＮＡ構成鎖のＴ７転写中に、非鋳型様式で付加されたと考えられる。

（Ｂ）約２１塩基のＲＮＡのヌクレオチド組成の二次元ＴＬＣ分析。ショウジョウバエ溶解物における内部放射性標識５０４ｂｐ Ｐｐ−ｌｕｃ ｄｓＲＮＡのインキュベーションにより、約２１塩基のＲＮＡを作製し、ゲル精製した後、ヌクレアーゼＰ１（上列）またはリボヌクレアーゼＴ２（下列）でモノヌクレオチドに消化した。表示したα^３２Ｐヌクレオシド三リン酸の１つの存在下での転写により、ｄｓＲＮＡを内部標識した。リン光イメージング（phosphorimaging）により放射活性を検出した。ヌクレオシド５’一リン酸、ヌクレオシド３’一リン酸、ヌクレオシド５’，３’二リン酸、および無機リン酸をそれぞれｐＮ、Ｎｐ、ｐＮｐ、およびｐ_ｉで表す。黒丸は、非放射能キャリアヌクレオチドからのＵＶ吸収斑を示す。３’，５’ビス−リン酸（赤丸）は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとγ^３２Ｐ−ＡＴＰによるヌクレオシド３’一リン酸の５’リン酸化により調製された放射性標識標準との同時泳動により確認した。

図５：合成２１および２２塩基のＲＮＡは、標的ＲＮＡ切断を媒介する。

（Ａ）対照５２ｂｐ ｄｓＲＮＡ並びに合成２１および２２塩基ｄｓＲＮＡをグラフで表示した図。２１および２２塩基の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖を青色で、アンチセンス鎖を赤色で示す。ｓｉＲＮＡの配列は、二本鎖５の２２塩基アンチセンス鎖を除いて、５２および１１１ｂｐ ｄｓＲＮＡのクローン化断片（図４Ａ）に由来する。二本鎖６および７のｓｉＲＮＡは、１１１ｂｐ ｄｓＲＮＡプロセシング反応に特有のものであった。緑色で示す２つの３’突出塩基は、二本鎖１および３の合成アンチセンス鎖の配列に存在する。対照５２ｂｐ ｄｓＲＮＡの両鎖は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により作製したため、転写物の画分には、非鋳型３’ヌクレオチド付加が含まれることもある。ｓｉＲＮＡ二本鎖により指令される標的ＲＮＡ切断部位は、オレンジ色の丸で示し（図４Ａの説明を参照）、図５Ｂに示したように決定した。

（Ｂ）センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ上の切断部位の位置。標的ＲＮＡ配列は、図３Ｂに説明した通りである。ショウジョウバエ溶解物において、対照５２ｂｐ ｄｓＲＮＡ（１０ｎＭ）または２１および２２塩基のＲＮＡ二本鎖１〜７（１００ｎＭ）を標的ＲＮＡと一緒に２５℃で２．５時間インキュベートした。安定した５’切断産物がゲル上で分離された。切断部位を図５Ａに示す。５２ｂｐ ｄｓＲＮＡまたはセンス（ｓ）もしくはアンチセンス（ａｓ）鎖は、ゲルの横に黒棒で示す。切断部位はすべてｄｓＲＮＡの同一性領域内に位置する。アンチセンス鎖の切断部位の正確な決定のために、低いパーセンテージのゲルを用いた。

図６：短いｄｓＲＮＡ上の長い３’突出部がＲＮＡｉを阻害する。

（Ａ）５２ｂｐ ｄｓＲＮＡ構築物をグラフで示した図。センスおよびアンチセンス鎖の３’延長部分をそれぞれ青色および赤色で示す。標的ＲＮＡ上で観察された切断部位を図４Ａと同様のオレンジ色の丸で表し、これらを図６Ｂで示したように決定した。

（Ｂ）センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ上の切断部位の位置。標的ＲＮＡ配列は図３Ｂに説明した通りである。ショウジョウバエ溶解物において、ｄｓＲＮＡ（１０ｎＭ）を標的ＲＮＡと一緒に２５℃で２．５時間インキュベートした。安定した５’切断産物をゲル上で分離させた。主要な切断部位は水平方向の矢印で示し、図６Ａでも表示する。５２ｂｐ ｄｓＲＮＡによりターゲッティングされる領域は、ゲル両側の黒棒で表示する。

図７：ＲＮＡｉのモデル案
ＲＮＡｉは、主として２１および２２塩基の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を生成するｄｓＲＮＡ（センス鎖は黒、アンチセンス鎖は赤）のプロセシングで開始すると推定される。短い３’突出塩基が、ｄｓＲＮＡ上に存在すれば、これは、短鎖ｄｓＲＮＡのプロセシングに有益であると考えられる。これから特性決定しようとするｄｓＲＮＡプロセシングタンパク質は、緑色および青色の長円形として表し、非対称にｄｓＲＮＡ上に集合させる。本発明のモデルでは、これは、推定上の青色タンパク質またはタンパク質ドメインと、３’から５’方向のｓｉＲＮＡ鎖との結合により説明されるのに対し、推定上の緑色タンパク質またはタンパク質ドメインは、向き合うｓｉＲＮＡ鎖と必ず結合する。これらのタンパク質またはサブセットは、ｓｉＲＮＡ二本鎖と会合したままであり、ｄｓＲＮＡプロセシング反応の方向により決定される配向を保存している。青色タンパク質と会合したｓｉＲＮＡ配列だけが標的ＲＮＡ切断を指示することができる。エンドヌクレアーゼ複合体は、短い干渉リボ核タンパク質複合体またはｓｉＲＮＰと呼ばれる。本発明では、ｄｓＲＮＡを切断するエンドヌクレアーゼは、恐らく、標的認識に使用されない受動ｓｉＲＮＡを一時的に置換することにより、標的ＲＮＡも切断することができると推定する。次に、この標的ＲＮＡは、配列相補的ガイドｓｉＲＮＡにより認識される領域の中心部で切断される。

図８：リポーター構築物とｓｉＲＮＡ二本鎖。

（ａ）プラスミドｐＧＬ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＧＬ−３−ＣｏｎｔｒｏｌおよびｐＲＬ−ＴＫ（Promega）からのホタル（Ｐｐ−ｌｕｃ）およびウミシイタケ（Ｒｒ−ｌｕｃ）ルシフェラーゼリポーター遺伝子領域を示す。ＳＶ４０調節エレメント、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーターと、２つのイントロン（斜線）を示す。ＧＬ３ルシフェラーゼの配列はＧＬ２と９５％同一であるが、ＲＬは、両者とまったく関連性がない。ｐＧＬ２からのルシフェラーゼ発現は、トランスフェクトした哺乳動物細胞におけるｐＧＬ３からの発現に対して約１０分の１低い。ｓｉＲＮＡ二本鎖によりターゲッティングされる領域は、ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域下方の黒棒で表す。

（ｂ）ＧＬ２、ＧＬ３およびＲＬルシフェラーゼをターゲッティングするｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス（上）およびアンチセンス（下）配列を示す。ＧＬ２およびＧＬ３ｓｉＲＮＡ二本鎖は、３つの一塩基置換が異なるにすぎない（灰色で囲んだ箇所）。非特異的対照として、逆転ＧＬ２配列、すなわち、ｉｎｖＧＬ２を有する二本鎖を合成した。２’−デオキシチミジンの２塩基３’突出部をＴＴとして表す。ｕＧＬ２は、ＧＬ２ｓｉＲＮＡと類似しているが、リボ−ウリジン３’突出部を含んでいる。

図９：ｓｉＲＮＡ二本鎖によるＲＮＡ干渉。

標的対照ルシフェラーゼの比をバッファー対照（ｂｕ、黒棒）に対して正規化した；灰色の棒は、フォティナス・ピラリス（Photinus pyralis）（Ｐｐ−ｌｕｃ）ＧＬ２またはＧＬ３ルシフェラーゼと、レニラ・レニフォルミス（Renilla reniformis）（Ｒｒ−ｌｕｃ）ＲＬルシフェラーゼの比を示し（左軸）、白色の棒は、ＲＬとＧＬ２またはＧＬ３比を示す（右軸）。ａ、ｃ、ｅ、ｇおよびｉの各表は、ｐＧＬ２−ＣｏｎｔｒｏｌとｐＲＬ−ＴＫリポータープラスミドの組合せを用いて実施した実験を示し、表ｂ、ｄ、ｆ、ｈおよびｊは、ｐＧＬ３−ＣｏｎｔｒｏｌとｐＲＬ−ＴＫリポータープラスミドを用いたものを示す。干渉実験に用いた細胞系は、各表の上部に示す。バッファー対照（ｂｕ）に対するＰｐ−ｌｕｃ／Ｒｒ−ｌｕｃの比は、正規化の前に各種被検細胞系間で、ｐＧＬ２／ｐＲＬでは０．５〜１０、また、ｐＧＬ３／ｐＲＬについては０．０３〜１の範囲をそれぞれ変動した。プロットしたデータは、３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｄ．である。

図１０：ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発現に対する２１塩基のｓｉＲＮＡ、５０ｂｐおよび５００ｂｐのｄｓＲＮＡの影響。

長いｄｓＲＮＡの正確な長さを棒の下に示す。表ａ、ｃおよびｅは、ｐＧＬ２−ＣｏｎｔｒｏｌとｐＲＬ−ＴＫリポータープラスミドを用いて実施した実験を示し、表ｂ、ｄおよびｆは、ｐＧＬ３−ＣｏｎｔｒｏｌとｐＲＬ−ＴＫリポータープラスミドを用いたものを示す。データは、２つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｄ．である。

（ａ）および（ｂ）任意のルミネセンス単位でプロットした絶対Ｐｐ−ｌｕｃ発現。

（ｃ）および（ｄ）任意のルミネセンス単位でプロットしたＲｒ−ｌｕｃ発現。

（ｅ）および（ｆ）正規化した標的と対照ルシフェラーゼの比。ｓｉＲＮＡ二本鎖についてのルシフェラーゼ活性の比は、バッファー対照（ｂｕ、黒棒）に対して正規化した；５０または５００ｂｐ ｄｓＲＮＡについてのルミネセンス比は、ヒト化ＧＦＰ（ｈＧ、黒棒）由来の５０および５００ｂｐ ｄｓＲＮＡについて認められたそれぞれの比に対して正規化した。ＧＬ２およびＧＬ３をターゲッティングする４９および４８４ｂｐのｄｓＲＮＡ間の配列の全相違は、ＧＬ２およびＧＬ３標的間に特異性を賦与するのに十分ではなかった（４９ｂｐ断片では４３塩基の連続した同一性、４８４ｂｐ断片では２３９塩基の最長連続同一性）。

図１１：２１塩基ｓｉＲＮＡ二本鎖の３’突出部の変動
（Ａ）実験戦略の概要。キャップを有し、かつポリアデニル化されたセンス標的ｍＲＮＡを描くと共に、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡの相対位置を示す。８つの異なるアンチセンス鎖に従って８系統の二本鎖を用意した。ｓｉＲＮＡ配列と、突出ヌクレオチドの数を１塩基ずつ変化させた。

（Ｂ）５ｎＭ平滑末端ｄｓＲＮＡの存在下で、キイロショウジョウバエ胚溶解物において、対照ルシフェラーゼ（Renilla reniformis、Ｒｒ−ｌｕｃ）に対する、標的ルシフェラーゼ（Photinus pyralis、Ｐｐ−ｌｕｃ）の正規化相対ルミネセンス。ｄｓＲＮＡの存在下で決定したルミネセンス比は、バッファー対照で得られた比（ｂｕ、黒棒）に対して正規化した。１より小さい正規化比は、特異的干渉を意味する。

（Ｃ〜Ｊ）８系統の２１塩基ｓｉＲＮＡ二本鎖について正規化した干渉比。ｓｉＲＮＡ二本鎖の配列を棒グラフの上方に表示する。各表は、所与のアンチセンスガイド（guide）ｓｉＲＮＡと、５つの異なるセンスｓｉＲＮＡにより形成された二本鎖のセットについての干渉比を示す。突出塩基の数（３’突出部は正の数；５’突出部は負の数）をＸ軸に示す。データ点は、少なくとも３回の独立した実験から平均したものであり、エラーバー（error bar）は標準偏差を表す。

図１２：ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖の長さ変動。

（Ａ）実験をグラフで示す図。３つの２１塩基アンチセンス鎖を８つのセンスｓｉＲＮＡと対合させた。ｓｉＲＮＡは、その３’末端で長さを変化させた。アンチセンスｓｉＲＮＡの３’突出部は、１塩基（Ｂ）、２塩基（Ｃ）、または３塩基（Ｄ）であるのに対し、センスｓｉＲＮＡの突出部は、各系統で変動させた。ｓｉＲＮＡ二本鎖の配列および対応する干渉比を表示する。

図１３：保存された２塩基３’突出部を有するｓｉＲＮＡ二本鎖の長さの変動。

（Ａ）実験をグラフで示す図。２１塩基のｓｉＲＮＡ二本鎖は、図１１Ｈまたは１２Ｃに示したものと配列が同じである。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、センスｓｉＲＮＡの３’側（Ｂ）、またはセンスｓｉＲＮＡの５’側（Ｃ）まで延長させた。ｓｉＲＮＡ二本鎖の配列およびそれぞれの干渉比を表示する。

図１４：ｓｉＲＮＡリボース残基の２’−ヒドロキシル基の置換。

ｓｉＲＮＡ二本鎖の鎖における２’−ヒドロキシル基（ＯＨ）は、２’−デオキシ（ｄ）または２’−Ｏ−メチル（Ｍｅ）によって置換した。３’末端での２塩基および４塩基２’−デオキシ置換をそれぞれ２塩基ｄおよび４塩基ｄとして表示する。ウリジン残基は２’−デオキシチミジンで置換した。

図１５：２塩基３’突出部を有する２１塩基のｓｉＲＮＡ二本鎖によるセンスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ切断のマッピング
（Ａ）３２Ｐ（星印）キャップ標識センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡと、ｓｉＲＮＡ二本鎖をグラフで示した図。センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ切断の位置は、ｓｉＲＮＡ二本鎖の上方および下方に、それぞれ三角形で示す。

（Ｂ）標的ＲＮＡ切断部位のマッピング。キイロショウジョウバエ胚溶解物において、１００ｎＭ ｓｉＲＮＡ二本鎖と一緒に１０ｎＭ標的を２時間インキュベートした後、５’キャップ標識基質と５’切断産物を配列決定用ゲル上で分離させた。標的ＲＮＡの部分的ＲＮａｓｅＴ１消化（Ｔ１）と部分的アルカリ加水分解（ＯＨ−）により、長さマーカーを作製した。画像左側の太線は、標的と同じ配向のｓｉＲＮＡ鎖１および５が占める領域を示す。

図１６：ガイドｓｉＲＮＡの５’末端が、標的ＲＮＡ切断の位置を画定する。

（Ａ、Ｂ）実験戦略をグラフで示した図。アンチセンスｓｉＲＮＡは、すべてのｓｉＲＮＡ二本鎖で同じであるが、センス鎖は、３’末端を改変することにより１８〜２５塩基までの間を（Ａ）、または５’末端を改変することにより１８〜２３塩基までの間（Ｂ）を変動させた。センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ切断の位置は、ｓｉＲＮＡ二本鎖の上方および下方に、それぞれ三角形で示す。

（Ｃ、Ｄ）キャップ標識センス（上の表）またはアンチセンス（下の表）標的ＲＮＡを用いた標的ＲＮＡ切断の分析。キャップ標識の５’切断産物だけを示す。ｓｉＲＮＡ二本鎖の配列を表示すると共に、センスｓｉＲＮＡ鎖の長さを表の上部に示す。パネル（Ｃ）においてダッシュで示した対照レーンは、ｓｉＲＮＡの不在下でインキュベートした標的ＲＮＡを示す。マーカーは、図１５に記載した通りである。（Ｄ）の下部パネルの矢印は、１塩基だけ異なる標的ＲＮＡ切断部位を示す。

図１７：ｓｉＲＮＡ二本鎖の３’突出部の配列変動
２塩基３’突出部（灰色のＮＮ）は、表示したように配列および組成を改変した（Ｔ、２’−デオキシチミジン、ｄＧ、２’−デオキシグアノシン；星印、野生型ｓｉＲＮＡ二本鎖）。正規化した干渉比は、図１１で記載したように決定した。野生型配列は図１４に示したものと同じである。

図１８：標的認識の配列特異性。

ミスマッチｓｉＲＮＡ二本鎖の配列を示し、修飾した配列部分または単一塩基を灰色で示す。基準二本鎖（ｒｅｆ）とｓｉＲＮＡ二本鎖１〜７は、２’−デオキシチミジン２塩基突出部を含む。チミジンを修飾した基準二本鎖のサイレンシング効率は、野生型配列と同等であった（図１７）。正規化した干渉比は、図１１に記載したのと同様に決定した。

図１９：保存された２塩基３’突出部を有するｓｉＲＮＡ二本鎖の長さ変動。

ｓｉＲＮＡ二本鎖は、センスｓｉＲＮＡの３’側（Ａ）、またはセンスｓｉＲＮＡの５’側（Ｂ）まで延長した。ｓｉＲＮＡ二本鎖配列と、それぞれの干渉比を示す。ＨｅＬａ ＳＳ６細胞については、ＧＬ２ルシフェラーゼをターゲッティングするｓｉＲＮＡ二本鎖（０．８４μｇ）を、ｐＧＬ２−ＣｏｎｔｒｏｌおよびｐＲＬ−ＴＫプラスミドで一緒にトランスフェクトした。比較のため、キイロショウジョウバエ胚溶解物で試験したｓｉＲＮＡ二本鎖のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡｉ活性を示す。

実施例１
短い合成ＲＮＡにより媒介されるＲＮＡ干渉
１．１．実験手順
１．１．１ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡｉ
以前記載されている（Tuschlら、1999；Zamoreら、2000）ように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡｉおよび溶解物調製を実施した。最適なＡＴＰ再生のためには、新しく溶解したクレアチンキナーゼ（Roche）を用いる必要がある。ＲＮＡｉ翻訳アッセイ（図１）は、５ｎＭのｄｓＲＮＡ濃度と、２５℃で１５分の長いプレインキュベーション時間で実施した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、キャッピングおよびポリアデニル化したＰｐ−ｌｕｃおよびＲｒ−ｌｕｃリポーターｍＲＮＡを添加した。インキュベーションを１時間継続した後、二重ルシフェラーゼアッセイ（Promega）およびモノライト３０１０Ｃルミノメーター（PharMingen）を用いて、Ｐｐ−ｌｕｃおよびＲｒ−ｌｕｃタンパク質の相対量を分析した。

１．１．２ ＲＮＡ合成
標準的手順を用いて、Ｔ７またはＳＰ６プロモーター配列を有するＰＣＲ鋳型からのＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を実施した（例えば、Tuschlら、1998を参照）。Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＲＮＡホスホルアミダイト（Proligo）を用いて、合成ＲＮＡを調製した。ジメトキシトリチル−１，４−ベンゼンジメタノール−スクシニル−アミノプロピル−ＣＰＧを用いて、３’アダプターオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴリボヌクレオチドを、３ｍｌの３２％アンモニア／エタノール（３／１）において、５５℃で４時間（Expedite RNA）または５５℃で１６時間かけて脱保護した（３’および５’アダプターＤＮＡ／ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチド）後、以前記載されている（Tuschlら、1993）ように、脱シリル化してからゲル精製した。長い３’突出部を含むｄｓＲＮＡを調製するためのＲＮＡ転写物は、センス方向にＴ７プロモーターを、アンチセンス方向にＳＰ６プロモーターを含むＰＣＲ鋳型から作製した。５’プライマーとしてGCGTAATACGACTCACTATAGAACAATTGCTTTTACAG（下線部、Ｔ７プロモーター）と、３’プライマーとしてATTTAGGTGACACTATAGGCATAAAGAATTGAAGA（下線部、ＳＰ６プロモーター）、ならびに、鋳型として線状化Ｐｐ−ｌｕｃプラスミド（ｐＧＥＭ−ｌｕｃ配列）（Tuschlら、1999）を用いて、センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ用の転写鋳型をＰＣＲ増幅した。Ｔ７転写センスＲＮＡは、１７７塩基長であり、開始コドンに対して位置１１３〜２７３のＰｐ−ｌｕｃ配列と、これに続いて、３’末端にＳＰ６プロモーター配列の１７塩基の相補配列（complement）を含む。平滑末端ｄｓＲＮＡ形成用の転写物は、単一のプロモーター配列だけを含む２つの異なるＰＣＲ産物からの転写によって調製した。

フェノール／クロロホルム抽出により、ｄｓＤＮＡのアニーリングを実施した。０．３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ６）における等モル濃度のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ（利用可能な長さおよび量に応じて、５０ｎＭ〜１０μＭ）を９０℃で３０秒インキュベートしてから、等量のフェノール／クロロホルムを用いて、室温で抽出した後、クロロホルム抽出により、残留フェノールを除去した。得られたｄｓＲＮＡは、２．５〜３容量のエタノールの添加により沈降させた。このペレットを溶解バッファー（１００ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）_２）中で溶解させ、１×ＴＡＥバッファー中の標準アガロースゲル電気泳動によりｄｓＲＮＡの品質を確認した。１７塩基および２０塩基の３’突出部を有する５２ｂｐのｄｓＲＮＡ（図６）を９５℃で１分インキュベートすることによりアニールしてから、７０℃まで急冷した後、３時間かけてゆっくりと室温まで冷却した（５０μｌアニーリング反応、１μＭ鎖濃度、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）。次に、このｄｓＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈降させた後、溶解バッファー中に溶解させた。

ｄｓＲＮＡ調製に用いる内部^３２Ｐ放射性標識ＲＮＡの転写（図２および４）は、１ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、０．１または０．２ｍＭ ＵＴＰ、および０．２〜０．３μＭ−^３２Ｐ−ＵＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、あるいは、ＵＴＰ以外の放射性標識ヌクレオシド三リン酸についてのそれぞれの比を用いて実施した。標的ＲＮＡのキャップの標識は、既述されている通りに実施した。キャップ標識後、標的ＲＮＡをゲル精製した。

１．１．３ 切断部位マッピング
１０ｎＭ ｄｓＲＮＡを１５分プレインキュベートした後、１０ｎＭキャップ標識標的ＲＮＡをを添加することにより、標準ＲＮＡｉ反応を実施した。プロテイナーゼＫ処理（Tuschlら、1999）により、さらに２時間（図２Ａ）または２．５時間（図５Ｂおよび６Ｂ）インキュベートした後、反応を停止した。次に、８または１０％配列決定用ゲル上でサンプルを分析した。２１および２２塩基の合成ＲＮＡ二本鎖を１００ｎＭ最終濃度で用いた（図５Ｂ）。

１．１．４ 約２１塩基のＲＮＡのクローニング
標的ＲＮＡの不在下で、ショウジョウバエ溶解物における放射性標識ｄｓＲＮＡのインキュベーションにより（２００μｌ反応物、１時間インキュベーション、５０ｎＭ ｄｓＰ１１１、または１００ｎＭ ｄｓＰ５２もしくはｄｓＰ３９）、２１塩基のＲＮＡを生成した。次に、反応混合物をプロテイナーゼＫで処理した（Tuschlら、1999）後、ｄｓＲＮＡプロセシング産物を変性１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。少なくとも１８〜２４塩基のサイズ範囲を含むバンドを除去し、０．３Ｍ ＮａＣｌに４℃で一晩かけて溶離した後、シリコン処理管に導入した。エタノール沈降によりＲＮＡを回収した後、脱リン酸化した（３０μｌ反応物、３０分、５０℃、１０Ｕアルカリホスファターゼ、Roche）。フェノール／クロロホルム抽出により反応を停止し、ＲＮＡをエタノール沈降させた。次に、３’アダプターオリゴヌクレオチド（pUUUaaccgcatccttctcx：大文字はＲＮＡ；小文字はＤＮＡ；ｐはリン酸；ｘは４−ヒドロキシメチルベンジル）を脱リン酸化した約２１塩基のＲＮＡと連結させた（２０μｌ反応物、３０分、３７℃、５μＭ３’アダプター、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ＡＴＰ、０．１ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、１５％ＤＭＳＯ、２５Ｕ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、Amersham-Pharmacia）（PanおよびUhlenbeck, 1992）。等量の８Ｍ尿素／５０ｍＭ ＥＤＴＡ停止混合物（stopmix）の添加により連結反応を停止した後、１５％ゲルに直接ロードした。連結収率は５０％を超えた。連結産物をゲルから回収した後、５’−リン酸化した（２０μｌ反応物、３０分、３７℃、２ｍＭ ＡＴＰ、５Ｕ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、NEB）。フェノール／クロロホルム抽出によりリン酸化反応を停止した後、エタノール沈降によりＲＮＡを回収した。次に、前記と同様に、５’アダプター（tactaatacgactcactAAA：大文字はＲＮＡ；小文字はＤＮＡ）をリン酸化連結産物と連結させた。新しい連結産物をゲル精製し、キャリアとして用いる逆転写プライマー（GACTAGCTGGAATTCAAGGATGCGGTTAAA：太字はＥｃｏＲＩ部位）の存在下で、ゲル切片から溶離させた。逆転写（１５μｌ反応物、３０分、４２℃、１５０Ｕ ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素、Life Technologies）の後、５’プライマーCAGCCAACGGAATTCATACGACTCACTAAA（太字はＥｃｏＲＩ部位）と、３’ＲＴプライマーを用いたＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルム抽出により精製した後、エタノール沈降させた。次に、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ（NEB）で消化してから、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（高濃度、NEB）を用いてコンカテマー化する。サイズが２００〜８００ｂｐの範囲にあるコンカテマーを低融点アガロースゲル上で分離し、標準的な融解およびフェノール抽出手順によりゲルから回収した後、エタノール沈降させた。非対合末端を標準的条件下でＴａｑポリメラーゼと一緒に７２℃で１５分インキュベートすることにより充填した後、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いて、ＤＮＡ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに直接連結した。ＰＣＲと、Ｍ１３−２０およびＭ１３逆方向配列決定用プライマーを用いて、コロニーをスクリーニングした。カスタム（custom）配列決定（Sequence Laboratories Gottingen GmbH, ドイツ）のためにＰＣＲ産物を直接提出した。平均して、１クローン当たり４〜５個の２１ｍｅｒ配列が得られた。

１．１．５ ２Ｄ−ＴＬＣ分析
放射性標識し、ゲル精製したｓｉＲＮＡおよび２Ｄ−ＴＬＣのヌクレアーゼＰ１消化を記載されている通りに実施した（Zamoreら、2000）。２μｇ／μｌキャリアｔＲＮＡと３０ＵリボヌクレアーゼＴ２（Life Technologies）を用いて、１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．５）中、１０μｌ反応物において、ヌクレアーゼＴ２消化を５０℃で３時間実施した。非放射性標準の泳動をＵＶシャドウイング（shadowing）により測定した。ヌクレオシド−３’，５’−二リン酸の同一性は、γ−３２Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた市販のヌクレオシド３’−一リン酸の５’−^３２Ｐリン酸化により調製した標準によるＴ２消化産物の同時泳動によって確認した（データは示していない）。

１．２ 結果および考察
１．２．１ ２１および２２塩基のＲＮＡ断片のプロセシングに必要な長さ
キイロショウジョウバエ合胞体胚から調製した溶解物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＲＮＡｉを再現することから、ＲＮＡｉ機構の生化学的分析の新たなツールを提供するものである（Tuschlら、1999；Zamoreら、2000）。ＲＮＡｉのためのｄｓＲＮＡに必要な長さについてのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ分析から、標的ｍＲＮＡを分解する上で、短いｄｓＲＮＡ（＜１５０ｂｐ）は、長いｄｓＲＮＡより効果が低いことが明らかにされている（Caplenら、2000；Hammondら、2000；Ngoら、1998）；Tuschlら、1999）。このｍＲＮＡ分解効率が低い理由はわかっていない。従って、本発明者は、ショウジョウバエ溶解物における最適化条件下で（Zomoreら、2000）、標的ＲＮＡ分解のためのｄｓＲＮＡに必要な正確な長さを調べた。数系統のｄｓＲＮＡを合成し、ホタルルシフェラーゼ（Ｐｐ−ｌｕｃ）リポーターＲＮＡに対して指令させた。標的ＲＮＡ発現の特異的抑制を二重ルシフェラーゼアッセイ（Tuschlら、1999）によりモニタリングした（図１Ａおよび１Ｂ）。本発明者は、３８ｂｐという短いｄｓＲＮＡの標的ＲＮＡ発現の特異的阻害を検出したが、２９〜３６ｂｐのｄｓＲＮＡはこの過程において有効ではなかった。効果は、Ｐｐ−ｌｕｃ ｍＲＮＡの標的位置および阻害度とは無関係で、ｄｓＲＮＡの長さと相関していた。すなわち、長鎖ｄｓＲＮＡの方が、短鎖ｄｓＲＮＡより有効であった。

ｄｓＲＮＡのプロセシングにより作製された２１〜２３塩基のＲＮＡは、ＲＮＡ干渉および共抑制の媒介物質であることが示唆されている（HamiltonおよびBaulcombe, 1999；Hammondら、2000；Zamoreら、2000）。従って、本発明者は、サイズが５０１〜２９ｂｐの範囲にあるｄｓＲＮＡのサブセットについて、２１〜２３塩基断片の形成の速度を分析した。ショウジョウバエ溶解物における２１〜２３塩基断片の形成（図２）は、長さが３９〜５０１ｂｐのｄｓＲＮＡでは容易に検出することができたが、２９ｂｐのｄｓＲＮＡでは有意な遅延が認められた。この観察結果は、ｍＲＮＡ切断を指示する上での２１〜２３塩基断片の役割と一致し、３０ｂｐのｄｓＲＮＡによる不十分なＲＮＡｉを解明する助けとなった。２１〜２３ｍｅｒ形成が長さに依存するのは、通常の細胞ＲＮＡの短い分子内塩基対合構造によるＲＮＡｉの不要な活性化を防止するための、生物学的に関連する制御機構を表すものと考えられる。

１．２．２ ３９ｂｐのｄｓＲＮＡは、単一部位で標的ＲＮＡ切断を媒介する
ショウジョウバエ溶解物にｄｓＲＮＡおよび５’−キャップ標識ＲＮＡを添加すると、標的ＲＮＡの配列特異的分解が起こる（Tuschlら、1999）。標的ｍＲＮＡは、ｄｓＲＮＡと同一性のある領域内でしか切断されず、標的切断部位の多くは、２１〜２３塩基ずつ分離された（Zamoreら、2000）。従って、所与のｄｓＲＮＡの切断部位の数は、ｄｓＲＮＡの長さを２１で割った数とおおまかに対応することが予想された。本発明者は、キャップにおいて５’放射性標識されたセンスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ上の標的切断部位をマッピングした（Zamoreら、2000）（図３Ａおよび３Ｂ）。配列決定用ゲル上で安定した５’切断産物を分離し、標的ＲＮＡからの部分的ＲＮａｓｅＴ１およびアルカリ性加水分解標準（ladder）との比較により、切断位置を決定した。

以前の観察結果（Zamoreら、2000）と一致して、すべての標的ＲＮＡ切断部位は、ｄｓＲＮＡとの同一性領域内に位置した。センスまたはアンチセンス標的は、３９ｂｐのｄｓＲＮＡによって一回しか切断されなかった。各切断部位は、ｄｓＲＮＡが占める領域の５’末端から１０塩基の位置にあった（図３Ｂ）。３９ｂｐのＲＮＡと同じ５’末端を有する５２ｂｐのｄｓＲＮＡは、第１部位から２３および２４塩基下流の２つの弱い切断部位に加えて、ｄｓＲＮＡと同一性のある領域の５’末端から１０塩基の位置に、センス標的上の同じ切断部位を生成する。アンチセンス標的も、やはり各ｄｓＲＮＡが占める領域の５’末端から１０塩基の位置で、１回だけ切断された。図１に示した３８〜４９ｂｐのｄｓＲＮＡについての切断部位のマッピングから、第１および優勢切断部位は、常に、ｄｓＲＮＡが占める領域から７〜１０塩基下流の位置にあることが明らかにされた（データは示していない）。これは、標的ＲＮＡ切断点が、ｄｓＲＮＡの末端により決定されることを示唆しており、このことは、２１〜２３ｍｅｒへのプロセシングが二本鎖の末端から開始することを意味すると考えられる。

より長い１１１ｂｐのｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス標的上の切断部位は、予想よりはるかに頻度が高く、それらのほとんどは、２０〜２３塩基ずつ分離したクラスターとして現れる（図Ａおよび３Ｂ）。より短いｄｓＲＮＡに関しては、センス標的上の第１切断部位は、ｄｓＲＮＡが占める領域の５’末端から１０塩基の位置であり、アンチセンス標的上の第１切断位置は、ｄｓＲＮＡが占める領域の５’末端から９塩基の位置である。この不規則な切断の原因は不明であるが、１つには、より長いｄｓＲＮＡが末端からだけではなく、内部でもプロセシングされるためか、あるいは、まだ理解されていないｄｓＲＮＡプロセシングの何らかの特異性決定因子があると考えられる。２１〜２３塩基間隔についてのある程度の不規則性も以前指摘されていた（Zamoreら、2000）。ｄｓＲＮＡプロセシングおよび標的ＲＮＡ認識の分子レベルでの根本原理をより明瞭に理解するために、本発明者は、ショウジョウバエ溶解物における３９、５２、および１１１ｂｐのｄｓＲＮＡのプロセシングにより生成される２１〜２３塩基断片の配列を分析することにした。

１．２．３ ｄｓＲＮＡをＲＮａｓｅＩＩＩ様機構による２１および２３塩基ＲＮＡにプロセシングする
２１〜２３塩基のＲＮＡ断片を特性決定するために、ＲＮＡ断片の５’および３’末端を調べた。ゲル精製した２１〜２３塩基のＲＮＡを過ヨウ素酸化した後、β脱離すると、末端２’および３’ヒドロキシル基の存在が示された。２１〜２３ｍｅｒはまた、アルカリ性ホスファターゼ処理に応答性であり、これは５’末端リン酸基の存在を意味する。５’リン酸および３’ヒドロキシル末端の存在は、ｄｓＲＮＡが大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩと類似した酵素活性によりプロセシングされ得ることを示唆している（確認のため、（Dunn, 1982；Nicholson, 1999；Robertson, 1990：Robertson, 1982）を参照）。

Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いて、３’および５’アダプターオリゴヌクレオチドと精製２１〜２３ｍｅｒとを連結することにより、２１〜２３塩基のＲＮＡ断片の定方向クローニングを実施した。連結産物を逆転写、ＰＣＲ増幅、コンカテマー化、クローニングした後、配列決定した。３９、５２および１１１ｂｐ ｄｓＲＮＡ（図４Ａ）のｄｓＲＮＡプロセシング反応から、２２０個を超える短いＲＮＡを配列決定した。本発明者は、次のような長さ分布をみいだした：１％１８塩基、５％１９塩基、１２％２０塩基、４５％２１塩基、２８％２２塩基、６％２３塩基、および２％２４塩基。プロセシングされた断片の５’末端ヌクレオチドの配列分析から、５’グアノシンを有するオリゴヌクレオチドは過小提示されることがわかった。この偏りは、５’リン酸化グアノシンを供与オリゴヌクレオチドとして区別するＴ４ ＲＮＡリガーゼにより引き起こされると考えられる。尚、３’末端の配列には有意な偏りは認められなかった。二本鎖のセンスまたはアンチセンス鎖の３’末端から得られた約２１塩基断片の多くは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたＲＮＡ合成中にヌクレオチドの非鋳型付加により得られる３’ヌクレオチドを含んでいる。興味深いことに、有意な数の内因性ショウジョウバエの約２１塩基のＲＮＡもクローニングされ、その中には、ＬＴＲおよび非ＬＴＲレトロトランスポゾン由来のものもあった（データは示していない）。これは、トランスポゾンサイレンシングにおいてＲＮＡｉが果たす可能性のある役割と一致している。

約２１塩基のＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ配列全体を含むクラスター形成群として現われる（図４Ａ）。明らかに、プロセシング反応は、付着３’末端を残してｄｓＲＮＡを切断しており、これはＲＮａｓｅＩＩＩ切断のもう一つの特徴である。３９ｂｐのｄｓＲＮＡでは、約２１塩基のＲＮＡの２つのクラスターが突出３’末端を含む各ｄｓＲＮＡ構成鎖から見出されたが、センスおよびアンチセンス標的には１つの切断部位しか検出されなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。約２１塩基の断片が、ｍＲＮＡ分解を媒介する複合体において一本鎖ガイドＲＮＡとして存在するのであれば、少なくとも２つの標的切断部位が存在すると想定できたが、そうではなかった。これは、約２１塩基のＲＮＡがエンドヌクレアーゼ複合体において二本鎖形態で存在する可能性があるが、標的ＲＮＡの認識および切断には、そのうち一方の鎖しか使用できないことを示唆している。標的切断に約２１塩基鎖の一方だけを使用することは、約２１塩基の二本鎖が、ヌクレアーゼ複合体と結合している配向によって簡単に決定することができる。この配向は、本来のｄｓＲＮＡがプロセシングされた方向によって決定される。

５２ｂｐおよび１１１ｂｐのｄｓＲＮＡの場合の約２１ｍｅｒクラスターは、３９ｂｐのｄｓＲＮＡと比較して、あまりよく明確にされていない。これらのクラスターは、約２１塩基二本鎖の複数の個別小集団を提示する、従って、複数の近傍部位における標的切断を指示すると考えられられる２５〜３０塩基の領域に分布している。これらの切断領域は、やはり２０〜２３塩基の間隔で主に分離されている。標準的ｄｓＲＮＡがいかにして約２１塩基の断片にプロセッシングされ得るかを決定する法則はいまだに解明されていないが、切断部位同士の約２１〜２３塩基の間隔は、一連のウリジンによって改変できることがすでに認められている（Zamoreら、2000）。大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩによるｄｓＲＮＡ切断の特異性は、主に、非決定因子（antideterminant）、すなわち、切断部位に対する所与の位置で特異的塩基対を排除することにより、制御されているようである。

糖−、塩基−またはキャップ修飾が、プロセシングされた約２１塩基のＲＮＡ断片に存在するか否かを試験するため、本発明者は、溶解物において放射性標識した５０５ｂｐのＰｐ−ｌｕｃ ｄｓＲＮＡをインキュベートし、約２１塩基産物を単離した後、それをＰ１またはＴ２ヌクレアーゼでモノヌクレオチドに消化した。このヌクレオチド混合物を２Ｄ薄層クロマトグラフィーにより分析した（図４Ｂ）。Ｐ１またはＴ２消化により示されるように、４つの天然リボヌクレオチドのうち、修飾されたものは１つもなかった。本発明者は既に、約２１塩基断片におけるアデノシンからイノシンへの変換を分析し（２時間のインキュベーション後）、わずかな程度（＜０．７％）の脱アミノ化を検出している（Zamoreら、2000）。溶解物中での短いインキュベーション（１時間）により、このイノシン画分をかろうじて検出可能なレベルまで縮小した。ホスホジエステル結合の３’を切断するＲＮａｓｅＴ２は、ヌクレオシド３’−リン酸とヌクレオシド３’，５’−二リン酸を生成したが、これは、５’−末端一リン酸の存在を意味する。４つのヌクレオシド３’，５’−二リン酸の全てが検出されたが、これは、配列特異性がほとんどまたは全くなしに、ヌクレオチド間の結合が切断されたことを示唆している。要約すると、約２１塩基断片は、非修飾であり、ｄｓＲＮＡから生成され、その際、５’−末端に５’−一リン酸および３’−ヒドロキシルが存在する。

１．２．４ 合成２１および２２塩基ＲＮＡは、標的ＲＮＡ切断を媒介する
ｄｓＲＮＡプロセシングの産物の分析から、ＲＮａｓｅＩＩＩ切断反応のあらゆる特徴を有する反応によって約２１断片が生成されることがわかった（Dunn, 1982；Nicholson, 1999；Robertson, 1990；Robertson, 1982）。ＲＮａｓｅＩＩＩは、ｄｓＲＮＡの両鎖に２つの付着切断を形成し、約２塩基の３’突出部を残す。本発明者は、クローン化した約２１塩基断片のいくつかと配列が同じである２１および２２塩基のＲＮＡを化学的に合成し、標的ＲＮＡ分解を媒介する能力についてそれらを試験した（図５Ａおよび５Ｂ）。２１および２２塩基のＲＮＡ二本鎖を、溶解物中１００ｎＭの濃度（５２ｂｐの対照ｄｓＲＮＡの１０倍の濃度）でインキュベートした。これらの条件下で、標的ＲＮＡ切断は容易に検出可能である。２１および２２塩基二本鎖の濃度を１００から１０ｎＭまで下げても、やはり標的ＲＮＡ切断が起こる。しかし、二本鎖の濃度を１００から１，０００ｎＭに高めても、標的切断は増加しない。これは恐らく、溶解物内の制限タンパク質因子によるものであろう。

ＲＮＡｉを媒介しなかった２９または３０ｂｐのｄｓＲＮＡとは対照的に、２〜４塩基の突出３’末端を有する２１および２２塩基ｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡの有効な分解を媒介した（二本鎖１、３、４、６：図５Ａおよび５Ｂ）。平滑末端２１または２２塩基ｄｓＲＮＡ（二本鎖２、５および７：図５Ａおよび５Ｂ）は、標的を分解する能力が低かったが、これは、突出３’末端がＲＮＡ−タンパク質ヌクレアーゼ複合体の再構成に重要であることを意味している。約２１塩基の二本鎖とタンパク質成分の高親和結合には、一本鎖突出部が必要であると考えられる。５’末端リン酸は、ｄｓＲＮＡプロセシング後も存在するが、標的ＲＮＡ切断を媒介するのに必要ではなく、短い合成ＲＮＡからは欠如していた。

合成２１および２２塩基二本鎖は、短い二本鎖が占める領域内で、センスおよびアンチセンス標的の切断を指示した。これは、約２１塩基断片の２対のクラスターを形成する３９ｂｐのｄｓＲＮＡ（図２）が、センスまたはアンチセンス標的を２回ではなく１回しか切断しなかったことを考慮すると、重要な結果である。本発明者は、この結果から、約２１塩基二本鎖に存在する二本鎖の一方だけが標的ＲＮＡ切断を指示できること、また、ヌクレアーゼ複合体における約２１塩基二本鎖の配向がｄｓＲＮＡプロセシングの最初の方向によって決定されることを示唆していると解釈した。しかし、すでに完全にプロセシングされた約２１塩基の二本鎖をｉｎ ｖｉｔｒｏ系に提示すれば、対称的なＲＮＡ二本鎖の可能性ある２つの配向で活性配列−特異的ヌクレアーゼ複合体を形成することできる。この結果、２１塩基のＲＮＡ二本鎖と同一性領域内でセンスおよびアンチセンス標的の切断が達成される。

標的切断部位は、２１または２２塩基のガイド（指示）配列と相補的な第１ヌクレオチドから１１または１２塩基下流に位置する。すなわち、切断部位は、２１または２２塩基のＲＮＡが占める領域の中心付近にある（図４Ａおよび４Ｂ）。２２塩基二本鎖のセンス鎖を２塩基ずつ移動すると（図５Ａの二本鎖１および３を比較）、アンチセンス標的のみの切断部位が２塩基ずつ移動した。センスおよびアンチセンス鎖を２塩基ずつ移動すると、両方の切断部が２塩基ずつシフトした（二本鎖１および４を比較）。本発明者は、ほぼすべての位置で標的ＲＮＡを切断する１対の２１または２２塩基のＲＮＡを設計することが可能であると推定した。

異常な切断部位が検出されないことから、２１および２２塩基のＲＮＡにより指示される標的ＲＮＡ切断の特異性は、正確であると考えられる（図５Ｂ）。しかし、注意すべきは、２１および２２塩基のＲＮＡ二本鎖の３’突出部に存在するヌクレオチドは、切断部位付近のヌクレオチドと比べて、基質認識に寄与しない可能性があることである。これは、活性二本鎖１または３（図５Ａ）の３’突出部における３’末端（most）ヌクレオチドが標的と相補的ではないという観察結果に基づいている。ＲＮＡｉの特異性についての詳しい分析は、合成２１および２２塩基ＲＮＡを用いて、容易に実施することができる。

突出３’末端を有する合成２１および２２塩基ＲＮＡがＲＮＡ干渉を媒介するという証拠に基づいて、本発明者は、約２１塩基のＲＮＡを「短鎖の干渉ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡと、また、それぞれのＲＮＡ−タンパク質複合体を「短い干渉リボ核タンパク質粒子」またはｓｉＲＮＰと呼称することを提案する。

１．２．５ 短鎖ｄｓＲＮＡ上の２０塩基の３’突出部がＲＮＡｉを阻害する
本発明者は、短い平滑末端ｄｓＲＮＡが、ｄｓＲＮＡの末端からプロセシングされることを明らかにした。ＲＮＡｉにおけるｄｓＲＮＡの長さ依存の研究中に、本発明者が、１７〜２０塩基の突出３’末端を有するｄｓＲＮＡも分析したところ、驚くべきことに、これらが、平滑末端ｄｓＲＮＡより効力が弱いことがわかった。長い３’末端の阻害効果は、１００ｂｐまでのｄｓＲＮＡに特に顕著であったが、これより長いｄｓＲＮＡについてはそれほど強くなかった。未改変ゲル分析（データは示していない）によれば、この効果は、不完全なｄｓＲＮＡ形成によるものではなかった。本発明者は、長い突出３’末端の阻害効果を、短いＲＮＡ二本鎖の２つの末端の一方だけに対するｄｓＲＮＡプロセシングを指令するツールとして使用できるかどうかを試験した。

５２ｂｐのモデルｄｓＲＮＡを、平滑末端のもの、センス鎖だけに３’延長部分を有するもの、アンチセンス鎖だけに３’延長部分を有するもの、ならびに、両鎖に二重３’延長部分を有するもの、の４つの組合せで合成し、溶解物中でのインキュベーション後、標的ＲＮＡ切断部位をマッピングした（図６Ａおよび６Ｂ）。二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端が延長されている場合には、センス標的の第１および優勢切断部位が失われ、その逆もまた同じで、二本鎖のセンス鎖の３’末端が延長された場合には、アンチセンス標的の強力な切断部位が失われた。両鎖の３’延長部分によって、５２ｂｐのｄｓＲＮＡが実質的に不活性になった。約２０塩基の３’延長部分によるｄｓＲＮＡ不活性化を説明するものとして、この末端におけるｄｓＲＮＡプロセシング因子の１つの会合を妨害する一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質の会合が考えられる。この結果は、集合ｓｉＲＮＰにおけるｓｉＲＮＡ二本鎖の鎖の一方だけが、標的ＲＮＡ切断を指示することができる、本発明者のモデルとも一致する。ＲＮＡ切断を指示する鎖の配向は、ｄｓＲＮＡプロセシング反応の方向によって定められる。３’付着末端の存在が、プロセシング複合体の集合を促進していると考えられる。センス鎖の３’末端のブロッキングによってのみ、アンチセンス鎖の向き合う３’末端からのｄｓＲＮＡプロセシングが可能となる。これが、今度は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖だけが、センス標的ＲＮＡ切断を指示することができるｓｉＲＮＰ複合体を生成する。同じことが相互の状況で言える。

長鎖のｄｓＲＮＡ（５００ｂｐ以上、データは示していない）の場合に、長い３’延長部分の阻害効果がそれほど高くないのは、長鎖ｄｓＲＮＡも内部ｄｓＲＮＡプロセシングシグナルを含む、あるいは、複数の切断因子の会合により、協働してプロセシングされる可能性があることを示唆している。

１．２．６ ｄｓＲＮＡ指令によるｍＲＮＡ切断のモデル
新しい生化学データを用いて、どのようにしてｄｓＲＮＡがｍＲＮＡをターゲッティングし、破壊するかについてのモデルを更新する（図７）。二本鎖ＲＮＡはまず、主に２１および２２塩基長で、かつ、ＲＮａｓｅＩＩＩ様反応と類似した付着３’末端を有する短いＲＮＡ二本鎖にプロセシングされる（Dunn, 1982；Nicholson, 1999；Robertson, 1982）。プロセシングされたＲＮＡ断片の２１〜２３塩基長に基づき、ＲＮａｓｅＩＩＩ様活性がＲＮＡｉに関与し得ることがすでに想定されていた（Bass, 2000）。この仮定は、ＲＮａｓｅＩＩＩ反応産物に観察されるように、ｓｉＲＮＡの末端に５’リン酸および３’ヒドロキシルが存在することにより支持される（Dunn, 1982；Nicholson, 1999）。細菌ＲＮａｓｅＩＩＩ、Ｓ．セレビシエにおける真核生物相同体Ｒｎｔ１ｐ、およびＳ．ポンベにおけるＰａｃ１ｐは、リボソームＲＮＡ、ならびに、ｓｎＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡのプロセシングにおいて機能することがわかっている（例えば、Chanfreauら、2000参照）。

植物、動物またはヒト由来のＲＮａｓｅＩＩＩ相同体の生化学についてはほとんどわかっていない。２つのファミリーのＲＮａｓｅＩＩＩ酵素が、主にデータベースを利用した配列分析またはｃＤＮＡのクローニングにより同定されている。第１のＲＮａｓｅＩＩＩファミリーの代表は、１３２７アミノ酸長のキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）タンパク質ｄｒｏｓｈａである（アクセッション番号ＡＦ１１６５７２）。Ｃ末端は、２つのＲＮａｓｅＩＩＩと１つのｄｓＲＮＡ結合ドメインから構成され、Ｎ末端の機能は未知である。酷似した相同体が、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）（アクセッション番号ＡＦ１６０２４８）およびヒト（アクセッション番号ＡＦ１８９０１１）でもみいだされている（Filippovら、2000；Wuら、2000）。ｄｒｏｓｈａ様ヒトＲＮａｓｅＩＩＩは、近年クローン化され、特性決定された（Wuら、2000）。遺伝子はヒト組織および細胞系において偏在的に発現し、タンパク質は細胞の核および核小体に局在化する。アンチセンス阻害に関する研究から推定される結果により、ｒＲＮＡプロセシングにおけるこのタンパク質の役割が示唆された。第２のクラスの代表は、１８２２アミノ酸長のタンパク質をコードする線虫遺伝子Ｋ１２Ｈ４．８（アクセッション番号Ｓ４４８４９）である。このタンパク質は、Ｎ末端ＲＮＡヘリカーゼモチーフ、続いて、ｄｒｏｓｈａ ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーと類似した２つのＲＮａｓｅＩＩＩ触媒ドメインおよびｄｓＲＮＡ結合モチーフを有する。Ｓ．ポンベ（アクセッション番号Ｑ０９８８４）、シロイヌナズナ（アクセッション番号ＡＦ１８７３１７）、キイロショウジョウバエ（アクセッション番号ＡＥ００３７４０）、およびヒト（アクセッション番号ＡＢ０２８４４９）にも酷似した相同体がある（Filippovら、2000；Jacobsenら、1999；Matsudaら、2000）。恐らく、Ｋ１２Ｈ４．８ ＲＮａｓｅＩＩＩ／ヘリカーゼは、ＲＮＡｉに関与すると考えられる候補であろう。

線虫における遺伝子スクリーニングにより、トランスポソン可動化または共抑制に影響を及ぼすことなくＲＮＡｉを活性化するのにｒｄｅ−１およびｒｄｅ−４が不可欠であると確認された（Dernburgら、2000；Grishokら、2000；KettingおよびPlasterk, 2000；Tabaraら、1999）。このことから、これらの遺伝子が、ｄｓＲＮＡプロセシングに重要であるが、ｍＲＮＡ標的分解には関与しないという仮定が導かれる。両遺伝子の機能はいまだに未知であり、ｒｄｅ−１遺伝子産物は、ウサギタンパク質ｅｌＦ２Ｃと類似したタンパク質ファミリーメンバーであり（Tabaraら、1999）、ｒｄｅ−４の配列はまだ記載されていない。これらタンパク質の将来の生化学的特性決定によって、これらの分子的機能が明らかにされるに相違ない。

ｓｉＲＮＡ二本鎖へのプロセシングは、平滑末端のｄｓＲＮＡまたは短い（１〜５塩基）３’突出部を有するｄｓＲＮＡの末端から開始するようであり、約２１〜２３塩基ずつ進行する。短鎖ｄｓＲＮＡ上の長い（約２０塩基）３’付着末端は、恐らく一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質との相互作用によって、ＲＮＡｉを抑制する。短鎖ｄｓＲＮＡと隣接する一本鎖領域によるＲＮＡｉの抑制と、３０ｂｐの短いｄｓＲＮＡからのｓｉＲＮＡ形成の欠如が、ｍＲＮＡで頻繁に出会う構築領域（structured regions）がＲＮＡｉの活性化を起こさない理由を説明しうる。

特定の理論に拘束されるわけではないが、本発明者は、ｄｓＲＮＡプロセシングタンパク質またはこれらのサブセットが、プロセシング反応後もｓｉＲＮＡ二本鎖と会合したままであると推定する。これらタンパク質に対するｓｉＲＮＡ二本鎖の配向が、２つの相補鎖のどちらが、標的ＲＮＡ分解を指示する上で機能するかを決定する。化学的に合成されたｓｉＲＮＡ二本鎖は、考えられる２つの配向のいずれかでタンパク質成分と会合することができるため、センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡの切断を指示する。

２１および２２塩基の合成ｓｉＲＮＡ二本鎖が効率的なｍＲＮＡ分解に使用可能であるという注目すべき知見は、機能遺伝学および生物医学的研究における遺伝子発現の配列特異的調節に新しいツールを提供するものである。ｓｉＲＮＡは、ＰＫＲ応答の活性化のために、長いｄｓＲＮＡを使用することができない哺乳動物系で有効となり得る（Clemens, 1997）。このように、ｓｉＲＮＡ二本鎖は、アンチセンスまたはリボザイム治療法に代わる新しい治療法を提供する。

実施例２
ヒト組織培養物におけるＲＮＡ干渉
２．１ 方法
２．１．１ ＲＮＡ調製
Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＲＮＡホスホルアミダイトとチミジンホスホルアミダイト（Proligo, Germany）を用いて、２１塩基のＲＮＡを化学的に合成した。合成オリゴヌクレオチドを脱保護してからゲル精製した（実施例１）後、Sep-Pak C18カートリッジ（Waters, Milford, MA, USA）により精製を実施した（Tuschl, 1993）。ｓｉＲＮＡ配列がターゲッティングするＧＬ２（アクセッション番号Ｘ６５３２４）とＧＬ３ルシフェラーゼ（アクセッション番号Ｕ４７２９６）は、開始コドンの第１ヌクレオチドに対してコード領域１５３〜１７３と対応し、ｓｉＲＮＡがターゲッティングするＲＬ（アクセッション番号ＡＦ０２５８４６）は、開始コドン後の領域１１９〜１２９と対応した。より長いＲＮＡは、ＰＣＲ産物からＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写した後、ゲルおよびＳｅｐ−Ｐａｋ精製に付した。４９および４８４ｂｐのＧＬ２またはＧＬ３ｄｓＲＮＡは、翻訳の開始に対して、位置１１３〜１６１および１１３〜５９６にそれぞれ対応した。５０および５０１ｂｐのＲＬ ｄｓＲＮＡは、位置１１８〜１６７および１１８〜６１８にそれぞれ対応した。ヒト化ＧＦＰ（ｈＧ）をターゲッティングするｄｓＲＮＡ合成のためのＰＣＲ鋳型をｐＡＤ３から増幅した（Kehlenbach, 1998）ところ、５０および５０１ｂｐのｈＧ ｄｓＲＮＡは、翻訳の開始に対して、位置１１８〜１６７および１１８〜６１８にそれぞれ対応した。

ｓｉＲＮＡのアニーリングのために、２０μＭの一本鎖をアニーリングバッファー（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ酢酸マグネシウム）において９０℃で１分インキュベートした後、３７℃で１時間続けた。３７℃のインキュベーションステップを５０および５００ｂｐのｄｓＲＮＡについて一晩延長し、これらのアニーリング反応を８．４μＭおよび０．８４μＭ鎖濃度でそれぞれ実施した。

２．１．２ 細胞培養
１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したシュナイダーのショウジョウバエ培地（Life Technologies）において２５℃で、Ｓ２細胞を増殖させた。１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したダルベッコの改変イーグル培地において３７℃で、２９３、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＨｅＬａＳ３、ＣＯＳ−７細胞を増殖させた。細胞を定期的に継代させて、対数増殖を維持した。約８０％密集度でのトランスフェクションの２４時間前に、哺乳動物細胞をトリプシン処理してから、抗生物質を含まない新鮮な培地で５倍に希釈した（１〜３×１０^５細胞／ｍｌ）後、２４ウェルプレート（５００μｌ／ウェル）に移した。Ｓ２細胞はトリプシン処理せずに開裂反応に付した。付着細胞系について製造者が記載しているように、リポフェクトアミン２０００試薬（Life Technologies）を用いて、トランスフェクションを実施した。１ウェルにつき、リポソームに組み込まれた１．０μｇのｐＧＬ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Promega）またはｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Promega）、０．１μｇのｐＲＬ−ＴＫ（Promega）および０．２８μｇのｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡを導入した；最終量は、１ウェル当たり６００μｌであった。トランスフェクションの後、細胞を２０時間インキュベートしたが、その後の細胞は健常のようであった。次に、二重ルシフェラーゼアッセイ（Promega）で、ルシフェラーゼ発現をモニタリングした。１．１μｇのｈＧＦＰコード化ｐＡＤ３と０．２８μｇのｉｎｖＧＬ２ ｉｎＧＬ２ ｓｉＲＮＡの共トランスフェクション後、哺乳動物細胞系の蛍光顕微鏡検査により、トランスフェクション効率を測定したところ、７０〜９０％であった。リポータープラスミドをＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Stratagene）において増幅した後、Ｑｉａｇｅｎエンドフリー・マキシ・プラスミドキット（Qiagen EndoFree Maxi Plasmid Kit）を用いて精製した。

２．２ 結果と考察
ｓｉＲＮＡが、組織培養物においてもＲＮＡｉを媒介することができるか否かを試験するために、本発明者は、ウミシイタケ（Renilla reniformis）および、ホタルルシフェラーゼ（Photinus pyralis、ＧＬ２およびＧＬ３）の２つの配列種をコードするリポーター遺伝子に対して指令される対称２塩基３’突出部を有する２１塩基ｓｉＲＮＡ二本鎖を合成した（図８ａ、ｂ）。カチオンリポソームを用いて、ｓｉＲＮＡ二本鎖をリポータープラスミドの組合せｐＧＬ２／ｐＲＬまたはｐＧＬ３／ｐＲＬと一緒に、キイロショウジョウバエ・シュナイダーＳ２細胞または哺乳動物細胞に共トランスフェクトした。トランスフェクションから２０時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。試験したすべての細胞系において、本発明者は、相同ｓｉＲＮＡ二本鎖（cognate siRNA duplex）の存在下でリポーター遺伝子の発現の特異的減弱を観察した（図９ａ〜ｊ）。驚くことに、絶対ルシフェラーゼ発現レベルは、非相同ｓｉＲＮＡによる影響を受けなかった。これは、２１塩基のＲＮＡ二本鎖（例えば、ＨｅＬａ細胞については図１０ａ〜ｄ）による有害な副作用がないことを意味している。キイロショウジョウバエＳ２細胞（図９ａ、ｂ）において、ルシフェラーゼの特異的阻害は完全であった。リポーター遺伝子が５０〜１００倍強く発現した哺乳動物細胞では、特異的抑制は完全ではなかった（図９ｃ〜ｊ）。相同ｓｉＲＮＡに応答して、ＧＬ２発現は、３〜１２倍、ＧＬ３発現は９〜２５倍、またＲＬ発現は１〜３倍減弱した。２９３細胞については、ＲＬ ｓｉＲＮＡによるＲＬルシフェラーゼのターゲッティングは無効であったが、ＧＬ２およびＧＬ３標的は、特異的に応答した（図９ｉ、ｊ）。２９３細胞でＲＬ発現の減弱がないのは、この発現が、試験した他の哺乳動物細胞系と比べて５〜２０倍高いこと、および／またはＲＮＡ二次構造もしくは会合タンパク質のために標的配列の受容能力が制限されたことによるものであろう。それでも、相同ｓｉＲＮＡ二本鎖によるＧＬ２およびＧＬ３ルシフェラーゼの特異的ターゲッティングは、ＲＮＡｉが２９３細胞においても機能していることを示している。

ｕＧＬ２を除くすべてのｓｉＲＮＡ二本鎖における２塩基３’突出部は、（２’−デオキシ）チミジンから構成されていた。３’突出部における、チミジンによるウリジンの置換は、キイロショウジョウバエｉｎ ｖｉｔｒｏ系で十分に許容されたため、突出部の配列は標的認識に重要ではなかった。組織培地中およびトランスフェクトした細胞内でｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増強することが推定されるため、チミジン突出部を選択した。実際に、試験したすべての細胞系で、チミジン修飾ＧＬ２ ｓｉＲＮＡは、非修飾ｕＧＬ２ ｓｉＲＮＡよりやや強力であった（図９ａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｉ）。３’突出塩基をさらに修飾することにより、ｓｉＲＮＡ二本鎖の送達および安定性が改善されると考えられる。

共トランスフェクション実験では、組織培地の最終量に対して２５ｎＭのｓｉＲＮＡ二本鎖を用いた（図９、１０）。ｓｉＲＮＡの濃度を１００ｎＭまで増加しても、特異的サイレンシング効果は増強されなかったが、プラスミドＤＮＡとｓｉＲＮＡ間のリポソームのカプセル化（被包）競合により、トランスフェクション効率に影響を与え始めた（データは示していない）。ｓｉＲＮＡの濃度を１．５ｎＭまで低下しても、特異的サイレンシング効果は低下せず（データは示していない）、ｓｉＲＮＡ濃度がＤＮＡプラスミドより２〜２０倍高いだけでもそうであった。これは、ｓｉＲＮＡが、遺伝子サイレンシングを媒介する極めて強力な試薬であること、また、ｓｉＲＮＡが、通常のアンチセンスまたはリボザイム遺伝子ターゲッティング実験で使用される濃度より数桁低い濃度で有効であることを意味している。

より長いｄｓＲＮＡの哺乳動物細胞に対する効果をモニタリングするため、リポーター遺伝子に対して相同な５０〜５００ｂｐのｄｓＲＮＡを調製した。非特異的対照として、ヒト化ＧＦＰ（ｈＧ）由来のｄｓＲＮＡ（Kehlenbach, 1998）を用いた。ｓｉＲＮＡ二本鎖と同じ量（濃度ではない）のｄｓＲＮＡを共トランスフェクトすると、リポーター遺伝子発現は強力かつ非特異的に減弱した。この効果は、代表的例としてＨｅＬａ細胞について示する（図１０ａ〜ｄ）。絶対ルシフェラーゼ活性は、５０ｂｐ ｄｓＲＮＡにより、１０〜２０倍、５００ｂｐ ｄｓＲＮＡ共トランスフェクションにより２０〜２００倍非特異的にそれぞれ低下した。同様の非特異的効果が、ＣＯＳ−７およびＮＩＨ／３Ｔ３細胞について観察された。２９３細胞では、１０〜２０倍の非特異的減弱は、５００ｂｐ ｄｓＲＮＡによってしか観察されなかった。ｄｓＲＮＡ＞３０ｂｐによるリポーター遺伝子発現の非特異的減弱は、インターフェロン応答の一部として予想されたものだった。

驚くことに、リポーター遺伝子発現の強い非特異的減弱にもかかわらず、本発明者は、別の配列特異的ｄｓＲＮＡ媒介サイレンシングを再現的に検出した。しかし、特異的サイレンシング効果は、相対リポーター遺伝子活性をｈＧ ｄｓＲＮＡ対照に対して正規化したときしか明らかではなかった（図１０ｅ、ｆ）。他の３つの被検哺乳動物細胞系においても、相同ｄｓＲＮＡに応答する２〜１０倍の特異的減弱が観察された（データは示していない）。ｄｓＲＮＡ（３５６〜１６６２ｂｐ）による特異的サイレンシング作用はＣＨＯ−Ｋ１細胞においてすでに報告されているが、２〜４倍の特異的減弱を検出するのに必要なｄｓＲＮＡの量は、本発明者の実験（Ui-Tei、2000）より約２０倍高かった。また、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、インターフェロン応答が欠失しているようである。別の報告では、ルシフェラーゼ／ｌａｃＺリポーターの組合せ、および８２９ｂｐ特異的ｌａｃＺまたは７１７ｂｐ非特異的ＧＦＰｄｓＲＮＡを用いて、２９３、ＮＩＨ／３Ｔ３およびＢＨＫ−２１細胞をＲＮＡｉについて試験した（Caplen、2000）。この例でＲＮＡｉを検出できなかったのは、ルシフェラーゼ／ｌａｃＺリポーターアッセイの感受性が低かったことと、標的および対照ｄｓＲＮＡの長さが異なるためであろう。以上のことを考え合わせると、本発明者の結果から、ＲＮＡｉが哺乳動物細胞において活性であるが、インターフェロン系がｄｓＲＮＡ＞３０ｂｐにより活性化されると、サイレンシング効果の検出が難しくなることがわかる。

要約すると、本発明者は、哺乳動物細胞におけるｓｉＲＮＡ媒介の遺伝子サイレンシングを最初に証明した。短鎖ｓｉＲＮＡの使用により、ヒト組織培養物における遺伝子機能の不活性化、ならびに、遺伝子特異的治療法の開発の可能性が高まる。

実施例３
ＲＮＡ干渉による遺伝子発現の特異的阻害
３．１ 材料と方法
３．１．１ ＲＮＡ調製とＲＮＡｉアッセイ
実施例１または２、あるいは、これまでの文献（Tuschlら、1999；Zamoreら、2000）に記載されているように、化学的ＲＮＡ合成、アニーリング、およびルシフェラーゼに基づくＲＮＡｉアッセイを実施した。すべてのｓｉＲＮＡ二本鎖はホタルルシフェラーゼに対して指令され、ルシフェラーゼｍＲＮＡ配列は、記載されている（Tuschlら、1999）ように、ｐＧＥＭ−ｌｕｃ（GenBankアクセッション番号Ｘ６５３１６）由来のものであった。キイロショウジョウバエＲＮＡｉ／翻訳反応において、ｓｉＲＮＡ二本鎖を１５分インキュベートしてから、ｍＲＮＡを添加した。翻訳に基づくＲＮＡｉアッセイを少なくとも３回繰り返して実施した。

センス標的ＲＮＡ切断のマッピングのため、開始コドンに対して位置１１３から２７３までのホタルルシフェラーゼ配列と対応する１７７塩基転写物を作製した後、ＳＰ６プロモーター配列の１７塩基相補体を作製した。アンチセンス標的ＲＮＡ切断のマッピングのため、鋳型から１６６塩基転写物を作製し、５’プライマーTAATACGACTCACTATAGAGCCCATATCGTTTCATA（下線部はＴ７プロモーター）および３’プライマーAGAGGATGGAACCGCTGGを用いて、上記転写物をＰＣＲによりプラスミド配列から増幅した。標的配列は、開始コドンに対して位置５０から２１５までのホタルルシフェラーゼ配列の相補体と対応する。グアニリルトランスフェラーゼ標識を、すでに記載されている（Zamoreら、2000）ように実施した。標的ＲＮＡ切断のマッピングのために、キイロショウジョウバエ胚溶解物において、１００ｎＭのｓｉＲＮＡ二本鎖を５〜１０ｎＭ標的ＲＮＡと一緒に標準的条件（Zamoreら、2000）下で、２５℃で２時間インキュベートした。８容量のプロテイナーゼＫバッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム）を添加することにより反応を停止させた。プロテイナーゼＫ（E.M. Merck、水に溶解）を０．６ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。次に、反応を６５℃で１５分インキュベートしてから、フェノルール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出した後、３容量のエタノールで沈降させた。サンプルを６％配列決定用ゲルに載せた。長さ基準は、キャップ標識センスまたはアンチセンス標的ＲＮＡの部分的ＲＮａｓｅＴ１消化および部分的塩基加水分解反応によって作製した。

３．２ 結果
３．２．１ ２１塩基のｓｉＲＮＡの二本鎖における３’突出部の変動
前述のように、ｓｉＲＮＡ二本鎖の３’末端で２または３非対合ヌクレオチドは、それぞれの平滑末端二本鎖と比べて、標的ＲＮＡ分解が効率的である。末端ヌクレオチドの機能のさらに総合的分析を実施するために、本発明者は、５つの２１塩基センスｓｉＲＮＡ（各々、標的ＲＮＡに対する１塩基で表される）と、８つの２１塩基アンチセンスｓｉＲＮＡ（各々、標的に対する１塩基で表される）を合成した（図１１Ａ）。センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡを組み合わせることにより、７塩基３’突出部〜４塩基５’突出部の範囲にある合成突出末端を有する８系統のｓｉＲＮＡ二本鎖を作製した。二重ルシフェラーゼアッセイ系（Tuschlら、1999；Zamoreら、2000）を用いて、ｓｉＲＮＡ二本鎖の干渉を測定した。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡに対して指令され、ウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡを内部対照として用いた。ｓｉＲＮＡ二本鎖の存在下で、標的と対照ルシフェラーゼ活性のルミネセンス比を測定した後、ｄｓＲＮＡの不在下で得られた比に対して正規化した。比較のため、長いｄｓＲＮＡ（３９〜５０４ｂｐ）の干渉比を図１１Ｂに示す。長鎖ｄｓＲＮＡ（図１１Ａ）については５ｎＭ、また、ｓｉＲＮＡ二本鎖（図１１Ｃ〜Ｊ）については１００ｎＭの濃度で、干渉比を測定した。５ｎＭの５０４ｂｐ ｄｓＲＮＡの完全なプロセシングにより、１２０ｎＭの全ｓｉＲＮＡ二本鎖が得られたことから、ｓｉＲＮＡについては１００ｎＭ濃度を選択した。

２１塩基のｓｉＲＮＡ二本鎖がＲＮＡｉを媒介する能力は、形成された突出ヌクレオチドまたは塩基対の数に応じて異なる。４〜６個の３’突出塩基を有する二本鎖では、ＲＮＡｉを媒介することができなかった（図１１Ｃ〜Ｆ）が、２個以上の５’突出塩基を有する二本鎖は媒介することができた（図１１Ｇ〜Ｊ）。２塩基の３’突出部を有する二本鎖が、ＲＮＡ干渉を媒介するのに最も効率的であったが、サイレンシングの効率はやはり配列依存的であり、２塩基の３’突出部を有する様々なｓｉＲＮＡ二本鎖について１２倍の差が認められた（図１１Ｄ〜Ｈを比較）。平滑末端、１塩基５’突出部または１〜３塩基３’突出部を有する二本鎖は、場合により機能的であった。７塩基の３’突出部を有するｓｉＲＮＡ二本鎖について観察されたわずかなサイレンシング効果（図１１Ｃ）は、ＲＮＡｉよりもむしろ長い３’突出部のアンチセンス効果によるものであろう。長鎖ｄｓＲＮＡ（図１１Ｂ）と、最も有効な２１塩基のｓｉＲＮＡ二本鎖（図１１Ｅ、Ｇ、Ｈ）をＲＮＡｉの効率について比較すると、１００ｎＭ濃度の一本鎖ｓｉＲＮＡ二本鎖が、５ｎＭの５０４ｂｐ ｄｓＲＮＡと同じくらい有効となり得ることがわかる。

３．２．２ ２１塩基のアンチセンスｓｉＲＮＡと対合するセンスｓｉＲＮＡの長さ変動
ＲＮＡｉに対するｓｉＲＮＡの長さの影響を調べるために、本発明者は、３つの２１塩基アンチセンス鎖と８つの１８〜２５塩基センス鎖とを組み合わせて、３系統のｓｉＲＮＡ二本鎖を作製した。アンチセンスｓｉＲＮＡの３’突出部は、各ｓｉＲＮＡ二本鎖系統における１、２または３塩基に固定したのに対し、センスｓｉＲＮＡは、その３’末端で変動させた（図１２Ａ）。センスｓｉＲＮＡの長さとは無関係に、アンチセンスｓｉＲＮＡの２塩基の３’突出部を有する二本鎖（図１２Ｃ）は、１または３塩基の３’突出部を有するもの（図１２Ｂ、Ｄ）より活性が高いことがわかった。アンチセンスｓｉＲＮＡの１塩基の３’突出部を有する第１の系統では、センスｓｉＲＮＡの１および２塩基の３’突出部をそれぞれ有する、２１および２２塩基センスｓｉＲＮＡの二本鎖の活性が最も高かった。１９〜２５塩基のセンスｓｉＲＮＡを有する二本鎖もＲＮＡを媒介することができたが、程度は低かった。同様に、アンチセンスｓｉＲＮＡの２塩基突出部を有する第２系統では、２塩基の３’突出部を有する２１塩基のｓｉＲＮＡ二本鎖の活性が最も高く、１８〜２５塩基のセンスｓｉＲＮＡとのその他すべての組合せは、有意な程度まで活性であった。３塩基のアンチセンスｓｉＲＮＡ３’突出部を有する最後の系統では、２０塩基のセンスｓｉＲＮＡおよび２塩基のセンス３’突出部を有する二本鎖だけが標的ＲＮＡ発現を減弱することができた。以上、これらの結果から、ｓｉＲＮＡの長さと共に、３’突出部の長さが重要であることと、２塩基３’突出部を有する２１塩基のｓｉＲＮＡの二本鎖がＲＮＡｉには最適であることがわかる。

３．２．３ 一定の２塩基３’突出部を有するｓｉＲＮＡ二本鎖の長さ変動
次に、本発明者は、対称の２塩基３’突出部を維持しながら、両ｓｉＲＮＡ鎖の長さを同時に変化させて生じる影響を調べた（図１３Ａ）。図１１Ｈの２１塩基のｓｉＲＮＡ二本鎖を基準として含む２系統のｓｉＲＮＡ二本鎖を作製した。センスｓｉＲＮＡ（図１３Ｂ）の３’末端またはアンチセンスｓｉＲＮＡ（図１３Ｃ）の３’末端で塩基対合部分を延長することにより、二本鎖の長さを２０〜２５ｂｐで変動させた。２０〜２３ｂｐの二本鎖は、標的ルシフェラーゼ活性の特異的抑制を起こしたが、２１塩基のｓｉＲＮＡ二本鎖は、他の二本鎖のどちらと比較しても少なくとも８倍有効であった。２４および２５塩基のｓｉＲＮＡ二本鎖は、検出可能な干渉を全く起こさなかった。配列特異的効果は、二本鎖の両末端における変動が同様の効果を生じたため、わずかであった。

３．２．４ ２’−デオキシおよび２’−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖
ＲＮＡｉにおけるｓｉＲＮＡリボース残基の重要性を評価するため、２’−デオキシまたは２’−Ｏ−メチル修飾鎖を含む２１塩基のｓｉＲＮＡおよび２塩基３’突出部を有する二本鎖を試験した（図１４）。２’−デオキシヌクレオチドによる２塩基３’突出部の置換では影響がなく、対合領域における突出部と隣接した２つの別のリボヌクレオチドの置換でも、有意に活性のｓｉＲＮＡが生じた。従って、ｓｉＲＮＡ二本鎖の４２塩基のうち８つをＤＮＡ残基で置換しても、活性は失われなかった。２’−デオキシ残基による一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖の完全な置換では、２’−Ｏ−メチル残基による置換と同様に、ＲＮＡｉを破壊した。

３．２．５ 標的ＲＮＡ切断部位の画定
２２塩基のｓｉＲＮＡ二本鎖および２１塩基／２２塩基の二本鎖について、標的ＲＮＡ切断位置を事前に決定した。標的ＲＮＡ切断の位置は、ｓｉＲＮＡ二本鎖が占める領域の中心部、すなわち、２１または２２塩基のｓｉＲＮＡガイド配列と相補的な第１塩基から１１または１２塩基下流に位置することがわかった。２塩基３’突出部を有する５つの別個の２１塩基ｓｉＲＮＡ二本鎖（図１５Ａ）を５’キャップ標識センスまたはアンチセンス標的ＲＮＡと一緒にキイロショウジョウバエ溶解物中でインキュベートした（Tuschlら、1999；Zamoreら、2000）。５’切断産物を配列決定用ゲル上で分離した（図１５Ｂ）。切断されたセンス標的ＲＮＡの量は、翻訳に基づくアッセイで決定されるｓｉＲＮＡ二本鎖の効率と相関しており、ｓｉＲＮＡ二本鎖１、２および４（図１５Ｂおよび１１Ｈ、Ｇ、Ｅ）は、二本鎖３および５（図１５Ｂおよび１１Ｆ、Ｄ）より速く標的ＲＮＡを切断する。注目すべきことに、５’切断産物および投入標的ＲＮＡの放射活性の合計は、時間に関して一定ではなく、５’切断産物は蓄積しなかった。恐らく、５’−キャップのポリ（Ａ）テイルのいずれかが欠如しているために、ｓｉＲＮＡ−エンドヌクレアーゼ複合体から放出した切断産物は急速に分解されるのであろう。

センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡの両方で、切断部位は、ｓｉＲＮＡ二本鎖が占める領域の中央部に位置した。５つの異なる二本鎖により生成された各標的の切断部位は、標的配列に沿って、二本鎖の１塩基置換により１塩基ずつ変動した。標的は、配列相補的ガイドｓｉＲＮＡの３’末端（most）ヌクレオチドと相補的な標的位置から正確に１１塩基下流で切断された。

ガイドｓｉＲＮＡの５’または３’末端が、標的ＲＮＡ切断のルーラー（ruler）を設定するか否かを決定するために、本発明者は、図１６ＡおよびＢに概要を示す実験戦略を考案した。２１塩基アンチセンスｓｉＲＮＡは、この実験では不変に維持し、５’または３’末端のいずれかにおいて修飾されたセンスｓｉＲＮＡと対合させた。センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ切断の位置は前記のように決定した。センスｓｉＲＮＡの３’末端の変化を、１塩基５’突出部〜６塩基３’突出部でモニタリングしたが、これらはいずれも、センスまたはアンチセンス標的ＲＮＡ切断の位置に影響を及ぼさなかった（図１６Ｃ）。センスｓｉＲＮＡの５’末端における変化は、センス標的ＲＮＡ切断に影響を及ぼさなかった（図１６Ｄ、上パネル）が、これは、アンチセンスｓｉＲＮＡが変化しなかったため、予想されたことであった。しかし、アンチセンス標的ＲＮＡ切断は影響を受け、センスｓｉＲＮＡの５’末端に強く依存した（図１６Ｄ、下パネル）。センスｓｉＲＮＡサイズが２０または２１塩基であるとき、アンチセンス標的だけが切断され、切断の位置は１塩基ずつ異なった。このことは、標的を認識する５’末端が標的ＲＮＡ切断のルーラー（ruler）を設定することを示唆している。この位置は、ガイドｓｉＲＮＡの５’末端（most）塩基と対合した標的の塩基から上流方向に数えると、塩基１０と１１の間に位置する（図１５Ａも参照）。

３．２．６ ３’突出部における配列の影響および２’−デオキシ置換
２塩基の３’突出部が、ｓｉＲＮＡ機能には好ましい。本発明者は、突出塩基の配列が、標的認識に寄与するのか、またはこの配列が、エンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣまたはｓｉＲＮＰ）の認識に必要な特徴であるだけなのかを知ろうとした。本発明者は、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＵＵおよびＵＧ３’突出部を有するセンスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡを合成し、２’−デオキシ修飾ＴｄＧおよびＴＴを含有させた。野生型ｓｉＲＮＡは、センス３’突出部にＡＡを、また、アンチセンス３’突出部にＵＧを含んでいた（ＡＡ／ＵＧ）。ｓｉＲＮＡ二本鎖はすべて、干渉アッセイにおいて機能的であり、標的発現を少なくとも５倍減弱した（図１７）。１０倍以上標的発現を減弱した最も効率的なｓｉＲＮＡ二本鎖は、配列型：ＮＮ／ＵＧ、ＮＮ／ＵＵ、ＮＮ／ＴｄＧ、およびＮＮ／ＴＴ（Ｎは任意のヌクレオチドである）のものであった。ＡＡ、ＣＣまたはＧＧのアンチセンスｓｉＲＮＡ３’突出部を有するｓｉＲＮＡ二本鎖は、野生型配列ＵＧまたは突然変異配列ＵＵと比較して、２〜４倍活性が低かった。ＲＮＡｉ効率が低いのは、恐らく、末端から２番目の３’塩基が配列特異的標識認識に寄与するためと考えられる。というのは、３’末端塩基は、ＧからＵに改変しても、影響がないからである。

センスｓｉＲＮＡの３’突出部の配列を改変しても、配列に依存する影響は一切明らかにされなかったが、これは、センスｓｉＲＮＡはセンス標的ｍＲＮＡ認識に寄与してはならないため、予想されたことだった。

３．２．７ 標的認識の配列特異性
標的認識の配列特異性を調べるため、本発明者は、ｓｉＲＮＡ二本鎖の対合部分に配列改変を導入し、サイレンシングの効率を調べた。配列改変は、３または４塩基長の短い部分を逆転させるか、あるいは、点突然変異として導入した（図１８）。一方のｓｉＲＮＡ鎖の配列改変は、相補的ｓｉＲＮＡ鎖において補償され、これによって、塩基対合したｓｉＲＮＡ二本鎖構造の不安定化（pertubing）を回避した。合成にかかるコストを下げるため、２塩基の３’突出部の配列は、すべてＴＴ（Ｔ、２’−デオキシチミジン）とした。ＴＴ／ＴＴ基準ｓｉＲＮＡ二本鎖は、ＲＮＡｉについて、野生型ｓｉＲＮＡ二本鎖ＡＡ／ＵＧと同等であった（図１７）。リポーターｍＲＮＡ破壊を媒介する能力は、翻訳に基づくルミネセンスアッセイを用いて定量化した。逆転配列部分有するｓｉＲＮＡの二本鎖は、ホタルルシフェラーゼリポーターをターゲッティングする能力が著しく低いことがわかった（図１８）。アンチセンスｓｉＲＮＡの３’末端と中央部との間に位置する配列改変は、標的ＲＮＡ認識を完全に破壊したが、アンチセンスｓｉＲＮＡの５’末端付近の突然変異は、わずかな程度のサイレンシングを呈示する。推定標的ＲＮＡ切断部位の反対側に直接、または推定部位から１塩基離れて位置するＡ／Ｕ塩基対のトランスバージョンによって、標的ＲＮＡ切断が阻止されるが、これは、ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心部内の単一突然変異が、ミスマッチ標的を識別することを示している。

３．３ 論考
ｓｉＲＮＡは、昆虫細胞だけではなく、哺乳動物細胞においても、遺伝子発現を不活性化するための有用な試薬であり、治療用途に極めて有望である。本発明者は、キイロショウジョウバエ胚溶解物において効率的な標的ＲＮＡ分解を促進するのに必要なｓｉＲＮＡ二本鎖の構造上の決定因子を系統的に分析することにより、最も効力のあるｓｉＲＮＡ二本鎖の設計についての法則を提供した。完全なｓｉＲＮＡ二本鎖は、全ＲＮＡの同等量を用いれば、５００ｂｐのｄｓＲＮＡと同等の効率で、遺伝子発現をサイレンシングすることができる。

３．４ ｓｉＲＮＡユーザーガイド
効率的なサイレンシングｓｉＲＮＡ二本鎖は、２１塩基のアンチセンスｓｉＲＮＡから構成されるため、２塩基３’突出末端を有する１９ｂｐ二重らせんを形成するように選択しなければならない。２塩基３’突出リボヌクレオチドの２’−デオキシ置換は、ＲＮＡｉに影響を及ぼさないが、ＲＮＡ合成にかかるコスト削減に役立ち、ｓｉＲＮＡ二本鎖のＲＮａｓｅ抵抗を増強することができる。ところが、これより広範囲な２’−デオキシまたは２’−Ｏ−メチル修飾は、恐らく、ｓｉＲＮＡＰ集合のためのタンパク質会合を妨害するために、ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介する能力を低下させる。

標的認識は、標的に相補的なｓｉＲＮＡにより媒介される、高度に配列特異的過程である。ガイドｓｉＲＮＡの３’末端（most）塩基は、標的認識の特異性に寄与しないのに対し、３’突出部から２番目の塩基は、標的ＲＮＡ切断に影響を与え、また、ミスマッチはＲＮＡｉを１／２〜１／４倍に低下させる。ガイドｓｉＲＮＡの５’末端もまた、３’末端と比べて、ミスマッチ標的ＲＮＡ認識を広く許容するようである。標的ＲＮＡ切断部位と向き合って位置する、ｓｉＲＮＡの中心のヌクレオチドは、重要な特異性決定因子であり、ただ１つの塩基改変でも、ＲＮＡｉは検出不可能なレベルまで低下する。これは、ｓｉＲＮＡ二本鎖が、遺伝子ターゲッティング実験において突然変異体または多型対立遺伝子を区別することができることを示唆しており、このことは、将来の治療法開発にとって重要な特徴となるであろう。

センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ複合体またはその拘束（commitment）複合体のタンパク質成分と会合すると、個別の役割を果たすことが示唆されている。この複合体におけるｓｉＲＮＡ二本鎖の相対配向が、どの鎖を標的認識に用いることができるかを決定する。合成ｓｉＲＮＡ二本鎖は、二重らせん構造に対して二回転対称を有するが、配列に対してはそうではない。キイロショウジョウバエ溶解物におけるＲＮＡｉタンパク質とｓｉＲＮＡ二本鎖との会合により、２つの非対称複合体が形成される。このような推定上の複合体では、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ、従って、それらの機能について、キラル環境がそれぞれ異なる。この推定は、明らかにパリンドロームのｓｉＲＮＡ配列、またはホモ二量体として会合できるＲＮＡｉタンパク質には適用されない。センスおよびアンチセンスターゲッティングｓｉＲＮＰの比に及ぼす可能性のある配列の影響を最小限にするため、本発明者は、同一の３’突出部配列を有するｓｉＲＮＡ配列を用いることを提案する。本発明者は、センスｓｉＲＮＡの突出部の配列を、アンチセンス３’突出部の配列に対して調節するよう勧める。なぜなら、センスｓｉＲＮＡは、典型的ノックダウン実験には標的をもたないからである。センスおよびアンチセンス切断ｓｉＲＮＰの再構成における非対称性は、この実験（図１４）で用いた２塩基３’突出部を有する様々な２１塩基のｓｉＲＮＡ二本鎖について観察したＲＮＡｉ効率の変動に（部分的に）起因すると考えられる。あるいは、標的部位の塩基配列および／または標的ＲＮＡ構造の受容能力は、これらｓｉＲＮＡ二本鎖の効率の変動によるものと考えられる。

参照文献

Ｐｐ−ｌｕｃ ｍＲＮＡをターゲッティングするのに用いたｄｓＲＮＡのグラフである。 ＲＮＡ干渉アッセイを示す図である。 ショウジョウバエ溶解物における内部^３２Ｐ標識ｄｓＲＮＡ（５ｎＭ）のプロセシングからの２１〜２３ｍｅｒ形成の時間経過と、ｄｓＲＮＡの長さおよび供給源を示す図。 ５’切断産物の変性ゲル泳動を示す図である。 センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ上の切断部位の位置を示す図である。 ｄｓＲＮＡプロセシング後の約２１塩基ＲＮＡの配列を示す図である。 約２１塩基ＲＮＡのヌクレオチド組成の二次元ＴＬＣの分析を示す図である。 対称５２ｂｐのｄｓＲＮＡならびに合成２１および２２塩基のｄｓＲＮＡをグラフで示す図である。 センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ上の切断部位の位置を示す図である。 ５２ｂｐのｄｓＲＮＡ構築物をグラフで示す図である。 センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ上の切断部位の位置を示す図である。 ＲＮＡｉのモデル案を示す図である。 プラスミドｐＧＬ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＧＬ−３−ＣｏｎｔｒｏｌおよびｐＲＬ−ＴＫ（Promega）からのホタル（Ｐｐ−ｌｕｃ）およびウミシイタケ（Ｒｒ−ｌｕｃ）ルシフェラーゼリポーター遺伝子領域を示す図である。 ＧＬ２、ＧＬ３およびＲＬルシフェラーゼをターゲッティングするｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス（上）およびアンチセンス（下）配列を示す図である。 ｓｉＲＮＡ二本鎖によるＲＮＡ干渉を示す図である。 ｐＧＬ２−ＣｏｎｔｒｏｌとｐＲＬ−ＴＫリポータープラスミドを用いて実施した実験を示す。 （Ａ）実験戦略の概要を示す図である。（Ｂ）対照ルシフェラーゼに対する、標的ルシフェラーゼの正規化相対ルミネセンスを示す図である。（Ｃ〜Ｊ）８系統の２１塩基のｓｉＲＮＡ二本鎖について正規化した干渉比を示す図である。 ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖の長さ変動を示す図である。 保存された２塩基３’突出部を有するｓｉＲＮＡ二本鎖の長さ変動を示す図である。 ｓｉＲＮＡリボース残基の２’−ヒドロキシ基の置換を示す図である。 ３２Ｐ（星印）キャップ標識センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡと、ｓｉＲＮＡ二本鎖をグラフで示す図である。 標的ＲＮＡ切断部位のマッピングを示す図である。 （ＡおよびＢ）実験戦略をグラフで示す図である。（ＣおよびＤ）キャップ標識センスまたはアンチセンス標的ＲＮＡを用いた標識ＲＮＡ切断の分析を示す図である。 ｓｉＲＮＡ二本鎖の３’突出部の配列変動を示す図である。 標的認識の配列特異性を示す図である。 保存された２塩基３’突出部を有するｓｉＲＮＡ二本鎖の長さ変動を示す図である。

Claims (39)

1. 単離された二本鎖ＲＮＡ分子であって、各ＲＮＡ鎖が１９〜２３塩基長を有し、少なくとも１つの鎖が１〜３塩基からなる３’突出部を有するものであり、該ＲＮＡ分子は標的特異的なＲＮＡ干渉が可能なものであり、３’突出部を除く該ＲＮＡ分子の１つの鎖が、予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して１００％の同一性を有する配列からなり、かつ、該ｍＲＮＡ標的分子が細胞または生物中に存在するものである、上記ＲＮＡ分子。
2. 各鎖が、２０〜２２塩基長を有する、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
3. ３’突出部が分解に対して安定化されている、請求項１または２に記載のＲＮＡ分子。
4. 少なくとも１つの修飾されたリボヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。
5. 修飾リボヌクレオチドが、糖、骨格鎖または核酸塩基修飾リボヌクレオチドから選択される、請求項４に記載のＲＮＡ分子。
6. 修飾リボヌクレオチドが、糖修飾リボヌクレオチドであり、２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ^１、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２またはＣＮから選択される基で置換され、Ｒは、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである、請求項４または５に記載のＲＮＡ分子。
7. 修飾リボヌクレオチドが、ホスホチオエート基を含む骨格鎖修飾リボヌクレオチドである、請求項４または５に記載のＲＮＡ分子。
8. 下記のステップを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子の作製方法：
   （ａ）各々が１９〜２３塩基長を有する２本のＲＮＡ鎖を合成するステップであって、このＲＮＡ鎖は二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができるものである、上記ステップ、
   （ｂ）二本鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下で合成ＲＮＡ鎖を結合させるステップであって、得られる二本鎖ＲＮＡ分子は標的特異的なＲＮＡ干渉が可能なものである、上記ステップ。
9. ＲＮＡ鎖が化学的に合成される、請求項８に記載の方法。
10. ＲＮＡ鎖が酵素により合成される、請求項８に記載の方法。
11. 下記のステップを含む、動物細胞において標的特異的なＲＮＡ干渉を媒介する方法：
    （ａ）標的特異的なＲＮＡ干渉が起こりうる条件下で、上記細胞を請求項１〜７のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡ分子と接触させるステップ、
    （ｂ）上記二本鎖ＲＮＡと一致する配列部分を有する標的核酸に対する、上記二本鎖ＲＮＡにより引き起こされる標的特異的なＲＮＡ干渉を媒介するステップ。
12. 接触ステップが、二本鎖ＲＮＡ分子を標的細胞に導入し、そこで標的特異的なＲＮＡ干渉を起こさせうるステップを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 導入ステップが、キャリア媒介による送達または注射を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 動物細胞における遺伝子の機能を決定するための、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法の使用。
15. 動物細胞における遺伝子の機能を抑制するための、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法の使用。
16. 遺伝子が病理的状態と関連する、請求項１４または１５に記載の使用。
17. 遺伝子が病原体関連遺伝子である、請求項１６に記載の使用。
18. 遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項１７に記載の使用。
19. 遺伝子が腫瘍関連遺伝子である、請求項１６に記載の使用。
20. 遺伝子が自己免疫疾患関連遺伝子である、請求項１６に記載の使用。
21. 標的遺伝子特異的ノックアウト表現型を示す動物細胞であって、この細胞が、内因性標的遺伝子の発現を阻害しうる少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子、または少なくとも１つの内因性標的遺伝子の発現を阻害しうる少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡでトランスフェクトされているものであり、該二本鎖ＲＮＡ分子は、各ＲＮＡ鎖が１９〜２３塩基長を有し、少なくとも１つの鎖が１〜３塩基からなる３’突出部を有するものであり、かつ、３’突出部を除く該ＲＮＡ分子の１つの鎖が、予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して１００％の同一性を有する配列からなる、上記細胞。
22. 哺乳動物細胞である、請求項２１に記載の細胞。
23. ヒト細胞である、請求項２２に記載の細胞。
24. 標的タンパク質、または該標的タンパク質の変異体もしくは突然変異形態をコードする少なくとも１つの外因性標的核酸でさらにトランスフェクトされた、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の細胞であって、この外因性標的核酸は、二本鎖ＲＮＡ分子による該外因性標的核酸の発現の阻害が、内因性標的遺伝子の発現より低いという点で、該内因性標的遺伝子とは核酸レベルで異なるものである、上記細胞。
25. 外因性標的核酸が、検出可能なペプチドまたはポリペプチドをコードするさらに別の核酸配列と融合される、請求項２４に記載の細胞。
26. 分析手法のための、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の細胞の使用。
27. 遺伝子発現プロフィールを分析するための、請求項２６に記載の使用。
28. プロテオーム分析のための、請求項２６に記載の使用。
29. 外因性標的核酸によってコードされる標識タンパク質の変異体または突然変異形態の分析が実施される、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の使用。
30. 標的タンパク質の機能ドメインを同定するための、請求項２９に記載の使用。
31. 下記のものから選択される少なくとも２つの動物細胞の比較を実施する、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の使用：
    （ｉ）標的遺伝子阻害を含まない対照細胞、
    （ｉｉ）標的遺伝子阻害を含む細胞、および
    （ｉｉｉ）標的遺伝子阻害と、外因性標的核酸による標的遺伝子の相補を含む細胞。
32. 分析が、機能および／または表現型の分析を含む、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の使用。
33. 調製手法のための、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の細胞の使用。
34. 真核細胞からタンパク質またはタンパク質複合体を単離するための、請求項３３に記載の使用。
35. 高分子量タンパク質複合体を単離するための、請求項３４に記載の使用。
36. 高分子量タンパク質複合体が核酸を含む、請求項３５に記載の使用。
37. 薬理学的物質を同定および／または特性決定する手法における、請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の使用。
38. 下記の（ａ）〜（ｃ）を含む、少なくとも１つの標的タンパク質に作用する薬理学的物質の同定および／または特性決定システム：
    （ａ）少なくとも１つの標的タンパク質をコードする少なくとも１つの標的遺伝子を発現することができる、動物細胞、
    （ｂ）上記少なくとも１つの内因性標的遺伝子の発現を阻害することができる、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ分子であって、該二本鎖ＲＮＡ分子は、各ＲＮＡ鎖が１９〜２３塩基長を有し、少なくとも１つの鎖は１〜３塩基からなる３’突出部を有するものであり、かつ、３’突出部を除く該ＲＮＡ分子の１つの鎖が、予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して１００％の同一性を有する配列からなる、上記ＲＮＡ分子、および
    （ｃ）薬理学的特性を同定および／または特性決定しようとする、試験物質または試験物質のコレクション。
39. さらに下記の（ｄ）を含む、請求項３８に記載のシステム：
    （ｄ）上記標的タンパク質または該標的タンパク質の変異体もしくは突然変異形態をコードする少なくとも１つの外因性標的核酸であって、この外因性標的核酸は、二本鎖ＲＮＡ分子による発現の阻害が、上記内因性標的遺伝子の発現より低いという点で、該内因性標的遺伝子とは核酸レベルで異なるものである、上記外因性標的核酸。

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