KR20100031528A - 숙주세포 대사경로의 조절을 통한 바이러스 감염 치료 - Google Patents

숙주세포 대사경로의 조절을 통한 바이러스 감염 치료 Download PDF

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KR20100031528A
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alkyl
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토마스 센크
조슈아 디 래비노비츠
조슈 먼거
브라이슨 베넷
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더 트러스티즈 오브 프린스턴 유니버시티
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Abstract

바이러스 감염에 대한 반응으로 일어나는 특정 대사산물 농도 및 플럭스의 변화를 설명한다. 관련 대사경로의 숙주세포 효소를 중재의 표적으로 선택한다. 즉, 대사 플럭스를 회복시켜 바이러스 복제를 억제하거나, 대사 플럭스를 와해시켜 바이러스 감염세포(단, 감염되지 않은 세포는 제외)의 "자살"을 초래하고 바이러스 증식을 억제한다. 관련 대사경로에 있는 효소 중 어느 것이나 선택 가능하나, 이 대사경로의 주요 조절지점에 있는 중심 효소들이 항바이러스제 표적 후보로 바람직하다. 이 효소들을 억제하는 화합물을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 역전시키거나 전환시킨다. 체외와 숙주세포 및 동물모델에서 선별검사를 사용해 약물 후보의 항바이러스 활성을 시험한다. 그런 다음 동물모델을 사용하여 후보 화합물의 바이러스 감염 예방 및 치료 효능을 시험한다. 효소 억제제의 항바이러스 활성을 입증한다.

Description

숙주세포 대사경로의 조절을 통한 바이러스 감염 치료{TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS BY MODULATION OF HOST CELL METABOLIC PATHWAYS}
본 출원은 2007년 6월 1일 제출된 미국 가출원 번호 60/932,769와 2008년 3월 3일 제출된 미국 가출원 번호 61/033, 243에 대하여 35 U.S.C.§119(e)에 의거해 우선권 특혜를 청구한다. 각 가출원은 인용에 의해 본 문서에 완전히 첨부되어 있다. 본 발명은 부분적으로 베크만 재단의 후원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에 대한 권리를 가질 수 있다.
1. 서론
본 출원은 항바이러스 요법과 항바이러스제의 설계에 관한 것이다.
2. 발명의 배경
일반적으로 항바이러스제의 설계 전략은 바이러스 자체를 공격하는 화합물을 동정하는데 초점을 맞추었다. 가장 일반적인 항바이러스 표적은 비리온의 구조적 성분인 바이러스 단백질과, 바이러스 증식에 필요한 바이러스 게놈이 암호화 된 효소들이었다. 따라서 항바이러스 화합물들은 숙주 세포막과의 바이러스의 부착, 세포 안으로의 바이러스 진입, 바이러스 유전자의 복제, 전사 및 번역, 세포 안에서 비리온의 증식, 및/또는 세포로부터 후대 비리온의 방출에 관여하는 바이러스 단백 질을 저지하도록 설계되고 개발되었다.
그럼에도 바이러스 단백질을 표적으로 삼는 접근법은 다음과 같은 몇 가지 한계가 있다: 1) 바이러스 표적의 제한된 개수; 2) 바이러스 표적이 특정 바이러스나 바이러스 균주에 매우 특정한 경향; 3) 바이러스가 유전적 조성을 급속히 바꿔 항바이러스제에 내성을 발현할 능력.
항바이러스제 개발에 대한 또 다른 접근법은 바이러스 감염 자체에 저항할 약보다는 바이러스 감염에 저항할 숙주의 면역체계를 강화시키는 약을 설계하는 것이다. 이 전략을 사용하여 약들은 숙주가 바이러스 감염에 보다 잘 저항할 수 있게 숙주의 면역체계를 강화하도록 설계된다.
반면에, 세포 표적은 일반적으로 항바이러스 요법의 후보에 그다지 적합하지 않다고 간주되었다. 몇 가지 이유로 항바이러스제는 숙주 효소를 거의 표적으로 삼지 않았는데 숙주 자체에 대한 높은 독성 위험이 가장 큰 이유였다. 숙주 세포 인자들은 바이러스 성장과 증식을 촉진하는데 핵심 역할을 하지만 상기한 숙주 인자들을 공격할 전략은 여전히 불투명한 상태이다.
항바이러스제 개발에 있어 중요한 도전적 과제는 바이러스 감염과 전투할 새로운 전략을 찾는 것이다.
3. 본 발명의 요약
본 발명은 항바이러스 화합물, 상기한 화합물의 선별 방법, 상기한 화합물을 사용한 바이러스 감염의 치료 방법, 및 숙주세포 효소를 겨냥한 항바이러스 요법에 관한 것이다.
바이러스 감염 과정에서 바이러스가 증식하는 데는 숙주세포의 대사망에서 나오는 에너지와 고분자 전구체가 필요하다. 바이러스는 상기한 필요를 충족시키기 위해 여러 경로를 통해 세포 대사 활성을 변경시킨다. 대사 플럭스에서 유도된 변화는 바이러스 생존과 증식의 핵심일 가능성이 높다. 그러나 최근까지는 바이러스 감염이 숙주 대사에 미치는 영향을 평가할 적절한 기술이 없었다.
본 발명은 본 출원인이 대사 플럭스 프로파일링을 위해 개발하여 여기에 "동적 플럭스 프로파일링(kinetic flux profiling)"이라고 칭한 통합 접근법에 일부 기초한다. 상기한 접근법을 사용하여 본 출원인은 바이러스 감염에 대한 반응으로 일부 대사산물 농도와 플럭스가 변경된 것을 발견하였다. 상기한 발견에 기초하여 본 출원인은 대사 플럭스를 회복시켜 바이러스 복제를 억제하거나, 대사 플럭스를 와해시켜 바이러스 감염세포(단, 감염되지 않은 세포는 제외)의 "자살"을 초래하고 바이러스 증식을 억제할 중재의 표적으로서 관련 대사경로의 숙주세포 효소를 선택하였다. 관련 대사경로에 있는 어느 효소든 선택 가능하나, 상기한 대사경로의 주요 조절 지점에 있는 중심 효소들이 항바이러스제의 대표적 후보로 바람직하다. 상기한 효소들을 억제하는 물질을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 역전시키거나 전환시킨다. 약제 후보의 항바이러스 활성을 체외, 숙주세포, 동물모델에서 선별검사를 사용해 시험한다. 그런 다음, 동물모델을 사용하여 후보 화합물의 바이러스 감염 예방 및 치료 효능을 시험한다.
본 문서에 설명된 동적 플럭스 프로파일링 접근법에서, 외피 보유 바이러스(enveloped viruses)는 대사 플럭스 프로파일을 변경한다는 것이 뜻밖에 발견되 었다. 이것은 외피 보유 바이러스는 필요한 에너지를 충족시키기 위해 숙주의 대사 경로를 전환시키는 공통 기제를 사용할 수 있음을 암시한다. 본 발명의 실제예에서 본 출원인은 숙주세포가 감염된 직후, 인간 거대세포바이러스(human cytomegalovirus: HCMV)가 포도당으로부터 지방산이 생합성되는 경로의 플럭스를 증가시켜 지방산을 생산하고/하거나, 포도당-3-인산염 탈수소효소에 의해 포도당을 글리세롤로 전환시킨다는 것을 입증하였다. 따라서 지방산 생합성 경로의 효소들은 핵심 항바이러스제 표적에 속한다. 다양한 실시예에서, 바이러스는 외피를 보유한 바이러스 혹은 외피가 없는 바이러스(즉, 비외피 바이러스)일 수 있다. 상기한 원리의 증거는 상기한 대사경로의 숙주세포 억제제들이 후대 바이러스의 생산을 최소 2로그(log) 억제한다는 것을 보여주는 실제 예들에서 입증된다. 특히, 연장효소 및/또는 지방산 연장에 관련된 효소들, 지방산 불포화효소, 콜레스테롤 대사 및/또는 지질 관련 과정을 조절하는 효소들도 핵심 항바이러스제 표적에 속할 수 있다.
특별한 이론에 구애받지 않고, 상기한 접근법에서 확인된 상기한 후보 항바이러스 화합물들은 바이러스가 대사 필요를 충족하기 위해 숙주 효소를 사용하는 것을 차단함으로써 적어도 부분적으로는 숙주 세포의 대사 활성을 회복시키는 작용을 할 수 있다. 따라서 본 발명은 인간 피험자에서 바이러스 감염에 의해 변경된 대사 플럭스를 전환하는 방법과도 관련이 있으며, 상기 방법은 미리 선정된 화합물의 유효량을 상기한 화합물이 필요한 인간 피험자에게 투여하는 것으로 구성된다. 여기에서 말하는 미리 선정된 화합물은 세포 효소의 억제제이며, 바이러스에 감염된 배양된 세포에서 대사 플럭스를 역전 혹은 전환시키는 작용을 한다.
3.1 용어
본문서에서 "메타볼롬(metabolome)"이란용어는 주어진 일정 시점의 한 세포 내 대사산물의 총체를 말한다
본 문서에서 "약" 혹은 "대략"이란 용어는 수와 함께 사용되는 경우 상기 언급된 수의 1%, 5% 혹은 10% 이내의 수를 의미한다.
본 문서에서 "화합물"이란 용어는 표적 효소의 활성을 억제할 능력을 시험 중인 물질 혹은 표적 효소의 활성을 억제한다고 확인된 물질을 말하며, 여기에는 본 출원에 제시되거나 인용에 의해 본 출원에 첨부된 특정 구조식, 그리고 용매화합물, 수화물, 전구약물, 입체이성질체, 및 상기한 것들의 약학적으로 허용되는 염류가 포함된다. 화합물은 펩티드(상기 펩티드의 이량체 및 다량체 포함), 폴리펩티드, 번역 후 변형 단백질을 비롯한 단백질, 접합체, 항체, 항체 조각 등 단백질성 분자; 무기 또는 유기 화합물을 비롯한 저분자; 두가닥이나 외가닥 DNA 혹은 두가닥이나 외가닥 RNA, 안티센스 RNA, RNA 간섭(RNAi) 분자(예: 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 짧은 머리핀형 RNA(shRNA) 등), 인트론 서열, 삼중나선 핵산 분자, 앱타머(aptamer) 등 핵산 분자; 탄수화물; 및 지질을 포함하나 이에만 국한되지 않는다. 한 실시예에서, 화합물은 (I)-(XLIV) 구조이다. 한 실시예에서, 화합물은 정제된다.
이 문서에서, 화학적으로 합성된 화합물에 관하여"정제된"이란 용어는 실질적으로 화학적 전구체를 함유하지 않은 화합물 혹은 화학적으로 합성된 기타 화학물질을 함유하지 않은 화합물을 말한다. 특정 실시예에서, 화합물은 기타 다른 화 합물을 60%, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 99% 함유하지 않은 화합물이다.
RNAi 분자(예: siRNA, miRNA, shRNA 등) 혹은 RNAi 분자를 생산하기 위한 벡터 구성과 같은 "분리된" 혹은 "정제된" 핵산 서열이나 뉴클레오티드 서열은 재조합 기법에 의해 생산되는 경우, 실질적으로 세포 물질이나 배지를 함유하지 않거나, 화학적으로 합성되는 경우 실질적으로 화학적 전구체를 함유하지 않을 수 있다. 일부 실시예에서, "분리된" 핵산 서열 혹은 뉴클레오티드 서열은 이종 세포에서 재조합되어 표현된 핵산 서열 혹은 뉴클레오티드 서열이다.
본 문서에서, 세포 등의 천연 원료에서 얻을 수 있는 화합물(펩티드와 같은 단백질성 물질 포함)에서 사용된 "정제된" 혹은 '분리된"이란 용어는 실질적으로 상기 천연 원료의 오염 물질, 예를 들어 토양 입자, 광물질, 환경 중의 화학 물질, 및/또는 상기 천연 원료의 세포 내에 존재하는 세포 파편, 세포벽 물질, 막, 소기관, 핵산 덩어리, 탄수화물, 단백질, 및/또는 지질 등을 포함하나 이에만 국한되지 않는 세포성 물질이 함유되지 않은 화합물이나 약제를 말한다. "실질적으로 천연 원료 물질이 함유되지 않은"이란 문구는 화합물 혹은 약제를 분리해낼 물질(예: 세포의 세포성분)에서 분리한 화합물 혹은 약제로 만든 제제를 가리킨다. 그러므로 분리된 화합물에는 세포성 물질 및/또는 오염 물질의 함유량이 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2% 혹은 1%(건조중량 기준) 미만인 화합물 혹은 약제의 제제가 포함된다.
좀 더 일반적인 명칭의 화학 기(chemical group)에 대한 정의는 아래에 기술되어 있다. 본 문서에 공개된 화합물 계열의 몇몇 변수들은 다른 화학 기로 표현되 어 있다. 본 문서에서, 화학 분야 종사자들이 일반적으로 알고 있는 화학 기는 특별한 정의 없이 사용된다.
"C1-x알킬" 기는 탄소 원자가 1개부터 x개까지 있는 직쇄형 혹은 분지형 비고리 포화 하이드로카본이다. 대표적인 -(C1-8알킬)에는 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실, -n-헵틸, -n-옥틸이 있다. 분지형 포화 알킬에는 -이소프로필, -이차부틸, -이소부틸, -삼차부틸, - 이소펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸 등이 있다. -(C1-x알킬) 기는 치환 혹은 무치환 될 수 있다.
"할로겐"과 "할로"라는 용어는 불소, 염소, 브롬, 요오드를 의미한다.
"아릴" 기는 탄소 원자 6 내지 14개가 하나의 고리(예: 페닐)나 여러 개의 밀집된 고리(예: 나프틸 혹은 안트릴)를 이루고 있는 불포화 방향족 탄소고리 작용기이다. 특별한 아릴에는 페닐, 바이페닐, 나프틸 등이 있다. 아릴기는 치환 혹은 무치환 될 수 있다.
"헤테로아릴" 기는 이종원소 방향족 고리 시스템 안에 1 내지 4개의 이종원자가 있고, 나머지 원자는 탄소 원자로 되어 있는 아릴 고리 시스템이다. 적절한 이종원자에는 산소, 황, 질소가 있다. 일부 실시예에서, 이종고리 시스템은 하나의 고리를 가진 모노사이클릭 시스템이거나 두 개의 고리를 가진 바이사이클릭 시스템이다. 제한 없는 예시들은 다음에서 선택된 방향족을 포함한다:
Figure 112009082238916-PCT00001
여기에서, Q는 CH2, CH=CH, O, S 혹은 NH이다. 헤테로아릴기의 대표적 예를 더 들면, 벤조푸라닐(benzofuranyl), 벤조티에닐(benzothienyl), 인돌일(indolyl), 벤조피라졸릴(benzopyrazolyl), 쿠마린일(coumarinyl), 푸라닐(furanyl), 이소티아졸릴(isothiazolyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 이속사졸릴(isoxazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 트리아졸릴(triazolyl), 테트라졸릴(tetrazolyl), 티오페닐(thiophenyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 이소퀴놀리닐(isoquinolinyl), 퀴놀리닐(quinolinyl), 피리디닐(pyridinyl), 피롤릴(pyrrolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 1H-인돌릴(1H-indolyl), 1H-인다졸릴(1H-indazolyl), 벤조[d]티아졸릴(benzo[d]thiazolyl), 및 피라지닐(pyrazinyl) 등이 있다. 헤테로아릴은 어느 고리 원자에서나(즉, 헤테로아릴 고리의 어느 탄소 원자나 이종원자에서나) 결합될 수 있다. 헤테로아릴기는 치환 혹은 무치환 될 수 있다. 한 실시예에서, 헤테로아릴기는 C3-10헤테로아릴이다.
"시클로알킬" 기는 포화 혹은 불포화 비방향족 탄소환 고리이다. 대표적인 시클로알킬기에는 시클로프로필(cyclopropyl), 시클로부틸(cyclobutyl), 시클로펜틸(cyclopentyl), 시클로펜타디에닐(cyclopentadienyl), 시클로헥실(cyclohexyl), 시클로헥세닐(cyclohexenyl), 1,3-시클로헥사디에닐(1,3-cyclohexadienyl), 1,4-시클로헥사디에닐(1,4-cyclohexadienyl), 시클로헵틸(cycloheptyl), 1,3-시클로헵타디에닐(1,3-cycloheptadienyl), 1,3,5-시클로헵타트리에닐(1,3,5-cycloheptatrienyl), 시클로옥틸(cyclooctyl), 시클로옥타디에닐(cyclooctadienyl) 등이 있다. 시클로아킬기는 치환 혹은 무치환 될 수 있다. 한 실시예에서, 헤테로아릴기는 C3-10시클로알킬기이다.
"헤테로시클로알킬" 기는 고리의 탄소 원자들 중 1 내지 4개가 O, S, 및 N으로 구성된 작용기의 이종원자로 독립적으로 대체되어 있는 비방향족 시클로알킬이다. 대표적인 헤테로시클로알킬기로는 모르폴리닐(morpholinyl), 피롤릴(pyrrolyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl), 티에닐(thienyl), 푸라닐(furanyl), 티아졸릴(thiazolyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 트리아졸릴(triazolyl), 피페리지닐(piperizinyl), 이소티아졸릴(isothiazolyl), 이속사졸릴(isoxazolyl), (1,4)-디옥산((1,4)-dioxane), (1,3)-디옥살레인((1,3)-dioxolane), 4,5-디하이드로-1H-이미다졸릴(4,5-dihydro-1H-imidazolyl), 및 테트라졸릴(tetrazolyl) 등이 있다. 헤테로시클로알킬은 어느 고리 원자에서나(즉, 이종아릴 고리의 어느 탄소 원자나 이종원자에서나) 결합될 수 있다. 기헤테로시클로알킬기는 치환 혹은 무치환 될 수 있다. 한 실시예에서, 헤테로시클로알킬은 3 내지 7개 원자의 헤테로시클로알킬이다.
한 실시예에서, 본 문서에 기술된 작용기들이 "치환"된다고 하는 경우, 상기 작용기들은 적절한 치환기(들)로 치환될 수 있다. 치환기의 설명 예들은 이 안에 공개된 예시 화합물 및 실시예에 있는 것들뿐 아니라 다음 것들도 포함한다: 할로겐(염소, 요오드, 브롬, 혹은 불소); C1 -6 알킬; C2 -6 알케닐; C2 -6 알키닐; 하이드록실; C1 -6 알콕실; 아미노; 니트로; 티올; 티오에테르; 이민; 시아노; 아미도; 포스포나토; 포스핀; 카르복실; 티오카르보닐; 술포닐; 술폰아미드; 케톤; 알데하이드; 에스테르; 산소(-O); 할로알킬(예: 트리플루오로메틸); 모노사이클릭이거나 접합 혹은 비접합 폴리사이클릭(예: 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 또는 시클로헥실)일 수 있는 카르보사이클릭 시클로알킬, 혹은 모노사이클릭이거나 접합 혹은 비접합 폴리사이클릭(예: 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 혹은 티아지닐)일 수 있는 헤테로시클로알킬; 카르보사이클릭 혹은 헤테로사이클릭, 모노사이클릭, 혹은 접합 혹은 비접합 폴리사이클릭 아릴(예: 페닐, 나프틸, 피롤릴, 인돌릴, 푸라닐, 티오페닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 아크리디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 벤지미다졸릴, 벤조티오페닐, 혹은 벤조푸라닐); 아미노(일차, 이차, 삼차); o-저급 알킬; o-아릴, 아릴; 아릴-저급-알킬; CO2CH3; CONH2; OCH2CONH2; NH2; SO2NH2; OCHF2; CF3; OCF3.
본 문서에서 "약학적으로 허용되는 염류"라는 용어는 약학적으로 허용되는 비독성산이나 염기(무기 산 및 염기와 유기 산 및 염기를 포함)로 조제된 염류를 말한다. 화합물의 약학적으로 허용되는 적절한 염기 첨가 염류는 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 및 아연으로 만든 금속염 혹은 리신, N, N'-디벤질 에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메그루민(N-메틸글루카민), 및 프로카인으로 만든 유기염을 포함하나 이에만 국한되지 않는다. 적절한 비독성 산은 아세트산, 알긴산, 안트라닐산, 벤젠술폰산, 벤조산, 캄포르술폰산, 구연산, 에텐술폰산, 포름산, 푸마린산, 푸론산, 갈락투론산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루타민산, 글리콜산, 브롬화수소산, 염산, 이스에티온산, 젖산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄술폰산, 뮤신산, 질산, 파모산, 판토텐산, 페닐아세트산, 인산, 프로피온산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 술파닐산, 황산, 타르타르산, 및 p-톨루엔술폰산을 포함하나 이에만 국한되지 않는다. 특정 비독성 산은 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산, 및 메탄술폰산을 포함한다. 따라서, 특정 염류의 예는 염산염과 메실레이트염을 포함한다. 당해 기술의 잘 알려진 기타 예들은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th eds., Mack Publishing, Easton PA (1990) 혹은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th eds., Mack Publishing, Easton PA (1995)을 참고한다.
달리 명시하지 않는 한, 본 문서에서 "수화물"이란 용어는 비공유 분자간 힘으로 결합된 화학량론적인 양의 물 혹은 비화학량론적인 양의 물을 포함하는 화합물이나 그것의 염을 말한다.
달리 명시하지 않는 한, 본 문서에서 "용매화합물"이란 용어는 비공유 분자간 힘으로 결합된 화학량론적인 양의 물 혹은 비화학량론적인 양의 용매를 포함하는 화합물이나 그것의 염을 말한다.
달리 명시하지 않는 한, 본 문서에서 "전구약물(prodrug)"이란 용어는 화합물을 제공하기 위해 생물학적 조건(생체외 혹은 생체내) 하에서 가수분해, 산화, 혹은 기타 반응을 할 수 있는 화합물 유도체를 말한다. 전구약물의 예시는 생가수분해성(biohydrolyzable) 아미드, 생가수분해성 에스테르, 생가수분해성 카바메이트, 생가수분해성 카르보네이트, 생가수분해성 우레이드(ureide) 및 생가수분해성 인산염 유사체와 같은 생가수분해성 성분을 포함하는 화합물의 유도체와 대사산물을 포함하나 이에만 국한되지 않는다. 일부 실시예에서, 카르복실 작용기를 가진 화합물의 전구약물은 상기 카르복실산의 저급 알킬 에스테르이다. 카르복실레이트 에스테르는 분자에 있는 카르복실산 성분 중 어느 성분이든 에스테르화하여 편리하게 형성한다. 전구약물은 잘 알려진 방법들, 예를 들어 Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6th ed. 및 Design and Application of Prodrug(H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers Gmfh에 기술된 방법들을 사용하여 조제할 수 있다
달리 명시하지 않는 한, 본 문서에서 유기 혹은 무기 분자에 관하여 사용된 "입체이성질체" 혹은 "입체이성적으로 순수"(stereomerically pure)라는 용어는 실질적으로 상기 화합물의 다른 입체이성질체를 함유하지 않은 화합물의 한 입체이성질체를 말한다. 예를 들어, 하나의 키랄 중심(chiral center)을 가진 입체이성적으로 순수한 화합물의 경우 실질적으로 상기 화합물의 반대 에난티오머(거울상 이성질체)를 함유하지 않을 것이다. 두 개의 키랄 중심을 가진 입체이성적으로 순수한 화합물은 실질적으로 상기 화합물의 다른 부분입체이성질체(diastereomer)를 함유 하지 않을 것이다. 입체이성적으로 순수한 화합물은 일반적으로 상기 화합물의 한 입체이성질체가 무게비로 약 80% 이상 및 상기 화합물의 다른 입체이성질체들이 무게비로 약 20% 이하를 구성하거나, 상기 화합물의 한 입체이성질체가 무게비로 90% 이상 및 상기 화합물의 다른 입체이성질체들이 무게비로 약 10% 이하, 혹은 상기 화합물의 한 입체이성질체가 무게비로 95% 이상 및 상기 화합물의 다른 입체이성질체들이 무게비로 5% 이하, 혹은 상기 화합물의 한 입체이성질체가 무게비로 약 97% 이상 및 상기 화합물의 다른 입체이성질체들이 무게비로 약 3% 이하를 구성한다. 상기 화합물은 키랄 중심을 갖고 있을 수 있으며, 라세미체(racemate), 개별 에난티오머 혹은 부분입체이성질체, 그리고 상기한 것들의 혼합체일 수 있다. 상기한 모든 이성질 형태 및 그것들의 혼합체는 여기에 공개된 실시예에 포함되어 있다.
다양한 화합물이 한 개 이상의 키랄 중심을 함유하고 있으며, 에난티오머들의 라세미 혼합체, 부분입체이성질체들의 혼합체, 혹은 에난티오머적 혹은 광학적 순수 화합물로 존재할 수 있다. 상기 화합물들의 입체이성적 순수 형태의 사용뿐 아니라, 상기한 형태들의 혼합체의 사용도 여기에 공개된 실시예에 포함되어 있다. 예를 들어, 특정 화합물의 에난티오머들이 동일한 양이나 서로 다른 양으로 구성된 혼합체는 여기에 공개된 방법들과 조성물들에 사용될 수 있다. 상기 입체이성질체들은 키랄 칼럼이나 키랄 분할제와 같은 표준기법을 사용하여 비대칭적으로 합성 혹은 분해될 수 있다. Jacques, J., et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, New York, 1981); Wilen, S. H., et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E. L., Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); 및 Wilen, S. H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E. L. Eliel, Ed., Univ. of . Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972)를 참고한다.
유기 및 무기 분자에 관하여 화합물은 E 및 Z 입체이성질체 혹은 그것들의 혼합체, 그리고 시스 및 트란스 입체이성질체나 그것들의 혼합체를 포함할 수 있다는 점도 주지해야 한다. 일부 실시예에서, 화합물은 E 입체이성질체 또는 Z 입체이성질체로서 분리된다. 다른 실시예에서, 화합물은 E 및 Z 입체이성질체의 혼합체이다.
본 문서에서, 피험자에게 요법을 실시하는 상황에 사용된 "유효량"이란 용어는 다음 효과들 중 한 가지, 두 가지, 세 가지, 네 가지 혹은 그 이상을 달성하기에 충분한 요법의 양을 말한다: (i) 바이러스 감염이나 그로 인한 증상의 심각도를 감소시키거나 호전시킨다; (ii) 바이러스 감염이나 그로 인한 증상의 지속시간을 감소시킨다; (iii) 바이러스 감염이나 그로 인한 증상의 진행을 예방한다; (iv) 바이러스 감염이나 그로 인한 증상의 퇴화를 유발한다; (v) 바이러스 감염이나 그로 인한 증상의 발현 혹은 개시를 예방한다, (vi) 바이러스 감염이나 그로 인한 증상의 재발을 예방한다; (vii) 다른 세포나 다른 조직으로 바이러스가 확산되는 것을 감소시키거나 예방한다; (ix) 다른 피험자에게로 바이러스가 확산되는 것을 예방하거나 감소시킨다; (x) 바이러스 감염으로 인한 기관 부전을 감소시킨다; (xi) 피험자의 입원율을 감소시킨다; (xii) 입원기간을 감소시킨다; (xiii) 바이러스에 감염된 피험자의 생존율을 증가시킨다, (xiv) 바이러스 감염을 제거한다; 및/또는 (xv) 다른 요법의 예방효과나 치료효과를 강화 혹은 호전시킨다.
본 문서에서, 세포 배양 관련 제품에 사용되는 화합물에 관하여 "유효량"이라는 용어는 세포 배양에서 바이러스 역가를 감소시키거나 세포 배양에서 바이러스 복제를 예방하기에 충분한 화합물의 양을 말한다.
본 문서에서, 한 피험자에게 두 가지 이상의 요법을 실시하는 상황에서 "병용"이라는 용어는 하나 이상의 요법(예: 한 가지 이상의 예방약이나 치료제)을 사용하는 것을 말한다. "병용"이라는 용어의 사용은 바이러스에 감염된 피험자에게 실시되는 요법에 대한 처방순서를 제한하지 않는다. 첫 번째 요법(예: 첫 번째 예방약 혹은 치료제)은 바이러스에 감염된 피험자에게 2차 요법을 실시하기 전(예: 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 혹은 12주 전)에, 혹은 투여와 병행하여, 혹은 투여 후(예: 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 혹은 12주 후)에 투여될 수 있다.
문서에서 "감염"이라는 용어는 세포나 피험자에게 바이러스가 침입, 증식 및/또는 존재하는 것을 말한다. 한 실시예에서, 감염은 "활성" 감염, 즉 세포나 피험자에서 바이러스가 복제되고 있는 감염이다. 상기 감염은 바이러스에 처음 감염되었던 세포, 조직, 및/또는 기관으로부터 다른 세포, 조직, 및/또는 기관으로 바이러스가 확산되는 것이 특징이다. 감염은 잠복 감염, 즉 바이러스가 복제되고 있지 않은 감염일 수도 있다. 한 실시예에서, 감염은 세포나 피험자에게 바이러스가 존재하여 혹은 세포나 피험자에게 바이러스가 침입하여 생긴 병리학적 상태를 말한다.
본 문서에서 "라이브러리"라는 용어는 아주 많은 화합물을 말한다. 라이브러리는 조합 라이브러리(combinatorial library), 예를 들어 조합적 화학기법을 사용하여 합성된 화합물 모음이나 특이한 저분자량(1,000 돌턴 이하) 화합물들의 모음일 수 있다.
본 문서에서, 피험자에게 요법을 실시하는 상황에서 사용된 "관리하다", "관리하는", 및 "관리"라는 용어는 요법으로부터 피험자가 얻는 이로운 효과를 말하며, 결과적으로 바이러스 감염의 치유를 달성하는 것은 아니다. 일부 실시예에서, 피험자는 바이러스 감염의 진행이나 악화를 예방하기 위해 질병을 "관리"하기 위한 요법을 한 가지 이상 받는다.
본 문서에서 "감염 다중도(multiplicity of infection)" 혹은 "MOI"는 감염된 세포 당 바이러스의 평균 개수를 말한다. MOI는 첨가된 바이러스의 개수(첨가량 ml x PFU)를 첨가된 세포 수(첨가량 ml x 세포수/ml)로 나누어 구한다.
본 문서에서 "미숙아"라는 용어는 임신 37주가 되기 전에 태어난 영아를 말한다.
본 문서에서 "영아"라는 용어는 1세 미만의 신생아를 말한다.
본 문서에서 "소아"라는 용어는 1세 이상 18세 미만의 유아 및 청소년을 말한다.
본 문서에서 "성인"이라는 용어는 18세 이상의 연령을 말한다.
본 문서에서 "고령자"라는 용어는 65세 이상의 노인을 말한다.
본 문서에서, 바이러스 감염을 예방하기 위해 피험자에게 요법을 실시하는 상황에서 "예방하다", "예방하는", "예방"이라는 용어는 요법이나 병용 요법들의 실시에서 기인하는 다음 효과의 한 가지 이상을 말한다: (i) 바이러스 감염 및/또는 그로 인한 증상의 발현 혹은 개시를 억제; 및 (ii) 바이러스 감염 및/또는 그로 인한 증상의 재발을 억제.
본 문서에서 "예방약"과 "예방약들"은 바이러스 감염이나 그로 인한 증상을 예방하는데 사용될 수 있는 제제(들)을 말한다. 바람직한 예방약은 바이러스 감염이나 그로 인한 증상의 개시, 발현, 진행 및/또는 심각도를 예방하거나 저지하는데 유용하다고 알려져 있거나, 예방하거나 저지하기 위해 사용되어 왔거나, 현재 사용 중인 제제이다.
본 문서에서 "예방적 유효량"이라는 용어는 피험자에게서 바이러스 감염이나 그것의 증상을 예방하는데 충분한 요법(예: 예방약)의 양을 말한다.
본 문서에서 "저분자"라는 용어와 유사 용어들은 펩티드, 펩티드모방체(peptidomimetics), 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 기타 몰분자량이 10,000 그램 이하인 유기 및 무기 화합물(즉, 헤테로유기화합물과 유기금속화합물 포함), 몰 분자량이 5,000 그램 이하인 유기 혹은 무기화합물, 몰분자량이 1,000 그램 이하인 유기 혹은 무기화합물, 몰분자량이 500 그램 이하인 유기 혹은 무기화합물, 몰분자 량이 100 그램 이하인 유기 혹은 무기화합물, 그리고 상기 화합물의 염류, 에스테르 및 약학적으로 허용되는 기타 형태를 포함한다. 상기 화합물의 염류, 에스테르 및 약학적으로 허용되는 기타 형태 역시 포함된다.
본 문서에서 "피험자", 혹은 "환자"라는 용어는 같은 의미로 맞바꿔 사용된다. 본 문서에서 "피험자" 혹은 및 "환자"라는 용어는 동물(예: 조류, 파충류, 포유류), 바람직하게는 비영장류(예: 낙타, 당나귀, 얼룩말, 암소, 돼지, 말, 염소, 양, 고양이, 개, 쥐, 및 생쥐)와 영장류(예: 원숭이, 침팬지, 및 인간)를 포함한 포유류, 및 가장 바람직하게는 인간을 말한다.
본 문서에서 "요법들"과 "요법"은 바이러스 감염이나 그로 인한 증상의 예방, 치료, 관리, 또는 호전에 사용될 수 있는 프로토콜(들), 방법(들), 조성물, 제형, 및/또는 제제를 의미할 수 있다. 일부 실시예에서, "요법들"과 "요법"은 바이러스 감염이나 그로 인한 증상의 예방, 치료, 관리, 또는 호전에 유용하다고 당업자에게 알려진 생물학적 요법, 지지 요법, 및/또는 기타 요법을 말한다.
본 문서에서, 요법의 효과에 관하여 사용된 "상승(synergistic)"이란 용어는 병용 요법들의 효과가 두 개 이상의 개별 요법의 효과를 더한 것보다 더 효과적인 것을 말한다. 특정 실시예에서, 병용 요법들이 상승 효과가 있으면 바이러스 감염 피험자에게 한 개 이상의 요법들의 용량을 줄이고/이거나 상기 요법의 실시 빈도를 줄일 수 있다. 일부 실시예에서, 요법(예: 예방약이나 치료제)의 저용량을 사용할 능력이나 및/또는 상기 요법의 실시 빈도를 줄일 능력은 바이러스 감염의 예방이나 치료에서 상기 요법의 효능을 감소시키지 않으면서 피험자에게 상기 요법의 실시로 인한 독성을 감소시킨다. 일부 실시예에서, 상승 효과는 바이러스 감염의 예방, 관리, 및/또는 치료에서 요법들(예: 예방약이나 치료제)의 효능 향상을 가져온다. 일부 실시예에서, 요법(예: 예방약 또는 치료제) 병용의 상승 효과는 단일 요법의 사용에 관련된 이상반응 또는 원치 않는 부작용을 방지하거나 감소시킨다.
본 문서에서 "치료 유효량"이란 용어는 바이러스 감염을 치료 및/또는 관리하기에 충분한 요법의 양을 말한다. 본 문서에서 "치료제"와 "치료제들"은 바이러스 감염이나 그로 인한 증상의 예방, 치료, 및/또는 관리에 사용될 수 있는 제제(들)를 말한다. 바람직한 치료제는 바이러스 감염이나 그로 인한 증상의 예방, 치료, 및/또는 관리에 유용하다고 알려지거나, 상기 목적으로 사용되어 왔거나, 현재 사용 중인 제제이다.
본 문서에서, 바이러스 감염을 치료하기 위해 피험자에게 요법(들)을 실시하는 상황에서 "치료하다", "치료", "치료하는"이라는 용어는 요법이나 병용 요법들의 실시에서 기인하는 다음 효과들의 한 가지, 두 가지, 세 가지, 네 가지, 다섯 가지, 혹은 그 이상을 말한다: (i) 바이러스 감염 및/또는 그로 인한 증상의 심각도를 감소시키거나 호전시킴; (ii) 바이러스 감염 및/또는 그로 인한 증상의 지속시간을 감소; (iii) 바이러스 감염 및/또는 그로 인한 증상을 퇴화; (iv) 바이러스의 역가를 감소; (v) 바이러스 감염으로 인한 기관 부전을 감소; (vi) 피험자의 입원율을 감소; (vii) 입원기간을 감소; (viii) 피험자의 생존율을 증가; (ix) 바이러스 감염을 제거; (x) 바이러스 감염 및/또는 그로 인한 증상의 진행을 억제; (xi) 바이러스가 세포나 조직, 피험자에게서 또 다른 세포나 조직, 피험자에게로 확산되는 것을 예방 및/또는 (xii) 다른 치료법의 예방효과나 치료효과를 강화 혹은 향상.
4. 도면의 설명
도 1. 바이러스 분류 개략적 도식.
도 1은 바이러스군의 분류와 그것들의 구조적 특징을 보여준다. 도 1은 Flint 등이 기술한 Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis and Control of Animal Virus (2nd edition, ASM Press, 2003)에 나와 있는 도면을 수정한 것이다. 상기 도면은 화합물의 항바이러스 활성을 평가할 수 있는 바이러스 집단을 보여준다.
도 2. 거대세포바이러스(CMV) 감염은 당분해 유출을 지방산 생합성으로 유도한다.
도 2A는 비표지에서 균일 13C-포도당으로 전이된 CMV 감염 세포에서 대사산물 표지 패턴을 관찰한 동적 플럭스 프로파일링(kinetic flux profiling) 실험의 결과이다. 짙은 회색 부분은 급속하게 완전히 표지된 것으로 밝혀진 화합물들이고, 짙은 회색/밝은 회색이 섞여 있는 부분은 부분적으로 표지된 화합물들이며, 밝은 회색으로만 되어 있는 부분은 비표지된 화합물들이다. 아세틸 보효소 A(AcCoA)의 표지는 아세틸 성분에 한정되었고, 구연산의 표지는 AcCoA에서 직접 나오는 두 개의 탄소(C) 원자에 한정되었다. 관측된 표지 패턴에 일치하는 경로들은 실선으로 표시되어 있으며, 피루브산(pyruvate)로부터 지방산 생합성으로 이어진다. 점선은 거의 비활성으로 보이는 주요 대사경로들을 나타낸다. 이 경로들의 활성은 관측된 표지 패턴과는 실질적으로 다른 표지 패턴을 보일 것이다. 도 2B는 도 2A를 만드는데 사용된 예시적 동력학 데이터이다. 구연산 표지 동력학 대 말산 표지 동력학 비교는 핵심 정보를 제공한다. 상기 두 동력학은 지질 생합성을 위한 구연산 사용(이 과정은 말산 표지를 초래하지 않는다)과 삼카르복실산(TCA) 사이클을 작동시키기 위한 구연산 사용(이 과정에서는 말산이 구연산과 유사한 동력학으로 표지될 것이고, 결국 더 많이 표지된 구연산이 나타날 것이다)의 차이를 드러낸다. 예시 2를 참고한다.
도 3. CMV 감염은 14C-포도당으로부터 지질의 신생 합성(de novo synthesis)을 유도한다. 예시 4를 참고한다.
도 4. C75는 HSV 바이러스 복제를 억제한다.
도 4는 C75가 단순포진바이러스(HSV)에 감염된 일차 섬유모세포 MRC-5 세포들에서 HSV 복제를 효과적으로 억제하였음을 보여준다. C75는 HSV 바이러스 복제를 2 로그(log) 이상 감소시켰다. 예시 8을 참고한다.
도 5. C75는 HCMV 바이러스 복제를 억제한다.
도 5는 C75가 HCMV에 감염된 일차 섬유모세포 MRC-5 세포들에서 HCMV 복제를 효과적으로 억제하였음을 보여준다. C75는 HCMV 바이러스 복제를 3 로그(log) 이상 감소시켰다. 예시 8을 참고한다.
도 6. 에토목서(Etomoxir)는 HCMV 바이러스 복제를 억제한다.
도 6은 에토목서가 HCMV에 감염된 일차 섬유모세포에서 HCMV 복제를 효과적으로 억제하였음을 보여준다. 에토목서는 HCMV 바이러스 복제를 1 로그(log) 이상 감소시켰다. 예시 8을 참고한다.
도 7A 및 도 7B. CMV 감염은 당분해 화합물과 관련 화합물의 대사 플럭스를 지배한다.
도 7A와 도 7B는 모의감염된(mock-infected) 인체 섬유모세포와 CMV에 감염된 인체 섬유모세포에서 당분해 화합물 및 관련 화합물의 표지 동력학을 보여준다. 예시 9의 6.9.1절을 참고한다.
도 8. CMV 감염은 뉴클레오티드 3인산염과 그것들의 전구체 PRPP의 대사 플럭스를 지배한다.
도 8은 모의감염된 인체 섬유모세포("2"로 표지)와 CMV에 감염된 인체 섬유모세포("1"로 표지)에서 뉴클레오티드 3인산염과 그것들의 전구체 PRPP의 표지 동력학을 보여준다. 예시 9의 6.9.2절을 참고한다.
도 9A 및 도 9B. CMV 감염은 TCA 사이클 화합물들의 대사 플럭스를 지배한다: 포도당 표지.
도 9A와 도 9B는 TCA 사이클 화합물들의 표지 동력학과 상기 화합물들의 분할 표지를 보여준다. 예시 9의 6.9.3절을 참고한다.
도 10A 및 도 10B. CMV 감염은 TCA 사이클 화합물들의 대사 플럭스를 지배한다: 글루타민 표지.
도 10A와 도 10B는 TCA 사이클 화합물들의 표지 동력학과 상기 화합물들의 분할 표지를 보여준다. 예시 9의 6.9.4절을 참고한다.
도 11. CMV 감염 세포의 중앙 탄소 대사 흐름의 개략 도식.
도 11은 바이러스에 감염된 세포들 내에서 일어나는 중앙 탄소 대사 흐름의 개략 도식을 보여준다. 음영 부분은 포도당과 포도당 대사산물을 나타내고, 음영이 없는 부분은 글루타민과 글루타민 대사산물을 나타낸다. 예시 9의 6.9.5절을 참고한다.
도 12. 바이러스 감염에 대한 세포 반응의 메타볼롬 및 플럭스 통합 분석.
도 12는 바이러스 감염에 대한 세포 반응의 메타볼롬 및 플럭스 통합분석을 개요한 것이다. 이에 대한 상세한 내용은 6절에 기술되어 있다.
도 13. HCMV 복제 억제에서 C75와 TOFA의 용량 반응.
도 13은 10 ㎍/mL의 C75와 TOFA는 HCMV에 감염된 일차 섬유모세포에서 바이러스 복제를 대략 1로그 감소시키는데 충분하였음을 보여준다. 오차 막대는 2회 중복 측정치들의 표준편차이다. 예시 11를 참고한다.
도 14. HCMV 복제 억제에서 TOFA의 용량 반응.
도 14는 20 ㎍/mL의 TOFA가 HCMV에 감염된 일차 섬유모세포에서 바이러스 복제를 대략 2로그 감소시키는 결과를 가져왔음을 보여준다. 오차막대는 2회 중복 측정치들의 표준편차이다. 예시 12를 참고한다.
도 15A-B. HCMV 및 인플루엔자 A 바이러스의 복제에 대한 C75와 TOFA의 효과.
도 15A는 10 ㎍/mL의 C75와 TOFA는 HCMV 감염(감염다중도(MOI)는 3.0으로 높 았음) 96시간 뒤 감염성 HCMV 비리온의 바이러스 생산(PFU/ml)이 각각 100배 이상과 1,000배 이상 감소하는 결과를 가져왔음을 보여준다. 도 15B는 10 ㎍/mL의 C75와 TOFA는 인플루엔자 A 감염(감염다중도(MOI)는 0.1) 24시간 뒤 감염성 인플루엔자 A 비리온의 바이러스 복제가 각각 10배 이상과 1,000배 이상 감소하는 결과를 가져왔음을 보여준다. 예시 13를 참고한다.
도 16. 중심 대사 및 중심대사와 생합성과의 연관성에 대한 회로도.
도 16은 중심 대사 및 중심 대사와 생합성과의 연관성에 대한 회로도이다. 상기 회로도는 예시 14에 기술된 바와 같은 상미분방정식(ODE)을 세우는데 기초로 사용되었다.
도 17. HCMV에 감염된 섬유모세포의 메타볼롬에 대한 TOFA의 효과.
도 17은 모의감염 섬유모세포(회색 막대), HCMV 감염 섬유모세포(줄무늬 막대), TOFA를 함유한 배지에서 배양된 HCMV 감염 섬유모세포(흑색 막대)에서 말로닐-CoA, NADP+, NADPH, 및 구연산의 배수 변화(모의감염 세포 대비)를 보여준다. 바이러스에 의해 유도되는 말로닐-CoA 상승과 세포 NADPH 고갈(NADP+ 상승)이 TOFA에 의해 차단되어 있다. 예시 22를 참고한다.
도 18. 항HCMV 활성을 가진 이중 ACC1/ACC2 억제제.
도 18은 이중 ACC1/ACC2 억제제 화합물들의 구조, 체외 및 설치류에서 상기 화합물들의 개별 IC50 값, 및 바이러스 복제를 억제하는데 있어 상기 각 화합물의 항HCMV 효과를 보여준다. 예시 23를 참고한다.
도 19. 항HCMV 활성을 가진 선택적 ACC2 억제제.
도 19는 선택적 ACC2 억제제 화합물들의 구조, 체외에서 ACC2와ACC1 억제에 대한 상기 화합물의 IC50 값, 및 바이러스 복제를 억제하는데 있어 상기 각 화합물의 항HCMV 효과를 보여준다. 예시 23를 참고한다.
도 20. ACC 억제제들의 항바이러스 효과.
도 20은 명시된 ACC 억제 화합물들이 바이러스 수율(pfu/ml)에 미치는 효과를 나타낸 막대 그래프이다. 상기 막대 그래프는 표 13에 제시된 원시데이터에 대응한다. 예시 23을 참고한다.
도 21. 고해상 질량분석기를 사용해 바이러스 감염에 의해 상향 조정된 대사경로를 식별한 결과.
도 21은 모의감염 세포의 추출물 또는 HCMV 감염세포의 추출물을 액체크로마토그래피-고해상 질량분석기(LC-HRMS)에서 오르비트랩(Orbitrap) 장치의 완전 스캔모드로 분석한 실험의 데이터이다. 상기 그래프는 모의감염 세포 추출물 또는 HCMV 감염 세포 추출물의 신호강도 대 신호시간을 나타낸다. 상기 실험에서, N-아세틸-아스파르테이트(NAA)는 HCMV 감염 세포에서 생산이 증가한 대사산물로 확인되었다. 예시 24를 참고한다.
도 22. 3-메틸아데닌은 HCMV 바이러스 복제를 억제한다.
도 22는 감염 후 경과일수(dpi) 대비 HCMV 감염 단위(infectious unit)를 나타낸 그래프이다. 상기 그래프는 3군 PI(3) 활성효소의 억제자인 3-메틸아데닌이 항바이러스 활성이 있음을 보여준다. 예시 25를 참고한다.
5. 발명의 상세한 설명
바이러스 복제는 숙주세포의 대사망에서 기인한 에너지와 고분자 전구체를 필요로 한다. 본 발명인들은 대사 플럭스 프로파일링에 대한 통합 접근법을 사용하여, 바이러스 감염에 대한 반응으로 일부 대사산물의 농도와 플럭스가 변경되었음을 발견하였다. 이러한 발견에 기초하여 다양한 대사경로의 효소들, 특히 핵심 "스위치"로서 작용하는 효소들을 중재 표적, 즉 바이러스 복제를 저지하고 정상적인 대사 플럭스 프로파일을 회복시키기 위해 대사 플럭스를 전환시킬 표적으로 선택하여 항바이러스 요법의 표적으로 사용하였다. 대사경로의 최초 단계에 관여하는 효소들이 바람직한 효소 표적들이다. 또한, 대사경로에서 "비가역" 반응 혹은 개입 단계(committed step)에 촉매작용을 하는 효소들도 항바이러스 요법의 효소 표적으로서 유리하게 사용될 수 있다.
예를 들어, 당분해 유출을 지방산 생합성으로 유도하는 바이러스 감염은 지방산 생합성을 봉쇄함으로써 치료될 수 있다. 지방산 생합성에 관여하는 어느 효소나 표적으로서 사용될 수 있지만, 포도당을 지방산으로 전환시키는 개입단계에 관여하는 효소들이 표적으로 바람직하다. 예를 들어, 이러한 효소에는 아세틸 CoA 카르복실라제(ACC), 이것의 상류 조절자(upstream regulator)인 AMP 활성 단백질 활성효소(AMPK), ATP 구연산 분해효소 등이 포함되나 이에만 국한되지 않는다.
연장효소(Elongase) 및/또는 지방산 연장에 관련된 효소, 지방산 불포화효소(예를 들어, 스테아로일-CoA 불포화효소(SCDs), 델타-6-불포화효소, 델타-5-불포화효소 등을 포함하나 이에만 국한되지 않음), 콜레스테롤 대사 및/또는 지질 관련 과정을 변화시키는 효소도 주요 항바이러스제 표적이 될 수 있다.
또 다른 예시로서, 바이러스 감염은 암모니아 편입을 지배하는 질소 플럭스를 변경시킬 수 있다. 글루탐산 탈수소효소와 글루탐산분해효소 등을 비롯한(이에만 국한되지 않음) 이 대사경로의 효소 표적들은 바이러스 감염 세포에서 질소 흐름을 전환시키는데 사용될 수 있다.
아래 소절들에는 본 발명의 표적 효소들, 상기 표적 효소들을 억제하는 성질이 있어 항바이러스 화합물로 사용될 수 있는 화합물들, 새로운 항바이러스 화합물들을 식별하고 특성화하기 위한 선별검사, 상기 화합물들을 바이러스 감염의 치료와 예방을 위한 항바이러스 요법으로 사용할 방법들이 상세히 기술되어 있다.
5.1 숙주세포 표적 효소
바이러스 감염에 대한 반응으로 대사산물의 농도 및/또는 플럭스가 변조되는 세포 대사경로의 효소는 항바이러스 중재의 표적으로서 고려된다. 특정 실시예에서, 지방산 생합성 및 대사에 관여하는 숙주 효소가 항바이러스 중재의 표적이다. 바이러스는 숙주의 대사 플럭스를 변조하여 예를 들어, 포도당에서 지질로 숙주세포의 정상적 에너지 흐름을 간섭한다는 발견에 기초하여, 이러한 경로에 관여하는 숙주 효소들이 항바이러스제 표적으로서 동정되어 왔다. 항바이러스 중재의 표적이 되는 상기 효소들의 비제한적 예시들이 표 1에 도시되어 있다.
관측된 아세틸-CoA 플럭스(특히, 세포질 아세틸-CoA를 통한 플럭스)의 증가와 그것에 관련된 지방산 신생(de novo)생합성의 증가는 바이러스, 특히 외피보유 바이러스에게 많은 기능을 한다. 예를 들어, 지방산 신생 합성은 인지질 합성에 전구체를 제공하고, 인지질은 여러 기능 중에서도 바이러스 외피 형성에 기여한다. 중요한 것은, 새로이 합성된 지방산과 인지질은 바이러스에게 외피의 화학적 조성과 물리적 특징(예를 들어, 인지질 지방 아실 사슬 길이 혹은 및/또는 탈포화, 및 관련 외피 유동성) 조절 등의 목적에 필요할 수 있다는 점이다. 원래 있던 세포 인지질은 바이러스 성장과 복제를 지원하기에는 절대적인 양, 화학적 조성, 혹은 물리적 속성 면에서 불충분할 수 있다.
따라서, 인지질 생합성의 어느 단계에서의 억제제든 항바이러스제가 될 수 있다. 상기 단계는 초기 지방산 생합성을 바이러스 인지질의 합성에 적절한 지방 아실-CoA 화합물의 합성에 연결하는 단계를 포함한다. 이 단계들에는 지방산 연장과 불포화 등도 포함하나 이에만 국한되지 않는다. 지방산 연장은 지방산 합성효소(FAS)의 종말 산물인 팔미토일-CoA (C16-지방산)를 취하여(예를 들어, C18과 더 긴 지방산을 형성하기 위해) 그것을 두 개의 탄소 단위만큼 연장시킨다. 여기에 관여하는 효소가 연장효소다. C18과 더 긴 지방산의 형성은 바이러스 외피의 화학적 조성 및 물리적 속성의 조절뿐 아니라, 다른 바이러스 기능에도 필요하므로 연장효소의 억제제들은 바이러스 성장 및/또는 복제의 억제제로도 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 지방산 신생 생합성 효소(예를 들어, 아세틸-CoA 카르복실라제와 지방산 합성효소)를 억제하여 바이러스 감염을 치료하기 위한 화합물 외에도, 연장효소 및/또는 지방산 연장 관련 효소들의 억제를 통해 바이러스 감염을 치료하기 위한 화합물도 포함한다. 알파-리놀레닉산 특이 연장효소 등을 비롯한(이에만 국한되지 않음) 연장효소들이 이 분야에서 제안되어 왔다. 인용에 따라, 본 문서에 첨부된 미국특허 출원 공개번호 US 2005/0089981 A1과 US 2005/00009140 A1을 참고한다.
포유류에서 단일불포화 지방산의 주 생산 경로는 팔미토일-CoA를 주요 기질로 사용한다. (팔미토일-CoA는 지방산 합성효소(FAS)의 산물이며, 생산에는 아세틸-CoA 카르복실라제([ACC])와 스테아로일-CoA(연장효소의 최초 산물)에 의한 세포질 아세틸-CoA의 카르복실화가 필요하다). 주요 효소는 스테아로일-CoA 불포화효소(SCD) 1 - 5이다(일반적으로 지방산 불포화효소 1 혹은 델타-9-불포화효소라고도 한다). SCD 동종효소 1과 5는 인간을 비롯한 영장류에서 발현되고(Wang et al ., Biochem. Biophys. Res. Comm. 332:735-42, 2005), 따라서 이 효소들이 필요한 인간 환자에게서 바이러스 감염을 치료하는 데 있어 표적이다. 기타 동종효소들은 기타 포유류에서 발현되고, 따라서 그 효소들이 발현되는 종에서 바이러스 감염을 치료하는 데 표적이 된다. 그러므로, 지방산 신생 생합성 효소(예: 아세틸-CoA 카르복실라제와 지방산 합성효소)의 억제를 통해 바이러스 감염을 치료하기 위한 화합물 외에도, 본 발명에는 지방산 탈포화 효소들(예: SCD1, SCD2, 고도 불포화 지방산 형성에 관여하는 효소들(예: 델타-6-불포화효소, 델타-5-불포화효소))의 억제를 통해 바이러스 감염을 치료하기 위한 화합물도 포함한다. 예시적 SCD억제제들은 5.2절에 기술되어 있다.
위에서 살펴본 바와 같이, 지질 관련 과정의 조절은 바이러스의 성장, 복제, 및/또는 기타 감염 요소에 필수적이다. 이 과정의 중요성은 부분적으로는 바이러스가 세포성 막(즉, 형질막이나 세포질 세망 같은 세포내 막구조)의 조성 및/또는 물리적 속성을 조절할 필요에서 기인하고, 부분적으로는 외피보유 바이러스가 외피의 조성 및/또는 물리적 속성을 조절할 필요에서 기인한다. 과거에는 인지되지 못했던 이 조절의 중요성은 부분적으로는 여기 기술된 메타볼롬 및 플럭스 프로파일링 실험들에서 세포질 아세틸-CoA 같은 콜레스테롤 생합성에 관련된 대사산물을 통해 플럭스가 극적으로 증가한 것이 관찰되면서 드러났다. 포유류 세포막의 주요 구성분은 콜레스테롤(및 콜레스테롤 유도체들)이다. 지방 아실기의 사슬 길이 및 불포화처럼 콜레스테롤은 막/외피의 유동성, 빙점 등 물리적 속성을 조절하는 데 핵심 역할을 한다. 인지질 조성의 세부정보처럼 콜레스테롤 백분율은 막 단백질의 속성 및/또는 지질 신호(lipid signaling) 기능에도 영향을 줄 수 있다. 이러한 현상의 일부나 전부가 바이러스 감염에서 핵심 역할을 하기 때문에 콜레스테롤 대사의 억제제나 기타 조절제(modulator)는 항바이러스제로 작용할 수 있다. 예컨대, 스테롤 류(sterol family)의 아세틸-CoA 아세틸전이효소, HMG-CoA 합성효소, HMG-CoA 환원효소, 메발로네이트 활성효소, 포스포메발로네이트 활성효소, 이소펜틸이인산 이성질화효소, 게라닐-이인산 합성효소, 파르네실-이인산 합성효소, 파르네실-이인산 파르네실전이효소, 스쿠알렌 모노옥시게나제, 라노스테롤 합성효소, 및 관련 디메틸라제, 옥시다제, 환원효소, 이성질화효소, 및 불포화효소의 억제제들은 항바이러스제로 작용할 수 있다. HMG-CoA 환원효소 억제제들과 그것들의 구조는 당업계에 잘 알려져 있다. 예시적인 HMG-CoA 환원효소 억제제들은 5.2절에 기술되어 있다.
지방산 생합성 효소의 억제제들은 일반적으로 바이러스 감염을 치료하는 데 유용성이 있는데, 특히 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC)는 바이러스 감염 치료에 특별히 중요한 표적이 될 수 있는 특정한 속성이 있다. ACC는 지방산 생합성을 통해 플럭스를 조절할 독특한 입장에 있다. 잠재적 항바이러스 표적인 상류 효소(upstream enzyme) (예: 피루브산 탈수소효소, 구연산 합성효소, ATP-구연산 분해효소, 아세틸-CoA 합성효소)는 다중 반응경로에 관여하는 산물들을 생성하는 반면에, ACC는 지방산 경로의 개입기질(committed substrate)인 말로닐-CoA를 생성한다. 아세틸-CoA 합성효소와 ATP-구연산 분해효소는 세포질 아세틸-CoA를 생성할 잠재력이 있다. 따라서 어떤 상황에서는 이 두 효소 중 하나가 나머지 하나를 대신할 수 있다. 이와는 달리, 말로닐-CoA는 아세틸-CoA의 카르복실화(ACC 반응) 이외에는 다른 적절한 대체 반응경로가 없다. 이런 면에서, ACC 표적화는 상류반응 표적화보다 지방산 생합성을 좀더 완전하고 특이적으로 조절한다.
ACC 표적화의 하나의 대안 혹은 추가 방법으로서, FAS 표적화도 전반적으로 지방산 신생 생합성을 적절히 조절할 수 있다. ACC 표적화 대 FAS 표적화의 핵심적 차이는 ACC의 기질(아세틸-CoA)은 여러 경로에 사용된다는 것이다. 따라서 ACC 표적화에서는 다른 경로들이 ACC를 소비할 수 있기 때문에 아세틸-CoA가 꼭 현저히 증강되지는 않는다. 이와는 달리 FAS의 기질(말로닐- CoA)은 대개 FAS가 소비한다. 그래서 FAS 표적화에서는 말로닐-CoA가 현저히 증강되는 경향이 있다. 그런 증강은 일부 경우에는 바이러스 감염의 치료에 효용을 가질 수도 있지만 다른 경우에는 부작용에 기여할 수도 있다. 그런 부작용은 (1) 말로닐-CoA의 중요한 신호(signaling) 기능과 대사조절 기능, 및 (2) 포유류에서 생체내 부작용이 미미한 현 FAS 억제제의 부재를 생각하면 특히 중요한 문제이다. 세포내 말로닐-CoA의 상승을 가져오는 FAS 억제는 세포성 DNA 복제의 봉쇄를 동반한 세포주기 정지와 세포자멸 개시를 유발할 수 있다(Pizer et al ., Cancer Res. 56:2745-7, 1996; Pizer et al ., Cancer Res. 58:4611-5, 1998; Pizer et al ., Cancer Res. 60:213-8, 2000). 그리고 이 해로운 반응이 FAS 억제제에 의한 바이러스 복제의 억제를 설명해 줄 가능성이 있다는 주장도 제기되었다(Rassmann et al ., Antiviral Res. 76:150-8, 2007). 이와는 달리, TOFA 같은 ACC 억제제들은 포유류에게 유해성이 극히 적다. Gibson 등의 "Toxicity and teratogenicity studies with the hypolipidemic drug RMI 14,514 in rats", Fundam . Appl . Toxicol . 1981 Jan-Feb; 1(1): 19-25를 참고한다. 예를 들어, 쥐에서 TOFA의 경구 LD50은 5,000 mg/kg 이상일 수 있고, 6개월 동안 100 mg/kg/1일 용량에서 아무런 유해효과가 발견되지 않는다. 또한, TOFA는 150 mg/kg/1일 용량에서 쥐에게 기형유발 효과를 나타내지 않는다. ACC 억제제에 대한 비제한적 예시들은 5.2절에 기술되어 있다.
중요한 점으로, ACC는 인간에서 두 동종효소, ACC1과 ACC2로 존재한다. 이 안에 기술된 화합물들은 ACC의 동종효소 특이 억제제를 포함하나 이에만 국한되지는 않는다. 동종효소 선택적 화합물들은 5.2절에 기술되어 있다.
특정 바이러스 감염과 특정 감염부위(예: 뇌, 말초신경계, 피부, 연결조직, 간, 심장, 지방 등)에 따라서는, ACC의 동종효소를 1개만 표적화하는 것이 (동종효소 특이 약제의 사용에 의해 감소될) 위험도 대비 ACC 억제제 요법의 항바이러스 치료 이득을 최적화할 수 있다. 일반적으로, 표적으로 삼기에 바람직한 동종효소는 (1) 가장 중요한 특정 감염조직에서 지배적인 동종효소, 혹은 및/또는 (2) 중요한 특정 바이러스에 의해 활성이 아주 심하게 상향조정되는 동종효소일 것이다.
특정 실시예에서, 당분해 경로에 관여하는 숙주 효소들이 항바이러스 중재의 표적이다. 한 실시예에서, 삼카르복실산(TCA) 사이클의 숙주 효소들이 항바이러스 중재의 표적이다. 특정 실시예에서, 지방산 대사 및 생합성에 관여하는 숙주 효소들이 항바이러스 중재의 표적이다. 특정 실시예에서, 지방산 산화에 관여하는 숙주 효소들이 항바이러스 중재의 표적이다. 일부 실시예에서, 지방산 생합성에 관여하는 숙주 효소들이 항바이러스 중재의 표적이다. 한 실시예에서, 콜레스테롤 생합성 및 대사에 관여하는 숙주 효소들이 항바이러스 중재의 표적이다. 한 실시예에서, 포도당 운반에 관여하는 숙주 효소들이 항바이러스 중재의 표적이다. 한 실시예에서, 바이러스는 숙주의 대사 플럭스를 변조한다는 우리의 발견에 따라, 양성자 ATP아제(proton ATPase) 같은 장벽을 통과하는 이온 항상성 및 에너지 운반에 관여하는 세포 구성분들이 항바이러스 중재의 타당한 표적이다. 이 발명의 예시적 표적 효소들은 표1 에 나와 있다. 이 경로들이나 세포 대사에 관련된 다른 경로의 기타 효소들도 이 중재의 화합물의 잠재 표적이다. 일부 실시예에서, 효소는 지방산 생합성의 효소가 아니다. 중 일부 실시예에서, 표적 효소는 지방산 분해에 관여하는 효소가 아니다. 일부 실시예에서, 효소 표적은 콜레스테롤 생합성이나 대사에 관여하지 않는다. 일부 실시예에서, 표적이 될 효소는 당분해 경로의 일부가 아니다. 특정 실시예에서, 효소는 TCA 사이클의 일부가 아니다. 일부 실시예에서, 효소 표적은 지방산 합성효소가 아니다. 일부 실시예에서, 효소는 ATP 구연산 분해효소가 아니다. 일부 실시예에서, 효소 표적은 아세틸-CoA 카르복실라제가 아니다. 일부 실시예에서, 표적은 AMP-활성 단백질 활성효소가 아니다. 일부 실시예에서, 효소는 카르니틴 팔미토일 전이효소(CPT1)가 아니다. 일부 실시예에서, 효소는 말로닐-CoA 디카르복실라제가 아니다. 일부 실시예에서, 효소는 메틸말로닐-CoA뮤타제가 아니다. 일부 실시예에서, 효소는 글루탐산염 탈수소효소가 아니다. 일부 실시예에서, 효소는 HMG-CoA 합성효소가 아니다. 일부 실시예에서, 항바이러스 중재의 표적이 될 효소는 리소포스파티드산 아세틸전이효소 혹은 리소포스파티드산 아실전이효소가 아니다. 기타 실시예에서, 효소는 스테아로일-CoA 불포화효소(SCD)가 아니다. 일부 실시예에서, 효소는 델타-6-불포화효소가 아니다. 일부 실시예에서, 효소는 델타-5-불포화효소가 아니다.
일부 실시예에서, 인지질 생산 이나 및/또는 인지질 활성 조절에 관여하는 숙주 효소가 항바이러스 중재의 표적이다. 인지질 종류는 다양한 머리 기(head group)(예: 클로라인(choline), 세린(serine), 이노시톨(inositol) 등)를 동반해 생성된다. 상기 종류들의 생산은 지방산, 글리세롤, 및 머리 기의 가용성에 좌우된다. 따라서, 바이러스 감염세포에서(혹은 바이러스 감염세포에 영양을 공급하는 세포에서) 이런 화학 성분들의 동화나 생합성의 억제는 항바이러스 효과가 있을 수 있다. 나아가, 인지질을 생산할 이들 구성분들의 농축을 억제하거나 결과적인 인지질 산물의 추후 대사를 억제하는 것도 항바이러스 효과가 있을 수 있다.
다양한 인지질 종류 중에서도 이노시톨을 포함한 머리 기를 가진 인지질들이 바이러스 감염에서 특히 중요하다. 메타볼롬 데이터는 이노시톨이 특정하게 인체 섬유모세포의 HCMV 감염에 의해 고갈된다는 것을 보여준다. 섬유모세포 증식에 사용된 배지에 이노시톨이 존재한다는 점을 생각하면 이 고갈은 특히 충격적이다. 이 안에 있는 다른 데이터에 비춰보면, 이노시톨의 이 고갈은 이노시톨이 바이러스로 인해 이노시톨-인지질 종류의 합성에 소비되었음을 의미할 가능성이 있다. 최근에 본 발명인들은 이노시톨을 함유한 어떤 종류들은 HCMV의 복제에서 필수적인 역할을 한다는 것을 발견하였다. 상기 어떤 종류는 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)과 포스파티딜이노시톨(3)-인산을 포함한다. 따라서 일부 실시예에서, 이 안에 기술된 화합물들은 이노시톨 대사산물, 이노시톨 함유 대사산물 혹은 및/또는 인지질의 동화나 대사의 한 개 이상 단계를 표적으로 하는 바이러스 복제 억제제이다. 예시 25의 6.25.1절을 참고한다. 일부 실시예에서, 이 안에 기술된 바이러스 감염 치료방법은 바이러스에 감염된 피험자에게 화합물을 투여하는 것으로 구성된다. 특정 실시예에서, 바이러스에 감염된 피험자에서 바이러스 감염을 치료하는 방법은 화합물을 사용해 3군 PI(3)K를 억제하는 것으로 구성된다. 기타 실시예에서, 이 안에 기술된 화합물들은 이노시톨을 함유한 화학종들을 격리함으로써 바이러스 감염에서 그 화학종들의 정상적 필수 역할을 차단하는 바이러스 복제 억제제들이다. 예시 25의 6.25.2절을 참고한다. 일부 실시예에서, 바이러스에 감염된 피험자에서 바이러스 감염을 치료하는 방법은 화합물을 사용해 PI(3)P를 격리하는 것으로 구성된다.
포스포이노시티드3-활성효소(PI(3)K)들은 이노시톨 대사산물, 이노시톨 함유 대사산물 및/또는 인지질의 동화 혹은 대사의 한 개 이상 단계에 대한표적의 비제한적 예시들이다. PI(3)K들은 포스포이노시티드의 이노시톨 고리를 인산화하는 활성효소군이다(참고: 예를 들어, Toker and Cantley, Nature 387:673-676, 1997). PI3K들은 구조적 특징과 기질 특이성에 기초해 세 종류로 분류된다. 1군(class I) 효소들은 p110 촉매 아단위와 p85 혹은 p101 조절 아단위로 구성된 이종이합체(heterodimer)이며, 티로신 활성효소에 기초한 신호 경로나 이종삼합체(heterotrimer) G 단백질에 기초한 신호 경로에 의해 활성화 된다. 2군(class II) 효소들은 C 말단에 C2 영역이 있는 것이 특징인 크기가 큰 (>200 kDa) 효소들이다. 3군(class III) 효소들은 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 Vps34p와 동종이고, PtdIns에 국한된 기질 특이성이 있으며, PtdIns(3)P를 생산한다(참고: 예를 들어, Schu et al ., Science 260:88-91, 1993). 3군 PI(3)K는 인체 액포 단백질 분류(human vaculolar protein sorting 34 [hVps34])로도 알려져 있으며, PI의 이노시톨 고리에 있는 3'-하이드록실기를 인산화하여 PI(3)P를 생산한다. 특정 실시예에서, 표적은 3군PI(3)K (일명 human vaculolar protein sorting 34 (hVps34))이다.
일부 실시예에서, 표적은 포스포이노시티드3-활성효소가 아니다. 기타 실시예에서, 표적은 3군PI(3)K가 아니다.
위에서 살펴본 바와 같이, 지질 관련 과정은 바이러스의 성장, 복제, 및/또는 기타 감염 요소에 필수적이다. 결과적으로, 지질 대사에서 기능하는 여러 세포성 효소들은 성공적 감염에 필요할 가능성이 있고, 여러 효소들(예: 2종류 이상의 효소들)의 동시 억제는 감염을 억제하는 데 상승효과를 내거나, 각 화합물의 저용량을 사용해 바람직한 치료효과를 달성하게 할 가능성이 있다. 따라서, 본 발명에는 중재가 필요한 포유류에서 이 안에 기술된 화합물을 두 가지 이상 투여하여 바이러스 감염을 예방하고 치료하는 것과 관련 있으며, 각 화합물은 이 안에 기술된 한 가지 이상 효소들을 표적으로 삼는다. 일부 실시예에서, 그러한 병용 요법은 순차적이다. 다른 실시예에서, 그러한 병용 용법은 동시적이다. 일부 실시예에서, 숙주세포의 지질 및/또는 콜레스테롤 대사의 조절을 통해 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 두 가지 이상 화합물로 구성된 조성물을 만들기 위하여 두 가지 이상 제제가 함께 조제된다. 일부 실시예에서, 화합물 중 하나의 용량은 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 독립적으로 사용될 때 필요한 양보다 실질적으로 적으며, 예컨대 1.5배, 2배, 3배, 5배, 7배, 혹은 10배 적다. 일부 실시예에서, 두 제제의 용량은 1.5배, 2배, 3배, 5배, 7배, 혹은 10배 이상 줄인 용량이다.
병용하여 억제하기 위한 예시적 효소 쌍은 ACC와 구연산 분해효소; ACC와 FAS; ACC와 연장효소; ACC와 SCD; ACC와 HMG-CoA 환원효소; FAS와 HMG-CoA 환원효소; 연장효소와 HMG-CoA 환원효소; SCD와 HMG-CoA 환원효소; 연장효소와 SCD; 및 아세틸-CoA 합성효소와 ATP-구연산 분해효소를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
예시적 숙주세포 경로와 표적 효소들은 표1에 나와 있다.
Figure 112009082238916-PCT00002
Figure 112009082238916-PCT00003
5.2 화합물
이 안에 기술된 바이러스 감염의 치료 혹은 예방 방법에 사용될 수 있는 화합물은 유기 및 무기 분자, 펩티드와 펩티드 유사체, 저분자, 및 핵산 분자(예: RNA 간섭(RNAi) 분자, 작은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 짧은 머리핀형 RNA (shRNA) 등을 포함)을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
화합물들의 구조식들이 아래에 제시되어 있다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조(I)를 갖는다(구조 식별자는 이 안에서 "구조식"이라고도 불린다):
Figure 112009082238916-PCT00004
,
(I)
여기서 A는 -(CH2)X- 이다. 혹은
Figure 112009082238916-PCT00005
;
여기서 x는 0부터 6까지이다.
구조 (I)의 화합물은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 Hadvary et al . (미국 특허번호 4,958,089)에 기술된 방법(특히 칼럼8의 1행부터 11페이지의 10행)으로도 만들 수 있다. 나아가, 이 화합물들의 특정 예시들은 본 공개물에도 나와 있다.
구조 (I)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00006
,
이것은 오를리스탓(orlistat)이라고도 알려져 있다
또 다른 실시예에서, 구조 (I)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00007
;
Figure 112009082238916-PCT00008
;
Figure 112009082238916-PCT00009
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00010
.
한 실시예에서, 구조 (I)의 화합물은 오를리스탓이 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (II)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00011
,
( II )
상기 구조에서 점선은 결합을 의미하고, 점선이 있으면 이중결합이 있다는 의미이고, 점선이 없으면 단일결합이 있다는 의미이다.
Rl은 수소, 할로겐, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분, 혹은 N(RA)2이고, 여기서 각 경우의 RA는 독립적으로 수소, 보호족(protecting group) 혹은 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분이다.
R2는 수소, 할로겐, 시아노,-ORB, -N(RB)2, -SRB, -O(C=O)RB, -N(RB)(C=O)(RB), -C(O)RB,-C(O)ORB,-CON(RB)2, -OCO2RB, 혹은 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분이고, 여기서 각 경우의 RB는 독립적으로 수소, 보호족 혹은 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분이다.
R3은 수소, 할로겐, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분, 혹은 -N(RC)2이고, 여기서 각 경우의 R은 독립적으로 수소, 보호족 혹은 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분이다.
R4는 수소, 할로겐, 시아노, -ORD, -N(RD)2, -SRD, -O(C=O)RD, -N(RD)(C=O)(RD), -C(O)RD, -C(O)ORD, -CON(RD)2, -OCO2RD, 혹은 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분이고, 여기서 각 경우의 RD는 독립적으로 수소, 보호족 혹은 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분이다.
Z는 O, S 혹은 NRE이고, 상기 RE는 수소, 보호족, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴, 혹은 ORF이고, 상기 RF는 수소, 보호족, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분이다.
X는 O, S 혹은 NRG이고, 상기 RG는 수소 혹은 저급 알킬이다.
A와 B는 함께
Figure 112009082238916-PCT00012
, -CHR5-CHR6-, -CR5=CR6-을 의미하고, 여기서 R5와 R6은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 시아노, -ORJ, -N(RJ)2, -SRJ, -O(C=O)RJ, -O(S=O)RJ, -N(RJ)(C=O)(RJ), -C(=O)RJ, -C(=O)ORB, -CON(RJ)2, -OCO2RJ, -OS(=O)ORJ 혹은 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분이고, RJ는 각 경우에 독립적으로 수소, 보호족 혹은 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분이고, R7은 수소, 보호족, -ORK,-SRK, -C(O)ORK, -C(O)NRK, -S(O)2RK, -O(C=O)RK, -N(RK)(C=O)(RK), -C(O)RK, -C(O)ORK, -CON(RK)2, -OCO2RK, 혹은 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 혹은 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분이고, RK는 각 경우에 독립적으로 수소, 보호족 혹은 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분이다. 혹은 A와 B가 함께 -CHR5- CHR6-을 의미하는 경우, R5와 R6은 함께 치환 혹은 비치환 3 내지 7개 원자의 지방족, 헤테로지방족, 아릴 혹은 헤테로아릴 고리를 의미한다.
D와 E는 함께 -CHR8-CHR9-, -CR8=CR9-을 의미하고, R8와 R9는 각각 독립적으로 수소 혹은 저급 알킬이다.
G와 J는 -CHR10-CHR11-, -CR10=CR11-을 의미하고, R10과 R11은 각각 독립적으로 수소 혹은 저급 알킬이다.
K와 L은 함께 C=O, C=S, CH-CH3, CH-CH(RL)2, C=C (RL)2, -CH2-, -C(-S (CH2)3S-)-, CH-ORL, CH-SRL, CH-N(RL)2, CH-N(RL)(C=O)(RL), C=N-O-RL, CH-N=O, C=C(RL)-N(RL)2, C=N-RL, C=N-N-(RL)2을 의미한다. 혹은 점선 ---이 결합을 의미하고 점선에 의해 이중결합이 존재한다면, K와 L은 함께 C-N(RL)2을 의미한다. 여기서 RL은 각 경우에 독립적으로 수소, 보호족, 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 혹은 알킬헤테로아릴 성분이거나, 두 개가 함께 존재하는 RL은 3 내지 7개 원자의 고리 지방족, 헤테로지방족, 방향족, 혹은 헤테로방향족 성분이다. 상기한 지방족과 헤테로지방족 성분의 각각은 독립적으로 치환 혹은 비치환, 고리 혹은 비고리, 분지형 혹은 비분지형일 수 있고, 각각의 아릴, 헤테로아릴, 알킬아릴, 및 알킬헤테로아릴 성분은 치환 혹은 비치환될 수 있다. 여기서 Rl, RA, R2, RB, R3, RC, R4, RD, RS, R6, RJ, 또는 RL 중 어느 것이든 한 개나 두 개는 선택적으로 라디시콜(radicicol), 모노실린(monocillin), 라디시콜의 유사체, 모노실린, 겔다나마이신(geldanamycin), 겔다나마이신의 유사체, 및 스테로이드; 및 약학적으로 허용되는 그것들의 유도체로 구성된 기에서 선택된 화합물에 공유결합된 링커(linker)여도 된다.
구조 (II)의 화합물은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 Danishefsky et al . (국제 특허 공개 번호 WO 02/16369)에 기술된 방법(특히 69페이지의 25행부터 87페이지의 28행)으로도 만들 수 있다. 나아가, 이 화합물들의 특정 예시들은 본 공개물에도 나와 있다.
구조 (II)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00013
,
이것은 라디시콜(radicicol) 혹은 모노르덴(monorden)이라고 불린다.
또 다른 실시예에서, 구조 (II)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00014
;
Figure 112009082238916-PCT00015
;
Figure 112009082238916-PCT00016
;
Figure 112009082238916-PCT00017
;
Figure 112009082238916-PCT00018
;
Figure 112009082238916-PCT00019
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00020
.
실시예에서, 구조 (II)의 화합물은 라디시콜이 아니다.
실시예에서, 화합물은 다음 구조 (III)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00021
( III )
여기서 각 R1기는 독립적으로 친유성기 및/또는 전자 끄는 기(electron withdrawing group)이다.
N은 5부터 8이며, R2와 R3은 둘 다 수소이고, R4는 수소 혹은 하이드록시이고, R5는 CH(R6)R7이고, R6는 수소 혹은 하이드록시이고, R7은 카르복실기 혹은 카르복실기로 가수분해 가능한 카르복실산 에스테르기이다. 혹은 R4는 수소이고, R5는 수소 혹은 하이드록시이고, R2는 하이드록시이고, R3는 카르복실기 혹은 카르복실기로 가수분해 가능한 카르복실산 에스테르기이다. 혹은 R2와 R3은 수소이고, R4와 R5는 함께 =C(R6)R7 기를 형성하고, R6와 R7은 위에 정의된 것들 및 그것들의 염이다.
구조 (III)의 화합물들은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 Gribble et al . (미국 특허번호 5,447,954) 에 기술된 방법(특히 칼럼10의 37행부터 칼럼24의 50행)으로도 만들 수 있다. 나아가, 이 화합물들의 특정 예시들은 본 공개물에도 나와 있다.
구조 (III)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00022
이것은 화합물명 SB-204990으로 식별된다.
또 다른 실시예에서, 구조 (III)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00023
;
Figure 112009082238916-PCT00024
;
Figure 112009082238916-PCT00025
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00026
.
한 실시예에서, 구조 (III)의 화합물은 SB-204990이 아니다.
한 실시예에서 화합물은 구조 (IV)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00027
( IV )
여기서 각 R1기는 독립적으로 친유성기 혹은 및/또는 전자 끄는 기(electron withdrawing group)이다.
여기서 n은 5부터 8이다. 그리고
R2와 R3은 둘 다 수소이고, R4는 수소 혹은 하이드록시이고, R5는 CH(R6)COOH이고, R6은 수소 혹은 하이드록시이다. 혹은 R4는 수소이고, R5는 수소 혹은 하이드록시이고, R2는 하이드록시이고, R3은 COOH이다. 혹은 R2와R3은 수소이고, R4와 R5는 함께 =C(R6)COOH 기를 형성하고, R6은 위에 정의한 것들 및 약학적으로 허용되는 그것들의 염이다.
구조 (IV)의 화합물들은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 Gribble et al .(미국 특허번호 5,447,954) 이 기술한 방법(특히 칼럼10의 37행부터 칼럼24의 50행)으로도 만들 수 있다. 나아가, 이 화합물들의 특정 예시들은 본 공개물에 나와 있다.
구조 (IV)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00028
이것은 화합물명 SB-201076으로 식별된다.
또 다른 실시예에서, 구조 (IV)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00029
;
Figure 112009082238916-PCT00030
;
Figure 112009082238916-PCT00031
;
Figure 112009082238916-PCT00032
;
Figure 112009082238916-PCT00033
;
Figure 112009082238916-PCT00034
;
Figure 112009082238916-PCT00035
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00036
.
한 실시예에서, 구조 (IV)의 화합물은 SB-201076이 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (V)를 갖는다.
Figure 112009082238916-PCT00037
(V)
여기서, Y는 CH, CH2, N, C=O, O, S, 및 NR3로 구성된 기에서 선택되고, R3은 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알콕실로 구성된 기에서 선택되며, Y는 존재하거나 없을 수 있다.
X는 O, S, 및 NR4이고, 각 R4는 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 및 알콕실로 구성된 기에서 독립적으로 선택된다.
R1은 알킬, 할로, 하이드록실, 알콕시, 아릴옥실, 및 알콕시로 구성된 기에서 선택된다.
R2은 H, 알킬, 할로, 하이드록실, 알콕시, 아릴옥실, 및 알콕시로 구성된 기에서 선택된다.
n은 0부터 3까지의 정수이다.
구조 (V)의 화합물은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 국제 특허 공개 번호 WO 2005/051296에 기술된 방법(특히 38페이지의 4행부터 49페이지의 11행)으로도 만들 수 있다. 나아가, 이 화합물들의 특정 예시들은 본 공개물에 나와 있다.
구조 V의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00038
.
또 다른 실시예에서, 구조 (V)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00039
;
Figure 112009082238916-PCT00040
;
Figure 112009082238916-PCT00041
;
Figure 112009082238916-PCT00042
;
Figure 112009082238916-PCT00043
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00044
.
한 실시예에서, 구조 (V)의 화합물은 다음이 아니다:
Figure 112009082238916-PCT00045
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (VI)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00046
( VI )
여기서 A-B는 N-CH 혹은 CH-N이다.
K는 (CH2)r이고, r은 2, 3 혹은 4이고, m과 n은 A-B가 N-CH일 때는 각각 독립적으로 1, 2 혹은 3이고 A-B 가 CH-N일 때는m과 n은 각각 독립적으로 2 혹은 3이다. 점선은 임의적인(optional) 이중결합의 존재를 의미한다.
D는 카르보닐 혹은 술포닐이다.
E는 a) 완전히 불포화된 5 내지 7원자 고리 2개가 접합된 2환 고리이고, 독립적으로 상기 각 고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 이종원자를 임의로 갖는다. 혹은 b) 완전히 불포화된 5 내지 7원자 고리가 2개가 접합된 3환 고리이고, 독립적으로 상기 각 고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 이종원자를 갖고, 상기 접합된 2개의 고리는 부분 포화, 완전 불포화, 혹은 완전 포화된 5 내지 7 원자로 된 세 번째 고리에 접합되고, 상기 세 번째 고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 이종원자를 갖는다. 혹은 c) 완전 불포화된 5 내지 7 원자 고리 2개가 접합된 2환 고리로 구성되는 4환 고리이고, 독립적으로 상기 각 고리들은 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4 개의 이종원자를 임의로 갖고, 상기 2환 고리는 완전 포화, 부분 포화, 혹은 완전 불포화된 5 내지 7 원자 고리로 된 2개의 독립적으로 취해진 단일환 고리에 접합되고, 상기 각 고리들은 산소, 황 및 질소로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 이종원자를 임의로 갖는다. 혹은 상기 2환 고리가 완전 포화, 부분 포화 또는 완전 불포화된 5 내지 7 원자 고리 2개가 접합된 두 번째 2환 고리에 접합되며, 독립적으로 상기 각 고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 이종원자를 임의로 갖는다. 혹은 d) 완전 불포화된 5 내지 7 원자 고리로 구성된 테라릴(teraryl) 고리이고, 상기 고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 이종원자를 임의로 갖고, 상기 고리는 완전 불포화된 5 내지 7 원자 고리로 독립적으로 2치환 되어 테라릴 비접합 고리계를 형성하고, 상기 치환고리 각각은 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4 개의 이종원자를 임의로 갖는다. 여기서 말하는 E 2환-, 3환-, 혹은 4환 고리 혹은 테라릴 고리는 그 2환-, 3환-, 4환 고리, 혹은 테라릴 고리를 형성하는 데 사용된 각 고리에서, 임의로, 할로, 하이드록시, 아미노, 시아노, 니트로, 옥소, 카르복시, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C1-C6) 알콕시, (C1-C4) 알킬티오,(C1-C6) 알콕시카르보닐로 독립적으로 단일치환, 2치환, 또는 3치환 된다.
여기서 말하는 E 2환-, 3환-, 혹은 4환 고리 혹은 테라릴 고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4 개의 이종원자를 임의로 갖는, 부분 포화, 완전 포화, 혹은 완전 불포화된 3 내지 8 원자 고리 R10, 혹은 각각의 고리가 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4 이종원자를 임의로 갖는, 독립적으로 부분 포화, 완전 포화, 혹은 완전 불포화된 3 내지 8 원자 고리 2개가 접합된 고리들로 구성된 2환 고리 R" 임의로 단일 치환되고, 상기 R10과 R" 고리들은 임의로 추가로 가교되고, 상기 R10과 R" 고리들은 완전 포화, 부분 불포화, 혹은 완전 불포화된 1 내지 4 원자 고리의 직쇄 혹은 분지형 탄소 사슬에 임의로 연결되고, 여기서 상기 탄소는 산소, 질소, 및 황 중에서 독립적으로 선택된 1 개나 2개의 이종원자로 임의로 대체될 수 있다. 단, 상기 E 2환 고리는 최소 1개의 치환기를 가지며, D에 결합된 E 2환 고리 원자는 탄소라는 전제 하에서이다. 여기서 상기 R10 혹은 R" 고리는 독립적으로 할로, 하이드록시, 아미노, 시아노, 니트로, 옥소, 카르복시, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐,(C2-C6) 알키닐,(C1-C6) 알콕시, (C1-C4) 알킬티오, (C1- C6) 알콕시카르보닐, (C1-C6) 알킬카르보닐, (C1-C6) 알킬카르보닐아미노, 혹은 모노-N- 혹은 디-N,N-(C1-C6) 알킬아미노 혹은 모노-N- 혹은 디-N,N-(C1-C6) 알킬아미노카르보닐로 임의로 단일치환, 2치환,혹은 3치환되고, 상기 (C1-C6) 알킬 치환기와 (C1-C6) 알콕시 치환기도 임의로 할로, 하이드록시, (C1-C6) 알콕시, 아미노, 모노-N-혹은 디-N,N-(C1-C6) 알킬아미노 혹은 1 내지 9개의 불소로 독립적으로 단일치환, 2치환 혹은 3치환 된다.
G는 카르보닐, 술포닐, 혹은 CR7R8이다. 여기서 R7과 R8은 각각 독립적으로 수소, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐 혹은 (C2-C6) 알키닐, 혹은 산소, 황, 및 질소 중에서 선택된 1개의 이종원자를 임의로 갖는 부분 포화, 완전 포화 혹은 완전 불포화된 5 내지 7 원자 고리이다. J는 OR', NR2R3 혹은 CR4R5R6이고, 여기서 R', R2와 R3은 각각 독립적으로 H, Q, 혹은 (Cl- C10) 알킬, (C3-C10) 알케닐 혹은 (C3-C10) 알키닐 치환기이고, 상기 탄소(들)은 산소, 질소, 및 황 중에서 독립적으로 선택된 1개 혹은 2개의 이종원자로 임의로 대체될 수 있고, 상기 황은 임의로 옥소로 단일치환 혹은 2치환 되고, 상기 탄소(들)은 임의로 옥소로 단일치환되고, 상기 질소는 임의로 옥소로 2치환 되고, 상기 탄소(들)은 할로, 하이드록시, 아미노, 니트로, 시아노, 카르복시, (C1-C4) 알킬티오, (C1-C6) 알킬옥시카르보닐, 모노-N- 혹은 디-N, N- (Cl-C6) 알킬아미노 혹은 모노-N- 혹은 디-N, N-(C1-C6) 알킬아미노카르보닐로 독립적으로 임의로 단일치환, 2치환, 혹은 3치환 된다. 상기 사슬은 Q1으로 임의로 단일치환 되고, 여기서 Q과 Q1 각각은 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 3개 이종원자를 갖는 부분 포화, 완전 포화, 혹은 완전 불포화된 3 내지 8 원자고리이거나, 독립적으로 부분 포화, 완전 포화 혹은 완전 불포화된 3 내지 6 원자고리 2개의 접합고리 혹은 스피로사이클릭(spirocyclic) 고리로 이루어진 2환 고리이고, 상기 2환 고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 3 이종원자를 임의로 갖고, 상기 단일환 혹은 2환 고리는 (C1-C3) 알킬렌과 임의로 추가로 가교되고, 상기 (C1-C3) 알킬렌 탄소들은 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 2 이종원자로 임의로 대체된다. 여기서, 상기 Q과 Q1 각각은 임의로 할로, 하이드록시, 아미노, 니트로, 시아노, 옥소, 카르복시, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐,(C1-C6) 알콕시, (C1-C4) 알킬티오, (C1-C6) 알킬카르보닐, (C1- C6) 알킬카르보닐아미노, (C1-C6) 알콕시카르보닐, 모노-N- 혹은 디-N,N- (C1-C6) 알킬아미노, 모노-N- 혹은 디-N, N-(C1-C6) 알킬아미노술포닐, 모노-N- 혹은 디-N,N-(C1-C6) 알킬아미노카르보닐로 독립적으로 단일치환, 2치환, 3치환, 혹은 4치환 된다. 상기 (C1-C6) 알킬 치환기는 임의로 할로, 하이드록시, 아미노, 니트로, 시아노, 옥소, 카르복시, (C1-C6) 알콕시, (C1-C4) 알킬티오, (C1- C6) 알킬옥시카르보닐 혹은 모노-N- 혹은 디-N, N-(C1-C6) 알킬아미노로 독립적으로 단일치환, 2치환, 혹은 3치환 되고, 상기 (C1-C6) 알킬 치환기도 임의로 1 내지 9 불소로 치환된다.
혹은 여기서 R2와 R3은 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 추가 1 내지 3개의 이종원자를 임의로 갖는 부분 포화, 완전 포화 혹은 완전 불포화된 3 내지 8 원자고리, 혹은 독립적으로 취한 부분 포화, 완전 포화 혹은 완전 불포화된 3 내지 6 원자의 접합, 가교, 혹은 스피로사이클릭 고리들로 구성된 2환 고리(이 2환고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 추가적 1 내지 3개의 이종원자를 임의로 갖는다), 혹은 독립적으로 취한 부분 포화, 완전 포화 혹은 완전 불포화된 3 내지 6 원자의 접합, 가교, 혹은 스피로사이클릭 고리로 구성된 3환 고리 (이 3환 고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 추가적 1 내지 3개의 이종원자를 임의로 갖는다)를 형성하기 위해 부착되어 있는 질소 원자와 함께 하나로 취할 수 있다. 여기서 상기 NR2R3 고리는 독립적으로 R15, 할로, 하이드록시, 아미노, 니트로, 시아노, 옥소, 카르복시, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C1-C6) 알콕시, (C1-C4) 알킬티오, (C1-C6) 알킬카르보닐아미노 혹은 모노-N- 혹은 디-N, N-(C1-C6) 알킬아미노로 임의로 단일치환, 2치환, 3치환, 혹은 4치환된다. 상기 (C1-C6) 알킬 치환기는 독립적으로 할로, 하이드록시, 아미노, 니트로, 시아노, 옥소, 카르복시, (C1-C6) 알콕시, (C1-C4) 알킬티오, (C1-C6) 알킬카르보닐, 모노-N- 혹은 디-N, N-(C1-C6) 알킬아미노로 임의로 단일치환, 2치환, 혹은 3치환 된다. 상기 (C1-C6) 알킬 치환기는 또한 1 내지 9개 불소로도 임의로 치환된다.
여기서 3개의 이종원자는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택되고, 상기 고리는 할로, 하이드록시, 아미노, 니트로, 시아노, 옥소, 카르복시, (C1-C6) 알킬, (C2-C6) 알케닐, (C2-C6) 알키닐, (C1-C4) 알킬티오, (C1-C6) 알콕시, (C1-C6) 알킬카르보닐아미노, 모노-N- 혹은 디-N, N-(C1-C6) 알킬아미노로 임의로 단일치환, 2치환, 혹은 3치환된다. 여기서 상기 NR2R3 고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 이종원자를 임의로 갖는 부분 포화, 완전 포화, 혹은 완전 불포화된 3 내지 8 원자의 단일환 고리, 혹은 독립적으로 취한 부분 포화, 완전 포화, 혹은 완전 불포화된 3 내지 6 원자 고리 2개가 접합된 2환 고리로 임의로 치환된다. 상기 2환 고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 이종원자를 임의로 갖고, 상기 단일환 혹은 2환 고리는 임의로 추가로 가교되고, 상기 고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 이종원자를 임의로 갖는다. 상기 (C1-C6) 알킬과 상기 고리는 할로, 하이드록시, 아미노, 니트로, 시아노, 옥소, 카르복시, (C2-C6) 알케닐, (C3-C6) 알키닐, (C1-C6) 알킬카르보닐아미노, 하이드록시, (C1-C6) 알콕시, (C1-C4) 알킬티오, (Cl-C6) 알콕시, 모노-N- 혹은 디-N, N-(C1-C6) 알킬아미노로 임의로 단일치환, 2치환, 혹은 3치환 된다. 여기서 R4, R5및 R6은 독립적으로 H, 할로, 하이드록시, (C1-C6) 알킬이다. 혹은 R4와 R5은 함께 부분 포화, 완전 포화, 혹은 완전 불포화된 3 내지 8 원자고리를 형성한다. 상기 고리는 산소, 황, 및 질소 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 3 이종원자를 임의로 갖는다. 상기 (C1-C6) 알킬과 상기 고리는 1'-(안트라센-9-카르보닐)-[1, 4'] 바이피페리디닐- 3-카르복실산 디에틸아미드; 1'-(1-옥사-2, 3-디아자-시클로펜타[a]나프탈렌-5-술포닐)-[1, 4'] 바이피페리디닐-3 카르복실산 디에틸아미드;1'-(5-디메틸아미노-나프탈렌-1-술포닐)-[1,4'] 바이피페리디닐-3-카르복실산 디에틸아미드; 1'-(9, 10,10-트리옥소-9, 10-디하이드로-티오잔틴-3-카르보닐)-[1-4'] 바이피페리디닐-3-카르복실산 디에딜아미드; 및 1'-(2-옥소-2H-크로멘-3-카르보닐)-[1-4'] 바이피페리디닐-3-카르복실산 디에틸아미드는 포함되지 않는다는 전제 하에, 할로, 하이드록시, 아미노, 니트로, 시아노, 옥소, 카르복시, (C2-C6) 알케닐, (C3-C6) 알키닐, (C1-C6) 알킬카르보닐아미노, 하이드록시, (C1-C6) 알콕시, (C1-C4) 알킬티오, (Cl-C6) 알콕시, 모노-N- 혹은 디-N, N-(C1-C6) 알킬아미노로 임의로 단일치환, 2치환, 혹은 3치환된다.
구조 (VI)의 화합물은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 국제 특허 공개 번호 WO 03/072197에 기술된 방법(특히 103페이지의 14행부터 160페이지의 17행)으로도 만들 수 있다. 나아가, 이 화합물들의 특정 예시들은 본 공개물에 나와 있다.
구조 (VI)의 화합물의 기타 특정 예시들은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00047
, 그리고
Figure 112009082238916-PCT00048
.
CP-610431로도 알려져 있다.
구조 (VI)의 화합물의 기타 특정 예시들은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00049
, 그리고
Figure 112009082238916-PCT00050
CP-640186으로도 알려져 있다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VI)의 화합물은 다음과 같다.
Figure 112009082238916-PCT00051
;
Figure 112009082238916-PCT00052
;
Figure 112009082238916-PCT00053
;
Figure 112009082238916-PCT00054
;
Figure 112009082238916-PCT00055
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00056
.
한 실시예에서, 구조 (VI)의 화합물은 CP-610431이 아니다.
한 실시예에서, 구조 (VI)의 화합물은 CP-640186이 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (VII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00057
( VII )
여기서 각 R1은 독립적으로 수소, (C1-C6)알킬, (C1-C6)알케닐, (C1-C6)알키닐, 페닐, 벤질, 혹은 C(O)R3이다.
R2는 -H 혹은 OR1이다.
R3는 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알케닐, (C1-C6)알키닐, NR4, 혹은 페닐이다.
R4는 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알케닐, (C1-C6)알키닐, 혹은 페닐이다.
구조(VII)의 화합물들은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된Peschko et al . (Tetrahedron Letters, 41: 9477-9481, 2000)에 기술된 방법으로도 만들 수 있다. 이 화합물들의 특정 예시들은 본 공개물에도 나와 있다.
구조 (VII)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00058
,
이것은 푸푸론(Pupurone)으로도 알려져 있다.
특정 실시예에서, 구조 (VII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00059
,
이것은 닌갈린 D(ningalin D)로도 알려져 있다.
특정 실시예에서, 구조 (VII)의 화합물은 다음과 같다:.
Figure 112009082238916-PCT00060
.
한 실시예에서, 구조 (VII)의 화합물은 푸푸론이 아니다.
한 실시예에서, 구조 (VII)의 화합물은 닌갈린 D가 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (VIII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00061
( VIII )
이 구조식에서, 점선은 독립적으로 포화결합 혹은 다른 말로 이중결합이고, R은 수소, CH3 혹은 -C(O)A이고, A는 할로겐 혹은 (C1 -C3)알콕시로 비치환 혹은 치환되는 수소, (C3 -C6)시클로알킬 혹은 (C1-C6) 알킬이다.
X는 결합이 포화결합인 경우에는 -OH이고, 아니면, 불포화 결합이 한 개 있는 경우에는 =O, =N-OY 혹은 =N-N(R1)(R2)이다.
Y는 수소, (C1 -C6)알킬, (C3 -C6)알케닐, (C3 -C6)알키닐 혹은 아실기 -C(O)-Z이다. 여기서
Z는 페닐, 혹은 할로겐 혹은 (C1-C4)알콕시로 치환되는 (C1 -C6)알킬기이거나, 수소, (C1 -C6)알킬, (C2 -C6)알케닐 혹은 (C2-C6)알키닐이다.
R1은 수소 혹은 (C1 -C6)알킬이고,
R2는 수소, (C1 -C6)알킬, 페닐, 카르바모일(CONH2), -COA 혹은 -SO2-R3이다. 여기서
R3은 (C1-C6) 알킬이거나, (C1 -C4)알킬로 비치환 혹은 치환되는 페닐이다.
구조 (VIII)의 화합물들은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 Boelendorf et al . (미국 특허번호 5,026,878)에 기술된 방법(특히 칼럼10의 25행부터 칼럼16의 14행)으로도 만들 수 있다. 이 화합물들의 특정 예시들은 본 공개물에도 나와있다.
구조 (VIII)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00062
,
이것은 소라펜 A(Soraphen A)로도 알려져 있다.
특정 실시예에서, 구조 (VIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00063
,
이것은 소라펜 B(Soraphen B)로도 알려져 있다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VIII)의 화합물은 다음과 같다:
;
Figure 112009082238916-PCT00065
;
Figure 112009082238916-PCT00066
;
Figure 112009082238916-PCT00067
;
Figure 112009082238916-PCT00068
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00069
.
한 실시예에서, 구조 (VIII)의 화합물은 소라펜 A가 아니다.
한 실시예에서, 구조 (VIII)의 화합물은 소라펜 B가 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (IX)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00070
,
여기서 T는 산소 혹은 황이다.
X는 Cl, Br 혹은 CF3이다.
X와 Y 중 최소 하나는 CF3라는 전제조건 하에, Y는 H, Cl, Br 혹은 CF3이다.
Z는 -C(O)OR1, -C(O)NR2R3, -C(O)O-M+, -C(O)SR4, -CN R1은 H, (C1-C8)알킬, 벤질, 클로로벤질 혹은 C3-C6 알콕시알킬이다.
R4는 (C1 -C4)알킬이다.
R5는 H 혹은 (C1 -C4)알킬이다.
R6는 (C1 -C7)알킬이다.
M은 NHR2R3R7, Na, K, Mg 혹은 Ca이다.
R2와 R3은 둘 다 동시에 -OCH3일 수 없고 -NHR2R3R7에서 -OCH3일 수 없다는 전제 하에, 각각 독립적으로 R7 혹은 -OCH3 중에서 선택된다.
R7은 H, (C1 -C4)알킬 혹은 (C2 -C3)하이드록시알킬이다.
구조 (IX)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00071
,
이것은 할록시폽(haloxyfop)으로도 알려져 있다.
또 다른 실시예에서, 구조 (IX)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00072
;
Figure 112009082238916-PCT00073
;
Figure 112009082238916-PCT00074
;
Figure 112009082238916-PCT00075
Figure 112009082238916-PCT00076
.
한 실시예에서, 구조 (IX)의 화합물은 할록시폽이 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (X)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00077
(X)
여기서 점선이 결합이면, R2와 R3은 존재하지 않는다.
R1은 에폭사이드 고리를 형성하기 위해 R3와 공유된 H, OR4, NR4R5, SR6, 할로, C(O)OR4 혹은 O이다.
R2는 H 혹은 할로이다.
R3는 에폭사이드 고리를 형성하기 위해 R1과 공유된 H, SR6, 혹은 O이다.
R4는 H, (C1-C6)알킬, (C2-C6)알케닐, (C2-C6)알키닐, 아릴, 혹은 벤질이다.
R5는 H, (C1-C6)알킬, 혹은 OR4이다.
R6은 H, (C1-C6)알킬, SH 혹은 S-(C1-C6)알킬이다
R1이 에폭사이드 고리를 형성하기 위해 R3와 공유된 OR4 혹은 O이면, R2는 할로일 수 없다.
구조(X)의 화합물들은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 Saxty et al . (1992, Eur. J. Biochem. 202:889-896)과 Dolle et al .(1995, Journal of Medicinal Chemistry 38(3): 537-543)에 기술된 방법으로도 만들 수 있다. 이 화합물들의 특정 예시들은 이들 공개물에도 나와 있다.
구조 (X)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다.
,
이것은 2S-하이드록시구연산(2S-hydroxycitrate)로도 알려져 있다.
특정 실시예에서, 구조 (X)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00079
,
이것은 2,2-디플루오로구연산 (2,2-difluorocitrate)로도 알려져 있다.
특정 실시예에서, 구조 (X)의 화합물은 다음과 같다:.
Figure 112009082238916-PCT00080
.
특정 실시예에서, 구조 (X)의 화합물은 다음과 같다:.
Figure 112009082238916-PCT00081
.
특정 실시예에서, 구조 (X)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00082
.
특정 실시예에서, 구조 (X)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00083
.
또 다른 실시예에서, 구조 (X)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00084
;
Figure 112009082238916-PCT00085
;
Figure 112009082238916-PCT00086
;
Figure 112009082238916-PCT00087
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XI)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00088
( XI )
여기서 X는 S, S=O 혹은 -CH2-이다.
n은 0부터 6까지다.
Z는 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알킬-COOH, OR1, 혹은 NR1R2이다.
R1는 H, (C1-C6)알킬, (C2-C6)알케닐, (C2-C6)알키닐, 페닐, 혹은 벤질이다.
R2는 H, (C1-C6)알킬, (C2-C6)알케닐, (C2-C6)알키닐, 페닐, 혹은 벤질이다.
구조(XI)의 화합물들은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 Usher et al . (1994, Biochemistry 33: 7753-7759)과 Charlier et al .(1997, Biochemistry 36: 1551-1558)에 기술된 방법으로도 만들 수 있다. 이 화합물들의 특정 예시들은 이들 공개물에도 나와 있다.
구조 (XI)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:.
Figure 112009082238916-PCT00089
,
이것은 3-옥소부틸-CoA (3-Oxobutyl-CoA)로도 알려져 있다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XI)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00090
;
Figure 112009082238916-PCT00091
;
Figure 112009082238916-PCT00092
;
Figure 112009082238916-PCT00093
;
Figure 112009082238916-PCT00094
;
Figure 112009082238916-PCT00095
;
Figure 112009082238916-PCT00096
;
Figure 112009082238916-PCT00097
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00098
.
한 실시예에서, 구조 (XI)의 화합물은 옥소부틸-CoA가 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00099
( XII )
여기서:
Ra 는 C1-C6-알킬이다.
Rb 는 수소, 농업에 유용한 양이온의 동등물, C2 -C8-알킬카르보닐알콕시, C1-C10-알킬술포닐, C1-C10-알킬포스포닐 혹은 벤조일, 벤젠술포닐 혹은 벤젠포스포닐이고, 언급한 순서대로 뒤에서부터 세 개의 기는 각각 1 내지 5개의 할로겐 원자를 추가로 가질 수 있다.
Rc는 수소, 시아노, 포르밀, C1-C6-알킬, C1-C4-알콕시-C1-C6-알킬 혹은 C1-C4-알킬티오-C1-C6-알킬, 펜옥시-C1-C6-알킬, 페닐티오-C1-C6-알킬, 피리딜옥시- C1-C6-알킬 혹은 피리딜티오-C1-C6-알킬이고, 상기 페닐 고리와 피리딜 고리는 니트로, 시아노, 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된 C1-C4-알콕시, C1-C4-알킬티오, C3-C6-알케닐, C3-C6-알케닐옥시, C3-C6-알키닐, C3-C6-알키닐옥시, 및 -NRgRh로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개의 라디칼을 추가로 가질 수 있다. 여기서
Rg는 수소, C1-C4-알킬, C3-C6-알케닐, C3-C6-알키닐, C1-C6-아실 혹은 벤조일이고, 이것들은 니트로, 시아노, 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된 C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시, 및 C1-C4-알킬티오로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개의 라디칼을 추가로 가질 수 있다. 그리고
Rh는 수소, C1-C4-알킬, C3-C6-알케닐 혹은 C3-C6-알키닐; C3-C7-시클로알킬 혹은 C5-C7-시클로알케닐(여기서 이 기들은 하이드록실, 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시, C1-C4-알킬티오, 벤질티오, C1-C4-알킬술포닐, C1-C4-알킬술페닐과 C1-C4-알킬술피닐로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개의 라디칼을 추가로 가질 수 있다), 1개 혹은 2개의 산소 원자 혹은 황 원자들 혹은 1개의 산소와 1개의 황 원자를 이종 원자로서 함유하며 C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시와 C1-C4-알킬티오로 구성된 군에서 추가로 1 내지 3개의 라디칼을 가질 수 있는 5원자 포화 헤테로사이클릭 구조, 1개 혹은 2개의 산소 원자 혹은 황 원자들 혹은 1개의 산소와 1개의 황 원자를 이종 원자로서 함유하며 하이드록실, 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시 및 C1-C4-알킬티오로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개의 라디칼을 추가로 가질 수 있는 6 원자 혹은 7 원자 포화 헤테로사이클릭 구조 혹은 1가 불포화(monounsaturated) 혹은 2가 불포화(diunsaturated) 헤테로사이클릭 구조, 1개 혹은 2개의 질소 원자와 1개의 산소 혹은 황 원자로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개의 라디칼을 함유하는 보유하는 5원자 헤테로방향족 구조이다. 상기 헤테로방향족 구조는 시아노, 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된 C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된C1-C4-알콕시, C1-C4-알킬티오, C2-C6-알케닐, C2-C6-알케닐옥시, C3-C6-알키닐옥시와 C1-C4-알콕시-C1-C4-알킬, 페닐 혹은 피리딜로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개의 라디칼을 추가로 가질 수 있다. 이것들 각각은 니트로, 시아노, 포르밀, 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된C1-C4-알콕시, C1-C4-알킬티오, C3-C6-알케닐, C3-C6-알케닐옥시, C3-C6-알키닐, C3-C6-알키닐옥시 및 -NRgRh로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개의 라디칼을 추가로 가질 수 있다. 여기서 Rg와 Rh는 위에서 말한 의미를 갖는다.
Rd는 수소, 하이드록실, 혹은 C1-C6-알킬이다.
Ro는 수소, 할로겐, 시아노, C1-C4-알콕시카르보닐 혹은 C1-C4-알킬케톡심 기이다.
W는 C1-C6-알키닐렌, C3-C6-알케닐렌 혹은 C3-C6-알키닐렌 사슬(이것들 각각은 3개의 C3-C6-알킬 치환기, 3개의 할로겐 원자, 및 1개의 메틸렌 치환기로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개 라디칼을 추가로 가질 수 있다), C3-C6-알키닐렌 혹은 C4-C6-알케닐렌 사슬(이것들 둘 다 1 내지 3개의 C3-C6-알킬 라디칼을 추가로 가질 수 있고, 여기서 각 경우마다 사슬의 메틸렌 기 1개는 산소 혹은 황 원자, 술폭실 혹은 술포닐 기 혹은 -N(Ri)-기로 대체될 수 있다)이다. 여기서 Ri는 수소, C1-C4-알킬, C3-C6-알케닐 혹은 C3-C6-알키닐이다.
Rf는 수소; C1-C6-알킬; 비닐; -CH=CH-Z기(여기서 Z는 시아노, 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된 C1-C4-알킬, C3-C6-시클로알킬이고, 이것들은 바람직한 경우, 하이드록실, 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된 C1-C4-알킬 및 C1-C4-알콕시로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개의 치환기를 가질 수 있다); 카르복실, C1-C8-알콕시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 페닐, 티에닐 혹은 피리딜(여기서 이 3개의 방향족 라디칼들은 비치환될 수 있거나, 니트로, 시아노, 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화 된 C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된 C1-C4-알콕시, C1-C4-알킬티오, 및 C3-C6-시클로알킬로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개의 치환기를 가질 수 있고, 상기 시클로알킬 치환기는 비치환될 수 있거나 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된 C1-C4-알킬 및 C1-C4-알콕시로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개 라디칼을 추가로 가질 수 있다); 에티닐, 이것은 다음 라디칼 중 하나를 가질 수 있다: C1-C4-알킬, C3-C6-시클로알킬 (이것은 바람직한 경우, 하이드록시, 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된 C1-C4-알킬과 C1-C4-알콕시로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개 치환기를 추가로 가질 수 있다. 여기서 이 방향족 라디칼들은 비치환될 수 있거나 니트로, 시아노, 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된 C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된 C1-C4-알콕시와 C1-C4-알킬티오로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개의 치환기를 추가로 가질 수 있다); 페닐, 할로페닐, 디할로페닐, 5원자 헤테로방향족 기(이것은 1 내지 3개 질소 원자와 1개의 산소 혹은 황 원자로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개 헤테로 원자를 갖는다), 혹은 6 원자 헤테로 방향족 기(이것은 1 내지 4개 질소원자를 가지며, 이것들 모두가 동시에 이웃하지는 않을 수 있다). 여기서 페닐기와 헤타릴기는 바람직한 경우, 니트로, C1-C4-알콕시, C1-C4-알킬티오, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된 C1-C4-알콕시, 라디칼인 Z와 -NRkRl로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개의 라디칼을 추가로 가질 수 있다. 여기서
Rk는 수소, C1-C4-알킬, C3-C6-알케닐 혹은 C3-C6-알키닐이다. 그리고
Rl은 수소, C1-C4-알킬, C3-C6-알케닐, C3-C6-알키닐, C1-C6-아실 혹은 벤조일이고, 이것들은 바람직한 경우, 니트로, 시아노, 할로겐, C1-C4-알킬, 부분적으로 혹은 완전히 할로겐화된 C1-C4-알킬, C1-C4-알콕시 및 C1-C4-알킬티오로 구성된 군에서 선택된 1 내지 3개 치환기를 추가로 가질 수 있다.
구조 (XII)의 화합물들은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 1996년 2월 13일 공개된 미국특허 번호5,491,123에 기술된 방법(특히 칼럼 11의 62행부터 칼럼13의 5행)으로도 만들 수 있다. 이 화합물들의 특정 예시들은 본 특허에 나와 있다. 구조 (XII)의 화합물들의 다른 예시들은 2002년 5월 7일 공개된 미국특허 번호6,383,987; 2000년 8월 15일 공개된 미국특허 번호6,103,664; 및 1982년 6월 15일 공개된 미국특허 번호 4,334,913에 나와 있으며, 상기 특허들은 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된다.
구조 (XII)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00100
,
이것은 세톡시딤(sethoxydim)이라고도 알려져 있다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00101
;
Figure 112009082238916-PCT00102
;
Figure 112009082238916-PCT00103
;
Figure 112009082238916-PCT00104
;
Figure 112009082238916-PCT00105
;
Figure 112009082238916-PCT00106
;
Figure 112009082238916-PCT00107
;
Figure 112009082238916-PCT00108
;
Figure 112009082238916-PCT00109
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00110
.
한 실시예에서, 구조 (XII)의 화합물은 세톡시딤이 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XIII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00111
( XIII )
여기서:R은 C1 - 10알킬, C2 - 10알케닐, 아릴 혹은 아랄킬이다.
X는 NHR1 혹은 OR2이다. 그리고
R1과 R2는 H 혹은 C1 - 6알킬이다.
구조 (XIII)의 화합물들은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 미국특허 번호 5,188,830(1993년 2월 23일 공개)에 기술된 방법 (특히 칼럼5의 1행부터 칼럼6의 62행)으로도 만들 수 있다. 나아가, 이 화합물들의 특정 예시들은 본 특허에 나와 있다. 구조 (XIII)의 화합물들의 다른 예들은 2005년 8월 21일 공개된 미국 특허출원 공개번호 2003/0158156; 1980년 1월 11일 공개된 FR 2425432; 1908년 12월 26일 공개된 FR 2457864; Lawrence et al . (1999, J. Med . Chem . 42:4932-4941)에도 나와 있으며, 상기 공개물들은 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된다.
한 실시예에서, 구조 (XIII)의 화합물은 R이 C2 - 10알케닐인 화합물이다.
구조 (XIII)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00112
,
이것은 세룰레닌(cerulenin)이라고도 한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00113
;
Figure 112009082238916-PCT00114
;
Figure 112009082238916-PCT00115
;
Figure 112009082238916-PCT00116
;
Figure 112009082238916-PCT00117
;
Figure 112009082238916-PCT00118
;
Figure 112009082238916-PCT00119
;
Figure 112009082238916-PCT00120
;
Figure 112009082238916-PCT00121
Figure 112009082238916-PCT00122
;
Figure 112009082238916-PCT00123
;
Figure 112009082238916-PCT00124
;
Figure 112009082238916-PCT00125
;
Figure 112009082238916-PCT00126
;
Figure 112009082238916-PCT00127
;
Figure 112009082238916-PCT00128
;
Figure 112009082238916-PCT00129
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00130
.
한 실시예에서, 구조 (XIII)의 화합물은 세룰리닌이 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XIV)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00131
( XIV )
여기서:R은 -CH2OH, -CO2R2, -CONR3R4 혹은 COR5 중에서 선택되고, 여기서 R2는 수소이거나 저급 알킬기이고, R3과 R4는 각각 독립적으로 수소이거나 저급 알킬기이고, R5 는 아미노산의 말단 질소를 통해 결합된 아미노산 잔기이거나 최소 2개의 아미노산 잔기를 가진 펩티드이다. 그리고
여기서 R1은 아랄킬, 아랄킬(저급 알킬)에테르 혹은 C5-C13 알킬(저급 알킬)에테르이다.
구조 (XIV)의 화합물들은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 2000년 11월 28일 발표된 미국특허 번호 6,153,589에 기술된 방법(특히 칼럼4의 21행부터 칼럼17의 24행)으로도 만들 수 있다. 나아가, 이 화합물들의 특정 예시들은 본 특허에 나와 있다.
한 실시예에서, 구조 (XIV)의 화합물들은 레트로바이러스에 대한 활성을 갖고 있지 않다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XIV)의 화합물들은 단백분해효소에 대하여 부호화하는 바이러스에 대한 활성을 갖고 있지 않다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XIV)의 화합물들은 C형 레트로바이러스, D형 레트로바이러스, HTLV-1, HTLV-2, HIV-1, HIV-2, 설치류 백혈병 바이러스, 설치류유암 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 말 전염성 빈혈 바이러스, 또는 조류 육종 바이러스(예: 라우스 육종 바이러스)에 대한 활성을 갖고 있지 않다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XIV)의 화합물은 다음과 같다.
2R-시스-노닐옥시란 메탄올, 2S-시스-노닐옥시란 메탄올, 2R-시스-헵틸옥시란 메탄올, 2S-시스-헵틸옥시란 메탄올, 2R-시스-(헵틸옥시메틸) 옥시란, 메탄올, 2S-시스-(헵틸옥시메틸) 옥시란, 메탄올, 2-시스-운데실옥시란 메탄올, 2R-시스-(벤질옥시메틸) 옥시란, 메탄올, 2S-시스-(벤질옥시메틸) 옥시란 메탄올, 시스-2-에폭시데센, 2R-트란스-노닐옥시란 메탄올, 2S-트란스-노닐옥시란 메탄올, 2R-트란스-헵틸옥시란 메탄올, 2S-트란스-헵틸옥시란 메탄올, 2R-트란스-운데실옥시란 메탄올, 2S-트란스-운데실옥시란 메탄올, 2-트란스-운데실옥시란 메탄올, 2R-시스-노닐옥시란카르복실산, 2S-시스-노닐옥시란카르복실산, 2R-시스-헵틸옥시란카르복실산, 2S-시스-헵틸옥시란카르복실산, 2-시스-운데실옥시란카르복실산, 2R-트란스-노닐옥시란카르복실산, 2S-트란스-노닐옥시란카르복실산, 2R-트란스-운데실옥시란카르복실산, 2S-트란스-운데실옥시란 카르복실산, 2R-시스-노닐옥시란카르복시 아미드, 2S-시스-노닐옥시란카르복시 아미드, N,N-디에텔-2R-시스- 노닐옥시란카르복시 아미드, 혹은 N-(2R-시스-노닐옥시란아실)-L-프롤린 메틸 에스테르.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XV)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00132
( XV )
여기서:
R11은 H, 혹은 C1-C20 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬, 혹은 알킬아릴, =CHR13, -C(O)OR13, -C(O)R13, -CH2C(O)OR13, -CH2C(O)NHR13이고, 여기서 R13은 H 혹은 C1-C10 알킬, 시클로알킬, 혹은 알케닐이다.
R12는 C1-C20알킬, 시클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬, 혹은 알킬아릴이다.
X3은 OR14 혹은 NHR14이고, 여기서 R14는H, C1-C20 알킬, 하이드록시알킬, 시클로알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬, 혹은 알킬아릴, R14 기(이것은 임의로 카르보닐기, 카르복실기, 카르복시아미드기, 알코올기 혹은 에테르기를 함유한다), R14 기(이것은 더욱이 임의로 1개 이상의 할로겐 원자를 함유한다)이다.
구조 (XV)의 화합물들은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 2006년 10월 26일 공개된 미국특허 출원 공개번호 2006/0241177에 기술된 방법 (특히 7 - 10페이지와 도1 및 도2)으로도 만들 수 있다. 나아가, 이 화합물들의 특정 예시들은 본 공개물에 나와 있다. 구조 (XV)의 화합물들의 다른 예들은 2004년 5월 21일 공개된 국제 특허 공개 번호 WO 2004/041189; 1997년 5월 29일 공개된 국제특허 공개번호 WO 97/18806; 2005년 10월 27일 공개된 미국특허 출원 공개번호 2005/0239877에 나와 있으며, 상기 특허 각각은 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된다.
구조 (XV)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00133
,
이것의 이름은 C75 (트란스-4-카르복시-5-옥틸-3-메틸렌-부티롤락톤) [C75 (trans-4-carboxy-5-octyl-3-methylene-butyrolactone)]이라고도 한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XV)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00134
;
Figure 112009082238916-PCT00135
;
Figure 112009082238916-PCT00136
;
Figure 112009082238916-PCT00137
;
Figure 112009082238916-PCT00138
;
Figure 112009082238916-PCT00139
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00140
.
한 실시예에서, 구조 (XV)의 화합물은 C75가 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XVI)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00141
( XVI )
여기서:
R1-R5는 독립적으로 H, OH, 알킬, 알콕시, 할로겐, NH2, NHR, NR2, 혹은 CR3이고, 여기서 R은 각 경우에 독립적으로 H, 할로겐 혹은 알킬이다.
Q는 NH, O 혹은 S이다.
그리고 X, Y및 Z 중 둘은 N이고 세 번째 것은 N 혹은 CH이다.
구조 (XVI)의 화합물들은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 2003년 8월 14일 공개된 미국특허 출원 공개번호 2003/0153570에 기술된 방법 (특히 8 - 41페이지, 예시 1-90)으로도 만들 수 있다. 나아가, 이 화합물들의 특정 예시들은 본 공개물에 나와 있다. 구조 (XVI)의 화합물들의 다른 예시들은 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된 2005년 4월 5일 발표된 미국특허 번호 6,875,781에 나와 있다.
구조 (XVI)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00142
,
이것은 CT-32228이라고도 한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XVI)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00143
;
Figure 112009082238916-PCT00144
;
Figure 112009082238916-PCT00145
;
Figure 112009082238916-PCT00146
;
Figure 112009082238916-PCT00147
;
Figure 112009082238916-PCT00148
;
Figure 112009082238916-PCT00149
;
Figure 112009082238916-PCT00150
;
Figure 112009082238916-PCT00151
;
Figure 112009082238916-PCT00152
;
Figure 112009082238916-PCT00153
;
Figure 112009082238916-PCT00154
;
Figure 112009082238916-PCT00155
;
Figure 112009082238916-PCT00156
; 그리고
Figure 112009082238916-PCT00157
.
한 실시예에서, 구조 (XVI)의 화합물은 CT32228이 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XVII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00158
, ( XVII )
여기서:
R1은 직쇄 혹은 분지형 모노-, 폴리-, 혹은 비치환 알킬기, 직쇄 혹은 분지형 모노-, 폴리-, 혹은 비치환 알킬렌 기, 직쇄 혹은 분지형 모노-, 폴리-, 혹은 비치환 아르알킬, 알킬아릴, 혹은 아릴기이다.
R6은 OH, O-M+, O-M2+로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 M은 알칼리 금속, 알칼리토금속 혹은 토금속 혹은 유기질소 염기 양이온, 및 OR이고, R은 1 내지 15개 탄소원자를 가진 치환 혹은 비치환 알킬 혹은 알킬렌 라디칼이다.
구조(XVII)의 화합물들은 당업자들이 알고 있는 유기합성 기법을 사용해서도 만들 수 있고, 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부된Cernerud et al. (미국특허 번호 7,078,543)에 기술된 방법으로도 만들 수 있다. 이 화합물들의 특정 예시들은 본 공개물에도 나와 있다.
구조 (XVII)의 화합물의 특정 예시는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00159
,
이것은 에토목서(Etomoxir)라고도 불린다.
한 실시예에서, 구조 (XVII)의 화합물은 에토목서가 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XVIII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00160
이것의 화학명은 6-[4-(2-피페리딘-1-일-에톡시)-페닐)]-3-피리딘-4-일-피라졸로[1,5-a]-피리미딘이다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XIX)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00161
,
이것은 옥스페니신(oxfenicine)이라고도 불린다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XX)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00162
,
이것은 클로로퀸(chloroquine)이라고도 불린다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXI)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00163
,
이것은 트리콜산(triclosan)이라고도 불린다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00164
,
이것은 에피갈로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate)라고도 불린다.
한 실시예에서, 화합물은 자연에서 생기는 플라보노이드이다.
특정 실시예에서, 화합물은 다음 천연 플라보노이드 중 하나이다:
Figure 112009082238916-PCT00165
,
이것은 루테올린(luteolin)이라고도 불린다.
Figure 112009082238916-PCT00166
,
이것은 케르세틴(quercetin)이라고도 불린다. 또는
Figure 112009082238916-PCT00167
,
이것은 캠퍼롤(kaempferol)이라고도 불린다.
한 실시예에서, 화합물은 CBM-301106이다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXIV)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00168
;
혹은 그것의 치료적으로 적합한 염, 에스테르 혹은 전구약물이다.
여기서:
A는 알케닐, 알콕시알킬, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 할로알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 헤테로사이클, 및 헤테로사이클알킬로 구성된 군에서 선택된다.
B는 아릴 고리와 헤테로아릴 고리로 구성된 군에서 선택되고, 이것은 할로, -할로, -OH, -NO2, NHC(O)-(C1 -6)알킬, CHO, 비닐, 알릴, (C1 -6)하이드록시알킬, NH2, NH(C1 -6)알킬, N[(C1 -6)알킬]2 CH=NOH, CH2N[(C1 -6)알킬]2 혹은 CN으로 임의로 치환될 수 있다.
D는 아릴 고리와 헤테로 아릴 고리로 구성된 군에서 선택된다.
L1은 없거나, 하이드록시알킬렌, -C(CaRb)-, -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)NH-, -NRc-, -NRcCH2-, -NRcC(O)-, -NRcC(O)-O-, -NH-N=CH-, --NRcS(O)2-, -O-, -OC(O)NH-, OC(O)-, O-N=CH-, -S-, -S(O)2-, -S(O2)NH-로 구성된 군에서 선택된다.
L2는 -C(RdRe)-, -(CH2)n-, -NH-, -O-, 및 -S-로 구성된 군에서 선택된다.
n은 1, 2 혹은 3이다.
Z는 알콕시, 하이드록시, 하이드록시알킬, Rg-O- 및 Rj-NH-로 구성된 군에서 선택된 일원이다.
R1은 수소, (C1 -6)할로알킬 혹은 (C1 -6)알킬이다. Ra와 Rb는 수소, 알킬, 할로알킬, 및 하이드록시에서 구성된 군에서 독립적으로 각각 선택된다. 혹은
Ra와 Rb는 부착된 원자와 함께 하나로 취하여 Rf-N=을 형성한다.
Rc는 수소, 알킬, 아릴, 할로알킬, 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 선택된다.
Rd는 알킬, 할로알킬, 하이드록시, 및 할로로 구성된 군에서 선택된다.
Re는 수소, 알킬, 할로알킬, 하이드록시, 및 할로로 구성된 군에서 선택된다. 혹은 Rd와 Re는 부착되어 있는 원자와 함께 하나로 취하여 옥소를 형성한다.
Rf는 알콕시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 및 하이드록시로 구성된 군에서 선택된다.
Rg는 H2N-C(O)- 혹은 (C1 -6)alkylHN-C-(O)-이고, Rj는 알킬카르보닐, 알킬-NH-C(O)-, 알콕시알킬, 알콕시알킬카르보닐, 알콕시카르보닐, 알콕시카르보닐-NH-알킬-NHC(O)-, 알콕시-NH-C(O)-, 시아노알킬카르보닐, 하이드록시, HONH-C(O)-, H2NC(O)-, H2NC(=NH)-, H2NC(O)알킬-NHC(O)-, H2N-O-C(O)-, 헤테로아릴, 헤테로아릴카르보닐, 헤테로사이클, 및 헤테로사이클카르보닐로 구성된 군에서 선택된 일원이다.
구조 (XXIV)의 한 실시예는 구조 (XXIVa)이다.
Figure 112009082238916-PCT00169
;
여기서:
R은 (C1 -6)알킬, (C1 -6)알킬-시클로알킬, (C1 -6)알킬-헤테로아릴, (C1 -6)알킬-헤테로시클로알킬이고, 여기서 X는 -할로, -OH, -NO2, NHC(O)-(C1 -6)알킬, CHO, 비닐, 알릴, (C1 -6)하이드록시알킬, NH2, NH(C1 -6)알킬, N[(C1 -6)알킬]2 CH=NOH, CH2N[(C1-6)알킬]2 혹은 CN이다.
구조 (XXIVa)의 특정 실시예는 아래 표에 나와 있다:
Figure 112009082238916-PCT00170
( XIVa )
Figure 112009082238916-PCT00171
구조 (XXIV)의 또 다른 실시예는 구조 (XXIVb)이다.
Figure 112009082238916-PCT00172
여기서:
R은 (C1 -6)알킬, (C1 -6)알킬-시클로알킬, (C1 -6)알킬-헤테로아릴, (C1 -6)알킬-헤테로시클로알킬이고, 여기서 X는 -할로, -OH, -NO2, NHC(O)-(C1 -6)알킬, CHO, 비닐, 알릴, (C1 -6)하이드록시알킬, NH2, NH(C1 -6)알킬, N[(C1 -6)알킬]2 CH=NOH, CH2N[(C1-6)알킬]2 혹은 CN이다.
특정 실시예에서, 구조 (XXIVb)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00173
혹은
Figure 112009082238916-PCT00174
.
특정 실시예에서, 구조 (XXIV)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00175
.
특정 실시예에서, 구조 (XXIV)의 화합물은 다음이 아니다:
Figure 112009082238916-PCT00176
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXV)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00177
;
여기서:
x와 y는 각각 독립적으로 1, 2 혹은 3이고,
W는 -C(O)N(R1)-, -C(O)N[C(O)R1a]-, -N(R1)C(O)N(R1a)- 혹은 -N(R1)C(O)-이고, V는 -C(O)-, -C(S)-, -C(R10)H, -O- 혹은 -CH2-이다.
각 R1은 수소; 할로, 메틸 혹은 트리플루오로메틸로 구성된 군에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된 (C1-C6)알킬; 메톡시와 하이드록실로 구성된 군에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된 (C2-C6)알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
R1a는 수소, (C1-C6)알킬, 및 시클로알킬로 구성된 군에서 선택된다.
R2는 (C1-C6)알킬, (C2-C12)알케닐, (C2-C12)하이드록시알킬, (C2-C12)하이드록시알케닐, (C2-C12)알콕시, (C2-C12)알콕시알킬, (C3-C12)시클로알킬, (C4-C12)시클로알킬알킬, 아릴, (C7-C12)아르알킬, (C3-C12)헤테로시클릴, (C3-C12)헤테로시클릴알킬, (C3-C12)헤테로아릴, 및 (C3-C12)헤테로아릴알킬로 구성된 군에서 선택된다. 혹은
R2는 2 내지 4개 고리를 가진 다중고리 구조이고, 상기 고리들은 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고 상기 고리들의 일부나 전부는 서로 접합될 수 있다.
R3는 (C1-C6)알킬, (C2-C12)알케닐, (C2-C12)하이드록시알킬, (C2-C12)하이드록시알케닐, (C2-C12)알콕시, (C2-C12)알콕시알킬, (C3-C12)시클로알킬, (C4-C12)시클로알킬알킬, 치환 아릴, 치환 (C7-C12)아르알킬, (C3-C12)헤테로시클릴, (C3-C12)헤테로시클릴알킬, (C3-C12)헤테로아릴, 및 (C3-C12)헤테로아릴알킬로 구성된 군에서 선택된다.혹은
R3는 2 내지 4개 고리를 가진 다중고리 구조이고, 고리들은 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고 고리들의 일부나 전부는 서로 접합될 수 있다.
R4와 R5는 수소, 플루오로, 클로로, 메틸, 메톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로 혹은 -N(R12)2 중에서 각각 독립적으로 선택된다.
R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9, 및R9a는 수소나 (C1-C3)알킬 중에서 각각 독립적으로 선택된다. 혹은
R6와 R6a는 함께, 혹은 R7과 R7a는 함께, 혹은 R8와 R8a는 함께, 혹은 R9와 R9a는 함께 옥소 군이다. 단, V가 -C(O)-일 때, R7과 R7a가 함께 혹은 R8 와 R8a가 함께 옥소 군을 형성하지 않고, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9, 및 R9a는 수소나 (C3-C12)알킬 중에서 각각 독립적으로 선택된다는 전제 하에서이다. 혹은
R6, R6a, R7, 및 R7a 중 하나가 R8, R8a, R9, 및 R9a 중 하나와 함께 알킬렌 가교를 형성하고 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9, 및 R9a는 수소나 (C3-C12)알킬 중에서 각각 독립적으로 선택된다는 전제 하에서이다.
R10은 수소 혹은 (C3-C12)알킬이다. 그리고
각 R12는 수소 혹은 (C1-C6)알킬; 상기의 입체이성질체, 에난티오머 혹은 타우토머, 상기의 약학적으로 허용되는 염류, 상기의 약학적 조성물, 혹은 상기의 전구약물 중에서 독립적으로 선택된다.
특정 실시예에서, 구조 (XXV)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00178
;
여기서:
Ar은 2-트리플루오로메틸페닐, 페닐, 2-플루오로페닐, 3-플루오로페닐, 4-플루오로페닐, 2,3-디플루오로페닐, 2,4-디플루오로페닐, 2,5-디플루오로페닐, 2,6-디플루오로페닐, 2-클로로페닐 혹은 2,5-디클로로페닐이다.
구조 (XXV)의 또 다른 특정 실시예는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00179
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXVI)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00180
여기서:
m은 1, 2 혹은 3이다.
n은 1.2, 3 혹은 4이다.
P는 2, 3 혹은 4이다.
V는 -C(O)-, -S(O)- 혹은 -S(O)2, -O- 혹은 -CH2-이다.
R1은 수소, 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 아르알케닐 혹은 시클로알킬이다.
R2는 수소, -R7-OR8, -R7-N(R8)2, -R7-S(O)tR10 (여기서 t는 0, 1 혹은 2), 알킬, 알케닐, 임의치환(optionally substituted) 아릴, 임의치환 아르알킬, 임의치환 아르알케닐, 임의치환 시클로알킬, 임의치환 시클로알킬알킬, 임의치환 시클로알킬알케닐, 임의치환 헤테로시클릴, 임의치환 헤테로시클릴알킬, 임의치환 헤테로시클릴알케닐, 임의치환 헤테로아릴, 임의치환 헤테로아릴알킬, - 임의치환 헤테로아릴알케닐로 구성된 군에서 선택된다.
R3는 수소, -R9-OR8, -R9-N(R8)2, 알킬, 알케닐, 임의치환 아릴, 임의치환 아르알킬, 임의치환 아르알케닐, 임의치환 시클로알킬, 임의치환 시클로알킬알킬, 임의치환 시클로알킬알케닐, 임의치환 헤테로시클릴, 임의치환 헤테로시클릴알킬, 임의치환 헤테로시클릴알케닐, 임의치환 헤테로아릴, 임의치환 헤테로아릴알킬, 임의치환 헤테로아릴알케닐로 구성된 군에서 선택된다.
각 R4는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 아릴, 시아노, 니트로, -R9-OR8, -R9-N(R8)2 혹은 -S(O)t-R10 (여기서 t는 0, 1 혹은 2)이다.
각 R5와 R6은 독립적으로 수소, 옥소, 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 혹은 아릴이다. 혹은
하나의 R5와 하나의 R6이 함께 하나의 직선형 혹은 분지형 알케닐 가교를 형성할 수 있다.
각 R7은 독립적으로 직선형 혹은 분지형 알킬렌 혹은 알케닐렌 사슬이다.
각 R8은　독립적으로　수소，알킬，알케닐，할로알킬，시클로알킬，시클로알킬알킬，아릴，아르알킬，헤테로시클릴，　헤테로시클릴알킬，헤테로아릴　혹은　헤테로아릴알킬이다．
각　R9는　독립적으로　직접결합이거나, 직선형 혹은 분지형 알킬렌　혹은　알케닐렌　사슬이다．그리고
R10은 알킬, 알케닐, 할로알킬, 시클로알킬，시클로알킬알킬，아릴，아르알킬，헤테로시클릴，헤테로시클릴알킬，헤테로아릴 혹은 헤테로아릴알킬이고, 단일　입체이성질체，입체이성질체들의　혼합체，입체이성질체들의　라세미혼합체，혹은타우토머로서,　혹은　상기의　약학적으로 허용되는 염류，전구약물，용매화합물，혹은　다형체（polymorph）로서이다.
구조(XXVI)의 또 다른 특정 실시예는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00181
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXVII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00182
;
여기서: x와 y는 각각 독립적으로 1, 2 혹은 3이고，
W는 -C(O)N(R1)-, -C(O)N[C(O)R1a]-, -N(R1)C(O)N(R1a)- 혹은 -N(R1)C(O)-이고，V는 -C(O)-, -C(S)-, -C(R10)H, -O- 혹은 -CH2-이다.
각 R1은 수소; 할로, 메틸, 또는 트리플루오로메틸로 구성된 군에서 선택된 1개 이상 치환기로 임의치환된 (C1-C6)알킬; 및 메톡시와 하이드록실로 구성된 군에서 선택된 1개 이상 치환기로 임의치환된 (C2-C6)알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
R1a는 수소, (C1-C6)알킬, 및 시클로알킬로 구성된 군에서 선택된다. R2는 (C1-C6)알킬, (C2-C12)알케닐, (C2-C12)하이드록시알킬, (C2-C12)하이드록시알케닐, (C2-C12)알콕시, (C2-C12)알콕시알킬, (C3-C12)시클로알킬, (C4-C12)시클로알킬알킬, 아릴, (C7-C12)아르알킬, (C3-C12)헤테로시클릴, (C3-C12)헤테로시클릴알킬, (C3-C12)헤테로아릴, 및 (C3-C12)헤테로아릴알킬로 구성된 군에서 선택된다.
혹은 R2는 2 내지 4개 고리를 가진 다중고리 구조이고, 상기 고리들은 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 상기 고리들의 일부나 전부는 서로 접합될 수 있다.
R3은 (C1-C6)알킬, (C2-C12)알케닐, (C2-C12)하이드록시알킬, (C2-C12)하이드록시알케닐, (C2-C12)알콕시, (C2-C12)알콕시알킬, (C3-C12)시클로알킬, (C4-C12)시클로알킬알킬, 치환 아릴, 치환 (C7-C12)아르알킬, (C3-C12)헤테로시클릴, (C3-C12)헤테로시클릴알킬, (C3-C12)헤테로아릴, 및 (C3-C12)헤테로아릴알킬로 구성된 군에서 선택된다. 혹은
R3은 2 내지 4개 고리를 가진 다중고리 구조이고, 상기 고리들은 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고 상기 고리들의 일부나 전부는 서로 접합될 수 있다.
R4와 R5는 수소, 플루오로, 클로로, 메틸, 메톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로 혹은 -N(R12)2 중에서 각각 독립적으로 선택된다.
R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9, 및 R9a는 수소나 (C1-C3)알킬 중에서 각각 독립적으로 선택된다. 혹은
R6와 R6a는 함께, 혹은 R7과 R7a는 함께, 혹은 R8와 R8a는 함께, 혹은 R9와 R9a는 함께 옥소 기이다. 단, V가 -C(O)-일 때, R7과 R7a가 함께 혹은 R8 과 R8a가 함께 옥소 기를 형성하지 않고 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9, 및 R9a는 수소나 (C3-C12)알킬 중에서 각각 독립적으로 선택된다는 전제 하에서이다. 혹은
R6, R6a, R7, 및 R7a 중 하나가 R8, R8a, R9, 및 R9a 중 하나와 함께 알킬렌 가교를 형성하고 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9, 및 R9a는 수소나 (C3-C12)알킬 중에서 각각 독립적으로 선택된다는 전제 하에서이다.
R10은 수소 혹은 (C3-C12)알킬이고,
각 R12는 수소 혹은 (C1-C6)알킬;
이것들의 입체이성질체, 에난티오머 혹은 타우토머, 이것들의 약학적으로 허용되는 염류, 이것들의 약학적 조성물, 이것들의 전구약물 중에서 독립적으로 선택된다.
구조 (XXVII)의 한 실시예는 (XXVIIa)이다:
Figure 112009082238916-PCT00183
;
여기서 R2a는 -H, CH3, HOCH2CH2이고,
Figure 112009082238916-PCT00184
;
여기서 Ar은 2-플루오로페닐, 2-클로로페닐, 2-브로모페닐, 2-시아노페닐 혹은 2-클로로-5-플루오로페닐이다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXVIII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00185
;
여기서:
x와 y는 각각 독립적으로 1, 2 혹은 3이다.
V는 -C(O)-, -C(S)-, -C(R10)H, -O- 혹은 -CH2-이다.
각 R1은 수소; 할로, 메틸 혹은 트리플루오로메틸로 구성된 군에서 선택된1개 이상의 치환기로 임의치환된 (C1-C6)알킬; 메톡시와 하이드록실로 구성된 군에서 선택된 1개 이상의 치환기로 임의치환된 (C2-C6)알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
R1a는 수소, (C1-C6)알킬, 시클로알킬로 구성된 군에서 선택된다.
R2는 (C1-C6)알킬, (C2-C12)알케닐, (C2-C12)하이드록시알킬, (C2-C12)하이드록시알케닐, (C2-C12)알콕시, (C2-C12)알콕시알킬, (C3-C12)시클로알킬, (C4-C12)시클로알킬알킬, 아릴, (C7-C12)아르알킬, (C3-C12)헤테로시클릴, (C3-C12)헤테로시클릴알킬, (C3-C12)헤테로아릴, 및 (C3-C12)헤테로아릴알킬로 구성된 군에서 선택된다. 혹은
R2는 2 내지 4개 고리를 가진 다중고리 구조이고, 상기 고리들은 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 상기 고리들의 일부나 전부는 서로 접합될 수 있다.
R3는 (C1-C6)알킬, (C2-C12)알케닐, (C2-C12)하이드록시알킬, (C2-C12)하이드록시알케닐, (C2-C12)알콕시, (C2-C12)알콕시알킬, (C3-C12)시클로알킬, (C4-C12)시클로알킬알킬, 치환 아릴, 치환 (C7-C12)아르알킬, (C3-C12)헤테로시클릴, (C3-C12)헤테로시클릴알킬, (C3-C12)헤테로아릴, 및 (C3-C12)헤테로아릴알킬로 구성된 군에서 선택된다. 혹은
R3은 2 내지 4개 고리를 가진 다중고리 구조이고, 상기 고리들은 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 상기 고리들의 일부나 전부는 서로 접합될 수 있다.
R4와 R5는 수소, 플루오로, 클로로, 메틸, 메톡시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로 혹은 -N(R12)2 중에서 각각 독립적으로 선택된다.
R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9, 및 R9a는 수소나 (C1-C3)알킬 중에서 각각 독립적으로 선택된다. 혹은
R6와 R6a는 함께, 혹은 R7과 R7a는 함께, 혹은 R8와 R8a는 함께, 혹은 R9와 R9a는 함께 옥소 기이다. 단, V가 -C(O)-일 때, R7과 R7a가 함께 혹은 R8과 R8a가 함께 옥소 기를 형성하지 않고, 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9, R9a는 수소나 (C3-C12)알킬 중에서 각각 독립적으로 선택된다는 전제 하에서이다. 혹은
R6, R6a, R7, 및 R7a 중 하나가 R8, R8a, R9, 및 R9a 중 하나와 함께 알킬렌 가교를 형성하고 나머지 R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9, 및 R9a는 수소나 (C3-C12)알킬 중에서 각각 독립적으로 선택된다는 전제 하에서이다.
R10은 수소 혹은 (C3-C12)알킬이고,
각 R12는 수소 혹은 (C1-C6)알킬; 이것들의 입체이성질체, 에난티오머 혹은 타우토머, 이것들의 약학적으로 허용되는 염류, 이것들의 약학적 조성물, 또는 이것들의 전구약물 중에서 독립적으로 선택된다.
한 실시예에서, 구조 (XVIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00186
, 또는
Figure 112009082238916-PCT00187
구조 (XXVIII)의 한 특정 실시예는 다음과 같은 (XXVIIIa)이다:
Figure 112009082238916-PCT00188
;
여기서:
R13 은 -CH3, -CF3, n-Pr 혹은 -CH2Ph이고, 여기서
Ar은 페닐, 2-클로로페닐, 2-플루오로페닐, 2-메틸페닐 혹은 2-클로로-5-플루오로페닐이다.
구조 (XXVIII)의 또 다른 특정 실시예는 다음과 같은 (XVIIIb)이다:
Figure 112009082238916-PCT00189
;
여기서 R13은 -CH3, -CF3, n-Pr 혹은 -CH2Ph이고,
여기서 Ar은 페닐, 2-클로로페닐, 2-플루오로페닐, 2-메틸페닐 혹은 2-클로로-5-플루오로페닐이다.
구조 (XXVIII)의 또 다른 특정 실시예는 다음과 같은 (XXVIIIc)이다:
Figure 112009082238916-PCT00190
;
여기서 R13은 -CH3, -CF3, n-Pr 혹은 -CH2Ph이고,
여기서 Ar은 페닐, 2-클로로페닐, 2-플루오로페닐, 2-메틸페닐 혹은 2-클로로-5-플루오로페닐이다.
구조 (XXVIII)의 또 다른 특정 실시예는 다음과 같은 (XXVIIId)이다:
Figure 112009082238916-PCT00191
여기서 Het은 다음과 같고,
Figure 112009082238916-PCT00192
;
여기서 Ar은 페닐, 2-클로로페닐, 2-플루오로페닐, 2-메틸페닐 혹은 2-클로로-5-플루오로페닐이다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXIX)를 갖는다:.
Figure 112009082238916-PCT00193
;
여기서:
X는 -(C5-C20)알킬, -O-(C5-C20)알킬 혹은 -(C5-C20)알콕시이고,
R은 -O-(C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, O-(C1-C6)알킬-NHC(O)-(C1-C6)알킬, -NH2 혹은 -NH-(C1-C6)알킬;
그것들의 입체이성질체, 에난티오머 혹은 타우토머, 그것들의 약학적으로 허용되는 염류, 그것들의 금속 킬레이트, 그것들의 약학적 조성물 혹은 그것들의 전구약물이다.
특정 실시예에서, 구조 (XXIX)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00194
;
Figure 112009082238916-PCT00195
;
Figure 112009082238916-PCT00196
;
Figure 112009082238916-PCT00197
또는
Figure 112009082238916-PCT00198
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXX)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00199
;
여기서:
X는 -(C1-C6)알킬, -(C1-C6)알콕시, -(C1-C6)알켄옥시, -(C1-C6)하이드록시알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 헤테로아릴, -CN, -CHO, -CO(C1-C6)알킬, -S(C1-C6)알킬, -CON[(C1-C6)알킬]2, -CONH2, -(C1-C6)알킬COO(C1-C6)알킬, -(C1-C6)알킬OCOO(C1-C6)알킬, -(C1-C6)알케닐COO(C1-C6)알킬, -CO(C1-C6)알킬COO(C1-C6)알킬, CO(C1-C6)알킬COOH, -O(C1-C6)알킬COO(C1-C6)알킬 또는 -S(C1-C6)알킬COO(C1-C6)알킬이다.
특정 실시예에서, 구조 (XXX)의 화합물은 다음과 같다.
Figure 112009082238916-PCT00200
;
Figure 112009082238916-PCT00201
;
Figure 112009082238916-PCT00202
;
Figure 112009082238916-PCT00203
;
Figure 112009082238916-PCT00204
;
Figure 112009082238916-PCT00205
;
Figure 112009082238916-PCT00206
혹은
Figure 112009082238916-PCT00207
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXXI)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00208
;
여기서:
X는-(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)알킬 혹은 -(C5-C20)알콕시, -(C5-C20)할로알킬, -O-(C5-C20)할로알킬 혹은 -(C5-C20)할로알콕시, -할로, -OH, -(C5-C20)알케닐, -(C5-C20)알키닐, -(C5-C20)알콕시-알케닐, -(C5-C20)하이드록시알킬, -O(C1-C6)알킬, -CO2(C1-C6)알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐, -O(C5-C20)시클로알킬;, -S(C5-C20)알킬, -NH(C5-C20)알킬, -NHCO(C5-C20)알킬, -N(C1-C6)알킬CO(C5-C20)알킬 또는 -O(C5-C20)알콕시이다.
R은 -H 혹은 -(C1 -C6)알킬이다.
m은 1, 2 혹은 3이다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXI)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00209
Figure 112009082238916-PCT00210
;
Figure 112009082238916-PCT00211
Figure 112009082238916-PCT00212
혹은
Figure 112009082238916-PCT00213
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXXIII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00214
;
여기서:
Y는 O 혹은 S; -NH 혹은 N(C1-C6)알킬이다.
X는 -COOH, -CO2(C1-C6)알킬, -CONH-2, -H, -CO(C1-C6)알킬, -COC(할로)3이거나,
Figure 112009082238916-PCT00215
혹은 보효소 A와 함께 부가생성물(adduct)을 형성할 수 있는 성분이다. 그리고
Z는-(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)알킬 혹은 -(C5-C20)알콕시, -(C5-C20)할로알킬, -O-(C5-C20)할로알킬 혹은 -(C5-C20)할로알콕시, -할로, -OH, -(C5-C20)알케닐, -(C5-C20)알키닐, -(C5-C20)알콕시-알케닐, -(C5-C20)하이드록시알킬, -O(C1-C6)알킬, -CO2(C1-C6)알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐, -O(C5-C20)시클로알킬;, -S(C5-C20)알킬, -NH(C5-C20)알킬, -NHCO(C5-C20)알킬, -N(C1-C6)알킬CO(C5-C20)알킬 혹은 -O(C5-C20)알콕시이다.
한 실시예에서, 구조 (XXXIII)의 화합물은 Y가 O인 화합물이다.
한 실시예에서, 구조 (XXXIII)의 화합물은 X가 -COOH인 화합물이다.
한 실시예에서, 구조 (XXXIII)의 화합물들은 Z가 -O(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)할로알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐 혹은 -O(C5-C20)알콕시인 화합물이다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XXXIII)의 화합물들은 Y가 O이고, X는 -COOH 이고, Z는 -O(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)할로알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐 혹은 -O(C5-C20)알콕시인 화합물이다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XXXIII)의 화합물들은 X가 보효소 A와 함께 에스테르 결합(ester linkage)을 형성할 수 있는 성분이다. 예컨대. X는 다음 구조의 화합물을 형성할 수 있는 성분일 수 있다:
Figure 112009082238916-PCT00216
.
특정 실시예에서, 구조 (XXXIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00217
;
여기서:
X는 -COOH, -CO2(C1-C6)알킬, -CONH-2, -H, -CO(C1-C6)알킬, -COC(할로)3이거나,
Figure 112009082238916-PCT00218
혹은 보효소 A와 함께 부가생성물(adduct)을 형성할 수 있는 성분이다.
또 다른 특정 실시예에서, 구조 (XXXIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00219
;
Figure 112009082238916-PCT00220
혹은
Figure 112009082238916-PCT00221
.
특정 실시예에서, 구조 (XXXIII)의 화합물들은 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부되는 Parker et al.(J. Med . Chem . 1977, 20, 781-791)에 공개되어 있는 화합물들이다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXXII)를 갖는다.
Figure 112009082238916-PCT00222
;
여기서:
X는 -(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)알킬 혹은 -(C5-C20)알콕시, -(C5-C20)할로알킬, -O-(C5-C20)할로알킬 혹은 -(C5-C20)할로알콕시, -할로, -OH, -(C5-C20)알케닐, -(C5-C20)알키닐, -(C5-C20)알콕시-알케닐, -(C5-C20)하이드록시알킬, -O(C1-C6)알킬, -CO2(C1-C6)알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐, -O(C5-C20)시클로알킬, -S(C5-C20)알킬, -NH(C5-C20)알킬, -NHCO(C5-C20)알킬, -N(C1-C6)알킬CO(C5-C20)알킬 혹은 -O(C5-C20)알콕시이다.
Y는 O, S, -NH 혹은N(C1-C6 )알킬이다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00223
;
Figure 112009082238916-PCT00224
;
Figure 112009082238916-PCT00225
;
Figure 112009082238916-PCT00226
;
Figure 112009082238916-PCT00227
; 혹은
Figure 112009082238916-PCT00228
.
특정 실시예에서, 구조 (XXXII)의 화합물들은 인용에 의해 이 안에 완전히 첨부되는 Parker et al.(J. Med . Chem . 1977, 20, 781-791)에 공개되어 있는 화합물들이다.
한 실시예에서, 구조 (XXXIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00229
,
[구조 (XXIII)], 이것은 TOFA라고도 불리며, 화학명은 5-(tetradecyloxy)-2-furoic acid [5-(테트라데실옥시)-2-푸로산]이다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXIII)의 화합물은 TOFA가 아니고, 다음 구조로도 묘사된다:
Figure 112009082238916-PCT00230
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXXIV)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00231
;
여기서:
R1은 수소, 시클로알킬, 알킬, 및 할로알킬로 구성된 군에서 선택된다.
Y는 -(CR4aR4b)m-, -C(O)-, -0-, -N(H)-, N(알킬)-, 및 -S-로 구성된 군에서 선택되고, 여기서
m은 1, 2 혹은 3이다.
m이 1, 2, 혹은 3일 때, 각 R4a과 R4b는, 각 경우에, 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
다른 식으로, m이 1일 때는 R4a 와 R4b 는 부착되는 탄소와 함께 단일환 시클로알킬 혹은 헤테로사이클 고리를 형성한다.
Ar3는 페닐 혹은 단일환 헤테로아릴이다. 여기서 Ar3는 하기 것들로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 1, 2 혹은 3 혹은 4개의 치환기로 치환된다: 알킬, 알케닐, -CN, -NO2, 할로겐, -OR5, -O-N=CH(R2), -OC(O)R2, -OC(O)N(R3)(R5), -OC(O)OR2, -OS(O)2R5, -SR2, -S(O)R2, -S(O)2R5, -S(O)2OR5, -S(O)2N(R3)(R5), -C(O)R5, -C(O)N(R3)(R5), -C(O)OR5, -C(O)N(R3)(R5), -N(R3)(R5), -N(H)-N=CH(R2), --N(R3)C(O)R2, -N(R3)C(O)OR5, -N(R3)S(O)2R5, -N(R3)C(O)N(R3)(R5), -N(R3)S(O)2N(R3)(R5), -R8, 할로알킬, 시아노알킬, 니트로알킬, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 할로알콕시알킬, -알킬레닐-OC(O)R2, -알킬레닐-OC(O)N(R3)(R5), -알킬레닐-OC(O)OR2, -알킬레닐-OS(O)2R5, -알킬레닐-SR2, -알킬레닐-S(O)R2, -알킬레닐-S(O)2R5, -알킬레닐-S(O)2OR5, -알킬레닐-S(O)2N(R3)(R5), -알킬레닐-C(O)R5, -알킬레닐-C(O)N(R3)(R5), -알킬레닐-C(O)OR5, -알킬레닐-C(O)N(R3)(R5), -알킬레닐-N(R3)(R5), -알킬레닐-N(R3)C(O)R2, -알킬레닐-N(R2)C(O)OR5, -알킬레닐-N(R3)S(O)2R5, -알킬레닐-N(R3)C(O)N(R3)(R5), 및 -알킬레닐-N(R3)S(O)2N(R3)(R5), -알킬레닐-R8.
각 경우의 R2는 알킬, 알케닐, 할로알킬, 알콕시알킬, 할로알콕시알킬, -R8, 및 -알킬레닐-R8로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R3는 수소, 알킬, 아릴알킬, 할로알킬, 및 헤테로아릴알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R5는 수소, 알킬, 알케닐, 할로알킬, 알콕시알킬, 할로알콕시알킬, -R8, 및 -알킬레닐-R8로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
Ar1은 페닐과 단일환, 5 내지 6원자 헤테로아릴 고리로 구성된 군에서 선택된다.
Ar2는 단일환, 5원자 헤테로아릴 고리이고, 여기서 Ar2는 하기 것들로 구성된 군에서 선택된 1 개 혹은 2개의 치환기로 독립적으로 치환 혹은 비치환 된다: 알킬, 알케닐, 할로겐, -CN, -NO2, 하이드록시, 알콕시, -NH2, -N(H)(알킬), -N(알킬)2, -C(O)OH, -C(O)O알킬, -C(O)H, -C(O)알킬, 및 할로알킬.
Z는 -OR9a, -알킬레닐-OR9a, -NR6R9b, 및 -알킬레닐-NR6R9b로 구성된 군에서 선택된다.
각 경우의 R6는 수소, 알킬, 및 할로알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R9a는 하기 것들로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다: 수소, 알킬, 할로알킬, R8, -C(O)OR10, -S(O)2R10, -C(O)NR7R11, -S(O)2NR7R11, -C(O)R10, -알킬레닐-OR10, -알킬레닐-NR7R11, -알킬레닐-N(R7)C(O)OR10, -알킬레닐-N(R7)C(O)R10, -알킬레닐-C(O)OR10, -알킬레닐-S(O)2R10, -알킬레닐-S(O)2NR7R11, -알킬레닐-C(O)NR7R11, -알킬레닐-C(O)R10, 및 -알킬레닐-R8.
각 경우의 R9b는 하기 것들로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다: 수소, 알킬, 하이드록시, 알콕시, R8, -C(=NH)NH2, -C(O)OR10, -S(O)2R10, -C(O)NR7R12, -C(O)ONH2, -S(O)2NR7R12, -C(O)R10, -C(O)CH2C(O)R10, 할로알킬, -알킬레닐-OR10, -알킬레닐-NR7R12, -알킬레닐-N(R7)C(O)OR10, -알킬레닐-N(R7)C(O)R10, -알킬레닐-C(O)OR10, -알킬레닐-S(O)2R10, -알킬레닐-S(O)2NR7R12, -알킬레닐-C(O)NR7R12, -알킬레닐-C(O)R10, 및 -알킬레닐-R8.
각 경우의 R7은 수소, 알킬, 및 할로알킬로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R10는 수소, 알킬, 알콕시알킬, 시아노알킬, 할로알킬, -R8, 및 알킬레닐-R8로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R11는 수소, 알킬, 하이드록시, 알콕시, 알콕시알킬, 시아노알킬, 할로알킬, -R8, 및 -알킬레닐-R8로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R12는 수소, 알킬, 하이드록시, 알콕시, --R8, 알콕시알킬, 시아노알킬, 할로알킬, -알킬레닐-C(O)NH2, -알킬레닐-C(O)N(H)(알킬), -알킬레닐-C(O)N(알킬)2, -알킬레닐-N(H)C(O)O알킬, -알킬레닐-N(알킬)C(O)O알킬, 및 -알킬레닐-R8로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. 그리고
각 경우의 R8은 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 시클로알킬, 및 시클로알케닐로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. 그리고 페닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 및 아릴알킬의 아릴 성분, 및 Ar1, R3 및 R8로 표현된 헤테로아릴알킬의 헤테로아릴 성분은 하기 것들로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 1, 2, 3 혹은 4개의 치환기로 각각 독립적으로 치환 혹은 비치환 된다: 알킬, 알케닐, -CN, -NO2, 할로겐, 에틸렌디옥시, 메틸렌디옥시, 옥소, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)ORa, -OS(O)2Ra, -S(알킬), -S(O)알킬, -S(O)2알킬, -S(O)2ORa, -S(O)2NRaRb, -C(O)ORa, -C(O)NRaRa, -C(O)ORa, -C(O)NRaRb, -NRaRb, -NORa, -N(Rb)C(O)Ra, -N(Rb)C(O)ORa, -N(Rb)S(O)2Ra, -N(Rb)C(O)NRaRb, -N(Rb)S(O)2NRaRb, 할로알킬, 시아노알킬, 니트로알킬, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 할로알콕시알킬, -알킬레닐-OC(O)Ra, -알킬레닐-OC(O)ORa, -알킬레닐-OS(O)2알킬, -알킬레닐-S(알킬), -알킬레닐-S(O)알킬, -알킬레닐-S(O)2알킬, -알킬레닐-S(O)2ORa, -알킬레닐-S(O)2NRaRb, -알킬레닐-C(O)Ra, -알킬레닐-C(O)NRaRb, -알킬레닐-C(O)ORa, -알킬레닐-C(O)NRaRb, -알킬레닐-NRaRb, -알킬레닐-N(Rb)C(O)Ra, -알킬레닐-N(Rb)C(O)ORa, -알킬레닐-N(Rb)S(O)2Ra, -알킬레닐-N(Rb)C(O)NRaRb, 및-알킬레닐-N(Rb)S(O)2NRaRb. 여기서
각 경우의 Ra는 수소, 알킬, 알케닐, 및 할로알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 Rb는 수소와 알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXIV)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00232
;
Figure 112009082238916-PCT00233
;
Figure 112009082238916-PCT00234
;
Figure 112009082238916-PCT00235
혹은
Figure 112009082238916-PCT00236
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXXV)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00237
;
여기서:
R1은 수소, 알킬, 할로알킬, 혹은 시클로알킬이고,
L1은 -CRxRy-, -C(O)-, -O-, -S-, -N(알킬)-, 혹은 -N(H)-이다. 여기서 각 Rx와Ry는 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 및 할로알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. 혹은 Rx와 Ry는 부착되는 탄소와 함께 3 내지 6원자의 단일환 고리 (이 단일환 고리는 시클로알킬과 헤테로사이클 고리로 구성된 군에서 선택된다)를 형성한다.
RA, RB 및 RC는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 할로겐 혹은 할로알킬이다.
Z는 -CN, -OR2, -알킬레닐-OR2, --N(R3)(R4) 혹은 -알킬레닐-N(R3)(R4)이다.
각 경우의 R2는 수소, 알킬, 할로알킬, -C(O)ORa, -S(O)2Ra, -C(O)N(Ra)(Rb), -S(O)2N(Ra)(Rb), -C(O)Ra, -알킬레닐-ORa, -알킬레닐-N(Ra)(Rb), -알킬레닐 -N(Rb)C(O)ORa, -알킬레닐-N(Rb)C(O)N(Ra)(Rb), -알킬레닐-N(Rb)C(O)Ra, -알킬레닐-N(Rb)S(O)2Ra, -알킬레닐-C(O)ORa, -알킬레닐-S(O)2Ra, -알킬레닐-S(O)2ORa, -알킬레닐-S(O)2N(Ra)(Rb), -알킬레닐-C(O)N(Ra)(Rb), 및 -알킬레닐-C(O)Ra로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다:
각 경우의 R3는 수소, 알킬, 및 할로알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R4는 수소, 알킬, 하이드록시, 알콕시, -C(=NH)NH2, -C(O)ORa, -S(O)2Ra, -C(O)N(Ra)(Rb), --S(O)2N(Ra)(Rb), -C(O)Ra, -C(O)CH2C(O)Ra, 할로알킬, -알킬레닐-ORa, -알킬레닐-N(Ra)(Rb), -알킬레닐-N(Rb)C(O)ORa, -알킬레닐-N(Rb)C(O)N(Ra)(Rb), -알킬레닐-N(Rb)S(O)S2Ra, -알킬레닐-N(Rb)C(O)Ra, -알킬레닐-C(O)ORa, -알킬레닐-S(O)2Ra, -알킬레닐-S(O)2ORa, -알킬레닐-S(O)2N(Ra)(Rb), -알킬레닐-C(O)N(Ra)(Rb), 및 -알킬레닐-C(O)Ra로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다:
Ar1은 페닐 혹은 단일환 헤테로아릴이고, 상기 각각은 페닐 혹은 단일환, 5 내지 6원자 고리(이 고리는 시클로알킬, 시클로알케닐, 헤테로사이클, 및 헤테로아릴로 구성된 군에서 선택된다)에 임의로 접합된다. 각 Ar1은 하기 것들로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 1, 2, 3 혹은 4개의 치환기와 독립적으로 치환 혹은 비치환 된다: 알킬, 알케닐, -CN, -NO2, 할로겐, -OR6, -O-N=CH(R5), -OC(O)R5, -OC(O)N(R7)(R6), -OC(O)OR5, -OS(O)2R5, -SR6, -S(O)R5, -S(O)2R5, -S(O)2OR6, -S(O)2N(R7)(R6), -C(O)R6, -C(O)N(R7)(R6), -C(O)OR6, -C(O)N(R7)(R6), -N(R7)(R6), -N(H)-N=CH(R5), -N(R7)C(O)R6, --N(R7)C(O)OR6, --N(R7)S(O)2R6, --N(R7)C(O)N(R7)(R6), -N(R7)S(O)2N(R7)(R6), -R8, 할로알킬, 시아노알킬, 니트로알킬, 하이드록시알킬,알콕시알킬, 할로알콕시알킬, -알킬레닐-OC(O)R5, -알킬레닐-OC(O)N(R7)(R6), -알킬레닐-OC(O)OR5, -알킬레닐-OS(O)2R5, -알킬레닐-SR6, -알킬레닐-S(O)R5, -알킬레닐-S(O)2R5, -알킬레닐-S(O)2OR6, -알킬레닐-S(O)2N(R7)(R6), -알킬레닐-C(O)R6, -알킬레닐-C(O)N(R7)(R6), -알킬레닐-C(O)OR6, -알킬레닐-C(O)N(R7)(R6), -알킬레닐-N(R7)(R6), -알킬레닐-N(R7)C(O)R5, -알킬레닐-N(R7)C(O)OR5, -알킬레닐-N(R7)S(O)2R5, -알킬레닐-N(R7)C(O)N(R7)(R6), -알킬레닐-N(R7)S(O)2N(R7)(R6), 및 -알킬레닐-R8.
각 경우의 R5는 알킬, 알케닐, 할로알킬, 알콕시알킬, 할로알콕시알킬, -R8, 및 -알킬레닐-R8로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R6는 수소, 알킬, 알케닐, 할로알킬, 알콕시알킬, 할로알콕시알킬, -R8, 및 -알킬레닐-R8로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R7는 수소, 알킬, 아릴알킬, 할로알킬, 및 헤테로아릴알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R8은 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 시클로알킬, 및 시클로알케닐로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. 그리고 페닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 아릴알킬의 아릴 성분, 및 R7과 R8로 표현된 헤테로아릴알킬의 헤테로아릴 성분은 하기 것들로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 1, 2, 3 혹은 4개의 치환기로 각각 독립적으로 치환 혹은 비치환 된다: 알킬, 알케닐, -CN, -NO2, 할로겐, 에틸렌디옥시, 메틸렌디옥시, 옥소, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)ORa, -OS(O)2Ra, -S(알킬), -S(O)알킬, -S(O)2알킬, -S(O)2ORa, -S(O)2NRaRb, -C(O)Ra, -C(O)NRaRb, C(O)ORa, -C(O)NRaRb, -NRaRb, -NORa, -N(Rb)C(O)Ra, -N(Rb)C(O)ORa, -N(Rb)S(O)2Ra, N(Rb)C(O)NRaRb, -N(Rb)S(O)2NRaRb, 할로알킬, 시아노알킬, 니트로알킬, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 할로알콕시알킬, -알킬레닐-OC(O)Ra, -알킬레닐-OC(O)ORa, -알킬레닐-OS(O)2알킬, -알킬레닐-S(알킬), -알킬레닐-S(O)알킬, -알킬레닐-S(O)2알킬, -알킬레닐-S(O)2ORa, -알킬레닐-S(O)2NRaRa, -알킬레닐-C(O)Ra, -알킬레닐-C(O)NRaRb, -알킬레닐-C(O)ORa, -알킬레닐-C(O)NRaRb, -알킬레닐-NRaRb, -알킬레닐-N(Rb)C(O)Ra, -알킬레닐-N(Rb)C(O)ORa, -알킬레닐-N(Rb)S(O)2Ra, -알킬레닐-N(Ra)C(O)NRaRb, 및 -알킬레닐-N(Rb)S(O)2NRaRb.
각 경우의 Ra는 수소, 알킬, 알케닐, 및 할로알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. 그리고
각 경우의 Rb는 수소와 알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXV)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00238
;
Figure 112009082238916-PCT00239
;
Figure 112009082238916-PCT00240
;
Figure 112009082238916-PCT00241
;
Figure 112009082238916-PCT00242
;
Figure 112009082238916-PCT00243
혹은
Figure 112009082238916-PCT00244
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXXVI)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00245
혹은 약학적으로 허용되는 염류, 전구약물, 전구약물의 염, 혹은 그것들의 조합을 갖는다. 여기서
Y는 -CRxRy--, -C(O)-, -O-, -N(H)-, -N(알킬)- , 및 -S-로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. 여기서
각 Rx와 Ry는 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 및 할로알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. 혹은 Rx와 Ry는 부착되는 탄소와 함께 단일환 시클로알릴 혹은 헤테로사이클 고리를 형성한다.
Ar1은 페닐과 단일환, 5 내지 6원자의 헤테로아릴 고리로 구성된 군에서 선택된다.
Ar3는 페닐 혹은 단일환 헤테로아릴이다. 여기서 Ar3은 하기 것들로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 1, 2, 3 혹은 4개의 치환기로 치환된다: 알킬, 알케닐, -CN,-NO2, 할로겐, -OR2, -O-N=CH(R1), -OC(O)R1, -OC(O)N(R3)(R2), -OC(O)OR1, -OS(O)2R1, -SR2, --S(O)R1, -S(O)2R2, -S(O)2OR2, -S(O)2N(R3)(R2), -C(O)R-, -C(O)N(R3)(R2), -C(O)OR2, -C(O)N(R3)(R2), -N(R3)(R2), -N(H)-N-CH(R1), -N(R3)C(O)R2, -N(R3)C(O)OR2, -N(R3)S(O)2R1, -N(R3)C(O)N(R3)(R2), -N(R3)S(O)2N(R3)(R2), -R4, 할로알킬, 시아노알킬, 니트로알킬, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 할로알콕시알킬, -알킬레닐-CO(O)R1, -알킬레닐-OC(O)N(R3)(R2), -알킬레닐-OC(O)OR1, -알킬레닐-OS(O)R1, -알킬레닐-SR2, -알킬레닐-S(O)R1, -알킬레닐-S(O)2R1, -알킬레닐-S(O)2OR2, -알킬레닐-S(O)2N(R3)(R2), -알킬레닐-C(O)R2, -알킬레닐-C(O)N(R3)(R2), -알킬레닐-C(O)OR2, -알킬레닐-C(O)N(R2)(R2), -알킬레닐-N(R3)(R2), -알킬레닐-N(R3)C(O)R2, -알킬레닐-N(R3)C(O)OR2, -알킬레닐-N(R3)S(O)2R1, -알킬레닐-N(R3)C(O)N(R3)(R2), -알킬레닐-N(R3)S(O)2N(R3)(R2), 및 -알킬레닐-R4.
각 경우의 R1는 알킬, 알케닐, 할로알킬, 알콕시알킬, 할로알콕시알킬, -R4, 및 -알킬레닐-R4로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R2는 수소, 알킬, 알케닐, 할로알킬, 알콕시알킬, 할로알콕시알킬, -R4, 및 -알킬레닐-R4로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R3는 수소, 알킬, 아릴알킬, 할로알킬, 및 헤테로아릴알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R4는 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 시클로알킬, 및 시클로알케닐로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
Ar2는 (a), (b), (c), (d), 혹은 (e) 구조식을 가진 기이다.
Figure 112009082238916-PCT00246
(a)
Figure 112009082238916-PCT00247
(b)
Figure 112009082238916-PCT00248
(c)
Figure 112009082238916-PCT00249
(d)
Figure 112009082238916-PCT00250
(e)
여기서
R은 수소, 시클로알킬, 알킬 혹은 할로알킬이다.
Z1, Z2, Z3 및 Z4는C(R101)이다. 혹은 Z1, Z2, Z3, 및 Z4 중에서 1개나 2개는 N이고 나머지는 C(R101)이다.
Z5, Z6, 및 Z7은 C(R102)이다. 혹은 Z5, Z6, 및 Z7 중 1개나 2개는 N이고 나머지는 C(R102)이다. R101과R102는 각 경우에 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 할로겐, -CN, -NO2, 하이드록시, 알콕시, -NH2, -N(H)(알킬), -N(알킬)2, -C(O)OH, -C(O)O알킬, -C(O)H, -C(O)알킬, 혹은 할로알킬이다.
W1은 CH2이고, W2는CH2, CH2-CH2, 혹은 X-CH2이다. 여기서 X는 W1에 연결되고, X는 N(Rz), O 혹은 S이다. 혹은
W1은 N(Rz), O 혹은 S이고, W2는 CH2-CH2이다.
각 경우의 Rz는 독립적으로 수소, 알킬, 할로알킬, -C(O)O알킬, -C(O)알킬, -C(O)NH2), -C(O)N(H)(알킬), -C(O)N(알킬)2, -S(O)2NH2, -S(O)2N(H)(알킬) 혹은 --S(O)2N(알킬)2이다.
Z는 -OR5, -알킬레닐-OR5, -N(R6)(R7), 및 -알킬레닐-N(R6)(R7)로 구성된 군에서 선택된다.
각 경우의 R5는 수소, 알킬, 할로알킬, R4, -C(O)OR8, -S(O)2R8, -C(O)N(R9)(R10), -S(O)2N(R9)(R10), --C(O)R8, -알킬레닐-OR8, -알킬레닐-N(R9)(R10), -알킬레닐-N(R9)C(O)OR8, -알킬레닐-N(R9)C(O)R8, -알킬레닐-C(O)OR9, -알킬레닐-S(O)2R8, -알킬레닐-S(O)2N(R9)(R10), -알킬레닐-C(O)N(R9)(R10), -알킬레닐-C(O)R8, 및 -알킬레닐-R4로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R6는 수소, 알킬, 및 할로알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R7은 수소, 알킬, 하이드록시, 알콕시, R4, -C(=NH)NH2, -C(O)OR8, --S(O)2R8, -C(O)N(R9)(R11), -C(O)ON(R9)(R11), -S(O)2N(R9)(R11), -C(O)R8, -C(O)CH2C(O)R8, 할로알킬, -알킬레닐-OR8, -알킬레닐-N(R9)(R11), -알킬레닐-N(R9)C(O)OR8, -알킬레닐-N(R9)C(O)R9, -알킬레닐-C(O)OR8, -알킬레닐-S(O)2R8, -알킬레닐-S(O)2N(R9)(R11), -알킬레닐-C(O)N(R9)(R11), -알킬레닐-C(O)R8, 및 -알킬레닐-R4로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R8은 수소, 알킬, 알콕시알킬, 시아노알킬, 할로알킬, --R4, 및 -알킬레닐-R4로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R9은 수소, 알킬, 및 할로알킬로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R10는 수소, 알킬, 하이드록시, 알콕시, 알콕시알킬, 시아노알킬, 할로알킬, -R4, 및 -알킬레닐-R4로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
각 경우의 R11는 수소, 알킬, 하이드록시, 알콕시, -R4, 알콕시알킬, 시아노알킬, 할로알킬, -알킬레닐-C(O)NH2, -알킬레닐-C(O)N(H)(알릴), -알킬레닐-C(O)N(알킬)2, -알킬레닐-N(H)C(O)O알킬, -알킬레닐-N(알킬)C(O)O알킬, 및 -알킬레닐-R4로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. 그리고
페닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 아릴알킬의 아릴 성분, 및 Ar1, R3 및 R4로 표현된 헤테로아릴알킬의 헤테로아릴 성분은 하기 것들로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 1, 2, 3 혹은 4개의 치환기로 각각 독립적으로 치환 혹은 비치환 된다: 알킬, 알케닐, -CN, -NO2, 할로겐, 에틸렌디옥시, 메틸렌디옥시, 옥소, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)ORa, -OS(O)2Ra, -S(알킬), -S(O)알킬, -S(O)2알킬, -S(O)2ORa, -S(O)2NRaRb, -C(O)Ra, -C(O)NRaRb, -C(O)ORaRb, -C(O)NRaRb, -NRaRb, -NORa, N(Rb)C(O)Ra, -N(Rb)C(O)ORa, -N(Rb)S(O)2Ra, -N(Rb)C(O)NRaRb, -N(Rb)S(O)2NRaRb, 할로알킬, 시아노알킬, 니트로알킬, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 할로알콕시알킬, -알킬레닐-OC(O)Ra, -알킬레닐-OC(O)ORa, -알킬레닐-OS(O)2알킬, -알킬레닐-S(알킬), -알킬레닐-S(O)알킬, -알킬레닐-S(O)2알킬, -알킬레닐-S(O)2ORa, -알킬레닐-S(O)2NRaRb, -알킬레닐-C(O)Ra, -알킬레닐-C(O)NRaRb, -알킬레닐-C(O)ORa, -알킬레닐-C(O)NRaRb, -알킬레닐-NRaRb, -알킬레닐-N(Rb)C(O)Ra, -알킬레닐-N(Rb)C(O)ORa, -알킬레닐-N(Rb)S(O)2Ra, -알킬레닐-N(Rb)C(O)NRaRb, 및 -알킬레닐-N(Rb)S(O)2NRaRb. 여기서:
각 경우의 Ra는 수소, 알킬, 알케닐, 및 할로알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. 그리고
각 경우의 Rb는 수소와 알킬로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVI)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00251
;
Figure 112009082238916-PCT00252
;
Figure 112009082238916-PCT00253
혹은
Figure 112009082238916-PCT00254
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXXVII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00255
;
여기서:
W는 -OH, -O(C1-C6)알킬, -NH2, N((C1-C6)알킬)2, -NH(C1-C6)알킬, -SH, -S(C1-C6)알킬, 할로, -CN, -H 혹은-(C1-C6)알킬이다.
X는 -OH, -O(C1-C6)알킬, -NH2, N((C1-C6)알킬)2, -NH(C1-C6)알킬, -SH, -S(C1-C6)알킬, 할로, -CN, -H 혹은-(C1-C6)알킬이다.
Y는 -OH, -O(C1-C6)알킬, -NH2, N((C1-C6)알킬)2, -NH(C1-C6)알킬, -SH, -S(C1-C6)알킬, 할로, -CN, -H 혹은-(C1-C6)알킬이다.
Z는 -OH, -O(C1-C6)알킬, -NH2, N((C1-C6)알킬)2, -NH(C1-C6)알킬, -SH, -S(C1-C6)알킬, 할로, -CN, -H 혹은-(C1-C6)알킬이다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00256
;
이것은 쿠르쿠민(curcumin)이라고도 불린다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVII)의 화합물은 쿠르쿠민이 아니다.
또 다른 특정 실시예에서, 구조 (XXXVII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00257
;
Figure 112009082238916-PCT00258
;
Figure 112009082238916-PCT00259
혹은
Figure 112009082238916-PCT00260
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXXVIII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00261
;
여기서:
R1는 -H, (C1-C6)알킬, (C1-C6)알케닐, -(C1-C6)알키닐, 혹은 -(C1-C6)알콕시이다.
R2는 -H, -(C1-C6)알킬, -(C1-C6)알케닐, -(C1-C6)알키닐, -(C3-C6)시클로알킬 혹은 페닐(상기 페닐은 하나 이상의 할로, -(C1-C6)알킬, -(C1-C6)알케닐 -및/또는 (C1-C6)알키닐 기들로 임의로 치환될 수 있다)이다.
X는 -CH2O, -CH2S, O, -S, -NH, -N(C1-C6)알킬, -CH2-이다.
Figure 112009082238916-PCT00262
Y는 -할로이다.
Figure 112009082238916-PCT00263
.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00264
,
이것은 플루페나세트(flufenacet)라고도 불린다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 플루페나세트가 아니다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00265
,
이것은 아닐로포스(anilofos)라고도 불린다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 아닐로포스가 아니다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00266
,
이것은 펜트라자미드(fentrazamide)라고도 불린다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 펜트라자미드가 아니다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00267
,
이것은 카펜스트롤(cafenstrole)이라고도 불린다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 카펜스트롤이 아니다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00268
,
이것은 알라클로르(alachlor)라고도 불린다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 알라클로르가 아니다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00269
,
이것은 알리도클로르(allidochlor)라고도 불린다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 알리도클로르가 아니다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 다음과 같다:.
Figure 112009082238916-PCT00270
,
이것은 트리알레이트(triallate)라고도 불린다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXVIII)의 화합물은 트리알레이트가 아니다.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XXXIX)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00271
;
여기서:
R1은 -C(할로)3 혹은 하기 구조식이다.
Figure 112009082238916-PCT00272
;
R2a와R2b는 결합하여 옥시레인 고리 혹은 (=CH2)를 형성할 수 있다.
X는 -할로이다.
Y는 할로이다.
m은 0, 1 혹은 2이다. 그리고
n은 0, 1 혹은 2이다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXIX)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00273
이것은 인다노판(indanofan)이라고도 불린다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXIX)의 화합물은 S-인다노판이다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXIX)의 화합물은 R-인다노판이다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXIX)의 화합물은 인다노판이 아니다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXIX)의 화합물은 S-인다노판이 아니다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXIX)의 화합물은 R-인다노판이 아니다.
특정 실시예에서, 구조 (XXXIX)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00274
;
Figure 112009082238916-PCT00275
;
Figure 112009082238916-PCT00276
;
Figure 112009082238916-PCT00277
혹은
Figure 112009082238916-PCT00278
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XL)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00279
;
여기서
R은 하이드로카본 라디칼 혹은 하이드로카본옥시 라디칼이고, 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 시클로알킬옥시, 시클로알케닐옥시, 아릴, 및 아릴옥시로 구성된 군 중의 라디칼이고, 상기 라디칼은 비치환 혹은 치환되고, 치환기를 포함해 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는다. 혹은 R은 헤테로시클릴 라디칼 혹은 헤테로시클릴옥시 라디칼이고, 상기 라디칼은 비치환 혹은 치환된다. 혹은 R은 수소 원자, 할로겐 혹은 라디칼 C(O)R3, OC(O)R3, S(O)-nR3, OS(O)nR3, OH, CN, NO2, NH2, SF5, NR4R5 혹은 Si(R6)3이다. 여기서
n은 0, 1 혹은 2이다.
R1은 각 경우에 독립적으로 할로겐, OH, SH이거나, 무탄소(carbon-free) 질소함유 라디칼이거나, 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 함유하는 탄소함유 라디칼이다.
l은 0, 1, 2 혹은 3, 바람직하게는 0, 1 혹은 2, 더 바람직하게는 0부터 1, 아주 바람직하게는 0이다.
R2는 5개의 고리를 가진 치환 혹은 비치환 헤테로시클릴 라디칼이고, 상기 고리 중 바람직하게 최소 1개는 산소, 황 혹은 질소이고, 나머지 1 내지 4개의 고리는 질소일 수 있다.
R3 는 하이드로카본 라디칼 혹은 하이드로카본옥시 라디칼이고, 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 시클로알킬옥시, 시클로알케닐옥시, 아릴, 및 아릴옥시로 구성된 군 중의 라디칼이다. 상기 라디칼은 비치환 혹은 치환되고, 치환기를 포함해 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는다. 혹은 R3 는 비치환 혹은 치환되는 헤테로시클릴 라디칼 또는 헤테로시클릴옥시 라디칼이거나, R3 는 수소원자, CN 혹은 NR4R5이다.
R4는 R0-Q0- 구조식을 가진 기이다. 여기서 R0는 수소원자, 아실 라디칼, 하이드로카본 라디칼, 혹은 헤테로시클릴 라디칼이고, 상기한 것 중 뒤에서부터 2개의 라디칼 각각은 비치환 혹은 치환되고, 치환기를 포함해 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는다. 그리고 Q0는 직접 결합된 것이거나 구조식 -O- 혹은 -N(R#)-의 2가 기이다. 상기 R#은 수소원자, 아실 라디칼 혹은 하이드로카본 라디칼이다. 상기 하이드로카본 라디칼은 비치환 혹은 치환되고, 치환기를 포함해 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는다. 혹은 R0과 R#은 함께 질소함유 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R5는 수소원자, 아실 라디칼, 하이드로카본 라디칼 혹은 헤테로시클릴 라디칼이고, 상기한 것 중 뒤에서부터 2개의 라디칼 각각은 비치환 혹은 치환되고, 치환기를 포함해 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는다. 혹은 R4와 R5가 함께 질소함유 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R6는 하이드로카본 라디칼이고, 이 하이드로카본 라디칼은 비치환 혹은 치환되고, 치환기를 포함해 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자, 바림직하게는 (C1-C4)알킬 혹은 (C6-C10)아릴을 갖는다. 그리고
W는 산소원자 혹은 황원자이다.
특정 실시예에서, 구조 (XL)의 화합물은 다음과 같다
Figure 112009082238916-PCT00280
;
Figure 112009082238916-PCT00281
;
Figure 112009082238916-PCT00282
혹은
Figure 112009082238916-PCT00283
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XLI)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00284
;
여기서
R은 하이드로카본 라디칼 혹은 하이드로카본옥시 라디칼이고, 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 시클로알킬옥시, 시클로알케닐옥시, 아릴, 및 아릴옥시로 구성된 군 중의 라디칼이다. 상기 라디칼은 비치환 혹은 치환되고, 치환기를 포함해 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는다. 혹은 R은 헤테로시클릴 라디칼 혹은 헤테로시클릴옥시 라디칼이고, 상기 라디칼은 비치환 혹은 치환된다. 혹은 R은 수소 원자, 할로겐 혹은 라디칼 C(O)R3, OC(O)R3, S(O)nR3, OS(O)nR3, OH, CN, NO2, NH2, SF5, NR4R5 혹은 Si(R6)3이다. 여기서 n은 0, 1 혹은 2이다. R1은 각 경우에 독립적으로 할로겐, OH, SH, 무탄소 질소함유 라디칼, 혹은 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는 탄소함유 라디칼이다.
l은 0, 1, 2 혹은 3, 바람직하게는 0, 1 혹은 2, 더 바람직하게는 0부터 1, 아주 바람직하게는 0이다.
R2는 하이드로카본수소 라디칼 혹은 하이드로카본 라디칼이고, 상기 라디칼은 비치환 혹은 치환되고, 치환기를 포함해 1 내지 20개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는다 (예: 비치환 혹은 치환 (C1-C4)알킬, 바람직하게는 수소 혹은 CH3).
R3은 하이드로카본 라디칼 혹은 하이드로카본옥시 라디칼이고, 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 시클로알킬옥시, 시클로알케닐옥시, 아릴 및 아릴옥시로 구성된 군 중의 라디칼이다. 상기 라디칼은 비치환 혹은 치환되고, 치환기를 포함해 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는다. 혹은 R3 는 비치환 혹은 치환되는 헤테로시클릴 라디칼 혹은 헤테로시클릴옥시 라디칼이다. 혹은 R3 는 수소원자, CN 혹은 NR4R5이다.
R4는 R0-Q0- 구조식을 가진 기이다. 여기서 R0는 수소원자, 아실 라디칼, 하이드로카본 라디칼, 혹은 헤테로시클릴 라디칼이고, 상기한 것 중 뒤에서부터 2개의 라디칼 각각은 비치환 혹은 치환되고, 치환기를 포함해 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는다. Q0는 직접 결합된 것이거나 구조식 -O- 혹은 -N(R#)-의 2가 기이다. 상기 R#은 수소원자, 아실 라디칼 혹은 하이드로카본 라디칼이다. 상기 하이드로카본 라디칼은 비치환 혹은 치환되고, 치환기를 포함해 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는다. 혹은 R0과 R#은 서로 함께 질소함유 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R5는 수소원자, 아실 라디칼, 하이드로카본 라디칼 혹은 헤테로시클릴 라디칼이고, 상기한 것 중 뒤에서부터 2개의 라디칼 각각은 비치환 혹은 치환되고, 치환기를 포함해 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는다, 혹은 R4와 R5는 함께 질소함유 헤테로사이클릭 고리를 형성한다. R6는 비치환 혹은 치환되고 치환기를 포함해 1 내지 30개의 탄소원자, 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는 하이드로카본 라디칼, 바람직하게는 (C1-C4)알킬 혹은 (C6-C10)아릴이다.
W는 산소원자 혹은 황원자이다.
X와 Y 각각은 서로 독립적으로 수소원자, 할로겐, (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시 혹은 (C1-C6)알킬티오이고, 상기한 것 중 뒤에서부터 3개의 라디칼 각각은 할로겐, (C1-C4)알콕시, 및 (C1-C4)알킬티오로 구성된 군의 하나 이상의 라디칼로 비치환 혹은 치환되거나, 모노- 혹은 디[(C1-C6)알킬]아미노, (C2-C6)알케닐, (C2-C6)알키닐, (C3-C6)알케닐옥시 혹은 (C3-C6)알키닐옥시이다. 그리고
V와 Z는 서로 독립적으로 각각 CH 혹은 N이다.
특정 실시예에서, 구조 (XLI)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00285
;
Figure 112009082238916-PCT00286
;
Figure 112009082238916-PCT00287
혹은
Figure 112009082238916-PCT00288
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XLII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00289
;
그리고 약학적으로 허용되는 염류, 용매화합물, 수화물, 포접화합물 혹은 그것들의 전구약물을 갖는다. 여기서:
Z1과 Z2는 독립적으로 -OH, -OPO3H, -OP2O6H2, -OPO2-(뉴클레오티드), -OP2O6(H)-(뉴클레오티드)이다.
R1와 R3는 독립적으로 수소, 메틸, 혹은 페닐이다.
R2와 R4는 독립적으로 메틸 혹은 페닐이다.
m과 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4, 5, 혹은 6이다.
Y1과 Y2는 독립적으로 -CH2,
Figure 112009082238916-PCT00290
이고,
X는 O, S, Se, C(O), C(H)F, CF2, S(O), NH, O-P(O)(OH)-O, NH-C(O)-NH 혹은 NH-C(S)-NH이다.
특정 실시예에서, 구조 (XLII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00291
;
Figure 112009082238916-PCT00292
;
Figure 112009082238916-PCT00293
;
Figure 112009082238916-PCT00294
;
Figure 112009082238916-PCT00295
;
Figure 112009082238916-PCT00296
; 혹은
Figure 112009082238916-PCT00297
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XLIII)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00298
;
여기서:
R1은 H 혹은 임의치환 저급 알킬, 아릴, 아르알킬, 혹은 알킬옥시알킬이다.
각 R2는 독립적으로 H, 보호기, 혹은 -C(=O)-CHRa-NHRb 이다. 여기서:
Ra는 알킬, 아릴, 아실, 케토, 아지도, 하이드록실, 하이드라진, 시아노, 할로, 하이드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노, 술포닐, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로사이클릭, 에논, 이민, 알데하이드, 에스테르, 티오산, 하이드록실아민, 아미노 기 및 그것들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 그리고
Rb는 H 혹은 아미노 보호기이다.
각 V와 Z는 독립적으로 (CRcRd)n, O, NRe, S, Ar, CRcRdAr, OAr, NR4Ar, SAr, 혹은 Ar이다. 여기서:
각 Rc와 Rd는 독립적으로 H, 저급 알킬, OH, O-저급 알킬이다, 혹은
Rc와 Rd는 함께 =O, =N-OH, =N-O-저급 알킬, 혹은 =N-O-CH2CH2-O-CH3이다.
Re는H, 저급 알킬, 혹은 -CH2CH2-O-CH3이다. 그리고
n은1부터 7까지다.
q는 0부터 3까지다.
Ar은 임의 치환된 아릴 혹은 헤테로아릴이다.
u는 0 혹은 1이다.
각 X는 독립적으로 H 혹은 할로겐이다. 그리고
m은 4부터 12까지이다.
특정 실시예에서, 구조 (XLIII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00299
;
Figure 112009082238916-PCT00300
;
Figure 112009082238916-PCT00301
;
Figure 112009082238916-PCT00302
혹은
Figure 112009082238916-PCT00303
.
한 실시예에서, 화합물은 다음 구조 (XLIV)를 갖는다:
Figure 112009082238916-PCT00304
;
여기서:
R1은 -H, (C1-C6)알킬, -(C3-C6)시클로알킬, -(C1-C6)알콕시, O(C1-C6)알킬, -N((C1-C6)알킬)2 혹은 -NH(C1-C6)알킬이다.
R2는 -H 혹은 -(C1-C6)알킬이다.
R3는 -H 혹은 -(C1-C6)알킬이다. 그리고
R4는 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00305
.
특정 실시예에서, 구조 (XLIV)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00306
,
이것은 모이라미드 B(moiramide B)라고도 불린다.
특정 실시예에서, 구조 (XLIV)의 화합물은 모이라미드 B가 아니다.
특정 실시예에서, 구조 (XLIV)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00307
,
이것은 안드리미드(andrimid)라고도 불린다.
특정 실시예에서, 구조 (XLIV)의 화합물은 안드리미드가 아니다.
특정 실시예에서, 구조 (XLIV)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00308
;
Figure 112009082238916-PCT00309
;
Figure 112009082238916-PCT00310
;
Figure 112009082238916-PCT00311
;
Figure 112009082238916-PCT00312
혹은
Figure 112009082238916-PCT00313
.
한 실시예에서, 화합물은 3군 포스포이노시티드 3-활성효소 (III PI3K) 억제제이다.
특정 실시예에서, 구조 (XLV)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00314
,
이것은 3-메틸아데닌(3-methyladenine)으로도 알려져 있다.
특정 실시예에서, 화합물은 3-메틸아데닌의 유도체이다.
특정 실시예에서, 구조 (XLVI)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00315
,
이것은 LY 294002로도 알려져 있다.
특정 실시예에서, 화합물은 LY 294002의 유도체이다.
특정 실시예에서, 구조 (XLVII)의 화합물은 다음과 같다:
Figure 112009082238916-PCT00316
,
이것은 워트만닌(wortmannin)으로도 알려져 있다.
특정 실시예에서, 화합물은 워트만닌의 유도체이다.
특정 실시예에서, 화합물은 워트만닌의 유도체이다.
특정 실시예에서, 화합물은 HMG-CoA 환원효소 억제제이다. 예시적 HMG-CoA 환원요소 억제제는 당업계에 잘 알려져 있고, 하기를 포함한다 (하기에 국한되지 않는다): 메바스타틴(mevastatin)과 관련 분자들 (예: 미국특허 번호3,983,140을 참고); 로바스타틴(lovastatin) (메비놀린(mevinolin))과 관련 분자들(예: 미국특허 번호4,231,938을 참고); 프라바스타틴(pravastatin)과 관련 분자들(예: 미국특허 번호4,346,227을 참고); 심바스타틴(simvastatin)과 관련 분자들(예: 미국특허 번호 4,448,784와 4,450,171을 참고); 플루바스타틴(fluvastatin) (예: 미국특허 번호 5,354,772를 참고); 세리바스타틴(cerivastatin) (예: 미국특허 번호 5,006,530과 5,177,080을 참고); 아토르바스타틴(atorvastatin) (예: 미국특허 번호 4,681,893; 5,273,995; 5,385,929 및 5,686,104을 참고); 이타바스타틴(itavastatin) (예: 미국특허 번호 5,011,930을 참고); 시오노기-아스트라/제네카 비스타틴(Shionogi-Astra/Zeneca visastatin) (ZD-4522) (예: 미국특허 번호 5,260,440을 참고), 관련 스타틴 화합물 (예: 미국특허 번호 5,753,675를 참고); 메발로놀락톤(mevalonolactone) 유도체의 피라졸 유사체 (예: 미국특허 번호 4,613,610을 참고); 메발로놀락톤 유도체의 인덴(indene) 유사체 (예: 국제특허출원 공개번호 WO 1986/03488을 참고); 6-[2-(치환-피롤-l-일)-알킬)피란-2-온스 및 그것들의 유도체 (예: 미국특허 번호 4,647,576); 시얼스(Searle's) SC-45355 (3- 치환 펜탄디온산 유도체) 디클로로아세테이트, 메발로놀락톤의 이미다졸 유사체 (예: 국제특허출원 번호WO 1986/07054를 참고); 3-카르복시-2- 하이드록시-프로판-포스폰산 유도체; 메발로놀락톤의 나프틸유사체 (예: 미국특허 번호 4,686,237을 참고); 옥타하이드로나프탈렌 (예: 미국특허 번호 4,499,289를 참고); 메비놀린(로바스타틴)의 케토 유사체; 포스핀산 화합물 (예: GB 2205837을 참고); 및 퀴놀린 및 피리딘 유도체 (예: 미국특허 번호 5,506,219와 5,691,322를 참고). 상기 특허들의 각각은 인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된다. 그러한 HMG-CoA 환원효소 억제제들의 구조들은 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 실시예에서, 화합물은 HMG-CoA 환원효소 억제제가 아니다.
예시적 SCD 억제제들은 Liu et al ., (J. Med. Chem. 50:3086-3100, 2007); 국제특허출원 공개번호 WO 2005/011655 A2; 미국 출원공개번호 2005/0119251; 및 국제특허출원 공개번호WO 2007/0099236 A1에 나와 있다. 상기 특허들의 각각은 인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된다. 그러한 억제제들은 피리다진 유도체와 피리다진 헤테로즈릴 기반 SCD1 억제제를 포함하며, 이에 국한되지 않는다.
일부 실시예에서, ACC를 표적으로 삼아 억제하는 화합물은 펩티드모사체 피롤리딘 디온 항생제(예: 모이라미드 B와 그것의 합성유사체, 및 안드리미드와 그것의 합성유사체; 및 피롤리딘디온 유사체)를 포함하며, 이에 국한되지 않는다. Freiberg et al ., J. Biol. Chem. 279:26066-26073, 2004; Freiberg et al ., Antimicrob. Agents Chemother. 49:749-759, 2005; 및 Pohlmann et al ., Bioorg. Med. Chem. Lett. 15:1189-1192, 2005을 참고한다. 이것들은 인용에 의해 본 문서에 완전히 포함되어 있다. 기타 실시예에서, 화합물은 펩티드모사체 피롤리딘 디온 항생제가 아니다. 일부 실시예에서, 화합물은 모이라미드 B가 아니다.
일부 실시예에서, 화합물은 피롤리딘디온 유도체이다. 피롤리딘디온 유도체의 비제한적 예시는 Pohlmann et al ., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005 15:1189-1192에 공개되어 있다. 다른 실시예에서, 화합물은 피롤리딘디온 유도체가 아니다.
중요한 점으로, ACC는 인간에서 두 동종효소, 즉 ACC1과 ACC2로 존재한다. 본 문서에 기술된 화합물들은 ACC의 동종효소 특이 억제제를 포함하며, 이에 국한되지 않는다. 동종효소 선택적인 화합물들은 다음의 예에서도 찾을 수 있다: Clark et al ., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007 17:1961-1965; 및 Gu et al ., J. Med. Chem. 2006 49:3770-3773. 이것들은 인용에 의해 본 문서에 완전히 포함되어 있다. 일부 실시예에서, 페닐고리 치환으로 구성된 페녹시 티아졸릴 계열 ACC 억제제들은 선택적ACC2 억제제들이다. 특정 실시예에서, 화합물은 ACC1 보다 ACC2 를 대략 최소 10배, 100배, 1,000배, 2,000배, 3,000배, 4,000배, 5,000배, 혹은 10,000배 더 선택적으로 억제한다.
일부 실시예에서, 포스포이노시티드 3-활성효소(PI(3)K)를 표적으로 삼아 억제하는 화합물은 2-메티아데닌, 워트만닌, LY294002, 5-페닐티아졸 유도체(예: 국제특허출원 번호 WO 2003/072557, WO 2004/078754, 및 WO 2005/021519을 참고), 일부 5-헤테로아릴 치환 티아졸 유도체(예: 국제특허출원 번호 WO 2004/096797을 참고), 일부 2-아실아미노-5-티아졸-4-일티아졸 유도체(예: 국제특허출원 번호 WO 2005/068444을 참고), AS-605240(예: Camp et al ., Nat. Med. 2005, 11(9):936-43을 참고), 티오졸리딘디온 유도체(예: 국제특허출원 번호 WO 2008/014219을 참고)를 포함하며, 이에 국한되지 않는다. 3-메틸아데닌은 3군 PI(3)K를 억제한다(예를 들어, Petiot et al ., J. Biol. Chem. 275:992-998, 2000을 참고). 특정 실시예에서, 화합물들은 3군 PI(3)K를 표적으로 삼아 억제한다. 특정 실시예에서, 화합물은 3-메틸아데닌이다. 다른 실시예에서, 화합물은 3-메틸아데닌이 아니다. 일부 실시예에서, 화합물은 PI(3)K 억제제가 아니다.
일부 실시예에서, 화합물은 PI(3)P 봉쇄제(sequestering agent)이다. PI(3)P 봉쇄제의 비제한적 예시는 펩티드 혹은 하나 이상의 FYVE(서열번호: 55) 모티프를 함유하는 화학변형 펩티드를 포함한다. 이 화학변형 펩티드는 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 전사활성화 단백질(Tat protein)(아미노산 서열: YGRKKRRQRRR(서열번호: 56) 혹은 그것의 하위집합 또는 연장 버전)의 세포막 형질도입 영역(transduction domain) 같은 세포 형질도입 영역을 가진 FYVE(서열번호: 55) 모티프를 함유하는 펩티드를 포함한다. 기타 세포막 형질도입 영역은 당업계에 잘 알려져 있고, FYVE(서열번호: 55) 서열(다중 반복 혹은 그것들의 변이형)에 결합되거나 항바이러스 치료제로 설계된 다른 PI(3)P-봉쇄 서열(들)에 결합될 수 있다. 다른 실시예에서, (세포막형질도입 영역이 있거나 없는) FYVE(서열번호: 55) 모티프는(예를 들어, FYVE 모티프가 순환에 의해 및/혹은 세포성 단백분해효소에 의해 가수분해 되지 않도록 방지함으로써) FYVE(서열번호: 55) 모티프의 혈장 반감기를 증가시키기 위해 다른 화학 성분에 결합될 수 있다.
한 실시예에서, 화합물이 묘사되거나 이 문서에서 언급되는 경우, 그런 묘사나 언급은 약학적으로 허용되는 염류, 전구약물, 전구약물의 염류, 용매화합물, 포접화합물 및 그것들의 입체이성질체를 포함한다.
RNAi 분자
일부 실시예에서, 화합물은 표적 효소의 발현 수준을 감소시킬 수 있는 RNA 간섭(RNAi) 분자이다. RNAi 분자는 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 머리핀형 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA)를 포함하고, 서열 특이 RNAi를 매개할 수 있는 분자를 포함하며, 이에 국한되지 않는다.
RNA 간섭(RNAi)은 표적 mRNA와 상동한 서열을 가진 두가닥 RNA(dsRNA)에 의해 개시되는 서열 특이 전사후 유전자 침묵 기전이다. RNAi는 전사후 유전자 침묵(post-transcriptional gene silencing) 혹은 PTGS라고도 불린다. 예컨대 Couzin(2002, Science 298:2296-2297); McManus et al ., 2002, Nat. Rev. Genet. 3, 737-747; Hannon, G. J., 2002, Nature 418, 244-251; Paddison et al ., 2002, Cancer Cell 2, 17-23을 참고한다. 다이서(Dicer)라고 하는 RN아제 3형(RNase III type) 효소는 dsRNA를 인지하고, 절단할 표적으로 삼는다. 다이서 효소는 RNA를 짧은 두가닥으로 된 약 21 내지 23개의 뉴클레오티드로 "자른다". 이것을 siRNA, 즉 짧은 간섭 RNA(short-interfering RNA)라고 부른다. siRNA는 완벽하게 쌍을 이룬 리보뉴클레오티드의 19개 뉴클레오티드와 각 가닥의 3' 말단에 있는 2개 내지 3개의 짝없는 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 이 짧은 두가닥들은 RISC라는 단백복합체와 결합하고 단백복합체로 하여금 siRNA와 유사한 서열로 mRNA를 전사하도록 유도한다. 그러면 RNA에 의해 유도된 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex), 즉 RISC에 있는 뉴클레아제는 표적mRNA 전사를 절단하고 분해함으로써 유전자 산물의 발현을 막는다.
문헌에는 siRNA 서열과 거의 완벽한 일치가 필요함을 암시하는 siRNA의 특이성에 관한 보고가 많다(Elbashir et al ., 2001. EMBO J. 20:6877-6888; Tuschl et al ., 1999, Genes Dev. 13:3191-3197; Hutvagner et al ., Sciencexpress 297:2056-2060을 참고). 한 예로, Hutvagner et al ., Sciencexpress 297:2056-2060은 siRNA를 표적으로 하는 전사 절단에는 완벽히 상보적인 서열이 필요한데 부분적으로 상보적이면 전사 분해없이 마이크로RNA의 방식으로 번역 억제가 일어날 것이라고 보고한다.
miRNA는 게놈으로부터 발현되는 조절 RNA이며, 전구체 줄기-루프(짧은 머리핀) 구조체(약 80 뉴클레오티드 길이)가 절단될 때 외가닥 핵산(대략 22 뉴클레오티드 길이)이 되고, 표적 mRNA의 3' UTR의 상보적인 서열에 결합(혹은 부합)한다(Lee et al ., 1993, Cell 75:843-854; Reinhart et al ., 2000, Nature 403:901-906; Lee et al., 2001, Science 294:862-864; Lau et al ., 2001, Science 294:858-862; Hutvagner et al ., 2001, Science 293:834-838). miRNA는 부분적으로만 상보적인 전사 서열에 결합하고(Zeng et al ., 2002, Molec. Cell 9:1327-1333), 항정상태 RNA 수준에 영향을 줌 없이 번역을 억제한다(Lee et al ., 1993, Cell 75:843-854; Wightman et al ., 1993, Cell 75:855-862). miRNA와 siRNA둘 다 다이서에 의해 절단되고 RNA에 의해 유도된 침묵 복합체의 구성분과 결합한다(Hutvagner et al ., 2001, Science 293:834-838; Grishok et al ., 2001, Cell 106: 23-34; Ketting et al ., 2001, Genes Dev. 15:2654-2659; Williams et al ., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6889-6894; Hammond et al ., 2001, Science 293:1146-1150; Mourlatos et al ., 2002, Genes Dev. 16:720-728).
짧은 머리핀 RNA(shRNA)는 돌출부(overhang)가 있는 두가닥 RNA(예: siRNA와 miRNA)로 절단될 때 RNAi를 매개하기에 충분한 길이의 두가닥 구조체를 형성하도록 부합된 혹은 부합될 수 있는 최소 2군데 상보적 부분으로 구성된 외가닥 RNA 분자이다. 또한 shRNA는 상보적 부분이 부합되어 두가닥 구조체를 형성할 때 루프 구조체를 형성하는 비상보적 부분도 최소 1군데 갖고 있다. shRNA는miRNA와 siRNA의 전구체이다.
대개는 shRNA를 암호화 하는 서열이 매개체(vector)에 복제되고, 그 매개체가 세포에 도입되어 세포의 전사 기전을 통해 전사된다(Chen et al ., 2003, Biochem Biophys Res Commun 311:398-404). 그러면 예컨대 RNA 폴리머라제 III(Pol III)가 매개체에 있는 Pol III형 전구체에 반응하여 shRNA를 전사할 수 있다(Yuan et al., 2006, Mol Biol Rep 33:33-41과 Scherer et al ., 2004, Mol Ther 10:597-603). 그러면 발현된 shRNA가 세포질 속으로 수송되어 다이서와 같은 단백질에 의해 siRNA로 절단되고, siRNA가 RNAi를 개시한다(Amarzguioui et al ., 2005, FEBS Letter 579:5974-5981). 최적 RNA 폴리머라제 III 전사를 위해서는 새로 개시된 RNA의 5' 말단에 푸린이 필요하다고 보고되었다. 보다 더 자세한 고찰은 Zecherle et al ., 1996, Mol . Cell . Biol. 16:5801-5810; Fruscoloni et al ., 1995, Nucleic Acids Res, 23:2914-2918; Mattaj et al ., 1988, Cell, 55:435-442에 나와 있다. shRNA 핵심 서열은 세포에서 안정적으로 발현될 수 있기 때문에 예를 들어, 동물의 체내 및 체외 세포에서 장기간 유전자 침묵이 가능하다(McCaffrey et al ., 2002, Nature 418:38-39; Xia et al ., 2002, Nat . Biotech. 20:1006-1010; Lewis et al ., 2002, Nat . Genetics 32:107-108; Rubinson et al ., 2003, Nat . Genetics 33:401-406; and Tiscornia et al ., 2003, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 100:1844-1848을 참고).
Martinez et al ., 은 RNA 간섭은 발암성 돌연변이를 선택적으로 표적화하는데 사용될 수 있다고 보고하였다(Martinez et al ., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14849-14854). 상기 보고서에서, 점 돌연변이를 함유하는 p53의 R248W 돌연변이 부위를 표적으로 하는 siRNA는 돌연변이 p53의 발현은 침묵시켰으나 야생형 p53은 침묵시키지 않은 것으로 나타났다.
Wilda et al ., 은 M-BCR/ABL 융합 mRNA를 표적으로 한 siRNA는 백혈구 세포에서 M-BCR/ABL mRNA와 M-BCR/ABL 종양단백질을 고갈시키는 데 사용될 수 있다고 보고하였다(Wilda et al ., 2002, Oncogene 21:5716-5724).
미국특허번호 6,506,559는 세포에서 표적유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭 과정을 공개하고 있다. 상기 과정은 표적 유전자의 서열과 동일한 두가닥 부위의 서열을 가진 부분적 두가닥 혹은 완전 두가닥 RNA를 세포나 세포외 환경에 주입하는 것으로 구성되어 있다.
미국특허출원 공개번호 US 2002/0086356은 드로소필라(Drosophila) 초파리의 체외에서 21-23 개 뉴클레오티드(nt) 길이의 RNA 조각들을 사용하는 RNA 간섭을 공개하고 있다. 상기 특허출원 공개물은 이 21-23 뉴클레오티드 조각들을 정제하여 드로소필라 추출물에 추가하면 긴dsRNA 없이도 서열 특이적 RNA 간섭을 매개한다는 것을 알려준다. 또한 상기 특허출원 공개물은 화학적으로 합성된 동일 혹은 유사 성격의 올리고뉴클레오티드도 포유류 세포에서 특정 mRNA를 분해 표적으로 삼는 데 사용될 수 있다는 것을 알려준다.
국제특허출원 공개번호 WO 2002/44321은 19-23개 뉴클레오티드 길이의 두가닥 RNA(dsRNA)는 드로소필라 초파리 체외에서 서열 특이적 전사후 유전자 침묵을 유도한다는 것을 공개하고 있다. 이 특허협력조약(PCT) 공개물은 돌출부 3' 말단을 가진 긴 dsRNA나 화학적으로 합성된 siRNA 두가닥으로부터 RN아제 III 유사 절단 반응에 의해 생긴 짧은 간섭 RNA(siRNA)는 세포용해질에서 효과적인 표적 RNA 절단을 매개하며, 그 절단 부위의 위치는 가이드 siRNA가 다루는 부위의 중앙 근처라는 것을 알려준다.
미국특허출원 공개번호 US 2002/016216은 엄격한 조건에서 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열에 부합되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 두가닥 RNA(dsRNA)를 표적 유전자의 발현을 약화시키기 충분한 양으로 세포에 도입함으로써 배양 세포에서 표적 유전자의 발현을 약화시키는 방법을 공개하고 있다.
국제특허출원 공개번호 WO 2003/006477는 세포에서 발현될 때 세포에 의해 처리되어 표적 짧은 간섭 RNA(siRNA)가 되고, 표적 유전자를 세포의 고유 RNA 간섭(RNAi) 경로를 사용해 (특이 mRNA를 절단함으로써) 선택적으로 침묵시키는 조작된 RNA 전구체를 공개하고 있다. 이 PCT 공개물은 조작된 RNA 전구체를 암호화하는 핵산 분자를 적절한 조절 서열로 체내 세포에 주입함으로써, 조작된 RNA 전구체의 발현을 시간적 및 공간적으로, 즉 특정 시간 및/또는 특정한 조직, 기관 혹은 세포에서 선택적으로 조절할 수 있다는 것을 알려준다.
국제특허출원 공개번호 WO 2002/44321은 19-23개 뉴클레오티드 길이의 두가닥 RNA(dsRNA)는 드로소필라 초파리 체외에서 서열 특이적 전사후 유전자 침묵을 유도한다는 것을 공개하고 있다. 이 PCT 공개물은 돌출부 3' 말단을 가진 긴 dsRNA나 화학적으로 합성된 siRNA 두가닥으로부터 RN아제 III 유사 처리 반응에 의해 생긴 짧은 간섭 RNA(siRNA)는 용해질에서 효과적인 표적 RNA 절단을 매개하며, 그 절단 부위의 위치는 가이드 siRNA가 다루는 부위의 중앙 근처라는 것을 알려준다. 또한 이 PCT 공개물은 생성된 siRNA 복합체에 의해 센스 혹은 안티센스-동일 표적 RNA가 절단될 수 있는지 여부는 dsRNA 처리 지시에 따라 결정된다는 증거도 제시한다. siRNA 설계를 돕도록 RNA에 대한 siRNA의 길이, 2차 구조, 당류 백본(sugar backbone) 및 서열 특이성의 효과에 대한 체계적 분석이 공개되어 있다. 아울러, 침묵 효능은 19개 염기쌍 표적 서열의 5' 부위와 3' 부위의 GC 함량과 상관관계가 있는 것으로 나타났다. GC가 풍부한 5' 부위와 GC가 적은 3' 부위를 siRNA 표적화 서열로 할 때 최고의 효과를 내는 것으로 밝혀졌다. 보다 자세한 고찰은 Elbashir et al ., 2001, EMBO J. 20:6877-6888과 Aza-Blanc et al ., 2003, Mol . Cell 12:627-637에 나와 있다. 상기 두 문헌은 인용에 의해 본 문서에 완전히 첨부된다.
아울러, siRNA 설계 알고리듬은 PCT 공개물 번호 WO 2005/018534 A2와 WO 2005/042708 A2에 공개되어 있다. 상기 두 공개물은 인용에 의해 본 문서에 완전히 첨부된다. 구체적으로, 국제특허출원 공개번호 WO 2005/018534 A2는 표적 유전자와 부분적으로 상동한 서열을 가진 siRNA를 사용하는 유전자 침묵의 방법과 조성물을 공개하고 있다. 상기 공개물은 유전자를 표적으로 하는 서로 다른 siRNA에 대한 공통 반응 및/또는 차등 반응을 식별하는 방법을 제시하고, siRNA의 두 개 가닥의 상대적 활성을 평가하는 방법도 제시한다. 상기 공개물은 siRNA를 질병치료를 위한 요법으로서 사용하는 방법도 제시한다. 국제특허출원 공개번호 WO 2005/042708 A2는 위치 특이적 스코어 매트릭스 접근법을 사용하여 전사체에서 siRNA 표적 모티프를 식별하는 방법을 제시한다. 상기 공개물은 위치 특이적 스코어 매트릭스 접근법을 사용하여 siRNA의 표적외(off-target) 유전자를 식별하는 방법도 제시한다. 나아가 상기 공개물은 향상된 침묵 효능 및 특이성뿐 아니라 예시적 siRNA의 라이브러리로 siRNA를 설계하는 방법도 제시한다.
설계 소프트웨어들은 본 문서에 기술된 방법들에서 siRNA의 표적이 될 수 있는 표적효소 mRNA 내 잠재 서열을 식별하는데 사용될 수 있다. 예시를 보려면 http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html("앰비온 siRNA 표적 탐색 소프트웨어"를 참고한다. 예를 들어, 당업계에 알려져 있는 ACC1의 뉴클레오티드 서열(GenBank 등록번호 NM_198834)을 앰비온 siRNA 표적 탐색 소프트웨어(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)에 입력하면 소프트웨어가 잠재적 ACC1 표적 서열과 그에 대응하는 siRNA 서열을 찾아준다. 그 서열들을 ACC1 발현의 하향조정에 의해 인체 ACC1 활성을 억제할 검사에 사용할 수 있다. 이 방법을 사용해서 찾은, ACC1 억제를 위한 ACC1 표적 서열(5'부터 3')과 그에 대응하는 센스 및 안티센스 가닥 siRNA 서열(5'부터 3')의 비제한적 예시들이 아래 제시되어 있다:
Figure 112009082238916-PCT00317
이와 동일한 방법을 적용해서 ACC2 표적 서열(5'부터 3')과 그에 대응하는 siRNA 서열(센스 및 안티센스 가닥, 5'부터 3')을 식별할 수 있다. ACC2를 억제하기 위한 siRNA 서열의 비제한적 예시들이 아래 제시되어 있다:
Figure 112009082238916-PCT00318
RNAi 분자를 획득하기 위해 효소의 표적 서열과 그에 대응하는 siRNA 서열(센스 및 안티센스 가닥)을 식별하는 데도 이와 동일한 방법을 사용할 수 있다.
일부 실시예에서, 화합물은 표적 효소, 예를 들어 ACC 혹은 FAS의 발현을 억제하는데 효과적인 siRNA이다. 여기서 siRNA는 표적 효소 mRNA의 센스 서열을 구성하는 1차 가닥과 표적 효소의 센스 서열의 보체를 구성하는 2차 가닥으로 구성되고, 여기서 1차 가닥과 2차 가닥의 길이는 약 21 내지 23개 뉴클레오티드다. 일부 실시예에서, siRNA는 표적 효소 mRNA의 센스 서열과 보체 서열로 구성된 1차 및 2차 가닥으로 구성되고, 길이는 약 17, 18, 19, 혹은 20개 뉴클레오티드다.
RNAi 분자(예: siRNA, shRNA, miRNA)는 부분적 두가닥이거나 완전 두가닥일 수 있고, 가닥 당 최소 18개, 최소 19개, 최소 20개, 최소 21개, 최소 22개, 최소 23개, 최소 24개, 최소 25개, 최소 30개, 최소 35개, 최소 40개, 최소 45개, 최소 50개, 혹은 그 이상의 뉴클레오티드 조각들을 포함할 수 있다. 또한 RNAi 분자(예: siRNA, shRNA, miRNA)는 최소 1개, 최소 2개, 최소 3개, 혹은 최소 4개 뉴클레오티드의 3' 돌출부를 구성할 수 있다. RNAi 분자(예: siRNA, shRNA, miRNA)는 표적 유전자의 발현을 억제할 능력이 보존되는 한 사용자가 원하는 어느 길이나 될 수 있다.
ACC2를 표적으로 하는 RNAi 분자는 예컨대 미국특허번호 7,211,423과 미국특허출원 공개번호 US 2008/0026363 A1에 기술되어 있다. 상기 두 문헌은 인용에 의해 본 문서에 완전히 첨부된다.
일부 실시예에서, 인간 피험자에서 바이러스 감염을 치료 혹은 예방하기 위한 방법은 유효량의 RNAi 분자(예: siRNA, shRNA, miRNA)를 투여하여 표적효소의 발현수준을 감소시킴으로써 표적효소(예: ACC, FAS, SCD)의 활성을 억제하는 것으로 구성된다. RNAi 분자에 의해 억제될 수 있는 표적효소들의 예시는 5.1절에 제시되어 있다.
RNAi 분자는 일반 당업자들에게 알려진 여러 기법 중 어느 것이나 사용해서 얻을 수 있다. 일반적으로 RNAi 분자의 생산은 화학합성이나 핵산 재조합 기법을 통해서 할 수 있다. dsRNA를 준비하는 방법은 예컨대 Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 56), John Wiley & Sons, New York, 2001과 Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.sup.rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2001에 기술되어 있고, 본 문서에 기술된 방법들에서도 활용될 수 있다. 예를 들어, PCR 산물로부터 RNA를 전사한 후 겔을 정화할 수 있다. PCR 주형(template)으로부터 RNA의 체외 전사에 대한 표준 절차는 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, dsRNA는 PCR 주형과 앰비온 T7 메가스크립트, 혹은 기타 유사한 키트(텍사스, 오스틴)를 사용해서 합성될 수 있다. 그 후 RNA를 LiCl 로 침전시키고 완충용액에서 재부유시킬 수 있다.
세포에서 RNAi 활성을 분석하는 데는 일반 당업자들이 알고 있는 기법 중 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, RNAi 분자를 세포에 주입한 후, 당업자들이 알고 있는 분석법(예: ELISA와 면역블롯시험법)을 사용해서 표적 효소의 발현 수준을 분석할 수 있다. 또한 표적 효소의 mRNA 전사 수준은 당업자들이 알고 있는 방법들(예: 노던 블롯 시험법과 실시간 정량 PCR법)을 사용해서도 분석할 수 있다. 표적 효소의 활성은 당업자들이 알고 있는 방법들 및/또는 본 문서의 5.3절에 기술된 방법을 사용해서 분석할 수 있다. 특정 실시예에서, RNAi 분자는 표적 효소의 단백질 발현 수준을 최소한 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 혹은 95% 감소시킨다. 한 실시예에서, RNAi 분자는 표적 효소의 mRNA전사 수준을 최소한 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 혹은 95% 감소시킨다. 특정 실시예에서, RNAi 분자는 표적 효소의 효소 활성을 최소한 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 혹은 95% 감소시킨다.
5.3. 숙주세포 표적효소 억제제를 식별하기 위한 선별검사
숙주세포 표적효소의 억제제로 알려진 화합물의 항바이러스 활성은 당업자들이 알고 있는 분석법 및/또는 아래 기술된 분석법을 사용해서 직접적으로 선별될 수 있다(5.4절 이하를 참고). 임의적이지만, 그런 효소 억제제들의 유도체 혹은 동종체(congener), 혹은 그 외 다른 화합물이 효소 표적을 변조할 능력은 일반 당업자들이 알고 있는 분석법 및/또는 아래 기술된 분석법을 사용해서 시험할 수 있다.효소 표적을 변조하는 것으로 밝혀진 화합물은 추가로 항바이러스 활성을 시험할 수 있다. 효소 표적을 변조하거나 항바이러스 활성을 가진 것으로(혹은 두 기능을 모두 하는 것으로) 밝혀진 화합물은 세포의 대사 플럭스에 대한 효과를 확증하기 위하여 예시 1에 기술된 플럭스 분석법으로 시험할 수 있다. 이것은 특히 세포성 대사 플럭스를 변경할 바이러스의 능력을 화합물이 효과적으로 차단하는지 판정하고 화합물의 표적이 될 가능성이 있는 기타 대사 경로를 식별하는 데 유용하다.
다르게는, 화합물의 항바이러스 활성을 직접적으로 시험할 수 있다. 항바이러스 활성을 입증하는 화합물 혹은 항바이러스 작용을 하지만 허용되지 않는 특이성이나 독성을 가진 것으로 알려진 화합물은 본 발명의 효소 표적에서 제외될 수 있다. 효소 표적을 변조하는 항바이러스 화합물은 활성 프로파일이 향상되도록 최적화 될 수 있다.
당업자들에게 알려지고/지거나 5.1절에 기술되어 있는 숙주세포 효소는 항바이러스 중재의 잠재 표적으로 고려된다. 나아가, 세포의 대사를 조절하는 데 있어 직접적 혹은 간접적 역할을 하는 숙주세포 효소도 항바이러스 중재의 잠재 표적으로서 고려된다. 화합물들, 이를테면 5.2절에 기술된 화합물이나 기타 화합물(예: 공개적으로 이용 가능한 화합물 라이브러리)은 그러한 숙주세포 효소의 활성을 변조(활성화 혹은 억제)할 능력에 대하여 시험될 수 있다. 화합물이 특정 효소의 활성을 변조하는 것으로 밝혀진다면 잠재적 항바이러스 화합물 하나가 확인된 것이다.
한 실시예에서, 지방산 생합성 및/또는 대사에 영향을 주거나 혹은 관여하는 효소, 예를 들어 ATP 구연산 분해효소와 그것의 동종형(isoform), HMG-CoA 합성효소, 아세틸-CoA 카르복실라제와 그것의 동종효소, 지방산 합성효소와 그것의 아단위, 리소포스파티드산 아세틸트란스페라제 혹은 리소포스파티드산 아실트란스페라제와 그것의 동종형, 혹은 말로닐-CoA 디카르복시라제가 화합물의 표적으로서 시험된다. 한 실시예에서, 당분해 경로의 효소들이 화합물에 의해 변조되는지 시험된다. 한 실시예에서, 삼카르복실산(TCA) 사이클의 성분들이 시험된다. 한 실시예에서, 양성자 ATP아제 같은 장벽간 이온 항상성과 에너지 수송에 관여하는 세포 구성분들이 발명의 화합물에 의해 변조(억제 혹은 활성화)되는지 검사된다. 일부 실시예에서, 당분해 수송에 관여하는 숙주효소들의 활성이 화합물의 표적으로서 시험된다.
바람직한 실시예에서, 화합물이 숙주효소 대사를 변조할 능력은 그 화합물로 구성된 조성물과 효소로 구성되고 효소의 활성을 측정하는 조성물을 접촉시킴으로써 시험된다. 화합물이 존재하는 경우에 대조군에 비해 효소의 활성이 변경된다면, 상기 화합물은 효소의 활성을 변조하는 것이다. 본 발명의 일부 실시예에서, 상기 화합물은 효소의 활성을 증가시킨다(예를 들어, 지방산 생합성을 부정적으로 조절하는 효소는 잠재적 항바이러스 화합물에 의해 활성이 증가될지도 모른다). 특정 실시예에서, 상기 화합물은 효소의 활성을 최소 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 혹은 90% 증가시킨다. 일부 실시예에서, 상기 화합물은 효소의 활성을 감소시킨다. 특정 실시예에서, 상기 화합물은 효소의 활성을 최소 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 혹은 100% 감소시킨다. 일부 실시예에서, 상기 화합물은 하나의 효소를 독점적으로 변조한다. 일부 실시예에서, 상기 화합물은 여러 효소를 변조하지만 한 효소를 다른 효소들보다 더 많이 변조할 수도 있다. 본 문서에 기술된 표준 효소활성 분석법을 사용하여 화합물의 활성을 특성화할 수 있다. 한 실시예에서, 화합물은 비가역적 억제를 보이거나 특정 효소의 활성화를 보인다. 일부 실시예에서, 화합물은 한 효소를 비가역적으로 억제하거나 활성화시킨다. 일부 실시예에서, 화합물은 효소의 동력학을 변경시킨다.
일부 실시예에서, 예를 들어, 시험 화합물과 숙주 표적효소 간의 관계에 대한 평가는 (i) 시험 화합물과 효소 간의 결합에 대한 평가, (ii) 효소의 생물학적 활성에 대한 평가, (iii) 시험 화합물의 존재 및 부재 시 효소의 효소 활성(예: 활성효소 활성)에 대한 평가 중 하나 이상을 포함한다. 체외 접촉은 시험 화합물, 효소, 필요한 보조인자(예: 비오틴) 또는 에너지원(예: ATP, 혹은 방사성 표지된 ATP), 기질(예: 아세틸-CoA, 설탕, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 또는 기타 대사산물, 표지 사용 혹은 미사용), 및 기질에서 산물로의 전환에 대한 평가를 포함하는 반응 혼합물 형성을 포함할 수 있다. 산물 형성을 평가하는 데는 예를 들어 탄소 또는 인산염의 전달 탐지(예: 화학적 감지 혹은 방사성 표지 같은 표지 사용), 반응산물 탐지, 1차반응 의존적 2차반응의 탐지, 혹은 예를 들어 분자량 변화, 전하량, 혹은 등전점(pI)과 같은 기질의 물리적 특성 탐지를 포함할 수 있다.
선별분석에 사용할 표적효소는 자연적 출처, 예컨대 지방세포를 구성하는 세포나 조직 혹은 기관(예: 지방조직), 간 등으로부터 정제할 수 있다. 다르게는, 표적 효소는 많은 여러 가지 재조합 DNA 발현 시스템 중 하나에서 발현시킬 수 있고, 다량으로 획득하여 생물학적 활성을 시험할 수 있다. 재조합 박테리아 세포, 예컨대 이콜라이(E. coli)에서의 발현을 위하여, 세포는 예를 들어, LB배지와 같은 적절한 배지에서 성장시키고, 재조합 폴리펩티드의 발현은 배지에 IPTG를 첨가하거나 배양온도를 좀더 높은 온도로 전환함으로써 유도한다. 2시간에서 24시간 사이의 기간 동안 박테리아를 배양한 후에, 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 세척하여 잔류배지를 제거한다. 그런 다음 예를 들어, 세포파쇄기(cell homogenizer)로 박테리아 세포를 분쇄하여 용해시키고, 원심분리하여 치밀 봉입소체와 세포막을 용해성 세포 성분들로부터 분리한다. 이 구성은 자당 같은 당류를 완충용액에 편입한 후 선택된 속도로 원심분리 함으로써 치밀 봉입소체를 선택적으로 강화하는 조건 하에서 수행될 수 있다. 봉입체에서 재조합 폴리펩티드가 발현된다면, 이것들을 몇몇 용액 중 하나로 세척하여 오염 숙주 단백질의 일부를 제거한 다음, 고농도 요소(예: 8M) 혹은 무질서 유발제(chaotropic agent) (예: 구아니딘 염화수소)를 함유한 용액에 베타-메르캅토에탄올이나 DTT(디티오트레이톨)와 같은 환원제를 넣고 용해시킬 수 있다. 이 단계에서는, 폴리펩티드가 되접기(refolding) 과정을 겪어 천연 폴리펩티드의 입체 형태와 더욱 유사한 입체 형태가 되기에 적절한 조건으로 폴리펩티드를 몇 시간 동안 배양하는 것이 유리할 수 있다. 상기 조건은 일반적으로 저농도 폴리펩티드(500 mg/ml 이하의 농도), 저농도의 환원제, 2M 이하의 요소 농도, 그리고 환원되고 산화된 글루타티온 혼합물과 같은 단백질 분자 내 디설파이드 결합의 교환을 촉진시키는 시약의 사용을 종종 포함한다. 상기 되접기 과정은 예를 들어, SDS-PAGE로 모니터 하거나 천연 분자 특이 항체를 사용해 모니터 할 수 있다. 되접기 후에, 폴리펩티드를 더욱 정제한 다음, 크로마토그래피에서 이온 교환 수지, 겔 투과 수지, 또는 다양한 친화 컬럼 등의 지지체 중 하나를 사용해 되접기 혼합물로부터 분리할 수 있다.
숙주세포에서 발현된 폴립펩티드나 그 조각들의 분리와 정제는 단일클론 항체나 다클론 항체에 관련된 조제용 크로마토그래피와 면역학적 분리 등을 포함한, 그러나 이에만 국한되지 않는 기존 방법으로 수행할 수 있다.
상기 폴리펩티드들은 본 발명의 목적에 맞는 화합물을 선별하는데 유용한 순수하고 생물 활성이 있는 표적효소를 대량 생산할 수 있도록 재조합 DNA 기법을 비롯한 다양한 수단으로 생산될 수 있다. 다르게는, 선별할 표적효소를 세포 용해질이나 기타 용액 혹은 혼합물에서 부분적으로 정제하거나 시험할 수도 있다.
표적효소 활성분석은 바람직하게는 효소를 용액에 용해하여 사용하거나, 상기 효소를 발현하는 세포 내지 세포 용해질을 사용하는 체외분석이다. 그러나, 본 발명은 그다지 제한적이지 않다. 일부 실시예에서, 상기 효소는 용액 상태이다. 다른 실시예에서, 상기 효소는 미세소체 혹은 세제와 관련 있다. 다른 실시예에서, 상기 효소는 고체나 겔 지지체에 고정된다. 일부 실시예에서, 상기 효소는 정제 및/또는 탐지가 용이하도록 표지된다. 다른 실시예에서, 효소는 정제 및/또는 탐지가 용이하도록 표지된다. 표지는 폴리펩티드 꼬리표, 비오틴, 방사성표지, 형광표지, 혹은 비색표지(colorimetric label)를 포함한다. 당업계에서 용인되는 대사효소 활성 시험법은 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 고효율 선별 분석법으로 다수의 화합물을 여러 표적에 비추어 선별하는 것이다.
기질과 산물의 농도는 체외 시스템에서 예컨대 단백질의 예컨대 생화학적 추출물에서의 농도를 평가할 수 있다. 예를 들어, 추출물은 모든 용해성 단백질 혹은 단백질의 소집단(예: 70% 혹은 50% 황산암모늄 포화용액), 표적효소를 포함하는 소집단이라고 정의된 유용한 단백질 소집단을 포함할 수 있다. 시험 화합물의 효과는 예컨대 시험화합물을 포함하는 반응과 시험화합물을 포함하지 않고 동시에 수행되는 대조근 반응에서 기질과 산물의 농도를 시험 시작 때 측정하고 정해진 시간(예: 30분, 1시간, 혹은 2시간) 이후에 측정하여 비교함으로써 평가할 수 있다. 이것은 체외 기질 대 산물의 비에 대한 시험화합물의 효과를 측정하는 하나의 방법이다. 반응속도는 각 배양의 방사성 혹은 편입된 기타 표지 대 반응시간을 선형 회귀분석하여 구할 수 있다. KM 값과 Vmax 값은 표준 헨리-미카엘리스-멘텐 방정식(standard Henri-Michaelis-Menten equation)에 따라 최초 속도를 비선형 회귀분석하여 구할 수 있다. kcat은 V max값을 비색법을 통한 단백질 분석(예: Bio-RAD 단백질 분석, 브래드포드 분석법, 로우리 법)에서 도출된 효소 반응농도로 나누어서 구할 수 있다. 한 실시예에서, 화합물은 표적 효소를 비가역적으로 불활성화 시킨다. 한 실시예에서, 화합물은 표적 효소를 비가역적으로 억제한다. 일부 실시예에서, 화합물은 경쟁적 억제를 통해 표적 효소를 비가역적으로 억제한다. 일부 실시예에서, 화합물은 무경쟁 억제를 통해 표적 효소를 비가역적으로 억제한다. 일부 실시예에서, 화합물은 비경쟁적 억제를 통해 표적 효소를 비가역적으로 억제한다. 추가 실시예에서, 화합물은 혼합 억제(mixed inhibition)를 통해 표적 효소를 비가역적으로 억제한다. 화합물의 억제 기전은 일반 당업자들에게 알려진 표준 분석법으로 판정할 수 있다.
상(phase) 분배 시스템을 활용하는 효소활성 정량 방법은 미국특허 번호 6,994,956에 기술되어 있다. 상기 특허는 인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된다. 구체적으로, 방사성표지 기질과 반응 산물을 액상과, 액상과 혼합되지 않는 섬광액을 함유한 유기상으로 차등 분배한 후, 효소활성을 방사성표지가 들어있는 유기용매 성분이 산물 분자에 편입된 양을 측정(신호획득 분석)하거나 방사성표지를 함유한 유기용매 성분이 기질 분자에서 손실된 양을 측정(신호손실 분석)하여 분석한다. 섬광(Scintillation)은 섬광체를 함유한 유기상에 방사성핵종이 들어있을 때에만 검출된다. 그런 방법들을 활용해서 화합물이 표적효소의 활성을 억제하는 능력을 시험할 수 있다.
세포 분석을 활용할 수 있다. 예시적 세포분석은 시험 화합물을 배양 세포(예컨대 포유류 배양세포, 예컨대 인체 배양세포)에 접촉시킨 다음, 이 문서에 기술된 아무 방법이든(예컨대 역상 HPLC) 사용하여 세포 내 기질 및 산물의 농도를 평가하는 것을 포함한다.
기지와 산물의 농도는 예컨대 NMR, HPLC(예컨대, Bak, M. I., and Ingwall, J. S. (1994) J. Clin. Invest. 93, 40-49을 참고), 질량분석기, 박층 크로마토그래피, 혹은 방사성표지 성분(예: 활성효소 분석용 방사성표지 ATP)을 사용하여 측정할 수 있다. 예컨대, 31P NMR은 ATP와 AMP 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 한 실시예에서, 세포 및/혹은 조직을 10mm NMR 샘플 튜브에 넣어서, 89 cm 구멍을 가진 9.4 테슬라 초전도자석 안에 놓인 1H/31P 복동조 프로브에 넣을 수 있다. 원한다면, 스캔을 인덱싱하기 위해 뚜렷한 피크를 제공하는 기질에 세포를 접촉시킬 수 있다. GE-400 오메가 NMR 스펙트로미터(Bruker Instruments, 미국 캘리포니아 프리몬트)를 사용해 60도 숙임각(flip angle), 15 마이크로초(microsecond) 펄스, 2.14초 지연, 6,000 Hz 스위프 폭(sweep width), 2048 데이터포인트로 6개의 31P NMR 스펙트럼을 수집할 수 있고, 각 스펙트럼은 104개의 자유 유도 붕괴 신호를 평균하여 도출된다. 스펙트럼은 20Hz 지수 곱셈과 0차 및 1차 상 보정을 사용해 분석된다. 공명 피크의 면적은 NMR1 소프트웨어(New Methods Research Inc., 미국 뉴욕 시라큐스)에서 로렌츠 선 모양(Lorentzian line shape)에 의해 적합화 될 수 있다. 완전히 이완된 스펙트럼(리사이클 타임: 15초)의 피크면적과 부분 포화된 스펙트럼(리사이클 타임: 2.14초)의 피크면적을 비교함으로써 이 피크들에 대한 포화 보정계수를 계산할 수 있다. 피크면적은 세포 및/또는 조직의 무게 혹은 개수에 대하여 정규화될 수 있고, 임의의 면적단위로 표현될 수 있다. 예컨대 ATP 농도와 AMP 농도를 평가하는 또 다른 방법은 표본의 세포를 용해하여 추출물을 만들고, 그 추출물을 역상 HPLC로 분리하여 260 nm에서 흡광도를 측정하는 것을 포함한다.
또 다른 종류의 체외 분석은 시험 화합물이 1차 효소경로 성분과 2차 효소경로 성분 간의 상호작용, 예컨대 AMPK 알파와 베타-감마 혹은 지방산 합성효소의 여러 효소 활성들 간의 상호작용을 변조할 능력을 평가한다. 이런 종류의 분석은 예컨대 복합체 내 표지 화합물의 검출을 통해 표지 성분과 2차경로 성분의 결합을 측정할 수 있도록 성분들 중 하나를 방사성동위원소 혹은 효소표지에 결합시켜 수행될 수 있다. 효소경로 성분을 125I, 35S, 14C, 혹은 3H를 직접적으로 혹은 간접적으로 표지한 후, 이 방사성동위원소를 방사능방출 직접 측정 혹은 섬광 측정를 통해 검출할 수 있다. 다르게는, 성분을 효소, 예컨대 겨자무 과산화효소, 알칼리성 인산분해효소, 혹은 루시페라제로 표지한 후, 기질에서 산물로의 전환량을 측정함으로써 효소 표지를 검출할 수 있다. 경쟁 분석은 시험 화합물과 표적 간의 물리적 상호작용을 평가하는 데도 사용될 수 있다.
용해성 형태 및/혹은 막결합 형태의 유리된 단백질(예: 효소경로 성분들과 그것들의 수용체 혹은 그것들의 생물학적 활성 부분)은 본 발명에서 세포 없이 분석하는 데 사용될 수 있다. 막결합 형태의 효소를 사용하는 경우에는 용해제를 활용하는 것이 바람직할 수 있다. 그런 용해제의 예시는 비이온성 세제, 예컨대 n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥타노일-N-메틸글루카미드, 데카노일-N-메틸글루카미드, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 테시트, 이소트리데시폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암미니오]-1-프로판 술포네이트(CHAPS), 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암미노]-2-하이드록시-1-프로판 술포네이트(CHAPSO), 혹은 N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판 술포네이트를 포함한다. 또 다른 예시에서, 효소경로 성분(예: AMPK의 경우에서 GLUT-4)는 막 안에, 예컨대 리포좀이나 기타 소포 안에 있을 수 있다.
무세포 분석(Cell-free assay)에서는 표적 효소와 시험 화합물을 혼합하고, 두 성분이 상호작용하여 결합할 수 있는 충분한 시간과 조건 아래서 반응시켜 두 성분의 복합체를 형성시킨 후에 제거 및/혹은 검출할 수 있다.
두 분자, 예컨대 표적 효소와 시험 화합물 간의 상호작용은, 예컨대 시험 화합물과 표적 효소 간의 상호작용을 평가하기 위해 최소 하나의 성분을, 예컨대형광 표지하는 형광분석법을 사용해서 검출할 수 있다. 그런 분석의 한 예시는 형광 에너지 전달(형광 공명에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer), 즉 FET 혹은 FRET)을 포함한다(Lakowicz et al ., 미국특허 번호 5,631,169; Stavrianopoulos et al ., 미국특허 번호 4,868,103을 참고). 첫 번째 "공여" 분자 상의 형광단 표지는 그것이 방출한 형광에너지가 두 번째 "수용" 분자 상의 형광 표지에 흡수되어 그 흡수된 에너지로 인해 형광할 수 있는 것을 선택한다. 다르게는, 단백질성 "공여" 분자는 단순히 트립토판 잔류물의 자연적 형광에너지를 활용할 수 있다. "수용" 분자의 표지와 "공여" 분자의 표지는 두 표지가 서로 구분될 수 있도록 서로 파장이 다른 것을 선택한다. 두 표지 간의 에너지 전달 효율은 두 분자 간 거리와 관련 있으므로, 두 분자 간의 공간관계를 평가하는 것이 가능하다. 분석에서 두 분자 사이에 결합이 일어날 때 "수용" 분자 표지의 형광 방출은 최대여야 한다. FET 결합은 당업계에 잘 알려진 표준 형광검출 수단(예: 형광계 이용)을 통해 편리하게 측정할 수 있다.
형광분석법의 또 다른 예시는 형광 편광(fluorescence polarization: FP)측정법이다. 형광편광측정(FP)법의 경우, 표지는 한 성분에만 필요하다. 결합 상호작용은 표지된 성분의 분자크기의 변화를 통해 검출된다. 분자크기가 변화되면 용액 중의 성분의 텀블링율이 변화된다. 예컨대 Nasir et al ., (1999), Comb Chem HTS 2:177-190, Jameson et al ., (1995), Methods Enzymol 246:283을 참고하고, Anal Biochem. 255:257(1998)을 참고한다. 형광편광은 다중공 평판(multi-well plate)에서 모니터 될 수 있다. 예컨대 Parker et al ., (2000), Journal of Biomolecular Screening 5:77-88과 Shoeman et al ., (1999), 38, 16802-16809을 참고한다.
또 다른 실시예에서, 표적 효소가 표적 분자에 결합할 능력은 실시간 생체분자 상호작용 분석(Biomolecular Interaction Analysis: BIA)를 사용해 측정할 수 있다(예컨대 Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991), Anal. Chem. 63:2338-2345와 Szabo et al .,(1995), Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705을 참고한다). "표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)" 혹은 "BIA" 상호작용하는 생체물질을 표지하지 않고도 실시간으로 생체물질의 상호작용을 검출한다(예: BIAcore). 결합면의 질량 변화(결합현상을 암시함)는 표면 근처에서 빛의 굴절률 변화(표면 플라즈몬 공명(SPR)의 광학현상)를 초래하여 신호가 감지되게 하므로 생체분자 간 실시간 상호작용의 지표로 사용될 수 있다.
한 실시예에서, 표적 효소는 고체상에 고정된다. 고체상에 고정된 표적 효소/시험 화합물 복합체는 반응, 이를테면 결합반응이 끝날 때 검출될 수 있다. 예컨대, 표적 효소는 고체면에 고정될 수 있고, 시험 화합물(이것은 고정되어 있지 않다)은 이 문서에 고찰한 검출가능한 표지로 직접 혹은 간접적으로 표지될 수 있다.
표적 효소나 항표적 효소 항체를 고정하여 단백질 중 하나 혹은 둘 다의 결합 형태를 비결합 형태와 수월히 분리하고 분석의 자동화를 촉진시키는 것이 바람직하다. 후보 화합물이 들어있는 경우와 들어있지 않은 경우에 시험 화합물과 표적 효소의 결합, 혹은 표적 효소와 2차 성분의 상호작용은 이 반응물질들을 담을 적절한 용기에서 실시할 수 있다. 그런 용기의 예시는 미량 역가판(microtiter plate), 시험관, 및 미량 원심분리 튜브를 포함한다. 한 실시예에서, 접합 단백질을 제공하여 단백질 중 하나나 둘이 매트릭스에 결합될 수 있는 영역을 추가할 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트란스페라제/표적효소 접합 단백질을 글루타티온 세파로스 비드(Sigma Chemical, 미국 미주리 세인트 루이스) 혹은 글루타티온을 유도하는 미량역가판에 흡착시킬 수 있다. 그러면 이것은 시험 화합물과 결합하거나 시험 화합물과 흡착되지 않은 표적효소와 결합한다. 이 혼합물은 복합체 형성에 유리한 조건(예: 염류용 생리학적 조건과 pH) 아래서 배양한다. 배양 후에, 비드 혹은 미량역가판 벽을 세척하여 결합되지 않은 성분들(비드의 경우 고정된 매트릭스)을 제거하고, 복합체를 직접적 혹은 간접적으로, 예컨대 앞에 기술된 바와 같이 분석한다. 다르게는, 복합체를 매트릭스와 분리할 수 있고, 표적효소의 결합 수준 혹은 활성을 표준 기법을 사용해 분석한다.
표적 효소나 시험 화합물을 매트릭스에 고정하는 다른 기법으로는 비오틴과 스트렙타비딘의 접합을 사용하는 것이 포함된다. 비오틴화 표적효소나 시험화합물은 당업계에 알려진 기법(예: 비오틴화 키트, Pierce Chemicals, 일리노이 락포드)을 사용해 비오틴-NHS (N-하이드록시-숙시니미드)로부터 조제될 수 있고, 이것을 스트렙타비딘 코팅된 96공 판(Pierce Chemical)에 고정할 수 있다.
분석을 하기 위해, 고정된 성분을 함유하는 코팅 표면에 고정되지 않은 성분을 첨가한다. 반응이 완결된 후, 반응하지 않은 성분들을(예컨대 세척하여) 제거하되 형성된 복합체가 고체 표면에 계속 고정되어 있을 조건에서 제거한다. 고체 표면에 고정된 복합체는 여러 방법으로 검출할 수 있다. 고정되지 않은 성분이 표지되어 있는 경우, 고체면에 고정된 표지가 검출된다면 복합체가 형성되었음을 의미한다. 고정되지 않은 성분이 표지되지 않은 경우, 표면에 고정된 성분을 검출하는 데는 간접 표지, 예컨대 고정된 성분에 특정한 표지된 항체를 사용할 수 있다(이 항체는 직접 표지되거나 예컨대 표지된 항-Ig 항체로 간접 표지될 수 있다).
한 실시예에서, 이 분석은 표적 효소와는 반응하지만 표적효소와 시험화합물 및/혹은 기질과의 결합은 방해하지 않는 항체를 사용하여 수행된다. 그런 항체는 판의 구멍(well)에 유도될 수 있고, 항체 접합에 의해 구멍 안에 갇힌 표적 효소를 떼어낼 수 있다. 앞에서 GST-고정 복합체에 대하여 기술된 방법들 외에도, 그런 복합체를 검출하는 방법은 표적효소에 반응하는 항체를 사용하는 복합체 면역검출법뿐 아니라 표적 효소에 관련된 효소활성의 검출을 이용하는 효소 관련 분석법도 포함한다.
다르게는, 액상에서는 무세포 분석법을 사용할 수 있다. 그런 분석에서는, 하기를 비롯한(하기에 국한되지 않음) 표준 기법들을 통해 반응산물을 미반응 성분과 분리한다: 차등 원심분리(예: Rivas, G.와 Minton, A. P., 1993, Trends Biochem Sci 18:284-7을 참고); 크로마토그래피(겔 여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피); 전기영동(예: Ausubel, F. et al ., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York을 참고); 및 면역침강법(예: Ausubel, F. et al ., eds., 1999, Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley: New York을 참고). 그런 수지와 크로마토그래피 기법들은 당업계에 알려져 있다(예컨대 Heegaard, N. H., 1998, J Mol Recognit 11:141-8; Hage, D. S.와 Tweed, S. A., 1997, J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 699:499-525를 참고). 나아가, 이 문서에 기술된 형광에너지 전달 분석법도 용액에서 복합체를 추가 정제함 없이 결합을 검출하는 데 편리하게 사용될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 분석은 표적 효소나 그것의 생물활성 부분을 기지의 화합물과 접촉시켜 효소 결합으로 분석 혼합물을 형성하고, 분석 혼합물을 시험 화합물에 접촉시키고, 시험 화합물이 표적 효소와 반응하는 능력을 측정하는 것을 포함한다. 여기서, 시험 화합물이 표적 효소와 반응할 능력의 측정에는 기지의 화합물(예: 경쟁 분석)에 비해 시험 화합물이 표적 효소에 우선적으로 결합할 능력 혹은 표적효소의 활성을 변조할 능력의 측정을 포함한다. 다른 실시예에서, 시험 화합물이 표적 효소에 결합하고 활성을 변조할 능력은 그런 표적효소의 기지의 활성제 혹은 억제제의 능력과 비교된다.
본 발명의 표적 효소는 체내에서 하나 이상의 세포성 혹은 세포외 고분자, 이를테면 단백질과 반응할 수 있다. 그런 고분자들은 숙주세포의 이종 고분자이거나 내생적 고분자들이며, 재조합되어 발현될 수 있거나 아닐 수도 있다. 이 고찰을 위하여, 그런 세포성 및 세포외 고분자를 이하 "결합 파트너(binding partners)"라고 칭한다. 그런 상호작용을 저지할 수 있는 화합물은 표적효소의 활성을 조절하는 데 유용할 수 있다. 그런 화합물은 항체, 펩티드, 및 저분자를 포함한다(이에 국한되지 않는다). 대안적 실시예에서, 본 발명은 시험 화합물이 그런 표적효소를 하향 조정하는 효과제(effector)의 활성을 변조함으로써 표적효소의 활성을 변조할 능력을 측정하는 방법을 제시한다. 예컨대, 적절한 표적에 대한 효과제 분자의 활성 혹은 적절한 표적과 효과제의 결합은 앞에 기술된 바와 같이 측정할 수 있다.
표적 효소와 그 효소의 세포성 혹은 세포외 결합 파트너(들) 간의 상호작용을 간섭하는 화합물을 동정하기 위하여, 그 표적효소와 그 결합파트너를 함유하는 반응혼합물을 조제하여 일정 조건과 충분한 시간 동안 두 산물이 복합체를 형성하게 한다. 억제 화합물을 시험하기 위하여 상기 반응혼합물은 시험 화합물이 들어간 경우와 들어가지 않은 경우로 제공한다. 시험 화합물은 반응 혼합물에 먼저 들어갈 수 있거나, 혹은 표적 효소와 그것의 세포성 혹은 세포외 결합 파트너를 첨가한 후에 첨가될 수 있다. 대조 반응혼합물은 시험 화합물을 넣지 않고 혹은 속임 화합물(placebo)을 첨가하여 배양한다. 그 후, 표적 산물과 세포성 혹은 세포외 결합 파트너 간에 복합체가 형성되었는지 검출한다. 대조 반응에서는 복합체가 형성되고 시험 화합물을 함유한 반응 혼합물에서는 복합체가 형성되지 않았다면, 시험 화합물이 표적 산물과 결합 파트너 간의 상호작용을 간섭한다는 것을 의미한다. 또한, 시험 화합물과 정상적 표적효소를 함유한 반응 혼합물에서 복합체 형성을 시험 화합물과 돌연변이 표적효소를 함유한 반응 혼합물에서 복합체 형성과 비교할 수 있다. 이 비교는 돌연변이 표적효소의 상호작용은 저지하지만 정상적 표적효소의 상호작용은 저지하지 않는 화합물을 동정하고자 하는 경우에 중요할 수 있다.
여기 기술된 분석법은 이종 방식이나 동질 방식으로 수행될 수 있다. 이종 분석법에서는 표적 효소 혹은 결합파트너, 기질, 혹은 시험 화합물을 고형판에 고정시키고, 반응이 끝난 후에 고형판에 고정된 복합체를 검출한다. 동질 분석에서는, 반응 전체를 액상에서 수행한다. 둘 중 어느 접근법을 사용하든, 시험하는 화합물에 대한 정보를 얻기 위해 반응물질 첨가순서를 달리할 수 있다. 예컨대, 표적 효소와 결합파트너, 혹은 기질 간의 상호작용을, 이를테면 경쟁에 의해 간섭하는 시험 화합물은 시험 물질이 들어간 반응을 실시함으로써 동정할 수 있다. 다르게는, 형성된 복합체를 붕괴하는 시험 화합물, 예컨대 더 높은 결합상수를 가져서 복합체의 구성분 중 하나를 떼어내는 시험 화합물은 복합체가 형성된 다음에 반응 혼합물에 첨가하여 시험할 수 있다. 다양한 방식이 아래에 간략히 기술되어 있다.
이종분석 시스템에서는, 표적효소나 그것과 상호작용 하는 세포성 혹은 세포외 결합파트너, 혹은 기질을 고형판(예: 미량 역가판)에 고정하고, 고정하지 않는 물질은 직접적 혹은 간접적으로 표지한다. 고정된 물질은 비공유 부착 혹은 공유 부착에 의해 고정될 수 있다. 다르게는, 고정될 물질에 특정한 고정 항체를 사용해서 그 물질을 고형판에 고정할 수 있다.
분석을 수행하기 위해, 고정된 물질의 결합 파트너를 시험 화합물을 함유한 코팅 면 혹은 함유하지 않은 코팅 면에 노출시킨다. 반응이 완결된 후에, 반응되지 않은 성분들을(예컨대 세척하여) 제거한다. 단, 형성된 복합체는 고형판에 계속 고정되어 있어야 한다. 비고정 물질들이 표지되어 있는 경우, 고형판에 고정된 표지가 검출되었다는 것은 복합체가 형성되었음을 의미한다. 비고정 물질들이 표지되지 않은 경우, 표면에 고정된 복합체의 검출에는 간접 표지, 예컨대 애초 비고정 물질에 특정하게 표지된 항체를 사용할 수 있다(이 항체를 직접적으로 표지하거나 예컨대 표지된 항-Ig 항체로 간접 표지할 수 있다). 복합체 형성을 억제하거나 형성된 복합체를 붕괴하는 시험 화합물은 반응 성분의 첨가순서에 따라 검출할 수 있다.
다르게는, 반응은 시험 화합물, 미반응 성분에서 분리한 반응 산물, 및 검출된 복합체가 존재하는 상태로 혹은 없는 상태로 액상에서 시험할 수 있다. 예컨대, 용액 속에 형성된 복합체를 고정할 결합 성분 중 하나에 특정한 고정항체와, 고정된 복합체를 검출하기 위해 그 결합 파트너의 나머지 하나에 특정하게 표지한 항체를 사용해서 반응을 시험할 수 있다. 다시, 반응물질을 액상에 첨가하는 순서에 따라, 복합체 형성을 억제하거나 형성된 복합체를 붕괴하는 시험화합물을 검출할 수 있다.
본 발명의 대안적 실시예에서는 동질 분석을 사용할 수 있다. 예컨대, 표적효소나 그것의 결합파트너, 혹은 기질이 표지되어 있다는 점에서 표적효소와 이와 상호작용하는 세포성 혹은 세포외 결합파트너 산물, 혹은 기질은 복합체를 형성한 상태이다. 하지만 표지에 의해 발생하는 신호는 복합체 형성으로 인해 소멸된다(이 면역분석 접근법을 활용하는 미국특허 번호 4,109,496을 참고). 형성된 복합체의 물질 중 하나와 경쟁하여 떼어내는 시험화합물을 첨가하면 배경보다 높은 신호가 발생한다. 이런 식으로, 표적효소와 결합 파트너, 혹은 기질을 붕괴하는 시험 화합물을 동정할 수 있다.
그러나 또 따른 측면에서, 표적 효소는 표적효소에 결합 혹은 간섭하는 다른 단백질("표적효소 결합단백질(target enzyme binding protein)" 혹은 "표적효소-bp")을 동정하기 위해 2-하이브리드 분석혹은 3-하이브리드 분석)서 "미끼 단백질(bait protein)" 사용될 수 있고(예컨대 미국특허 번호 5,283,317; Zervos et al., (1993), Cell 72:223-232; Madura et al ., (1993), J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al., (1993), Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al ., (1993), Oncogene 8:1693-1696; 및 Brent, 국제특허출원 공개번호 WO94/10300을 참고), 표적 효소 경로 활성에 관여한다. 그러한 표적효소 결합단백질은 표적효소의 활성제나 억제제일 수 있고, 혹은 예컨대 표적효소 경로의 하향 요소로서 표적효소의 표적일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 표적효소의 유전자 발현을 변조하는 물질을 동정한다. 예컨대, 세포 혹은 무세포 혼합물을 후보 화합물과 접촉시키고, 표적효소 mRNA 혹은 단백질의 발현을 후보 화합물이 없을 때의 표적효소 mRNA 혹은 단백질의 발현수준과 비교평가 한다. 후보 화합물을 사용하지 않은 경우보다 사용한 경우에 표적효소 mRNA 혹은 단백질의 발현이 높으면, 그 후보 화합물은 표적효소 mRNA 혹은 단백질의 발현 자극제로 확인된다. 혹은, 후보 화합물을 사용하지 않은 경우보다 사용한 경우에 표적효소 mRNA 혹은 단백질의 발현이 낮으면(통계적으로 유의하게 낮음), 그 후보 화합물은 표적효소 mRNA 혹은 단백질의 발현 억제제로 확인된다. 표적효소 mRNA 혹은 단백질의 발현수준은 표적효소 mRNA 혹은 단백질을 검출하는 방법들, 예컨대 일반 당업자들에게 알려져 있는 웨스턴, 노던, PCR, 질량분석, 2-D 전기영동 등등으로 측정할 수 있다.
효소표적을 생산하기 위한 분석, 효소표적의 활성을 시험하기 위한 분석, 및 효소표적의 억제나 활성화를 검사하기 위한 분석은 지방산 생합성 관련 효소를 예시로 사용하여 아래 기술되어 있다. 이 분석들을 당업계의 일반 기술로 수정하여 혹은 당업계에 알려진 다른 분석법을 사용하여 발명의 다른 표적들의 활성을 시험할 수 있다.
AMP -활성 단백질 활성효소( AMPK )
본 발명의 한 실시예에서, 지방산 생합성을 상향조정 하는 바이러스는 AMP-활성 단백질 활성효소(AMPK)를 활성화하는 화합물에 의해 억제될 것이다. AMPK는 아세틸 CoA 카르복실라제의 억제제이기 때문이다. 바람직한 실시예에서, 당분해 상향조정에 의존하고 AMPK 활성에 의존하는 바이러스는 AMPK 억제제에 의해 억제될 것이므로 바람직한 결과는 AMPK 억제이다.
AMPK는 예시적으로 돼지 간에서 정제할 수 있다. 간(1 kg)을 완충액 4,000 ml에서 균질화 한다. 2.5- 7.0% (w/v) PEG 6000 분획을 조제한 다음, 그 분획을 1,500 ml의 DEAE 셀룰로오즈(Whatman, 뉴저지 클리프톤)로 처리하고, 0.25 M NaCl을 함유한 완충액으로 용리한다. 용출물을 크로마토그래피에서 예컨대 블루 세파로즈(Pharmacia, 스웨덴 웁살라)를 사용해 분리하고, AMPK 를 1 M NaCl을 함유한 완충액으로 용리한다. 펩티드 기질 친화 크로마토그래피로 크로마토그래피를 하기 앞서, 효소 분획을 10% (w/v) PEG-6000으로 침전시켜 농축 및 탈염한다. 펩티드 기질 친화 컬럼을 0.1% (v/v) Triton X-100과 0.5 M NaCl을 함유한 동일한 완충액으로 세척하고, AMPK를 2 M NaCl과 30% (v/v) 에틸렌 글리콜을 함유한 이 완충액으로 용리한다.
위에 기술된 효소활성 및 화합물 선별을 위한 일반 분석 외에도, AMPK의 활성을 측정하기 위한 분석(이것은 잠재적 항바이러스 화합물의 효과를 시험하는 데 사용될 수 있다)은 미국특허 공개번호 20060147947; 미국특허 번호 7220729; 미국특허 번호 6124125; 및 Feng et al ., (2004), Antiviral Res. 62, A43에 설명되어 있다.상기 참조는 인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된다. AMPK 활성 체외분석은 시험 화합물, AMPK, AMP, 기질(예: 단백질), 및 ATP(예: 방사성표지 ATP)를 포함하는 반응 혼합물의 생성과 ATP에서 기질로 인산 전달에 대한 평가를 포함할 수 있다. 인산 전달에 대한 평가는 예컨대 인산 검출(예: 화학적으로, 즉 방사성표지 같은 표지를 사용하여), 혹은 기질의 물리적 특성(예: 분자량, 전하, 혹은 pI의 변화) 검출을 포함할 수 있다.
AMPK 활성은 체외에서 분석할 수 있다. 예컨대 Hardie et al ., (1997), Eur. J. Biochem. 246: 259; Hardie et al ., (1998), Annu Rev. Biochem. 67:851; Vavvas et al ., (1997), J. Biol. Chem. 272:13256; 및Winder et al ., (1996), Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 270:E299를 참고한다. 반응 혼합물은 방사성표지 ATP (예: [32P]ATP)와 인공 펩티드 기질(예: 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC) 효소의 아미노산 서열인 "SAMS"라고 불리는 15-아미노산 펩티드)를 포함할 수 있다. SAMS 펩티드는 서열 HMRSAMSGLHLVKRR을 포함할 수 있다. Davies et al .,(1989) Eur. J. Biochem, 186:123을 참고한다. 글리코겐 합성에서 나오는 펩티드, 예컨대 서열 PLSRTLSVAAKK를 포함하는 펩티드도 사용될 수 있다.
AMPK 활성 증가는 펩티드의 인산화 증가를 유발할 것이다. 일부 실시예에서, 반응 혼합물은 AMP 혹은 크레아틴 인산을 포함할 수 있다. 인산화는 펩티드에서 유리 ATP를 분리한 후에 예컨대 섬광계수기를 사용해서 검출할 수 있다.
아세틸- CoA 카르복실라제( ACC )
아세틸-CoA 카르복실라제(ACC)는 지방산 생합성의 첫 번째 개입단계를 촉진시키고, ATP, 바이카르보네이트 및 아세틸-CoA를 말로닐-CoA, ADP 및 무기 인산염 촉매로 전환하는 지방산 생합성 속도제한 단계 중 하나이다. ACC 효소 분석은 재조합된 정제 ACC1 및/또는 ACC2를 사용해서 수행할 수 있다. 인간과 쥐의 ACC2의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열은 예컨대 미국특허 번호 7,211,423(참고)에 기술되어 있다. 상기 특허는 인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된다. 따라서 본 발명의 일부 실시예에서, 특정 화합물의 특정 동종효소나 효소 동종형에 대한 특이성을 분석하는 것이 일반적으로 바람직하다는 데 유의한다. 재조합 ACC1이나 ACC2는 적절한 숙주세포(예: 박테리아, 곤충세포, 이스트 세포, 혹은 포유류 세포)에서 발현되고 친화 크로마토그래피로 정제된 꼬리표, 예컨대 Myc, 글루타티온 S-트란스페라제(GST), 폴리His, HA, Flag, 혹은 마노즈 결합단백질(MBP)로 표지할 수 있다. 예시적 분석에서, 항정상태 동력학 파라미터들은 산에 불안정한 H[14C]O3에서 아세틸-CoA로 방사능이 ACC 및 ATP 의존적으로 편입되어 산에 안정한 말로닐-CoA 산물이 생성되는 것을 모니터링 함으로써 분석한다. 반응은 37℃에서 수행하고, 큰 규모로 예컨대 96공 미량역가판에서 수행할 수 있다. 반응을 저지한 다음, 편입되지 않은 표지를 제거한다. 미량판에 존재하는 14C의 양은 섬광계수기로 측정할 수 있고, 반응속도는 각 배양의 편입된 방사능 대 반응시간을 선형 회귀분석하여 구할 수 있다. KM 값과 Vmax 값은 표준 헨리-미카엘리스-멘텐 방정식(standard Henri-Michaelis-Menten equation)에 따라, 최초 속도를 비선형 회귀분석하여 구할 수 있다. kcat은 Vmax값을 비색법을 통한 단백질 분석에서 도출된 효소의 반응농도로 나누어 구할 수 있다. 특정 화합물의 적정에서 이 값들이 변이한다면 그 화합물은 ACC 활성을 변조한다는 의미이다(Cheng et al ., (2007) Protein Exp and Purif. 51:11-21을 참고한다. 이 문헌은 인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된다). ACC 활성에 대한 기타 분석법은 미국특허 번호 6069298; 국제특허출원 공개번호 WO 2003/072602; 유럽특허출원 번호 EP1607477; Oizumi et al ., (1990), J Chromatogr 529: 55-63); Bijleveld et al ., (1987), Biochim Biophys Acta 918:274-283; 및 Haas A.(1994), Methods 126: 87-97에 나와 있다. 상기 각 문헌은 인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된다.
당업계 분야에 기술된, 예컨대 미국특허 번호 6,994,956(이 특허는 인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된다)에 공개된 바와 같은 ACC 효소활성 측정을 위한 분석법은 화합물의 ACC 효소활성 억제능력을 시험하는 데 사용될 수 있다. 그런 분석법은 고효율 검색에도 사용될 수 있다. 미국특허 번호 6,994,956에 기술된 방법들은 ACC에 의해 촉진되는 NaHCO3와 [1-14C]아세틸-CoA 반응의 산물 [2-14C]말로닐-CoA를 FAS의 기질로 사용하는 신호획득 분석을 통해 ACC 활성의 방사선 검출 분석을 할 수 있다. ACC 활성의 방사선 검출 분석은 반응혼합물을 산성화한 후에, ACC-FAS 공역 분석(coupled assay)의 방사성 산물(14C-방사성표지 올레산과 팔미트산)을 PPSF(Microscint™-E)로 분배한다. 예컨대, 96공 밀도 반응을 다음 방식으로 분배한다: 효소(ACC 및 FAS), 기질, 시험 화합물, 완충액을 구성분으로 함유한 100 ㎕ 효소 분석 억제제 시험 혼합물을 지방산 산물이 생성되도록 실온에서 배양한다. 2N HCl 20 ㎕를 첨가한 후 150 ㎕의 Microscint™-E 를 첨가하여 효소 반응을 중단시킨다. 분배하는 데는 특정 혼합단계가 필요하지 않지만 확실히 분배되는 데 몇 시간이 필요하며 24시간 동안 안정이 필요하다. 방사성 기질 [1-14C]아세틸-CoA도 ACC 반응 산물 [2-14C]말로닐-CoA도 유기상에 분배되지 않는다.
효소활성은 액체섬광계수법으로 측정한 유기상의 방사능에 비례한다. PPSF(phase-partition scintillation fluid, 상분배 섬광용액)에서 검출되는 방사능양은 공(well) 안의 FAS 양과 효소반응을 실시한 시간길이에 의존한다. 즉, CPM(1분 당 방사선 수)은 ACC의 반응시간과 농도에 관하여 용량 의존적이다. 긴 사슬 지방산을 PPSF로 분배하는 데 있어 산성화와 PPSF의 효과는 방사성표지 팔미트산의 기지의 양을 사용해서 평가할 수 있다. 분석의 이론적 배경 신호는 같은 몰 수와 같은 방사능양의 방사성표지 기질과 산물을 사용해 PPSF의 CPM을 비교하여 구할 수 있다.
아래 기술된 바와 같은 샘플 반응은 화합물을 사용하여 혹은 사용하지 않고서 수행될 수 있다. 여러 농도의 ACC와 FAS를 4 mM ATP, 400 μM NADPH, 및 16 μM 아세틸-CoA(0.015 uCi; [아세틸-1-14 C]-CoA)를 첨가하고, 50 mM HEPES(pH 7.5), 20 mM NaHCO3 , 10 mM 구연산, 5 mM DTT, 10 mM MgCl2 , 1 mM EDTA, 및 0.03% BSA를 함유한 완충액을 첨가하여 총량을 100 ㎕로 만든 후 실온에서 75분간 배양한다. 10N 아세트산 10 ㎕을 첨가한 후 150 ㎕ Microscint™-CAT을 첨가하여 반응을 종결한다. 이 혼합물을 하룻밤 배양한 후 데이터를 획득한다.
ACC의 효소활성을 측정하기 위한 분석의 기타 비제한적 예시들이 아래 제시되어 있다. 분광광도분석(Spectrophotometric assay)은 ATP 의존 비오틴의 부분 반응을 측정하는 데 사용될 수 있다. 이 방법에서, 비오틴 카르복실라제에 의한 ATP 가수분해율은 ADP 생산을 피루브산 활성효소와 젖산 탈수소효소에 결부시켜 340nm에서분광광도분석으로 측정된다(Levert et al ., Biochemistry 39:4122-3128, 2000을 참고). 또한, 분광광도분석은 ACC 촉매작용에 의한 말로닐-CoA의 탈카르복실화를 모니터 하는 데도 사용될 수 있다. 이 방법에서, ACC 반응에서 생산된 아세틸-CoA는 구연산 합성효소 촉매 반응에서 구연산을 생산하도록 말산 탈수소효소가 말산과 NAD에 작용하여 생산된 옥살아세트산으로 농축되고, NADH 생산은 340 nm에서 흡광도를 증가시키며 측정된다(Winder et al ., J. Appl. Physiol. 882219-2226, 2000을 참고). 방사성표지 분석은 NaH14CO3와 아세틸-CoA로부터 [3-14C]말로닐-CoA생산량을 측정하는 데도 사용될 수 있다(Herbert et al ., Biochem. J. 318:997-1006, 1996을 참고).
리소포스파티드산 아실트란스페라제( 리소포스파티드산 아세틸트란스페라제 포함)( LPAAT ) 분석
LPAAT 폴리펩티드는 다수의 재조합 DNA 발현 시스템 중 어느 것으로나 발현시킬 수 있다. 예컨대, 재조합 LPAAT는 본 발명을 위한 화합물 선별에 유용한 순수, 생물활성적 hLPAAT-알파, hLPAAT-베타, hLPAAT-감마-1, hLPAAT-감마2, 및 hLPAAT-델타를 대규모 생산할 수 있도록 이콜라이(E. coli)에서 발현하고 정제할 수 있다.
LPAAT 효소를 억제하기 위한 화합물의 선별은 예컨대, hLPAAT-알파, hLPAAT-베타, hLPAAT-감마1, hLPAAT-감마2, 및/혹은 hLPAAT-델타를 LPAAT를 위한 화합물 및 기질, 즉 LPA와 지방 아실-CoA의 존재 하에서 접촉시키는 것으로 구성된다. 이 hLPAAT 단백질들은 배양 전에 정제하거나, 혹은 이 폴리펩티드들을 암호화 하는 cDNA를 이입한 세포주(들)(예: Sf9, ECV304, A549)의 추출물에 첨가될 수 있다(West et al ., DNA Cell Biol. 16:691, 1997). 다르게는, hLPAAT 단백질을 이입 세포로부터 정제한 후, 막횡단 단백질인 이 단백질을 세포 안으로 전달하기 위해 리포좀을 형성하도록 지질 이중층에서 재구성할 수 있다(Weiner, Immunomethods 4:201, 1994).
hLPAAT-알파, hLPAAT-베타, hLPAAT-감마1, hLPAAT-감마2, 혹은 hLPAAT-델타 활성에 대한 화합물 혹은 조성물의 효과는 예컨대 PA와 CoA의 생성량을 측정하여 분석할 수 있다. PA는 예컨대 아래 예시 3과 예시 7에 기술되어 있는 TLC법으로 측정할 수 있다. 다르게는, 반응에서 유리 CoA의 형성을 검출하여 LPAAT 활성을 분석할 수 있다. CoA는 유리 설프하이드릴기를 갖고 있으며, 예컨대 설프하이드릴 특이 시약, 이를테면 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)(DTNB) 혹은 티오글로(Covalent Associates, 매사츄세츠 워번)를 사용해 비색법 혹은 형광법으로 측정할 수 있다. hLPAAT-알파, hLPAAT-베타, hLPAAT-감마1, hLPAAT-감마2, 혹은 hLPAAT-델타에 대한 관측된 효과는 억제이거나 자극일 수 있다.
리소포스파티드산 아세틸전이효소 활성 분석법의 예시들은 미국특허 공개번호 20040043465; Bonham et al ., (2003), Expert Opin. Ther. Targets 7/5:643-661; 및 미국특허 번호 6136964에 나와 있다. 상기 문헌은 인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된다.
HMG - CoA 합성효소
HMG-CoA 합성효소는 간에서 정제될 수 있다. 한 예시적 시험계획은, 찰스 리버 CD 수컷 쥐들의 간(225-350 g)을 0.25M 자당에서 균질화 한 후, 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)와 N-p-토실-1-리신 클로로메틸 케톤(TLCK)으로 조정하여 각각의 최종 농도를 각각 50 ㎍/ml와 25 ㎍/ml로 만든다. 이 균등질을 700xg로 10분간 원심분리한 후, 상등액을 따라내어 7,700xg로 20분간 다시 원심분리 한다. 이 상등액을 미세 나일론 스크린으로 여과하여 지방층의 대부분을 제거한 다음, 100,000xg로 1시간 동안 원심분리 한다. 이 상등액을 취하여, 1M 인산칼륨, 디티오트레이톨(DTT) 및 에틸렌 글리콜비스(베타-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA)을 최종 농도가 각각 0.1M(pH 7.2), 0.5 mM 및 0.1 mM이 되도록 첨가한다. 포화도 50%가 되도록 단백질 용액에 고체 황산암모늄을 첨가한 후, 15,000xg에서 원심분리 하고 상등액은 버린다. 침전된 단백질은 -70℃에서 최소 1달간 활성 손실 없이 보관될 수 있다. 황산암모늄 침전물을 0.5 mM 디티오트레이톨과 0.1 mM EGTA(0.06M 인산염 완충액이라고 불린다)을 함유한 0.06M 인산칼륨 완충액(pH 7.2)에서 용해시킨 다음, 동일한 완충액 2 리터로 하룻밤 투석하여 황산암모늄을 제거하고 HMG-CoA 분해효소를 불활성화 시킨다(Clinkenbeard et al ., J. Biol. Chem. 250, 3108-3116(1975)).
투석된 추출물을 0.06M 인산염 완충액으로 평형된 DEAE-52(Whatman) 컬럼에 첨가한다(수지 충전 부피 1ml 당 단백질 10 mg). DEAE-셀룰로즈를 280 nm에서 광밀도가 0이 될 때까지 0.06M 인산염 완충액으로 용리한다. 이 분획은 베타-케토아세틸-CoA 티오라제 활성을 담고 있다. 0.5 mM DTT와 0.1 mM EGTA를 함유한 0.06M 인산염 완충액(pH 7.2)으로 만든 0.1M KCl 을 사용해 HMG-CoA 합성효소를 컬럼에서 용리한다. 이렇게 하면 사실상 모든 티오라제 활성이 제거된다. 50% 포화도가 되도록 황산암모늄을 첨가하여 단백질을 침전시킨다. 이 용액을 4℃에서 10분간 교반한 다음, 침전물을 회수해 15,000 rpm으로 10분간 원심분리 한다. 상등액은 버리고, 침전물을 최소한 0.06M 인산염 완충액, pH 7.2(약 10 ml)에서 용해시킨다. 이 효소를 -80℃에서 보관한다.
HMG-CoA 합성효소의 내재활성은 다음 체외분석으로 측정한다. 117 mM Tris-HCl(pH 8.0), 11.7 mM MgCl2, 1.17 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 0.58 mM 디티오트레이톨을 함유한 용액에 시험 화합물(예컨대 디메틸설폭사이드 용액 2 ㎍/ml 농도로 첨가한 것)을 첨가한 것과 첨가하지 않은 것에 효소 단백질(약 12.2 ㎍)을 첨가한다. 30℃ 교반 수조에서 0.085 ml 액량으로 배양한다. 5분 후, 아세토아세틸-CoA와 0.1 uCi의 1[14C]-아세틸-CoA를 함유한 용액 15 ㎕를 첨가하여 최종 농도를 각각 0.1 mM과 0.4 mM으로 만든다. 배양을 2분 더 계속한 다음, 유리 섬광 바이알에서 6N HCl 0.2 ml에다 분석 혼합물 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중단시킨다.바이알을 110℃에서 1시간 가열한 다음, 6N HCl 0.2 ml를 각 바이알에 첨가하고, 다시 1시간 동안 가열한다. 그 후, 0.9% 식염수 1.0 ml를 각 바이알에 첨가하여 섬광액의 최종 액량을 10ml로 만든다. Packard Tri-Carb 액체 섬광 계수기에서 방사능을 측정한다. 억제 백분율은 표준 공식으로 계산된다. IC50 값은 시험 화합물의 로그 농도 대 억제 백분율을 플로팅 하고, 최소자승법을 사용해 직선을 결과 데이터에 적합화하여 도출된다.
HMG-CoA 합성효소의 활성을 측정하기 위한 분석법의 예시들은 미국특허 5064856, 유럽특허출원 EP99107413, 및 Omura S.(1992, J Industrial Microbiol 10:135-156)에 제시되어 있다. 이 문헌들 각각은 인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된다.
ATP 구연산 분해효소
쥐 혹은 인간의 ATP 구연산 분해효소는 본 발명에 따라 정제되고 사용될 수 있다. 위스타 수컷 쥐들을 24시간 동안 굶긴 후, 72시간 동안 고탄수화물 먹이를 먹이고 나서 간을 제거한다. ATP 구연산 분해효소는 Wraight et al ., (Anal. Biochem., 1985, 144, 604-609)의 방법을 대규모 정제를 위해 Wells(Eur. J. Biochem., 1991, 199, 163-168)에 따라 수정한 방법으로 조제한다. 단백질 순도는 SDS-PAGE로 측정할 수 있다. 인간 ATP 구연산 분해효소는 유럽 생화학 저널(European Journal of Biochemistry,1992, 204, 491-99)에 기술된 방법을 위에서 말한 Wells에 따라 대규모 정제를 위해 수정한 방법으로 조제한다. 이 방법으로 얻은 단백질 순도를 SDS-PAGE로 판단한다.
ATP 구연산 분해효소의 활성은(Linnet et al ., (J. Biol. Chem., 1979, 254, 1691-1698)의 방법에 따라) 말산 탈수소효소와 NADH로 생산된 옥살로아세테이트를 25℃에서 환원시키고 베크만 DU50 분광광도기를 사용해 340 nm에서 모니터링 하면서 분석한다. 간단히,ATP 구연산 분해효소(인간이나 쥐의)를 50 mM Tris/HCl, pH=8.0, 0.2 mM NADH, 10 mM MgCl2, 10 mM KCl, 5 mM ATP, 200 μM 보효소 A, 10 mM 디티오트레이톨, 및 말산 탈수소효소를 담은 1 ml 큐벳에 첨가한다. 억제제 용액을 첨가한다(비수용성 억제제의 경우, DMSO 보관액을 조제한다. 큐벳에서 최종 DMSO 농도는 1%를 초과해서는 안 된다). 마지막으로, 최종 100 μM가 되도록 트리칼륨 구연산을 첨가한다. 이것은 구연산용 KM 이다(Wells et al ., Eur. J. Biochem., 1992, 204, 249-255과 Houston et al ., Biochim. Biophys. Acta, 1985, 844, 233-239). 데이터 분석은 곡선화(curve fitting) 패키지인 Enzfitter(Elsevier Biosoft)를 사용해서 수행한다.
인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된 ATP 구연산 분해효소 활성 분석법들은 미국특허 번호 5447954; 국제특허출원 공개번호 WO 2004/100885; 및 효모에서의 분석법에 대한 Holdsworth et al ., (1998), J Gen Microbiol 134:2907-2915에서 찾을 수 있다.
지방산 합성효소
예시적으로, 효소 분석을 위해 피하 지방조직을 파열시켜 세포를 용해하고 용해성 용해질을 사용한다. 분석은 말로닐 CoA 첨가로 시작하고, NADPH의 산화율을 측정한다. 지방산 합성효소의 활성을 분리하고 시험하는 방법은 Wiesner et al., (1988), European J Biochemistry 177:69-79와, A K Joshi and S Smith (1993), Biochem J. 296: 143-149에 제시되어 있다.
지방산 합성효소의 활성은 수정 분광광도측정법(Lowry et al ., 1951, "Protein measurement with the Folin phenol reagent," J Biol Chem. 193(1): 265-75)으로 측정할 수 있다. 지방산 합성효소 활성의 상세 분석은 미국특허 번호 4735895; 국제특허출원 공개번호 WO 2003/051307; 및 미국특허출원 공개번호 US20070099230과 US20020151463에 나와 있으며, 상기 각 문헌은 인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된다.
5.3.1 화합물과 표적효소의 고효율 검색
한 실시예에서, 예컨대 질량분석법을 사용하는 고효율 검색을 사용해 다수의 화합물과 다수의 표적효소를 동시에 선별할 수 있다. 질량분석법은 대사산물 농도와 효소활성을 측정하는 데도 사용될 수 있다.
특정 대사산물(예: AMP, ATP)의 농도는 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS/MS)으로 정량할 수 있다. 관심 대사산물은 특정한 크로마토그래피 체류시간을 가질 것이고, 그 시점에서 질량분석기는 선택된 반응 모니터링(selected reaction monitoring, SRM) 스캐닝을 수행한다. 이 스캐닝은 3개의 식별자로 구성된다:
1) 대사산물의 질량(어미 이온(parent ion));
2) 특정 질량을 가진 토막을 얻기 위해 어미 이온을 아르곤과의 충돌에서 파편화 하는 데 필요한 에너지; 및
3) 특정 토막 이온의 질량.
상기 식별자들을 사용해서, 관심 대사효소의 활성에 의존하여 생산되는 대사산물의 누적량을 측정할 수 있다. 효소의 활성이 속도 제한인자가 되도록 과량의 효소 기질을 세포 용해물에 첨가하여, 시간 경과에 따른 효소산물의 누적량을 위에서 설명한 LC-MS/MS로 측정한다. 이 효소산물 누적량은 대사효소의 활성의 함수가 된다. 그런 분석의 한 예시는 인용에 의해 이 문서에 완전히 첨부된 Munger et al ., (2006), PLoS Pathogens, 2: 1-11에 보고되어 있다. Munger 등은 과량의 인산 과당 활성효소 기질 ATP와 인산 과당을 첨가한 후 LC-MS/MS로 이인산 과당 누적량을 측정함으로써, 감염된 용해질에 들어 있는 인산 과당 활성효소의 활성을 측정하였다. 이 접근법은 여러 숙주세포 효소의 활성을 측정하기 위해 수정하여 사용될 수 있다.
5.3.2 잠재 항바이러스 화합물을 평가하기 위한 동적 플럭스 프로파일링( Kinetic Flux Profiling , KFP )
발명의 추가 실시예에서, 앞에서 말한 분석법 중 하나에서 표적효소를 억제하는 것으로 밝혀진 화합물이 들어가거나 들어가지 않은 경우의 동적 플럭스 프로파일링(KFP)(6절과 Munger et al ., (2006), PLoS Pathogens, 2: 1-11을 참고)을 사용해 바이러스가 있는 경우 혹은 없는 경우의 세포 대사 플럭스를 프로파일링 한다. 그런 대사 플럭스 프로파일링은 추가로 (i) 숙주의 어떤 대사 성분을 항바이러스 중재의 표적으로 삼을 수 있는지에 대한 정보, (ii) 서로 다른 바이러스의 표적 대사경로에 대한 정보, (iii) 특정하게 바이러스 감염세포에서 화합물이 바이러스가 유발한 대사 플럭스를 상쇄할 능력 혹은 세포 치사성 대사 이상을 개시할 능력에 기초해 화합물의 잠재 항바이러스제로서의 유효성을 제공한다. 한 실시예에서, 발명의 동적 플럭스 프로파일링 방법은 다음을 판정하기 위한 선별에 사용될 수 있다: (i) 서로 다른 바이러스에 의해 유발된 특정 대사 변화, (ii) 서로 다른 바이러스에 의해 유발된 대사 플럭스 변화를 상쇄(혹은 특정하게 증강)할 화합물의 능력.
따라서, 발명의 한 실시예에서, 세포는 바이러스로 감염되고, 대사 플럭스는 바이러스 감염 후 서로 다른 시점(당업계에 알려진 시점)에서 분석된다. 예컨대, 플럭스는 감염 후 24시간, 48시간, 혹은 72시간 후에 측정할 수 있다. 바이러스 존재 하에 대사 플럭스가 변경된다면, 그 바이러스는 감염 동안 세포 대사를 변경하는 것이다. 관측된 대사 플럭스 변경 유형(위 설명과 이 안의 예시를 참고)은 바이러스가 작용하는 세포 경로에 대한 정보가 될 것이다. 그러면 당업계에 잘 알려져 있고 아래 기술된 분석법들을 사용해 그 바이러스의 표적을 확인할 수 있다. 예컨대, 바이러스가 지방산 합성효소의 활성을 변조하는 것으로 보인다면, 아래 5.4절에 기술된 항바이러스 활성 분석법으로 세룰레닌(cerulenin)의 항바이러스 능력을 시험해볼 수 있다. 바이러스가 ATP 구연산 분해효소를 변조하는 것으로 보인다면, 라디시콜과 그 유도체의 항바이러스 효과를 시험해볼 수 있다. 잘 알려진 이들 화합물이 효과적인 항바이러스제라면, 특정 바이러스 대사 표적이 확인되었기에 이들 표적을 변조하는 기타 화합물을 잠재적 항바이러스제로 유사하게 평가할 수 있다. 발명에 사용될 수 있는 화합물, 항바이러스제로 사용될 수 있는 화합물, 및 신약의 대사 표적을 동정하거나 항바이러스 중재의 기타 바이러스를 동정하기 위한 시험 화합물로 유용한 화합물들의 예시는 표 2를 참고한다.
Figure 112009082238916-PCT00319
Figure 112009082238916-PCT00320
발명의 한 실시예에서, 바이러스 감염세포를 화합물에 접촉시키고 대사 플럭스를 측정한다. 화합물이 존재한 경우와 없는 경우의 대사 플럭스가 바이러스의 대사 효과가 억제되거나 증강된 식으로 서로 차이가 있다면, 대사 플럭스를 변경할 바이러스의 능력을 변조하는 화합물이 확인된 것이다. 관측된 대사 플럭스 변경 유형은 그 화합물이 작용하는 세포 경로에 대한 정보가 될 것이다. 그러면 당업계에 잘 알려져 있고 여기 기술된 분석법을 사용해 항바이러스 화합물의 표적을 확인할 수 있다.
한 실시예에서, 고효율 메타볼롬 정량 질량분석법을 사용하여, 바이러스에 의해 유발된 메타볼롬 변화를 검사하고 화합물 혹은 화합물 라이브러리가 그 변화를 상쇄하는지 여부를 검사할 수 있다. Munger et al ., (2006), PLoS Pathogens, 2: 1-11을 참고한다.
5.3.3 화합물
바이러스 감염세포의 메타볼롬 및 플럭솜 분석을 사용하여, 본 발명인들은 표 1(5.1절)에 나열된 숙주세포 표적효소들이 바이러스 감염에 의해 영향 받는 것을 발견하였다. 이 발견에 기초하여, 그 효소들의 알려진 억제제들과 구조적으로 관련 있는 화합물들을 확인하여, 그 효소들의 활성을 특정하게 변조하는 것들을 선별한다. 표 2(앞의 5.3.2절)를 참고한다. 아울러, 그 효소들의 활성을 변조할 능력에 대하여 관심 화합물들을 시험할 수 있다. 다르게는, 대사에 관련된 다른 숙주세포 효소들을 억제할 능력에 대하여 화합물들을 시험할 수 있다. 일단 그런 화합물이 대사효소 변조작용이 있는 것으로 확인되면, 5.4절에 기술된 항바이러스 활성에 대하여 그 화합물들을 추가 시험할 수 있다. 다르게는, 항바이러스 활성이 있는 화합물을 선별하여, 이 문서에 기술된 대사 선별 분석법을 사용해 임의로 특성화 할 수 있다.
한 실시예에서, 수많은 잠재적 치료제 화합물(잠재적 조절제 혹은 리간드 화합물)을 담고 있는 조합 화학물질 혹은 펩티드 라이브러리(예: 공개적으로 이용 가능한 라이브러리)를 제공하기 위해 고효율 검색법을 사용한다. 그 후, 바람직한 특징적 활성을 보이는 라이브러리 항목(특정 화학종 혹은 하위계열)을 찾기 위해, 5.3절에 기술된 바와 같이, 분석(들)에서 그런 "조합 화학 라이브러리" 혹은 "리간드 라이브러리"를 검색한다. 그렇게 해서 확인된 화합물은 전통적인 "선도 화합물"로 사용되거나, 잠재적 혹은 실제 치료제로 사용될 수도 있다.
조합 화학 라이브러리는 화학합성이나 생물학적 합성에 의해 만들어진 다양한 화합물을 시약 같은 다수의 화학적 "빌딩 빌록"을 결합하여 모아 놓은 것이다. 예컨대, 폴리펩티드 라이브러리 같은 선형 조합 화학 라이브러리는 일단의 화학적 빌딩블록(아미노산)을 그 화합물의 길이(즉, 한 폴리펩티드 화합물에서 아미노산의 수)에 대하여 가능한 모든 방식으로 결합하여 만든다. 그처럼 화학적 빌딩블록의 조합 혼합을 통해 수백만 개의 화합물이 합성될 수 있다.
조합 화학 라이브러리의 준비와 선별은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 그런 조합 화학 라이브러리는 펩티드 라이브러리(예컨대 미국특허 번호 5,010,175; Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991) 및 Houghton et al ., (1991), Nature 354:84-88을 참고)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 화학 다양성 라이브러리(를 생성하기 위한 기타 화학들은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: 펩토이드(예: 특허협력조약 공개번호 WO 91/19735), 암호화된 펩티드(예: 특허협력조약 공개번호 WO 93/20242), 임의 바이오-올리고머(예: 특허협력조약 공개번호 WO 92/00091), 벤조디아제핀(예: 미국특허 번호 5,288,514), 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드 같은 다이버조머(diversomers) (Hobbs et al ., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 , 1993), 비닐위치 폴리펩티드(vinylogous polypeptides) (Hagihara et al ., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568, 1992)), 포도당 골격을 가진 비펩티드 펩티드모사체 (Hirschmann et al ., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218, 1992), 소분자 화합물 라이브러리의 유사 유기합성(Chen et al ., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661, 1994), 올리고카바메이트(Cho et al ., Science 261:1303, 1993), 및/혹은 펩티딜 포스포네이트(Campbell et al ., J. Org. Chem. 59:658, 1994), 핵산 라이브러리(Ausubel, Berger 및 Sambrook, 위 모든 것 참고), 펩티드 핵산 라이브러리(예컨대 미국특허 번호 5,539,083 참고), 항체 라이브러리(예컨대 Vaughn et al ., Nature Biotechnology, 14(3):309-314, 1996과 특허협력조약/US96/10287 참고), 탄수화물 라이브러리(예컨대 Liang et al ., Science, 274:1520-1522, 1996와 국제특허출원 공개번호 WO 1997/000271 참고), 유기 저분자 라이브러리(예컨대, 벤조디아제핀, Baum C&EN, January 18, page 33, 1993; 이소프레노이드, 미국특허 번호 5,569,588; 티아졸리디논과 메타티아자논, 미국특허 번호 5,549,974; 피롤리딘, 미국특허 번호5,525,735과 5,519,134; 모르폴리노(morpholino) 화합물, 미국특허 번호 5,506,337; 벤조디아제핀, 미국특허 번호 5,288,514 등등참고). 이 외에도 분자 라이브러리 합성방법의 예시는 당업계에서, 예컨대 다음에서 찾을 수 있다: DeWitt et al . (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al . (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al . (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al . (1993) Science 261:1303; Carrell et al . (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al . (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 및 Gallop et al . (1994) J. Med. Chem. 37:1233
특정 선도 화합물로부터 변이형을 만들기 위해 몇몇 예시 라이브러리를 사용한다. 한 가지 방법은 예컨대 유도체화(derivatization)를 통해 선도 화합물의 하나 이상의 작용기들이 다양화되도록 조합 라이브러리를 생성하는 것을 포함한다. 따라서 조합 라이브러리는 공통된 구조 특징(예: 골격)을 갖는 같은 계열의 화합물을 포함할 수 있다. 라이브러리 생성의 시작물질로 사용될 수 있는 선도 화합물의 예시는, 예를 들어 AMPK의 경우, 메트포르민 같은 비구아니드; 티아졸리디네디온(예: 로시글리타존과 피오글리타존); AMP 유사체(예: AICAR=5'-아미노이미다졸-4-카르복시아미드-리보시드); 렙틴과 렙틴 관련 분자; 아디포넥틴과 아디포넥틴 관련 분자를 포함한다.
조합 라이브러리를 조제하기 위한 장비들은 상용화 되어 있다(예: 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech(켄터키 루이스빌), Symphony, Rainin(매사츄세츠 워번), 433A Applied Biosystems(캘리포니아 포스터 시티), 9050 Plus, Millipore(매사츄세츠 베드포드)를 참고). 또한, 다수의 조합 라이브러리 자체가 상용화 되어 있다(예: ComGenex(뉴저지 프린스턴) Asinex(러시아 모스코바), Tripos, Inc.(미주리 세인트 루이스), ChemStar, Ltd(러시아 모스코바), 3D Pharmaceuticals(필라델피아 엑스톤), Martek Biosciences (매릴랜드 콜롬비아) 등을 참고). 시험 화합물도 다음 라이브러리 및 방법으로부터 구할 수 있다: 생물학 라이브러리; 펩토이드 라이브러리(펩티드 기능을 갖고 있으나 새로운, 비펩티드 백본이 있고 효소에 잘 분해되지 않으면서도 생물활성을 갖고 있는 분자들의 라이브러리. 예컨대 Zuckermann, R. N. et al ., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85를 참고); 공간 지정이 가능한 평행 고체상 혹은 액체상 라이브러리; 디콘볼루션(deconvolution)이 필요한 합성 라이브러리 방법; 1비드 1화합물('One-bead one-compound') 라이브러리 방법; 및 정선된 친화 크로마토그래피를 사용하는 합성 라이브러리 방법. 생물학 라이브러리는 핵산 라이브러리와 단백질 라이브러리를 포함한다. 일부 핵산 라이브러리는 다양한 단백질(예: 천연 및 인공 단백질)을 암호화 하고, 다른 핵산 라이브러리는 예컨대 기능성 RNA분자 및 DNA 분자(예: 핵산 압타머 혹은 리보자임)를 제공한다. 펩토이드 라이브러리는 펩티드 라이브러리와 유사한 구조를 포함하도록 만들어질 수 있다(Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145을 참고). 단백질 라이브러리는 발현 라이브러리나 디스플레이 라이브러리(예: 파지(phage) 디스플레이 라이브러리)에 의해서 만들어질 수 있다. 화합물 라이브러리는 용액으로 제시되거나(예: Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), 비드(Lam, (1991) Nature 354:82-84), 칩(Fodor, (1993) Nature 364:555-556), 박테리아(Ladner, 미국특허 번호 5,223,409), 포자(Ladner , 미국특허 번호 5,223,409), 플라스미드(Cull et al . (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) 혹은 파지(phage) (Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al . (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner 윗글 참고.)로 제시될 수 있다. 조합 화학 라이브러리 혹은 기타 적절한 출처에서 선택될 수 있는 화합물을 식별하기 위해 효소를 검색할 수도 있다(Hogan, Jr., Nat. Biotechnology 15:328, 1997).
이 안의 분석들, 예컨대 체외분석이나 체내분석은 이를테면 시험 화합물만을 사용하여 혹은 적절한 대조물질을 사용하여 개별적으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 병행 분석을 시험 화합물 없이 수행하거나, 다른 병행분석을 다른 반응성분, 예컨대 표적 혹은 기질 없이 수행할 수 있다. 다르게는, 분석결과를 예컨대 문헌, 선행 분석 등에서 도출한 기준값과 비교하는 것도 가능하다. 분석결과는 적절한 상관관계와 당업자들에게 알려진 통계기법들을 사용해서 평가할 수 있다. 앞의 5.3.1절을 참고한다.
일단 화합물이 바람직한 효과를 가진 것으로 확인되면, 그 화합물을 합성하여 예컨대 그 화합물의 최소 50 mg, 500 mg, 5 g, 혹은 500 g을 생산할 수 있다. 본 발명의 기법에서는 숙주세포에 침투할 수 있는 화합물이 바람직하지만, 용해도를 유지하도록 혹은 숙주세포 진입이 용이하도록 화합물을 용해보조제와 결합할 수 있다. 혹은 예컨대 지질과 혼합하여 다른 화합물(들)과 병행 투여할 수 있다. 그 화합물은 피험자 투여용으로 배합될 수 있고, 피험자에게 투여될 수도 있다.
5.4 화합물의 항바이러스 활성의 특성분석
5.4.1 바이러스
본 발명은 바이러스 감염의 예방, 관리 및/혹은 치료에 사용할 화합물을 제공한다. 어떤 바이러스에 대해서든 화합물들의 항바이러스 활성은 아래 5.4.2절에 기술된 기법을 사용해서 시험할 수 있다. 바이러스는 외피보유 바이러스이거나 비외피 바이러스일 수 있고, DNA 혹은 RNA 게놈을 갖거나, 두가닥 혹은 외가닥 게놈을 가진 것일 수 있다. 소단위의 바이러스군과 그것들의 분류, 그리고 화합물의 항바이러스 활성을 평가하게 될 수도 있는 바이러스들의 소단위에 관해서는 Flint et al, Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis and Control of Animal Viruses. 2nd edition, ASM Press, 2003으로부터 수정된 도 1을 참고한다. 특정 실시예에서, 바이러스는 인간을 감염시킨다. 다른 실시예에서, 바이러스는 인간외 동물을 감염시킨다. 특정 실시예에서, 바이러스는 돼지, 가금류, 기타 가축, 혹은 애완동물을 감염시킨다.
일부 실시예에서, 바이러스는 외피보유 바이러스이다. 외피보유 바이러스는 헤파드나바이러스과, 헤르페스바이러스과, 이리도바이러스과, 폭스바이러스과, 플라비바이러스과, 토가바이러스과, 레트로바이러스과, 코로나바이러스과, 필로바이러스과, 랍도바이러스와, 번야바이러스과, 오르도믹소바이러스과, 파라믹소바이러스과, 및 아레나바이러스과를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 이들 과에 속하는 바이러스들의 비제한적 예시는 표 3에 나와 있다.
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Figure 112009082238916-PCT00322
일부 실시예에서, 바이러스는 비외피 바이러스, 즉 외피가 없는 바이러스이다. 그런 바이러스의 비제한적 예시즌 바보바이러스과, 서코바이러스과, 폴리오마 바이러스과, 유두종바이러스과, 아데노바이러스과, 이리도바이러스과, 레오바이러스과, 비르나바이러스과, 칼리시바이러스과, 및 피코르나바이러스과의 바이러스를 포함한다. 이들 과에 속하는 바이러스의 비제한적 예시는 표 4에 나와있다.
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일부 실시예에서, 바이러스는 DNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 RNA 바이러스이다. 한 실시예에서, 바이러스는 외가닥 게놈을 가진 DNA 바이러스 혹은 RNA 바이러스이다. 한 실시예에서, 바이러스는 두가닥 게놈을 가진 DNA 바이러스 혹은 RNA 바이러스가 아니다.
일부 실시예에서, 바이러스는 선형 게놈을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 바이러스는 원형 게놈을 갖고 있다. 일부 실시예에서, 바이러스는 분절 게놈을 갖고 있다. 다른 실시예에서, 바이러스는 비분절 게놈을 갖고 있다.
일부 실시예에서, 바이러스는 양성가닥 RNA 바이러스이다. 다른 실시예에서, 바이러스는 음성가닥 RNA 바이러스이다. 한 실시예에서, 바이러스는 분절, 음성가닥 RNA 바이러스이다. 또 다른 실시예에서, 바이러스는 비분절, 음성가닥 RNA 바이러스이다.
일부 실시예에서, 바이러스는 정20면체 바이러스이다. 다른 실시예에서, 바이러스는 나선형 바이러스이다. 그러나 다른 실시예들에서, 바이러스는 복합 바이러스이다.
일부 실시예에서, 바이러스는 포진 바이러스, 예컨대 HSV-1, HSV-2 및 CMV이다. 다른 실시예에서, 바이러스는 포진바이러스 (예컨대 HSV-1, HSV-2 및 CMV)가 아니다. 특정 실시예에서, 바이러스는 HSV이다. 특정 실시예에서, 바이러스는 HSV가 아니다. 또 다른 실시예에서, 바이러스는 HCMV이다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 HCMV가 아니다. 또 다른 실시예에서, 바이러스는 간 영양성 바이러스(liver trophic virus)가 아니다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 간 영양성 바이러스가 아니다. 또 다른 실시예에서, 바이러스는 간염 바이러스이다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 간염 바이러스가 아니다. 또 다른 실시예에서, 바이러스는 C형 간염 바이러스이다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 C형 간염 바이러스가 아니다. 또 다른 실시예에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 HIV이다. 다른 실시예에서, 바이러스는 HIV가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 B형 간염 바이러스이다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 B형 간염 바이러스가 아니다. 특정 실시예에서, 바이러스는 EBV이다. 특정 대안적 실시예에서, 바이러스는 EBV가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 카포시 육종 관련 포진 바이러스(KSHV)이다. 일부 대안적 실시예에서, 바이러스는 KSHV가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 마마 바이러스이다. 일부 대안적 실시예에서, 바이러스는 마마 바이러스가 아니다. 한 실시예에서, 바이러스는 뎅기 바이러스이다. 한 대안적 실시예에서, 바이러스는 뎅기 바이러스가 아니다. 다른 실시예들에서, 바이러스는 사스(SARS) 바이러스이다. 다른 대안적 실시예들에서, 바이러스는 SARS 바이러스가 아니다. 특정 실시예에서, 바이러스는 에볼라 바이러스이다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 에볼라 바이러스가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 마르부르그 바이러스이다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 마르부르그 바이러스가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 홍역 바이러스이다. 일부 대안적 실시예들에서, 바이러스는 홍역 바이러스가 아니다. 특정 실시예에서, 바이러스는 우두 바이러스이다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 우두 바이러스가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 수두대상포진(VZV) 바이러스이다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 VZV가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 피코르나바이러스이다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 피코르나바이러스가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 리노바이러스가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 폴리오바이러스이다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 폴리오바이러스가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 아데노바이러스이다. 대안적 실시예에서, 바이러스는 아데노바이러스가 아니다. 특정 실시예에서, 바이러스는 콕삭키바이러스(예: 콕삭키바이러스 B3)이다. 다른 실시예에서, 바이러스는 콕삭키바이러스(예: 콕삭키바이러스 B3)가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 리노바이러스이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 리노바이러스가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 인간 파필로마바이러스(HPV)이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 인간 파필로마바이러스가 아니다. 일부 실시예에서, 바이러스는 표3과 표4에 나열된 바이러스로 구성된 군에서 선택된 바이러스이다. 다른 실시예에서, 바이러스는 표3과 표4에 나열된 바이러스로 구성된 군에서 선택된 바이러스가 아니다. 한 실시예에서, 바이러스는 표3과 표4에 나열된 바이러스로 구성된 군에서 선택된 바이러스(들)이 아니다.
바이러스의 어떠한 종류, 하위종류 혹은 균주에 대해서도 화합물의 항바이러스 활성을 평가할 수 있다. 예를 들어, 자연 발생하는 바이러스 균주, 변이체 혹은 돌연변이체, 돌연변이 바이러스, 재편성 및/혹은 유전자조작 바이러스에 대하여 화합물의 항바이러스 활성을 평가할 수 있다.
특정 바이러스의 치명성, 특정 바이러스를 다루는 작업의 안전 문제, 및/또는 특정 바이러스를 다루는 작업의 어려움은 그런 바이러스에 관한 화합물의 항바이러스 활성 특성분석을 불가능하게(적어도 처음에는)할 수도 있다. 그런 상황에서는, 그런 바이러스를 대표하는 다른 동물 바이러스를 이용할 수 있다. 예컨대, HIV에 대한 화합물의 항바이러스 활성을 특성분석 하는 데 처음에 SIV를 이용할 수 있다. 라사 열 바이러스에 대한 화합물의 항바이러스 활성을 특성분석 하는 데는 처음에 피친드(Pichinde) 바이러스를 이용할 수 있다.
일부 실시예에서, 바이러스는 세포 배양체나 피험자에서 4시간 이내, 6시간 이내, 8시간 이내, 12시간 이내, 16시간 이내, 혹은 24시간 이내에 피크 역가를 보인다. 다른 실시예에서, 바이러스는 세포 배양체나 피험자에서 48시간 이내, 72시간 이내, 혹은 1주 이내에 피크 역가를 보인다. 다른 실시예에서, 바이러스는 약 1주 이상 지나서 피크 역가를 보인다. 이들 실시예에 따라, 바이러스 역가는 감염된 조직 혹은 혈청에서 측정할 수 있다.
일부 실시예에서, 바이러스는 세포 배양에서 104 pfu/ml 이상, 5 x 104 pfu/ml 이상, 105 pfu/ml 이상, 5 x 105 pfu/ml 이상, 106 pfu/ml 이상, 5 x 106 pfu/ml 이상, 107 pfu/ml 이상, 5 x 107 pfu/ml 이상, 108 pfu/ml 이상, 5 x 108 pfu/ml 이상, 109 pfu/ml 이상, 5 x 109 pfu/ml 이상, 혹은 1010 pfu/ml 이상의 바이러스 역가를 보인다. 어떤 일부 실시예에서, 바이러스는 세포배양에서 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간 혹은 24시간 이내에 104 pfu/ml 이상, 5 x 104 pfu/ml 이상, 105 pfu/ml 이상, 5 x 105 pfu/ml 이상, 106 pfu/ml 이상, 5 x 106 pfu/ml 이상, 107 pfu/ml 이상, 5 x 107 pfu/ml 이상, 108 pfu/ml 이상, 5 x 108 pfu/ml 이상, 109 pfu/ml 이상, 5 x 109 pfu/ml 이상, 혹은 1010 pfu/ml 이상의 바이러스 역가를 보인다. 일부 실시예에서, 바이러스는 세포 배양에서 48시간, 72시간 혹은 1주 이내에 104 pfu/ml 이상, 5 x 104 pfu/ml 이상, 105 pfu/ml 이상, 5 x 105 pfu/ml 이상, 106 pfu/ml 이상, 5 x 106 pfu/ml 이상, 107 pfu/ml 이상, 5 x 107 pfu/ml 이상, 108 pfu/ml 이상, 5 x 108 pfu/ml 이상, 109 pfu/ml 이상, 5 x 109 pfu/ml 이상, 혹은 1010 pfu/ml 이상의 바이러스 역가를 보인다.
일부 실시예에서, 바이러스는 피험자에서 1 pfu/ml 이상, 10 pfu/ml 이상, 5 x 101 pfu/ml 이상, 102 pfu/ml 이상, 5x102 pfu/ml 이상, 103 pfu/ml 이상, 2.5x103 pfu/ml 이상, 5x103 pfu/ml 이상, 104 pfu/ml 이상, 2.5 x104 pfu/ml 이상, 5 x104 pfu/ml 이상, 혹은 105 pfu/ml 이상의 바이러스 수율을 보인다. 일부 실시예에서, 바이러스는 피험자에서 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 24시간, 혹은 48시간 이내에 1 pfu/ml 이상, 10 pfu/ml 이상, 5 x 101 pfu/ml 이상, 102 pfu/ml 이상, 5x102 pfu/ml 이상, 103 pfu/ml 이상, 2.5x103 pfu/ml 이상, 5x103 pfu/ml 이상, 104 pfu/ml 이상, 2.5 x104 pfu/ml 이상, 5 x104 pfu/ml 이상, 혹은 105 pfu/ml 이상의 바이러스 수율을 보인다. 일부 실시예에서, 바이러스는 피험자에서 48시간, 72시간, 혹은 1주 이내에 1 pfu/ml 이상, 10 pfu/ml 이상, 101 pfu/ml 이상, 5 x 101 pfu/ml 이상, 102 pfu/ml 이상, 5x102 pfu/ml 이상, 103 pfu/ml 이상, 2.5x103 pfu/ml 이상, 5x103 pfu/ml 이상, 104 pfu/ml 이상, 2.5 x104 pfu/ml 이상, 5 x104 pfu/ml 이상, 혹은 105 pfu/ml 이상의 바이러스 수율을 보인다. 이들 실시예에 따라, 바이러스 수율은 감염된 조직 혹은 혈청에서 측정할 수 있다. 특정 실시예에서, 피험자는 면역적격자이다. 또 다른 실시예에서, 피험자는 면역이 손상되었거나 면역이 억제된 사람이다.
일부 실시예에서, 바이러스는 피험자에서 1 pfu 이상, 10 pfu 이상, 5 x 101 pfu 이상, 102 pfu 이상, 5x102 pfu 이상, 103 pfu 이상, 2.5x103 pfu 이상, 5x103 pfu 이상, 104 pfu 이상, 2.5 x104 pfu 이상, 5 x104 pfu 이상, 혹은 105 pfu 이상의 바이러스 수율을 보인다. 일부 실시예에서, 바이러스는 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 24시간, 혹은 48시간 이내에 1 pfu 이상, 10 pfu 이상, 5 x 101 pfu 이상, 102 pfu 이상, 5x102 pfu 이상, 103 pfu 이상, 2.5x103 pfu 이상, 5x103 pfu 이상, 104 pfu 이상, 2.5 x104 pfu 이상, 5 x104 pfu 이상, 혹은 105 pfu 이상의 바이러스 수율을 보인다. 일부 실시예에서, 바이러스는 피험자에서 48시간, 72시간, 혹은 1주 이내에 1 pfu/ml 이상, 10 pfu/ml 이상, 101 pfu/ml 이상, 5 x 101 pfu/ml 이상, 102 pfu/ml 이상, 5x102 pfu/ml 이상, 103 pfu/ml 이상, 2.5x103 pfu/ml 이상, 5x103 pfu/ml 이상, 104 pfu/ml 이상, 2.5 x104 pfu/ml 이상, 5 x104 pfu/ml 이상, 혹은 105 pfu/ml 이상의 바이러스 수율을 보인다. 이들 실시예에 따라, 바이러스 수율은 감염된 조직 혹은 혈청에서 측정할 수 있다. 특정 실시예에서, 피험자는 면역적격자이다. 또 다른 실시예에서, 피험자는 면역이 손상되었거나 면역이 억제된 사람이다.
일부 실시예에서, 바이러스는 피험자에서 1 감염단위 이상, 10 감염단위 이상, 5 x 101 감염단위 이상, 102 감염단위 이상, 5x102 감염단위 이상, 103 감염단위 이상, 2.5x103 감염단위 이상, 5x103 감염단위 이상, 104 감염단위 이상, 2.5 x104 감염단위 이상, 5 x104 감염단위 이상, 혹은 105 감염단위 이상의 바이러스 수율을 보인다. 어떤 일부 실시예에서, 바이러스는 피험자에서 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 24시간, 혹은 48시간 이내에 1 감염단위 이상, 10 감염단위 이상, 5 x 101 감염단위 이상, 102 감염단위 이상5x102 감염단위 이상, 103 감염단위 이상, 2.5x103 감염단위 이상, 5x103 감염단위 이상, 104 감염단위 이상, 2.5 x104 감염단위 이상, 5 x104 감염단위 이상, 혹은 105 감염단위 이상의 바이러스 수율을 보인다. 어떤 일부 실시예에서, 바이러스는 피험자에서 48시간, 72시간, 혹은 1주 이내에 1 감염단위 이상, 10 감염단위 이상, 101 감염단위 이상, 5 x 101 감염단위 이상, 102 감염단위 이상, 5x102 감염단위 이상, 103 감염단위 이상, 2.5x103 감염단위 이상, 5x103 감염단위 이상, 104 감염단위 이상, 2.5 x104 감염단위 이상, 5 x104 감염단위 이상, 혹은 105 감염단위 이상의 바이러스 수율을 보인다. 이들 실시예에 따라, 바이러스 수율은 감염된 조직 혹은 혈청에서 측정할 수 있다. 특정 실시예에서, 피험자는 면역적격자이다. 또 다른 실시예에서, 피험자는 면역이 손상되었거나 면역이 억제된 사람이다. 특정 실시예에서, 바이러스는 104 감염단위 이하의 수율을 보인다. 다른 실시예에서, 바이러스는 105 감염단위 이상의 수율을 보인다.
일부 실시예에서, 바이러스는 피험자에서 1 감염단위/ml 이상, 10 감염단위/ml 이상, 5 x 101 감염단위/ml 이상, 102 감염단위/ml 이상, 5x102 감염단위/ml 이상, 103 감염단위/ml 이상, 2.5x103 감염단위/ml 이상, 5x103 감염단위/ml 이상, 104 감염단위/ml 이상, 2.5 x104 감염단위/ml 이상, 5 x104 감염단위/ml 이상, 혹은 105 감염단위/ml 이상의 바이러스 역가를 보인다. 일부 실시예에서, 바이러스는 피험자에서 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 24 시간, 혹은 48 시간 이내에 10 감염단위/ml 이상, 5 x 101 감염단위/ml 이상, 102 감염단위/ml 이상, 5x102 감염단위/ml 이상, 103 감염단위/ml 이상, 2.5x103 감염단위/ml 이상, 5x103 감염단위/ml 이상, 104 감염단위/ml 이상, 2.5 x104 감염단위/ml 이상, 5 x104 감염단위/ml 이상, 혹은 105 감염단위/ml 이상의 바이러스 역가를 보인다. 일부 실시예에서, 바이러스는 피험자에서 48시간, 72시간, 혹은 1주 이내에 1 감염단위/ml 이상, 10 감염단위/ml 이상, 5 x 101 감염단위/ml 이상, 102 감염단위/ml 이상, 5x102 감염단위/ml 이상, 103 감염단위/ml 이상, 2.5x103 감염단위/ml 이상, 5x103 감염단위/ml 이상, 104 감염단위/ml 이상, 2.5 x104 감염단위/ml 이상, 5 x104 감염단위/ml 이상, 혹은105 감염단위/ml 이상의 바이러스 역가를 보인다. 이들 실시예에 따라, 바이러스 역가는 감염된 조직 혹은 혈청에서 측정할 수 있다. 특정 실시예에서, 피험자는 면역적격자이다. 또 다른 실시예에서, 피험자는 면역이 손상되었거나 면역이 억제된 사람이다. 특정 실시예에서, 바이러스는 104 감염단위/ml 이하의 역가를 보인다. 일부 실시예에서, 바이러스는 1ml 당 105 이상의 감염단위를 보인다.
일부 실시예에서, 바이러스는 세포를 감염시키고 세포 당 101 이상, 2.5 x 101 이상, 5 x 101 이상, 7.5 x 101 이상, 102 이상, 2.5 x 102 이상, 5 x 102 이상, 7.5 x 102 이상, 103 이상, 2.5 x 103 이상, 5 x 103 이상, 7.5 x 103 이상, 104 이상, 2.5 x 104 이상, 5 x 104 이상, 7.5 x 104 이상, 혹은 105 이상의 바이러스 입자를 생산한다. 일부 실시예에서, 바이러스는 세포를 감염시키고 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 혹은 24시간 이내에 세포 당 10 이상, 101 이상, 2.5 x 101 이상, 5 x 101 이상, 7.5 x 101 이상, 102 이상, 2.5 x 102 이상, 5 x 102 이상, 7.5 x 102 이상, 103 이상, 2.5 x 103 이상, 5 x 103 이상, 7.5 x 103 이상, 104 이상, 2.5 x 104 이상, 5 x 104 이상, 7.5 x 104 이상, 혹은105 이상의 바이러스 입자를 생산한다. 다른 실시예에서, 바이러스는 세포를 감염시키고 48시간, 72시간, 혹은 1주 이내에 세포 당 10 이상, 101 이상, 2.5 x 101 이상, 5 x 101 이상, 7.5 x 101 이상, 102 이상, 2.5 x 102 이상, 5 x 102 이상, 7.5 x 102 이상, 103 이상, 2.5 x 103 이상, 5 x 103 이상, 7.5 x 103 이상, 104 이상, 2.5 x 104 이상, 5 x 104 이상, 7.5 x 104 이상, 혹은 105 이상의 바이러스 입자를 생산한다.
다른 실시예에서, 바이러스는 약 최소 1일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 혹은 15 일간 잠복한다. 또 다른 실시예에서, 바이러스는 약 최소한 1 주, 혹은 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 혹은 10 주 동안 잠복한다. 추가 실시예에서, 바이러스는 약 최소 1개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 혹은 11 개월 동안 잠복한다. 그러나 또 다른 실시예에서, 바이러스는 약 최소 1년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 6 년, 7 년, 8 년, 9 년, 10 년, 11 년, 12 년, 13 년, 14 년, 혹은 15 년 간 잠복한다. 일부 실시예에서, 바이러스는 15년 이상 잠복한다.
5.4.2 항바이러스 활성을 감지하기 위한 체외 분석
화합물의 항바이러스 활성은 이 문서에 기술되거나 당업자들에게 알려진 여러 체외 분석으로 평가할 수 있다. 그런 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 가진 화합물들에게 시험할 수 있는 바이러스들의 비제한적 예시는 위의 5.4.1절에 제시되어 있다. 특정 실시예에서, 화합물들은 바이러스 복제를 억제할 능력에 일치하는 활성 프로파일을 보이면서도 진핵세포, 바람직하게는 포유류 세포에 대한 독성이 적다. 예컨대, 바이러스 복제에 대한 화합물의 효과는 화합물의 다양한 희석액을 사용한 상태에서 혹은 사용하지 않은 상태에서, 바이러스의 여러 가지 희석액으로 세포를 감염시킨 다음, 화합물이 예컨대 바이러스 복제, 바이러스 게놈 복제, 및/혹은 바이러스 단백질의 합성에 미친 효과를 평가함으로써 측정할 수 있다. 다르게는, 바이러스 복제에 대한 화합물의 효과는 화합물이나 위약의 다양한 희석액을 세포에 접촉시키고, 바이러스의 여러 가지 희석액으로 세포를 감염시킨 다음, 화합물이 예컨대 바이러스 복제, 바이러스 게놈 복제, 및/혹은 바이러스 단백질의 합성에 미친 효과를 평가함으로써 측정할 수 있다. 바이러스 복제의 변화는 예컨대 플라크 형성을 분석하여 평가할 수 있다. 바이러스 단백질의 생산은 예를 들면 ELISA, 웨스턴 블롯, 혹은 유세포분석기 분석으로 평가할 수 있다. 바이러스 핵산의 생산은 예컨대 RT-PCR, PCR, 노던 블롯 분석, 혹은 서던 블롯으로 평가할 수 있다.
일부 실시예에서, 화합물은 이 문서에 기술된 분석법이나 당업자들에게 알려진 분석법에서 음성 대조물질(예: PBS, DMSO)에 비해 바이러스 게놈 복제를 대략 10%, 바람직하게는 15%, 25%, 30%, 45%, 50%, 60%, 75%, 95% 이상 감소시킨다. 일부 실시예에서, 화합물은 이 문서에 기술된 분석법이나 당업자들에게 알려진 분석법에서 음성 대조물질(예: PBS, DMSO)에 비해 바이러스 게놈 복제를 약 최소 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 75배, 100배, 500배, 혹은 1000배 감소시킨다. 다른 실시예에서, 화합물은 이 문서에 기술된 분석법이나 당업자들에게 알려진 분석법에서 음성 대조물질(예: PBS, DMSO)에 비해 바이러스 게놈 복제를 약 최소 1.5 내지 3배, 2 내지 4배, 3 내지 5배, 4 내지 8배, 6 내지 9배, 8 내지 10배, 2 내지 10배, 5 내지 20배, 10 내지 40배, 10 내지 50배, 25 내지 50배, 50 내지 100배, 75 내지 100배, 100 내지 500배, 500 내지 1000배, 혹은 10 내지 1000배 감소시킨다. 다른 실시예에서, 화합물은 이 문서에 기술된 분석법이나 당업자들에게 알려진 분석법에서 음성 대조물질(예: PBS, DMSO)에 비해 바이러스 게놈 복제를 약 1로그, 1.5로그, 2로그, 2.5로그, 3로그, 3.5로그, 4로그, 4.5로그, 5로그 이상 감소시킨다. 이들 실시예에 따라, 그런 화합물들은 추가로 그 안전성과 효능을 아래 5.4절에 기술된 바와 같은 분석법들에서 평가할 수 있다.
일부 실시예에서, 화합물은 이 문서에 기술된 분석법이나 당업자들에게 알려진 분석법에서 음성 대조물질(예: PBS, DMSO)에 비해 바이러스 게놈 복제를 대략 10%, 바람직하게는 15%, 25%, 30%, 45%, 50%, 60%, 75%, 95% 이상 감소시킨다. 일부 실시예에서, 화합물은 이 문서에 기술된 분석법이나 당업자들에게 알려진 분석법에서 음성 대조물질(예: PBS, DMSO)에 비해 바이러스 게놈 복제를 약 최소 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 75배, 100배, 500배, 혹은 1000배 감소시킨다. 다른 실시예에서, 화합물은 이 문서에 기술된 분석법이나 당업자들에게 알려진 분석법에서 음성 대조물질(예: PBS, DMSO)에 비해 바이러스 게놈 복제를 약 최소 1.5 내지 3배, 2 내지 4배, 3 내지 5배, 4 내지 8배, 6 내지 9배, 8 내지 10배, 2 내지 10배, 5 내지 20배, 10 내지 40배, 10 내지 50배, 25 내지 50배, 50 내지 100배, 75 내지 100배, 100 내지 500배, 500 내지 1000배, 혹은 10 내지 1000배 감소시킨다. 다른 실시예에서, 화합물은 이 문서에 기술된 분석법이나 당업자들에게 알려진 분석법에서 음성 대조물질(예: PBS, DMSO)에 비해 바이러스 게놈 복제를 약 1로그, 1.5로그, 2로그, 2.5로그, 3로그, 3.5로그, 4로그, 4.5로그, 5로그 이상 감소시킨다. 이들 실시예에 따라, 그런 화합물들은 추가로 그 안전성과 효능을 아래 5.4절에 기술된 바와 같은 분석법들에서 평가할 수 있다.
일부 실시예에서, 화합물은 이 문서에 기술된 분석법이나 당업자들에게 알려진 분석법에서 음성 대조물질(예: PBS, DMSO)에 비해 바이러스 단백질의 합성을 대략 10%, 바람직하게는 15%, 25%, 30%, 45%, 50%, 60%, 75%, 95% 이상 감소시킨다. 일부 실시예에서, 화합물은 이 문서에 기술된 분석법이나 당업자들에게 알려진 분석법에서 음성 대조물질(예: PBS, DMSO)에 비해 바이러스 단백질의 합성을 약 최소 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 75배, 100배, 500배, 혹은 1000배 감소시킨다. 다른 실시예에서, 화합물은 이 문서에 기술된 분석법이나 당업자들에게 알려진 분석법에서 음성 대조물질(예: PBS, DMSO)에 비해 바이러스 단백질의 합성을 약 최소 1.5 내지 3배, 2 내지 4배, 3 내지 5배, 4 내지 8배, 6 내지 9배, 8 내지 10배, 2 내지 10배, 5 내지 20배, 10 내지 40배, 10 내지 50배, 25 내지 50배, 50 내지 100배, 75 내지 100배, 100 내지 500배, 500 내지 1000배, 혹은 10 내지 1000배 감소시킨다. 다른 실시예에서, 화합물은 이 문서에 기술된 분석법이나 당업자들에게 알려진 분석법에서 음성 대조물질(예: PBS, DMSO)에 비해 바이러스 단백질의 합성을 약 1로그, 1.5로그, 2로그, 2.5로그, 3로그, 3.5로그, 4로그, 4.5로그, 5로그 이상 감소시킨다. 이들 실시예에 따라, 그런 화합물들은 추가로 그 안전성과 효능을 아래 5.5절에 기술된 바와 같은 분석법들에서 평가할 수 있다.
일부 실시예에서, 화합물들은 1회 바이러스 복제 당 바이러스 수율이 약 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 35배 이상, 40배 이상, 45배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 혹은 100배 이상 억제/감소되는 결과를 낳는다. 일부 실시예에서, 화합물은 1회 바이러스 복제 당 바이러스 수율을 2배 이상 억제/감소하는 결과를 낳는다. 특정 실시예에서, 화합물은 1회 바이러스 복제 당 바이러스 수율이 10배 이상 억제/감소되는 결과를 낳는다.
체외 항바이러스 분석은 일차세포와 확립세포주를 포함해 어떤 진핵세포나 사용해서 수행할 수 있다. 선택된 세포나 세포주는 관심 바이러스에 의한 감염에 취약해야 한다. 개별 바이러스에 대하여 표준 체외 항바이러스 분석(예: 바이러스 세포병변 효과 분석, 뉴트럴 레드 염료흡수량 분석, 바이러스 수율 분석, 플라크 감소 분석)에 사용될 수 있는 포유류 세포주의 비제한적 예시는 표 5에 제시되어 있다.
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아래 5.4.2.1절부터 5.4.2.7절은 화합물들의 개별 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 특성분석 하는 데 사용될 수 있는 항바이러스 분석법들의 비제한적 예시를 제시한다. 당업자들은 5.4.2.1절부터 5.4.2.7절에 기술된 방법들을 예컨대 세포 시스템과 바이러스 병원체를 변경함으로써 다른 바이러스에 맞게 수정하는 방법을 알 것이다.
5.4.2.1 바이러스 세포병변 효과( CPE ) 분석
CPE는 배양된 세포가 대부분의 바이러스에 감염되는 즉시 겪게 되는 형태 변화이다. 이 형태변화는 고정되지 않고 염색되지 않은 세포에서 현미경으로 쉽게 관찰할 수 있다. CPE의 형태는 바이러스에 따라서 다를 수 있는데, 세포의 원형화(rounding), 감염세포의 핵 및/또는 세포질에서 봉입체 출현, 및 합포체 형성 혹은 다핵세포(많은 핵을 함유한 커다란 세포질 덩어리) 형성을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 아데노바이러스 감염의 경우, 아데노바이러스 캡시드의 결정형 배열이 핵에 축적되어 봉입체를 형성한다.
CPE 분석은 화합물의 항바이러스 효과에 대한 척도를 제공할 수 있다. 그런 분석의 비제한적 예시에서, 화합물을 연속 희석하고(예: 1000, 500, 100, 50, 10, 1 ㎍/ml), 96공 판 중 세포 단층(바람직하게는 80 내지 100% 유착된 포유류 세포)이 들어 있는 3개의 공에 첨가한다. 5분 내에 바이러스를 추가하고, 플레이트를 밀봉하여 37℃에서, 거의 최대의 바이러스 CPE를 유도하는 데 필요한 표준 시간(예: 48 내지 120 시간, 바이러스 및 감염다중도에 따라 다름) 동안 배양한다. CPE는 화합물과 병행하여 시험되는 기지의 양성 대조약물을 평가한 후에 현미경으로 판독한다. 양성 대조약물의 비제한적 예시는 뎅기, 인플루엔자, 홍역, 호흡기 세포융합, 파라인플루엔자, 피친드, 푼타 토로, 및 베네주엘라 말 열 바이러스에는 리바비린(ribavirin); 아데노바이러스에는 시도포비르(cidofovir); 리노바이러스에는 피로도비르(pirodovir); 웨스트 나일 바이러스와 황열 바이러스에는 6-아자우리딘(6-azauridine); 사스 바이러스에는 알페론(인터페론α-n3)이다. 데이터는 50% 유효농도 혹은 대략 바이러스가 억제되는 농도, 50% 종말점(EC50)과 세포억제 농도, 50% 종말점(IC50)으로 표현한다. 일반적인 선택지수("SI")는 IC50을 EC50으로 나눈 값으로 계산된다. 이 값들은 당업계에 알려져 있는 방법들, 예컨대 컴퓨터 소프트웨어 프로그램 MacSynergy II(M.N. Prichard, K.R. Asaltine, 및 C. Shipman, Jr., University of Michigan, Ann Arbor, Michigan)를 사용해서 계산한다.
한 실시예에서, 화합물은 3, 혹은 4, 혹은 5, 혹은 6, 혹은 7, 혹은 8, 혹은 9, 혹은 10, 혹은 11, 혹은 12, 혹은 13, 혹은 14, 혹은 15, 혹은 20, 혹은 21, 혹은 22, 혹은 23, 혹은 24, 혹은 25, 혹은 30, 혹은 35, 혹은 40, 혹은 45, 혹은 50, 혹은 60, 혹은 70, 혹은 80, 혹은 90, 혹은 100, 혹은 200, 혹은 300, 혹은 400, 혹은 500, 1,000, 혹은 10,000보다 높은 SI를 갖는다. 일부 실시예에서, 화합물은 10보다 높은 SI를 갖는다. 특정 실시예에서, 10보다 높은 SI를 가진 화합물은 안전성과 효능을 특성분석 하기 위해 이 문서에 기술된 체외분석이나 체내분석 혹은 당업계에 알려져 있는 기타 분석들로 추가로 평가한다.
5.4.2.2 뉴트럴 레드 ( Neutral Red : NR ) 염료흡수량 분석
뉴트럴 레드(NR) 염료흡수량 분석을 사용해서 CPE 억제 분석의 유효성을 확인할 수 있다 (5.4.2.1절 참고). 이 분석의 비제한적 예시에서는 CPE 억제 분석에 사용된 동일한 96공 미량역가판을 사용할 수 있다. 뉴트럴 레드를 배지에 첨가하면, 바이러스에 손상되지 않은 세포들은 염료를 더 많이 흡수한다. 생존능이 있는 세포를 나타내는 흡수 백분율을 미량역가판 자동판독기에서 405 nm와 540 nm 두 파장에서 판독하고, 차이를 취하여 배경값을 제거한다. (McManus et al ., Appl. Environment. Microbiol. 31:35-38, 1976 참고). 화합물에 접촉된 감염세포 표본들에 대하여 EC50을 결정하고, 화합물에 접촉된 비감염세포 표본들에 대하여 IC50을 결정한다.
5.4.2.3 바이러스 수율 분석
CPE 억제 분석(5.3.2.1절 참고)에서 나온 것과 같은 감염 배양체에서 나온 용해된 세포와 상등액을 사용해서 바이러스 수율(일차 감염 후 바이러스 입자 생산량)을 분석할 수 있다. 비제한적 예시에서, 이 상등액을 연속 희석하고, 취약세포(예: 베로 세포) 단층에 첨가한다. 이 세포들에서 CPE가 일어난다면 상등액에 감염성 바이러스가 존재한다는 표시이다. 당업계에 알려진 계산법을 사용해서 그 데이터들로부터 90% 유효농도(EC90), 즉 바이러스 수율을 1 log10만큼 억제하는 시험 화합물 농도를 결정한다. 한 실시예에서, 화합물의 EC90은 음성 대조물질의 EC90보다 최소 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 혹은 50배 적다.
5.4.2.4 플라크 감소 분석
이 분석의 비제한적 예시에서, 바이러스를 다양한 농도로 희석하고, 단층의 표적 포유류 세포가 3개씩 들어 있는 각 공(well)에 첨가한다. 그 후, 대조표본의 유효 감염을 달성하는 데 필요한 시간 동안(예: 15분마다 교반해주면서 1시간 동안) 미량역가판을 배양한다. 배양시간이 지난 후, 동량의 1% 한천을 동량의 각 화합물 희석액(2배 농도)에 첨가한다. 일부 실시예에서, 0.03 ㎍/ml에서 100 ㎍/ml 사이의 화합물 최종 농도를 최종 0.5%의 한천 중층농도로 시험할 수 있다. 약물-한천 혼합물을 미량역가판의 각 공에 2ml씩 첨가하고, 3일간 배양한 다음, 뉴트럴 레드 1.5% 용액으로 세포들을 염색한다. 4-6시간의 배양시간이 끝난 후, 뉴트럴 레드 용액을 흡인하고, 입체현미경으로 미량역가판을 계수한다. 다르게는, 최종 0.4%의 한천농도를 사용할 수 있다. 다른 실시예에서는, 미량역가판을 3일 이상 배양하고, 적절한 경우 4일째와 8일째에 한천배지를 추가로 도포한다. 또 다른 실시예에서, 중층배지는 반고상 대신에 액상이다.
5.4.2.5 바이러스 역가 분석
이 비제한적 예시에서, 표적 포유류세포주 단층을 바이러스(예: HCMV 혹은 HSV)의 여러 가지 양(예: 3 플라크 형성 단위(plaque forming units: pfu) 혹은 5 pfu의 다중도)으로 감염시킨 후, 화합물의 여러 가지 희석액(예: 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 5 ㎍/ml, 혹은 10 ㎍/ml)을 사용하여 혹은 사용하지 않고, 배양한다. 감염된 배양체를 감염 후 48시간이나 72시간 후에 수거하고, 적절한 표적 세포주(예: 베로 세포, MRC5 세포)에 관하여 당업계에 알려진 표준 플라크 분석법으로 적정한다. 일부 실시예에서, 화합물을 사용하여 감염세포를 배양하면 화합물을 사용치 않고 배양한 경우보다 감염성 바이러스의 수율이 최소 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배, 100배, 500배, 혹은 1000배 감소한다. 특정 실시예에서, 화합물을 사용한 상태에서 감염세포를 배양하면 화합물을 사용치 않고 감염세포를 배양한 경우보다 PFU/ml가 최소 10배 감소한다.
일부 실시예에서, 화합물을 사용하여 감염세포를 배양하면 화합물을 사용치 않고 배양한 경우보다 감염성 바이러스의 수율이 최소 0.5 log10, 1 log10, 1.5 log10, 2 log10, 2.5 log10, 3 log10, 3.5 log10, 4 log10, 4.5 log10, 5 log10, 5.5 log10, 6 log10, 6.5 log10, 7 log10, 7.5 log10, 8 log10, 8.5 log10, 혹은 9 log10 감소한다. 특정 실시예에서, 화합물을 사용하여 감염세포를 배양하면 화합물을 사용치 않고 감염세포를 배양한 경우보다 감염성 바이러스의 수율이 최소 1 log10 혹은 2 log10 감소한다. 또다른 특정 실시예에서, 화합물을 사용하여 감염세포를 배양하면 화합물을 사용치 않고 감염세포를 배양한 경우보다 감염성 바이러스의 수율이 최소 2 log10 감소한다.
5.4.2.6 유세포 분석( Flow Cytometry Assay )
유세포 분석은 화합물을 사용하거나 사용치 않고 배양한 감염 표적세포에서 바이러스 항체의 발현을 검출하는 데 이용될 수 있다(예: McSharry et al ., Clinical Microbiology Rev., 1994, 7:576-604참고). 유세포 분석에 의해 세포 표면에서 검출될 수 있는 바이러스 항체의 비제한적 예시는 HSV의 gB, gC, gC 및 gE; 일본 뇌염 바이러스의 E 단백질; 마우스 유방암 바이러스의 gp52; 수두대상포진바이러스의 gpI; HCMV의 gB; HIV의 gp160/120; 인플루엔자의 HA; HHV-6의 gp110/60; 및 홍역 바이러스의 H와 F를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 다른 실시예에서, 세포내 바이러스 항체 혹은 바이러스 핵산은 당업계에 알려진 기법을 사용해서 유세포 분석으로 검출할 수 있다.
5.4.2.7 항바이러스 분석을 위한 유전자조작 세포주
항바이러스 분석에 사용되는 다양한 세포주는 유전자조작을 통해 바이러스 감염이나 바이러스 복제에 좀더 적절한 숙주가 될 수 있고 바이러스 감염세포를 신속히 검출하는 데 더 편리한 기질이 될 수 있다(예: Olivo, P.D., Clin. Microbiol. Rev., 1996, 9:321-334 참고). 일부 측면에서, 이런 세포주들은 바이러스 복제 단계(예: 전사, 번역, 프리게놈 캡슐화, 역전사, 입자 조립 및 방출)의 차단에 관하여 화합물의 항바이러스 활성을 시험하는 데 이용 가능하다. 개별 바이러스에 대한 항바이러스 분석에 사용되는 유전자조작 세포주의 비제한적 예시는 아래 기술되어 있다.
HepG2-2.2.15는 바이러스 복제단계(예: 전사, 번역, 프리게놈 캡슐화, 역전사, 입자 조립 및 방출)를 차단하는 화합물을 식별하고 특성화 하는 데 유용한 B형 간염 바이러스(HBV) ayw 균주 게놈을 함유하는 안정된 세포주이다. 한 측면에서는, 화합물이 세포로부터 분비된 HBV의 생산을 감소시키는지 여부를 시험하기 위하여 화합물들을 HepG2-2.2.15 배양에 첨가하고 실시간 PCR (TaqMan) 정량분석으로 HBV DNA 복사를 측정할 수 있다. 구체적으로, HepG2-2.2.15 세포들의 유착 배양체를 바닥이 평평한 96공 조직배양판에서 배양하고, 화합물의 다양한 농도의 일일용량으로 처리한다. 배양배지의 HBV 비리온 DNA는 마지막으로 정량적 블롯 부합(blot hybridization) 혹은 실시간 정량 PCR (TaqMan) 분석을 한 후 24시간 뒤에 평가할 수 있다. 뉴트럴 레드 염료의 흡수량(510nM [A510]에서 측정한 내부화 된 염료의 흡광도)은 마지막 처리 24시간 뒤의 상대적 독성수준을 결정하는 데 사용할 수 있다. 값들은 동일한 판에 유지된 비처리 세포들의 별도 배양체에 대한 평균 A510 값들의 백분율로서 제시한다. 세포내 HBV DNA 억제 중간산물은 정량적 서던 블롯 부합법으로 평가할 수 있다. 세포내 HBV 입자들은 처리된 HepG2-2.2.15 세포들과, 서던 블롯 분석법으로 검사한 프리게놈 RNA로부터 분리할 수 있다. HBV 외피 단백질, 표면 항체(HBsAg), 및 배양에서 분비된 e-항체(HBeAg)의 양을 정량하는 데는 ELISA를 사용할 수 있다. 라미부딘(3TC)은 양성 분석 대조물질로 사용될 수 있다. (Korba 및 Gerin, Antivir.Res.19:55-70,1992 참고).
한 측면에서, 새로운 HCV RNA 레플리콘과 함께 안정된 루시페라제(LUC) 리포터를 갖고 있는 세포주 Huh7 ET (luc-ubi-neo/ET)는 C형 간염 바이러스 복제에 대하여 화합물의 항바이러스 활성을 분석하는 데 사용될 수 있다(Krieger, N., V. Lohmann, 및 R. Bartenschlager J. Virol., 2001, 75:4614-4624 참고). LUC 리포터의 활성은 HCV RNA 수준에 정비례하고, 양성 대조 항바이러스 화합물들은 LUC 종말점이나 RNA 종말점을 사용하면서 유사하게 거동한다. Huh7 ET 세포들의 아유착(Subconfluent) 배양체를 96공 판에서 평판배양 하고, 그 다음날 적절한 공에 화합물을 첨가하고, 세포들이 여전히 아유착 상태이면 표본뿐 아니라 양성 대조표본(예: 인간 인터페론-알파 2b)과 음성 대조표본을 72시간 후에 처리한다. HCV RNA 수준도 정량적 PCR(TaqMan)을 사용해서 평가할 수 있다. 일부 실시예에서, 화합물은 비처리 표본 대조군에 비해 LUC 신호(혹은 HCV RNA 수준)을 20%, 35%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 혹은 95% 이상 감소시킨다. 바람직한 실시예에서, 화합물은 비처리 표본 대조군에 비해 LUC 신호(혹은 HCV RNA 수준)를50% 이상 감소시킨다. HCV를 연구하기 위한 기타 세포배양 모델들은 Durantel et al ., J. Hepatology, 2007, 46:1-5에 기술되어 있다.
EBV에 대한 화합물의 항바이러스 효과는 다우디(Daudi) 세포에서 바이러스 캡시드 항체(VCA) 수준을 ELISA 분석법으로 측정하여 평가할 수 있다. 화합물을 다양한 농도(예: 50 mg/ml 내지 0.03 mg/ml)로 시험하고, 화합물 비처리 세포와 화합물 처리 세포의 결과로부터 EC50값을 계산할 수 있다. 독성 없이 EBV VCA 생산을 억제하는 우수한 활성을 가진 선택된 화합물은 EBV DNA 합성을 억제하는 능력에 대해서도 시험해야 한다.
HSV를 분석하는 경우, BHKICP6LacZ 세포주를 사용할 수 있다. BHKICP6LacZ 세포주는 HSV-1 UL39 프로모터의 전사 조절 하에 이콜라이 lacZ 유전자와 함께 안정적으로 전환되었다(Stabell et al ., 1992, Methods 38:195-204 참고). 감염세포들은 당업계에 알려진 베타-갈락토시다제 분석, 예컨대 비색분석을 사용해서 검출한다.
인플루엔자 바이러스에 대한 표준 항바이러스 분석은 Sidwell et al ., Antiviral Research, 2000, 48:1-16에 기술되어 있다. 이 분석들도 수정하여 다른 바이러스에 사용할 수 있다.
5.5 화합물의 안전성 및 효능의 특징
화합물의 안전성 및 효능은 당업자들에게 알려진 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 다음 5.5.1 절 및 5.5.2절에서 화합물의 안전성 및 효능을 특징짓기 위해 각각 다음 세포독성 분석법과 동물모델 분석법의 비제한적 예시를 제공한다. 일부 실시예에서, 5.5.1절에 기술된 세포독성 분석법은 상기 5.4절에 기술된 체외 분석법에 따라 수행된다. 기타 실시예에서, 5.5.1절에 기술된 세포독성 분석법은 상기 5.4절에 기술된 체외 항바이러스 분석법 이전에 또는 동시에 수행된다.
일부 실시예에서, 화합물은 바이러스 비감염 세포 및 감염 세포의 생존능에 다른 영향을 미친다. 바이러스 감염 세포 및 비감염 세포의 생존능에 대한 화합물의 차등 효과는 아래 5.5.1절에 기술된 것과 같은 기술들 또는 당업자에게 알려진 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 특정 실시예에서, 화합물은 바이러스 비감염 세포보다 감염 세포에 더욱 유독하다. 특정 실시예에서, 화합물은 바이러스에 감염된 세포의 생존능에 우선적으로 영향을 미친다. 어떤 특정 개념과 관계없이, 화합물의 바이러스 감염 및 비감염 세포의 활성에 대한 차등 효과는 다르게 발현되거나 조절되거나 바이러스 감염 및 비감염 세포에서 차별적 작용을 갖는 특정 효소 또는 단백질을 표적으로 하는 화합물의 결과일 수 있다. 예를 들어, 비감염 숙주세포에서의 바이러스 감염 및/또는 바이러스 복제는 효소 및/또는 단백질의 발현, 조절, 및/또는 활성을 변경시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서는, 동일한 효소, 단백질 또는 대사경로를 표적으로 하는 다른 화합물의 항바이러스 작용을 검사한다. 기타 실시예에서는, 바이러스 감염 세포의 활성에 다르게 영향을 미치는 화합물의 동종체(congener)를 설계하고 항바이러스 작용을 검사한다. 화합물의 항바이러스 작용을 평가하는데 사용될 수 있는 항바이러스작용 분석의 비제한적 예는 상기 5.4절에 제시되어 있다.
5.5.1 세포독성 시험
바람직한 실시예에서, 일차세포 및 세포주들을 포함한 세포는 동물세포이다. 일부 실시예에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 특정 실시예에서, 세포독성을 하나 이상의 다음 세포주들, 즉, 인간 단핵구 세포주인 U937, 일차 말초혈액 단핵구 세포(PBMC), 인간 간 모세포종 세포주 Huh7, 인간 배아 신장 세포주 293T, 및 단핵구 세포 THP-1에서 평가한다. 화합물의 세포독성을 시험하기 위해 사용할 수 있는 세포주의 비제한적 예시가 표 5에 제시되어있다.
당업계에 잘 알려져 있는 많은 분석법들을 화합물에의 노출 후 (감염 또는 비감염) 세포 또는 세포주의 생존능을 평가하는데 사용할 수 있으며, 따라서 화합물의 세포독성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 세포 증식은 브로모데옥시유리딘(Bromodeoxyuridine: BrdU) 편입 (예: Hoshino et al ., 1986, Int. J. Cancer 38, 369; Campana et al ., 1988, J. Immunol. Meth. 107:79 참고), (3H) 티미딘 편입(예: Chen, J., 1996, Oncogene 13:1395-403; Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270:18367 73 참고) 측정, 직접 세포 수 측정, 또는 원형 암유전자(예: fos, myc) 또는 세포주기 표지자(Rb, cdc2, 시클린 A, D1, D2, D3, E, 등)와 같은 유전자의 전사, 번역 또는 활성 변화 감지에 의해 분석할 수 있다. 그러한 단백질 및 mRNA의 활성 수준은 당업계에 잘 알려져 있는 어떤 방법에 의해서든 측정할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 시판 항체를 포함한 항체를 이용하는 ELISA, 웨스턴 블로팅 또는 면역침강반응과 같은 면역진단법에 의해 정량할 수 있다. mRNA는 역전사와 관련하여 잘 알려지고 당 업계에서 일상적인, 예를 들어, 노던 분석, RNA 분해효소방어시험 또는 중합효소 연쇄반응을 사용하여 정량할 수 있다. 세포 생존능은 트리판-청(trypan-blue) 염색 또는 다른 세포 사멸 또는 당업계에서 알려져 있는 생존능 표지자를 사용하여 측정할 수 있다. 특정 실시예에서, 세포 생존능 결정을 위해 세포 ATP의 수준을 측정하였다.
특정 실시예에서, 세포 활성은 세포내 ATP 수준을 측정하는 CellTiter-Glo 측정 키트(Promega)와 같은 당 업계에서의 표준분석법을 사용하여 3일 및 7일 기간에서 측정한다. 세포 ATP의 감소는 세포독성 효과를 나타내는 것이다. 또다른 특정 실시예에서, 세포 생존능은 뉴트럴 레드 염료흡수량 분석으로 측정할 수 있다. 다른 실시예에서, 형태학적 변화를 위한 육안관찰에는 팽대, 입도, 불균일 변연 세포, 흰막성 외관, 원형화, 공(well) 표면으로부터의 박리, 또는 다른 변화 관찰이 포함된다. 이러한 변화는 관찰된 세포독성 정도에 맞게 T(100% 독성), PVH(부분 독성-매우 심함-80%), PH(부분 독성-심함-60%), P(부분독성-40%), Ps(부분 독성-경미-20%), 또는 0(무독성-0%)으로 표현된다. 50% 세포 억제(세포독성) 농도(IC50)는 이들 데이터를 회귀분석하여 결정한다.
동물모델에서 화합물의 체내 독성을 시험할 수 있다. 예를 들어, 화합물의 항바이러스 활성 시험에 사용된 본 문서에 기술된 그리고/또는 당 업계에서 알려진 다른 동물 모델 역시 이들 화합물들의 체내 독성 결정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 실험동물에 화합물 농도범위를 투여한 후, 치사율, 체중감소 또는 체중증가 실패, 및/또는 조직 손상을 나타낼 수 있는 혈청 표지자(예를 들어, 일반적 조직손상 지표로서 크레아틴 인산효소 수준, 가능한 간손상 지표로서 글루탐옥살산 아미노전이효소 또는 피루브산 아미노전이효소 수준을 시간의 흐름에 따라 모니터한다. 이러한 체내 분석은 용량뿐 아니라 다양한 투여방법 및/또는 투여요법의 독성 시험에도 채택될 수 있다.
예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 투여량) 및 ED50 (집단의 50%에 치료학적으로 효과적인 투여량) 결정과 같은, 본 발명에 따른 화합물의 독성 및/또는 효능은 실험동물 또는 세포배양의 표준 약학적 절차에 의해 결정된다. 독성 및 치료효과 사이의 용량비는 치료지수이며, 이는 LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 본 발명에 따라 확인된 화합물은 높은 치료지수를 나타내는 것이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 본 발명에 따라 확인된 화합물이 사용될 수 있으므로, 비감염 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하고 따라서 부작용을 감소시키기 위해 영향을 받은 조직 부위에 그러한 제제를 표적으로 하는 전달시스템의 설계를 고려해야만 한다.
세포배양검사 및 동물시험에서 획득한 데이터를 본 발명에서 확인된 화합물의 용량범위를 인체에 맞게 공식화하는데 이용할 수 있다. 그러한 제제의 용량은 독성이 없거나 거의 없는 ED50을 포함하는 혈중 농도 범위내 있다. 상기 용량은 사용된 제형 및 투여경로에 따라 이들 범위내에서 달라질 수 있다. 본 발명 방법에 사용된 모든 제제의 경우, 치료유효량은 먼저 세포배양검사로 추정할 수 있다. 세포배양에서 결정된 것처럼 IC50(즉, 최대증상의 절반을 억제하는 시험화합물의 농도)을 포함하는 혈중 혈장농도범위에 도달하게 하기 위해 투여량을 동물 모델에서 공식화할 수 있다. 인체에서 유효한 농도를 더욱 정확히 결정하는데 그러한 정보를 사용할 수 있다. 예를 들어, 혈장 농도는 고성능 액체크로마토그래피로 측정할 수 있다. 용량 결정에 관한 추가 정보는 아래 5.7.4절에서 제시된다.
5.5.2 동물 모델
인체 사용 전 기대치료활성 또는 예방작용을 위해 우선적으로 화합물 및 조성물의 체내 검사가 시행된다. 예를 들어, 체내 분석을 화합물 및/또는 또다른 치료제제 투여가 바람직한지 여부를 결정하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 감염 예방에의 화합물 사용을 평가하기 위해, 동물이 바이러스에 감염되기 전 화합물을 투여할 수 있다. 또다른 실시예에서, 동물이 바이러스에 감염됨과 동시에 화합물을 동물에 투여할 수 있다. 한 실시예에서, 바이러스 감염 치료 또는 관리에 대한 화합물 사용을 평가하기 위해, 화합물을 동물이 바이러스에 감염된 이후 투여한다. 또다른 실시예에서는, 바이러스 감염 치료 및/또는 관리를 위해 동물이 바이러스에 감염됨과 동시에 동물에 화합물을 투여한다. 특정 실시예에서, 화합물은 동물에게 1회 이상 투여된다.
화합물은 쥐, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 돼지, 염소, 양, 개, 토끼, 기니아피그 등을 포함한 동물 모델 시스템에서 바이러스에 대한 항바이러스 작용 확인을 위해 시험할 수 있다. 본 발명의 특정 실시예에서, 화합물을 마우스 모델 시스템에서 시험한다. 상기 모델계는 널리 사용되고 있으며, 숙련된 당업자에게 잘 알려져 있다.
동물이 바이러스에 감염된 동시에 또는 그 이후에 화합물 또는 위약으로 치료한다. 이들 동물로부터 획득된 검체(예: 혈청, 뇨, 가래, 정액, 타액, 혈장, 또는 조직 표본)로 당업계에 잘 알려져 있는 방법들을 통해 바이러스 복제를 시험할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 복제 변화(예: 플라크 형성에 의한 측정) 또는 바이러스성 단백질(예: 웨스턴 블롯, ELISA, 또는 유세포 분석법에 의한 측정) 또는 바이러스 핵산(예: RT-PCR, 노던 블롯 분석법 또는 서던 블롯에 의한 측정)을 측정한다. 조직표본에서 바이러스의 정량을 위해, 조직표본을 인산염완충식염수(PBS)에서 균질화하고, 정제된 균등질 희석액을 37℃에서 1시간 동안 세포의 단분자층(예: 베로, CEF 또는 MDCK 세포)에 흡착시킨다. 다른 분석법에서는 오히려 감염 후 바이러스 감염 표적인 기관의 조직병리학적 평가가 수행된다. 바이러스 면역조직화학은 바이러스 특이 단클론항체를 사용하여 수행할 수 있다. 다음 절(5.5.2.1절 -5.5.2.5절)에 기술된 비제한적인 예시적 동물모델들은 다른 바이러스 시스템에도 채택될 수 있다.
바이러스 독성에 대한 화합물의 효과는 화합물을 투여한 감염 대상에서의 바이러스 역가, 화합물을 투여한 감염 대상의 생존 기간, 화합물을 투여한 감염 대상의 면역 반응, 화합물을 투여한 감염 대상에서 나타난 증상의 수, 기간 및/또는 중증도, 및/또는 화합물을 투여한 감염 대상에서 하나 이상의 증상 발현 이전 기간을 평가하는 체내 분석을 이용하여 또한 측정할 수 있다. 당업계에 알려진 기술들도 그러한 효과 측정에 사용할 수 있다.
5.5.2.1 단순포진 바이러스( HSV )
단순포진 바이러스 유형 1 또는 유형 2(HSV-1 또는 HSV-2)의 마우스 모델을 화합물의 체내 항바이러스 활성 평가에 사용할 수 있다. 보통 BALB/c 마우스가 이용되나, 감수성이 있는 다른 적절한 마우스 균주 역시 이용할 수 있다. 마우스에 적절한 감염다중도의 HSV(예: HSV-1 균주 E-377의 105 pfu 또는 HSV-2 균주 MS의 4x104 pfu)를 다양한 경로로 접종하고 화합물 및 위약을 투여한다. 복강(i.p.) 접종의 경우, HSP-1은 소화관, 간 및 비장에서 복제되고 CNS로 퍼진다. i.n. 접종의 경우, HSP-1은 비인두에서 복제되고 CNS로 퍼진다. 최적의 투여량 및 치료요법 결정을 위해 화합물을 이용하여, 선택적으로 다른 치료요법과 병용하여 모든 적절한 투여 경로(예: 경구, 국소, 전신, 비강), 투여 빈도 및 용량을 시험할 수 있다.
HSV-2 생식기 질환의 마우스 모델에서, HSV-1 또는 HSV-2을 암컷 스위스 웹스터 마우스에 질내 접종하고, 바이러스 복제에 대한 치료요법의 효과를 평가하기 위해 질 분비물을 획득한다(Crute et al ., Nature Medicine, 2002, 8:386-391 참고). 예를 들어, 플라크 분석법으로 질 분비물로부터 바이러스 역가를 측정한다. 표피병변 연구를 위한 SKH-1 마우스를 이용한 HSV-1 마우스 모델, 면역적격 무모증 마우스계 역시 당업계에 기술되어 있다(Crute et al ., Nature Medicine, 2002, 8:386-391 및 Bolger et al., Antiviral Res., 1997, 35:157-165 참고). HSV 기니아피그 모델 또한 기술되어 있으며, Chen et al ., Virol. J, 2004 Nov 23, 1:11을 참고한다. 유의성 계산을 위해 통계 분석을 시행한다 (예를 들어, 0.05 이하의 P값).
5.5.2.2 인간 거대세포 바이러스( HCMV )
일반적으로 실험동물은 HCMV에 감염되지 않으므로, 뮤린 CMV(MCMV) 감염 마우스 모델을 화합물의 체내 항바이러스 활성 분석에 사용할 수 있다. 예를 들어, BALB/c 마우스의 MCMV 마우스 모델을 감염 마우스에 화합물을 투여했을 때 화합물의 체내 항바이러스 활성 분석에 사용될 수 있다(예: Kern et al ., Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 48:4745-4753 참고). 화합물 투여 또는 비투여 감염 마우스로부터 분리된 조직 균등질을 마우스 배아 섬유모세포(MEFs)로 표준 플라크 측정법을 이용하여 시험할 수 있다. 이후 유의성 계산을 위해 통계 분석을 시행한다(예: 0.05 이하의 P값).
또한, 인체조직(즉, 망막 조직 또는 태아 흉선 및 간 조직)을 SCID 마우스에 이식하고, 이어서 가급적 마우스의 조직 이식편 부위에 HCMV를 감염시킨다(예: Kern et al ., Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 48:4745-4753 참고). 접종에 이용된 HCMV pfu는 실험 및 바이러스 균주에 따라 다양할 수 있다. 최적의 투여량 및 치료요법 결정을 위해 화합물을 이용하여, 선택적으로 다른 치료요법과 병용하여, 모든 적절한 투여 경로(예: 경구, 국소, 전신, 비강), 투여 빈도 및 용량을 시험할 수 있다. 다양한 시점에서 화합물을 투여한 또는 투여하지 않은 감염 마우스에서 분리된 이식조직 균등질을 인체 음경 섬유모세포(HFFs)로 표준 플라크 측정법을 이용하여 시험한다. 이후 유의성 계산을 위해 통계 분석을 시행한다(예: 0.05 이하의 P값).
항바이러스 제제 연구를 위한 CMV의 기니아피그 모델은 Bourne et al ., Antiviral Res., 2000, 47:103-109; Bravo et al ., Antiviral Res., 2003, 60:41-49 및 Bravo et al, J. Infectious Diseases, 2006, 193:591-597(참고)에도 역시 기술되어 있다.
5.5.2.3 인플루엔자
인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 제제 시험에 사용하기 위해 개발된 흰 족제비(ferret), 마우스 및 닭과 같은 동물 모델은 Sidwell et al ., Antiviral Res., 2000, 48:1-16; 그리고 McCauley et al ., Antiviral Res., 1995, 27:179-186(참고)등에 기술되어 있다. 인플루엔자 마우스 모델의 경우, 인플루엔자 감염 마우스에 투여한 화합물의 항바이러스 활성 분석에 사용될 수 있는 매개변수(들)의 비제한적 예시는 폐렴 관련 사망, 혈청α1-산 당단백 증가, 동물 체중, 적혈구응집소(hemagglutinin)에 의한 폐 바이러스 분석, 플라크 측정법에 의한 폐 바이러스 분석, 그리고 폐의 조직병리학적 변화를 포함한다. 유의성 계산을 위해 통계 분석을 시행한다 (예: 0.05 이하의 P값).
상피의 변화와 상피하부 염증 확인을 위해 비갑개 및 기관을 검사할 수 있다. 폐의 경우 세기관지 상피 변화 및 대, 중 및 소 또는 종말 세기관지에서 세기관지주위 염증을 검사할 수 있다. 폐포의 염증성 변화 역시 평가한다. 중간 세기관지는 다음과 같이 0에서 3+의 척도로 등급을 분류한다: 0 (정상: 섬모정점경계 및 가중층 기저핵의 중간에서 긴 정도의 원주 상피세포 내막; 최소 염증), 1+ (원주형 상피세포층 그리고 증식이 다소 증가된 외벽; 많은 세포들에서 여전히 섬모가 관찰됨), 2+ (약한 정도에서 뚜렷한 증식에 이르는 범위의 뚜렷한 상피세포 변화; 붕괴된 세포 및 내강벽에서의 불규칙한 세포층 외벽), 3+ (내강 괴사 세포 및 상피세포층의 현저한 붕괴 및 분열; 약간 약화된 세기관지 및 뚜렷한 반응성 증식).
상기 기관(trachea)은 다음과 같은 0에서 2.5+의 척도로 등급이 분류된다: 0 (정상: 섬모 정점 경계, 기저핵, 가중층이 있는 중간정도에서 큰범위의 원주상피 정렬. 정점경계와 핵 사이의 분명한 세포질. 간헐적 국소 편평세포), 1+ (상피층의 국소 편평상피화생), 2+ (많은 상피세포층의 광범위 편평상피화생, 섬모는 국소적으로 분명함), 2.5+ (명확한 섬모는 극소수인 광범위 편평상피화생).
바이러스 면역조직화학은 바이러스 특이 단클론항체를 이용하여 수행한다(예: NP-, N- 또는 HN- 특이 단클론 항체). 염색법은 다음과 같이 0에서 3+의 등급으로 분류된다: 0 (비감염 세포); 0.5+ (소수 감염 세포); 1+ (광범위하게 분리된 개별 세포로서 소수 감염 세포); 1.5+ (광범위하게 분리된 단일세포 및 작은 군집으로서의 소수 감염 세포); 2+ (중간정도 수의 감염 세포, 보통 상피층내막 세기관지 부분 또는 폐포에서 작은 소엽하 병소의 인접세포의 감염된 군집); 3+ (세기관지에서 대부분의 상피세포층 또는 폐포의 많은 소엽하 병소에 영향을 미치는 다수의 감염 세포).
5.5.2.4 간염
HBV 유전자이전(transgenic) 모델, 직계성 1.3.46 (공식 지정, Tg[HBV 1.3 게놈] Chi46)은 이전에 기술된 바 있으며, 투여량 및 투여요법뿐 아니라 화합물의 체내 항바이러스 활성 시험에 사용할 수 있다(예: Cavanaugh et al ., J. Virol., 1997, 71:3236-3243; 및 Guidotti et al ., J. Virol., 1995, 69:6158-6169 참고). 이들 HBV 유전자이전 마우스에서, 만성 HBV 간염 피험자들의 감염된 간에서 관찰되는 것과 유사한 수준으로, 이들 유전자이전 마우스의 간실질세포 및 신장 근위 곡세관(convoluted tubules)에서 높은 수준의 바이러스 복제가 발생한다. 주령(즉, 6-10주), 성별(즉, 수컷) 및 혈청B형 간염 표면 항원(HBsAg) 수준을 보정한 HBV 유전자이전 마우스에 화합물 또는 위약을 투여한 다음, 화합물의 항바이러스 활성 평가를 위한 항바이러스 활성 분석을 시행할 수 있다. 이들 화합물 투여 및 비투여 마우스에 대해 수행할 수 있는 분석법의 예시에는 간 HBV DNA를 측정하기 위한 서던 분석, 간 HBV RNA 측정을 위한 정량적 역전사효소 PCR(qRT-PCR), 혈청 간염 e 항원(HBeAg) 및 HBV 표면 항원(HBsAg) 측정을 위한 면역분석법, 간의 HBV 항체측정을 위한 면역조직화학, 혈청 HBV DNA 측정을 위한 정량적 PCR (qPCR)이 포함된다. 필요 시 육안 검사 및 현미경적 병리 검사를 수행할 수 있다.
당업계에 기술되어 있는 다양한 C형 간염 바이러스(HCV) 마우스 모델들을 HCV 감염에 대한 화합물의 항바이러스 활성 평가에 사용할 수 있다(Zhu et al ., Antimicrobial Agents and Chemother., 2006, 50:3260-3268; Bright et al ., Nature, 2005, 436:973-978; Hsu et al ., Nat. Biotechnol., 2003, 21:519-525; Ilan et al ., J. Infect. Dis.. 2002, 185:153-161; Kneteman et al ., Hepatology, 2006, 43:1346-1353; Mercer et al ., Nat. Med., 2001, 7:927-933; 및 Wu et al ., Gastroenterology, 2005, 128:1416-1423 참고). 예를 들어, 정상 인간 간세포를 플라스미노겐 활성제 전이유전자(Alb-uPA) 보유 SCID 마우스에 이식함으로써 인간 키메라 간(chimeric human liver)을 갖는 마우스를 생성시킨다(Mercer et al ., Nat. Med., 2001, 7:927-933 참고). 상기 마우스에 HCV(예: 감염된 인간 혈청으로부터) 접종 후 고역가 바이러스로 HCV 감염을 지속시킬 수 있다. 따라서, 상기 마우스에 HCV 감염 이전, 동시, 또는 이후에 화합물 또는 위약을 투여할 수 있으며, 바이러스 복제는 이식된 간세포 결절에 HCV 바이러스 단백 발현 또는 이식된 간에서의 음성가닥 바이러스 RNA 검출로 확인할 수 있다. 바이러스 복제 감소 수준의 통계학적 유의성을 결정한다.
HCV 마우스 모델의 또다른 예시에는 HCV 하위 게놈(subgenome)에 결합된 루시페라제 리포터 발현 HuH7 세포주를 SCID마우스에 피하 또는 간에 직접 이식하는 것이 포함된다(Zhu et al ., Antimicrobial Agents and Chemother., 2006, 50:3260-3268 참고). 상기 마우스에 화합물 또는 위약을 투여하고, 생체발광(bioluminescence) 신호강도를 감지하고 정량하기 위해 전신 영상을 이용한다. HCV에 효과적인 화합물을 투여한 마우스는 위약 투여 마우스 또는 음성 대조군 대비 약한 생체발광 신호강도를 갖는다.
5.5.2.5 인간 면역결핍 바이러스( HIV )
HIV에 대한 화합물의 안전성 및 효능은 당업계에 잘 알려져 있는 기 확립된 동물모델로 체내에서 평가될 수 있다. 예를 들어, HIV-1 감염 트리메라(Trimera) 마우스 모델은 뮤린 SCID 골수를 갖는 방사선 조사된 정상 BALB/c 마우스와 이식된 인간 말초혈액 단핵세포 재편에 의해 개발되어 왔다(Ayash-Rashkovsky et al ., FASEB J., 2005, 19:1149-1151 참고). 상기 마우스에 T- 및 M-성 HIV-1 실험 균주를 복강 투여한다. HIV 감염 후, 신속한 인간 CD4+ T 세포 소실, CD4/CD8 비 감소 및 T 세포 활성 증가를 관찰할 수 있다. 상기 마우스에 화합물을 투여할 수 있고, 당 업계에 알려진 표준 분석법으로 화합물 투여 및 비투여 실험 동물의 바이러스 복제능을 측정할 수 있다. 그러한 분석법의 비제한적 예시에는 혈장 바이러스 부하(HIV-1 RNA copies/ml) 측정을 위한 COBAS AMPLICOR®RT-PCR 측정((Roche Diagnostics, 뉴저지 브랜치버그)이 포함된다. 감염 트리메라 마우스로부터 회수된 인간 림프구를 표적 T 세포(MT-2 세포) 및 HIV 의존성 형성 합포체와 함께 배양하고, 여기에서 활성 HIV-1 바이러스 복제측정법을 시행하였다. 그리고 감염 트리메라 마우스에서 회수된 인간 림프구를 cMAGI 지표 세포들과 함께 배양하고, 베타-갈락토시다제의 HIV-1 LTR 유도 트란스 활성을 측정하였다. 상기 마우스에서 생산된 항 HIV-1 항체 수준은 ELISA로도 측정할 수 있다. 당 업계에서 기술된 기 설정된 다른 마우스 모델 역시 화합물의 체내 항바이러스 활성 측정시험에 이용될 수 있다(Mosier et al ., Semin. Immunol., 1996, 8:255-262; Mosier et al ., Hosp. Pract. (Off Ed)., 1996, 31:41-48, 53-55, 59-60; Bonyhadi et al ., Mol. Med. Today, 1997, 3:246-253; Jolicoeur et al ., Leukemia, 1999, 13:S78-S80; Browning et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:14637-14641; 및 Sawada et al ., J. Exp. Med., 1998, 187:1439-1449 참고). 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV) 비인간 영장류 모델 역시 기술되어 있다(Schito et al ., Curr. HIV Res., 2006, 4:379-386 참고).
5.6 약물학적 조성물
본 문서에 기술되거나 언급된 모든 화합물은 본 화합물을 구성하는 조성물의 형태에 선택적으로 포함된다.
본 문서에 제시된 특정 실시예에서, 조성물(약물학적 조성물 포함)은 화합물 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다.
본 문서에 제시된 다른 실시예에서, 약물학적 조성물은 화합물의 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다. 약물학적 조성물은 동물 및/또는 인체 투여에 적합한 것이다.
본 문서에서 제시된 약물학적 조성물은 피험자에게 투여되는 조성물로 허용된 모든 형태일 수 있다. 피험자는 바람직하게 동물, 즉, 인간, 포유류 또는 소, 말, 양, 돼지, 가금류, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼, 기니아피그 등과 같은 인간이 아닌 동물을 포함하나 이에만 국한되는 것은 아니다. 더 바람직한 것은 포유류, 그리고 가장 바람직한 것은 인간이다..
특정 실시예에서 및 이와 관련하여, "약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제"라는 용어는 동물 및 특히 인체 사용을 위해 연방 규제기관 또는 주정부에 의해 승인되었거나, 미국 약전(U.S. Pharmacopeia) 또는 다른 공인된 약전에 등재되어 있는 담체, 부형제 또는 희석제를 의미한다. "담체"라는 용어는 치료 시 함께 투여되는 희석제, 보강제(예: Freund 보강제(완전 및 불완전)), 부형제 또는 전달체를 나타낸다. 그러한 약물학적 담체는 물 및 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성물질 기원의 기름과 같은 멸균용액일 수 있다. 약물학적 조성물이 정맥투여되는 경우에는 물이 더 바람직하다. 식염수와 포도당 수용액 및 글리세롤 용액 역시 액체 담체로서 특히 주사용액의 경우에서 사용될 수 있다. 적절한 약물학적 담체의 예시는 E.W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다.
전형적인 조성물 및 제형에는 하나 이상의 부형제가 포함된다. 적절한 부형제는 당업계 전문가들에게 잘 알려져 있으며, 적절한 부형제의 예시에는 전분, 포도당, 젖당, 자당, 젤라틴, 맥아, 쌀, 곡분(flour), 석회분말(chalk), 실리카겔, 스테아린산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조저지방유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 특정 부형제가 약물학적 조성물 또는 제형에의 혼합에 적합한지 여부는 환자에게 투여될 제형 및 제형의 특정 활성성분을 포함한 이에만 국한되지 않는 당업계에 잘 알려진 여러 인자들에 따라 달라진다. 필요한 경우, 복합 또는 단일 제형은 소량의 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다.
젖당 제거 조성물은 당 업계에 알려져 있고, 예를 들어, 미국 약전(USP) SP (XXI)/NF (XVI)에 등재된 부형제들을 포함할 수 있다. 일반적으로 젖당 제거 조성물은 약학적으로 합당하고, 약학적으로 허용되는 양의 활성 성분, 결합제/충진제, 그리고 윤활제를 포함한다. 선호되는 젖당 제거 제형에는 화합물, 미세결정 셀룰로오스, 사전 젤라틴화 전분 및 스테아린산 마그네슘이 포함된다.
물이 몇몇 화합물들의 분해를 촉진시킬 수 있기 때문에, 하나 이상의 화합물로 구성된 무수 약물학적 조성물 및 제형이 이후 본 문서에 제시된다. 예를 들어, 물 첨가(예: 5%)는 저장기간 또는 시간에 따른 제형의 안정성과 같은 특성 결정을 위한 장기 보존 모의실험의 수단으로 제약업계에서 널리 받아 들여지고 있다. Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 2d. Ed., Marcel Dekker, NY, NY, 1995, pp. 379 80을 참고한다. 사실상, 물과 열은 일부 화합물의 분해를 가속화한다. 따라서, 수분 및/또는 습도는 제조, 취급, 포장, 보관, 출하 및 제형 사용시 흔히 맞닥뜨리게 되는 것이므로 제형에 대한 물의 효과는 매우 큰 중요성을 가질 수 있다.
본 문서에서 제공된 무수 조성물 및 제형은 무수 또는 저수분, 저수분 또는 저습도 조건의 성분을 이용하여 제조될 수 있다. 만일 제조, 포장 및/또는 보관 중 수분 및/또는 습도와 실질적으로 접촉하게 되는 경우, 젖당 및 일차 및 이차 아민(amine)을 포함하는 하나 이상의 화합물로 구성된 조성물 및 제형은 무수물이 바람직하다.
무수 조성물은 그 무수성이 유지되도록 제조 및 보관하여야 한다. 따라서, 무수 조성물은 바람직하게 수분에 대한 노출을 방지하는 것으로 알려진 물질을 사용하여 포장해야 하며, 그렇게 적절한 의약품 키트에 포함될 수 있다. 적절한 포장의 예시에는 밀봉 호일, 플라스틱, 단위용량 용기(예: 바이알), 기포팩(blister pack) 및 압착팩(strip pack)이 포함된다.
화합물의 분해 속도를 감소시키는 하나 이상의 제제를 포함하는 조성물 및 제형이 이후 본 문서에 제시된다. 본 문서에 "안정화제'로 언급된 제제에는 아스코르빈 산과 같은 항산화제, pH 완충제, 또는 완충염이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
조성물 및 단일단위 제형은 용액, 현탁액, 유탁액, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 지효성 제형 등의 형태를 갖는다. 경구용 제형에는 약물학적 등급의 마니톨, 젖당, 전분, 스테아린산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체가 포함될 수 있다. 그러한 조성물 및 제형은 예방적으로 또는 치료적으로 유효한 양의 화합물을 바람직하게 정제된 형태로 포함하며, 이와 함께 제제를 환자에게 적절히 투여할 수 있도록 적절한 양의 담체를 포함한다. 제형은 투여방법에 적합해야 한다. 바람직한 실시예에서, 조성물 또는 단일단위 제형은 무균이며, 피험자, 동물 피험자, 더욱 적절하게는 포유류 피험자, 그리고 가장 적절하게는 인간 피험자 투여에 적합한 형태이다.
본 문서에서 제공된 조성물은 의도된 투여경로에 합당하게 제형화된다. 투여경로의 예시에는 정맥내, 피내(intradermal), 피하, 경구(예. 흡입), 비강, 경피(국소), 점막관통, 관절강내 및 직장 투여와 같은 비경구적 투여가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시예에서, 조성물은 인간에의 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비강 또는 국소투여를 위해 채택된 조성물로서의 일상적 절차에 따라 제형화된다. 바람직한 실시예에서, 인체 피하투여를 위해 조성물은 일상적 절차에 따라 제제화한다. 일반적으로, 정맥투여를 위한 조성물은 멸균 등장완충수용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 용해보조제와 주사부위 통증 경감을 위한 리그노카인(lignocaine)과 같은 국소마취제를 포함한다. 제형의 예시에는 정제; 캐플릿(caplet); 연질 탄성 젤라틴 캡슐과 같은 캡슐; 카세제(cachet); 트로키(troche); 함당정제(lozenge); 분산제(dispersion); 좌제; 연고제; 습포제; 페이스트; 파우더; 드레싱; 크림; 플라스타(plaster); 용액; 패치; 에어로졸(예: 비강스프레이 또는 흡입제); 겔; 현탁액(예: 수성 또는 비수성 액상 현탁제, 수유에멀전 또는 유수에멀전)을 포함하는, 피험자에게 경구 또는 점막으로 투여하는데 적합한 액상 제형; 용액 및 엘릭서(elixir); 비경구적 투여에 적합한 액상 제형; 그리고 비경구투여에 적합한 액상 제형을 공급하기 위해 재구성될 수 있는 무균 고체(예: 결정성 또는 무정형 고체)가 포함되나, 이에만 한정되지는 않는다.
본 발명에서의 조성, 모양 및 제형 유형은 일반적으로 그 사용에 따라 달라질 것이다.
일반적으로, 본 문서에서 제공된 조성물의 성분은 개별적으로 또는 단위 제형에서 혼합된 상태로 공급된다. 예를 들어, 활성제의 수량을 나타내는 앰플 또는 새쉬(sachette)와 같은 밀봉된 기밀용기내 냉동건조 분말 또는 물이 없는 농축물로서 공급된다. 조성물을 점적주사로 투여하는 경우, 조성물을 무균상태의 약제학적 등급의 물 또는 식염수를 포함하는 점적주사용 병에 분포한다. 조성물을 주사로 투여하는 경우, 투여 전 성분들의 혼합을 위해 멸균 주사용수 또는 식염수 앰플을 제공할 수 있다.
본 문서에서 제공된 경구투여에 적합한 약제학적 조성물은 정제(예: 씹을 수 있는 정제), 캐플릿, 캡슐 및 액제(예: 가미시럽)과 같은 별개 제형으로 제공될 수 있다. 그러한 제형은 사전에 결정된 활성 성분 용량을 포함하며, 당업자에게 잘 알려진 약학적 방법으로 제조될 수 있다. 전반적 사항은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990)을 참고한다.
본 문서에 제공된 전형적 경구제형은 기존 약제학적 혼합 기법에 따라 화합물을 최소 1가지 이상의 부형제와 친숙한 혼합물로 결합시킴으로써 제조한다. 부형제는 투여에 바람직한 제조형태에 따라 폭넓게 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 경구 액제 또는 에어로졸 제형에 적합한 부형제에는 물, 글리콜, 기름, 알코올, 향미료, 보존제 및 착색제가 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 고형 경구제형(예: 파우더, 정제, 캡슐 및 캐플릿)에 적합한 부형제의 예시에는 전분, 설탕, 미세 결정 셀룰로오스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제 및 분해제가 포함되나 이에 한정되지는 않는다.
투여의 용이성으로 인해, 정제 및 캡슐제가 가장 이점이 많은 경구투여제제를 나타내며, 이런 경우 고체 부형제가 사용된다. 원하는 경우, 정제를 표준 수성 또는 비수성 기술로 코팅할 수 있다. 그러한 제형은 어떠한 약제학적 방법에 의해서든 제조가 가능하다. 일반적으로, 약제학적 조성물과 제형은 활성 성분을 액상 담체, 미세하게 분할된 고형 담체, 또는 둘 모두와 균질하게 직접적으로 혼합하여 제조한다. 그런 다음, 필요 시 제품을 바람직한 제형으로 형태를 만든다.
예를 들어, 정제는 압축 또는 성형(molding)에 의해 제조될 수 있다. 압축 정제는 분말 또는 과립과 같은 자유 유동성 활성 성분을 선택적으로 부형제와 혼합하여 적절한 기계에서 압축하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 불활성 액상 희석제로 습윤한 분말 화합물의 혼합제를 적절한 기계에서 성형하여 제조할 수 있다.
본 문서에 제공된 경구제형에 사용될 수 있는 부형제 예시에는 결합제, 충진제, 분해제 및 윤활제를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 약제학적 조성물 및 제형에의 사용에 적합한 결합제에는 옥수수 전분, 감자전분, 또는 다른 전분, 젤라틴, 아카시아(acacia)와 같은 천연 및 합성 고무, 알긴산 나트륨, 알긴산 및 다른 알지네이트, 트래거캔스(tragacanth) 분말, 구아 고무(guar gum), 셀룰로오스 및 그 유도체(예: 에틸 셀룰로오스, 아세트산 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스), 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로오스, 사전 젤라틴화 전분, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 (예: 번호 2208, 2906, 2910), 미세결정 셀룰로오스 및 그 혼합물이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
본 문서에서 제공된 약제학적 조성물 및 제형에의 사용에 적합한 충전제의 예시에는 활석, 칼슘 카보네이트(예: 입자 또는 분말), 미세결정 셀룰로오스, 분말 셀룰로오스, 덱스트레이트, 카올린, 마니톨, 규산(, 솔비톨, 전분, 사전 젤라틴화 전분 및 그 혼합물들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 본 문서에서 제공된 약제학적 조성물에서의 결합제 또는 충전제는 통상 약제학적 조성물 또는 제형의 50에서 대략 99 중량 퍼센트를 나타낸다.
미세결정 셀룰로오스의 적합한 형태는 AVICEL PH 101, AVICEL PH 103 AVICEL RC 581, AVICEL PH 105 (FMC Corporation 제조, American Viscose Division, Avicel Sales, 펜실베이니아 마커스 후크)로 판매되는 물질 및 그 혼합물을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 특정 결합제는 AVICEL RC 581로 판매되는 미세결정 셀룰로오스 및 소듐 카복시메틸 셀룰로오스의 혼합물이다. 적합한 무수 또는 저습도 부형제 또는 첨가제는 AVICEL PH 103™ 및 Starch 1500 LM을 포함한다.
분해제는 수성 환경에 노출되었을 때 분해되는 정제 제공을 위해 본 문서에 제공된 조성물에 사용한다. 너무 많은 분해제를 포함하는 정제는 보관중 분해될 수 있는 반면, 너무 적게 포함될 경우는 기대 속도 또는 기대 조건하에서 분해되지 않을 수 있다. 따라서, 활성성분 방출을 유해하게 변화시키지 않도록 하기 위해 너무 적거나 너무 많지 않은 충분한 양의 분해제를 본 문서에서 제공된 고형 경구제제 형성을 위해 사용하여야 한다. 사용된 분해제의 양은 제형 유형에 따라 다양하며, 당업자들은 이를 쉽게 인식할 수 있다. 전형적 약제학적 조성물은 분해제를 약 0.5에서 15 중량 퍼센트, 특히 약 1에서 5 중량 퍼센트를 포함한다.
본 문서에서 제공된 약제학적 조성물 및 제형에 사용될 수 있는 분해제에는 한천, 알긴산, 탄산칼슘, 미세결정 셀룰로오스, 크로스카멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 폴라크릴린 칼륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 감자 또는 타피오카 전분, 사전 젤라틴화 전분, 기타 전분, 점토, 기타 알긴, 기타 셀룰로오스, 고무, 그리고 그 혼합물들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
본 문서에서 제공된 약제학적 조성물 및 제형에 사용될 수 있는 윤활제에는 스테아린산 칼슘, 스테아린산 마그네슘, 미네랄 오일, 경광유, 글리세린, 솔비톨,마니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 기타 글리콜류, 스테아린 산, 라우릴 황산 나트륨, 활석, 수소화 식물유(예: 땅콩유, 면실유, 해바라기 유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유), 스테아린산 아연, 에틸 올레이트, 에틸 라우레이트, 한천, 그리고 그 혼합물들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 추가적 윤활제에는 예를 들어, 실로이드 실리카겔(AEROSIL 200, W.R. Grace Co. 제조, 매릴랜드 발티모어), 합성 이산화규소의 응고 에어로졸(Degussa Co. 판매, 텍사스 플라노), CAB O SIL(발열성 이산화규소 제품, Cabot Co. 판매, 매사츄세츠 보스톤), 및 그 혼합물들이 포함된다. 윤활제를 사용하게 되는 경우, 보통 혼합할 약제학적 조성물 또는 제형의 대략 1 중량 퍼센트 미만을 사용한다.
당업자들에게 잘 알려져 있는 방출 제어수단 또는 전달장치를 사용하여 화합물을 투여할 수 있다. 그 예시에는 본 문서에 참고문헌으로 포함되어 있는 nr미국 특허 번호 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 그리고 4,008,719, 5,674,533, 5,059,595, 5,591,767, 5,120,548, 5,073,543, 5,639,476, 5,354,556, 및5,733,566이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 1가지 이상의 활성성분을 예를 들어, 하이드로프로필메틸 셀룰로오스, 기타 중합체 기질, 겔, 투과성 막, 삼투압시스템, 다중층 코팅, 미세입자, 리포좀, 미세구, 또는 다양한 비율로 기대 방출 프로파일을 나타내기 위한 이들의 조합을 이용하여 서서히 방출시키거나 방출을 조절하기 위해 이러한 제형을 사용할 수 있다. 본 문서에 기술된 것들을 포함하여, 당업자들에게 잘 알려져 있는 적절한 서방 제형을 본 발명에서의 활성 성분에 대한 용도로 선택할 수 있다. 본 발명은 따라서 서방성을 위해 채택한 경구투여에 적합한 정제, 캡슐, 젤캡, 및 캐플릿 등의 이에 국한되지 않는 단일 단위 제형을 포함한다.
모든 서방성 약제학적 제품의 공통적 목적은 방출 제어형이 아닌 해당 제품으로 달성가능한 약물치료요법의 개선에 있다. 이상적으로, 의학적 치료에 있어서 최적으로 설계된 서방성 제제의 사용은 최단시간내 증상을 치료 또는 조절하기 위해 사용되는 의약물질의 최소화를 특징으로 한다. 서방제제의 이점에는 약물 작용 확대, 투여빈도 감소, 그리고 피험자 순응도 증가가 포함된다. 또한, 작용 발현시간 또는 약물의 혈중 농도와 같은 다른 특징들에 영향을 미치게 하기 위해 서방성 제제를 사용할 수 있고, 따라서 부작용(예: 유해) 발현에도 영향을 미칠 수 있다.
대부분의 서방성 제제는 기대 치료효과를 신속히 나타내는 약물(활성 성분)의 양을 초기에 방출하고, 장기간에 걸쳐 이러한 치료 또는 예방 효과를 유지할 수 있도록, 그리고 점차적이고 지속적으로 약물을 방출하도록 설계된다. 이러한 일정한 약물 수준을 체내에서 유지되게 하려면, 체내에서 대사 및 배설되는 약물량을 대체할 수 있는 속도로 제형에서 약물이 방출되게 하여야 한다. 활성성분의 방출은 pH, 온도, 효소, 수분 또는 기타 다른 생리학적 조건 또는 약물을 포함하는, 그러나 여기에 국한되지 않는 다양한 조건에 의해 자극될 수 있다.
비경구용 제형은 피하, 정맥(볼루스(bolus) 주사 포함), 근육 및 동맥을 포함하는, 그러나 이에 국한되지 않는 다양한 경로로 피험자에게 투여할 수 있다. 이러한 제형의 투여는 통상 오염물에 대한 피험자들의 자연 방어기전을 우회하기 때문에, 비경구제형은 무균인 것이 바람직하며 또는 피험자에게 투여전 무균화할 수 있어야 한다. 비경구 제형의 예시에는 주사용액, 약학적으로 허용되는 주사용 전달체에 용해 또는 현탁화된 건조 제품, 주사용 현탁액 및 에멀전이 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
본 문서에서 제공된 비경구 제형에 사용될 수 있는 적합한 운반체는 당업자들에게 익히 잘 알려져 있다. 그 예시에는 USP 주사용수; 염화나트륨 주사제, 링거(Ringer) 주사액, 포도당 주사액, 포도당 및 염화나트륨 주사액, 그리고 링거 젖산 주사제와 같은 그러나 이에 한정되지는 않는 수성 운반체; 에틸알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜과 같은 그러나 이에 한정되지는 않는 물 혼화성 운반체; 그리고 옥수수유, 면실유, 땅콩유, 참기름, 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트 및 벤질 벤조에이트와 같은, 그러나 이에 국한되지 않는 비수성 운반체가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
본 문서에 제공된 하나 이상의 화합물의 용해도를 증가시키는 약제 역시 본 문서에 제공된 비경구 제형에 혼합될 수 있다.
본 문서에 제공된 경피, 국소 및 점막투여 제형에는 안과용액, 스프레이, 에어로졸, 크림, 로션, 연고, 겔, 용액, 유탁액, 현탁액 또는 당업자에게 알려져 있는 기타 다른 제형이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th 및 18th eds, Mack Publishing, Easton PA (1980 & 1990), 및 Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985)을 참고한다. 구강내 점막조직 치료에 적합한 제형은 함수제 또는 구강 겔로 제제화할 수 있다. 나아가, 경피용 제형에는 적정량의 활성성분을 특정 기간 동안 투과할 수 있게 피부에 적용하고 부착시켜 놓을 수 있는 "저장소(reservoir) 유형" 또는 '기질(matrix) 유형"의 패치가 포함된다.
문서에서 제공된 경피, 국소, 그리고 점막 제형에 사용할 수 있는 적합한 부형제(예: 담체 및 희석제) 및 기타 다른 물질들은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 이는 주어진 약제학적 조성물 또는 제형이 적용될 특정 조직에 따라 달라진다. 이러한 사실을 고려하여 로션, 팅크제, 크림, 유탁액, 겔 또는 연고제를 만들기 위한 전형적 부형제에는 무독성이고 약학적으로 허용되는 물, 아세톤, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부탄 1,3 디올, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 미네랄 유, 및 그 혼합물들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 원하는 경우, 보습제 또는 습윤제 역시 약제학적 조성물 및 제형에 첨가할 수 있다. 그러한 부가적 성분의 예시는 당 업계에 잘 알려져 있다. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th 및 18th eds, Mack Publishing, Easton PA (1980 & 1990)을 참고한다.
치료해야 할 특정 조직에 따라, 추가적 성분들을 화학물로의 치료 이전, 동시, 또는 이후에 사용할 수 있다. 예를 들어, 활성성분을 조직에 전달하는 것을 돕게끔 하기 위해 투과항진제를 사용할 수 있다. 적합한 투과항진제에는 아세톤; 에탄올, 올레일 및 테트라하이드로푸릴과 같은 다양한 알코올류; 디메틸 설폭사이드와 같은 알킬 설폭사이드류; 디메틸 아세트아마이드; 디메틸 포름아마이드; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리비닐피롤리돈과 같은 피롤리돈 류; Kollidon 그레이드 (포비돈, 폴리비돈); 요소; 그리고 Tween 80(폴리솔베이트 80) 및 Span 60(솔비탄 모노스테아레이트)과 같은 다양한 수용성 또는 불용성 당 에스테르가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
약제학적 조성물 또는 제형의 pH 또는 약제학적 조성물 또는 제형이 적용되는 조직의 pH 역시 하나 이상의 화합물 전달을 개선시키기 위해 조정할 수 있다. 이와 유사하게, 용매 담체의 극성, 이온 강도 또는 장력도 전달개선을 위해 조정할 수 있다. 전달개선을 위해 하나이상 화합물의 친수성 또는 친지질성을 이롭게 변화시킬 수 있도록 약제학적 조성물 또는 제형에 스테아린산 염과 같은 약제 역시 첨가할 수 있다. 이 점에 있어서, 스테아린산 염은 제형의 지질 전달체, 유화제 또는 현탁제, 그리고 전달 증강 또는 투과항진제로 작용할 수 있다. 화합물의 다양한 염, 수화물 또는 용매화합물을 결과 조성물의 이후 특성 조절에 사용할 수 있다.
특정 실시예에서, 조성물은 경구용, 주사용 또는 경피용 제형이다. 한 특정 실시예에서, 조성물은 경구 투여제형이다. 또다른 특정 실시예에서, 조성물은 주사용 제형이다. 또다른 특정 실시예에서, 조성물은 경피용 제형이다.
5.7 예방 및 치료 방법
본 발명은 바이러스 감염의 예방, 치료 및/또는 관리 방법, 즉 피험자에게 하나 이상의 화합물을 필요시 투여하는 것으로 이루어진 방법을 제공한다. 특정 실시예에서, 본 발명은 바이러스 감염의 예방, 치료, 그리고/또는 관리방법, 즉 하나 이상의 화합물 또는 화합물로 이루어진 조성물의 예방 또는 치료 유효량을 피험자에게 필요시 투여하는 방법을 제공한다. 화합물 또는 화합물로 구성된 조성물은 바이러스 감염의 경우, 어떤 단계의 치료에든 사용될 수 있다 (예: 1차, 2차, 3차, 4차 또는 5차 치료).
또다른 실시예에서, 본 발명은 인간 피험자에서 바이러스 감염에 의해 변화된 대사의 플럭스를 하나 이상의 화합물 또는 하나 이상의 화합물로 구성된 조성물의 유효량을 필요로하는 인간 피험자에게 투여함으로써 역전 또는 재배열시키는 방법과 관련되어 있다. 예를 들어, 상승 효과, 부작용 감소, 더 높은 치료 지수와 같은 유익한 결과를 생성하는 효소 억제 화합물의 조합을 이용하여 바이러스 감염을 치료할 수 있다. 그러한 한 실시예에서, 구연산 분해효소 억제제는 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC)와 병용하여 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 화합물은 바이러스 감염 예방, 치료, 관리 또는 개선을 위해 투여된 유일한 활성 성분이다. 특정 실시예에서, 화합물로 구성된 조성물은 유일한 활성 성분이다.
사용하는 화합물의 선택은 바이러스 감염 유형, 피험자의 건강 상태 및 연령, 독성 또는 부작용을 포함하는, 그러나 이에 국한되지 않는 인자들의 수에 따라 달라진다. 예를 들어, 양성자 ATP아제와 같은 핵심 ATP 생산에 필요한 효소를 억제하는 치료법은 독성을 보상할 수 있는 치료법, 즉 약물의 전신분포를 제한하는 국소전달시스템의 사용과 같은 치료법에서 사용하는 것이 아닌 한 바람직하지 않다.
본 발명은 항바이러스 요법이 가능하지 않은 바이러스 감염의 예방, 치료, 및/또는 관리를 위한 방법을 포함한다. 본 발명은 기존의 다른 치료법의 대체요법으로서 바이러스 감염의 예방, 치료 및/또는 관리 방법 역시 포함한다.
본 발명은 바이러스 감염의 예방, 치료 및/또는 관리 방법, 즉, 하나 이상의 화합물 및 한가지 이상의 다른 치료제(예: 예방 또는 치료제)를 필요시 피험자에게 투여하는 것으로 구성된 방법 역시 제공한다. 특정 실시예에서, 다른 치료법이란 바이러스 감염의 예방, 치료 및/또는 관리에 현재 사용되고 있거나, 사용되어 왔거나 또는 유용한 것으로 알려진 것을 말한다. 그러한 요법들의 비제한적 예시가 하기 5.6.3절에 제시되어 있다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 화합물을 하기 5.6.3절에 기술된 하나 이상의 치료와 병용하여 피험자에게 투여한다. 또 다른 실시예에서는, 하나 이상의 화합물을 보조요법, 통증해소요법, 또는 항바이러스 작용을 갖지 않는 다른 치료법과 병용하여 피험자에게 투여한다.
본 발명의 병용요법은 후속적으로 또는 동시에 투여할 수 있다. 한 실시예에서, 본 발명의 병용요법은 화합물과 동일한 작용기전을 갖는 최소 한가지의 다른 치료법을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 병용요법은 화합물과 다른 작용기전을 갖는 최소 한가지의 다른 치료법과 화합물로 구성된다.
특정 실시예에서, 본 발명의 병용요법은 부가 혹은 상승 효과를 나타내기 위해 화합물과 함께 작용함으로써 예방 및/또는 치료 효과를 개선시킨다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 병용요법은 각 치료법을 단독으로 시행했을 때와 관련된 부작용을 감소시킨다.
병용요법의 예방 또는 치료제를 동일한 약제학적 조성물의 피험자에게 투여할 수 있다. 또는, 병용요법의 예방 혹은 치료약제를 별도의 약제학적 조성물로 피험자에게 동시에 투여할 수 있다. 예방 또는 치료제를 동일한 또는 다른 투여경로로 피험자에게 투여할 수 있다.
5.7.1 환자 집단
일부 실시예에서, 화합물, 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 바이러스감염 피험자에게 투여한다. 다른 실시예에서, 화합물, , 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 바이러스에 감염되기 쉬운 또는 감수성이 있는 피험자에게 투여한다. 일부 실시예에서는, 화합물, 화합물로 구성된 조성물 투여, 또는 병용요법을 바이러스 감염 지역 또는 발생위험지역에 거주하는 피험자에게 시행한다. 일부 실시예에서, 바이러스 감염은 잠복 바이러스 감염이다. 한 실시예에서는, 화합물 투여 또는 병용요법을 영아에게 시행한다. 한 실시예에서는, 화합물 투여 또는 병용요법을 미숙아에게 시행한다. 다른 실시예에서, 바이러스 감염은 활동성 감염이다. 그러나 또다른 실시예에서, 바이러스 감염은 만성 바이러스 감염이다. 바이러스 감염 유형의 비제한적 예시에는 상기 5.4.1절에서 제공된 것들에 의해 초래된 감염이 포함된다. 특정 실시예에서, 바이러스 감염은 외피보유 바이러스 감염이다. 일부 실시예에서, 외피보유 바이러스는 DNA 바이러스이다. 다른 실시예에서, 외피보유 바이러스는 RNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, 외피보유 바이러스는 이중가닥 DNA 또는 RNA 게놈을 갖는다. 다른 실시예에서, 외피보유 바이러스는 단일가닥 DNA 또는 RNA 게놈을 갖는다. 특정 실시예에서, 바이러스는 인체를 감염시킨다.
특정 실시예에서, 화합물, 화합물로 구성된 조성물 투여, 또는 병용요법을 생후 0 내지 6개월, 6 내지 12개월, 1 내지 5년, 5 내지 10년, 10 내지 15년, 15 내지 20년, 20 내지 25년, 25 내지 30년, 30 내지 35년, 35 내지 40년, 40 내지 45년, 45 내지 50년, 50 내지 55년, 55 내지 60년, 60 내지 65년, 65 내지 70년, 70 내지 75년, 75 내지 80년, 80 내지 85년, 85 내지 90년, 90 내지 95년, 또는 95 내지 100년 연령의 포유류에 시행한다. 특정 실시예에서, 화합물, 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 바이러스 감염 위험성이 있는 인간에게 투여한다. 특정 실시예에서, 화합물, 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 바이러스 감염 인간에게 투여한다. 특정 실시예에서, 피험자는 연령이 0 내지 6개월, 6 내지 12개월, 1 내지 5세, 5 내지 10세, 5 내지 12세, 10 내지 15세, 15 내지 20세, 13 내지 19세, 20 내지 25세, 25 내지 30세, 20 내지 65세, 30 내지 35세, 35 내지 40세, 40 내지 45세, 45 내지 50세, 50 내지 55세, 55 내지 60세, 60 내지 65세, 65 내지 70세, 70 내지 75세, 75 내지 80세, 80 내지 85세, 85 내지 90세, 90 내지 95세, 또는 95 내지 100세의 인간이다. 일부 실시예에서, 화합물, 화합물로 구성된 조성물 투여, 또는 병용요법을 인간영아에게 시행한다. 다른 실시예에서는 화합물, 화합물로 구성된 조성물 투여, 또는 병용요법을 인간 유아 및 청소년에게 시행한다. 다른 실시예에서는, 화합물, 화합물로 구성된 조성물 투여, 또는 병용요법을 인간성인에게 시행한다. 또다른 실시예에서는, 화합물, 화합물로 구성된 조성물 투여, 또는 병용요법을 인간고령자에게 시행한다.
특정 실시예에서, 화합물, 화합물로 구성된 조성물 투여, 또는 병용요법을 예를 들어, 개나 고양이와 같은 애완동물에게 시행한다. 특정 실시예에서, 화합물, 화합물로 구성된 조성물 투여, 또는 병용요법을 예를 들어, 돼지, 소, 말, 닭 등의 농장 동물 또는 가축류에 시행한다. 특정 실시예에서, 화합물, 화합물로 구성된 조성물 투여, 또는 병용요법을 예를 들어, 오리나 닭과 같은 조류에 시행한다.
특정 실시예에서, 화합물, 화합물로 구성된 조성물 또는 병용요법을 면역약화 상태 또는 면역억제 상태 또는 면역약화 혹은 면역억제가 될 위험성이 있는 상태에서 영장류, 바람직하게는 인간, 또는 돼지, 소, 말, 양, 염소, 개, 고양이, 설치류와 같은 또다른 동물에 투여한다. 특정 실시예에서 화합물, 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 면역억제요법을 받거나 또는 회복된 피험자에게 투여한다. 특정 실시예에서 화합물, 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 암 또는 암에 걸릴 위험성이 있는 피험자, AIDS, 다른 바이러스 감염, 또는 세균 감염 피험자에게 투여한다. 특정 실시예에서 피험자는 수술, 항암화학요법 및/또는 방사선 요법을 받았거나 받을 예정인 자이다. 특정 실시예에서 화합물, 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 낭성섬유증, 폐섬유증, 또는 피험자를 바이러스 감염에 감수성을 갖게 만드는 다른 질환을 가진 피험자에게 투여한다. 특정 실시예에서 화합물, 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 조직이식을 받았거나 받을 예정인 피험자에게 투여한다. 일부 실시예에서는 화합물, 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 요양원, 수용시설(10명 이상의 피험자들을 위한 시설), 또는 감옥에 거주하는 피험자에게 투여한다. 일부 실시예에서는 화합물, 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 학교(예: 초등학교, 중학교, 고등학교, 또는 대학교) 또는 보육시설에 있는 피험자에게 투여한다. 일부 실시예에서는 화합물, 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 의사 또는 간호사와 같은 의료분야 종사자 또는 병원 근무 피험자에게 투여한다. 특정 실시예에서 화합물, 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 임신부 또는 가임기 피험자에게 투여한다.
일부 실시예에서, 피험자에게 화합물 외 다른 치료법에 대한 어떠한 유해효과 또는 불내성을 보이기 전에 화합물 또는 화합물을 포함한 조성물, 또는 병용요법을 투여한다. 일부 실시예에서, 화합물 또는 하나 이상의 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 난치성(refractory) 피험자에게 투여한다. 특정 실시예에서, 난치성 피험자는 표준 항바이러스 요법에 불응성인 피험자를 말한다. 특정 실시예에서, 바이러스 감염 피험자는 감염이 유의하게 근치되지 않았고/않았거나 증상이 유의하게 경감되지 않은 경우, 치료에 반응하지 않는다. 피험자가 반응을 하지 않는지 여부에 결정은 그러한 상황에서 당업계에서 수용되는 "불응성"의 의미를 사용하여, 감염 치료의 유효성을 평가하기 위한 당 업계에서 알려진 모든 체내 또는 체외 방법으로 이루어진다. 다양한 실시예에서, 바이러스 감염 피험자는 바이러스 복제가 감소되지 않거나 증가되는 경우 불응성이다.
일부 실시예에서, 화합물 또는 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용 요법을 바이러스 감염으로 진전될 위험도를 갖는 피험자에서 바이러스 감염 발현 또는 재발을 방지하기 위해 투여한다. 일부 실시예에서, 화합물 또는 하나 이상의 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 기존 치료법에 이상반응을 나타낼 감수성이 있는 피험자에게 투여한다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 화합물 또는 하나 이상의 화합물로 구성된 조성물, 또는 병용요법을 화합물 이외의 요법에 반응하지 않는 것으로 밝혀지고 이들 요법을 더 이상 받지 않는 피험자에게 투여한다. 특정 실시예에서, 본 발명의 방법에 따라 관리 또는 치료받는 피험자는 항생제, 항바이러스제, 항진균제 또는 다른 생물학적 요법/면역요법으로 치료받는 피험자들로서, 이들 중 피험자들은 불응성 피험자, 및 기존 치료요법을 받기에는 너무 어린 연령의 피험자, 기존 요법으로 치료 또는 관리를 받았음에도 불구하고 바이러스 감염 재발 피험자이다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 화합물 또는 하나 이상의 화합물로 구성된 조성물을 투여받거나 병용요법을 받는 피험자는 화합물 또는 조성물 또는 병용치료 투여 전 치료를 받지 않은 상태이다. 다른 실시예에서, 하나 이상의 화합물 또는 하나 이상의 화합물로 구성된 조성물을 투여받거나 병용요법을 받는 피험자는 하나 이상의 화합물 또는 하나 이상의 화합물로 구성된 조성물 또는 병용치료 투여 전 치료를 받았던 상태이다. 일부 실시예에서, 화합물 또는 화합물로 구성된 조성물을 투여받은 피험자는 이전 치료법에 무반응이었거나 이전 치료법에서 유해한 부작용을 경험하였거나 또는 피험자에게 수용될 수 없는 수준의 독성으로 인해 이전 요법의 중단을 경험하였다.
5.7.2 투여 방법
피험자에게 투여 시, 약학적으로 허용되는 담체를 선택적으로 포함하는 조성물의 구성성분으로 화합물을 투여하는 것이 바람직하다. 조성물은 경구 또는 기타 편리한 어떤 경로로, 예를 들어, 점적주사나 볼루스 주사로 상피세포 또는 피하점막 벽(예: 구강점막, 직장 및 장관벽)을 통한 흡수로 투여할 수 있으며, 또 다른 생물학적으로 활성을 갖는 약제와 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여할 수 있다. 리포좀 피막, 미세입자, 미세협막, 캡슐과 같은 다양한 전달시스템이 알려져 있으며, 화합물 및 약학적으로 허용되는 그 염을 투여하는데 사용될 수 있다.
투여방법에는 비경구적, 피내, 근육, 복강, 정맥, 피하, 비강, 경막외(epidural), 경구, 설하, 뇌내, 질내, 경피, 직장, 흡입, 또는 특히 귀, 눈, 코 또는 피부를 통한 국소 투여법이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 투여 방법은 의료인의 재량에 따른다. 대부분의 경우, 투여로 인해 화합물이 혈류로 방출된다.
특정 실시예에서는, 화합물을 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 국소 점적, 상처 드레싱과 함께 국소 적용, 주사, 카테터를 사용하여, 좌제 사용 또는 이식, 즉 실라스틱 막 또는 섬유와 같은 점막을 포함한 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴성 물질의 이식에 의해 국소투여가 가능하나, 이에 국한되지 않는다.
특정 실시예에서, 뇌실내, 경막내 및 경막외 주사를 포함한 모든 적당한 경로를 통해 화합물을 중추신경계로 도입시키는 것이 바람직할 수 있다. 뇌실내 주사는 옴마야 리저버(Ommaya reservoir)와 같은 리저버에 부착된 뇌실내 카테터로 촉진될 수 있다.
흡입제 또는 네불라이저(nebulizer) 사용 및 분무화제 제형, 또는 탄화불소 또는 합성 폐표면활성제의 관류를 통해 폐로 투여하는 것 역시 가능하다. 특정 실시예에서, 화합물을 중성지방과 같은 전통적 결합제 및 담체를 이용하여 좌제로 제제화 한다.
피부소견을 갖는 바이러스 감염의 경우, 화합물을 국소 투여할 수 있다. 이와 유사하게, 안과적 소견을 갖는 바이러스 감염의 경우 화합물을 눈에 투여할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 화합물은 소포(vesicle)내, 특히 리포솜 내에서 전달된다(Langer, 1990, Science 249:1527 1533; Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Bacterial infection, Lopez-Berestein and Fidler(eds.), Liss New York, pp.353-365(1989); Lopez Berestein, ibid., pp. 317-327 참고, 일반적으로 상기 문헌을 참고한다.).
또 다른 실시예에서, 화합물은 방출제어시스템에서 전달된다(Goodson, Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115 138 (1984) 참고). 서방형 시스템의 예시는 Langer, 1990, Science 249:1527 1533에 논의되어 있다. 한 실시예에서, 펌프를 사용할 수 있다(Langer, 위와 같음; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al ., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al ., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574 참고). 또 다른 실시예에서 중합체 물질이 사용될 수 있다(Medical Applications of Controlled Release, Langer 및 Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen 및 Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger 및 Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levy et al, 1985, Science 228:190; During et al, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al, 1989, J. Neurosurg. 71 : 105 참고). 특정 실시예에서, 바이러스 감염 조직을 예방, 치료 및/또는 관리하기 위해 화합물로 구성된 서방 시스템을 감염조직과 가까운 곳에 위치시킨다. 이러한 실시예에 따라, 감염 근접부의 서방 시스템은 전신 투여된 경우 필요한 화합물 용량 분획만을 방출할 수 있다.
특정 실시예에서, 화합물이 항바이러스 작용을 갖는 바이러스의 자연 감염경로를 통해 화합물을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 바이러스(예: 인플루엔자 바이러스)에 의한 호흡기 감염을 치료 또는 예방하기 위해 본 발명의 화합물을 모든 적합한 경로를 통해 폐로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 흡입기 또는 네불라이저 및 스프레이로 사용하기 위한 분무화제 제형의 사용과 같은 방법으로 화합물을 폐로 투여할 수 있다.
5.7.3 화합물과의 병용을 위한 약제
바이러스 감염 예방, 치료 및/또는 관리를 위해 화합물과 병용하여 사용할 수 있는 치료 또는 예방 약제에는 소분자, 합성 약물, 펩타이드(고리 펩타이드 포함), 폴리펩티드, 단백질, 핵산(예: 안티센스 뉴클레오티드 서열, 삼중 나선, RNAi, 및 생물학적 활성 단백질 암호화 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 또는 펩타이드를 포함하나 이에 한정되지는 않는 DNA 및 RNA 뉴클레오티드), 항체, 합성 또는 천연 무기물 분자, 유사 약제, 그리고 합성 또는 천연 유기물 분자를 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 그러한 약제의 특정 예에는 면역조절제(예: 인터페론), 항염증제(예: 아드레노코티코이드), 코티코스테로이드(예: 베클로메타손, 부데소나이드, 플루니소라이드, 플루티카손, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손 , 하이드로코티손), 글루코코르티코이드, 스테로이드, 및 비스테로이드성 항염증제(예: 아스피린, 이부프로펜, 디클로페낙, 및 COX-2 억제제), 진통제, 류코트리엔 길항제(예: 몬테루카스트, 메틸 잰틴, 자퍼루카스트 및 자일루톤), 베타2-작용제(예: 알부테롤, 비테롤, 페노테롤, 이소에타린, 메타프로테레놀, 피르부테롤, 살부타몰, 테르부탈린), 포모테롤(살메테롤, 및 살부타몰 테르부탈린), 항콜린 작용제(예: 이프라트로피움 브로마이드와 옥시트로피움 브로마이드), 설파살라진, 페니실라민, 댑손, 항히스타민제, 항말라리아제(예: 하이드록시클로로퀸), 항바이러스제(예: 뉴클레오시드 유사체(예: 지도부딘, 아시클로버, 간시클로버, 비다라빈, 이독스유리딘, 트리플루리딘, 및 리바비린), 포스카르넷, 아만타딘, 리만타딘, 사퀴나버, 인디나버,리토나버, 및 AZT) 및 항생제(예: 닥티노마이신(구 액티노마이신, 블레오마이신, 에리스로마이신, 페니실린, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC))가 포함되나, 이에 국한되지는 않는다.
바이러스 예방, 관리 및/또는 치료를 위해 현재 사용되고 있거나, 사용되어 왔거나, 또는 유효한 것으로 알려진 모든 요법을 본 문서에 기술된 발명에 따라 화합물과 병용할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 예방, 치료 및/혹은 관리에 사용되어 왔거나, 현재 사용 중인 치료 요법(예: 예방 또는 치료제) 관련 정보를 확인하려면Gilman et al, Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, 2001; The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Berkow, M.D. et al (eds.), 17th Ed., Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, NJ, 1999; Cecil Textbook of Medicine, 20th Ed., Bennett and Plum (eds.), W.B. Saunders, Philadelphia, 1996, 및 Physicians' Desk Reference (61st ed. 1007)를 참고한다.
5.7.3.1 항바이러스제
화합물과 병용하여 사용할 수 있는 항바이러스제에는 비뉴클레오시드 역 전사효소 억제제, 뉴클레오시드 역 전사효소 억제제, 단백분해효소 억제제 및 융합 억제제가 포함되나, 이에 국한되지는 않는다. 한 실시예에서, 아만타딘, 오셀타미비어 인산염, 리만타딘 및 자나미비어로 이루어지는 군에서 선택한다. 또 다른 실시예에서, 항바이러스제는 델라비어딘, 에파비렌즈 및 네비라핀으로 구성된 군에서 선택한 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제이다. 또 다른 실시예에서, 항바이러스제는 아바카비어, 디다노신, 엠트리시타빈, 라미부딘, 스타부딘, 테노포비어 DF, 잘시타빈 및 지도부딘으로 이루어진 군에서 선택한 뉴클레오시드 역전사효소 억제제이다. 또 다른 실시예에서, 항바이러스제는 암프레나버, 아타자나버, 포삼프레나버, 인디나버, 로피나버, 넬피나버, 리토나버 및 사퀴나버로 이루어진 군에서 선택한 단백분해효소 억제제이다. 또 다른 실시예에서, 항바이러스제는 엔푸버타이드와 같은 융합억제제이다.
화합물과의 병용을 위한 항바이러스제의 추가적, 비제한적 예시에는 다음이 포함된다: 리팜피신, 뉴클레오시드 역전사효소 억제제(예: AZT, ddI, ddC, 3TC, d4T), 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제(예: 델라비어딘 에파비렌즈, 네비라핀), 단백분해효소 억제제(예: 아프레나버, 인디나버, 리토나버및 사퀴나버), 이독스유리딘, 시도포비어, 아시클로버, 간시클로버, 자나미비어, 아만타딘 및 팔리비주맙. 항바이러스제의 다른 예시에는 아세마난; 아시클로버; 아시클로버 소듐; 아데포비어; 알로부딘; 알비셉트 수도톡스; 아만타딘 염산(SYMMETRELTM); 아라노틴; 아릴돈; 아테비어딘 메실레이트; 아비리딘; 시도포비어; 시팜필린; 시타라빈 염산; 델라비어딘 메실레이트; 데시클로버; 디다노신; 디속사릴; 에독수딘; 엔비라딘; 엔비록심; 팜시클로버; 파모틴 염산; 피아시타빈; 피알유리딘;포사릴레이트; 포스카멧 소듐; 포스포넷 소듐; 간시클로버; 간시클로버 소듐; 이독스유리딘; 케톡살; 라미부딘; 로부카버 ; 메모틴 염산; 메티사존; 네비라핀; 오셀타미비어 인산염(TAMIFLUTM); 펜시클로버; 피로다비어;리바비린; 리만타딘 염산(FLUMADINETM); 사퀴나버 메실레이트; 소만타딘 염산; 소리부딘;스타토론; 스타부딘; 틸로론 염산; 트리플루리딘; 발라시클로버 염산; 비다라빈; 비다라빈 인산염; 비다라빈 소듐 인산; 비록심; 잘시타빈; 자나미비어(RELENZATM); 지도부딘; 및 진비록심이 포함되나, 이에 국한되지는 않는다.
5.7.3.2 항균제
화합물과 병용할 수 있는 항생제를 포함한 항균제에는 아미노글리코사이드 항생제, 글리코펩타이드, 암페니콜 항생제, 안사마이신 항생제, 세팔로스포린, 세파마이신 옥사졸리디논, 페니실린, 퀴놀론, 스트렙도가민, 테트라사이클린 및 그 유사체가 포함되나, 이에 국한되지는 않는다. 일부 실시에에서, 항생제를 세균 감염을 예방 및/또는 치료하기 위해 화합물과 병용하여 투여한다.
특정 실시예에서, 화합물은 스트렙토마이신, 네오마이신, 에리스로마이신, 카보마이신 및 스피라마이신을 포함하나, 이에 국한되지 않는 다른 단백질 합성 억제제와 병용한다.
한 실시예에서, 항균제는 암피실린, 아목시실린, 사이프로플록사신, 겐타마이신, 가나마이신, 네오마이신, 페니실린 G, 스트렙토마이신, 설파닐아마이드 및 반코마이신으로 이루어진 군에서 선택한다. 또 다른 실시에에서, 항균제는 아지스로마이신, 세포니시드, 세포테탄, 세팔로틴, 세파마이신, 클로르테트라사이클린, 클래리스로마이신, 클린다마이신, 사이클로세린, 달포프리스틴, 독시사이클린, 에리스로마이신, 리네졸리드, 뮤피로신, 옥시테트라사이클린, 퀴누프리스틴, 리팜핀, 스펙티노마이신 및 트리메토프림으로 이루어진 군에서 선택한다.
화합물과 병용하여 사용하기 위한 추가적, 비제한적 예시에는 아미노글리코사이드 항생제(예: 아프라마이신, 아베카신, 밤버마이신, 부티로신, 디베카신, 네오마이신, 네오마이신 운데실레이트, 네틸마이신, 파로모마이신, 리보스타마이신, 시소마이신 및 스펙티노마이신), 암페니콜 항생제(예: 아지담페니콜, 클로람페니콜, 플로르페니콜, 및 티암페니콜), 안사마이신 항생제(예: 리파마이드 및 리팜핀), 카바세펨계(예: 로라카베프), 카바페넴(예: 비아페넴 및 이미페넴), 세팔로스포린(예: 세파클러, 세파드록실, 세파만돌, 세파트리진, 세파제돈, 세파조프란, 세피미졸, 세프피라마이드 및 세프피롬), 세파마이신(예: 세프부페라존, 세프메타졸 및 세프미녹스), 엽산유사체 (예: 트리메토프림), 글리코펩티드(예: 반코마이신), 린코사마이드(예: 클린다마이신 및 린코마이신), 마크로라이드(예: 아지스로마이신, 카보마이신, 클래리스로마이신, 디리스로마이신, 에리스로마이신 및 에리스로마이신 아시스트레이트), 모노박탐(예: 아즈트레오남, 카루모남, 및 티게모남), 니트로푸란(예: 푸랄타돈, 푸라졸리움 클로라이드), 옥사세펨(예: 플로목세프 및 목사락탐), 옥사졸리디논(예: 리네졸리드), 페니실린(예: 암디노실린, 암디노실린 피복실, 아목시실린, 바캄피실린, 벤질페니실린산, 벤질페니실린 소듐, 에피실린, 펜베니실린, 플록사실린, 페남실린, 페네타메이트 하이드리오다이드, 페니실린o 베네타민, 페니실린 0), 페니실린 V, 페니실린 V 벤자틴, 페니실린 V 하이드라바민, 페니메피실린, 및 펜치실린 칼륨), 퀴놀론 및 그 유사체(예: 시녹사신, 시프록사신, 클리나플록사신, 플루메퀸, 그레파글록사신, 레보플록사신 목시플록사신), 스트렙토그라민(예: 퀴누프리스틴 및 달포프리스틴), 설폰아마이드(예:아세틸 설파메톡시피라진, 벤질설파미드, 노프릴설파미드, 프탈릴설프아세타미드, 설파크리소이딘, 및 설파사이틴), 설폰(예: 디아티모설폰, 글루코설폰 나트륨, 및 솔라설폰), 및 테트라사이클린(예: 아피사이클린, 클로르테트라사이클린, 클로모사이클린 및 데모클로사이클린)이 포함된다. 추가적 예시에는 사이클로세린, 뮤피로신, 튜베린 암포마이신, 박시트라신, 카프레오마이신, 콜리스틴, 엔듀라시딘, 엔비로마이신 및 2,4 디아미노피리미딘(예: 브로디모프림)이 포함된다.
5.7.4 투여 용량 및 빈도
바이러스 감염 예방, 치료 및/또는 관리에 유효할 화합물의 양 또는 화합물로 구성된 조성물의 양은 표준 임상 기법으로 결정할 수 있다. 최적의 용량범위 확인을 돕기 위해 체내 또는 체외 분석법을 선택적으로 사용할 수 있다. 사용할 정확한 용량은 투여 경로, 발명의 유형 및 감염의 중증도 등에 따라서도 역시 달라질 수 있으므로, 의료인의 판단과 각 환자 또는 피험자의 상황에 따라 이를 결정해야 한다.
일부 실시예에서, 화합물의 투여량은 동물시험에서 결정된 최대무작용량(NOAEL)으로부터의 외삽에 의해 결정한다. 외삽투여량은 인체 임상시험의 최대 권장 시작용량 결정에 유용하다. 예를 들어, 인간당량(human equivalent dosage: HED) 결정을 위해 NOAEL을 외삽할 수 있다. 통상적으로, HED는 체표면적(즉, mg/m2)에 대해 표준화한 용량을 토대로 비인간 동물 용량으로부터 외삽된다. 특정 실시예에서 NOAEL은 마우스, 햄스터, 쥐, 흰족제비, 기니아피그, 토끼, 개, 영장류, 영장류(원숭이, 명주원숭이, 다람쥐원숭이, 개코원숭이), 마이크로피그 또는 미니피그에서 결정한다. 인간당량 결정을 위한 NOAEL 및 그 외삽 사용에 대한 논의는 Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Pharmacology and Toxicology, July 2005를 참고한다. 한 실시예에서 화합물 또는 그 조성물은 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년, 3년, 4년 이상의 기간에 걸쳐 NOAEL의 인간당량(HED) 이하의 용량으로 투여한다.
특정 실시예에서, 인체대상의 용량요법은 실험동물의 10% 치사량(LD10)을 사용하여 동물모델 시험으로부터 외삽할 수 있다. 일반적으로 제1상 임상시험의 시작투여량은 전임상시험을 토대로 한다. 전임상시험에서 약물의 표준 독성은 처치로 인한 동물의 치사율로 측정한다. 인간 시작용량 외삽의 토대로, 체표면적으로 보정한 동물시험에서 LD10과 인간 최대내약용량(MTD)의 상관관계는 당 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시예에서, 한 동물모델의 경우 용량의 상호관계성은 예를 들어, Freireich et al ., Cancer Chemother. Rep., 1966, 50:219-244에 기술된 바와 같이, (체표면적 제곱미터당 밀리그램을 토대로 한) 전환인자를 사용하여 인간을 포함한 또 다른 동물시험에 사용하기 위해 전환할 수 있다. 체표면적은 피험자의 체중과 신장으로부터 대략적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, N. Y., 1970, 537을 참고한다. 특정 실시예에서, 체표면적의 보정에는, 예를 들어 표면적, 체중, 대사, 조직분포, 흡수속도 및 배설속도와 같은 숙주인자가 포함된다. 또한 투여 경로, 부형제 사용 및 특정 질환 또는 표적 바이러스 역시 고려해야 할 인자이다. 한 실시예에서, 표준 보수적 시작용량은 다른 종(예를 들어, 개)이 화합물에 대해 더욱 민감하다 하더라도 마우스 LD10의 대략 1/10로 한다. 다른 실시예에서 표준 보수적 시작용량은 마우스 LD10의 약 1/100, 1/95, 1/90, 1/85, 1/80, 1/75, 1/70, 1/65, 1/60, 1/55, 1/50, 1/45, 1/40, 1/35, 1/30, 1/25, 1/20, 1/15, 2/10, 3/10, 4/10, 또는 5/10이다. 다른 실시예에서, 인간에서 화합물의 시작용량은 동물모델 시험으로부터 외삽한 용량보다 더 낮다. 또 다른 실시예에서, 인간에서 화합물의 시작용량은 동물모델 시험으로부터 외삽한 용량보다 더 높다. 활성 조성물의 시작 용량을 다소 낮은 수준으로 하고, 독성을 최소화하면서 기대효과에 도달할 수 있도록 필요 시 용량을 증가 또는 감소시키는 것은 당 업계에 잘 알려져 있다.
화합물 또는 조성물의 기본 용량은 피험자 또는 표본 중량 킬로그램 당 밀리그램 또는 마이크로그램(예: 킬로그램 당 약1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 500밀리그램, 킬로그램 당 약 5마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 100밀리그램, 또는 킬로그램 당 약 1마이크로그램 내지 킬로그램당 약 50마이크로그램)을 포함한다. 특정 실시예에서, 일일 용량은 최소 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 250 mg, 500 mg, 750 mg, 또는 최소 1 g이다.
한 실시예에서, 용량은 0.01 내지 5000 mM, 1 내지 300 mM, 10 내지 100 mM 및 10 mM 내지 1 M 농도이다. 또다른 실시예에서, 용량은 최소 5 μM, 최소 10 μM, 최소 50 μM, 최소 100 μM, 최소 500 μM, 최소 1 mM, 최소 5 mM, 최소 10 mM, 최소 50 mM, 최소 100 mM, 또는 최소 500 mM 농도이다.
한 실시예에서 용량은 0.01 내지 5000 mM, 1 내지 300 mM, 10 내지 100 mM, 그리고10 mM 내지 1 M 농도이다. 또 다른 실시예에서, 용량은 최소 5 μM, 최소 10 μM, 최소 50 μM, 최소 100 μM, 최소 500 μM, 최소 1 mM, 최소 5 mM, 최소 10 mM, 최소 50 mM, 최소 100 mM, 또는 최소 500 mM농도이다. 특정 실시예에서, 용량은 피험자 체중의 0.25 ㎍/kg 이상, 바람직하게는 0.5 ㎍/kg 이상, 1 ㎍/kg 이상, 2 ㎍/kg 이상, 3 ㎍/kg 이상, 4 ㎍/kg 이상, 5 ㎍/kg 이상, 6 ㎍/kg 이상, 7 ㎍/kg 이상, 8 ㎍/kg 이상, 9 ㎍/kg 이상, 또는 10 ㎍/kg 이상, 25 ㎍/kg 이상, 바람직하게는 50 ㎍/kg 이상, 100 ㎍/kg 이상, 250 ㎍/kg 이상, 500 ㎍/kg 이상, 1 mg/kg 이상, 5 mg/kg 이상, 6 mg/kg 이상, 7 mg/kg 이상, 8 mg/kg 이상, 9 mg/kg 이상, 또는 10 mg/kg 이상이다.
또 다른 실시예에서 용량은 5 mg, 바람직하게는 10 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg 이상의 단위 용량이다. 또 다른 실시예에서, 용량은 약5 mg 내지 100 mg, 약 100 mg 내지 200 ㎍, 약 150 mg 내지 300 mg, 약 150 mg 내지 400 mg, 250 ㎍ 내지 500 mg, 약 500 mg 내지 800 mg, 약 500 mg 내지 1000 mg, 또는 약 5 mg 내지 1000 mg 범위의 단위 용량이다.
특정 실시예에서, 경구 투여에 적합한 용량 범위는 1일 체중 킬로그램당 화합물 약 0.001 내지 500밀리그램이다. 본 발명의 특정 실시예에서, 경구 용량은 1일 체중 킬로그램당 약 0.01 내지 100밀리그램, 1일 체중 킬로그램당 약 0.1 내지 75밀리그램, 또는 1일 체중 킬로그램당 약 0.5 내지 5밀리그램이다. 본 문서에 기술된 투여량은 투여한 총량을 나타낸다. 즉, 하나 이상의 화합물을 투여하는 경우, 일부 실시예에서 용량은 투여한 총량에 해당한다. 특정 실시예에서, 경구용 조성물은 본 발명 화합물의 약 10% 내지 95% 중량을 포함한다.
정맥 투여(i.v)에 적합한 용량 범위는 1일 체중 킬로그램당 약 0.01 내지 100 밀리그램, 1일 체중 킬로그램당 약 0.1 내지 35밀리그램, 그리고 1일 체중 킬로그램당 약 1 내지 10밀리그램이다. 일부 실시예에서, 비강 투여에 적합한 용량 범위는 1일 약 0.01 pg/kg 내지 1 mg/kg이다. 일반적으로, 좌제는 약 1일 체중 킬로그램당 본 발명의 화합물을 약 0.01 내지 50밀리그램을 포함하며, 활성성분은 약 0.5% 내지 10% 중량 범위로 포함되어 있다.
피내, 근육, 복강, 피하, 경막외, 설하, 뇌내, 질내, 경피 투여 또는 흡입 투여에서의 권장 용량은 1일 체중 킬로그램당 0.001 내지 500밀리그램 범위이다. 국소 투여에 적합한 용량은 투여 부위 영역에 따라, 약 0.001 내지 50밀리그램 범위 용량을 포함한다. 유효량은 체외 또는 동물모델 시험 시스템으로부터 도출된 용량-반응 곡선으로부터 외삽할 수 있다. 그러한 동물모델 및 시스템은 당 업계에 잘 알려져 있다.
또 다른 실시예에서는, 화합물 또는 조성물의 예방 또는 치료 유효량을 1회 이상 피험자에게 투여하며, 이 때 예방 또는 치료 유효량의 각 투여량은 동일하지 않다. 또 다른 실시예에서, 화합물 또는 조성물의 예방 또는 치료 유효량을 1회 이상 피험자에게 투여하며, 이 때 화합물 또는 조성물의 예방 및 치료 유효량을 치료 경과에 따라, 예를 들어 0.01 ㎍/kg, 0.02 ㎍kg, 0.04 ㎍/kg, 0.05 ㎍/kg, 0.06 ㎍/kg, 0.08 ㎍/kg, 0.1 ㎍/kg, 0.2 ㎍/kg, 0.25 ㎍/kg, 0.5 ㎍/kg, 0.75 ㎍/kg, 1 ㎍/kg, 1.5 ㎍/kg, 2 ㎍/kg, 4 ㎍/kg, 5 ㎍/kg, 10 ㎍/kg, 15 ㎍/kg, 20 ㎍/kg, 25 ㎍/kg, 30 ㎍/kg, 35 ㎍/kg, 40 ㎍/kg, 45 ㎍/kg, 또는 50 ㎍/kg으로 증가시켜 피험자에게 투여한다. 또 다른 실시예에서는, 화합물 또는 조성물의 예방 또는 치료 유효량을 1회 이상 피험자에게 투여하며, 이 때 투여량을 치료 경과에 따라, 예를 들어 0.01 ㎍/kg, 0.02 ㎍/kg, 0.04 ㎍/kg, 0.05 ㎍/kg, 0.06 ㎍/kg, 0.08 ㎍/kg, 0.1 ㎍/kg, 0.2 ㎍/kg, 0.25 ㎍/kg, 0.5 ㎍/kg, 0.75 ㎍/kg, 1 ㎍/kg, 1.5 ㎍/kg, 2 ㎍/kg, 4 ㎍/kg, 5 ㎍/kg, 10 ㎍/kg, 15 ㎍/kg, 20 ㎍/kg, 25 ㎍/kg, 30 ㎍/kg, 35 ㎍/kg, 40 ㎍/kg, 45 ㎍/kg, 또는 50 ㎍/kg으로 감소시킨다.
특정 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 게놈 복제를 최소 20% 내지 25%, 바람직하게는 최소 25% 내지 30%, 최소 30% 내지 35%, 최소 35% 내지 40%, 최소 40% 내지 45%, 최소 45% 내지 50%, 최소 50% 내지 55%, 최소 55% 내지 60%, 최소 60% 내지 65%, 최소 65% 내지 70%, 최소 70% 내지 75%, 최소 75% 내지 80%, 또는 최소 85% 까지 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양을 피험자에게 투여한다. 다른 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 게놈 복제를 최소 20% 내지 25%, 바람직하게는 최소 25% 내지 30%, 최소 30% 내지 35%, 최소 35% 내지 40%, 최소 40% 내지 45%, 최소 45% 내지 50%, 최소 50% 내지 55%, 최소 55% 내지 60%, 최소 60% 내지 65%, 최소 65% 내지 70%, 최소 70% 내지 75%, 최소 75% 내지 80%, 또는 최소 85% 까지 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다. 특정 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 게놈 복제를 최소 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 4 배, 5 배, 8 배, 10 배, 15 배, 20 배, 또는 2 내지 5 배, 2 내지 10 배, 5 내지 10 배, 또는 5 내지 20배 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다.
특정 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 게놈 합성을 최소 20% 내지 25%, 바람직하게는 최소 25% 내지 30%, 최소 30% 내지 35%, 최소 35% 내지 40%, 최소 40% 내지 45%, 최소 45% 내지 50%, 최소 50% 내지 55%, 최소 55% 내지 60%, 최소 60% 내지 65%, 최소 65% 내지 70%, 최소 70% 내지 75%, 최소 75% 내지 80%, 또는 최소 85%까지 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다. 다른 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 게놈 합성을 최소 20% 내지25%, 바람직하게는 최소 25% 내지 30%, 최소 30% 내지 35%, 최소 35% 내지 40%, 최소 40% 내지 45%, 최소 45% 내지 50%, 최소 50% 내지 55%, 최소 55% 내지 60%, 최소 60% 내지 65%, 최소 65% 내지 70%, 최소 70% 내지 75%, 최소 75% 내지 80%, 또는 최소 85%까지 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다. 특정 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 게놈 합성을 최소 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 4 배, 5 배, 8 배, 10 배, 15 배, 20 배, 또는 2 내지 5 배, 2 내지 10 배, 5 내지 10 배, 또는 5 내지 20배 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다.
특정 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 감염을 최소 20% 내지 25%, 바람직하게는 최소 25% 내지 30%, 최소 30% 내지 35%, 최소 35% 내지 40%, 최소 40% 내지 45%, 최소 45% 내지 50%, 최소 50% 내지 55%, 최소 55% 내지 60%, 최소 60% 내지 65%, 최소 65% 내지 70%, 최소 70% 내지 75%, 최소 75% 내지 80%, 또는 최소 85% 까지 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다. 일부 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 감염을 최소 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 4 배, 5 배, 8 배, 10 배, 15 배, 20 배, 또는 2 내지 5 배, 2 내지 10 배, 5 내지 10 배, 또는 5 내지 20배 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다.
특정 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 복제를 최소 20% 내지 25%, 바람직하게는 최소 25% 내지 30%, 최소 30% 내지 35%, 최소 35% 내지 40%, 최소 40% 내지 45%, 최소 45% 내지 50%, 최소 50% 내지 55%, 최소 55% 내지 60%, 최소 60% 내지 65%, 최소 65% 내지 70%, 최소 70% 내지 75%, 최소 75% 내지 80%, 또는 최소 85% 까지 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다. 일부 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 복제를 최소 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 4 배, 5 배, 8 배, 10 배, 15 배, 20 배, 또는 2 내지 5 배, 2 내지 10 배, 5 내지 10 배, 또는 5 내지 20배 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다. 다른 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 복제를 1 로그, 1.5 로그, 2 로그, 2.5 로그, 3 로그, 3.5 로그, 4 로그, 5 로그 이상 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다.
특정 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 다른 개체로의 바이러스 전파 능력을 최소 20% 내지 25%, 바람직하게는 최소 25% 내지 30%, 최소 30% 내지 35%, 최소 35% 내지 40%, 최소 40% 내지 45%, 최소 45% 내지 50%, 최소 50% 내지 55%, 최소 55% 내지 60%, 최소 60% 내지 65%, 최소 65% 내지 70%, 최소 70% 내지 75%, 최소 75% 내지 80%, 또는 최소 85%까지 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다. 다른 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 피험자의 다른 세포, 조직 또는 기관으로의 바이러스 전파 능력을 최소20% 내지 25%, 바람직하게는 최소 25% 내지 30%, 최소 30% 내지 35%, 최소 35% 내지 40%, 최소 40% 내지 45%, 최소 45% 내지 50%, 최소 50% 내지 55%, 최소 55% 내지 60%, 최소 60% 내지 65%, 최소 65% 내지 70%, 최소 70% 내지 75%, 최소 75% 내지 80%, 또는 최소 85%까지 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다.
특정 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 유래 지질 합성을 최소 20% 내지 25%, 바람직하게는 최소 25% 내지 30%, 최소 30% 내지 35%, 최소 35% 내지 40%, 최소 40% 내지 45%, 최소 45% 내지 50%, 최소 50% 내지 55%, 최소 55% 내지 60%, 최소 60% 내지 65%, 최소 65% 내지 70%, 최소 70% 내지 75%, 최소 75% 내지 80%, 또는 최소 85%까지 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다. 다른 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 유래 지질 합성을 최소 20% 내지 25%, 바람직하게는 최소 25% 내지 30%, 최소 30% 내지 35%, 최소 35% 내지 40%, 최소 40% 내지 45%, 최소 45% 내지 50%, 최소 50% 내지 55%, 최소 55% 내지 60%, 최소 60% 내지 65%, 최소 65% 내지 70%, 최소 70% 내지 75%, 최소 75% 내지 80%, 또는 최소 85%까지 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다. 특정 실시예에서, 음성 대조군 대비 본 문서에 기술된 분석법 또는 당업계에 알려져 있는 다른 분석법을 사용하여 결정된 것으로서, 바이러스 유래 지질합성을 최소 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 4 배, 5 배, 8 배, 10 배, 15 배, 20 배, 또는 2 내지 5 배, 2 내지 10 배, 5 내지 10 배, 또는 5 내지 20배 감소 또는 억제하는데 유효한 화합물 또는 조성물 용량을 피험자에게 투여한다.
특정 실시예에서, 화합물 또는 조성물의 용량을 매일, 격일, 매 2일마다, 매 3일마다, 주 1회, 주 2회, 주 3회 또는 격주 1회로 피험자에게 투여한다. 다른 실시예에서, 화합물 또는 조성물의 용량을 매일, 매 2일마다, 매 3일마다, 주 1회 또는 격주 1회로 피험자에게 투여한다. 일부 실시예에서, 화합물 또는 조성물의 용량(들)을 2일, 3일, 5일, 7일, 14일 또는 21일 동안 투여한다. 특정 실시예에서는 화합물 또는 조성물의 용량을 1개월, 1.5개월, 2개월, 2.5개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 이상의 기간 동안 투여한다.
바이러스 예방, 치료 및/또는 관리를 위해 사용되어 왔거나, 현재 사용되는 예방 또는 치료약제의 투여량은 Physicians' Desk Reference(61st ed. 2007)와 같은 임상의가 입수 가능한 참고문헌들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직하게는 감염 예방, 치료 및/또는 관리를 위해 사용되어 왔거나, 또는 현재 사용되고 있는 용량보다 저용량을 하나 이상의 화합물 또는 조성물과 병용한다.
바이러스 감염 예방, 치료 또는 관리 이외의 사용으로 승인된 화합물의 경우, 안전한 용량 범위는 Physician's Desk Reference (61st ed. 2007)와 같은 임상의들이 입수 가능한 참고문헌을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다.
상기 기술한 투여 계획은 예증 목적만을 위해 제공한 것이며, 제한을 위해 고려해서는 안 된다. 당 업계의 통상적 지식을 보유한 자는 모든 용량이 발명 범위 내 있음을 쉽게 이해할 것이다.
한 실시예에서는, 오를리스탓(상품명 Xenical®로 판매됨)를 지방함유 식이와 함께 120 mg을 매일 3회 투여한다. 이론적 제한 없이, 120 mg 이상 범위의 오를리스탓 투여량이 이 적응증에서 추가적 이득을 나타내지 않은 반면, 1일 기준 800 mg 1회 투여 및 400mg 3회 투여와 같은 높은 투여량은 유해한 부작용을 나타내지 않았다.
특정 실시예에서, 구조 (I) 화합물은 캡슐과 같은 고형 제형으로 투여한다.
다른 실시예에서, 구조 (I) 화합물은 약 100 mg 내지 800 mg의 용량으로 투여한다. 특정 실시예에서, 구조 (I) 화합물은 120 mg, 400 mg, 또는 800mg으로 투여한다.
다른 실시예에서, 구조 (I) 화합물은 1일 기준 1회, 2회 또는 3회 투여한다.
특정 실시예에서, 구조 (I) 화합물은 120 mg 캡슐로 1일 3회 투여한다. 구조 (I) 화합물은 식이, 예를 들어 지방 함유 식이와 함께 투여할 수 있다.
한 실시예에서, 구조 (II) 화합물은 1일 체중당 약 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (II) 화합물은 1일 체중당 약 0.01 mg/kg 내지 25 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서 구조 (II) 화합물은 1일 체중당 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (II) 화합물은 1일 체중당 약 50 mg/kg 내지 100 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (II) 화합물은 1일 0.001 mg/kg 이하의 용량으로 투여한다.
한 실시예에서 구조 (III) 화합물은 1일 체중당 약 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서 구조 (III) 화합물은 1일 체중당 약 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서 구조 (III) 화합물은 1일 체중당 약 10 mg/kg 내지 30 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (III) 화합물은 1일 체중당 약 50 mg/kg 내지 100 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (III) 화합물은 1일 0.001 mg/kg 미만 용량으로 투여한다.
한 실시예에서 구조 (IV) 화합물은 1일 체중당 약 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서 구조 (IV) 화합물은 1일 체중당 약 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서 구조 (IV) 화합물은 1일 체중당 약 10 mg/kg 내지 30 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (IV) 화합물은 1일 체중당 약 50 mg/kg 내지 100 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (IV) 화합물은 1일 0.001 mg/kg 미만 용량으로 투여한다.
한 실시예에서, 구조 (VI) 화합물은 1일 체중당 약 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VI) 화합물은 1일 체중당 약 0.01 mg/kg 내지 25 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서 구조 (VI) 화합물은 1일 체중당 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VI) 화합물은 1일 체중당 약 50 mg/kg 내지 100 mg/kg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VI) 화합물은 1일 0.001 mg/kg 미만 용량으로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VI) 화합물을 0.25 mg 내지 약 500 mg 용량 범위의 캡슐로 경구 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VI) 화합물을 0.25 mg 내지 약 500 mg 용량 범위의 정제로 경구 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VI) 화합물을 0.25 mg 내지 약 500 mg 용량 범위의 현탁제로 경구 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VI) 화합물을 0.10 mg 내지 약 100 mg 용량 범위의 흡입 에어로졸로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VI) 화합물을 10 mg 내지 약 500 mg 용량 범위의 좌제로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VI) 화합물을 0.1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml 용량 범위에서 정맥 투여한다.
한 실시예에서, 구조 (VIII) 화합물은 1일 1 mg 내지 약 100 mg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VIII) 화합물은 1일 체중당 1 mg 내지 약10mg의 용량 범위로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VIII) 화합물을 1 mg 내지 약 100 mg 용량 범위에서 정제로 경구 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VIII) 화합물을 1 mg 내지 약 100 mg 용량 범위에서 캡슐로 경구 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VIII) 화합물을 1 mg 내지 약 100 mg 용량 범위에서 새쉬(sachet)로 경구 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (VIII) 화합물을 1 mg 내지 약 100 mg 용량 범위에서 주사제로 투여한다.
한 실시예에서 구조 (XIII) 화합물을 약 10 ㎍/kg/일 내지 100 mg/kg/일의 용량으로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XIII) 화합물을 경구(예: 정제) 또는 비경구 제형으로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XIII) 화합물은 구조 (XIII) 화합물을 약 2 ㎍ 내지 1000 mg을 포함하는 고형 제형으로 투여한다. 특정 실시예에서, 구조 (XIII) 화합물은 구조 (XIII) 화합물을 500 mg 포함하는 고형 제형으로 투여한다.
한 실시예에서, 구조 (XIV) 화합물을 약 0.5 mg/kg 내지 100 mg/kg범위의 용량으로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XIV) 화합물을 경구 또는 전신 투여한다.
한 실시예에서, 구조 (XV) 화합물을 약 1 mg/kg 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여한다. 특정 실시예에서는, 구조 (XV) 화합물을 10 mg/kg의 용량으로 투여한다.
또 다른 실시예에서, 구조 (XV) 화합물을 액상 제형으로 복강 투여한다. 특정 실시예에서, 구조 (XV) 화합물을 10 mg/kg 농도의 액상 제형으로 복강 투여한다.
한 실시예에서, 구조 (XVI) 화합물을 일일 용량으로 체중당 약 5 내지 200 mg/kg을 투여한다. 또 다른 실시예에서, 구조 (XVI) 화합물을 일일 용량으로 체중당 약 10 내지 100 mg/kg을 1일 1회 이상 투여한다.
특정 실시예에서, TOFA 화합물을 약 500 mg/일 내지 1,000 mg/일의 용량으로 인체에 투여한다.
또 다른 실시예에서, TOFA와 같은 ACC 억제제인 화합물을 혈중 농도가 약 75 μM (또는 약 30 ㎍/mL)가 되도록 150 mg/kg/일의 용량으로 설치류에 투여한다. 특정 실시예에서는 TOFA와 같은 ACC 억제제인 화합물의 약 1,500 mg/일(BSA 기준) 용량을 인체에 투여한다. 특정 실시예에서, TOFA와 같은 ACC 억제제인 화합물의 약 1,000 mg/일 내지 1,500 mg/일(BSA 기준) 용량을 인체에 투여한다. 또 다른 실시예에서, TOFA와 같은 ACC 억제제인 화합물의 약 1,500 mg/일 내지 2,000 mg/일(BSA 기준) 용량을 인체에 투여한다. 특정 실시예에서, TOFA와 같은 ACC 억제제인 화합물을 인체에 투여 시 폐 조직 또는 간 조직과 같은 조직내 화합물의 농도는 화합물의 혈장 농도보다 높다. 일부 실시예에서, TOFA와 같은 ACC 억제제인 화합물을 인체에 투여 시 화합물의 폐 조직 내 농도는 혈장 내 화합물 농도보다 약 1.5배, 또는 약 2배, 또는 약 3배, 또는 약 4배, 또는 약 5배 높다. 특정 실시예에서, TOFA와 같은 ACC 억제제인 화합물을 인체에 투여했을 때, 폐 조직에서의 화합물 농도는 혈장 화합물 농도보다 약 3배 높다. 특정 실시예에서, TOFA와 같은 ACC 억제제인 화합물을 인체에 투여했을 때, 간 조직 내 화합물 농도는 혈장 화합물 농도보다 약 5배, 또는 약 10배, 약 15배, 또는 약 20배, 또는 약 25배, 또는 약 30배, 또는 약 35배, 또는 약 40배, 또는 약 50배 높다. 특정 실시에에서, TOFA와 같은 ACC 억제제인 화합물을 인체에 투여했을 때, 간 조직 내 화합물 농도는 혈장 화합물 농도보다 약 30배 높다.
5.7.5 세포 배양 용도
본 발명은 항바이러스 활성을 갖는 바람직한 세포 배양 관련 제품의 성분으로서 화합물 사용을 제공한다. 한 실시예에서, 하나 이상의 화합물을 세포 배양 배지에 첨가한다. 특정 실시예에서, 심한 독성이 내포된 것으로 밝혀지거나 대상에 사용되지 않는 화합물은 배지와 같은 세포 배양 관련 제품에 추가한다.
6. 예시
생물학적 시약 및 세포 배양. MRC-5 섬유모세포(ATCC)를 7.5% 태아 소 혈청과 포도당 4.5g/L를 함유한 둘베코 수정 이글 배지(DMEM)에서 배양한다. 인간 거대세포 바이러스의 모든 감염은 BADwt에서 수행되었고, 이는 HCMV의 AD169균주 인공 세균 염색체(BAC) 클론으로부터 도출된 것이다 (Giaever et al ., Nature 418, 387 ( Jul 25, 2002) 참고). 어떠한 바이러스 서열도 삭제하지 않고, BAC를 HCMV 게놈에 삽입하였고, loxP 부위에서의 재조합을 매개하는 상호 전달 감염된 CRE 재조합 효소로 바이러스 클론에서BAC 측부에 위치한 1oxP부위만을 남기고 절단하였다. 이 클론은 다양한 분석법으로 시험되어 왔으며, 항상 야생형 AD169 표현형을 나타내었다.
모든 대사실험의 경우, 섬유모세포는 10-cm 접시에서 증식 및 융합되었고, 접시당 ~1.5 x106 세포가 되었다. 융합 상태에서 3-5일 동안 배양한 후, 혈청 함유 배지를 제거하였고, 무혈청 배지를 추가한 다음, 세포를 혈청제거 DMEM에서 24시간 동안 유지시켰다. 이는 이전에 세포주기 G0 기에서 동기화된 세포로 입증된 것이다(Munger et al ., PLoS Pathog 2, e132 (Dec 15, 2006)). 세포를 모의 감염시키거나 또는 3.0 pfu/세포의 다중도에서 HCMV로 감염시켰다. 2시간 흡착기 이후, 접종물을 흡인하고 신선한 무혈청 DMEM을 가하였다. 대사 억제제 존재 시 HCMV 생장 측정을 위해 MRC-5 세포에 대한 표준 플라크 형성 측정법으로 바이러스 역가를 측정 하였다.
개 원위세뇨관 상피세포(MDCK 세포)를 ATCC로부터 획득하였고, 이를 7.5% 소태아혈청 및 포도당 4.5 g/L을 함유한 DMEM에서 배양하였다. MDCK 세포를 0.2% BSA, 0.01% CaCl2, 0.01% MgCl2, 1 ㎍/ml 트립신( Worthington) 및 0.1% FBS 함유 DMEM에서 A/WSN/33 인플루엔자 균주(ATCC)로 감염시켰다. 대사 억제제 존재 시 인플루엔자 A 생장 측정을 위해 MDCK 세포에 대한 표준 플라크 형성 측정법으로 바이러스 역가를 측정하였다.
대사 플럭스 실험 및 대사물 추출. 대사 플럭스 실험 중 실험 인공물을 제한하기 위해 가능한 대사 교란없이 표지 영양분을 세포에 주입하는 것이 중요하다. 배지 및 세포내 특정 대사물 수준이 시간흐름에 따라 변화하는 것이 발견되었으므로(Munger et al ., PLoS Pathog . 2, e132 ( Dec 15, 2006)), 모의 및 HCMV 감염 배양 배지를 흡인하고, 표지 도입 시 신선한 배지 변화로 인해 유도된 대사 변화를 방지하기 위해 감염 후24시간에 그리고 다시 감염 후 47시간에 신선한 DMEM(10mM HEPES을 포함)으로 대체하였다. 감염 48시간 후 모의 및 HCMV 감염 배양물 배지를 흡인하고, t=0 시점에서4.5 g/L 12C 포도당을 포함하는 DMEM(10 mM HEPES 포함) 또는 다른 시점에서 일반적으로 13C 표지 포도당 (Cambridge isotopes, http://www.isotope.com)을 4.5 g/L 포함한 DMEM(10 mM HEPES 포함)으로 대체하였다. -75℃에서 메탄올:물 80:20 (80% 메탄올)을 가하여 대사물을 추출하고, 배양 즉시, t=0 시점, 또는 배양후 0.5분, 1분, 2분, 5분, 15분, 30분, 60분, 또는 120 분에 각각을 가하였다. 대사 억제 후, 세포들을 드라이아이스 위에서 플라스틱 조직 배양 접시로부터 긁어 내었다. 결과로 얻어진 세포 현탁액을 교반하고, 6000 ×g에서 5분 동안 원심분리하였으며, 또한 -75℃에서 80% 메탄올로 2회 이상 재추출하였다. 세 개의 추출물을 혼합한 후, 표본을 질소 가스 하에서 완전히 건조시켰다. 이를 220 ㎕ 50% 메탄올에 용해시키고, 13,000 ×g에서 파편 제거를 위해 5분 동안 원심분리하였다. 또한 (다양한 처리 시간으로 인한 불안정 화합물 측정 시 인공물을 피하기 위해) 하기에 기술된 LC-MS/MS로 바이러스 감염 및 모의감염 표본을 분석하였다. 대사물 추출을 위한 배지 샘플 채취 시, 80:20 메탄올:배지 혼합물을 만들어내기 위해 -75℃에서 100% 메탄올과 채취한 배지를 혼합하였다. 그런 다음, 배지 표본을 원심분리하고, 위와 같이 건조 및 재현탁시켰다.
대사물 농도 측정. 질량분석기를 이용한 대사물의 절대 정량에는 내부 표준품의 추가가 필요하다. 중동위원소 표준은 가격이 비싸고 많은 관심 대사물의 경우 이용 가능하지 않다. 이러한 장애를 극복하기 위해 내부 표준으로서 13탄소 섬유모세포 대사 망을 12C-대사물 사용으로 대체하고자 하였다. 이를 위해, 12C-포도당 및12C-글루타민 결핍 DMEM에서 ~3 계대 배가 동안 일차 섬유모세포를 생장시켰으나, 13C-포도당 및13C-글루타민 초기 농도로 보충하였다. 탄소 대체의 효율성은 표 S1에 나타나 있다. 융합 상태에서 세포를 3일간 배양하였고, 상기에 나타낸 결핍 및 감염 혈청을 제외한 모든 배지는 13C-포도당 및13C-글루타민 함유 DMEM이었다. 표 S4에 나타낸 농도에서, 12C-대사물 내부표준 포함 -75℃ 80% 메탄올을 가하여 세포를 채취하였다. 대사물 농도 정량을 위해, 12C-내부 표준 및 13C-대사물 풀(pool) 모두의 SRM 최고점 높이를 측정하였다. 대사물 풀 농도를 특정 내부 표준 최고점 높이, 초기 내부 표준 농도 및 원 13C 대체의 효율을 계산하였다. 평균 3 독립 감염의 결과를 얻었다.
다양한 대사물의 섭취 및 배설 측정을 위해, 미배양 배지 또는 모의 또는 HCMV 감염 배지로부터의 표본을 감염 후 44시간에서부터 배양하고, 그런 다음 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 이후 채취하였다. 평균 6 독립 감염의 결과를 얻었다. 포도당 섭취 획득을 위해, 세포 배양 배지에서 포도당 농도 변화 측정을 위해 표준 혈당 측정기를 이용하였다. 글루타민, 아스파라진산 및 글루탐산 농도는 아래 개술한 SRM 최고점 높이로 측정하는 반면, 잘 분쇄되지 않는 젖산은 단일 이온 모드(SIM)로 측정하였다. 젖산, 글루타민, 아스파라진산 및 글루탐산의 알려진 농도의 13C 내부 표준을 80% 메탄올 추출 용매에 가하였다 (Cambridge isotopes, http://www.isotope.com).
해당작용 및 오탄당 인산 경로 추정. 해당작용과 오탄당 인산 경로 사이의 상대적 탄소 플럭스 추정은 크게 Lee et al ., Am J Physiol 274, E843 (May, 1998)에 기술되어 있다. 특히, MRC5 세포의 모의 또는 바이러스 감염 48시간 후, 조직 배양 배지를 흡인하였고, 30% 1,2-C13-포도당 및70% C12 포도당 (총 4.5 g/l 포도당) 함유 DMEM을 가하였다. 배양 4시간 후 세포를 상기와 같이 추출하였고, 1-C13-젖산 대1,2-C13-젖산의 상대적 농도를 질량분석기로 분석하였다. 산화 오탄당 인산 경로를 통한 젖산 생산의 상대적 비는 1-C13-젖산과 1,2-C13-젖산의 합에 의해 나누어진 1-C13-젖산 표지 젖산 분획과 동일한 것이다. 1-C13-젖산의 양을 자연 발생 존재 탄소-13 동위원소 1.1%로 보정하였다.
산화 대 카르복실화 결과에 의한 TCA 회로에 대한 피루브산 분포 추정. 피루브산의 아세틸-CoA로의 산화에서, 피루브산의 세번째 탄소는 피루브산 카르복실화 중 발생하지 않는 CO2로 유리된다. MRC5세포의 모의 또는 바이러스 감염 48시간 후, 조직 배양배지를 흡인하고 100% 3-C13-포도당 함유 DMEM을 가하였다. 3-C13-포도당 함유 DMEM 에서의 배양 6시간 후, 세포 대사물을 추출하고 상기와 같이 처리하였다. 3-C13 표지 TCA 구성요소의 상대적 양을 자연 존재 동위원소와 불완전 표지3-탄소 당분해 화합물로 보정하였다(세포가 3-C13-포도당만을 산화시키는 경우, 세 탄소 당분해 성분의 50%만이 포도당으로부터 3-탄소를 받을 것이다).
LC - MS / MS 기구. LC-MS/MS 양성 모드는 질량분석기와 결합된LC-10A HPLC 시스템(Shimadzu, http://www.shimadzu.com) 아미노프로필 컬럼(Phenomenex, http://www.phenomenex.com의 입자크기 3-㎛ 100 mm ×1 mm 또는 5-㎛ 250 mm x 2)을 사용하여 수행하였다. LC 매개변수는 다음과 같다: 자동 표본채집기 온도, 4℃; 주입 부피, 20 ㎕; 컬럼온도, 15℃; 그리고 유속, 100mm 컬럼의 경우 50 ㎕/분, 및 250 mm 컬럼의 경우 150 ㎕/분. 두 컬럼의 경우, LC 용매는 용매 A: 96:5 물:아세토니트릴(pH 9.45)에서 20 mM 아세트산 암모늄 + 20 mM 수산화 암모늄(pH 9.45); 그리고 용매 B: 아세토니트릴. 기울기는 100mm 컬럼의 경우 다음과 같다: t= 0, 85% B; t = 12, 0% B; t= 24, 0% B; t = 26, 85% B; t = 40, 85% B 그리고 250 mm 컬럼의 경우: t = 0, 85% B; t = 15 분, 0% B; t = 28 분, 0% B; t = 30 분, 85% B; t = 40 분, 85% B; 그리고 음성 모드_t = 0, 85% B; t = 15 분, 0% B; t = 38 분, 0% B; t = 40 분, 85% B; t = 50 분, 85% B.
LC-MS/MS 음성 모드는 (Luo et al ., J. Chromatogr . A 1147, 153 ( Apr 20, 2007))에 기술된 것을 약간 조정하여 수행하였다. 표본은 질량 분석기와 결합된 루나(luna) C18 컬럼(Phenomenex, http://www.phenomenex.com의 4 μM 입자크기 150 x 2 mm)와 LC-20 AD HPLC 시스템(Shimadzu, http://www.shimadzu.com)을 이용하여 분석하였다. LC 매개변수는 다음과 같다: 자동표본채집기 온도, 4℃; 주입부피, 20 ㎕; 컬럼온도, 25℃; 그리고 유속, 200 ㎕/분. LC 용매는 용매 A: 15 mM 아세트산, 97:3 물:아세트산(pH 4.95)에서 10 mM 트리부틸아민 그리고 용매 B: 메탄올. 기울기는 다음과 같다: t = 0, 0% B　; t = 5, 0% B; t= 10, 20% B　; t= 20, 20% B　; t = 35, 65% B; t = 38, 95% B　; t = 42, 95% B, t = 43, 0% B　; t = 50, 0% B.
질량 분석계 분석은 전자스프레이 이온화 (ESI)원이 장착된 Finnigan TSQ Quantum Ultra(양성 모드의 경우)에서 또는 Finnigan TSQ Discovery Max(음성 모드의 경우)에서 삼중-사중극자 질량 분석기(Thermo Electron Corporation, http://www.thermo.com)를 이용해 수행하였다. 두 모드의 경우, ESI 분무전압은 3,200V 였고, 질소는 피포(sheath)로서 사용되었으며, 보조 가스는 각각 20 psi와 10 psi에서 사용되었다. 아르곤은 325℃에서 설정된 모세관 온도와 1.5 mTorr에서 충돌가스로 이용하였다. 각 SRM 전송의 경우, 스캔 시간은 0.1 초였고, 스캔 폭은 1 m/z였다. LC 이동을 시간 구간으로 나뉘었고, SRM 스캔은 각 시간 구간에서 해당 시간 구간 동안 용출된 화합물에 제한하였다. 시간 구간 사이의 경계에서 용출된 화합물의 경우, 화합물에 해당하는 SRM 스캔은 양 시간 구간에서 수행된다. 기구 제어, 데이터 획득 및 데이터 분석은 크로마토그래피 시스템도 제어하는 Xcalibar 소프트웨어(Thermo Electron Corporation, version 1.4 SR1)로 시행하였다.
지질 합성 측정. 인지질 합성에 이용되는 포도당 양을 정량하기 위해 일차 섬유모세포를 12-공 배양접시에서 생장시킨 다음, 이를 3-5일 동안 유지시킨 후 혈청함유 배지를 제거하고 무혈청 배지를 첨가하였다. 24시간 동안 무혈청 DMEM에서 유지시킨 후, 세포를 모의 감염 또는 BADwt로 감염시켰다(MOI=3.0). 감염 48시간 후, D-[6-14C] 포도당 8 μC/ml를 1 g/ L포도당 함유 DMEM에서 모의 또는 바이러스 감염 세포에 가하였다. 37℃에서 4시간 동안 배양 후, 세포 배양 배지를 흡인하였고, 세포를 PBS로 세척한 다음, 헥산:이소프로파놀(3:2) 500 ㎕를 가하여 인지질을 추출하였다. 공(well)을 추가적 헥산:이소프로파놀(3:2) 400 ㎕로 세척하였다. 그런 다음, 인지질 추출물을 N2 가스 하에서 건조시키고, 90% 메탄올:물에서 500 ㎕ 1N KOH에서 재현탁시켰으며, 70℃에서 60분 동안 배양한 후, 100 ㎕ 2.5 m H2SO4를 가하였다. 지방산을 추출하기 위해 헥산 700 ㎕를 가하였다. 유기 및 수성 상(phase)을 원심분리하여 분리하고, 섬광을 계측하였다. 세 독립 감염 결과를 평균의 표준편차로 기록하였다.
6.1 예시 1: 바이러스 감염에 의해 상향조절된 대사 플럭스를 식별하기 위한 접근법
바이러스 복제는 숙주세포의 대사망에서 유래한 에너지와 고분자 전구체를 필요로 한다. 그러나 최근까지, 숙주 대사에 대한 바이러스 감염의 효과를 평가하는 기술은 충분하지 않았다.
바이러스는 다양한 경로를 통해 세포 대사 활성을 변화시킬 수 있다. 여기에는 mRNA 및/또는 단백질의 전사, 번역 및/또는 분해에 대한 영향, mRNA 및/또는 단백질의 재위치, 단백질 공유 수정, 그리고 효소 또는 다른 단백질의 알로스테리(allosteric) 조절; 그리고 그들의 활성을 조정하는 단백질 포함 복합물의 조성에 대한 변화가 포함된다. 상기 모든 변화의 순수 결과는 바이러스의 필요를 충족시키는 대사 플럭스의 조정이다. 따라서 대사 플럭스 변화는 숙주세포의 대사를 조정하려는 바이러스의 노력의 궁극적 결과를 나타낸다. 따라서, 바이러스에 의해 증가되는 플럭스는 특히 바이러스의 생존과 복제에 있어 중요하며, 이는 또한 유용한 약물 표적이 된다.
대사 플럭스 프로파일링을 위해 새로운 접근법이 개발되었다. 이 접근법은 이콜라이(E. coli)에서 질소 대사 플럭스를 측정하기 위한 것으로, Rabinowitz와 그 동료들(Yuan et al ., 2006, Nat. Chem. Biol. 2:529-530)에 의해 개발되었으며, 본 문서에 참고문헌으로 포함되어 있다. 이 동적 플럭스 프로파일링(KFP) 접근법의 핵심사항은 다음과 같다:
(1) 세포 (바이러스 비감염 또는 감염 모두)를 비표지영양분에서 동위원소 표지 영양분으로 신속히 전환시킨다(또는 역으로도 해당됨): 본 목적을 위해, 바람직한 영양분에는 균일하게 또는 부분적으로 13C-표지 또는 15N-표지 포도당, 글루타민, 글루탐산 또는 피루브산, 젖산, 글리세롤, 아세트산, 아스파라진산, 알기닌 및 요소를 포함하여 이에만 국한되지 않는 관련 화합물들이 포함된다. 표지에는 방사능 및 안정 표지 모두를 포함하여, 알려진 모든 H, C, N, O, P 또는 S 동위원소가 포함된다. 결과는 바이러스 부하 및 감염 후 시간을 포함한 숙주세포 유형 및 바이러스 병원체 사이의 상호작용에 따라 달라진다.
(2) 동위원소 전환 후 대사를 다양한 시점(예: 0.2분, 0.5분, 1분, 2분, 5분, 10분, 20분, 30 분 및 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 16시간, 24시간, 36시간, 48시간 또는 그 아단위 또는 변형)에서 중단한다. 대사를 중단시키는 편리한 방법들 중 하나는 끓는 용매를 포함한 다른 용매 및 온도 역시 가능하긴 하지만, 냉각(예: 드라이 아이스 온도) 메탄올을 첨가하는 것이다.
(3) 채취한 각 표본에서 동위원소 표지 정도를 포함한 대사화합물을 정량한다. 그러한 정량시 편리한 방법들 중 하나는 세포로부터 대사물을 추출하고, 추출물을 액상 일렬-크로마토그래피 질량 분석기(LC-MS/MS)로 분석을 시행하는 것이다. 적절한 추출 프로토콜과 LC-MS/MS 방법은 당업계에 익히 알려져 있다. 본 문서에 참고문헌으로 포함되어 있는 다음 인용문을 참고한다((Bajad et al, 2006, J Chromatogr. A 1125:76-88; Boiling and Fiehn, 2005, Plant Physiol. 139:1995-2005; Coulier et al, 2006, Anal Chem. 78:6573-6582; Kimball and Rabinowitz, 2006, Anal Biochem. 358:273-280; Lu et al, 2006, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17:37-50;Lu et al, 2007, J Am Soc Mass Spectrom. 18:898-909; Luo et al, 2007, J. Chromatogr. A 1147:153-164; Maharjan and Ferenci, 2003, Anal Biochem 313:145-154; Milne et al, 2006, Methods 39:92- 103; Munger et al, 2006, PLoS Pathog. 2:el32; Olsson et al, 2004, Anal Chem. 76:2453-2461; Rabinowitz and Kimball, 2007, Anal Chem. 79:6167-73; Schaub et al, 2006, Biotechnol. Prog. 22:1434-1442; van Winden et al, 2005, FEMS Yeast Research 5:559-568; Villas-Boas et al, 2005, Yeast 22:1155-1169.; Wittmann et al, 2004, Anal Biochem. 327:135-139; Wu et al, 2005, Anal Biochem. 336: 164-171; Yuan et al, 2006, Nat. Chem. Biol. 2:529-530).
(4) 세포 대사 플럭스 측정을 위해 결과 데이터를 분석한다.
KFP 데이터는 다음과 같은 원칙을 기초로 분석되며, 셀 대사 분야에서 숙련된 적용법으로 비감염 표본 대비 감염 표본 비교로 바이러스 감염과 연관된 플럭스 변화를 확인할 수 있다:
(1) 대사 네트워크에 첨가된 영양소에 더욱 가까운 대사물에 그 하류 산물이 생성되기 이전에 표지한다. 따라서 표지 양상은 특정 대사물 형성 시 취하는 경로 에 대한 통찰을 제공한다. 예를 들어, 표지되지 않은 세포로부터 균일한 13C-포도당으로의 전환에 있어 구연산보다 옥살로아세트산이 더욱 신속하게 표지되는 것은 삼카르복실산 회로의 시계방향 회전을 통해서라기 보다는 포스포에놀피루브산 카르복실라제 또는 포스포에놀피루브산 카르복시활성효소를 통한 옥살로아세트산의 형성을 의미할 것이다.
(2) 표지 속도는 풀(pool) 및/또는 작은 절대 풀 크기를 통한 대량 플럭스에서 기인한 대사물 풀의 신속한 표지와 함께 다양한 대사 경로를 통한 양적 플럭스에 대한 통찰을 제공한다. 영양소가 직접적으로 세포내 대사물로 변환되는 잘 혼합된 시스템의 이상적인 경우를 위해, 시스템의 다른 조정 없이, 동위원소 표지된 형태로 영양소의 순간 전환은 표지되지 않은 대사물의 시간의 흐름에 따른 소실을 초래한다:
dXU/dt = - fX XU / XT 식 (A)
XT는 대사물 X의 총 풀; XU 표지되지 않은 형태; 그리고 fX 는 대사물을 소비하는 모든 플럭스의 합. fX 와 XT 상수(즉, 동위원소 전환 전 가상 항정상태에서의 시스템),
XU/XT = exp (- fX t / XT) 식 (B)
및 fX = XT kX 식 (C)
kX는 비표지 대사물 소실을 위한 겉보기 일차속도상수이다. 식 (C)에 따라 대사물 X를 통한 총 플럭스는 실험을 통해 직접적으로 측정될 수 있는 두 매개변수를 토대로 측정될 수 있다: 대사물의 세포내 풀 크기와 비표지 형태의 소실율. 동위원소 전환이 순간적이지 않고 다소 더욱 복잡한 방정식이 필요한 경우, 전체 미분방정식은 여전히 분석적으로 해결될 수 있으며, 통상 두개의 자유 매개변수만을 포함한다. 이들 중 하나는 상기에 나타낸 것과 같은 총 대사물 플럭스를 직접적으로 산출하는 kX 이다(Yuan et al ., 2006, Nat. Chem. Biol. 2:529-530).
그러나, 분지 및 고리경로를 포함하는 특정 경우들에서는 수학은 더 복잡하게 되고 데이터분석을 용이하게 하기 위한 정교한 계산 알고리듬을 사용하는 것이 더 유익할 수 있다. 세포 대사 네트워크는 시간의 흐름에 따른 대사물에서의 변화(동위원소 표지 양상에서의 변화 포함)를 기술하는 미분 방정식 시스템으로 기술할 수 있다. 본 문서에 참고문헌으로 포함된 다음 인용문을 참고한다(Reed et al ., 2003, Genome Biol. 4:R54; Sauer, 2006, Mol. Syst. Biol. 2:62; Stephanopoulos, 1999, Metab. Eng. 1:1-11; Szyperski et al ., 1999, Metab. Eng. 1:189-197; Zupke et al ., 1995). 그러한 기술에 있어서 방정식의 형태는 상기 식 (A)와 유사하며, 대사물 농도와 표지 역학(가 항정상태에서의 XT 및 시간 함수로서 XU/XT )을 기술하는 실험적으로 관찰된 데이터를 기반으로 플럭스 fx1, fx2, 등을 위해 해결될 수 있다. 그러한 해법을 획득하기 위한 알고리듬의 한 적절한 부류는 본 문서에 참고문헌으로 포함되어있는 다음 인용문(Feng and Rabitz, 2004, Biophys. J. 86:1270-1281; Feng et al ., 2006, J. Phys. Chem. A. Mol. Spectrosc. Kinet. Environ. Gen. Theory 110:7755-7762)에 기술되어 있다.
일반적으로, 바이러스 감염에 의해 유발된 플럭스의 변화는 대사물의 전환과 비교시 다소 느리게 발생한다. 따라서, 항정상태 추정은 단시간에서 중간정도 시간척도(예: CMV의 경우 최대 ~2시간; 더욱 공격적 병원체는 일반적으로 더욱 짧은 시간 척도와 관련 되어 있으며, 정확한 시간 길이는 바이러스의 병원성의 특징에 따라 달라진다)에 대한 바이러스 교란 대사 네트워크에 일반적으로 적용된다.
항정상태에서, 선형 대사 경로의 모든 단계를 통한 플럭스는 동일해야 한다. 따라서, 만일 경로의 한 단계를 통한 플럭스가 바이러스 감염에 의해 현저히 증가되는 경우, 다른 단계를 통한 플럭스 역시 증가되는 경향이 있다. 그러나, 분지로 인한 복잡성이 발생한다. 분지효과가 작은 경우 측면 분지는 상대적으로 낮은 플럭스와 연관되어 있는 반면, 분지(비 항정상태 조건과 마찬가지로) 가능성은 생존 가능한 약물 표적으로서 다른 경로 단계를 관련시키기 위한 단 하나의 측정 경로 플럭스 보다 더욱 많은 실험 데이터가 필요함을 나타낸다. 그러나, 경로의 상위 및 하위 흐름 단계 모두에서의 증가된 플럭스가 실험으로 증명되는 경우, (측정되지 않은) 중간 단계에서의 흐름 역시 증가한다는 것에 대한 신뢰성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 문서에서 유효한 항 바이러스 약제 표적으로서 중간 단계 플럭스 (및 관련 촉매작용 효소)를 검증하기에 적당한 상위 및 하위 흐름 단계 모두에서의 (단, 개별적이 아닌, 선택된 실시예에서) 플럭스가 증가됨을 입증하고자 하였다.
6.2 예시 2: 인간 거대세포 바이러스에 의한 글리세롤-3-인산 탈수소효소, 구연산 수송 단백질, 및 구연산 분해효소 플럭스의 상향조절
본 문서에 기술된 동적 플럭스 프로파일링(KFP) 접근법을 일차 인간 포피 섬유모세포의 인간 거대세포 바이러스(CMV) 감염에 의해 유발된 탄소 대사 플럭스 변화 시험에 사용하였다. 균일하게 13C 표지된 포도당을 동위원소 추적자로 사용하였다. 다음의 해당작용 및 해당작용 관련 대사물의 경우, 농도가 감염 후 48시간(hpi)에 실질적으로 증가하였고(비감염, 무활동 섬유모세포와 비교시) 동위원소 표지 속도는 변화하지 않거나 또는 증가하였다. 육탄당 인산(포도당-6-인산, 포도당-1-인산, 및 과당-6-인산을 포함한 대사물로부터의 결합 신호), 과당 이인산, 글리에르알데하이드-3-인산, 포스포에놀피루브산, 그리고 아세틸-보효소 A. 농도 증가 및 전환속도의 무변화 또는 증가의 결합은 대사 플럭스의 증가를 의미하였다 (식 C 참고).
글리세롤-3-인산의 표지, 인지질, 디아실글리세롤 및 트리글리세리드 형성에 필요한 해당작용 부산물 역시 CMV 감염에 의해 증가한 것으로 확인되었다. 이는 CMV 감염에 의해 글리세롤-3-인산 탈수소효소 플럭스가 유발되었음을 나타내었다.
구연산 회로 구성성분의 표지 역시 검사하였다. 그 결과를 도 2A에 요약하였고, 특별히 중요한 두 대사물, 구연산과 말산의 전체 데이터는 도 2B에 나타내었다.
CMV 감염으로 인한 말산 표지의 병행 증가 없이 구연산 표지가 현저히 증가하는 것에 대한 관찰은 바이러스에 의해 유발된 구연산 수송 단백질 및 구연산 분해효소 플럭스의 급격한 상향조절을 위한 진단적인 것이었다: 총 구연산 농도는 실질적으로 변화하지 않았던 것으로 보아(즉, 비 표지 구연산 농도는 표지 구연산 농도의 증가와 병행하여 감소하였다), 바이러스에 의해 상향조절되었던 구연산으로부터 유출이 있었음이 분명하다. 이러한 유출은 표지된 케토글루타레이트, 숙신산 또는 말산을 생성시키지 않았음이 분명하다(이들 종류의 신속한 표지는 관찰되지 않았다). 따라서, 이러한 유출은 동위구연산에서 케토글루타레이트(TCA 회로; 표지된 케토글루타레이트, 숙신산 및 말산으로부터 형성) 또는 동위구연산에서 숙신산(글리옥실산 회로; 표지된 숙신산 및 말산으로부터 형성)를 통할 수 없다. 마지막으로 남은 가능성은 아래 기술한 단계를 통한 세포질 아세틸-CoA + 말산 염으로의 유출강화였다.
(1) 미토콘드리아 구연산 운반 단백질은 미토콘드리아 내막을 통한 말산을 위한 양성자와 구연산의 교환을 촉매한다.
(2) 세포질내 구연산 분해효소는 구연산 + ATP + CoA + 물 → 아세틸-CoA + ADP + Pi + 옥살로아세트산 반응을 촉매한다.
(3) 결과로 생성되는 옥살로아세트산은 세포질 말산 탈수소효소에 의한 NADH에 의해 말산으로 환원된다.
글리옥실산 회로 또는 TCA 회로와는 달리, 이들 단계에서는 2C-표지 구연산으로부터 비표지 말산을 형성한다(미토콘드리아내 비표지 옥살로아세트산과 AcCoA[아세틸 부분 표지]의 농축에서 기인한 구연산의 표지와 함께; 구연산 합성효소 촉매 옥살로아세트산[비표지]과 아세틸-CoA[아세틸 기 표지] 농축에 의해 생성된 구연산과의 일치를 위한 MS/MS 분석으로 CMV 감염에 의해 유발된 구연산 표지 양상이 확인되었다).
결과로 생성되는 세포질 말산은 이후 NADP+ 결합 말산 효소(말릭 효소로도 알려져 있음)에 의해 피루브산 + NADPH로 전환될 수 있다.
이 과정의 단계 (1)과 (2)가 필수적인 것과 마찬가지로, 도 2에서 관찰된 데이터는 구연산 수송 단백질과 구연산 분해효소 플럭스의 증가가 CMV에 의해 유발됨을 입증하였다.
6.3 예시 3: 인간 거대세포바이러스에 의한 글루탐산분해효소 및 글루탐산 탈수소효소 플럭스의 상향조절:
본 예시에서는, 균일하게 13C-표지된 글루타민을 동위원소 추적자로 사용하였다. 비감염, 무활동성 섬유모세포 대비 CMV 감염 후 48시간에 섬유모세포에서 TCA 회로 구성요소 케토글루타레이트, 숙신산, 푸마린산 및 말산 뿐 아니라 아미노산 글루타메이트의 표지 동태를 관찰하였다. CMV 감염 표본에서 대사물의 농도가 증가하였고 동위원소 표지율 역시 증가하였다. 표지 글루타민)으로부터 표지 글루탐산(그리고 케토글루타레이트, 숙신산 및 말산과 같은 TCA 회로의 하류흐름) 형성은 글루탐산 분해효소를 통한 플럭스를 포함한다. 따라서, KFP 데이터는 글루탐산 분해효소 플럭스의 증가를 입증하였다. 글루탐산은 이후 글루탐산 탈수소효소에 의 해 케토글루타레이트로 전환함이 분명하므로, 따라서, KFP 데이터는 글루탐산 분해효소 플럭스의 증가를 입증하였다. 인간 게놈에서 글루탐산 탈수소효소에는 글루탐산 탈수소효소 I 과 글루탐산 탈수소효소 II의 두가지 형태가 있으며, 이들 각각은 케토글루타레이트 + 암모니아를 형성하기 위해 글루탐산의 탈아미노작용에서 NADH와 NADPH를 생성한다.이들 데이터를 토대로, 글루탐산 분해효소와 2 가지 형태의 글루탐산 탈수소효소는 새로운 항바이러스 약제의 표적이 되며, 억제제의 감염 개체에의 전달은 바이러스 감염치료 방법을 구성한다. 글루탐산 탈수소효소를 통한 플럭스의 증가는 특히 흥미로운데, 이는 형성된 NADPH가 지방산 생합성의 환원단계를 가능하게 하기 때문이다. 따라서 글루탐산 탈수소효소 II의 억제는 지방산 생합성을 차단하고 따라서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 구성한다.
6.4 예시 4: 인간 거대세포 바이러스에 의한 유리지방산 및 지질의 생합성 상향조절
본 예시에서는, 14C-표지 포도당을 동위원소 추적자로 이용하였고 질량분석기에 의해서보다는 방사능(섬광계측에 의해 측정하는 것으로서)을 토대로 대사물 하류흐름의 표지를 측정하였다. 표적 대사물은 유리(즉, 단백질과 공유결합하지 않은) 지질 및 지방산의 총 풀(pool)이었으며, 이를 클로로포름-에틸 아세트산 혼합물과 같은 소수성(hydrophobic) 용매를 사용한 추출법으로 다른 세포 화합물(특히 단백질과 공유결합된 지질을 포함하여)로부터 분리하였다. CMV 감염은 도 3에 나타낸 바와 같이 표지 포도당으로부터 유리 지질 및 지방산으로의 플럭스를 증가시켰 다. 따라서 지방산 생합성 억제(예컨대 단백질 팔미토일레이션(palmitoylation)과 같은 지질에 의한 단백질의 공유변화 억제로부터 구별되는 것으로서, 지질 및 유리지방산 생합성 억제를 제한하지 않는 것을 포함하여)는 바이러스 감염 치료법을 구성한다. 지방산 생합성은 지방산 합성효소(그 아실 담체 단백을 포함하여)에 의존하므로, 이들 데이터는 지방산 생합성이 항바이러스 약제의 표적임을 입증한다.
6.5 예시 5: 항바이러스제의 표적으로서 지방산 합성효소의 유효성 확인
CMV와 단순포진 바이러스 1(HSV-1)의 복제능을 지방산 합성효소 억제제 C75 부재 대비 존재시 측정하였다. 세룰레닌(cerulenin)과는 달리 C75는 단백질 팔미토일레이션(palmitoylation)을 직접적으로 억제하지 않는다는 것에 주목한다. 5 - 10 μM C75로의 치료는 CMV와 HSV-1 모두의 역가의 100배 이상을 감소시킨다. 이러한 결과는 단백질 팔미토일레이션과 대비적으로, 항바이러스제 표적으로서의 지방산 합성효소를 검증하였다.
6.6 예시 6: 항바이러스제 표적으로서 아세틸 CoA 카르복실라제의 동정
구연산 분해효소 플럭스 및 지방산 합성효소 플럭스 모두가 인간 섬유모세포의 CMV 감염에 의해 증가하였다는 것의 관찰은 플럭스 균형 제한을 토대로 아세틸 CoA 카르복실라제의 중간 플럭스 역시 증가되었음을 의미한다. 아세틸 CoA 카르복실라제 플럭스의 증가에 대한 발견은 아세틸 CoA 카르복실라제가 항바이러스제의 표적이 됨을 의미하였다.
6.7 예시 7: 거대세포바이러스 감염에 의해 유도된 효소 전사 변화의 측정.
모의 감염 또는 CMV 감염 4시간, 24시간, 48시간 또는 72시간 이후 제조사(Invitrogen, 캘리포니아 카리스바드)의 권장사항에 따라, 트리졸(Trizol)을 사용하여 RNA를 준비하였고, 이어서 RNAeasy 컬럼(Quiagen, 캘리포니아 발렌시아)을 통해 정제하였다. 제조사의 지시서에 따라 로우 RNA 선형 증폭(Low RNA Linear Amplification 키트 (Agilent, 캘리포니아 팔로알토)를 사용하여 대조 RNA 세트(Clontech의 인간 표준품 총 RNA) 뿐 아니라 모든 표본으로부터 형광 cRNA (Cy3 and Cy5)를 준비하였다. 독립적 복제 표본을 역 염색하였고 표본 cRNA를 선택적으로 표지된(Cy3 대 Cy5) 대조 cRNA와 혼합하였으며 제조사(Agilent, 캘리포니아 팔로알토)의 지시사항에 따라 인간 전체 게놈 올리고 마이크로어레이(Human Whole Genome Oligo Microarray)에 부합시켰다. Agilent 스캐너(모델 #G2505B)로 슬라이드를 스캔하고 Feature Extractor 7.5 소프트웨어로 데이터를 추출하였다. 결과 데이터 파일을 Genespring GX 7.3에 입력하였다. 기록된 형광값을 활동적 교차유전자 오류 모델로 내정값인 칩당(per-chip) 및 유전자당(per-gene) Lowess 정규화를 수행하였다. 형광신호 존재 또는 미확인을 표시한 탐색자(probe) 세트만을 검사하였다. 탐색자 세트를 이후 제어채널 발현으로 여과하였고, 33형광단위 이하의 cRNA 제어신호를 갖는 모든 탐색자는 분석하지 않았다. 모의감염의 경우 24시간, 48시간 및 72시간 시점 및 CMV 감염의 경우 24시간, 48시간 및 72시간 시점을 그룹화한 매개변수로서, 모의 대 CMV 감염을 사용하여 나머지 탐색자에 대한 분산분석(ANOVA)를 이후 시행하였다. 4시간 시점에서의 모의 및 CMV 감염 대사 유전자 간 변화가 거의 없었으므로 4시간 시점은 제외하였다. 0.05를 P값의 기준점으로 하여 Benjamini/Hochberg 다중시험 보정과 오류모델 분산을 이용하여 Welsh ANOVA 분석을 시행하였다. 이러한 P 기준값을 충족시키는 알려진 또는 의심되는 효소를 표 6에 기재되어 있다.
구연산 분해효소, 아세틸 CoA-카르복실라제, 지방산 합성효소, 글루탐산 분해효소, 글루탐산 탈수소효소 I 또는 II, 혹은 글리세롤-3-인산 탈수소효소의 경우 유의한 효과가 확인되지 않았다. 전사 데이터를 토대로 이들 효소의 확인 실패는(이들의 반응을 통한 플럭스의 증가가 KFP로 증명되었음에도 불구하고) 대사작용내 항바이러스 약제 표적 확인을 위한 전사 프로파일링과 같은 이전의 방법이 불충분함을 증명한다. 이는 본 문서에 기술된 KFP 접근법을 통해 선택된 표적의 예기치 못한 특성 및 신규성(novelty)을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 바이러스에 의해 전사적으로 상향조절된 효소는 역시 그 자체로 항바이러스 약제 표적이 된다. 지질 생합성을 유도하기 위한 NADPH 생성과 관련된 효소인 말릭 효소 1은 바이러스에 의해 전사적으로 상향조절되었음에 주목한다.
Figure 112009082238916-PCT00325
Figure 112009082238916-PCT00326
6.8 예시 8: 화합물의 HSV 및 HCMV의 바이러스 복제 억제
이러한 예시들은 HSV 및/또는 HCMV의 바이러스 복제 감소에 있어서 지방산 합성효소 억제제, 즉, C75, 트랜스-4-카르복시-5-옥틸-3-메틸렌-부티로락톤, 그리고 카르니틴 팔미토일 전이효소1(CPT-1) 억제제, 즉, 에토목서의 유효성을 입증한다.
6.8.1 C75 의 단순포진바이러스( HSV ) 복제 억제
일차 섬유모세포(MRC-5 세포)를 7.5% FBS 함유 DMEM(고 포도당)에서 증식시켰다. 감염 전 24시간, 세포를 DMEM(무혈청)에서 배양함으로써 세포로부터 혈청을 결핍시켰다. 이후, C75(5 ㎍/ml) 또는 담체(DMSO) 당량 존재시 세포당 5.0 플라크 형성 단위(PFU)의 다중도에서 세포를 감염시켰다. 37℃에서 바이러스 흡착 2시간 후, 바이러스 접종물을 흡인하였고 미결합 바이러스를 불활성화시키기 위해 낮은 PH의 구연산 나트륨 완충제(40mM 구연산나트륨, 10 mM KCl, 135 mM NACl, pH 3.0)로 세포를 1회 세척하고 이후 C75(5 ㎍/ml) 또는 담체 당량을 포함한 증식 배지 첨가 전 PBS 완충제로 1회 세척하였다. 감염 섬유모세포 배양물을 감염후 48시간에 채취하고 베로 세포에서 표준 플라크 형성 측정법으로 바이러스 역가를 측정하였다. 도 4에 나타낸 것과 같이 C75는 바이러스 복제를 2 로그 이상 감소시켰다.
6.8.2 C75 의 인간 거대세포바이러스 ( HCMV ) 복제 억제
일차 섬유모세포(MRC-5 세포)를 7.5% FBS 함유 DMEM(고 포도당)에서 증식시키고, C75 (10 ㎍/ml) 또는 담체(DMSO) 당량 존재시 세포당 3.0 플라크 형성 단위의 다중도에서 감염시켰다. 37℃에서 바이러스 흡착 2시간 후, 바이러스 접종물을 흡인하였고 미결합 바이러스를 불활성화시키기 위해 낮은 PH의 구연산 나트륨 완충제(40mM 구연산나트륨, 10 mM KCl, 135 mM NACl, pH 3.0)로 1회 세척하고 이후 C75(10 ㎍/ml) 또는 담체 당량을 포함한 증식 배지 첨가 전 PBS 완충제로 1회 세척하였다. 감염된 섬유모세포 배양물을 감염 72시간 후 수확하였으며, MRC-5 세포에서의 표준플라크시험법을 통해 바이러스 역가를 확인하였다. 도 5에 나타낸 것과 같이 C75는 바이러스 복제를 3로그 이상 감소시켰다.
6.8.3 에토목서의 HCMV 복제 억제
카르니틴 팔미토일 전이효소 1(CPT-1)인 에토목서(Etomoxir)는 체외 바이러스 복제 측정법에서 HCMV에 대해 항 바이러스 작용을 갖는다. 에토목서(5 μM) 또는 담체(DMSO) 당량 존재하에 HCMV (AD169, 1.0 감염 다중도) 감염 전 24시간동안 일차 섬유모세포를 혈청 결핍시켰다. 감염된 섬유모세포 배양물을 감염 후 96시간에 채취하고 바이러스 역가를 표준 플라크 형성 측정법으로 측정하였다. 도 6에 나타내었듯, 에토목서는 바이러스 복제를 1로그 이상 감소시켰다.
6.9 예시 9: CMV에 의한 대사 플럭스 조정
6.9.1 CMV 감염 유도 당분해 및 관련 화합물의 대사 플럭스
도 7은 모의 감염 대 CMV 감염 인간 섬유모세포에서 (A) 해당작용(경로발생 순서로)와 (B) 관련 화합물의 표지 동태를 나타낸다. t = 0 분에서 발생하는 비표지 포도당으로부터 균일하게 표지된 포도당으로 전환한 균일한 13C-포도당을 사용하여 표지를 수행하였다. 바이러스 감염 세포의 경우 "1"로 표지하고 모의감염 세포의 경우 "2"로 표지하였다. 정사각형 입체는 동위원소 전환 후 감소하는 비표지 화합물(균일한 12C) 수준을 나타낸다. 개방원은 동위원소 전환 후 증가하는 부분적으로 또는 완전히 13C-표지된 화합물을 나타낸다. 본 도면에 나타낸 화합물 각각의 경우, 표지 화합물의 주요 형태에는 완전한 표지(균일한 13C)가 포함되었다. 비표지 형태의 더욱 급격한 감소와 표지된 형태의 급격한 증가는(리보스 인산을 제외한 화합물의 경우) 감염된 세포에서의 신속한 해당작용 플럭스 및 글리세롤 인산 플럭스를 나타낸다.
6.9.2 CMV 감염 유도 뉴클레오티드 3인산 및 그 전구체 PRPP 의 대사 플럭스
도 8은 모의 감염 대 CMV 감염 인간 섬유모세포에서 뉴클레오티드 3인산 및 그 전구체 PRPP의 표지 동태를 나타낸다. t = 0 분에서 발생하는 비표지 포도당으로부터 균일하게 표지된 포도당으로 전환한 균일한 13C-포도당을 사용하여 표지를 수행하였다. 바이러스 감염 세포의 경우 "1"로 표지하고 모의감염 세포의 경우 "2"로 표지하였다. 정사각형 입체는 동위원소 전환 후 감소하는 비표지 화합물(균일한 12C) 수준을 나타낸다. 개방원은 동위원소 전환 후 증가하는 부분적으로 또는 완전히 13C-표지된 화합물을 나타낸다. PRPP의 경우, 표지 화합물의 주요 형태에는 완전한 표지(균일한 13C)이 포함되었다. ATP와 UTP의 경우, 염기 부분이 종종 완전히 표지되지 않는데 반해, 리보스 부분은 전체적으로 완전히 표지되었다. 비표지 형태의 더욱 급격한 감소와 표지된 형태의 급격한 증가는 감염된 세포에서의 더욱 신속한 뉴클레오티드 생합성 플럭스를 나타낸다.
6.9.3 CMV 감염 유도 TCA 회로 화합물의 대사 플럭스 : 포도당 표지
도 9는 (A) TCA 회로 화합물의 표지 동태 및 (B) 이들 화합물의 표지 분획(비례 표지=[표지 량]/[표지량 +완전 비표지량])을 나타낸다. 그 결과는 모의 감염 대 CMV 감염 인간 섬유모세포에 대한 것이다. t = 0 분에서 발생하는 표지되지 않은 포도당으로부터 균일하게 표지된 포도당으로의 전환과, 균일한 13C-포도당을 사용하여 표지를 수행하였다. (A) 부분에서 바이러스 감염 세포의 경우 "1"로 표지하고 모의감염 세포의 경우 "2"로 표지하였다. 다시 (A) 부분에서, 정사각형 입체는 동위원소 전환 후 감소한 비표지 화합물(균일한 12C) 수준을 나타내며, 개방원은 동위원소 전환 후 증가한 2x13C 원자 (표지형태 우세) 포함 말산 및 구연산 농도를 나타낸다. 비표지 형태의 더욱 신속한 감소와 표지 형태의 신속한 증가는 감염 세포에서 TCA 회로의 더욱 빠른 플럭스를 나타낸다. 그러나 가장 두드러지는 결과는 새 로운 지방산 생합성에 구연산이 실질적으로 사용됨(구연산 분해효소와 AcCoA 카르복실라제를 통해)을 나타내는, 구연산 표지가 말산 표지를 훨씬 상회한다는 것이다.
6.9.4 CMV 감염 유도 TCA 회로 화합물의 대사 플럭스 : 글루타민 표지
도 10은 (A) TCA 회로 화합물의 표지 동태 및 (B) 이들 화합물의 표지 분획(비례 표지=[표지 량]/[표지량 +완전 비표지량])을 나타낸다. 그 결과는 모의 감염 대 CMV 감염 인간 섬유모세포에 대한 것이다. 균일한 13C-글루타민을 사용하여 표지와 t = 0 분에서 발생하는 균일하게 표지된 13C-글루타민으로 균일하게 표지되지 않은 글루타민으로부터의 전환을 수행하였다. (A) 부분에서 바이러스 감염 세포의 경우 "1"로 표지하고 모의감염 세포의 경우 "2"로 표지하였다. 다시 (A) 부분에서, 정사각형 입체는 동위원소 전환 후 감소한 비표지 화합물(균일한 12C) 수준을 나타내며, 개방원은 동위원소 전환 후 증가한 부분적 또는 완전 표지된 화합물 수준을 나타낸다. 비표지 형태의 더욱 신속한 감소와 표지 형태의 신속한 증가는 감염 세포에서 TCA 회로의 더욱 빠른 플럭스를 나타낸다. 구연산과 말산(구연산 표지보다 다소 더 신속하게 발생하는 말산 표지와 함께)의 표지 동태는, 이전 페이지(이들 화합물의 포도당 표지와 관련된)에서의 결과와 함께, 포도당이 아닌 글루타민이 TCA 회로에서 케토글루타레이트에서 옥살로아세트산으로의 시계방향 회전을 유도하는 일차적 연료임을 나타낸다.
6.9.5 CMV 감염 세포에서 중앙 탄소 대사 흐름의 개략도식
도 11은 바이러스 감염 세포에서 중앙 탄소 대사 흐름의 개략도식을 나타내며(개략도식 작성에 CMV로부터의 데이터를 사용하였으나, 개략도식은 신속 증식 외피보유 바이러스에 적용되어야 한다), 어둡게 표시된 부분은 대사흐름으로부터 형성된 포도당과 대사물을, 그리고 어둡게 표시되지 않은 부분은 형성된 글루타민과 대사물을 나타낸다. 구연산은 글루타민과 포도당 모두로부터 탄소를 받지만 지질 생합성에 사용되는 것은 포도당의 탄소이다.
6.10 예시 10: 바이러스 감염에 대한 세포 반응의 통합 대사 및 플럭스 분석
도 12는 목표, 대사물 및 플럭스 측정 방법, 바이러스 감염으로 인한 대사 항상성 붕괴 여부 분석, 전사 관여 여부 측정, 바이러스 감염의 (플럭스 및 관련 대사물 농도와 관련된) 해당 작용에 대한 영향 분석을 포함하여, 바이러스 감염에 대한 세포반응의 통합적 대사 및 플럭스 분석의 개요를 제공한다. 본 문서에 제공된 데이터는 바이러스 감염으로 지질 생합성을 유도하기 위해 해당작용을 상향조절할 수 있음을 나타낸다. 따라서 바이러스 감염에 의한 지질생합성을 차단함으로써 바이러스 복제를 억제할 수 있다.
6.11 예시 11: HCMV 복제 억제에서의 C75 와 TOFA의 용량 반응
일차 섬유모세포(MRC-5 세포)를 10% FBS 함유 DMEM (고 포도당)에서 증식시키고 세포당 3.0 판 형성단위 다중도에서 감염시켰다. 사용된 HCMV는 바이러스 역가 측정을 용이하게 하기 위한 녹색 형광 단백질 제공자를 전달한다는 것을 제외하면 야생형 바이러스였다. 감염은 37℃에서 1.5시간동안 진행하였다. 이후, 바이러 스 접종물을 흡인하고 세포를 미결합 바이러스와 세포표면에 남아있는 바이러스 입자를 불활성화시키기 위해 낮은 pH의 구연산나트륨 완충제로 1회 세척하고 이후 C75 또는 TOFA 지정 농도 또는 담체(DMSO) 일당량을 포함하는 신선 DMEM + 10% FBS 첨가전 PBS 완충제로 1회 세척하였다. 감염 후 72시간에 세포 및 상등액 화합물을 모두 채취함으로써 감염 섬유모세포 배양물을 채취하고 MRC-5 세포에서 표준 플라크 형성 측정법(녹색 형광 판과 함께)으로 바이러스 역가를 측정하였다. 도 13에서 볼 수 있듯이, 약물 농도가 더 높으면 더 많은 효과를 나타냈지만, 두 약제 10 ㎍/mL는 바이러스 복제를 대략 1로그 감소시키는데 적합하였다. 도 13에서의 오차막대는 복제측정의 표준편차를 나타낸다.
6.12 예시 12: HCMV 복제 억제에서 TOFA의 용량 반응.
일차 섬유모세포(MRC-5 세포)를 10% FBS 함유 DMEM (고 포도당)에서 증식시키고 세포당 3.0 판 형성단위 다중도에서 감염시켰다. 사용된 HCMV는 바이러스 역가 측정을 용이하게 하기 위한 녹색 형광 단백질 제공자를 전달한다는 것을 제외하면 야생형 바이러스였다. 감염은 37℃에서 1.5시간동안 진행하였다. 이후, 바이러스 접종물을 흡인하고 TOFA 지정 농도 또는 담체(DMSO) 일당량을 포함하는 신선 DMEM + 10% FBS 첨가전 PBS 완충제로 1회 세척하였다. 감염 후 72시간에 유리된 바이러스(상등액에서 발견된)만을 채취함으로써 감염 섬유모세포 배양물을 채취하고 MRC-5 세포에서 표준 플라크 형성 측정법(녹색 형광 판과 함께)으로 바이러스 역가를 측정하였다. 도 14에서 볼 수 있듯이, 약물 농도가 더 높으면 더 많은 효과를 나타냈지만, 20 ㎍/mL의 TOFA는 바이러스 복제를 대략 2로그 감소시키는데 적합하 였다. 도 14에서의 오차막대는 복제측정에서의 표준편차를 나타낸다.
6.13. 예시 13: HCMV 및 인플루엔자 A 바이러스의 복제에 대한 C75와 TOFA의 효과.
HCMV 증식을 위해, MRC-5 섬유모세포(ATCC로부터 획득한)를 7.5% 소태아 혈청 및 4.5g/L 포도당을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양하였다. 인간 거대세포 바이러스의 모든 감염은 HCMV의 AD169균주 인공 세균 염색체(BAC) 클론 으로부터 도출된 BADwt로 수행하였다(Giaever et al ., Nature 418, 387 ( Jul 25, 2002 ) 참고). 어떠한 바이러스 서열도 삭제하지 않고, BAC를 HCMV 게놈에 삽입하였고, loxP 부위에서의 재조합을 매개하는 상호 전달 감염된 CRE 재조합 효소로 바이러스 클론에서BAC 측부에 위치한 1oxP부위만을 남기고 절단하였다. 이 클론은 다양한 분석법으로 시험되어 왔으며, 항상 야생형 AD169 표현형을 나타내었다. 바이러스 역가는 MRC-5세포에서 표준 플라크 형성 측정법으로 측정하였다.
인플루엔자 A 증식을 위해, 개 원위세뇨관 상피세포(MDCK 세포)를 ATCC로부터 획득하였고 이를 7.5% 소태아혈청 및 포도당4.5 g/L을 함유한 DMEM에서 배양하였다. MDCK 세포를 0.2% BSA, 0.01% CaCl2, 0.01% MgCl2, 1 ㎍/ml 트립신(Worthington) 및 0.1% FBS 함유 DMEM에서 A/WSN/33 인플루엔자 균주(ATCC)로 감염시켰다. MDCK 세포에서 표준 플라크 형성 측정법으로 바이러스 역가를 측정하였다.
도 15A 및 도15B는 (A) HCMV (MOI = 3.0) 와 (B) 인플루엔자 A (MOI = 0.1) 의 복제에 대한 담체(DMSO)의 효과 대비 TOFA(10 ㎍/mL), C75 (10 ㎍/mL)의 효과를 나타낸다. 이들 측정법에서, 바이러스를 숙주세포에 가함과 동시에 C75 또는 TOFA(10 ㎍/mL)를 첨가하였다. HCMV 감염을 96시간동안 진행하였고, 비리온을 채취한 후 판 형성측정법으로 계측하였다(도 15A). 인플루엔자 A의 경우, 비리온 채취전 24시간동안 감염을 진행하였고, 이후 플라크 형성측정법으로 비리온을 계측하였다(도 15B). 도 15A는 담체, TOFA(10 ㎍/mL) 또는 C75(10 ㎍/ml) (평균 + 표준편차) 존재시 고 감염 다중도(MOI=3.0) 96시간 후 감염성 HCMV 비리온 생성을 나타낸다. 도면 15B는 담체, TOFA(10 ㎍/mL) 또는 C75(10 ㎍/ml) (평균 + 표준편차) 존재시 감염 24시간 후(MOI=0.1) 감염성 인플루엔자 A 비리온 생산을 나타낸다. 도 15A 및 도 15B는 10 ㎍/mL TOFA가 HCMV복제를 1000배 이상 감소시키며, 인플루엔자 A 복제를 1000배 이상 감소시켰음을 나타낸다. 10 ㎍/mL C75는 HCMV를 100배 이상 감소시키며, 인플루엔자 A 복제를 10배 이상 감소시켰다.
6.14 예시 14: 바이러스 감염 세포 _대 비감염 세포에서 양적 대사물 농도 및 플럭스 추정을 위한 실험 및 계산의 통합
본 예시는 본 문서에서 기술된 방법 그리고 질량분석기와 핵자기공명스펙트럼법을 이용하여 바이러스 감염 및 비감염세포에서 대사물 농도 및 동위원소 표지 양상에 관한 다양한 데이터 유형을 수집하기 위한 능력을 기반으로 한다. 본 예시는 예시적 계산 프레임워크(framework)를 기술하는데서 시작하여 이후 데이터를 프레임워크로 통합하여 HCMV 감염을 위해 획득된 결과를 기술한다. 일반적인 실험 및 계산 도식은 더 많은 그리고/ 또는 다양한 대사의 구성성분에 대한 연구뿐 아니라 다른 숙주세포 및 바이러스 연구에 이용될 수 있다.
플럭스 균형을 유지하기 위해 작성된 68개의 미분방정식으로 구성된 도 16에 나타낸 회로도를 토대로 중앙 탄소대사의 상미분방정식(ODE)을 구성하였다. 모델의 방정식은 U-13C 포도당 또는 U-13C 글루타민 배지에서 대사물의 비표지 형태의 소실율(그리고 특정 표지 형태의 생성)을 기술하였다. 플럭스가 두 경우 모두에서 동일한 것으로 추정되었지만, 포도당 및 글루타민 표지 경우를 기술하는데 별도의 방정식을 사용하였다. 모델에서 양함수로 포함된 표지 형태는 (각각 2, 3, 4, 또는 5 13C-원자 처리된)구연산, (각각 1, 2, 3, 또는 4 13C-원자 처리된) 케토글루타레이트 및 글루탐산, 그리고 (각각1, 2, 또는 3 13C- 원자 처리된) 말산, 옥살로아세트산 그리고 아스파라진산이다. 포도당 섭식(feeding)이 글루타민 섭식보다 TCA 구성성분의 부분적 표지에 대한 정보를 더 많이 산출하므로, 글루타민 표지 포함물 역시 가능함에도, 본 예시에서는 부분 표지 형태 처리는 포도당 섭식으로 제한하였다. 부분 표지 형태간 반응은 알려진 관련 효소 작용에 따라 측정하였다 (표 10).
상기 모델은 20 매개변수로 구성되었다. 12 세포내 플럭스, 2 영양소 섭취 속도, 2 배설 속도, 그리고 4 세포내 농도, 이들은 본 문서에서 직접 실험으로 측정되지 않았었다(포도당, 글루타민 및 옥살로아세트산, 그리고 해당작용으로 분리된 육탄당인산 풀의 일부). 도 11에 나타낸 추가적 세포내 플럭스는 상기 기술한 16 플럭스들의 선형 조합으로 감소하였다.
비용함수로 측정된 것처럼, 실험 관측값과 모의결과 간 차이를 최소화하는 매개변수를 찾기 위한 전체적 반전 알고리듬으로 매개변수들(플럭스 및 미측정 농도)을 확인하였다. 최소화는 Massachusetts Institute of Technology 에서 Matthew Wall이 기술한 유전자 알고리듬 패키지 "GAlib",에서 실행된 유전자 알고리듬(GA)을 토대로 한다(Wall, 1995; Feng and Rabitz, Biophys. J. 86:1270-1281 (Mar, 2004)). 각 매개변수(표 11)를 위한 검색범위는 이전 문헌에서의 지식 및 확장범위를 이용한 초기 검색을 토대로 선택하였다. 모의 및 바이러스 감염 모델 모두에서 동일한 검색범위를 이용하였다.
GA는 자연 선택과 유사한 기전으로 작용한다. 먼저, 매개변수 세트 집단을 무작위로 생성하였다. 이후 각 매개변수 세트를 스티프 기어 적분기(stiff Gear integrator)를 이용하는 ODE 시스템의 통합으로 모의 결과를 생성하는데 사용하였다(Hindmarsh, A. C., and L. R. Petzold, "Algorithms and Software for Ordinary Differential Equations and Differential-Algebraic Equations," Computers in Physics, 9, (1995), pp. 34-41 and 148-155; Lawrence Livermore National Lab Technical Report UCRL-JC-116619, April 1994 참고). 출력 데이터가 실험데이터에 얼마나 잘 맞는지를 토대로 적합도 점수를 매개변수 세트에 할당하였다. 실험 데이터에 가장 적합한 (50%) 매개변수를 남기고, 나머지는 다음 결합 과정을 통해 대체하였다: 사전 규정된 검색범위로부터 임의적 매개변수값("돌연변이")을 첫번째 소산 매개변수의 각 매개변수값이 첫번째 기원으로부터 56%, 두번째 기원으로부터 24%, 그리고 20% 기회를 갖게 하기 위해 소산 매개변수 세트(다음 세대 세트) 쌍을 주기 위해, 적합도 점수를 토대로, 매개변수 세트 쌍을 추계적으로 선택하였다. 이 후 상기 과정을 반복하였다.
득점함수로 다음과 같은 차원에서 실험결과와 모의 데이터간의 일치도를 평가하였다: (1) U-13C 포도당 섭식의 경우 동적 플럭스 프로파일링 데이터, (2) U-13C-글루타민 섭식의 경우 동적 플럭스 프로파일링 데이터, (3) 글루타민 및 포도당의 측정된 섭취속도, (4) 젖산, 알라닌 및 글루탐산의 측정된 배설 속도, (5) 1,2-13C-포도당 섭식 후 항정상태에서 1대 2 표지 탄소를 갖는 젖산 분획, 그리고 (6) 3-13C-포도당 섭식 후 항정상태에서 표지된 TCA 중간체 분획. 또한, 억제의 대가로 플럭스는 음의 값을 갖는 단일 방향으로 위치했다(모든 매개변수 검색범위를 양의 값으로 제한했음에도 불구하고, 일부 플럭스는 그 자체로 매개변수로 들어가는 것이 아니라, 플럭스 균형 제한을 토대로 둘 이상의 매개화된 플럭스간의 차이로서 계산되었다). 생리적으로 적당한 속도로의 배출을 제한하기 위해 대사에 추가적 제한을 두었다: 포도당-1-인산 소비(예컨대, 당단백 또는 글리코겐으로)를 해당작용율의 20%로 제한하였고, 아미노산 소비는 2 nmols 단백질/(세포 평판 x 시간)로 제한하였다(이러한 제한은 바이러스 감염 중 단백질 생물량(biomass)에서의 순 변화의 직접 측정을 토대로 하였다. 이후 총 단백질에서의 특정 아미노산 분획 발생을 근거로 특정 아미노산 발생률을 산정하였다).
이들 각 성분의 함수형식은 표 12에 기재되어 있다. 일반적 접근법은 모의 결과가 실험데이터의 95% 신뢰한계(±2 표준오차, SE) 밖에 위치하는 경우에만 비 용 페널티(penalty)를 적용하는 것이었다. 이는 각 실험 측정의 경우, 모의 데이터가 95% 신뢰한계이내 위치하거나(그러한 경우 점수=1) 이들 한계 외부에 위치하는지(이러한 경우 점수= 편차의 절대 크기/2 SE)를 평가함으로써 이루어진다.
동적 플럭스 프로파일링 실험의 경우, 상기 식에서 사용된 SE는 주어진 대사물을 위한 모든 실험 시점에서의 평균 SE였다. 이러한 오류의 평균화는 작은 표본수 설명을 위해 수행하였다. 종류 부족을 과조정하는 것을 방지하기 위해, 모든 종에 대해 0.02 nmoles의 최소 오류를 설정하였다. 다른 실험을 위한 오류 추정은 실험 복제로부터 직접 설정되었다. 동적 표지 데이터가 불가능한 경우 대사물은 득점 함수에서 제거하였다. 표지된 탄소의 수가 동일한 다수 종을 포함하는 모델을 위한 대사물의 경우, 실험데이터와의 비교를 위해 그 농도를 합산하였다.
3-13C-포도당 섭식 후 항정상태 TCA 표지를 포함하는 실험의 목적은 피루브산 카르복실라제 대 구연산 합성효소를 통해 TCA 회로로 들어가는 상대적 플럭스를 검사하는 것이었다. 실험 데이터(특히, 동일해야 하는 구연산과 아스파라진산의 경우 그리고 말산의 경우)를 주어진 플럭스 매개변수를 위해 예측한 항정상태 표지 분획과 비교하였다. 이러한 예측값은 항정상태 TCA 작용을 기술하는 선형 방정식 해법을 토대로 한다. 수학적으로, 각 종을 위해 표지될 것으로 예상되는 분획은 다음과 같이 기술된다:
Figure 112009082238916-PCT00327
플럭스 및 X는 도 16에 규정된 것과 같다. 표지 분획은 실험 데이터에 의한 것이다.
정확한 추출 플럭스에서 핵심적 문제는 주요 경로의 첫번째 개입단계를 통한 플럭스의 정확한 측정이다. 대부분의 경로에서 이는 동적 플럭스 프로파일링 데이터 이상의 특정 데이터에 의해 용이해졌다(예를 들어, 해당 작용의 경우, 포도당 섭취; 오탄당 인산 경로의 경우, 포도당 섭취와 함께 1,2-13C-포도당 표지). TCA 회로 진입의 경우, 3-13C- 포도당 데이터는 피루브산 카르복실라제 대 구연산 합성효소를 통한 분획을 제공한다. 그러나 절대 플럭스 추정 역시 필요하다. TCA 회로로의 전체 탄소 진입을 직접 측정할 수 없으므로, 비표지 구연산 신호 감쇠 5 및 15분 시점에 추가적 가중값(4배 추가적)을 주어, 이들 시점이 포도당으로부터 TCA 회로까지의 전체적 플럭스에 관해 독특하게 정보를 제공하였다. 다른 득점 함수와 다른 유형의 데이터 함유물은 실행가능하며 특정 상황에서 가치를 가질 수 있다. 여기서의 정확한 세부사항은 단지 예시일 뿐이다.
각 차원의 점수를 가중 평균에 의해 통합하였다. 가중치는 동일한 가중치를 각 서로 다른 데이터 입력값(예: 포도당 섭취 측정; 3-13C-포도당 항정상태 TCA 표 지)에 대해 대사물 시간 프로파일(총 8 측정값)이 동일한 가중치를 받도록 하였다. 최종 점수는 총점이 1이 되도록 총 입력수(및 그 가중치)로 정규화하였다.
Figure 112009082238916-PCT00328
상기 접근법을 상기 기술되고 48hpi에서 모의 감염 및 HCMV 감염 섬유모세포 모두에 대해 본 문서에서 기술된 것으로서 획득된 데이터에 적용하였다.
대사물 농도를 HPLC-MS/MS로 직접 측정하였다. 배양 섬유모세포에 1주일 동안 U-13C-포도당과 U-13C-글루타민을 공급하였고, HCMV- 또는 모의감염시켰다. 대사를 중단시킨 후 본 문서에 기술된 것처럼 48 hpi에서 -80℃, 80:20 메탄올:물로 대사물을 추출하였다. 내인성 대사문의 단편적 표지를 표 7에 나타내었다. 유사하게 표지된 감염 및 모의감염된 세포를 표 8에 나타낸 비표지형태의 대사물을 알려진 농도로 첨가한 용매로 추출하였다. 감염 및 비감염 세포에서 대사물의 절대량 측정을 위해, 비표지 최고점높이(대부분 표준 첨가로부터 도출된)에 대한 표지 최고점 높이(표지 세포대사물로부터 도출된)의 비를 세포 대사물 표지 정도(표 8) 및 표준 농도에 대한 지식과 함께 이용하였다. HCMV 감염세포에서 많은 세포 대사물의 농도가 현저히 증가하였다. 이러한 특정 대사물(예: 구연산)의 증가는 바이러스에 의한 지방산 생합성 관련 과정의 증강을 시사하였다.
동적 플럭스 프로파일링(KFP) 시험으로부터의 데이터를 표 8에서의 농도와 KFP 작업에서 관찰된 대사물의 표지 분획을 곱하여 표지 및 비표지 종의 절대 농도 로 전환하였다(예: 비표지 절대농도=표 8 대사물 절대농도 x KFP 시험으로부터의 비표지 최고점 크기/KFP 시험으로부터의 모든 표지 형태와 비표지 형태의 최고점 크기 합).
KFP의 반복 실행, 대사물 유입 및 유출을 측정하는 실험의 반복, 그리고 1,2-13C-포도당 표지 및 3-13C-포도당 표지 시험의 반복실행으로 얻은 데이터를 사용하여, 세포내 대사 플럭스를 상기 기술하였던 GA를 통해 측정하였다. 총 20회의 독립적 GA 를 HCMV 감염 세포로부터의 데이터와 모의감염된 세포로부터의 데이터와 비교가능한 수를 획득하기 위해 시행하였다. 실험데이터와 가장 일치하는 100 플럭스 세트를 이러한 계산 실행으로 얻었다. 이들 세트에서의 각 플럭스의 중간값, 최대 및 최소값을 표 9에 기재하였다. 유의할 점은, 플럭스의 다양성은 본질적으로 바이러스에 의해 상향조절된다는 것이다. 이들은 뉴클레오티드 생합성(오탄당-P에서 ATP, GTP, UTP 또는 CTP; 최대 ~2.5배)과 지방산 합성(구연산에서 말로닐 CoA로; 최대 ~20배) 플럭스를 포함한다. 바이러스에 의한 말로닐 CoA플럭스의 두드러진 상향조절 정도는 바이러스 감염 치료를 위해 치료적 표적이 되는 지방산 생합성의 독특한 값을 나타내었다.
따라서, 표 8과 표 9에 나타낸 바이러스에 의해 강하게 상향 조절된 플럭스는 비감염 세포에 유해한 작용을 미치지 않고 이들 플럭스를 억제할 수 있는 만큼 항바이러스 치료의 바람직한 표적이 될 수 있다. 지방산 생합성 및 관련 과정(예: 연장, 불포화반응, 콜레스테롤 합성) 억제는 포유동물에서 일반적으로 내성이 좋 다. 따라서, 이들 과정의 억제는 단독 또는 병용으로 바이러스 감염 치료의 유용한 수단이 된다.
아래 표 7은 13C-포도당과 13C-글루타민 함유 배지에서 섬유모세포 증식에 대한 중앙 탄소 대사물의 표지 비율을 나타낸다. 섬유모세포를 48시간 동안 모의 또는 HCMV 감염시켰다.
Figure 112009082238916-PCT00329
아래 표 8은 모의 또는 HCMV 감염 섬유모세포에서의 대사물 농도(섬유모세포 nmols/10cm 평판)를 나타낸다.
Figure 112009082238916-PCT00330
표 9는 모의 및 HCMV 감염 중 중앙 탄소 대사의 대사 플럭스 값을 나타낸다.
Figure 112009082238916-PCT00331
아래의 표 10에서, 3번째 컬럼의 구연산은 컬럼 1 및 컬럼 2에 나타낸 옥살로아세트산(OAA) 및 아세틸-보효소 A(AcCoA)에서 생산된다. 4번째 컬럼의 말로닐 보효소 A(MalCoA) 및 5번째 컬럼의 말산과 OAA는 구연산 분해효소를 통해 컬럼 3의 구연산에서 생산된다. 6번째 컬럼의 케토글루타레이트(KG)는 이소구연산 탈수소효소를 통해 컬럼 3의 구연산에서 생산된다. 7번째 컬럼의 말산 및 OAA는 TCA 회로의 시계방향 반응을 통해 컬럼 6의 케토글루타레이트에서 생산된다. 표의 숫자 및 그리스 문자는 표지된 탄소의 위치를 나타낸다.
Figure 112009082238916-PCT00332
Figure 112009082238916-PCT00333
Figure 112009082238916-PCT00334
Figure 112009082238916-PCT00335
6.15 예시 15: ACC 억제제에 의한 B형 간염 바이러스(HBV) 복제 억제
5.4절 및 5.5절에서 고찰한 바와 같이, 바이러스 감염에 대한 화합물의 치료작용 가능성을 평가하는 데 광범위한 시험법을 적용할 수 있으며, 여기에는 개별 바이러스 공정 시험법, 바이러스 성분, 입자 또는 감염성 신생바이러스의 생산 시험법, 배양세포 또는 동물 내에서의 바이러스 전파 시험법 또는 감염된 동물 내에서의 바이러스 발병기전 시험법이 포함된다. HBV는 사람에서 심각하고 생명에 위협적인 만성질환을 유발한다. HBV 복제에 대한 ACC 억제제의 효과를 평가하기 위해 시행할 수 있는 시험법의 1가지 비제한적인 예시는 다음과 같다. 5.4절에 나타낸 바와 같이, HepG2-2.2.15(Sells et al ., PNAS 84, 1005-9, 1987)는 HBV ayw 균주 게놈이 들어있는 안정된 세포주이다. 바이러스 복제 및 방출 단계를 차단하는 화합물을 이러한 세포에서 시험할 수 있다(Korba & Milman, Antiviral Res. 15:217-28, 1991). ACC억제제, 예를 들어 TOFA를 다양한 농도(1, 3, 10, 30, 90 μ/ml)로 혈청 이 없는 배지 또는 혈청이 들어있는 배지의 HepG2-2.2.15 세포배양물에 첨가한다. ACC 억제제가 들어있는 배지를 24시간 마다 교체하며, 24, 48, 72 및 96시간 동안 약물처치 후 배지 샘플을 제거하고 실시간 정량적 PCR에 의해 세포외 바이러스 DNA 존재를 측정한다. ACC 억제제 처치 기간 동안 세포외 바이러스 DNA 량 감소 또는 축적 지연은 항-HBV 작용을 의미한다. 뉴트럴 레드 염색약의 흡수를 이용하여 샘플이 수확된 각 시점에서 복제 배양물에 대한 상대적인 독성 정도를 확인한다. 세포외 HBV DNA 생산 억제에 대한 양성 시험대조로 라미부딘(3TC)를 이용한다(Korba & Gerin, Antivir.Res.19:55-70,1992). 대표적인 시험법에서, 라미부딘은 전형적인 항-HBV 작용을 나타낸다. 운반체(DMSO)는 세포외 HBV DNA 생산을 변경시키지 않는다. 3 ㎍/mL TOFA로 인해 세포외 HBV DNA가 소량이나 통계적으로 유의하게 감소된다. 10 ㎍/mL TOFA로 인해 세포외 HBV DNA가 약 10배(약 ~3배 내지 ~30배) 감소된다. 30 ㎍/mL TOFA로 세포외 HBV DNA 생산이 10배 이상의 효과로 뚜렷하게 저해되며, 일부 사례의 경우 100배 이상에 이른다. 90 ㎍/mL TOFA는 세포외 HBV DNA 생산을 거의 완전히 차단하나 일부 감염되지 않은 숙주세포주에도 부정적인 영향을 미친다.
6.16 예시 16: ACC 억제제에 의한 C형 간염 바이러스(HCV)의 복제 억제
5.4절 및 5.5절에서 고찰한 바와 같이, 바이러스 감염에 대한 약물의 치료효과 가능성을 평가하는 데 광범위한 시험법을 적용할 수 있으며, 여기에는 개별 바이러스 공정 시험법, 바이러스 성분, 입자 또는 감염성 신생바이러스의 생산 시험법, 배양세포 또는 동물 내에서의 바이러스 전파 시험법 또는 감염된 동물 내에서 의 바이러스 발병기전 시험법이 포함된다. HCV 는 사람에서 심각하고 생명에 위협적인 만성질환을 유발한다. HCV 는 플라비바이러스 ( Flavivirus ) 과에 속하며, 비리온에 양성가닥 RNA ( mRNA 의 센스)로 포장된다. 많은 양성가닥 RNA 바이러스는 감염세포 내의 특이적인 세포막 부위에서 게놈을 복제하는 것으로 나타났으며( Sagan et al ., Biochem. Cell Biol. 84, 67-79, 2006 및 상기 내 인용), 세포 내에서 지질 생합성 및 조성을 조절하는 약물에 민감한 것으로 예상될 수 있다. 그러나, 주목할 것은, 양성가닥 RNA 바이러스를 검사하였고(콕삭키 B3 바이러스) ACC 억제제인 TOFA에 민감하지 않은 것으로 보고하였다는 점이다(Rassmann et al ., Antiviral Res. 76, 150-8, 2007). TOFA는 HCV 복제단위가 들어있는 Huh-7 세포에서 경미한 정도(약 3배)로만 HCV 복제를 억제하는 것으로 보고되었으며(Kapadia & Chisari, PNAS 102, 2561-6, 2004), 이러한 억제 정도는 TOFA가 HCV 질환에 치료효과를 나타내지 않는 것을 의미한다. 그러나, 중요한 것은, 단회 저용량의 TOFA(5 ㎍/ml) 만을 검사하였다는 점이다. HCV 복제에 대해 더 완전히 ACC 작용을 억제하는 더 높은 용량의 TOFA 작용을 평가하기 위해 시행할 수 있는 1가지 비제한적인 시험법의 예시는 다음과 같다. 5.4절에 나타낸 바와 같이, 안정된 루시퍼라제(LUC) 리포터에 HCV RNA 복제단위를 포함한 Huh7 ET 세포를 사용하여 HCV에 대한 항바이러스 작용 화합물을 시험할 수 있다(Krieger et al . Virol., 2001, 75, 4614-24). LUC리포터의 작용은 HCV RNA 농도에 직접적으로 비례하며, 양성대조 항바이러스성 화합물은 LUC 또는 RNA 종점을 이용하여 유사하게 작용한다. TOFA를 다양한 농도(1, 3, 10, 30, 90 μ/ml)로 혈청이 없는 배지 또는 혈청이 들어있는 배지의 Huh7 ET세포배양 물에 첨가한다. 약물이 들어있는 배지를 24시간 마다 교체하며, TOFA처치 시작 후 24, 48, 72 및 96시간째 세포 추출물을 제조하고 LUC 활성을 측정한다. 약물을 투여하지 않은 세포에 비해 약물처치 세포에서의 LUC 활성 저하는 항바이러스 작용을 의미한다. 인간 인터페론-알파 2b와 같은 양성대조물을 적용하여 LUC 시험법이HCV 복제단위 억제에 반응하는 것을 확인한다. 그리고 뉴트럴 레드 염색약의 흡수를 이용하여 샘플이 수확된 각 시점에서 복제 배양물에서의 상대적인 독성 정도를 측정한다. 10 ㎍/mL의 TOFA는 LUC 활성을 ~ 10배 저하시키며, 이는 TOFA가 HCV 질환에 치료적 효과를 제공하지 않는다고 확인된 이전 논문 결과보다 더 큰 작용이다. 30 ㎍/mL의 TOFA는 LUC 활성을 뚜렷하게 감소시키며, 일부 실험에서 100배 이상 감소시키기도 한다. 10 ㎍/mL 또는 30 ㎍/mL TOFA는 뉴트럴 레드 염색약의 세포 흡수를 유발하지 않으며, 이는 숙주세포 독성이 없음을 의미한다. ACC 활성을 억제하는데 필요한 용량과 유사한 용량의 다른 ACC 억제제 처치로 유사한 작용이 나타난다.
6.17 예시 17: ACC 억제제에 의한 웨스트 나일 바이러스(WNV) 또는 뎅기바이러스(DV)의 억제.
5.4절 및 5.5절에서 고찰한 바와 같이, 바이러스 감염에 대한 약물의 치료 효과 가능성을 평가하는 데 광범위한 시험법을 적용할 수 있으며, 여기에는 개별 바이러스 공정 시험법, 바이러스 성분, 입자 또는 감염성 신생바이러스의 생산 시험법, 배양세포 또는 동물 내에서의 바이러스 전파 시험법 또는 감염된 동물 내에서의 바이러스 발병기전 시험법이 포함된다. WNV 및 DV는 플라비바이러스 과에 속하는 양성가닥 RNA 바이러스로, 사람에서 중증 질환을 유발한다. WVN 및 DV 복제에 대한 ACC 억제제의 영향을 평가하기 위해 시행할 수 있는 1가지 비제한적인 시험법의 예시는 다음과 같다. ACC억제제인 TOFA를 다양한 농도(1, 3, 10, 30, 90 μ/ml)로 혈청이 없는 배지 또는 혈청이 들어있는 배지의 WVN 감염 또는 DV 감염 베로 원숭이 신장세포배양물에 첨가한다. 약물이 들어있는 배지를 24시간 마다 교체하며, 24, 48, 72 또는 96시간 동안 약물처치 후 배지 샘플을 제거하고 실시간 정량적 RT-PCR에 의해 세포외 바이러스 RNA 존재를 측정한다. 약물 처치 기간 동안 세포외 바이러스 RNA 량 감소 또는 세포외 바이러스 RNA 량 축적 지연은 항-WNV 또는 항-DV 작용을 의미한다. 뉴트럴 레드 염색약의 흡수를 이용하여 샘플이 수확된 각 시점에서 복제 배양물에 대한 상대적인 독성 정도를 확인한다. 20 ㎍/mL의 TOFA는 세포외 바이러스 RNA 축적을 ~ 10배, 때로는 그 이상 저하시킨다. 또한 비처치 세포에 비해 세포외 바이러스 RNA의 축적이 지연된다.
6.18 예시 18: ACC 억제제에 의한 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)의 억제
5.4절 및 5.5절에서 고찰한 바와 같이, 바이러스 감염에 대한 약물의 치료효과 가능성을 평가하는 데 광범위한 시험법을 적용할 수 있으며, 여기에는 개별 바이러스 공정 시험법, 바이러스 성분, 입자 또는 감염성 신생바이러스의 생산 시험법, 배양세포 또는 동물 내에서의 바이러스 전파 시험법 또는 감염된 동물 내에서의 바이러스 발병기전 시험법이 포함된다. HIV-1 바이러스는 AIDS 증후군의 원인체이다. HIV-1복제에 대한 ACC 억제제의 영향을 평가하기 위해 시행할 수 있는 1가지 비제한적인 시험법의 예시는 다음과 같다. ACC 억제제인 TOFA를 다양한 농도(1, 3, 10, 30, 90 ㎍/ml)로 10% 소태아혈청이 들어있는 배지의 HIV-1 균주 IIIB(Popovic et al ., Science 224, 497-500, 1984)-감염된 C8166세포, 즉 HIV-1 복제에 대해 허용된 림프양 세포주(Somasundaran & Robinson, Science 242, 1554-7, 1988)에 첨가한다. 약물이 들어있는 배지를 24시간 마다 교체하며, 24, 48, 72, 96, 120 또는 144시간 동안 약물처치 후 배지 샘플을 제거하고 실시간 정량적 RT-PCR에 의해 세포외 바이러스 RNA 존재를 측정하거나 ELISA에 의해 HIV p24항원의 존재를 측정한다. 약물 처치 기간 동안 세포외 바이러스 RNA 량 또는 p24 항원량 감소 또는 세포외 바이러스 RNA 량 또는 p24 항원량 축적 지연은 항-HIV-1작용을 의미하게 된다. 뉴트럴 레드 염색약의 흡수를 이용하여 샘플이 수확된 각 시점에서 복제 배양물에 대한 상대적인 독성 정도를 확인한다.
6.19 예시 19: ACC 억제제에 의한 폭스바이러스 및 우두바이러스(VV) 복제의 억제.
5.4절 및 5.5절에서 고찰한 바와 같이, 바이러스 감염에 대한 약물의 치료효과 가능성을 평가하는 데 광범위한 시험법을 적용할 수 있으며, 여기에는 개별 바이러스 공정 시험법, 바이러스 성분, 입자 또는 감염성 신생바이러스의 생산 시험법, 배양세포 또는 동물 내에서의 바이러스 전파 시험법 또는 감염된 동물 내에서의 바이러스 발병기전 시험법이 포함된다. VV는 바이러스 오르도폭스(orthopox)과에 속하며, 마마 바이러스(천연두 바이러스)에 대한 모델로 연구된다. 백신접종에 의해 자연적인 마마 감염이 박멸되었으나, 생물학적 무기로 마마 사용에 대한 염려가 증가하였다. 마마 복제에 대한 효과를 예측하는 VV복제에 대한 ACC 억제제 효과 를 평가하기 위해 1가지 비제한적인 시행될 수 있는 시험법 예시는 다음과 같다. ACC억제제인 TOFA를 다양한 농도(1, 3, 10, 30, 90 ㎍/ml)로 혈청이 없는 배지 또는 혈청이 들어있는 배지의 VV(변형된 우두 바이러스 Ankara균주) 감염 BHK-21 햄스터 신장세포배양물에 첨가한다. 약물이 들어있는 배지를 24시간 마다 교체하며, 24, 48, 72 또는 96시간 동안 약물처치 후 배지 및 세포 샘플을 제거하고 세포를 배지에서 용해시켜 실시간 정량적 RT-PCR에 의해 용해물에서 바이러스 DNA 존재를 측정한다. 약물 처치 기간 동안 바이러스 DNA 량 감소 또는 바이러스 DNA축적 지연은 항-VV 작용을 의미하게 된다. 뉴트럴 레드 염색약의 흡수를 이용하여 샘플이 수확된 각 시점에서 복제 배양물에 대한 상대적인 독성 정도를 확인한다.
6.20 예시 20: ACC 억제제 및 HMG-CoA 환원효소 억제제 조합에 의한 HCMV, 인플루엔자 A, HIV-1, HBV 또는 HCV의 증가된 억제.
스타틴은 3-하이드록시-3-메틸글루타리-CoA(HMG-CoA) 환원효소의 경쟁적 억제제로, 메발론산 및 콜레스테롤 합성에 작용한다. 다양한 스타틴이 특정 바이러스의 복제 주기를 부분적으로 방해하는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 플루바스타틴은 배양된 내피세포에서 HCMV 복제를 부분적으로 억제할 수 있다(Potena et al ., Circulation 109, 532-6, 2004). 로바스타틴은 Huh-7 세포에서 HCV 복제단위의 복제를 부분적으로 억제할 수 있다(Kapadia and Chisari, PNAS 102, 2561-6, 2005; Sagan et al ., Biochem. Cell Biol. 84, 67-79, 2006). 로바스타틴은 감염성 HBV 입자 생산을 차단하지 않으나, HBV 표면항원인 HBsAg의 분비를 억제하며, HBsAg는 감염된 개체에서 다량 생산되고 HBV 발병기전에 영향을 미칠 수 있다(Lin et al., Virology 314, 253-60, 2003). 흥미롭게도, 인플루엔자 A 바이러스 증식 및/또는 복제를 저해하는 스타틴 가능성이 이전에 제안되지 않았으나, 스타틴을 복용한 환자는 인플루엔자 유행기 동안 호흡기 질병이 나타나거나 사망할 가능성이 낮은 것으로 보인다(Hak et al . 16 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Nice, abstr.; http://www.blackwellpublishing.com/eccmid16/abstract.asp?id=49073, 2006). 위에서 나타낸 바와 같이, 1가지 본 발명의 실시예는 이전에 스타틴 요법에 민감한 것으로 확인되지 않았던 인플루엔자 A 및 기타 바이러스를 치료하는 HMG-CoA 환원효소 억제제 사용과 관련된다. 본 예시는 바이러스 복제 및 전파를 길항하기 위해 스타틴 및 ACC 억제제의 조합과 관련이 있다. 상기 조합에 대한 많은 이론적 근거가 있다. 상기 이론적 근거의 비제한적인 예시에는 다음이 포함된다. 다음과 같은 2가지 효소가 지질 대사에 작용한다: ACC는 지방산 합성에 대한 속도제한반응을 촉매하며, HMG-CoA 환원효소는 메발론산 경로의 주요 단계를 촉매한다. 두 효소는 지질 합성에 대한 기질로 아세틸-CoA를 이용하며, 두 효소는 단백 변형에서 지질을 생산하는 경로에 있어 주된 역할을 하며(예: ACC: 팔미토일레이션; HMG-CoA 환원효소: 프레닐레이션), 두 효소는 AMP-활성화 단백 활성효소에 의해 인산화되고 불활성화된다. HCMV, 인플루엔자 A, HBV 또는 HCV 복제에 대한 스타틴 및 ACC 억제제 조합 영향을 평가하기 위해 시행할 수 있는 비제한적인 예시는 다음과 같다. HCMV 감염 인간 섬유모세포, 인플루엔자 A-감염 MDCK 세포, HIV-1 감염 C8166 세포, HBV 생성 HepG2-2.2.15세포 및 HCV RNA 복제단위가 들어있는Huh7 ET 세포를 이용한 TOFA 매개 항바이러스 활성에 대한 시험법을 여기에서 나타냈다. 각 시험법에서, 다양한 농도의 TOFA를 다양한 농도의 로바스타틴과 조합할 수 있으며, 바이러스 복제에 대한 효과를 측정할 수 있다. 로바스타틴은 이 시험법에서 이용하기 전에 락톤 전구체형에서 활성형으로 전환시켜 활성화시켜야 한다. 1가지 선호된 실시예의 경우, 로바스타틴의 생리학적 농도는 TOFA 용량이 증가함에 따라 일정하게 유지되게 된다. 대조배양물은 약물로 처치하지 않거나 로바스타틴 단독 또는 다양한 농도의 TOFA 단독으로 처치한다. 약물 처치 시작 후 24, 48, 72 및 96시간째 샘플을 채취한다. 그런 다음, 로바스타틴 및 각 농도의 TOFA의 항바이러스 효과를 로바스타틴 단독 또는 다양한 농도의 TOFA 단독 작용과 비교한다. 뉴트럴 레드 염색약의 섭취는 샘플을 수확한 각 시점에서 복제 배양물에 대한 상대적인 독성 정도를 확인하는 데 이용할 수 있다. 치료적으로 효과적인 농도의 활성형 로바스타틴에 의해 바이러스 증식 및/또는 복제를 10배 감소시키는 데 필요한 TOFA 농도는 약 2배 감소되며, 때로는 그 이상 감소된다.
6.21 예시 21: ACC 억제제 및 Cox 억제제 조합에 의한 HCMV 복제의 증가된 억제.
섬유모세포의 HCMV 감염 후 사이클로옥시게나제2(Cox2)가 강력하게 유도되고, 감염 후 프로스타글란딘 E2 합성이 강력하게 유도되며, Cox 억제제의 생리학적 농도 이상의 농도는 HCMV 복제를 억제할 수 있다(Zhu et al ., PNAS 99, 3932-3937, 2002). Cox 억제제는 2차 신호로 작용하는 지질 성분인 프로스타글란딘 생산을 차단하고 세포 및 조직에서 광범위한 생리학적 반응을 일으킨다. ACC 억제제 및 Cox 억제제 조합의 유익한 항바이러스 효과에 관한 이론적 근거의 비제한적인 예시는 에이코시노이드가 아라키돈산에 대한 COX 작용에 의해 합성된다는 사실에서 유래된다. 아라키돈산은 식이 및 지방산 합성에서 유래되며 그 결과 아리키돈산의 가용성은 ACC 활성에 의해 영향을 받는다. HCMV 복제에 대한 ACC 억제제 및 Cox 억제제 조합의 영향을 평가하기 위해 시행할 수 있는 시험법의 비제한적인 예시는 다음과 같다. 이 문서에서 HCMV 감염 인간 섬유모세포를 이용한 TOFA 매개 항바이러스 작용에 대한 시험법을 나타냈다. 각 시험법에서, 다양한 농도의 TOFA를 다양한 농도의 인도메타신과 조합할 수 있으며 바이러스 복제에 대한 영향을 측정할 수 있다. 1가지 선호된 실시예의 경우, 인도메타신의 생리학적 농도는 TOFA 용량이 증가함에 따라 일정하게 유지되게 된다. 대조배양물은 약물로 처치하지 않거나 인도메타신 단독 또는 다양한 농도의 TOFA 단독으로 처치한다. 약물 처치 시작 후 24, 48, 72 및 96시간째 샘플을 채취한다. 그런 다음, 인도메타신 및 각 농도의 TOFA의 항바이러스 효과를 인도메타신 단독 또는 다양한 농도의 TOFA 단독 작용과 비교한다. 뉴트럴 레드 염색약의 섭취는 샘플을 수확한 각 시점에서 복제 배양물에 대한 상대적인 독성 정도를 확인하는데 이용할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 농도의 인도메타신(통증치료에 대해 FDA 허가 약물용량을 이용한 환자에서 나타난 전형적인 혈장농도와 동일함)이 존재하는 경우, HCMV 증식 복제를 10배 감소시키는 데 필요한 TOFA 농도가 ~ 10 ㎍/mL에서 ≤ 5 ㎍/mL로 뚜렷하게 감소된다. 10 ㎍/mL의 TOFA에서, 치료효과 정도는 인도메타신이 없는 경우 ~ 10배에서 인도메타신이 있는 경우 ~ 100배로 증가한다. TOFA와 인도메타신의 병용으로 숙주세포 독성이 증가하지 않 으며, 이는 뉴트럴 레드 염색 시험법에서 평가되었다. 다른 Cox2 억제제 및 다른 ACC 억제제의 경우에도 유사한 결과가 확인된다.
6.22 예시 22: HCMV 감염 섬유모세포의 메타볼롬에 대한 TOFA의 영향은 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC)의 효과적인 차단으로 지방산 합성을 의미한다.
7.5% FBS 가 들어있는 DMEM(고 포도당)에서 일차 섬유모세포(MRC-5 세포)를 증식시켰으며, 세포 당 3.0 플라크형성단위의 다중도로 감염시켰다(대조세포는 바이러스 감염 대신 모의감염시켰다). 37oC에서 바이러스 흡착 2시간 후, 바이러스 접종물을 흡인하고 비결합 바이러스를 불활성화하기 위해 낮은 pH의 구연산나트륨 완충액(40mM 구연산나트륨, 10 mM KCl, 135 mM NACl, pH 3.0)에서 세포를 1회 세척한 다음 PBS 완충액으로 1회 세척하였다. 그런 다음 모의감염 세포를 48시간 동안 증식배지(+ DMSO 부형제)에 다시 넣었다. HCMV 감염 세포를 48시간 동안 증식배지(+ DMSO 부형제) 또는 TOFA(20 ㎍/mL)가 들어있는 증식배지에 다시 넣었다. 48시간 배양기간 종료시점(HCMV 감염세포에서의 최대 바이러스 복제 시점)에서, 증식배지를 흡인하고 -70℃, 80:20 메탄올:물에 즉시 옮겼다. 대사물을 메탄올:물로 추출하였으며, 여기에 나타낸 대사물의 다양성에 대해 LC-MS/MS를 통해 샘플을 분석하였다. 4가지 많은 정보를 제공하는 세포내 대사물 결과를 도17에 나타낸다.
말로닐-CoA는 ACC의 직접 산물이다. 이것의 농도는 HCMV 감염에 의해 ~ 8배 증가한다. HCMV 감염 세포에 TOFA를 첨가한 경우, 말로닐-CoA 농도가 검출한계 이하로 감소하였다. 말로닐-CoA의 이러한 큰 폭의 저하는 TOFA에 의한 ACC의 효과적 인 억제와 일치한다.
지방산 합성효소는 증식하는 지방산 사슬에 2개 탄소 단위를 첨가하는데 기질로 말로닐-CoA를 사용한다. 첨가한 다음, 이러한 2개 탄소 단위를 NADPH로 2회 환원시켜야 한다. 도A에 나타낸 바와 같이, HCMV 감염 세포에서의 NADPH 농도는 모의감염된 세포의 농도보다 낮았으며, 이는 바이러스 유도 지방산 생합성에 의한 신속한 NADPH 소비와 일치한다. TOFA는 바이러스 감염세포에서 NADPH 농도를 뚜렷하게 증가시켰으며, 이는 NADPH 소비 환원단계의 지방산 생합성 상류를 중단시켜 NADPH 소비를 간접적으로 차단한 것과 일치한다. NADP+농도는 NADPH와 반대 경향을 보여 바이러스 감염 동안 증가되고 TOFA 처치 동안 감소되었으며, 이는 TOFA가 NADPH 이용을 간접적으로 차단하는 것(따라서 NADP+생성)과 일치한다.
구연산은 사립체에서 세포질로 2개 탄소 단위를 운반하는 역할을 하며, 이들 탄소 단위는 세포질에서 ACC에 의해 이용된다. 구연산 농도는 HCMV 감염에 의해 증가되었으며, 이는 HCMV가 구연산 운반체 활성을 증가시키는 것과 일치한다. TOFA에 의해 ACC가 저해되어 구연산 이용이 감소되므로 바이러스 감염 세포에서 구연산 농도가 더 증가하게 되었다.
6.23 예시 23: 구조적으로 다양한 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC) 억제제는 HCMV 복제를 차단한다.
도 18에 나타낸 CP -640186(5.2절의 구조 VI 참고), CP -610431(5.2절의 구조 VI 참고), 및 화합물 8a(5.2절의 구조 XXIVb 참고)와 같은 이중 ACC1 / ACC2 억제제 는 또한 HCMV 복제를 각각 약 50배, 50배 및 100배 억제할 수 있다. 예를 들어, Harwood et al ., J. Biol. Chem. 2003 278:37099-37111; Clark et al ., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007 17:1961-1965; 및Gu et al., J. Med. Chem. 2006 49:3770-3773을 참고한다.
도19에 나타낸 화합물 7a(5.2절의 구조 XXIVa3 참고), 화합물 8b(5.2절의 구조 XXIVb 참고) 및 화합물 9c(5.2절의 구조 XXIVa1 참고)와 같은 선택적 ACC2 억제제는 또한 HCMV 복제를 각각 약 40배, 100배 및 100배 이상 억제할 수 있다. 예를 들어, Harwood et al ., J. Biol. et al .및 et al .Chem. 2006 49:3770-3773을 참고한다.
도 18 및 도 19에 나타낸 ACC 억제제인 화합물 7b, 8a, 8b 및 9c에서 구한 실제 결과의 막대 그래프를 도 20에 나타낸다. 도 20의 막대 그래프를 생성하기 위해 사용된 원 데이터는 표 13에 나타나 있다.
Figure 112009082238916-PCT00336
Figure 112009082238916-PCT00337
요약하면, 도 20 및 표 13과 표 14에 나타낸 실험을 다음과 같이 시행하였다. 7.5% FBS 가 들어있는 DMEM(고 포도당)에서 일차 섬유모세포(MRC-5 세포)를 증식시켰으며, ACC억제제 또는 부형제 대조물(DMSO) 존재 하에서 세포 당 3.0 플라크형성단위의 다중도로 감염시켰다. 37oC에서 바이러스 흡착2시간 후, 바이러스 접종 물을 흡인하고, 비결합 바이러스를 불활성화하기 위해 낮은 pH의 구연산나트륨 완충액(40mM 구연산나트륨, 10 mM KCl, 135 mM NACl, pH 3.0)에서 세포를 1회 세척한 다음, ACC 억제제 또는 부형제 대조물이 들어있는 증식배지에 첨가하기 전에 PBS 완충액으로 1회 세척하였다. 감염된 섬유모세포 배양물을 감염 72시간 후 수확하였으며, MRC-5 세포에서의 표준플라크시험법을 통해 바이러스 역가를 확인하였다. 표 13 및 표 14에 나타낸 바와 같이, ACC2 동종효소에 특이적인 화합물을 포함한 모든 검사된 ACC 억제제는 HCMV 복제를 차단하는데 효과적이었다. 표 13에서, 모든 결과를 단일 실험에서 수집하였다. 표14에서, 결과는 2가지 비의존성 실험(공백선에 의해 구분됨)에서 나온 것이며, 이는 각 실험일에서 보고된 별도의 배지 대조물 및 부형제 대조물 결과를 동반한다.
세포층의 육안 검사 및 뉴트럴 레드 생존능 시험법을 통해 숙주세포에 대한 다양한 ACC 억제제의 독성을 확인하였다. 뉴트럴 레드 시험법을 통해 위의 검사된 농도의 모든 억제제에서 독성 증거가 확인되지 않았다. 육안검사를 통해 세포형태 면에서 약물유도 변화 증거가 확인되지 않았으며, CP 화합물은 예외로 CP86(CP640186)보다 CP31(CP610431)이 다소 더 높은 영향을 나타냈다(이러한 화합물의 뉴트럴 레드 시험법은 검사농도에서 DMSO 대조물과 구별할 수 없었다).
6.24 예시 24: 고해상 질량분석기를 이용한 HCMV 감염에 의해 상향조절된 대사물 확인.
바이러스 감염에 의해 상향조절된 대사경로를 확인하는 다른 비제한적인 접근법은 공평한 고해상 질량분석기 분석을 바탕으로 한다. 예를 들어, 상기 분석을 아래 나타낸 바와 같이 적용하였다.
7.5% FBS 가 들어있는 DMEM(고 포도당)에서 일차 섬유모세포(MRC-5 세포)를 증식시켰다. 그런 다음, 세포를 혈청이 없는 DMEM(고 포도당)로 옮기고 3-5일 동안 배양하였다. 이후, 세포를 세포 당 3.0 플라크형성단위의 다중도로 감염시켰다(대조세포는 바이러스 감염 대신 모의감염되었다). 37℃에서 바이러스 흡착2시간 후, 바이러스 접종물을 흡인하고 비결합 바이러스를 불활성화하기 위해 낮은 pH의 구연산나트륨 완충액(40mM 구연산나트륨, 10 mM KCl, 135 mM NACl, pH 3.0)에서 세포를 1회 세척한 다음 PBS 완충액으로 1회 세척하였다. 그런 다음 세포를 DMEM(고 포도당)에 다시 넣고 여기에 나타낸 바에 따라 냉각된 메탄올:물에서 반응 중단 및 추출을 통해 대사체 샘플을 다양한 시점에 채취하였다. 그런 다음 Orbitrap 기구 전체스캔모드의 액체 크로마토그래피-고해상 질량분석기를 통해 추출물을 분석하였다(TOF 기구를 이용한 경우에도 유사한 결과가 나올 수 있다). 바이러스 감염에서 뚜렷하게 증가되는 LC-MS/MS 최고점에 대해 원 데이터를 검사하였다. 그러한 최고점은 바이러스에 의해 생산이 증가할 가능성이 있는 대사물을 나타내므로, 생산경로의 억제는 항바이러스 효능을 나타낼 가능성이 있다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 그러한 1가지 최고점이 m/z 174에서 확인되었다. 정확한 질량 분석을 통해 분자식 C6H8NO5이 확인되었으며, 이는 C6H9NO5의 탈양자화된 분자 이온에 해당된다. 구조식 C6H9NO5은 아스파라진산과 아세틸-CoA(HCMV에 의한 지방산 생합성에서도 중요한 역할을 함) 반응에 의해 형성된 아스파라진산 유도체인 N-아세틸-아스파라진산이 포 함된 화합물에 해당되는 것으로 확인되었다. N-아세틸-아스파라진산의 동정은 정제된 표준화합물에 해당되는 LC 정체시간 및 MS/MS 분석을 바탕으로 확인되었다. N-아세틸-아스파라진산은 뇌에서 두번째로 가장 많은 화합물(글루탐산 다음으로)로 체액 균형 및 에너지 대사에 중요한 역할을 한다. N-아세틸-아스파라진산은 HCMV에 의해 유도된 거대세포증에 작용할 수 있으며, 이의 생산 억제로 이러한 과정 및 HCMV 복제가 저해될 수 있다. 또한, N-아세틸-아스파라진산은 HCMV 감염 세포에서 2개 탄소 운반반응 또는 에너지 대사에 필수적인 역할을 할 수 있다.
6.25 예시 25: 항바이러스제로서 포스포이노시티드 3-활성효소의 억제제.
6.25.1 3군 포스포이노시티드 3-활성효소인 3-메틸아데닌에 의한 HCMV 복제 억제.
포스파티드산은 글리세롤 백본으로 이루어지며, 탄소1에 결합된 포화지방산, 탄소2에 결합된 비포화지방산 및 탄소3에 결합된 인산기로 구성된다. 포스파티딜이노시톨[PI]은 본질적으로 이노시톨에 대해 인산기를 통해 연결된 포스파티드산 백본으로 이루어진 인지질이다. 중요한 것은, PI의 생산이 지방산 가용성에 따라 달라진다는 것이다.
포스포이노시티드 3-활성효소[PI(3)Ks]는 포스포이노시티드의 이노시톨 고리를 인산화하는 활성효소에 속한다. 인체 액포 단백질 분류34[hVps34]로도 알려진 Class III PI(3)K는 PI의 이노시톨 고리에 3'-하이드록실기를 인산화하여 PI(3)P를 만든다.
3-메틸아데닌은 3군 PI(3)K를 억제하며(Petiot et al., J Biol Chem 275, 992-998, 2000), 인간 거대세포바이러스 복제도 억제한다(도22). 이러한 사살은 효소인 3군 PI(3)K 및 그의 산물 PI(3)P가 인간 거대세포바이러스 후대의 효과적인 생산에 중요한 것을 의미한다. 따라서, 3군 PI(3)K 억제제는 새로운 항바이러스제일 수 있다. 특이한 실시예의 경우, 여기에 나타낸 바이러스 감염을 치료하는 방법은 바이러스 감염을 앓고 있는 포유동물에서의 3군 PI(3)K 억제로 구성된다. 3군 PI(3)K를 억제하는 화합물의 비제한적인 예시는 3-메틸아데닌이다.
도 22에 나타낸 결과는 다음과 같이 간략히 나타낸 실험에서 구하였다: 3-메틸아데닌(5 mM)의 유무 하에서 0.01 pfu/세포의 다중성으로 섬유모세포를 HCMV로 감염시켰으며, 감염 후 지시된 시점에서 감염성 바이러스에 대해 배지를 측정하였다.
6.25.2 이노시톨이 들어있는 화학종 봉쇄를 통한 바이러스 복제 억제.
PI(3)P는 여러 세포내 과정을 조절하며, 여기에는 FYVE(서열 번호: 55) 영역이 들어있는 단백질과의 상호작용을 통한 세포막 수송이 포함된다. 일렬 FYVE(서열 번호: 55) 영역(Gillooly et al ., EMBO J. 19:4577-4588, 2000)을 함유한 폴리펩티드를 세포에 도입시켰으며 인간 거대세포바이러스 감염 말기 동안 생산되는 세포질 소포 형성을 차단하는 것으로 확인되었다. 이러한 소포 양상은 감염성 바이러스 생산과 상호 관련이 있다 특정 이론에 구속되지 않은 1가지 해석은 FYVE 영역이 PI(3)P를 봉쇄하여 단백질과 상호작용하여 감염성 바이러스 형성에 필요한 소포 형성을 막는다는 것이다. 이러한 사실을 통해 PI(3)P에 결합하여 정상기능을 차단하 는 제제는 새로운 항바이러스제로 작용할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 특정 실시예의 경우, 여기에 나타낸 바이러스 감염을 다루는 방법은 PI(3)P 봉쇄와 관련이 있다. PI(3)P 봉쇄제의 비제한적 예시에는 1가지 이상의 FYVE(서열 번호: 55) 모티프가 들어있는 펩티드 또는 화학적으로 변형된 펩티드가 포함되며, 여기에는 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) Tat 단백(아미노산 서열: YGRKKRRQRRR(서열 번호: 56) 또는 이의 아단위 또는 확장 버전) 의 세포막 형질도입 영역과 같은 세포 형질도입 영역으로 FYVE(서열 번호: 55) 모티프가 들어있는 펩티드가 포함된다. 다른 세포막 형질도입 영역이 현재 잘 알려져 있으며 항바이러스 치료제 설계에 있어 FYVE(서열 번호: 55) 서열(그의 여러 반복체 또는 변이체를 포함함) 또는 다른 PI(3)P-봉쇄 서열과 조합할 수 있다. FYVE(서열 번호: 55) 모티프(세포막 형질도입 영역 유무)를 다른 화학 성분과 혼합하여 FYVE(서열 번호: 55) 모티프(예를 들어, 순환 및/또는 세포 단백분해효소에 의한 가수분해로부터 FYVE(서열 번호: 55) 모티프를 보호하여)의 혈장 반감기를 증가시킬 수 있다.
당업자들은 통상적인 실험만을 이용하여, 여기에 나타낸 발명의 특정 실시예와 동등한 많은 동등물을 확인하거나 규명할 수 있을 것이다. 그러한 동등물은 다음 청구항들에서 망라된다.
여기에서 인용한 모든 참조문헌은 각 개별 발행물 또는 특허 또는 특허출원이 모든 목적상 완전히 참조문헌에 의해 통합되는 것과 같은 동일한 범위로 모든 목적에서 완전히 여기에 통합된다.
본 발명은 여기에 나타낸 특정 실시예의 범위에 국한되지 않는다. 실제로, 여기에 나타낸 것 외에 발명의 여러 수정물이 앞서 언급한 설명 및 병행 도면을 통해 당업자들에게 명백히 인식될 것이다. 그러한 수정물은 첨부된 청구 범위 내에 속하게 된다.
본 발명은 다음과 같은 번호의 하위절에서 설명되는 실시예에 의해 추가로 설명된다.
1. 포유류에서의 바이러스 감염 치료 또는 예방 방법으로, 치료적으로 효과적인 양의 1가지 이상 화합물 또는 그의 전구체 또는 약학적으로 허용가능한 앞서 언급한 화합물 또는 전구체의 염을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어지며 여기서의 화합물은 다음과 같다:
i) 구조식 I의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00338
상기 [00101]-[00108] 절에 정의된 바에 따름;
ii) 구조식 II의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00339
상기 [00109]-[00125] 절에 정의된 바에 따름;
iii) 구조식 III의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00340
상기 [00126]-[00132] 절에 정의된 바에 따름;
iv) 구조식 IV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00341
상기 [00123]-[00141] 절에 정의된 바에 따름;
v) 구조식 V의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00342
상기 [00142]-[00151] 절에 정의된 바에 따름;
vi) 구조식 VI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00343
상기 [00152]-[00166] 절에 정의된 바에 따름;
vii) 구조식 VII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00344
상기 [00167]-[00179] 절에 정의된 바에 따름;
viii) 구조식 VIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00345
상기 [00180]-[00195] 절에 정의된 바에 따름;
ix) 구조식 IX의 화합물
Figure 112009082238916-PCT00346
상기 [00196]-[00210] 절에 정의된 바에 따름;
x) 구조식 X의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00347
상기 [00211]-[00229] 절에 정의된 바에 따름;
xi) 구조식 XI의 화합물
Figure 112009082238916-PCT00348
상기 [00230]-[00240] 절에 정의된 바에 따름;
xii) 구조식 XII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00349
상기 [00241]-[00258] 절에 정의된 바에 따름;
xiv) 구조식 XIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00350
상기 [00259]-[00269] 절에 정의된 바에 따름;
xiv) 구조식 XIV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00351
상기 [00270]-[00279] 절에 정의된 바에 따름;
xv) 구조식 XV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00352
상기 [00280]-[00289] 절에 정의된 바에 따름;
xvi) 구조식 XVI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00353
상기 [00290]-[00299] 절에 정의된 바에 따름;
xvii) 구조식 XVII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00354
상기 [00300]-[00307] 절에 정의된 바에 따름;
xviii) 구조식 XVIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00355
상기 [00308]-[00309] 절에 정의된 바에 따름;
xix) 구조식 XIX의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00356
상기 [00310]-[00311] 절에 정의된 바에 따름;
xx) 구조식 XX의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00357
상기 [00312]-[00313] 절에 정의된 바에 따름;
xxi) 구조식 XXI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00358
상기 [00314]-[00315] 절에 정의된 바에 따름;
xxii) 구조식 XXII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00359
상기 [00316]-[00323] 절에 정의된 바에 따름;
xxiii) 구조식 XXIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00360
상기 [00452] 절에 정의된 바에 따름;
xxiv) 구조식 XXIV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00361
상기 [00324]-[00348] 절에 정의된 바에 따름;
xxv) 구조식 XXV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00362
상기 [00349]-[00364] 절에 정의된 바에 따름;
xxvi) 구조식 XXVI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00363
상기 [00365]-[00380] 절에 정의된 바에 따름;
xxvii) 구조식 XXVII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00364
상기 [00381]-[00395] 절에 정의된 바에 따름;
xxviii) 구조식 XXVIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00365
상기 [00396]-[00421] 절에 정의된 바에 따름;
xxix) 구조식 XXIX의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00366
상기 [00422]-[00425] 절에 정의된 바에 따름;
xxx) 구조식 XXX의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00367
상기 [00426]-[00428] 절에 정의된 바에 따름;
xxxi) 구조식 XXXI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00368
상기 [00429]-[00433] 절에 정의된 바에 따름;
xxxii) 구조식 XXXII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00369
상기 [00447]-[00451] 절에 정의된 바에 따름;
xxxiii) 구조식 XXXIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00370
상기 [00434]-[00446] 및 [00452]-[00453] 절에 정의된 바에 따름;
xxxiv) 구조식 XXXIV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00371
상기 [00454]-[00477] 절에 정의된 바에 따름;
xxxv) 구조식 XXXV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00372
상기 [00478]-[00492] 절에 정의된 바에 따름;
xxxvi) 구조식 XXXVI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00373
상기 [00493]-[00521] 절에 정의된 바에 따름;
xxxvii) 구조식 XXXVII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00374
상기 [00522]-[00529] 절에 정의된 바에 따름;
xxxviii) 구조식 XXXVIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00375
상기 [00530]-[00548] 절에 정의된 바에 따름;
xxxix) 구조식 XXXIX의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00376
상기 [00549]-[00562] 절에 정의된 바에 따름;
xl) 구조식 XL의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00377
상기 [00563]-[00573]절에 정의된 바에 따름;
xli) 구조식 XLI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00378
상기 [00574]-[00584] 절에 정의된 바에 따름;
xlii) 구조식 XLII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00379
상기 [00585]-[00591] 절에 정의된 바에 따름;
xliii) 구조식 XLIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00380
상기 [00592]-[00607] 절에 정의된 바에 따름;
xliv) 구조식 XLIV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00381
상기 [00608]-[00618]절에 정의된 바에 따름;
xlv) 구조식 XLV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00382
상기 [00619]-[00620] 절에 정의된 바에 따름;
xlvi) 구조식 XLVI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00383
,
상기 [00621]-[00622] 절에 정의된 바에 따름;
xlvii) 구조식 XLVII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00384
상기 [00623]-[00624] 절에 정의된 바에 따른다.
2. 포유류에서의 바이러스 감염 치료 또는 예방 방법으로, 치료적으로 효과적인 양의 1가지 이상 화합물 또는 그의 전구체 또는 약학적으로 허용가능한 화합물 또는 전구체의 염을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어지며 여기서의 화합물은 구조식 XXXIII의 화합물이다:
Figure 112009082238916-PCT00385
;
여기서
a) X 는 -COOH, -CO2(C1-C6)알킬, -CONH-2, -H, -CO(C1-C6)알킬, -COC(할로)3 또는 보효소A와 부가물을 형성할 수 있는 성분이다.
b) Y는 O 또는 S; -NH 또는 N(C1-C6)알키이다. 그리고
c) Z 는 -(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)알킬 혹은 -(C5-C20)알콕시, -(C5-C20)할로알킬, -O-(C5-C20)할로알킬 혹은 -(C5-C20)할로알콕시, -할로, -OH, -(C5-C20)알케닐, -(C5-C20)알키닐, -(C5-C20)알콕시-알케닐, -(C5-C20)하이드록시알킬, -O(C1-C6)알킬, -CO2(C1-C6)알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐, -O(C5-C20)시클로알킬;, -S(C5-C20)알킬, -NH(C5-C20)알킬, -NHCO(C5-C20)알킬, -N(C1-C6)알킬CO(C5-C20)알킬 혹은 -O(C5-C20)알콕시이다.
3. 2절의 방법으로, 구조식 XXXIII 의 화합물의 X는 보효소 A와 에스테르 연결을 형성할 수 있는 성분이다.
4. 하위절 2의 방법으로, 구조식 XXXIII 의 화합물의 X는 구조식의 화합물을 형성하는 성분이다.
Figure 112009082238916-PCT00386
5. 하위절 2의 방법으로, 구조식 XXXIII 의 X는 -COOH이다.
6. 하위절2의 방법으로, 구조식 XXXIII 의 Y는 O이다.
7. 하위절 2의 방법으로, 구조식 XXXIII의 Z는 -O(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)할로알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐 혹은 -O(C5-C20)알콕시이다.
8. 하위절 2의 방법으로, 구조식 XXXIII의 Y는 O이고, X는 -COOH 이며, Z는 -O(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)할로알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐 혹은 -O(C5-C20)알콕시이다.
9. 하위절2의 방법으로, 구조식 XXXIII 의 화합물은 다음 구조를 가진다:
Figure 112009082238916-PCT00387
,
여기에서
X는 -COOH, -CO2(C1-C6)알킬, -CONH-2, -H, -CO(C1-C6)알킬, -COC(할로)3, 또는
Figure 112009082238916-PCT00388
이다.
10. 하위절 2의 방법으로, 구조식 XXXIII 의 화합물은 다음 구조를 가진다:
Figure 112009082238916-PCT00389
;
Figure 112009082238916-PCT00390
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00391
.
11. 하위절 2의 방법으로, 구조식 XXXIII 의 화합물은 다음 구조를 가진다:
Figure 112009082238916-PCT00392
;
여기서:
i) X는 -(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)알킬 혹은 -(C5-C20)알콕시, -(C5-C20)할로알킬, -O-(C5-C20)할로알킬 혹은 -(C5-C20)할로알콕시, -할로, -OH, -(C5-C20)알케닐, -(C5-C20)알키닐, -(C5-C20)알콕시-알케닐, -(C5-C20)하이드록시알킬, -O(C1-C6)알킬, -CO2(C1-C6)알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐, -O(C5-C20)시클로알킬, -S(C5-C20)알킬, -NH(C5-C20)알킬, -NHCO(C5-C20)알킬, -N(C1-C6)알킬CO(C5-C20)알킬 혹은 -O(C5-C20)알콕시이다. 그리고
ii) Y는 O, S, -NH 혹은 N(C1-C6)알킬이다
12. 하위절 2의 방법으로, 구조식 XXXIII 의 화합물은 다음 구조를 가진다
Figure 112009082238916-PCT00393
;
Figure 112009082238916-PCT00394
;
Figure 112009082238916-PCT00395
;
Figure 112009082238916-PCT00396
;
Figure 112009082238916-PCT00397
; 또는
Figure 112009082238916-PCT00398
.
13. 하위절 2의 방법으로, 상기 화합물은 5-(테트라데실옥시)-2-푸로산 [TOFA]이다.
14. 하위절2의 방법으로, 상기 화합물은 TOFA가 아니다.
15. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 지방산 생합성 경로에서 효소 활성을 억제하는 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 포유동물 피험자에 투여하는 것으로 이루어진다.
16. 하위절 15의 방법으로, 숙주효소는 다음과 같다:
i) 아세틸CoA 카르복실라제,
ii) ATP 구연산 분해효소,
iii) HMG-CoA 합성효소,
iv) 지방산 합성효소 영역,
v) 지방산 합성효소 케토-아실 합성효소 영역,
vi) 지방산 합성효소 티오에스터라제 영역,
vii) 리소포스파티드산 아실전이효소,
viii) 리소포스파티드산 아실전이효소-베타,
ix) 말로닐-CoA 디카르복실라제,
x) AMP-활성 단백질 활성효소(AMPK),
xi) 지방산 연장효소,
xii) ELOVL(매우 긴 사슬 지방산의 연장),
xiii) 스테아로일-CoA 불포화효소 1-5,
xiv) 델타-6- 불포화효소
xv) 델타-5불포화효소.
17. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 지방산 생합성 경로에서 숙주효소의 활성을 억제하는 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 포유동물 피험자에 투여하는 것으로 이루어진다.
18. 하위절 17의 방법으로, 숙주효소는 다음과 같다:
i) 메틸말로닐 보효소 A 뮤타제,
ii) 아실-보효소 A 카르복실라제 베타,
iii) 아실-보효소 A 산화효소2, 분지형 사슬,
iv) 잠정 아실-CoA 탈수소효소,
v) 단분지사슬 아실-보효소 A 탈수소효소,
vi) 생체이물/배지-사슬 지방산:CoA 결합효소,
vii) 3을 포함한 에노일 보효소 A 수화효소 영역,
viii) 인지질 스크램블라제 1,
ix) 인지질 스크램블라제 2,
x) 인지질 스크램블라제 4,
xi) 지방산 불포화효소 1,
xii) 카르티닌 팔미토일 전이효소(CPT),
xiii) 지방산 결합 단백질 5(건선 관련), 또는
xiv) 지방산 결합 단백질 3, 근육 및 심장(유선 유래 증식 억제제).
19. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포도당 운송 경로에서 숙주효소의 활성을 억제하는 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
20. 하위절 19의 방법으로, 효소는 GLUT4이다.
21. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 해당경로에서 숙주효소의 활성을 억제하는 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
22. 하위절 21의 방법으로, 효소는 다음과 같다:
i) 포도당 인산 이성질화효소,
ii) 삼탄당인산 이성질화효소1,
iii) 포스포글리세레이트 활성효소 1,
iv) 에놀라제 1(알파), 또는
v) 피루브산 활성효소, 근육.
23. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 삼카르복실산(TCA) 회로에서 숙주효소의 활성을 억제하는 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
24. 하위절 23의 방법으로, 효소는 다음과 같다:
i) 이소구연산 탈수소효소,
ii) 숙신산-CoA 결합효소,
iii) 숙신산 탈수소효소,
iv) 말산 탈수소효소,
v) 말산효소, 또는
vi) TCA 아코니타제.
25. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 숙주 양자 ATP아제 효소의 활성을 억제하는 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
26. 하위절 25의 방법으로, 효소는 다음과 같다:
i) F0 복합체, 아단위 b, 이소형 1,
ii) F0 복합체, 아단위 c(아단위 9), 이소형 3,
iii) F0 복합체, 아단위 c(아단위 9), 이소형 1,
iv) F0 복합체, 아단위 e,
v) F0 복합체, 아단위 F6,
vi) F0 복합체, 아단위 g,
vii) F1 복합체, 알파 아단위, 이소형 1,
viii) F1 복합체, 베타 폴리펩티드,
ix) F1 복합체, 엡실론 아단위, 또는
x) F1 복합체, O 아단위.
27. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 콜레스테롤 합성 또는 대사에 관여하는 숙주 효소의 활성을 억제하는 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
28. 하위절 27의 방법으로, 효소는 다음과 같다:
i) 아세틸-CoA 아세틸전이효소,
ii) HMG-CoA 합성효소,
iii) HMG-CoA 환원효소,
iv) 이소펜틸이인산 이성질화효소,
v) 메발론산 활성효소,
vi) 포스포메발론산 활성효소,
vii) 게라닐-이인산 합성효소,
viii) 파르네실-이인산 합성효소,
ix) 파르네실-이인산 파르네실전이효소,
x) 스쿠알렌 모노옥시게나제,
xi) 라노스테롤 합성효소,
xii) 스쿠알렌 에폭시다제, 또는
xiii) 스쿠알렌 옥시도시클라제.
29. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 숙주 대사 또는 생합성 효소의 활성을 억제하는 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
30. 하위절 29의 방법으로, 효소는 다음과 같다:
i) 젖산 탈수소효소 B,
ii) 디카르보닐/L-자일룰로스 환원효소,
iii) 하이드록시프로스타글란딘 탈수소효소 15-(NAD),
iv) 리불로오스-5-인산-3-에피머라제,
v) 글루탐산 탈수소효소,
vi) 글루타미나제,
vii) 인지질분해효소 A2,
viii) 사이클로옥시게나제 1, 또는
ix) 사이클로옥시게나제 2.
31. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 치료적으 로 효과적인 양의 지방산 생합성 억제제 및 콜레스테롤 생합성 억제제 또는 그의 전구체 또는 약학적으로 허용가능한 앞서 언급한 억제제 또는 전구체의 염을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
32. 하위절 31의 방법으로, 지방산 생합성 억제제는 ACC[아세틸- CoA 카르복실라제] 억제제이며, 콜레스테롤 생합성 억제제는 HMGCoA(3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-CoA) 환원효소 억제제이다.
33. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포유동물 피험자의 지방산 생합성 경로 숙주세포의 활성을 줄이는 것으로 이루어진다.
34. 하위절 33의 방법으로, 숙주효소는 다음과 같다:
i) 아세틸CoA 카르복실라제,
ii) ATP 구연산 분해효소,
iii) HMG-CoA 합성효소,
iv) 지방산 합성효소 영역,
v) 지방산 합성효소 케토-아실 합성효소 영역,
vi) 지방산 합성효소 티오에스터라제 영역,
vii) 리소포스파티드산 아실전이효소,
viii) 리소포스파티드산 아실전이효소-베타,
ix) 말로닐-CoA 디카르복실라제,
x) AMP-활성 단백질 활성효소(AMPK),
xi) 지방산 연장효소,
xii) ELOVL(매우 긴 사슬 지방산의 연장),
xiii) 스테아로일-CoA 불포화효소 1-5,
xiv) 델타-6- 불포화효소, 또는
xv) 델타-5-불포화효소.
35. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포유동물 피험자의 지방산 대사 경로 숙주세포의 활성을 줄이는 것으로 이루어진다.
36. 하위절 35의 방법으로, 숙주효소는 다음과 같다:
i) 메틸말로닐 보효소 A 뮤타제,
ii) 아실-보효소 A 카르복실라제 베타,
iii) 아실-보효소 A 산화효소2, 분지형 사슬,
iv) 잠정 아실-CoA 탈수소효소,
v) 단분지사슬 아실-보효소 A 탈수소효소,
vi) 생체이물/배지-사슬 지방산:CoA 결합효소,
vii) 3을 포함한 에노일 보효소 A 수화효소 영역,
viii) 인지질 스크램블라제 1,
ix) 인지질 스크램블라제 2,
x) 인지질 스크램블라제 4,
xi) 지방산 불포화효소 1,
xii) 카르티닌 팔미토일 전이효소(CPT),
xiii) 지방산 결합 단백질 5(건선 관련), 또는
xiv) 지방산 결합 단백질 3, 근육 및 심장(유선 유래 증식 억제제).
37. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포유동물 피험자의 포도당 운송 경로 숙주세포의 활성을 줄이는 것으로 이루어진다.
38. 하위절 37의 방법으로, 효소는 GLUT4이다.
39. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포유동물 피험자의 해당경로 숙주세포의 활성을 줄이는 것으로 이루어진다.
40. 하위절 39의 방법으로, 효소는 다음과 같다:
i) 포도당 인산 이성질화효소,
ii) 삼탄당인산 이성질화효소1,
iii) 포스포글리세레이트 활성효소 1,
iv) 에놀라제 1(알파), 또는
v) 피루브산 활성효소, 근육.
41. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포유동물 피험자의 삼카르복실산(TCA) 회로 숙주세포의 활성을 줄이는 것으로 이루어진다.
42. 하위절 41의 방법으로, 효소는 다음과 같다:
i) 이소구연산 탈수소효소,
ii) 숙신산-CoA 결합효소,
iii) 숙신산 탈수소효소,
iv) 말산 탈수소효소,
v) 말산효소, 또는
vi) TCA 아코니타제.
43. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포유동물 피험자의 숙주 양자 ATP아제 효소 활성을 줄이는 것으로 이루어진다.
44. 하위절 43의 방법으로, 효소는 다음과 같다:
i) F0 복합체, 아단위 b, 이소형 1,
ii) F0 복합체, 아단위 c(아단위 9), 이소형 3,
iii) F0 복합체, 아단위 c(아단위 9), 이소형 1,
iv) F0 복합체, 아단위 e,
v) F0 복합체, 아단위 F6,
vi) F0 복합체, 아단위 g,
vii) F1 복합체, 알파 아단위, 이소형 1,
viii) F1 복합체, 베타 폴리펩티드,
ix) F1 복합체, 엡실론 아단위, 또는
x) F1 복합체, O 아단위.
45. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포유동물 피험자의 콜레스테롤 합성 또는 대사에 관여하는 숙주효소의 활성을 줄이는 것으로 이루어진다.
46. 하위절 45의 방법으로, 효소는 다음과 같다:
i) 아세틸-CoA 아세틸전이효소,
ii) HMG-CoA 합성효소,
iii) HMG-CoA 환원효소,
iv) 이소펜틸이인산 이성질화효소,
v) 메발론산 활성효소,
vi) 포스포메발론산 활성효소,
vii) 게라닐-이인산 합성효소,
viii) 게라닐-이인산 합성효소,
ix) 파르네실-이인산 파르네실전이효소,
x) 스쿠알렌 모노옥시게나제,
xi) 라노스테롤 합성효소,
xii) 스쿠알렌 에폭시다제, 또는
xiii) 스쿠알렌 옥시도시클라제.
47. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포유동물 피험자의 숙주 대사 또는 생합성 효소의 활성을 줄이는 것으로 이루어진다.
48. 하위절 47의 방법으로, 효소는 다음과 같다:
i) 젖산 탈수소효소 B,
ii) 디카르보닐/L-자일룰로스 환원효소,
iii) 하이드록시프로스타글란딘 탈수소효소 15-(NAD),
iv) 리불로오스-5-인산-3-에피머라제,
v) 글루탐산 탈수소효소,
vi) 글루타미나제,
vii) 인지질분해효소 A2,
viii) 사이클로옥시게나제 1, 또는
ix) 사이클로옥시게나제 2.
49. 하위절 1, 2, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 37, 39, 41, 43, 45 또는 47의 방법에서 바이러스 감염은 다음에 의해 유발된다: B형 간염 바이러스(HBV), 마못간염바이러스, 얼룩다람쥐간염바이러스, 오리B형간염바이러스 및 왜가리 B형간염바이러스를 포함한 헤파드나바이러스; 단순포진바이러스(HSV) 1형 및 2형, 수두대상포진바이러스, 거대세포바이러스(CMV), 인간 거대세포바이러스(HCMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 인간 헤르페스바이러스6(변형 A및 B), 인간 헤르페스바이러스7, 인간 헤르페스바이러스8, 카포시육종관련 헤르페스바이러스(KSHV) 및 B 바이러스를 포함한 헤르페스바이러스;폭스바이러스(폭스바이러스과); 마마바이러스, 천연두바이러스, 원숭이폭스바이러스, 소폭바이러스, 낙타폭스바이러스, 마우스폭스바이러스, 너구리폭스바이러스, 전염성연속종바이러스, 양아구창바이러스, 착유인결절바이러스, 소구진성구내염바이러스, 양폭스바이러스, 염소폭스바이러스, 럼프스킨병바이러스, 조류폭스바이러스, 카나리폭스바이러스, 비둘기폭스바이러스, 참새폭스바이러스, 점액종바이러스, 산토끼섬유종바이러스, 집토끼섬유종바이러스, 다람쥐섬유종바이러스, 돼지폭스바이러스, 타나폭스바이러스 및 야바폭스바이러스가 포함된 우두바이러스; 뎅기바이러스, C형간염바이러스(HCV), GB 간염바이러스(GBV-A, GBV-B 및 GBV-C), 웨스트나일바이러스, 황열바이러스, 세인트루이스뇌염바이러스, 일본뇌염바이러스, 포와산바이러스, 진드기매개 뇌염바이러스 및 키야사나삼림병바이러스를 포함한 플라비바이러스(플라비바이러스과); 베네수엘라말뇌염바이러스, 치쿤구니아바이러스, 로스리버바이러스, 마야로바이러스, 신드비스바이러스 및 루벨라 바이러스를 포함한 토가바이러스(토가바이러스과); 인간 면역결핍바이러스(HIV) 1형 및 2형, 인간 T세포백혈병바이러스(HTLV) 1, 2 및 5형, 마우스유선종양바이러스(MMTV), 라우스육종바이러스(RSV), 렌티바이러스를 포함한 레트로바이러스(레트로바이러스과); 중증급성호흡기증후군(SARS)바이러스가 포함된 코로나바이러스(코로나바이러스과); 에볼라바이러스, 마르부르그 바이러스를 포함한 필로바이러스(필로바이러스과); 광견병바이러스 및 수포성구내염바이러스를 포함한 랍도바이러스(랍도바이러스과); 크리미아-콩고출혈열바이러스, 리프트계곡열바이러스, 라크로세 바이러스, 한탄바이러스를 포함한 번야바이러스(번야바이러스과); 인플루엔자바이러스(A, B 및 C형)를 포함한 오르도믹소바이러스(오르소믹소바이러스과); 파라인프루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(A형과 B형), 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스를 포함한 파라믹소바이러스(파라믹소바이러스과); 림프구 맥락수막염바이러스, 주닌 바이러스, 마추포 바이러스, 구아나리토 바이러스, 라사 바이러스, 암파리 바이러스, 플렉살 바이러스, 입피 바이러스, 모발라 바이러스, 모페이아 바이러스, 라티노 바이러스, 파라나 바이러스, 피친드 바이러스, 타카라이브 바이러스, 타미아미 바이러스를 포함한 아레나바이러스(아레나바이러스과); 개파보바이러스 및 파보바이러스B19를 포함한 파보바이러스(파보바이러스과); 돼지서코바이러스1형 및 2형, BFDV(부리 및 깃털병바이러스) 및 닭빈혈바이러스를 포함한 파보바이러스(파보바이러스과); 원숭이 바이러스 40(SV40), JC 바이러스, BK 바이러스, 어린 잉꼬 질병 바이러스를 포함한 폴리오마바이러스(폴리오마바이러스과); 인간 유두종바이러스 및 소유두종바이러스(BPV) 1형을 포함한 유두종바이러스(유두종바이러스과); 인간 아데노바이러스(HAdV-A, HAdV-B, HAdV-C, HAdV-D, HAdV-E 및 HAdV-F), 가금아데노바이러스A, 양아데노바이러스D 및 개구리아데노바이러스를 포함한 아데노바이러스(아데노바이러스과); 인간 오비바이러스, 인간 콜티바이러스, 포유류 오르도레오바이러스, 청설 바이러스, 로타바이러스 A, 로타바이러스(B군 내지 G군), 콜로라도 진드기 열 바이러스, 아쿠아레오바이러스 A, 시포바이러스 1, 피지병 바이러스, 벼 왜소병 바이러스, 벼 줄무늬 잎마름병 바이러스, 이드노레오바이러스 1, 미코레오바이러스 1을 포함한 레오바이러스(레오바이러스과); 점액낭병바이러스, 췌장괴사바이러스를 포함한 비르나바이러스(비르나바이러스과); 돼지 수포성 발진 바이러스, 집토끼 출혈병 바이러스, 노르워크 바이러스, 삽포로 바이러스를 포함한 칼리시바이러스(칼리시바르나이러스과); 또는 인간 폴리오바이러스(1-3), 인간 콕삭키바이러스 A1-22, 24(CA1-22와 CA24, CA23 = 에코바이러스 9), 인간 콕삭키바이러스(B1-6(CB1-6)), 인간 에코바이러스 1-7, 9, 11-27, 29-33, 빌리유이시 바이러스, 원숭이 엔테로바이러스 1-18(SEV1-18), 돼지 엔테로바이러스 1-11(PEV1-11), 소 엔테로바이러스 1-2(BEV1-2), A형 간염 바이러스, 리노바이러스, 헤파토바이러스, 카디오바이러스, 아프토바이러스, 에코바이러스를 포함한 피코나바이러스(피코나바이러스과).
50. 하위절 1, 2, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 또는 47의 방법에서 포유동물은 인간 피험자이다.
51. 바이러스 감염 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물로, (i) 1가지 이상 화합물, 그의 전구체 또는 약학적으로 허용가능한 화합물 또는 전구체의 염, 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 운반체로 이루어진 치료적으로 효과적인 양의 조성물로 이루어진다. 여기에서 화합물은 다음과 같다:
i) 구조식 I의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00399
상기 [00101]-[00108] 절에 정의된 바에 따름;
ii) 구조식 II의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00400
상기 [00109]-[00125] 절에 정의된 바에 따름;
iii) 구조식 III의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00401
상기 [00126]-[00132] 절에 정의된 바에 따름;
iv) 구조식 IV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00402
상기 [00123]-[00141] 절에 정의된 바에 따름;
v) 구조식 V의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00403
상기 [00142]-[00151] 절에 정의된 바에 따름;
vi) 구조식 VI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00404
상기 [00152]-[00166] 절에 정의된 바에 따름;
vii) 구조식 VII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00405
상기 [00167]-[00179] 절에 정의된 바에 따름;
viii) 구조식 VIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00406
상기 [00180]-[00195] 절에 정의된 바에 따름;
ix) 구조식 IX의 화합물
Figure 112009082238916-PCT00407
상기 [00196]-[00210] 절에 정의된 바에 따름;
x) 구조식 X의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00408
상기 [00211]-[00229] 절에 정의된 바에 따름;
xi) 구조식 XI의 화합물
Figure 112009082238916-PCT00409
상기 [00230]-[00240] 절에 정의된 바에 따름;
xii) 구조식 XII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00410
상기 [00241]-[00258] 절에 정의된 바에 따름;
xiv) 구조식 XIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00411
상기 [00259]-[00269] 절에 정의된 바에 따름;
xiv) 구조식 XIV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00412
상기 [00270]-[00279] 절에 정의된 바에 따름;
xv) 구조식 XV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00413
상기 [00280]-[00289] 절에 정의된 바에 따름;
xvi) 구조식 XVI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00414
상기 [00290]-[00299] 절에 정의된 바에 따름;
xvii) 구조식 XVII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00415
상기 [00300]-[00307] 절에 정의된 바에 따름;
xviii) 구조식 XVIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00416
상기 [00308]-[00309] 절에 정의된 바에 따름;
xix) 구조식 XIX의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00417
상기 [00310]-[00311] 절에 정의된 바에 따름;
xx) 구조식 XX의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00418
상기 [00312]-[00313] 절에 정의된 바에 따름;
xxi) 구조식 XXI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00419
상기 [00314]-[00315] 절에 정의된 바에 따름;
xxii) 구조식 XXII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00420
상기 [00316]-[00323] 절에 정의된 바에 따름;
xxiii) 구조식 XXIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00421
상기 [00452] 절에 정의된 바에 따름;
xxiv) 구조식 XXIV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00422
상기 [00324]-[00348] 절에 정의된 바에 따름;
xxv) 구조식 XXV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00423
상기 [00349]-[00364] 절에 정의된 바에 따름;
xxvi) 구조식 XXVI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00424
상기 [00365]-[00380] 절에 정의된 바에 따름;
xxvii) 구조식 XXVII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00425
상기 [00381]-[00395] 절에 정의된 바에 따름;
xxviii) 구조식 XXVIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00426
상기 [00396]-[00421] 절에 정의된 바에 따름;
xxix) 구조식 XXIX의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00427
상기 [00422]-[00425] 절에 정의된 바에 따름;
xxx) 구조식 XXX의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00428
상기 [00426]-[00428] 절에 정의된 바에 따름;
xxxi) 구조식 XXXI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00429
상기 [00429]-[00433] 절에 정의된 바에 따름;
xxxii) 구조식 XXXII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00430
상기 [00447]-[00451] 절에 정의된 바에 따름;
xxxiii) 구조식 XXXIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00431
상기 [00434]-[00446] 및 [00452]-[00453] 절에 정의된 바에 따름;
xxxiv) 구조식 XXXIV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00432
상기 [00454]-[00477] 절에 정의된 바에 따름;
xxxv) 구조식 XXXV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00433
상기 [00478]-[00492] 절에 정의된 바에 따름;
xxxvi) 구조식 XXXVI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00434
상기 [00493]-[00521] 절에 정의된 바에 따름;
xxxvii) 구조식 XXXVII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00435
상기 [00522]-[00529] 절에 정의된 바에 따름;
xxxviii) 구조식 XXXVIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00436
상기 [00530]-[00548] 절에 정의된 바에 따름;
xxxix) 구조식 XXXIX의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00437
상기 [00549]-[00562] 절에 정의된 바에 따름;
xl) 구조식 XL의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00438
상기 [00563]-[00573]절에 정의된 바에 따름;
xli) 구조식 XLI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00439
상기 [00574]-[00584] 절에 정의된 바에 따름;
xlii) 구조식 XLII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00440
상기 [00585]-[00591] 절에 정의된 바에 따름;
xliii) 구조식 XLIII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00441
상기 [00592]-[00607] 절에 정의된 바에 따름;
xliv) 구조식 XLIV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00442
상기 [00608]-[00618]절에 정의된 바에 따름;
xlv) 구조식 XLV의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00443
상기 [00619]-[00620] 절에 정의된 바에 따름;
xlvi) 구조식 XLVI의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00444
,
상기 [00621]-[00622] 절에 정의된 바에 따름;
xlvii) 구조식 XLVII의 화합물:
Figure 112009082238916-PCT00445
52. 바이러스 감염 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물로, 치료적으로 효과적인 양의 지방산 생합성 억제제 및 콜레스테롤 생합성 억제제 및 약학적으로 허용가능한 운반체로 이루어진다.
53. 하위절 52의 약학적 조성물로, 지방산 생합성 억제제는 ACC[아세틸- CoA 카르복실라제] 억제제이며, 콜레스테롤 생합성 억제제는 HMGCoA(3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-CoA) 환원효소 억제제이다.
54. 인간 피험자에서 바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법으로, 효과적인 양의 4S-하이드록시구연산, 2,2-디플루오로구연산, 티올-구연산, sb201076, sb204990, 2-클로로-1,3,80트리하이드록실-6-메틸-9-안스론, 푸르푸론, 3-옥소부틸설폭실-CoA, CP610431, CP640186, 소라펜-A, 세톡시딤, 오를리스탓 또는 CT32228 또는 인간 피험자에 대해 약학적으로 허용가능한 그것의 염을 투여하는 것으로 이루어진다.
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SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of Princeton University <120> TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS BY MODULATION OF HOST CELL METABOLIC PATHWAYS <130> 12171-002-228 <140> To Be Assigned <141> <150> 60/932,769 <151> 2007-06-01 <150> 61/033,243 <151> 2008-03-03 <160> 56 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 Target Sequence 1 <400> 1 aatcactttg cccgtgtggc g 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 1 <400> 2 ucacuuugcc cguguggcgu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 1 <400> 3 cgccacacgg gcaaagugau u 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 Target Sequence 2 <400> 4 aacgttccca tctccacccc t 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 2 <400> 5 cguucccauc uccaccccuu u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 2 <400> 6 agggguggag augggaacgu u 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 Target Sequence 3 <400> 7 aagggaaatt gaggctgagg g 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand siRNA 2 <400> 8 gggaaauuga ggcugagggu u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand siRNA 2 <400> 9 cccucagccu caauuucccu u 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 Target Sequence 4 <400> 10 aaattgaggc tgagggaact g 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 4 <400> 11 auugaggcug agggaacugu u 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 4 <400> 12 caguucccuc agccucaauu u 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 Target Sequence 5 <400> 13 aactgggccc agggacggcg a 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 5 <400> 14 cugggcccag ggacggcgau u 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 5 <400> 15 ucgccguccc ugggcccagu u 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 Target Sequence 6 <400> 16 aagggctgct cgtggatgaa c 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 6 <400> 17 gggcugcucg uggaugaacu u 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 6 <400> 18 guucauccac gagcagcccu u 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 Target Sequence 7 <400> 19 aatcagatgc ttctggaacg t 21 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 7 <400> 20 ucagaugcuu cuggaacguu u 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 7 <400> 21 acguuccaga agcaucugau u 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 Target Sequence 8 <400> 22 aataatggat gaaccatctc c 21 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 8 <400> 23 uaauggauga accaucuccu u 21 <210> 24 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 8 <400> 24 ggagaugguu cauccauuau u 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC1 Target Sequence 9 <400> 25 aatggatgaa ccatctccct t 21 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 9 <400> 26 uggaugaacc aucucccuuu u 21 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 9 <400> 27 aagggagaug guucauccau u 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC2 Target Sequence 1 <400> 28 aatggtcttg cttctttgtc t 21 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 1 <400> 29 uggucuugcu ucuuugucuu u 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 1 <400> 30 agacaaagaa gcaagaccau u 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC2 Target Sequence 2 <400> 31 aagccgatca ccaagagtaa a 21 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 2 <400> 32 gccgaucacc aagaguaaau u 21 <210> 33 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 2 <400> 33 uuuacucuug gugaucggcu u 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC2 Target Sequence 3 <400> 34 aagaaacccc ctttcttcca g 21 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 3 <400> 35 gaaacccccu uucuuccagu u 21 <210> 36 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 3 <400> 36 cuggaagaaa ggggguuucu u 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC2 Target Sequence 4 <400> 37 aaagaagaca agaagcaggc a 21 <210> 38 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 4 <400> 38 agaagacaag aagcaggcau u 21 <210> 39 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 4 <400> 39 ugccugcuuc uugucuucuu u 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC2 Target Sequence 5 <400> 40 aaggtgctta ttgccaacaa c 21 <210> 41 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 5 <400> 41 ggugcuuauu gccaacaacu u 21 <210> 42 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 5 <400> 42 guuguuggca auaagcaccu u 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC2 Target Sequence 6 <400> 43 aatcagtgtc ccagaagatg t 21 <210> 44 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 6 <400> 44 ucaguguccc agaagauguu u 21 <210> 45 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 6 <400> 45 acaucuucug ggacacugau u 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC2 Target Sequence 7 <400> 46 aatttccgga gcagcaagaa c 21 <210> 47 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 7 <400> 47 uuuccggagc agcaagaacu u 21 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 7 <400> 48 guucuugcug cuccggaaau u 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC2 Target Sequence 8 <400> 49 aatttgggca ctgcttctcc t 21 <210> 50 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 8 <400> 50 uuugggcacu gcuucuccuu u 21 <210> 51 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 8 <400> 51 aggagaagca gugcccaaau u 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACC2 Target Sequence 9 <400> 52 aatacctcat taacctcctg g 21 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense Strand siRNA 9 <400> 53 uaccucauua accuccuggu u 21 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Strand siRNA 9 <400> 54 ccaggagguu aaugagguau u 21 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FYVE domain <400> 55 Phe Tyr Val Glu 1 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV-1 Tat <400> 56 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10

Claims (36)

  1. 포유류에서의 바이러스 감염 치료 또는 예방 방법으로, 치료적으로 효과적인 양의 1가지 이상 화합물 또는 그의 전구체 또는 약학적으로 허용가능한 앞서 언급한 화합물 또는 전구체의 염을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어지며 여기서의 화합물은 다음과 같다:
    i) 구조식 I의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00446
    상기 [00101]-[00108] 절에 정의된 바에 따름;
    ii) 구조식 II의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00447
    상기 [00109]-[00125] 절에 정의된 바에 따름;
    iii) 구조식 III의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00448
    상기 [00126]-[00132] 절에 정의된 바에 따름;
    iv) 구조식 IV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00449
    상기 [00123]-[00141] 절에 정의된 바에 따름;
    v) 구조식 V의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00450
    상기 [00142]-[00151] 절에 정의된 바에 따름;
    vi) 구조식 VI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00451
    상기 [00152]-[00166] 절에 정의된 바에 따름;
    vii) 구조식 VII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00452
    상기 [00167]-[00179] 절에 정의된 바에 따름;
    viii) 구조식 VIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00453
    상기 [00180]-[00195] 절에 정의된 바에 따름;
    ix) 구조식 IX의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00454
    상기 [00196]-[00210] 절에 정의된 바에 따름;
    x) 구조식 X의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00455
    상기 [00211]-[00229] 절에 정의된 바에 따름;
    xi) 구조식 XI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00456
    상기 [00230]-[00240] 절에 정의된 바에 따름;
    xii) 구조식 XII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00457
    상기 [00241]-[00258] 절에 정의된 바에 따름;
    xiii) 구조식 XIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00458
    상기 [00259]-[00269] 절에 정의된 바에 따름;
    xiv) 구조식 XIV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00459
    상기 [00270]-[00279] 절에 정의된 바에 따름;
    xv) 구조식 XV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00460
    상기 [00280]-[00289] 절에 정의된 바에 따름;
    xvi) 구조식 XVI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00461
    상기 [00290]-[00299] 절에 정의된 바에 따름;
    xvii) 구조식 XVII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00462
    [00300]-[00307] 절에 정의된 바에 따름;
    xviii) 구조식 XVIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00463
    상기 [00308]-[00309] 절에 정의된 바에 따름;
    xix) 구조식 XIX의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00464
    상기 [00310]-[00311] 절에 정의된 바에 따름;
    xx) 구조식 XX의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00465
    상기 [00312]-[00313] 절에 정의된 바에 따름;
    xxi) 구조식 XXI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00466
    상기 [00314]-[00315] 절에 정의된 바에 따름;
    xxii) 구조식 XXII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00467
    상기 [00316]-[00323] 절에 정의된 바에 따름;
    xxiii) 구조식 XXIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00468
    상기 [00452] 절에 정의된 바에 따름;
    xxiv) 구조식 XXIV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00469
    상기 [00324]-[00348] 절에 정의된 바에 따름;
    xxv) 구조식 XXV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00470
    상기 [00349]-[00364] 절에 정의된 바에 따름;
    xxvi) 구조식 XXVI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00471
    상기 [00365]-[00380] 절에 정의된 바에 따름;
    xxvii) 구조식 XXVII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00472
    상기 [00381]-[00395] 절에 정의된 바에 따름;
    xxviii) 구조식 XXVIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00473
    상기 [00396]-[00421] 절에 정의된 바에 따름;
    xxix) 구조식 XXIX의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00474
    상기 [00422]-[00425] 절에 정의된 바에 따름;
    xxx) 구조식 XXX의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00475
    상기 [00426]-[00428] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxi) 구조식 XXXI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00476
    상기 [00429]-[00433] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxii) 구조식 XXXII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00477
    상기 [00447]-[00451] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxiii) 구조식 XXXIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00478
    상기 [00434]-[00446] 및 [00452]-[00453] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxiv) 구조식 XXXIV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00479
    상기 [00454]-[00477] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxv) 구조식 XXXV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00480
    상기 [00478]-[00492] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxvi) 구조식 XXXVI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00481
    상기 [00493]-[00521] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxvii) 구조식 XXXVII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00482
    상기 [00522]-[00529] 절에 정의된 바에 따름;
    구조식 XXXVIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00483
    상기 [00530]-[00548] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxix) 구조식 XXXIX의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00484
    상기 [00549]-[00562] 절에 정의된 바에 따름;
    xl) 구조식 XL의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00485
    상기 [00563]-[00573]절에 정의된 바에 따름;
    xli) 구조식 XLI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00486
    상기 [00574]-[00584] 절에 정의된 바에 따름;
    xlii) 구조식 XLII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00487
    상기 [00585]-[00591] 절에 정의된 바에 따름;
    xliii) 구조식 XLIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00488
    상기 [00592]-[00607] 절에 정의된 바에 따름;
    xliv) 구조식 XLIV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00489
    상기 [00608]-[00618]절에 정의된 바에 따름;
    xlv) 구조식 XLV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00490
    상기 [00619]-[00620] 절에 정의된 바에 따름;
    xlvi) 구조식 XLVI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00491
    ,
    상기 [00623]-[00624] 절에 정의된 바에 따름; 또는
    xlvii) 구조식 XLVII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00492
    ,
    상기 [00620]-[00621] 절에 정의된 바에 따른다.
  2. 포유류에서의 바이러스 감염 치료 또는 예방 방법으로, 치료적으로 효과적인 양의 1가지 이상 화합물 또는 그의 전구체 또는 약학적으로 허용가능한 화합물 또는 전구체의 염을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어지며 여기서의 화합물은 구조식 XXXIII의 화합물이다.
    Figure 112009082238916-PCT00493
    ;
    여기서:
    a) X는 -COOH, -CO2(C1-C6)알킬, -CONH-2, -H, -CO(C1-C6)알킬, -COC(할로)3 또는 보효소 A와 부가물을 형성할 수 있는 성분이다.
    b) Y는 O 또는 S; -NH 또는 N(C1-C6)알키이다. 그리고
    c) Z는 -(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)알킬 혹은 -(C5-C20)알콕시, -(C5-C20)할로알킬, -O-(C5-C20)할로알킬 혹은 -(C5-C20)할로알콕시, -할로, -OH, -(C5-C20)알케닐, -(C5-C20)알키닐, -(C5-C20)알콕시-알케닐, -(C5-C20)하이드록시알킬, -O(C1-C6)알킬, -CO2(C1-C6)알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐, -O(C5-C20)시클로알킬;, -S(C5-C20)알킬, -NH(C5-C20)알킬, -NHCO(C5-C20)알킬, -N(C1-C6)알킬CO(C5-C20)알킬 혹은 -O(C5-C20)알콕시이다.
  3. 제2항의 방법으로, 구조식 XXXIII의 화합물의 X는 보효소 A와 에스테르 연결을 형성할 수 있는 성분이다.
  4. 제 2항의 방법으로, 구조식 XXXIII의 화합물의 X는 구조식의 화합물을 형성하는 성분이다.
    Figure 112009082238916-PCT00494
  5. 제2항의 방법으로, 구조식 XXXIII의 X는 -COOH이다.
  6. 제2항의 방법으로, 구조식 XXXIII의 Y는 O이다.
  7. 제2항의 방법으로, 구조식XXXIII의 Z는 -O(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)할로알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐 혹은 -O(C5-C20)알콕시이다.
  8. 제2항의 방법으로, 구조식 XXXIII의 Y는 O이고, X는 -COOH 이며, Z는 -O(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)할로알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐 혹은 -O(C5-C20)알콕시이다.
  9. 제2항의 방법으로, 구조식 XXXIII의 화합물은 다음 구조를 가진다:
    Figure 112009082238916-PCT00495
    ,
    여기서
    X는 -COOH, -CO2(C1-C6)알킬, -CONH2, -H, -CO(C1-C6)알킬, -COC(할로)3, 또는
    Figure 112009082238916-PCT00496
    이다.
  10. 제2항의 방법으로, 구조식 XXXIII의 화합물은 다음 구조를 가진다:
    Figure 112009082238916-PCT00497
    ;
    Figure 112009082238916-PCT00498
    ; 또는
    Figure 112009082238916-PCT00499
    .
  11. 제2항의 방법으로, 구조식 XXXIII의 화합물은 다음 구조를 가진다:
    Figure 112009082238916-PCT00500
    ;
    여기서:
    i) X는 -(C5-C20)알킬, -O(C5-C20)알킬 혹은 -(C5-C20)알콕시, -(C5-C20)할로알킬, -O-(C5-C20)할로알킬 혹은 -(C5-C20)할로알콕시, -할로, -OH, -(C5-C20)알케닐, -(C5-C20)알키닐, -(C5-C20)알콕시-알케닐, -(C5-C20)하이드록시알킬, -O(C1-C6)알킬, -CO2(C1-C6)알킬, -O(C5-C20)알케닐, -O(C5-C20)알키닐, -O(C5-C20)시클로알킬, -S(C5-C20)알킬, -NH(C5-C20)알킬, -NHCO(C5-C20)알킬, -N(C1-C6)알킬CO(C5-C20)알킬 혹은 -O(C5-C20)알콕시이다. 그리고
    ii) Y는 O, S, -NH 혹은 N(C1-C6)알킬이다
  12. 제2항의 방법으로, 구조식 XXXIII의 화합물은 다음 구조를 가진다:
    Figure 112009082238916-PCT00501
    ;
    Figure 112009082238916-PCT00502
    ;
    Figure 112009082238916-PCT00503
    ;
    Figure 112009082238916-PCT00504
    ;
    Figure 112009082238916-PCT00505
    ; 또는
    Figure 112009082238916-PCT00506
    .
  13. 제2항의 방법으로, 상기 화합물은 5-(테트라데실옥시)-2-푸로산 [TOFA]이다.
  14. 제2항의 방법으로, 상기 화합물은 TOFA가 아니다.
  15. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 지방산 생합성 경로에서 효소 활성을 억제하는 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
  16. 제15항의 방법으로, 숙주효소는 다음과 같다:
    i) 아세틸 CoA 카르복실라제,
    ii) ATP 구연산 분해효소,
    iii) HMG-CoA 합성효소,
    iv) 지방산 합성효소 영역,
    v) 지방산 합성효소 케토-아실 합성효소 영역,
    vi) 지방산 합성효소 티오에스터라제 영역,
    vii) 리소포스파티드산 아실전이효소,
    viii) 리소포스파티드산 아실전이효소-베타,
    ix) 말로닐-CoA 디카르복실라제,
    x) AMP-활성 단백질 활성효소(AMPK),
    xi) 지방산 연장효소,
    xii) ELOVL(매우 긴 사슬 지방산의 연장),
    xiii) 스테아로일-CoA 불포화효소 1-5,
    xiv) 델타-6-불포화효소, 또는
    xv) 델타-5-불포화효소.
  17. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 지방산 생합성 경로에서 숙주효소의 활성을 억제하는 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
  18. 제17항의 방법으로, 숙주효소는 다음과 같다:
    i) 메틸말로닐 보효소 A 뮤타제,
    ii) 아실-보효소 A 카르복실라제 베타,
    iii) 아실-보효소 A 산화효소2, 분지형 사슬,
    iv) 잠정 아실-CoA 탈수소효소,
    v) 단분지사슬 아실-보효소 A 탈수소효소,
    vi) 생체이물/배지-사슬 지방산:CoA 결합효소,
    vii) 3을 포함한 에노일 보효소 A 수화효소 영역,
    viii) 인지질 스크램블라제 1,
    ix) 인지질 스크램블라제 2,
    x) 인지질 스크램블라제 4,
    xi) 지방산 불포화효소 1,
    xii) 카르티닌 팔미토일 전이효소(CPT),
    xiii) 지방산 결합 단백질 5(건선 관련), 또는
    xiv) 지방산 결합 단백질 3, 근육 및 심장(유선 유래 증식 억제제).
  19. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 콜레스테롤 합성 또는 대사에 관여하는 숙주 효소의 활성을 억제하는 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
  20. 제19항의 방법으로, 효소는 다음과 같다:
    i) 아세틸-CoA 아세틸전이효소,
    ii) HMG-CoA 합성효소,
    iii) HMG-CoA 환원효소,
    iv) 이소펜틸이인산 이성질화효소,
    v) 메발론산 활성효소,
    vi) 포스포메발론산 활성효소,
    vii) 게라닐-이인산 합성효소,
    viii) 파르네실-이인산 합성효소,
    ix) 파르네실-이인산 파르네실전이효소,
    x) 스쿠알렌 모노옥시게나제,
    xi) 라노스테롤 합성효소,
    xii) 스쿠알렌 에폭시다제, 또는
    xiii) 스쿠알렌 옥시도시클라제.
  21. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 숙주 대사 또는 생합성 효소의 활성을 억제하는 치료적으로 효과적인 양의 화합물을 포유동물 피험자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
  22. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 치료적으로 효과적인 양의 지방산 생합성 억제제 또는 콜레스테롤 생합성 억제제 또는 그의 전구체 또는 약학적으로 허용가능한 앞서 언급한 억제제 또는 전구체를 포유동물 피 험자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
  23. 제22항의 방법으로, 지방산 생합성 억제제는 ACC[아세틸-CoA 카르복실라제] 억제제이며, 콜레스테롤 생합성 억제제는 HMGCoA(3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-CoA) 환원효소 억제제이다.
  24. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포유동물 피험자의 지방산 생합성 경로 숙주세포의 활성을 줄이는 것으로 이루어진다.
  25. 제24항의 방법으로, 숙주효소는 다음과 같다:
    i) 아세틸CoA 카르복실라제,
    ii) ATP 구연산 분해효소,
    iii) HMG-CoA 합성효소,
    iv) 지방산 합성효소 영역,
    v) 지방산 합성효소 케토-아실 합성효소 영역,
    vi) 지방산 합성효소 티오에스터라제 영역,
    vii) 리소포스파티드산 아실전이효소,
    viii) 리소포스파티드산 아실전이효소-베타,
    ix) 말로닐-CoA 디카르복실라제,
    x) AMP-활성 단백질 활성효소(AMPK),
    xi) 지방산 연장효소,
    x) ELOVL(매우 긴 사슬 지방산의 연장),
    xiii) 스테아로일-Co 불포화효소 1-5,
    xiv) 델타-6-불포화효소, 또는
    xv) 델타-5-불포화효소.
  26. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포유동물 피험자의 지방산 대사 경로 숙주세포의 활성을 줄이는 것으로 이루어진다.
  27. 제26항의 방법으로, 숙주효소는 다음과 같다:
    i) 메틸말로닐 보효소 A 뮤타제,
    ii) 아실-보효소 A 카르복실라제 베타,
    iii) 아실-보효소 A 산화효소2, 분지형 사슬,
    iv) 잠정 아실-CoA 탈수소효소,
    v) 단분지사슬 아실-보효소 A 탈수소효소,
    vi) 생체이물/배지-사슬 지방산:CoA 결합효소,
    vii) 3을 포함한 에노일 보효소 A 수화효소 영역,
    viii) 인지질 스크램블라제 1,
    ix) 인지질 스크램블라제 2,
    x) 인지질 스크램블라제 4,
    xi) 지방산 불포화효소 1,
    xii) 카르티닌 팔미토일 전이효소(CPT),
    xiii) 지방산 결합 단백질 5(건선 관련), 또는
    xiv) 지방산 결합 단백질 3, 근육 및 심장(유선 유래 증식 억제제).
  28. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포유동물 피험자의 콜레스테롤 합성 또는 대사에 관여하는 숙주효소의 활성을 줄이는 것으로 이루어진다.
  29. 제28항의 방법으로, 효소는 다음과 같다:
    i) 아세틸-CoA 아세틸전이효소,
    ii) HMG-CoA 합성효소,
    iii) HMG-CoA 환원효소,
    iv) 이소펜틸이인산 이성질화효소,
    v) 메발론산 활성효소,
    vi) 포스포메발론산 활성효소,
    vii) 게라닐-이인산 합성효소,
    viii) 게라닐-이인산 합성효소,
    ix) 파르네실-이인산 파르네실전이효소,
    x) 스쿠알렌 모노옥시게나제,
    xi) 라노스테롤 합성효소,
    xii) 스쿠알렌 에폭시다제, 또는
    xiii) 스쿠알렌 옥시도시클라제.
  30. 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로, 포유동물 피험자의 숙주 대사 또는 생합성 효소의 활성을 줄이는 것으로 이루어진다.
  31. 바이러스 감염 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물로, (i) 1가지 이상 화합물, 그의 전구체 또는 약학적으로 허용가능한 화합물 또는 전구체의 염, 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 운반체로 이루어진 치료적으로 효과적인 양의 조성물로 이루어진다. 여기서 화합물은 다음과 같다:
    i) 구조식 I의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00507
    상기 [00101]-[00108] 절에 정의된 바에 따름;
    ii) 구조식 II의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00508
    상기 [00109]-[00125] 절에 정의된 바에 따름;
    iii) 구조식 III의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00509
    상기 [00126]-[00132] 절에 정의된 바에 따름;
    iv) 구조식 IV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00510
    상기 [00123]-[00141] 절에 정의된 바에 따름;
    v) 구조식 V의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00511
    상기 [00142]-[00151] 절에 정의된 바에 따름;
    vi) 구조식 VI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00512
    상기 [00152]-[00166] 절에 정의된 바에 따름;
    vii) 구조식 VII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00513
    상기 [00167]-[00179] 절에 정의된 바에 따름;
    viii) 구조식 VIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00514
    상기 [00180]-[00195] 절에 정의된 바에 따름;
    ix) 구조식 IX의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00515
    상기 [00196]-[00210] 절에 정의된 바에 따름;
    x) 구조식 X의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00516
    상기 [00211]-[00229] 절에 정의된 바에 따름;
    xi) 구조식 XI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00517
    상기 [00230]-[00240] 절에 정의된 바에 따름;
    xii) 구조식 XII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00518
    상기 [00241]-[00258] 절에 정의된 바에 따름;
    xiii) 구조식 XIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00519
    상기 [00259]-[00269] 절에 정의된 바에 따름;
    xiv) 구조식 XIV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00520
    상기 [00270]-[00279] 절에 정의된 바에 따름;
    xv) 구조식 XV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00521
    상기 [00280]-[00289] 절에 정의된 바에 따름;
    xvi) 구조식 XVI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00522
    상기 [00290]-[00299] 절에 정의된 바에 따름;
    xvii) 구조식 XVII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00523
    상기 [00300]-[00307] 절에 정의된 바에 따름;
    xviii) 구조식 XVIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00524
    상기 [00308]-[00309] 절에 정의된 바에 따름;
    xix) 구조식 XIX의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00525
    상기 [00310]-[00311] 절에 정의된 바에 따름;
    xx) 구조식 XX의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00526
    상기 [00312]-[00313] 절에 정의된 바에 따름;
    xxi) 구조식 XXI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00527
    상기 [00314]-[00315] 절에 정의된 바에 따름;
    xxii) 구조식 XXII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00528
    상기 [00316]-[00323] 절에 정의된 바에 따름;
    xxiii) 구조식 XXIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00529
    상기 [00452] 절에 정의된 바에 따름;
    xxiv) 구조식 XXIV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00530
    상기 [00324]-[00348] 절에 정의된 바에 따름;
    xxv) 구조식 XXV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00531
    상기 [00349]-[00364] 절에 정의된 바에 따름;
    xxvi) 구조식 XXVI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00532
    상기 [00365]-[00380] 절에 정의된 바에 따름;
    xxvii) 구조식 XXVII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00533
    상기 [00381]-[00395] 절에 정의된 바에 따름;
    xxviii) 구조식 XXVIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00534
    상기 [00396]-[00421] 절에 정의된 바에 따름;
    xxix) 구조식 XXIX의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00535
    상기 [00422]-[00425] 절에 정의된 바에 따름;
    xxx) 구조식 XXX의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00536
    상기 [00426]-[00428] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxi) 구조식 XXXI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00537
    상기 [00429]-[00433] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxii) 구조식 XXXII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00538
    상기 [00447]-[00451] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxiii) 구조식 XXXIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00539
    상기 [00434]-[00446] 및 [00452]-[00453] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxiv) 구조식 XXXIV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00540
    상기 [00454]-[00477] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxv) 구조식 XXXV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00541
    상기 [00478]-[00492] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxvi) 구조식 XXXVI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00542
    상기 [00493]-[00521] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxvii) 구조식 XXXVII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00543
    상기 [00522]-[00529] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxviii) 구조식 XXXVIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00544
    상기 [00530]-[00548] 절에 정의된 바에 따름;
    xxxix) 구조식 XXXIX의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00545
    상기 [00549]-[00562] 절에 정의된 바에 따름;
    xl) 구조식 XL의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00546
    상기 [00563]-[00573]절에 정의된 바에 따름;
    xli) 구조식 XLI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00547
    상기 [00574]-[00584] 절에 정의된 바에 따름;
    xlii) 구조식 XLII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00548
    상기 [00585]-[00591] 절에 정의된 바에 따름;
    xliii) 구조식 XLIII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00549
    상기 [00592]-[00607] 절에 정의된 바에 따름;
    xliv) 구조식 XLIV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00550
    상기 [00608]-[00618]절에 정의된 바에 따름;
    xlv) 구조식 XLV의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00551
    상기 [00619]-[00620] 절에 정의된 바에 따름;
    xlvi) 구조식 XLVI의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00552
    ,
    상기 [00621]-[00622] 절에 정의된 바에 따름; 또는
    xlvii) 구조식 XLVII의 화합물:
    Figure 112009082238916-PCT00553
    ,
    상기 [00623]-[00624] 절에 정의된 바에 따른다.
  32. 바이러스 감염 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물로, 치료적으로 효과적인 양의 지방산 생합성 억제제 및 콜레스테롤 생합성 억제제 및 약학적으로 허용가능한 운반체로 이루어진다.
  33. 제32항의 약학적 조성물로, 지방산 생합성 억제제는 ACC[아세틸-CoA 카르복실라제] 억제제이며, 콜레스테롤 생합성 억제제는 HMGCoA(3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-CoA) 환원효소 억제제이다.
  34. 인간 피험자에서 바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법으로, 효과적인 양의 4S-하이드록시구연산, 2,2-디플루오로구연산, 티올-구연산, sb201076, sb204990, 2-클로로-1,3,8-트리하이드록실-6-메틸-9-안스론, 푸르푸론, 3-옥소부틸설폭실-CoA, CP610431, CP640186, 소라펜-A, 세톡시딤, 오를리스탓 또는 CT32228 또는 인간 피험자에 대해 약학적으로 허용가능한 그것의 염을 투여하는 것으로 이루어진다.
  35. 청구항 제1항, 제2항, 제15항, 제17항, 제19항, 제21항, 제22항, 제24항, 제26항, 제28항, 제30항, 제31항, 제32항 및 제34항의 방법에서 바이러스 감염은 다음에 의해 유발된다: B형 간염 바이러스(HBV), 마못간염바이러스, 얼룩다람쥐 간염바이러스, 오리 B형 간염바이러스 및 왜가리 B형 간염바이러스를 포함한 헤파드나바이러스; 단순포진바이러스(HSV) 1형 및 2형, 수두대상포진바이러스, 거대세포바이러스(CMV), 인간 거대세포바이러스(HCMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 인간 헤르페스바이러스6(변형 A및 B), 인간 헤르페스바이러스7, 인간 헤르페스바이러스8, 카포시육종관련 헤르페스바이러스(KSHV) 및 B 바이러스를 포함한 헤르페스바이러스;폭스바이러스(폭스바이러스과); 마마바이러스, 천연두바이러스, 원숭이폭스바이러스, 소폭바이러스, 낙타폭스바이러스, 마우스폭스바이러스, 너구리폭스바이러스, 전염성연속종바이러스, 양아구창바이러스, 착유인결절바이러스, 소구진성구내염바이러스, 양폭스바이러스, 염소폭스바이러스, 럼프스킨병바이러스, 조류폭스바이러스, 카나리폭스바이러스, 비둘기폭스바이러스, 참새폭스바이러스, 점액종바이러스, 산토끼섬유종바이러스, 집토끼섬유종바이러스, 다람쥐섬유종바이러스, 돼지폭스바이러스, 타나폭스바이러스 및 야바폭스바이러스가 포함된 우두바이러스; 뎅기바이러스, C형간염바이러스(HCV), GB 간염바이러스(GBV-A, GBV-B 및 GBV-C), 웨스트나일바이러스, 황열바이러스, 세인트루이스뇌염바이러스, 일본뇌염바이러스, 포와산바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 키야사나삼림병바이러스를 포함한 플라비바이러스(플라비바이러스과); 베네수엘라말뇌염바이러스, 치쿤구니아바이러스, 로스 리버바이러스, 마야로바이러스, 신드비스바이러스 및 루벨라 바이러스를 포함한 토가바이러스(토가바이러스과); 인간 면역결핍바이러스(HIV) 1형 및 2형, 인간 T세포백혈병바이러스(HTLV) 1, 2 및 5형, 마우스유선종양바이러스(MMTV), 라우스육종바이러스(RSV), 렌티바이러스를 포함한 레트로바이러스(레트로바이러스과); 중증급성호흡기증후군(SARS)바이러스가 포함된 코로나바이러스(코로나바이러스과); 에볼라바이러스, 마르부르그 바이러스를 포함한 필로바이러스(필로바이러스과); 광견병바이러스 및 수포성구내염바이러스를 포함한 랍도바이러스(랍도바이러스과); 크리미아-콩고출혈열바이러스, 리프트계곡열바이러스, 라크로세 바이러스, 한탄바이러스를 포함한 번야바이러스(번야바이러스과); 인플루엔자바이러스(A, B 및 C형)를 포함한 오르도믹소바이러스(오르소믹소바이러스과); 파라인프루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(A형과 B형), 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스를 포함한 파라믹소바이러스(파라믹소바이러스과); 림프구 맥락수막염바이러스, 주닌 바이러스, 마추포 바이러스, 구아나리토 바이러스, 라사 바이러스, 암파리 바이러스, 플렉살 바이러스, 입피 바이러스, 모발라 바이러스, 모페이아 바이러스, 라티노 바이러스, 파라나 바이러스, 피친드 바이러스, 타카라이브 바이러스, 타미아미 바이러스를 포함한 아레나바이러스(아레나바이러스과); 개파보바이러스 및 파보바이러스B19를 포함한 파보바이러스(파보바이러스과); 돼지서코바이러스1형 및 2형, BFDV(부리 및 깃털병바이러스) 및 닭빈혈바이러스를 포함한 파보바이러스(파보바이러스과); 원숭이 바이러스 40(SV40), JC 바이러스, BK 바이러스, 어린 잉꼬 질병 바이러스를 포함한 폴리오마바이러스(폴리오마바이러스과); 인간 유두종바이러스 및 소유두종바 이러스(BPV) 1형을 포함한 유두종바이러스(유두종바이러스과); 인간 아데노바이러스(HAdV-A, HAdV-B, HAdV-C, HAdV-D, HAdV-E 및 HAdV-F), 가금아데노바이러스A, 양아데노바이러스D 및 개구리아데노바이러스를 포함한 아데노바이러스(아데노바이러스과); 인간 오비바이러스, 인간 콜티바이러스, 포유류 오르도레오바이러스, 청설 바이러스, 로타바이러스 A, 로타바이러스(B군 내지 G군), 콜로라도 진드기 열 바이러스, 아쿠아레오바이러스 A, 시포바이러스 1, 피지병 바이러스, 벼 왜소병 바이러스, 벼 줄무늬 잎마름병 바이러스, 이드노레오바이러스 1, 미코레오바이러스 1을 포함한 레오바이러스(레오바이러스과); 점액낭병바이러스, 췌장괴사바이러스를 포함한 비르나바이러스(비르나바이러스과); 돼지 수포성 발진 바이러스, 집토끼 출혈병 바이러스, 노르워크 바이러스, 삽포로 바이러스를 포함한 칼리시바이러스(칼리시바르나이러스과); 또는 인간 폴리오바이러스(1-3), 인간 콕삭키바이러스 A1-22, 24(CA1-22와 CA24, CA23 = 에코바이러스 9), 인간 콕삭키바이러스(B1-6(CB1-6)), 인간 에코바이러스 1-7, 9, 11-27, 29-33, 빌리유이시 바이러스, 원숭이 엔테로바이러스 1-18(SEV1-18), 돼지 엔테로바이러스 1-11(PEV1-11), 소 엔테로바이러스 1-2(BEV1-2), A형 간염 바이러스, 리노바이러스, 헤파토바이러스, 카디오바이러스, 아프토바이러스, 에코바이러스를 포함한 피코나바이러스(피코나바이러스과).
  36. 청구항 제1항, 제2항, 제15항, 제17항, 제19항, 제21항, 제22항, 제24항, 제26항, 제28항, 제30항, 제31항, 제32항 및 제34항의 방법에서 포유동물은 인간 피험자이다.
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