JP4790619B2 - 遺伝子サイレンシングのためのsiRNAを設計する方法 - Google Patents
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Description
本発明は転写産物中のsiRNA標的モチーフを同定する方法に関する。本発明はまた、siRNAの標的外遺伝子を同定する方法に関する。本発明はさらに、より高いサイレンシング効果及び特異性を有するsiRNAを設計する方法に関する。本発明はまた、高いサイレンシング効果及び特異性を有するsiRNAを含むsiRNAのライブラリーに関する。
RNA干渉(RNAi)は、哺乳類細胞における遺伝子発現を抑制する強力な方法であり、科学界を非常に騒がせてきた(Couzin, 2002, Science 298: 2296-2297; McManusら, 2002, Nat. Rev. Genet. 3,737-747 ; Hannon, G. J., 2002, Nature 418,244-251 ; Paddisonら, 2002, CancerCell 2, 17-23)。RNA干渉は進化を通じて線虫からヒトまで保存されており、RNAウイルスによる進入から細胞を保護する際に機能すると信じられている。細胞がdsRNAウイルスによって感染される際、dsRNAが認識され、ダイサーと称するRNアーゼIII型酵素による切断の標的とされる。ダイサー酵素はRNAを、siRNA又は低分子干渉RNAと称する21ntの短い二本鎖(各鎖の3'末端に対を形成していない2つのヌクレオチドと完全に対合した19ntのリボヌクレオチドからなる)に「切断(dice)」する。これらの短い二本鎖はRISCと称する多タンパク質複合体と会合して、この複合体をsiRNAと類似の配列を有するmRNA転写産物に導く。結果として、RISC複合体に存在するヌクレアーゼがmRNA転写産物を切断して、この遺伝子産物の発現を破壊する。ウイルス感染の場合、この機構はウイルス転写産物の破壊を生じるため、ウイルス合成を防止するだろう。siRNAは二本鎖であるため、いずれかの鎖がRISCと会合する可能性を有し、配列類似性を有する転写産物のサイレンシングに導く。
一態様において、本発明は複数の異なるsiRNAから生物中の標的遺伝子をサイレンシングするための1以上のsiRNAを選択する方法であって(該複数の異なるsiRNAはそれぞれ標的遺伝子の転写産物中の異なる標的配列を標的化する)、該方法が(a)転写産物中の対応する標的配列モチーフの位置塩基組成(positional base composition)に従って該複数の異なるsiRNAを順位付けすること(ここで、各標的配列モチーフは対応するsiRNAの標的配列の少なくとも一部分、及び/又は標的配列にフランキングする配列領域中の第2配列を含む);並びに(b)順位付けしたsiRNAから1以上のsiRNAを選択することを含む、上記方法を提供する。好適な実施形態では、各配列モチーフは標的化siRNAの標的配列を含む。他の実施形態では、順位付け工程は(a1)異なる各siRNAについてスコアを決定すること(ここで、該スコアは位置特異的スコア行列を用いて算出される);及び(a2)該スコアに従って複数の異なるsiRNAを順位付けすること、によって実施される。
に従って算出される。
に従って位置適合スコアpmScoreを算出することを含み、そして工程(i2)は位置適合スコアが所与の閾値を超える場合に遺伝子を標的外遺伝子として予測することを含む。
に従って算出すること;(ee)複数のsiRNA機能的配列モチーフ間で、該スコアとsiRNAの特徴の測定基準との相関関係を算出すること;(ff)選択した重みの複数の異なる値について所与の範囲で工程(cc)〜(ee)を繰り返し、選択した重みの最大相関に対応する値を保持すること;及び(gg)工程(bb)〜(ff)を選択した回数繰り返してPSSMを決定すること、を含む方法によって得られる。
siRNAによって直接サイレンシングされる);(ii)複数の異なるsiRNAを標的外遺伝子の数によって順位付けすること;及び(iii)所与の閾値未満の標的外遺伝子の数について1以上のsiRNAを選択することを含む。
に従って位置適合スコアpmScoreを算出することを含み、工程(i2)は位置適合スコアが所与の閾値より大きい場合に遺伝子を標的外遺伝子として予測することを含む。
に従って、試験psPSSMを用いて、複数のsiRNA機能的配列モチーフの各スコアを算出すること;(e)複数のsiRNA機能的配列モチーフ間で、該スコアとsiRNAを特徴付ける測定基準との相関関係を算出すること;(f)選択した重みの異なる複数の値について所与の範囲で工程(c)〜(e)を繰り返し、選択した重みの最大相関に対応する値を保持すること;及び(g)工程(b)〜(f)を選択した回数繰り返して、psPSSMを決定することを含む。
に従って、試験psPSSMを用いて複数のsiRNA機能的配列モチーフの各スコアを算出すること;(e)複数のsiRNA機能的配列モチーフ間で、該スコアとsiRNAの特徴の測定基準との相関関係を算出すること;(f)選択した重みの複数の異なる値について所与の範囲で工程(c)〜(e)を繰り返し、選択した重みの最大相関に対応する値を保持すること;及び(g)工程(b)〜(f)を選択した回数繰り返して、psPSSMを決定することを含む。
に従って、複数のN siRNA標的外配列に基づいて算出すること(ここでi=1,2,…,Lである);(c)位置iが適合する場合にEi=Piであり、かつ位置iが適合しない場合にEi=(1-Pi)/3となるように、Eiを算出することによってpsPSSMを決定することを含む。
に従って、試験位置特異的スコア行列を用いて複数のsiRNAのそれぞれのスコアを算出すること;(e)複数のsiRNA間で、該スコアとsiRNAの特徴の測定基準との相関関係を算出すること;(f)選択した重みの異なる複数の値について工程(c)〜(e)を繰り返して、選択した重みの最大相関に対応する値を保持すること;及び(g)工程(b)〜(f)を選択した回数繰り返して、位置特異的スコア行列を決定すること、を含む方法によって得られる。
図1A-Cは、siRNA標的配列中の及び該標的配列周辺の塩基組成がsiRNAのサイレンシング効果に影響することを示す。合計377つのsiRNAを、HeLa細胞へのトランスフェクションの24時間後に、Taqman分析によってその標的配列をサイレンシングする能力について試験した。中央値標的サイレンシングは約75%であった。このデータセットを、中央値未満である小集団と中央値サイレンシング能と同等であるか又はそれ以上であるサブセットに2分割した(それぞれ「粗悪な(bad)」及び「良好な」(good)」siRNAと称する)。ここに示されるのは、良好なsiRNAと粗悪なsiRNA間の、標的配列の各相対的位置での、GC含量(図1A)、A含量(図1B)及びU含量(図1C)における5のウインドウ内の平均差(すなわち5塩基全てにわたって平均化した)である。
本発明は、位置特異的スコア行列アプローチを用いて転写産物中のsiRNA標的モチーフを同定する方法を提供する。本発明はまた、位置特異的スコアマトリックアプローチを用いてsiRNAの標的外遺伝子を同定するための及びsiRNAの特異性を予測するための方法を提供する。本発明はさらに、より高いサイレンシング効果及び特異性を有するsiRNAを設計する方法を提供する。本発明はまた、高いサイレンシング効果及び特異性を有するsiRNAを含むsiRNAのライブラリーを提供する。
本発明は、転写産物の分解のためにsiRNAによって標的化し得る、転写産物中の配列モチーフ(例えば非常に効果的な標的化部位でありそうな配列モチーフ)を同定する方法を提供する。かかる配列モチーフはsiRNA感受性(susceptible)モチーフとも称する。この方法は、おそらくsiRNAによる標的化が所望でない、転写産物中の配列モチーフ(例えば効果の乏しいsiRNA標的化部位でありそうな配列モチーフ)を同定するために使用することもできる。かかる配列モチーフはsiRNA耐性モチーフとも称する。
好適な実施形態では、機能的配列モチーフのプロファイルは位置特異的スコア行列(PSSM)を用いて表される。PSSMの一般的な議論は、例えばR. Durbin、S. Eddy、A. Krogh及びG. Mitchisonによる「Biological Sequence Analysis」(Cambridge Univ. Press, 1998)及びHenikoffら, 1994, J Mol Biol. 243: 574-8で見つけることができる。PSSMは、機能的配列モチーフの特徴を捕獲する、配列モチーフの記述子である。この開示において、PSSMは本発明の配列モチーフ(例えば感受性又は耐性モチーフ)を記載するために使用される。siRNA感受性(耐性)モチーフのPSSMは感受性(耐性)PSSMとも称される。当業者は、位置特異的スコア行列が位置特異的スコアリング行列、位置重み行列(PWM)又はプロファイルとも称されることを理解するだろう。
本発明は、siRNAを特徴付けるいくつかの数量が測定されている複数のsiRNAに基づいて、機能的配列モチーフのPSSMを決定する方法を提供する。例えば、サイレンシング効果が測定されている複数のsiRNAを、siRNA感受性又は耐性配列モチーフのPSSMの決定に使用することができる。この開示において、簡便化のために、この効果はしばしばsiRNAを分類するための測度として使用される。siRNAの効果は標的配列をサイレンシングするために設計された他のsiRNAの不在下で測定される。本発明の方法が、siRNAが他の測度に基づいて分類された場合にも等しく適用可能であることは当業者に明らかであろう。そのような複数のsiRNAはsiRNAのライブラリーとも称される。目的の機能的配列モチーフが、一方又は両方のフランキング領域中の1以上の配列を含む場合には、複数のsiRNA機能的モチーフ(すなわち、転写産物中にsiRNA標的配列とフランキング配列中の配列とを含む配列)を機能的モチーフのPSSMの決定に使用することができる。好適な実施形態では、siRNA機能的配列モチーフは、19ヌクレオチドのsiRNA標的配列と、siRNA標的配列のいずれかの側の10ヌクレオチドのフランキング配列からなる。簡便化のために、この開示において指定がない限り、「siRNAのライブラリー」という用語は、しばしばsiRNAのライブラリーとsiRNA機能的モチーフのライブラリーの両方を指すために使用される。後者において、siRNAの効果に言及する場合に、そのモチーフを標的化するsiRNAの効果を指すことは理解されるだろう。複数のsiRNA又はsiRNA標的モチーフが少なくとも10、50、100、200、500、1000又は10000個の異なるsiRNA又はsiRNA標的モチーフを含むことが好ましい。
ピーク1
平均: 1.5
標準偏差: 2
振幅: 0.0455
ピーク1の平均、標準偏差及び振幅は、Set1トレーニングセット及び試験セットにおいて、siRNA標的部位の塩基−2〜5内に生じる、良好なsiRNAと粗悪なsiRNAとの間のGC含量の平均差のピークに対応するように設定される。
平均: 11
標準偏差: 0.5
振幅: 0.0337
ピーク2の平均、標準偏差及び振幅は、Set1トレーニングセット及び試験セットにおいて、siRNA標的部位の塩基10〜12内に生じる、良好なsiRNAと粗悪なsiRNAとの間のGC含量の平均差のピークに対応するよう設定される。
平均: 18.5
標準偏差: 4
振幅: -0.0548
ピーク3の平均、標準偏差及び振幅は、Set1トレーニングセット及び試験セットにおいて、siRNA標的部位の塩基12〜25内に生じる、良好なsiRNAと粗悪なsiRNAとの間のGC含量の平均差のピークに対応するよう設定される。
位置特異的スコアリング行列アプローチはsiRNA機能的モチーフ(例えば、siRNA感受性及び耐性モチーフ)を表す好適な方法である。しかし、PSSMで表された情報は、特定の位置における塩基組成の重みをも提供する別の方法によって表すこともできる。この節はsiRNA機能的モチーフを評価するための上記方法を提供する。
配列中の位置で塩基組成を重み付けする共通の方法は、配列位置の「ウインドウ」中で特定の塩基又は塩基のセットの数を集計することである。あるいは、集計は割合として表される。ウインドウスコアとも称されるそのようなスコアの値の数はウインドウの大きさに左右される。例えば、G/C含量についてサイズ5のウインドウをスコア付けすることは、0、1、2、3、4若しくは5の値;又は0%、20%、40%、60%、80%又は100%の値を与え得る。
1.直接的なパラメーター
ATG_Dist‐開始コドンまでの距離
STOP_Dst‐コード領域の末端までの距離
Cording_Percent‐コード領域の長さの割合としてのATG_Dist
End_Dist‐転写産物の末端までの距離
Total_Percent‐転写産物配列の長さの割合としての開始位置
2.ウインドウベースのパラメーター
転写産物配列上の119塩基を考慮した(19mer+下流50塩基及び上流50塩基)。サイズ3〜10のウインドウを、119塩基チャンクの初めから終わりまで各位置について調査した。以下の項目を各ウインドウ位置についてカウントした:
a.塩基(A、C、G又はU)の数
b.塩基対(M(A又はC)、R(A又はG)、W(A又はU)、S(C又はG)、Y(C又はU)及びK(G又はU))の数
c.様々な序列の二量体(AC、AT、AG、MM、RY、KM、SW等)の数
d.上記1塩基又は2塩基ユニットの最長ストレッチ
3.モチーフベースのパラメーター
これらのパラメーターも119塩基チャンクを基礎とする。文字は塩基(A、C、G、U)及び塩基対(M、R、W、S、Y、K)を含む。
(2)4つの広い領域(上流50塩基、19merプロパー(proper)、下流50塩基、及び全体119mer領域)中の単量体〜7量体の数
4.構造パラメーター
構造パラメーターは以下の領域を基礎とする
19merオリゴプロパー(接頭辞:proper)
オリゴの即上流の20mer(接頭辞:up20)
オリゴの即上流の40mer
オリゴの即上流の60mer
オリゴの即下流の20mer(接頭辞:down20)
オリゴの即下流の40mer
オリゴの即下流の60mer
RNA構造によって予測される塩基対合を調査し、以下のパラメーターを算出した:
バルジ・ループの総数(パラメーター:bulge)
バルジ・ループ中の総塩基(bulge_b)
内部ループの総数(internal)
内部ループ中の総塩基(internal_b)
ヘアピンの総数(hairpin)
ヘアピン中の総塩基(hairpin_b)
他のモチーフ領域の総数(other)
他のモチーフ領域中の総塩基(other_b)
対合塩基の合計(total_pairs_b)
非対合塩基の合計(total_nonpairs_b)
対合塩基の最長ストレッチ(longest_pairs_b)
非対合塩基の最長ストレッチ(longest_nonpairs_b)
こうして、合計12*7=84パラメーターを各siRNAの二次構造について計算した。
10個の異なるパラメーターを、節5.2で議論される重み付きFASTAスコア、節5.4で議論されるミニマックススコア及び予測の二本鎖ΔGを用いて、異なる条件を用いて計算した。
配列コンセンサスパターン、隠れマルコフモデル及びニューラルネットワークもPSSMの代用としてsiRNA機能的モチーフ(例えば、siRNA感受性又は耐性モチーフ)を表すために使用することができる。
本発明は転写産物中の1以上の配列モチーフ(siRNA感受性又は耐性モチーフ)を同定する方法を提供する。そのためこれに対応する機能的又は非機能的siRNAもこの方法によって提供される。一実施形態では、目的の配列領域が、機能的モチーフのプロファイルと適合する配列を同定するために走査される。一実施形態では、複数の可能なsiRNA配列モチーフは、その領域にわたって規定の塩基区間のステップ(step)でタイル状に存在するsiRNA配列モチーフを含み、これはプロファイルと適合した配列を同定するために評価される。好適な実施形態では、1、5、10、15又は19塩基の間隔のステップが用いられる。好適な実施形態では、完全な転写産物配列が走査される。スコアは節5.1.1.〜5.1.3.に記載されるPSSMを用いて各別個の配列モチーフについて算出される。次いで、配列はこのスコアに従って順位付けされる。次いで、1以上の配列が順位リストから選択される。一実施形態では、最高スコアを有するsiRNA配列モチーフがsiRNA感受性モチーフとして選択される。別の実施形態では、最低スコアを有するsiRNA配列モチーフがsiRNA耐性モチーフとして選択される。
トレーニングセット中の組合せPSSMスコア範囲は、200の最大値を有する(スコアの97%は0以下であり、スコアの60%は−300以下である)。
本発明はまた、siRNAの標的外遺伝子を同定する方法を提供する。本明細書で使用される「標的外」遺伝子は、他の遺伝子を標的化するよう設計されたsiRNAによって直接的にサイレンシングされる遺伝子である(参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Jacksonらによる国際特許出願第PCT/US2004/015439(出願日2004年5月17日)を参照)。標的外遺伝子は、siRNAのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかによってサイレンシングされ得る。
マイクロアレイ実験は、大部分のsiRNAオリゴがsiRNAと標的外転写産物との間の直接的な相互作用を介して標的外遺伝子の下流制御を引き起こすことを示唆する。dsRNAと転写産物との間の配列同一性は、どの標的外遺伝子が影響を受けるかを判定する際に役割を果たしていると思われるが、配列同一性検索はハイブリダイゼーションの熱力学モデルと組合わせても標的外効果を正確に予測するのに不十分である。しかし、標的外転写産物と原因(offending)siRNA配列とのアライメントは、両者間での一部の塩基対形成による相互作用が他塩基対形成よりもより重要らしいことを明らかにする(図6)。
によるスコアを用いたpmPSSM(位置適合スコア、pmScoreとも称される)で評価することができる。所与の閾値を超えるpmScoreは、可能な標的外遺伝子として配列を同定する。
所与のsiRNAの標的外遺伝子は、最初にsiRNAと整列する標的外転写産物配列を同定することによって同定することができる。ペアワイズアライメントに適切なあらゆる方法(非限定的にBLAST及びFASTA等)を使用することができる。次いで、位置特異的スコアリング行列は、これらのアライメントの位置適合スコアを算出するために使用される。好適な実施形態では、アライメントは低ストリンジェントなFASTA検索を用いて確立され、各アライメントのスコアは式6に従って算出される。所与の閾値を超えるスコアは、可能な標的外遺伝子としての配列を含む転写産物を同定する。
本発明は、siRNAの位置特異的塩基組成に基づいて、siRNAの鎖選好及び/又は効果又は特異性を予測する方法を提供する。本発明者らは、塩基組成PSSMスコア(節5.1.を参照されたい)がその逆相補体の塩基組成PSSM(G/C PSSM)スコアより大きいsiRNAは、そのセンス鎖よりも活性であるアンチセンス鎖を有すると予測されることを見出した。対照的に、塩基組成PSSMスコアがその逆相補体の塩基組成PSSMスコア未満であるsiRNAは、そのアンチセンス鎖よりも活性であるセンス鎖を有すると予測される。
本発明は、遺伝子サイレンシングのためのsiRNAを設計する方法を提供する。この方法は、標的遺伝子中の各標的配列との完全な配列同一性を有するsiRNAを設計するために使用することができる。この方法はまた、標的遺伝子と部分的な配列同一性のみを有するsiRNAを設計するために使用することもできる。標的遺伝子中の標的配列との部分的な配列同一性のみを有するsiRNAを用いて標的遺伝子をサイレンシングするための方法及び組成物は、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Jacksonらによる国際出願第PCT/US2004/015439(出願日2004年5月17日)に開示される。例えば、標的配列の転写産物の配列と同一であるが、転写産物の任意の配列との完全長の同一性を有しない、11〜18ヌクレオチドのセンス鎖連続的ヌクレオチド配列を含むsiRNAは、転写産物のサイレンシングに使用し得る。かかる連続的ヌクレオチド配列はsiRNA分子の中心領域にあることが好ましい。siRNAの中心領域中の連続的ヌクレオチド配列は、3'末端を起点としない、siRNA中のヌクレオチド配列の任意の連続ストレッチであり得る。例えば、11ヌクレオチドの連続的ヌクレオチド配列は、2〜12、3〜13、4〜14、5〜15、6〜16、7〜17、8〜18又は9〜19のヌクレオチド配列であり得る。好適な実施形態では、連続的ヌクレオチド配列は、11〜16、11〜15、14〜15、11、12又は13ヌクレオチドの長さである。あるいは、標的遺伝子の転写産物の配列と同一であるが、転写産物中の任意の連続配列と完全長の同一性を有しない、9〜18ヌクレオチドの3'センス鎖連続ヌクレオチド配列を含むsiRNAも、転写産物をサイレンシングすることに使用し得る。3'の9〜18ヌクレオチドの配列は、最初の塩基対を起点とするヌクレオチドの連続ストレッチである(すなわち、3'突出部の2塩基を含まない)。好適な実施形態では、連続的ヌクレオチド配列は9〜16、9〜15、9〜12、11、10又は9ヌクレオチドの長さである。
例えば本発明に記載される方法によって設計したsiRNAを用いた遺伝子サイレンシングを実施するために、遺伝子サイレンシングのためのあらゆる標準的な方法を本発明と組合せて用いることができる(例えばGuoら, 1995, Cell 81: 611-620; Fireら, 1998, Nature 391:806-811 ; Grant, 1999, Cell 96: 303-306; Tabaraら, 1999, Cell 99: 123-132; Zamoreら, 2000, Cell 101 :25-33 ; Bass, 2000, Cell 101 :235-238 ; Petcherskiら, 2000, Nature 405: 364-368; Elbashirら, Nature 411: 494-498; Paddisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 1443-1448参照)。一実施形態では、遺伝子サイレンシングは、細胞にダイサー切断の産物を模倣するsiRNAを与えることによって誘導される(例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れるElbashirら, 2001, Nature 411, 494-498; Elbashirら, 2001, Genes Dev. 15,188-200参照)。合成siRNA二本鎖はRISCと会合する能力を維持し、mRNA転写産物のサイレンシングに導く。siRNAは化学的に合成するか、又は組み換えダイサーによる二本鎖RNAの切断から誘導することができる。細胞は当技術分野で公知の標準的な方法を用いてsiRNAでトランスフェクトすることができる。
、50%、75%、80%、85%、90%又は95%のサイレンシングを達成するのに効果的なsiRNAの濃度より低い濃度を有する。別の好適な実施形態では、プール中の異なる各siRNAは、他のsiRNAの不在下で又は遺伝子をサイレンシングするために設計された他のsiRNAの不在下で使用される際に、30%、20%、10%又は5%未満の遺伝子サイレンシングを引き起こす濃度を有する。好適な実施形態では、各siRNAは単独で使用される際に30%、20%、10%又は5%未満の標的遺伝子のサイレンシングを引き起こすが、複数のsiRNAが標的遺伝子の少なくとも80%又は90%のサイレンシングを引き起こす濃度である。
λ2=600 nm、
(εredλ1)=155,677(570nmでの、還元型alamarBlueのモル吸光計数)
(εredλ2)=14,652(600nmでの、還元型alamarBlueのモル吸光計数)
(εoxλ1)=80,586(570nmでの、酸化alamarBlueのモル吸光計数)
(εoxλ2)=117,216(600nmでの、酸化alamarBlueのモル吸光計数)
(Aλ1)=570nmでの、試験ウェルの吸光度
(Aλ2)=600nmでの、試験ウェルの吸光度
(A'λ1)=培地+alamarBlueを含むが細胞に添加されていないネガティブコントロールウェルの570nmでの吸光度
(A'λ2)=培地+alamarBlueを含むが細胞に添加されていないネガティブコントロールウェルの600nmでの吸光度
細胞を含まないウェルの還元%は、バックグラウンドを超える還元%を測定するために、サンプルを含むェルの還元%から差し引いた]
を用いて還元された割合が算出される。
本発明の分析方法は、以下のプログラム及び方法に従って、コンピューター・システム(この説に記載されるコンピューター・システム等)を用いて実施することができるのが好ましい。かかるコンピューター・システムはまた、本発明の分析方法を用いて実施されるコンピューター・システムによって使用することができる、様々な実験で得た測定シグナルを蓄積しかつ操作できることが好ましい。したがって、かかるコンピューター・システムも本発明の一部であると考慮される。
以下の実施例は本発明を説明するために提供され、いかなる場合も本発明を限定することを意図しない。
700種を超える遺伝子を標的化するsiRNAのライブラリーを構築した。このライブラリー中のsiRNAは、科学文献から利用可能な制限的な設計原理(Elbashirら, 2001, Nature 411: 494-8)及び節5.2に記載される配列同一性のスコア付けによって標的外効果を予測する方法の組合せに基づく、「標準的な」アプローチの使用によって設計した。377個のsiRNAのセットを、Taqman分析によって、それぞれの標的遺伝子をサイレンシングする能力について試験した。377個のsiRNAのセットは表IIに列挙される。表IIは377個のsiRNAについて以下の情報を列挙する:siRNAのID番号、標的遺伝子の登録番号、標的配列の開始位置、標的配列、サイレンシング%、Set1に属するセット(すなわち、トレーニング又は試験)、Set2に属するセット、及び配列番号。この試験の結果は、ほとんどのsiRNAはその標的遺伝子のサイレンシングに成功したことを示したが(中央値サイレンシング、約75%)、個々のsiRNAは依然として広範囲のサイレンシング能を示した。良好な(又は弱い)サイレンシング能力は任意の位置における特定の塩基、総GC含量、標的転写産物内のsiRNA配列の位置又は標的転写産物の選択的スプライシングのいずれとも一貫して関連しなかった。
の通りに計算された39塩基(19merの上流の10塩基、siRNAプロパーの19塩基、及び下流の10塩基)の加重和である。したがって、割り付け及び最適化に合計117の重みが必要である(39の位置で3つの塩基型−G又はC、A、U)。
siRNA及びshRNA配列の標的外効果の重要性が示されてきた。マイクロアレイ実験は、大部分のsiRNAオリゴが、dsRNAと標的外転写産物との間の直接的な相互作用を介して標的外遺伝子の下流制御を生じさせることを示唆している。dsRNAと転写産物との間の配列同一性が、どの標的外遺伝子に作用するかを決定する際に役割を果たすようであるが、配列同一性検索は、ハイブリダイゼーションの熱力学モデルと組み合わせても正確に標的外効果を予測するには不十分である。しかし、標的外転写産物の、有害な(offending)siRNA配列とのアライメントは、その2つの間の一部の塩基対相互作用が他の塩基対相互作用よりも重要らしいことを表す(図6)。
を用いて算出される。スコアが閾値を超える所与のsiRNAのアライメント数が、観察される標的外効果を予示することが観察された。スコアの閾値を、効果の予測数と観察数との間の相関が最大になるように最適化した(図8)。選択パイプラインは、予測される標的外効果が比較的少数である配列を好むようにこの最適化した閾値を使用する。
PSSMを、ある任意の位置の塩基組成の、その隣接する位置への依存性を仮定する方法(「曲線モデル」と称する)によって作成した。
ピーク1
平均: 1.5
標準偏差: 2
振幅: 0.0455
ピーク1の平均、標準偏差及び振幅は、Set1トレーニングセット及び試験セット中の、siRNA標的部位の塩基−2〜5内に生じる、良好なsiRNAと粗悪なsiRNAとの間のGC含量における平均差のピークに対応するように設定される。
平均: 11
標準偏差: 0.5
振幅: 0.0337
ピーク2の平均、標準偏差及び振幅は、Set1トレーニングセット及び試験セット中の、siRNA標的部位の塩基10〜12内に生じる、良好なsiRNAと粗悪なsiRNAとの間のGC含量における平均差のピークに対応するように設定される。
平均: 18.5
標準偏差: 4
振幅: −0.0548
ピーク3の平均、標準偏差及び振幅は、Set1トレーニングセット及び試験セット中の、siRNA標的部位の塩基12〜25内に生じる、良好なsiRNAと粗悪なsiRNAとの間のGC含量における平均差のピークに対応するように設定される。
3ピークG/Cモデル:
ピーク1:
振幅:gc1=0−0.091
平均:gc1=-2.5−1.5
標準偏差:gc1=2.5−4
ピーク2:
振幅:gc2=0.0337−0.1011
平均:gc2=11−11.5
標準偏差:gc2=0.5−0.9
ピーク3:
振幅:gc3=-0.1644−-0.0822
平均:gc3=18.75−20.75
標準偏差:gc3=2.5−3.5
4ピークG/Cモデル:
ピーク0:
振幅:gc0=0−0.091
平均:gc0=-5.5−-3.5
標準偏差:gc0=1−2.5
ピーク1:
振幅:gc1=0−0.091
平均:gc1=-2.5−-1.5
標準偏差:gc1=2.5−4
ピーク2:
振幅:gc2=0.0337−0.1011
平均:gc2=11−11.5
標準偏差:gc2=0.5−0.9
ピーク3:
振幅:gc3=-0.1644−-0.0822
平均:gc3=18.75−20.75
標準偏差:gc3=2.5−3.5
5ピークUモデル:
Uピーク1:
振幅:u1=-0.2−0.0
平均:u1=1−2
標準偏差:u1=.75−1.5
Uピーク2:
振幅:u2=0.0−0.16
平均:u2=5−6
標準偏差:u2=.75−1.5
Uピーク3:
振幅:u3=0.0−0.1
平均:u3=10−11
標準偏差:u3=1−2
Uピーク4:
振幅:u4=0.0−0.16
平均:u4=13−14
標準偏差:u4=.75−1.5
Uピーク5:
振幅:u5=0.0−0.16
平均:u5=17−18
標準偏差:u5=1−3
3ピークAモデル:
Aピーク1:
振幅:a1=0.0442−0.2210
平均:a1=5.5−6.5
標準偏差:a1=1−2
Aピーク2:
振幅:a2=-0.5−0
平均:a2=10−12.5
標準偏差:a2=2.5−4.5
Aピーク3:
振幅:a3=0.0442−0.2210
平均:a3=18−20
標準偏差:a3=4−6
PSSMの曲線モデルの例示的なセットは図11Aに示される。図11Bはトレーニングセット及び試験セットに対するこのモデルの性能を示す。
良好なsiRNAと粗悪なsiRNAとの間のG/C含量の平均差は、siRNA機能的モチーフ及びsiRNA耐性モチーフを分類するために使用できる、G/C PSSMのモデルを提供する。siRNAのいずれの鎖も活性であり得ることが知られるため(例えば、Elbashirら,2001, Genes Dev. 15: 188-200を参照)、siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖のG/C含量が、良好なsiRNAと粗悪なsiRNAとの間のG/C含量の平均差から誘導されるsiRNA機能的標的モチーフのG/C含量のモデルといかに良く適合するかを発見することに興味があった。このために、良好なsiRNA及び粗悪なsiRNAの逆相補体を調査した。これらの逆相補体はsiRNA二本鎖のセンス鎖に憶測上完全に適合する標的部位に相当する。逆相補体を、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖の実際に完全に適合する標的部位によって表された、実際の良好なsiRNA及び粗悪なsiRNAと比較した。
先の実施例では、より大きくかつより均一なサイレンシング能を有するsiRNAの選択を可能にする改良型siRNA設計アルゴリズムを記載した。この劇的な改良にも関わらず、一部の遺伝子は高い効果のサイレンシングが困難なままである。低発現型遺伝子(マイクロアレイ上で-0.5未満の強度;細胞当たり<5コピー;図16)は、より低いサイレンシングに向かうという一般的な傾向を観察した。この実施例は、siRNAのサイレンシング効果が低発現型遺伝子に対して影響するパラメーターの同定を記載する。
(1)センス19merの塩基2〜7における1〜3 G+Cの選択、
(2)センス19merの塩基1及び19の非対称性(位置1、G又はC;位置19、A又はT)、
(3)−300<pssmスコア<+200
(4)わずか16の最大標的外BLAST適合、及び
(5)19merのいずれかの側における200塩基が繰り返し又は低コンプレキシティー配列ではない。
本明細書で引用された全ての参考文献は、各個別の刊行物又は特許若しくは特許出願があらゆる目的のためにその全体を参照により組み込まれるべきであると具体的かつ個別に示されたのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体を参照により本明細書に組み入れる。
Claims (16)
- 複数の異なるsiRNAから生物中の標的遺伝子をサイレンシングするための1以上のsiRNAを選択する方法であって、該複数の異なるsiRNA中の異なる各siRNAは標的遺伝子の転写産物中の異なる標的配列を標的化するものであり、該方法が、(a) 該複数の異なるsiRNA中の異なる各siRNAについて、該転写産物中の対応する標的配列モチーフのスコアを算出する工程であって、該スコアは位置特異的スコア行列(PSSM)を用いて算出され、該配列モチーフのそれぞれが、Lヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Lは整数であり、該PSSMが{log(eij/pij)}であり[ここで、eijは位置jにおけるヌクレオチドiの重みであり、pijはランダム配列中の位置jにおけるヌクレオチドiの重みであり、そしてi=G又はC、A、U(T)であり、j=1,…,Lである]、該標的配列モチーフのそれぞれは、対応するsiRNAの標的配列の少なくとも一部分、及び/又は標的配列にフランキングする配列中の第2配列を含むものである、上記工程;(b) 該スコアに従って該複数の異なるsiRNAを順位付けする工程;並びに(c)該順位付けしたsiRNAから1以上のsiRNAを選択する工程、を含み、該工程(a)、(b)並びに(c)が好適にプログラムされたコンピューターを用いて実施される、上記方法。
- 前記標的配列モチーフのそれぞれが、前記対応するsiRNAの標的配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的配列モチーフのそれぞれが、Lヌクレオチドのヌクレオチド配列であり、Lは整数であり、前記位置特異的スコア行列が{log(eij/pij)}である、[ここで、eijは位置jにおけるヌクレオチドiの重みであり、pijはランダム配列中の位置jにおけるヌクレオチドiの重みであり、そしてi=G、C、A、U(T)であり、j=1,…,Lである]請求項1に記載の方法。
- 前記標的配列モチーフのそれぞれが、前記対応するsiRNAの標的配列と少なくとも1つのフランキング配列とを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的配列モチーフのそれぞれが、前記対応するsiRNAの標的配列と5'フランキング配列と3'フランキング配列とを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記5'フランキング配列と前記3'フランキング配列とが、それぞれDヌクレオチドの配列であり、Dが整数である、請求項5に記載の方法。
- 前記標的配列のそれぞれが19ヌクレオチドの配列であり、前記5'フランキング配列と3'フランキング配列とが、それぞれ10ヌクレオチドの配列である、請求項6に記載の方法。
- 前記標的配列のそれぞれが19ヌクレオチドの配列であり、前記5'フランキング配列と3'フランキング配列とが、それぞれ50ヌクレオチドの配列である、請求項5に記載の方法。
- 前記位置特異的スコア行列(PSSM)を、(aa)19ヌクレオチドの二本鎖領域と選択した閾値を超えるサイレンシング効果とを有するsiRNAからなる複数のN siRNAを同定すること;
(bb)前記N siRNAのそれぞれについて機能的配列モチーフを同定すること、ここで、該機能的配列モチーフは、前記N siRNAのそれぞれの19ヌクレオチドの標的配列と、10ヌクレオチドの5'フランキング配列と、10ヌクレオチドの3'フランキング配列とを含むものである;
(cc)式:
(dd)式:
- 前記複数のN siRNAが、細胞中の異なる転写産物量を示す複数の異なる遺伝子を標的化する、請求項9に記載の方法。
- 前記順位付け工程を、前記異なる各siRNAについてスコアを決定することによって実施し、前記工程(c)を、最大スコアを有する1以上のsiRNAを選択することによって実施する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(c)を、規定の値に最も近似する前記スコアを有する1以上のsiRNAを選択することによって実施し、その際、該規定の値が、細胞当たり3〜5コピー未満の存在レベルを有する転写産物中の複数のsiRNA配列モチーフの最大中央値サイレンシング効果に対応するスコア値である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(c)を、規定の範囲内の前記スコアを有する1以上のsiRNAを選択することによって実施し、該規定の範囲は所与のレベルのサイレンシング効果をそれぞれが有する複数のsiRNA配列モチーフに対応するスコア範囲である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サイレンシング効果が100nMのsiRNA濃度で50%、75%又は90%を超える、請求項13に記載の方法。
- 前記複数のsiRNA配列モチーフが、細胞当たり3〜5コピー未満の存在レベルを有する転写産物中の配列モチーフである、請求項13又は14に記載の方法。
- 前記複数のN siRNAが少なくとも10、50、100、200又は500個の異なるsiRNAを含む、請求項9〜15のいずれか1項に記載の方法。
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