CN110295171B - 用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用 - Google Patents

用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110295171B
CN110295171B CN201910566028.4A CN201910566028A CN110295171B CN 110295171 B CN110295171 B CN 110295171B CN 201910566028 A CN201910566028 A CN 201910566028A CN 110295171 B CN110295171 B CN 110295171B
Authority
CN
China
Prior art keywords
npc1
sirna
seq
nucleotide sequence
inhibiting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910566028.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110295171A (zh
Inventor
叶树标
兰平
杨孜欢
陈代词
李佩思
冯杏芝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Original Assignee
Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University filed Critical Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority to CN201910566028.4A priority Critical patent/CN110295171B/zh
Publication of CN110295171A publication Critical patent/CN110295171A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110295171B publication Critical patent/CN110295171B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了抑制NPC1基因表达的siRNA的应用，属于生物医药技术领域，用于抑制NPC1基因表达的siRNA至少为以下两条siRNA中一种：NPC1‑siRNA‑1，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；NPC1‑siRNA‑3，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明设计的NPC1‑siRNA‑1、NPC1‑siRNA‑3在HCT‑116和HCT‑8细胞中均能良好地抑制NPC1基因的表达；在NPC1‑siRNA‑1、NPC1‑siRNA‑3转染下，敲低NPC1的肿瘤细胞对5‑FU的耐药作用得到降低；本发明设计的NPC1‑siRNA和5‑氟脲嘧啶可以联合用于治疗结直肠癌。

Description

用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用。
背景技术
结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位。结直肠癌好发部位为直肠与乙状结肠交界处，占60％；发病多在40岁以后。5-氟尿嘧啶可在细胞内转化成不同的细胞毒性代谢产物，作用与S期，属于抗代谢类抗肿瘤药。
然而，5-氟尿嘧啶的药性有限，还有必要研发出用于治疗结直肠癌的新药物。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供抑制NPC1基因表达的siRNA的应用，抑制NPC1基因表达的siRNA可降低结肠癌对5-氟尿嘧啶的耐药性。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：用于抑制NPC1基因表达的siRNA，其特征在于，至少为以下两条siRNA中一种：
NPC1-siRNA-1，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
NPC1-siRNA-3，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
NPC1蛋白是一个由1278个氨基酸组成并含有13次跨膜螺旋的膜蛋白，NPC1蛋白是胆固醇在人体细胞内不可或缺的搬运工，NPC1异常是C型Niemann-Pick疾病的主要致病因素。
另外，本发明还提供NPC1-siRNA-1在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用，NPC1-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
另外，本发明还提供NPC1-siRNA-1和5-氟尿嘧啶在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用，NPC1-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
另外，本发明还提供一种用于治疗结直肠癌药物，其包括NPC1-siRNA-1和5-氟尿嘧啶，NPC1-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
另外，本发明还提供NPC1-siRNA-3在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用，NPC1-siRNA-3正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
另外，本发明还提供NPC1-siRNA-3和5-氟尿嘧啶在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用，NPC1-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
另外，本发明还提供一种用于治疗结直肠癌药物，其包括NPC1-siRNA-3和5-氟尿嘧啶，NPC1-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其反应链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明有益效果：本发明提供抑制NPC1基因表达的siRNA的应用，本发明设计的NPC1-siRNA-1、NPC1-siRNA-3在HCT-116和HCT-8细胞中均能良好地抑制NPC1基因的表达；在NPC1-siRNA-1、NPC1-siRNA-3转染下，敲低NPC1的HCT-116和HCT-8肿瘤细胞对5-FU的耐药作用得到降低。
附图说明
图1显示NPC1-siRNA转染HCT-116和HCT-8细胞后，细胞中NPC1蛋白的表达量；其中，NC表示阴性对照，NPC1-1表示采用NPC1-siRNA-1进行转染，NPC1-2表示采用NPC1-siRNA-2进行转染，NPC1-3表示采用NPC1-siRNA-3进行转染；
图2显示NPC1-siRNA对HCT-116和HCT-8细胞耐药性的影响；其中，GAPDH表示阳性对照，NC-si表示阴性对照，NPC1-si01表示采用NPC1-siRNA-1进行转染，NPC1-si03表示采用NPC1-siRNA-3进行转染。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
NPC1-siRNA的设计
本发明设计了3个NPC1-siRNA，NPC1-siRNA的核苷酸序列如表1所示。
表1 NPC1-siRNA的核苷酸序列
Figure BDA0002108442880000031
涉及的实验方法
细胞的培养
结直肠癌细胞系HCT-116，HCT8由中山大学胃肠病学研究所保存，HCT-116用含10％胎牛血清(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)的DMEM(Gibco，China)培养基，HCT8用含10％胎牛血清(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)的RPMI1640(Gibco，China)培养基，置于含5％二氧化碳、37℃恒温潮湿的培养箱中培养。
瞬时转染细胞
用NPC1-siRNA瞬时转染HCT-116，HCT8。当细胞接种于6孔板24小时细胞密度达到50％后，按照生产商说明以脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen，USA)为载体用NPC1-siRNA和NC-siRNA瞬时转染HCT-116，HCT8，NPC1-siRNA和NC-siRNA模拟物最终浓度为10nM。转染8小时后更换含10％FBS的新鲜培养基。为了验证转染效果，提取转染后三天总RNA并通过实时定量PCR验证NPC1敲低的表达效果。
NPC1表达水平的检测
按照TRIZOL试剂(Invitrogen，USA)的生产商说明书中的步骤提取细胞总RNA。步骤如下：(1)吸弃培养基，用1ml的PBS冲洗两次，每孔加入TRIZOL试剂0.5ml，室温放置5min；(2)将细胞裂解液全部转移到1.5ml的EP管中，加入0.1ml氯仿，剧烈震荡15s，室温下静置5min，12,000g，4℃离心15min；(3)取上层水相转移到另外一个新的无RNase的离心管内，加入等体积的异丙醇，轻柔混匀，室温放置10min，12,000g，4℃离心15min；(4)弃上清，加入75％乙醇洗涤RNA沉淀，7,500g，4℃离心10min，弃上清，空气干燥RNA沉淀10min，用DEPC水溶解RNA。用All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit(Gene Copoeia，China)试剂盒进行RT-PCR扩增。所得定量数据由7500software v2.0.6(Applied Biosystems)导出，每个样品的threshold cycle(CT)值代表所测基因的表达水平，由ΔΔCT方法计算出来的值代表NPC1与内参基因的差异，最后由2-ΔΔCt方法处理数据，得出数据代表NPC1的表达水平。
5-FU耐药试验
将5-FU(Sigma，China)粉剂用DMSO配制成浓度为1M的储存液备用。细胞以106个/孔的密度接种于6孔板后培养24小时，加入5-FU使得终浓度分别为0.01μM，0.1μM，1μM，10μM，100μM，1000μM，分别培养96小时。
细胞存活率的测试(MTS)
按照Cell Titer 96@AQneous One Solution Reagent试剂的生产商说明书中的步骤测细胞存活率。步骤如下：(1)室温溶解，往每个96孔板加入20ul，于37℃培养箱避光孵育2小时；(2)取出培养板，490nm测量细胞吸光度，并统计处理。
实验结果
如图1所示，本发明设计的NPC1-siRNA-1、NPC1-siRNA-2和NPC1-siRNA-3在HCT-116和HCT8细胞中均能良好地抑制NPC1基因的表达。
如图2所示，在一系列5-FU浓度下(0μM，1μM，5μM，10μM，20μM，50μM，100μM，200μM)，敲低NPC1的HCT-116和HCT-8肿瘤细胞对5-FU的耐药作用得到降低。
实施例1
本实施例提供一种用于治疗结直肠癌药物，其包括NPC1-siRNA-1和5-氟尿嘧啶，NPC1-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反应链的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
实施例2
本实施例提供一种用于治疗结直肠癌药物，其包括NPC1-siRNA-3和5-氟尿嘧啶，NPC1-siRNA-1正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其反应链的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属第六医院
<120> 用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用
<130> 2019.6.24
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggagccacgu acuucauga 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
ucaugaagua cguggcucc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccauguuccu uucggauaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
uuauccgaaa ggaacaugg 19

Claims (4)

1.NPC1-siRNA-1和5-氟尿嘧啶在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用，NPC1-siRNA-1正义链的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于治疗结直肠癌药物，其特征在于，由NPC1-siRNA-1和5-氟尿嘧啶组成，其中NPC1-siRNA-1正义链的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.NPC1-siRNA-3和5-氟尿嘧啶在制备用于治疗结直肠癌药物中的应用，NPC1-siRNA-3正义链的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种用于治疗结直肠癌药物，其特征在于，由NPC1-siRNA-3和5-氟尿嘧啶组成，其中NPC1-siRNA-3正义链的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
CN201910566028.4A 2019-06-26 2019-06-26 用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用 Active CN110295171B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910566028.4A CN110295171B (zh) 2019-06-26 2019-06-26 用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910566028.4A CN110295171B (zh) 2019-06-26 2019-06-26 用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110295171A CN110295171A (zh) 2019-10-01
CN110295171B true CN110295171B (zh) 2022-07-22

Family

ID=68029009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910566028.4A Active CN110295171B (zh) 2019-06-26 2019-06-26 用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110295171B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112226434B (zh) * 2020-09-24 2023-01-13 中山大学附属第六医院 用于抑制GAN基因表达的siRNA的应用
CN114703183A (zh) * 2022-03-10 2022-07-05 中山大学附属第六医院 一种靶向敲除HIF-1α基因的sgRNA及CRISPR/Cas9慢病毒系统与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1926551A (zh) * 2003-10-27 2007-03-07 罗斯塔生化科技有限责任公司 用于基因沉默的siRNA的设计方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2579790A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-09 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Npc1l1 and npc1l1 inhibitors and methods of use thereof
US20100119525A1 (en) * 2005-08-01 2010-05-13 Mount Sinai Schoool Of Medicine Of New York University Method for extending longevity using npc1l1 antagonists
CN109125329A (zh) * 2017-06-15 2019-01-04 北京蛋白质组研究中心 C型1类尼曼-匹克蛋白抑制剂的新用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1926551A (zh) * 2003-10-27 2007-03-07 罗斯塔生化科技有限责任公司 用于基因沉默的siRNA的设计方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110295171A (zh) 2019-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3907287A1 (en) Modulatory polynucleotides
CN110295171B (zh) 用于抑制NPC1基因表达的siRNA的应用
CN106834290B (zh) 一种环状rna及其用途
WO2018024034A1 (zh) 环状RNA circ-NFATC3及其用途
CN110384800B (zh) LncRNA XLOC_075168在制备促进血管新生的药物中的应用
CN102242080A (zh) miR-24用于治疗或诊断心衰或患心衰倾向或者改善心肌细胞功能的方法
CN109966496B (zh) miRNA-5571在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用
CN112226434B (zh) 用于抑制GAN基因表达的siRNA的应用
CN104894223B (zh) 人copb2基因的用途及其相关药物
CN114934048B (zh) 一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circMTMR14及试剂盒和应用
CN114939125A (zh) 巨噬细胞源外泌体在制备抗腹膜纤维化药物中的应用
CN107858351A (zh) 一种双链siRNA在制备恶性肿瘤的药物中的应用
CN110433171B (zh) miRNA-1293在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用
CN114181937A (zh) 一种沉默人LINC01614表达的shRNA分子及其应用
CN102533982B (zh) 人klf8基因在肿瘤治疗中的新用途
CN102978226A (zh) 微环dna基因载体组合物及其制备方法和应用
CN110354137B (zh) miRNA-197-3p在制备抗前列腺癌药物中的应用
CN111020036A (zh) 人circ-STXBP5L的用途及相关产品
CN112280859B (zh) 一种乳腺癌标志物及应用
CN108060133B (zh) 稳定低表达miR-497的HPMC细胞株及其应用
CN111803513B (zh) 一种用于制备抑制结肠癌细胞增殖药物的基因抑制剂
CN103623427A (zh) 人usp14基因的用途及其相关药物
CN107582525A (zh) Trim31抑制剂磁性靶向载药微球在制备抑制pdac增殖能力药物中的应用
CN108060134B (zh) 稳定超表达miR-497的HPMC细胞株及其应用
CN109913454B (zh) 一种生物活性提高的microRNA及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant