CN109913454B

CN109913454B - 一种生物活性提高的microRNA及其应用

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Publication number: CN109913454B
Application number: CN201910164705.XA
Authority: CN
Inventors: 张彩华; 常英; 廉云飞
Original assignee: Shanghai Longxin Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Longxin Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2019-03-05
Filing date: 2019-03-05
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2039-03-05
Also published as: CN109913454A

Abstract

本发明公开了一种生物活性提高的microRNA及其应用，属于生物医药技术领域。本发明的microRNA是通过将双链miR‑150的正义链从5’端起第4、7、12和19位核糖核苷酸的2’OH位进行化学修饰得到。本发明经过修饰的miR‑150稳定性好、生物活性强，且配合3’端进行胆固醇修饰后，无需进行包裹可以直接给药，且生物活性降低幅度较小，诱导大肠癌细胞的程序化死亡，对大肠癌具有显著药效。

Description

一种生物活性提高的microRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种生物活性提高的microRNA及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

微小核酸分子(MicroRNAs，miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸组成的小片段RNA，它能够结合到靶基因上，抑制或降解靶基因，在转录后调控靶基因的表达。近年来，研究发现miR-150在大肠癌、肺癌及胰腺癌等恶性肿瘤中表达异常，并通过多种分子机制促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移，因此，miR-150有望成为肿瘤精准诊断和治疗的候选分子标记物。

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，随着我国居民生活水平的不断提高和饮食习惯的改变，结直肠癌的发病率逐年提高。目前，应对结直肠癌的治疗主要采用对肿瘤有治疗效果的药物进行治疗，缺乏针对结直肠癌的靶向治疗药物。据报道，miR-150的异常表达与结直肠癌细胞的恶性程度、此病患者的临床效果密切相关，外源导入的miR-150明显抑制结直肠癌细胞的增殖，并且诱导癌细胞的程序化死亡，因此，使用化学合成和修饰的microRNA治疗结直肠癌是一种机理明确，靶点清晰的治疗方法。

从理论上讲，一个含有相同序列的单链RNA分子，作为miRNA模拟物，可以像成熟的miRNA一样起作用。然而，由一条正义链和一条反义链组成的双链，比单链miRNA模拟物，具有高出100～1000倍的效能。该正义链包含与成熟miRNA完全相同的序列，而反义链序列与成熟miRNA互补。因此，采用双链miRNA具有更佳明显的优势。

尽管机理方面的研究让人兴奋，但是到临床应用阶段，还有很多技术障碍需要克服，主要包括体内稳定性差、生物分布不适当、内源性RNA机制的破坏以及一些不良的副作用，可通过开发病毒载体和合成材料载体系统来解决这些问题。病毒载体是有效的传递媒介，但是其毒性和免疫原性限制了其临床应用。合成材料已经成功用于DNA和siRNA的体内传导，用于miRNA的体内传导也有相关报道，与基于病毒的载体相比，免疫原性低，但是与病毒载体相比，合成材料的相对效率较低，特异性和生物活性也受到影响。其次，现有的一些对miRNA进行化学修饰的，虽然核酸分子的化学稳定性得到提高，但是与RNA结合的亲和力降低，还会对细胞产生非特异性抑制等。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种稳定性好、生物活性强，且无需进行包裹可以直接给药的microRNA。

本发明的第一个目的是提供一种生物活性提高的microRNA，所述的microRNA是通过将双链miR-150的正义链(guide strand)从5’端起第4、7、12和19位核糖核苷酸的2’OH位进行化学修饰，反义链从5’端起第7和15位核糖核苷酸的2’OH位进行化学修饰得到。

进一步地，所述的化学修饰的修饰基团为氟基或甲氧基。

进一步地，所述的miR-150正义链的序列为5’-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3’，反义链的序列为5’-CACUGGUACAAGGGUUGGGAGA-3’。

进一步地，所述的microRNA反义链的3’端还修饰有胆固醇。

进一步地，所述的microRNA正义链和反义链的5’端分别进行两个硫代骨架修饰，3’端分别进行四个硫代骨架修饰。

本发明的第二个目的是提供一种药物组合物，所述的药物组合物包含所述的microRNA。

进一步地，所述的药物组合物还包括适用于microRNA体内传导的载体。

进一步地，所述载体为病毒载体、天然材料载体或合成材料载体。

进一步地，所述的天然材料载体为蛋白质、碳水化合物或脂质。

进一步地，所述的蛋白质为人血清蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白或球蛋白；所述的碳水化合物为右旋糖酐、支链淀粉、甲壳质、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸。

进一步地，所述的合成材料载体为合成聚氨基酸、聚胺或寡核苷酸。

进一步地，所述的聚氨基酸包括聚赖氨酸、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物或聚乙二醇；所述的聚胺包括聚乙烯亚胺、精胺、亚精胺、阳离子脂质或阳离子卟啉。

本发明的第三个目的是提供一种所述的microRNA在制备治疗与miR-150低表达相关疾病的靶向药物中的应用。

进一步地，所述的与miR-150低表达相关疾病包括大肠癌、结肠癌、直肠癌。

本发明的第四个目的是提供一种所述的microRNA在基因治疗与miR-150低表达相关疾病中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明经过修饰的miR-150稳定性好、生物活性强，且配合3’端进行胆固醇修饰后，无需进行包裹可以直接给药，且生物活性降低幅度较小，诱导大肠癌细胞的程序化死亡，对大肠癌具有显著药效。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR方法测定不同miRNA对细胞内miR-150的表达水平的影响情况；

图2为实时荧光定量PCR方法测定未经包载的不同miRNA对细胞内miR-150的表达水平的影响情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：miR-150合成

根据miR-150mimics双链中的正义链和反义链的序列进行修饰合成miR-150agomir：具体修饰包括以下几种实例，其中小写字母代表2’-OMe，s代表硫骨架修饰，Chol代表胆固醇修饰：

(1)miR-150agomir1：将miR-150的正义链从5’端起第4、7、12和19位核糖核苷酸的2’OH位进行甲氧基修饰，反义链从5’端起第7和15位核糖核苷酸的2’OH位进行甲氧基修饰；

miR-150agomir1正义链：5’-UCUcCCaACCCuUGUACCaGUG-3’

miR-150agomir1反义链：5’-CACUGGuACAAGGGuUGGGAGA-3’

(2)miR-150agomir2：将miR-150的正义链从5’端起第4、7、12和19位核糖核苷酸的2’OH位进行甲氧基修饰，反义链从5’端起第7和15位核糖核苷酸的2’OH位进行甲氧基修饰，并且对反义链的3’端进行胆固醇修饰；

miR-150agomir2正义链：5’-UCUcCCaACCCuUGUACCaGUG-3’

miR-150agomir2反义链：5’-CACUGGuACAAGGGuUGGGAGA-Chol 3’

(3)miR-150agomir3：将miR-150的正义链从5’端起第4、7、12和19位核糖核苷酸的2’OH位进行甲氧基修饰，反义链从5’端起第7和15位核糖核苷酸的2’OH位进行甲氧基修饰，并且对反义链的3’端进行胆固醇修饰，正义链和反义链的5’端分别进行两个硫代骨架修饰，3’端分别进行四个硫代骨架修饰；

miR-150agomir3正义链：5’-UsCsUcCCaACCCuUGUACCasGsUsGs-3’

miR-150agomir3反义链：5’-CsAsCUGGuACAAGGGuUGGGsAsGsAs-Chol 3’

(4)miR-150agomir4：将miR-150的正义链从5’端起第3、6、11和18位核糖核苷酸的2’OH位进行甲氧基修饰，反义链从5’端起第2、11和20位核糖核苷酸的2’OH位进行甲氧基修饰；

miR-150agomir4正义链：5’-UCuCCcAACCcUUGUACcAGUG-3’

miR-150agomir4反义链：5’-CaCUGGUACAaGGGUUGGGaGA-3’

(5)miR-150agomir5：将miR-150的正义链从5’端起第5、10、15和20位核糖核苷酸的2’OH位进行甲氧基修饰，反义链从5’端起第4和15位核糖核苷酸的2’OH位进行甲氧基修饰；

miR-150agomir5正义链：5’-UCUCcCAACcCUUGuACCAgUG-3’

miR-150agomir5反义链：5’-CACuGGUACAAGGGuUGGGAGA-3’

(6)miR-150agomir6：对miR-150mimics的反义链3’端进行胆固醇修饰；

miR-150agomir6正义链：5’-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3’

miR-150agomir6反义链：5’-CACUGGUACAAGGGUUGGGAGA-Chol 3’

具体序列信息见表1所示：

表1 miR-150序列信息

本实施例所提供的序列，包括miR-150mimics、miR-150mimics NC、miR-150inhibitor、miR-150inhibitor NC以及修饰的miR-150agomir按照常规合成方法设计合成的。

实施例2：体外生物学活性实验

将未经修饰的miR-150mimics和miR-150mimics NC与实施例1中的miR-150agomir1～5、对应的agomir NC以及miR-150inhibitor、miR-150inhibitor NC分别经lipofectamin包载形成的复合物转染至LOVO细胞系，使用实时荧光定量PCR法对细胞内miR-150的表达水平进行半定量分析，以检测其体外生物学活性，从而确定各种修饰对mimics活性的影响。

细胞培养：本发明研究中体外细胞转染实验中细胞系为LOVO细胞，LOVO细胞采用含10％胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

细胞转染：

(1)取培养瓶中LOVO细胞接种于24孔细胞培养板中，培养至细胞培养板覆盖率达到70～80％，丢弃原培养基，加入无血清、无抗生素的DMEM培养基培养4h；

(2)转染样品制备：

a)用50ul不含血清的opti-MEMI培养基分别稀释miRNA样品，终浓度为50nM，轻轻混匀，每个转染设3个复孔；

b)将lipofectamin轻轻混匀，然后取2ul稀释到50ul的opti-MEM I培养基中，轻轻混匀后在室温下孵育5min；

c)将步骤a)和b)的稀释液混合，轻轻混匀后在室温下孵育20min，形成复合物；

(3)将复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中，轻轻摇动培养板混合；

(4)在37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜，更换含10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养24h。

在细胞转染24小时后，对各组细胞进行总RNA的抽提，经反转录PCR获得相对应的cDNA，最后通过实时定量PCR方法来检测各组细胞内miR-150的表达情况。其中用U6基因作为参比基因，每个样品均设有三个重复孔。

总RNA提取：

(1)离心收集细胞，往离心管中加入500ul Ezol，将离心管上下颠倒混匀，室温放置10min；

(2)加入200ulRNA专用的三氯甲烷，剧烈上下颠倒混匀，直至离心管中的液体彻底混匀，成乳白色状；

(3)室温放置5min，12000rpm离心15min；

(4)小心将上清转移至另一干净的1.5ml离心管中，避免吸动中层蛋白相和下层有机相；

(5)往上清中加入500ul预冷的RNA专用的异丙醇，室温放置5min，10000rpm离心10min；

(6)小心弃尽上清，加入1mlRNA专用的75％乙醇洗涤沉淀，10000rpm离心10min；

(7)小心弃尽上清，置于室温晾干乙醇，每管加入20ulDEPC水溶解混匀。

RNA逆转录：

将上述抽提得到的RNA分别用U6和miRNA样品特异逆转录引物进行逆转录，制备cDNA模板

逆转录体系

表2逆转录体系

试剂名称	用量/管
		5x逆转录缓冲液	4ul
RT Primer Mix(1uM)	1.25ul
		dNTP(10mM)	0.75ul
RNA	2ul
		RTase(200/ul)	0.5ul
DEPC H<sub>2</sub>O	至20ul

逆转录反应条件：16℃ 30min；42℃ 30min；85℃ 10min。

荧光定量PCR检测：

(1)cDNA模板稀释：将上述逆转录得到的cDNA稀释3倍，往20ul的体系中加入40ul无RNase/DNase的ddH₂O混匀；

(2)荧光定量PCR体系

表3荧光定量PCR体系

试剂名称	用量/管
		2x PCR Master Mix	10ul
F Primer(20uM)	0.2ul
		R Primer(20uM)	0.2ul
模板	2ul
		rTaq DNA聚合酶(5U/ul)	0.2ul
dd H<sub>2</sub>O	至20ul

(3)反应条件：1)95℃ 3min；2)95℃ 15s；3)55℃ 30s；4)72℃ 30s；第2)步至第4)步共40个循环。

实验结果见图1，结果显示，各组的mimics均有一定的效果，其中miR-150agomir1、miR-150agomir2和miR-150agomir3引起细胞内miR-150相对表达量的大幅度增加，miR-150agomir1的增幅最大，而miR-150agomir4对细胞内miR-150表达量的影响较小，miR-150agomir5对细胞内miR-150表达量反而有一定的降低。

实施例3：未包载脂质体进行生物学活性实验

将未经修饰的miR-150mimics和miR-150mimics NC与实施例1中的miR-150agomir1～3、6直接转染至LOVO细胞系，使用实时荧光定量PCR法对细胞内miR-150的表达水平进行半定量分析，以检测其体外生物学活性，从而确定包载对mimics活性的影响。

实验结果见图2，结果显示，未经包载的miR-150mimics和miR-150agomir1的细胞内的miR-150的表达量降低较多，miR-150agomir6的细胞内的miR-150的表达量也降低较多，而miR-150agomir2和miR-150agomir3能够引起细胞内miR-150相对表达量的大幅度增加。

实施例4：miR-150mimics制剂靶向治疗

将LOVO细胞接种到裸鼠皮下形成肿瘤，把经lipofectamin包载的miR-150mimics、经lipofectamin包载的miR-150agomir1、未经包载的miR-150agomir2及控制组的微核酸药物制剂，以及转染试剂组和PBS空白对照组注射入肿瘤组织，转染浓度为50M，连续治疗9次。皮下移植瘤每两天注射一次药物(沿背部皮肤水平进针0.5cm达到肿瘤组织，继续进针达到肿瘤中央，瘤内注射)，每次注射100ul/只，每只累计注射9次。从开始给药至最后取标本，整个过程共计18天。靶向治疗过程中肿瘤抑制情况：治疗开始时，各组肿瘤体积大约为150mm³，随着治疗进行，各组的肿瘤生长趋势见表4。

表4各组肿瘤体积

结果表明miR-150agomir1对肿瘤有明显的抑制作用，且未经包载的miR-150agomir2也能够对肿瘤起到明显的抑制作用。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 上海珑欣生物医学科技有限公司

<120> 一种生物活性提高的microRNA及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> （人工序列）

<400> 1

ucucccaacc cuuguaccag ug 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> （人工序列）

<400> 2

cacugguaca aggguuggga ga 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> （人工序列）

<400> 3

uuuguacuac acaaaaguac ug 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> （人工序列）

<400> 4

caguacuuuu guguaguaca aa 22

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> （人工序列）

<400> 5

cacugguaca aggguuggga ga 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> （人工序列）

<400> 6

caguacuuuu guguaguaca aa 22

Claims

1.一种生物活性提高的microRNA，其特征在于，所述的microRNA是通过将双链miR-150的正义链从5’端起第4、7、12和19位核糖核苷酸的2’OH位进行化学修饰，反义链从5’端起第7和15位核糖核苷酸的2’OH位进行化学修饰得到；所述的化学修饰的修饰基团为氟基或甲氧基；所述的miR-150正义链的序列为5’-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3’，反义链的序列为5’-CACUGGUACAAGGGUUGGGAGA-3’。

2.根据权利要求1所述的microRNA，其特征在于，所述的microRNA反义链的3’端还修饰有胆固醇。

3.根据权利要求1所述的microRNA，其特征在于，所述的microRNA正义链和反义链的5’端分别进行两个硫代骨架修饰，3’端分别进行四个硫代骨架修饰。

4.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1~3任一项所述的microRNA。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括适用于microRNA体内传导的载体。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为病毒载体、天然材料载体或合成材料载体。

7.一种权利要求1~3任一项所述的microRNA在制备治疗与miR-150低表达相关疾病的靶向药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的与miR-150低表达相关疾病包括大肠癌、结肠癌、直肠癌。