CN112375823B - miRNA抑制剂在制备治疗和/或预防淋巴瘤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及miRNA抑制剂在制备治疗和/或预防淋巴瘤的药物中的应用。本发明所述miRNA抑制剂通过抑制miR130b的表达，诱导细胞自噬，从而抑制肿瘤细胞增殖，因此，该miRNA抑制剂可用于制备治疗和/或预防淋巴瘤的药物。

Description

miRNA抑制剂在制备治疗和/或预防淋巴瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及miRNA抑制剂在制备治疗和/或预防淋巴瘤的药物中的应用。

背景技术

淋巴瘤是原发于淋巴结或结外淋巴组织的恶性肿瘤。在淋巴结内，淋巴细胞发生基因突变导致细胞增殖失控，最终导致肿瘤发生。在我国，淋巴瘤发病率约为3-4/10万，每年新发患者约4.5万人，死亡人数超过2万人，发病率占男性恶性肿瘤的第9位，占女性恶性肿瘤的第10位。并且发病率呈逐年升高趋势，严重威胁人类健康。

淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma，NHL)两大类，其中，以NHL为主，大约占到80-90％。非霍奇金淋巴瘤是由B淋巴细胞、T淋巴细胞或NK细胞引起的高度异质性的恶性肿瘤。淋巴瘤常采用联合化疗、放疗、免疫靶向治疗及骨髓移植等综合方案治疗。尽管淋巴瘤的治疗取得了很大进步，能改善近一半患者长期无病生存，但仍有约半数以上的患者对治疗反应差，预后不理想，影响淋巴瘤预后的因素很多，但主要与病理亚型、分期、国际预后指征(IPI)和病变特殊部位有关。

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是NHL中最常见的类型，几乎占所有病例的1/3。这类淋巴瘤占临床上的“侵袭性”或“中高度恶性”淋巴瘤的大多数病例。近年多个国际多中心随机对照临床试验研究资料证明，其标准的一线治疗方案是利妥昔单抗(Rituximab,R)+CHOP方案，并且通过增加方案的剂量密度，缩短疗程间隙时间，从而获得更好的疗效，如R-CHOP14方案。尽管DLBCL患者的治疗取得了很大的进展，但复发或难治性疾病患者的临床疗效较差，中位生存时间小于6个月，因此，解析B淋巴细胞的恶变机制，寻找特征性的生物标志进行精确分子分型和精准靶向治疗，是现代B细胞淋巴瘤诊治的关键难题。

microRNA(miRNA)研究通常的策略是通过miRNA芯片等高通量的技术手段对于miRNA和疾病之间的关系进行研究，同时通过生物信息学预测系统如miRNA TargetScanalgorithm、PicTar algorithm、DIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITA、rna22 algorithms等预测miRNA的靶基因位点。进行靶位点预测之后，接着是要通过miRNApulldown方法，识别靶基因位点。将会使人们对于高等真核生物基因表达调控的网络理解提高到一个新的水平。这也将使miRNA可能成为疾病诊断的新的生物学标记，还可能使得这一分子成为药靶，或是模拟这一分子进行新药研发，这将可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手段。

到目前为止，淋巴瘤的研究主要集中在蛋白编码基因上，以寻找致癌或抑癌的基因。对小分子非编码RNA的研究表明虽然也有所涉及，但这方面的研究相对匮乏。目前已有研究表明，miR-15a、miR-16与弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)在淋巴瘤中的表达较正常组织低表达，与淋巴瘤的形成、发生和发展相关。尚未发现miR-130b与DLBCL的形成、发生和发展存在相关性。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种miRNA抑制剂在制备治疗和/或预防淋巴瘤的药物中的应用。

本发明提供了miRNA作为标志物在制备淋巴肿瘤诊断试剂盒中的应用，所述miRNA具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或为SEQ ID NO:1经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核酸。

本发明中，所述miRNA为miR130b，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1所示核苷酸序列为：5’-ACUCUUUCCCUGUUGCACUAC-3’。

本发明选取20个DLBCL淋巴瘤的患者在初发，治疗后获得完全缓解和复发时的60个标本，抽取他们的RNA作为芯片测试样本miRNA芯片。其中miRNA芯片包含了372条miRNA。在对外周血miRNA的研究中，我们从中逐步筛选出在初发和复发状态下对比缓解状态下同时存在明显变化的miRNA以及在淋巴瘤中研究最多的miRNA作为研究对象，筛选的过程富有逻辑性，最终发现miRNA130b对肿瘤增殖具有明显的抑制作用。。

本发明还提供了miRNA抑制剂在制备治疗和/或预防淋巴瘤的药物中的应用，所述核酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或为SEQ ID NO:2经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核酸。

一些实施方案中，所述miRNA抑制剂为经修饰的核酸，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明中，所述miRNA抑制剂的核苷酸序列与miRNA的核苷酸序列反向互补。

一些具体实施例中，所述miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述miRNA抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列反向互补。SEQ ID NO:2序列为：5’-GUAGUGCAACAGGGAAAGAGU-3’。

本发明中，所述miRNA抑制剂在制备治疗和/或预防淋巴瘤的药物中的应用中，所述修饰包括甲基化修饰、硫代修饰和胆固醇修饰。

一些具体实施例中，所述修饰具体为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的5’端第1～2位的碱基以及3’末端1～4位的碱基经硫代修饰，3’末端经胆固醇修饰，其全链经甲基化修饰。

本发明所述miRNA抑制剂在制备治疗淋巴瘤的药物中的应用中，所述治疗为抑制淋巴瘤细胞的增殖。

一些具体实施例中，所述淋巴瘤细胞包括DB细胞和/或OCI-LY10细胞。

本发明还提供一种治疗淋巴瘤的药物，包括本发明所述的miRNA抑制剂和包裹所述miRNA抑制剂的药物载体；

所述miRNA抑制剂为经修饰的核酸，所述核酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或为SEQ ID NO:2经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核酸。

迄今为止，大多数寡核苷酸疗法，包括几乎所有已批准的核酸药物，都是局部给药，例如眼睛、脊髓、肝脏。寡核苷酸通常是大的亲水性多聚阴离子，这种特性意味着它们不容易通过质膜。由于基于寡核苷酸的治疗药物通常无法穿越血脑屏障(BBB)，因此向中枢神经系统(CNS)的递送是一个额外的挑战。

本发明中，采用纳米脂质体材料对所述miRNA抑制剂进行包裹，解决了药物递送难题。一些具体实施例中，本发明采用的纳米脂质体为葡聚糖基纳米脂质体。

本发明提供了miRNA抑制剂在制备治疗和/或预防淋巴瘤的药物中的应用。本发明提供的miRNA抑制剂通过抑制miR130b的表达，诱导细胞自噬，从而抑制肿瘤细胞增殖。本发明还提供了包含所述miRNA抑制剂的纳米药物，经体内和体外实验证实，其对B细胞性淋巴瘤细胞株DB和OCI-ly10增殖具有显著抑制作用，能够明显减小淋巴瘤的肿瘤体积。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明纳米药物对淋巴瘤细胞株DB和OCI-ly10增殖的抑制作用；

图2为本发明纳米药物的吸收效率；

图3为给予本发明纳米药物后小鼠肿瘤体积的变化情况，其中，3-A为给药0～14天小鼠的肿瘤体积，Day 10的P<0.05，Day 12的P<0.001；Day 14的P<0.05；3-B为给药14天小鼠的肿瘤体积的PETCT检测结果图。

具体实施方式

本发明公开了miRNA抑制剂在制备治疗和/或预防淋巴瘤的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明miRNA抑制剂在制备治疗和/或预防淋巴瘤的药物中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

(一)细胞株及细胞培养

本研究应用了以下几种人淋巴瘤细胞株：B细胞性淋巴瘤细胞株DB，OCI-ly10均购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。DB细胞采用含10％灭活胎牛血清(FBS，Gibco)的RPMI1640培养基，OCI-ly10细胞采用含10％灭活胎牛血清(FBS，Gibco)的IMDM培养基，在5％CO2-95％空气，饱和湿度以及37℃的条件下培养。

(二)稳转细胞株构建

保证DB，OCI-ly10细胞状态良好，用完全培养基制备10⁵/ml的细胞悬液，在12孔板中加入1ml细胞，20ul Poly P转染试剂，100×PGMLV-CON/100×PGMLV-miR130b-5p病毒。用薄膜将12孔密封后采用室温下2000x rpm离心1小时，37℃培养12小时后根据细胞状态换液。转染72小时后荧光显微镜下观察转染效率，采用流式分选或嘌呤霉素筛选出稳定感染的细胞。

(三)脂质体纳米药物的制备

将脂质葡聚糖纳米载体(40mg/ml)与miRNA inhibitor(miRNA130b抑制剂)(20uM)按1:2混合，室温震荡20s得到载miRNA抑制剂的脂质体(本发明中称其为纳米药物)。室温静置15min后加入opt-MEM重悬后的DB和OCI-ly10细胞中，4小时后换完全培养基，与换液前观察药物吸收效率可达95％以上。

实施例2体外miRNA130b抑制剂对淋巴瘤细胞增殖的抑制作用

将实施例1制备的纳米药物室温静置15min后加入opt-MEM重悬后的DB和OCI-ly10细胞中，4小时后换完全培养基，与换液前观察药物吸收效率可达95％以上。对纳米药物处理后的肿瘤细胞进行细胞计数制备细胞悬液，按照每孔2000个细胞(分对照组和加药处理组)接种于96孔板中，并设置4个复空，连续4天进行CCK8检测。对肿瘤增殖的抑制作用见图2。

结果显示，本发明包含的miRNA130b抑制剂的纳米药物对淋巴瘤细胞株DB和OCI-ly的增殖均具有显著抑制作用(P＜0.01或P＜0.05)。

实施例3体内miRNA130b抑制剂对Balb/c小鼠淋巴瘤的治疗作用

Balb/c老鼠背部剃毛，每只老鼠皮下注射107个A20细胞。与接种后6天开始进行纳米药物治疗，给药方式为尾静脉注射，给药频率为2次/周，连续给药2周，检测2周，比较肿瘤细胞的结果见图3。

PETCT检查结果显示，与不给药的对照组相比，给予miR130b antagomir纳米药物后两组老鼠的肿瘤体积明显减小，差异显著(P＜0.01或P＜0.05)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院

<120> miRNA抑制剂在制备治疗和/或预防淋巴瘤的药物中的应用

<130> MP2027257

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acucuuuccc uguugcacua c 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

guagugcaac agggaaagag u 21

Claims (4)

1.miRNA抑制剂在制备治疗淋巴瘤的药物中的应用；所述miRNA抑制剂为经修饰的核酸，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述治疗为抑制淋巴瘤细胞的增殖；

所述淋巴瘤为弥漫大 B 细胞淋巴瘤。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述修饰包括甲基化修饰、硫代修饰和胆固醇修饰。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述修饰具体为：SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的5’端1~2位的碱基以及3’末端1~4位的碱基经硫代修饰，3’末端经胆固醇修饰，其全链经甲基化修饰。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述淋巴瘤细胞包括DB细胞和/或OCI-LY10细胞。

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