CN101939446B - 人类卵巢癌中的微小rna特征 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于诊断、预测和治疗卵巢癌的新方法和组合物。本发明还提供了鉴定抗癌剂的方法。

Description

人类卵巢癌中的微小RNA特征
发明人：C·M·克罗斯 
相关申请的交叉引用 
本申请要求2008年9月8日提交的PCT申请PCT/US08/075565(其要求2007年9月6日提交的美国临时申请第60/967,663号的优先权)的权益，其公开内容特别通过引用并入本文。 
政府支持 
本发明全部或部分由来自国家癌症研究所基金第---号的支持。政府在本发明中具有某些权利。 
发明领域
本发明一般涉及分子生物学领域。更特别地，其关于涉及微小RNA(miRNA或miR)分子的方法和组合物。描述了用于分离、标记、制备用于分析或作为分析工具的miRNA的方法和组合物，诸如miRNA阵列。另外，涉及miRNA在诊断学、治疗学和预测学中的应用。 
发明背景 
上皮性卵巢癌是最常见的妇科肿瘤，并且是世界范围内女性第6种最常见的癌症，伴有高侵袭性自然病史，每年造成几乎125,000例死亡(1)。尽管在检测和细胞毒性治疗中的进展，在最初诊断后5年仅30％患有晚期卵巢癌的患者存活(2)。该疾病的高死亡率主要是由于对超过70％卵巢癌的晚期诊断。事实上，当卵巢癌在其早期被诊断时，其仍局限于 器官内，5年存活率超过90％。遗憾地，所有卵巢癌中仅19％在其早期被诊断。实际上，这种相当差的预测是由于(i)该疾病在其早期发病时隐伏的无症状本质，(ii)缺少稳健和微创的早期检测方法，和(iii)肿瘤对化疗的抗性。绝大多数的人类卵巢癌是由卵巢上皮癌(OEC)表现，其来自卵巢表面上皮(OSE)(3)。 
卵巢腺癌以4种主要组织学亚型存在，浆液性、粘液性、子宫内膜样和透明细胞，其中浆液性是最常见的亚型。目前的数据表明每种这些组织学类型与不同的形态和分子遗传学改变相关(4)，但是进一步研究促进卵巢癌的分子机制对确定每种亚型是如何出现的是必要的。 
过去5年表达谱技术极大地改进，因此扩展了关于癌症病因和具有临床应用的生物标志物的知识(5，6)。然而，尽管这些技术已提供了大多数具有潜在诊断、药物开发和个体化治疗应用的新生物标志物，迄今为止这些技术很少深入该瘤形成起源的详细机制，因此暗示卵巢肿瘤发生可通过新的或表征不好的途径发生。 
近来发现一类新的小非编码RNA(称为微小RNA)，并显示其在转录后水平调节基因表达，多半通过以部分序列同源性与靶mRNA的3’非翻译区(3’UTR)结合，并造成翻译阻断和/或mRNA降解(7)。微小RNA是从70-100nt发夹前-miRNA前体切割的19-25nt长的分子。该前体由胞质RNA酶III Dicer切割为约22-nt miRNA双链体：短寿双链体的一条链(miRNA＊)被降解，而作为成熟miRNA的另一条链掺入RNA-诱导的沉默复合体(RISC)，并驱动含有反义序列的靶mRNA的选择。 
一些研究已证明miRNA在诸如分化、细胞生长和细胞死亡的基本过程中发挥重要作用(8，9)。 
此外，已显示miRNA在癌症中异常表达或突变，暗示其作为新一类癌基因或肿瘤抑制基因发挥作用，这取决于其调节的靶：在肺癌中下调的let-7抑制RAS(10)和HMGA2(11，12)；在白血病中缺失或下调的mir-15和mir-16抑制BCL2(13)；mir-17-5p和mir-20a控制由原癌基因c-Myc驱动的细胞死亡和增殖的平衡(14)。 
清楚的证据表明miRNA多顺反子mir-17-92作为淋巴瘤和肺癌中的癌基因(15)；mir-372和mir-373通过麻痹p53途径是睾丸生殖细胞肿瘤中新的癌基因(16)，在B细胞淋巴瘤和实体瘤中过量表达的miR-155导致转基因小鼠体内模型中B细胞恶性肿瘤的发展(17)。 
微小RNA微阵列技术的应用已用作有力的工具来识别在正常样品和肿瘤样品中差异表达的微小RNA(18-20)，并且来鉴定与明确定义的临床病理特点和疾病结果相关的miRNA表达特征(21，22)。一些研究还研究了导致异常微小RNA表达的分子机制，鉴定了微小RNA基因中基因组异常的存在(21，23，24)。更近来，少量证据显示微小RNA基因还可通过外遗传机制如基因组DNA甲基化模式的改变被调控：miR-127(25)和miR-124a(26)由CpG岛的高度甲基化被转录地失活，而在肺癌中let-7a-3的过量表达似乎是由于DNA低甲基化(27)。 
尽管大量关于卵巢癌治疗的研究，卵巢癌仍旧难于诊断和有效治疗，患者中观察到的死亡率表明疾病的诊断、治疗和预防需要改进。 
发明概述 
本发明部分基于鉴定相对于正常对照细胞在卵巢癌细胞中差异表达的卵巢癌-特异的miRNA特征。 
相应地，本发明包含诊断受治疗者是否患有卵巢癌或处于发展卵巢癌的危险的方法，其包括测量来自受治疗者的测试样品中至少一种miR的水平，其中测试样品中miR水平相对于对照样品中对应miR水平的改变指示受治疗者患有卵巢癌或者处于发展卵巢癌的危险。 
在特定的方面，本文提供了诊断受治疗者是否患有卵巢癌或处于发展卵巢癌的危险的方法，其包括测量来自受治疗者的测试样品中至少一种miR的水平。测试样品中miR水平相对于对照样品中对应miR水平的改变指示受治疗者患有卵巢癌或者处于发展卵巢癌的危险。 
在另一个特定方面，本文提供了包括鉴定miR表达与卵巢癌或卵巢癌的诱因的相关性的方法，其包括：(a)标记从来自患有或怀疑患有疾病 或病况的受治疗者的样品中分离的miR；(b)将所述miR与miR阵列杂交；(c)确定miR与阵列的杂交；和(d)鉴定与参考相比代表疾病或病况的样品中差异表达的miR。 
在特定的方面，本文提供了其中鉴定差异表达的miR包括产生样品的miR谱和评估miR谱来确定与正常样品相比样品中的miR是否差异表达的方法。在某些实施方案中，miR谱选自表1中所示的miR的一种或多种。在某些实施方案中，miR谱还选自图3A或图3B中所示的miR的一种或多种。 
在特定的方面，卵巢癌是透明细胞、浆液性或子宫内膜样卵巢癌的一种或多种。在特定的方面，miR谱选自表3中所示的miR的一种或多种，由此区分卵巢癌细胞与正常细胞。在某些实施方案中，miR谱还选自表4中所示的miR的一种或多种，由此根据以下的组织型区分卵巢癌细胞：浆液性、非浆液性、子宫内膜样、非子宫内膜样、透明细胞、非透明细胞、低分化的和非低分化的。 
在特定实施方案中，miR谱涉及选自由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-199a、miR-140、miR-145和miR-125b1组成的组的至少一种miR，其中与正常样品相比一种或多种miRNA的表达差异指示卵巢癌。在某些实施方案中，miR谱还涉及至少miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-199a、miR-140、miR-145和miR-125b1，其中与正常样品相比一种或多种miRNA的表达差异指示卵巢癌。 
在特定的方面，本文提供了其中与正常样品相比miR-200a、miR-200b、miR-200c或miR-141表达的增加和/或miR-199a、miR-140、miR-145或miR-125b1表达的降低指示卵巢癌的方法。 
在特定的方面，本文提供了其中miR谱涉及选自由miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-141组成的组的至少一种miRNA的方法，其中与正常样品相比一种或多种miRNA的表达差异指示浆液性卵巢癌。 
在特定的方面，本文提供了其中miR谱涉及选自由miR-205、miR- 21、miR-182、miR-200b和miR-141组成的组的至少一种miRNA的方法，其中与正常样品相比一种或多种miRNA的表达差异指示子宫内膜样卵巢癌。 
在特定的方面，本文提供了区分浆液性、子宫内膜样、透明细胞和/或低分化的卵巢癌的卵巢癌组织型的方法。在某些实施方案中，miR谱选自图3A或图3B中所示的miR的一种或多种，并且指示浆液性卵巢癌。在某些其他实施方案中，miR谱选自图3A或图3B中所示的miR的一种或多种，并且指示子宫内膜样卵巢癌。在某些其他实施方案中，miR谱选自图3A或图3B中所示的miR的一种或多种，并且指示透明细胞卵巢癌。 
在特定的方面，本文提供了抑制卵巢癌细胞增殖的方法，其包括：i)将抑制选自表3中所示的组的一种或多种miR的表达或活性的一种或多种药剂引入细胞；ii)将增强miR的一种或多种靶基因的表达的一种或多种药剂引入细胞，或将i)和ii)的一种或多种药剂的组合引入细胞，并保持细胞处于其中一种或多种药剂抑制miR的表达或活性、增强miR的一种或多种靶基因的表达或活性、或导致其组合的条件下，因此抑制卵巢癌细胞的增殖。在特定实施方案中，该细胞是人类细胞。 
在特定的方面，本文提供了其中miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-141的表达被上调并具有如常见的推测靶抑癌基因BAP1、BRCA1相关蛋白的方法，所述抑癌基因BAP1、BRCA1相关蛋白在卵巢癌中被下调。 
在特定的方面，本文提供了与正常组织相比用于在卵巢癌细胞中调控miR-21、miR-203、miR-146、miR-205、miR-30-5p和miR-30c的一种或多种的水平的方法，其包括施用有效量的脱甲基化剂。在特定实施方案中，在5-氮杂-2′-脱氧胞苷脱甲基化处理之后该水平被增加。 
在特定的方面，本文提供了用于改变miR-21、miR-203、miR-146、miR-205、miR-30-5p和miR-30c的一种或多种的表达的方法，其包括控制负责其过量表达的DNA低甲基化机制。 
至少一种miR的水平可使用本领域技术人员公知的多种技术来测量。在一个实施方案中，至少一种miR的水平使用Northern印迹分析测量。在另一种实施方案中，测试样品中至少一种miR的水平低于对照样品中对应miR的水平。在另一个实施方案中，测试样品中至少一种miR的水平还可高于对照样品中对应miR的水平。 
本发明还提供了诊断受治疗者中与一种或多种预测标志相关的癌症的方法，其包括测量来自受治疗者的癌症样品中至少一种miR的水平，其中测试样品中至少一种miR水平相对于对照样品中对应miR水平的改变指示受治疗者患有与一种或多种预测标志物相关的癌症。在一个实施方案中，至少一种miR的水平通过以下来测量：反转录来自获自受治疗者的测试样品的RNA来提供一组靶寡脱氧核苷酸；靶寡脱氧核苷酸与包含miR-特异探针寡核苷酸的微阵列杂交来提供测试样品的杂交谱；和比较测试样品的杂交谱与产生自对照样品的杂交谱。至少一种miR的信号的改变指示受治疗者患有此类癌症或处于发展此类癌症的危险。 
本发明还包含治疗受治疗者的癌症的方法，其中至少一种miR的信号相对于产生自对照样品的信号是失调的(例如，下调、上调)。 
本发明还包含诊断受治疗者是否患有与受治疗者中一种或多种不良预测标志物相关的癌症、或处于发展与受治疗者中一种或多种不良预测标志物相关的癌症的危险的方法，通过反转录获自受治疗者的测试样品的RNA来提供一组靶寡脱氧核苷酸；将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miR-特异探针寡核苷酸的微阵列杂交来提供测试样品的杂交谱；和比较测试样品的杂交谱与产生自对照样品的杂交谱。信号的改变指示受治疗者患有该癌症，或处于发展该癌症的危险。 
本发明还包含治疗患有癌症的受治疗者的癌症的方法，其中相对于对照细胞，受治疗者的癌细胞中至少一种miR被下调或上调。当至少一种miR在癌细胞中被下调时，该方法包括将有效量的至少一种分离的miR施用至受治疗者，以致受治疗者中癌细胞的增殖被抑制。当至少一种miR在癌细胞中被上调时，该方法包括将有效量的用于抑制至少一种miR表达的至少一种化合物施用至受治疗者，以致受治疗者中癌细胞的 增殖被抑制。 
在相关实施方案中，本发明提供了治疗受治疗者的癌症的方法，其包括：确定相对于对照细胞在癌细胞中至少一种miR的量；和通过以下改变癌细胞中表达的miR的量：如果癌细胞中表达的miR的量低于对照细胞中表达的miR的量，将有效量的至少一种分离的miR施用至受治疗者；或者如果癌细胞中表达的miR的量高于对照细胞中表达的miR的量，将有效量的用于抑制至少一种miR表达的至少一种化合物施用至受治疗者，以致受治疗者中癌细胞的增殖被抑制。 
本发明进一步提供了用于治疗癌症的药物组合物，其包括至少一种分离的miR和药学上可接受的载体。在特定实施方案中，药物组合物至少一种分离的miR对应于相对于适合的对照细胞在癌细胞中被下调的miR。 
在另一个特定实施方案中，药物组合物包含至少一种miR表达抑制剂化合物和药学上可接受的载体。在特定实施方案中，药物组合物还包含特异于在相对于适合的对照细胞在癌细胞中被下调和/或上调的miR的至少一种miR表达抑制剂化合物。 
在其他实施方案中，本发明提供了鉴定抗癌剂的方法，其包括向细胞提供测试剂和测量与癌细胞中降低表达水平相关的至少一种miR的水平，其中相对于适合的对照细胞，细胞中miR水平的增加指示测试剂为抗癌剂。 
本发明还提供了鉴定抗癌剂的方法，其包括向细胞提供测试剂和测量与癌细胞中增加表达水平相关的至少一种miR的水平，其中相对于适合的对照细胞，细胞中miR水平的降低指示测试剂为抗癌的。 
在如本文公开的具体方面中，至少一种miR选自表3中所示的组。在特定实施方案中，miR选自由miR-200a、miR-141、miR-200c和miR-200b、miR-199a、miR-140、miR-145和miR-125b1组成的组。 
在具体方面中，本文还提供了其表达与特定卵巢癌生物病理特征(诸如组织型、淋巴管和器官浸润和卵巢表面受累)相关的miRNA的鉴 定。 
在另一个具体方面，本文公开了与正常组织相比卵巢癌中上调的miR-21、miR-203和miR-205的水平在OVCAR3细胞的5-氮杂-2′-脱氧胞苷脱甲基化处理之后显著增加。 
在另一个特定方面，本文还公开了通过控制负责其过量表达的DNA低甲基化机制来改变这些miR的表达的方法。 
当根据附图阅读时，通过以下优选实施方案的详述，本发明的各种目标和优势将对本领域技术人员是明显的。 
附图简述 
本专利或申请文件可含有一个或多个以颜色制成的图和/或一张或多张照片。具有彩图和/或照片的本专利或专利申请公布的副本将在请求和必要付费之后由美国专利商标局提供。 
图1A-1C：卵巢癌和正常卵巢组织的聚类分析： 
图1A：系统聚类分析产生的树，其显示根据点在芯片上的所有人类miRNA，正常组织与卵巢癌的分离。 
图1B：在肿瘤对比正常卵巢中最显著下调的一些微小RNA。 
图1C：在肿瘤对比正常卵巢中最显著上调的4种微小RNA。 
图2A：使用miR-200a、miR-141、miR-199a、miF-125b1、miR-145探针的人类卵巢癌的Northern印迹分析。对miR-199a、miR-125b1和miR-145在人类卵巢细胞系的评估。使用5S探针来归一化不同泳道的表达水平。 
图2B：实时PCR来验证与正常样品相比肿瘤中miR-140的下调。 
图3A和3B：显示与正常组织相比表征不同卵巢癌组织型(浆液性、子宫内膜样和透明细胞)的微小RNA特征的维恩(Venn)图(图3A，上调的miR；图3B，下调的)。 
图4A：在浆液性和子宫内膜样肿瘤中miR-222的微阵列数据表达的 T-检验图代表。 
图4B：Northern印迹对最小组样品的验证。 
图5A-5D：在用脱甲基化剂5’-AZA处理之前和之后，OVCAR3细胞系中微小RNA的表达模式。 
图5A：报告产生于微阵列谱的最显著差异表达的miR的表。 
图5B：系统聚类树表示。 
图5C：实时PCR来验证5种最显著诱导的miR的上调，报道为miR表达水平的图示(每个条形图是产生于3次技术重复的平均的独立实验)。 
图5D：显示处理后miR-21的上调的Northern印迹，用EtBr凝胶染色归一化。 
图6A和6B：显示根据图8-表1中报道的miR特征，为癌症或正常组织的每种样品概率(0.0至1.0)的图示的PAM分析，其描述了更小组的29种miR，4种上调(miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-141)和25种下调(miR-199a、miR-140、miR-145和miR-125b1为最显著)，分化正常对比肿瘤，分类率为89％。 
图7A和7B：对一组人类卵巢癌和两种正常组织的Northern印迹(图7A)；miR-21和miR-203与CpG岛相关，其中miR-203嵌入CpG岛875bp长，miR-21表征为CpG岛-成熟序列上游2kb(图7B)，而miR-205在跨越其成熟形式上游2Kb的区域内部不显示任何CpG岛。 
图8：表1.肿瘤和正常之间差异表达的微小RNA的PAM分析。在通过SAM分析发现的39种miR中，29种miR(4种上调和25种下调)能分类正常，肿瘤样品分类率为89％。发现4种上调的miR在Zhang等，2005进行的基因组研究中被扩增；在Zhang的研究中，下调的miR中，发现25种中的10种被缺失，4种不一致，11种不显示任何拷贝缺失或获得。 
图9-表2：在肿瘤样品对比正常卵巢组织中差异表达的miR。在肿瘤 和正常组织中差异表达的微小RNA的SAM分析显示10种微小RNA上调，29种下调(q-值＜1％，倍数改变＞3)。在上调的10种miR中，发现6种在Zhang等，2005进行的基因组研究中被扩增，4种不显示任何拷贝缺失或获得；在Zhang的研究中，下调的miR中，发现29种中的12种被缺失，6种不一致，11种不显示任何拷贝缺失或获得。 
图10-表3：与正常组织相比不同组织亚型的SAM分析。 
图11-表4：成对比较的肿瘤不同组织型的miRNA表达的SAM分析。 
图12-表5：鉴定与EOC临床病理特征相关的微小RNA的SAM分析。 
图13-表6：概述了产生于我们的分析的最显著微小RNA的证实和重要的预测的靶的表。 
优选实施方案的详述 
本发明涉及关于miRNA的制备和表征的组合物和方法，以及miRNA用于治疗、预测和诊断应用的用途。 
如本文可交换使用，“miR”、“微小RNA”、“miR”、或“miRNA”指来自miR基因的未加工或加工的RNA转录物。由于miR不翻译成蛋白质，术语“miR”不包括蛋白质。未加工的miR基因转录物也称为“miR前体”，并且一般含有长度约70-100个核苷酸的RNA转录物。miR前体可通过用RNA酶(例如，Dicer、Argonaut或RNA酶III，例如大肠杆菌RNA酶III))消化加工为活性的19-25个核苷酸的RNA分子。这种活性的19-25个核苷酸的RNA分子还称为“加工的”miR基因转录物或“成熟”miRNA。应理解，如本文所用的术语“miR”可包括一种或多种miR-寡核苷酸，包括成熟miR、前-miR、pri-miR、或miR种子序列。在某些实施方案中，还可使用各种miR核酸的混合物。在某些实施方案中，miR还可被修饰来增强递送。 
miRNA(miR)信息可获自Sanger研究所，其在http:/microrna.sanger. ac.uk/sequences/保持miRNA的注册。miRBase序列数据库包括核苷酸序列和来自各种来源的公布的miRNA的注释。miRBase注册为新的miRNA基因提供独特的名称，在公布前新的miRNA遵从传统的定名命名法。miRBase靶还是动物中预测的miRNA靶的来源。 
活性的19-25个核苷酸的RNA分子可通过天然加工途径(例如使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶，诸如分离的Dicer、Argonaut或RNA酶III)获自miR前体。应理解，活性的19-25个核苷酸的RNA分子还可直接通过生物或化学合成来产生，而无需从miR前体加工。 
本发明包含诊断受治疗者是否患有癌症或处于发展癌症的危险的方法，其包括测量来自受治疗者的测试样品中至少一种miR的水平和比较测试样品中miR的水平与对照样品中对应miR的水平。如本文所用，“受治疗者”可以是患有或者怀疑患有乳腺癌的任何哺乳动物。在特定实施方案中，受治疗者是患有或者怀疑患有癌症的人类。 
至少一种miR的水平可在获自受治疗者的生物样品的细胞中测量。例如，可通过传统的活检技术从怀疑患有相关的卵巢癌的受治疗者中去除组织样品。在另一个实例中，血样可从受治疗者取出，可通过标准技术分离白细胞用于DNA提取。血液或组织样品优选地在放疗、化疗或其他治疗性治疗起始之前获自受治疗者。对应的对照组织或血样可获自受治疗者的未染病组织、获自正常人类个体或正常个体的群体、或获自对应于受治疗者样品中大多数细胞的培养细胞。然后对照组织或血样与来自受治疗者的样品一起处理，以便在来自受治疗者样品的细胞中从特定miR基因产生的miR的水平可与来自对照样品细胞的对应miR水平相比。 
相对于对照样品中对应miR的水平，获自受治疗者的样品中miR水平的改变(即增加或降低)指示受治疗者中癌症的存在。在一个实施方案中，测试样品中至少一种miR的水平高于对照样品中对应miR的水平(即miR的表达被“上调”)。如本文所用，当来自受治疗者的细胞或组织样品中miR的量高于对照细胞或组织样品中相同miR的量时，miR 的表达被“上调”。在另一个实施方案中，测试样品中至少一种miR的水平低于对照样品中对应miR的水平(即miR的表达被“下调”)。如本文所用，当来自受治疗者的细胞或组织样品中从该基因产生的miR的量低于从对照细胞或组织样品中相同基因产生的量时，miR基因的表达被“下调”。对照和正常样品中相对的miR基因表达可根据一种或多种RNA表达标准来确定。标准可包含例如，零miR基因表达水平、标准细胞系中miR基因的表达水平、或先前为正常人类对照群体获得的miR基因表达的平均水平。 
样品中miR的水平可使用适合用于检测生物样品中RNA表达水平的任何技术来测定。适合用于确定生物样品的细胞中RNA表达水平的技术(例如Northern印迹分析、RT-PCR、原位杂交)是本领域技术人员公知的。在特定实施方案中，至少一种miR的水平使用Northern印迹分析来检测。例如，通过在核酸提取缓冲液存在下匀浆然后通过离心从细胞中纯化总细胞RNA。沉淀核酸，通过用DNA酶处理并沉淀去除DNA。然后根据标准技术通过琼脂糖凝胶上的凝胶电泳分离RNA分子，并转移至硝酸纤维素滤膜。然后通过加热将RNA固定于滤膜上。使用与研究的RNA互补的适当标记的DNA或RNA探针完成特定RNA的检测和定量。参见，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室指南)，J.Sambrook等，编辑，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，第7章，其完整公开内容通过引用并入。 
适合用于特定miR的Northern印迹杂交的探针可产生自特定miR的核酸序列。用于制备标记DNA和RNA探针的方法及其与靶核苷酸序列杂交的条件描述于Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室指南)，J.Sambrook等，编辑，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，第10和11章，其公开内容通过引用并入本文。 
例如，核酸探针可使用如下来标记：例如放射性核素(诸如3H、 32P、33P、14C或35S)；重金属；或能作为标记配体的特定结合对成员起作用的配体(例如，生物素、抗生物素蛋白或抗体)、荧光分子、化学发光分子、酶或类似物。 
通过Rigby等(1977)，J.Mol.Biol.113：237-251的切口平移方法或通过Fienberg等(1983)，Anal.Biochem.132：6-13的随机引发方法可将探针标记至高特异活性，所述文献的完整公开内容通过引用并入本文。后者是选择用于从单链DNA或从RNA模板合成高特异活性的32P-标记的探针的方法。例如，根据切口平移方法通过用高放射活性的核苷酸替换预存的核苷酸，可能制备具有远超过108cpm/微克的具有特异活性的32P-标记的核酸探针。然后通过将杂交滤膜曝光于照相胶片进行杂交的放射自显影检测。杂交滤膜曝光的照相胶片的光密度扫描提供了对miR基因转录物水平的精确测量。使用另一种方法，miR基因转录物水平可通过计算机化的成像系统，诸如可获自Amersham Biosciences，Piscataway，NJ的分子动力学400-B 2D感光成像仪来定量。 
其中放射性核素标记DNA或RNA探针不实用，可使用随机引物的方法来将类似物例如，dTTP类似物5-(N-(N-生物素基-ε-氨基己酰基-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺入探针分子。生物素标记探针寡核苷酸可通过与荧光染料或产生颜色反应的酶偶联的生物素结合蛋白诸如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和抗体(例如，抗-生物素抗体)反应而被检测。 
除了Northern和其他RNA杂交技术，确定RNA转录物的水平可使用原位杂交技术来实现。该技术需要比Northern印迹技术更少的细胞，并且涉及将全细胞沉积到显微镜盖玻片上和使用含有放射活性或其他方法标记的核酸(例如，cDNA或RNA)探针的溶液探测细胞的核酸含量。该技术特别适合于分析受治疗者的组织活检样品。原位杂交技术的实践更详细地描述于美国专利第5,427,916号，其完整的公开内容通过引用并入本文。适合用于特定miR的原位杂交的探针可产生自核酸序列。 
细胞中miR基因转录物的相对数目还可通过miR基因转录物的反转录、然后通过聚合酶链反应扩增反转录的转录物(RT-PCR)来确定。miR基因转录物的水平可通过与内标例如相同样品中存在的“管家”基因的mRNA的水平比较来定量。适合用作内标的“管家”基因包括，例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。用于定量RT-PCR的方法及 其变化在本领域的技术范围内。 
在一些实例中，可能需要同时确定样品中多种不同miR的表达水平。在其他实例中，可能需要确定与癌症相关的所有已知miR基因转录物的表达水平。评估上百个miR基因的癌症特异的表达水平是耗时的，并且需要大量的总RNA(每次Northern印迹至少20μg)和需要放射活性同位素的放射自显影技术。 
为了克服这些限制，可构建以微芯片形式(即微阵列)的含有特异于一组miR基因的一组探针寡脱氧核苷酸的寡核苷酸文库。使用此类微阵列，生物样品中多种微小RNA的表达水平可通过反转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸、并与微阵列上的探针寡脱氧核苷酸杂交以产生杂交或表达谱来确定。然后测试样品的杂交谱可与对照样品的杂交谱比较来确定哪些微小RNA在癌症中具有改变的表达水平。 
如本文所用，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”指能与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。 
“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”指待检测(例如，通过杂交)的分子。 
“miR-特异的探针寡核苷酸”或“特异于miR的探针寡核苷酸”意指具有选择来与特异miR或特异miR的反转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。 
特定样品的“表达谱”或“杂交谱”实质上是样品状态的指纹图谱；尽管两种状态可具有相似表达的任何特定基因，同时评估基因的数目允许产生细胞状态独特的基因表达谱。也就是说，正常细胞可与癌细胞区分，并且在癌细胞内，不同的预测状态(例如好或差的长期存活前景)可被确定。通过比较不同状态下癌细胞的表达谱，获得关于哪些基因在每个这些状态中是重要的信息(包括基因的上调和下调)。 
在癌细胞或正常细胞中差异表达的序列的鉴定以及导致不同预测结果的差异表达允许以多种方式使用该信息。例如，特定的治疗方案可被评估(例如，来确定化疗药物是否起作用来改进特定患者中的长期预 测)。相似地，可通过将患者样品与已知的表达谱比较来完成或验证诊断。此外，这些基因表达谱(或单个基因)允许筛选抑制癌症表达谱或将差的预测谱转变为更好的预测谱的药物候选物。 
相应地，本发明提供了诊断受治疗者是否患有癌症或处于发展癌症的危险的方法，其包括反转录获自受治疗者的测试样品的RNA以提供一组靶寡-脱氧核苷酸、将所述靶寡-脱氧核苷酸与包含miRNA-特异的探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱和比较测试样品的杂交谱与产生自对照样品的杂交谱，其中至少一种miRNA信号的改变指示受治疗者患有癌症或处于发展癌症的危险。 
在一个实施方案中，微阵列包含用于大部分人类miRNA组的miRNA-特异的探针寡核苷酸。 
微阵列可从产生自已知miRNA序列的基因-特异的寡核苷酸探针来制备。阵列可含有每个miRNA的2种不同的寡核苷酸探针，一种含有活性的成熟序列，而另一种特异于miRNA的前体。阵列还可含有对照，诸如与人类直向同源物仅几个碱基不同的一种或多种小鼠序列，其可作为杂交严紧条件的对照。来自两个物种的tRNA也可印在微芯片上，提供了特异杂交的内部、相对稳定的阳性对照。非特异杂交的一个或多个适当的对照也可包括于微芯片上。为达到此目的，基于缺少与任何已知miRNA的任何同源性来选择序列。 
可使用本领域已知的技术来制造微阵列。例如，适当长度的探针寡核苷酸例如40个核苷酸在C6位置具有5’-胺修饰，并使用可商业获得的微阵列系统例如GeneMachine OmniGridTM 100微阵列点样仪和Amersham CodeLinkTM活化的载玻片点样。通过用标记的引物反转录靶RNA来制备对应于靶RNA的标记的cDNA寡聚物。第一链合成之后，RNA/DNA杂交体被变性以降解RNA模板。然后这样制备的标记的靶cDNA在以下的杂交条件下与微阵列芯片杂交，例如6X SSPE/30％甲酰胺，25℃18小时、然后于0.75X TNT中37℃下洗涤40分钟。在其中固定的探针DNA识别样品中互补的靶cDNA的阵列上的位置，发生杂交。标记的靶cDNA标出其中发生结合的阵列上的精确位置，允许自动检测 和定量。输出结果由杂交事件的列表组成，表明患者样品中特异cDNA序列的相对丰度，因此表明患者样品中对应的互补miR的相对丰度。根据一个实施方案，标记的cDNA寡聚物是从生物素标记的引物制备的生物素标记的cDNA。然后通过使用例如链霉抗生物素蛋白-Alexa647轭合物直接检测含有生物素的转录物来处理微阵列，并利用传统的扫描方法扫描微阵列。阵列上每个点的图像强度与患者样品中对应miR的丰度是成比例的。 
使用阵列对miRNA表达检测具有一些优势。第一，可在一个时间点鉴定相同样品中上百个基因的总体表达。第二，通过仔细设计寡核苷酸探针，可鉴定成熟和前体分子两者的表达。第三，与Northern印迹分析相比，芯片需要少量的RNA，并使用2.5μg总RNA提供了可重复的结果。相对有限数目的miRNA(每个物种几百个)允许构建对一些物种具有用于每个物种的不同寡核苷酸探针的通用微阵列。此类工具将允许在各种条件下分析每个已知miR的跨物种表达。 
除了用于特定miR的定量表达水平测定外，可采用含有对应于大部分miRNA组，优选完整miRNA组的miRNA-特异探针寡核苷酸的微芯片来进行miR基因表达谱用于分析miR表达模式。不同的miR特征可与建立的疾病标志物相关，或者直接与疾病状态相关。 
根据本文描述的表达谱方法，来自怀疑患有癌症的受治疗者的样品的总RNA被定量地反转录以提供一组与样品中的RNA互补的标记的靶寡脱氧核苷酸。然后靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供样品的杂交谱。结果是代表样品中miRNA表达模式的样品的杂交谱。杂交谱包含来自样品的靶寡脱氧核苷酸与微阵列中的miRNA-特异探针寡核苷酸结合的信号。谱可记录为结合的存在与否(信号对比零信号)。更优选地，记录的谱包括每次杂交的信号强度。将所述谱与产生自正常即非癌性、对照样品的杂交谱相比较。信号的改变指示受治疗者中癌症的存在。 
用于测量miR基因表达的其他技术也在本领域的技术范围内，并且包括用于测量RNA转录和降解速率的各种技术。 
本发明还提供了诊断与一种或多种预测标志物相关的癌症的方法，其包括测量来自受治疗者的癌症测试样品中至少一种miR的水平和比较癌症测试样品中至少一种miR的水平与对照样品中对应miR的水平。相对于对照样品，测试样品中至少一种miRNA的信号的改变(例如，增强、降低)指示受治疗者患有与一种或多种预测标志物相关的癌症或处于发展与一种或多种预测标志物相关的癌症的危险。 
癌症可与一种或多种预测标志物或特征相关，所述标志物或特征包括与不良(即阴性)预测相关的标志物、或与良好(即阳性)预测相关的标志物。在某些实施方案中，使用本文描述的方法诊断的癌症与一种或多种不良预测特征相关。 
其表达在与每种这些预测标志物相关的癌细胞中改变的特定微小RNA描述于本文。在一个实施方案中，至少一种miR的水平通过以下来测量：反转录获自受治疗者的测试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸、将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱和比较测试样品的杂交谱与产生自对照样品的杂交谱。 
不希望受限于任一种理论，相信细胞中一种或多种miR水平的改变可导致这些miR的一种或多种预期靶的失调，其可导致癌症的形成。 
因此，改变miR的水平(例如，通过降低在CLL细胞中上调的miR的水平，通过提高在癌细胞中下调的miR的水平)可成功地治疗癌症。癌细胞中失调的miRNA的推测的基因靶的实例描述于本文。 
相应地，本发明包含治疗受治疗者的癌症的方法，其中至少一种miR在受治疗者的癌细胞中失调(例如，下调、上调)。当至少一种分离的miR在癌细胞中被下调时，方法包括施用有效量的至少一种分离的miR，以致受治疗者中癌细胞的增殖被抑制。当至少一种分离的miR在癌细胞中被上调时，该方法包括将有效量的用于抑制至少一种miR基因表达的至少一种化合物施用于受治疗者，以致癌细胞的增殖被抑制，所述化合物在本文称为miR基因表达抑制化合物。 
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指缓解与疾病或病况例如癌症相关的症状，包括预防或延缓疾病症状的发作和/或减轻疾病或病况的症状的严重性或频率。术语“受治疗者”和“个体”如本文定义，包括动物，诸如哺乳动物，包括但不限于灵长类、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛科、绵羊科、马科、犬科、猫科、啮齿目或鼠科物种。在优选实施方案中，动物是人类。 
如本文所用，分离的miR的“有效量”是足以抑制患有癌症的受治疗者中癌细胞的增殖的量。通过考虑诸如受治疗者的大小和体重、疾病穿透程度；受治疗者的年龄、健康和性别；施用途径；和施用是区域性或系统性的因素，本领域技术人员能容易地确定待施用至特定受治疗者的miR的有效量。 
例如，分离的miR的有效量可基于待治疗的受治疗者的大概或估计的体重。优选地，如本文所述此类有效量被肠胃外或肠内施用。例如，施用至受治疗者的分离miR的有效量的范围可为约5-3000微克/kg体重、约700-1000微克/kg体重或大于约1000微克/kg体重。 
本领域技术人员还可容易地确定用于将分离的miR施用至特定受治疗者的适当的剂量方案。例如，miR可施用至受治疗者一次(例如，作为单次注射或注入)。可选地，miR可每日一次或两次施用至受治疗者，持续从约3天至约28天，更特别地从约7天至约10天的时间。在特定的剂量方案中，miR每天施用1次，持续7天。其中剂量方案包含多次施用的情况，应理解施用至受治疗者的miR的有效量可包含在整个剂量方案期间施用的miR的总量。 
如本文所用，“分离的”miR是合成、或改变的、或通过人类干预从自然状态取出的miR。例如，合成的miR、或者从其天然状态的共存材料部分或完全分离的miR被认为是“分离的”。分离的miR可以以大体上纯的形式存在，或者可存在于miR被递送到的细胞中。因此，被故意递送至细胞中或在细胞中表达的miR被认为是“分离的”miR。在细胞内从miR前体分子产生的miR也认为是“分离的”分子。 
分离的miR可使用多种标准技术来获得。例如，可使用本领域已知的方法化学合成或重组产生miR。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和传统的DNA/RNA合成仪化学合成miR。合成的RNA分子或合成试剂的商业供应商包括例如，Proligo(Hamburg，Germany)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，U.S.A.)、PierceChemical(part of Perbio Science，Rockford，IL，U.S.A.)、Glen Research(Sterling，VA，U.S.A.)、ChemGenes(Ashland，MA，U.S.A.)和Cruachem(Glasgow，UK)。 
可选地，可使用任何适合的启动子从重组环型或线型DNA质粒表达miR。适合用于从质粒表达RNA的启动子包括例如，U6或H1 RNA polIII启动子序列或巨细胞病毒启动子。其他适合的启动子的选择在本领域的技术范围内。本发明的重组质粒还可包含用于在癌细胞中表达miR的可诱导或可调节启动子。 
从重组质粒表达的miR可通过标准技术分离自培养的细胞表达系统。从重组质粒表达的miR还可被递送至并且直接表达于癌细胞中。重组质粒将miR递送至癌细胞的应用在下文更详细地讨论。 
miR可从分离的重组质粒表达，或者miR可从相同的重组质粒表达。在一个实施方案中，从单个质粒将miR表达为RNA前体分子，通过适合的加工系统前体分子被加工为功能性miR，所述加工系统包括但不限于现存于癌细胞内的加工系统。其他适合的加工系统包括例如体外果蝇细胞裂解系统(例如，如描述于Tuschl等的美国公布的专利申请第2002/0086356号，其完整公开内容通过引用并入本文)和大肠杆菌RNA酶III系统(例如，如描述于Yang等的美国公布的专利申请第2004/0014113号，其完整公开内容通过引用并入本文)。 
适合用于表达miR的质粒的选择、用于将核酸序列插入质粒以表达miR的方法和将重组质粒递送至感兴趣的细胞的方法在本领域的技术范围内。参见，例如，Zeng等(2002)，Molecular Cell 9：1327-1333；Tuschl(2002)，Nat.Biotechnol，20：446-448；Brummelkamp等(2002)，Science296：550-553；Miyagishi等(2002)，Nat.Biotechnol.20：497-500；Paddison 等(2002)，Genes Dev.16：948-958；Lee等(2002)，Nat.Biotechnol.20：500-505；和Paul等(2002)，Nat.Biotechnol.20：505-508，其完整公开内容通过引用并入本文。 
在一个实施方案中，表达miR的质粒包含编码在CMV即时早期启动子控制下的miR前体RNA的序列。如本文所用，“在启动子的控制下”意指编码miR的核酸序列位于启动子的3’，以致启动子可起始miR编码序列的转录。 
miR还可从重组病毒载体表达。本文涵盖，可从两个不同的重组病毒载体或从相同的病毒载体表达miR。从重组病毒载体表达的RNA可通过标准技术分离自培养的细胞表达系统，或者可直接在癌细胞中表达。重组病毒载体将miR递送至癌细胞的应用在下文更详细地讨论。 
本发明的重组病毒载体包含编码miR的序列和任何适合用于表达RNA序列的启动子。适合的启动子包括例如，U6或H1RNA pol III启动子序列或巨细胞病毒启动子。其他适合的启动子的选择在本领域的技术范围内。本发明的重组病毒载体还可包含用于在癌细胞中表达miR的可诱导或可调节的启动子。 
可使用能接受miR编码序列的任何病毒载体；例如，衍生自腺病毒(AV)；腺伴随病毒(AAV)；反转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒)；疱疹病毒和类似病毒的载体。可通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原假型载体、或通过置换适当的不同病毒衣壳蛋白来修饰病毒载体的向性。 
例如，可用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、Mokola和类似病毒的表面蛋白来假型本发明的慢病毒载体。通过改造载体以表达不同衣壳蛋白血清型，本发明的AAV载体可被靶向不同细胞。例如，在血清型2基因组上表达血清型2衣壳的AAV载体被称为AAV2/2。AAV 2/2载体中的血清型2衣壳基因可被血清型5衣壳基因替换以产生AAV 2/5载体。用于构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域的技术范围内；参见，例如，Rabinowitz，J.E.，等(2002)，J.Virol.76：791-801，其完整公开内容通过引用并入本文。 
选择适合在本发明中使用的重组病毒载体、用于将表达RNA的核酸序列插入载体的方法、将病毒载体递送至感兴趣的细胞和表达的RNA产物的回收在本领域的技术范围内。参见，例如，Dornburg(1995)，GeneTherap.2：301-310；Eglitis(1988)，Biotechniques 6：608-614；Miller(1990)，Hum.Gene Therap.1：5-14；和Anderson(1998)，Nature 392：25-30，其完整公开内容通过引用并入本文。 
特别适合的病毒载体是衍生自AV和AAV的病毒载体。适合用于表达miR的AV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于将载体递送进靶细胞的方法描述于Xia等(2002)，Nat.Biotech.20：1006-1010，其完整公开内容通过引用并入本文。适合用于表达miR的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法和用于将载体递送进靶细胞的方法描述于Samulski等(1987)，J.Virol.61：3096-3101；Fisher等(1996)，J.Virol，70：520-532；Samulski等(1989)，J.Virol.63：3822-3826；美国专利第5,252,479号；美国专利第5,139,941号；国际专利申请第WO 94/13788号；和国际专利申请第WO 93/24641号，其完整公开内容通过引用并入本文。在一个实施方案中，从包含CMV即时早期启动子的单个重组AAV载体表达miR。 
在某个实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含在人类U6RNA启动子控制下、与多聚T终止序列可操作连接的编码miR前体RNA的核酸序列。如本文所用，“与多聚T终止序列可操作连接”意指编码有义或反义链的核酸序列在5’方向紧邻多聚T终止信号。在miR序列从载体转录期间，多聚T终止信号的作用为终止转录。 
在本发明的治疗方法的其他实施方案中，有效量的抑制miR表达的至少一种化合物可被施用至受治疗者。如本文所用，“抑制miR表达”意指治疗后产生的活性、成熟形式的miR低于治疗之前产生的量。使用例如上文讨论的用于诊断方法的用于确定miR转录物水平的技术，本领域技术人员可容易地确定miR表达在癌细胞中是否被抑制。抑制可在基因表达水平(即通过抑制编码miR的miR基因的转录)或在加工水平发生(例如，通过抑制miR前体加工为成熟、活性的miR)发生。 
如本文所用，抑制miR表达的化合物的“有效量”是足以抑制患有 与癌症相关染色体特征相关的癌症的受治疗者中癌细胞的增殖的量。通过考虑诸如受治疗者的大小和体重；疾病穿透的程度；受治疗者的年龄、健康和性别；施用途径；和施用是区域性或系统性的因素，本领域技术人员能容易地确定待施用至特定受治疗者的miR表达-抑制化合物的有效量。 
例如，表达-抑制化合物的有效量可基于待治疗的受治疗者的大约或估计体重。如本文所述此类有效量尤其被肠胃外或肠内施用。例如，施用至受治疗者的表达-抑制化合物的有效量的范围可从约5-3000微克/kg体重、从约700-1000微克/kg体重，或者其可大于约1000微克/kg体重。 
本领域技术人员还可容易地确定用于将抑制miR表达的化合物施用至特定受治疗者的适当的剂量方案。例如，表达-抑制化合物可被施用至受治疗者一次(例如，作为单次注射或注入)。可选地，表达-抑制化合物可每日一次或两次施用至受治疗者，持续从约3天至约28天，更优选地从约7至约10天的时间。在特定剂量方案中，每天施用1次表达-抑制化合物，持续7天。其中剂量方案包含多次施用的情况中，应理解施用至受治疗者的表达-抑制化合物的有效量可包含在整个剂量方案期间施用的化合物的总量。 
适合用于抑制miR基因表达的化合物包括双链RNA(诸如短-干扰RNA或小干扰RNA或“siRNA”)、反义核酸和酶RNA分子，诸如核酶。每种这些化合物可被靶向特定的miR并破坏或诱导靶miR的破坏。 
例如，可通过用与miR的至少一部分具有至少90％，例如至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同源性的分离的双链RNA(“dsRNA”)分子诱导miR基因的RNA干扰而抑制特定miR基因的表达。在特定实施方案中，dsRNA分子是“短干扰RNA或小干扰RNA”或“siRNA”。 
用在本方法中的siRNA包含长度从约17个核苷酸至约29个核苷酸，优选地长度从约19个至约25个核苷酸的短双链RNA。siRNA包含有义RNA链和通过标准的Watson-Crick碱基配对相互作用(下文“碱基配对”)退火到一起的互补的反义RNA链。有义链包含大体上与包含 于靶miR内的核酸序列相同的核酸序列。 
如本文所用，siRNA中与包含于靶mRNA内的靶序列“大体上相同”的核酸序列是与靶序列相同的核酸序列或与靶序列有1或2个核苷酸不同的核酸序列。siRNA的有义和反义链可包含两条互补的单链RNA分子，或者可包含其中两个互补部分碱基配对并且通过单链“发夹”区域共价连接的单个分子。 
siRNA还可以是通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。此类改变可包括非核苷酸材料添加到诸如siRNA的末端或siRNA的一个或多个内部核苷酸、或使siRNA抵抗核酸酶消化的修饰、或用脱氧核糖核苷酸置换siRNA中一个或多个核苷酸。 
siRNA的一条或两条链还可包含3′突出端。如本文所用，“3′突出端”指从双链RNA链的3′-末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。因此，在某些实施方案中，siRNA包含长度从1个至约6个核苷酸(包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)、长度从1个至约5个核苷酸、长度从1个至约4个核苷酸、或长度从约2个至约4个核苷酸的至少一个3′突出端。在特定实施方案中，3′突出端存在于siRNA的两条链上，并且长度为2个核苷酸。例如，siRNA的每条链可包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3′突出端。 
siRNA可化学地或生物地产生，或者可如上文对于分离的miR所述从重组质粒或病毒载体表达。用于产生和测试dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Gewirtz的美国公布的专利申请第2002/0173478号和Reich等的美国公布的专利申请第2004/0018176号，其完整公开内容通过引用并入本文。 
特定miR基因的表达还可被反义核酸抑制。如本文所用，“反义核酸”指通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用与靶RNA结合的核酸分子，其改变靶RNA的活性。适合用在本方法中的反义核酸是单链核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合体、PNA)，其一般包含与miR中的连续核酸序列互补的核酸序列。反义核酸可包含与miR 中的连续核酸序列50-100％互补、75-100％互补或95-100％互补的核酸序列。miR的核酸序列提供于本文。不希望受任何理论所限，相信反义核酸激活RNA酶H或消化miR/反义核酸双链体的另一种细胞核酸酶。 
反义核酸还可含有对核酸骨架或对糖和碱基部分(或其等同物)的修饰以增强靶特异性、核酸酶抗性、递送或与分子功效相关的其他特性。此类修饰包括胆固醇部分、双链体嵌入剂(诸如吖啶)或一种或多种核酸酶-抗性基团。 
反义核酸可化学地或生物地产生，或者可如上文对分离的miR所述从重组质粒或病毒载体表达。用于产生和测试的示例性方法在本领域的技术范围内；参见，例如，Stein和Cheng(1993)，Science 261：1004和Woolf等的美国专利第5,849,902号，它们的完整公开内容通过引用并入本文。 
特定miR基因的表达还可被酶核酸抑制。如本文所用，“酶核酸”指包含与miR的连续核酸序列互补的底物结合区的核酸，并且其能特异地切割miR。酶核酸底物结合区可以是例如，与miR中的连续核酸序列50-100％互补、75-100％互补或95-100％互补。酶核酸还可包含碱基、糖和/或磷酸基团的修饰。用在本方法中的示例性酶核酸是核酶。 
酶核酸可化学地或生物地产生，或者可如上文对分离的miR所述从重组质粒或病毒载体表达。用于产生和测试dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner和Uhlenbeck(1995)，Nucl.Acids Res.23：2092-96；Hammann等(1999)，Antisense and nucleic acid Drug Dev.9：25-31；和Cech等的美国专利第4,987,071号，它们的完整公开内容通过引用并入本文。 
施用至少一种miR、或用于抑制miR表达的至少一种化合物将抑制患有与癌症相关染色体特征相关的癌症受治疗者中癌细胞的增殖。如本文所用，“抑制癌细胞的增殖”意指杀死细胞、或永久地或暂时地停止或减缓细胞的生长。如果在施用miR或miR基因表达-抑制化合物后受治疗者中此类细胞的数目保持不变或减少，可推断癌细胞的增殖被抑制。如果此类细胞的绝对数目增加，但肿瘤生长速率降低，可推断癌细胞的 增殖被抑制。 
受治疗者的机体中癌细胞的数目可通过直接测量、或通过估计原发性或转移性肿瘤块的大小来确定。例如，可通过免疫组织学方法、流式细胞术或设计为检测癌细胞的特征性表面标志物的其他技术来测量受治疗者中癌细胞的数目。 
miR或miR基因表达-抑制化合物可通过适合将这些化合物递送至受治疗者的癌细胞的任何方法施用至受治疗者。例如，miR或miR表达抑制化合物可通过适合用这些化合物或用包含编码这些化合物的序列的核酸转染受治疗者的细胞的方法来施用。在一个实施方案中，细胞用包含编码至少一种miR或miR基因表达抑制化合物的序列的质粒或病毒载体转染。 
真核细胞的转染方法在本领域是公知的，并且包括例如，直接将核酸注射进细胞核或原核；电穿孔；脂质体转移或亲脂材料介导的转移；受体-介导的核酸递送；基因枪或颗粒加速；磷酸钙沉淀和病毒载体介导的转染。 
例如，细胞可用脂质体转移化合物转染，所述化合物例如，DOTAP(N-[l-(2，3-二油酰基氧)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵，Boehringer-Mannheim)或等同物，诸如LIPOFECTIN。使用的核酸的量对本发明的实践不是关键的；可接受的结果可使用0.1-100微克核酸/105个细胞来实现。例如，可使用每105个细胞于3微克DOTAP中约0.5微克质粒载体的比率。 
miR或miR基因表达抑制化合物还可通过任何适合的肠内或肠胃外施用途径而施用至受治疗者。适合用于本方法的肠内施用途径包括例如，口服、直肠或鼻内递送。适合的肠胃外施用途径包括例如血管内施用(例如，静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和导管滴注进脉管系统)；组织周围和组织内注射(例如，肿瘤周围和肿瘤内注射、视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或注入，包括皮下输注(诸如通过渗透泵)；直接施用至感兴趣的组织，例如通过导管或其他放置装置(例如视网膜颗粒或栓剂或包含多孔、无孔或凝胶状材料的 植入物)；和吸入剂。特别适合的施用途径是注射、灌注和静脉内施用进患者。 
本方法中，miR或miR表达抑制化合物可作为裸RNA与递送试剂组合或作为包含表达miR或表达抑制化合物的序列的核酸(例如，重组质粒或病毒载体)施用至受治疗者。适合的递送试剂包括例如，MirusTransit TKO亲脂试剂；脂质转染剂；脂质转染胺试剂；细胞转染剂；聚阳离子(例如，聚赖氨酸)和脂质体。 
包含表达miR或miR基因表达抑制化合物的序列的重组质粒和病毒载体和用于将此类质粒和载体递送至癌细胞的技术在本文讨论。 
在特定实施方案中，脂质体用来将miR或miR基因表达-抑制化合物(或包含编码这些化合物的序列的核酸)递送至受治疗者。脂质体还可增加核酸的血液半衰期。适合用在本发明中的脂质体可从标准的形成小泡的脂类形成，其一般包括中性或带负电荷的磷脂和甾醇，诸如胆固醇。脂类的选择一般由考虑诸如需要的脂质体的大小和脂质体在血流中的半衰期的因素来指导。用于制备脂质体的各种方法是已知的，例如，如描述于Szoka等(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467；和美国专利第4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369号，其完整公开内容通过引用并入本文。 
用在本方法中的脂质体可包含将脂质体靶向癌细胞的配体分子。结合在癌细胞中普遍存在的受体的配体诸如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。 
用在本方法中的脂质体还可被修饰以便避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。如此修饰的脂质体具有在表面或掺入脂质体结构的调理-抑制部分。在特别优选的实施方案中，本发明的脂质体可包含调理-抑制部分和配体两者。 
用于制备本发明的脂质体的调理-抑制部分一般是结合到脂质体膜上的大的亲水性聚合体。如本文所用，当调理抑制部分例如通过将可溶于脂的锚嵌入膜本身，或通过直接结合到膜脂的活性基团被化学地或物理 地附着于膜上时，其被“结合”到脂质体膜上。这些调理-抑制亲水性聚合体形成显著降低MMS和RES摄取脂质体的保护性表面层；例如描述于美国专利第4,920,016号，其完整公开内容通过引用并入本文。 
适合用于修饰脂质体的调理抑制部分优选地是具有从约500至约40,000道尔顿和更优选地从约2,000至约20,000道尔顿的平均数分子量的水溶性聚合体。此类聚合体包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成的聚合体，诸如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线性、分支或树枝状聚酰胺胺；聚丙烯酸；多元醇，例如，羧基或氨基基团与其化学连接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，诸如神经节苷脂GM1。PEG的共聚物，甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物也是适合的。另外，调理抑制聚合体可以是PEG和聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理抑制聚合体还可以是含有氨基酸或羧酸例如半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、卡拉胶的天然多糖；氨化多糖或寡糖(线性或分支)；或例如与具有连接羧基基团的产物的碳酸衍生物反应的羧化多糖或寡糖。优选地，调理-抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG酰化脂质体”。 
调理抑制部分可通过多种公知技术的任一种结合到脂质体膜上。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯可结合磷脂酰-乙醇胺脂溶性锚，然后结合到膜上。相似地，葡聚糖聚合体可通过使用Na(CN)BH3和溶剂混合物诸如四氢呋喃和水以30∶12的比例在60℃下的还原胺化用硬脂酰胺脂溶性锚衍生化。 
用调理-抑制部分修饰的脂质体比未修饰的脂质体保持在循环中的时间更长。为此，此类脂质体有时称为“隐身”脂质体。已知隐身脂质体在充满多孔或“有漏隙的”微血管的组织中积累。因此，特征为此类微血管缺陷的组织(例如实体瘤)将有效地积累这些脂质体；参见Gabizon，等(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，18：6949-53。另外，RES摄取的减少通过阻止脂质体在肝和脾的显著积累而降低了隐身脂质体的毒性。因 此，用调理-抑制部分修饰的脂质体特别适合来将miR或miR基因表达抑制化合物(或包含编码这些化合物的序列的核酸)递送至肿瘤细胞。 
miR或miR基因表达抑制化合物在将其施用至受治疗者之前根据本领域已知的技术可配制为药物组合物，有时称为“药剂”。相应地，本发明包含用于治疗癌症的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的miR和药学上可接受的载体。在特定实施方案中，该至少一种miR对应于相对于适合的对照细胞在癌细胞中具有降低水平表达的miR。 
在其他实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种miR表达抑制化合物。在特定实施方案中，该至少一种miR基因表达抑制化合物特异于其表达在癌细胞中高于对照细胞的miR基因。 
本发明的药物组合物的特征为至少无菌的和不含致热原。如本文所用，“药物制剂”包括用于人类和兽医应用的制剂。用于制备本发明的药物组合物的方法在本领域的技术范围内，例如描述于Remington′sPharmaceutical Science(雷明顿药物科学)，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.(1985)，其完整公开内容通过引用并入本文。 
本药物制剂包含与药学上可接受的载体混合的至少一种miR或miR基因表达抑制化合物(或包含编码这些化合物的序列的至少一种核酸)(例如，按重量计0.1％至90％)，或其生理学上可接受的盐。本发明的药物制剂还可包含至少一种miR或miR基因表达抑制化合物(或包含编码这些化合物的序列的至少一种核酸)，其被脂质体和药学上可接受的载体包囊。 
特别适合的药学上可接受的载体是水、缓冲水、正常盐水、0.4％的盐水、0.3％的甘氨酸、透明质酸和类似载体。 
在特定实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种miR或miR基因表达抑制化合物(或包含编码这些化合物的序列的至少一种核酸)，其抵抗核酸酶的降解。本领域技术人员可容易地合成抗核酸酶的核酸，例如通过将在2’-位置被修饰的一种或多种核糖核苷酸掺入miR。 适合的2’-修饰的核糖核苷酸包括在2’-位置用氟代、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修饰的核糖核苷酸。 
本发明的药物组合物还可包含传统的药物赋形剂和/或添加剂。适合的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲剂和pH调节剂。适合的添加剂包括例如，生理学上生物相容的缓冲液(例如，氨丁三醇盐酸盐)、螯合剂(诸如，例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合复合体(诸如，例如，钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)的加入或任选地钙盐或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)的加入。本发明的药物组合物可被包装用于以液体形式使用，或者可以是冻干的。 
对本发明的固体药物组合物，可使用传统的无毒固体药学上可接受的载体；例如，药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁和类似载体。 
例如，用于口服施用的固体药物组合物可包含上文所列的载体和赋形剂的任一种和10％-95％优选25％-75％的至少一种miR或miR基因表达抑制化合物(或包含编码这些化合物的序列的至少一种核酸)。用于气溶胶(吸入)施用的药物组合物可包含按重量计0.01％-20％优选按重量计1％-10％的如上文所述包囊于脂质体的至少一种miR或miR基因表达抑制化合物(或包含编码这些化合物的序列的至少一种核酸)和推进剂。如果需要还可包括载体例如卵磷脂用于鼻内递送。 
本发明还包含鉴定抗癌剂的方法，其包括向细胞提供测试剂和测量细胞中至少一种miR的水平。在一个实施方案中，该方法包括向细胞提供测试剂和测量与癌细胞中降低的表达水平相关的至少一种miR的水平。相对于适合的对照细胞，细胞中miR水平的增加指示测试剂为抗癌剂。 
在其他实施方案中，该方法包括向细胞提供测试剂和测量与癌细胞中增加的表达水平相关的至少一种miR的水平。相对于适合的对照细胞，细胞中miR水平的降低指示测试剂为抗癌剂。 
适合的药剂包括但不限于药物(例如，小分子、肽)和生物大分子(例如，蛋白质、核酸)。该药剂可重组地、合成地产生，或者其可从天然来源分离(即纯化)。用于向细胞提供此类药剂的各种方法(例如转染)在本领域是公知的，几种此类方法描述于上文。用于检测至少一种miR的表达的方法(例如Northern印迹、原位杂交、RT-PCR、表达谱)也是本领域公知的。 
现将通过以下非限制性实施例阐述本发明。以下实施例意图示例本发明的优选实施方案，不应解释为限制如权利要求中定义的本发明的范围，除非如此特指。 
实施例
本文介绍了在一大组正常和肿瘤卵巢组织中基因组范围miRNA表达谱的结果。目前本文证明了卵巢癌特异miRNA特征的存在。还鉴定了微小RNA基因改变的甲基化作为负责其异常表达的可能的外遗传机制。 
材料和方法 
卵巢癌样品和细胞系
总共84种速冻的正常和恶性卵巢组织收集于哥伦布的哥伦布儿童医院(OH，USA)GOG组织库。用于微阵列分析的组织采集包括15种正常的卵巢组织切片和69种恶性组织，所有卵巢上皮癌，包括31种浆液性(其中29种显示肤纹型式)、8种子宫内膜样、4种透明细胞、9种低分化和1种粘液性癌。卵巢癌细胞系IGROV1最初由Bernard博士(Institute Gustave Roussy，Villejuf，France)从未治疗患者中等分化的卵巢癌衍生，OAW-42来自Ulrich U.博士(Department of Obstetrics andGynecology，University of UIm，Germany)的，而OVCAR3、OVCAR8和SK-OV3购自美国典型培养物保藏中心。所有细胞系保持于RPMI培养基中(Life Technologies，Rockville，MD)，其补充有10％(v/v)胎牛血清(FCS)、3mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素/链霉素。 
miRNA微阵列杂交和定量
总RNA分离根据制造商的说明书用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行。在微小RNA微阵列芯片上的RNA标记和杂交如前文所述每个样品使用5μg总RNA来进行(28)。杂交在我们的微小RNA微阵列(OhioState Comprehensive Cancer Center，version 2.0)上进行，所述微阵列包含以四重复点的具有注解的活性位点的460种成熟微小RNA的探针(235种智人、222种小家鼠和3种拟南芥)。通常特定的成熟微小RNA存在不止一种探针组。另外，存在对应于大多数前体微小RNA的四重复探针。杂交信号用链霉抗生物素蛋白-Alexa647轭合物检测，使用Genepix6.0软件(Axon Instruments，Sunnyvale，CA)定量扫描的图像(Axon4000B)。 
微小RNA微阵列数据的计算分析
微阵列图像通过使用GENEPIX PRO来分析。每个miRNA的重复点的平均值被差减背景、归一化和进行进一步的分析。通过使用由Richard Simon & Amy Peng Lam开发的BRB阵列工具，我们对卵巢微阵列数据进行全部中值归一化(29)。在随后的统计分析之前，缺少的点被阈值至4.5。该水平是实验中检测的平均最小强度水平。miRNA命名是根据基因组浏览器(genome.ucsc.edu)和Sanger中心的miRNA数据库(microrna.sanger.ac.uk/)；在矛盾的情况下，遵循miRNA数据库。差异表达的miRNA通过使用t检验步骤在微阵列的显著性分析(SAM)内来鉴定，该分析是基于最近Tusher，Tibshirani和Chu的文章在斯坦福大学实验室开发的方法(30)。 
为鉴定miRNA特征，我们还应用PAM，其通过Tibshirani，Hastie，Narasimhan和Chu的“最近邻缩小质心法”对基因表达数据进行样品分类(31)。 
Northern印迹
Northern印迹分析如前文所述进行。RNA样品(每种10μg)运行在15％聚丙烯酰胺、7M尿素标准预凝的凝胶上(Bio-Rad，Hercules，CA)，并转移到Hybond-N+膜上(Amersham，Piscataway，NJ)。杂交在37℃下于ULTRAhyb-Oligo杂交缓冲液(Ambion，Austin，TX)中进行16小时。在37 ℃下用2X SSPE和0.5％SDS洗涤膜两次。 
用作探针的寡核苷酸与成熟微小RNA的序列反义(miR注册于sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/，其通过引用完全并入本文)： 
miR-200a：5′-ACA TCG TTA CCA GAC AGT GTT A-3′[SEQ IDNO：92]； 
miR-141：5′-CCA TCT TTA CCA GAC AGT GTT A-3′[SEQ IDNO：93]； 
miR-199a：5′-GAA CAG GTA GTC TGA ACA CTG GG-3′[SEQ IDNO：94]； 
miR-125bl：5′TCA CAA GTT AGG GTC TCA GGG A-3′[SEQ IDNO：95]； 
miR-145：5′-AAG GGA TTC CTG GGA AAA CTG GAC-3′[SEQ IDNO：96]； 
miR-222：5′-GAG ACC CAG TAG CCA GAT GTA GCT-3′[SEQ IDNO：97]； 
miR-21：5′-TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A-3′[SEQ ID NO：98]。 
5S RNA或EtBr凝胶染色用来归一化。使用多核苷酸激酶(Roche)将200ng每种探针用100μCi[γ-32P]-ATP末端标记。在重新杂交之前，印迹在煮沸的0.1％SDS中10分钟被脱去。 
实时PCR
根据制造商的说明书，单管TaqMan微小RNA测定用来在AppliedBiosystems实时PCR仪器(Applied Biosystems，Foster City，CA)上检测和定量成熟微小RNA。用18S rRNA进行归一化。所有RT反应，包括无模板的对照和RT减去对照，在GeneAmp PCR 9700热循环仪(AppliedBiosystems)中运行。基因表达水平使用ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)来定量。比较实时PCR以三重复进行，包括无模板的对照。相对表达使用比较Ct方法来计算。 
脱甲基化实验
在用10μM 5’-氮杂-2’-脱氧胞苷(5’-AZA，Sigma)处理之前48h以低密度接种OVCAR3细胞。处理24h后，收集细胞并使用Trizol试剂(Invitrogen)分离总RNA。未处理细胞和AZA-处理细胞的3重复用来通过微阵列谱评估miR的表达。差异表达的微小RNA通过使用具有随机变量模型的单变量双侧T检验来鉴定。 
结果
微小RNA表达特征区分卵巢癌组织和正常卵巢
已通过各种研究验证的常规微阵列平台(19)用来在来自不同患者的异质组卵巢组织上评估微小RNA表达谱。这组包括15种正常的卵巢样品、69种卵巢恶性肿瘤和5种卵巢癌细胞系，总共89种生物上独立的样品。每种肿瘤样品衍生自单个标本(数据未显示)。 
基于点在芯片上的所有人类微小RNA，未受监督的系统聚类产生由正常组织和恶性组织代表的两个主要组中样品的明显差异树(图1)。 
为了鉴定区分正常对比癌症组织的微小RNA，我们使用SAM和PAM工具，从两类类别预测分析获得的结果基本上是重叠的。正常和癌症组织之间的SAM比较鉴定了39种miRNA(q-值＜1％，倍数改变＞3)差异表达，10种在肿瘤中上调，剩余的下调(列表报道于图9-表2)。 
根据图8-表1中报道的miR特征，图6A和6B中的PAM分析显示了为癌症或正常组织的每种样品概率(0.0至1.0)的图示，其描述了更小组的29种miR，4种上调(miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-141)，25种下调(其中miR-199a、miR-140、miR-145和miR-125b1最显著)，区分正常对比肿瘤分类率为89％。 
为了确认通过微阵列分析获得的结果，我们在一些差异表达的微小RNA上进行Northern印迹(图2A)或实时PCR(图2B)。我们分析miR-200a和miR-141的表达，在卵巢癌中最显著上调，最显著下调的微小RNA：miR-199a、miR-140、miR-145和miR-125b1。所有实验证实了通过微阵列分析获得的结果。 
生物病理特征和微小RNA表达
考虑到卵巢上皮癌作为由不同形态和分子遗传改变表征的不同组织亚型出现，我们决定比较它们的每种与正常组织的微小RNA谱以评估微小RNA表达谱在卵巢癌的不同组织型中是否不同。产生自SAM分析的完整列表报道于图10-表3中，而概述以维恩图显示于图3A和3B： 
在肿瘤对比正常组织中最显著上调的4种微小RNA中的2种(2)(图3A)，miR-200a和miR-200c在考虑的所有3种组织型中上调(浆液性、子宫内膜样和透明细胞)，而miR-200b和miR-141的上调由子宫内膜样和浆液性组织型共有。 
此外，子宫内膜样组织型显示3种其他微小RNA的上调：miR-21、miR-203和miR-205。包括miR-125b1、miR-199a和miR-140的19种miR与正常组织相比在检验的所有3种组织型中被下调(图3B)，而4种在不同特征的每次成对分析中共有：例如miR-145在浆液性和透明细胞癌中被下调；miR-222在子宫内膜样和透明细胞癌中被下调。 
考虑到肿瘤分类为“混合的”和“低分化的”，我们发现第1组揭示了具有不同组织型特性的特征，共有例如miR-200c和miR-181在子宫内膜样癌中过量表达，miR-214在浆液性中下调，而“低分化的”肿瘤具有非常不同的微小RNA表达模式(图10-表3)。 
然后我们比较成对报道于图11-表4中的不同组肿瘤的miRNA表达，特别地我们比较2种最多的组织型：浆液性和子宫内膜样。当考虑在与浆液性相比子宫内膜样癌中差异表达的微小RNA时，我们发现miR-212上调，miR-302b＊和miR-222(图4A中微阵列数据的T-检验分析，p＜0.05)，为最显著下调的微小RNA。 
图4B中在小组样品上的Northern印迹证实了与子宫内膜样相比浆液性肿瘤中miR-222的过量表达。然后我们将注意力集中在与肿瘤标本相关的其他临床病理特征上：尽管没有发现与患者年龄相关的显著差异表达的miR，其他肿瘤特性看起来影响miR表达，诸如淋巴管浸润、卵巢表面、输卵管、子宫和盆腔腹膜受累(图12-表5)。 
为了研究是否存在与疾病的不同级或阶段相关的miR，考虑所有肿 瘤或仅考虑最多的浆液性组织型，我们进行比较分析，但是我们没有获得任何显著差异表达的微小RNA。 
各种特征的miRNA成员的证实和潜在的靶
使用于″diana.pcbi.upenn.edu/tarbase″的DianaTarbase，我们寻找产生自我们的分析的一些最显著miRNA的证实的靶，发现一些有趣的数据：例如，ERBB2和ERBB3受体被miR-125靶向(32)；已证明卵巢癌中下调的miR-101靶向癌基因MYCN(33)。然后我们使用″diana.pcbi.upenn.edu/miRGen″数据库分析其潜在的靶并评估卵巢癌中一些这些分子的表达水平。例如，所有4种最显著上调的微小RNA：miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-141具有常见的推测靶：在卵巢癌中下调的抑癌基因BAP1、BRCA1-相关蛋白。获得的信息概述于图13-表6。 
miR表达的外遗传调节
为了评估异常的DNA甲基化模式是否也能促进表征人类卵巢癌的改变的微小RNA表达，我们分析用脱甲基化剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷处理之前和之后卵巢细胞系OVCAR3的miR谱。微阵列数据的分析显示11种差异表达的人类微小RNA，9种上调，2种下调(每个单变量检验的显著性阈值：p＜0.001)，其中miR-21、miR-203、miR-146b、miR-205、miR-30-5p和miR-30c在处理时最显著被诱导(差异表达的miR列于图5A中，而得到的系统聚类树报道于图5B中)。 
验证5种最显著诱导的miR的上调的实时PCR描述于图5C和5D中，作为miR表达水平的图示(图5C)，还通过Northern印迹验证了miR-21(图5D)。 
有趣地，与正常组织相比miR-21、miR-203和miR-205在卵巢癌中过量表达(参见图9-表2的SAM分析和图3A和3B的维恩图)：脱甲基化处理后这些miR基因的重新激活暗示低甲基化可能是负责其体内过量表达的机制。我们证实了在处理时最显著诱导的miR miR-21的过量表达，对一组人类卵巢癌和两种正常组织进行了Northern印迹(图7A)。 此外，使用CpG岛搜索程序(34)，我们验证了miR-21和miR-203与CpG岛相关，其中miR-203嵌入CpG岛875bp长，miR-21的特征为成熟序列上游2kb的CpG岛(图7B)，而miR-205在跨越其成熟形式上游2Kb的区域内未显示任何CpG岛。 
讨论
在本文的实施例中，目前显示微小RNA在人类卵巢癌中异常表达。总体微小RNA的表达可清楚地分开正常与癌症组织，鉴定了在人类卵巢癌中改变的并且可能参与该瘤的发展的多种微小RNA。 
我们发现的最显著上调的所有4种微小RNA的表达：miR-200a和miR-141属于相同家族；miR-200b(位于miR-200a的相同区域，在chr.1p36.33)；和miR-200c(位于miR-141的相同区域，在chr.12p13.31)，与Zhang等(24)在基因组水平获得的结果一致，暗示驱动其上调的机制可能是微小RNA基因的扩增。 
有趣地，所有这些miR具有常见的推测靶：抑癌基因BAP1、BRCA1-相关蛋白(24)。发现并建议GATA因子改变的表达作为卵巢癌发生中脱分化的潜在机制(35)，可能还由微小RNA的失调驱动。特别地，从85％的卵巢癌的核中缺失或排除的GATA6可能受miR-200a的调节，并且在大多数卵巢癌细胞系中缺少的GAT A4可能被miR-200b靶向(图12-表5)。 
在下调的基因中，明显地我们发现也在乳腺癌中改变的miR-125b1，以及miR-145(18)；近来显示在诸如肝癌的其他肿瘤中下调的mir-199a(36)；在卵巢癌中缺失的miR-140(24)。 
有趣地，miR-140实际上位于通常在卵巢癌中缺失的脆性区域chr.6q22，据预测靶向如c-SRK、MMP13和FGF2的重要分子。 
即使这些实施例中可用的正常对照由整个正常卵巢代表，我们的数据可鉴定在人类卵巢癌中改变并且可能参与该恶性肿瘤生物学的多种微小RNA。事实上，比较卵巢癌不同组织型(浆液性、子宫内膜样、透明细胞和混合的)与正常组织获得的miRNA特征在大多数情况中是重叠 的，但是它们还揭示了似乎为“组织型-特异”的多种微小RNA：例如子宫内膜样肿瘤与其他共有4种最显著上调的miR(miR-200a、miR200b、miR-200c和miR-141)，还出现已知在多种实体瘤中错调的miR-21的过量表达(18，37，38)，并且在不同细胞系统中执行抗凋亡作用(39，40)，miR-205和miR-182。 
与其他类肿瘤相比，子宫内膜样肿瘤还出现几种微小RNA的下调，例如已证明靶向c-Kit(41)的miR-222参与癌症(42-44)，并且在叶酸缺陷疾患中下调(45)。 
这些差异支持不同组织型代表生物上和病理遗传上不同的EOC实体的事实，即使其目前用相同的治疗性策略治疗。近来微阵列分析证实不同组织型(浆液性、粘液性、子宫内膜样和透明细胞)显示不同途径的改变可能反映器官起源(分别为输卵管、肠粘膜和子宫内膜)的基因表达模式(46)。 
明显地，取决于组织型，预测许多差异表达的微小RNA靶向参与差异激活的途径的分子。例如，在浆液性癌中下调的miR-212的推测靶为WT1，其在该卵巢癌亚组中过量表达(47)。miR-212的另一个推测靶是BRCA1：在遗传性卵巢癌中突变，近来发现该分子还参与阵发性卵巢上皮癌(OEC)的病理病因，其中更普遍地观察到由于外遗传改变导致的基因功能的丧失(48)。降低的BRCA1表达可通过一种或多种微小RNA的过量表达来确定。 
与子宫内膜样相比，在浆液性组织型中上调的miR-299-5p和miR-135b推测分别靶向DLK1(δ-样1)和MSX2(msh同源框2)，在子宫内膜样癌中过量表达(47)。与其他肿瘤相比，透明细胞癌显示分别与两个推测靶RBP4(视黄醇结合蛋白4)和SLC40A1(溶质载体40-铁-调节转运体，成员1)相反的miR-30-5p和miR-20a的表达水平(46)。与正常组织相比，透明细胞癌还显示miR-18a、miR-19a和miR-19b的降低表达，暗示聚类17-92(已由Zhang等证实缺失)的可能下调。参与由E2F1和c-Myc介导的复杂调节的该聚类似乎具有推测的癌基因或肿瘤抑制物的双重本质，所述具有推测的癌基因如近来在B-细胞淋巴瘤中所示(15)，所述 具有肿瘤抑制物：例如在肝癌中，已报道在该基因座编码miR-17-92聚类(13q31)的LOH(49)。在卵巢癌中，至少在透明细胞组织型中，其还可执行抑癌基因的作用。本文所示的数据目前实际上暗示微小RNA可能在导致EOC特定亚型发育的分化过程中具有调节作用。 
有趣地，低分化的癌具有非常不同的微小RNA表达模式，显示与正常卵巢相比几种微小RNA的上调。更有趣地，其中之一miR-373近来已描述为睾丸生殖细胞肿瘤中推测的癌基因(16)。 
缺少与肿瘤阶段或级别相关的显著差异表达的微小RNA可由以下事实解释：我们的样品组大多数由晚期阶段的肿瘤代表，如预期考虑这种瘤的晚期诊断；然而，不同组样品之间大小的差异可能代表统计分析的限制。可选地，微小RNA对人类卵巢癌的发育可能是重要的，但是对疾病的进行不重要。 
产生自我们的分析的过量表达的但在Zhang的研究中未报道为扩增的多种miR，以及下调但不缺失的miR，外遗传调节机制的参与可能实际上在人类EOC中的微小RNA表达中发挥作用。 
实际上，在卵巢细胞系的脱甲基化处理之后最显著诱导的微小RNA中，我们发现miR-21、miR-203和miR-205在卵巢癌中上调。此外，miR-203和miR-21与CpG岛相关(miR-203嵌入CpG岛，而miR-21其成熟序列上游2kb具有CpG岛)，支持了脱甲基化导致这些微小RNA基因的重新激活的想法。明显地，已描述miR-21在几种人类肿瘤中上调，并且在不同细胞模型中具有抗凋亡的作用。这些数据目前显示DNA低甲基化可能是负责潜在致癌的miR的体内过量表达的外遗传机制。 
据本发明人所知，这是描述人类EOC中完整miR表达谱的第一个报道，集中在鉴定在癌对比正常卵巢和在肿瘤不同亚组中差异表达的miR。目前的数据显示微小RNA可在病原发生和卵巢癌不同组织型的发育中发挥重要作用，并且鉴定改变的DNA甲基化作为负责不受基因组改变影响的微小RNA异常表达的可能的外遗传机制。 
根据专利法的规定，本发明的操作原理和模式已在其优选实施方案被解释和示例。然而，必须理解本发明可以不同于具体解释和示例、不偏离其精神和范围的其他方式实践。 
miR基因数据库 
感兴趣的miRNA列于公共数据库。在某些优选实施方案中，公共数据库可以是由Sanger研究所http://microRNA.sanger.ac.uk/sequences/提供的中央存储库，miRNA序列提交到该数据库用于命名和命名分配，以及将序列安置于数据库中用于存档和用于通过世界范围的网络联机检索。一般而言，Sanger研究所收集的关于miRNA序列的数据包括物种、来源、对应的基因组序列和基因组的位置(染色体坐标)，以及全长转录产物和成熟的完全加工的miRNA的序列(具有5′末端磷酸基团的miRNA)。另一个数据库可以是通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站进入、由美国国立卫生研究院和美国国立医学图书馆维护的GenBank数据库。这些数据库通过引用完全并入本文。 
  登录号   ID   序列   SEQ  ID NO
  MIMAT0000682   hsa-miR-200a   UAACACUGUCUGGUAACGAUGU   1
  MIMAT0000318   hsa-miR-200b   UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA   2
  MIMAT0000617   hsa-miR-200c   UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA   3
  MIMAT0000432   hsa-miR-141   UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG   4
  MIMAT0000714   hsa-miR-302b*   ACUUUAACAUGGAAGUGCUUUC   5
  MIMAT0000259   hsa-mir-182   UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU   6
  MIMAT0000771   hsa-miR-325   CCUAGUAGGUGUCCAGUAAGUGU   7
  MIMAT0000726   hsa-miR-373   GAAGUGCUUCGAUUUUGGGGUGU   8
  MIMAT0000264   hsa-miR-203   GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG   9
  MIMAT0000266   hsa-miR-205   UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG   10
  MIMAT0000231   hsa-miR-199a   CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC   11
  MIMAT0000263   hsa-miR-199b   CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC   12
  MIMAT0000435   hsa-miR-143   UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC   13
  MIMAT0004604   hsa-miR-127   CUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAU   14
  MIMAT0000431   hsa-miR-140   CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG   15
  MIMAT0000441   hsa-miR-9   UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA   16
  MIMAT0000427   hsa-miR-133a   UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG   17
  MIMAT0000102   hsa-miR-105   UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU   18
  MIMAT0000099   hsa-miR-101   UACAGUACUGUGAUAACUGAA   19
  MIMAT0000281   hsa-miR-224   CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU   20
  MIMAT0000445   hsa-miR-126   UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG   21
  MIMAT0000098   hsa-miR-100   AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG   22
  MIMAT0000251   hsa-miR-147   GUGUGUGGAAAUGCUUCUGC   23
  MIMAT0000265   hsa-miR-204   UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU   24
 
  MIMAT0000271   hsa-miR-214   ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU   25
  MIMAT0000097   hsa-miR-99a   AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG   26
  MIMAT0000268   hsa-miR-211   UUCCCUUUGUCAUCCUUCGCCU   27
  MIMAT0000437   hsa-miR-145   GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU   28
  MIMAT0000065   hsa-let-7d   AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU   29
  MIMAT0000422   hsa-miR-124   UAAGGCACGCGGUGAAUGCC   30
  MIMAT0000443   hsa-miR-125a   UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA   31
  MIMAT0000064   hsa-let-7c   UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU   32
  MIMAT0000062   hsa-let-7a   UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU   33
  MIMAT0000681   hsa-miR-29c   UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA   34
  MIMAT0000461   hsa-miR-195   UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC   35
  MIMAT0000423   hsa-miR-125b   UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA   36
  MIMAT0000727   hsa-miR-374   UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG   37
  MIMAT0000715   hsa-miR-302b   UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG   38
  MIMAT0000086   hsa-miR-29a   UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA   39
       
  MIMAT0000076   hsa-miR-21   UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA   40
  MIMAT0000259   hsa-miR-182   UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU   41
  MIMAT0000270   hsa-miR-181a*   ACCAUCGACCGUUGAUUGUACC   42
  MIMAT0000273   hsa-miR-216   UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA   43
  MIMAT0000717   hsa-miR-302c   UAAGUGCUUCCAUGUUUCAGUGG   44
  MIMAT0000688   hsa-miR-301a   CAGUGCAAUAGUAUUGUCAAAGC   45
  MIMAT0000096   hsa-miR-98   UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU   46
  MIMAT0000074   hsa-miR-19b   UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA   47
  MIMAT0000100   hsa-miR-29b   UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU   48
  MIMAT0000072   hsa-miR-18a   UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG   49
  MIMAT0000452   hsa-miR-154   UAGGUUAUCCGUGUUGCCUUCG   50
  MIMAT0000073   hsa-miR-19a   UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA   51
  MIMAT0000439   hsa-miR-153   UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUC   52
  MIMAT0000436   hsa-miR-144   UACAGUAUAGAUGAUGUACU   53
  MIMAT0000279   hsa-miR-222   AGCUACAUCUGGCUACUGGGU   54
  MIMAT0000416   hsa-miR-1   UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU   55
  MIMAT0000684   hsa-miR-302a   UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA   56
  MIMAT0000686   hsa-miR-34c-5p   AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC   57
  MIMAT0000272   hsa-miR-215   AUGACCUAUGAAUUGACAGAC   58
  MIMAT0000085   hsa-miR-28-5p   AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG   59
  MIMAT0000770   hsa-miR-133b   UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA   60
  MIMAT0002890   hsa-miR-299-5p   UGGUUUACCGUCCCACAUACAU   61
  MIMAT0000252   hsa-miR-7   UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU   62
  MIMAT0000250   hsa-miR-139-5p   UCUACAGUGCACGUGUCUCCAG   63
  MIMAT0000722   hsa-miR-370   GCCUGCUGGGGUGGAACCUGGU   64
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  MIMAT0002809   hsa-miR-146b-5p   UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU   67
  MIMAT0000087   hsa-miR-30   UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG   68
  MIMAT0000095   hsa-miR-96   UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU   69
 
  MIMAT0000646   hsa-miR-155   UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU   70
  MIMAT0000738   hsa-miR-383   AGAUCAGAAGGUGAUUGUGGCU   71
  MIMAT0000244   hsa-miR-30c   UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC   72
  MIMAT0002819   hsa-miR-193b   AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU   73
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  MIMAT0000447   hsa-miR-134   UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG   75
       
  MIMAT0004696   hsa-miR-323-5p   AGGUGGUCCGUGGCGCGUUCGC   76
  MIMAT0004695   hsa-miR-337-5p   GAACGGCUUCAUACAGGAGUU   77
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  MIMAT0001080   hsa-miR-196b   UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGGG   80
  MIMAT0000460   hsa-miR-194   UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA   81
  MIMAT0000761   hsa-miR-324-5p   CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU   82
  MIMAT0000758   hsa-miR-135b   UAUGGCUUUUCAUUCCUAUGUGA   83
  MIMAT0000269   hsa-miR-212   UAACAGUCUCCAGUCACGGCC   84
       
  MIMAT0000451   hsa-miR-150   UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG   85
  MIMAT0000759   hsa-miR-148b   UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU   86
  MIMAT0000692   hsa-miR-30e   UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG   87
  MIMAT0000075   hsa-miR-20a   UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG   88
       
  MIMAT0000256   hsa-miR-181a   AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU   89
  MIMAT0000449   hsa-miR-146a   UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU   90
  MIMAT0004614   hsa-miR-193a-5p   UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA   91
       
参考文献 
上文讨论的参考文献和以下参考文献在提供示例性程序上的细节或补充本文提到的参考文献的其他细节方面，特别通过引用并入本文。 
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Claims (8)

1.miR-特异的探针寡核苷酸在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂通过下列来诊断受治疗者是否患有卵巢癌或处于发展卵巢癌的危险：
测量来自所述受治疗者的测试样品中miR的水平，其中所述miR包括包含下列的miR谱：miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-199a、miR-140、miR-145和miR-125b1，和
其中相对于对照样品中对应miR的水平，所述测试样品中所述miR的水平的改变指示受治疗者患有卵巢癌，或处于发展卵巢癌的危险。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述卵巢癌是透明细胞、浆液性或子宫内膜样卵巢癌的一种或多种。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述测试样品包含卵巢癌细胞，其中根据以下组织型区分卵巢癌细胞：浆液性、非浆液性、子宫内膜样、非子宫内膜样、透明细胞、非透明细胞、低分化和非低分化。
4.如权利要求1所述的用途，所述诊断还包括：
测量来自所述受治疗者的测试样品中选自miR-205、miR-21和miR-182的至少一种miRNA的水平，
其中与正常样品相比，所述miRNA的一种或多种的表达差异指示与透明细胞卵巢癌或浆液性卵巢癌相区别的子宫内膜样卵巢癌。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述miR谱还包括图3A或图3B中所示的miR的一种或多种，其中所述miR谱指示与透明细胞卵巢癌或子宫内膜样卵巢癌相区别的浆液性卵巢癌。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述miR谱还包括图3A或图3B中所示的miR的一种或多种，其中所述miR谱指示与透明细胞卵巢癌或浆液性卵巢癌相区别的子宫内膜样卵巢癌。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述miR谱还包括图3A或图3B中所示的miR的一种或多种，其中所述miR谱指示与子宫内膜样卵巢癌或浆液性卵巢癌相区别的透明细胞卵巢癌。
8.如权利要求1所述的用途，其中miR-特异的探针寡核苷酸用于制备微阵列，并且所述微阵列通过下列来诊断受治疗者是否患有卵巢癌或处于发展卵巢癌的危险：
(1)反转录获自所述受治疗者的测试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；
(2)将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱；和，
(3)比较所述测试样品的杂交谱与产生自对照样品的杂交谱，
其中所述miR的信号的改变指示所述受治疗者患有卵巢癌或者处于发展卵巢癌的危险。
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