CN110564854B - 基于miRNA检测的试剂盒及其在癌症早期筛查中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及miRNA检测技术领域，具体提供一种基于miRNA检测的试剂盒及其在癌症早期筛查中的应用。该基于miRNA检测的试剂盒包含MIR202、MIR508、MIR509‑3、MIR205、MIR182、MIR513C、MIR183及MIR513B这八种miRNA的引物。本发明的试剂盒对卵巢癌的早期诊断具有灵敏度高、特异性良好、准确性高等特点，并且能够降低筛查成本。

Description

基于miRNA检测的试剂盒及其在癌症早期筛查中的应用
技术领域
本发明属于miRNA检测技术领域，具体涉及一种基于miRNA检测的试剂盒及其在癌症早期筛查中的应用。
背景技术
筛查是指在一些尚无相关疾病症状的健康群体中进行一些简单的测试，来筛选出有疾病的个体的过程。目前大部分癌症都是在中晚期阶段才被检测出来，错过了癌症的最佳治疗期，极大影响了癌症治疗效果。世界卫生组织提出，三分之一的癌症可以通过早期发现得到根治。通过规范化筛查早期发现并进行手术治疗，可以有效减轻癌症患者的痛苦和经济负担。
目前筛查癌症的方法主要是通过化验血肿瘤指标及B超、CT、MRI、PET-CT等检查，但这些方法的敏感性和特异性均不高，发现有异常时往往已是中晚期。
卵巢癌(Ovarian cancer，简称OC)是美国和世界各地妇女中最致命的妇科恶性肿瘤。约75％的患者被诊断时已经处于晚期，肿瘤已扩散到腹部，因此5年生存率仅为10-30％。处于一期卵巢癌患者存活率能达到90％，但由于缺乏有效的筛查策略和早期检测标记物，通过早期诊断筛查出这些患者具有一定困难。由于早期和晚期卵巢癌患者的长期存活率具有明显差异，一种有效的早期诊断方法显得尤为重要，且该方法必须是易于操作，低成本，安全，高灵敏度高特异性具有高阳性预测值。
目前针对卵巢癌的常规诊断方法主要有盆腔检查、经阴道超声检查、血清CA125检查。其中，盆腔检查是指对女性生殖系统的检查，包括外阴、阴道、子宫、卵巢、输卵管、膀胱、直肠等部位。主要包括：对外生殖器进行观察或借助窥阴器对阴道壁和子宫颈进行观察，触诊，采取子宫颈细胞样品进行巴氏试验等，检查过程往往只需几分钟。通过这些检查来判断女性盆腔器官是否有异常，从而达到卵巢癌诊断的目的。但是常规盆腔检查对人群灵敏度较差，不是非常有效的筛查工具。
经阴道超声检查指向阴道放入传感器，传感器不断发出声波并记录反射回的声波信息，最后在仪器上成像，通过成像信息评估阴道是否出现异常状况。经阴道超声检查在评估卵巢状况比其他成像方法更具优势，其能更清晰地观察卵巢的形态学特征，且在一定程度上能判断卵巢癌的恶化程度。经阴道超声检查同样存在对人群灵敏度差的问题。
CA125是一种糖磷脂酰肌醇连结蛋白，是在卵巢癌检查中使用最广的肿瘤标记物。CA125由体腔上皮细胞表达并且存在于间皮细胞组织中，包括胸膜，心包膜和腹膜。CA125也来源于米勒管上皮组织中，如输卵管、子宫内膜以及宫颈上皮。正常卵巢表面上皮细胞不表达CA125。普遍接受的正常血清CA125上限是35U/mL。临床上通过检测血液中CA125表达水平是否异常可以对卵巢癌进行筛查，CA125是目前卵巢癌检测的金标准。但是CA125检查对早期癌症的灵敏度差，而且特异性有限。
在每年接受常规盆腔检查的无症状女性中，并没有相关数据显示其检查出卵巢癌的频率，而且目前尚无证据表明通过盆腔检查进行卵巢癌早筛能改善总体生存率。经阴道超声检查无法检查所有女性的卵巢，特别是绝经期后的女性，因此其应用范围具有一定限制。80％的晚期卵巢癌患者能检测到血清CA125水平提高，但只有50-60％的早期卵巢癌患者CA125水平会提高。此外，其他癌症患者如胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、肺癌等血清CA125也会提高，憩室炎、肝硬化、子宫内膜异位症和其他良性疾病，以及月经或怀孕等情况下均可能使CA125水平提高，这会导致一些假阳性结果。因此通过检测CA125水平来对卵巢癌进行早筛的灵敏度和特异性不高。三项大型随机临床试验PLCO7(前列腺癌、肺癌、结直肠癌和卵巢癌)、UKTOCS8(英国卵巢癌筛查合作试验)和最近得出结论的USPSTF9(美国预防服务工作组)对CA125以及其他标记物和超声波进行了测试，但没有提供任何线索来证明CA125可以作为筛查工具，试验没有显示出任何总体生存效益。
另外，成熟的miRNA是一种由大约18-24个核苷酸组成的内源性非编码单链小RNA，能通过转录后修饰在基因调控中起关键作用，在卵巢癌和其他癌症中发现miRNA被解除了调控。miRNA不容易在血液、组织、粪便和其他体液中降解，是一种稳定的非侵入性生物标志物，稳定性优于DNA和mRNA。体内miRNA数量会随着肿瘤发展过程发生变化，已经有研究表明正常卵巢组织和卵巢癌组织中的miRNA表达水平存在差异，因此通过检测组织miRNA水平可以对卵巢癌进行预后、监测等。血清miRNA具有良好稳定性，对核糖核酸酶、温度和pH不敏感，能长时间保存，可被反复冻存，且检查简便、成本低，已有研究表明其可作为有效的肿瘤标志物，用于癌症诊断。
组织miRNA检测虽然能用于卵巢癌的预后、监测，但不能用于卵巢癌早筛，因为卵巢癌早期阶段无法获取组织样本，而且循环无细胞miRNA的异质性限制了它们的特异性。血清miRNA虽然可作为有效的肿瘤标志物，但目前还没有研究使用早期卵巢癌患者来发现有效的生物标志物。
发明内容
针对目前市面上对癌症尤其是卵巢癌筛查的方法存在灵敏度低、特异性有限等问题，本发明提供一种基于miRNA检测的试剂盒及其在癌症早期筛查中的应用。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种基于miRNA检测的试剂盒，所述试剂盒包含MIR202、MIR508、MIR509-3、MIR205、MIR182、MIR513C、MIR183及MIR513B这八种miRNA的引物。
相应地，如上所述的基于miRNA检测的试剂盒在癌症早期筛查中的应用。
本发明的技术效果为：
相对于现有技术，本发明上述提供的基于miRNA检测的试剂盒由于其中含有MIR202、MIR508、MIR509-3、MIR205、MIR182、MIR513C、MIR183及MIR513B这八种miRNA的引物，因而对卵巢癌的早期诊断具有灵敏度高、特异性良好、准确性高等特点，此外能够降低卵巢癌的筛查成本。
本发明提供的基于miRNA检测的试剂盒在癌症早期筛查中的应用，能够高效、快速地筛查出早期癌症，以便于快速应对，降低治疗怠慢引发的启发风险，而且其应用具有成本低、效率高等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为32种miRNA在肿瘤组织和正常组织中的表达情况；
图2为以GSE106817miRNA微阵列队列来训练OCaMIR的逻辑回归模型得到的ROC曲线；
图3为以GSE106817miRNA微阵列队列来训练OCaMIR的逻辑回归模型得到的OCaMIR风险评分图；
图4为将训练得到的逻辑回归模型应用到GSE31568 miRNA回顾性血清微阵列队列中进行验证得到的ROC曲线；
图5为将训练得到的逻辑回归模型应用到GSE31568 miRNA回顾性血清微阵列队列中进行验证得到的OCaMIR风险评分图；
图6为将训练得到的逻辑回归模型应用到GSE113486miRNA回顾性血清微阵列队列中进行验证得到的ROC曲线；
图7为将训练得到的逻辑回归模型应用到GSE113486miRNA回顾性血清微阵列队列中进行验证得到的OCaMIR风险评分图；
图8为将训练得到的逻辑回归模型应用到捷克共和国回顾性血清队列中进行验证得到的ROC曲线；
图9为将训练得到的逻辑回归模型应用到捷克共和国回顾性血清队列中进行验证得到的OCaMIR风险评分图；
图10为OcaMIR在验证不同疾病回顾性血清队列中的ROC曲线；
图11为在华西医院以OCaMIR进行前瞻性验证得到的ROC曲线；
图12为在华西医院以OCaMIR进行前瞻性验证得到的OCaMIR风险评分图；
其中，Specificity表示特异性；Sensitivity表示灵敏度；OCaMIR表示MIR202、MIR508、MIR509-3、MIR205、MIR182、MIR513C、MIR183、MIR513B这八个miRNA的简称；OCaMIRrisk score表示OCaMIR风险评分。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种基于miRNA检测的试剂盒。
该试剂盒包含MIR202、MIR508、MIR509-3、MIR205、MIR182、MIR513C、MIR183及MIR513B这八种miRNA的引物；
所述八种miRNA的引物包括八种反转录引物、qPCR正向引物以及qPCR反向引物；其中八种反转录引物依次为：
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCCCA，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCTACT，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCATGAT，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAACTT，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAGTTG，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCTTCT，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTATGG，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCTCT，
所述八种miRNA的qPCR正向引物依次为：
GUCCAGUUUUCCCAGGAAGAGGTATAGGGCA，
GUCCAGUUUUCCCAGGATGATTGTAGCCTTTTGG，
GUCCAGUUUUCCCAGGATACTGCAGACGTGGCA，
GUCCAGUUUUCCCAGGAGATTTCAGTGGAGTG，
GUCCAGUUUUCCCAGGATGGTTCTAGACTTGC，
GUCCAGUUUUCCCAGGATAAATTTCACCTTTCTG，
GUCCAGUUUUCCCAGGAGTGAATTACCGAAGGG，
GUCCAGUUUUCCCAGGAAAATGTCACCTTTTTG，
qPCR反向引物均为：TGGTGTCGTGGAGTCG，也就是反向引物是一种通用引物。
进一步优选地，试剂盒中还包含用于反转录的试剂、利用所述引物进行多重PCR反应的试剂、用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于分析的试剂中的一种或者多种。
如用于反转录试剂包括dNTPs、反转录酶、反转录缓冲液、MgCl2、RNA酶抑制剂、DEPC水。
利用所述引物进行多重PCR反应的试剂包括TaqMan探针、DNA聚合酶、dNTPs、ROX、无核酸酶水、缓冲液。
本发明的基于miRNA检测的试剂盒可用于癌症的早期检查。具体来说，可以是卵巢癌的早期筛查。
本发明提供的基于miRNA检测的试剂盒对卵巢癌的早期诊断具有灵敏度高、特异性良好、准确性高等特点，并且能够降低筛查成本。
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面通过实验来做进一步的解释说明。
一、确认对卵巢癌表达的miRNA实验
确认对卵巢癌表达的miRNA，具体可以按照如下方法进行：
(1)血清样本收集：收集OC患者以及正常人(作为对照)的血清样本，用于后续检测。
(2)miRNA提取：使用200μL血清样本，采用miRNeasy serum kit(Qiagen,Valencia,CA)对其RNA进行提取，提取方法可参照miRNeasy serum kit(Qiagen,Valencia,CA)说明书。
(3)cDNA制备：参照Micro RNA Assays试剂盒(ABI)进行miRNA的反转录，首先制备反转录反应液，每份反应液包括6μL反转录引物，反转录引物包括
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCCCA，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCTACT，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCATGAT，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAACTT，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAGTTG，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCTTCT，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTATGG，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCTCT；0.3μL dNTP，3μLMultiScribe反转录酶，1.5μL 10×反转录缓冲液，0.19uL RNA酶抑制剂以及1.01uLNuclease-free water，混匀后快速离心，然后加入96孔板中，再在各孔加入3uL提取得到的miRNA模板(350-1000)ng，混匀并快速离心，冰上孵育5min，然后按以下程序进行反应：第一步16℃30min，第二步42℃30min，第三步85℃5min，反应得到cDNA模板，将得到的cDNA模板置于4℃的环境中。
(4)实时q-PCR：往96孔板中每个孔加入0.5uLMicroRNA Assays(20×)，再加入0.08uL上述反应得到的cDNA，5uL/>Universal Master Mix II，NoUNG(2×)，4.42uL DEPC水(Nuclease-free water)，混匀并快速离心；其中，0.5uL/>MicroRNA Assays(20×)中含有qPCR正向引物和反向引物；其中，qPCR正向引物包括：
GUCCAGUUUUCCCAGGAAGAGGTATAGGGCA，
GUCCAGUUUUCCCAGGATGATTGTAGCCTTTTGG，
GUCCAGUUUUCCCAGGATACTGCAGACGTGGCA，
GUCCAGUUUUCCCAGGAGATTTCAGTGGAGTG，
GUCCAGUUUUCCCAGGATGGTTCTAGACTTGC，
GUCCAGUUUUCCCAGGATAAATTTCACCTTTCTG，
GUCCAGUUUUCCCAGGAGTGAATTACCGAAGGG，
GUCCAGUUUUCCCAGGAAAATGTCACCTTTTTG，
qPCR反向引物均为：TGGTGTCGTGGAGTCG。
按以下程序进行反应：
第一步95℃10min，第二步95℃15s，第三步60℃60s，其中，第二和第三步40次循环。
(5)数据分析：使用2-ΔCT法对miRNA的表达情况进行分析。
由上述表达情况的分析可知，通过对比Ⅰ期卵巢癌和正常对照组中32个miRNA的表达情况，其中32个miRNA分别为：MIR34B、MIR34C、MIR561、MIR582、MIR150、MIR642A、MIR1224、MIR490、MIR4423、MIR190B、MIR1180、MIR1247、MIR503、MIR424、MIR542、MIR450B、MIR139、MIR145、MIR143、MIR140、MIR126、MIR10A、MIR451A、MIR144、MIR202、MIR508、MIR509-3、MIR205、MIR182、MIR513C、MIR183、MIR513B。
图1显示了这32中miRNA在肿瘤组织(Tumor)和正常组织(Normal)中的表达情况，由此鉴定出了8个在卵巢癌中表达上升的miRNAs(OCaMIR)，OCaMIR包括以下八个miRNA：MIR202、MIR508、MIR509-3、MIR205、MIR182、MIR513C、MIR183、MIR513B，利用OCaMIR可用于早期卵巢癌检测。
二、训练逻辑回归模型
使用GSE106817miRNA微阵列队列(OC血清n＝320/健康血清n＝320)来训练一个包含8个miRNA(OCaMIR)的逻辑回归模型。该血清多变量逻辑回归模型如下：
logit(P)＝-1.3374+(0.0887*MIR202)+(0.1622*MIR508)+(0.3776*MIR509-3)+(-0.0381*MIR205)+(0.1101*MIR182)+(0.1038*MIR513C)+(-0.0690*MIR183)+(0.2317*MIR513B)。
具体结果如图2、3所示。从图2可知，通过1000次交叉验证，OCaMIR在检测OC中的AUC达到0.85以上，其检测灵敏度达到84％，特异性达到74％，阳性预测值(PPV)达到77％，阴性预测值(NPV)达到83％；从图3的OCaMIR风险评分图显示出了癌症血清样本和健康血清样本存在差异性。
三、回顾性血清队列验证
随后将训练得到的逻辑回归模型应用到三个独立的回顾性血清队列：
(1).GSE31568 miRNA微阵列队列(OC血清n＝15/健康血清n＝70)，结果如图4、5所示；
(2).GSE113486miRNA微阵列队列(OC血清n＝40/健康血清n＝100)，结果如图6、7所示；
(3).捷克共和国基于RT-PCR的队列(OC血清n＝96/健康血清n＝96)，结果如图8、9所示。
并计算和分析OCaMIR在所有验证队列的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、AUC。
从图4、5可知，检测灵敏度达到85％，特异性达到81％，AUC达到0.839；
从图6、7可知，检测灵敏度达到93％，特异性达到76％，AUC达到0.871；
从图8、9可知，检测灵敏度达到84％，特异性达到89％，AUC达到0.908。
四、对OCaMIR及CA125对卵巢癌检测效果的验证
在捷克共和国队列中比较OCaMIR和CA125在卵巢癌检测中的AUC，包括全阶段卵巢癌和早期卵巢癌的检测。
OCaMIR在检查所有阶段OC样本和Ⅰ期OC样本时AUC分别为0.91和0.86，CA125在检查所有阶段OC样本和Ⅰ期OC样本时AUC分别为0.85和0.73。对比OCaMIR和CA125的检测效果，无论是检查Ⅰ期OC样本还是所有阶段的OC样本，OCaMIR的AUC均高于CA125，表明OCaMIR比CA125具有更好的检测效果。
五、对卵巢癌特异性的验证
为了考察OCaMIR检测卵巢癌的特异性，采用GSE31568微阵列队列(该队列包含了OC在内的各种疾病的miRNA表达数据)，对比OCaMIR在检查卵巢癌(Ovarian cancer)以及其他疾病包括：急性心肌梗塞(Acute myocardial infarction)、肺癌(Lung cancer)、黑色素瘤(Melanoma)、多发性硬化症(Multiple sclerosis)、胰腺岛管癌(Pancreatic ductalcancer)、其他胰腺癌(Other pancreatic cancers)、胰腺炎(Pancreatitis)、前列腺癌(Prostate cancer)、结节病(Sarcoidosis)、胃癌(Stomach cancer)和Wilms肿瘤(Wilmstumor)的AUC，结果如图10所示。
从图10可知，在检测卵巢癌时AUC达到0.85，而检测其他疾病的AUC处于0.1～0.73之间，这表明OCaMIR在检测卵巢癌具有高度特异性。
六、前瞻性队列的验证
用OCaMIR在华西医院进行独立的前瞻性验证，将先前建立的逻辑回归模型应用于该前瞻性队列中，并对AUC，灵敏度，特异性，阳性预测值，阴性预测值进行分析。同时在该队列中对比OCaMIR和CA125在卵巢癌检测中的效果(AUC)，包括全阶段卵巢癌和早期卵巢癌的检测，具体详见图11～12。
从图11和图12可以看出，经检测，OCaMIR的AUC达到0.92，灵敏度达86％，特异性达92％，阳性预测值和阴性预测值分别达91％和89％。针对该队列的Ⅰ期卵巢癌，AUC达到0.81。在该前瞻性队列中，无论是是检查Ⅰ期卵巢癌样本还是所有阶段的卵巢癌样本，OCaMIR的检查效果均优于CA125。
七、成本效益分析的验证
利用在前瞻性队列研究中得到的灵敏度和特异性，在中国的临床背景下，采用基于马尔可夫模型的成本-效果分析(CEA)来评估使用OCaMIR进行高风险群体大规模筛选的成本效益。分析的高风险群体是处于55-80岁的中国女性。
用基于马尔可夫模型的成本-效果分析(CEA)来评估使用OCaMIR进行高风险群体大规模筛选的成本效益，结果表明相对于无筛查，使用OCaMIR筛查具有经济效益(ICER＝CNY 5139.4/QALY)。
由以上实验可以得知，包括MIR202、MIR508、MIR509-3、MIR205、MIR182、MIR513C、MIR183、MIR513B这八个的miRNA形成的OCaMIR可以用于有效的进行卵巢癌的早期筛查，因而可以将其制成本发明的试剂盒，能够高效地对卵巢癌进行筛查，并且筛查具有灵敏度高、特异性强特点，还能够降低成本，提高效益。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.基于miRNA检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含MIR202、MIR508、MIR509-3、MIR205、MIR182、MIR513C、MIR183及MIR513B这八种miRNA的引物；
所述八种miRNA的引物包括反转录引物、qPCR正向引物和qPCR反向引物；
所述反转录引物进行反转录的程序包括：第一步16℃ 30min，第二步42℃ 30min，第三步85℃5min；
所述qPCR正向引物和qPCR反向引物进行PCR扩增的程序包括：第一步95℃ 10min，第二步95℃ 15s，第三步60℃ 60s，其中，第二和第三步40次循环；
其中所述八种miRNA的反转录引物依次为：
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCCCA，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCTACT，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCATGAT，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAACTT，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAGTTG，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCTTCT，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTATGG，
5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCTCT，
所述八种miRNA的qPCR正向引物依次为：
GUCCAGUUUUCCCAGGAAGAGGTATAGGGCA，
GUCCAGUUUUCCCAGGATGATTGTAGCCTTTTGG，
GUCCAGUUUUCCCAGGATACTGCAGACGTGGCA，
GUCCAGUUUUCCCAGGAGATTTCAGTGGAGTG，
GUCCAGUUUUCCCAGGATGGTTCTAGACTTGC，
GUCCAGUUUUCCCAGGATAAATTTCACCTTTCTG，
GUCCAGUUUUCCCAGGAGTGAATTACCGAAGGG，
GUCCAGUUUUCCCAGGAAAATGTCACCTTTTTG，
所述八种miRNA的qPCR反向引物均为：TGGTGTCGTGGAGTCG。
2.如权利要求1所述的基于miRNA检测的试剂盒，其特征在于，所述基于miRNA检测为癌症早期的检测。
3.如权利要求2所述的基于miRNA检测的试剂盒，其特征在于，所述癌症选自卵巢癌。
4.如权利要求1或2所述的基于miRNA检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含以下一种或者多种试剂：
用于反转录的试剂；
利用所述引物进行多重PCR反应的试剂；
用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于分析的试剂。
5.如权利要求4的基于miRNA检测的试剂盒，其特征在于，用于反转录的试剂包括dNTPs、反转录酶、反转录缓冲液、MgCl2、RNA酶抑制剂、DEPC水。
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