CN110951863B - 胎盘植入性疾病标志物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子诊断医疗领域，具体而言，涉及一种胎盘植入性疾病标志物。该标志物具体为miR‑139‑3p。miR‑139‑3p可以用于胎盘植入性疾病诊断，或用于区分胎盘植入性疾病与前置胎盘及子痫前期，具有重要的临床应用价值。

Description

胎盘植入性疾病标志物

技术领域

本发明涉及分子诊断医疗领域，具体而言，涉及一种胎盘植入性疾病标志物。

背景技术

胎盘植入性疾病(placenta accreta spectrum disorders，PAS)是一种胎盘绒毛异常黏附或侵入子宫肌层的妊娠并发症。据统计，PAS在全球孕产妇中的发生率为0.01％至1.1％，其死亡率约为0.05％，严重危害母胎生命安全。研究表明，前置胎盘和剖宫产手术是导致PAS发病的重要独立因素，其发生率增加是导致近年来发病率逐渐上升的重要因素之一。胎盘植入性疾病的发生发展是一个复杂的多因素过程，目前研究表明蜕膜缺失、母体血管重塑异常和绒毛外滋养细胞侵蚀是其发病的主要机制之一，其中胎盘发生侵蚀性改变是胎盘植入的前期病理基础。

胎盘发生侵蚀性改变可以通过外周血中的各类生物标志物进行检测,从而判定体内胎盘生长状态。生物标志物包括血清蛋白、血清小分子和游离核酸等种类，其中miRNA是一类内源基因编码的长度约为19～22个核苷酸的非编码单链小RNA分子，主要通过与mRNA的3’UTR结合以调节基因的表达。它们可通过调节参与细胞分化、粘附、迁移、凋亡以及血管生成相关基因的表达以影响胎盘发育。

有报道发现血清甲胎蛋白(AFP)与胎盘植入有明显相关性，但是其特异性不高，尚未开发成临床可以应用的检测试剂盒。在孕早期分析孕产妇血浆中的胎盘游离mRNA可以预测胎盘植入，但是对于技术手段要求很高，目前尚无进一步应用。此外，有研究报道血浆中胎儿游离DNA在胎盘植入孕产妇外周血中升高，但是临床意义并不明确。因此，截至目前，并没有成熟的采用母体血清中miRNA分子对孕产妇进行胎盘植入的检测方法。

发明内容

本发明基于相对于正常分娩孕产妇，在胎盘植入孕产妇中差异表达的miRNA进行了特异性的鉴定，进而发现miR-139-3p在胎盘植入性疾病孕产妇样品(特别是外周血样品)中显著低表达，并且其表达量与胎盘植入性疾病临床病理学参数显著相关，且该差异在前置胎盘孕与子痫前期产妇中不存在，表明miR-139-3p是特异性的胎盘植入性疾病标志物。

具体的，本发明涉及miR-139-3p的定量检测剂在制备用于胎盘植入性疾病诊断的试剂或试剂盒中的应用，其中受试者样品中降低的miR-139-3p的表达量是发生胎盘植入性疾病的指征。

本发明还涉及miR-139-3p的定量检测剂在制备用于区分胎盘植入性疾病与其类似疾病的试剂或试剂盒中的应用，所述类似疾病包括前置胎盘与子痫前期，其中受试者样品中降低的miR-139-3p的表达量是发生胎盘植入性疾病的指征。

每一例胎盘植入患者对于产科医师都是挑战，在明确诊断胎盘植入后进行多学科协作下的充分围手术期处理对于减少严重的产妇和新生儿并发症尤为重要。因此，胎盘植入的产前诊断是产科临床医师首要关注的问题。影像学诊断是目前临床上产前筛查PAS的重要手段之一，一般采用孕妇胎盘植入高危因素，结合产前的B超或磁共振成像进行诊断。但是，此类影像学诊断成本昂贵，对操作技术水平要求较高，而且具有一定局限性。例如，产前超声不能明确胎盘组织植入的深度，而且对于植入部位较低和子宫后壁的胎盘植入病例假阴性较高；同时造影剂不能在孕妇身上使用，限制了临床MRI的应用。本发明发现了一种新的胎盘植入性疾病标志物miR-139-3p，其可以方便地进行检测，并可以协助现有的临床检测手段实现更灵敏、更精确的方法来识别胎盘植入疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中在所有进行产前辅助诊断胎盘植入的孕产妇中检测获得的miR-139-3p的表达量；CON：正常分娩孕产妇，PAS：病理确诊患有胎盘植入的孕妇；NON-PAS：前置胎盘和子痫前期等非胎盘植入的其它胎盘疾病；表达值在三组人群中有显著差异(p<0.01及p<0.0001)；

图2为本发明一个实施例中miR-139-3p预测孕产妇患病风险指数的ROC曲线和AUC值。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。

提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及miR-139-3p作为胎盘侵蚀性疾病标志物的应用，具体的，涉及miR-139-3p的定量检测剂在制备用于胎盘植入性疾病诊断的试剂或试剂盒中的应用，其中受试者样品中降低的miR-139-3p的表达量是发生胎盘植入性疾病的指征。

本发明还涉及miR-139-3p的定量检测剂在制备用于区分胎盘植入性疾病与其类似疾病的试剂或试剂盒中的应用，所述类似疾病包括前置胎盘与子痫前期，其中受试者样品中降低的miR-139-3p的表达量是发生胎盘植入性疾病的指征。

在本发明中，胎盘植入性疾病被定义为由于部分或全部蜕膜基底层缺失，部分乃至整个胎盘绒毛组织异常种植于子宫壁层的病理状态。胎盘绒毛组织可能不仅仅是侵入到子宫肌层，而且可以穿透子宫壁侵入到子宫浆膜层外乃至膀胱组织，使得胎盘无法与子宫剥离。本发明中胎盘植入性疾病可包括粘连性胎盘(placenta accreta)、植入性胎盘(placenta increta)以及穿透性胎盘(placenta percreta)疾病。

在本发明中用作标志物的miR-139-3p预期包括其全长核糖核苷酸序列，或天然存在的变体，或全长序列及变体的片段，特别是可被检测并确定具体序列的片段，更优选为能够在乳腺组织中与其他RNA序列相区分的片段。优选地包含所述全长核糖核苷酸序列的至少7、8、9、10、11、12、15或20个连续的核糖核苷酸。

“天然存在的变体”应被理解为，高等动物的基因通常伴有高频率的多态性。也存在许多在剪接过程中产生含有相互不同的氨基酸序列的同种型的分子。与癌症相关疾病相关的具有与标志物基因的活性相似的活性的任何基因包括在标志物基因中，即使其由于多态性或为同种型而具有核苷酸序列差异。

本领域的技术人员可认识到，由细胞释放的核糖核苷酸或存在于胞外基质中的核糖核苷酸可能受到损害(例如，在炎症过程中)，且可被降解或切割成这样的片段。如熟练的技术人员将明白的，mRNA或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标志物。因而，在替代方案中，所述试剂或试剂盒也可用于检测这样的复合物，这同样在本发明的保护范围内。

在本文中的一些方法中，期望鉴定存在于样品中的miRNA。

在一些实施方式中，所述定量检测剂通过选自如下的方法检测miR-139-3p：原位杂交、实时荧光定量PCR、数字PCR、荧光染料法、microRNA 芯片法、共振光散射法以及生物质谱法。

在一些实施方式中，所述定量检测剂为引物和/或探针；该探针通常能够特异性结合miR-139-3p。RNA的定量检测剂可选用本领域技术人员所公知的试剂，例如能够与该RNA杂交，且标记有荧光标记的核酸等；常见情况下RNA的检测剂可以选自RT-PCR的引物，以及用于扩增RT-PCR的产物——cDNA的引物。在一些实施方案中，期望使用原位杂交(ISH)。原位杂交将核酸杂交的技术应用和延伸至单细胞水平，并且与细胞化学、免疫细胞化学和免疫组织化学的技术组合，允许形态学的维持以及待维持和鉴定的细胞标志物的鉴定，以及允许序列至群体例如组织和血液样品内的特定细胞的定位。ISH是使用互补核酸来将一个或多个特定核酸序列定位在组织的部分或切片(原位)中，或如果组织足够小，定位在整个组织中(全标本包埋ISH)的杂交类型。RNA的ISH可用于测定组织的表达模式，例如miRNA的表达。

在本发明的一些实施方式中，所述探针或引物带有可检测的标记。

例如在PCR基因扩增监控法中，将检测靶(DNA或RNA的反转录物)与用荧光染料和吸收荧光的猝灭剂标记的探针杂交。当PCR进行并且Taq聚合酶以其5′-3′外切核酸酶活性降解探针时，荧光染料与猝灭剂彼此分离，从而检测到荧光。实时检测荧光。通过同时测量其中靶的拷贝数是已知的标准样品，可利用循环数(其中PCR扩增是线性的)测定受试者样品中靶的拷贝数。同样，本领域技术人员公认PCR扩增监控法可使用任何适当的方法来进行。

如本文所用的术语“标记”指可用于提供可检测的(优选可定量的)效果且可以连接至核酸或蛋白的任何原子或分子。标记包括但不限于染料；放射性标记，诸如³²P；结合部分诸如生物素；半抗原诸如地高辛；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。在一些实施方式中，所述标记选自荧光团、比色标记、量子点、生物素、用于拉曼衍射成像的炔烃基团、用于click反应的环烯烃、用于聚合物标记的引发集团、多肽/蛋白分子以及LNA/PNA。

在一些实施方式中，所述标记是荧光团。

在一些实施方式中，所述荧光团可选自荧光素类染料、罗丹明类染料以及菁染料。

在一些实施方式中，所述试剂盒中还包括另外一种或多种胎盘植入性疾病诊断标志物的检测剂。

在一些实施方式中，所述胎盘植入性疾病诊断标志物选自肌酐激酶、血清甲胎蛋白以及胎盘泌乳素mRNA。

在一些实施方式中，所述样品来自受试者的血液、血清、血浆、羊水、绒毛、组织裂解液、脑脊液或细胞培养上清。

在一些实施方式中，所述样品来自受试者的血清。

在一些实施方式中，所述样品来自外周血血清。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种评估胎盘植入性疾病的方法，所述方法包括：

(a)测量样品中的miR-139-3p的表达量，(b)任选地，测量样品中的一种或更多种其它的胎盘植入性疾病标志物的浓度，和(c)使用步骤(a)的测量结果和任选的步骤(b)的测量结果来评估胎盘植入性疾病，其中受试者样品中降低的miR-139-3p的表达量是发生胎盘植入性疾病的指征(之一)。

诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的多因子病，没有生化标志物的诊断是100％特异性且同100％灵敏度。确定受试者样品和所述正常对照样品相比，是否患有胎盘植入性疾病的差异可用本领域公知的统计学方法进行，并使用置信区间和/或p值进行确认。在一些实施方案中，置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％并且p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。此外，可使用生化标志物(例如，肌酐激酶、血清甲胎蛋白以及胎盘泌乳素mRNA，或本公开证实的miR-139-3p)来以某种可能性或预测值评估胎盘植入性疾病的存在与否或严重性。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。

诊断的过程可以辅以本领域常用的其他技术手段，例如超声以及核磁共振。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1

一、材料与设备

试剂盒:MagMAX mirVana总RNA分离试剂盒

仪器型号：ABI公司的7900HT实时荧光定量仪

芯片：miRCURY-Ready-to-Use PCR-Human-panel-I+II-V4.M

二、采集外周血样本

征得孕产妇知情同意后，在分娩前分别采集疑似病例的非抗凝外周血血清和正常分娩孕产妇的非抗凝外周血血清，在室温下凝固30～45分钟后，4℃2000g离心15分钟以分离血清和细胞，然后将分离的血清转移到低温冻存管中。冻存于-80℃超低温冰箱。待样本采集完毕后，4℃融解200μl血清，2000g重复离心10分钟，以完全去除血小板和其他沉淀物。

三、血清总RNA提取

根据生产商提供的方法，利用ABI公司的MagMAX mirVana总RNA分离试剂盒对每个样本分离的200微升的血清提取总RNA，最终用50微升的无RNA酶的水溶解洗脱。提取的RNA可以储存于-80℃直到后续实验。

四、芯片分析

在筛查阶段，根据生产商提供的方法，使用Exiqon公司提供的逆转录试剂盒对2.5-5.0ng RNA进行逆转录，同时进一步使用该公司的miRCURY-Ready-to-Use PCR-Human-panel-I+II-V4.M芯片在ABI公司的7900HT实时荧光定量仪上进行检测。其中检测的Ct值少于37且低于阴性对照5个Ct值的miRNA才被分析。

五、统计学分析

所有数据使用SPSS 20.0软件和GraphPad Prism 7软件进行分析，其中组间比较使用曼-惠特尼U检验、两独立样本t检验、单因素方差分析、卡方检验；利用ROC曲线分析选取miRNA的诊断价值；p<0.05被认为具有统计学意义。

六、检测结果

分别计算出各个疑似病例样本的检测值/参考值的比值。其中包括病例数12人，对照数12人。结果显示，有约50种人类微小RNA的表达量在胎盘植入病人中均呈现显著变化，其中miR-139-3p呈现显著变化。

由以上结果可知，与正常孕产妇比较，患有胎盘植入的孕产妇血清中多种微小RNA的表达量水平变化显著而且变化稳定，可以进行辅助诊断。

实施例2

一、材料与设备

试剂盒:MagMAX mirVana总RNA分离试剂盒

仪器型号：ABI公司的Q-PCR仪

二、采集外周血样本

征得孕产妇知情同意后，在分娩前分别采集疑似病例的非抗凝外周血血清和正常分娩孕产妇的非抗凝外周血血清，在室温下凝固30～45分钟后，4℃2000g离心15分钟以分离血清和细胞，然后将分离的血清转移到低温冻存管中。冻存于-80℃超低温冰箱。待样本采集完毕后，4℃融解200μl血清，2000g重复离心10分钟，以完全去除血小板和其他沉淀物。

三、血清总RNA提取

根据生产商提供的方法，利用ABI公司的MagMAX mirVana总RNA分离试剂盒对每个样本分离的200微升的血清提取总RNA，最终用50微升的无RNA酶的水溶解洗脱。提取的RNA可以储存于-80℃直到后续实验。

四、实时荧光定量

根据上面筛出的miRNA以及作为内参的miRNA(U6，hsa-miR191-5p和hsa-miR-423-5p)设计相应的逆转录引物，然后根据生产商提供的方法使用宝生物工程有限公司的逆转录试剂盒对每个样本进行逆转录。接着取1ul的cDNA利用宝生物工程有限公司的染料法高特异性qPCR试剂进行荧光定量检测。

五、统计学分析

所有数据使用SPSS 20.0软件和GraphPad Prism 7软件进行分析，其中组间比较使用曼-惠特尼U检验、两独立样本t检验、单因素方差分析、卡方检验；利用ROC曲线分析选取miRNA的诊断价值；p<0.05被认为具有统计学意义。

根据上述方法，分别采集分娩后病理确诊发生胎盘植入发的孕妇和正常分娩孕产妇的产前非抗凝外周血血清，进行已知的人类微小RNA的表达量检测。来自每个样本的miR-139-3p和内参miRNA(U6，hsa-miR191-5p和hsa-miR-423-5p)被相应引物特异性逆转录后，miR-139-3p的表达水平使用内参miRNA平均值进行校正，通过以2^-ΔCt法获得miR-139-3p表达水平。

六、检测结果

在第二批人群中进行检测，分别对分娩前有出血倾向的孕妇以及正常孕妇于分娩前采集的非抗凝外周血血清，进行miR-139-3p的表达量检测并计算其表达量。最终病理分析表明，入组人群中胎盘植入40人，正常对照40人。

表1 第二批人群Q-PCR分析的miRNA表达变化

miRNA ID	PAS/CON	p value
			miR-139-3p	0.6880	0.0355*

Ratio：不同组之间的表达倍数。PAS:胎盘植入孕产妇；CON:正常分娩孕产妇；*:与对照相比t-test的p<0.05。

检测结果显示(表1)，血清中的miR-139-3p可以分别区分胎盘植入和正常对照。

实施例3

采用与实施例2相同的方法，在第三批人群中进行检测，分别对分娩前有出血倾向的孕妇以及正常孕妇于分娩前采集的非抗凝外周血血清，进行miR-139-3p的表达量检测。其具体诊断结果由孕产妇分娩后的病理组织分析获得，真阳性结果为确诊胎盘植入病例，假阳性结果包括前置胎盘和子痫前期病例。最终人数为胎盘植入病例数20人，前置胎盘病例数20人，子痫前期病例数20人，正常对照数20人。

表2 第三批人群中不同组别间的变化倍数和P值

Ratio：不同组之间的表达倍数。PAS:胎盘植入孕产妇；CON:正常分娩孕产妇；PP:前置胎盘孕产妇；PE:子痫前期孕产妇；*:两组间相比t-test的p<0.05。

检测结果显示(表2)，血清中的miR-139-3p可以分别区分胎盘植入、其它胎盘病症包括子痫前期和前置胎盘，以及正常对照。因此，以此miR-139-3p预测，不仅可以辅助诊断胎盘植入，而且能够区分临床上的其它产科并发症，从而提供了一种方便、快捷、精准的辅助分析手段，有利于提高孕妇胎盘植入风险预测的准确度。

实施例4

按照实施例2所述的方法，检测2016年1月～2017年12月的234例正常对照的疑似胎盘植入病例孕产妇的产前外周血清的miR-139-3p表达量，与对照比较表达量降低则有患病风险。预测结果与孕产妇产后病理确诊结果进行对比，并计算该预测方法的AUC曲线值、敏感度和特异性，以及约登指数，结果如表3所示。

表3 所有人群中miRNA的分子诊断特异性分析

miRNA ID	AUC(95％CI)	Sensitivity	Specificity	PPV	NPV	Youden index
							miR-139-3p	0.73(0.65-0.81)	0.80	0.62	0.56	0.83	0.41

其结果显示，利用miR-139-3p表达量可以预测胎盘植入，该标记物具有中等级强度的AUC值，为0.73；具有高等级的敏感性，为0.80；具有中等级的特异性，为0.62；阳性预测值为0.56；阴性预测值为0.83；具有中等级的约登指数，为0.41。

同时，图示表明(图1～2)，在不同批次的所有检测人群中，表达值在正常孕产妇、胎盘植入、其它胎盘疾病的三组人群中均有显著差异(p<0.01及p<0.0001)，ROC曲线的AUC值在0.65～0.81之间，显示具有中等强度的区分性能。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.miR-139-3p的定量检测剂在制备用于胎盘植入性疾病诊断的试剂或试剂盒中的应用，其中受试者样品中降低的miR-139-3p的表达量是发生胎盘植入性疾病的指征。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测剂通过选自如下的方法检测miR-139-3p：原位杂交、实时荧光定量PCR、数字PCR、荧光染料法、microRNA芯片法、共振光散射法以及生物质谱法。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测剂为引物和/或探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引物和/或探针具有可检测的标记。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括另外一种或多种胎盘植入性疾病诊断标志物的检测剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述胎盘植入性疾病诊断标志物选自肌酐激酶、血清甲胎蛋白以及胎盘泌乳素mRNA。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样品来自受试者的血液、血清、血浆、羊水、绒毛、组织裂解液、脑脊液或细胞培养上清。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述样品来自受试者的血清。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述样品来自外周血血清。

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