CN114592057A - 一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用 - Google Patents

一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明专利涉及到一种用于检测食管癌及癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用，具体地说是一种使用8个血清中含有的微小RNA的表达量变化作为食管癌及其癌前病变，即食管上皮不典型增生的诊断标志物的检测试剂盒。其中包括用于miRNA逆转录为cDNA的通用引物，以及用于RT‑qPCR的特异性引物对。

Description

一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及 应用
技术领域
本发明涉及到生物技术领域，具体地说属于涉及一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用。
背景技术
食管鳞癌是一种多发于“亚洲食管癌高发带”的上消化道癌症，在我国发病率和死亡率位居所有癌症种类前列。食管癌早期症状轻微，极易被忽视，发现时常已处于晚期，极大降低了患者的5年生存率。目前食管癌及其早期病变的诊断主要依靠内镜，液基薄层细胞制片（CTC），和核DNA量化法。内镜成本较高，便利性和准确率都不尽如人意。CTC和核DNA法在早期筛查上相较于内镜有很大优势，但是仍然依赖于局部取样的覆盖面和病理主观判断，较难标准化和规模化。因此，发展新的食管癌诊断和预后方法，提高筛查普及度和检测准确率，是食管癌早筛，挽救生命的当务之急。
MicroRNA（miRNA）是一种小的非编码RNA，长度通常在19到24个核苷酸。众多文献报道了miRNA参与细胞分裂增殖、分化与发育，代谢等许多重要的生物过程，在生物种属之间（甚至人和果蝇之间）具有高度的保守性、时序性以及组织特异性。在影响癌症的形成和发展方面，主要通过对抑癌或促癌基因的调控来实现。某些miRNA的表达量与食管鳞癌和癌前病变呈现明显的正或负性相关。miRNA存在于血液，唾液等多种体液中，性质稳定，容易提取。是多种癌症早期筛查的优质候选生物标志物。
食管鳞癌发生前通常会经历鳞状上皮不典型增生直至高级病变的阶段。这一阶段是发现和治疗，防止向恶性发展的黄金阶段。及时准确的诊断是治疗的前提。然而，国内的肿瘤生物标记物研究和应用始终不能形成产业，这主要是由于基础研究比较薄弱。国外的研究大部分都是针对欧美人群的高发癌种，如食管腺癌及其癌前病变Barret’s 食管进行的，和我国食管鳞癌为绝大多数的实际情况有较大差别。在灵敏度很高的肿瘤标记物方面，混用效果可能不好。因此，我国亟待发展适合于自己国情的肿瘤标志物产业，以辅助负担较重的内镜和细胞病理学诊断，提高癌症早筛率和检出率，切实改善健康医疗条件。
发明内容
针对现有技术存在的问题和不足，本发明提供了一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用，便于临床应用的早期食管癌和癌前病变诊断试剂盒，为食管癌的筛查和诊断提供数据支持。
本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种用于食管癌辅助诊断的血液miRNA标志物组合，所述血液miRNA标志物组合为hsa-mir-16-5p，hsa-mir-197-5p，hsa-mir-320c，hsa-mir-451a，hsa-mir-638，hsa-mir-486-5p，hsa-mir-92a-3p，hsa-mir-574-5p。
本发明还提供了一种上述血液miRNA标志物组合在制备食管癌辅助诊断试剂盒或试剂中的应用。
优选地，所述试剂盒包含检测hsa-mir-16-5p，hsa-mir-197-5p，hsa-mir-320c，hsa-mir-451a，hsa-mir-638，hsa-mir-486-5p，hsa-mir-92a-3p，hsa-mir-574-5p的检测试剂。
本发明还提供了检测试剂在制备食管癌早期辅助诊断试剂盒中的应用：
优选地，所述检测试剂包括RNA逆转录引物和/或DNA扩增引物；
[优选地，所述RNA逆转录引物为Oligo(dt)引物；所有miRNA和内参snRNA可以通过一条通用引物进行逆转录。该引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其中N表示A/T/C/G混合碱基。
用于检测hsa-mir-16-5p的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 3所示，用于检测hsa-mir-197-5p的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 4所示，用于检测hsa-mir-320c的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 5所示，用于检测hsa-mir-451a的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 6所示，用于检测hsa-mir-638的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 7所示，用于检测hsa-mir-486-5p的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 8所示，用于检测hsa-mir-92a-3p的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 9所示，用于检测hsa-mir-574-5p的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 10所示。
使用snRNA U6作为RT-qPCR反应的内参基因。检测该内参基因的正向引物序列如SEQ ID NO. 11所示。
优选地，所述试剂盒还包含逆转录反应试剂和PCR扩增试剂，如逆转录酶、缓冲液、dNTPs，MgCl2，无RNA降解酶的超纯水（Rnase free water）和Taq酶等。
本试剂盒包括从正常受试者血清中提取的总RNA混合样品，其检测值作为正常表达量参考值。
作为改进，血液miRNA差异表达分析，采用QPCR进行差异表达miRNA的分析，具体的操作步骤为：
1)提取血清样本（包括正常对照样本）总RNA；
2)将步骤(1)获得的RNA逆转录成cDNA；
3)在荧光实时定量PCR仪上将miRNA和内参基因进行扩增检测；
4)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量；
5）在8个miRNA标志物中有2个或以上出现表达量异常升高情况，或者有1个出现特别升高情况（如>5倍）,则判定为阳性样本，需转介内镜科进行进一步筛查或活检确诊。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
1)本发明采用的标志物组合为对食管癌病例和健康人对照的血清miRNA表达谱进行分析后获取，并通过大样本人群验证，可靠性高；
2)血液miRNAs是一种新型生物标志物，稳定、微创、易于检测，且定量精确。因此，本发明通过检测血清miRNA表达量将大大提高食管癌诊断的敏感性和特异性，同时为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴；
3)本发明以检测与食管癌相关的血液miRNA标志物组合的RNA逆转录引物和DNA扩增引物来制备试剂盒，灵敏度高，特异性强，操作简单，使用方便，可用于食管癌早期诊断和食管癌无症状高危人群的筛查，为临床医生快速准确对食管癌无症状高危人群进行筛查诊断奠定基础。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术：
与人类食管癌相关的miRNA的筛选：
1）系统采集人口学资料；
2）采集外周血；
3）外周血总RNA的提取，具体步骤为：
①取冻存的血液并充分解冻，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分
钟，10000rmp离心1分钟；
②彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀；
③加入Trizol试剂，室温放置5min裂解细胞；
④4℃下12000rpm离心10min，取上清；
⑥加等体积酚氯仿，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min；
⑦12000rpm高速离心10min后吸取上层水相到另一新离心管中，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上30min；
⑧12000rpm高速离15min后小心弃上清液，加入75％乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，4℃下12000rpm高速离心5min；
⑨弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干，加入无酶水溶解沉淀
⑩用紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
RT-QPCR检测差异表达的miRNA，具体步骤如下：
①逆转录：
将上述步骤提取的总RNA模板(10pg-1μg)与2μl10×缓冲液、2μldATP(10mM)、
polyA多聚酶、RNase抑制剂和无酶水混合，总体积为20μl，37℃孵育1h。然后向反应管中加入μl 0.5μg/μl Oligo(dT)逆转录引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育5min。最后，将上述20μl反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM)，逆转录酶，RNase抑制剂，
10μl polyA反应混合液和4μl无酶水混合，42℃孵育1h。
②QPCR扩增反应：
每个样本设置3个重复以保证结果的可靠性。具体反应体系为：SYBR GreenRealtime PCR Master Mix 10 μl，5μM/μl正向引物1μl，同浓度反向引物1μl，模板cDNA2.0μl，无酶水补至20μl反应体系。QPCR的扩增程序为：95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 60s，45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。
通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，可得各miRNA，包括正常对照在血清中相对于内参基因的表达量。
SEQ ID NO. 1
5’-
GAAAGAAGGCGAGGAGCAGATCGAGGAAGAAGACGGAAGAATGTGCGTCTCGCCTTCTTTCNNNNNNN-3’
SEQ ID NO. 2
5’-GAAGGCGAGGAGCAGATCGAG-3’
SEQ ID NO. 3
5’-GCCGAGTAGCAGCACGTAAAT-3’
SEQ ID NO. 4
5’-GCCGAGCGGGTAGAGAGGGCA-3’
SEQ ID NO. 5
5’-TCGGCAGGAAAAGCTGGGTTG-3’
SEQ ID NO. 6
5’-GCCGAGAAACCGTTACCATTA-3’
SEQ ID NO. 7
5’-GCCGAGAGGGATCGCGGGCGG-3’
SEQ ID NO. 8
5’-GCCGAGTCCTGTACTGAGCTG-3’
SEQ ID NO. 9
5’-GCCGAGTATTGCACTTGTCCC-3’
SEQ ID NO. 10
5’-GCCGAGTGAGTGTGTGTGTGTG-3’
SEQ ID NO. 11
5’-CCTGCGCAAGGATGACACGCA-3’

Claims (8)

1.一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用，其特征在于miRNA标志物包括：hsa-mir-16-5p，hsa-mir-197-5p，hsa-mir-320c，hsa-mir-451a，hsa-mir-638，hsa-mir-486-5p，hsa-mir-92a-3p，hsa-mir-574-5p，以检测早期食管癌及食管上皮不典型增生。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用，其特征在于： hsa-mir-16-5p，hsa-mir-197-5p，hsa-mir-320c，hsa-mir-451a，hsa-mir-638，hsa-mir-486-5p，hsa-mir-92a-3p在食管上皮不典型增生患者血清中的表达量显著高于正常受试者，其变化范围在1.79-5.19倍。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用，其特征在于：hsa-mir-16-5p，hsa-mir-197-5p，hsa-mir-320c，hsa-mir-451a，hsa-mir-486-5p，hsa-mir-574-5p在早期食管癌患者血清中的表达量显著高于正常受试者，其变化范围在1.4-5.16倍。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用，其特征在于：使用引物SEQ ID NO. 1作为所有miRNA和内参snRNA逆转录为cDNA的通用引物。
5.据权利要求1所述的一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用，其特征在于：使用引物SEQ ID NO. 2作为所有RT-qPCR扩增反应的反向通用引物。
6.据权利要求1所述的一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用，其特征在于：用于检测hsa-mir-16-5p的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 3所示，用于检测hsa-mir-197-5p的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 4所示，用于检测hsa-mir-320c的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 5所示，用于检测hsa-mir-451a的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 6所示，用于检测hsa-mir-638的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 7所示，用于检测hsa-mir-486-5p的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 8所示，用于检测hsa-mir-92a-3p的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 9所示，用于检测hsa-mir-574-5p的RT-qPCR扩增的正向引物序列如SEQ ID NO. 10所示。
7.据权利要求1所述的一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用，其特征在于：使用snRNA U6作为RT-qPCR反应的内参基因，检测该内参基因的正向引物序列如SEQ ID NO. 11所示。
8.据权利要求1所述的一种用于检测食管癌及其癌前病变的miRNA标志物试剂盒及应用，其特征在于：包括从正常受试者血清中提取的总RNA混合样品，其检测值作为正常表达量参考值 。
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