CN110093418B

CN110093418B - 用于结直肠癌早筛、诊断、疗效及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒

Info

Publication number: CN110093418B
Application number: CN201910036674.XA
Authority: CN
Inventors: 林东昕; 郑健; 麦冬梅
Original assignee: Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Cancer Center
Current assignee: Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2019-01-15
Filing date: 2019-01-15
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2039-01-15
Also published as: CN110093418A

Abstract

本发明公开了一种用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评价的piRNA‑54265检测试剂盒。该试剂盒包含有piRNA‑54265检测引物组合，包括前向引物和反向引物，前向引物是将piRNA‑54265的RNA序列中的U改成T，从5端开始撷取若干碱基且包括TGGAG五个碱基。本发明原创性首次针对piRNA‑54265提供了特定的引物设计模式，据此设计的引物扩增效率及特异性俱佳。本试剂盒提供了从样本RNA纯化至含量检测的完整过程，流程优化，操作简便高效，适用的待测样本包括组织、细胞，细胞上清、血清（血浆）、尿液、唾液等体液以及其余各类RNA稀有样本，所需样本量较市面同类型试剂盒少，适用范围广。

Description

用于结直肠癌早筛、诊断、疗效及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域。更具体地，涉及一种用于人结直肠癌早筛、诊断、疗效及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒。

背景技术

结直肠癌是世界范围内常见的胃肠道肿瘤，在我国恶性肿瘤中位居前列，结直肠癌隐匿性强，大多患者发现时已是中晚期临床治疗效果不佳，是全球范围内致人死亡的重要病因之一。而早期结直肠癌患者手术切除率高，复发转移少，五年总生存显著提高。因此，结直肠癌早期诊断尤其是早期筛查具有重要意义。目前，肠镜检查作为早期诊断的重要手段，准确率高，但由于经济成本高、操作人员及设备要求高、体检者依从性差，并不利于普及早期筛查。因此，寻找及开发出经济简便、高灵敏度特异度的生物标志物进行结直肠癌的早期筛查和诊断，意义重大。

Piwi-interacting RNA(简称piRNA)是一类长度约26-31nt的单链非编码RNA，在转座子抑制和基因表达调控方面行使重要功能。越来越多的研究发现，某些特定piRNA在胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤中异常表达，而扰动这些肿瘤细胞中特定的piRNA能影响诸如增殖、转移、侵袭等细胞恶性表型。因此，piRNA在肿瘤的发生发展中可能发挥重要作用。本课题组研究发现piRNA-54265在结直肠癌与癌旁组织中的表达具有显著统计学差异，piRNA-54265在癌组织中高表达。piRNA-54265在癌组织中表达量的高低与结直肠癌患者的生存预后相关，piRNA-54265高表达组结直肠癌患者预后较差。结直肠癌患者血清中能够检测到piRNA-54265，其在血清中的含量与在癌组织中的含量呈正相关性，并与患者生存预后相关；在非结直肠癌的正常人血清中，piRNA-54265含量极低，与结直肠癌患者血清piRNA-54265含量比较，差异显著并很容易区分。敲降piRNA-54265后，结直肠癌细胞的增殖及侵袭能力等均明显减弱，能够抑制裸鼠皮下移植瘤的生长及癌细胞的远处转移及定植。增加或降低piRNA-54265的表达水平，结直肠癌细胞均表现出一定程度的化疗敏感性降低或增强；piRNA-54265高表达患者，化疗近期疗效较差。而且，血清piRNA-54265能有效预测结直肠癌，可在确诊3年前患者的血液中检测到异常高表达的piRNA-54265，因此能在正常人群中进行结直肠癌的早期筛查及早期诊断，有效预测时间比临床确诊提早至少三年。

因此，以piRNA-54265作为结直肠癌早筛、诊断、预后监测靶标开发相关诊断试剂盒具有重要意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

基于本课题组的研究成果，piRNA-54265在血清中稳定表达，piRNA-54265在结直肠癌患者血清中特异性高表达，并且与肿瘤分期正相关(piRNA-54265的核苷酸序列如SEQID NO.1所示)。前瞻性自然人群队列研究表明血清piRNA-54265水平可预测结直肠癌的发病，并且可比临床确诊提早3年。因此piRNA-54265可以作为结直肠癌早筛、诊断、疗效评价、预后判断的生物标志物。进一步开发了piRNA-54265的检测试剂盒，可用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评价。

具体地，一种用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒，其包含有用于特异性检测piRNA-54265的引物，所述引物为定量PCR引物对，包括前向引物和反向引物，前向引物是将piRNA-54265的RNA序列中的U改成T、从5端开始撷取若干碱基且包括TGGAG五个碱基所得到。

作为一种优选地可选择方案，所述引物对可为piRNA-54265茎环法PCR引物对，或piRNA-54265加PolyA尾法PCR引物对。

优选地，所述piRNA-54265茎环法PCR引物对如SEQ ID NO.8/9、SEQ ID NO.10/9、SEQ ID NO.11/9、SEQ ID NO.12/13、SEQ ID NO.14/13、SEQ ID NO.15/13、SEQ ID NO.16/13、SEQ ID NO.17/13、SEQ ID NO.18/13、SEQ ID NO.19/13或SEQ ID NO.20/13所示。

优选地，所述piRNA-54265加PolyA尾法PCR引物对如SEQ ID NO.8/21、SEQ IDNO.10/21、SEQ ID NO.11/22、SEQ ID NO.12/22、SEQ ID NO.14/23、SEQ ID NO.15/22、SEQID NO.16/22、SEQ ID NO.17/22、SEQ ID NO.18/22、SEQ ID NO.19/22、或SEQ ID NO.20/22所示。

最优选地，茎环法引物对的前向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.26和SEQ IDNO.9所示。

最优选地，加polyA尾法引物对的前向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.26和SEQID NO.22所示。

另外，所述试剂盒还包括配合所述引物使用的探针。

优选地，与茎环法引物配合使用的探针如SEQ ID NO.27所示。

另外，所述试剂盒还包括样本RNA逆转录引物。

优选地，piRNA-54265茎环法逆转录引物序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，piRNA-54265加PolyA尾法逆转录引物序列如SEQ ID NO.3-5所示。

另外，优选地，本发明上述试剂盒使用时，若采用实时荧光定量PCR，其反应体系如表13，表14，反应程序如表15。若数字PCR，其反应体系如表16，反应程序如表17。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的可用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒，本发明原创性首次针对piRNA-54265提供了特定的引物设计模式，并验证了其引物设计的扩增效率及特异性俱佳。本试剂盒提供了从样本RNA纯化至含量检测的完整过程，流程已优化，操作简便高效。

而且，该试剂盒使用时，待测样本适合于包括组织、细胞，以及细胞上清、血清(血浆)、尿液、唾液等体液以及其余各类RNA稀有样本，所需的样本量较市面同类型试剂盒少；同时提供了两种可选的含量检测方法包括与数字PCR绝对定量法进行，适用范围广。

附图说明

图1：茎环引物法和加PolyA尾法PCR引物设计模式示意图。

图2：茎环法11对引物的扩增曲线和融解曲线。

图3：加PolyA尾法11对引物的扩增曲线和融解曲线。

图4：茎环法和加PolyA尾法的最优引物对应的扩增曲线和融解曲线。

图5：试剂盒实时荧光定量PCR检测随访中未发病的对照一例(正常人)，随访中发病的病例一例(取样时未发病，为结直肠癌患者发病前)，高级别上皮内瘤变一例，结直肠癌患者两例(Ⅰ期和Ⅳ期)血清piRNA-54265水平。

图6：试剂盒实时荧光定量PCR检测结直肠癌患者术前，术后第1天，第3天，第5天，第7天血清piRNA-54265水平；6a患者术前和术后第1，3，5，7天血清piRNA-54265和外参cel-miR-39的扩增曲线。6b为相应的融解曲线。

图7：试剂盒数字PCR检测正常人和结直肠癌患者治疗前血清piRNA-54265水平结果。

图8：piRNA-54265检测试剂盒效能评价。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。下述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂、材料均为市购，未注明具体条件的实验方法通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

另外，以下实施例中：

1、主要仪器设备：Beckman Coulter Centrifuge(美国)、水浴锅(crystal公司)、温度循环仪(Thermo Fisher)、实时定量PCR仪(Roche)、超低温冰箱、Vortex漩涡震荡仪(crystal公司)、TGear微型离心机(TGear)、磁力架、Bio Rad QX200微滴式数字PCR仪。

2、主要实验试剂：蛋白酶K(50mg/ml)(Thermo Fisher)；TURBO DNase(20U/μl)(Thermo Fisher)；裂解缓冲液；蛋白酶K消化缓冲液；RNA结合磁珠(Thermo Fisher)；洗液1(Thermo Fisher)；洗液2(Thermo Fisher)；重连缓冲液；TURBO DNase缓冲液(ThermoFisher)；裂解促进液(lysis binding enhancer)；无酶水；反应板；洗脱板；贴膜；逆转录反应缓冲液(Thermo Fisher)；脱氧核糖核苷酸混合物(10mM dNTP Mix)(Thermo Fisher)；逆转录酶(200U/μl)(Thermo Fisher)；RNA酶抑制剂(20U/μl)(Thermo Fisher)；

480SYBR Green I Master；异丙醇；无水乙醇；2-巯基乙醇；

480Multiwell96/384plate；Axygen八联管；QX200^TM油滴生成油；油包水微滴生成卡槽；微滴生成封口胶垫；ddPCR96孔板；铝膜；微滴读取油。

实施例1引物设计

1、分别利用茎环法和加PolyA尾法这两种小RNA逆转录方法，设计逆转录引物(如表1和表2)，再对应地设计PCR引物，进而对piRNA-54265定量，具体设计思路如下图1。

茎环法和加PolyA尾法的前向引物设计原理类似。piRNA-54265的前向引物即是将piRNA-54265的RNA序列中的U改成T，从5端开始撷取若干碱基。一般荧光定量PCR引物长度为17-25nt，因此，理论上当前向引物设计为piRNA-54265的全长，即29nt(如下表3中的前向引物1)，亦能特异地扩增piRNA-54265经逆转录形成的cDNA；另一方面，当适当减少前向引物的长度，即减少前向引物与cDNA的互补碱基数亦能定量扩增，但当这种互补碱基减少到一定数目时，该前向引物即不能进行有效扩增。因此在确保能有效扩增前提下，我们探讨前向引物与cDNA互补碱基的最少数目进行了探讨。设计的前向引物与cDNA3’末端互补的碱基数依次递减，分别是29，25，21，17，13，9，5，4，3，2，1。引物序列如下表3和表4。对应的扩增曲线与融解曲线如图2和3，可见piRNA-54265的前向引物从3末端最后一个碱基，从3’到5’，和cDNA3末端连续互补碱基≥5个碱基(TGGAG)能进行有效扩增，当互补碱基为4，3，2，1时不能进行有效扩增(即表3和表4中的引物对，前向引物中不包含TGGAG的引物对不能进行有效扩增)。

表1 piRNA-54265逆转录引物

表2外参cel-miR-39逆转录引物

表3 piRNA-54265茎环法PCR引物

表4 piRNA-54265加PolyA尾法PCR引物

表5外参cel-miR-39茎环法PCR引物

表6外参cel-miR-39加PolyA尾法PCR引物

2、引物的进一步优化

根据图2、3的结果显示，茎环法的第三对引物对(即对应SEQ ID NO.11&9)和加PolyA尾法的第四对引物对(即对应SEQ ID NO.11&22)的扩增效率相对其他引物较高，因此挑选这两对引物作为候选最优引物。

在上述筛选的候选最优引物基础上，在引物5’端引入C、G进一步优化。优化后的引物序列如下表7和8所示，对应的扩增曲线和融解曲线如图4。

表7茎环法最优引物对

表8加PolyA尾法最优引物对

3、另外根据该最优引物序列，由于数字PCR平台检测涉及到探针使用，因此根据此最优引物，设计了对应的探针，如表9所示：

表9茎环法探针

实施例2 piRNA-54265检测方法

1、样本总RNA提取

(1)血清总RNA提取

1)取100μl血浆(清)至反应板。

2)加入蛋白酶K消化，消化体系为：蛋白酶K消化缓冲液45μl、蛋白酶K(50mg/ml)5μl，总体积50μl。

3)漩涡仪上摇匀孵育5分钟；65℃，孵育30分钟；漩涡仪上摇匀，700rpm,5分钟。

4)配制裂解&RNA结合体系(Lysis Binding Mix)：裂解缓冲液99μl、2-巯基乙醇1μl，总体积100μl。

5)每个样品孔依次加入100μl Lysis Binding Mix、外参cel-miR-395fmol、20μl磁珠(RNA Binding Beads)。

6)漩涡仪上摇匀孵育，400rpm,7分钟。

7)异丙醇洗脱，漩涡仪上摇匀孵育15分钟。

8)再次颠倒混匀同7)。

9)将反应板置于磁力架上直至溶液澄清；弃上清。

10)每个反应孔加入180μl完整洗液1(完整洗液1：洗液1加入10ml异丙醇)，置于漩涡仪上摇匀，700rpm，1分钟。

11)将反应板放磁力架上1分钟，直至溶液变澄清；弃上清。

12)用180μl完整洗液2(完整洗液2：洗液2加入48ml无水乙醇)。重复10)-11)。

13)置于漩涡仪上甩干5分钟。

14)DNA酶消化，消化体系为：DNase缓冲液48μl、DNase(20U/μl)2μl，总体积50μl

15)贴膜后置于漩涡仪上摇匀15分钟。

16)每个样品孔中分别加入50μl重连缓冲液(Rebinding buffer)，100μl异丙醇。漩涡仪上摇匀5分钟。

17)将反应板放磁力架上5分钟直至溶液变澄清；弃上清。

18)每个样品孔加入180μl完整洗液2，贴膜置于漩涡仪上摇匀，700rpm、30秒。

19)将反应板放磁力架上1分钟，直至溶液变澄清；弃上清。

20)重复18)-19)。

21)漩涡仪上风干5分钟。

22)加入50μl已预热至65℃的无酶水(Elution Buffer)置于漩涡仪上摇匀，2分钟。

23)将反应板放至65℃的水浴锅中，孵育5分钟。

24)将反应板置于磁力架上直至溶液变澄清；转移上清(提取好的RNA)至无酶管，-80度保存。

(2)尿液标本总RNA的提取

1)取50μl尿液标本至反应板。

2)配置裂解&RNA结合体系(Lysis Binding Mix)(一个样品孔)：裂解缓冲液198μl、β-巯基乙醇2μl，总体积200μl

3)往2)反应板中加入200μl Lysis Binding Mix，调整至终体积450μl，封膜，涡旋仪上摇匀混匀，300rpm,7分钟。

4)往反应板加入30μl磁珠结合体系，磁珠结合体系(一个样品孔)：RNA结合磁珠20μl、裂解/结合促进液10μl，总体积30μl。

5)封膜，涡旋仪上摇匀混匀，速度300rpm,时间5分钟。

6)异丙醇洗脱。涡旋仪上摇匀混匀20分钟。

7)将反应板放至磁力架上直至溶液澄清；弃上清。

8)加入180μl完整洗液1，封膜涡旋仪上混匀，700rpm，1min。

9)将反应板放在磁力架上直至反应孔中的溶液澄清；弃上清。

10)用完整洗液2。重复8)-9)。

11)涡旋仪上空甩5分钟。

12)DNA酶消化，封膜，涡旋仪上摇匀混匀，15分钟；消化体系为：DNase缓冲液48μl、DNase(20U/μl)2μl，总体积50μl。

13)依次加入50μl重连缓冲液和100μl异丙醇至反应板。

14)封膜涡旋仪上摇匀5分钟。

15)反应板放在磁力架上待反应液变澄清，弃上清。

16)加入180μl完整洗液2，涡旋仪上摇匀30秒。

17)放磁力架上待反应液变澄清；弃上清。

18)用完整洗液2重复16)-17)。

19)涡旋仪空甩反应板5分钟。

20)加入50μl已预热至65℃的无酶水，封膜涡旋仪上孵育2分钟。

21)反应板放入65℃水浴箱孵育5分钟。

22)涡旋仪上孵育2分钟。

23)将反应板放在磁力架上待溶液变澄清，转移上清(提取好的RNA)至无酶管，-80℃保存。

2、逆转录

(1)茎环法逆转录合成cDNA第一链

1)配制逆转录体系如下表10(每个样品)：

表10茎环法逆转录体系

备注：【1】5×逆转录反应缓冲液，由三(羟甲基)氨基甲烷即Tris-HCl(pH＝8.3),氯化钾(KCl)，氯化镁(MgCl₂)，二硫苏糖醇(DTT)配成。【2】10mM脱氧核糖核苷酸混合物，包含四种脱氧核糖核苷酸dATP,dCTP,dGTP,dTTP,浓度均为10mM，溶于0.6mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)中。

2)从提取的总RNA 50μl中抽取10μl，再加入以上10μl逆转录体系，瞬离。置于温度循环仪中按下进行逆转录反应：42℃60分钟，70℃5分钟。

3)逆转录合成的cDNA第一链可置于冰上备用，或-20℃长期保存。

(2)加PolyA尾法逆转录合成cDNA第一链

1)RNA加PolyA尾，按如下表11反应体系对样本中的RNA进行加尾，37度孵育10min。

表11

成分	体积(μl)
		多聚腺嘌呤核苷酸聚合酶(5000units/ml)	1
10×多聚腺嘌呤核苷酸聚合反应缓冲液	2
		RNA酶抑制剂	1
10mMATP	2
		RNA	1-10μg
无酶水	补足体积至20μl
		总体积	20

2)逆转录合成cDNA第一链

对1)中已进行加PolyA尾的RNA进行逆转录，按如下表12配置逆转录反应体系

表12

3、PCR检测

(1)实时荧光定量PCR

1)反应体系

cDNA原液进行适当稀释后进行定量PCR，目的和外参，反应体系分别如下表13和14所示，分别2-3个副孔：

表13

表14

2)PCR扩增反应

往PCR反应板中每孔先加入除模板的9μl反应体系，再加入适当稀释倍数的cDNA，按下表15进行扩增反应

表15

3)结果分析

PCR扩增结果用CT值表示，CT值的定义是PCR反应体系中荧光信号达到设定阈值时的循环数。样品目的基因的相对表达量采用ΔCT_target＝CT_target-CT_control计算，此处CT_target即piRNA-54265的CT值，CT_control为与前者同一样本的cel-miR-39的CT值，因此目的基因的相对表达量＝2^-ΔCTtarget。

(2)数字PCR(基于Bia-rad平台示例)

1)适当浓度cDNA 20ul体系中所加样本核酸含量不要超过数字PCR规定检测范围(1～100000拷贝片段化核酸或者1～20000拷贝较完整基因组DNA)，一般50fg～100ng为宜。

2)数字PCR反应体系配置如下表16

表16

3)上述体系配置完成后，打开数字PCR液滴生成仪器，预热封膜机，准备油包水微滴生成卡槽，分别加入上述表16体系20μl和70μl微滴生成用油，避免产生气泡。

4)加上微滴生成封口胶垫后轻放入数字PCR液滴生成仪器，开始生成微滴。

5)油包水微滴生成完成后，移取40μl油包水微滴至PCR反应板。

6)微滴移取完成后，用铝膜进行封膜，封膜完成后按如表17进行扩增反应：

表17

7)整个PCR过程大概耗时1小时45分钟，需提前打开微滴读取仪进行冲洗，设置参数。扩增完成后，立刻将PCR反应板放上微滴读取仪，读取结果。

实施例3试剂盒组装

1、一种用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的piRNA-54265检测试剂盒，。

所述引物对包括前向引物和反向引物，前向引物是将piRNA-54265的RNA序列中的U改成T，从5端开始撷取若干碱基且包括TGGAG五个碱基。

所述引物对为piRNA-54265茎环法PCR引物对，或piRNA-54265加PolyA尾法PCR引物对。

最优选地，所述piRNA-54265茎环法PCR引物对的前向引物和反向引物分别如SEQID NO.26和SEQ ID NO.9所示。

最优选地，所述piRNA-54265加PolyA尾法PCR引物对的前向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.22所示。

所述探针序列如SEQ ID NO.27所示。

所述逆转录引物分为piRNA-54265茎环法逆转录引物或piRNA-54265加PolyA尾法逆转录引物两种。

piRNA-54265茎环法逆转录引物序列如SEQ ID NO.2所示。

piRNA-54265加PolyA尾法逆转录引物序列如SEQ ID NO.3-5所示。

2、该试剂盒的使用方法参考实施例2中所述。

实施例4试剂盒样本检测

1、标本来源

在取得患者知情同意后，收集中山大学肿瘤防治中心2016-2018年经病理确诊的结直肠癌患者的血清样本、防癌体检中心体检未发现恶性肿瘤的血清样本。

2、检测正常人、结直肠癌患者发病前、高级别上皮内瘤变、结直肠癌患者血清piRNA-54265水平

(1)按照实施例2中的方法，提取血清样本RNA，茎环法逆转录，进行荧光定量PCR检测。

(2)结果如图5。图中a图随访中未发病的对照(CONTROL)一例，随访中发病(CASE)一例(取样时未发病)，高级别上皮内瘤变一例，结直肠癌两例(Ⅰ期和Ⅳ期)血清piRNA-54265和外参cel-miR-39的扩增曲线。

ΔCt_CRC1Average＝6.09，ΔCt_CRC2Average＝10.19，ΔCt_HINAverage＝13.84，ΔCt_CASEAverage＝15.17，ΔCt_{CONTROLAverage}＝19.88。

ΔCt越大，相对表达量越低。可见结直肠癌病人血清piRNA-54265水平要明显高于正常人和高级别上皮内瘤变。另外结直肠癌患者发病前水平亦高于不会发展成结直肠癌的对照。

3、检测结直肠癌患者术前、术后第一天、第三天、第五天、第七天血清piRNA-54265水平

(2)结果如图6，结直肠癌患者术前，术后第1天，第3天，第5天，第7天血清piRNA-54265水平。图中a图患者术前和术后第1，3，5，7天血清piRNA-54265和外参cel-miR-39的扩增曲线。ΔCt_术前＝6.57，ΔCt_术后1天＝7.31，ΔCt_术后3天＝8.49，ΔCt_术后5天＝10.67，ΔCt_术后7天＝12.12。ΔCt越小，相对表达量越大。可见术后血清piRNA-54265水平相对术前降低，且随着术后天数的递增，piRNA-54265水平也逐渐下降。

4、基于Bio-rad数字PCR平台对血清piRNA-54265水平进行定量检测

(1)按照实施例2中的方法，提取血清样本RNA，茎环法逆转录，进行数字PCR检测。

(2)结果如图7，正常人及结直肠癌患者血清中均能够检测到piRNA-54265的表达；经参考基因校正后，结直肠癌患者血清中piRNA-54265的表达量显著高于对照组水平。

实施例5检测piRNA-54265试剂盒的效能评价

实验设计检测阴性血清中添加外源性合成的特定量piRNA-54265类似物，经本试剂盒进行RNA提取、逆转录及定量PCR检测，考察本试剂盒的检测值符合真实值(外源性添加特定量)的程度及本试剂盒所提供的引物设计模型下设计的各引物的扩增效率和特异性。

具体实验方法：外源性人工合成piRNA-54265mimic(模拟类似物)，在序列及结构上与天然血清中完全吻合。100μl阴性血清(胎牛血清)中加入特定总量piRNA-54265mimic5fmol，依据本试剂盒进行随后的提取与检测(需要外参)。结果根据检测Ct值与外参进行回收率校准后计算所得。

结果如图8。图中，a图、b图为不同浓度cel-miR-39和piRNA-54265标准品所作的标准曲线。c图为计算回收率后校正的piRNA-54265的水平。回收率计算参照加入一定量cel-miR-39的胎牛血清样本经试剂盒提取检测到cel-miR-39的Ct值与等量cel-miR-39标准品不经提取经过逆转录PCR所得Ct值二者计算所得。d图是评价c图中不同引物对检测效能。

经本试剂盒进行检测，如图8中b图，各检测结果值贴近真实值水平，检测效能均在90％以上，如图8中d图；同时基于本试剂盒所提供的引物设计模型所设计的各引物对，扩增效率和特异性俱佳(F1/R1～F7/R7)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学，中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）

<120> 用于结直肠癌早筛、诊断、疗效及预后评价的piRNA-54265检测试剂盒

<130>

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> piRNA-54265序列

<400> 1

tggaggtgat gaactgtctg agcctgacc 29

<210> 2

<211> 67

<212> DNA

<213> piRNA-54265茎环法逆转录引物

<400> 2

tgaccgtctg tatggttgtt cacgactcct tcaccctatc caaccataca gacggtcagg 60

tcaggct 67

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> piRNA-54265和cel-miR-39 的加PolyA尾法逆转录引物

<400> 3

gctgtcaacg atacgctacg taacggcatg acagtgta 38

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> piRNA-54265和cel-miR-39 的加PolyA尾法逆转录引物

<400> 4

gctgtcaacg atacgctacg taacggcatg acagtgtg 38

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> piRNA-54265和cel-miR-39 的加PolyA尾法逆转录引物

<400> 5

gctgtcaacg atacgctacg taacggcatg acagtgtc 38

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> cel-miR-39序列

<400> 6

tcaccgggtg taaatcagct tg 22

<210> 7

<211> 76

<212> DNA

<213> cel-miR-39茎环法逆转录引物

<400> 7

tgaacatcct ctggaggcca actgcgtgag cttgttactc attttctcag cctccagagg 60

atgttcacaa gctgat 76

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> piRNA-54265的茎环法前向引物1和加PolyA尾法前向引物1

<400> 8

tggaggtgat gaactgtctg agcctgacc 29

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> piRNA-54265茎环法反向引物1、2、3、12

<400> 9

tatggttgtt cacgactcct tcac 24

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> piRNA-54265的茎环法前向引物2和加PolyA尾法前向引物2

<400> 10

tggaggtgat gaactgtctg agcct 25

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> piRNA-54265的茎环法前向引物3和加PolyA尾法前向引物3

<400> 11

tggaggtgat gaactgtctg a 21

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> piRNA-54265的茎环法前向引物4和加PolyA尾法前向引物4

<400> 12

tggaggtgat gaactgt 17

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> piRNA-54265茎环法反向引物4、5、6、7、8、9、10、11

<400> 13

tatggttgtt cacgact 17

<210> 14

<211> 13

<212> DNA

<213> piRNA-54265的茎环法前向引物5和加PolyA尾法前向引物5

<400> 14

tggaggtgat gaa 13

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> piRNA-54265的茎环法前向引物6和加PolyA尾法前向引物6

<400> 15

ctatcgcatg ctggaggtga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> piRNA-54265的茎环法前向引物7和加PolyA尾法前向引物7

<400> 16

tcgactatcg catgctggag 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> piRNA-54265的茎环法前向引物8和加PolyA尾前向引物8

<400> 17

tcgactatcg catgctgga 19

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> piRNA-54265的茎环法前向引物9和加PolyA尾前向引物9

<400> 18

tcgactatcg catgctgg 18

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> piRNA-54265的茎环法前向引物10和加PolyA尾法前向引物10

<400> 19

tcgactatcg catgctg 17

<210> 20

<211> 16

<212> DNA

<213> piRNA-54265的茎环法前向引物11和加PolyA尾法前向引物11

<400> 20

tcgactatcg catgct 16

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> piRNA-54265加PolyA尾法反向引物1、2

<400> 21

gctgtcaacg atacgctacg taacg 25

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> cel-miR-39加PolyA尾法反向引物和piRNA-54265加PolyA尾法反向引物3、4、6、7、8、9、10、11、12

<400> 22

gctgtcaacg atacgctacg 20

<210> 23

<211> 15

<212> DNA

<213> piRNA-54265加PolyA尾法反向引物5

<400> 23

gctgtcaacg atacg 15

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> cel-miR-39的茎环法和加PolyA尾法前向引物

<400> 24

cggctcaccg ggtgtaaatc 20

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> cel-miR-39茎环法反向引物

<400> 25

caactgcgtg agcttgttac tc 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> piRNA-54265的茎环法前向引物12和加PolyA尾法前向引物12

<400> 26

cctggaggtg atgaactgtc tg 22

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> piRNA-54265茎环法探针

<400> 27

ccctatccaa ccatacagac ggtcagg 27

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> cel-miR-39茎环法探针

<400> 28

attttctcag cctccagagg atgttca 27

Claims

1.一种用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的piRNA-54265检测引物组合，其特征在于，包含有用于特异性检测piRNA-54265的引物对和探针；所述引物对为piRNA-54265茎环法PCR引物对，或piRNA-54265加PolyA尾法PCR引物对；

所述piRNA-54265茎环法PCR引物对的前向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.26和SEQID NO.9所示；

所述piRNA-54265加PolyA尾法PCR引物对的前向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.22所示；

所述探针的序列如SEQ ID NO.27所示。

2.根据权利要求1所述引物组合，其特征在于，还包括待测样本RNA逆转录引物。

3.根据权利要求2所述引物组合，其特征在于，piRNA-54265茎环法逆转录引物序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求2所述引物组合，其特征在于，piRNA-54265加PolyA尾法逆转录引物序列如SEQ ID NO.3-5所示。

5.一种用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的piRNA-54265检测试剂盒，其特征在于，包含有权利要求1-4任一所述引物组合。