CN105925681A - 一种用于肺癌筛查的组合物及其应用 - Google Patents

一种用于肺癌筛查的组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于肺癌筛查的组合物，所述组合物包含分别用于检测SHOX2基因、PTGE4基因和FOXL2基因中的每个基因的至少一个靶区域内甲基化程度的核酸序列；其中，所述靶区域为分别选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的连续的至少18个碱基长度的片段；所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域。本发明还提供了上述组合物在制备筛查肺癌的试剂中的应用，以及用于筛查肺癌的试剂盒。利用本发明的组合物可以通过综合SHOX2、PTGER4和FOXL2的甲基化检测结果来表明细胞增殖性异常的存在。

Description

一种用于肺癌筛查的组合物及其应用
技术领域
本发明涉及基因检测领域，尤其涉及基因标识物的筛选、基因标识物的组合应用和将该基因标识物组合在疾病的体外辅助诊断中的应用。
背景技术
癌症是一种因细胞增殖性异常而导致的疾病，同时也是一个主要的公共健康难题，根据国家癌症中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》显示，全国肿瘤登记地区恶性肿瘤发病第一位的是肺癌，其次为结直肠癌、肝癌和食管癌；死亡第一位的是肺癌，其次为肝癌、食管癌和结直肠癌。我国肺癌的发病率及死亡率已跃居各种肿瘤的首位，成为严重威胁人民健康的疾病之一。
肺癌发病隐匿，多数早期肺癌患者的癌灶未能及时被发现，大多肺癌病人被发现和确诊时疾病已进展为中晚期，失去手术或治疗的最佳机会，这也是肺癌死亡率高居不下的原因之一。尽管过去几十年中，肺癌的诊断、分期、外科手术治疗、研究方面取得了重大的进步，但是相比乳腺癌、结直肠癌以及前列腺癌，肺癌的五年生存率较低，始终保持在16％左右。肺癌患者往往处于晚期时才被发现和确诊，丧失了最佳的治疗时机。如果能早发现、早治疗，势必能有效的改善患者的预后，提高5年存活率、降低死亡率。但是与前列腺癌和乳腺癌相比，肺癌目前仍然缺乏理想的早期辅助诊断手段。
目前临床所使用的肺癌筛查诊断方法主要靠低剂量螺旋CT和胸部X射线影像资料检查，除此之外，还有其它多种辅助手段帮助支持肺癌的诊断，如纤维支气管镜、痰细胞学检查、肿瘤标志物检测等，但经长期研究发现，上述这些方法各有利弊，都分别存在费用高、投入大、并存在敏感度低、漏诊率高、假阳率高、不能早期诊断的局限性，有的还给患者造成痛苦和不便。因此，迫切需要敏感、特异的生物标记。
而随着生物科技的不断发展，利用基因检测来诊断疾病的方法受到了广泛的瞩目。其中DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，不仅在维持正常细胞功能，而且在癌症发生中也起着重要的作用，即甲基化状态的改变是引起癌症的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化程度降低和CpG岛局部甲基化程度的异常升高，从而导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率提高。因此，甲基化的研究，为癌症的早期预测、分类、分级及预后评估提供了新的依据，是目前的研究热点之一。
发明内容
基于上述背景技术，本发明的目的在于提供一种通过综合分析基因甲基化谱(methylome)数据，筛选适用于液相活检的癌症甲基化基因标识物，进而得到针对所述癌症甲基化基因标识物的用于肺癌筛查的组合物。
本发明提供了一种用于肺癌筛查的组合物，所述组合物包含分别用于检测SHOX2基因、PTGER4基因和FOXL2基因中的每个基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列；
其中，所述靶区域为分别选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQID NO:27中的连续的至少18个碱基长度的片段；
所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。
在根据本发明的一个实施方案中，所述核酸序列为引物和探针，其中，所述引物和探针具有以下特征：
1)可扩增人造的甲基化的所述靶区域，而不能扩增人造的非甲基化的所述靶区域；
2)在以正常的人白细胞中提取的DNA为模板时显示没有扩增，但在以人肺癌组织中提取的DNA为模板时显著扩增；
优选地，所述引物和探针还包括以下特征：
3)在以从正常人的血浆提取的DNA为模板时显示没有扩增，但在从肺癌病人的血浆提取的DNA为模板时显著扩增。
在根据本发明的一个实施方案中，检测SHOX2基因的引物和探针为组合1或组合2；
组合1
引物：SEQ ID No 1，
探针：SEQ ID No 2，
引物：SEQ ID No 3；
组合2
引物：SEQ ID No 4，
探针：SEQ ID No 5，
引物：SEQ ID No 6。
在根据本发明的一个实施方案中，检测PTGER4基因的引物和探针选自组合3、组合4和组合5中的一种；
组合3
引物：SEQ ID No 7，
探针：SEQ ID No 8，
引物：SEQ ID No 9；
组合4
引物：SEQ ID No 10，
探针：SEQ ID No 11，
引物：SEQ ID No 12；
组合5
引物：SEQ ID No 13，
探针：SEQ ID No 14，
引物：SEQ ID No 15。
在根据本发明的一个实施方案中，检测FOXL2基因的引物和探针为组合6或组合7；
组合6
引物：SEQ ID No 16，
探针：SEQ ID No 17，
引物：SEQ ID No 18；
组合7
引物：SEQ ID No 19，；
探针：SEQ ID No 20，
引物：SEQ ID No 21。
本发明还提供了上述组合物在制备用于检测肺癌的试剂中的应用。
本发明进一步提供了一种用于筛查肺癌的试剂盒，所述试剂盒包含上述组合物。
本发明进一步提供了一种用于上述试剂盒的样本处理方法，所述方法包括：
a)提供人源样本，所述人源样本选自细胞系、组织切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种；优选地选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种；
b)由步骤a)的样本中提取基因组DNA，并进行预处理使所述基因组DNA的5’位未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交上不同于胞嘧啶的另一碱基；
c)以步骤b)处理后的基因组DNA为模板，利用上述的组合物进行PCR扩增；优选地，在PCR扩增中以β肌动蛋白(ACTB)为内对照基因；更优选地，所述β肌动蛋白(ACTB)的引物和探针为：引物：SEQ ID NO:22，探针：SEQ ID NO:23，引物：SEQ ID NO:24。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤b)所述的预处理是通过亚硫酸氢盐试剂实现的；优选地，所述亚硫酸氢盐试剂与变性剂联用，所述变性剂为正烷基二醇，优选为二乙二醇二甲基醚(DME)、二噁烷或二噁烷衍生物；更优选地，所述亚硫酸氢盐试剂与清除剂联用，所述清除剂为色原烷衍生物，优选地选自6-羟基-2，5，7，8-四甲基色原烷2-羧酸，三羟基苯甲酸或其衍生物中的一种。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤c)所述的PCR扩增为实时PCR扩增；优选地，PCR反应混合物包括经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25-40ng和300-600nM引物、150-300nM探针、1UTaq聚合酶、50-400μM的各个dNTP、1至10mM的MgCl2和2×PCR缓冲至最终的2μl至100ul的体积；所述PCR的反应条件为：在85至99℃持续3-60分钟，然后在50～72℃进行1～30秒的35-55个循环，在45～80℃下退火5～90秒，在85～99℃下变性5～90秒。
另一方面，本发明具有以下有益效果：
本发明将SHOX2、PTGER4和FOXL2三个靶基因结合在一起进行肺癌筛查，通过将分别用于检测SHOX2、PTGER4和FOXL2基因及其片段的甲基化的核酸序列联合使用，使得肺癌检测的灵敏度和特异性，尤其是肺癌检测的灵敏度得到了显著提高，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。
具体而言，根据某些具体实施方式，SHOX2的灵敏度为75％，PTGER4的灵敏度为60％，FOXL2的灵敏度为50％，三个标志物多元检测时，灵敏度提高到了95％。并且，通过利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，能方便地实现针对SHOX2、PTGER4和FOXL2这三个生物标记物的同时间的三通道检测，并且能根据实时PCR的循环阈值(Ct)值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，提供了一种无创性的快速癌症的检测方法。
附图说明
图1显示使用甲基化和非甲基化DNA筛选SHOX2、PTGER4和FOXL2多组引物和探针组合的结果，所有组合均对甲基化DNA有正常扩增，对非甲基化DNA无扩增。
图2-1、2-2和2-3显示SHOX2、PTGER4和FOXL2多组引物和探针组合对肺癌、肠癌、胃癌和正常人的检测结果，所有引物和探针组合对肺癌DNA均能正常扩增，而对其他癌症和正常人无扩增。
图3-1、3-2和3-3显示SHOX2、PTGER4和FOXL2的甲基化DNA多元检测与单独检测时Ct的差异，三个标志物在多元检测时与单独检测无差异，基本一致。
图4-1、4-2和4-3分别为使用血浆检测SHOX2、PTGER4和FOXL2时的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非特别指明，本发明所使用的试剂和材料均可通过商业途径获得。
除非另有说明，本申请的实施将采用常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和基因学技术，其均在本领域常规技术手段的范围内。在文献中对此类技术进行了详细说明如MolecularCloning:A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait，1984版)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，1987版)；Methods in Enzymology丛书(美国学术出版社有限公司)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等，1987版，和定期更新)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等，1994版)。本申请中使用的引物、探针和试剂盒可以采用本领域公知的标准技术制备。
除非另有定义，本申请所使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。Singleton等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，第二版，J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)，和March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms andStructure，第四版，John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)，针对本申请中使用的多个术语为本领域技术人员提供了一般性的指导。
定义
本申请的“癌症”的含义包括任何恶性肿瘤(malignancy)、或恶性细胞分裂或恶性肿瘤(malignant tumour)，或具有不受控制的或不适当的细胞增殖的任何疾病状态，并且包括但不限于特征为不受控制的或不适当的细胞增殖的任何疾病。
本申请的“肺癌(lung cancer)”，是指肺部的恶性肿瘤，特征为肺部组织中的细胞不受控制地生长。肺癌包括小细胞肺癌(small-cell lung carcinoma，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)。
本申请的“肺癌细胞”表示具有肺癌特征的细胞，并且包括癌症前期细胞。
本申请的“癌症前期”表示处于转化为癌细胞的早期阶段或倾向于转化为癌细胞的细胞。这样的细胞可以表现出一种或多种具有癌细胞特征的表型性状。
本申请中的“生物标记物”指的是一种诸如基因的物质、与疾病相关的变量测定，可以作为那个疾病的指示因子或预测因子。疾病的存在或风险可以从生物标记物这个参数推断出来，不需要测定疾病本身。
本申请中的“核酸”、“核酸序列”等等，指的是聚核苷酸，可以是gDNA、cDNA或RNA，也可以是单链或双链的。术语也包括肽核酸(PNA)，或任何化学的DNA类或RNA类物质。“cDNA”指的是从天然生成的mRNA复制的DNA。“gDNA”指的是基因组DNA。也可以使这些物质的组合(即部分是gDNA和部分是cDNA的重组核酸)。
本申请中的“可操作地结合”、“可操作地连接”指的是功能上结合核酸序列。
本申请中的“严紧杂交条件”和“高度严紧”指的是探针与其靶子序列杂交的条件，典型的在核酸复杂的混合物中。严紧的条件是依赖于序列的，并且在不同的环境下是不同的。较长的序列在较高的温度中特异性的杂交。关于核酸杂交的详细的指导可以参考Tijssen，生物化学和分子生物学技术-核酸探针杂交，“杂交原理和核酸试验策略的回顾”。通常，严紧条件是在限定的离子强度pH下低于特定核酸的熔点(Tm)大约5-10℃。在Tm的温度(在所限定的离子强度，pH和核酸浓度)下，50％的和靶点互补的探针均衡地和靶点序列杂交。还可以通过增加去稳定剂来实现严紧条件。对于选择性或者特定的杂交，正信号为背景杂交的两倍，优选10倍。示例性的严紧杂交条件如下：在50％甲酰胺,5x SSC和1％的SDS的溶液中在42℃杂交，或者在5x SSC和1％的SDS的溶液中在65℃杂交，然后在0.2xSSC和0.1％SDS的溶液中在65℃洗涤。
并且，如果核酸所编码的多肽是实质性相似的话，即使不能在严紧条件下杂交的核酸仍然是实质性相似的。这种情况下，典型地，核酸在中等严紧杂交条件下进行杂交。作为示例的，“中等严紧杂交条件”包括在40％甲酰胺，1M的氯化钠和1％的SDS的溶液中在37℃杂交，并且在1xSSC的溶液中在45℃洗涤。本领域的普通技术人员可以很显然地在现有技术中获得对于取得获得相同的严紧度的条件的指导。对于PCR而言，36℃左右的温度典型地适用于低度严紧扩增，而基于引物的长度，退火温度的范围则在32℃至48℃之间。对于高度严紧的PCR扩增，一般是在62℃，而基于引物的长度和特异性，高度严紧杂交的退火温度的范围则在50℃至65℃之间。对于高度严紧和低度严紧扩增的循环条件，典型的，包括：在90-95℃下持续变性阶段30秒至2分钟，持续退火阶段30秒至2分钟，在约72℃下持续扩展阶段1至2分钟。关于低度和高度严紧扩增反应的工具和指导可以在现有技术中获得。
本申请中的“寡核苷酸”指由两个或者两个以上的核苷酸构成的分子，优选为由三个以上的核苷酸构成的分子，其精确大小可以依靠许多因素，这些因素反过来又是由寡核苷酸的最终功能和用途决定的。在某些具体实施方式中，寡核苷酸可以包括10个核苷酸至100个核苷酸的长度。在某些具体实施方式中，寡核苷酸可以包括10个核苷酸至30个核苷酸的长度，或者可以具有20和25个核苷酸的长度。在一些特定的具体实施方式中，短于这些长度的寡核苷酸也是合适的。
本申请的“引物”表示当置于能诱发与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，即在核苷酸和诸如DNA或RNA聚合酶的诱发剂的存在下并且在合适的温度和pH下，能够作为合成起始点的寡核苷酸，无论它是纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的。引物可以是单链或双链的，并且必须足够长而使其在诱发剂的存在下能引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源和所用的方法。例如，为了诊断和预后应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有至少或多于约10、或15、或20、或25或更多个核苷酸，但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。参与确定引物合适长度的因素是本领域技术人员熟知的。
本申请的“引物对”表示与靶DNA分子相反链杂交或与侧翼连接待扩增的核苷酸序列的靶DNA区域杂交的引物对。
本申请的“引物位点”表示引物杂交的靶DNA或其它核酸的区域。
本申请的“探针”，当涉及核酸序列时，以其通常含义使用，表示在规定条件下能与靶序列杂交并且可以用于检测该靶序列的存在的选择的核酸序列。本领域技术人员应当理解，在某些情况下，探针也可以用作引物，并且引物可以用作探针。
本申请的“DNA甲基化”是指甲基添加到胞嘧啶(C)的5位，这通常(但不必须)是在CpG(胞嘧啶之后为鸟嘌呤)二核苷酸的情况下。本文所用的“增加的甲基化程度”或“显著的甲基化程度”是指DNA序列中至少存在一个甲基化的胞嘧啶核苷酸，其中正常对照样品(例如从非癌细胞或组织样品提取的DNA样品或对DNA残基的甲基化进行处理的DNA样品)中对应的C是非甲基化的，在某些实施方案中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个C可以是甲基化的，其中对照DNA样品中的这些位置的C是非甲基化的。
在实施方案中，多种不同的方法可用于检测DNA甲基化改变。检测DNA甲基化的方法包括，例如，利用southern或聚合酶链反应(PCR)分析的甲基化敏感的限制性内切核酸酶(MSRE)测定、甲基化特异性或甲基化敏感的PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)、高分辨率熔解(HRM)分析、重亚硫酸盐测序、焦磷酸测序、甲基化特异性单链构象分析(MS-SSCA)、组合重亚硫酸盐限制分析(COBRA)、甲基化特异性变性梯度凝胶电泳(MS-DGGE)、甲基化特异性熔解曲线分析(MS-MCA)、甲基化特异性变性高效液相色谱(MS-DHPLC)、甲基化特异性微阵列(MSO)。这些测定可以是PCR分析、利用荧光标记的定量分析或southern印记分析。
本申请的“甲基化测定”指确定DNA序列内一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
本申请的“生物样品”或“样品”包括诸如活检和尸检样品的组织切片、和为了组织学目的而获取的冷冻切片、或任何这些样品的处理后形式。生物样品包括血液和血液组分或产物(例如血清、血浆、血小板、红细胞等)，痰液或唾液，淋巴和舌组织，诸如原代培养物、外植体和转化的细胞的培养的细胞，粪便，尿液，胃活检组织等。生物样品通常获自真核生物，所述真核生物可以是哺乳动物，可以是灵长类并且可以是人类个体。
本申请的“活检”是指为了诊断或预后评估取出组织样品的过程，并且也指组织样本自身。本领域已知的的任何活检技术可以用于本发明的诊断和预后方法。所用的活检技术取决于待评估的组织类型(例如舌、结肠、前列腺、肾、膀胱、淋巴结、肝、骨髓、血细胞、胃组织等)等因素。代表性的活检技术包括但不限于切除活检、切去活检、针吸活检、手术活检和骨髓活检，并且可以包括结肠镜检查。多种活检技术是本领域技术人员公知的，他们需要进行很少的实验便可以从这些技术中选择并使用。
本申请的“分离的”核酸分子表示从通常与该分离的核酸分子相关联的其它核酸分子中分离出的核酸分子。因此，“分离的”核酸分子包括但不限于这样的核酸分子：其不具有在分离的核酸来源于的生物体的基因组中天然地侧翼连接该核酸的一个或两个末端的序列(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶消化而产生的cDNA或基因组DNA片段)。通常将这样的分离的核酸分子引入载体(例如，克隆载体或表达载体)，以便于操控或产生融合核酸分子。此外，分离的核酸分子可以包括工程化的核酸分子，例如重组的或合成的核酸分子。存在于例如核酸文库(例如cDNA或基因组文库)或含有限制性消化的基因组DNA的凝胶(例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺)的一部分中的数百至数百万其它核酸分子中的核酸分子不被认为是分离的核酸。
本申请的“细胞”可以是分离的，可以被包含在细胞群体中，可以在培养物中，或可以被包含在活的个体中，并且可以是哺乳动物细胞，且可以是人的细胞。同样，“组织”可以包括任何数目的细胞，并且可以被包含在活的个体中或可以从其中被分离出。
本申请的“纯化的”或“基本纯化的”，当用来指核酸时，表示从它们的天然环境中分离出的核酸，使得它们占给定样品中全部核酸或有机化学物的至少约75％、80％、85％、90％或95％。本文中，可以通过琼脂糖凝胶和EtBr染色评估核酸纯度。
本申请的“检测”表示观察生物样品中的标志物或标志物改变(例如标志物甲基化状态的改变或核酸或蛋白序列的表达水平)的任何过程，无论实际上是否检测到标志物或标志物改变。换言之，探测样品的标志物或标志物改变的行为是“检测”，即使标志物被测定为不存在或低于灵敏度水平。检测可以是定量、半定量或非定量观察，并且可以基于与一个或多个对照样品的比较。应当理解，检测本文公开的肺癌包括检测癌症前期细胞，所述癌症前期细胞开始发展为肺癌细胞或将要发展为肺癌细胞，或具有增加的发展为肺癌细胞的倾向。检测肺癌还可以包括检测可能的死亡概率或疾病条件的可能的预后。
本申请的“同源性”、“同一性”和“相似性”表示2个核酸分子之间的序列相似性。可以比较每个序列中的位置来测定“同源性”、“同一性”或“相似性”，为了比较的目的可以将所述序列进行比对。当比较的序列中的等同位置被相同碱基占据时，所述分子在该位置是相同的；当等同位点被相同或相似氨基酸(例如，在空间性质或带电性质上相似)残基占据时，所述分子可以称为在该位置是同源的(相似的)。同源性/相似性或同一性百分比的表达是指比较的序列所共享的位置上相同或相似氨基酸的数量的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本发明的序列共享小于40％同一性，优选小于25％同一性。在比较2个序列时，残基(氨基酸或核酸)的缺失或多余残基的存在也降低同一性和同源性/相似性。在具体实施方案中，对于两个或更多个序列或子序列，按照使用具有下文所述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法进行测定或通过例如国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))在线提供的手动比对和肉眼检查进行测定，当在比较窗或指定区域上为最大对应性进行比较和比对时，如果它们的序列在规定的区域上同一性为约60％，或约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高，可以认为是基本或显著同源的、相似的或同一的。该定义也涉及或可以用于测试序列的互补物。因此，在本文背景允许的程度下，例如，如果核苷酸序列可以被预测为天然存在于DNA双链体中，或可以以互补链中的一条或两条的形式天然存在，则与规定靶序列或其变体互补的核苷酸序列自身被视为与靶序列是“相似的”，并且当涉及“相似的”核酸序列时，包括单链序列、其互补序列、双链的链复合物、能够编码相同或相似多肽产物的序列、以及上述任意一项的任何容许的变体。相似性必须限制为单一核酸链序列的分析的情况可以包括例如细胞中特定RNA序列或编码序列的表达的检测和定量。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。在实施方案中，同一性或相似性可以是在长度为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、10、21、22、23、24、25或更多核苷酸的区域上，或在长度为多于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或多于约100个核苷酸的区域上。
本申请的“扩增”表示由核酸的一个具体基因座得到多个拷贝的过程，所述核酸例如基因组DNA或cDNA。可以使用多种已知手段中的任何一种实现扩增，所述手段包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、基于转录的扩增和链置换扩增(SDA)。
本申请的“标准扩增条件”是指扩增反应混合物的基本组分和循环条件，所述循环条件包括模板核酸变性、寡核苷酸引物与模板核酸退火和通过聚合酶的引物延伸以产生扩增产物的多个循环。
本申请的“聚合酶链反应”或“PCR”表示这样的技术：变性、与引物的退火和与DNA聚合酶的延伸的循环被用于将靶DNA序列的拷贝数扩增至约106倍或更多。用于扩增核酸的聚合酶链反应过程可参见申请号分别为4,683,195和4,683,202的美国专利。
本申请的“基于荧光的实时PCR”表示这样的方法：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在该PCR技术中，有一个很重要的概念，循环阈值，也称为Ct值。C代表Cycle，t代表threshold(阈值，临界值)，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。例如，荧光阈值(threshold)的设定方法如下：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省(默认)设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
本申请的“实时PCR的cut off值”表示针对某一个生物标记物的判断样本阴阳性的一个临界Ct值。根据本申请的某些具体实时方式，“临界Ct值(Cut Off值)是根据一定数量的样本数据，基于统计学处理而得到的”，该临界Ct值可以根据所需要的灵敏度或特异性的要求不同而不同。在概述中，将对于该临界Ct值做进一步的举例说明。
本申请的“灵敏度”表示从一定癌症样本中检测出癌症的比例，其计算公式为：灵敏度＝(检测到的癌症/所有的癌症)，而“特异性”表示一定正常人样本中检测出正常的比例，其计算公式为特异性＝(未检测到的阴性/总的阴性)。
本申请的“标记”或“可检测的部分”是可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组分。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛或半抗原和可以被制备为可检测的蛋白，例如，通过将放射性标记并入肽或用于检测与肽特异性反应的抗体。
可以使用多种不同方法检测核酸分子。核酸检测方法包括，例如，PCR和核酸杂交(例如，Southern印迹、Northern印迹或原位杂交)。具体而言，能够扩增靶核酸的寡核苷酸(例如，寡核苷酸引物)可以用于PCR反应。PCR方法通常包括以下步骤：获得样品、从所述样品分离核酸(例如，DNA、RNA或两者)和使所述核酸与一种或多种寡核苷酸引物接触，所述引物在能使模板核酸扩增发生的条件下特异性地与模板核酸杂交。在模板核酸的存在下，产生扩增产物。核酸扩增和扩增产物检测的条件是本领域技术人员已知的。已开发出多种对于基础PCR技术的改进，包括但不限于，锚定PCR、RACE PCR、RT-PCR和连接酶链式反应(LCR)。扩增反应中的引物对必须与模板核酸的相对链退火，并且应该彼此保持合适的距离，使得聚合酶能有效地跨过区域进行聚合并使得可以例如使用电泳来容易地检测扩增产物。例如，可以使用诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，Colo.)的计算机程序来设计寡核苷酸引物，以助于设计具有相似熔解温度的引物。通常，寡核苷酸引物长度为10-30或40或50个核苷酸(例如，长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)，但是寡核苷酸引物可以更长或更短，只要使用合适的扩增条件。
通常使用可检测的标记实现扩增产物或杂交复合物的检测。术语“标记”，当涉及核酸时，意图包括通过将可检测的物质偶联(即，物理连接)至核酸的核酸直接标记，以及通过与直接标记了可检测的物质的另一试剂进行反应的核酸间接标记。可检测的物质包括各种酶、辅基、荧光材料、冷光材料、生物冷光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生物素蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯代三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；冷光材料的实例包括鲁米诺；生物冷光材料的实例包括荧光素酶、虫荧光素和水母蛋白。间接标记的实例包括用生物素将核酸进行末端标记，使得可以用荧光标记的抗生物素蛋白链菌素检测该核酸。
概述
本申请提供了一种通过同时检测SHOX2、PTGER4和FOXL2基因来对肺癌进行筛查的方法以及相应的组合物、试剂盒以及核酸序列，从而以非侵入性地方式、高效灵敏地诊断和检测癌症。通过具体实施方式可以发现在癌症中，尤其是肺癌中，SHOX2、PTGER4和FOXL2的联合使用很大程度地提高了检测的灵敏度或特异性。
下述为本申请的组合物、试剂盒、核酸序列以及检测方法的具体实施方案。可以理解，考虑到上文所提供的一般性描述，可以实施多种其他的实施方式。
在第一组实施方案中，公开了对生物样品中的细胞增殖性异常进行诊断或检测的组合物，所述组合物包括用于检测SHOX2、PTGER4和FOXL2基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度的核酸。具体而言，所述组合物不仅包括用于检测SHOX2基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度的核酸序列，还包括用于检测PTGER4和FOXL2基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度的核酸序列。
人类SHOX2基因，正人矮小同源盒基因，是同源盒基因家族的一员，其基因表达调控与器官发育密切相关。研究发现，SHOX2基因在胚胎时期表达于中胚层和外胚层，对骨骼、心脏和神经系统的发育起到重要作用，另外，SHOX2基因甲基化与肺癌高度相关。例如，SEQ ID No：25提供了SHOX2的富含CpG的启动子区域的序列。
用于检测SHOX2基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度的核酸序列包括：等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ IDNO：25的连续序列的至少18个碱基长片段。
根据某些优选实施方式，可以基于SEQ ID No：25的序列，设计引物和探针。其中适用于作为PCR扩增的引物和探针的序列，可以包括任何合适的长度，例如可以包括至少18个的核苷酸，或者可以包括至少20,25,30,35,40,45个或者多于50个的核苷酸。在这些具体实施方式中，核酸序列可以和SEQ ID NO:25的序列或者其互补序列具有约95％,96％,97％,98％或99％的相似性。
PTGER4，前列腺素E受体4基因，其编码的蛋白是G蛋白偶联受体家族的一个成员，已被证明可调控PGE2诱导的早期生长反应因子1(EGR1)，调节环氧合酶-2mRNA的水平和稳定性，导致糖原合成酶激酶磷酸化。用于检测PTGER4基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度的核酸序列可以包括：等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于由如下所示的PTGER4的启动子区域SEQ ID No：26的至少18个核苷酸及其互补序列。
根据某些优选实施方式，可以基于SEQ ID No：26的序列，设计引物和探针。其中适用于作为PCR扩增的引物和探针的序列，可以包括任何合适的长度，例如可以包括至少18个的核苷酸，或者可以包括至少20,25,30,35,40,45个或者多于50个的核苷酸。在这些具体实施方式中，核酸序列可以和SEQ ID NO:26的序列或者其互补序列具有约95％,96％,97％,98％或99％的相似性。
FOXL2，位于3q23区域。用于检测FOXL2基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度的核酸序列可以包括：等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于由如下所示的FOXL2的启动子区域SEQ ID No：27的至少18个核苷酸及其互补序列。
根据某些优选实施方式，可以基于SEQ ID No：27的序列，设计引物和探针。其中适用于作为PCR扩增的引物和探针的序列，可以包括任何合适的长度，例如可以包括至少18个的核苷酸，或者可以包括至少20,25,30,35,40,45个或者多于50个的核苷酸。在这些具体实施方式中，核酸序列可以和SEQ ID NO:27的序列或者其互补序列具有约95％,96％,97％,98％或99％的相似性。
因此，可以设计TaqMan探针和引物用于检测SHOX2、PTGER4和FOXL2基因启动子区域的DNA甲基化，优选检测的启动子区域如分别以SEQ ID No：25、SEQ ID NO:26、SEQ ID No：27为靶点区域设计用于检测SHOX2、PTGER4和FOXL2基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度的引物和探针。所以，根据申请，可以设计很多套探针和引物的组合，而每一套探针和引物的组合的性能可能存在差别。所以，为了筛选高效的引物和探针，本申请通过以下步骤利用人造甲基化模板和非甲基化模板，以及癌症(例如肺癌)和正常DNA做模板，对所设计的多套探针和引物组合进行了筛选：
1.设计SHOX2、PTGER4和FOXL2基因启动子区域的引物和探针。
2.设计人造甲基化DNA和非甲基化DNA。
3.利用人造甲基化DNA和非甲基化DNA筛选引物和探针，人造甲基化DNA有扩增，人造非甲基化没有显示扩增。
4.利用从健康的人白细胞DNA中提取的DNA筛选引物和探针。
5.如果在健康的人白细胞DNA中没有扩增或扩增很少，那么利用从人肺癌组织中提取的DNA筛选引物和探针。
6.从临床研究阶段正常血浆中提取的DNA筛选引物和探针。
7.如果在临床研究阶段正常血浆中没有扩增或扩增很少，那么利用从肺癌病人中提取的DNA筛选引物和探针。
通过上述筛选，构建了以下序列SEQ ID NO:1-21作为引物和探针：
引物：SEQ ID No 1(SF1)5'-TTCCGCCTCCTACCTTCT-3'
探针：SEQ ID No 2(SP1)5'-FAM-CCCGACTTAAACGACGAACC-TAMRA-3'
引物：SEQ ID No 3(SR1)5'-CGTTTACGTTATGTTGGTTG-3'
引物：SEQ ID No 4(SF2)5'-ACGCCTATACTCGTACGAC-3'
探针：SEQ ID No 5(SP2)5'-FAM-CGATCGAACAAACGAAACGA-TAMRA-3'
引物：SEQ ID No 6(SR2)5'-GGGTTAAATTTTGTATAAGGTT-3'
引物：SEQ ID No 7(TF1)5'-TATATTTCGAGCGGTAGGTA-3'
探针：SEQ ID No 8(TP1)5'-JOE-CGAGGCGGAAACGGTCGT-BHQ1-3’
引物：SEQ ID No 9(TR1)5'-TCCTAAACTCGACTTCCAAT-3'
引物：SEQ ID No 10(TF2)5'-TTGGAAGTCGAGTTTAGGAG-3'
探针：SEQ ID No 11(TP2)5'-JOE-CGGTTAAGCGGTCGTCGG-BHQ1-3’
引物：SEQ ID No 12(TR2)5'-CGTAATTTTCACGCCCTC-3'
引物：SEQ ID No 13(TF3)5'-GCGGTAGTCGTAAATTTTAGTAG-3'
探针：SEQ ID No 14(TP3)5'-JOE-CGTTCGTGTTGTTCGTGGTTG-BHQ1-3’
引物：SEQ ID No 15(TR3)5'-CCAACTCTAACTACCCTCCG-3'
引物：SEQ ID No 16(FF1)5'-GTCGGTTTCGGGTTATAAG-3'
探针：SEQ ID No 17(FP1)5'-NED-CGTTTAGGTCGGTCGTTGTCG-MGB-3’
引物：SEQ ID No 18(FR1)5'-TTCAAACCTCCTACTTCTCC-3'
引物：SEQ ID No 19(FF2)5'-GGATTGTACGGTAGTCGG-3'
探针：SEQ ID No 20(FP2)5'-NED-CGCGGAGAGCGAGCGTAT-MGB-3’
引物：SEQ ID No 21(FR2)5'-GCAAACCTCTTAACCTTCTC-3'
进一步，申请人根据所筛选的上述引物和探针，设计了至少一个的引物和探针组合，其中优选为以下7个组合：
A、引物和探针组合1(扩增甲基化SHOX2基因)
引物：SEQ ID No 1(SF1)5'-TTCCGCCTCCTACCTTCT-3'
探针：SEQ ID No 2(SP1)5'-FAM-CCCGACTTAAACGACGAACC-TAMRA-3'
引物：SEQ ID No 3(SR1)5'-CGTTTACGTTATGTTGGTTG-3'
B、引物和探针组合2(扩增甲基化SHOX2基因)
引物：SEQ ID No 4(SF2)5'-ACGCCTATACTCGTACGAC-3'
探针：SEQ ID No 5(SP2)5'-FAM-CGATCGAACAAACGAAACGA-TAMRA-3'
引物：SEQ ID No 6(SR2)5'-GGGTTAAATTTTGTATAAGGTT-3'
C、引物和探针组合3(扩增甲基化PTGER4基因)
引物：SEQ ID No 7(TF1)5'-TATATTTCGAGCGGTAGGTA-3'
探针：SEQ ID No 8(TP1)5'-JOE-CGAGGCGGAAACGGTCGT-BHQ1-3’
引物：SEQ ID No 9(TR1)5'-TCCTAAACTCGACTTCCAAT-3'
D、引物和探针组合4(扩增甲基化PTGER4基因)
引物：SEQ ID No 10(TF2)5'-TTGGAAGTCGAGTTTAGGAG-3'
探针：SEQ ID No 11(TP2)5'-JOE-CGGTTAAGCGGTCGTCGG-BHQ1-3’
引物：SEQ ID No 12(TR2)5'-CGTAATTTTCACGCCCTC-3'
E、引物和探针组合5(扩增甲基化PTGER4基因)
引物：SEQ ID No 13(TF3)5'-GCGGTAGTCGTAAATTTTAGTAG-3'
探针：SEQ ID No 14(TP3)5'-JOE-CGTTCGTGTTGTTCGTGGTTG-BHQ1-3’
引物：SEQ ID No 15(TR3)5'-CCAACTCTAACTACCCTCCG-3'
F、引物和探针组合6(扩增甲基化FOXL2基因)
引物：SEQ ID No 16(FF1)5'-GTCGGTTTCGGGTTATAAG-3'
探针：SEQ ID No 17(FP1)5'-NED-CGTTTAGGTCGGTCGTTGTCG-MGB-3’
引物：SEQ ID No 18(FR1)5'-TTCAAACCTCCTACTTCTCC-3'
G、引物和探针组合7(扩增甲基化FOXL2基因)
引物：SEQ ID No 19(FF2)5'-GGATTGTACGGTAGTCGG-3'
探针：SEQ ID No 20(FP2)5'-NED-CGCGGAGAGCGAGCGTAT-MGB-3’
引物：SEQ ID No 21(FR2)5'-GCAAACCTCTTAACCTTCTC-3'
在某些具体实施方式中，所述组合物还包括将基因的未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。例如，该试剂可以是亚硫酸氢盐。
在某些具体实施方式中，所述细胞增殖性异常为癌症。例如，所述细胞增殖性异常为肺癌。首先，本申请的用于联合测定的多元基因组合物可以适用于包括肝癌、肺癌、结肠癌、血癌的各类癌症，但是其在肺癌诊断和检测上的效果特别好。例如在一个示例性实施例中，可以使用上述引物和探针组合1、3、7作为肺癌检测的引物和探针，从而可以在把肺癌从正常人中区分出来时取得95％的灵敏度。
在第二组实施方案中，公开了一种检测个体中细胞增殖性异常的方法，包括：确定分离自所述个体的生物样品中SHOX2、PTGER4和FOXL2基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度，以通过综合SHOX2、PTGER4和FOXL2的甲基化检测结果来表明细胞增殖性异常的存在。
典型地，根据本申请的方法还包括使用试剂以将基因的5’位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的步骤。
DNA的亚硫酸氢盐修饰为已知的用于评估CpG甲基化状态的工具。在真核细胞的DNA中，5-甲基胞嘧啶是最常见的共价碱基修饰。其例如在调节转录、遗传印迹以及肿瘤发生中起作用。因此确认5-甲基胞嘧啶作为遗传信息组分有相当大的意义。但是，5-甲基胞嘧啶不能通过测序来鉴定，因为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶有相同的碱基配对行为。此外，例如在PCR扩增过程中，5-甲基胞嘧啶携带的表观遗传信息则完全丢失。
最常用于分析DNA中5-甲基胞嘧啶存在的方法是基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异反应，由此在随后的碱性水解后，胞嘧啶被转变为在配对行为上对应胸腺嘧啶的尿嘧啶。但重要的是，在这些条件下5-甲基胞嘧啶保持不被修饰。结果，原始的DNA以此方式被转变，使得原来在其杂交行为上不能与胞嘧啶区分开的甲基胞嘧啶现在可作为仅剩的胞嘧啶被常规的已知分子生物学技术检测到，例如通过扩增和杂交。所有这些技术都基于不同的碱基配对特性，现在可被充分利用了。
因此，典型地，本申请提供了亚硫酸氢盐技术与一种或多种甲基化测定的联合使用，用于确定SHOX2、PTGER4和FOXL2基因序列内的CpG二核苷酸序列的甲基化状态。基因组CpG二核苷酸可被甲基化或未被甲基化(或者分别称为上和下甲基化(up-and down-methylated))。但是，本发明的方法适于分析异质的生物样品，例如血液或粪便中的低浓度肿瘤细胞。因此，当分析这种样品中CpG位置的甲基化状态时，本领域技术人员可以使用定量测定法来确定特定CpG位置处的甲基化水平(例如百分比、份数、比率、比例或程度)，而不是甲基化状态。相应地，术语甲基化状况或甲基化状态还应被认为是指反映CpG位置处甲基化程度的值。除非有明确说明，术语“超甲基化”或“上甲基化”应被认为是指甲基化水平超过特定的临界值，其中所述的临界值可以是代表给定群体的平均或中值甲基化水平的值，或优选为优化的临界水平。在本文中“临界”也可指“阈值”。在本发明的上下文中，对于在选自以下序列的基因或基因组序列内的或与其有关的(例如在启动子或调节区内)所有CpG位置来说，术语“甲基化的”、“超甲基化的”或“上甲基化的”应被认为是包括甲基化水平高于临界值零(0)％(或其等同值)甲基化，所述序列为上述的SHOX2、PTGER4和FOXL2基因序列。
在某些实施方式中，本申请的方法具体包括：使所述经试剂处理的SHOX2、PTGER4和FOXL2基因或其片段与扩增酶和引物接触，使得所述经处理的基因或片段被扩增以产生扩增产物或不被扩增；用探针检测扩增产物；以及基于所述扩增物是否存在，确定SHOX2、PTGER4和FOXL2的基因DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化程度。
并且，典型地，所述接触或扩增包括适用至少一种选自如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶；使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶；使用聚合酶链式反应(PCR)；产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。
即，优选地用PCR方式来测定甲基化程度，诸如“基于荧光的实时PCR技术”(Eads等人，Cancer Res.59：2302-2306，1999)、Ms-SNuPE TM(甲基化敏感的单核苷酸引物延伸)反应(Gonzalgo&Jones，Nucleic AcidsRes.25：2529-2531，1997)、甲基化特异性PCR(“MSP”；Herman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9821-9826，1996；美国专利5,786,146)以及甲基化的CpG岛扩增(“MCA”；Toyota等人，Cancer Res.59：2307-12，1999)等测定方法被用于测定SHOX2、PTGER4和FOXL2的基因DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化程度。
其中，“基于荧光的实时PCR”测定为高通量定量甲基化测定，其使用基于荧光的实时PCR(TaqMan_)技术，在PCR步骤后不需要进一步的操作(Eads等人，Cancer Res.59：2302-2306，1999)。简言之，“基于荧光的实时PCR”方法以基因组DNA的混合样品开始，该混合样品根据标准操作(亚硫酸氢盐过程将未甲基化的胞嘧啶残基转变成尿嘧啶)在亚硫酸氢钠反应中被转变为甲基化依赖的序列差异的混合池。随后在“偏移的(biased)”反应(采用重叠已知CpG二核苷酸的PCR引物)中进行基于荧光的PCR。可在扩增过程水平以及在荧光检测过程水平上产生序列差别。
“基于荧光的实时PCR”测定可以用作基因组DNA样品中甲基化模式的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平上。在该定量方式中，在重叠特定的推定甲基化位点的荧光探针存在下，PCR反应提供了甲基化特异的扩增。用于输入DNA量的无偏移对照由以下反应提供：其中引物和探针都不覆盖任何CpG二核苷酸。“基于荧光的实时PCR”方法可与任何适合的探针一起使用，如“TaqMan”、“Lightcycler”等等。
TaqMan_探针为荧光“报道物”和“淬灭”分子双标记的，并被设计为特异于相对高GC含量区，以至于其在PCR循环中以比正向或反向引物的熔解温度高约10℃的温度熔解。这使得TaqMan_探针在PCR退火/延伸步骤中保持充分杂交。当Taq聚合酶在PCR中酶合成新链时，其最终会遇到退火的TaqMan_探针。Taq聚合酶5’至3’内切酶活性随后将通过消化TaqMan_探针而顶替它，从而释放荧光报道物分子用于采用实时荧光检测系统定量检测其现在未被淬灭的信号。
用于“基于荧光的实时PCR”分析的典型试剂(例如，可以在基于“基于荧光的实时PCR”的试剂盒中找到的)可以包括，但不限于：用于特定基因(或亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物；TaqMan_探针或Lightcycler_探针；优化的PCR缓冲液以及脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。
并且，具体而言，在优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
在第一步中，获得待分析的组织样品。该来源可以是任何适合的来源，例如细胞系、组织学切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液分离的细胞及其所有可能的组合。优选地，DNA的所述来源为粪便或体液，选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、分离自血液的细胞。
然后从所述样品分离基因组DNA。可通过现有技术中的任何标准手段来分离，包括使用可商购的试剂盒。简言之，当目的DNA被包裹在细胞膜中时，该生物样品必须被破碎并通过酶、化学或机械手段被裂解。随后例如通过蛋白激酶K的消化而清除蛋白和其它的污染物。接着从溶液回收基因组DNA。这可以通过各种方法来实现，包括盐析、有机提取或将DNA结合到固相支持物。对方法的选择会受到多种因素的影响，包括时间、费用和所需的DNA的量。
当所述样品DNA未被包裹在细胞膜中时(例如来自血液样品的循环DNA)，可以使用现有技术中分离和/或纯化DNA的标准方法。这些方法包括使用蛋白降解试剂，例如离液盐，如盐酸胍或脲；或去污剂，如十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化氰。其它方法包括但不限于乙醇沉淀或丙醇沉淀、通过离心的真空浓缩等。本领域技术人员也可以利用装置，例如诸如超滤的滤器，硅表面或膜，磁性颗粒，聚苯乙烯颗粒，聚苯乙烯表面，带正电荷的表面以及带阳性电荷的膜，带电膜，带电表面，带电转换膜，带电转换表面。
一旦核酸被提取，就将基因组双链DNA用于分析。
在所述方法的第二步中，将所述基因组DNA样品处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不同于胞嘧啶的另一碱基。这应被理解为本文所述的“预处理”或“处理”。
这优选通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现。术语“亚硫酸氢盐试剂”指包括亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐(disulfite)、酸式亚硫酸盐或其组合的试剂，如这里所公开的可用于区分甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列。所述处理在本领域中是已知的(例如PCT/EP2004/011715，通过参考将其整体并入本文)。优选地，该亚硫酸氢盐处理在变性溶剂存在下进行，所述变性溶剂诸如但不限于正烷基二醇，尤其是二乙二醇二甲基醚(DME)，或者在二噁烷或二噁烷衍生物存在下进行。在优选的实施方案中，所述变性溶剂以1％至35％(v/v)的浓度使用。还优选该亚硫酸氢盐反应在清除剂存在下进行，例如但不限于色原烷衍生物，如6-羟基-2，5，7，8，-四甲基色原烷2-羧酸或三羟基苯甲酸及其衍生物，例如没食子酸(参见：PCT/EP2004/011715，将其整体通过参考并入本文)。该亚硫酸氢盐转变优选在30℃至70℃的反应温度下进行，其中在反应期间温度短时间地增加至超过85℃(参见：PCT/EP2004/011715，将其整体通过参考并入本文)。经亚硫酸氢盐处理的DNA优选在定量之前进行纯化。这可通过任何现有技术中已知的方法来进行，例如但不限于超滤，优选通过Microcon^(TM)柱(由Millipore^(TM)生产)进行。
在所述方法的第三步中，采用本发明的引物寡核苷酸以及扩增酶扩增经处理的DNA的片段。可在同一个反应容器中同时进行几种DNA片段的扩增。通常，该扩增反应采用聚合酶链式反应(PCR)进行。优选地，所述扩增产物的长度为100至2,000个碱基对。
对于内对照基因的检测，β肌动蛋白(ACTB)的引物和探针，例如：
引物：SEQ ID No 22(AF1)5'-GGTGATGGAGGAGGTTTAGTA-3'；
探针：SEQ ID No 23(AP1)5'-ROX-CCACCACCCAACACACAATAACAAAC-BHQ2-3’；
引物：SEQ ID No 24(AR1)5'-CCAATAAAACCTACTCCTCCCTT-3'。
对于SHOX2基因及其片段的甲基化的检测，利用针对SHOX2的经上述筛选方法所筛选的引物和探针。例如，在一个优选实施方式中，可以利用上述的引物和探针组合1、2中的任何一种组合。
对于PTGER4基因及其片段的甲基化的检测，利用针对PTGER4的经上述筛选方法所筛选的引物和探针。例如，在一个优选实施方式中，可以利用上述的引物和探针组合3、4、5中的任何一种组合。
对于FOXL2基因及其片段的甲基化的检测，利用针对FOXL2的经上述筛选方法所筛选6、7中的任何一种组合。
通过扩增获得的片段可携带有可直接或间接地检测的标记物。优选的是，标记物为荧光标记物、放射性核素或可附着的分子片段的形式。
在所述方法的第四步中，分析在所述方法的第三步中获得的扩增产物，以便确定处理之前CpG二核苷酸的甲基化状态。
在第四步中，对扩增产物的检测是通过实时检测探针来进行。在本发明中，可以利用各种商业用实时PCR仪器设备上根据现有技术的标准操作进行实时PCR的检测。根据某些具体实施方式，在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR的检测。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25-40ng和300-600nM引物、150-300nM探针、1UTaq聚合酶、50-400uM的各个dNTP、1至10mM的MgCl2和2XPCR缓冲至最终的2ul至100ul的体积。在85至99℃持续3-60分钟，以用预循环扩增样品，紧接着在50至72℃进行1至30秒的35-55个循环的退火，在45至80℃下退火5至90秒，在85至99℃下变性5至90秒。
通过仅仅在甲基化的SHOX2基因和PTGER4基因片段上观测扩增，用与含5-甲基胞嘧啶的SHOX2、PTGER4和FOXL2启动子区域的特异性的探针检测所述基因片段。并且，在某些具体实施方式中，以β肌动蛋白作为PCR的内参，通过使用与β肌动蛋白序列互补的引物来创建β肌动蛋白扩增子，并且用特定的探针检测β肌动蛋白扩增子。每个样品进行至少一次的实时PCR，在某些具体实施方式中，进行一到三次实时PCR检测。
在所述方法的第五步中，分别体现所述SHOX2、PTGER4和FOXL2的基因DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定，然后进一步包括以下步骤：A)比较所测样本的SHOX2所对应的PCR Ct值与SHOX2的预先设定的cut值(即临界Ct值)，从而确定基于SHOX2基因的分析结果是否为阳性；B)比较所测样本的PTGER4所对应的PCR Ct值与PTGER4的预先设定的cut值，从而确定基于PTGER4基因的分析结果是否为阳性；C)比较所测样本的FOXL2所对应的PCR Ct值与FOXL2的预先设定的cut值，从而确定基于FOXL2基因的分析结果是否为阳性；D)综合所述A)、B)和C)步骤的结果确定所述样本的最终分析结果是否为阳性。
根据本申请的具体实施方式，基于一定数量的肺癌样本和正常样本的SHOX2、PTGER4和FOXL2的平均Ct值，确定相对于SHOX2、PTGER4和FOXL2的肺癌和正常的临界Ct值。SHOX2、PTGER4和FOXL2的临界Ct值是基于一定数量的肺癌样本和正常样本的上述三个基因的Ct值制作的ROC曲线确定的。
并且，本申请还允许使用不同的方法学来分析Ct值。例如，使用ΔCt或dCT，肌动蛋白Ct作为PCR内部对照，SHOX2Ct减去肌动蛋白Ct得到SHOX2的dCT值。相似地，PTGER4Ct减去肌动蛋白Ct得到PTGER4的dCT值。相应地，如果采用ΔCt或dCT作为检测标准，那么在所述方法的第五步中，分别体现所述SHOX2、PTGER4和FOXL2的基因DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定，然后进一步包括以下步骤：A)比较所测样本的SHOX2所对应的PCRΔCt值与SHOX2的预先设定的Δcut值(即临界Ct值)，从而确定基于SHOX2基因的分析结果是否为阳性；B)比较所测样本的PTGER4所对应的PCRΔCt值与PTGER4的预先设定的Δcut值，从而确定基于PTGER4基因的分析结果是否为阳性；C)比较所测样本的FOXL2所对应的PCRΔCt值与FOXL2的预先设定的Δcut值，从而确定基于FOXL2基因的分析结果是否为阳性；D)综合所述A)、B)和C)步骤的结果确定所述样本的最综分析结果是否为阳性。
进一步，对于在本申请上文描述的或建议的用途，在第三组实施方案中，公开了一种用于检测个体中细胞增殖性异常的试剂盒，其包括用于检测SHOX2、PTGER4和FOXL2基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度的核酸，以通过综合SHOX2、PTGER4和FOXL2的甲基化检测结果来表明细胞增殖性异常的存在。
所述试剂盒包括在第一组实施方案中公开的对生物样品中的细胞增殖性异常进行诊断或检测的组合物。对于该组合物的描述和第一组实施方案类似，在此不再重复。
此类试剂盒可以包括被分隔成用于密封收纳一个或多个容器如小瓶、小管等的载体，每个容器均包括将在所述方法中使用的一个独立元件。例如，其中一个容器可以包括探针，其是或者可能是可检测标记的。
典型地，本申请的试剂盒将包括用于容纳患者生物样品的容器和或使用和解释试剂盒结果的说明，具体而言，本申请的试剂盒包括从商业和用户的角度看所需的材料，包括用于容纳患者生物样品的容器、缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和插入包装中的使用说明书。可以在容器上使用标签，以便说明所述组分用于特定的治疗或非治疗应用，并且还可以说明是在体内或体外使用，如上文所述的那些。
本申请的试剂盒具有多种实施方式。一个典型的实施方式是试剂盒，其包括容器、在所述容器上的标签和在所述容器内的组分；其中所述组分包括用于检测SHOX2、PTGER4和FOXL2基因及其片段中至少一个靶区域内甲基化程度的核酸，在所述容器上的标签表明可以使用所述组分评估样品的DNA甲基化程度，并对如何使用本试剂盒进行说明。该试剂盒可以进一步包括一组说明和用于制备组织样品和将本申请的组合物应用于样品的材料。该试剂盒可以包括用于将基因的未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂，例如亚硫酸氢盐。
综上所述，本申请通过以上所述的组合物、核酸序列、试剂盒及其用途，以及上述检测方法，通过联合利用分别用于检测SHOX2、PTGER4和FOXL2基因及其片段的甲基化的核酸序列，使得癌症检测的灵敏度和特异性，尤其是肺癌检测的灵敏度和特异性得到了提高，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。
实施例1 引物和探针筛选
对于SHOX2、PTGER4和FOXL2三个基因，可以设计很多套探针和引物的组合，而每一套探针和引物的组合的性能可能存在差别。所以在以下实施例中对于探针和引物进行了筛选。
在本实施例中，先用人造甲基化模板和非甲基化模板对SHOX2、PTGER4和FOXL2的引物和探针进行了筛选。本实施例包括以下步骤：
首先，设计SHOX2、PTGER4和FOXL2的各种引物和探针，只要其能等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID No：25、SEQID No：26和SEQ ID No：27的至少18个核苷酸及其互补序列。
然后，用人造甲基化的寡核苷酸序列和人造非甲基化的寡核苷酸序列作为模板，使用不同的探针和引物组合进行PCR扩增。其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30ul的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。
最后，通过PCR试验结果，筛选出以下5套合适的引物和探针：
引物和探针组合1(扩增甲基化SHOX2基因)
引物：SEQ ID No 1(SF1)5'-TTCCGCCTCCTACCTTCT-3'
探针：SEQ ID No 2(SP1)5'-FAM-CCCGACTTAAACGACGAACC-TAMRA-3'
引物：SEQ ID No 3(SR1)5'-CGTTTACGTTATGTTGGTTG-3'
引物和探针组合2(扩增甲基化SHOX2基因)
引物：SEQ ID No 4(SF2)5'-ACGCCTATACTCGTACGAC-3'
探针：SEQ ID No 5(SP2)5'-FAM-CGATCGAACAAACGAAACGA-TAMRA-3'
引物：SEQ ID No 6(SR2)5'-GGGTTAAATTTTGTATAAGGTT-3'
引物和探针组合3(扩增甲基化PTGER4基因)
引物：SEQ ID No 7(TF1)5'-TATATTTCGAGCGGTAGGTA-3'
探针：SEQ ID No 8(TP1)5'-JOE-CGAGGCGGAAACGGTCGT-BHQ1-3’
引物：SEQ ID No 9(TR1)5'-TCCTAAACTCGACTTCCAAT-3'
引物和探针组合4(扩增甲基化PTGER4基因)
引物：SEQ ID No 10(TF2)5'-TTGGAAGTCGAGTTTAGGAG-3'
探针：SEQ ID No 11(TP2)5'-JOE-CGGTTAAGCGGTCGTCGG-BHQ1-3’
引物：SEQ ID No 12(TR2)5'-CGTAATTTTCACGCCCTC-3'
引物和探针组合5(扩增甲基化PTGER4基因)
引物：SEQ ID No 13(TF3)5'-GCGGTAGTCGTAAATTTTAGTAG-3'
探针：SEQ ID No 14(TP3)5'-JOE-CGTTCGTGTTGTTCGTGGTTG-BHQ1-3’
引物：SEQ ID No 15(TR3)5'-CCAACTCTAACTACCCTCCG-3'
引物和探针组合6(扩增甲基化FOXL2基因)
引物：SEQ ID No 16(FF1)5'-GTCGGTTTCGGGTTATAAG-3'
探针：SEQ ID No 17(FP1)5'-NED-CGTTTAGGTCGGTCGTTGTCG-MGB-3’
引物：SEQ ID No 18(FR1)5'-TTCAAACCTCCTACTTCTCC-3'
引物和探针组合7(扩增甲基化FOXL2基因)
引物：SEQ ID No 19(FF2)5'-GGATTGTACGGTAGTCGG-3'
探针：SEQ ID No 20(FP2)5'-NED-CGCGGAGAGCGAGCGTAT-MGB-3’
引物：SEQ ID No 21(FR2)5'-GCAAACCTCTTAACCTTCTC-3'
结论：如图1所示，人造甲基化寡核苷酸模板有扩增，人造非甲基化寡核苷酸模板没有扩增，表明引物和探针的设计是正确的。7组引物和探针均能区别甲基化模板和非甲基化模板，都可以用作SHOX2、PTGER4和FOXL2甲基化检测试验中的引物和探针。虽然不同的探针和引物的组合，效果略有不同，但是以上7组引物探针均适用于作为SHOX2、PTGER4和FOXL2甲基化检测试验中的引物和探针。
接着，用癌症和正常DNA做模板进一步筛选SHOX2、PTGER4和FOXL2的引物和探针。
得到4例肺癌(L1-L4)、2例肠癌(CRC1、CRC2)、1例胃癌(SC)和1例正常人(WBC)的样品。并提取4例肺癌(L1-L4)、2例肠癌(CRC1、CRC2)、1例胃癌(SC)和1例正常人(WBC)的基因组DNA。所有癌症样品来源于博尔诚公司。人正常样品来源于BioReclamationIVT公司。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有人样品DNA是通过使用Epigenomics公司的EPi proColonPlasma Quick Kit提取。
然后，将所述基因组DNA样品预处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不同于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用EPi proColon Plasma Quick Kit进行的。
接着，上述经过预处理的4例肺癌(L1-L4)、2例肠癌(CRC1、CRC2)、1例胃癌(SC)和1例正常人(WBC)的基因组DNA样本中加入上述5组引物和探针组，进行PCR试验，在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。
其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30ul的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。
最后，分别测得4例肺癌(L1-L4)、2例肠癌(CRC1、CRC2)、1例胃癌(SC)和1例正常人(WBC)的基因组DNA样本对于SHOX2、PTGER4和FOXL2基因的实时PCR的Ct值(如图2-1、2-2和2-3所示)。
从SHOX2、PTGER4和FOXL2基因的实时PCR的Ct值可以看出SHOX2、PTGER4和FOXL2在肺癌DNA有高度扩增，其他癌症和正常DNA没有扩增。SHOX2、PTGER4和FOXL2引物和探针的特异性能区别癌症DNA和正常DNA。SHOX2、PTGER4和FOXL2不同的引物和探针组合，效果略有不同。
根据上述实施例，本申请设计的SHOX2、PTGER4和FOXL2的5组探针和引物均能区别肺癌DNA和正常DNA。在下面的实施例中，使用引物和探针组合1、组合3和组合7，进一步进行体外试验和临床试验。
实施例2 SHOX2、PTGER4和FOXL2的甲基化DNA多元检测技术
以4例肺癌(L1-L4)、2例肠癌(CRC1、CRC2)、1例胃癌(SC)和1例正常人(WBC)的组织样品为检测对象。提取上述4例肺癌、2例肠癌、2例肺癌、1例血癌和1例正常人的组织的基因组DNA。所有癌症样品来源于博尔诚公司。人正常样品来源于BioReclamationIVT公司。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有人样品DNA是通过使用Epigenomics公司的EPi proColon Plasma QuickKit提取。
然后，将所述基因组DNA样品预处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不同于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用EPi proColon Plasma Quick Kit进行的。
接着，上述经过预处理的4例肺癌、2例肠癌、2例肺癌、1例血癌和1例正常人的基因组DNA样本中加入上述5组引物和探针组，进行PCR试验，在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。
本实施例中将优选使用引物和探针组合1和3进行多元检测(实时双通道检测)，同时加入内参引物和探针，SEQ ID No 22-24。
其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30ul的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。
最后，分别测得4例肺癌(L1-L4)、2例肠癌(CRC1、CRC2)、1例胃癌(SC)和1例正常人(WBC)的基因组DNA样本对于SHOX2、PTGER4和FOXL2基因的实时PCR的Ct值(如图3-1、3-2和3-3所示)。
从SHOX2、PTGER4和FOXL2基因的实时PCR的Ct值可以看出当多元检测时，SHOX2、PTGER4和FOXL2的Ct值，在经过优化后的PCR反应体系中，其各自的Ct值与单独检测时基本一致，说明该经过优化的多元检测体系适用于肺癌的检测。
实施例3 SHOX2、PTGER4和FOXL2的甲基化DNA多元检测试剂盒对肺癌、正常人血浆的灵敏度和特异性
以20例正常人和20例肺癌患者的血浆样品为检测对象。提取各样品中的游离DNA。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA是通过使用Epigenomics公司的EPi proColon Plasma Quick Kit提取。
然后，将所述DNA样品预处理以使得5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不同于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用EPi proColon Plasma Quick Kit进行的。
然后，上述经过预处理的20例正常人和20例肺癌患者的DNA样本中加入上述实施例二的检测体系，多元地检测SHOX2、PTGER4和FOXL2和内参β-肌动蛋白。在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。
其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30ul的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。
最后，测得20例正常人和20例肺癌患者DNA样本Ct值。如下表1所示。
表1.血浆检测Ct值
根据SHOX2、PTGER4和FOXL2各自的ROC曲线，见图4-1、4-2和4-3，确定各自的Cutoff值为Ct＝45，即样本的Ct值<45为阳性，Ct值≥45(表现为No Ct)为阴性，此种判定标准下灵敏度最高。SHOX2、PTGER4和FOXL2三个个基因只要有1个的结果为阳性，即判定该样本为阳性，其他情况视为阴性。
根据上表1的检测结果及上述判定标准，SHOX2的灵敏度为75％，PTGER4的灵敏度为60％，FOXL2的灵敏度为50％，三个标志物多元检测时，灵敏度提高到了95％，特异性为60％。
为了达到不同预期用途和目的，本发明提供的检测方法和检测试剂盒，可以通过调整Cutoff值达到不同的灵敏度和特异性指标，优选的，在实施例三中，为了提高灵敏度，设定Cutoff值为45，并不代表本发明仅能用45作为Cutoff值，可以根据本发明提供的血浆检测Ct值及ROC曲线，选取不同的Cutoff值作为判定标准。
实施例4 DCC、PTGER4和FOXL2的甲基化DNA多元检测对肺癌、正常人血浆的灵敏度和特异性
为证明本发明提供的组合物及试剂盒对于肺癌检测的灵敏度和特异性指标优于其他现有方法和标志物，本实施例将引用文献报道的DCC基因的甲基化检测的引物和探针组合[1]，并与本发明中的2种基因(PTGER4和FOXL2)的引物和探针组合多元检测体系，平行检测实施例3中肺癌和正常人的DNA。
以实施例3获得的DNA作为PCR反应的模板，多元地检测DCC、PTGER4和FOXL2和内参β-肌动蛋白。在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。
其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30ul的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。其中DCC的扩增使用如下的引物探针组合：
引物：SEQ ID No 28(DF1)5'-CGCGATTTTTGGTTTCGAAGG-3'
探针：SEQ ID No 29(DP1)5'-FAM-CAAAAAAACTCCGAAAAATACAAAAACC-TAMRA-3’
引物：SEQ ID No 30(DR1)5'-TACCGATTACTTAAAAATACGCG-3'
最后，测得20例正常人和20例肺癌患者DNA样本Ct值。如下表2所示。
表2.血浆检测Ct值
为得到最大的灵敏度，以Cutoff值为Ct＝45，即样本的Ct值＜45为阳性，Ct值≥45(表现为No Ct)为阴性，此种判定标准下灵敏度最高。DCC、PTGER4和FOXL2三个个基因只要有1个的结果为阳性，即判定该样本为阳性，其他情况视为阴性。
根据上表2的检测结果及上述判定标准，DCC的灵敏度为30％，PTGER4的灵敏度为60％，FOXL2的灵敏度为50％，三个标志物多元检测时，灵敏度提高到了85％，特异性为60％。与实施例3相比，DCC、PTGER4和FOXL2多元检测方法的特异性与本发明的SHOX2、PTGER4和FOXL2多元检测试剂盒具有相同的特异性，但灵敏度远低于本发明的多元检测试剂盒。
[1].Ostrow KL,Hoque MO,Loyo M,Brait M,Greenberg A,Siegfried JM,Grandis JR,Gaither Davis A,Bigbee WL,Rom W,Sidransky D.2010.Molecular analysis of plasma DNA for the early detection of lung cancer byquantitative methylation-specific PCR.Clin Cancer Res.16(13):3463-3472.
综上所述，本申请中，通过联合利用分别用于检测SHOX2、PTGER4和FOXL2基因及其片段的甲基化的核酸序列，使得癌症检测的灵敏度和特异性，尤其是肺癌检测的灵敏度和特异性得到了提高，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。
并且，通过利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，能方便地实现针对SHOX2、PTGER4和FOXL2这三个生物标记物的同时间的三通道检测，并且能根据实时PCR的循环阈值(Ct)值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，提供了一种无创性的快速癌症的检测方法。
最后，本申请还公开了至少一组的效果较好的、设计达到最优化的用于检测SHOX2、PTGER4和FOXL2基因及其片段是否甲基化的探针和引物组合及其筛选方法，确保检测效果达到最优化。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种用于肺癌筛查的组合物，其特征在于，所述组合物包含分别用于检测SHOX2基因、PTGE4基因和FOXL2基因中的每个基因的至少一个靶区域内的甲基化程度的核酸序列；
其中，所述靶区域为分别选自SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQID NO:27中的连续的至少18个碱基长度的片段；
所述核酸序列等同、互补或杂交于所述靶区域；优选地，所述核酸序列在中等严紧或严紧条件下杂交于所述靶区域。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述核酸序列为引物和探针，其中，所述引物和探针具有以下特征：
1)可扩增人造的甲基化的所述靶区域，而不能扩增人造的非甲基化的所述靶区域；
2)在以正常的人白细胞中提取的DNA为模板时显示没有扩增，但在以人肺癌组织中提取的DNA为模板时显著扩增；
优选地，所述引物和探针还包括以下特征：
3)在以从正常人的血浆提取的DNA为模板时显示没有扩增，但在从肺癌病人的血浆提取的DNA为模板时显著扩增。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，检测SHOX2基因的引物和探针为组合1或组合2；
组合1
引物：SEQ ID No 1，
探针：SEQ ID No 2，
引物：SEQ ID No 3；
组合2
引物：SEQ ID No 4，
探针：SEQ ID No 5，
引物：SEQ ID No 6。
4.如权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，检测PTGER4基因的引物和探针选自组合3、组合4和组合5中的一种；
组合3
引物：SEQ ID No 7，
探针：SEQ ID No 8，
引物：SEQ ID No 9；
组合4
引物：SEQ ID No 10，
探针：SEQ ID No 11，
引物：SEQ ID No 12；
组合5
引物：SEQ ID No 13，
探针：SEQ ID No 14，
引物：SEQ ID No 15。
5.如权利要求2～4中任一项所述的组合物，其特征在于，检测FOXL2基因的引物和探针为组合6或组合7；
组合6
引物：SEQ ID No 16，
探针：SEQ ID No 17，
引物：SEQ ID No 18；
组合7
引物：SEQ ID No 19，；
探针：SEQ ID No 20，
引物：SEQ ID No 21。
6.如权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备用于检测肺癌的试剂中的应用。
7.一种用于筛查肺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1～5中任一项所述的组合物。
8.一种用于如权利要求7所述的试剂盒的样本处理方法，其特征在于，所述方法包括：
a)提供人源样本，所述人源样本选自细胞系、组织切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种；优选地选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种；
b)由步骤a)的样本中提取基因组DNA，并进行预处理使所述基因组DNA的5’位未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交上不同于胞嘧啶的另一碱基；
c)以步骤b)处理后的基因组DNA为模板，利用如权利要求1～5中任一项所述的组合物进行PCR扩增；优选地，在PCR扩增中以β肌动蛋白(ACTB)为内对照基因；更优选地，所述β肌动蛋白(ACTB)的引物和探针为：引物：SEQ ID NO:22，探针：SEQ ID NO:23，引物：SEQ IDNO:24。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤b)所述的预处理是通过亚硫酸氢盐试剂实现的；优选地，所述亚硫酸氢盐试剂与变性剂联用，所述变性剂为正烷基二醇，优选为二乙二醇二甲基醚(DME)、二噁烷或二噁烷衍生物；更优选地，所述亚硫酸氢盐试剂与清除剂联用，所述清除剂为色原烷衍生物，优选地选自6-羟基-2，5，7，8-四甲基色原烷2-羧酸，三羟基苯甲酸或其衍生物中的一种。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤c)所述的PCR扩增为实时PCR扩增；优选地，PCR反应混合物包括经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25-40ng和300-600nM引物、150-300nM探针、1UTaq聚合酶、50-400μM的各个dNTP、1至10mM的MgCl2和2×PCR缓冲至最终的2μl至100μl的体积；所述PCR的反应条件为：在85至99℃持续3-60分钟，然后在50～72℃进行1～30秒的35-55个循环，在45～80℃下退火5～90秒，在85～99℃下变性5～90秒。
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