CN104812899A

CN104812899A - 利用胃息肉和胃癌特异性甲基化检测胃息肉和胃癌标记基因的方法

Info

Publication number: CN104812899A
Application number: CN201380061964.0A
Authority: CN
Inventors: 安城皖; 吴泰祯
Original assignee: Genomictree Inc
Current assignee: Genomictree Inc
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2013-09-26
Publication date: 2015-07-29
Also published as: WO2014073785A1; ES2681035T3; KR20140059125A; KR101569498B1; DK2918679T3; EP2918679A4; EP2918679B1; JP2016500521A; US20160040244A1; TR201810602T4; EP2918679A1

Abstract

本发明涉及多配体聚糖-2(SDC2；NM_002998)基因作为胃息肉和胃癌特异性的甲基化生物标记物的新用途，并且更具体地，涉及多配体聚糖-2基因作为生物标记物的用途，其使得能够通过测量多配体聚糖-2基因的甲基化水平在早期阶段诊断出胃息肉和胃癌。本发明的效果在于可检测胃息肉和胃癌特异性标记基因的CpG岛的甲基化，从而提供用于诊断胃癌的信息。使用根据本发明的甲基化检测方法或本发明的诊断组合物、试剂盒或核酸芯片使得有可能在早期转变阶段诊断胃癌，从而能够早期诊断胃癌。另外，与常规方法相比，本发明的方法使得能够以准确快速的方式有效地诊断胃癌。

Description

利用胃息肉和胃癌特异性甲基化检测胃息肉和胃癌标记基因的方法

技术领域

本发明涉及多配体聚糖-2(syndecan，SDC2；NM_002998)基因作为胃息肉和胃癌特异性的甲基化生物标记物的新用途，并且更具体地，涉及多配体聚糖-2基因作为生物标记物的用途，其使得能够通过测量多配体聚糖-2基因的甲基化水平在早期阶段诊断出胃息肉和胃癌。

背景技术

即使医学发展到今天，癌症患者，特别是实体瘤患者(除了血癌患者以外)的5年存活率仍小于50％，并且所有癌症患者中约2/3在晚期被诊断出来，几乎所有都在癌症诊断后的2年内死亡。在癌症治疗中这样差的结果不仅是治疗方法的问题，还是由于这样的事实，即不容易在早期诊断癌症和准确地诊断晚期癌症，并在癌症治疗后对癌症患者进行随访。

在目前的临床实践中，癌症的诊断是由后询问病史、体检及临床评估后进行组织活检，而如果怀疑是癌症，随后进行射线检测和内窥镜检查来确认的。然而，由现有临床实践对癌症的诊断只有当癌细胞的数目超过十亿并且癌的直径大于1cm时才可能。在这种情况下，癌细胞已经具有转移能力，并且其至少一半已经转移。同时，用于监测从癌直接或间接产生的物质的肿瘤标记物被用于癌症筛查，但是它们由于准确性有限而引起混乱，因为其中高达约半数即使在癌症存在时也显示为正常，它们即使在没有癌症时也表现为阳性。此外，主要用于癌症治疗的抗癌剂的问题在于只有当癌体积很小时才显示出效果。

之所以难以诊断和治疗癌症是因为癌细胞是高度复杂和可变的。癌细胞过度生长并且连续地侵入周围组织以及转移到远端器官导致死亡。尽管有免疫机制或抗癌治疗的攻击，但癌细胞仍旧存活，不断地发展并且选择性繁殖最适宜存活的细胞群。癌细胞是具有高度生存能力的生物体，通过大量基因的突变而产生。为了使一个细胞转变为癌细胞并发展成临床上可检测到的恶性癌症肿块，必须发生大量基因的突变。因此，为了从根本上诊断并治疗癌症，在基因水平的方法是必要的。

最近，已积极尝试用遗传分析来诊断癌症。最简单的典型方法是通过PCR检测血液中ABL：BCR融合基因(白血病的遗传特征)的存在。该方法具有大于95％的准确率，并且在使用这个简易的基因分析来诊断并治疗慢性髓细胞性白血病后，这一方法被用于结果评估和后续研究。但是，这种方法的缺点在于它只能适用于某些血癌。

此外，已尝试另一种方法，其中通过RT-PCR和印迹法检测由癌细胞表达的基因的存在，从而诊断血细胞中癌细胞的存在。但是，这种方法的缺点在于它只能适用于包括前列腺癌和黑色素瘤在内的某些癌症，并且具有较高的假阳性率。此外，难以对该方法中的检测和读数标准化，并且它的效用也很有限(Kopreski,M.S.et al.,Clin.Cancer Res.,5:1961,1999；Miyashiro,I.etal.,Clin.Chem.,47:505,2001)。

最近，已积极尝试使用血清或血浆中的DNA的基因检测。这是一种检测从癌细胞中分离并释放到血液中并游离DNA的形式存在于血清中的癌症相关基因的方法。据发现，血清中的DNA浓度在实际癌症患者中比正常人中增加5-10倍，并且这种增加的DNA大多从癌细胞释放。使用这样的从癌细胞中分离的DNA来分析癌症特异性基因的异常，例如原癌基因和肿瘤抑制基因的突变、缺失和功能丧失，允许诊断癌症。在这项工作中，出现了通过检查血清中突变的K-ras癌基因、p53肿瘤抑制基因和p16基因中的启动子甲基化，以及微卫星的标记和不稳定性来诊断肺癌、头颈癌、乳腺癌、结肠癌和肝癌的积极尝试(Chen,X.Q.et al.,Clin.Cancer Res.,5:2297,1999；Esteller,M.et al.,Cancer Res.,59:67,1999；Sanchez-Cespedes,M.et al.,Cancer Res.,60:892,2000；Sozzi,G.et al.,Clin.Cancer Res.,5:2689,1999)。

同时，在血液以外的样品中，也可以检测癌细胞的DNA。尝试一种通过基因或抗体测试来检测肺癌患者的痰或支气管肺泡灌洗术中癌细胞或原癌基因的存在的方法(Palmisano,W.A.et al.,Cancer Res.,60:5954,2000；Sueoka,E.et al.,Cancer Res.,59:1404,1999)。此外，尝试了检测结肠和直肠癌患者的粪便中原癌基因的存在(Ahlquist,D.A.et al.,Gastroenterol.,119:1219-27,2000)和检测尿液和前列腺液中启动子甲基化异常(Goessl,C.et al.,Cancer Res.,60:5941,2000)的其他方法。然而，为了准确地诊断引起大量基因异常的癌症并显示每种癌症的各种突变特性，需要一种以准确且自动的方式同时分析大量基因的方法。然而，尚未建立这样的方法。

为了准确诊断癌症，重要的是不仅检测突变基因，而且检测此基因发生突变的机制。在此之前，进行了侧重于编码序列的突变，即，微变化，如点突变、缺失和插入，或宏观染色体异常的研究。然而，近几年，表观遗传改变被报道为与这些突变一样重要，并且表观遗传改变的典型例子是启动子CpG岛的甲基化。

在哺乳动物细胞的基因组DNA中，除了A、C、G和T以外还有第五碱基，即5-甲基胞嘧啶，其中甲基是结合到胞嘧啶环的第五个碳(5-mC)上。5-mC总是只连接至CG二核苷酸(5'-mCG-3')的C，这是经常被标示的CpG。CpG的C通过结合甲基而主要被甲基化。这一CpG的甲基化抑制基因组中的重复序列(如Alu或转座子)被表达。另外，该CpG是在哺乳动物细胞中表观遗传学改变出现次数最多的位点。这一CpG的5-mC天然脱氨基为T，并且因此，在哺乳动物基因组中的CpG仅示出了1％的频率，这远低于正常频率(1/4×1/4＝6.25％)。

CpG异常地整合的区域被称为CpG岛。CpG岛是指长度为0.2-3kb，并且C+G含量超过50％且CpG比率超过3.75％的位点。在人类基因组中大约有45,000个CpG岛，并且发现它们大多数在调控基因表达的启动子区中。实际上，在持家基因的启动子中发现的CpG岛约占人类基因的50％(Cross,S.et al.,Curr.Opin.Gene Develop.,5:309,1995)。最近，已经积极地进行了检查血液、痰、唾液、粪便或尿液中的肿瘤相关基因的启动子甲基化，和使用检测结果诊断并治疗各种癌症的尝试(Esteller,M.et al.,CancerRes.,59:67,1999；Sanchez-Cespedez,M.et al.,Cancer Res.,60:892,2000；Ahlquist,D.A.et al.,Gastroenterol.,119:1219,2000)。因此，本发明人根据相关的研究已证明，配体蛋白聚糖2基因可以特异地用于诊断结肠癌(KR10-1142131B)。然而，该文献没有建议使用配体蛋白聚糖2基因来诊断包括胃癌的其他癌症。同时，本发明人发现，配体蛋白聚糖2基因并不适合作为各种实体癌症如肺癌、乳腺癌等的生物标记物，因此它仅作为结肠癌特异性生物标记物，而不是诊断一般癌症的生物标记物。

因此，本发明人已进行了广泛的努力来开发有效的胃癌特异性甲基化标记物，这使得能够在早期阶段诊断癌症和癌变的风险并预测癌症预后。结果是，本发明人发现，配体蛋白聚糖2(SDC2；NM_002998)基因在胃息肉和胃癌细胞中特异性甲基化，而在肺癌组织、乳癌组织、肝癌组织、宫颈癌组织和甲状腺癌组织中没有特异性甲基化并且通过使用SDC22基因作为生物标记物测量其甲基化水平可以在早期阶段诊断胃息肉和胃癌，从而完成了本发明。

在此背景技术部分公开的上述信息仅用于增强对本发明背景的理解，因此它可能包含不形成本领域的普通技术人员已知晓的现有技术的信息。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种胃息肉或胃癌特异性的甲基化生物标记物及其在为胃癌的早期诊断提供信息中的应用，所述生物标记物在胃息肉或胃癌中被特异性甲基化，因此可以有效地用于胃息肉或胃癌的诊断。

本发明的另一个目的是提供一种检测胃息肉或胃癌特异性甲基化标记基因SDC2基因的甲基化的方法，以及使用SDC2基因诊断胃息肉或胃癌的试剂盒和核酸芯片。

为了达到上述目的，本发明提供了用于诊断胃息肉或胃癌的试剂盒，其包含：用于扩增包含多配体聚糖2(SDC2)基因的CpG岛的片段的PCR引物对；和用于对由所述引物对扩增的PCR产物进行焦磷酸测序的测序引物。

本发明还提供了用于检测胃息肉或胃癌的方法，包括步骤：

(a)分离来自临床样品的DNA；和

(b)在分离的DNA中测量SDC2(多配体聚糖-2)基因的CpG岛的甲基化以检测胃息肉或胃癌，所述SDC2(多配体聚糖-2)基因是胃息肉或胃癌生物标记物。

本发明还提供了用于诊断胃息肉或胃癌的组合物，其含有能够检测多配体聚糖2(SDC2)基因的CpG岛的甲基化的物质。

本发明提供了用于诊断胃息肉或胃癌的核酸芯片，该核酸芯片上固定有能够在严谨条件下杂交到包括多配体聚糖2(SDC2)基因的CpG岛的片段的探针。

本发明的其它特征和实施方式将从以下的详细说明和所附权利要求中更加显而易见。

附图说明

图1是示出通过焦磷酸测序测量SDC2生物标记基因的甲基化水平的结果的曲线图，该SDC2生物标记基因在正常胃组织、低度发育异常和高度发育异常中特异性地结合双酚A。

图2A是示出通过焦磷酸测序测量在胃癌细胞系中的SDC2生物标记基因的甲基化水平的结果的曲线图；图2B是示出通过焦磷酸测序测量在正常胃组织、胃癌组织和与胃癌组织相邻的正常胃组织中SDC2生物标记基因的甲基化水平的结果的曲线图；和图2C示出通过ROC曲线分析测量SDC2生物标记基因对胃癌诊断的灵敏度和特异性的结果。

图3A示出通过qMSP法测量在正常人和胃癌患者的血清DNA中的SDC2生物标记基因的甲基化水平的结果；和图3B示出通过ROC曲线分析测量SDC2生物标记基因对胃癌诊断的灵敏度和特异性，以评估SDC2生物标记基因诊断胃癌的能力的结果。

图4示出通过焦磷酸测序测量在肺癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌和前列腺癌患者的癌组织和正常组织中SDC2生物标记基因的甲基化水平的结果。

图5示出测量在通过胃镜被确定为正常的正常人和胃息肉患者的血清中的SDC2生物标记基因的甲基化水平的结果，和分析ROC曲线的结果。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。通常，本文中使用的命名法是众所周知的并且被普遍用于本领域中。

本发明涉及在胃息肉或胃癌中被特异性甲基化的多配体聚糖2(SDC2)基因的CpG岛作为生物标记物的应用。因此，在一个方面，本发明涉及用于诊断胃息肉或胃癌的组合物，其含有能够检测多配体聚糖2(SDC2)基因的CpG岛的甲基化的物质。

在本发明中，CpG岛可以位于SDC2基因的启动子区。此外，它也可以位于启动子的上游或下游区域，如内含子、外显子或增强子区。

在本发明中，CpG岛优选位于SDC2基因的启动子区、5'非翻译区、第一外显子和第一个内含子处。具体地，CpG岛可以位于SDC2(多配体聚糖-2)基因的转录起始点-0.5kb和+1.5kb之间。更具体地，CpG岛可以位于由SEQ ID NO：1所表示的区域。

本发明的胃息肉或胃癌特异性甲基化标记基因可以用于胃癌筛查、风险评估、预后、疾病识别、疾病阶段的诊断和治疗靶标的选择。具体地讲，根据本发明的作为生物标记基因的SDC2基因在胃息肉(胃癌的癌前病变)中表现出高水平和频率的阳性甲基化，这表明SDC2基因可用作胃息肉的诊断及胃癌的早期诊断的生物标记物。

在本发明中，能够检测CpG岛的甲基化的物质可以是选自以下组中的任何一种：能够扩增包含甲基化CpG岛的片段的引物对、能够与该甲基化CpG岛杂交的探针、能够结合到该甲基化CpG岛的甲基化特异性结合蛋白或甲基化特异性结合抗体、测序引物、测序-合成引物和测序-连接引物。

在胃癌以及在胃癌不同阶段的异常中甲基化的基因的鉴别使得能够以准确有效的方式在早期阶段诊断胃癌，并允许多个基因的甲基化作图及用于治疗干预的新靶标的识别。此外，根据本发明的甲基化数据可与其它非甲基化相关的生物标记物检测方法结合以获得用于胃癌诊断的更精确的系统。

根据本发明的方法中，可以通过测定从样品中获得的一个或多个核酸生物标记物的甲基化阶段来诊断胃癌在不同阶段或时期的进展。通过将从在胃癌的各阶段的样品中分离的核酸的甲基化阶段与从没有胃组织的细胞增殖性病症的样品中分离的一个或多个核酸的甲基化阶段进行比较，可以检测样品中胃癌的特定阶段。这里，甲基化阶段可以是高甲基化(hypermethylation)。

在本发明的一个实施方式中，核酸可以在基因的调控区被甲基化。在另一个实施方式中，由于甲基化是从参与细胞转化的基因的外部向内进行,因此可以通过检测该基因的调控区外的甲基化来诊断该参与细胞转化的基因。

本发明的试剂盒的一个实例包括：被区室化以在其中容纳样品的载体装置；和一个或多个容器，包括含有敏感裂解未甲基化胞嘧啶的试剂的第一容器，含有用于扩增含CpG的核酸的引物的第二容器，以及含有检测裂解或未裂解核酸的存在的装置的第三容器。考虑用于本发明的引物包括在SEQID NO：2、3、5和6中示出的序列，以及其任何功能性组合和片段。功能性组合或片段被用作引物以检测在试图被检测的基因组的区域中是否发生了甲基化。

此外，根据本发明，可以通过使用试剂盒或核酸芯片检测SDC2(多配体聚糖-2)基因的甲基化来诊断样品中胃组织的细胞增殖性病症(发育异常(dysplasia))。

因此，在另一个方面，本发明涉及用于诊断胃息肉或胃癌的修饰核酸，其源自SEQ ID NO：1示出的SDC2(多配体聚糖-2)基因片段，其中所述修饰核酸是通过在杂交过程中修饰SDC2基因片段使SDC2基因片段中的至少一个胞嘧啶残基被修饰为尿嘧啶或胞嘧啶以外的核苷酸而得到的。

另外，在本发明中，所述修饰核酸可以包含示于SEQ ID NO：17的序列。

在另一个方面，本发明涉及一种用于诊断胃息肉或胃癌的试剂盒，包括：用于扩增包含多配体聚糖2(SDC2)基因的CpG岛的片段的PCR引物对；和用于对由该引物对扩增的PCR产物进行焦磷酸测序的测序引物。

本发明还涉及用于诊断胃息肉或胃癌的核酸芯片，该核酸芯片上已经固定有能够在严谨条件下与包括多配体聚糖2(SDC2)基因的CpG岛的片段杂交的探针。

使用该诊断试剂盒或核酸芯片允许检测样品的胃组织的细胞增殖性病症(发育异常)。该检测方法包括测定从样品中分离的至少一种核酸的甲基化状态，并且所述至少一种核酸的甲基化状态可以与从没有胃组织的细胞增殖性病症(发育异常)的样品中分离的核酸的甲基化状态进行比较。

在本发明的又一个实施方式中，可以使用甲基化标记基因在早期阶段诊断可能会形成胃癌的细胞。当被证实在癌细胞中甲基化的基因在临床或形态上表现正常的细胞中甲基化时，这表明该表象正常的细胞进展为癌症。因此，可以通过检测在表象正常的细胞中的胃癌特异性基因的甲基化，在早期阶段诊断胃癌。特别是，在本发明的一个实例中，发现SDC2(多配体聚糖-2)基因可以用于胃息肉(胃癌的癌前病变)的诊断。

本发明使得，可以使用甲基化标记基因在早期阶段诊断可能会形成胃癌的细胞。当被证实在癌细胞中甲基化的基因在临床或形态上表现正常的细胞中被甲基化时，这表明该表象正常的细胞进展为癌症。因此，可以通过检测在表象正常的细胞中的胃癌特异性基因的甲基化，在早期阶段诊断胃癌。

使用本发明的甲基化标记基因允许检测样品中胃组织的细胞增殖性病症(发育异常)。该检测方法包括将包括分离自受试者的至少一种核酸的样品与能够测定该核酸甲基化状态的至少一种试剂相接触。该方法包括检测至少一种核酸的至少一个区域的甲基化，其中所述核酸的甲基化与从没有胃细胞的异常生长(发育异常进展)的样品中存在的核酸的相同区域的甲基化状态不同。

在本发明的又一个实施方式中，组织向胃癌进展的可能性可以通过检查在胃癌中特异性甲基化的基因的甲基化频率，并测定可能进展为胃癌的组织的甲基化频率进行评估。

因此，在又一方面，本发明涉及用于检测胃息肉或胃癌的方法，包括步骤：

(a)分离来自临床样品的DNA；和

(b)测量在分离的DNA中的作为胃息肉或胃癌生物标记物的SDC2(多配体聚糖-2)基因的CpG岛的甲基化，以检测胃息肉或胃癌。

在本发明中，步骤(b)可以通过测量基因的启动子、5'非翻译区(UTR)、内含子和外显子区域中的任一种的甲基化来进行。优选地，可以测量在SDC2基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的区域的CpG岛甲基化。

在本发明中，步骤(b)可通过选自下组的方法来进行：PCR、甲基化特异性PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR测定法、定量PCR、基于DNA芯片的测定法、焦磷酸测序和亚硫酸氢盐测序。此外，临床样品可以选自来自疑似罹患癌症的患者或待诊断的受试者的组织、细胞、血液、血浆、粪便和尿液，但不限于此。

在本发明的一个实施方式中，用于检测基因甲基化的方法可包括：(a)制备含有DNA的临床样品；(b)分离来自临床样品的DNA；(c)使用能够扩增包含SDC2基因的启动子或内含子的CpG岛的片段的引物，扩增经分离的DNA；和(d)根据该DNA是否在步骤(c)被扩增，测定所述内含子是否被甲基化。

在本发明的另一个实施方式中，样品中胃组织的细胞增殖性病症(发育异常)可以通过使用试剂盒检测SDC2(NM_002998，配体蛋白聚糖2)基因的甲基化状态进行诊断。

因此，在另一个方面，本发明涉及一种用于诊断胃息肉或胃癌的试剂盒，其包含：用于扩增包含SDC2(NM_002998，配体蛋白聚糖2)基因的任一CpG岛的片段的PCR引物对；和对由该引物对扩增的PCR产物进行焦磷酸测序的测序引物。

在本发明中，PCR引物对可以是SEQ ID NO：2和3示出的引物对，或SEQ ID NO：5和6示出的引物对。

在本发明中，测序引物可以是SEQ ID NO：4或7示出的引物。

在本发明的另一个实施方式中，样品中的胃组织细胞的细胞增殖性病症(发育异常)可以通过使用核酸芯片检测SDC2(NM_002998，配体蛋白聚糖2)基因的甲基化状态进行诊断。

在又一个方面，本发明涉及一种用于诊断胃息肉或胃癌的核酸芯片，该核酸芯片上已固定有能够在严谨条件下与包含配体蛋白聚糖-2(SDC2)基因的CpG岛的片段杂交的探针。

在本发明中，探针可以选自由SEQ ID NO：8到13所示碱基序列组成的组，并且其具体实例如下：

SDC2

1)5'-cggagctgcc aatcggcgtg taatcctgta-3'(SEQ ID NO：8)

2)5'-ctgccgtagc tccctttcaa gccagcgaat ttattcctta aaaccagaaa-3'(SEQ IDNO：9)

3)5'-gcacgggaaa ggagtccgcg gaggagcaaa accacagcag agcaagaaga-3'(SEQID NO：10)

4)5'-gcagccttcc cggagcacca actccgtgtc gggagtgcag aaaccaacaa gtgagagggc-3'(SEQ ID NO：11)

5)5'-cccgagcccg agtccccgag cctgagccgc aatcgctgcg gtactctgct-3'(SEQ IDNO：12)

6)5'-cttggtggcc tgcgtgtcgg cggagtcggt gagtgggcca-3'(SEQ ID NO：13)

修饰核酸序列探针

1')5'-cggagttgtt aatcggcgtg taattttgta-3'(SEQ ID NO：14)

2')5'-ttgtcgtagt ttttttttaa gttagcgaat ttatttttta aaattagaaa-3'(SEQ ID NO：15)

3')5'-gtacgggaaa ggagttcgcg gaggagtaaa attatagtag agtaagaaga-3'(SEQ IDNO：16)

4')5'-gtagtttttt cggagtatta atttcgtgtc gggagtgtag aaattaataa gtgagagggt-3'(SEQ ID NO：17)

5')5'-ttcgagttcg agttttcgag tttgagtcgt aatcgttgcg gtattttgtt-3'(SEQ ID NO：18)

6')5'-tttggtggtt tgcgtgtcgg cggagtcggt gagtgggtta-3'(SEQ ID NO：19)

使用的诊断试剂盒或本发明的核酸芯片，能够测定样品中胃组织细胞的异常生长(发育异常的进展)。该方法包括测定从样品中分离的至少一个核酸的甲基化阶段，其中将所述至少一个核酸的甲基化状态与从没有胃细胞的异常生长(发育异常进展)的样品中分离的核酸的甲基化节段进行比较。

在本发明的另一个实施方式中，可通过使用所述试剂盒或核酸芯片检查标记基因的甲基化来检测转化的胃癌细胞。

在本发明的又一实施方式中，可通过使用所述试剂盒或核酸芯片检查标记基因的甲基化来诊断胃癌。

在本发明的又一个实施方式中，可以通过使用所述试剂盒或核酸芯片检查显示为正常表型的样品中的标记基因的甲基化，诊断进展为胃癌的可能性。用于本发明中的样品可以是固体或液体组织、细胞、粪便、尿、血清或血浆。

在本文中使用的主要术语的定义如下。

如本文所用，术语“细胞转化”是指细胞特性从一种形式到另一种形式的变化，例如从正常变成异常、非肿瘤变成肿瘤、未分化变成分化、干细胞变成非干细胞。另外，转化可通过细胞的形态学、表型、生化特性等来识别。

如本文所用，术语癌症的“早期检测”是指在转移前发现癌症的可能性，优选在观察到组织或细胞的形态变化之前。此外，术语细胞转化的“早期检测”是指细胞在形态上被标示为转化之前，细胞在其早期阶段经历转化的高可能性。

如本文所用，术语“高度甲基化”是指CpG岛的甲基化。

如本文所用，术语“样品”或“临床样品”在其最广义上是指，并且包括根据要进行的测定法的类型，从个体、体液、细胞系、组织培养物获得的任何生物学样品。用于从哺乳动物获得组织活检和体液的方法是现有技术中公知的。胃组织活检是优选的来源。

胃癌的生物标记物在比较癌细胞和正常细胞中的应用

在本发明中，“正常”细胞是指那些没有显示任何异常形态学或细胞学改变的细胞。“肿瘤”细胞是癌细胞。“非肿瘤”细胞是那些作为患病组织的一部分，但不被认为是肿瘤的一部分的细胞。

在一个方面，本发明是基于对胃癌和SDC2(NM_002998，配体蛋白聚糖2)基因的甲基化之间的关系的发现。

在本发明的另一个实施方式中，可以通过使用本发明的试剂盒或核酸芯片测定来自受试者的至少一种核酸的甲基化程度，在早期阶段诊断胃组织细胞的细胞增殖性病症。在此，该至少一种核酸的甲基化状态可以与从没有胃组织的细胞增殖性病症的受试者中分离的至少一种核酸的甲基化状态进行比较。该核酸优选含有CpG的核酸，例如CpG岛。

在本发明的另一个实施方式中，可以通过使用本发明的试剂盒或核酸芯片测定受试者的至少一种核酸的甲基化来诊断胃组织的细胞增殖性病症。这里，核酸可以是SDC2(NM_002998，配体蛋白聚糖2)。在本实施方式中，该至少一种核酸的甲基化可以与从没有胃组织的细胞增殖性病症倾向的受试者中分离的至少一种核酸的甲基化状态进行比较。

如本文所用，“倾向”是指易感细胞增殖性病症的性质。具有细胞增殖性病症倾向的受试者还没有细胞增殖性病症，但却是细胞增殖性病症可能性增加的受试者。

在另一个方面，本发明提供了用于诊断胃组织的细胞增殖性病症的方法，所述方法包括将包含核酸的样品与能够测定样品的甲基化状态的试剂相接触，并且测定至少一种核酸的至少一个区域的甲基化。这里，在至少一种核酸的至少一个区域的甲基化不同于在没有细胞异常生长的受试者中存在的核酸的同一区域的甲基化状态。

本发明的方法包括测定从受试者分离的至少一种核酸的至少一个区域的甲基化的步骤。如本文所用的术语“核酸”或“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸或其片段，或者是基因组或合成来源的单链或双链DNA或RNA，基因组或合成来源的有义或反义链DNA或RNA，肽核酸(PNA)，或者是天然或合成来源的任何DNA样或RNA样材料。对于本领域技术人员显而易见的是，当核酸是RNA时，脱氧核苷酸A、G、C和T分别由核糖核苷酸A、G、C和U代替。

在本发明中可使用任何核酸，只要可以检测到在其中进行了不同甲基化的CpG岛的存在。CpG岛是在核酸序列中富含CpG的区域。

甲基化

在本发明中，可使用任何纯化或者非纯化形式的核酸样品，只要其含有或者怀疑其含有包括把位点的核酸序列(例如含CpG的核酸)。能够被差异性地甲基化的一种核酸区域是CpG岛，一种与二核苷酸CpG的其他核酸区相比具有增加的密度的核酸序列。CpG二核苷酸(doublet)仅仅以大约20％的频率出现在脊椎动物DNA中，其可被预期来自一部分G*C碱基对。在一些区域中，CpG二核苷酸的密度达到预测值；其相对于其余基因组增加了10倍。CpG岛具有大约60％的平均G*C含量，并且主体DNA具有大约40％的平均G*C含量。该岛采取典型地大约1到2千碱基长的DNA延伸形式。在人类基因中存在大约45,000个这样的岛。

在许多基因中，CpG岛紧邻启动子的上游开始，并向下游延伸到转录区中。在启动子的CpG岛的甲基化常常遏制基因表达。该岛还可围绕基因编码区的5′区和编码区的3′区。因此，可在包括如下区域的多个区域中发现CpG岛，即，包括启动子区的调控区的编码序列上游、编码区(例如外显子)、编码区的下游，例如增强子区和内含子。

典型地，含CpG的核酸是DNA。然而，本发明的方法可以采用，例如，含有DNA，或含有DNA和RNA的mRNA的样品，其中DNA或RNA可以是单链或双链的，或者可以在样品中包括DNA-RNA杂交体。

也可采用核酸的混合物。待测的特定核酸序列可以是较大分子序列的一部分，或者可以作为离散分子存在，因此特定序列构成了整个核酸。待研究的核酸序列最初不需要以纯的形式存在，核酸序列可以是(诸如包含在整个人类DNA中的)复合体混合物的很小的部分。样品中所含的用于检测甲基化的CpG岛的核酸可通过各种技术来提取，诸如由Sambrook等人描述的技术(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。

从受试者分离的核酸得自受试者的生物样品。如果想要检测胃癌或者胃癌发展的阶段，可通过刮取或者生物活检从胃组织分离核酸。这些的样品可通过本领域技术人员已知的各种手术而得到。

在本发明的一个方面，与没有胃组织的细胞增殖性病症的受试者的核酸的相同区域相比，从受试者得到的样品的核酸的甲基化状态是高甲基化的。这里使用的“高甲基化”是指在一个或多个核酸中甲基化等位基因的存在。当检查相同的核酸时，来自没有胃组织的细胞增殖性病症的受试者的核酸不含有可检测到的甲基化等位基因。

个体基因和组

可以理解的是，本发明可单独使用每个基因作为诊断或者预后标记物的来实践，或者使用结合成组显示形式(panel display format)的几个标记物基因来实践，从而对于甲基化的基因的全部类型或列表可以检测多个标记基因以增加可靠性和效率。此外，在本申请中识别的任何基因可单独或者作为与在此记载的任何其他基因以任何组合而成的一组基因使用。或者，基因可根据它们的重要性以及甲基化基因数目被分级和加权，并且可确定发展癌症的可能性水平。这些算法也落入本发明的范围之内。

检测甲基化的方法

甲基化特异性PCR

当使用亚硫酸氢盐处理基因组DNA时，5'-CpG'-3区中的甲基化胞嘧啶保持不变，但是未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶。因此，基于通过亚硫酸氢盐处理而转变的碱基序列，构建了与具有5'-CpG-3'碱基序列的区域相对应的PCR引物组。这里，所构建的引物组是两种引物组：与甲基化碱基序列对应的引物组和与未甲基化碱基序列对应的引物组。当基因组DNA被亚硫酸氢盐转变然后使用上述两种引物组进行PCR扩增时，在基因组DNA被甲基化的情况下，在使用与甲基化碱基序列对应的引物的PCR混合物中检测到PCR产物，而在基因组DNA未甲基化的情况下，在使用与未甲基化的碱基序列对应的引物的PCR引物中检测到基因组DNA。这一甲基化可使用琼脂糖凝胶电泳定量分析。

实时甲基化特异性PCR

实时甲基化特异性PCR是由甲基化特异性PCR法改良而来的实时测定方法，并且包括使用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，设计与甲基化碱基序列对应的PCR引物，并使用该引物进行实时PCR。检测基因组DNA甲基化的方法包括两种方法：使用与扩增的碱基序列互补的TanMan探针进行检测的方法，和使用Sybergreen进行检测的方法。因此，实时甲基化特异性PCR能够选择性地定量分析甲基化的DNA。这里，使用体外甲基化DNA样品绘制标准曲线，并且将在碱基序列中不含5'-CpG-3'序列的基因作为阴性对照组扩增，以进行标准化来定量分析甲基化程度。

焦磷酸测序

焦磷酸测序法是由亚硫酸氢盐测序法改良而来的实时测序方法。与亚硫酸氢盐测序相似，基因组DNA通过亚硫酸氢盐处理被转变，然后构建与不含5'-CpG-3'序列的区域对应的PCR引物。具体地，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，使用PCR引物对其进行扩增，然后使用测序引物进行实时碱基序列分析。分析5'-CpG-3'区域中胞嘧啶和胸腺嘧啶的量，以甲基化指数表示甲基化程度。

使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR、定量PCR和DNA芯片测定法

当仅仅与甲基化DNA特异性结合的蛋白质与DNA混合时，蛋白质仅仅特异性地与甲基化DNA结合。因此，无论是使用甲基化特异性结合蛋白的PCR，或DNA芯片测定法都允许只选择性地分离甲基化DNA。基因组DNA与甲基化特异性结合蛋白混合，然后只有甲基化DNA被选择性地分离出来。使用对应于启动子区域的PCR引物扩增分离的DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳测定DNA甲基化。

此外，DNA的甲基化还可以通过定量PCR法测定，并且用甲基化DNA特异性结合蛋白分离的甲基化DNA可以用荧光探针标记并与含有互补探针的DNA芯片杂交，从而测量甲基化DNA。这里，甲基化DNA特异性结合蛋白可以是，但不限于，MBD2bt(截短的甲基-CpG结合域蛋白2)。

差异性甲基化-甲基化-敏感的限制性内切酶的检测

差异性甲基化的检测可以通过将核酸样品与只裂解未甲基化CpG位点的甲基化敏感限制性内切酶接触来实现。

在一个单独的反应中，将样品进一步接触既裂解甲基化又裂解未甲基化的CpG-位点的甲基化敏感限制酶，从而裂解甲基化的核酸。

将特异性引物加入到核酸样品中，并且通过任何常规的方法扩增核酸。在用甲基化敏感限制酶处理的样品中存在扩增产物而在用甲基化敏感限制酶的同裂酶处理的样品中不存在扩增产物表明在检测的核酸区域中发生了甲基化。但是，在用甲基化敏感限制酶处理的样品中不存在扩增产物以及在用甲基化敏感限制酶的同裂酶处理的样品中不存在扩增产物一起表明在检测的核酸区域中没有甲基化发生。

如本文所用，术语“甲基化敏感限制酶”是指一种限制性酶(例如，SmaI)，其包括CG作为其识别位点的一部分，并且当C被甲基化时相比于C未甲基化时具有活性。甲基化敏感限制酶的非限制性实例包括MspI、HpaII、BssHII、BstUI和NotI。这些酶可以单独使用或组合使用。其它甲基化敏感限制酶的实例包括但不限于：SacII和EagI。

该甲基化敏感限制酶的同裂酶是识别与甲基化敏感限制酶相同的识别位点，但裂解甲基化和未甲基化CG两者的限制性酶。其实例包括MspI。

本发明的引物被设计成与待扩增座位的每条链“基本上”互补，并包括如上所述的适当的G或C核苷酸。这意味着引物必须充分互补以便在聚合反应条件下与它们各自的链杂交。本发明的引物用于酶链式反应(例如PCR)扩增过程中，其中靶标座位通过一些反应步骤呈指数增长。典型地，一个引物与座位的负(-)链同源(反义引物)而另一个引物与正(+)链同源(有义引物)。在引物与变性核酸退火后，核酸通过诸如DNA聚合酶I(Klenow)的酶和注入核苷酸的试剂延伸，结果是，新合成了含有靶标座位序列的+和-链。当这些新合成的序列用作模板，并进行变性、引物退火和延伸的重复循环时，发生靶标座位序列的指数合成。所得的反应产物是具有与采用的特定引物末端相对应末端的离散核酸双螺旋。

扩增反应是本领域中通常使用的PCR。然而，也可以采用替代方法，例如实时PCR或使用等温酶的线性扩增。此外，还可以使用多重扩增反应。

亚硫酸氢盐测序法

用于检测含有甲基化CpG的核酸的另一种方法包括将含核酸的样品与修饰未甲基化胞嘧啶的试剂接触，并使用与甲基化无关的寡核苷酸引物扩增样品中含CpG的核酸。此处，寡核苷酸引物扩增核酸，而不区分修饰的甲基化核酸和未甲基化的核酸。扩增产物使用测序引物通过桑格法测序或由与针对亚硫酸氢盐测序所描述的下一代测序方法进行测序以检测甲基化的核酸。这里，下一代测序方法可以由测序-合成或测序-连接技术执行。此方法的特征在于，代替制备细菌克隆，对单个DNA片段进行空间分离，原位扩增(克隆扩增)，并测序。这里，数十万片段被同时读出，因此，该方法也被称为“大规模并行测序法”。

通常，使用在依次加入单或二核苷酸时获得信号的测序-合成法。这种方法的实例包括焦磷酸测序、离子流，和Solexa法。

基于测序-合成的NGS系统包括454平台(Roche)、HiSeq平台(Illumina)、离子PGM平台(Life Technology)和PacBio平台(PacificBioSciences)。454和离子PGM平台使用再现PCR(emersion PCR)进行克隆扩增，而HiSeq平台使用Bridge扩增。在测序-合成法中，通过检测在依次加入单核苷酸来合成DNA时产生的磷酸盐、氢离子或荧光进行测序。在检测序列的过程中，454平台是基于焦磷酸测序法，而离子PGM平台是基于氢离子的检测。HiSeq和PacBio平台是通过检测荧光执行测序。

测序-连接法是使用DNA连接酶，并且执行用来识别在DNA核苷酸序列的特定位置存在的核苷酸的测序技术。与使用聚合酶的大多数测序技术不同，测序-连接法的特征在于不使用聚合酶并且DNA连接酶不连接错配序列。SOLiD系统对应于这种方法。在该技术中，在测序过程的每一步中读出两个核苷酸。读数通过引物重置被单独重复五次，并且因此每个核苷酸被读两次，使得数据高度准确。

在测序-连接法中，在由16个组合形成的二核苷酸引物组中，顺序连接对应于目的核苷酸序列的二核苷酸引物，并且对连接组合进行最后分析，以确定目的DNA的碱基序列。

使用甲基化DNA特异性结合蛋白或抗体的测序、测序-合成或测序-连接

在使用甲基化DNA特异性结合蛋白或抗体的测序或下一代测序法中，将特异性结合甲基化DNA的蛋白质或抗体与DNA混合，然后使其特异结合甲基化DNA。因此，只有甲基化DNA可以被选择性地分离出来。在本发明中，将基因组DNA与甲基化DNA特异性结合蛋白混合，然后只有甲基化DNA被选择性地分离出来。用PCR引物扩增被分离的DNA，然后使用Sanger法或测序-合成或测序-连接法来测量DNA是否被甲基化。

这里，新一代测序方法可以通过测序-合成或测序-连接法进行。此外，甲基化DNA特异性结合蛋白可以是MBD2bt，但不限于此，并且抗体可以是5'-甲基胞嘧啶，但不限于此。

试剂盒

本发明提供了一种可用于检测受试者的细胞增殖性病症的试剂盒。本发明的试剂盒包含被区室化以在其中容纳样品的载体装置，一个或多个容器，包括含有用于扩增5'-CpG-3'碱基序列的PCR引物的第二容器和含有用于对扩增的PCR产物进行焦磷酸测序的测序引物的第三容器。

载体装置适合于含有一个或多个容器，例如小瓶、管等，每个容器包括用于本方法的分离元件之一。鉴于本文所提供的本发明方法的描述，本领域的技术人员可容易地确定必要试剂在容器中的分配。

基底

在扩增了靶标核酸区域后，可将核酸扩增产物与结合于固体支持物(基底)的已知基因探针杂交来检测核酸序列的存在。

如本文所用，在参照物质、结构、表面或材料使用时，术语“基底”是指包含非生物的、合成的、非存活的(nonliving)平面或圆表面的组合物，它们是迄今为止的包含特异性结合、杂交或催化识别位点或超过包含表面、结构或材料的不同分子种类的数量的多个不同的识别位点或一些不同的识别位点。基底的实例包括，但不限于，半导体、合成(有机)金属、合成的半导体、绝缘体和掺质；金属、合金、元素、化合物和矿物质；合成的、切割的、蚀刻的、平版印刷的、印刷的，机械加工的和微制造的载片、装置、结构和表面；工业聚合物、塑料、膜硅、硅酸盐、玻璃、金属和陶瓷；和木材、纸张、纸板、棉花、羊毛、布、机织和非机织纤维、材料和织物；和双亲表面。

本领域已知的是，一些类型的膜对核酸序列有粘附性。这些膜的具体的非限制性实例包括硝化纤维，或用于检测基因表达的其它膜，例如聚氯乙烯、重氮化纸和其他市售的膜，例如GENESCREEN^TM，ZETAPROBE^TM(Biorad)和NYTRAN^TM。珠、玻璃、晶片和金属基板也包括在内。用于将核酸结合到这些物体的方法是本领域公知的。替代地，筛选可在液相进行。

杂交条件

在核酸杂交反应中，用于实现特定水平的严谨性的条件将根据杂交的核酸的性质而变化。例如，可以在选择杂交条件考虑核酸的杂交区域的长度、互补程度、核苷酸序列组成(例如，GC/AT含量)和核酸类型(例如，RNA/DNA)。另外考虑的是核酸之一是否被固定，例如，在滤纸上。

逐渐提高的严谨性条件的实例如下：在室温下2×SSC/0.1％SDS(杂交条件)；在室温下0.2×SSC/0.1％SDS(低度严谨条件)；在42℃时0.2×SSC/0.1％SDS(中度严谨条件)和在约68℃时0.1X SSC(高度严谨条件)。洗涤可以仅使用其中一个条件，例如，高严谨条件，或者可以按上面列出的顺序使用每一种条件，例如，每种条件10-15分钟，重复任何或所有列出的步骤。然而，如上所述，最佳条件将根据所涉及的特定的杂交反应而变化，并且可凭经验确定。一般而言，高度严谨条件用于目的探针的杂交。

标签

可例如，使用放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合物或酶来可检测地标记目的探针。用这样的探针的适当标记是本领域公知的，并且可以通过任何常规方法进行。

实施例

以下，参照实施例对本发明进行更详细地说明。对本领域的普通技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅仅是说明性的目的，并且不应被解释为限制本发明的范围。

实施例1：在胃息肉患者的组织中对SDC2生物标记基因的甲基化的测量

为了评估SDC2生物标记基因对癌前病变的胃息肉的早期诊断的有用性，从正常胃组织(Biochain；5个样品)和胃息肉患者的石蜡组织(由Chungnam National University Hospital的生物库提供；10个低度发育异常样品，10个高度发育异常样品)分离基因组DNA。从石蜡组织分离基因组DNA是使用QIAamp DNA Micro Kit(Qiagen，德国)根据制造商的说明书进行的。

使用定量焦磷酸测序方法进行甲基化测定。使用EZ DNA甲基化-金试剂盒(Zymo Research，USA)，将200ng分离的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理。当DNA用亚硫酸氢盐处理时，未甲基化的胞嘧啶被修饰为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不变。经亚硫酸氢盐处理的DNA用20μl无菌蒸馏水洗脱并进行焦磷酸测序。采用PSQ分析设计程序(Qiagen，德国)设计为SDC2基因执行焦磷酸测序的PCR和测序引物。用于测量每个基因的甲基化的PCR和测序引物示于表1。

表1

[表1]

用于亚硫酸氢盐PCR和焦磷酸测序的引物

^a Y＝C或T；R＝A或G

^b与转录起始位点(+1)的距离(核苷酸)：CpG区域在用于测量甲基化的基因组DNA上的位置

将20ng经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA进行PCR扩增。在PCR扩增中，使用PCR反应液(20ng经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA，5μl的10×PCR缓冲液(Enzynomics，韩国)，5单位Taq聚合酶(Enzynomics，韩国)，4μl的2.5mM的dNTP(Solgent，韩国)和2μl(10pmol/μl)的PCR引物)，并在以下条件下进行PCR反应：95℃预变性5min，然后45个循环：95℃变性，40sec，60℃退火45sec和72℃延伸40sec，然后在72℃最终延伸5min。通过2.0％琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物的扩增。

扩增的PCR产物用PyroGold试剂(Biotage，USA)处理，然后使用PSQ96MA系统(Biotage，USA)根据制造商的说明进行焦磷酸测序。在焦磷酸测序后，通过计算甲基化指数测量DNA的甲基化水平。甲基化指数是通过测定结合到每个CpG岛的胞嘧啶的平均比率来计算的。

结果是，可以从图1看出，正常胃组织没有表现出甲基化，低度发育异常显示出90.0％(9/10)的甲基化频率，而高度发育异常显示出100％(10/10)的甲基化频率。

这样的结果表明，即使在作为胃癌的癌前病变的胃息肉的情况下，SDC2生物标记基因也显示出高水平和频率的甲基化，这表明SDC2生物标记基因可用作用于诊断胃息肉和早期诊断胃癌的生物标记物。

实施例2：在胃癌细胞株和胃癌组织中的生物标记基因的甲基化的测量

为了检查在胃息肉中被证实甲基化的SDC2生物标记基因是否也可用作诊断胃癌的生物标记物，以与实施例1中所述相同的方式进行焦磷酸测序。

使用QIAamp DNA迷你试剂盒(Qiagen，德国)根据制造商的说明书，从胃癌细胞株AGS(Korean Cell Line Bank(KCLB No.21739)以及41位胃癌患者的癌症组织和与癌症组织相邻的正常组织(由ChungnamNational University Hospital的Biobank提供)分离基因组DNA。使用EZDNA甲基化-金试剂盒(Zymo Research，USA)，将200ng分离的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理。当基因组DNA用亚硫酸氢盐处理时，未甲基化的胞嘧啶被修饰为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不变。经亚硫酸氢盐处理的DNA用20μl无菌蒸馏水洗脱并进行焦磷酸测序。

图2A示出了通过焦磷酸测序法定量测定在胃癌细胞株中的SDC2生物标记基因的甲基化水平的结果。如可以从其中看出，SDC2生物标记基因在胃癌细胞株AGS中高水平表达。这表明，SDC2基因显示出在胃癌细胞株中的高水平甲基化，表明SDC2基因作为诊断胃癌的生物标记物是有用的。

为了验证这个暗示，进行对胃癌组织样品中的SDC2基因的甲基化的验证实验。

为了验证SDC2基因在胃癌组织中的甲基化，以与实施例1中所述相同的方式测量胃癌组织在不同疾病阶段(疾病阶段1：13人；疾病阶段2：9人；疾病阶段3：11人；和疾病阶段4：8人)的SDC2基因的甲基化水平。

结果是，如图2B所示，SDC2基因在胃癌组织中的甲基化水平比正常人的胃组织和与胃癌组织相邻的正常胃组织显著更高。

此外，为了评估SDC2基因对胃癌诊断的灵敏度和特异性，进行ROC曲线分析。结果是，该基因显示出90.2％的高灵敏度和100％的非常高的特异性(图2C)。这样的结果表明，SDC2甲基化生物标记基因在胃癌的诊断中是有用的。

实施例3：SDC2生物标记基因的甲基化在胃癌患者血清中的测量

为了使用血清检查SDC2生物标记基因作为胃癌诊断的生物标记物的有用性，通过定量甲基化特异性实时PCR(qMSP)法测量在胃癌患者的血清中的SDC2生物标记基因的甲基化。

为了这个目的，设计两个能够特异扩增经亚硫酸氢盐处理过的甲基化SDC2基因的PCR引物(IDT，美国)和荧光探针(IDT，USA)。为确定用亚硫酸氢盐处理的血清DNA的量和质量，将ACTB基因用作内部对照。在qMSP中使用的PCR引物和荧光探针的序列示于下表2中。

表2

[表2]

用于qMSP的引物的和荧光探针序列

使用DynalBeads SILANE viral NA试剂盒(Invitrogen)根据制造商的说明，从800μl血清中分离基因组DNA。使用EZ DNA甲基化-金试剂盒(Zymo Research，USA)，用亚硫酸氢盐处理经分离的基因组DNA，然后用20μl无菌蒸馏水洗脱并用于qMSP。将1/3量的经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA用于qMSP。使用Rotor Gene-Q Real Time PCR系统(Qiagen,Germany)，用Rotor Gene Probe Kit(Qiagen,Germany)进行实时PCR。将20μl最终体积在以下条件下进行实时PCR：对于SDC2，95℃，10min，以及50个循环，每个循环由95℃，10sec，62℃，1sec，和72℃，20sec组成；对于ACTB，95℃，10min，以及50个循环，每个循环由95℃，10sec，58℃，60sec组成。甲基化水平为由比较循环阈值(CT)法测量的甲基化参照百分数(PMR)，并且使用胃癌细胞株AGS(Korean Cell LineBank(KCLB No.21739))的人工甲基化的基因组DNA作为参照。用以下的公式计算PMR：PMR＝2^-△△CtX100；△△Ct＝[(C_tSDC2-C_tACTB)样品]-[(C_tSDC2-C_tACTB)_AGS]。

为了评估在血清中SDC2生物标记基因诊断胃癌的能力，将130位正常人和40位胃癌患者的血清中的DNA进行qMSP。

结果是，从图3A可以看出，正常人的血清显示出SDC2生物标记基因很少或没有甲基化，而胃癌患者的血清显示出SDC2生物标记基因在高水平和频率的甲基化。具体地讲，在胃癌的疾病阶段1和2的血清显示出SDC2生物标记基因的高水平和频率的甲基化。

为了测量SDC2生物标记基因对胃癌诊断的灵敏度和特异性，使用的MedCalc程序(MedCalc，比利时)进行ROC曲线(Receiver OperatingCharacteristic)分析。

结果是，如图3B中所示，SDC2基因显示出分别为80.0％和96.9％的灵敏度和特异性，这表明它具有非常高的诊断胃癌的能力。具体地讲，SDC2基因对早期胃癌或晚期胃癌表现出80.0％的灵敏度，这表明它对于胃癌的早期诊断是有用的。

实施例4：SDC2生物标记基因在其它实体癌组织中的甲基化的测量

为了检查SDC2生物标记基因是否可具体用作胃息肉和胃癌特异性诊断标记物，对其他类型的癌症进行实验。为了将SDC2生物标记基因作为标记物用于胃息肉或胃癌的诊断，它在除了患者以外的正常人的各种器官组织以及在其他实体癌组织中不应该被甲基化。

为了验证SDC2生物标记基因是否满足此要求，使用QIAamp DNA迷你试剂盒(QIAGEN，美国)，从除了患者以外的正常人的各种器官组织(Biochain)、各种实体癌组织和与癌症组织相邻的正常组织(由Chungnam National University Hospital的Biobank提供)分离基因组DNA。使用EZ DNA甲基化-金试剂盒(Zymo Research，USA)，将200ng经分离的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理，然后用20μl无菌蒸馏水洗脱并用于焦磷酸测序。

将20ng经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA进行PCR扩增。在PCR扩增中，使用PCR反应液(20ng经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA，5μl的10×PCR缓冲液(Enzynomics，韩国)，5单位Taq聚合酶(Enzynomics，韩国)，4μl的2.5mM的dNTP(Solgent，韩国)和2μl的PCR引物(10pmol/μl))，并在以下条件下进行PCR反应：95℃预变性5min，然后45个循环：95℃变性，40sec，60℃退火45sec和72℃延伸40sec，然后在72℃最终延伸5min。通过2.0％琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物的扩增。

扩增的PCR产物用PyroGold试剂(Biotage，USA)处理，然后使用PSQ96MA系统(Biotage，USA)根据制造商的说明进行焦磷酸测序。在焦磷酸测序后，通过计算甲基化指数测量SDC2生物标记基因的甲基化水平。甲基化指数是通过测定结合到每个CpG岛的胞嘧啶的平均比率来计算的。

结果是，如从图4中可以看出，SDC2生物标记基因的甲基化水平在所有肺癌组织、乳腺癌组织、肝癌组织、宫颈癌组织和前列腺癌组织中为10％或更低。这表明，SDC2生物标记基因在胃癌组织中被特异性地甲基化。这样的结果表明，SDC2生物标记基因可作为生物标记物不仅用于胃癌特异性诊断，而且用于肠癌症的诊断。

实施例5：在胃息肉患者血清中的SDC2生物标记基因的甲基化的测量

为了确认SDC2生物标记基因在血清胃息肉的诊断中的有用性，通过定量甲基化特异性实时PCR(qMSP)法测量SDC2生物标记基因在胃癌息肉患者的血清中的甲基化。按与实施例3所述相同的方式进行qMSP。

为了评估SDC2生物标记基因在血清中诊断胃息肉的能力，在通过胃镜确认的12名正常人、5名增生性息肉患者和16名腺瘤性息肉患者的血清DNA中进行qMSP。甲基化水平表示为SDC2基因的循环阈值(Ct)，并且当由于未被甲基化而不形成Ct值时，Ct值表示为40。

结果是，如在图5A所示，12名正常人的血清没有显示出SDC2基因的甲基化，而胃息肉患者的血清显示出SDC2基因的高水平和频率的甲基化。

为了测量SDC2生物标记基因对胃癌息肉诊断的灵敏度和特异性，使用MedCalc程序(MedCalc中，比利时)进行ROC曲线(Receiver OperatingCharacteristic)分析。

结果是，如从图5B中可以看出，对于全部胃息肉患者，SDC2基因分别表现出61.9％(13/21)和100％的灵敏度和特异性，这表明它具有优异的诊断胃息肉的能力。此外，SDC2基因对于增生性息肉表现出40％(2/5)的灵敏度，和对于腺瘤性息肉为68.8％(11/16)的灵敏度。因此，发现，SDC2基因对于血液中的胃息肉诊断是非常有用的。

虽然已参照具体特征对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员显而易见的是该描述仅仅用于优选实施方式，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来限定。

工业实用性

如上所述，本发明的作用在于可以检测胃息肉和胃癌特异性标记基因的CpG岛的甲基化，从而提供用于诊断胃癌的信息。

使用根据本发明的甲基化检测方法或根据本发明的诊断组合物、试剂盒或核酸芯片使得有可能在早期转变阶段诊断胃癌，从而能够进行胃癌的早期诊断。另外，本发明的方法相比于常规方法能使胃癌以准确和快速的方式被有效地诊断。

序列表

电子文本。

Claims

1.一种用于诊断胃癌的组合物，包括能够检测多配体聚糖2(SDC2)基因的CpG岛的甲基化的物质。

2.一种用于诊断胃息肉的组合物，包括能够检测多配体聚糖2(SDC2)基因的CpG岛的甲基化的物质。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述CpG岛是位于SDC2基因的启动子区、5'-非翻译区、外显子和内含子中的任一上。

4.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述SDC2基因的CpG岛包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

5.如权利要求1或2所述的组合物，其中能够检测CpG岛的甲基化的物质是选自以下组中的任一种：能够扩增包含甲基化的CpG岛的片段的引物对、能够杂交甲基化的CpG岛的探针、测序引物、测序-合成引物和测序-连接引物。

6.如权利要求5所述的组合物，其中能够检测CpG岛的甲基化的物质进一步包括能够结合到甲基化的CpG岛的甲基化特异性结合蛋白或甲基化特异性结合的抗体。

7.一种用于诊断胃息肉或胃癌的修饰核酸，源自示于SEQ ID NO：1的SDC2(多配体聚糖-2)基因片段，其中所述修饰核酸是通过修饰SDC2基因片段，使得在杂交过程中在SDC2基因片段中的至少一个胞嘧啶残基将被修饰为尿嘧啶或除了胞嘧啶以外的核苷酸而获得的。

8.如权利要求7所述的修饰核酸，所述修饰核酸包含示于SEQ IDNO：23的序列。

9.一种诊断胃息肉或胃癌的试剂盒，包括：PCR引物对，用于扩增包含多配体聚糖2(SDC2)基因的CpG岛的片段；和测序引物，用于对所述引物对扩增的PCR产物进行焦磷酸测序。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述PCR引物对和测序引物是这样的PCR引物对和测序引物，其在通过用对甲基化DNA和未甲基化DNA进行不同修饰的试剂处理来修饰包括CpG岛的片段后，检测CpG岛的甲基化。

11.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述PCR引物对是示于SEQ IDNO：2和3的引物对，或示于SEQ ID NO：5和6的引物对。

12.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述测序引物是示于SEQ IDNO：4或7的引物。

13.一种检测胃癌的方法，包括步骤：

(a)分离来自临床样品的DNA；和

(b)在分离的DNA中，测量作为胃癌生物标记物的SDC2(多配体聚糖-2)基因的CpG岛的甲基化，以检测胃癌。

14.一种检测胃癌息肉的方法，包括步骤：

(a)分离来自临床样品的DNA；和

(b)在分离的DNA中，测量作为胃息肉生物标记物的SDC2(多配体聚糖-2)基因的CpG岛的甲基化，以检测胃息肉。

15.如权利要求13或14所述的方法，其中从临床样品分离的DNA用对甲基化DNA和未甲基化DNA进行不同修饰的试剂进行处理，然后测量处理过的DNA的甲基化。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述试剂是亚硫酸氢盐。

17.如权利要求13或14所述的方法，其中步骤(b)是通过测量所述基因的启动子、5'非翻译区(UTR)、内含子和外显子区域中的任一个的甲基化来进行的。

18.如权利要求13或14所述的方法，其中步骤(b)是通过测量在SDC2基因中具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的区域的CpG岛的甲基化来进行的。

19.如权利要求13或14所述的方法，其中所述CpG岛的甲基化是通过使用具有示于SEQ ID NO：23的序列的修饰核酸来测量的。

20.如权利要求13或14所述的方法，其中步骤(b)是通过选自下组的方法来进行的：PCR、甲基化特异性PCR、实时甲基化特异性PCR、使用甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR、使用甲基化DNA特异性结合抗体的PCR、定量PCR、DNA芯片、测序、测序-合成以及测序-连接技术。

21.如权利要求13或14所述的方法，其中所述临床样品是选自疑似癌症患者或待诊断受试者的组织、细胞、血液、血浆、粪便和尿液。

22.一种用于诊断胃癌的核酸芯片，包括固定在其上的探针，所述探针能够在严谨条件下与包括多配体聚糖2(SDC2)基因的CpG岛的片段杂交。

23.一种用于诊断胃息肉的核酸芯片，包括固定在其上的探针，所述探针能够在严谨条件下与包括多配体聚糖2(SDC2)基因的CpG岛的片段杂交。

24.如权利要求22或23所述的核酸芯片，其中所述探针选自由示于SEQ ID NO：8-19的碱基序列组成的组。

25.如权利要求22或23所述的方法，其中所述探针是当将其与对甲基化DNA和未甲基化DNA进行不同修饰的试剂处理来修饰包括CpG岛的片段所获得的核酸片段一起处理时，能够与包括CpG岛被甲基化的DNA的片段对应的相应修饰核酸片段杂交的探针。