KR101284014B1

KR101284014B1 - 위암 진단을 위한 위암 특이적 메틸화 바이오마커

Info

Publication number: KR101284014B1
Application number: KR1020100117372A
Authority: KR
Inventors: 안성환; 문영호; 노승무; 송규상; 윤치왕; 오태정; 김명순; 오명석
Original assignee: (주)지노믹트리
Priority date: 2010-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2013-07-09
Also published as: WO2012070861A3; WO2012070861A2; KR20120055917A

Abstract

본 발명은 위암 진단을 위한, 위암 특이적인 바이오마커 유전자의 메틸화 검출방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 위암 세포에서 특정 유전자의 CpG 섬 부위가 특이적으로 메틸화되는 위암 특이적 바이오마커의 메틸화를 검출하여 위암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/ FMR2 family, member 2) 유전자의 CpG 섬의 메틸화 검출방법을 이용하면, 위암을 초기 형질전환 단계에서 진단할 수 있어, 조기진단이 가능하고 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 위암 및 위암의 진행단계를 진단할 수 있다.

Description

위암 진단을 위한 위암 특이적 메틸화 바이오마커 {Methylation Biomarker of Gastric Cancer Specific for Gastric Cancer Diagnosis}

본 발명은 위암 진단을 위한, 위암 특이적인 바이오마커의 메틸화 검출방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 위암 세포에서 특정유전자의 CpG 섬 부위가 특이적으로 메틸화되는 위암 특이적 바이오마커의 메틸화를 검출하여 위암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

현대 의약분야의 발전에도 불구하고, 암의 대부분을 차지하는 고형암(혈액암외의 암)은 5년 생존율이 50%도 되지 않는다. 모든 암 환자의 3분의 2 가량이 암이 진행된 상태에서 발견되며, 이들 중 대부분이 암 진단을 받은 후 2년 안에 사망한다. 이러한 결과가 나타나는 것은 암 치료 방법의 문제뿐만 아니라, 초기 단계에서 암을 진단하거나, 진행된 암을 정확하게 진단하거나, 새로이 개발된 치료제에 대한 예후를 관찰하기가 쉽지 않기 때문이다.

최근 임상에서의 암 진단은 전형적으로 병력 조사, 물리적 검사 및 임상적 평가 후 조직 생검을 수행하여 확인하고 있다. 그러나 임상 실험에 의한 암 진단은 암 세포의 수가 10억 개 이상이고 암의 직경이 1cm 이상일 경우에만 가능하다. 이 경우, 상기 암 세포는 이미 전이능력을 가지고 있으며, 적어도 이들 중의 반은 이미 전이된 것이다. 반면, 암으로부터 직접 또는 간접적으로 생산되는 물질을 모니터링하기 위한 종양 마커가 암 스크리닝에 사용되고 있지만, 암이 존재하는 경우에도 반 이상이 정상으로 나타나고, 암이 없는 경우에도 자주 양성으로 나타나기 때문에, 정확성에 한계가 있어 혼란을 초래하고 있다. 게다가, 암 치료에 주로 사용되는 항암물질은 종양의 크기가 작을 때만 효과를 나타낸다는 문제가 있다.

암의 진단 및 치료가 어려운 이유는 암세포가 매우 복잡하고 다양하기 때문이다. 암세포는 과도하게 계속적으로 자라고, 주변 조직으로 침투하며, 말단 기관으로 전이하여 결국 죽음에 이르게 한다. 면역 체계나 항암 치료의 공격에도 불구하고, 암세포는 살아남아서, 계속해서 진화하며, 생존하기에 가장 알맞은 세포그룹으로 선택적으로 전파된다. 암세포는 수많은 유전자의 변이에 의하여 발생하는 고도의 생명력을 가지는 살아있는 생명체이다. 하나의 세포가 암세포로 형질 전환되고, 병원에서 진단가능한 악성의 암 덩어리로 발달하기 위해서는, 수많은 유전자 변이가 일어나야만 한다. 그러므로, 근원에서 암을 진단하고 치료하기 위해서는 유전자 수준의 접근이 필요하다.

최근, 유전자 분석이 암 진단에 적극적으로 시도되고 있다. 가장 간단하고 전형적인 방법은 PCR을 이용하여 혈액 내의 ABL:BCR 퓨전 유전자(백혈병의 유전적 특징)의 존재를 검출하는 것이다. 상기 방법은 95% 이상의 정확성을 가지고 있으 며, 간단하고 쉬운 이러한 유전자 분석을 이용하여 만성 골수성 백혈병을 치료하 고, 결과 평가 및 후속 연구에 사용된다. 그러나 상기 방법은 소수의 혈액 암에만 적용된다는 결점이 있다.

최근에는, 혈청 또는 혈장의 DNA를 이용한 유전자 테스트가 적극적으로 시도되고 있다. 상기 방법은 암세포에서 분리되어 혈액으로 분비되고, 혈청에서 자유 DNA 형태로 존재하는 암 관련 유전자를 검출하는 것이다.

혈청에 존재하는 DNA의 농도는 정상인보다 실제 암 환자에서 5~10배 높게 나타난다는 것이 확인되었으며, 이러한 증가된 DNA는 대부분 암 세포에서 유래된 것이다. 암 세포로부터 분리된 DNA 등을 이용한, 돌연변이, 삭제 또는 종양유전자 및 종양-억제 유전자의 기능적 소실과 같은 암-특이적 유전자 이상을 분석하여 암을 진단할 수 있다.

혈청 내의 변이된 K-Ras 종양유전자, p53 종양-억제 유전자 및 p-16 유전자의 프로모터 메틸화와 마이크로세틀라이트의 표지 및 불안정성을 검토하여 폐암, 두경부암, 유방암, 대장암 및 간암을 진단하려는 적극적 시도가 있었다 (Chen, X. et al., Clin . Cancer Res., 5:2297, 1999; Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedes. M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Sozzi, G. et al., Clin . Cancer Res., 5:2689, 1999).

혈액 외의 샘플에서도 암세포의 DNA는 검출될 수 있다. 폐암 환자의 객담 또는 기관지폐포 세척액에서 유전자 또는 항체 테스트를 이용하여 암세포의 존재를 검출하는 방법이 시도되었다 (Palmisano, W. et al., Cancer Res., 60:5954, 2000; Sueoka, E. et al., Cancer Res., 59:1404, 1999). 덧붙여, 암 환자의 대장 및 직장 배설물에서 종양유전자의 존재를 검출하는 방법(ahlquist, D. et al., Gastroen terol., 119:1219, 2000) 및 뇨 및 전립선 액에서 프로모터 메틸화 이상을 검출하는 방법(Goessl, C. et al., Cancer Res., 60L:5941, 2000)이 시도되었다. 그러나, 수많은 유전자의 이상을 초래하고, 각 유전자의 다양한 변이 특징을 보여주는 암을 정학하게 진단하기 위해서는, 많은 수의 유전자를 정확하고 자동화된 방식으로 동시에 분석하는 방법이 요구되지만, 이러한 방법은 아직까지 수립되어 있지 않다.

따라서, DNA 메틸화의 측정을 통하여 암을 진단하는 방법을 제안하고자 한다. 특정 유전자의 프로모터 CpG 섬이 하이퍼-메틸화되면, 상기 유전자는 발현이 억제된다. 비록 생체에서 유전자의 단백질-코딩 서열에서 변이가 없더라도 상기 유전자의 기능이 손실되어 주된 메카니즘이 방해받게 된다. 또한, 인간 암에서 수많은 종양 억제 유전자가 기능을 잃는 것 또한 한 인자로 분석된다. 그러므로, 종양 억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검출하는 것이 암 연구에 있어서 절실히 요구된다. 최근에는, 암 진단 및 스크리닝을 위한 메틸화 특이적 PCR(이후, MSP라고 함) 또는 자동 DNA 시퀀싱과 같은 방법에 의하여 프로모터 메틸화를 결정하는 방법이 적극적으로 시도되고 있다.

포유동물 세포의 게놈 DNA에서는 A, C, G 및 T에 더하여, 시토신 링(5-mC)의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸시토신(5-methylcytosine)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-mC는 CpG라고 불리는, CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에만 부착된다. CpG의 C는 메틸그룹의 접촉에 의하여 대부분 메틸화된다. CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생성 변화가 자주 일어나는 부위이다. 상기 CpG의 5-mC는 자연적으로 탈아미노화하여 T가 되고, 포유동물 게놈의 CpG는 단지 1%의 확률로 나타나는데, 이는 정상적 확률(1/4×1/4=6.25%)보다 매우 낮은것이다.

CpG가 예외적으로 모여 있는 부위를 CpG 섬이라 한다. CpG 섬은 C+G 함유량이 50%이상이고, CpG 비율이 3.75%이상인 0.2~3kb 길이의 부위를 말한다. 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 있으며, 이들 대부분이 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에서 발견된다. 실제로, 상기 CpG 섬은 인간 유전자의 약 50%에 달하는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 프로모터에서 발견된다(Cross, S. & Bird, A., Curr . Opin . Gene Develop., 5:309, 1995).

정상인의 체세포에서, 상기 하우스키핑 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬은 비메틸화되어 있으며, 임프린티드(imprinted) 유전자 및 비활성화 상태의 X 염색체 상의 유전자와 같이 발달과정 동안 발현되지 않는 유전자들은 메틸화되어 있다.

암 유발 과정 동안, 프로모터 CpG 섬에서 메틸화가 발견되며, 해당하는 유전자의 발현이 억제된다. 특히, 세포 사이클 또는 세포자살(apoptosis)을 조절하고, DNA를 복구하며, 세포 부착 및 세포간의 상호작용에 관여하고, 세포 침입 및 전이를 억제하는 종양 억제 유전자의 프로모터 CpG 섬이 메틸화되면, 이러한 메틸화는 코딩 서열의 돌연변이와 같은 방식으로 상기 유전자의 발현과 기능을 억제하게 되고, 이에 의하여 암의 발달과 진행이 촉진되게 된다. 또한, 노화에 의하여 CpG 섬의 부분적 메틸화도 일어난다.

흥미로운 사실은, 유전자의 돌연변이가 선천적 암의 발달에 영향을 미치고, 후천성 암에서는 돌연변이가 발생하지 않은 유전자의 경우, 프로모터 CpG 섬의 메틸화가 돌연변이 대신에 일어난다는 것이다. 전형적인 예로, 후천적 신장암 VHL (von Hippel Lindau), 유방암 BRCA1, 대장암 MLH1 및 위암 E-CAD가 포함된다. 또한, 모든 암의 반 정도에서 p16의 프로모터 메틸화 또는 Rb의 돌연변이가 발생하며, 나머지 암들에서는 p53의 돌연변이나, p73, p14 등의 프로모터 메틸화가 나타난다.

중요한 사실은 프로모터 메틸화에 의한 후생성 변화가 유전적 변화(예를 들면, 코딩서열의 돌연변이)를 일으키고, 암의 발달이 상기와 같은 유전적 및 후생적 변화의 조합에 의하여 진행된다는 것이다. 한 예로, MLH1 유전자의 경우, 대장암에서 MLH1 유전자의 하나의 대립유전자의 기능이 변이나 삭제에 의하여 손실되고, 나머지 하나의 대립유전자는 프로모터 메틸화에 의하여 기능을 수행하지 못하는 상황이 된 것이다. 또한, DNA 복구 유전자인 MLH1이 프로모터 메틸화에 의하여 기능을 수행하지 못한다면, 다른 주요 유전자에서 돌연변이가 발생해 암 발생을 더욱 촉진시킬 수 있는 것이다.

대부분의 암은 CpG에 대하여 종양 억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 하이퍼메틸화, 나머지 CpG 염기 부위의 하이퍼메틸화 및 DNMT(DNA cytosine methyltrans ferase)라 불리는 메틸화 효소의 활성 증가라는 세가지 특징을 나타낸다 (singal, R. & Ginder, G., Blood, 93:4059, 1999; Robertson, K. & Jones, P., Carcino gensis, 21:461, 2000; Malik, K. & Brown, K., Brit . J. Cancer, 83:1583, 2000).

프로모터 CpG 섬이 메틸화될 때, 해당하는 유전자의 발현이 왜 억제되는지에 대해서는 아직까지 완전하게 밝혀지지 않았으나, MECP(methyl CpG-binding protein) 또는 MBD(methyl CpG-binding domain protein) 및 히스톤 디아세틸라아제가 메틸화된 시토신에 부착되고, 이에 의하여 염색체의 크로마틴 구조가 변화되어, 히스톤 단백질이 변화되기 때문일 것이라는 가설이 있다.

프로모터 메틸화를 이용하여 암 진단의 정확성을 극대화하고, 각 단계에 따른 암의 발달을 분석하고, 암과 노화에 따른 변화를 구별하기 위하여, 프로모터 CpG 섬의 모든 시토신 염기의 메틸화를 정확하게 분석할 수 있는 방법이 필요하다.

정통적인 방법은 CpG 섬을 포함하는 유전자 부위를 메틸화 특이적 PCR(MSP)에 의하여 증폭하는 것과 염기서열 분석 방법(바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법)을 함께 사용한다. 그러나 진단, 초기 진단 또는 임상 실험에서의 다양한 암의 각 단계를 평가하는데 사용할 수 있는, 많은 유전자의 프로모터 메틸화의 다양한 변화를 정확하고, 신속하게 자동화 방식으로 분석할 수 있는 방법은 아직 없다.

메틸화와 관련된 새로운 종양 억제 유전자의 스크리닝 분야에 대한 많은 연구가 수행되어왔다. 지금까지의 스크리닝 방법으로는 주로 기존문헌을 참고하여 여러 가지 암에서 메틸화되어있다고 알려진 종양억제 유전자들을 대상으로 스크리닝 하는 방법이 이용되어 왔다. 최근에는 암세포주에 디메틸화제를 처리하여 디메틸화제를 처리하지 않은 세포주와 비교하여, 디메틸화제를 처리한 세포주에서 디메틸화에 의해 발현이 증가하는 유전자들을 스크리닝하는 방법이 개발되었다 (Suzuki et al., 2002., Nature Genetics, 31: 141-149). 그러나 이 방법은 조직 유래의 임상시료를 이용한 유전자 발현 분석을 수행하기 않고, 암세포주 대상의 디메틸화 현상만을 이용하여 메틸화 관련 종양 유전자를 스크리닝 하였기 때문에 정확도가 높은 메틸화 관련 유전자를 탐색하는데는 비효율적이다. 따라서 임상적용에서 민감도와 특이도가 높은 종양 관련 메틸화 유전자를 스크리닝 하기 위해서는 조직 특이적이고 암 특이적인 메틸화 관련 종양 억제 유전자를 스크리닝 하는 체계적인 방법의 개발이 필요하였다.

이에, 본 발명자들은 위암조직에서 특이적으로 메틸화되는, 정확도가 높은 메틸화 관련 종양 억제 유전자를 효과적으로 스크리닝하여, 위암진단을 위한 위암 특이적 바이오마커로서 제공하고자 예의 노력한 결과, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, recep tor, type 3) 및 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 CpG 섬 부위가 위암세포에서 특이적으로 메틸화되는 것을 확인하고, 이를 바이오마커로 이용하여 메틸화 정도를 측정함으로써, 위암을 진단할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 위암 특이적 바이오마커 및 이를 이용하여 조기에 위암을 진단하기 위한 키트 및 칩을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 CpG 섬을 함유하는 위암 진단용 바이오마커를 제공한다.

본 발명은 또한, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 프라이머쌍을 함유하는 위암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 바이오마커과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 위암 진단용 핵산 칩을 제공한다.

본 발명은 또한, DNA를 함유한 임상샘플로부터 상기 바이오마커의 메틸화를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 위암 특이적 마커 유전자의 CpG 섬을 포함하는 바이오마커를 제공함으로써, 위암 진단을 위한 정보를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 위암 특이적 바이오마커와 키트, 핵산 칩 및 바이오마커의 메틸화 검출방법을 이용하면, 위암을 초기 형질전환단계에서 진단할 수 있어 조기 진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 위암을 진단할 수 있어 유용하다.

도1 은 위암 혈청과 정상인 혈청 DNA로부터 메틸화 DNA를 분리하여 CpG 마이크로어레이 분석과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 과메틸화된 프로브 및 과메틸화된 유전자를 선별하여 4종의 바이오마커 후보를 선별하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 위암세포주, 정상인 위조직 그리고 수술환자의 위암 조직 및 이와 연접하는 정상소견 조직에서 4종 바이오마커 후보 유전자의 MSP를 통한 PCR 산물을 전기영동한 결과이다.
도 4는 위암세포주, 정상인 및 위암환자 조직에서 AFF2 및 NTRK3 유전자의 파이로시퀀싱을 통한 메틸화 측정 결과이다.
도 5는 정상인 및 위암환자 위액세포 DNA에서 AFF2 및 NTRK3 유전자의 MSP를 통한 PCR 산물을 전기영동한 결과이다.
도 6은 정상인 및 위암환자 혈청 DNA에서 AFF2 유전자의 MSP를 통한 PCR 산물을 전기영동한 결과이다.
도 7은 정상인 및 위암환자 혈청 DNA에서 NTRK3 유전자의 MSP를 통한 PCR 산물을 전기영동한 결과이다.
도 8은 정상인 및 위암환자 혈청에서 AFF2 및 NTRK3 유전자의 메틸화 상태를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 CpG 섬을 함유하는 위암 또는 위암 진행단계 진단용 바이오마커 또는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 CpG 섬은 NTRK3 유전자의 프로모터 또는 5' UTR 부위와 AFF2 유전자의 5' UTR, 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론 부위 중 어느 하나 이상의 영역에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 NTRK3 유전자의 프로모터 및 5' UTR 부위를 포함하는 영역은 서열번호 1로 표시되는 서열임을 특징으로 할 수 있고, AFF2 유전자의 5' UTR, 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론 부위를 포함하는 영역은 서열번호 2로 표시되는 서열임을 특징으로 할 수 있다.

이때, NTRK3 유전자의 프로모터 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, -250~-1nt까지의 서열로, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. NTRK3 유전자의 5' UTR 부위 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +1~+277nt까지의 서열로, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 NTRK3 유전자의 프로모터 및 5' UTR 부위를 포함하는 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, -250~+277nt까지의 영역으로, 서열번호 1로 표시되는 서열임을 특징으로 할 수 있다.

이때, AFF2 유전자의 5' UTR 부위 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +479nt까지의 서열로, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 첫 번째 엑손 부위 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +480~+526nt까지의 서열로, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 첫 번째 인트론 부위 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +527~+800nt까지의 서열로, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 AFF2 유전자의 5' UTR, 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론 부위를 포함하는 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +301~+800nt까지의 영역으로 서열번호 2로 표시되는 서열임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 프라이머쌍을 함유하는 위암 또는 위암 진행단계 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 8 및 9 또는 서열번호 12 및 13로 표시되는 서열인 것을 특징으로 할 수 있다.

MSP 프라이머

유전자	프라이머 서열 (5-->3)
유전자		전방프라이머	후방프라이머
AFF2	메틸화 특이 프라이머	GGAGAGTCGGGGGTCGTCGAGAATC (서열번호8)	GACGAACGAACGCCTATCCCTAATCGCA (서열번호9)
AFF2	비메틸화 특이 프라이머	TGGAGAGTTGGGGGTTGTTGAGAATTGT (서열번호10)	AACAAACAAACACCTATCCCTAATCACA (서열번호11)
NTRK3	메틸화 특이 프라이머	TTTTAGAGTTTTCGGATTCGGCGAGTTAGC (서열번호12)	ATAAAAACCGCGAAAAACGCCTAATAACGC (서열번호13)
NTRK3	비메틸화 특이 프라이머	TAGAGTTTTTGGATTTGGTGAGTTAGTGA (서열번호14)	ATAAAAACCACAAAAAACACCTAATAACAC (서열번호15)

본 발명은 다른 관점에서, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 CpG 섬을 포함하는 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 위암 또는 위암 진행단계 진단용 핵산 칩에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 서열번호 24 내지 서열번호 33으로 표시되는 서열 중 어느 하나 이상의 서열이 프로브로서 고정되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

AFF2 유전자
probe1	gca gcagtggtag gtgttgattt	서열번호 24
probe2	gca gcagtggtag gtgttgattt ttgccttctc	서열번호 25
probe3	ttgccttctc ctttgatgag cgagtctcct ggcgaagtct gaggttttcg	서열번호 26
probe4	gcagtggtag gtgttgattt ttgccttctc ctttgatgag cgagtctcct ggcgaagtct gaggttttcg cctttgttaa	서열번호 27
probe5	gtgttgattt ttgccttctc ctttgatgag cgagtctcct ggcgaagtct gaggttttcg	서열번호 28
NTRK3 유전자
probe6	cgcgcctcgc ttccagagcc	서열번호 29
probe7	cgcgcctcgc ttccagagcc cccggacccg	서열번호 30
probe8	gatcgccgag ccggccacca tgcccggcag accgcgccac	서열번호 31
probe9	ccggccacca tgcccggcag accgcgccac taggcgctcc tcgcggctcc	서열번호 32
probe10	cgcgcctcgc ttccagagcc cccggacccg gcgagtcagc gatcgccgag ccggccacca tgcccggcag accgcgccac taggcgctcc tcgcggctcc cacccggcgg cggcggcggc	서열번호 33

본 발명에서는 NTRK3 또는 AFF2 유전자의 메틸화 상태를 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 검출하는 것에 의하여, 검체에 존재하는 위 조직의 세포 성장성 이상(이형증)을 진단할 수 있다.

본 발명의 진단용 키트 또는 핵산 칩을 이용하면 검체의 위 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증 진행도)을 결정할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 위 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증)이 없는 검체로부터 분리한 핵산의 메틸화 단계와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 위암 세포를 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 위암을 진단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 정상 표현형을 나타내는 샘플을 이용하여 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 위암으로 진행될 수 있는 가능성을 진단할 수 있다. 상기 샘플은 고체 또는 액체 조직, 세포, 소변, 대변, 혈청 또는 플라즈마를 사용할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, DNA를 함유한 임상샘플로부터 NTRK3 (GenBank NM_001007156,neurotro phic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자의 CpG 섬을 함유하는 위암 또는 위암 진행단계 진단용 바이오마커의 메틸화를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 위암세포에서 특이적으로 메틸화되어 있는 유전자 중, NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotroph ic tyrosine kinase, receptor, type 3) 또는 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자가 위암 및 위암 진행단계 진단에 유용함을 확인하였다.

본 발명에 따른 메틸화 마커 유전자를 스크리닝하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 형질전환 세포 및 비형질전환 세포로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA에 결합하는 단백질과 반응시켜 메틸화된 DNA를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 메틸화된 DNA를 증폭시킨 후, CpG 마이크로어레이에 하이브리다이제이션한 다음, 형질전환 세포와 비형질전환 세포 간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 유전자를 메틸화 마커 유전자로 선정하는 단계.

상기 선별된 유전자는 위암 스크리닝, 위험성 평가, 예측, 병명 확인, 병의 단계 진단 및 치료 타겟의 선정에도 사용될 수 있다.

위암 및 여러 단계의 이상에서 메틸화되는 유전자를 확인하는 것은 정확하고 효과적으로 위암을 조기 진단할 수 있게 하며, 다중 유전자를 사용한 메틸화 목록 확립 및 치료를 위한 새로운 타겟을 확인할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 메틸화 데이타는 다른 비-메틸화 연관 바이오마커 검출 방법과 연계하면 더욱 정확한 위암 진단 시스템을 확립할 수 있을 것이다.

본 발명의 상기 방법으로, 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산 바이오마커의 메틸화 단계를 결정하는 것을 포함하는 여러 단계 또는 기(期)의 위암 진행을 진단할 수 있다. 위암의 각 단계의 검체에서 분리된 핵산의 메틸화 단계를 위 조직의 세포 증식성 이상을 갖지 않는 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계와 비교하여, 검체의 위암의 특정 단계를 확인할 수 있으며, 상기 메틸화 단계는 하이퍼메틸화일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 메틸화 측정방법은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 임상 샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포, 혈액, 소변 및 대변으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 다음의 단계를 포함하여 상기 유전자의 CpG 섬의 메틸화 여부를 검출할 수 있다:

(a) 임상샘플로부터 분리된 DNA를 NTRK3 또는 AFF2 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 이용하여 증폭하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 결과물이 생성되는 경우 임상샘플 유래 위암 특이적 메틸화 마커 유전자의 CpG 섬이 메틸화된 것으로 결정하는 단계.

본 발명의 실시예에서 상기 메틸화 유전자 마커를 이용하여 위암을 형성할 가능성이 있는 세포의 조기 진단이 가능하다. 암세포에서 메틸화된다고 확인된 유전자가 임상적으로 또는 형태학적으로 정상으로 보이는 세포에서 메틸화되면, 상기 정상으로 보이는 세포는 암화가 진행되고 있는 것이다. 그러므로, 정상으로 보이는 세포에서의 위암 특이적 유전자가 메틸화된 것을 확인함으로, 위암을 조기 진단할 수 있다.

본 발명의 메틸화 마커 유전자를 이용하면, 검체에서 위조직의 세포 성장성 이상(이형증진행)을 검출할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산을 포함하는 시료를 하나 이상의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 하나 이상의 핵산에서 하나 이상의 부위의 메틸화 상태를 확인하는 것을 포함하고, 상기 핵산의 메틸화 상태는 위 조직의 세포 성장성 이상(이형증 진행)을 가지지 않는 검체의 핵산에서의 동일한 부위의 메틸화 상태와 차이가 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 위암에서 특이적으로 메틸화되는 유전자의 메틸화 빈도를 검토하고, 위암 진행 가능성을 가지는 조직의 메틸화 빈도를 정하는 것에 의하여 조직의 위암으로의 발전 가능성을 평가할 수 있다.

본 발명에서 암의 "조기 확인"은 전이되기 전에 암의 가능성을 발견하는 것으로, 바람직하게는 검체 조직 또는 세포에서 형태학적 변화가 관찰되기 전에 발견하는 것이다. 추가적으로, "조기 확인"은 세포가 암화되기 전에 초기 단계에서 세포형태의 변화가 일어날 가능성 높은 것을 말한다

본 발명에서 "하이퍼메틸화"는 CpG 섬의 메틸화를 의미한다.

본 발명에서, "샘플" 또는 "검체 샘플"은 수행되는 분석의 종류에 따라, 개개인, 체액, 세포주, 조직 배양 등에서 얻어지는 모든 생물학적 샘플을 포함하는 폭넓은 범위의 샘플을 의미한다. 포유동물로부터 체액 및 조직 생검을 획득하는 방법은 통상적으로 널리 알려져 있다. 바람직한 소스는 위의 생검(biopsy)이다

메틸화 조절 바이오 마커의 스크리닝

본 발명에서는 세포 또는 조직이 암화되거나 세포의 형태가 다른 형태로 형질전환될 때에 메틸화되는 바이오마커 유전자를 스크리닝하였다. 여기서, "형질전환" 세포는 정상형태가 비정상형태로, 비종양성이 종양성으로, 미분화형태가 분화형태로 바뀌는 등의 세포 또는 조직의 형태가 다른 형태로 변화되는 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는 정상인 및 위암 환자의 혈청 (serum)으로부터 부유 DNA (free DNA)를 분리하였다. 상기 분리된 메틸화 DNA를 증폭한 후, human CpG 마이크로어레이에 하이브리다이제이션시켜 정상인과 위암 환자간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 4개의 유전자를 바이오마커 후보로 선택하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 4개의 바이오마커 후보 유전자가 메틸화되었는지 추가로 확인하기 위하여, methylation-specific PCR (MSP)을 수행하였고, 그 결과, 상기 4개의 바이오 마커 유전자가 4개의 세포주 중 최소 1개 이상에서 메틸화되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에서는 상기 4종의 유전자가 정상 위조직에서는 메틸화가 되지 않는지 확인하기 위하여, 위암환자가 아닌 정상인의 위조직 지노믹 DNA의 메틸화 여부를 확인하기 위한 MSP를 수행하였고, 그 결과 2종의 유전자(NTRK3, AFF2)는 정상 위조직에서 메틸화가 되어 있지 않음을 확인하여 이들 2종의 유전자는 바이오마커로서 유용성이 높음을 확인할 수 있었다.

본 발명에서는 상기 2종의 유전자가 바이오마커로서 위암 조기진단의 유용성을 판정하기 위하여, 암조직과 연접하는 정상소견 조직에서 메틸화가 되어있는지 확인하였다. 그 결과, 암조직과 연접하고 있는 정상조직에서도 분자수준에서의 암화가 일어나는 것을 확인하였으며, 이에 상기 2종의 유전자가 바이오마커로서 위암의 조기진단에 대한 유용성이 높음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 2종의 유전자가 위암 진단용 바이오마커로서 유용성을 판정하기 위하여, 정상인 및 위암환자의 위액을 이용하여 메틸화 여부를 측정한 결과, 정상인의 경우에는 NTRK3와 AFF2 유전자가 메틸화되어 있지 않은 반면, 위암환자의 경우에는 NTRK3는 위암환자의 100%, AFF2는 위암환자의 60% 에서 메틸화되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 상기 2종의 유전자가 위액을 이용한 위암 진단에 대한 유용성이 높음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 2종의 유전자가 위암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 판정하기 위하여, 위암환자 및 정상인의 혈청 DNA를 대상으로 메틸화 여부를 추가적으로 측정한 결과, 4종의 유전자중 NTRK3는 조기 위암환자의 70%, 진행형 위암환자의 90% 그리고 AFF2는 조기 위암환자의 90%, 진행형 위암환자의 90% 에서 메틸화되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 상기 2종의 유전자가 바이오마커로서 위암 조기진단에 대한 유용성이 매우 높음을 확인할 수 있었다.

위암에 대한 바이오 마커

본 발명에서는 위암 진단을 위한 바이오마커로서, NTRK3와 AFF2 유전자의 CpG 섬을 제공한다.

위암에 대한 바이오 마커 -정상세포와의 비교를 위한 암세포에의 용도

본 실시예에서, "정상" 세포는 비정상적 세포 형태 또는 세포학적 성질의 변화를 나타내지 않은 세포를 의미한다. "종양"세포는 암 세포를 의미하고, "비종양" 세포는 병증 조직의 일부이지만, 종양 부위는 아니라고 판단되는 세포를 의미한다.

본 발명은 일 관점에서, 위암과 다음에 기재된 2개 유전자의 CpG 섬의 하이퍼메틸화 사이의 관련성의 발견에 기반을 둔 것이다: NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3)와 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자.

본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체에서 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계를 결정하여 검체의 위 조직의 세포 성장성 이상을 조기 진단할 수 있다. 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 위 조직의 세포 성장성 이상을 가지지 않는 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교 용도인 것을 특징으로 할 수 있다. 핵산은 CpG 섬과 같은 CpG-함유 핵산인 것이 바람직하다.

본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화를 결정하는 것을 포함하는 검체의 위 조직의 세포 성장성 이상 소양을 진단할 수 있다. 상기 핵산은 NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3)와 AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2) 유전자 및 그 조합을 코딩하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 위 조직의 세포 성장성 이상에 대한 소양을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 "소양"은 상기 세포 성장성 이상에 걸리기 쉬운 성질을 의미한다. 소양을 가진 검체는 아직은 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않지만, 세포 성장성 이상이 존재하거나 존재할 경향이 증가된 검체를 말한다.

본 발명은 다른 관점에서, 검체의 핵산을 포함하는 시료를 시료의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키고, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 확인하는 것을 포함하는 검체의 위 조직의 세포 성장성 이상을 진단하는 방법을 제공한다. 여기서, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화는 세포 성장성 이상을 가지지 않는 검체의 동일한 핵산의 동일한 부위의 메틸화 단계와 다른 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 방법은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 결정하는 단계를 포함한다. 여기서, "핵산" 또는 "핵산 서열"이란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 의미하거나 이들의 단편, 단일가닥 또는 이중가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 센스 또는 안티센스 가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, PNA (peptide nucleic acid) 또는 자연 기원 또는 합성 기원의 DNA 양 또는 RNA 양 물질을 말한다. 핵산이 RNA이면, 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T를 대신하여, 각각 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U로 대체된다는 것은 당해 분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명하다.

서로 다르게 메틸화된 CpG 섬의 존재를 검출할 수 있는 핵산이라면 어떤 것이든 사용할 수 있다. 상기 CpG 섬은 핵산 서열에서 CpG가 풍부한 부위이다.

메틸화( methylation )

본 발명에서의 정제되거나 정제되지 않은 형태의 어떠한 핵산도 사용될 수 있으며, 타겟 부위(예를 들면, CpG-함유 핵산)를 함유하는 핵산 서열을 함유하고 있거나 함유할 것으로 의심되는 어떠한 핵산도 사용될 수 있다. 차별적으로 메틸화될 수 있는 핵산 부위가 CpG 섬이고, 이는 다른 디뉴클레오티드 CpG 핵산 부위와 비교하여 높은 CpG 밀도를 가지는 핵산 서열이다. 이중(doublet) CpG는 G*C 염기쌍의 비율로 예측하였을 때, 척추동물 DNA에서 단 20% 정도의 확률로 나타난다. 특정 부위에서, 이중 CpG의 밀도는 게놈의 다른 부위와 비교하여 10배나 더 높다. CpG 섬은 평균 G*C 비율이 약 60%로, 보통의 DNA의 G*C 비율은 평균 40%를 나타낸다. CpG 섬은 전형적으로 약 1~2kb 길이를 가지고, 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 존재한다.

여러 유전자에서, CpG 섬은 프로모터의 업스트림(upstream)에서 시작하여, 다운스트림의 전사 부위까지 확장된다. 프로모터에서 CpG 섬의 메틸화는 보통 유전자의 발현을 억제시킨다. CpG 섬은 또한 유전자 코딩 부위의 3' 부위뿐만 아니라, 유전자 코딩 부위의 5' 부위를 둘러싸고 있을 수 있다. 그러므로, CpG 섬은 프로모터 부위를 포함하는 조절 부위의 코딩 서열 업스트림, 코딩 부위(예를 들어, 엑손영역), 코딩 부위의 다운스트림, 예를 들면, 인헨서 부위 및 인트론을 포함하는 여러 부위에서 발견된다.

통상적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이다. 그러나, 본 발명의 방법은 예를 들면, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 적용할 수 있으며, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유한 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.

핵산 혼합물 또한 사용할 수 있다. 검출될 특이적인 핵산 서열은 큰 분자의 분획일 수 있고, 처음부터 특이 서열이 전체 핵산 서열을 구성하는 분리된 분자 형태로 존재할 수 있다. 상기 핵산 서열은 순수한 형태로 존재하는 핵산일 필요는 없으며, 핵산은 전체 인간 DNA가 포함되어 있는 것과 같이 복잡한 혼합물 내의 적은 분획일 수도 있다. 시료에 포함된 핵산의 메틸화 정도를 측정하는 데 사용되거나, 메틸화된 CpG 섬을 검출하는 데 사용되는 시료에 포함된 핵산은 Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989)에 기재된 여러 가지 방법으로 추출될 수 있다.

검체로부터 분리된 핵산은 검체의 생물학적 시료에 의하여 얻어진다. 장암이나 장암의 진행 단계를 진단하고 싶다면, 스크랩이나 생검으로 장 조직에서 핵산을 분리하여야 한다. 이러한 시료는 당해 분야에서 알려진 여러 의학적 과정에 의하여 얻어질 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 검체로부터 얻어진 샘플의 핵산의 메틸화 정도는 장 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체의 동일한 핵산 부분과 비교하여 측정한다. 하이퍼메틸화는 하나 이상의 핵산에서 메틸화된 대립유전자가 존재하는 것을 말한다. 장 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체는 동일한 핵산을 검사했을 때, 메틸화 대립유전자가 나타나지 않는다.

샘플( sample )

본 발명은 위암의 조기 확인에 대하여 기술하고 있으며, 위암 특이적 유전자 메틸화를 이용하고 있다. 위암 특이적 유전자의 메틸화는 종양 부위의 부근 조직에서도 일어났다. 그러므로, 위암의 조기 확인 방법은 액체 또는 고체 조직을 포함하는 모든 샘플로 위암-특이적 유전자의 메틸화의 유무를 확인할 수 있다. 상기 샘플은 조직, 세포, 소변, 대변, 혈청 또는 플라즈마를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

개별 유전자 및 패널

본 발명은 진단 또는 예측 마커로서 각 유전자를 개별적으로 사용하거나, 몇몇 마커 유전자를 조합하여 패널 디스플레이 형태로 하여 사용할 수 있고, 몇몇의 마커 유전자는 전체적인 패턴 또는 메틸화된 유전자의 목록을 통하여 신뢰성 및 효율성을 향상시키는 것을 확인할 수 있다. 본 발명에서 확인된 유전자는 개별적으로, 또는 본 실시예에서 언급된 유전자가 조합된 유전자 세트로 사용될 수 있다. 또는, 유전자들은 함께 메틸화된 유전자의 수 및 그 중요도에 따라 순위를 매길 수 있고, 가중치를 둘 수 있으며, 암으로 발전할 가능성의 수준을 선정할 수 있다. 이러한 알고리즘은 본 발명에 속한다.

메틸화 검출 방법

메틸화 특이 PCR ( methylation specific PCR )

지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 이때 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 변환시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메틸화인 경우에는 비메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메틸화 여부는 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.

실시간 메틸화 특이 PCR ( real time methylation specific PCR )

실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TanMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 Sybergreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro methylated DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석하였다.

파이로시퀀싱

파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 시퀀싱 방법을 정량적인 실시간 시퀀싱으로 변환한 방법이다. 바이설파이트 시퀀싱과 마찬가지로 지노믹 DNA를 바이설파이트를 처리하여 전환시킨 다음, 5'-CpG-3' 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 상기 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 시퀀싱 프라이머를 이용하여 실시간 염기서열 분석을 수행하였다. 5'-CpG-3' 부위에서 시토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메틸화 정도를 메틸화 지수로 나타내었다.

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하였다. 이들 분리된 DNA를 인트론 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정하였다.

또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다. 여기서 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질은 MBD2bt에 제한되지 않는다.

차별적 메틸화의 검출-메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제

차별적 메틸화의 검출은 메틸화되지 않은 CpG 부위만을 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 핵산 샘플을 접촉시켜 비메틸화된 핵산을 절단하는 것으로 수행할 수 있다.

별도의 반응으로, 상기 샘플을 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머(isochizomer)와 접촉시켜, 메틸화된 핵산을 절단하였다.

특이적 프라이머를 핵산 샘플에 첨가하고, 통상의 방법으로 핵산을 증폭시켰다. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않으면, 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어난 것이다. 그러나, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서도 증폭 산물이 존재하지 않는다는 것은 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어나지 않은 것이다.

여기서, "메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제"는 인식 부위에 CG를 포함하고, C가 메틸화되지 않았을 때와 비교하여 C가 메틸화되었을 때 활성을 가지는 제한효소이다 (예를 들면, SmaI). 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 비제한적 예로써, MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI이 포함된다. 상기 효소들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 다른 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레오티드로는 예를 들어, SacII 및 EagI를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머는 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 동일한 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제이지만, 메틸화된 CGs와 비메틸화된 CGs를 모두 절단하며, 예를 들면, MspI를 들 수 있다.

본 발명의 프라이머는 증폭될 로커스의 각 가닥과 "대체적으로" 상보성을 가지도록 제작되고, 상기에서 설명한 바와 같이, 적당한 G 또는 C 뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션 되기에 충분한 상보성을 가지는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 증폭 과정에 사용되며, 상기 증폭 과정은 예를 들면, PCR과 같은, 타겟 로커스가 많은 반응 단계를 거치면서 기하급수적인 숫자로 증가하는 효소 연속 반응이다. 전형적으로, 한 프라이머(안티센스 프라이머)는 로커스의 네가티브(-) 가닥에 대하여 상동성을 가지고, 나머지 하나의 프라이머(센스 프라이머)는 포지티브(+) 가닥에 대하여 상동성을 가진다. 변성된 핵산에 프라이머가 어닐링되면, DNA 폴리머라아제 I(Klenow) 및 뉴클레오티드와 같은 효소 및 반응물들에 의하여 사슬이 신장되고, 그 결과, 타겟 로커스 서열을 함유하는 + 와 - 가닥이 새롭게 합성된다. 상기 새로이 합성된 타겟 로커스가 주형으로도 사용되어 변성, 프라이머 어닐링 및 사슬 신장의 사이클이 반복되면 타겟 로커스 서열의 기하급수적인 합성이 진행된다. 상기 연속 반응의 산물은 반응에 사용된 특이 프라이머의 말단과 대응하는 말단을 가지는 독립적인 이중가닥 핵산이다.

상기 증폭 반응은 당해 분야에서 보편적으로 사용되고 있는 PCR인 것이 바람직하다. 그러나, 리얼타임 PCR 또는 등온 효소를 사용한 선형증폭과 같은 대체적인 방법도 사용할 수 있으며, 멀티플렉스 증폭 반응 역시 사용할 수 있다.

차별적 메틸화의 검출- 바이설파이트 시퀀싱 방법

메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하여 메틸화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭 단계는 선택적이고, 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메틸화 및 비메틸화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이다. 상기와 같은 방법은 미국특허 5,786,146에 개시되어 있으며, 상기 특허에는 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트(bisulfite) 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다.

기질

타겟 핵산 부위가 증폭되면 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 상기 핵산 증폭 산물은 고체 지지체(기질)에 고정된 알려진 유전자 프로브와 하이브리다이제이션될 수 있다.

여기서, "기질"은 물질, 구조, 표면 또는 재료, 비생물학적이고, 합성되고, 무생물, 평면, 구형 또는 특이적 결합, 평편한 표면의 물질을 포함하는 혼합물 수단으로, 하이브리다이제이션 또는 효소 인식 부위 또는 대다수의 다른 인식 부위 또는 표면, 구조 또는 재료로 구성된 수많은 다른 분자 종을 넘어서는 수많은 다른 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 기질은 예를 들면, 반도체, (유기)합성 메탈, 합성 반도체, 인슐레이터 및 도판트; 금속, 합금, 원소, 화합물 및 미네랄; 합성되고, 분해되며, 에칭되고, 리소그라프되며, 프린트되고 마이크로패브리케이트된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적, 폴리머, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속 및 세라믹; 나무, 종이, 카드보드, 면, 울, 천, 직조 및 비직조 섬유, 재료 및 패브릭일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 형태의 멤브레인은 당해 분야에서 핵산 서열에 대하여 부착력을 가진다고 알려져 있다. 이러한 멤브레인의 특이적이고 비제한적인 예로 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐클로라이드, 디아조티즈드(diazotized) 페이퍼 및 GENESCREEN^TM, ZETAPROBE^TM(Biorad) 및 NYTRAN^TM 등의 상업적으로 사용되는 멤브레인과 같이 유전자 발현 검출용 멤브레인을 들 수 있다. 비드, 글래스, 웨이퍼 및 금속 기질도 포함된다. 이러한 목적물에 핵산을 부착시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 이와 다르게, 액체 상에서도 스크리닝을 수행할 수 있다.

하이브리다이제이션 조건

핵산 하이브리다이제이션 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 하이브리다이즈되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 하이브리다이제이션되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 하이브리다이제이션 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.

매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(하이브리다이제이션 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 하이브리다이제이션 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 하이브리다이제이션에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.

표지( Label )

중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.

키트( Kit )

본 발명에 의하면, 검체의 세포 성장성 이상을 검출하는 데 유용한 키트를 제공하고 있다. 본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 메틸화된 5'-CpG-3' 염기서열 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머쌍을 함유하는 두번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다.

캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

위암 특이적 메틸화 유전자 발굴

위암에서 과메틸화된 유전자를 선별하기 위하여, 충남대학교 병원 조직은행으로부터 위암환자의 혈청과 정상인의 혈청 시료를 제공받아 아래와 같은 방법으로 과메틸화 유전자들을 선별하였다.

우선 각 혈청 시료로부터 DNA를 분리하고, 정상인 20명(남자:10명, 여자:10명), 조기 위암환자 20명(남자:10명, 여자:10명) 그리고 진행형 위암환자 20명(남자:10명, 여자:10명)의 DNA들을 동량 혼합한 500ng의 DNA를 준비하였다. 500 ng의 DNA로부터 Methylcapture^TM (Genomictree 사, 대한민국)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 정상인 및 위암환자 유래의 혈청에 존재하는 메틸화 DNA를 선택적으로 분리하였다.

분리한 메틸화 DNA를 Genome Plex Complete Whole Genome Amplification Kit (Sigma, 미국)를 사용하여 증폭한 후, 위암 유래 증폭 DNA는 Cy5-dUTP로 표지하고, 정상인 유래 증폭 DNA는 Cy3-dUTP로 표지하여 혼합한 다음, 인간 유전체에 존재하는 27,800 여개의 CpG 섬에 존재하는 CpG에 대한 프로브가 집적되어 있는 CpG 마이크로어레이 (Agilent 사, 미국)를 사용하여 하이브리다이제이션을 수행하였다 (도 1).

상기 하이브리다이제이션 후, 일련의 세척 과정을 거친 다음, Agilent scanner (Agilent 사, 미국)를 이용하여 스캐닝하였다. 마이크로어레이 이미지로부터 시그날 값의 계산은 Feature Extraction 프로그램 v. 9.5.3.1(Agilent 사, 미국)을 이용하여 정상인과 위암환자 혈청 시료 간 시그날의 상대적인 강도 차이를 계산하고, 분석 프로그램인 GeneSpring GX (Agilent 사, 미국)를 이용하여 정상인과 위암 환자간 메틸화 정도의 차이가 큰 유전자를 선별하였다. 정상인 및 조기위암 그리고 정상인 및 진행형 위암의 비교 결과 얻어진 CpG 마이크로 어레이 데이터를 GeneSpring GX를 이용하여 정규화를 하고, 이로부터 2장의 어레이 전부에서 위암에서 정상인에 비하여 5배 이상 과메틸화된 프로브 1,107개를 선별하였다. 이로부터 2개 이상 연접한 프로브에서 동시에 암환자에서 과메틸화를 나타내는 52종의 유전자를 선별하였다. 52종의 유전자중 통계적 유의성이 높은 (p < 0.01) NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3), AFF2 (GenBank NM_002025, AF4/FMR2 family, member 2), LHX8 (NM_001001933, LIM homeobox 8) 및 ZAR1 (NM_175619, zygote arrest 1) 유전자를 바이오마커 후보로 선별하였다 (도 2).

메틸화 유전자의 위암 세포주, 정상 위조직 및 위암 수술조직에서 메틸화 확인

2-1: 메틸화 유전자의 위암 세포주에서 메틸화 확인

실시예 1에서 확인된 4개의 유전자가 위암 세포주에서 메틸화되어 있는지 확인하기 위하여, 위암 세포주 AGS (ATCC CRL-1739), MKN1 (한국세포주은행 KCLB No. 80101), MKN28 (한국세포주은행 KCLB No. 80102) 및 SNU484 (한국세포주은행 KCLB No. 00484)로부터 전체 게놈 DNA를 분리하고, 200ng의 게놈 DNA에 바이설파이트 키트(EZ DNA Methylation-Gold kit( ZYMO Research,USA))를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게된다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 MSP를 수행하였다.

상기 4개의 유전자에 대한 MSP 수행하기 위한 PCR 프라이머는 MethPrimer 프로그램(http://www.urogene.org/methprimer/index1.html)을 이용하여 설계하였다. 각 유전자의 메틸화 측정을 위한 MSP 프라이머는 표 3에 나타내었다.

MSP용 프라이머 서열 및 PCR 조건

유전자	프라이머 서열 (5-->3)			증폭산물 크기(bp) /어닐링 온도
유전자		전방프라이머	후방프라이머	증폭산물 크기(bp) /어닐링 온도
AFF2	메틸화 특이 프라이머	GGAGAGTCGGGGGTCGTCGAGAATC (서열번호8)	GACGAACGAACGCCTATCCCTAATCGCA (서열번호9)	88 (62)
AFF2	비메틸화 특이 프라이머	TGGAGAGTTGGGGGTTGTTGA GAATTGT (서열번호10)	AACAAACAAACACCTATCCCTAATCACA (서열번호11)	89 (58)
NTRK3	메틸화 특이 프라이머	TTTTAGAGTTTTCGGATTCGGC GAGTTAGC (서열번호12)	ATAAAAACCGCGAAAAACGCCTAATAACGC (서열번호13)	93 (60)
NTRK3	비메틸화 특이 프라이머	TAGAGTTTTTGGATTTGGTGAG TTAGTGA (서열번호14)	ATAAAAACCACAAAAAACACCTAATAACAC (서열번호15)	90 (58)
LHX8	메틸화 특이 프라이머	TTTAATGGTGGCGTTTTGCGGG TTTTC (서열번호16)	TCGCGTAATAAACGAACACTTTCTCATCGC (서열번호17)	116 (62)
LHX8	비메틸화 특이 프라이머	ATTTTTAATGGTGGTGTTTTGTGGGTTTTT (서열번호18)	TCACATAATAAACAAACACTTTCTCATCAC (서열번호19)	119 (58)
ZAR1	메틸화 특이 프라이머	GTTAGGGCGACGTTTTTGGGACGT (서열번호20)	CCGTACGATCAAAACTAACCTATACGCC (서열번호21)	93 (62)
ZAR1	비메틸화 특이 프라이머	GGTTAGGGTGATGTTTTTGGGA TGT (서열번호22)	CAACCATACAATCAAAACTAACCTATACAC (서열번호23)	97 (56)

상기 바이설파이트가 처리된 게놈 DNA 20ng에 10X PCR buffer (Enzynomics, Korea) 5㎕, Taq polymerase (Enzynomics, Korea) 5units, 2.5mM dNTP (Solgent, Korea) 4㎕, PCR 프라이머 2㎕(10 pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 다음, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다.

상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤상에서 전기영동하여 확인하였다. 즉, 상기 증폭된 PCR 산물의 band 강도를 측정 (ImageAnalyzer, 코아바이오, 한국)하여 메틸화 특이적 PCR 산물의 band 강도가 비메틸화 특이적 PCR 산물의 band 강도보다 1/10 이상인 경우를 메틸화된 것으로 판정하였다.

상기 4개의 유전자에 대하여 4종의 위암 세포주에서 메틸화 여부를 측정한 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, 4종의 유전자가 최소 1개 이상에서 메틸화되어 있는 것으로 확인되었다.

2-2: 메틸화 유전자의 정상 위조직에서 메틸화 확인

한편, 상기 유전자가 바이오마커로서 유용성을 가지려면 정상 위조직에서는 메틸화가 되어 있지 않아야 한다. 이를 확인하기 위하여 위암 환자가 아닌 정상인의 위조직 지노믹 DNA(Biochem 사, 미국)를 구입하여 메틸화 여부를 상기와 동일하게 MSP 방법으로 측정하였다.

그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, LHX8과 ZARI은 정상 위조직에서 메틸화가 검출되어 바이오마커로서 유용성이 없는 것으로 판단되어 제외시켰다. 반면에 NTRK3 유전자와 AFF2 유전자와는 정상위조직에서 메틸화가 되어 있지 않은 것을 확인하였다. 따라서 이들 2종의 유전자(NTRK3, AFF2)는 바이오마커로서 유용성을 가질 가능성이 있음을 확인하였다.

2-3: 메틸화 유전자의 위암 수술조직에서의 메틸화 확인

상기 2종의 바이오마커 유전자에 대하여 위암 수술조직에서의 메틸화 상태를 MSP 방법으로 측정하였다. 5명의 위암환자 수술조직 (충남대학교병원 조직은행)으로부터 암 조직과 이와 연접하는 정상소견 조직의 DNA를 분리하여 메틸화 여부를 측정하였다. NTRK3 유전자는 5명 전부의 암조직에서 메틸화가 확인되었으며, AFF2 유전자는 5명 중 3명의 암조직(2T, 4T, 5T)에서 메틸화가 확인되어 위암 진단용 바이오마커로서 유용성을 암조직에서 확인하였다(도 3C).

또한 이들 2종의 유전자는 정상조직에서는 메틸화가 전혀 되어있지 않은 반면(도 3B), 암 조직과 연접하는 정상소견 조직에서는 메틸화가 확인되어(도 3C), 이는 전형적인 field cancerizationn 현상이 나타나는 것을 확인하였다. 통상적으로 field defect 현상은 암 조직과 연접하고 있는 정상조직에서도 이미 분자수준에서의 암화가 일어나는 것을 대변해주는 현상으로서 조기진단에 대한 유용성이 높음을 제시해 주는 증거라 할 수 있다.

파이로시퀀싱을 이용한 메틸화 유전자의 메틸화 확인

3-1. 위암 세포주 대상 메틸화 확인

실시예 2에서 확인된 바이오마커 유전자의 메틸화 상태를 정량적으로 확인하기 위하여, 각각의 프로모터, UTR, 엑손 또는 인트론 부위에 대해 파이로시퀀싱을 수행하였다.

바이설파이트(bisulfite)를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변형하기 위하여, 위암 세포주 AGS (ATCC CRL-1739), MKN-1 (한국세포주은행 KCLB No. 80101) 및 SNU484 (한국세포주은행 KCLB No. 00484)로부터 전체 게놈 DNA를 분리하여, 그 중 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게 된다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하였다.

상기 2개의 유전자에 대한 파이로시퀀싱을 수행하기 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 PSQ assay design 프로그램(Biotage, USA)을 이용하여 설계하였다. 각 유전자의 메틸화 측정을 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 하기 표 2 및 표 3과 같다.

PCR 프라이머

유전자	프라이머	서열 (5'3')^a	서열 번호	CpG 위치^b	앰플리콘 크기 (bp)
AFF2	forward	GGGATTTGGAGTAGTAGTGGT AGG	34	+561, +573, +589	230
AFF2	reverse	Biotin-AATCCRCATCCCTCC CTCTTCC	35	+561, +573, +589	230
NTRK3	forward	TTGTTGTAATTTTGTAAAGTT T	36	-52, -46, -39, -37, -32	200
NTRK3	reverse	Biotin-ATACAAAATCCTTCAACRTCT AAAACCAT	37	-52, -46, -39, -37, -32	200

^a Y = C 또는 T, R = A 또는 G

^b전사 개시점 (+1)으로부터의 거리(nucleotide): 메틸화 측정에 사용된 CpG 부위의 게놈 DNA 상의 위치

메틸화 마커 유전자의 시퀀싱 프라이머 서열

유전자	서열 (5' --> 3')^a	서열번호
AFF2	TGTTTTTTTTTTTGATGAG	38
NTRK3	TTGTTGTAATTTTGTAAAGTTT	39

상기의 바이파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer(Enzynomics, Korea) 5㎕, Taq polymerase(Enzynomics, Korea) 5units, 2.5mM dNTP(Solgent, Korea) 4㎕, PCR 프라이머 2㎕(10 pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.

상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 처리한 후, PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 상기 파이로시퀀싱 후, 메틸화 지수(methylation index)를 계산함으로써 메틸화 정도를 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다.

상기 바이오마커 후보 유전자의 장암 세포주에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 정량적으로 측정한 결과, 도 4A에서 나타난 바와 같이, 상기 2개의 바이오 마커 유전자 모두가 최소 2개 이상의 세포주에서 약 50% 이상 높은 수준으로 메틸화되어 있는 것을 확인하였다. 상기 2개의 유전자는 위암 세포주에서 높은 메틸화 수준을 나타냄으로써, 위암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 가질 가능성을 보여주었다. 이에 다음과 같이, 이를 검증하기 위하여 조직시료를 이용한 메틸화 검증 실험을 추가로 진행하였다.

3-2. 위암 조직 대상 메틸화 확인

실시예 2로부터, 위암 조직 및 암세포주에서 과메틸화 되어 있으나 정상 위조직에서는 메틸화가 되어 있지 않음을 확인한 NTRK3 및 AFF2 유전자를, 조직시료를 대상으로 정량적인 메틸화 측정을 위하여 환자가 아닌 정상인의 위조직 (5예) 그리고 20명의 위암환자 수술조직으로부터 얻은 위암과 연접하는 정상소견 조직과 위암 조직 (충남대학교 병원 조직은행)을 이용한 암 진단용 바이오마커로 사용할 수 있는지 검증하기 위하여 정량적인 파이로시퀀싱 분석을 수행하였다. 메틸화 어세이는 실시예 3-1에 기재된 파이로시퀀싱 방법으로 수행하였다.

그 결과, AFF2 유전자의 경우, 환자가 아닌 정상 위조직에 비하여 20예의 위암 조직중 18예 (90.0%)에서 높은 수준의 메틸화를 나타내어 위암 특이적 과메틸화 유전자임을 확인할 수 있었다 (도 4B). 또한 NTRK3 유전자는 20예의 위암 조직중 20예 (100%)에서 높은 수준의 메틸화를 나타내는 것을 확인하였다 (도 5B). 이러한 결과는 이들 두 개의 유전자가 위암 진단을 위한 메틸화 바이오마커로서의 유용성을 갖는다는 것을 보여주는 증거이다. 그리고 MSP 결과와 마찬가지로 암과 연접한 정상소견 조직에서도 암환자가 아닌 정상인의 위조직에 비하여 높은 수준의 메틸화가 측정되어 전형적인 field defect 현상이 존재하는 것을 확인하였다. 통상적으로 field defect 현상은 암 조직과 연접하고 있는 정상조직에서도 이미 분자수준에서의 암화가 일어나는 것을 대변해주는 현상으로서 조기진단에 대한 유용성이 높음을 제시해 주는 증거라 할 수 있다. 그리고 조기위암 (병기 1, 2)에서도 높은 수준의 과메틸화가 관찰됨으로써 조기진단에 대한 유용성이 높음을 제시해 준다.

위액에서의 바이오마커 유전자의 과메틸화 측정

실시예 2 및 3으로부터, 위암 조직 및 암세포주에서 과메틸화 되어 있으나 정상 위조직에서는 메틸화가 되어 있지 않음을 확인한 NTRK3 및 AFF2 유전자를, 위내시경을 통하여 채취한 위액 (충남대학교 병원 조직은행)을 이용한 암 진단용 바이오마커로 사용할 수 있는지 검증하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다. 즉, 5명의 정상인 및 11명의 위암 환자의 위액을 이용하여 상기 바이오마커에 대하여 메틸화 어세이를 수행하였다. 메틸화 어세이는 실시예 2에 기재된 MSP 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, AFF2 유전자는 정상인의 위액에서는 전혀 메틸화가 되어 있지 않고, 11명의 위암환자중 7명 (63.6%)에서는 메틸화가 확인되었다. NTRK3 유전자는 정상인의 위액에서는 5명 중 1명에서 메틸화가 되어 있었으며, 위암환자에서는 11명 중 10명 (90.9%)의 위액에서 메틸화가 검출되었다. 이러한 결과는 상기 2종의 바이오마커 유전자는 위내시경을 통해 채취한 위액을 이용한 위암 진단의 경우에도 유용성이 있음을 보여주고, 특히 NTRK3 유전자는 11명 중 10명의 위암환자 전부에서 메틸화가 확인되어 위액을 이용한 위암 진단에 높은 유용성이 있음을 보여준다.

2종 바이오마커 유전자의 위암 환자 혈청 DNA 에서 메틸화 확인

상기 2종의 바이오마커 유전자가 대표적인 비침습적 시료인 혈청에서의 위암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 검증하기 위하여 정상인 20명, 조기 위암환자 10명, 그리고 진행형 위암환자 10명의 혈청(충남대학교병원 조직은행) DNA를 대상으로 메틸화 여부를 측정하였다. 혈청 DNA를 이용한 메틸화 측정은 실시예 2와 동일한 MSP 방법으로 수행하였다.

그 결과, AFF2 유전자는 정상인 20명 중 4명 (시료번호 3, 6, 14, 17)에서만 메틸화가 검출되었고, 반면에 조기위암환자의 혈청에서는 10명 중 8명 (80%) 그리고 진행형 위암환자에서도 10명 중 9명 (90%)에서 메틸화가 검출되어 혈청을 이용한 위암 조기진단에 대한 유용성이 높음을 보여준다(도 6, 도 8). NTRK3 유전자는 정상인 (20명)에서는 메틸화가 전혀 검출되지 않았고, 반면에 조기위암에서는 10명 중 7명 (70%) 그리고 진행형 위암에서는 10명 중 9명 (90%)에서 메틸화가 검출되어 혈청을 이용한 위암의 조기진단에 대한 유용성이 높음을 보여준다(도 7, 도 8). 각 유전자의 메틸화 빈도는 표 4에 요약하였다.

2종 바이오마커 유전자의 메틸화 빈도

바이오마커	메틸화 빈도 (%)
바이오마커	정상인(n=20)	조기위암환자(n=10)	진행형 위암환자(n=10)
NTRK3	0/20 (0%)	7/10 (70.0%)	9/10 (90.0%)
AFF2	4/20 (20.0%)	8/10 (80.0%)	9/10 (90.0%)

상기 위암 진단에 유용성을 확인한 위암 진단 바이오마커 유전자인 AFF2의 5' UTR, 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론 부위를 포함하는 영역과 NTRK3의 프로모터 및 5' UTR 부위를 포함하는 영역의 서열은 표 5와 같다.

AFF2와 NTRK3 바이오마커의 서열

유전자	서열번호
NTRK3	1
AFF2	2

따라서, NTRK3 유전자는 위암 진단에 대한 민감도 및 특이도가 각각 90% 와 80%로 확인되었고 AFF2 유전자는 민감도 및 특이도가 각각 90% 와 80%로 측정되어, 상기 2종의 바이오마커 유전자는 위암 환자 혈청을 이용한 위암 진단에도 유용함을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 유전자의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 프라이머쌍을 함유하는 위암 진단용 키트.
제 6항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 12 및 13로 표시되는 서열인 것을 특징으로 하는 위암 진단용 키트.
NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 유전자의 메틸화된 CpG 섬과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 위암 진단용 핵산 칩.
제 8항에 있어서, 서열번호 29 내지 서열번호 33으로 표시되는 서열 중 어느 하나 이상의 서열로 표시되는 프로브가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 위암 진단용 핵산 칩.
위암 진단을 위하여, DNA를 함유한 임상샘플로부터 NTRK3 (GenBank NM_001007156, neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 3) 유전자의 메틸화된 CpG 섬의 메틸화를 검출하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 메틸화 검출방법은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 임상 샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포, 위액, 혈액, 혈장, 소변 및 대변으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.