KR101136505B1

KR101136505B1 - 장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법

Info

Publication number: KR101136505B1
Application number: KR1020110066999A
Authority: KR
Inventors: 안성환; 문영호; 오태정; 정현철
Original assignee: (주)지노믹트리
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2012-04-20
Also published as: KR20110084486A

Abstract

본 발명은 장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 장암 세포에서 특이적으로 메틸화되는 장암 특이적 마커 유전자의 메틸화를 검출하여 장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 메틸화 검출방법과 진단용 조성물, 키트 및 핵산 칩을 이용하면, 장암을 초기 형질전환단계에서 진단할 수 있어 조기 진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 장암을 진단할 수 있어 유용하다.

Description

장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법{Method for Detecting Methylation of Colorectal Cancer Specific Methylation Marker Gene for Colorectal Cancer Diagnosis}

본 발명은 장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 장암 세포에서 특이적으로 메틸화되는 장암 특이적 마커 유전자의 메틸화를 검출하여 장암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

의학이 발달한 오늘날에도 인체 암, 특히 대다수를 차지하는 고형암(solid tumor: 혈액암을 제외한 나머지 암)의 경우 5년 생존율은 50%미만이다. 전체 암환자의 약 3분의 2는 진행된 단계에서 발견되며, 이들 대부분은 진단 후 2년 이내에 사망한다. 이와 같이 저조한 암의 치료효과는 치료법의 문제 뿐만은 아니며, 실제 암을 조기에 진단할 수 있는 방법과 진행된 암을 정확히 진단하고 치료 후 추적 조사하는 것이 용이하지 않기 때문이다.

현재 임상에서 암의 진단은 문진(history taking)과 신체검사, 임상병리검사를 거쳐 일단 의심이 되면 방사선검사 및 내시경검사로 진행되며, 최종적으로는 조직검사로 확인된다. 그러나 현존 임상검사법으로는 암의 세포 수가 10억개, 암의 직경이 1㎝ 이상이 되어야 진단이 가능하다. 이런 경우 이미 암세포는 전이능력을 갖고 있으며, 실제 절반 이상에서 암이 이미 전이되어 있다. 한편, 암이 직간접으로 생산하는 물질을 혈액 내에서 찾는 종양마커(tumor markers)가 암 선별검사(cancer screening)에 이용되는데, 이는 정확도에 한계가 있어서 암이 있을 때도 약 절반까지 정상으로 나타나며, 암이 없을 때도 종종 양성으로 나타나서 혼란을 야기한다. 또한, 암의 치료에 주로 사용되는 항암제의 경우, 암의 용적이 적은 경우에만 그 효과를 나타내는 문제점이 있다.

상기한 바와 같이, 암의 진단과 치료가 모두 어려운 것은 정상세포와 다른 점이 많고, 매우 복잡하고 다양하기 때문이다. 암은 제멋대로 과잉으로 계속 자라며, 사망에서 해방되어 계속 생존하고, 주위조직을 침범하고 원위 장기로 확산(전이)되어서 인간을 사망하게 한다. 면역기전의 공격이나 항암 치료에도 생존하고, 끊임없이 진화하며 생존에 가장 유리한 세포군(클론)이 선택적으로 증식한다. 암세포는 다수의 유전자의 변이에 의해 발생하는 고도의 생존능력을 가진 생존체이다. 하나의 세포가 암세포로 바뀌고, 임상에서 보는 악성의 암 덩어리로 발전해 나가기 위해서는 다수의 유전자에 변이가 일어나야 한다. 따라서 암을 근원적으로 진단하고 치료하기 위해서는 유전자 수준에서 접근할 필요가 있다.

최근, 암의 진단에 유전자검사가 적극적으로 시도되고 있다. 가장 단순한 대표적 방법은 혈액에서 백혈병의 유전자 지표인 ABL:BCR 융합 유전자의 유무를 PCR로 찾는 것이다. 이는 정확도가 95%이상이며, 단순 용이한 검사로 만성골수성 백혈병의 진단과 치료 후 결과 평가, 추적조사 등에 유용하게 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 소수 혈액암의 경우에만 적용이 가능하다.

또한, 암세포가 발현하는 유전자의 존재를 RT-PCR 및 블라팅으로 파악함으로써 혈구세포 중에 함께 존재하는 암세포를 진단하는 방법도 시도되고 있다. 그러나 이 방법은 전립선암과 흑색종 등 일부 암에서만 적용이 가능하며, 가양성(false positive rate)이 많고, 검사 및 판독 방법의 표준화가 어렵고, 그 유용성에도 한계가 있다 (Kopreski, M.S. et al ., Clin . Cancer Res ., 5:1961, 1999; Miyashiro, I. et al ., Clin . Chem ., 47:505, 2001).

혈청(serum)이나 혈장(plasma)내 DNA를 사용하는 유전자검사가 최근 활발히 시도되고 있다. 이는 암세포에서 분리되어 혈액으로 나와서 혈청 내에 유리형(free DNA)으로 존재하는 암 관련 유전자를 찾는 방법이다. 실제 암환자에서는 혈청 내 DNA 농도가 정상인의 5~10배로 증가되며, 이렇게 증가된 DNA는 대부분이 암세포에서 유리되는 것으로 밝혀지고 있다. 이들 암에서 유리된 DNA를 가지고 암 유전자(oncogene)와 종양억제 유전자의 돌연변이나 소실, 기능상실 등, 암에 특이한 유전자 이상을 분석하면 암을 진단할 수 있다. 실제 혈청에서 돌연변이형의 K-Ras 암유전자나 p53 종양억제 유전자, p16 유전자의 프로모터 메틸화, 그리고 마이크로세틀라이트(microsatellite)의 표지와 불안정성(instability) 등을 검사하여 폐암과 두경부암, 유방암, 대장암, 간암 등을 진단하는 것이 활발하게 시도되고 있다 (Chen, X.Q. et al ., Clin . Cancer Res ., 5:2297, 1999; Esteller, M. et al ., Cancer Res ., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedes, M. et al ., Cancer Res ., 60:892, 2000; Sozzi, G. et al ., Clin . Cancer Res ., 5:2689, 1999).

한편, 혈액외의 검체에서도 암의 DNA를 검사할 수 있다. 폐암 환자에서 객담이나 기관지폐포 세척액(bronchoalveolar lavage) 내에 존재하는 암세포 및 암 유전자의 존재를 유전자검사나 항체검사로 찾는 방법이 시도되고 있으며(Palmisano, W.A. et al ., Cancer Res ., 60:5954, 2000; Sueoka, E. et al ., Cancer Res ., 59:1404, 1999), 장암에서 대변 내에 존재하는 암 유전자를 찾는 방법 (Ahlquist, D.A. et al ., Gastroenterol ., 119:1219-27, 2000)과 소변 및 전립선액 내에 존재하는 프로모터 메틸화 이상을 검사하는 방법 (Goessl, C. et al ., Cancer Res ., 60:5941, 2000)도 시도되고 있다. 하지만, 다수 유전자 이상을 동반하며 개개 암별로 제각기 다양한 변이를 보이는 암을 정확하게 진단하기 위해서는 다수의 유전자를 동시에, 그리고 정확하게 자동분석할 수 있는 방법이 요구되나, 아직 이러한 방법은 정립되어 있지 않다.

이에 최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있다. 특정 유전자의 프로모터 CpG 섬이 과메틸화되어 있을 때, 그 유전자의 발현은 차단(gene silencing)되게 된다. 이는 생체 내에서 유전자의 단백질 지정 코딩서열(coding sequence)에 돌연변이(mutation)가 없이도 그 유전자의 기능이 소실되는 주요 기전이며, 인체 암에서 다수의 종양억제 유전자(tumor suppressor genes)의 기능이 소실되는 원인으로 해석되고 있다. 따라서 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검색하는 것은 암의 연구에 큰 도움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR(이하 MSP라고 함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사하여 암의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다.

상당수의 질환은 유전자의 이상에 의해 발생하고, 유전자 이상 중 가장 많은 형태는 유전자의 코딩서열에 변화가 오는 것으로 이러한 유전자 자체의 변화(genetic change)를 돌연변이라고 한다. 어떤 유전자에 돌연변이가 있을 때, 그 유전자가 코딩하는 단백질은 구조와 기능이 바뀌고 장애와 결손을 가져오게 되며, 이러한 돌연변이 단백질은 질병을 유발한다. 그러나 특정 유전자에 돌연변이가 없이도 그 유전자의 발현에 이상이 있으면 질병이 유발될 수 있다. 대표적인 예가 유전자 전사의 조절부위, 즉 프로모터 CpG 섬의 시토신 염기부위에 메틸기가 붙는 메틸화로, 이 경우 그 유전자는 발현이 차단된다. 이와 같은 것을 유전자외 변화(epigenetic change)라고 하며, 이것도 돌연변이와 마찬가지로 자손세포에 전달되며, 동일한 효과, 즉 해당 단백질의 발현 상실을 야기한다. 가장 대표적인 것이 암세포에서 프로모터 CpG 섬의 메틸화에 의해 종양억제 유전자의 발현이 차단되는 것으로, 이는 발암의 중요한 기전이 된다 (Robertson, K.D. et al ., Carcinogensis, 21:461, 2000).

암을 정확히 진단하려면 변이유전자를 파악하는 것뿐만 아니라, 그 유전자의 변이가 나타나는 기전을 파악하는 것이 중요하다. 이전에는 유전자의 코딩서열의 돌연변이, 즉 점 돌연변이나 결실, 삽입 등의 미세변화나 거시적인 염색체 이상에 초점을 맞추어 연구해 왔다. 그러나 최근에는 이들 만큼 유전자외 변화가 중요한 것으로 보고되고 있고, 대표적인 것이 프로모터 CpG 섬의 메틸화이다.

포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 5번째 염기가 존재하며, 이는 시토신 환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸기가 붙어서 메틸화되어 있다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈내에 반복되는 염기서열(repetitive sequence)이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다. 이러한 CpG의 5-mC는 자연히 탈아미노화(deamination)되어 T로 바뀌며, 이에 따라 포유류 게놈내 CpG는 정상적으로 나타나야 할 빈도(1/4 x 1/4 = 6.25%)보다 훨씬 낮은 1%의 빈도만을 나타낸다.

CpG 중에 예외적으로 밀집되어 나타나는 것들이 있으며, 이를 CpG 섬이라고 한다. CpG 섬은 길이가 0.2~3kb이고, C 및 G염기의 분포백분율이 50%를 넘으며, CpG의 분포백분율이 3.75%이상으로 높게 집중되어 나타나는 부위를 가리킨다. CpG 섬은 전체 인체 유전체에 약 45,000개가 나타나며, 특히 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에 집중되어 나타난다. 실제로 인체 유전자중 약 절반을 차지하는 중요 유전자(housekeeping genes)의 프로모터에는 CpG 섬이 나타난다 (Cross, S. et al., Curr . Opin . Gene Develop ., 5:309, 1995).

한편, 정상인의 체세포(somatic cell)에서는 이들 중요 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬이 메틸화되어 있지 않으나, 발생 중에 발현되지 않도록 각인된(imprinted) 유전자와 비활성화(inactivation)된 X 염색체상의 유전자들은 메틸화되어 있다.

발암과정 중에는 프로모터 CpG 섬에 메틸화가 나타나며, 그 해당 유전자의 발현에 장애가 나타나게 된다. 특히, 세포주기나 고사를 조절하고, DNA를 복구하며 세포의 부착과 세포간 상호협조 작용에 관여하고, 침윤과 전이를 억제하는 종양억제 유전자들의 프로모터 CpG 섬에 메틸화가 발생하는 경우, 이는 코딩서열의 돌연변이와 동일하게 이들 유전자의 발현과 기능을 차단하며, 그 결과 암의 발생과 진행이 촉진된다. 그 외에도 노화에 따라 CpG 섬에 부분적으로 메틸화가 나타나기도 한다.

흥미로운 사실은 선천성 암에서는 돌연변이가 발암의 원인이 되나, 후천성암에서는 돌연변이가 나타나지 않는 유전자들의 경우, 돌연변이 대신에 프로모터 CpG 섬의 메틸화가 나타난다는 것이다. 대표적인 예로, 후천성 신장암의 VHL(von Hippel Lindau), 유방암의 BRCA1, 대장암의 MLH1, 위암의 E-CAD와 같은 유전자의 프로모터 메틸화가 있다. 아울러 전체 암 중 약 절반에서 p16의 프로모터 메틸화나 Rb의 돌연변이가 나타나며, 나머지 절반은 p53의 돌연변이나 그 계열로 p73, p14 등의 프로모터 메틸화를 보인다.

중요한 사실은 이러한 프로모터 메틸화에 의한 유전자외 변화가 곧 유전자의 변화, 즉 코딩서열의 돌연변이를 유발하며, 이들 유전자 및 유전자외의 변화가 결합하여 발암이 진행된다는 것이다. MLH1 유전자를 예로 들면, 대장암세포에서 흔히 MLH1 유전자의 한 대립유전자(allele)는 돌연변이나 결실로 인해 기능이 상실되어 있고, 나머지 한 대립유전자는 프로모터 메틸화 때문에 고장이 나있는 경우가 있다. 아울러 프로모터 메틸화 때문에 DNA 복구 유전자인 MLH1의 기능이 상실되면, 이는 곧 다른 중요 유전자에 돌연변이가 일어나는 것을 용이하게 함으로써 발암을 촉진한다.

대부분의 암은 CpG에 관해 3가지 공통된 특징을 보이는데, 이는 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 과메틸화, 나머지 CpG 염기부위의 과소메틸화, 및 메틸화 효소, 즉 DNA 시토신 메틸트랜스퍼라제(DNMT)의 활성증가가 그것이다 (Singal, R. & Ginder, G.D., Blood, 93:4059, 1999; Robertson, K. et al ., Carcinogensis, 21:461, 2000; Malik, K. & Brown, K.W., Brit . J. Cancer, 83:1583, 2000).

프로모터 CpG 섬이 메틸화되어 있을 때, 그 해당 유전자의 발현이 차단되는 이유는 명확히 밝혀져 있지 않으나, 메틸화된 시토신에 메틸 CpG 부착 단백질(MECP)이나 CpG 부착 도메인 단백질(domain protein, MBD), 및 히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase)가 부착되면서 염색체의 크로마틴 구조를 바꾸고 히스톤을 변화시키기 때문인 것으로 추측되고 있다.

프로모터 CpG 섬의 메틸화가 발암을 직접 유발하는지, 또는 이것이 발암에 2차적인 변화인지에 대해 논란이 있으나, 분명한 사실은 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화가 암의 중요한 지표이며, 따라서 이는 암의 진단과 조기진단, 발암위험의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적조사, 항암요법에 대한 반응 예측 등 다방면으로 이용될 수 있다는 것이다. 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다 (Esteller, M. et al ., Cancer Res ., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al ., Cancer Res ., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol ., 119:1219, 2000).

프로모터 메틸화를 이용한 암 진단의 정확도를 극대화하고 발암을 단계별로 분석하며, 암과 고령화에 따른 변화를 감별하기 위해서는 프로모터 CpG 섬의 전체 시토신 염기의 메틸화를 모두 정확하게 분석할 수 있는 검사가 필요하다. 현재 이를 위한 표준적 방법은 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법이다. 이는 검체 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리한 다음, 표적 유전자의 검사하고자 하는 CpG 섬 전체 부위를 PCR로 증폭한 후, 그 염기서열을 분석하는 것이다. 그러나 이 검사는 한번에 검사할 수 있는 유전자의 수나 검체의 수에 한계가 있으며, 자동화가 어렵고 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있다.

존스 홉킨스 의대와 MD 엔더슨 암센터, 베를린의대 등에서 암과 관련된 유전자의 프로모터 메틸화에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이렇게 얻어진 기초자료는 DNA Methylation Society(DMS)에서 교류가 이루어지고 있으며, MethDB (http://www.methdb.de) 자료가 저장되고 있다. 한편, EpiGenX Pharmaceuticals사는 CpG 섬의 메틸화와 관련된 치료제를 개발하고 있고, Epigenomics사는 DNA칩과 MALDI-TOF 등의 기법으로 프로모터 메틸화를 검사하여 암 진단에 응용하려는 연구를 진행 중이다.

이에, 본 발명자들은 조기 진단, 발암 위험 또는 암의 예후 예측 등이 가능한 효과적인 장암 특이적 메틸화 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 및 SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자가 장암세포에서 특이적으로 메틸화되어 있으며, 이를 바이오마커로 이용하여 메틸화 정도를 측정함으로써 장암을 진단할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 장암 진단에 효과적으로 사용될 수 있는 장암에서 특이적으로 메틸화되는 장암 특이적 메틸화 바이오마커를 제공하고, 이를 이용하여 조기에 장암을 진단하기 위한 정보를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 장암 특이적 메틸화 마커 유전자인 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 및 SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 메틸화 검출방법 및 이를 이용한 장암 진단용 키트 및 핵산 칩을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 장암 진단을 위한, 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법을 제공한다:

(a) DNA를 함유한 임상샘플을 준비하는 단계; 및

(b) 상기 임상샘플의 DNA로부터 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬의 메틸화를 검출하는 단계:

(ⅰ) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);

(ⅱ) SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); 및

(ⅲ) SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3).

본 발명은 또한, 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 함유하는 장암 진단용 조성물을 제공한다:

(ⅰ) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);

본 발명은 또한, 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 장암 진단용 키트를 제공한다:

(ⅰ) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);

본 발명은 또한, 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 포함하는 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 장암 진단용 핵산 칩을 제공한다:

(ⅰ) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);

본 발명은 장암 특이적 마커 유전자의 CpG 섬의 메틸화를 검출함으로써, 장암 진단을 위한 정보를 주는 방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 메틸화 검출방법과 진단용 조성물, 키트 및 핵산 칩을 이용하면, 장암을 초기 형질전환단계에서 진단할 수 있어 조기 진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 장암을 진단할 수 있어 유용하다.

도 1은 정상인과 장암 환자의 소변세포로부터 CpG 마이크로어레이 분석을 통하여 장암 진단을 위한 메틸화 바이오 마커를 발굴하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 장암 CpG 마이크로어레이 데이터로부터 장암 특이적 과메틸화 유전자를 선별하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 7개의 바이오 마커 후보 유전자의 장암 세포주 및 정상인 장조직에서 메틸화 정도를 파이로시퀀싱으로 측정한 그래프이다.
도 4는 3개의 메틸화 바이오 마커의 장암 조직 및 이와 연접하는 정상소견조직에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법으로 측정한 그래프이다.
도 5는 3개 메틸화 바이오마커의 장암 진단능력을 평가하기 위하여 ROC 커브 분석을 수행하여 장암진단에 대한 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 측정한 그래프이다.
도 6은 SDC2 바이오마커 유전자의 정상인 및 장암환자의 대변조직에서 메틸화 여부를 메틸화-특이적 PCR 방법으로 검증한 것이다 (Circles: 메틸화 특이 PCR 산물).

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 장암에서 특이적으로 메틸화되어 있는 유전자인 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 및 SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 CpG섬을 바이오마커로서 사용하는 것으로서, 이에 본 발명은 일 관점에서 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 함유하는 장암 진단용 조성물에 관한 것이다:

(ⅰ) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);

본 발명에 있어서, 상기 CpG섬은 유전자의 인트론 부위에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, SDC2 유전자의 인트론 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +681 ~ +1800 nt까지의 서열로, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, SORCS3 유전자의 인트론 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +851 ~ +2000 nt까지의 서열로, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 CpG섬은 유전자의 프로모터 부위에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때, SIM1 유전자의 프로모터 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, -1500 ~ -501 nt까지의 서열로, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

*본 발명에서는 정상인과 장암 환자간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 7개의 바이오마커 후보 유전자를 선별한 다음, 이 중 SDC2 , SIM1 및 SORCS3 유전자가 장암 진단에 유용함을 확인하였으며, 본 발명에 따른 메틸화 마커 유전자를 스크리닝하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 형질전환 세포 및 비형질전환 세포로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA에 결합하는 단백질과 반응시켜 메틸화된 DNA를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 메틸화된 DNA를 증폭시킨 후, CpG 마이크로어레이에 하이브리다이제이션한 다음, 정상 세포와 암 세포 간 메틸화 정도의 차이가 가장 큰 유전자를 메틸화 마커 유전자로 선정하는 단계.

상기 메틸화 바이오 마커 유전자의 선별방법으로 장암뿐만 아니라, 장암으로 진행 중인 여러 이형증 단계에서 다양하게 메틸화되는 유전자를 찾아낼 수 있으며, 선별된 유전자는 장암 스크리닝, 위험성 평가, 예측, 병명 확인, 병의 단계 진단 및 치료 타겟의 선정에도 사용될 수 있다.

장암 및 여러 단계의 이상에서 메틸화되는 유전자를 확인하는 것은 정확하고 효과적으로 장암을 조기 진단할 수 있게 하며, 다중 유전자를 사용한 메틸화 목록 확립 및 치료를 위한 새로운 타겟을 확인할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 메틸화 데이터는 다른 비-메틸화 연관 바이오 마커 검출 방법과 연계하면 더욱 정확한 장암 진단 시스템을 확립할 수 있을 것이다.

본 발명의 상기 방법으로, 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산 바이오 마커의 메틸화 단계를 결정하는 것을 포함하는 여러 단계 또는 기(期)의 장암 진행을 진단할 수 있다. 장암의 각 단계의 검체에서 분리된 핵산의 메틸화 단계를 장 조직의 세포 증식성 이상을 갖지 않는 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계와 비교하여, 검체의 장암의 특정 단계를 확인할 수 있으며, 상기 메틸화 단계는 하이퍼메틸화일 수 있다.

본 발명의 일례로, 핵산은 유전자의 조절 부위에서 메틸화될 수 있다. 다른 예로, 메틸화는 유전자의 조절 부위의 외곽에서부터 시작되어 내부로 진행되기 때문에, 조절 부위의 외곽에서 메틸화를 검출하는 것으로 세포 형질전환에 관여하는 유전자를 조기 진단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 메틸화 유전자 마커를 이용하여 장암을 형성할 가능성이 있는 세포의 조기 진단이 가능하다. 암세포에서 메틸화된다고 확인된 유전자가 임상적으로 또는 형태학적으로 정상으로 보이는 세포에서 메틸화되면, 상기 정상으로 보이는 세포는 암화가 진행되고 있는 것이다. 그러므로, 정상으로 보이는 세포에서의 장암 특이적 유전자가 메틸화를 확인함으로, 장암을 조기 진단할 수 있다.

본 발명의 메틸화 마커 유전자를 이용하면, 검체에서 장 조직의 세포 성장성 이상(이형증진행)을 검출할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산을 포함하는 시료를 하나 이상의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 하나 이상의 핵산에서 하나 이상의 부위의 메틸화 상태를 확인하는 것을 포함하고, 상기 핵산의 메틸화 상태는 장 조직의 세포 성장성 이상 (이형증 진행)을 가지지 않는 검체의 핵산에서의 동일한 부위의 메틸화 상태와 차이가 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 장암에서 특이적으로 메틸화되는 유전자의 메틸화 빈도를 검토하고, 장암 진행 가능성을 가지는 조직의 메틸화 빈도를 정하는 것에 의하여 조직의 장암으로의 발전 가능성을 평가할 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 장암 진단을 위한, 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법에 관한 것이다:

(a) DNA를 함유한 임상샘플을 준비하는 단계; 및

(ⅰ) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는 상기 유전자의 인트론 부위의 CpG섬의 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 이때, SDC2 유전자의 인트론 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +681 ~ +1800 nt까지의 서열로, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, SORCS3 유전자의 인트론 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +851 ~ +2000 nt까지의 서열로, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 메틸화 검출단계는 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 임상 샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포, 혈액, 혈장, 대변 및 소변으로 구성된 군에서 선택되는 특징으로 할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 일례로 상기 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: (a) DNA를 함유한 임상샘플을 준비하는 단계; (b) 상기 임상샘플로부터 DNA를 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 DNA를 SDC2 , SIM1 및 SORCS3 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 프로모터 또는 인트론의 CpG섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물의 생성 유무를 근거로 인트론의 메틸화 여부를 결정하는 단계.

다른 예로, 본 발명에서는 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 및 SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 메틸화 상태를 키트를 이용하여 검출하는 것에 의하여, 검체에 존재하는 장 조직의 세포 성장성 이상(이형증)을 진단할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 장암 진단용 키트에 관한 것이다:

(ⅰ) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);

본 발명에 있어서, 상기 PCR 프라이머쌍은 서열번호 12 및 13; 서열번호 14 및 15; 및 서열번호 16 및 17로 표시되는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 프라이머쌍인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서 또한, 상기 시퀀싱 프라이머는 서열번호 22 내지 24로 표시되는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 할 수 있다.

다른 예로, 본 발명에서는 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2), SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 및 SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 메틸화 상태를 핵산 칩을 이용하여 검출하는 것에 의하여, 검체에 존재하는 장 조직의 세포 성장성 이상(이형증)을 진단할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 다음의 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자 또는 그 프로모터의 CpG섬을 포함하는 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 장암 진단용 핵산 칩에 관한 것이다:

(ⅰ) SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2);

본 발명에 있어서, 상기 CpG섬은 유전자의 인트론 부위에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, SDC2 유전자의 인트론 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +681 ~ +1800 nt까지의 서열로, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, SORCS3 유전자의 인트론 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, +851 ~ +2000 nt까지의 서열로, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 CpG섬은 유전자의 프로모터 부위에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때, SIM1 유전자의 프로모터 영역은 전사개시점을 기준으로 볼 때, -1500 ~ -501 nt까지의 서열로, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 33 내지 44로 표시되는 염기서열로 구성되는 군에서 선택된 것임을 특징으로 할 수 있으며, 그 구체적인 서열은 다음과 같다.

SDC2

1) 5'-tgggtcgggc ccgcgaggga acggc-3' (서열번호 33)

2) 5'-ggggggagcc tgggtcgggc ccgcgaggga acggctccac-3' (서열번호 34)

3) 5'-tcgccctcgg cgggtcttgc tgcgtggtct gggaaggacg gaggggaaag-3' (서열번호 35)

4) 5'-ggggtccctt cctccgcaca ccatcccccc cgcgccagct ttcctgtttg actgcatgca agttctgggg agatgggggc cagatttaag agacccgcga-3' (서열번호 36)

SIM1

1) 5'-gatgggcgcc cccgaaacct ctgcc-3' (서열번호 37)

2) 5'-gccccgcgcc cgcccagcag ccccgcagct ccgcggtggt-3' (서열번호 38)

3) 5'-gggaagcgga gaggccggcg gtgtcgctgg gttggacggt aggcatgaga-3' (서열번호 39)

4) 5'-gggaagcgga gaggccggcg gtgtcgctgg gttggacggt aggcatgaga acagttaaga

gatgggcgcc cccgaaacct ctgccgcttg tggggactga-3' (서열번호 40)

SORCS3

1) 5'-cgagaggtgg cgtcgttgag cccgg-3' (서열번호 41)

2) 5'-cgtcgttgag cccggtctgg cctactccgg cattccgaac-3' (서열번호 42)

3) 5'-cgagaggtgg cgtcgttgag cccggtctgg cctactccgg cattccgaac-3' (서열번호 43)

4) 5'-cgtcgttgag cccggtctgg cctactccgg cattccgaac tgggcgcccg actgagcatc gcgcctgcct ggcagctgca gcggcccgca gcgcgtgccc ggaggggctc-3' (서열번호 44)

본 발명의 진단용 키트 또는 핵산 칩을 이용하면 검체에서 장 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증 진행도)을 결정할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 장 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증)이 없는 검체로부터 분리한 핵산의 메틸화 단계와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 형질전환된 장암 세포를 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 장암을 진단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 정상 표현형을 나타내는 샘플을 이용하여 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 장암으로 진행될 수 있는 가능성을 진단할 수 있다. 상기 샘플은 고체 또는 액체 조직, 세포, 대변, 소변, 혈청 또는 플라즈마를 사용할 수 있다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

본원에서 사용된 "세포 형질전환"은 정상에서 비정상으로, 비-종양성에서 종양성으로, 미분화에서 분화로, 줄기세포에서 비-줄기세포로와 같이 세포의 특징이 한 형태에서 다른 형태로 바뀌는 것을 의미한다. 추가적으로, 상기 형질전환은 세포의 형태, 표현형, 생화학적 성질 등에 의하여 인식될 수 있다.

본원에서 암의 "조기 확인"은 전이되기 전에 암의 가능성을 발견하는 것으로, 바람직하게는 검체 조직 또는 세포에서 형태학적 변화가 관찰되기 전에 발견하는 것이다. 추가적으로, 세포 형질전환의 "조기 확인"은 세포가 형질전환되는 형태가 되기 전에 초기 단계에서 형질전환이 일어날 가능성 높은 것을 말한다.

본원에서 "하이퍼메틸화"는 CpG 섬의 메틸화를 의미한다.

본원에서, "샘플" 또는 "검체 샘플"은 수행되는 분석의 종류에 따라, 개개인, 체액, 세포주, 조직 배양 등에서 얻어지는 모든 생물학적 체액, 포함하는 폭넓은 범위의 체액을 의미하는 것이다. 포유동물로부터 체액 및 조직 생검을 획득하는 방법은 통상적으로 널리 알려져 있다. 바람직한 소스는 장의 생검(biopsy)이다.

장암에 대한 바이오 마커 -정상세포와의 비교를 위한 암세포의 용도

본 실시예에서, "정상" 세포는 비정상적 세포 형태 또는 세포학적 성질의 변화를 나타내지 않은 세포를 의미한다. "종양"세포는 암 세포를 의미하고, "비종양" 세포는 병증 조직의 일부이지만, 종양 부위는 아니라고 판단되는 세포를 의미한다.

본 발명은 일 관점에서, 장암과 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2); SIM1 (NM_005068, 싱글-마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 하이퍼메틸화 사이의 관련성의 발견에 기반을 둔 것이다.

본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체에서 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계를 결정하여 검체의 장 조직의 세포 성장성 이상을 조기 진단할 수 있다. 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 장 조직의 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다. 핵산은 CpG 섬과 같은 CpG-함유 핵산인 것이 바람직하다.

본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화를 결정하는 것을 포함하는 검체의 장 조직의 세포 성장성 이상 소양을 진단할 수 있다. 상기 핵산은 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2); SIM1 (NM_005068, 싱글-마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1); SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자; 및 그의 조합인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 장 조직의 세포 성장성 이상에 대한 소양을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 "소양"은 상기 세포 성장성 이상에 걸리기 쉬운 성질을 의미한다. 소양을 가진 검체는 아직은 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않지만, 세포 성장성 이상이 존재하거나 존재할 경향이 증가된 검체를 말한다.

본 발명은 다른 관점에서, 검체의 핵산을 포함하는 시료를 시료의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키고, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 확인하는 것을 포함하는 검체의 장 조직의 세포 성장성 이상을 진단하는 방법을 제공한다. 여기서, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화는 세포 성장성 이상을 가지지 않는 검체의 동일한 핵산의 동일한 부위의 메틸화 단계와 다른 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 방법은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 결정하는 단계를 포함한다. 여기서, "핵산" 또는 "핵산 서열"이란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 의미하거나 이들의 단편, 단일가닥 또는 이중가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 센스 또는 안티센스 가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, PNA(peptide nucleic acid) 또는 자연 기원 또는 합성 기원의 DNA 양 또는 RNA 양 물질을 말한다. 핵산이 RNA이면, 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T를 대신하여, 각각 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U로 대체된다는 것은 당해 분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명하다.

서로 다르게 메틸화된 CpG 섬의 존재를 검출할 수 있는 핵산이라면 어떤 것이든 사용할 수 있다. 상기 CpG 섬은 핵산 서열에서 CpG가 풍부한 부위이다.

메틸화( methylation )

본 발명에서의 정제되거나 정제되지 않은 형태의 어떠한 핵산도 사용될 수 있으며, 타겟 부위(예를 들면, CpG-함유 핵산)를 함유하는 핵산 서열을 함유하고 있거나 함유할 것으로 의심되는 어떠한 핵산도 사용될 수 있다. 차별적으로 메틸화될 수 있는 핵산 부위가 CpG 섬이고, 이는 다른 디뉴클레오티드 CpG 핵산 부위와 비교하여 높은 CpG 밀도를 가지는 핵산 서열이다. 이중(doublet) CpG는 G*C 염기쌍의 비율로 예측하였을 때, 척추동물 DNA에서 단 20% 정도의 확률로 나타난다. 특정 부위에서, 이중 CpG의 밀도는 게놈의 다른 부위와 비교하여 10배나 더 높다. CpG 섬은 평균 G*C 비율이 약 60%로, 보통의 DNA의 G*C 비율은 평균 40%를 나타낸다. CpG 섬은 전형적으로 약 1~2kb 길이를 가지고, 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 존재한다.

여러 유전자에서, CpG 섬은 프로모터의 업스트림(upstream)에서 시작하여, 다운스트림의 전사 부위까지 확장된다. 프로모터에서 CpG 섬의 메틸화는 보통 유전자의 발현을 억제시킨다. CpG 섬은 또한 유전자 코딩 부위의 3' 부위뿐만 아니라, 유전자 코딩 부위의 5' 부위를 둘러싸고 있을 수 있다. 그러므로, CpG 섬은 프로모터 부위를 포함하는 조절 부위의 코딩 서열 업스트림, 코딩 부위(예를 들어, 엑손영역), 코딩 부위의 다운스트림, 예를 들면, 인헨서 부위 및 인트론을 포함하는 여러 부위에서 발견된다.

통상적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이다. 그러나, 본 발명의 방법은 예를 들면, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 적용할 수 있으며, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유한 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.

핵산 혼합물 또한 사용할 수 있다. 검출될 특이적인 핵산 서열은 큰 분자의 분획일 수 있고, 처음부터 특이 서열이 전체 핵산 서열을 구성하는 분리된 분자 형태로 존재할 수 있다. 상기 핵산 서열은 순수한 형태로 존재하는 핵산일 필요는 없으며, 핵산은 전체 인간 DNA가 포함되어 있는 것과 같이 복잡한 혼합물 내의 적은 분획일 수도 있다. 시료에 포함된 핵산의 메틸화 정도를 측정하는 데 사용되거나, 메틸화된 CpG 섬을 검출하는 데 사용되는 시료에 포함된 핵산은 Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989)에 기재된 여러 가지 방법으로 추출될 수 있다.

검체로부터 분리된 핵산은 검체의 생물학적 시료에 의하여 얻어진다. 장암이나 장암의 진행 단계를 진단하고 싶다면, 스크랩이나 생검으로 장 조직에서 핵산을 분리하여야 한다. 이러한 시료는 당해 분야에서 알려진 여러 의학적 과정에 의하여 얻어질 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 검체로부터 얻어진 샘플의 핵산의 메틸화 정도는 장 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체의 동일한 핵산 부분과 비교하여 측정한다. 하이퍼메틸화는 하나 이상의 핵산에서 메틸화된 대립유전자가 존재하는 것을 말한다. 장 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체는 동일한 핵산을 검사했을 때, 메틸화 대립유전자가 나타나지 않는다.

개별 유전자 및 패널

본 발명은 진단 또는 예측 마커로서 각 유전자를 개별적으로 사용하거나, 몇몇 마커 유전자를 조합하여 패널 디스플레이 형태로 하여 사용할 수 있고, 몇몇의 마커 유전자는 전체적인 패턴 또는 메틸화된 유전자의 목록을 통하여 신뢰성 및 효율성을 향상시키는 것을 확인할 수 있다. 본 발명에서 확인된 유전자는 개별적으로, 또는 본 실시예에서 언급된 유전자가 조합된 유전자 세트로 사용될 수 있다. 또는, 유전자들은 함께 메틸화된 유전자의 수 및 그 중요도에 따라 순위를 매길 수 있고, 가중치를 둘 수 있으며, 암으로 발전할 가능성의 수준을 선정할 수 있다. 이러한 알고리즘은 본 발명에 속한다.

메틸화 검출 방법

메틸화 특이 PCR ( methylation specific PCR )

지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 이때 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 변환시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메틸화인 경우에는 비메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메틸화 여부는 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.

실시간 메틸화 특이 PCR ( real time methylation specific PCR )

실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TanMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 Sybergreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro methylated DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석하였다.

파이로시퀀싱

파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 시퀀싱 방법을 정량적인 실시간 시퀀싱으로 변환한 방법이다. 바이설파이트 시퀀싱과 마찬가지로 지노믹 DNA를 바이설파이트를 처리하여 전환시킨 다음, 5'-CpG-3' 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 상기 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 시퀀싱 프라이머를 이용하여 실시간 염기서열 분석을 수행하였다. 5'-CpG-3' 부위에서 시토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메틸화 정도를 메틸화 지수로 나타내었다.

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하였다. 이들 분리된 DNA를 인트론 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정하였다.

또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다. 여기서 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질은 MBD2bt에 제한되지 않는다.

차별적 메틸화의 검출-메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제

차별적 메틸화의 검출은 메틸화되지 않은 CpG 부위만을 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 핵산 샘플을 접촉시켜 비메틸화된 핵산을 절단하는 것으로 수행할 수 있다.

별도의 반응으로, 상기 샘플을 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머(isochizomer)와 접촉시켜, 메틸화된 핵산을 절단하였다.

특이적 프라이머를 핵산 샘플에 첨가하고, 통상의 방법으로 핵산을 증폭시켰다. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않으면, 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어난 것이다. 그러나, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서도 증폭 산물이 존재하지 않는다는 것은 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어나지 않은 것이다.

여기서, "메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제"는 인식 부위에 CG를 포함하고, C가 메틸화되지 않았을 때와 비교하여 C가 메틸화되었을 때 활성을 가지는 제한효소이다 (예를 들면, SmaI). 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 비제한적 예로써, MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI이 포함된다. 상기 효소들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 다른 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레오티드로는 예를 들어, SacII 및 EagI를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머는 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 동일한 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제이지만, 메틸화된 CGs와 비메틸화된 CGs를 모두 절단하며, 예를 들면, MspI를 들 수 있다.

본 발명의 프라이머는 증폭될 로커스의 각 가닥과 "대체적으로" 상보성을 가지도록 제작되고, 상기에서 설명한 바와 같이, 적당한 G 또는 C 뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션 되기에 충분한 상보성을 가지는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 증폭 과정에 사용되며, 상기 증폭 과정은 예를 들면, PCR과 같은, 타겟 로커스가 많은 반응 단계를 거치면서 기하급수적인 숫자로 증가하는 효소 연속 반응이다. 전형적으로, 한 프라이머(안티센스 프라이머)는 로커스의 네가티브(-) 가닥에 대하여 상동성을 가지고, 나머지 하나의 프라이머(센스 프라이머)는 포지티브(+) 가닥에 대하여 상동성을 가진다. 변성된 핵산에 프라이머가 어닐링되면, DNA 폴리머라아제 I(Klenow) 및 뉴클레오티드와 같은 효소 및 반응물들에 의하여 사슬이 신장되고, 그 결과, 타겟 로커스 서열을 함유하는 + 와 - 가닥이 새롭게 합성된다. 상기 새로이 합성된 타겟 로커스가 주형으로도 사용되어 변성, 프라이머 어닐링 및 사슬 신장의 사이클이 반복되면 타겟 로커스 서열의 기하급수적인 합성이 진행된다. 상기 연속 반응의 산물은 반응에 사용된 특이 프라이머의 말단과 대응하는 말단을 가지는 독립적인 이중가닥 핵산이다.

상기 증폭 반응은 당해 분야에서 보편적으로 사용되고 있는 PCR인 것이 바람직하다. 그러나, 리얼타임 PCR 또는 등온 효소를 사용한 선형증폭과 같은 대체적인 방법도 사용할 수 있으며, 멀티플렉스 증폭 반응 역시 사용할 수 있다.

차별적 메틸화의 검출- 바이설파이트 시퀀싱 방법

메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하여 메틸화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭 단계는 선택적이고, 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메틸화 및 비메틸화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이다. 상기와 같은 방법은 미국특허 5,786,146에 개시되어 있으며, 상기 특허에는 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트(bisulfite) 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다.

키트( Kit )

본 발명에 의하면, 검체의 세포 성장성 이상을 검출하는 데 유용한 키트를 제공하고 있다. 본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 샘플을 파이로시퀀싱하기 위한 5'-CpG-3' 염기서열 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머쌍을 함유하는 두번째 용기, 및 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다.

캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.

기질

타겟 핵산 부위가 증폭되면 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 상기 핵산 증폭 산물은 고체 지지체(기질)에 고정된 알려진 유전자 프로브와 하이브리다이제이션될 수 있다.

여기서, "기질"은 물질, 구조, 표면 또는 재료, 비생물학적이고, 합성되고, 무생물, 평면, 구형 또는 특이적 결합, 평편한 표면의 물질을 포함하는 혼합물 수단으로, 하이브리다이제이션 또는 효소 인식 부위 또는 대다수의 다른 인식 부위 또는 표면, 구조 또는 재료로 구성된 수많은 다른 분자 종을 넘어서는 수많은 다른 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 기질은 예를 들면, 반도체, (유기)합성 메탈, 합성 반도체, 인슐레이터 및 도판트; 금속, 합금, 원소, 화합물 및 미네랄; 합성되고, 분해되며, 에칭되고, 리소그라프되며, 프린트되고 마이크로패브리케이트된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적, 폴리머, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속 및 세라믹; 나무, 종이, 카드보드, 면, 울, 천, 직조 및 비직조 섬유, 재료 및 패브릭일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 형태의 멤브레인은 당해 분야에서 핵산 서열에 대하여 부착력을 가진다고 알려져 있다. 이러한 멤브레인의 특이적이고 비제한적인 예로 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐클로라이드, 디아조티즈드(diazotized) 페이퍼 및 GENESCREEN^TM, ZETAPROBE^TM(Biorad) 및 NYTRAN^TM 등의 상업적으로 사용되는 멤브레인과 같이 유전자 발현 검출용 멤브레인을 들 수 있다. 비드, 글래스, 웨이퍼 및 금속 기질도 포함된다. 이러한 목적물에 핵산을 부착시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 이와 다르게, 액체 상에서도 스크리닝을 수행할 수 있다.

하이브리다이제이션 조건

핵산 하이브리다이제이션 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 하이브리다이즈되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 하이브리다이제이션되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 하이브리다이제이션 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.

매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(하이브리다이제이션 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 하이브리다이제이션 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 하이브리다이제이션에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.

표지( Label )

중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

장암 특이적 메틸화 유전자 발굴

장암에서 특이적으로 메틸화된 바이오 마커를 선별하기 위하여, 암 환자가 아닌 정상인 2명의 게놈 DNA (Biochain), 장암환자 12명의 수술조직으로부터 얻은 암 조직 및 이와 연접하는 정상소견 조직 게놈 DNA 500ng을 초음파 분쇄(Vibra Cell, SONICS)하여, 약 200~300bp의 게놈 DNA 절편을 제작하였다.

게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA만을 획득하기 위하여, 메틸화 DNA에 결합한다고 알려진 메틸바인딩 도메인 (Methyl binding domain; MBD) (Fraga et al., Nucleic Acid Res., 31: 1765, 2003)을 사용하였다. 즉, 6X His가 tagging된 MBD2bt 2㎍을 대장균 JM110(한국생명공학연구원 생명자원센터, No. 2638) 게놈 DNA 500ng과 pre-incubation시킨 다음, Ni-NTA 마그네틱 비드 (Qiagen, USA)에 결합시켰다. 여기에 상기 초음파 분쇄된 정상인 및 장암 환자 조직세포에서 분리한 게놈 DNA 500ng을 결합 반응 용액(10mM Tris-HCl(pH 7.5), 50mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 3mM MgCl₂, 0.1% Triton-X100, 5% 글리세롤, 25㎎/㎖ BSA)하에서 4℃, 20 분간 반응시킨 후, 700mM NaCl이 포함된 결합 반응 용액 500㎕를 이용하여 3회 세척한 다음, MBD2bt에 결합된 메틸화된 DNA를 QiaQuick PCR purification kit(QIAGEN, USA)을 사용하여 분리하였다.

이후, 상기 MBD2bt에 결합된 메틸화된 DNA를 게놈 증폭 키트(Sigma, USA, Cat. No. WGA2)를 이용하여 증폭한 후, 상기 증폭된 게놈 DNA 4㎍을 BioPrime Total Genomic Labeling system I(Invitrogen Corp., USA)을 이용하여 Cy5로 표지하였다. 정상인과 장암 환자간의 메틸화 정도를 간접적으로 비교하기 위하여 표준비교 DNA를 제작하였다. 표준비교 DNA는 메틸화 분석을 위해 사용한 12명의 장암 환자 조직의 게놈 DNA를 동량으로 혼합하고 이를 DNA를 게놈 증폭 키트(Sigma, USA, Cat. No. WGA2)를 이용하여 증폭한 후, 상기 증폭된 게놈 DNA 4㎍을 BioPrime Total Genomic Labeling system I(Invitrogen Corp., USA)을 이용하여 Cy3로 표지하였다. 상기 표준비교 DNA 및 정상인과 장암 환자의 DNA 각각을 혼합한 후, 244K human CpG 마이크로어레이(Agilent, USA)에 하이브리다이제이션시켰다 (도 1). 상기 하이브리다이제이션 후, 일련의 세척 과정을 거친 다음. Agilent scanner를 이용하여 스캐닝하였다. 마이크로어레이 이미지로부터 시그날 값의 계산은 Feature Extraction 프로그램 v. 9.5.3.1(Agilent)을 이용하여 정상인과 장암 환자 시료 간 시그날의 상대적인 강도 차이를 계산하였다.

신뢰할 만한 하이브리다이제이션 시스날을 갖는 프로브들을 선별하기 위하여 GeneSpring 7.3 프로그램 (미국 Agilent 사)을 이용하여 cross gene error model을 적용하여 Cy3 시그날이 총 26개의 array중 최소 21개 array에서 112.8 이상인 64,325개의 프로브들을 신뢰할 만한 시그날을 갖는 프로브들로 선별하였다. 이로부터 장암에 특이적으로 과메틸화 되어 있는 프로브들을 선별하기 위하여 두 가지 방법으로 분석하였다. 첫째는 정상인의 장조직 및 장암과 연접하고 있는 정상소견조직을 동일그룹으로 간주하고 장암 조직과 비교하여 차별적인 메틸화를 보이는 프로브들을 선별하기 위하여 아노바 테스트 (ANOVA test)를 수행하여 p 값이 0.05 이하인 4,498개의 프로브를 선별하였다. 이로부터 장암조직에 과메틸화 되어 있는 1,560개의 프로브들을 다시 선별하고, 이중 약 400 bp 이내에 존재하는 2개 이상의 연접한 프로브에서 과메틸화를 동시에 나타내는 4개의 바이오마커 유전자 후보 (CHST11, IRX5, KCNA1, SDC2, SORCS3)를 발굴하였다 (도 2). 둘째는 조기진단에 적합한 메틸화 바이오마커를 발굴하기 위하여 장암 조직 및 이와 연접하는 정상소견조직을 동일 그룹으로 간주하고, 정상인의 장조직과 차별적으로 메틸화 되어 있는 프로브들을 아노바 테스트를 수행하여 p 값이 0.01 이하인 3,242개의 프로브를 선별하였다. 3,242개의 프로브중 장암 조직 및 이와 연접한 정상 소견 조직에서 과메틸화를 나타내는 705개의 프로브를 선별하고 이로부터 약 400 bp 이내에 존재하는 2개 이상의 연접한 프로브가 동시에 과메틸화를 나타내는 6개의 바이오마커 후보 유전자 (CHST11, IRX1, IRX5, KCNA1, SIM1, SORCS3)를 선별하였다 (도 2).

상기 두 가지 방법으로 분석한 바이오마커 후보 유전자들 중 4개의 유전자는 공통적인 유전자로 확인되었으며, 이에 전체 바이오마커 후보유전자는 7개를 확보하였다 (표 1). 또한, CpG 마이크로 어레이 분석에서 과메틸화를 보이는 이들 7개의 유전자들의 각 프로브에 해당하는 부위의 염기서열에 대해서 MethPrimer (http://itsa.ucsf.edu/~urolab/ methprimer/index1.html)을 이용하여 CpG islands가 존재하는 것을 확인하였다.

장암 진단용 메틸화 바이오 마커 후보유전자 목록

후보유전자	프로브 위치^a	GenBank No.	Description
CHST11	+501, +605	NM_018413	carbohydrate (chondroitin 4) sulfotransferase 11
IRX1	+809, +956, +1,021, +1,097	NM_024337	iroquois homeobox 1
IRX5	+2,647, +2,724	NM_005853	iroquois homeobox 5
KCNA1	-1,853, -1,612	NM_000217	potassium voltage-gated channel, shaker-related subfamily, member 1 (episodic ataxia with myokymia)
SDC2	+1,168, +1,282	NM_002998	Syndecan 2
SIM1	-1,242, -1,178	NM_005068	single-minded homolog 1 (Drosophila)
SORCS3	+1,478, +1,519	NM_014978	sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3

^a, 전사개시부위 (+1)로부터의 염기서열 거리 (bp)

암 세포주에서의 바이오마커 유전자의 메틸화 측정

실시예 1에서 선별된 바이오마커 후보 유전자의 메킬화 상태를 추가적으로 확인하기 위하여, 각각의 프로모터 또는 인트론 부위에 대해 파이로시퀀싱을 수행하였다.

바이설파이트(bisulfite)를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변형하기 위하여, 장암 세포주 Caco-2 (한국세포주은행 (KCLB No. 30037.1)와 HCT116 (한국세포주은행 (KCLB No. 10247)으로부터 전체 게놈 DNA를 분리하여, 그 중 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게 된다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하였다.

상기 7개의 유전자에 대한 파이로시퀀싱을 수행하기 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 PSQ assay design 프로그램(Biotage, USA)을 이용하여 설계하였다. 각 유전자의 메틸화 측정을 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 하기 표 2 및 표 3과 같다.

PCR 프라이머

유전자	프라이머	서열 (5'→3')^a	서열 번호	CpG 위치^b	앰플리콘 크기 (bp)
CHST11	forward	GAGATTATTTTGGTTAATATGG	4	+361, +368, +385, +391, +393	207
	reverse	TTTAAAACRAAATCTCACT	5
IRX1	forward	YGAAAYGGAGTTTATTTTAAGTG	6	+660, +681, +686, +692	126
	reverse	ACRAAACRACCTCTTAAATC	7
IRX5	forward	GGGTTYGGGTTAGGTTTTATAA	8	+2558, +2568, +2572, +2576	113
	reverse	TAACTCCRCAACATTTTC	9
KCNA1	forward	GGGTGGGTTTYGTAGAGAGTAAG	10	-420, -410, -398, -394	114
	reverse	CCTCCRACRAATTTACTTTT	11
SDC2	forward	YGTTTTTYGAGATTAGGGATGATT	12	+1100, +1115, +1131, +1133	107
	reverse	TCTCCCCAAAACTTACAT	13
SIM1	forward	GGTTTTTAATTAGGAATAATAGTG	14	-1024, -1021, -1015, -1003	244
	reverse	AACRCCCATCTCTTAACT	15
SORCS3	forward	GGGTTTTTTTGGATAAGG	16	+1741, +1751, +1754, +1763	101
	reverse	CAAACRCRATACTCAATC	17

^a Y = C 또는 T, R = A 또는 G

^b전사 개시점 (+1)으로부터의 거리(nucleotide): 메틸화 측정에 사용된 CpG 부위의 게놈 DNA 상의 위치

메틸화 마커 유전자의 시퀀싱 프라이머 서열

유전자	서열 (5' --> 3')	서열번호
CHST11	TAGGAGAATGGTGTGAAT	18
IRX1	TCCCTCTTCTCCCTA	19
IRX5	ATTTTAATGGATTAAATTAG	20
KCNA1	TTTTTTGGGGGAGGA	21
SDC2	GGGATGATTTGGAAATT	22
SIM1	CATCTCTTAACTATTCTCATACCT	23
SORCS3	TTTTTTTGGATAAGGATG	24

상기의 바이파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer(Enzynomics, Korea) 5㎕, Taq polymerase(Enzynomics, Korea) 5units, 2.5mM dNTP(Solgent, Korea) 4㎕, PCR 프라이머 2㎕(10 pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.

상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 처리한 후, PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 상기 파이로시퀀싱 후, 메틸화 지수(methylation index)를 계산함으로써 메틸화 정도를 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다.

상기 바이오마커 후보 유전자의 장암 세포주에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 정량적으로 측정한 결과, 도 3A에서 나타난 바와 같이, 상기 7개의 바이오 마커 유전자 모두가 최소 1개 이상의 세포주에서 높은 수준으로 메틸화되어 있는 것을 확인하였다. 상기 7개의 유전자는 장암 세포주에서 높은 메틸화 수준을 나타냄으로써, 장암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 가질 가능성을 보여주었다. 이에 다음과 같이, 이를 검증하기 위하여 조직시료를 이용한 메틸화 검증 실험을 추가로 진행하였다.

정상인 장 조직에서의 바이오마커 후보유전자의 메틸화 측정

실시예 1의 7개의 바이오마커 후보유전자가 장암 진단용 마커로서의 유용성을 가지려면, 환자가 아닌 정상인의 장조직에서는 낮은 메틸화 수준을 나타내어야 하고, 반면에 장암 조직에서는 높은 메틸화 수준을 나타내어야 한다.

따라서, 이를 검증하기 위하여, 1차적으로 환자가 아닌 정상인 2명의 장조직(Biochain사)으로부터 QIAamp DNA Mini kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 분리된 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 20㎕로 용출하여 파이로시퀀싱에 사용하였다.

상기 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5 units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), PCR 프라이머 2㎕(10pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.

상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 처리한 후, PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 파이로시퀀싱 후, 메틸화 정도는 메틸화 지수(methylation index)를 계산함으로써 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다. 이때, 실시예 2와 동일하게 표 2의 PCR 프라이머와 표 3의 시퀀싱 프라이머를 사용하였다.

그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, 7개의 유전자중 IRX1, IRX5, KCNA1 및 CHST11은 정상조직에서 40% 이상의 높은 메틸화 수준을 나타내어, 바이오마커로서의 유용성이 없는 것으로 판단되었으며, 따라서 바이오마커 후보에서 제외시켰다. 반면에 SIM1, SDC2 및 SORCS3는 상대적으로 낮은 메틸화 정도를 나타내었다. 따라서, 이들 SIM1, SDC2 및 SORCS3 유전자의 바이오마커로서의 유용성을 다음과 같이, 장암환자 조직을 대상으로 검증하였다.

장암환자 조직에서의 바이오 마커 유전자의 메틸화 측정

정상인 장조직에서 낮은 메틸화 수준을 보이는 것으로 나타난 SIM1, SDC2 및 SORCS3 유전자의 장암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 검증하기 위하여 12명의 장암환자 수술조직(보건복지가족부 지정 연세대학교 국가지정 바이오칩 센터)으로부터 확보한 장암조직과 이와 연접하는 정상소견조직으로 게놈 DNA를 분리하였다.

상기 분리된 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 20㎕로 용출하여 파이로시퀀싱에 사용하였다.

상기 3개 유전자의 메틸화 정도를 측정한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, SDC2와 SIM1 유전자는 12명의 환자 전부(100%)에서 장암조직에서 이와 연접하는 정상소견 조직에 비하여 높은 메틸화 수준을 나타내었다. 그리고 SORCS3 유전자는 12명의 환자중 10명(83.3%)의 장암 조직에서 높은 수준의 메틸화를 나타내어 3개의 유전자 전부가 장암 진단용 메틸화 바이오마커로서의 유용성이 매우 높은 것을 확인하였다. 표 4는 3개 바이오마커 유전자의 장암조직 및 이와 연접하는 정상소견 조직에서의 메틸화 평균값을 나타낸 것이다. 장암조직과 정상소견조직의 메틸화 수준이 통계적으로 유의하게 차이나는지를 확인하기 위하여 카이스퀘어 테스트를 수행하였고, 그 결과, 3개 유전자 전부가 p 값이 0.01 이하로 높은 유의수준을 나타내는 것을 확이할 수 있었다 (표 4).

3개 바이오 마커의 메틸화 정량 분석 결과

유전자	평균 메틸화 수준(%, 평균 ± 표준편차)		p값^a
유전자	정상소견조직	장암 조직
SDC2	5.7 ± 0.6	24.5 ± 15.4	< 0.0001
SIM1	18.3 ± 4.7	29.8 ± 11.8	< 0.0001
SORCS3	24.1 ± 5.0	51.8 ± 19.9	0.0012

^a 카이스퀘어 테스트 결과 얻은 p 값

3개 바이오 마커 유전자의 장암 진단능력 평가

실시예 4에서 장암 마커로서의 유용성을 확인한 SIM1, SDC2 및 SORCS3 유전자에 대하여, 추가적으로 장암 진단에 대한 능력을 평가하기 위하여 MedCalc 프로그램 (MEDCALC, 벨기에)을 이용한 ROC 커브 (Receiver Operating Characteristic) 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, SDC2 유전자는 민감도 및 특이도가 각각 100%, SIM1 유전자는 83.3%, 100% 그리고 SORCS3 유전자는 83.3% 및 100%를 나타내어 장암 진단에 대한 능력이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

이에 추가적으로 상기 3개의 바이오마커 중 장암 조직에서 진단능력이 가장 우수한 SDC2 유전자를 이용하여 대변시료에서의 장암 진단능력을 평가하였다.

이를 위하여 nested methylation-specific PCR(MSP) 기법을 이용하여 4명의 정상인 및 10명의 장암환자의 대변시료 (보건복지부 지정 연세대학교 바이오칩 연구센터)로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 게놈 DNA 4㎍에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 20㎕로 용출하여 nested MSP 실험에 사용하였다. Nested MSP 실험에 사용한 프라이머 서열은 표 5와 같다.

SDC2 유전자의 MSP용 프라이머 서열

메틸화	프라이머	프라이머 서열 (5‘--> 3’)	증폭산물 크기 (bp)	서열번호
메틸화	Outer-F	AATTTCGGTACGGGAAAGGAGTTC	248	25
	Outer-R	AAACAAAATACCGCAACGATTACGA	248	26
	Inner-F	TAGAAATTAATAAGTGAGAGGGCGT	121	27
	Inner-R	GACTCAAACTCGAAAACTCGAA	121	28
비메틸화	Outer-F	TGAATTTTGGTATGGGAAAGGAGTTT	250	29
	Outer-R	AAACAAAATACCACAACAATTACAAC	250	30
	Inner-F	GAGTGTAGAAATTAATAAGTGAGAGGGT	129	31
	Inner-R	TACAACTCAAACTCAAAAACTCAAA	129	32

상기 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 1ug을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 1ug, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5 units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), Outer PCR 프라이머 2㎕(5pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 30회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물 1/2을 취하여 동일한 방법으로 45회 PCR을 수행하고, PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, SDC2 유전자는 4명의 정상인에서는 전혀 메틸화가 관찰되지 않은 반면, 10명의 장암환자중 6명 (60%)에서 메틸화가 관찰되어 대변을 이용한 장암진단에도 유용한 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

부호 없음

서열목록 전자파일 첨부

Claims

임상샘플의 DNA로부터 SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터 부위의 CpG 섬의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 장암 진단을 위한, 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 메틸화를 검출하는 단계는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 SIM1 유전자의 프로모터 부위의 CpG섬의 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 CpG 섬 또는 그 프로모터의 CpG섬의 메틸화를 추가로 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 SORCS3 유전자의 인트론 부위의 CpG섬의 메틸화를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 메틸화를 검출하는 단계는 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 임상 샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포, 혈액, 혈장, 대변 및 소변으로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터 부위의 CpG섬을 함유하는 장암 진단용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 CpG 섬은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 SIM1 유전자의 프로모터 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 장암 진단용 조성물.
SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터 부위의 CpG섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 장암 진단용 키트.
제9항에 있어서, 상기 PCR 프라이머쌍은 서열번호 14 및 15로 표시되는 염기서열인 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
제9항에 있어서, 상기 시퀀싱 프라이머는 서열번호 23으로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
제9항에 있어서, SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 CpG 섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
SIM1 (NM_05068, 싱글 마인디드 호몰로그 1 (초파리), Single-minded homolog 1) 유전자의 CpG섬 또는 그 프로모터 부위의 CpG섬을 포함하는 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 장암 진단용 핵산 칩.
제13항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 37 내지 40으로 표시되는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 진단용 핵산 칩.
제13항에 있어서, SORCS3 (NM_014978, 쏘틸린-릴레이티드 VPS10 도메인 콘테이닝 리셉터 3, Sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) 유전자의 CpG 섬 또는 그 프로모터의 CpG섬을 포함하는 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 추가로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 진단용 핵산 칩.