KR20140059125A

KR20140059125A - 위용종 및 위암 특이적 메틸화 마커 유전자를 이용한 위용종 및 위암의 검출방법

Info

Publication number: KR20140059125A
Application number: KR1020130113903A
Authority: KR
Inventors: 안성환; 오태정
Original assignee: (주)지노믹트리
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2013-09-25
Publication date: 2014-05-15
Also published as: WO2014073785A1; ES2681035T3; KR101569498B1; DK2918679T3; EP2918679A4; EP2918679B1; JP2016500521A; CN104812899A; US20160040244A1; TR201810602T4; EP2918679A1

Abstract

본 발명은 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 위용종 및 위암 특이적 메틸화 바이오마커로서의 새로운 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 를 바이오마커로 이용하여 메틸화 정도를 측정함으로써 위용종 및 위암을 조기에 진단하는 용도에 관한 것이다. 본 발명은 위용종 및 위암 특이적 마커 유전자의 CpG 섬의 메틸화를 검출함으로써, 위암 진단을 위한 정보를 주는 방법을 제공하는 효과가 있다. 아울러, 본 발명에 따른 메틸화 검출방법과 진단용 조성물, 키트 및 핵산 칩을 이용하면, 위암을 초기 형질전환단계에서 진단할 수 있어 조기 진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 위암을 진단할 수 있어 유용하다.

Description

위용종 및 위암 특이적 메틸화 마커 유전자를 이용한 위용종 및 위암의 검출방법{Method for Detecting Gastric Polyp and Gastric Cancer Using Gastric Polyp and Gastric Cancer Specific Methylation Marker Gene}

본 발명은 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 위용종 및 위암 특이적 메틸화 바이오마커로서의 새로운 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이를 바이오마커로 이용하여 메틸화 정도를 측정함으로써 위용종 및 위암을 조기에 진단하는 용도에 관한 것이다.

의학이 발달한 오늘날에도 인체 암, 특히 대다수를 차지하는 고형암(solid tumor: 혈액암을 제외한 나머지 암)의 경우 5년 생존율은 50%미만이다. 전체 암환자의 약 3분의 2는 진행된 단계에서 발견되며, 이들 대부분은 진단 후 2년 이내에 사망한다. 이와 같이 저조한 암의 치료효과는 치료법의 문제 뿐만은 아니며, 실제 암을 조기에 진단할 수 있는 방법과 진행된 암을 정확히 진단하고 치료 후 추적 조사하는 것이 용이하지 않기 때문이다.

현재 임상에서 암의 진단은 문진(history taking)과 신체검사, 임상병리검사를 거쳐 일단 의심이 되면 방사선검사 및 내시경검사로 진행되며, 최종적으로는 조직검사로 확인된다. 그러나 현존 임상검사법으로는 암의 세포 수가 10억개, 암의 직경이 1㎝ 이상이 되어야 진단이 가능하다. 이런 경우 이미 암세포는 전이능력을 갖고 있으며, 실제 절반 이상에서 암이 이미 전이되어 있다. 한편, 암이 직간접으로 생산하는 물질을 혈액 내에서 찾는 종양마커(tumor markers)가 암 선별검사(cancer screening)에 이용되는데, 이는 정확도에 한계가 있어서 암이 있을 때도 약 절반까지 정상으로 나타나며, 암이 없을 때도 종종 양성으로 나타나서 혼란을 야기한다. 또한, 암의 치료에 주로 사용되는 항암제의 경우, 암의 용적이 적은 경우에만 그 효과를 나타내는 문제점이 있다.

상기한 바와 같이, 암의 진단과 치료가 모두 어려운 것은 정상세포와 다른 점이 많고, 매우 복잡하고 다양하기 때문이다. 암은 제멋대로 과잉으로 계속 자라며, 사망에서 해방되어 계속 생존하고, 주위조직을 침범하고 원위 장기로 확산(전이)되어서 인간을 사망하게 한다. 면역기전의 공격이나 항암 치료에도 생존하고, 끊임없이 진화하며 생존에 가장 유리한 세포군(클론)이 선택적으로 증식한다. 암세포는 다수의 유전자의 변이에 의해 발생하는 고도의 생존능력을 가진 생존체이다. 하나의 세포가 암세포로 바뀌고, 임상에서 보는 악성의 암 덩어리로 발전해 나가기 위해서는 다수의 유전자에 변이가 일어나야 한다. 따라서 암을 근원적으로 진단하고 치료하기 위해서는 유전자 수준에서 접근할 필요가 있다.

최근, 암의 진단에 유전자검사가 적극적으로 시도되고 있다. 가장 단순한 대표적 방법은 혈액에서 백혈병의 유전자 지표인 ABL:BCR 융합 유전자의 유무를 PCR로 찾는 것이다. 이는 정확도가 95%이상이며, 단순 용이한 검사로 만성골수성 백혈병의 진단과 치료 후 결과 평가, 추적조사 등에 유용하게 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 소수 혈액암의 경우에만 적용이 가능하다.

또한, 암세포가 발현하는 유전자의 존재를 RT-PCR 및 블라팅으로 파악함으로써 혈구세포 중에 함께 존재하는 암세포를 진단하는 방법도 시도되고 있다. 그러나 이 방법은 전립선암과 흑색종 등 일부 암에서만 적용이 가능하며, 가양성(false positive rate)이 많고, 검사 및 판독 방법의 표준화가 어렵고, 그 유용성에도 한계가 있다 (Kopreski, M.S. et al., Clin. Cancer Res., 5:1961, 1999; Miyashiro, I. et al., Clin. Chem., 47:505, 2001).

혈청(serum)이나 혈장(plasma)내 DNA를 사용하는 유전자검사가 최근 활발히 시도되고 있다. 이는 암세포에서 분리되어 혈액으로 나와서 혈청 내에 유리형(free DNA)으로 존재하는 암 관련 유전자를 찾는 방법이다. 실제 암환자에서는 혈청 내 DNA 농도가 정상인의 5~10배로 증가되며, 이렇게 증가된 DNA는 대부분이 암세포에서 유리되는 것으로 밝혀지고 있다. 이들 암에서 유리된 DNA를 가지고 암 유전자(oncogene)와 종양억제 유전자의 돌연변이나 소실, 기능상실 등, 암에 특이한 유전자 이상을 분석하면 암을 진단할 수 있다. 실제 혈청에서 돌연변이형의 K-Ras 암유전자나 p53 종양억제 유전자, p16 유전자의 프로모터 메틸화, 그리고 마이크로세틀라이트(microsatellite)의 표지와 불안정성(instability) 등을 검사하여 폐암과 두경부암, 유방암, 대장암, 간암 등을 진단하는 것이 활발하게 시도되고 있다 (Chen, X.Q. et al., Clin. Cancer Res., 5:2297, 1999; Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedes, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Sozzi, G. et al., Clin. Cancer Res., 5:2689, 1999).

한편, 혈액외의 검체에서도 암의 DNA를 검사할 수 있다. 폐암 환자에서 객담이나 기관지폐포 세척액(bronchoalveolar lavage) 내에 존재하는 암세포 및 암 유전자의 존재를 유전자검사나 항체검사로 찾는 방법이 시도되고 있으며(Palmisano, W.A. et al., Cancer Res., 60:5954, 2000; Sueoka, E. et al., Cancer Res., 59:1404, 1999), 장암에서 대변 내에 존재하는 암 유전자를 찾는 방법 (Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219-27, 2000)과 소변 및 전립선액 내에 존재하는 프로모터 메틸화 이상을 검사하는 방법 (Goessl, C. et al., Cancer Res., 60:5941, 2000)도 시도되고 있다. 하지만, 다수 유전자 이상을 동반하며 개개 암별로 제각기 다양한 변이를 보이는 암을 정확하게 진단하기 위해서는 다수의 유전자를 동시에, 그리고 정확하게 자동분석할 수 있는 방법이 요구되나, 아직 이러한 방법은 정립되어 있지 않다.

암을 정확히 진단하려면 변이유전자를 파악하는 것뿐만 아니라, 그 유전자의 변이가 나타나는 기전을 파악하는 것이 중요하다. 이전에는 유전자의 코딩서열의 돌연변이, 즉 점 돌연변이나 결실, 삽입 등의 미세변화나 거시적인 염색체 이상에 초점을 맞추어 연구해 왔다. 그러나 최근에는 이들 만큼 유전자외 변화가 중요한 것으로 보고되고 있고, 대표적인 것이 프로모터 CpG 섬의 메틸화이다.

포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 5번째 염기가 존재하며, 이는 시토신 환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸기가 붙어서 메틸화되어 있다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈내에 반복되는 염기서열(repetitive sequence)이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다. 이러한 CpG의 5-mC는 자연히 탈아미노화(deamination)되어 T로 바뀌며, 이에 따라 포유류 게놈내 CpG는 정상적으로 나타나야 할 빈도(1/4 x 1/4 = 6.25%)보다 훨씬 낮은 1%의 빈도만을 나타낸다.

CpG 중에 예외적으로 밀집되어 나타나는 것들이 있으며, 이를 CpG 섬이라고 한다. CpG 섬은 길이가 0.2~3kb이고, C 및 G염기의 분포백분율이 50%를 넘으며, CpG의 분포백분율이 3.75%이상으로 높게 집중되어 나타나는 부위를 가리킨다. CpG 섬은 전체 인체 유전체에 약 45,000개가 나타나며, 특히 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에 집중되어 나타난다. 실제로 인체 유전자중 약 절반을 차지하는 중요 유전자(housekeeping genes)의 프로모터에는 CpG 섬이 나타난다 (Cross, S. et al., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995). 이에 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다 (Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000). 이에 본 발명자들은 관련 연구를 통하여 신데칸 2 (Syndecan 2) 유전자가 장암 진단을 위하여 특이적으로 사용될 수 있음을 밝힌 바 있다 (KR 10-1142131 B). 그러나, 이는 위암을 포함한 타암에의 진단 용도를 제시하고 있지 않다. 한편, 폐암, 유방암 등 각종 고형암의 바이오마커로서 적절하지 않아 일반적인 암의 진단을 위한 바이오마커라기 보다는, 장암 특이적 바이오마커로서만 작용함을 확인하였다.

본 발명자들은 조기 진단, 발암 위험 또는 암의 예후 예측 등이 가능한 효과적인 위암 특이적 메틸화 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2)유전자가 폐암조직, 유방암조직, 간암조직, 자궁경부암 조직 그리고 갑상선암 조직 전부에서 특이적으로 메틸화되어 있지 않음과 달리, 위용종 및 위암세포에서 특이적으로 메틸화되어 있으며, 이를 바이오마커로 이용하여 메틸화 정도를 측정함으로써 위용종 및 위암을 조기에 진단할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 주된 목적은 위용종 또는 위암 진단에 효과적으로 사용될 수 있는 위용종 또는 위암에서 특이적으로 메틸화되는 위용종 또는 위암 특이적 메틸화 바이오마커를 제공하고, 이를 이용하여 조기에 위암을 진단하기 위한 정보를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 위용종 또는 위암 특이적 메틸화 마커 유전자인 SDC2 유전자의 메틸화 검출방법 및 이를 이용한 위용종 또는 위암 진단용 키트 및 핵산 칩을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 또한, SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 위용종 또는 위암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 위용종 또는 위암의 검출방법을 제공한다:

(a) 임상샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및

(b) 상기 분리된 DNA에서 위용종 또는 위암 바이오마커인 SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG 섬의 메틸화를 측정하여 위용종 또는 위암을 검출하는 단계.

본 발명은 또한, SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG섬을 함유하는 위용종 또는 위암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG섬을 포함하는 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 위용종 또는 위암 진단용 핵산 칩을 제공한다.

본 발명은 위용종 및 위암 특이적 마커 유전자의 CpG 섬의 메틸화를 검출함으로써, 위암 진단을 위한 정보를 주는 방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 메틸화 검출방법과 진단용 조성물, 키트 및 핵산 칩을 이용하면, 위암을 초기 형질전환단계에서 진단할 수 있어 조기 진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 위암을 진단할 수 있어 유용하다.

도 1은 파이로시퀀싱을 이용하여 SDC2 바이오마커 유전자의 정상 위조직, 저도 위용종 및 고도 위용종에서의 메틸화 정도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2A는 위암세포주에서 파이로시퀀싱을 이용하여 SDC2 바이오마커 유전자의 메틸화 정도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 2B는 정상 위조직과, 위암 및 이와 연접한 정상 위조직에서의 메틸화정도를 파이로시퀀싱을 이용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 2C는 ROC 커브 분석을 통하여 SDC2 바이오마커 유전자의 위암 진단에 대한 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다.
도 3A는 qMSP 방법을 이용하여 정상인 및 위암환자의 혈청 DNA에서의 SDC2 바이오마커 유전자의 메틸화 측정결과를 나타낸 것이고, 3B는 SDC2 바이오마커 유전자의 위암진단 능력을 평가하기 위하여 ROC 커브 분석을 통하여 위암 진단에 대한 민감도 및 특이도를 측정한 결과이다.
도 4는 파이로시퀀싱을 이용하여 SDC2 바이오마커 유전자의 타 고형암인 폐암, 유방암, 간암, 자궁경부암 그리고 갑상선암 환자의 암조직 및 정상조직에서의 메틸화 정도를 측정한 결과이다.
도 5는 위장내시경 확진 정상인 그리고 위용종 환자의 혈청에서 SDC2 메틸화 바이오마커 유전자의 메틸화 정도를 측정하고, ROC 커브를 분석한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 위용종 또는 위암에서 특이적으로 메틸화되어 있는 유전자인 SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG섬을 바이오마커로서 사용하는 것으로서, 이에 본 발명은 일 관점에서 SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG섬의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 함유하는 위용종 또는 위암 진단용 조성물에 관한 것이다:

본 발명에 있어서, 상기 CpG 섬은 SDC2 유전자의 프로모터 부위에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 아울러, 인트론 또는 엑손 부위뿐 아니라, 인헨서 등 이들의 업스트림이나 다운스트림 영역에 존재할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 CpG 섬은 바람직하게는 SDC2 유전자의 프로모터 부위, 5' 비전사 영역 (5' untranslated region), 첫 번째 엑손 및 첫번째 인트론 상에 존재하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 즉, 상기 CpG 섬은 SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 전사개시점을 기준으로 볼 때, -0.5kb ~ + 1.5kb까지의 범위, 즉, 서열번호 1로 표시되는 영역에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 위용종 또는 위암 특이적 메틸화마커 유전자는 위암 스크리닝, 위험성 평가, 예측, 병명 확인, 병의 단계 진단 및 치료 타겟의 선정에도 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 바이오마커 유전자인 SDC2 유전자는 위암의 전암병변인 위용종에서도 높은 수준 및 빈도의 메틸화 양성을 나타내어 위용종의 진단 및 위암의 조기 진단의 바이오마커로서의 유용성이 있음을 확인하였다.

본 발명에서, 상기 CpG 섬의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질은 상기 메틸화된 CpG섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 상기 메틸화된 CpG섬과 혼성화할 수 있는 프로브, 상기 메틸화된 CpG섬과 결합할 수 있는 메틸화 특이적 결합 단백질, 메틸화 특이적 결합 항체, 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스 및 시퀀싱 바이 라이게이션 프라이머로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

위암 및 여러 단계의 이상에서 메틸화되는 유전자를 확인하는 것은 정확하고 효과적으로 위암을 조기 진단할 수 있게 하며, 다중 유전자를 사용한 메틸화 목록 확립 및 치료를 위한 새로운 타겟을 확인할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 메틸화 데이타는 다른 비-메틸화 연관 바이오 마커 검출 방법과 연계하면 더욱 정확한 위암 진단 시스템을 확립할 수 있을 것이다.

본 발명의 상기 방법으로, 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산 바이오 마커의 메틸화 단계를 결정하는 것을 포함하는 여러 단계 또는 기(期)의 위암 진행을 진단할 수 있다. 위암의 각 단계의 검체에서 분리된 핵산의 메틸화 단계를 위 조직의 세포 증식성 이상을 갖지 않는 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계와 비교하여, 검체의 위암의 특정 단계를 확인할 수 있으며, 상기 메틸화 단계는 하이퍼메틸화일 수 있다.

본 발명의 일례로, 핵산은 유전자의 조절 부위에서 메틸화될 수 있다. 다른 예로, 메틸화는 유전자의 조절 부위의 외곽에서부터 시작되어 내부로 진행되기 때문에, 조절 부위의 외곽에서 메틸화를 검출하는 것으로 세포 형질전환에 관여하는 유전자를 조기 진단할 수 있다.

본 발명의 키트의 일예로는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 비메틸화 시토신을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫번째 용기, CpG 함유 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 두번째 용기 및 절단된 또는 절단되지 않은 핵산의 존재를 검출하는 수단이 함유된 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 프라이머는 서열번호 2 내지 3 및 5 내지 6에 기재된 서열, 기능적 조합 및 그 단편을 포함할 수 있다. 기능적 조합 또는 단편은 게놈상에서 메틸화가 일어났는지의 여부를 검출하는 프라이머로 사용된다.

다른 예로, 본 발명에서는 SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 메틸화 상태를 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 검출하는 것에 의하여, 검체에 존재하는 위 조직의 세포 성장성 이상(이형증)을 진단할 수 있다.

이에 본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1로 표시되는 SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자 단편 유래 핵산으로서, 상기 SDC2 유전자 단편 중 적어도 하나의 사이토신 염기를 우라실 또는 혼성화 과정에서 사이토신과 상이한 것으로 검출되는 다른 염기로 변형되도록 처리된, 위용종 또는 위암의 진단용 변형 핵산에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 변형핵산은 서열번호 17의 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또다른 관점에서, 본 발명은 SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 위용종 또는 위암 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 진단용 키트 또는 핵산 칩을 이용하면 검체의 위 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증 진행도)을 결정할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 위 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증)이 없는 검체로부터 분리한 핵산의 메틸화 단계와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 메틸화 유전자 마커를 이용하여 위암을 형성할 가능성이 있는 세포의 조기 진단이 가능하다. 암세포에서 메틸화된다고 확인된 유전자가 임상적으로 또는 형태학적으로 정상으로 보이는 세포에서 메틸화되면, 상기 정상으로 보이는 세포는 암화가 진행되고 있는 것이다. 그러므로, 정상으로 보이는 세포에서의 위암 특이적 유전자가 메틸화를 확인함으로, 위암을 조기 진단할 수 있다.특히 본 발명의 일 실시예에서는, 위암의 전암병변인 위용종의 진단에 이용할 수 있음을 발견한 바 있다.

본 발명은 상기 메틸화 유전자 마커를 이용하여 위암을 형성할 가능성이 있는 세포의 조기 진단이 가능하다. 암세포에서 메틸화된다고 확인된 유전자가 임상적으로 또는 형태학적으로 정상으로 보이는 세포에서 메틸화되면, 상기 정상으로 보이는 세포는 암화가 진행되고 있는 것이다. 그러므로, 정상으로 보이는 세포에서의 위암 특이적 유전자가 메틸화를 확인함으로, 위암을 조기 진단할 수 있다.

본 발명의 메틸화 마커 유전자를 이용하면, 검체에서 위 조직의 세포 성장성 이상(이형증진행)을 검출할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산을 포함하는 시료를 하나 이상의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 하나 이상의 핵산에서 하나 이상의 부위의 메틸화 상태를 확인하는 것을 포함하고, 상기 핵산의 메틸화 상태는 위 조직의 세포 성장성 이상 (이형증 진행)을 가지지 않는 검체의 핵산에서의 동일한 부위의 메틸화 상태와 차이가 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 위암에서 특이적으로 메틸화되는 유전자의 메틸화 빈도를 검토하고, 위암 진행 가능성을 가지는 조직의 메틸화 빈도를 정하는 것에 의하여 조직의 위암으로의 발전 가능성을 평가할 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는, 위용종 또는 위암의 검출방법에 관한 것이다:

(a) 임상샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는 상기 유전자의 프로모터, 5' UTR (untranslated region; 비번역 영역), 인트론 및 엑손 중 어느 한 부위의 CpG섬의 메틸화를 측정하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때, SDC2 유전자 중 서열번호 1의 염기서열을 가지는 영역의 CpG섬의 메틸화를 측정하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 메틸화 측정단계는 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 임상 샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포, 혈액, 혈장, 대변 및 소변으로 구성된 군에서 선택되는 특징으로 할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 일례로 상기 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: (a) DNA를 함유한 임상샘플을 준비하는 단계; (b) 상기 임상샘플로부터 DNA를 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 DNA를 SDC2 유전자의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물의 생성 유무를 근거로 인트론의 메틸화 여부를 결정하는 단계.

다른 예로, 본 발명에서는 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2)유전자의 메틸화 상태를 키트를 이용하여 검출하는 것에 의하여, 검체에 존재하는 위 조직의 세포 성장성 이상(이형증)을 진단할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 위용종 또는 위암 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 PCR 프라이머쌍은 서열번호 2 및 3; 또는 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머쌍인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서 또한, 상기 시퀀싱 프라이머는 서열번호 4 또는 7로 표시되는 것임을 특징으로 할 수 있다.

다른 예로, 본 발명에서는 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 메틸화 상태를 핵산 칩을 이용하여 검출하는 것에 의하여, 검체에 존재하는 위 조직의 세포 성장성 이상(이형증)을 진단할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자 의 CpG섬을 포함하는 단편과 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 위용종 또는 위암 진단용 핵산 칩에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 8 내지 19로 표시되는 염기서열로 구성되는 군에서 선택된 것임을 특징으로 할 수 있으며, 그 구체적인 서열은 다음과 같다.

SDC2

1) 5'-cggagctgcc aatcggcgtg taatcctgta-3' (서열번호 8)

2) 5'-ctgccgtagc tccctttcaa gccagcgaat ttattcctta aaaccagaaa-3' (서열번호 9)

3) 5'-gcacgggaaa ggagtccgcg gaggagcaaa accacagcag agcaagaaga-3' (서열번호 10)

4) 5'-gcagccttcc cggagcacca actccgtgtc gggagtgcag aaaccaacaa gtgagagggc-3' (서열번호 11)

5) 5'-cccgagcccg agtccccgag cctgagccgc aatcgctgcg gtactctgct-3' (서열번호 12)

6) 5'-cttggtggcc tgcgtgtcgg cggagtcggt gagtgggcca-3' (서열번호 13)

변형핵산 서열 프로브(bisulfite 후 변형핵선 검출용 프로브)

1') 5'-cggagttgtt aatcggcgtg taattttgta-3' (서열번호 14)

2') 5'-ttgtcgtagt ttttttttaa gttagcgaat ttatttttta aaattagaaa-3' (서열번호 15)

3') 5'-gtacgggaaa ggagttcgcg gaggagtaaa attatagtag agtaagaaga-3' (서열번호 16)

4') 5'-gtagtttttt cggagtatta atttcgtgtc gggagtgtag aaattaataa gtgagagggt-3' (서열번호 17)

5') 5'-ttcgagttcg agttttcgag tttgagtcgt aatcgttgcg gtattttgtt-3' (서열번호 18)

6') 5'-tttggtggtt tgcgtgtcgg cggagtcggt gagtgggtta-3' (서열번호 19)

본 발명의 진단용 키트 또는 핵산 칩을 이용하면 검체에서 위 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증 진행도)을 결정할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 위 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증)이 없는 검체로부터 분리한 핵산의 메틸화 단계와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 형질전환된 위암 세포를 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 위암을 진단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 정상 표현형을 나타내는 샘플을 이용하여 상기 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 위암으로 진행될 수 있는 가능성을 진단할 수 있다. 상기 샘플은 고체 또는 액체 조직, 세포, 대변, 소변, 혈청 또는 플라즈마를 사용할 수 있다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

본원에서 사용된 "세포 형질전환"은 정상에서 비정상으로, 비-종양성에서 종양성으로, 미분화에서 분화로, 줄기세포에서 비-줄기세포로와 같이 세포의 특징이 한 형태에서 다른 형태로 바뀌는 것을 의미한다. 추가적으로, 상기 형질전환은 세포의 형태, 표현형, 생화학적 성질 등에 의하여 인식될 수 있다.

본원에서 암의 "조기 확인"은 전이되기 전에 암의 가능성을 발견하는 것으로, 바람직하게는 검체 조직 또는 세포에서 형태학적 변화가 관찰되기 전에 발견하는 것이다. 추가적으로, 세포 형질전환의 "조기 확인"은 세포가 형질전환되는 형태가 되기 전에 초기 단계에서 형질전환이 일어날 가능성 높은 것을 말한다.

본원에서 "하이퍼메틸화"는 CpG 섬의 메틸화를 의미한다.

본원에서, "샘플" 또는 "검체 샘플"은 수행되는 분석의 종류에 따라, 개개인, 체액, 세포주, 조직 배양 등에서 얻어지는 모든 생물학적 체액, 포함하는 폭넓은 범위의 체액을 의미하는 것이다. 포유동물로부터 체액 및 조직 생검을 획득하는 방법은 통상적으로 널리 알려져 있다. 바람직한 소스는 장의 생검(biopsy)이다.

위암에 대한 바이오 마커-정상세포와의 비교를 위한 암세포의 용도

본 실시예에서, "정상" 세포는 비정상적 세포 형태 또는 세포학적 성질의 변화를 나타내지 않은 세포를 의미한다. "종양"세포는 암 세포를 의미하고, "비종양" 세포는 병증 조직의 일부이지만, 종양 부위는 아니라고 판단되는 세포를 의미한다.

본 발명은 일 관점에서, 위암과 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 하이퍼메틸화 사이의 관련성의 발견에 기반을 둔 것이다.

본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체에서 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계를 결정하여 검체의 위 조직의 세포 성장성 이상을 조기 진단할 수 있다. 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 위 조직의 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다. 핵산은 CpG 섬과 같은 CpG-함유 핵산인 것이 바람직하다.

본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화를 결정하는 것을 포함하는 검체의 위 조직의 세포 성장성 이상 소양을 진단할 수 있다. 상기 핵산은 SDC2 (NM_002998, 신데칸 2, Syndecan 2)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 핵산의 메틸화 단계는 위 조직의 세포 성장성 이상에 대한 소양을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 "소양"은 상기 세포 성장성 이상에 걸리기 쉬운 성질을 의미한다. 소양을 가진 검체는 아직은 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않지만, 세포 성장성 이상이 존재하거나 존재할 경향이 증가된 검체를 말한다.

본 발명은 다른 관점에서, 검체의 핵산을 포함하는 시료를 시료의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키고, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 확인하는 것을 포함하는 검체의 위 조직의 세포 성장성 이상을 진단하는 방법을 제공한다. 여기서, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화는 세포 성장성 이상을 가지지 않는 검체의 동일한 핵산의 동일한 부위의 메틸화 단계와 다른 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 방법은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 결정하는 단계를 포함한다. 여기서, "핵산" 또는 "핵산 서열"이란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 의미하거나 이들의 단편, 단일가닥 또는 이중가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 센스 또는 안티센스 가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, PNA(peptide nucleic acid) 또는 자연 기원 또는 합성 기원의 DNA 양 또는 RNA 양 물질을 말한다. 핵산이 RNA이면, 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T를 대신하여, 각각 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U로 대체된다는 것은 당해 분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명하다.

서로 다르게 메틸화된 CpG 섬의 존재를 검출할 수 있는 핵산이라면 어떤 것이든 사용할 수 있다. 상기 CpG 섬은 핵산 서열에서 CpG가 풍부한 부위이다.

메틸화(methylation)

본 발명에서의 정제되거나 정제되지 않은 형태의 어떠한 핵산도 사용될 수 있으며, 타겟 부위(예를 들면, CpG-함유 핵산)를 함유하는 핵산 서열을 함유하고 있거나 함유할 것으로 의심되는 어떠한 핵산도 사용될 수 있다. 차별적으로 메틸화될 수 있는 핵산 부위가 CpG 섬이고, 이는 다른 디뉴클레오티드 CpG 핵산 부위와 비교하여 높은 CpG 밀도를 가지는 핵산 서열이다. 이중(doublet) CpG는 G*C 염기쌍의 비율로 예측하였을 때, 척추동물 DNA에서 단 20% 정도의 확률로 나타난다. 특정 부위에서, 이중 CpG의 밀도는 게놈의 다른 부위와 비교하여 10배나 더 높다. CpG 섬은 평균 G*C 비율이 약 60%로, 보통의 DNA의 G*C 비율은 평균 40%를 나타낸다. CpG 섬은 전형적으로 약 1~2kb 길이를 가지고, 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 존재한다.

여러 유전자에서, CpG 섬은 프로모터의 업스트림(upstream)에서 시작하여, 다운스트림의 전사 부위까지 확장된다. 프로모터에서 CpG 섬의 메틸화는 보통 유전자의 발현을 억제시킨다. CpG 섬은 또한 유전자 코딩 부위의 3' 부위뿐만 아니라, 유전자 코딩 부위의 5' 부위를 둘러싸고 있을 수 있다. 그러므로, CpG 섬은 프로모터 부위를 포함하는 조절 부위의 코딩 서열 업스트림, 코딩 부위(예를 들어, 엑손영역), 코딩 부위의 다운스트림, 예를 들면, 인헨서 부위 및 인트론을 포함하는 여러 부위에서 발견된다.

통상적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이다. 그러나, 본 발명의 방법은 예를 들면, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 적용할 수 있으며, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유한 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.

핵산 혼합물 또한 사용할 수 있다. 검출될 특이적인 핵산 서열은 큰 분자의 분획일 수 있고, 처음부터 특이 서열이 전체 핵산 서열을 구성하는 분리된 분자 형태로 존재할 수 있다. 상기 핵산 서열은 순수한 형태로 존재하는 핵산일 필요는 없으며, 핵산은 전체 인간 DNA가 포함되어 있는 것과 같이 복잡한 혼합물 내의 적은 분획일 수도 있다. 시료에 포함된 핵산의 메틸화 정도를 측정하는 데 사용되거나, 메틸화된 CpG 섬을 검출하는 데 사용되는 시료에 포함된 핵산은 Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989)에 기재된 여러 가지 방법으로 추출될 수 있다.

검체로부터 분리된 핵산은 검체의 생물학적 시료에 의하여 얻어진다. 위암이나 위암의 진행 단계를 진단하고 싶다면, 스크랩이나 생검으로 위 조직에서 핵산을 분리하여야 한다. 이러한 시료는 당해 분야에서 알려진 여러 의학적 과정에 의하여 얻어질 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 검체로부터 얻어진 샘플의 핵산의 메틸화 정도는 위 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체의 동일한 핵산 부분과 비교하여 측정한다. 하이퍼메틸화는 하나 이상의 핵산에서 메틸화된 대립유전자가 존재하는 것을 말한다. 위 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체는 동일한 핵산을 검사했을 때, 메틸화 대립유전자가 나타나지 않는다.

개별 유전자 및 패널

본 발명은 진단 또는 예측 마커로서 각 유전자를 개별적으로 사용하거나, 몇몇 마커 유전자를 조합하여 패널 디스플레이 형태로 하여 사용할 수 있고, 몇몇의 마커 유전자는 전체적인 패턴 또는 메틸화된 유전자의 목록을 통하여 신뢰성 및 효율성을 향상시키는 것을 확인할 수 있다. 본 발명에서 확인된 유전자는 개별적으로, 또는 본 실시예에서 언급된 유전자가 조합된 유전자 세트로 사용될 수 있다. 또는, 유전자들은 함께 메틸화된 유전자의 수 및 그 중요도에 따라 순위를 매길 수 있고, 가중치를 둘 수 있으며, 암으로 발전할 가능성의 수준을 선정할 수 있다. 이러한 알고리즘은 본 발명에 속한다.

메틸화 검출 방법

메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR)

지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변형된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 이때 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 변형시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메틸화인 경우에는 비메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메틸화 여부는 아가로즈겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.

실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR)

실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TanMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 Sybergreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서, 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro methylated DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석하였다.

파이로시퀀싱

파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 시퀀싱 방법을 정량적인 실시간 시퀀싱으로 변환한 방법이다. 바이설파이트 시퀀싱과 마찬가지로 지노믹 DNA를 바이설파이트를 처리하여 전환시킨 다음, 5'-CpG-3' 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 상기 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 시퀀싱 프라이머를 이용하여 실시간 염기서열 분석을 수행하였다. 5'-CpG-3' 부위에서 시토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메틸화 정도를 메틸화 지수로 나타내었다.

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하였다. 이들 분리된 DNA를 인트론 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정하였다.

또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다. 여기서 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질은 MBD2bt에 제한되지 않는다.

차별적 메틸화의 검출-메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제

차별적 메틸화의 검출은 메틸화되지 않은 CpG 부위만을 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 핵산 샘플을 접촉시켜 비메틸화된 핵산을 절단하는 것으로 수행할 수 있다.

별도의 반응으로, 상기 샘플을 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머(isochizomer)와 접촉시켜, 메틸화된 핵산을 절단하였다.

특이적 프라이머를 핵산 샘플에 첨가하고, 통상의 방법으로 핵산을 증폭시켰다. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않으면, 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어난 것이다. 그러나, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서도 증폭 산물이 존재하지 않는다는 것은 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어나지 않은 것이다.

여기서, "메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제"는 인식 부위에 CG를 포함하고, C가 메틸화되지 않았을 때와 비교하여 C가 메틸화되었을 때 활성을 가지는 제한효소이다 (예를 들면, SmaI). 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 비제한적 예로써, MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI이 포함된다. 상기 효소들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 다른 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레오티드로는 예를 들어, SacII 및 EagI를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머는 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 동일한 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제이지만, 메틸화된 CGs와 비메틸화된 CGs를 모두 절단하며, 예를 들면, MspI를 들 수 있다.

본 발명의 프라이머는 증폭될 로커스의 각 가닥과 "대체적으로" 상보성을 가지도록 제작되고, 상기에서 설명한 바와 같이, 적당한 G 또는 C 뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션 되기에 충분한 상보성을 가지는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 증폭 과정에 사용되며, 상기 증폭 과정은 예를 들면, PCR과 같은, 타겟 로커스가 많은 반응 단계를 거치면서 기하급수적인 숫자로 증가하는 효소 연속 반응이다. 전형적으로, 한 프라이머(안티센스 프라이머)는 로커스의 네가티브(-) 가닥에 대하여 상동성을 가지고, 나머지 하나의 프라이머(센스 프라이머)는 포지티브(+) 가닥에 대하여 상동성을 가진다. 변성된 핵산에 프라이머가 어닐링되면, DNA 폴리머라아제 I(Klenow) 및 뉴클레오티드와 같은 효소 및 반응물들에 의하여 사슬이 신장되고, 그 결과, 타겟 로커스 서열을 함유하는 + 와 - 가닥이 새롭게 합성된다. 상기 새로이 합성된 타겟 로커스가 주형으로도 사용되어 변성, 프라이머 어닐링 및 사슬 신장의 사이클이 반복되면 타겟 로커스 서열의 기하급수적인 합성이 진행된다. 상기 연속 반응의 산물은 반응에 사용된 특이 프라이머의 말단과 대응하는 말단을 가지는 독립적인 이중가닥 핵산이다.

상기 증폭 반응은 당해 분야에서 보편적으로 사용되고 있는 PCR인 것이 바람직하다. 그러나, 리얼타임 PCR 또는 등온 효소를 사용한 선형증폭과 같은 대체적인 방법도 사용할 수 있으며, 멀티플렉스 증폭 반응 역시 사용할 수 있다.

바이설파이트 시퀀싱 방법

메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 메틸화-비의존적 (Methylation independent) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하지 않고 핵산을 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭된 산물을 시퀀싱 프라이머를 이용하여 Sanger 방법으로 시퀀싱하거나 차세대 시퀀싱 (next generation sequencing) 방법으로 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트 (bisulfite) 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다. 여기서 차세대 시퀀싱 방법은 Sequencing by synthesis와 Sequencing by ligation 방법으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 방법의 특징은 bacterial clone을 만드는 대신 단일 DNA 단편을 공간적으로 분리하여 in situ로 증폭하고 (clonal amplification), 시퀀싱을 해낸다는 것이다. 이때, 수십 만개의 단편을 동시에 읽어내기 때문에 매시브 페러럴 시퀀싱(massively parallel sequencing) 방법으로 불리기도 한다.

기본적으로는 시퀀싱 바이 신세시스(sequencing by synthesis) 방법이며, 모노 혹은 디뉴클레오티드를 순차적으로 붙여가면서 시그널을 얻는 방법을 사용하는데 파이로시퀀싱, ion torrent, Solexa 방법들이 여기에 해당한다.

시퀀싱 바이 신세시스에 기반하는 NGS 장비로는 로슈(Roche)사의 454 플랫폼, 일루미나(Illumina)사의 HiSeq 플랫폼, 라이프테크놀로지(Life Technology)사의 Ion PGM 플랫폼, 마지막으로 퍼시픽바이오사이언스(Pacific BioSciences)상의 PacBio 플랫폼이 있다. 454와 Ion PGM은 클로날증폭(clonal amplification)방법으로 emersion PCR을 사용하며, HiSeq은 브릿지 증폭(Bridge amplification)을 사용한다. 시퀀싱 바이 신세시스 방법은 한 개의 뉴클레오티드를 순차적으로 붙여가며 DNA를 합성시켜 나갈 때 발생되는 인산(phosphate), 수소이온, 혹은 미리 붙여 놓은 형광을 검출하여 서열을 읽어 나간다. 서열을 검출하는 방법에 있어, 454는 인산을 이용하는 파이로시퀀싱(pyroseqeuncing) 방법을 사용하며, Ion PGM은 수소이온 검출을 이용한다. HiSeq과 PacBio는 형광을 검출하여 서열을 해독한다.

시퀀싱 바이 라이게이션(Sequencing by ligation)은 DNA ligase를 이용하는 시퀀싱 기술로 DNA 염기서열에 존재하는 특정위치의 뉴클레오티드를 확인하는 기술이다. 대부분의 시퀀싱 기술이 중합효소를 사용하는 것과 달리 중합효소를 사용하지 않으며 DNA ligase가 미스매치 서열을 ligation하지 않는 특징을 이용한다. SOLiD 시스템이 여기에 해당한다. 이 기법에서는 간격을 두면서 두 개씩 염기를 읽는데, 프라이머 리셋(primer reset)을 통해 독립적으로 다섯 번을 반복하기 때문에, 최종적으로는 각 염기를 두 번씩 중복하여 읽어서 정확도를 높인다.

시퀀싱 바이 라이게이션(Sequencing by ligation)의 경우, 16개 조합으로 만들어진 디뉴클레오티드 프라이머 셋트 중, 해당 염기서열에 대응되는 디뉴클레오티드 프라이머가 순차적으로 라이게이션되며, 이 라이게이션들의 조합을 최종적으로 분석하여 해당 DNA의 염기서열이 완성된다.

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질 또는 항체를 이용한 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스또는 시퀀싱 바이 라이게이션

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질 또는 항체를 이용한 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질 또는 항체를 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질 또는 항체가 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하였다. 이들 분리된 DNA를 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, Sanger 방법, 시퀀싱 바이 신세시스또는 시퀀싱 바이 라이게이션 방법으로 메틸화 여부를 측정하였다.

여기서 차세대 시퀀싱 방법은 Sequencing by synthesis 또는 Sequencing by ligation 방법으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질은 MBD2bt에 제한되지 않으며, 항체는 5'-methyl-cytosine 항체에 제한되지않는다.

키트(Kit)

본 발명에 의하면, 검체의 세포 성장성 이상을 검출하는 데 유용한 키트를 제공하고 있다. 본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 샘플을 파이로시퀀싱하기 위한 5'-CpG-3' 염기서열 부위를 증폭할 수 있는 PCR 프라이머쌍을 함유하는 두번째 용기, 및 증폭된 PCR 산물을 파이로시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다.

캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.

기질

타겟 핵산 부위가 증폭되면 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 상기 핵산 증폭 산물은 고체 지지체(기질)에 고정된 알려진 유전자 프로브와 하이브리다이제이션될 수 있다.

여기서, "기질"은 물질, 구조, 표면 또는 재료, 비생물학적이고, 합성되고, 무생물, 평면, 구형 또는 특이적 결합, 평편한 표면의 물질을 포함하는 혼합물 수단으로, 하이브리다이제이션 또는 효소 인식 부위 또는 대다수의 다른 인식 부위 또는 표면, 구조 또는 재료로 구성된 수많은 다른 분자 종을 넘어서는 수많은 다른 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 기질은 예를 들면, 반도체, (유기)합성 메탈, 합성 반도체, 인슐레이터 및 도판트; 금속, 합금, 원소, 화합물 및 미네랄; 합성되고, 분해되며, 에칭되고, 리소그라프되며, 프린트되고 마이크로패브리케이트된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적, 폴리머, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속 및 세라믹; 나무, 종이, 카드보드, 면, 울, 천, 직조 및 비직조 섬유, 재료 및 패브릭일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 형태의 멤브레인은 당해 분야에서 핵산 서열에 대하여 부착력을 가진다고 알려져 있다. 이러한 멤브레인의 특이적이고 비제한적인 예로 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐클로라이드, 디아조티즈드(diazotized) 페이퍼 및 GENESCREEN^TM, ZETAPROBE^TM(Biorad) 및 NYTRAN^TM 등의 상업적으로 사용되는 멤브레인과 같이 유전자 발현 검출용 멤브레인을 들 수 있다. 비드, 글래스, 웨이퍼 및 금속 기질도 포함된다. 이러한 목적물에 핵산을 부착시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 이와 다르게, 액체 상에서도 스크리닝을 수행할 수 있다.

하이브리다이제이션 조건

핵산 하이브리다이제이션 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 하이브리다이즈되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 하이브리다이제이션되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 하이브리다이제이션 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.

매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(하이브리다이제이션 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 하이브리다이제이션 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 하이브리다이제이션에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.

표지(Label)

중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

위용종 환자 조직에서의 SDC2 바이오마커 유전자의 메틸화 측정

SDC2 바이오마커 유전자의 전암 병변인 위용종에 대한 조기진단 유용성을 평가하기 위하여 정상 위조직 (Biochain사, 5예)과 위용종 환자의 파라핀 조직 (충남대병원 인체자원은행 제공; 저도 위용종 10예, 고도 위용종 10예)으로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 파라핀 조직으로부터 게놈 DNA의 분리는 QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다.

메틸화 측정은 정량적 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 측정하였다. 분리된 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게 된다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하였다. 상기 SDC2 유전자에 대한 파이로시퀀싱을 수행하기 위한 바이썰파이트-PCR 및 시퀀싱 프라이머는 PSQ assay design 프로그램 (Qiagen, Germany)을 이용하여 설계하였다. 각 유전자의 메틸화 측정을 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 하기 표 1과 같다.

바이설파이트-PCR 및 파이로시퀀싱용 프라이머

유전자	프라이머	서열 (5'-> 3')^a	서열번호	CpG 위치^b	앰플리콘 크기(bp)
SDC2	순방향	GGGAGTGTYGAAATTAATAAGTG	2	+460, +466, +473, +479	149
	역방향	Biotin-ACCAAAACAAAACRAAACCTCCTACCCA	3
	시퀀싱	AGGAGGAGGAAGYGAG	4

^aY = C 또는 T, R=A 또는 G

^b전사 개시점(+1)로부터의 거리 (nucleotide): 메틸화 측정에 사용된 CpG 부위의 게놈 DNA 상의 위치

상기의 바이파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액 (바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer(Enzynomics, Korea) 5㎕, Taq polymerase(Enzynomics, Korea) 5units, 2.5mM dNTP (Solgent, Korea) 4㎕, PCR 프라이머 2㎕ (5 pmole/㎕)을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.

상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold 시약 (Qiagen, Germany)을 처리한 후, PSQ96MA 시스템 (Qiagen, Germany)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 파이로시퀀싱을 수행하였다. 상기 파이로시퀀싱 후, 메틸화 지수 (methylation index)를 계산함으로써 메틸화 정도를 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 정상 위조직에서는 전혀 메틸화 되어 있지 않고, 저도 위용종에서는 90.0% (9/10), 그리고 고도 위용종에서는 100% (10/10)의 메틸화 양성을 나타내었다.

이러한 결과는 SDC2 바이오마커 유전자는 위암의 전암병변인 위용종에서도 높은 수준 및 빈도의 메틸화 양성을 나타내어 위용종의 진단 및 위암 조기진단 바이오마커로서의 유용성이 있음을 보여주는 결과이다.

위암 세포주 및 위암 조직에서의 바이오마커 유전자의 메틸화 측정

위용종에서 메틸화가 확인된 SDC2 바이오마커 유전자가 위암 진단용 바이오마커로서도 유용성이 있는지 확인하기 위하여 실시예 1과 동일한 방법으로 파이로시퀀싱을 수행하였다.

위암 세포주인 AGS (한국세포주은행 (KCLB No. 21739), 그리고 41명의 위암환자의 암조직 및 이와 연접한 정상조직 (충남대병원 인체자원은행 제공)으로부터 QIAamp DNA mini Kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit (Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게 된다. 상기 바이썰파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 수행하였다.

상기 SDC2 바이오마커 유전자의 위암 세포주에서의 메틸화 정도를 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 정량적으로 측정한 결과, 도 2A에서 나타난 바와 같이, 위암 세포주인 AGS에서 높은 수준으로 메틸화되어 있는 것을 확인하였다. 따라서 SDC2 유전자는 위암 세포주에서 높은 메틸화 수준을 나타냄으로써, 위암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 가질 가능성을 보여주었다.

이에 이를 검증하기 위하여, 다음과 같이 추가적으로, 위암 조직시료를 이용한 메틸화 검증 실험을 진행하였다.

위암 조직에서의 메틸화 검증을 위하여 각 병기에 따른 위암 조직 (병기 1: 13명, 병기 2: 9명, 병기 3: 11명, 병기 4: 8명)을 대상으로 메틸화 정도를 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이, 환자가 아닌 정상인의 위조직과 위암과 연접한 정상 위조직에 비하여 위암조직에서 매우 높은 수준으로 메틸화가 되어 있음을 확인하였다.

또한 위암 진단에 대한 민감도 및 특이도를 평가하기 위하여 ROC 커브 분석을 수행한 결과, 민감도는 90.2% 그리고 특이도는 100%로 매우 우수하였다 (도 2C). 이러한 결과는 SDC2 메틸화 바이오마커 유전자는 위암 진단용도로서의 유용성을 가지고 있음을 보여준다.

위암환자 혈청에서의 SDC2 바이오마커 유전자의 메틸화 측정

SDC2 바이오마커 유전자의 혈청을 이용한 위암 진단용 바이오마커로서의 유용성을 확인하기 위하여, 위암환자 혈청에서의 메틸화 여부를 정량적 메틸화 특이적 실시간 PCR (quantitative methylation-specific real time PCR; qMSP) 방법을 사용하였다.

이를 위하여 바이썰파이트로 전환된 메틸화된 SDC2 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 두 개의 PCR 프라이머 (IDT사, 미국)와 형광프로브 (IDT사 미국)를 설계하였다. 또한 바이썰파이트로 전환된 혈청 DNA의 양과 질을 확인하기 위하여 ACTB 유전자를 internal control로 사용하였다. qMSP에 사용한 PCR 프라이머 및 형광프로브의 서열은 하기 표 2에 기술하였다.

qMSP용 프라이머 및 형광프로브 서열

유전자	서열 (5'-> 3')	서열번호	증폭산물 크기 (bp)
SDC2	순방향: TAGAAATTAATAAGTGAGAGGGCGT	5	121
	역방향: GACTCAAACTCGAAAACTCGAA	6
	형광프로브: FAM-AGTAGGCGTAGGAGGAGGAAGCGA -Iowa Black	7
ACTB	순방향: TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT	20	136
	역방향: AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA	21
	형광프로브: TET-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA -Iowa Black	22

혈청으로부터 게놈 DNA의 분리는 800 ㎕의 serum을 이용하여 DynalBeads SILANE viral NA kit (Invitrogen)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다. 상기 분리된 게놈 DNA에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 20㎕로 용출하여 qMSP에 사용하였다. 상기 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 1/3부피를 qMSP 실험에 사용하였다. 실시간 PCR은 Rotor Gene Probe Kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 Rotor Gene-Q Real Time PCR 장비 (Qiagen, Germany)를 이용하여 수행하였다. 실시간 PCR은 최종 부피 20㎕로 다음과 같다: SDC2: 95℃ 10분, 95℃ 10초, 62℃ 1초, 72℃ 20초; 50 cycles, ACTB: 95℃ 10분, 95℃ 10초, 58℃ 60초; 50 cycles. 메틸화 수준은 상대증폭계수 (Comparative Ct) 방법으로 Percentage of Methylated Reference (PMR) 값으로 측정하였으며, 인위적으로 메틸화 시킨 위암 세포주 AGS (한국세포주은행 (KCLB No. 21739)) 게놈 DNA를 기준점으로 사용하였다. PMR을 계산하는 공식은 다음과 같다: PMR = 2^-△△CtX100; △△Ct=[(C_t _SDC2 -C_t _ACTB )_sample]-[(C_t _SDC2 -C_t _ACTB )_AGS].

SDC2 바이오마커 유전자의 혈청에서의 위암 진단에 대한 능력을 평가하기 위하여 130명의 정상인 혈청, 그리고 40명의 위암 환자 혈청 DNA를 대상으로 qMSP를 수행하였다.

그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, 정상인 혈청에서는 거의 메틸화가 되어 있지 않고 위암환자의 혈청에서 높은 수준 및 빈도로 메틸화 되어 있는 것을 확인하였다. 특히 조기 위암인 병기 1기와 2기에서도 높은 메틸화 수준 및 빈도를 나타내는 것을 확인하였다.

SDC2 바이오마커 유전자의 위암진단에 대한 민감도 및 특이도를 측정하기 위하여 MedCalc 프로그램 (MEDCALC, 벨기에)을 이용한 ROC 커브 (Receiver Operating Characteristic) 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, SDC2 유전자는 민감도 및 특이도가 각각 80.0% 및 96.9%를 나타내어 위암 진단에 대한 능력이 매우 우수함을 확인할 수 있었다. 특히 조기 위암이나 진행형 위암에 대한 민감도가 공히 80.0%로 위암 조기진단에 대한 유용성을 확인하였다.

타 고형암 조직에서의 SDC2 바이오마커 유전자의 메틸화 측정

SDC2 바이오마커 유전자가 위용종 및 위암 특이적 진단용 마커로서의 특이적인 용도를 가지는지 확인하기 위하여, 다른 암종에 대한 실험을 수행하였다. SDC2 바이오마커 유전자가 위용종 또는 위암 진단용 마커로서의 용도를 가지려면, 환자가 아닌 정상인의 다양한 장기 유래 조직과 타고형암 조직에서는 메틸화가 되어 있지 않아야 한다.

따라서, 이를 증명하기 위하여, 환자가 아닌 정상인의 다양한 장기조직 (Biochain사), 다양한 고형암 조직 그리고 이와 연접한 정상조직 (충남대병원 인체자원은행으로부터 분양 받음)으로부터 QIAamp DNA Mini kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 분리된 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 다음, 멸균 증류수 20㎕로 용출하여 파이로시퀀싱에 사용하였다.

상기 바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 게놈 DNA 20ng, 10X PCR buffer 5 (Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5 units (Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕ (Solgent, Korea), PCR 프라이머 2㎕ (5 pmole/㎕))을 95℃에서 5분 동안 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 실시한 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로오스젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.

상기 증폭된 PCR 산물에 PyroGold 시약 (Qiagen, Germany)을 처리한 후, PSQ96MA 시스템 (Qiagen, Germany)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 파이로시퀀싱 후, 메틸화 정도는 메틸화 지수 (methylation index)를 계산함으로써 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 폐암조직, 유방암조직, 간암조직, 자궁경부암 조직 그리고 갑상선암 조직 전부에서 10% 이하로 메틸화가 되어 있지 않음을 확인하였다. 따라서 SDC2 바이오마커 유전자는 위암조직에서만 특이적으로 메틸화 되어 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 SDC2 바이오마커 유전자가 장암 진단 뿐만 아니라 위암 특이적 진단용 바이오마커로서의 용도가 있음을 보여주는 결과이다.

위용종환자 혈청에서의 SDC2 바이오마커 유전자의 메틸화 측정

SDC2 바이오마커 유전자의 혈청을 이용한 위용종 진단용 바이오마커로서의 유용성을 확인하기 위하여, 위용종환자 혈청에서의 메틸화 여부를 정량적 메틸화 특이적 실시간 PCR (quantitative methylation-specific real time PCR; qMSP) 방법을 사용하였다. qMSP 실험은 실시예 3에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

SDC2 바이오마커 유전자의 혈청에서의 위용종 진단에 대한 능력을 평가하기 위하여 12명의 위내시경 확진 정상인 혈청, 5명의 과형성용종 환자 그리고 16명의 선종성 용종 환자 혈청 DNA를 대상으로 qMSP를 수행하였다. 메틸화 정도는 SDC2 유전자의 증폭계수 (cycle threshold; Ct)로 나타내었으며, 메틸화가 전혀 검출되지 않아 Ct 값이 형성되지 않은 경우는 Ct 값을 40으로 표기하였다.

그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, 12명의 정상인 혈청에서는 전혀 메틸화가 되어 있지 않고 위용종 환자의 혈청에서 높은 수준 및 빈도로 메틸화 되어 있는 것을 확인하였다.

SDC2 바이오마커 유전자의 위용종 진단에 대한 민감도 및 특이도를 측정하기 위하여 MedCalc 프로그램 (MEDCALC, 벨기에)을 이용한 ROC 커브 (Receiver Operating Characteristic) 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 5B에 나타난 바와 같이, SDC2 유전자는 전체 용종환자에 대한 민감도 및 특이도가 각각 61.9% (13/21)및 100%를 나타내어 위용종 진단에 대한 능력이 매우 우수함을 확인할 수 있었다. 과형성용종에 대한 민감도는 40% (2/5) 그리고 선종성 용종에 대한 민감도는 68.8% (11/16)로 나타났다. 따라서 SDC2 유전자는 혈액을 이용한 위용종 진단에 대한 유용성도 높은 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> GENOMICTREE, INC. <120> Method for Detecting Gastric Polyp and Gastric Cancer Using Gastric Polyp and Gastric Cancer Specific Methylation Marker Gene <130> P12-B235 <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2000 <212> DNA <213> Promoter, 5' untranslated region and 1st intron of SDC2 gene <400> 1 ttgggggtgc ggaaggattt gggagaatgg gaaacactct cactatatat ttattacatt 60 aattatcttc tcttttaaaa tgcaattttc atgaactggc gatttatgaa cacttcacat 120 tgcttgaaag catcttacac tttttttttc cctcaactca caaagcagtt tctttctact 180 ggtcgaattc tcaaggcaga aaagctacat acgtctctcg tttcttcact aattgttctc 240 tagaaaaggg aaagtgaaga agggaaagag aaaagacaac ggggaagaaa agagcataga 300 ggagagagga aaagtgggga gagaaaggaa gaaaaggact gagaaaacgc aggagccctg 360 gcttgccggt gagcagagcc ggcgcagcca cagcgcggag ccgcggcgcc cactggtcct 420 cggagctgcc aatcggcgtg taatcctgta ggaatttctc ccgggtttat ctgggagtca 480 cactgccgcc tcctctcccc agtcgcccag gggagcccgg agaagcaggc tcaggaggga 540 gggagccaga ggaaaagaag aggaggagaa ggaggaggac ccggggaggg aggcgcggcg 600 cgggaggagg aggggcgcag ccgcggagcc agtggccccg cttggacgcg ctgctctcca 660 gatacccccg gagctccagc cgcgcggatc gcgcgctccc gccgctctgc ccctaaactt 720 ctgccgtagc tccctttcaa gccagcgaat ttattcctta aaaccagaaa ctgaacctcg 780 gcacgggaaa ggagtccgcg gaggagcaaa accacagcag agcaagaaga gcttcagaga 840 gcagccttcc cggagcacca actccgtgtc gggagtgcag aaaccaacaa gtgagagggc 900 gccgcgttcc cggggcgcag ctgcgggcgg cgggagcagg cgcaggagga ggaagcgagc 960 gcccccgagc cccgagcccg agtccccgag cctgagccgc aatcgctgcg gtactctgct 1020 ccggattcgt gtgcgcgggc tgcgccgagc gctgggcagg aggcttcgtt ttgccctggt 1080 tgcaagcagc ggctgggagc agccggtccc tggggaatat gcggcgcgcg tggatcctgc 1140 tcaccttggg cttggtggcc tgcgtgtcgg cggagtcggt gagtgggcca ggcggaggat 1200 gcgcgcgccg tttagggtgt ttgaagctac gagaggagcc cgcagggaat aggggagcgc 1260 cacctgggga acccccagtc cccaagtata caccggagat ccgctgggac aaatgcgctc 1320 gtccggtcac cctttccccc tcttcccttc ctcagaaaag cgctgctcgc tggcgttacc 1380 ccgcggtccg cgggaatggg ggcaccgaga attgcggttt ggtctagccg cagaggcccc 1440 tgaagtcact cccaacttct tcgccctcgg cgggtcttgc tgcgtggtct gggaaggacg 1500 gaggggaaag ggtggcagga ggggggagcc tgggtcgggc ccgcgaggga acggctccac 1560 tccgcgcgct cctcgagacc agggatgacc tggaaacttc ggggtccctt cctccgcaca 1620 ccatcccccc cgcgccagct ttcctgtttg actgcatgca agttctgggg agatgggggc 1680 cagatttaag agacccgcga gtgtccagag agaaaagttt gcaaaagttc ttttgtttga 1740 tgctccctgc ggctagggcg aggtaaccga cactacgtgg aatcgcagta ggcgatccct 1800 caaggggata ctgggggagg cacggaacgc gtccgaaaat gctgggacgc cggccactgg 1860 attcccagtc ctgcggcgac cccctcctcg ttgaggggtg gaggttgcac cgcggggcgt 1920 cagggacggg aggacatttt cataggagtt acacgggagt gccgcaagca gggcgaggcg 1980 gggtacgtgt gacacggcgc 2000 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of SDC2 gene <400> 2 gggagtgtyg aaattaataa gtg 23 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of SDC2 gene <400> 3 accaaaacaa aacraaacct cctaccca 28 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequencing primer of SDC2 gene <400> 4 aggaggagga agygag 16 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of SDC2 gene <400> 5 tagaaattaa taagtgagag ggcgt 25 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of SDC2 gene <400> 6 gactcaaact cgaaaactcg aa 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flourescene probe of SDC2 gene <400> 7 agtaggcgta ggaggaggaa gcga 24 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SDC2 gene <400> 8 cggagctgcc aatcggcgtg taatcctgta 30 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SDC2 gene <400> 9 ctgccgtagc tccctttcaa gccagcgaat ttattcctta aaaccagaaa 50 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SDC2 gene <400> 10 gcacgggaaa ggagtccgcg gaggagcaaa accacagcag agcaagaaga 50 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SDC2 gene <400> 11 gcagccttcc cggagcacca actccgtgtc gggagtgcag aaaccaacaa gtgagagggc 60 60 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SDC2 gene <400> 12 cccgagcccg agtccccgag cctgagccgc aatcgctgcg gtactctgct 50 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for SDC2 gene <400> 13 cttggtggcc tgcgtgtcgg cggagtcggt gagtgggcca 40 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 14 cggagttgtt aatcggcgtg taattttgta 30 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 15 ttgtcgtagt ttttttttaa gttagcgaat ttatttttta aaattagaaa 50 <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 16 gtacgggaaa ggagttcgcg gaggagtaaa attatagtag agtaagaaga 50 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 17 gtagtttttt cggagtatta atttcgtgtc gggagtgtag aaattaataa gtgagagggt 60 60 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 18 ttcgagttcg agttttcgag tttgagtcgt aatcgttgcg gtattttgtt 50 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 19 tttggtggtt tgcgtgtcgg cggagtcggt gagtgggtta 40 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of ACTB gene <400> 20 tggtgatgga ggaggtttag taagt 25 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer of ACTB gene <400> 21 aaccaataaa acctactcct cccttaa 27 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fluorescence probe of ACTB gene <400> 22 accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30 <210> 23 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bisulfite treated promoter, 5' untranslated region and 1st intron of SDC2 gene <400> 23 ttgggggtgc ggaaggattt gggagaatgg gaaatatttt tattatatat ttattatatt 60 aattattttt ttttttaaaa tgtaattttt atgaattggc gatttatgaa tattttatat 120 tgtttgaaag tattttatat tttttttttt ttttaattta taaagtagtt tttttttatt 180 ggtcgaattt ttaaggtaga aaagttatat acgtttttcg tttttttatt aattgttttt 240 tagaaaaggg aaagtgaaga agggaaagag aaaagataac ggggaagaaa agagtataga 300 ggagagagga aaagtgggga gagaaaggaa gaaaaggatt gagaaaacgt aggagttttg 360 gtttgtcggt gagtagagtc ggcgtagtta tagcgcggag tcgcggcgtt tattggtttt 420 cggagttgtt aatcggcgtg taattttgta ggaatttttt tcgggtttat ttgggagtta 480 tattgtcgtt tttttttttt agtcgtttag gggagttcgg agaagtaggt ttaggaggga 540 gggagttaga ggaaaagaag aggaggagaa ggaggaggat tcggggaggg aggcgcggcg 600 cgggaggagg aggggcgtag tcgcggagtt agtggtttcg tttggacgcg ttgtttttta 660 gatattttcg gagttttagt cgcgcggatc gcgcgttttc gtcgttttgt ttttaaattt 720 ttgtcgtagt ttttttttaa gttagcgaat ttatttttta aaattagaaa ttgaatttcg 780 gtacgggaaa ggagttcgcg gaggagtaaa attatagtag agtaagaaga gttttagaga 840 gtagtttttt cggagtatta atttcgtgtc gggagtgtag aaattaataa gtgagagggc 900 gtcgcgtttt cggggcgtag ttgcgggcgg cgggagtagg cgtaggagga ggaagcgagc 960 gttttcgagt ttcgagttcg agttttcgag tttgagtcgt aatcgttgcg gtattttgtt 1020 tcggattcgt gtgcgcgggt tgcgtcgagc gttgggtagg aggtttcgtt ttgttttggt 1080 tgtaagtagc ggttgggagt agtcggtttt tggggaatat gcggcgcgcg tggattttgt 1140 ttattttggg tttggtggtt tgcgtgtcgg cggagtcggt gagtgggtta ggcggaggat 1200 gcgcgcgtcg tttagggtgt ttgaagttac gagaggagtt cgtagggaat aggggagcgt 1260 tatttgggga atttttagtt tttaagtata tatcggagat tcgttgggat aaatgcgttc 1320 gttcggttat tttttttttt tttttttttt tttagaaaag cgttgttcgt tggcgttatt 1380 tcgcggttcg cgggaatggg ggtatcgaga attgcggttt ggtttagtcg tagaggtttt 1440 tgaagttatt tttaattttt tcgttttcgg cgggttttgt tgcgtggttt gggaaggacg 1500 gaggggaaag ggtggtagga ggggggagtt tgggtcgggt tcgcgaggga acggttttat 1560 ttcgcgcgtt tttcgagatt agggatgatt tggaaatttc ggggtttttt ttttcgtata 1620 ttattttttt cgcgttagtt tttttgtttg attgtatgta agttttgggg agatgggggt 1680 tagatttaag agattcgcga gtgtttagag agaaaagttt gtaaaagttt ttttgtttga 1740 tgttttttgc ggttagggcg aggtaatcga tattacgtgg aatcgtagta ggcgattttt 1800 taaggggata ttgggggagg tacggaacgc gttcgaaaat gttgggacgt cggttattgg 1860 atttttagtt ttgcggcgat ttttttttcg ttgaggggtg gaggttgtat cgcggggcgt 1920 tagggacggg aggatatttt tataggagtt atacgggagt gtcgtaagta gggcgaggcg 1980 gggtacgtgt gatacggcgt 2000

Claims

SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG섬의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 함유하는 위암 진단용 조성물.
SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG섬의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질을 함유하는 위용종 진단용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CpG섬은 SDC2 유전자의 프로모터, 5' UTR, 인트론 및 엑손 중 어느 한 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CpG섬은 SDC2 유전자 중 서열번호 1의 염기서열을 가지는 영역에 위치하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CpG 섬의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 물질은 상기 메틸화된 CpG섬을 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 상기 메틸화된 CpG섬과 혼성화할 수 있는 프로브, 시퀀싱 프라이머, 시퀀싱 바이 신세시스 프라이머 및 시퀀싱 바이 라이게이션 프라이머로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 메틸화된 CpG섬과 결합할 수 있는 메틸화 특이적 결합 단백질 또는 메틸화 특이적 결합 항체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
서열번호 1로 표시되는 SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자 단편 유래 핵산에서, 상기 SDC2 유전자 단편 중 적어도 하나의 사이토신 염기가 우라실로 변형되어 있거나, 혼성화 과정에서 사이토신과 상이한 것으로 검출되는 다른 염기로 변형되도록 처리된, 위용종 또는 위암의 진단용 변형 핵산.
제7항에 있어서, 상기 변형핵산은 서열번호 23의 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 변형 핵산.
SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍과 상기 프라이머쌍에 의하여 증폭된 PCR 산물을 시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머를 함유하는 위암 또는 위용종 진단용 키트.
제9항에 있어서, 상기 PCR 프라이머쌍 및 시퀀싱 프라이머는, CpG 섬을 포함하는 단편을 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 다르게 변형시키는 시약을 처리하여 변형시킨 후 메틸화를 검출하기 위한 프라이머쌍 및 시퀀싱 프라이머인 것을 특징으로 하는 키트.
제9항에 있어서, 상기 PCR 프라이머쌍은 서열번호 2 및 3 또는 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 키트.
제9항에 있어서, 상기 시퀀싱 프라이머는 서열번호 4 또는 7로 표시되는 프라이머임을 특징으로 하는 키트.
다음 단계를 포함하는, 위암의 검출방법:
(a) 임상샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 DNA에서 위 암 바이오마커인 SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG 섬의 메틸화 여부를 측정하는 단계.
다음 단계를 포함하는, 위용종의 검출방법:
(a) 임상샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 DNA에서 위용종의 바이오마커인 SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG 섬의 메틸화 여부를 측정하는 단계.
제13항 또는 제14항에 있어서, 임상샘플에서 분리된 DNA에 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 다르게 변형시키는 시약을 처리한 후, 처리된 DNA의 메틸화 여부를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 시약은 바이설파이트인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 유전자의 프로모터, 5''UTR, 인트론 및 엑손 중 어느 한 부위의 CpG섬의 메틸화 여부를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 (b) 단계는 SDC2 유전자 중 서열번호 1의 염기서열을 가지는 영역의 CpG섬의 메틸화 여부를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, CpG 섬의 메틸화 여부 측정은 서열번호 23의 변형핵산을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 (b)단계의 메틸화 측정은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체를 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 시퀀싱, 시퀀싱 바이 신세시스 및 시퀀싱 바이 라이게이션으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 임상 샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포, 혈액, 혈장, 대변 및 소변으로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG섬을 포함하는 단편과 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 위암 진단용 핵산 칩.
SDC2 (신데칸 2, Syndecan 2) 유전자의 CpG섬을 포함하는 단편과 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브가 고정되어 있는 위용종 진단용 핵산 칩.
제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 8 내지 19으로 표시되는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 칩.
제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 프로브는, CpG 섬을 포함하는 단편을 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 다르게 변형시키는 시약을 처리하여 변형시킨 핵산 단편과 함께 처리될 경우, CpG 섬이 메틸화된 DNA를 포함하는 단편에 대한 해당 변형 핵산단편과 하이브리다이제인션할 수 있는 프로브인 것을 특징으로 하는 핵산 칩.