KR101504069B1

KR101504069B1 - 담관선암 검출 또는 진단용 메틸화 마커 및 방법

Info

Publication number: KR101504069B1
Application number: KR1020140080791A
Authority: KR
Inventors: 강경훈; 조남윤; 신소현
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2015-03-20
Also published as: KR20140095040A

Abstract

본원은 생물학적 시료에서 TWIST1, HOXA1, SFRP1, PENK, GRIN2B, CDH13, NEUROG1, TIMP3, MINT2, CCND2, RASSF1A, RUNX3, CRABP1, GATA3, SEZ6L, SOCS3 및 BCL2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 메틸화 상태를 결정하여 담관선암 특이적 메틸화 마커 및 그 용도에 관한 것이다. 본원에 따른 메틸화 마커 유전자는 담즙세포병리검사가 갖는 낮은 민감도를 보완하고, 담즙을 이용하여 용이하게 담관선암을 고민감도와 고특이성으로 조기 진단할 수 있어서 담관선암의 수술 전 진단율을 획기적으로 개선할 수 있다.

Description

담관선암 검출 또는 진단용 메틸화 마커 및 방법 {Methods and Methylation Markers for detecting or diagnosing cholangiocarcinoma}

본원은 암의 검출 또는 진단용 마커 및 방법에 관한 것으로, 구체적으로 담관선암 검출용 메틸화 마커 및 그 방법에 관한 것이다.

담관선암(cholangiocarcinoma)은 뮤신을 분비하거나 뮤신을 분비하는 샘(gland)을 형성하는 선암의 일종으로, 간에서 생성된 담즙을 소장으로 보내는 담관의 표피세포에서 발생한 암으로, 크게 간내담관선암과 간외담관선암으로 구분된다. 담관선암은 내시경적 역행성 담췌관조영술(endoscopic retrograde cholangiopancreatography, ERCP), 내시경적 초음파검사(endoscopic ultrasonography), 자기공명영상법(magnetic resonance imaging, MRI) 같은 여러가지 영상 진단법을 사용하여 진단되고 있다. 하지만 초기 단계의 담관선암은 이미지 영상으로 보기에는 어려움이 있다. 특히, 염증으로 인한 협착과 암의 조기단계 협착을 구별하지 못한다. 조직을 채취하기 위한 검사는 협착이 있는 경우, 조직을 채취하기가 매우 어려워 실패하는 경우가 많으며, 세포학적 검사는 적은 세포수와 담즙으로 인한 세포변성 등으로 민감도가 낮은 단점이 있다.

또한 담관선암의 다단계 암화 과정에서 암의 전단계 병변인 담관세포 이형성 단계와 암단계를 구분하는데도 어려움이 있다.

최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있다. DNA 메틸화는 주로 특정 유전자의 프로모터 부위의 CpG 아일랜드(CpG island)의 사이토신(cytosine)에서 일어나고, 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단(gene silencing)되는 것으로, 코딩서열(coding sequence)에 돌연변이가 없이도 그 유전자의 기능이 소실되는 주요 기전이다. 전립선암, 결장암, 자궁암, 유방암 등 다양한 암 세포에서 CpG 아일랜드에서의 이러한 비정상적인 메틸화/탈메틸화가 보고되었으며, 여러 암에서 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene), DNA 수선 유전자(DNA repair gene), 세포 주기 조절 유전자 등의 과메틸화(hyper-methylation)되어 있어 이들 유전자의 발현이 차단되어 있다는 것이 확인되었다. 특히 암 발생의 초기 단계에서 특정 유전자의 프로모터 부위에 과메틸화가 일어나는 것으로 알려져 있다. 최근 종양 관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 활발하게 이루어지고 있다.

미국 공개특허공보 제2009-0053706호는 인간 대장암에서 CpG 아일랜드의 메틸화 양태와 연관된 DNA 메틸화 마커에 관한 것으로 대장암의 진단에 사용될 수 있는 마커를 제공한다.

한국 공개특허공보 제 2012-0058163호는 암 진단을 위한 메틸화 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, TESC 유전자 프로모터의 메틸화 상태를 확인하여 암을 진단하는 방법을 개시한다.

따라서, 메틸화 분석을 통한 담관암을 조기에 검출할 수 있는 민감도와 특이성이 높은 마커의 개발이 필요하다.

본원은 조기 진단 및 조직 진단이 어려웠던 담관선암을 높은 특이성과 민감도로 검출할 수 있는 메틸화 바이오 마커 및 이를 이용한 담관선암의 진행단계의 검출 또는 진단 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 생물학적 시료에서 TWIST1, HOXA1, SFRP1, PENK, GRIN2B, CDH13, NEUROG1, TIMP3, MINT2, CCND2, RASSF1A, RUNX3, CRABP1, GATA3, SEZ6L, SOCS3 및 BCL2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및 대조군과 비교하여 상기 하나 이상의 유전자의 메틸화 상태의 변화를 담관선암과 연관시키는 단계를 포함하는, 담관선암의 진행단계 판별, 검출 또는 진단을 위한, 담관선암 특이적 마커의 메틸화 분석 방법에 관한 것이다.

이러한 본원에 따른 담관선암 특이적 마커의 메틸화 분석은 담관선암의 진행단계, 진단을 위한 정보로 제공될 수 있다.

본원에서 상기 하나 이상의 유전자는 다양한 조합으로 사용될 수 있으며, 특히 TWIST1, CDH13, CCND2, GRIN2B 및 RUNX3 로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면 상기 하나 이상의 유전자의 조합은 TWIST1, CDH13 및 RUNX3; TWIST1, CDH13, GRIN2B 및 RUNX3; TWIST1, CDH13, CCND2 및 RUNX3; 또는 TWIST1, CDH13, CCND2, GRIN2B 및 RUNX3를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 마커가 사용되는 담관선암은 간내담관선암 또는 간외담관선암을 포함하며, 상기 간외담관선암은 다시 폐문암과 원위암을 포함한다.

본원에 따른 마커는 다양한 생물학적 시료를 이용하여 검출될 수 있으며, 예를 들면, 혈액, 담즙, 또는 조직을 포함하는 것이다.

본원에 따른 마커의 메틸화 부위는 상기 유전자 또는 그 프로모터의 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브에서 검출되며, 프로모터에서 검출되는 경우, 예를들면 전사개시 부위로부터 5' 방향으로 약 2kbp 이내, 특히 1kbp이내에서 검출될 수 있다.

본원에 따른 메틸화 부위는 다양한 방법에 의해 검출될 수 있으며, 예를 들면 본원의 마커 유전자의 적어도 일부를 메틸화 감응성 제한효소와 접촉하여 검출될 수 있으며, 상기 제한효소는 메틸화된 제한효소 부위를 선택적으로 절단하고, 상기 절단은 상기 유전자의 메틸화를 나타내는 것이거나, 또는 상기 제한효소는 비-메틸화 제한효소 부위를 선택적으로 절단하고, 상기 절단은 상기 유전자의 비-메틸화를 나타내는 것이다. 본원에 따른 메틸화 부위를 선택적으로 절단하는 제한효소는 AccIII, BanI, BstN I, MspI, 또는 XmaI를 포함하고, 상기 비-메틸화 부위를 선택적으로 절단하는 제한효소는 AccII, Ava, BssHII, BstU I, HpaII, 또는 NotI을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 메틸화는 또한 본원에 따른 유전자의 적어도 일부를 비-메틸화 사이토신 잔기를 선택적으로 변형시키거나, 또는 메틸화 사이토신 잔기를 선택적으로 변형시키는 화합물과 접촉하고, 상기 접촉에 의해 생성된 산물의 검출에 의한 방법으로 검출될 수 있다. 이러한 화합물은 당업계에 공지된 것으로 예를들면 하이드라진 또는 바이설파이트 이온이고, 상기 하이드라진과 접촉된 유전자의 적어도 일부를 피페리딘으로 절단하고, 상기 바이설파이트 이온과 접촉된 유전자의 적어도 일부를 알칼리로 처리될 수 있다.

본원에 따른 메틸화 부위 검출에 있어서, 검출은 메틸화 특이적 증폭방법으로 수행될 수 있으며, 이러한 증폭방법은 예를 들면 변형된 비-메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하나, 비변형된 메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하지 않는 적어도 하나의 프라이머를 이용하여 증폭산물을 생성하거나, 또는 비변형된 메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하나, 변형된 비-메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하지 않는 적어도 하나의 프라이머를 이용하여 증폭산물을 생성하는 방법에 수행될 수 있다. 이러한 방법에서 증폭산물은 (a) 변형된 비-메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하나, 비변형된 메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하지 않는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; (b) 비변형된 메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하나, 변형된 비-메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하지 않는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나 이상을 이용하여 검출될 수 있다.

다른 구현예에서 본원에 따른 메틸화부위의 검출은 교잡, 증폭, 서열분석, 전기영동, 크로마토그래피 및 질량분광분석기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 수행될 수 있다. 또다른 구현예에서, 본원에 따른 메틸화 부위의 검출은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 서열분석으로 수행될 수 있다.

다른 양태에서 본원에 따른 하나 이상의 메틸화 마커는 담관선암의 진단 등을 위한 최적의 조합을 선별하기 위해 마커의 조합이 사용될 수 있으며, 이러한 조합은 알고리즘을 사용하여 선별될 수 있다. 한 구현예에서 본원 다음의 단계를 포함하는 알고리즘을 제공한다. i) 각 시료 및 메틸화 분석의 PMR 값은 컷오프값에 따라 0 또는 1로 변환 (C, C = 1.0, 2.0, 3.0, 또는 4.0) (시료 및 메틸화 분석의 PMR 값 C를 초과하면 1이고 그렇지 않은 경우 0이 부여됨); ii) 조합된 마커의 수를 선별: (k, k = 2, 3, 4, 또는 5); iii) 최소 양성 마커수 선별(s, s = 1, -, k); iv) k 마커를 선별하고, 이들 선별된 k 마커에 대한 바이너리 값의 합을 각 시료 별로 생성하고, 합에 따라, 각 시료를 다음의 기준으로 "암" 또는 "정상"으로 분류: 양성 마커의 합이 s와 같거나 크면, s = 1, -, k, 이고 암으로 분류, 그렇지않은 경우, 정상으로 분류하고, 이어 미분류율, 정확도, 민감도 및 특이성을 수득; v) iv의 과정을 k 마커들의 모든 가능한 조합에 대하여 수행; vi) v)의 결과에 따라 최고의 민감도와 약 80% 이상의 특이성을 나타내는 마커의 조합을 선별; vii) 단계 vi)의 최종 모델을 검증 세트에 적용하고, 미분류율, 정확도, 민감도 및 특이성을 수득; viii) 단계 iv)부터 vii)의 과정을 모든 s(s = 1, -, k)에 대하여 수행; ix) 단계 ii)부터 단계 viii) 과정을 모든 k (k = 2, 3, 4, 5)에 대하여 수행; x) 단계 i)부터 단계 ix) 의 모든 과정을 C (C = 1.0, 2.0, 3.0, 또는 4.0)에 대하여 반복. 한 구현예에서 본원에 따른 알고리즘에서 상기 C인 컷오프 값은 1 또는 그 이상이고, 상한에는 제한이 없고, 상기 조합된 마커 수는 3 내지 5이다.

다른 양태에서 본원은 또한 담관선암의 진행단계, 진단을 위한, 생물학적 시료에서의 메틸화 분석용 키트로서, 상기 키트는 메틸화된 사이토신 잔기는 변형시키나, 비-메틸화된 사이토신 잔기는 변형시키지 않는 시약; 또는 비-메틸화된 사이토신 잔기는 변형시키나, 메틸화된 사이토신 잔기는 변형시키지 않는 시약; 및 TWIST1, HOXA1, SFRP1, PENK, GRIN2B, CDH13, NEUROG1, TIMP3, MINT2, CCND2, RASSF1A, RUNX3, CRABP1, GATA3, SEZ6L, SOCS3 및 BCL2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 유전자의 전사개시 부위로부터 1000bp 이내 부위에 결합하여 증폭할 수 있는 한 세트의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 메틸화 분석용 키트를 제공한다. 한 구현예에서 상기 생물학적 시료는 조직, 담즙 또는 혈액이 사용될 수 있다. 본원에 따른 키트에서 상기 프라이머 쌍의 적어도 하나는 변형된 비-메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 서열에는 결합하나, 비변형된 메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 서열에는 결합하지 않고, 또는 상기 프라이머 쌍의 적어도 하나는 비변형된 메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 서열에는 결합하나, 변형된 비-메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 서열에는 결합하지 않는다.

본원에 따른 키트는 또한 추가로 (a) 변형된 비-메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 서열에는 결합하나, 비변형된 메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 서열에는 결합하지 않는 제1 올리고뉴클레오타이드; 또는 (b) 비변형된 메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 서열에는 결합하나, 변형된 비-메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 서열에는 결합하지 않는 제2 올리고뉴클레오타이드 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 따른 키트는 또한 핵산 증폭용 DNA 폴리머라제, 예를 들면 시중의 PCR 용 Taq 폴리머라제를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 따른 키트에서 상기 하나 이상의 유전자는 다양한 조합으로 사용될 수 있으며, 특히 TWIST1, CDH13, CCND2, GRIN2B 및 RUNX3 로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면 상기 하나 이상의 유전자의 조합은 TWIST1, CDH13 및 RUNX3; TWIST1, CDH13, GRIN2B 및 RUNX3; TWIST1, CDH13, CCND2 및 RUNX3; 또는 TWIST1, CDH13, CCND2, GRIN2B 및 RUNX3를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 TWIST1, HOXA1, SFRP1, PENK, GRIN2B, CDH13, NEUROG1, TIMP3, MINT2, CCND2, RASSF1A, RUNX3, CRABP1, GATA3, SEZ6L, SOCS3 및 BCL2 유전자 또는 그 프로모터의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 부위와 교잡할 수 있는 프로브 또는 상기 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 담관선암 검출용 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 상술한 또는 후술하는 다양한 메틸화 검출 방법에 사용되어, 본원에 따른 마커의 메틸화여부의 검출에 사용될 수 있다.

본원에 따른 메틸화 마커 유전자는 담즙세포병리검사가 갖는 낮은 민감도를 보완하고, 담즙을 이용하여 용이하게 담관선암을 고민감도와 고특이성으로 조기 검출 또는 진단을 할 수 있어, 담관선암의 수술 전 진단율을 획기적으로 개선할 수 있고, 사망률을 낮추는 데 크게 기여할 것으로 기대된다. 또한 담관암의 전암단계 병변의 존재가능성에 대한 위험도를 알려주는 역할을 하게 되어, 정기적인 추적 검사를 통해 담관암의 조기진단과 조기절제를 가능하게 해 줄 것이다.

도 1은 총 40개의 조직 시료에서 59개 CpG 아일랜드를 분석한 PMR(percentage of methylated reference) 값을 나타낸다. EHC (간외담관선암, extrahepatic cholangiocarcinoma) (n = 20) 및 만성 담낭염 (n = 20). 진하기 정도는 메틸화 정도를 나타낸다 (백색, PMR < 4; 옅은 회색, 4 ≤ PMR < 20; 진한 회색, 20 ≤ PMR < 50; 흑색 PMR ≥ 50).
도 2는 EHC 및 만성담낭염 조직 시료 간에 메틸화 양상에 있어서 유의적 차이를 보이는 메틸화 마커의 메틸화 수준 (A) 및 메틸화 빈도(B)를 보여주는 그래프이다. 그래프에서 p값이 높은 것에서부터 낮은 순으로 x축을 따라 마커를 배열하였으며, 에러 바는 SEM 을 나타낸다.
도 3은 EHC (n=20) 및 담낭염 (cholecystitis) 또는 담관염 (cholangitis) (n=20)이 발생한 환자의 담즙 시료를 사용하여 17개의 메틸화 마커에 대하여 트레이닝 세트에서 수득한 PMR 값 (A)과, EHC (n=33) 및 담낭염 (cholecystitis) 또는 담관염 (cholangitis) (n=12)이 발생한 환자의 담즙 시료를 사용하여 17개의 메틸화 마커에 대하여 확증 세트에서 수득한 PMR 값을 나타낸다. 세포병리 (cytology) 컬럼의 각 원은 비정형성 또는 악성을 나타내며, 진하기 정도는 메틸화 수준을 나타낸다. (백색, PMR < 1; 옅은 회색, 1 ≤ PMR < 20; 진한 회색, 20 ≤ PMR < 50; 흑색, PMR ≥ 50).
도 4는 5 개의 메틸화 마커를 이용하여 수득한 PMR 값을 나타낸 것이다. 3개 세트의 시료 (EHC 및 비종양 시료)를 사용하였으며, A는 트레이닝 세트, B는 검증 세트이고, C는 테스트 세트이다. 메틸화 분석 컬럼 및 세포병리 컬럼에서 채워진 각 원은 각각 하나 이상의 메틸화 마커의 존재 및 비정형 또는 악성 진단을 나타낸다. 패널+세포병리분석 컬럼의 원은 양 쪽 분석 모두에서 양성인 것을 나타낸다. (백색, PMR < 1; 밝은 회색, 1 ≤ PMR < 20; 진한 회색, 20 ≤ PMR < 50; 흑색, PMR ≥ 50).
도 5는 유전자의 메틸화 정도를 검출할 수 있는 한 방법을 도식화 한 것이다.
도 6은 메틸화 정도를 판별하는 PMR 수치 계산 방법을 도식화 한 것이다.

본원은 특정 군의 유전자의 메틸화 여부와 담관선암과의 연관성의 발견에 근거한 것으로, 메틸화 검출을 통해 조기 진단 및 조직 진단이 어려웠던 담관선암을 비침습적인 방법으로, 높은 특이성과 민감도로 검출할 수 있다.

따라서 한 양태에서 본원은 생물학적 시료에서 TWIST1, HOXA1, SFRP1, PENK, GRIN2B, CDH13, NEUROG1, TIMP3, MINT2, CCND2, RASSF1A, RUNX3, CRABP1, GATA3, SEZ6L, SOCS3 및 BCL2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및 대조군과 비교하여 상기 하나 이상의 유전자의 메틸화 상태의 변화를 담관선암과 연관시키는 단계를 포함하는, 담관선암의 조기 진단, 진행단계에 따른 진단을 위한, 담관선암 특이적 메틸화 마커의 메틸화 분석 방법을 제공한다.

본원에 따른 메틸화 마커는 담관선암을 높은 민감도와 특이성으로 검출하여, 전암 검출, 조기진단, 발병 및 진행단계에 따른 진단에 대한 판별 지표가 될 수 있다. 본원의 메틸화 마커가 적용되는 담관선암은 뮤신을 분비하거나 뮤신을 분비하는 샘(gland)을 형성하는 선암의 일종으로, 간에서 생성된 담즙을 소장으로 보내는 담관의 표피세포에서 발생하는 악성 종양으로 크게 간내담관선암과 간외담관선암으로 구분된다. 간외담관선암은 다시 폐문(hilar)암과 원위(distal)암으로 나뉘며 이러한 다양한 종류의 담관선암의 진단 마커로서 사용될 수 있다. 한 구현예에서는 간외담관선암 (Adenocarcinoma of the extrahepatic bile cholangiocarcinoma, EHC)의 진단 등에 사용된다. 간외담관선암은 악성 종양의 0.2% 미만에서 나타나는 비교적 희귀한 암으로, 주변 조직 또는 장기로의 전이률이 30 내지 70%로 매우 높은 예후가 불량한 암으로, 진단시에는 이미 상당히 진행된 상태이다. 따라서 조기 진단이 암의 치료와 생존률에 있어서 매우 중요하다.

본원의 마커는 생물학적 시료에서 검출되며, 본원에서 용어 "생물학적 시료 또는 검체"는 인체나 포유동물로부터 얻어지는 모든 고형 또는 액상의 시료, 예컨대, 특정 장기 유래의 세포, 조직 또는 액체, 오줌, 타액, 전혈, 혈장 또는 혈청 시료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 생물학적 시료는 담즙으로, 담즙에 포함된 세포로부터 본원에 따른 메틸화 마커 유전자의 메틸화 여부를 분석할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 정상 세포 또는 대조군은 비정상적 세포 형태 또는 세포학적 성질의 변화를 나타내지 않은 세포를 의미하며, 비종양 세포를 포함한다. 비종양 세포는 정상 조직을 포함하는 종양 이외의 병증 조직의 일부이다.

본원에 따른 메틸화 마커는 TWIST1, HOXA1, SFRP1, PENK, GRIN2B, CDH13, NEUROG1, TIMP3, MINT2, CCND2, RASSF1A, RUNX3, CRABP1, GATA3, SEZ6L, SOCS3 및 BCL2로 구성되는 군으로부터 선택된다. 한 구현예에서 상기 유전자는 TWIST1, CDH13, CCND2, GRIN2B 및 RUNX3로부터 선택되는 하나 이상이다. 상기 유전자 또는 그 프로모터 부위, 예를 들면 전사개시부위로부터 예를 들면 5' 방향으로 약 1 kbp 이내에서의 메틸화 여부, 특히 후술하는 CpG 아일랜드 부위의 메틸화 상태의 판별을 통해 하나 이상의 유전자에서 대조군 즉, 비-암성 유래의 생물학적 시료와 비교하여, 하나 이상의 마커 유전자에서 과메틸화가 나타난 경우 담관선암으로 판별할 수 있다.

CpG 아일랜드에서의 참조 대조군과 비교한 메틸화 상태의 증감은 질환에 대하여 다양한 정보를 제공할 수 있으며, 전암 상태 판별, 질환의 진단, 질환의 경과 예측, 질환에 대한 감수성 판별, 질환의 진행 정도, 치료에 반응정도 판별, 질환의 재발가능성 등의 판별에 사용될 수 있으며, 본원의 마커는 간내담관선암 및 간외담관선암을 포함하는 담관선암에서 이러한 용도로 사용될 수 있다.

본원에서 용어 "진단" 또는 "검출"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 암으로 발병할 가능성이 높은 전암단계의 판별, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 질환의 진행정도, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 치료제에 대한 반응을 예측하거나 관찰하는 예후(prognosis)에 대한 정보를 얻거나 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것), 재발 가능성 여부의 판별을 포함한다.

본원에서 용어 "조기 진단"은 전이되기 전에 암의 가능성을 발견하는 것으로, 특히 검체 조직 또는 세포에서 형태학적 변화가 관찰되기 전에 발견하는 것으로, 예를 들면 세포가 암화되기 전 초기 단계에서 그 형태의 변화가 일어날 가능성 높은 것을 말한다.

본원에 따른 방법에서, 담관선암의 판별 마커로서 상기 마커 중 어느하나를 이용할 수도 있으나, 바람직하게는 이들 마커들이 둘 이상 포함된 복합 마커인 것이 좋다. 상기 마커들은 두 개 이상의 조합으로 사용되어 대조군으로부터 담관선암의 조기 진단, 진단, 진행상태 판별에 사용될 수 있다. 본원에 따른 마커중 이러한 용도에 최적의 효과를 나타내는 조합을 선별하여 사용할 수 있으며, 당업자라면 용도에 맞는 적절한 조합을 선택할 수 있을 것이다. 한 구현예에서, 상기조합은 TWIST1, CDH13 및 RUNX3; TWIST1, CDH13, GRIN2B 및 RUNX3; TWIST1, CDH13, CCND2 및 RUNX3; 또는 TWIST1, CDH13, CCND2, GRIN2B 및 RUNX3 이나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 마커 유전자들은 메틸화된 유전자의 수 및 그 중요도에 따라 순위를 매길 수 있고, 가중치를 둘 수 있으며, 암으로 발전할 가능성의 수준을 선정할 수 있다. 이러한 알고리즘은 본 발명에 속한다.

본원에 따른 방법에 사용되는 TWIST1, HOXA1, SFRP1, PENK, GRIN2B, CDH13, NEUROG1, TIMP3, MINT2, CCND2, RASSF1A, RUNX3, CRABP1, GATA3, SEZ6L, SOCS3 및 BCL2로 구성되는 군으로부터 선택되는 메틸화 마커, 특히 TWIST1, CDH13, CCND2, GRIN2B 및 RUNX3로부터 선택되는 메틸화 마커는 그 중 하나 이상이 메틸화된 경우, 높은 민감도와 정확도로 담관선암을 검출한다. 본원에 따른 마커의 특이성은 예를 들면 약 80%이상, 특히, 90% 이상, 더욱 특히 95% 이상, 더욱 특히 100%이다. 본원에 따른 마커의 민감도는 예를 들면 약 70%이상이다.

본원의 방법에서는 상기 메틸화 마커의 유전자 또는 그 프로모터의 메틸화된 부위, 특히 메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드 특히 CpG 아일랜드에서의 다이뉴클레오타이드의 존재를 검출하다. 상기 CpG 아일랜드는 CpG 다이뉴클레오타이드가 높은 빈도로 나타나는 DNA 부위를 말하는 것으로, 많은 경우 유전자의 프로모터 또는 5' 엑손 부위에서 발견된다(Takai D, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2002, 99:37403745). 대부분의 인간 유전자의 프로모터는 이러한 CpG 아일랜드에 위치하고 있으며, 비-메틸화 상태로 존재한다. 이러한 부위의 메틸화 정도는 그 정도차가 매우 크나 (Hinoue T, et al., Genome Res 2011; Noushmehr H, et al., Cancer Cell 2010, 17:510522) 유전자 불활성화 또는 암과 관련되어 있으며(4-6), 암별로 특이적인 양상을 나타낸다 (Soria JC et al., Cancer Res 2002, 62:351355; Eads CA et al., Cancer Res 2001, 61:34103418).

상술한 바와 같이 본원의 방법은 생물학적 시료로부터 분리된 핵산에서 상기 하나 이상의 유전자, 즉 핵산에서 하나 이상의 부위의 메틸화를 결정하는 단계를 포함한다. "핵산" 또는 "핵산 서열"이란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 의미하거나 이들의 단편, 단일가닥 또는 이중가닥의 천연 또는 합성의 DNA 또는 RNA, 센스 또는 안티센스 가닥의 천연 또는 합성의 DNA 또는 RNA, PNA (peptide nucleic acid) 또는 천연 또는 합성의 DNA 또는 RNA 유사 물질을 말한다.

본원의 방법에서는 상기 메틸화 마커의 유전자 또는 그 프로모터의 메틸화된 부위, 특히 메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드 특히 CpG 아일랜드에서의 다이뉴클레오타이드의 존재를 검출할 수 있는 핵산이라면 어떤 것이든 사용할 수 있다.

나아가 본 발명에서의 정제되거나 정제되지 않은 형태의 어떠한 핵산도 사용될 수 있으며, 타겟 부위(예를 들면, CpG-함유 핵산)를 함유하는 핵산 서열을 함유하고 있거나 함유할 것으로 의심되는 어떠한 핵산도 사용될 수 있다. 차별적으로 메틸화될 수 있는 핵산 부위가 CpG 아일랜드이고, 이는 다른 예를 들면 대조군의 동일한 CpG 핵산 부위와 비교하여 높은 CpG 밀도를 가지는 핵산 서열이다. CpG 아일랜드의 경우 평균 G*C 비율이 약 60%로, 보통의 DNA의 G*C 비율은 평균 40%를 나타낸다.

CpG 아일랜드는 전형적으로 약 1 내지 2kbp 길이를 가지고, CpG 아일랜드 프로모터의 업스트림 (upstream) 에서 시작하여, 다운스트림의 전사 부위를 포함하여 3'부위에도 존재하며, 예를 들면, 인핸서, 프로모터 및 인트론을 포함하는 여러 부위에서 발견된다. 본원의 메틸화 마커 유전자의 메틸화 여부는 이러한 다양한 부위에 존재하는 CpG 아일랜드의 CpG를 검출하는 것을 포함한다. 한 구현예에서 메틸화 부위는 프로모터 부위, 특히 전사개시부위로부터 5' 방향으로 약 2kbp 이내, 약 1 kbp 이내, 특히 750 bp 이내, 더욱 특히 500 bp 이내이다.

"프로모터"는 전사를 지시하는데 필요한 최소한의 서열이고, 프로모터-의존성 유전자에서 세포 타입 특이적, 조직 특이적 또는 외부 시그널이나 물질에 의해 조절될 수 있다. 이러한 프로모터는 유전자의 5' 또는 3' 부위에 위치한다. 프로모터 부위의 전체 또는 일부에서 메틸화 여부가 측정될 수 있으며, 표적 유전자 프로모터의 메틸화는 개시부위를 중심으로 바깥쪽에서부터 내부로 진행한다. 그러므로, 암세포로의 전환과 같은 변형의 초기 단계는 프로모터 부위의 외곽에서의 메틸화를 분석함으로써 검출할 수 있다.

통상적으로, CpG의 메틸화 여부 검출에 사용되는 핵산은 DNA이다. 그러나, 본 발명의 방법은 예를 들면, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 적용할 수 있으며, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유한 시료인 것을 특징으로 할 수 있다. 핵산 혼합물 또한 사용할 수 있다. 검출될 핵산 서열은 순수한 형태로 존재하는 핵산일 필요는 없으며, 핵산은 전체 게놈 DNA의 일부와 같이 큰 분자의 적은 분획일 수 도 있다. 이러한 CpG 아일랜드의 메틸화 상태의 검출에 사용되는 시료에 포함된 핵산은 Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY.,최신판)에 기재된 여러 가지 방법으로 추출될 수 있다.

본원의 마커는 메틸화 상태의 검출을 통해 담관선암을 판별할 수 있으며, 이는 공지된 다양한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

본원에 따른 일 구현에서는 CpG 다이뉴클레오타이드 메틸화 상태 검출에, 메틸화에 감응적인 제한효소가 사용된다. 이러한 제한효소는 메틸화된 제한효소 인식 부위 또는 비-메틸화된 제한효소 인식부위를 선별적으로 절단한다. 전자의 예로는 AccIII, BanI, BstNI, MspI, 또는 XmaI을 포함하고, 후자의 예로는 AccII, AvaI, BssHII, BstUI, HpaII, 또는 NotI를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 제한효소 처리 후 전기영동을 통해 산물의 크기를 분석하여, 절단 여부에 따라 메틸화 상태를 판별할 수 있다.

또한 대안적으로 CpG 다이뉴클레오타이드 부위를 선별적으로 변형시키는 화합물이 사용될 수 있으며, 이는 직접 또는 추가의 반응을 거쳐 검출될 수 있다. 예를 들면 크기 및/또는 하전 상태의 변화가 수반되는 경우, 전기영동, 크로마토그래피 및 질량분광기가 사용될 수 있다. 추가의 반응에 사용되는 화합물의 예로는 하이드라진 및 바이설파이트 이온을 들 수 있다. 하이드라진으로 변형된 DNA는 피페리딘으로 처리하는 경우 절단된다. 바이설파이트 이온으로 처리된 DNA는 알칼리로 처리하여 절단할 수 있다.

본원에 따른 다른 구현에서는 CpG 다이뉴클레오타이드 메틸화 상태 검출에, 다양한 증폭 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 PCR (Polymerase Chain Reaction), 메틸화 특이적 PCR, 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, DNA 마이크로어레이, 파이로서열분석 및 바이설파이트 서열분석을 통해서 수행될 수 있다. PCR 이외의 증폭방법으로는 라이게이즈 연쇄 반응 (ligase chain reaction, LCR) (Barringer et al, 1990. Gene 89, 117-122), 전사 증폭 (WO1988/10315), 표적 서열의 선택적 증폭 방법 (U.S. Pat. No. 6,410,276), 보존서열을 이용한 PCR (U.S. Pat. No. 4,437,975), 무작위 프라이머를 이용한 PCR (WO1990/06995), 핵산기재 서열 증폭 (NASBA) (U.S. Pat. Nos. 5,409,818; 5,554,517; 6,063,603), 및 틈(nick) 교체 증폭 (WO2004/067726) 방법을 들 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

CpG 다이뉴클레오타이드의 메틸화 상태의 검출을 위한 PCR 프라이머는 검출 방법에 따라 다양하게 제작될 수 있다. 예를 들면 바이설파이트 서열분석, COBRA (Called Combined Bisulfite Restriction Analysis), 또는 Ms-SNuPE (Methylation-sensitive single nucleotide primer extension) 분석의 경우, 프라이머 자체는 DNA 메틸화 부위 및 가능 부위는 커버하지 않거나, 교잡하지 않도록 디자인되며, 차별적으로 메틸화가 일어나는 부위에서의 서열변이는 한 쌍의 프라이머 사이에 위치하도록 한다. 또는 프라이머가 화합물 처리 후의 메틸화 또는 비-메틸화 부위에 특이적으로 교잡하도록 제작될 수 있으며, 결합 상보성이 충분하여 교잡을 방해하지 않는 경우, 추가의 서열 예를 들면 제한효소 부위, 리간드 결합부위, 링커 또는 반복서열을 포함하도록 제작될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 미국 특허 제6,017,704호 및 제6,200,756호에 기재된 메틸화 특이적 PCR이 사용된다. 변형된 DNA와 변형되지 않은 DNA를 구분하는 한 가지 방법은 둘 중의 하나에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 증폭반응을 수행하고, 증폭산물을 분석하는 것이다. 증폭산물의 존재는 프라이머가 시료에 결합한 것을 나타낸다. 프라이머의 특이적 결합은 DNA의 변형여부, 즉 DNA의 메틸화 여부를 나타낸다. 예를 들면 소디움 바이설파이트와 같은 바이설파이트 이온은 비-메틸화된 사이토신 염기에 작용하여 이를 우라실 염기로 바꾼다. 우라실은 교잡조건에서 아데닌에 결합하기 때문에 구아닌 대신에 아데닌을 포함하는 프라이머가 바이설파이트로 변형된 DNA에 교잡할 것이고, 반면, 구아닌을 포함하는 프라이머는 비-변형된 (메틸화) 사이토신 잔기에 결합할 것이다. 다른 쌍의 프라이머와 폴리머라제를 이용하여 증폭을 통해 용이하게 검출할 수 있다.

예를 들면 도 5 및 6에 도시된 바와 같이, 본원에 따른 일 구현예에서는 담즙을 이용하여 정상세포 및 암세포 DNA를 추출한 후 상술한 바와 같은 바이설파이트 처리 후에 메틸화 특이 프라이머와 프로브를 사용한 실시간 PCR 방법(Methylight assay)을 이용하여 증폭반응을 수행하며, 이 경우 암세포 유래의 DNA는 프라이머 및 프로브와 반응하여 형광을 방출하지만, 정상 DNA는 프라이머 및 프로브와 반응하지 않음으로 형광을 방출하지 않는다. 따라서 방출되는 형광의 양에 따라 메틸화 마커의 메틸화 여부를 판단 할 수 있다. 각 유전자의 메틸화 레벨(%)은 Percentage of Methylated Reference (PMR) 다음의 공식을 이용하여 계산될 수 있다 : PMR = (시료 중 검출 대상 유전자와 Alu의 비율)/(양성대조군의 검출대상 유전자와 Alu의 비율) x 100

나아가 바이설파이트를 이용한 서열분석을 메틸화 CpG를 검출할 수 있으며, 이는 미국특허 제5,786,146호에 기재된 것을 참조할 수 있다. 또한 파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 서열분석을 정량적인 분석을 통해 수행하는 것이다. 유전체 DNA를 바이설파이트로 처리 후 CpG 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 염기서열 분석용 프라이머를 이용하여 염기서열 분석을 수행하는 것으로, CpG 부위에서 사이토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메틸화정도를 메틸화 지수로 나타내는 것이다.

본원에 따른 일 구현예에서는 또한 변형 또는 비변형 DNA 검출을 위해 특정 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브가 사용될 수 있으며, 이러한 프로브는 변형된 산물에 직접 결합하거나 또는 변형된 산물의 증폭 산물에 결합할 수 있으며, 검출을 위해 공지의 다양한 물질 예를 들면 형광물질, 방사선물질, 생물발광물질, 발광물질, 화학발광물질, 효소, 수용체 또는 리간드로 표지될 수 있다. 표지방법은 당해 분야에 널리 알려진 기술로, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.

또다른 구현예에서 CpG 다이뉴클레오타이드의 메틸화 상태 검출은 메틸화 DNA에 특이적으로 결합하는 McCP2 단백질의 MBD 영역을 이용하는 것이다 (Shiraishi et al,Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:2913-8). 제한효소로 처리된 유전체 DNA를 고상의 기질에 고정된 His-태깅된 methyl-CpG 결합 영역 단백질과 반응시키고 컬럼 크로마토그래피 분석을 수행하여 과메틸화된 DNA 서열을 분리하는 것이다.

다른 일 구현예에서는 CpG 다이뉴클레오타이드의 메틸화 상태 검출은 실시간 PCR을 이용한다. 다양한 방법으로 실시간 PCR을 수행할 수 있으며, 예를 들면 TaqMan 시스템 (Applied Biosystems)이나, Molecular Beacon 시스템, Scorpion 시스템을 사용할 수 있으며, 전자의 두 방법은 양 말단 중 하나가 각각 형광염료 (fluorophore)와 형광제거염료 (fluorescence quencher)로 표지된 프로브가 사용되며, 후자는 프라이머에 연결된 헤어핀 구조가 형성된 표지된 프로브가 사용된다.

그 외 DNA 메틸화 상태를 분석할 수 있는 다른 방법으로는 MALDITOFF, MassARRAY, MethyLight, QAMA(Quantitative analysis of ethylated alleles), ERMA (enzymatic regional methylation assay), HeavyMethyl, QBSUPT, MS-SNuPE, MethylQuant, Quantitative PCR sequencing, 올리고뉴클레오타이드 기재의 마이크로어레이를 들 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

메틸화 상태의 검출을 위해 사용되는 프로브, 프라이머 등은 표적 핵산과 교잡을 통해 작용한다. 교잡 조건은 구체적 실험 목적, 반응에 사용되는 핵산의 특성 등에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면 교잡부위의 핵산의 길이, 상동성정도, 뉴클레오티드 서열 조성 (예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 교잡조건의 선택에 고려된다. 일반적으로 특이성을 높이기 위해서는 고교잡 조건이 사용된다. 그러나 상술한 바와 같이 최적 조건은 구제척 교잡반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 TWIST1, HOXA1, SFRP1, PENK, GRIN2B, CDH13, NEUROG1, TIMP3, MINT2, CCND2, RASSF1A, RUNX3, CRABP1, GATA3, SEZ6L, SOCS3 및 BCL2 유전자 또는 그 프로모터의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 부위와 교잡할 수 있는 프로브 또는 상기 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 포함하는, 담관선암 검출용 조성물에 관한 것으로, 메틸화 검출에 사용될 수 있는 프라이머, 프로브 또는 검출방법은 앞서 기술한 바와 같다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 담관선암의 진행단계, 진단의 결정을위한, 생물학적 시료에서의 메틸화 분석용 키트를 제공한다. 본원에 따른 키트는 본원에 따른 메틸화 마커 유전자의 메틸화 상태를 판별할 수 있는 시약을 포함하며, 사용안내서를 추가적으로 포함할 수 있다. 본원의 키트에 포함된 시약은 개별적으로 또는 혼합된 상태로 제공될 수 있으며, 그 형상도, 액체, 얼려진 상태, 동결건조된 것 등 다양할 수 있다.

본원에 따른 키트는 상술한 바와 같은 메틸화 또는 비-메틸화 사이토신을 차별적으로 변형시키는 시약을 포함할 수 있으며, 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 본원에 따른 WIST1, HOXA1, SFRP1, PENK, GRIN2B, CDH13, NEUROG1, TIMP3, MINT2, CCND2, RASSF1A, RUNX3, CRABP1, GATA3, SEZ6L, SOCS3 및 BCL2 중 하나 이상 유전자의 전사개시 부위로부터 1kb이내의 DNA에 결합할 수 있는 프라이머를 포함할 수 있다. 본원에 따른 키트에 포함되는 프라이머는 변형된 메틸화 잔기에 특이적으로 결합하거나 또는 결합하지 않을 수 있다. 이러한 프라이머는 전형적으로 하나의 유전자에 대하여 전방 및 후방 프라이머 쌍을 포함하고, 상보성을 위해 길이는 예를 들면 12, 15, 18, 20, 또는 24 뉴클레오타이드이다. 이러한 프라이머는 교잡을 방해하지 않는 범위에서 분석을 편이를 위해 제한효소 부위, 링커 등을 추가로 포함할 수 있다.

본원의 키트는 또한 프로브를 추가로 포함할 수 있으며, 프로브는 변형된 메틸화 잔기를 포함하는 서열에 특이적이거나 또는 비-메틸화 잔기를 포함하는 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.

본원의 키트는 또한 메틸화 사이토신 잔기를 변형시킬 수 있는 시약, 증폭에 필요한 시약 예를 들면 DNA 중합효소, dNTP 등을 추가로 포함할 수 있다.

본원의 키트는 또한 검출에 필요한 수단, 예를 들면, 프라이머, 또는 프로브의 표지에 필요한 시약을 추가로 포함 할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 키트는 메틸화된 사이토신 잔기는 변형시키나, 비-메틸화된 사이토신 잔기는 변형시키지 않는 시약; 또는 비-메틸화된 사이토신 잔기는 변형시키나, 메틸화된 사이토신 잔기는 변형시키지 않는 시약; 및 TWIST1, HOXA1, SFRP1, PENK, GRIN2B, CDH13, NEUROG1, TIMP3, MINT2, CCND2, RASSF1A, RUNX3, CRABP1, GATA3, SEZ6L, SOCS3 및 BCL2로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 유전자의 전사개시부위로부터 5' 방향으로 약 2kbp 이내, 특히 약 1 kbp 이내 부위에 결합하여 증폭할 수 있는 한 세트의 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.

그 외 키트의 성분 및 용도에 관하여는 앞서 설명한 바와 같다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 암 특이적 DNA 메틸화 마커의 선별을 위한 유전체 분석

담관선암에 특이적 마커를 선별하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

생물학적 시료

실험에 사용한 생물학적 시료로, 2001년부터 2003년 사이에 서울대학교 병원에서 EHC로 수술을 받은 20명의 EHC 환자 유래의 포르말린으로 고정된 파라핀 포매 조직 시료와 담낭절제 수술을 받은 20명의 환자 유래이다. EHC는 16건이 담도형 선암이었으며, 4건은 장형 선암이었다. 시료로 사용된 암의 판별은 조직검사를 통해 수행되었다.

담즙은 2008년부터 2010년 사이에 서울대학교 병원에 내원한 EHC (n=77) 환자로부터 ECRP (cholangiopancreatography), PTBD (Percutaneous transhepatic billary drainage) 또는 T-관을 이용하여 추출되었다. 채취한 담즙의 양은 약 1ml이었으며, 사용시까지 -70℃에서 동결되었다. 환자의 세포 유형 분석결과, 담도형 선암이 66건, 장형 선암이 11건, 위 소와형이 3건, 비분화성 암이 2건이고, 선 편평상피 세포암이 1건이었다.

대조군으로는 결석담낭염, 비결석 담낭염, 담관염 (n=48) 환자 유래의 담즙을 비-종양성 조직을 사용하였으며, 36개월 동안 추적 조사한 결과 한 건도 암으로 진행되지 않았다.

유전체 DNA 추출

상기 EHC 파라핀 조직시료로부터 박절되고 H&E (헤마토실린 에오신, Sigma) 염색을 시행하여 제작된 조직유리슬라이드를 광학현미경으로 관찰하여 종양세포의 밀도가 높은 부분의 윤곽을 표시하였다. 이어 조직유리슬라이드로부터 표시된 부분의 세포를 긁어내어 단백질 분해효소가 들어 있는 조직용해버퍼를 이용하여 조직을 용해시켜 DNA를 분리해내어 사용하였다.

담즙의 경우, 담즙 200㎕으로부터 DNA를 High Pure Viral Nucleic Acid Kit(Roche)를 제조자의 방법대로 사용하여 추출하였으며, 사용시까지 -20℃에 보관하였다.

유전체 DNA 변형(Modification)

양성 대조군 DNA는 CpG 메틸트랜스퍼라제 (M. SssI, NewEngland Biolabs, Inc.)를 제조자의 방법대로 처리하여 준비하였다. 요약하면 20㎕의 유전체 DNA에 28U의 SssI을 실온에서 12시간 반응한 후 정체하여 사용하였다.

소디움 바이설파이트를 이용한 바이설파이트 변형을 위해 상기 추출한 DNA를 DNA Methylation kit (ZYMO Research Inc.)를 제조자의 방법대로 사용하여 처리하였다. 요약하면, 1의 유전체 DNA를 상기 키트에 포함된 M-Dilution 용액 5㎕를 추가한 후, 증류수를 이용하여 총량이 50㎕가 되게 하였다. 이어 37℃에서 15분동안 방치한 후 키트에 포함된 CT (Cytosin to Thymine) 변환시약 100㎕를 첨가한 후, 혼합한 후 다음과 같이 반응을 수행하였다: 95℃ 1min → 50℃ 2hr → 95℃ 40sec → 50℃ 3hr → 95℃ 40sec → 50℃ 5hr → 95℃ 40sec → 50℃ 2~6hr. 이어 시료를 4℃에서 10분간 방치한 후 키트에 포함된 M-Binding Buffer 400㎕로 처리된 컬럼에 로딩한 후, 10,000xg에서 30초 동안 원심분리하였다. 이어 M-Wash 완충액 100㎕를 컬럼에 넣고 10,000xg에서 30초 동안 원심분리하여 용액을 제거하였다. 이어 키트에 포함된 M-Desulphonation 완충액 200㎕를 컬럼에 넣고 15~20분간 상온에 방치 한 후 10,000xg에서 30초 동안 원심분리하였다. 이어 M-Desulphonation 완충액 200㎕를 컬럼에 넣고 10,000xg에서 30초 동안 원심분리하는 과정을 2회 수행하여 용액을 제거하였다. 이어 여기에 키트에 포함된 M-Elution 완충액 10㎕를 컬럼에 로딩한 후 분간 방치하고 10,000xg에서 30초 동안 원심분리하였다. 용출과정을 1회 더 수행하였다. 이어 용출된 DNA 용액은 사용시까지 -20℃ 또는 -70℃에 보관하였다.

이어 바이설파이트로 변형된 DNA의 양은 Alu 특이적 프라이머/프로브를 사용한 정량 PCR 기계(Applied Biosystems 장비)를 이용하여 분석하였다. 사용된 프라이머는 forward 5' GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA 3'; Reverse 5' ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA 3'. PCR 조건을 다음과 같다: 95℃ 10분, 95℃ 20초 → 59℃ 40초 : 50-주기. 상기 정량 PCR을 수행하면 Ct (Threshold Cycle, 정량 PCR 수행으로 검출되는 형광신호가 문턱값(threshold) 즉, 배경값을 넘을 때의 사이클 수)이 도출되며, Ct 값을 18에 맞추어, 각 시료의 양을 멸균증류수를 이용하여 Methylight 분석에 사용하였다.

Methylight 분석을 통한 메틸화 상태 분석

Methylight 분석을 위해 종전 (Kang GH, et al.,. Lab Invest 2008, 88:161170)에 위암 및 대장암에서 분석된 총 177개의 DNA 메틸화마커 중에서 대조군(종양질환이 아닌 정상 조직)과 비교하여 과메틸화 정도 및 빈도가 높은 59개의 CpG 메틸화 마커를 선별하였으며, 20건의 EHC 및 20건의 결석 또는 비결석 담낭염시료를 이용하여 Methylight 분석을 수행하였다. Methylight 분석은 종전에 기술된대로 수행되었다 (Lee HS et al., Clin Cancer Res 2009, 15:812820). 59개의 CpG 메틸화 마커 분석에 사용된 각 유전자의 프라이머와 프로브는 표 1a 내지 c와 같다.

[표 1a]

[표 1b]

[표 1c]

요약하면, 바이설파이트로 변형된 부위에 특이적으로 결합하는 두 세트의 프라이머쌍과 프로브를 사용하였다. 첫 번째 세트는 각 마커에 특이적이고, 두 번째 세트는 사용한 DNA 양 및 증폭에 대한 노말라이제이션 대조군으로 메틸화와 관련없는 Alu에 특이적인 프라이머쌍과 프로브를 사용하였다. M.SssI 으로 처리된 DNA는 특정 좌위에서의 PMR (Percentage of Methylated Reference)의 계산을 위해 콘스탄트 참조 (constant reference)로 사용되었다. PMR은 다음과 같이 정의된다: 100 x (검출대상유전자 메틸화반응값/Alu 반응값)_시료/(검출대상유전자 메틸화반응값/Alu 반응값)_{M.SssI-참조군}. 이 계산을 통해 PMR 값이 >4인 경우, 메틸화된 것으로 판단하며, 이는 종전연구에서 CDKN2A, MLH1, 및 MGMT 의 메틸화 분석을 통해 확인된 수치이다 (Ogino S, et al., J Mol Diagn 2006, 8:209217).

민감도와 특이성 100%인 마커의 선별을 위한 알고리즘의 개발

후술하는 바와 같이 선별된 17개의 마커 중에서 최적의 민감도와 특이성을 갖는 마커 세트를 선별하기 위하여 다음의 10단계를 포함하는 알고리즘을 개발하였다. i) 각 시료 및 Methylight 분석의 PMR 값은 컷오프 값에 따라 0 또는 1로 변환 (C, C = 1.0, 2.0, 3.0, 또는 4.0) (특정 시료 및 Methylight 분석의 PMR 값 C를 초과하면 1이고 그렇지 않은 경우 0이 부여됨); ii) 조합 마커의 수를 선별: (k, k = 2, 3, 4, 또는 5); iii) 최소 양성 마커 수 선별(s, s = 1, -, k); iv) k 마커를 17개 마커 중에서 선별하고, 이들 선별된 k 마커에 대한 바이너리 값의 합을 각 시료 별로 생성하고, 합에 따라, 각 시료를 다음의 기준으로 "암" 또는 "정상"으로 분류: s = 1, -, k일 때, 양성 마커의 합이 s와 같거나 크면, 암으로분류, 그렇지 않은 경우, 정상으로 분류하고, 이어 미분류율, 정확도, 민감도 및 특이성을 수득; v) iv의 과정을 k 마커들의 모든 가능한 조합에 대하여 수행; vi) v)의 결과에 따라 최고의 민감도와 100% 특이성을 나타내는 마커의 조합을 선별; vii) 단계 vi)의 최종 모델을 검증 세트에 적용하고, 미분류율, 정확도, 민감도 및 특이성을 수득; viii) 단계 iv)부터 vii)의 과정을 모든 s(s = 1, -, k)에 대하여 수행; ix) 단계 ii)부터 단계 viii) 과정을 모든 k (k = 2, 3, 4, 5)에 대하여 수행; x) 단계 I)부터 단계 ix) 의 모든 과정을 C (C = 1.0, 2.0, 3.0, 또는 4.0)에 대하여 반복.

통계분석

상기 알고리즘을 적용하는 모든 통계분석은 R program (Ver 2.10.1) (http://www.r-project.org; last accessed December 14, 2009)과 SAS software (Ver 9.2) (SAS Institute, USA)를 이용하여 수행되었다. 시험군과 대조군간의 개별 메틸화 마커의 PMR 값은 Two-tailed Student's Test 및 Mann-Whitney Utest를 사용하여 분석하였다. 각 마커의 메틸화 빈도는 Two-tailed Fisher's exact test를 이용하여 분석하였다. Two-tailed McNemar test는 3-유전자 Methylight 패널과 담즙 세포분석의 민감도 간의 차이의 유의성 분석에 사용하였다. P < 0.05 값을 통계적으로 유의한 것으로 하였다.

실시예 2 암 특이적 DNA 메틸화 마커의 선별

상술한 바와 같이 20개의 EHC 시료 및 20개의 비-종양성 시료에 대하여 59개의 CpG 아일랜드의 MethyLight 분석을 수행하여 PMR 값을 결정한 후, 각 좌위의 시험군과 대조군에 대하여 메틸화 정도(level) 및 빈도를 조사하였다 (도 1 참조).

그 결과 다음 21개의 좌위에서 대조군과 비교하여 메틸화 정도(level) 및 빈도의 측면에서 통계적으로 유의한 차이 (과메틸화)가 관찰되었다 (P< 0.05; Students t-test 및 Mann-Whitney test로 계산): TWIST1, HOXA1, SFRP1, PENK, GRIN2B, CDH13, NEUROG1, TMEFF2, TIMP3, MINT2, CCND2, RASSF1A, RUNX3, DLC1, CRABP1, GATA3, MT1G, SEZ6L, SOCS3, THBS1, 및 BCL2. 결과는 도 2의 A에 기재되어 있다. 그러나 이 중 DLC1, MT1G, 및 THBS1의 3개의 유전자는 EHC에서 평균 PMR 값이 <1 이었다. 또한 메틸화 빈도를 측정한 결과 TMEFF2, DLC1, MT1G, 및 THBS1 4개의 좌위를 제외한 17개 유전자에서 통계적으로 유의한 과메틸화가 관찰되었다 (도 2의 B 참조) (P <0.05, Fishers exact test). 따라서 17개의 마커를 담관선암에 특이적 마커로 선별하였다.

실시예 3 암 특이적 DNA 메틸화 마커에 대한 메틸화 분석

상술한 바와 같이 선별된 17개의 마커에 대하여 실시예 1의 방법대로 두 세트의 시료 (트레이닝 세트: EHC 20, 대조군 10; 검증 세트: EHC 33, 대조군 12) Methylight 분석을 수행하였다. 결과는 도 3의 A와 B에 기재되어 있다. 분석값에 대하여 메틸화 양성은 PMR 컷오프 값 (C)을 1.0, 2.0, 3.0, 또는 4.0로 정하고, 실시예 1에서 기술한 10 단계의 알고리즘을 수행하였다. 이 과정을 통해 특정 k 및 C 조합에서 100% 특이성 및 최고의 민감도를 나타내는 4 종류의 마커 조합을 선별하였다. 이들은 PMR = 1.0 에서 컷오프 값이 다른 값과 비교하여 가장 좋을 결과를 나타냈기 때문에, C 값을 0.8, 1.0, 1.2, 또는 1.5.로 둔 후, 10 단계 알고리즘을 추가로 수행하였다. 그 결과 특정 k 및 C값에서 100% 특이성과 최적의 민감도를 나타낸 5 종류의 마커 조합 (A, B, C, D, 및 E)을 선별하였으며, 자세한 수치는 표 2와 같다.

[표 2]

또한 아래 표 3에 나타난 바와 같이 본원의 방법은 세포병리학 분석과 비교하여 민감도 및 특이도에서 매우 우수하다. 세포병리를 통한 진단의 경우 EHC 유래의 담즙에서 비정형(atypia) 또는 선암(adenocarcinoma)으로 진단된 것이 40%이고 (즉, 민감도가 40%), 담낭염 또는 담도염 유래의 담즙에서는 비정형 또는 선암으로 진단된 경우가 없어 세포병리학적 검사의 특이도가 100%로 조사되었으나, 본 방법을 이용한 경우는 가장 민감도가 낮은 패널 A의 경우에도 트레이닝세트에서 민감도가 60%이고 특이도는 100%이었으며, 검증 ?의 경우 세포병리학적 분석의 경우 민감도는 46%이었으나, 패널 A의 경우, 민감도가 73.5% 특이도가 100%로 우수하였다. 즉, 조사된 패널 중 민감도가 가장 낮은 A 패널 조차도 검증 시험에서 세포병리와 비교하여 높은 민감도를 나타냈다. (73.5% vs. 46%, P 0.021, two-tailed McNemar test).

[표 3]

표 2의 패널 중에서 A, B, C 및 E의 경우는 메틸화 양성 및 음성 값을 정하는데 PMR 값으로 1이 컷오프 (PMR >1.0 및 PMR 1.0, 각각 )으로 사용되었다. 이 패널을 사용하여 Methylight를 이용한 검증 분석을 새로운 시료를 사용하여 수행하였다 (EHC= 24, 만성 담낭염 16). 결과는 표 4에 기재되어 있으며, 100 % 특이도와 높은 민감도를 나타낸다.

[표 4]

실시예 4 세포병리 및 메틸화 분석을 통한 진단

도 4에 나타난 바와 같이, 패널 E 마커 (CCND2, CDH13, GRIN2B, RUNX3, 및 TWIST1, C 1.0, s 1)의 경우, 트레이닝세트에서 70%의 민감도를 보였고, 세포병리 결과에서 진단하였던 EHC 2예를 진단하지 못하였다 (그러나, 세포병리검사는 패널 E마커가 EHC로 진단하였던 16예 중, 8예를 진단하지 못하였음). 검증세트에서는 패널 E마커는 73.5%의 민감도를 보였고, 세포병리검사에서 진단하였던 3예를 진단하지 못하였다 (패널 E마커가 EHC로 진단하였던 25예 중 12예를 세포병리검사는 진단하지 못하였음). 세포병리검사와 패널 E를 함께 이용할 경우, EHC진단율을 9%-10%정도 더 개선할 수 있을 것으로 판단되었다.

위에서 본원의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자에 의해 다양한 변형 또는 개량된 것 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

생물학적 시료에서 TWIST1 (twist family bHLH transcription factor 1), CDH13 (cadherin 13), CCND2 (cyclin D2), GRIN2B (glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 2B) 및 RUNX3 (runt-related transcription factor 3) 유전자 조합의 각 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및
대조군과 비교하여 상기 각 유전자의 메틸화 상태의 변화를 간외담관선암과 연관시키는 단계를 포함하는, 간외담관선암의 진행단계의 판단 또는 진단을 위해 정보를 제공하기 위한, 간외담관선암 특이적 마커에 대한 메틸화 분석 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 담즙 또는 혈액인 것인, 메틸화 분석 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 메틸화는 상기 유전자 또는 그 프로모터의 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브에서 검출되는 것인, 메틸화 분석 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 메틸화는 상기 유전자를 메틸화 감응성 제한효소와 접촉하여 검출되는 것으로, 상기 제한효소는 메틸화된 제한효소 부위를 선택적으로 절단하고, 상기 절단은 상기 유전자의 메틸화를 나타내는 것이거나, 또는
상기 제한효소는 비-메틸화 제한효소 부위를 선택적으로 절단하고, 상기 절단은 상기 유전자의 비-메틸화를 나타내는 것인, 메틸화 분석 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 메틸화 부위를 선택적으로 절단하는 제한효소는 AccIII, BanI, BstN I, MspI, 또는 XmaI를 포함하고, 상기 비-메틸화 부위를 선택적으로 절단하는 제한효소는 AccII, Ava, BssHII, BstU I, HpaII, 또는 NotI을 포함하는 것인, 메틸화 분석 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 메틸화는 상기 유전자를 비-메틸화 사이토신 잔기를 선택적으로 변형시키거나, 또는 메틸화 사이토신 잔기를 선택적으로 변형시키는 화합물과 접촉하고, 상기 접촉에 의해 생성된 산물의 검출에 의한 것인, 메틸화 분석방법.
제 7 항에 있어서, 상기 검출은 메틸화 특이적 증폭 방법에 의한 것으로, 상기 증폭방법은 변형된 비-메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하나, 비변형된 메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하지 않는 적어도 하나의 프라이머를 이용하여 증폭산물을 생성하거나, 또는
비변형된 메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하나, 변형된 비-메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하지 않는 적어도 하나의 프라이머를 이용하여 증폭산물을 생성하는 것인, 메틸화 분석 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 증폭산물은 (a) 변형된 비-메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하나, 비변형된 메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하지 않는 제1 올리고뉴클레오타이드 프로브; (b) 비변형된 메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하나, 변형된 비-메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드 모티브를 포함하는 서열에는 결합하지 않는 제2 올리고뉴클레오타이드 프로브 중 하나 이상을 이용하여 검출되는 것인, 메틸화 분석 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 검출은 교잡, 증폭, 서열분석, 전기영동, 크로마토그래피 및 질량분광분석기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 수행되는 것인, 메틸화 분석 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 검출은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 서열분석으로 수행되는 것인, 메틸화 분석 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 화합물은 하이드라진 또는 바이설파이트 이온이고, 상기 하이드라진과 접촉된 유전자를 피페리딘으로 절단하고, 상기 바이설파이트 이온과 접촉된 유전자를 알칼리로 처리하는 것을 추가로 포함하는 것인, 메틸화 분석방법.
간외담관선암의 진행단계의 판단 또는 진단을 위한, 생물학적 시료에서의 메틸화 분석용 키트로서, 상기 키트는 메틸화된 사이토신 잔기는 변형시키나, 비-메틸화된 사이토신 잔기는 변형시키지 않는 시약; 또는 비-메틸화된 사이토신 잔기는 변형시키나, 메틸화된 사이토신 잔기는 변형시키지 않는 시약; 및 TWIST1 (twist family bHLH transcription factor 1), CDH13 (cadherin 13), CCND2 (cyclin D2), GRIN2B (glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 2B) 및 RUNX3 (runt-related transcription factor 3) 유전자 조합의 각 유전자의 전사개시 부위로부터 1000bp 이내 부위에 결합하여 증폭할 수 있는 한 세트의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 메틸화 분석용 키트.
제 13 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 담즙 또는 혈액인, 메틸화 분석용 키트.
제 13 항에 있어서, 상기 키트는 추가로 (a) 변형된 비-메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 서열에는 결합하나, 비변형된 메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 서열에는 결합하지 않는 제1 올리고뉴클레오타이드; 또는 (b) 비변형된 메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 서열에는 결합하나, 변형된 비-메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 서열에는 결합하지 않는 제2 올리고뉴클레오타이드 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 메틸화 분석용 키트.
제 13 항에 있어서, 상기 키트는 핵산 증폭용 DNA 폴리머라제를 추가로 포함하는 것인, 메틸화 분석용 키트.