KR20240053099A - 위암 조기진단을 위한 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 위암 조기진단을 위한 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 위암 및/또는 위선종 환자의 혈액에서 7종의 특이적인 엑소좀 miRNA(exo-miR 320e, exo-miR 214-3p, exo-miR 1290, exo-miR 4732-5p, exo-miR 1228-5p, exo-miR 483-3p 및 exo-miR 483-5p)를 발굴하였다. 본 발명에 따른 엑소좀 miRNA를 이용하는 경우, 위암 및/또는 위선종을 정확하고 신속하게 조기 진단할 수 있다. 나아가, 본 발명의 진단 방법은 혈액을 이용함으로써, 통증 및/또는 합병증의 발생이 적고, 반복적 시행이 가능함을 확인하였는 바, 상기 엑소좀 miRNA를 위암 및/또는 위선종의 조기 진단을 위한 바이오마커, 조기 진단 조성물, 키트 등으로 활용할 수 있다.
Description
위암 조기진단을 위한 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
암을 조기에 진단하고 예후를 예측하며, 치료반응을 모니터링하기 위한 노력은 오랫동안 지속되어 왔다. 최근에는 정밀 의학의 개념이 대두되면서 질병의 유전적 기초에 대한 이해를 바탕으로 환자 개인별 맞춤치료를 제공하기 위하여 표적 표지자에 대한 관심도 높아지고 있는 추세이다.
그러나, 아직까지 암을 정확히 진단 및 예측할 수 있는 방법이 없고, 암 환자에서 이러한 유전적 변이를 확인하는 최소 침습적인 방법에 대한 해결책도 없으며, 침습적 방법으로 병변의 연속적이고 반복적인 생검만이 암을 진단하고 맞춤형 유전정보를 얻을 수 있는 방법이다.
최근에는 혈액 내의 CTCs, cfDNA, EVs 등을 얻어 분석을 시행하는 연구가 활발히 진행되고 있고, 이런 순환 종양 표지자들은 조기 진단 및 예후 예측을 넘어서 게놈/면역 프로필을 결정하고, 반응 및 약물내성을 모니터링 하며, 치료제 선택을 하는 등 정밀의학의 기본이 될 수 있는 잠재력을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 위암 및/또는 위선종 환자의 혈액에서 엑소좀 miRNA를 분리한 후 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 비교 분석함으로써, 위암 및/또는 위선종의 진단을 위한 특이적인 엑소좀 miRNA를 발굴하였다.
일 양상은 exo-miR 320e, exo-miR 214-3p, exo-miR 1290, exo-miR 4732-5p, exo-miR 1228-5p, exo-miR 483-3p 및 exo-miR 483-5p으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 엑소좀 miRNA(exosome micro RNA)를 포함하는 위암 또는 위선종 조기 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 진단용 조성물을 포함하는 위암 또는 위선종 조기 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및
상기 분리된 엑소좀 내의 exo-miR 320e, exo-miR 214-3p, exo-miR 1290, exo-miR 4732-5p, exo-miR 1228-5p, exo-miR 483-3p 및 exo-miR 483-5p으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 엑소좀 miRNA(exosome micro RNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 위암 또는 위선종 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 exo-miR 320e, exo-miR 214-3p, exo-miR 1290, exo-miR 4732-5p, exo-miR 1228-5p, exo-miR 483-3p 및 exo-miR 483-5p으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 엑소좀 miRNA(exosome micro RNA)를 포함하는 위암 또는 위선종 조기 진단용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "엑소좀(exosome)"은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "miRNA(micro RNA)"는 식물, 동물, 바이러스 등에서 발견되는 약 22개의 뉴클레오타이드로 구성된 작은 비발현 RNA 분자를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 엑소좀 miRNA는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 4의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 7의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 엑소좀 miRNA는 위암 환자의 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수액, 양막액, 소변, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 분리되는 것일 수 있고, 구체적으로는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포 및 타액으로 이루어진 군에서 분리되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 혈액에서 분리되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "위선종(gastric adenoma)"은 위 점막에 이형성, 즉 이상 변성 (종양화 변화)이 생긴 것을 의미하고, 진행 정도에 따라 저도 위선종, 고도 위선종으로 나누어져 있으며, 위암의 전 단계로 불린다.
본 명세서에서 용어 "위암(gastric cancer)"이란 위에서 발생하는 암종(악성 종양)을 총칭하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "진단"이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 위암 또는 위선종의 진행 수준 등을 판단하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "조기 진단"이란 암이 전이되기 전에 암의 가능성을 발견하는 것을 의미하고, 특히 검체 조직 또는 세포에서 형태학적 변화가 관찰되기 전에 발견하는 것으로, 예를 들면 세포가 암화되기 전 초기 단계에서 그 형태의 변화가 일어날 가능성 높은 것을 말한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물을 이용하는 경우 엑소좀 miRNA를 바이오마커로 이용하여 위선종 및 위암을 효과적으로 진단할 수 있으며, 구체적으로 저도 위선종, 고도 위선종 및 초기 위암의 조기 진단에 이용할 수 있다.
본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 위암 또는 위선종 조기 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 샘플로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 상기 키트는 Real-time PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. Real-time PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명은 개체로부터 분리된 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및
상기 분리된 엑소좀 내의 exo-miR 320e, exo-miR 214-3p, exo-miR 1290, exo-miR 4732-5p, exo-miR 1228-5p, exo-miR 483-3p 및 exo-miR 483-5p으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 엑소좀 miRNA(exosome micro RNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 위암 또는 위선종 조기 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "개체"란 포유류일 수 있고, 예를 들면 마우스, 쥐, 고양이, 기니피그, 햄스터, 개, 원숭이, 침팬지, 인간 등일 수 있으며, 구체적으로는 인간일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수액, 양막액, 소변, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포 및 타액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로는 혈액일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 엑소좀 miRNA는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 4의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 7의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계는 차세대 염기서열 분석(NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), 실시간 정량중합효소연쇄반응(RT-qPCR), 역 중합효소 연쇄반응(Inverse PCR) 및 RNase 보호분석법(RNase RPA)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 이용하여 수행되는 것일 수 있고, 구체적으로는 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), 실시간 정량중합효소연쇄반응(RT-qPCR) 및 역 중합효소 연쇄반응(Inverse PCR)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 이용하여 수행되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 측정된 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 하기 (a) 또는 (b)와 같이 비교하여 위암 또는 위선종으로 진단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
(a) 상기 측정된 시료의 엑소좀 miRNA의 발현 수준이 대조군의 엑소좀 miRNA의 발현 수준 대비 증가하는 경우, 위암으로 진단;
(b) 상기 측정된 시료의 엑소좀 miRNA의 발현 수준이 대조군의 엑소좀 miRNA의 발현 수준 대비 증가하고, 위암군의 엑소좀 miRNA의 발현 수준 대비 감소하는 경우, 위선종으로 진단.
본 명세서에서 용어 "대조군"이란 위암 또는 위선종이 발생하거나 발생할 수 있는 지표 등이 나타나지 않는 정상인을 의미하고, 용어 "위암군"이란 위암이 발생한 환자를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 측정된 시료의 엑소좀 miRNA의 발현 수준이 대조군의 엑소좀 miRNA의 발현 수준 대비 5배, 10배 또는 15배 이상인 경우, 위암으로 진단하고, 상기 측정된 시료의 엑소좀 miRNA의 발현 수준이 대조군의 엑소좀 miRNA의 발현 수준 대비 5배, 10배 또는 15배 증가하고, 위암군의 엑소좀 miRNA의 발현 수준 대비 1.5배, 3배 또는 5배 감소하는 경우, 위선종으로 판단할 수 있다.
본 발명자들은 위암 및/또는 위선종 환자의 혈액에서 7종의 특이적인 엑소좀 miRNA(exo-miR 320e, exo-miR 214-3p, exo-miR 1290, exo-miR 4732-5p, exo-miR 1228-5p, exo-miR 483-3p 및 exo-miR 483-5p)를 발굴하였다. 본 발명에 따른 엑소좀 miRNA를 이용하는 경우, 위암 및/또는 위선종을 정확하고 신속하게 조기 진단할 수 있다. 나아가, 본 발명의 진단 방법은 혈액을 이용함으로써, 통증 및/또는 합병증의 발생이 적고, 반복적 시행이 가능함을 확인하였는 바, 상기 엑소좀 miRNA를 위암 및/또는 위선종의 조기 진단을 위한 바이오마커, 조기 진단 조성물, 키트 등으로 활용할 수 있다.
도 1은 조기 위암 진단 방법을 나타내는 도이다.
도 2는 위암 및 위선종 환자 혈액의 엑소좀 miRNA의 분석 및 분류 방법을 나타낸 도로서, 도 2a는 정상 위에서 위암으로 진행되는 과정을 나타낸 도이고, 도 2b는 정상인, 저도 위선종 환자, 고도 위선종 환자 및 조기 위암 환자의 혈액에서 엑소좀 miRNA를 확인하기 위해 분석 샘플링한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 중요한 데이터(significant data)에 대하여 발현 수준(정규화된 값(normalized value))이 유사한 샘플 및 성숙 miRNA(Mature miRNA)를 그룹화 하는 계층적 클러스터 분석(HCA: Hierarchical Clustering analysis)를 수행하고, 그 결과를 히트맵(Heatmap)으로 나타낸 도로서, 도 3a는 조기 위암 환자와 저도 위선종 환자의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 3b는 조기 위암 환자와 고도 위선종 환자의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 3c는 저도 위선종 환자와 고도 위선종 환자의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 3d는 저도 위선종 환자와 정상인의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 3e는 고도 위선종 환자와 정상인의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 3f는 조기 위암 환자와 정상인의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 혈장 유래 엑소좀 miRNA의 유사성, 차등 발현 및 miRNA 프로파일링 결과를 나타내는 도로서, 도 4a는 다차원적 스케일링(MDS: Multidimensional Scaling)을 이용하여 엑소좀 miRNA의 유사성을 확인한 결과를 나타내는 도이고, 도 4b는 엑소좀 miRNA의 염기 정보를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 5은 조기 위암 환자, 위선종 환자(저도 및 고도) 및 정상인의 혈장 유래 엑소좀의 차등 발현 및 miRNA의 프로파일링을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 조기 위암 환자, 위선종 환자(저도 및 고도) 및 정상인의 혈장 유래 엑소좀의 차등 발현 및 miRNA의 프로파일링을 확인한 결과를 나타내는 도로서, 도 6a는 저도 위선종 환자와 정상인의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 6b는 조기 위암 환자, 위선종 환자 및 정상인의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 6c는 조기 위암 환자, 고도 위선종 환자와 저도 위선종 환자의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 정상인, 위선종 환자 및 조기 위암 환자의 혈액에서 엑소좀을 분리하고, 특징을 확인한 결과를 나타내는 도로서, 도 7a 및 도 7d는 정상인의 엑소좀의 특징을 확인한 결과를 나타내는 도이고, 도 7b 및 도 7e는 위선종 환자의 엑소좀의 특징을 확인한 결과를 나타내는 도이고, 도 7c 및 도 7f는 조기 위암 환자의 엑소좀의 특징을 확인한 결과를 나나태는 도이다.
도 8은 정상인, 위선종 환자 및 조기 위암 환자의 엑소좀 마커의 발현을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 총 2,565개의 miRNA 중 카운트 값이 0인 miRNA 제외한 472개의 miRNA에 대하여 ｜폴드 변화 (FC)｜≥2 및 p-값＜0.05의 기준으로 miRNA를 필터링한 결과를 나나태는 도이다.
도 10은 총 2,565개의 miRNA 중 카운트 값이 0인 miRNA 제외한 472개의 miRNA에 대하여 ｜폴드 변화 (FC)｜≥2 및 p-값＜0.05의 기준으로 miRNA를 필터링한 결과에서 ｜폴드 변화 (FC)｜≥10 및 p-값＜0.05의 기준으로 miRNA를 필터링한 결과를 나타내는 도이다.
도 11은 조기 위암 환자, 저도 위선종 환자, 고도 선종 환자 및 정상인의 혈장 엑소좀에서 7개의 miRNA 발현 수준을 확인한 결과를 나타내는 도로서, 도 11a는 혈장 샘플 내 miRNA의 상대적인 발현 수준을 내부 대조군으로 miR-191을 이용한 2-△△Ct를 통해 정규화한 결과를 나타내는 도이고, 도 11b는 상기 도 11a의 결과를 바탕으로, 혈장 샘플 내 miRNA의 AUC 값을 나타내는 도이다.
도 2는 위암 및 위선종 환자 혈액의 엑소좀 miRNA의 분석 및 분류 방법을 나타낸 도로서, 도 2a는 정상 위에서 위암으로 진행되는 과정을 나타낸 도이고, 도 2b는 정상인, 저도 위선종 환자, 고도 위선종 환자 및 조기 위암 환자의 혈액에서 엑소좀 miRNA를 확인하기 위해 분석 샘플링한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 중요한 데이터(significant data)에 대하여 발현 수준(정규화된 값(normalized value))이 유사한 샘플 및 성숙 miRNA(Mature miRNA)를 그룹화 하는 계층적 클러스터 분석(HCA: Hierarchical Clustering analysis)를 수행하고, 그 결과를 히트맵(Heatmap)으로 나타낸 도로서, 도 3a는 조기 위암 환자와 저도 위선종 환자의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 3b는 조기 위암 환자와 고도 위선종 환자의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 3c는 저도 위선종 환자와 고도 위선종 환자의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 3d는 저도 위선종 환자와 정상인의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 3e는 고도 위선종 환자와 정상인의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 3f는 조기 위암 환자와 정상인의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 혈장 유래 엑소좀 miRNA의 유사성, 차등 발현 및 miRNA 프로파일링 결과를 나타내는 도로서, 도 4a는 다차원적 스케일링(MDS: Multidimensional Scaling)을 이용하여 엑소좀 miRNA의 유사성을 확인한 결과를 나타내는 도이고, 도 4b는 엑소좀 miRNA의 염기 정보를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 5은 조기 위암 환자, 위선종 환자(저도 및 고도) 및 정상인의 혈장 유래 엑소좀의 차등 발현 및 miRNA의 프로파일링을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 조기 위암 환자, 위선종 환자(저도 및 고도) 및 정상인의 혈장 유래 엑소좀의 차등 발현 및 miRNA의 프로파일링을 확인한 결과를 나타내는 도로서, 도 6a는 저도 위선종 환자와 정상인의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 6b는 조기 위암 환자, 위선종 환자 및 정상인의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이고, 도 6c는 조기 위암 환자, 고도 위선종 환자와 저도 위선종 환자의 miRNA를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 정상인, 위선종 환자 및 조기 위암 환자의 혈액에서 엑소좀을 분리하고, 특징을 확인한 결과를 나타내는 도로서, 도 7a 및 도 7d는 정상인의 엑소좀의 특징을 확인한 결과를 나타내는 도이고, 도 7b 및 도 7e는 위선종 환자의 엑소좀의 특징을 확인한 결과를 나타내는 도이고, 도 7c 및 도 7f는 조기 위암 환자의 엑소좀의 특징을 확인한 결과를 나나태는 도이다.
도 8은 정상인, 위선종 환자 및 조기 위암 환자의 엑소좀 마커의 발현을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 총 2,565개의 miRNA 중 카운트 값이 0인 miRNA 제외한 472개의 miRNA에 대하여 ｜폴드 변화 (FC)｜≥2 및 p-값＜0.05의 기준으로 miRNA를 필터링한 결과를 나나태는 도이다.
도 10은 총 2,565개의 miRNA 중 카운트 값이 0인 miRNA 제외한 472개의 miRNA에 대하여 ｜폴드 변화 (FC)｜≥2 및 p-값＜0.05의 기준으로 miRNA를 필터링한 결과에서 ｜폴드 변화 (FC)｜≥10 및 p-값＜0.05의 기준으로 miRNA를 필터링한 결과를 나타내는 도이다.
도 11은 조기 위암 환자, 저도 위선종 환자, 고도 선종 환자 및 정상인의 혈장 엑소좀에서 7개의 miRNA 발현 수준을 확인한 결과를 나타내는 도로서, 도 11a는 혈장 샘플 내 miRNA의 상대적인 발현 수준을 내부 대조군으로 miR-191을 이용한 2-△△Ct를 통해 정규화한 결과를 나타내는 도이고, 도 11b는 상기 도 11a의 결과를 바탕으로, 혈장 샘플 내 miRNA의 AUC 값을 나타내는 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 위암 환자 혈액 엑소좀(exosome)에서 엑소좀 miRNA(exosome micro RNA) 마커의 분리
위암(gastric cancer) 환자 혈액 엑소좀(exosome)에서 특정 엑소좀 miRNA(exosome micro RNA) 마커를 확인하기 위해 정상인(healthy control) 5명, 저도(Low Grade Dysplasia) 위선종(gastric adenoma) 환자 8명, 고도(High Grade Dysplasia) 위선종 환자 3명 및 조기 위암(early gastric cancer) 환자 7명의 혈액에서 엑소좀 miRNA를 분리하였다(도 1 및 도 2). 구체적으로, 상기 환자들의 말초혈액 샘플 3 ml에서 혈장을 분리하기 위해 800 x g로 10분간 15℃에서 원심분리하였다. 혈장 샘플(300 ul)에 3 ul의 트롬빈(thrombin)을 첨가한 후 새로운 튜브에 옮겨 15℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 이후 10,000 rpm으로 5분간 원심분리하였으며, 상층액의 250 ul를 새로운 튜브에 옮긴 후, 63 ul의 ExoQuick 용액을 첨가하였다. 그 후, 4℃에서 30분간 인큐베이션하고, 1,500 x g로 30분간 4℃에서 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 모든 액체를 제거하기 위해 샘플 혼합물을 1,500 x g로 5분간 원심분리하였다. 나머지 엑소좀 펠릿(exosome pellet)을 1 x 인산염 완충 식염수 300 ul에 재현탁하였다.
2. 엑소좀 miRNA 마커의 염기 정보의 확인
(1) 엑소좀 miRNA의 시퀀싱 라이브러리(sequencing libraries) 구축
각각의 샘플로부터 분리된 총 RNA로 제조자의 프로토콜에 따라 SMARTer smRNA-Seq 키트 for Illumina(Takara Bio, San Jose, CA, USA)를 이용하여 시퀀싱 라이브러리 (sequencing libraries)를 구축하였다. 인풋 RNA는 올리고-(dT) 프라이머를 위한 프라이밍 시퀀스를 제공하기 위해 폴리아데닐화(polyadenylation)되었다. cDNA 합성은 각 첫 번째 가닥 cDNA 분자의 5’-말단에 어댑터 서열을 포함한 3’-smRNA dT 프라이머에 의해 프라이밍(priming)되었다. MMLV-derived PrimeScriptRT 역전사 효소가 RNA 주형 5’- 말단에 도달할 때, 민감도를 높이기 위해 잠금 핵산 기술로 강화된 SMART smRNA Oligo에 의해 결합된 비주형 뉴클레오타이드(nucleotide)를 추가하였다. 주형 교체 단계에서는, PrimeScriptRT 역전사 효소가 각 첫 번째 가닥 cDNA 분자의 3’-말단에 두 번째 어댑터 서열을 추가하기 위해 SMART smRNA Oligo를 주형으로 이용하였다. 다음 단계에서, PCR 증폭 도중 전체길이 Illumina 어댑터(샘플의 멀티플렉싱을 위한 인덱스 시퀀스 포함)를 첨가하였다. 전방향 PCR 프라이머는 SMART smRNA Oligo에 의해 첨가된 시퀀스와 결합하였고, 역방향 PCR 프라이머는 3’-smRNA dT 프라이머에 의해 첨가된 시퀀스와 결합하였다. 결과 cDNA 분자 라이브러리는 Illumina 유세포 위에 응집되기위해 필요한 시퀀스를 포함한다. 라이브러리는 Agilent Bioanalyzer(AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, USA)에서의 사이즈, 순도 및 농도를 검사하여 검증하였다. 라이브러리는 등몰(equimolar) 양으로 채워졌고 51 염기의 리드를 생성하기 위해 Illumina HiSeq 2500 기기로 시퀀싱하였다. 이미지 분해 및 품질 값 계산은 Illumina pipeline 모듈을 이용해 수행하였다.
(2) 엑소좀 miRNA의 클러스터 분석(HCA: Hierarchical Clustering analysis)
중요한 데이터(significant data)에 대하여, 발현 수준(정규화된 값(normalized value))이 유사한 샘플 및 성숙 miRNA(mature miRNA)를 그룹화 하는 계층적 클러스터 분석(HCA: Hierarchical Clustering analysis)를 수행하고, 그 결과를 히트맵(Heatmap)으로 나타내었다.
7개 엑소좀 miRNA의 발현 패턴을 확인하기 위해 계층적 클러스터링 분석을 수행했으며, 이를 기반으로 조기위암과 저도선종 혈액 그리고 조기위암과 고도선종 혈액의 엑소좀 miRNA 발현 패턴이 두 그룹으로 나뉘어지는 결과를 확인할 수 있었다 (도3a, 도3b). 그리고 고도선종과 저도선종 혈액 엑소좀 miRNA를 클러스터링 분석한 결과에서도 두 부분으로 나뉘는 것을 확인하였고 (도3c), 정상인 혈액과 저도선종, 고도선종, 조기 위암 혈액 엑소좀 miRNA를 비교한 결과를 계층적 클러스터링 분석을 한 결과에서도 엑소좀 miRNA 발현 패턴이 두 부분으로 나뉘는 것을 확인할 수 있었다 (도3d, 도3e, 도3f).
(3) 엑소좀 miRNA의 유사성 평가
엑소좀 miRNA의 유사성은 다차원적 스케일링(MDS: Multidimensional Scaling)를 통해 확인하였다(도 4a). 그 결과, 각군이 특정지점에서 집중되는 양상이며, 접기 변화(fold change) 값에 따른 유의미한 up/down count를 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 배수 변화에 따라 상향 조절된 염기와 하향 조절된 염기 정보를 확인하였고, 접기 변화(fold change) 값의 변화가 2 이상인 경우 (fold change≥2)를 기준으로 상향 조절된 유전자의 수는 위암 환자/정상 대조군에서 77개, 하향 조절된 유전자의 수는 66개임을 확인하였고, 고도 위선종 환자/정상 대조군에서 상향 조절된 유전자는 58개, 하향 조절된 유전자의 수는 45개임을 확인하였다(도 4b)
조기위암 환자와 고도선종, 저도선종 그리고 정상 대조군 4군의 혈액에서 엑소좀 miRNA 발현 패턴을 확인하기 위하여 클러스터링 하였다. 그 결과, 정상인 대조군과 조기위암, 고도선종, 저도선종과의 비교에서 정상인 대조군과 나머지 세군에서의 뚜렷한 차이를 보여줌으로써, 정상인 대조군과 위암으로 가는 과정에서의 엑소좀 miRNA의 차이가 있음을 확인하였다 (도 5).
또한, 정상 대조군과 저도선종의 비교, 정상 대조군과 선종, 조기위암 환자 혈액 엑소좀 miRNA를 클러스터링으로 비교하였다. 그 결과, 저도선종과 정상대조군의 클러스터 결과에서는 두 부분으로 뚜렷하게 나뉘는 것을 확인할 수 있었고 (도 6a), 또한 정상대조군과 선종과 조기 위암의 클러스터링 결과에서도 정상 대조군과 확연한 구분을 보여줌으로써 정상대조군에서 발현되는 엑소좀 miRNA를 확인할 수 있었다 (도 6b). 마지막으로, 조기위암과 고도 선종에서의 클러스터링 결과에서도 두 부분으로 구분되는 것을 확인하였다 (도 6c).
3. 엑소좀 miRNA 마커의 검출
(1) 엑소좀 miRNA의 시퀀싱 테스트(sequencing test)
상기 결과를 바탕으로 표적 유전자를 선정하고 검증하고자 하였다. 정상인, 위선종 환자 및 조기 위암 환자에서 발현된 엑소좀 miRNA를 검출하기 위해 시퀀싱 테스트(sequencing test)를 수행하였다.
그 결과, 정상인, 위선종 환자 및 조기 위암 환자의 혈액에서 엑소좀을 분리하여 분석한 결과 모든 군에서 엑소좀이 존재함을 확인하였다. 엑소좀의 크기인 50 - 200nm 크기의 소포체의 사이즈를 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis: NTA)을 사용하여 확인하였고, 엑소좀의 모양은 투과전자현미경(transmitted electron microscopy, TEM)으로 확인하여 이중막의 세포체를 확인하였다 (도 7a 내지 7f).
(2) 투과전자현미경을 이용한 엑소좀 miRNA 관찰
엑소좀 샘플을 1% 글루타르알데히드와 1:1 비율로 30분간 고정하였다. 고정된 샘플 6 ㎕를 탄소 코팅된 formvar 필름(EMS, Hatfield, PA, USA)과 함께 100-메쉬 구리 그리드에 파이펫하였고, 10분간 인큐베이션하였다. 초과한 액체는 블랏팅으로 제거하였다. 그리드는 100 ㎕의 증류수로 두 번 세척하였고, 초과한 액체는 블랏팅으로 제거하였다. 이후, 그리드를 1% 우라닐 아세테이트 30 ㎕로 12초간 처리하였다. 초과한 액체를 블랏팅으로 제거한 뒤, 샘플을 투과전자현미경(JEM-1200EXⅡ, JEOL, Japan)으로 관측하였다.
(3) 웨스턴 블럿을 이용한 엑소좀 마커의 발현 확인
엑소좀 단백질 농도를 BCA 단백질 어세이 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, WA, USA)를 이용해 측정하였다. 동일한 양의 단백질(50 ㎍)을 포함하는 엑소좀 샘플을 4 내지 15% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였고, 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 막으로 전송하였다. PVDF 막을 1%의 소 혈청 알부민 용액으로 15℃에서 1.5시간 동안 블락시켰고, 4℃에서 항-CD63(1:5000)(Abcam, Cambridge, UK), 항-TSG101(1:5000)(Abcam) 및 HSP70(1:5000)(Abcam)과 같은 일차 항체와 밤새(over night) 인큐베이션하였다. 다음 날, 막을 Tris 완충 식염수-tween 20 용액에 넣고 15℃에서 세척하였다. 이후 막에 이차 항체를 첨가하여 15℃에서 인큐베이션하였고, 강화된 화학발광 웨스턴 블럿 키트로 엑소좀 마커를 관찰하였다. 결과, 정상인, 위선종 환자 및 조기 위암 환자에서 엑소좀 마커가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
(4) Exo-check 엑소좀 항체 어레이
엑소좀 마커의 발현을 확인하기 위해, Exo-check 엑소좀 항체 어레이를 수행하였다. 구체적으로, 샘플 단백질 50 ㎍에 용해 완충액(1 x)를 첨가한 후 15℃에서 30분간 혼합한 후, 샘플 혼합물을 컬럼을 통해 여과하고, 5 mL의 블라킹 완충액으로 혼합한 뒤 막에 첨가하였다. 막을 4℃에서 흔들면서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 막을 두 번 세척한 뒤 5 mL의 관측 완충액을 첨가하였고, 15℃에서 흔들면서 30분간 인큐베이션한 후, 막을 세 번 세척하였다. 상기 Exo-check 엑소좀 항체 어레이 결과, 정상인, 위선종 환자 및 조기 위암 환자로 갈수록 엑소좀 마커인 PC, GM130, FLOT1, ICAM, ALIX, CD81, CD63, EpCAM, ANXA5 및 TSG101 중 PC, ICAM 및 TSG101의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 8b).
4. 위암 조기 진단을 위한 엑소좀 miRNA 마커 후보군 선별
전체 2,565개 성숙 miRNA 중에서 472개의 성숙 miRNA를 선별하고, DE(Differential expression) miRNA 분석을 통해 최종적으로 fold change 및 p-value에서 유의미한 7개의 조기 위암 마커 후보군을 선별하였다. 구체적으로, 총 2,565개의 miRNA 중 카운트 값이 0인 성숙 miRNA 제외한 472개의 miRNA에 대하여 생물정보학적 분석을 수행하였다. ｜폴드 변화 (FC)｜≥2 및 p-값＜0.05의 기준으로 472개의 miRNA를 필터링한 결과(도 9)에서, ｜폴드 변화 (FC)｜≥10 및 p-값＜0.05의 기준으로 miRNA를 필터링한 결과, 정상 및 선종 혈액과 비교하여 위암 혈액에서 차별적으로 발현되는 7개의 miRNA을 선별하였다(도 10).
5. 위암 조기 진단을 위한 최종적인 엑소좀 miRNA 마커 확인
현재 본원의 인체자원은행에 보유하고 있는 위암 및 위선종 혈액 샘플에서 엑소좀을 분리하고, 검증(validation)하였다. 조기 위암 환자 20명, 저도 위선종 환자 20명, 고도 위선종 20명 및 정상인 20명으로 전체 80명에서 검증하였다. 구체적으로, 세포 엑소좀 miRNA의 발현은 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)로 측정하였고, 제조사의 지시에 따라 miVana PARISTM(Thermo Fisher Scientific, Waltham,WA, USA)을 이용해 400 ㎕의 엑소좀 샘플로부터 총 RNA를 분리하였다. cDNA 합성은TaqMan miRNA RT 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 수행하였다. qRT-PCR(real time PCR)은 TaqMan® Universal PCR Master Mix II로 수행하였고, RG-6000 실시간 PCR을 이용해 실시간으로 모니터링하였다. Ct(cycle threshold)값은 Rotor-Gene 6000 series 소프트웨어 1.7(Corbett Research, Sydney, Australia)을 이용해 계산하였다. 혈장 샘플 내 miRNA의 상대적인 발현 수준은 내부 대조군으로 miR-191을 이용한 2-△△Ct를 통해 정규화한 결과, 위암 조기 진단 마커로 exo-miR 320e, exo-miR 214-3p, exo-miR 1290, exo-miR 4732-5p, exo-miR 1228-5p, exo-miR 483-3p 및 exo-miR 483-5p가 선종(adenoma)에서 점진적으로 암으로의 발현을 보여줌으로써, 위암의 조기 진단 마커로서 이용할 수 있음을 확인하였다(도 11a).
또한, 상기 도 11a에 나타낸 바와 같이, 정규화된 평균 Ct 값의 데이터를 이용하여 플롯팅된 7개의 엑소좀 miRNA는 건강한 대조군과 조기 위암 환자를 구별하였다. 구체적으로, ROC(Receiver-operating characteristic) 곡선과 AUC(areas under the curve)를 이용하여 조기 위암 환자를 정상인과 구별하기 위해 7개의 선택된 miRNA의 수준을 평가하였다. 조기 위암 환자를 정상인과 구별하기 위한 miRNA의 민감도, 특이성, 양성 및 음성 예측 값은 95% 신뢰 구간(confidence intervals)을 사용하여 나타내었다. 그 후, ROC 곡선을 확인하여 각 유전자에 대한 민감도를 확인하였고, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 7개 유전자의 모든 AUC 값에서 높은 감도를 나타냄을 확인하였다. 특히, exo-miR 320e, exo-miR 214-3p, exo-miR 1290, exo-miR 4732-5p, exo-miR 1228-5p, exo-miR 483-3p 및 exo-miR 483-5p 유전자의 민감도는 0.5보다 높은 값을 나타냄을 확인하였고, 상기와 같은 결과는 조기 위암에 대한 특이적 마커로서의 검증 결과를 의미한다. 상기 결과를 바탕으로 위암의 표적 표지자로의 활용 가능성을 제시한다.
Claims (8)
- exo-miR 320e, exo-miR 214-3p, exo-miR 1290, exo-miR 4732-5p, exo-miR 1228-5p, exo-miR 483-3p 및 exo-miR 483-5p으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 엑소좀 miRNA(exosome micro RNA)를 포함하는, 위암 또는 위선종 조기 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀 miRNA는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 4의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 7의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀 miRNA는 위암 또는 위선종 환자의 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수액, 양막액, 소변, 세포 조직액 및 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 분리된 것인, 조성물.
- 청구항 1의 진단용 조성물을 포함하는 위암 또는 위선종 조기 진단용 키트.
- 개체로부터 분리된 시료로부터 엑소좀(exosome)을 분리하는 단계; 및
상기 분리된 엑소좀 내의 exo-miR 320e, exo-miR 214-3p, exo-miR 1290, exo-miR 4732-5p, exo-miR 1228-5p, exo-miR 483-3p 및 exo-miR 483-5p으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 엑소좀 miRNA(exosome micro RNA)의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 위암 또는 위선종 조기 진단을 위한 정보제공방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 엑소좀 miRNA는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 4의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 5의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 서열번호 6의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 7의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 정보제공방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계는 차세대 염기서열 분석(NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), 실시간 정량중합효소연쇄반응(RT-qPCR), 역 중합효소 연쇄반응(Inverse PCR) 및 RNase 보호분석법(RNase RPA)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 이용하여 수행되는 것인, 정보제공방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 측정된 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 하기 (a) 또는 (b)와 같이 비교하여 위암 또는 위선종으로 진단하는 단계;를 더 포함하는, 정보제공방법,
(a) 상기 측정된 시료의 엑소좀 miRNA의 발현 수준이 대조군의 엑소좀 miRNA의 발현 수준 대비 증가하는 경우, 위암으로 진단;
(b) 상기 측정된 시료의 엑소좀 miRNA의 발현 수준이 대조군의 엑소좀 miRNA의 발현 수준 대비 증가하고, 위암군의 엑소좀 miRNA의 발현 수준 대비 감소하는 경우, 위선종으로 진단.
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