JP2010517582A - 結腸癌の早期検出および予後診断の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、癌診断および治療学の分野に関する。特に、それは、大腸癌および前癌における特定の遺伝子の異常なメチル化パターンに関する。
DNAメチル化および発癌におけるその役割
すべての生物の細胞を作るための情報は、そのDNAに含まれている。DNAは、4種の塩基、アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)およびシトシン(C)の固有の配列で構成されている。これらの塩基は、DNA二重らせんを形成する2本の鎖上のAとTおよびGとCの対合である。これらの対の鎖が、遺伝子と呼ばれる領域にグループ分けされた特定の分子を作るための情報を記憶する。各細胞内には、どの遺伝子がオンになる、すなわち発現するのかを制御して、その細胞固有の機能を規定するプロセスがある。これらの制御機構の一つは、シトシン(C)にメチル基を付加することによって提供される。メチル基で標識されたCはmCと表記できる。
特定のプロモーター遺伝子の過剰メチル化に関する情報は、種々の癌の診断、予後診断および処置に有益でありうる。特定の遺伝子プロモーター領域のメチル化は、発癌において早期かつ頻繁に起こる場合があり、これらのマーカーを癌診断にとって理想的な標的となる。
癌がまだ限局性であり、容易に処置可能である間は、癌患者における臨床結果を改善するカギは、最早期段階での診断である。上記特性は、より高リスクな患者を分子ベースで特定することにより、より正確なスクリーニングおよび監視プログラムのための手段を提供する。また、それは、分子の特徴を有するが、悪性疾患に伴うすべての病理的または臨床的特徴をまだ有しない患者のより決定的な経過観察の正当化の理由を提供することもできる。
(1) 感度および特異性が非常に低い「便潜血試験」(FOBT)、
(2) 侵襲的であり、高額である(かつ供給が限られる) S字結腸鏡検査法および/または結腸鏡検査法、
(3) 比較的大きなポリープの検出のみが可能である、二重造影バリウム注腸後のX線検出法、または、まだ実験段階であるCT結腸画像法(バーチャル結腸鏡検査法とも呼ばれる)、および
(4) コストが大きく、感度が限られる、PreGen-Plus (Exact Sciences; LabCorp)と呼ばれる遺伝子突然変異解析試験法
によって実施されている。
癌が分子事象を通してどのように発生するかに関する情報は、そのような癌がどのように特定の化学療法剤に反応しそうかということを臨床医がより正確に予測することを可能にする可能性がある。この方法で、腫瘍の化学感受性の知識に基づく療法を合理的に設計することができる。研究により、グリオーム患者におけるMGMTプロモーターの過剰メチル化が、療法に対する良好な反応、より高い全体生存率および進行までのより長い期間を示すということが示されている。
からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の後成的サイレンシングである。後成的サイレンシングが検出される場合、新生物である細胞、新生物の前駆体である細胞、もしくは新生物形成の素因を有する細胞を含有するものとして、または、新生物である細胞、新生物の前駆体である細胞、もしくは新生物形成の素因を有する細胞からの核酸を含有するものとして、その試験試料を特定する。
からなる群より選択される。その細胞を、CpGジヌクレオチド脱メチル化剤、DNAメチルトランスフェラーゼインヒビターおよびヒストンデアセチラーゼ(HDAC)インヒビターからなる群より選択される一つまたは複数の剤と接触させることにより、細胞中で、後成的にサイレンシングされた遺伝子によってコードされたポリペプチドの発現を回復させる。それにより、細胞の無秩序な成長を低減または阻害する。
からなる群より選択される。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する。ポリペプチドは該遺伝子によってコードされる。ポリペプチドを細胞中で発現させ、それにより細胞中のポリペプチドの発現を回復させる。
からなる群より選択される後成的にサイレンシングされた遺伝子を有すると決定される。CpGジヌクレオチド脱メチル化剤、DNAメチルトランスフェラーゼインヒビターおよびヒストンデアセチラーゼ(HDAC)インヒビターからなる群より選択される一つまたは複数の剤を、患者の癌細胞中で後成的にサイレンシングされた遺伝子の発現を回復させるのに十分な量で患者に投与する。
に示されるものから選択される後成的にサイレンシングされた遺伝子を有すると決定される。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを患者に投与する。ポリペプチドは、後成的にサイレンシングされた遺伝子によってコードされる。ポリペプチドを患者の腫瘍において発現させ、それにより癌におけるポリペプチドの発現を回復させる。
からなる群より選択される。該癌患者を治療するために遺伝子の発現を増大させる治療剤をその癌患者のために選択する。
本発明者らは、ヒトCRC中でプロモーター過剰メチル化によってサイレンシングされた遺伝子を特定するための全ヒトトランスクリプトームマイクロアレイスクリーニングを記載する。この手法は、単一腫瘍における候補癌遺伝子を高い確認効率で容易に特定する。本発明者らは、候補過剰メチル化遺伝子のリストをCRC中で最近特定された突然変異遺伝子と比較することにより(3)、変化した腫瘍ゲノムと遺伝子過剰メチル化との間の重要な関係を立証する。本発明者らの研究は、後成的および遺伝的変化がヒト癌形成をどのように駆動するのかを理解するためのプラットフォームを提供する。
を含む。このような遺伝子の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10の後成的サイレンシングの検出を、癌もしくは前癌または癌を発症する危険性の指示として使用することができる。
から選択される遺伝子の発現またはメチル化を試験することができる。
から選択される遺伝子をコードする。
によってコードされるポリペプチドは、対象中で無秩序な成長を示す細胞の部位に直接投与することができる。ポリペプチドは、本明細書に開示する方法を使用して望みどおり産生し、単離し、製剤化することができ、ポリペプチドが標的細胞の細胞膜を透過することができるように細胞と接触させることができる。ポリペプチドは、細胞膜を透過する輸送を促進するペプチドまたはポリペプチド成分を含む融合タンパク質の一部として提供することもできる。たとえば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV) TATタンパク質トランスダクションドメインまたは核局在化ドメインを対象のマーカーに融合させることができる。投与されるポリペプチドは、細胞へのポリペプチドの導入を容易にするマトリックスに製剤化することができる。
より選択される遺伝子を、まず特定する。次いで、その遺伝子の発現を高める処置を選択する。そのような処置は、再活性化剤またはポリヌクレオチドの投与を含むことができる。または、ポリペプチドを投与することもできる。
典型的には、キットは、単一の遺伝子またはマーカーに関してフォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方を含有する。十分な相補性領域、たとえば12、15、18または20のヌクレオチドがある場合には、プライマーはまた、ハイブリダイゼーションを妨げず、かつ他の操作にとって有用であることができるさらなるヌクレオチド残基を含有することもできる。例示的な他のそのような残基は、制限エンドヌクレアーゼ開裂、リガンド結合または因子結合またはリンカもしくはリピートのための部位であってもよい。オリゴヌクレオチドプライマーは、修飾されたメチル化残基に特異的であるようなものであってもよいし、そうでなくてもよい。キットは、場合によっては、オリゴヌクレオチドプローブを含有することができる。プローブは、修飾されたメチル化残基を含有する配列または非メチル化残基を含有する配列に特異的であることができる。キットは、場合によっては、メチル化シトシン残基を修飾するための試薬を含有することができる。キットはまた、増幅を実行するための成分、たとえばDNAポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドを含有することもできる。また、プライマーまたはプローブ上の検出可能な標識を含む検出手段がキットに設けられてもよい。キットはまた、本発明のマーカー(表1;図9)の一つに関して遺伝子発現を検出するための試薬を含有することもできる。このような試薬は、たとえばプローブ、プライマーまたは抗体を含むことができる。酵素またはリガンドの場合、マーカーの存在を評価するために基質または結合相手を求めることができる。
より選択される遺伝子の発現が癌細胞中の化合物によって増大する場合には、または遺伝子のメチル化が癌細胞中の化合物によって低減する場合には、それを、患者を処置するのに有用なものとして選択することができる。
実施例1
材料および方法
細胞培養および処理
HCT116細胞および同質遺伝子ノックアウト派生物を前記のように維持した(14)。薬物治療の場合、対数増殖期CRC細胞を、10% BCSおよび1×ペニシリン/ストレプトマイシンならびに5μM 5アザ-デオキシシチジン(DAC) (Sigma、原液:PBS中1mM)を含有するMcCoys 5A培地(Invitrogen)中、96時間、24時間ごとに培地およびDACを交換しながら培養した。300nMトリコスタチンA(Sigma、原液:エタノールに溶解した1.5mM)による細胞処理を18時間実施した。平行して、対照細胞を、等しい量のPBSまたはエタノールを薬物なしで加える偽処理に付した。
Triazol (Invitrogen)およびRNeasyキット(Qiagen)を製造者の取扱い指示にしたがって使用して、DNAアーゼ消化段階を含め、全RNAを対数増殖期細胞から収穫した。NanoDrop ND-100を使用してRNAを定量したのち、2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)を用いて品質評価を実施した。個体試料のRNA濃度は200ng/ulよりも高く、28s/18sの比は2.2よりも大きく、RNA完全性は10であった(10が最高スコア)。低RNA入力蛍光リニア増幅キットを製造者の取扱い指示にしたがって使用して、試料増幅および標識化手順を実施した。RNeasyミニキット(Qiagen)を使用して標識化cRNAを精製し、定量した。増幅の前にRNAスパイクイン対照(Agilent Technologies)をRNA試料に加えた。Cy3またはCy5で標識化された試料0.75マイクログラムを対照標的(Agilent Technologies)と混合し、Oligoマイクロアレイ上でアセンブルし、ハイブリダイズさせ、Agilentマイクロアレイプロトコルにしたがって処理した。AgilentのG2565BAマイクロアレイスキャナを用いて、Agilent Technologiesによって推奨される設定を使用してスキャニングを実施した。
すべてのアレイを、製造者によって推奨される品質チェックに付した。アーチファクトに関して画像を目視的に検査し、赤および緑の両チャネルのシグナルおよびバックグラウンド強さの分布を試験して異常なアレイを特定した。不規則さは認められず、すべてのアレイを保持し、使用した。R統計学的計算プラットフォーム(23)およびBioconductorバイオインフォマチックスソフトウェアプロジェクトからのパッケージ(24)を使用してすべての計算を実施した。Bioconductorからのlimmaパッケージで具現化されているようなバックグラウンドサブトラクションおよびLoEss正規化ののち、緑シグナルに対する赤シグナルの対数比を計算した(25、26)。同じ四分位数間範囲(75番目の百分位数―25番目の百分位数)を有するように個々のアレイをスケーリングした。色素交換(dye-swap)複製マイクロアレイに関して対数倍率変化を平均化して、条件ごとに発現値の単一セットを生成した。
TRIzol試薬(Invitrogen)を製造者の取扱い指示にしたがって用いてRNAを単離した。逆転写PCR (RT-PCR)の場合、Ready-To-Go(商標) You-Prime First-Strand Beads (Amersham Biosciences)をランダムヘキサマー(1反応あたり0.2μg)の添加とともに使用することによって全RNA 1μgを逆転写した。RTプライマー設計には、Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)を使用した。MSP解析のために、標準的なフェノール-クロロホルム抽出法にしたがってDNAを抽出した。EZ DNAメチル化キット(Zymo Research)を使用してゲノムDNAの亜硫酸水素塩修飾を実施した。MSPPrimer (http://www.mspprimer.org)を使用して、非メチル化およびメチル化プロモーター配列に特異的なプライマー配列を設計した。MSPを前記のように実施した(20)。すべてのPCR産物(RT-PCRの場合には50μl全量の15μl、MSPの場合には25μl全量の7.5μl)を、GelStar Nucleic Acid Gel Stain (Cambrex Bio Science)を含有する2%アガロースゲルに直接装填し、紫外線照射下で視覚化した。MSP、亜硫酸水素塩配列決定およびRT-PCRのためのプライマー配列および条件は、要求すれば著者から得ることができる。
University Hospital MaastrichtのDepartment of Pathologyのアーカイブから、原発CRCからのホルマリン固定パラフィン包埋組織を得た。Maastricht University, University Hospital MaastrichtおよびJohns Hopkins University HospitalのMedical Ethical Committeeによる認可を得た。Puregene DNA単離キット(Gentra Systems)を使用してDNAを単離した。
ゲノム全体の発現アレイベースの手法で、野生型HCT116CRC細胞を、二つの主要なヒトDNAメチルトランスフェラーゼの個々および組み合わせの遺伝子欠失を有する同質遺伝子パートナ細胞と比較することにより、過剰メチル化依存性遺伝子発現変化のグローバルな特定に対する本発明者らの最初の段階を実施した(図1A、14)。重要なことに、グローバルな5-メチルシトシンの実質的に完全な損失を有するDNMT1(-/-)DNMT3b(-/-)ダブルノックアウト(DKO) HCT116細胞では、野生型細胞中で基底発現を欠く、以前に個別に検査されたすべての過剰メチル化遺伝子が、遺伝子再発現を伴いながらプロモーター脱メチル化を受ける(14〜17)。44K Agilent Technologiesアレイプラットフォーム上での変化したシグナル強さにしたがって遺伝子を層別化することにより、遺伝子発現の独特なスパイクが、同質遺伝子野生型親細胞、すなわちDNMTの1または3bが個々に欠失しており、DNAメチル化において最小限の変化を含む同質遺伝子細胞系と比較した場合、DKO細胞中で増大することを認める(図1B)。
本発明者らの新規なアレイ手法がCpGアイランド過剰メチル化遺伝子を特定する際の感度を検討するために、まず、過剰メチル化され、完全にサイレンシングされ、DAC処理後にHCT116細胞中で再発現することが知られている11の遺伝子を試験した(図4 (S1A)) (14〜17)。試験したすべての遺伝子はTSA非応答ゾーン内にとどまり(図4 (S1BおよびC))、発現変化の方向はDAC処理細胞およびDKO細胞で十分に相関した(図4 (S1D))。重要なことに、DAC増大の場合、ガイド遺伝子のうち五つ(45%)が2倍またはそれ以上の倍率で増大し、さらに三つの遺伝子、すなわち全部で73%が1.3倍またはそれ以上の倍率で増大した。
細胞培養ベースの手法における根本的問題は、それらの手法が原発腫瘍における不活性化の標的である遺伝子を特定するかどうかである。これを検討するため、HCT116上段(17遺伝子)、HCT116次段(2遺伝子)またはSW480上段(1遺伝子)から、検証された遺伝子リストからの20のCpGアイランド含有遺伝子をランダムに選択し、CRC細胞系のパネルにおけるメチル化に関して解析した。試験された遺伝子はすべて二つまたはそれ以上の細胞系中で過剰メチル化されていた(図3A)。かつ、20〜61の原発結腸癌のパネルにおけるこれら20の遺伝子および癌のない個人から得られた20〜40の正常と思われる結腸組織試料の状態を試験した。正常な結腸組織中では遺伝子の大部分(65%)は完全な非メチル化状態であったか、ほとんどメチル化されていなかったが、原発腫瘍の大多数(86%)ではメチル化されていた(図3A)。解析した20の遺伝子のうち13(65%)が「腫瘍特異的メチル化」の基準を満たし、細胞系中の高頻度のメチル化、正常な結腸中の低いまたは検出不可能なメチル化および腫瘍試料中の高頻度のメチル化を示した。本発明者らの戦略の効率は、細胞系中の過剰メチル化遺伝子を特定する場合には少なくとも1/2、癌特異的過剰メチル化遺伝子を特定する場合には少なくとも1/3の発見率を示唆する。
ヒト腫瘍形成の開始および進行にとって遺伝的機構および後成的機構の両方が重要であるということは明白であるが、これらの変化それぞれの相対的寄与は不十分にしか理解されていない。一握りの癌遺伝子に関するメチル化および突然変異頻度の間の比較が、いずれかの経路の優位性を確信的に実証したわけではない。重要なことに、この問題を問うためのゲノム全体の解析が実施されていない。
BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、JAM3、MMP2およびGPNMBに関して収集されたさらなる組織データ
材料および方法
組織確認に使用された臨床試料
リアルタイムMSPを使用して、77の正常組織および94の癌試料に対応する全部で171の結腸パラフィン包埋組織試料を処理した。表2は、組織確認に使用された試料セットの概要を示す。
まず、ホルマリン固定パラフィン包埋試料をキシレン750μl中で2時間かけて脱パラフィン化した。次いで、70%エタノール250μlを加えたのち、13000rpmで15分間遠心分離した。上澄みを取り除き、試料を室温で20分間空気乾燥させた。従来的なフェノール/クロロホルム抽出法を使用してDNAを抽出し、50μl LoTe (3mM TRIS、0.2mM EDTA、pH8.0)中に再懸濁させた。続いて、Picogreen(登録商標) dsDNA数量化キット(Molecular Probes, Invitrogen)を製造者の推奨にしたがって使用してDNAを定量した。キットとともに提供されたλDNAを使用して標準曲線を作成した(1〜800ng/ml)。FluoStar Galaxyプレートリーダ(BMG Lab technologies, Germany)を使用してデータを収集した。
EZ-96DNAメチル化キット(Zymo Research)を製造者のプロトコルにしたがって使用して、ピペットロボット(Tecan)上、96穴フォーマットで、DNA 1μgを亜硫酸水素塩修飾に付した。基本的に、45μlのアリコートをM希釈バッファ5μlと混合し、1100rpmで振とうしながら37℃で15分間インキュベートした。次いで、希釈したCT転換試薬100μlを加え、試料を1100rpmで振とうしながら70℃で3時間、暗所にインキュベートした。転換ののち、氷上での10分間のインキュベーションおよびM結合バッファ400μlの添加によって試料を脱塩した。試料を、捕集プレート中、Zymo-Spin Iカラムに装填し、遠心分離ののち、M洗浄バッファ200μlで洗浄した。M脱スルホン化バッファ200μlをカラムに載せ、室温で15分間インキュベートした。カラムの遠心分離ののち、カラムをM洗浄バッファ200μlで2回洗浄した。最後に、DNAをカラムから125μl Tris-HCl 1mM pH8.0中に洗い出し、さらなる処理まで-80℃で貯蔵した。
7900HT高速リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)上でリアルタイムMSPを適用した。修飾されたDNA 5μlを、バッファ(16.6mM (NH4) 2SO4、67mM Tris (pH8.8)、6.7mM MgCl2、10mM β-メルカプトエタノール)、dNTPs (5mM)、フォワードプライマー(6ng)、リバースプライマー(18ng)、分子ビーコン(0.16μM)およびJumpstart DNA Taqポリメラーゼ(0.4単位、Sigma Aldrich)を含有するPCRミックス(全量10μl)に加えた。各遺伝子に使用したプライマー配列および分子ビーコン配列を表3にまとめる。使用したサイクルプログラムは以下のとおりであった。5分間95℃、次いで30秒間95℃の45サイクル、30秒間57℃でおよび30秒間72℃。標準曲線(2×106―20コピー)を含めて、未知の試料のコピー数を標準曲線に対するそれらのCt値の補間によって決定した。
上記のようにして実験を実施した。表3に示すプライマーセットおよびビーコンプローブを使用して、結腸マーカー:BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、JAM3、MMP2およびGPNMBを組織材料において確認した。加えて、独立した参照β-アクチン(ACTB)を計測した。SDS 2.2ソフトウェア(Applied Biosystems)を使用して結果を生成し、Ct値(ソフトウェアによって自動的にセットされる、増幅曲線がしきい値と交差するところのサイクル数)としてエクスポートした。標準曲線を使用してコピー数を補外した。試料ごとのACTB (×1000)に対する対象遺伝子の比率を、各試料内の対象遺伝子ごとのメチル化DNAの相対レベルを表すための測度として使用した。
Claims (74)
- 前記試験試料が腺腫細胞を含有する、請求項1記載の方法。
- 前記試験試料が腺腫細胞からの核酸を含有する、請求項1記載の方法。
- 前記試験試料が癌腫細胞または癌腫細胞からの核酸を含有する、請求項1記載の方法。
- 前記試験試料が、新鮮な組織検体または凍結組織検体からの試験試料である、請求項1記載の方法。
- 前記試験試料が生検検体からの試験試料である、請求項1記載の方法。
- 前記試験試料が外科的検体からの試験試料である、請求項1記載の方法。
- 前記試験試料が細胞学的検体からの試験試料である、請求項1記載の方法。
- 前記試験試料が、全血、骨髄、脳髄液、腹膜液、胸膜液、リンパ液、血清、粘液、血漿、尿、乳び、糞便、精液、痰、乳頭吸引液、唾液、スワブ検体、結腸洗浄検体およびブラシ検体からなる群より選択される体液から単離される、請求項1記載の方法。
- 新生物組織の外科的除去が患者に推奨される、請求項8記載の方法。
- アジュバント化学療法が患者に推奨される、請求項8記載の方法。
- アジュバント放射線療法が患者に推奨される、請求項8記載の方法。
- 結腸鏡検査またはS字結腸鏡検査が患者に推奨される、請求項11記載の方法。
- 増大した頻度の結腸鏡検査が患者に推奨される、請求項8記載の方法。
- 結腸の画像診断検査が患者に推奨される、請求項11記載の方法。
- 少なくとも二つの遺伝子の後成的サイレンシングが検出される、請求項1記載の方法。
- 後成的サイレンシングが、前記遺伝子中のCpGジヌクレオチドモチーフのメチル化を検出する段階によって検出される、請求項1記載の方法。
- 後成的サイレンシングが、前記遺伝子のプロモーター中のCpGジヌクレオチドモチーフのメチル化を検出する段階によって検出される、請求項1記載の方法。
- 後成的サイレンシングが、前記遺伝子の発現の減少を検出する段階によって検出される、請求項1記載の方法。
- 後成的サイレンシングが、前記遺伝子のmRNAの減少を検出する段階によって検出される、請求項21記載の方法。
- 前記遺伝子の発現の減少が、対照試料との比較によって決定される、請求項21記載の方法。
- 前記遺伝子のmRNAの減少が、ヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーションによって決定される、請求項22記載の方法。
- 発現の減少が、ヌクレオチド配列決定によって検出される、請求項21記載の方法。
- 発現の減少が、逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって検出される、請求項21記載の方法。
- 前記RT-PCRが非定量的に実施される、請求項26記載の方法。
- 前記RT-PCRがリアルタイムでかつ定量的に実施される、請求項26記載の方法。
- 後成的サイレンシングが、前記遺伝子によってコードされるタンパク質の減少を検出する段階によって検出される、請求項21記載の方法。
- メチル化が、前記遺伝子の少なくとも一つの部分をメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼと接触させることによって検出され、
該エンドヌクレアーゼが、非メチル化認識部位と比べてメチル化認識部位を優先的に開裂させ、それにより、該遺伝子の該部分の開裂が該遺伝子の該部分のメチル化を示す、
請求項19記載の方法。 - メチル化が、前記遺伝子の少なくとも一つの部分をメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼと接触させることによって検出され、
該エンドヌクレアーゼが、メチル化認識部位と比べて非メチル化認識部位を優先的に開裂させ、それにより、該遺伝子が該メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含む場合、該遺伝子の該部分の開裂が該遺伝子の該部分の非メチル化を示す、
請求項19記載の方法。 - メチル化が、
前記試験細胞の前記遺伝子の少なくとも一つの部分を、メチル化シトシン残基と比べて非メチル化シトシン残基を選択的に修飾する化学試薬、または非メチル化シトシン残基と比べてメチル化シトシン残基を選択的に修飾する化学試薬と接触させることによって、および
該接触により生成される産物を検出する段階によって
検出される、請求項19記載の方法。 - 前記検出段階が、
修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にハイブリダイズするが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない少なくとも一つのプローブとのハイブリダイゼーション
を含む、請求項32記載の方法。 - 前記検出段階が、
非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にハイブリダイズするが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない少なくとも一つのプローブとのハイブリダイゼーション
を含む、請求項32記載の方法。 - 前記検出段階が、
修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にハイブリダイズするが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない少なくとも一つのプライマーを用いる、増幅産物を生成する増幅
を含む、請求項32記載の方法。 - 前記検出段階が、
非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にハイブリダイズするが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない少なくとも一つのプライマーを用いる、増幅産物を生成する増幅
を含む、請求項32記載の方法。 - 前記産物が、電気泳動、ハイブリダイゼーション、増幅、プライマー伸長、配列決定、リガーゼ連鎖反応、クロマトグラフィー、質量分析法およびそれらに組み合わせからなる群より選択される方法によって検出される、請求項32記載の方法。
- 絶対的検出法である、請求項37記載の方法。
- リアルタイム検出法である、請求項37記載の方法。
- 少なくとも二つの遺伝子に関して実施され、かつ
該少なくとも二つの遺伝子に関して生成された前記産物を比較する、
請求項37記載の方法。 - 前記化学試薬がヒドラジンである、請求項32記載の方法。
- 前記遺伝子のヒドラジンと接触させた少なくとも一つの部分についてのピペリジンによる開裂をさらに含む、請求項41記載の方法。
- 前記化学試薬が亜硫酸水素イオンを含む、請求項32記載の方法。
- 前記遺伝子の亜硫酸水素イオンと接触させた少なくとも一つの部分をアルカリで処理する段階をさらに含む、請求項43記載の方法。
- 細胞の新生物成長を低減または阻害する方法であって、
該細胞が癌に関連する少なくとも一つの遺伝子の後成的にサイレンシングされた転写を示す、以下の段階を含む方法:
細胞が、
からなる群より選択される後成的にサイレンシングされた遺伝子を有すると決定する段階、
CpGジヌクレオチド脱メチル化剤、DNAメチルトランスフェラーゼインヒビターおよびヒストンデアセチラーゼ(HDAC)インヒビターからなる群より選択される一つまたは複数の剤と、該細胞を接触させることによって、該細胞中で後成的にサイレンシングされた該遺伝子によってコードされたポリペプチドの発現を回復させ、それにより該細胞の無秩序な成長を低減または阻害する段階。 - 前記接触がインビトロで実施される、請求項45記載の方法。
- 前記接触が、前記細胞を含む哺乳動物対象に前記剤を投与することによってインビボで実施される、請求項45記載の方法。
- 前記剤が脱メチル化剤であり、かつ、
該剤が、5-アザ-2'-デオキシシチジン、5-アザ-シチジン、ゼブラリン、プロカインおよびL-エチオニンからなる群より選択される、
請求項45記載の方法。 - 前記剤が脱メチル化剤であり、かつ
該剤が、5-アザ-2'-デオキシシチジン、5-アザ-シチジン、ゼブラリン、プロカインおよびL-エチオニンからなる群より選択される、
請求項52記載の方法。 - 癌患者のための前記治療剤を処方する段階をさらに含む、請求項57記載の方法。
- 前記治療剤を癌患者に投与する段階をさらに含む、請求項57記載の方法。
- 前記治療剤が、前記遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項57記載の方法。
- 前記脱メチル化剤が5-アザ-2'-デオキシシチジンである、請求項57記載の方法。
- 前記治療剤が5-アザ-2'-デオキシシチジンである、請求項57記載の方法。
- 前記癌細胞が外科的検体から得られる、請求項57記載の方法。
- 前記癌細胞が生検検体から得られる、請求項57記載の方法。
- 前記癌細胞が細胞学的試料から得られる、請求項57記載の方法。
- 前記癌細胞が糞便、粘液、血清、血液または尿から得られる、請求項57記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも一つが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にハイブリダイズするが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、または、
該オリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも一つが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にハイブリダイズするが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、
請求項68記載のキット。 - (a)修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にハイブリダイズするが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第一のオリゴヌクレオチドプローブ、
(b)非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にハイブリダイズするが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第二のオリゴヌクレオチドプローブ、または
(c)該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブの両方
をさらに含む、請求項68記載のキット。 - (a)修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にハイブリダイズするが、非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第一のオリゴヌクレオチドプローブ、
(b)非修飾メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にハイブリダイズするが、修飾された非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフを含む配列にはハイブリダイズしない、第二のオリゴヌクレオチドプローブ、または
(c)該第一および第二のオリゴヌクレオチドプローブの両方
をさらに含む、請求項68記載のキット。 - オリゴヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項68記載のキット。
- DNAを増幅するためのDNAポリメラーゼをさらに含む、請求項68記載のキット。
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