CN108796065B - Fam127a在妊娠疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了FAM127A在妊娠疾病中的应用，具体的所述疾病为子痫前期，FAM127A在子痫前期孕妇中表达下调，进行大样本验证，发现该基因具有较高阳性检出率，提出该基因可应用于子痫前期的临床诊断；通过在滋养细胞中过表达FAM127A，发现滋养细胞的增殖能力和侵袭能力都发生改变，提示FAM127A可作为潜在靶标应用于子痫前期的治疗。

Description

FAM127A在妊娠疾病中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及FAM127A在妊娠疾病中的应用，具体的所述疾病为子痫前期。
背景技术
子痫前期(preeclampsia，PE)是妊娠期高血压疾病里较为严重的类型，主要表现为妊娠20周以后出现的高血压、蛋白尿，可以继发子痫抽搐、脑出血、脑水肿、多器官功能不全、HELLP综合征、胎盘早剥、胎儿生长受限等多种严重的母儿并发症。它是导致母儿患病率和死亡率的主要原因，同时也对产妇及子代的远期预后造成不良影响。不同国家和地区间的PE发病率差异相当明显，在欧美等发达国家PE的发病率在1％-5％之间(Abalos E,Cuesta C,Grosso AL,et al.Global and regional estimates of preeclampsia andeclampsia:a systematic review.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol.2013Sep；170(1):1-7.)，而经济社会发展相对落后的地区如非洲、印度等国家其发病率为1.8％-16.7％(Osungbade KO,Ige OK.Public health perspectives of preeclampsia in developingcountries:implication for health system strengthening.J Pregnancy.2011:2011:481095.)。在我国，PE的发病率同样存在一定的地域性差异，各种调查报道的发生率在3％-8％不等，约占产妇死因的20％，围产儿死因的40％。PE不仅影响妊娠结局，也可对产妇及子代的远期健康状况造成负面影响。PE产妇远期发生心脑血管疾病的机率增加2倍(Ross MG,Beall MH.Adult sequelae of intrauterine growth restriction.SeminPerinatol.2008Jun；32(3):213-8.Review.)；其子代远期罹患心脏病的风险也随之升高。每年因PE导致的医疗卫生资源的消耗巨大。
目前在PE认识上，其新进展的一大核心在于其临床表现和发病严重程度是异质性的，病情轻重不一，难于把控，同时涉及多器官系统，症状和体征复杂多样。其发病机制的细枝末节至今依然有待发掘，导致其临床管理和治疗在近年来进展缓慢，其诊断仍旧建立在患者的临床症状得到充分暴露的基础上，而所有的治疗均为对症处理、疗效相对有限，屡屡让产科医生和新生儿科医生陷入被动的局面。目前针对PE的预防措施虽有一定进展，但其广泛的临床应用还需进一步验证。因此，如何在PE相应的异质性特征基础上发现并筛选新的、可靠的临床、生化或物理标记物对其发病进行预测，从而采取可能的预防措施以改善母儿预后、节约医疗资源，是当前产科医生研究的重点。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与妊娠疾病-子痫前期发生发展相关的基因标志物。
本发明的目的之二在于提供子痫前期的生物标志物在子痫前期临床诊断和治疗中的应用。
本发明的目的之三在于提供子痫前期的生物标志物在筛选治疗子痫前期的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂能够检测FAM127A基因或其表达产物的水平。
进一步，所述试剂包括：
特异性识别FAM127A基因的探针；或
特异性扩增FAM127A基因的引物；或
特异性结合FAM127A基因编码的蛋白的抗体或配体。
进一步，特异性扩增FAM127A的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明的第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明的第三方面提供了一种芯片，所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明的第四方面提供了一种核酸膜条，所述核酸膜条包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明的第五方面提供了一种组合物，所述组合物包括FAM127A的促进剂，和/或药学上可接受的载体。所述促进剂包括提高FAM127A基因或其表达产物稳定性、上调FAM127A基因或其表达产物的表达水平、增加FAM127A基因或其表达产物有效作用时间的物质；所述药学上可接受的载体和/或辅料，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂；所述药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。
进一步，所述促进剂为含有FAM127A的载体。
本发明的第六方面提供了一种筛选治疗子痫前期的候选药物的方法，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有FAM127A基因或其编码的蛋白的培养体系；和
检测所述体系中FAM127A基因或其编码的蛋白的表达或活性；
其中，若所述待筛选物质可以促进FAM127A基因的水平或表达活性，则表明该待筛选物质是治疗子痫前期的候选药物。
在本发明中，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在本发明中，所述的步骤还包括：对获得的候选药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择可以治疗子痫前期的药物。
本发明的第七方面提供了如下任一项所述的应用：
a.本发明第一方面所述的试剂在制备早期诊断子痫前期的产品中的应用；
b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断子痫前期的产品中的应用；
c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断子痫前期的产品中的应用；
d.本发明第四方面所述的核酸膜条在制备诊断子痫前期的产品中的应用；
e.本发明第五方面所述的组合物在制备治疗子痫前期的药物中的应用；
f.本发明第六方面所述的方法在筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用；
g.FAM127A在筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用；
h.FAM127A在制备治疗子痫前期的药物中的应用。
附图说明
图1是利用QPCR检测FAM127A基因在子痫前期患者中的表达情况；其中，A是胎盘组织中的表达水平，图B是血液中的表达水平；
图2是FAM127A基因表达水平图；
图3是FAM127A蛋白表达水平图；
图4是MTT法检测FAM127A对细胞增殖活性的影响图；
图5是利用transwell小室检测FAM127A基因对细胞侵袭的影响图。
具体的实施方式
本发明通过高通量测序技术以及进行高通量测序分析，检测子痫前期患者和正常孕妇胎盘组织和血液中的基因表达水平，发现其中具有明显差异的基因，探讨其与子痫前期的发生之间的关系，从而为子痫前期的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。经过筛选本发明首次发现了FAM127A在子痫前期患者中表达下调，并通过基因过表达技术进一步验证了FAM127A参与滋养细胞的浸润过程，提示FAM127A可作为子痫前期的独立预测因子，也可以和其他的基因标志物联合应用。
FAM127A基因
本发明中的FAM127A包括野生型、突变型或其片段。在本发明的具体实施例中，FAM127A具有如目前国际公共核酸数据库GeneBank中FAM127A基因(NM_001078171.1)所示的序列。本发明的FAM127A核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
检测技术
本发明的基因和蛋白使用本领域普通技术人员已知的多种技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。
所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。
本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。
本发明的蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。
检测FAM127A蛋白的试剂为FAM127A蛋白的特异性结合剂。特异性结合剂是例如蛋白质FAM127A的受体、结合蛋白质FAM127A的凝集素、针对蛋白质FAM127A的抗体、针对蛋白质FAM127A的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。
特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。在本发明的具体实施例中，所述特异性结合剂为FAM127A特异性抗体。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
本发明提供了检测中FAM127A基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片、试剂盒、核酸膜条。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针或抗体，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于FAM127A所示的部分或全部序列，所述抗体特异性的结合FAM127A蛋白。
所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测FAM127A基因或蛋白的试剂。选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。
本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测。
在某些实施方案中，本文提供的是用于检测一种或多种生物标志物的蛋白质水平的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含用识别蛋白质生物标志物的抗体包被的试纸条、洗涤溶液、进行该试验的试剂、蛋白质分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。
本发明提供了一种核酸膜条，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。
促进剂和药物组合物
本发明提供了一种药物(组合物)，它含有有效量的所述的FAM127A的促进剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于治疗子痫前期。
作为本发明的一种优选方式，所述的FAM127A的促进剂是一种FAM127A的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。
本发明所述药物组合物组合物可以是适合注射给药的剂型、适合口服摄取的剂型(如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适合局部给药的油膏、乳膏或洗剂形式、适合用作滴眼剂的递送剂型、适合通过吸入给药的气雾剂形式(如通过鼻内吸入或口吸入)、适合胃肠外给药的剂型，即皮下、肌肉内或静脉内注射。
本发明的药物组合物还可以与其他治疗子痫前期的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。
优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将FAM127A的促进剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带FAM127A的促进调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，具体情况需视所述的促进剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
本发明中，术语“样本”以其最广泛的含义使用。意在包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样本。生物样本可获自动物(包括人)并涵盖液体、固体、组织和气体。生物样本包括血液制品，诸如血浆、血清等。然而，此类样本不应解释为限制适用于本发明的样本类型。
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1筛选与子痫前期相关的基因标志物
1、样品收集
1)血清标本的收集
各收集45例正常孕妇与未接受治疗的子痫前期患者的血液，EDTA抗凝管静置10min，离心分离血清，-20℃保存备用。
2)胎盘标本的收集
各收集45例子痫前期和正常孕妇的胎盘组织，生理盐水漂洗2次，去除水分后分装于冻存管内，-80℃保存备用。
两组均排除多胎妊娠、传染性疾病、化学药物依赖、孕妇吸烟、胎儿先天畸形及其他妊娠合并症及并发症，所有纳入的研究对象均于收集标本前签署知情同意书。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。每组各取5例标本进行基因表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在各组全部45例标本中进行验证实验。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胎盘组织中的总RNA，具体步骤参考说明书。
3、RNA样品的质量分析
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
4、去除rRNA
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。
5、构建cDNA文库
利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。
6、上机测序
使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。
7、高通量转录组测序数据分析
对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.05时，认为基因显著差异表达。
8、结果
RNA-seq结果显示，与正常孕妇的胎盘组织相比，FAM127A基因在子痫前期胎盘组织中的表达量显著下调，具有统计学意义(P<0.05)，提示FAM127A基因可能与子痫前期相关，因此对FAM127A进行进一步的大样本验证。
实施例2QPCR测序验证FAM127A基因的差异表达
1、对FAM127A基因差异表达进行大样本QPCR验证。
2、RNA提取
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胎盘组织中的总RNA，血液RNA提取试剂盒提取血清中的RNA，具体步骤参考说明书。
3、逆转录：
1)加入dNTP mixture1μl，Oligo dT primer 1μl，总RNA 2μg，加Rnase FreeddH2O使总体积至10μl，在PCR仪上进行变性、退火反应，65℃，5min，反应完成后置于4℃。
2)构建20μl反应体系，继续加入5×Primer Script Buffer 4μl，RNaseInhibitor0.5μl，Prime Script RTase 0.5μl，RNase Free ddH2O 5.0μl，在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃15～30min，95℃5min，反应完成之后，置于冰上。
3)水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，-20℃储存备用。
4、QPCR检测FAM127A的表达水平
1)引物设计
根据Genebank中FAM127A基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：
FAM127A基因：
正向引物为5’-CCCTACATCAAGAAGGAGAG-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物为5’-TCCAAAGACTCGCTTCATC-3’(SEQ ID NO.2)。
管家基因GAPDH的引物序列为：
正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.3)
反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)
2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各1μl，SYBR Green PCR master mix 10μl，cDNA 1μl，ddH2O 7μl。
3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃10s，60℃30s，72℃15s)×40个循环，65℃～95℃，温度升高速度0.5℃/5s。在Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
以GAPDH为内参，计算子痫前期胎盘组织与正常孕妇胎盘组织，子痫前期患者血液与正常孕妇血液中FAM127A荧光定量RT-PCR的实验结果，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，以P<0.05具有统计学差异。
6、结果
结果如图1所示，与正常孕妇相比，子痫前期孕妇中FAM127A基因表达显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
胎盘组织中的阳性检出率＝下调表达例数/总检测例数×100％＝44/45×100％＝97.8％，血液中的阳性检出率为42/45×100％＝93.3％，提示检测血液或胎盘组织中FAM127A的表达水平对于子痫前期患者的辅助诊断具有重要的作用。
实施例3FAM127A基因的过表达
1、细胞培养
人早孕绒毛滋养细胞株(HTR-8/SVneo)用含10％胎牛血清的RPIM-1640培养基在37℃、5％CO2的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、转染
1)转染前细胞的处理
将处于对数期的滋养细胞HTR-8/SVneo以1×105的密度分别种于六孔板中，于37℃5％CO2的培养箱中培养。
2)基因过表达载体的构建
根据GeneBank中FAM127A的序列合成特异的PCR扩增引物，引物序列如下：
正向引物：5’-CCGGAAGCTTGCCACCATGGACGGTCGGGTGC-3’(SEQ ID NO.5)
反向引物：5’-CGGGCGGCCGCGAAGTCCTCGTCCTCCTCCCA-3’(SEQ ID NO.6)
在5’端引物和3’端引物分别添加HindIII和NotI两个限制性酶切位点。以子痫前期患者提取和反转录得到的cDNA作为扩增模板，上述cDNA序列经限制性内切酶HindIII和NotI双酶切后插入到经HindIII和NotI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-1用于后续实验。
3)转染
将神经细胞分为3组，分别为对照组(HTR-8/SVneo)、空白对照组(转染pcDNA3.1-NC)、实验组(转染pcDNA3.1-1)。使用脂质体3000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-1的转染浓度均为0.5μg/ml。
3、QPCR检测FAM127A基因的转录水平
3.1细胞总RNA的提取
采用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，具体步骤详见试剂盒说明书
3.2逆转录步骤同实施例2。
3.3QPCR扩增步骤同实施例2。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，过表达FAM127A基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2显示，相比对照组HTR-8/SVneo和转染空载pcDNA3.1-NC，实验组能够显著增加FAM127A基因的表达水平，差异具有统计学意义。
实施例4ELISA检测HTR-8/SVneo细胞中FAM127A的蛋白表达
应用双抗体夹心酶标免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分应用双抗体夹心酶标免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分析法测定HTR-8/SVneo细胞上清中FAM127A蛋白水平。转染后48h分别收集三组HTR-8/SVneo细胞的上清液，按照ELISA试剂盒操作流程定量检测细胞上清液中FAM127A的浓度，用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)，所有标准品和待测样品的OD值均需减去零孔的OD值以得到校正值，计算样品的实际浓度。
结果如图3所示，过表达HTR-8/SVneo细胞的FAM127A基因，FAM127A的蛋白含量也相应增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例5MTT法检测HTR-8/SVneo细胞增殖活性
1、细胞转染后24h，0.25％胰蛋白酶消化，培养基重悬后计数，稀释细胞悬液，按每孔调整浓度控制在104个/ml；
2、按每孔150μl将细胞接种至96孔板，复设5个平行孔；
3、分别于转染1～6天时，弃掉各孔培养基，加入MTT培养液100μl(0.5mg/ml)继续培养5h。弃去MTT培养液，每孔加入150μl DMSO溶解MTT还原物甲瓒，摇床上震荡10min，使结晶物充分溶解，酶联免疫仪检测490nm处吸光度值；
4、统计每天的细胞吸光度值，得到的数值用曲线图表示。
5、结果
结果如图4所示，转染pcDNA3.1-1组的细胞增殖显著增加，提示改变FAM127A的表达水平可以改变滋养细胞的增殖能力，说明FAM127A与滋养细胞的增殖相关。
实施例7Transwell细胞体外侵袭实验
细胞转染后48h收集不同组别的HTR-8/SVneo细胞，重悬于培养液中，使细胞终浓度为106/ml，吸取100μl细胞悬液加入Transwell小室中。应用Transwell小室方法观察FAM127A基因沉默对HTR-8/SVneo细胞侵袭性的影响。
1、将Matrigel放入4℃融化，准备冰盒(冰浴环境)。Matrigel稀释后使用，终浓度为1mg/ml。
2、取出预冷的Transwell小室放入24孔板中，向每个Transwell小室膜上均匀加入稀释好的Matrigel胶50μ1，37℃，细胞培养箱放置3～4h使胶凝聚。
3、收集对数生长期的细胞，重悬于培养液中，终浓度为106/ml，轻轻加100μ1细胞悬液入小室。
4、24孔板中加入600μl含20％血清的培养基，37℃、5％CO2孵箱内孵育36h。
5、棉签轻轻地擦净Transwell孔内Matrigel胶和细胞，用甲醛固定小室底端的细胞，室温放置25min，取出小室后晾干。
6、0.4％结晶紫染色10min，生理盐水快速洗涤三次，甩干后显微镜下观察，随机选择八个不同的视野照相并计数，统计结果并分析。
7、数据处理
用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
8、结果
结果如图5所示，HTR-8/SVneo、pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-1在Transwell小室中培养后，实验组pcDNA3.1-1细胞膜下室面的细胞数增加，说明增加FAM127A的表达水平可以增加滋养细胞的浸润能力，提示FAM127A可以用于改善因滋养细胞浸润不足所引起。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> FAM127A在妊娠疾病中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccctacatca agaaggagag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccaaagact cgcttcatc 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctctggtaaa gtggatattg t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggaatca tattggaaca 20
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggaagctt gccaccatgg acggtcgggt gc 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgggcggccg cgaagtcctc gtcctcctcc ca 32

Claims (6)

1.一种筛选治疗子痫前期的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有FAM127A 基因或其编码的蛋白的培养体系；和
检测所述体系中FAM127A 基因或其编码的蛋白的表达；
其中，若所述待筛选物质可以促进FAM127A基因的表达水平，则表明该待筛选物质是治疗子痫前期的候选药物。
2.如下任一项所述的应用：
a.试剂在制备早期诊断子痫前期的产品中的应用，其特征在于，所述试剂能够检测FAM127A基因或其表达产物的表达水平；
b.试剂盒在制备诊断子痫前期的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括能够检测FAM127A基因或其表达产物的表达水平的试剂；
c.芯片在制备诊断子痫前期的产品中的应用，其特征在于，所述芯片包括能够检测FAM127A基因或其表达产物的表达水平的试剂；
d.核酸膜条在制备诊断子痫前期的产品中的应用，其特征在于，所述核酸膜条包括能够检测FAM127A基因或其表达产物的表达水平的试剂；
e.组合物在制备治疗子痫前期的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括FAM127A的促进剂和/或药学上可接受的载体，所述促进剂为促进FAM127A基因mRNA和/或蛋白表达水平的试剂；
f.权利要求1所述的方法在筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用；
g. FAM127A在筛选治疗子痫前期的候选药物中的应用；
h.FAM127A的促进剂在制备治疗子痫前期的药物中的应用，其特征在于，所述促进剂为促进FAM127A基因mRNA和/或蛋白表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于， a~d中所述的试剂包括：
特异性识别FAM127A基因的探针；或
特异性扩增FAM127A基因的引物；或
特异性结合FAM127A基因编码的蛋白的抗体或配体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，特异性扩增FAM127A的引物序列如SEQ IDNO.1~2所示。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，e中所述促进剂为含有FAM127A的载体。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，h中所述促进剂为含有FAM127A的载体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN112904020A (zh) * 2021-01-25 2021-06-04 上海市第六人民医院 Fam172a在筛查和治疗糖尿病大血管病变中的应用
CN113621080B (zh) * 2021-09-08 2022-04-19 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种用于预防或治疗子痫前期及相关病症的药物及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1650033A (zh) * 2002-03-07 2005-08-03 约翰霍普金斯大学医学院 针对与癌症相关的表观遗传学沉默基因的基因组筛选
CN101688239A (zh) * 2007-02-12 2010-03-31 约翰·霍普金斯大学 结肠癌的早期检测和预后
WO2017161387A1 (en) * 2016-03-18 2017-09-21 Reid Christopher Brian Compositions of natural extracts and use thereof in methods for preventing or treating diseases

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1650033A (zh) * 2002-03-07 2005-08-03 约翰霍普金斯大学医学院 针对与癌症相关的表观遗传学沉默基因的基因组筛选
CN101688239A (zh) * 2007-02-12 2010-03-31 约翰·霍普金斯大学 结肠癌的早期检测和预后
WO2017161387A1 (en) * 2016-03-18 2017-09-21 Reid Christopher Brian Compositions of natural extracts and use thereof in methods for preventing or treating diseases

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genetics, Cytogenetics, and Epigenetics of Colorectal Cancer;Lucia Migliore et,al.;《Journal of Biomedicine and Biotechnology》;20111231;第2011卷;第1-19页 *
Identification of Gastric Cancer–Related Genes Using a cDNA;Jeong-Min Kim et,al.;《Clinical Cancer Research》;20050115;第11卷;第473-482页 *

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