JP2013535688A

JP2013535688A - 肝移植における寛容性の診断及び／又は予後のための方法およびキット

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Publication number: JP2013535688A
Application number: JP2013523539A
Authority: JP
Inventors: フエヨ，アルベルトサンチェス; サルバテヤ，フアンホセロサーノ; ヨルデヤ，マルクマルティネス; カステヤ，アントニリモラ; ボーネ，フェリクス
Original assignee: ホスピタルクリニックデバルセロナ
Priority date: 2010-08-09
Filing date: 2011-03-02
Publication date: 2013-09-12
Also published as: CN103154267B; ES2643491T3; EP2418288A1; CA2807923A1; US20130210665A1; ES2400490T3; EP2418288B1; CN103154267A; EP2603604B1; EP2603604A1; WO2012019786A1

Abstract

本発明は、肝移植を受ける患者の寛容状態のインビトロの診断及び／又は予後のための方法およびキットに言及し、該方法は、検査中の患者から得られた生体サンプルにおける全身性の及び／又は肝臓内の鉄貯蔵のレベルを評価する工程と、それを参照サンプルの鉄貯蔵のレベル、または予め決められた閾値のいずれかと比較する工程を含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、人間医学の分野に言及する。より具体的には、本発明は、肝移植を受ける患者の寛容状態のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の診断及び／又は予後のための方法およびキットに焦点を当て、該方法は、検査中の患者から得られた生物学的サンプルにおける全身性及び／又は肝臓内の鉄貯蔵のレベルを評価し、それを参照サンプルの鉄貯蔵のレベル、または予め決められた閾値のいずれかと比較する工程を含む。

＜先行技術＞
移植された移植片の長期生存は、移植片拒絶を予防するために免疫抑制薬の生涯にわたる投与に極めて依存する。これらの薬物は、移植片拒絶の予防に非常に効果的であるが、腎毒性などの重度の副作用、日和見感染症と腫瘍の増大したリスク、および糖尿病、高脂血症および動脈高血圧などの代謝性の合併症に関係する。免疫抑制薬の副作用により、移植片が慢性的な免疫抑制がない中で正常機能を維持する状態として定義される、寛容の誘導は、移植免疫における研究の主要な目的の１つである。寛容誘導は、齧歯類における移植の大多数の実験モデルにおいて可能である。しかしながら、診療におけるこれらの実験的な処置の応用は、大部分は失敗であった。寛容誘導の実験的な処置のヒトにおける臨床応用が成功していない理由の１つは、ヒト移植レシピエント内で寛容を非侵襲的に診断する正確なツールの欠如に関係がある。最近の公報は、このツールの緊急の必要性を指摘する（Ｎ．Ｎａｊａｆｉａｎｅｔａｌ２００６ａｎｄＮｅｗｅｌｌｅｔａｌ．２００６）。他方では、すべての免疫抑制薬の完全な中止にもかかわらず正常な同種移植片機能の維持は、特に肝移植後の、臨床的な臓器移植において報告されることもある。自発的に移植片を許容する患者は、「手術上（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌｌｙ）」寛容であると慣習的に考慮され、免疫寛容が実際にヒトにおいて達成することができるという概念実証を提供する。肝移植は、寛容がかなりの割合の患者において自発的に生じる唯一の臨床設定である。実際は、完全な免疫抑制の離脱（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）は、約２１％の患者において達成することができる（Ｌｅｒｕｔ，Ｊ．ｅｔａｌ２００６）。不運にも、免疫抑制の離脱が試みられる前に、これらの患者を識別する手段は現在ない。この理由のために、免疫抑制薬の完全な中止は、肝移植ではめったに試みられておらず。したがって、多くの患者は、これが含む健康および経済的な問題を抱えたまま、不必要に免疫抑制され続ける。

主として腎臓および肝臓のレシピエントにおける、移植における寛容を識別する事前の試みは、抗原特異性の機能アッセイ、または抗原非特異性の試験のいずれかを利用してきた。機能アッセイにおいて、レシピエントのＴリンパ球は、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）のいずれかにおいて、ドナー抗原により攻撃される（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）（Ｊ．Ｃａｉｅｔａｌ２００４）、（Ｊ．Ｃａｉｅｔａｌ２００４）および（Ｅ．Ｊａｎｋｏｗｓｋａ−ＧａｎＥｅｔａｌ２００２）、（Ｐ．Ｓａｇｏｏｅｔａｌ．２０１０）。これらのアッセイは、どの経路が寛容状態の特異性の原因であるかを明らかにすることができる唯一の試験であるため、機械論的観点から見て非常に貴重である。不運にも、これらのアッセイはまた、実行するのが難しく、研究室によって非常に異なり（標準化することが困難）、慎重に凍結保存されたドナー細胞が利用可能であることが必要とされる。これらの理由のために、機能アッセイは、広範囲の臨床応用には最適でなく、選抜された、非常に特殊化した研究室においてのみ、また基本的に研究目的のために現在利用されている。

抗原−非特異的な免疫のモニタリング試験は、ドナー抗原での攻撃を使用することなく、レシピエント免疫系の表現型の特徴付けに向けた様々な方法論を構成する。これらの試験の中で、Ｔ細胞受容体ＣＤＲ３長の分散パターン（ＴｃＬａｎｄｓｃａｐｅ）の研究、フローサイトメトリーを使用することによる末梢血赤血球の免疫表現型検査、および遺伝子発現解析は、ヒトにおける寛容性のバイオマーカー特性を識別するために利用されてきた。ＴｃＬａｎｄｓｃａｐｅ技術は、慢性拒否反応を受けるレシピエントと寛容性のある腎臓レシピエントとを区別するために、末梢血において利用されてきた（Ｓ．Ｂｒｏｕａｒｄｅｔａｌ．２００５）。しかしながら、この技術は、高価であり、現在１つの研究室（Ｉｎｓｅｒｍ６４３ａｎｄＴｃＬａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＮａｎｔｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）でのみ利用可能であり、肝移植に有効ではない。末梢血の免疫表現型検査の使用は、肝臓および腎臓の両方の寛容性のある移植レシピエントから末梢血サンプルによって使用されてきた。この方法論に取り組む少なくとも４つの研究は、発明者に公知である。アメリカ合衆国のピッツバーグ大学の第１の研究（Ｇ．Ｖ．Ｍａｚａｒｉｅｇｏｓｅｔａｌ２００３）において、ｐＤＣとｍＤＣの樹状細胞のサブセットの間の比率は小児の肝移植において寛容性と非寛容性のレシピエントを区別し得ると言われている。京都の第２の研究（Ｙ．Ｌｉｅｔａｌ２００４）において、末梢血中のデルタ−１とデルタ−２のガンマデルタＴ細胞の間の増加した比率は、非寛容性の肝臓レシピエントにおけるよりも寛容性の肝臓レシピエントにおいてより顕著であると言われている。発明者（Ｍａｒｔｉｎｅｚ-Ｌｌｏｒｄｅｌｌａｅｔａｌ２００７）によって調整された第３の研究において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数の増加およびデルタ−１のデルタ−２のガンマデルタＴ細胞に対する比率の増加は、非寛容性のレシピエントと比較して、寛容性の肝臓レシピエントの末梢血において顕著であった。しかしながら、デルタ−１とデルタ−２のガンマデルタの間の比率の値は、同じ群からの続く研究において疑問視された（Ｐｕｉｇ-Ｐｅｙｅｔａｌ．ＴｒａｎｓｐｌａｎｔＩｎｔ２０１０）。さらに、これらの試験はどれも、広範囲の臨床応用に必要な正確性を提供しない。寛容性のバイオマーカーを識別する遺伝子発現解析技術の使用は、腎臓移植および肝移植の両方において使用されてきた（Ｓ．Ｂｒｏｕａｒｄｅｔａｌ．ＰＮＡＳ２００７；Ｍ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ-Ｌｌｏｒｄｅｌｌａｅｔａｌ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２００８；Ｋ．Ｎｅｗｅｌｌｅｔａｌ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２０１０；Ｐ．Ｓａｇｏｏｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２０１０）。これらの技術は、以前に記載された試験より標準化するのがより容易である。さらに、参照された研究は、識別された転写バイオマーカーの使用が、免疫抑制薬のない寛容性のレシピエントと免疫抑制の維持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）を必要とする非寛容性のレシピエントとを区別する、非常に正確な手段であることを示した。これまでの文献で公開された研究の主な制約は、先見的に結果を実証しようと試みなかったことである。言いかえれば、これらのバイオマーカーが、免疫抑制が中止される前に寛容性のレシピエントを識別することができるかどうかを実証できなかったということである。この実証が欠如している中では、遺伝子発現で観察された差が、非寛容性のレシピエントの群における薬理学的な免疫抑制の効果によって実際には引き起こされないと確信することは不可能である。さらに、以前に報告された研究はどれも、遺伝子発現の違いが移植片自体のレベルでも存在するかどうかを調査しようと試みなかった。免疫抑制薬の長期にわたる使用は、現在、移植された同種移植片の長期生存を保証する唯一の手段であるが、これらの薬物は、高価であり、かなりの罹病率および死亡率につながる、重度の副作用（腎毒性、腫瘍および感染の進行、糖尿病、心血管合併症など）に関係する。したがって、移植中の免疫抑制薬の使用を著しく減少させることができる任意の方策は、移植レシピエントの健康および生活の質に大きな影響を与え得る。

結論として、肝移植患者における寛容性を予測することができる且つそれ故前記患者への免疫抑制薬の投与が免除され得ることを示唆することができる有効な方法の提供が、課題のままである。

それ故、本発明は、検査中の患者から得られた生体サンプルにおいて全身性及び／又は肝臓内のレベルを評価することによって、およびそれを参照サンプルの鉄貯蔵のレベル、または予め決められた閾値のいずれかと比較することによって、寛容性の肝移植レシピエントを識別する、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の方法を提供することによって、上記に述べられた課題を解決することを目標とする。これは、全身性及び／又は肝臓内の鉄貯蔵のレベル（遊離鉄として、あるいは伝達タンパク質またはフェリチンなどのタンパク質と結合した、身体に存在する鉄の総量）が、非寛容性の肝移植レシピエントと比較して寛容性の肝移植レシピエントにおける方が著しく高いという事実に基づく。

本発明の好ましい実施形態において、全身性及び／又は肝臓内の鉄貯蔵のレベルの評価は、肝移植患者における寛容性の予測が可能な信頼できるバイオマーカーである、鉄代謝に直接関係する遺伝子の特異的な群の発現特性の、検査中の患者の肝生検における評価の手段によって実行される。したがって、免疫抑制療法を中止し得る肝臓レシピエント（寛容）と、免疫抑制薬の維持を必要とする肝臓レシピエント（非寛容）との間の発現レベル特性の統計的有意差を示す、これらの遺伝子を識別する目的のため、肝生検の組織サンプルは、免疫抑制薬の離脱の予期される臨床試験に登録された、免疫抑制療法の維持下での、安定した肝移植レシピエントの群から集められた。

発現特性は、当業者に既知の任意の技術によって決定され得る。特に、各遺伝子の発現レベルは、ゲノム及び／又は核及び／又はタンパク質のレベルで測定され得る。好ましい実施形態において、発現特性は、各遺伝子の核酸転写物の量を測定することによって決定される。別の実施形態において、発現特性は、遺伝子の各々によって生成されたタンパク質の量の測定することによって決定される。

核酸転写物の量は、当業者に既知の任意の技術によって測定され得る。特に、測定は、抽出されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）サンプル上で、または当該技術分野に周知の技術によって抽出されたｍＲＮＡから調製された、レトロ転写した（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）上で直接実行され得る。ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのサンプルから、核酸転写物の量は、核のマイクロアレイ、定量的ＰＣＲ、および標識プローブを用いたハイブリダイゼーションを含む、当業者に既知の任意の技術を使用して測定され得る。

本発明の範囲を限定するものとして見なされるべきではない、特定の実施形態において、これらの生検の発現特性の決定は、ｐ値＜０．０１および偽発見率（ＦＤＲ）＜２５％を有する遺伝子を識別する、ＩｌｌｕｍｉｎａＢｅａｄｃｈｉｐの全ゲノム発現マイクロアレイを使用することによって行われた（表１）。

マイクロアレイ結果および免疫寛容の実験動物モデルにおいて行われた多くの研究に基づいて、その後、（表２にリストされた）１セットの１０４の遺伝子を、定量的リアルタイムＰＣＲを利用する実証（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）のために選択された。

リアルタイムＰＣＲによって行った実験の結果は、表３にリストされる遺伝子が、免疫抑制薬を安全に放棄することができる（寛容）肝移植患者から取られた生検と、免疫抑制薬が中止されるときに拒絶反応を受ける（非寛容）患者との間の発現の統計的有意差を示すことを明らかにした。表３に示すように、非寛容性の肝移植レシピエントと比較して寛容性の肝移植レシピエントでは、遺伝子ＴＦＲＣおよびＭＩＦはダウンレギュレートされ、遺伝子ＣＤＨＲ２、ＨＭＯＸ１、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＰＥＢＰ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＡＤＯＲＡ３およびＤＡＢ２はアップレギュレートされる。肝移植患者から取られた生検が、参照ＲＮＡサンプルと比較されると、同一の結果を得ることができる（これは、健康な非移植肝臓組織から得られたＲＮＡのプール、Ａｍｂｉｏｎからの市販のＨｕｍａｎＬｉｖｅｒＴｏｔａｌＲＮＡなどの参照ＲＮＡ、または事前に定量化した数のＲＮＡ分子を含むサンプルに存在する絶対参照であり得る）。

表３に含まれる遺伝子が、鉄代謝の調節に関係するため、機能的経路を共有することを留意することは重要である。事実、図１Ａに示されるように、うまく免疫抑制の投薬を中止することができる寛容性の患者の生検は、より多くの鉄の蓄積を示した。さらに、肝臓内の鉄含量のこれらの違いは、免疫抑制療法の移植またはタイプがベースラインで利用されてからの時間などの、任意の臨床的パラメーターとは無関係であった（図１Ｂ）。遺伝子ＴＦＲＣ、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧおよびＨＭＯＸ１が、細胞の鉄代謝の制御に直接関係することが知られている。特に、全身性の鉄欠乏の状況において、ＴＦＲＣ発現は典型的に増加されるが、一方で、ＨＡＭＰ発現は減少される。我々の実験において、鉄代謝の調節における寛容性と非寛容性の患者の間で差次的に発現することが分かっている遺伝子の関与は、ＴＦＲＣ、ＨＡＭＰ、ＣＤＨＲ２、ＭＩＦ、ＳＬＣ５Ａ１２、ＡＤＯＲＡ３、ＨＭＯＸ１、ＩＦＮＧおよびＤＡＢ２が、肝臓内の鉄の沈着と有意に相互に関連付けられるという観察によってさらに示された（Ｓｃｈｅｕｅｒの変更された方法または合計の鉄スコア方法（ｔｏｔａｌｉｒｏｎｓｃｏｒｅｍｅｔｈｏｄ）によって測定された；図２を参照）。そのため、表３に含まれる遺伝子の発現特性が、非寛容性の患者（図２）と比較した寛容性の患者における、著しく高いレベルの全身性及び／又は肝臓内の鉄貯蔵の存在の明確な指標であり、それ故、結果的に寛容性の肝移植レシピエントの識別のための信頼できるバイオマーカーであることが明言できる。

より具体的には、これらの結果は、鉄代謝の前記調節に関係する遺伝子の発現レベルが、本発明による方法の考案に特に関連するはずであることを示す。故に、肝臓内レベルでの鉄代謝の調節に属する遺伝子の任意の発現特性は、記載される且つ請求される本発明において、同等の発現特性、またはパターンと見なされるべきである。したがって、肝臓における鉄代謝の前記調節に属する任意の遺伝子の発現は、本発明に記載される遺伝子の機能的な同等物と見なされるべきである。

それ故、本発明の好ましい実施形態は、肝移植を受けた患者の寛容状態のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の診断及び／又は予後のための方法に言及し、該方法は：
ａ．検査中の患者の肝臓同種移植片から生体サンプルを得る工程；
ｂ．以下の遺伝子：ＴＦＲＣ、ＣＤＨＲ２、ＨＭＯＸ１、ＭＩＦ、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＰＥＢＰ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＡＤＯＲＡ３およびＤＡＢ２、あるいはそれらの組み合わせ又は同等物の少なくとも１つの発現レベルを測定する工程；
ｃ．工程ｂ）の遺伝子の少なくとも１つの移植片内の発現レベルを、肝生検を得たサンプルにおいて、参照ＲＮＡサンプルから得た同じ遺伝子の発現レベルと比較することによって、移植した肝臓同種移植片に対する、検査中の患者の寛容性または非寛容性を評価する工程を含む。

参照サンプルは、健康な移植されていない被験体の肝臓組織の生体サンプルから得られた予め決められた発現特性である。それは、ＲＮＡのプール、Ａｍｂｉｏｎからの市販のＨｕｍａｎＬｉｖｅｒＴｏｔａｌＲＮＡなどの参照ＲＮＡ、または事前に定量化した数のＲＮＡ分子を含むサンプルに存在する絶対参照であり得る。

表４で以下に示されるように、表３に含まれる遺伝子の各々の発現レベルの測定は、拒絶反応を受けることなく（寛容性）安全に免疫抑制の投薬をすべて中止することができる患者の識別に有用である。それ故、この表４は、免疫抑制の投薬が中止されるときに拒絶反応を示すレシピエントから、免疫抑制療法の欠如下で移植肝臓に寛容性のある患者を統計的に識別する、そこにリストされた個々の遺伝子の能力を示す。

しかしながら、表３または４に引用された遺伝子は、個々に予測能力を有するが、できるだけ正確に予測的方法を識別する目的で、前記遺伝子のいくつかの組み合わせから逸脱して、異なるクラスターが作られた。さらに、表３または４にリストされた遺伝子はまた、（独立して得られるような）それ自体では予測値を示さなかった他の遺伝子、例えば：ＬＣ５Ａ１２、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＴＴＣ３、ＲＢＭ２３、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＮＣＲ１、ＴＦＲＣ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＴＡＦ１５、ＴＩＰＡＲＰ、ＭＯＸ１、ＭＣＯＬＮ１、ＥＢＰ１、ＤＨＲ２、およびＡＢ２とともにグループ化された。それ故、好ましい実施形態において、本発明は、以下の遺伝子の少なくとも１つの発現レベルを測定することをさらに含む：表３または４にリストされた遺伝子の少なくとも１つと組み合わせた、ＬＣ５Ａ１２、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＴＴＣ３、ＲＢＭ２３、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＮＣＲ１、ＴＦＲＣ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＴＡＦ１５、ＴＩＰＡＲＰ、ＭＯＸ１、ＭＣＯＬＮ１、ＥＢＰ１、ＤＨＲ２、およびＡＢ２。

肝移植における免疫抑制薬の離脱の結果の診断において最良の性能を有する遺伝子発現バイオマーカーの組み合わせ（複数可）を識別するために、線形判別分析および誤分類罰則付き事後分類（ｍｉｓｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｅｎａｌｉｚｅｄｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）（ＭｉＰＰ）ソフトウェアにおいて実施されたロジスティク回帰アルゴリズムを利用する予測モデルの徹底的な調査を行った。最初に、ＨｏｓｐｉｔａｌＣｌｉｎｉｃＢａｒｃｅｌｏｎａに登録された患者から収集した肝臓サンプルの群（１８が寛容および３１が非寛容）上で１０倍交差検定の工程を実行した。次に、診断用モデルのランダムに分割する交差検定を、外部モデル確認のために訓練事例（２／３）および独立したテスト事例（１／３）へと繰り返し分割することによって、（Ｂａｒｃｅｌｏｎａからの５６のサンプルおよびＲｏｍｅおよびＬｅｕｖｅｎからの２１の追加サンプルを含む）全体的なデータセット上で行った。さらに、訓練事例で識別された各モデルに関して、寛容性の最適確率のカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）を、ＲＯＣ（受信者動作曲線）分析を利用して計算した。モデルの性能が中央依存（ｃｅｎｔｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）ではなかったことを実証するために、その後、ＳＮ、ＳＰ、ＮＰＶ、ＰＰＶおよびＢａｒｃｅｌｏｎａから収集されたサンプルおよびＲｏｍｅおよびＬｅｕｖｅｎから得られたサンプルに関する全体的なエラー率を計算した。重要なことに、すべての遺伝子発現の測定を、免疫抑制投薬が中止される前に得られたサンプル上で実行した。それ故、識別された遺伝マーカーが、免疫抑制薬の離脱の成功を予測することができることを結果は示している。

上に引用されるように、このタイプの分析は、差次的に発現された遺伝子（表３）であると分かったこれらの遺伝子だけでなく、独立して得られるように、統計的に差次的発現されていないが、表３の遺伝子と組み合わせて診断を最適化することの一因となる遺伝子をも考慮に入れる。表５は、リアルタイムＰＣＲによって測定された遺伝子の肝生検での発現に基づいた予測モデルの設計および評価のために利用されるサンプルの群を示す。重要なことに、Ｂａｒｃｅｌｏｎａのレシピエントから収集されたサンプルは、マイクロアレイとｑＰＣＲ実験の両方のために利用されたが、一方でＲｏｍｅおよびＬｅｕｖｅｎから得られたサンプルはどれも、マイクロアレイ実験で利用されなかった。

したがって、表６は、遺伝子の発現が、ｑＰＣＲ発現の測定の結果による非寛容性または寛容性のカテゴリーへと患者を最適に分類する、遺伝子の組み合わせを示す。学習群において１５％未満および実証群において１５％未満の分類エラーを、最も正確で、臨床的に有用なモデルを選択するために、恣意的に選択した。

本発明の１つの実施形態は、以下の遺伝子の少なくとも１つ又はそれらの組み合わせの使用に言及する：肝移植を受けた患者の寛容状態のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の診断及び／又は予後のための方法における、ＴＦＲＣ、ＣＤＨＲ２、ＨＭＯＸ１、ＭＩＦ、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＰＥＢＰ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＡＤＯＲＡ３およびＤＡＢ２。好ましい実施形態において、本発明の方法は、以下の遺伝子の少なくとも１つと、上記の引用された遺伝子の少なくとも１つとの組み合わせを使用して実行される：ＬＣ５Ａ１２、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＴＴＣ３、ＲＢＭ２３、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＮＣＲ１、ＴＦＲＣ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＴＡＦ１５、ＴＩＰＡＲＰ、ＭＯＸ１、ＭＣＯＬＮ１、ＥＢＰ１、ＤＨＲ２およびＡＢ２。特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、以下の遺伝子の組合せの１つを使用して実行される：ＬＣ５Ａ１２、ＶＮＮ３、ＴＦＲＣ、ＳＯＣＳ１、ＭＩＦ、ＴＴＣ３、ＲＢＭ２３、ＰＥＢＰ１、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＮＣＲ１、ＤＡＢ２およびＡＤＯＲＡ３；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＴＴＣ３、ＨＭＯＸ１、ＶＮＮ３、ＮＣＲ１、ＡＤＯＲＡ３、ＴＡＦ１５、ＩＦＮＧ、ＳＯＣＳ１およびＴＩＰＡＲＰ；ＭＯＸ１、ＣＤＨＲ２、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＴＦＲＣ、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＯＣＳ１、ＨＡＭＰ、ＶＮＮ３およびＩＦＮＧ；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＳＬＣ５Ａ１２、ＨＡＭＰ、ＳＯＣＳ１、ＩＦＮＧおよびＨＭＯＸ１；ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＣＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３、ＨＡＭＰ、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＨＭＯＸ１およびＤＡＢ２；ＴＦＲＣ、ＤＡＢ２、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＩＦＮＧ、ＨＡＭＰ、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＯＣＳ１、ＶＮＮ３、ＡＤＯＲＡ３、ＣＤＨＲ２、ＭＣＯＬＮ１およびＨＭＯＸ１；ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＨＭＯＸ１、ＭＣＯＬＮ１、ＭＩＦ、ＨＡＭＰ、ＡＤＯＲＡ３、ＣＤＨＲ２、ＰＥＢＰ１およびＳＯＣＳ１；ＥＢＰ１、ＴＦＲＣ、ＨＭＯＸ１、ＩＦＮＧ、ＭＣＯＬＮ１、ＳＯＣＳ１、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰおよびＡＤＯＲＡ３；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＩＦＮＧ、ＣＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３、ＶＮＮ３、ＨＭＯＸ１、ＤＡＢ２、ＳＯＣＳ１、ＭＩＦおよびＨＡＭＰ；ＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３、ＩＦＮＧ、ＴＦＲＣ、ＶＮＮ３、ＨＭＯＸ１、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＳＬＣ５Ａ１２、ＨＡＭＰ、ＳＯＣＳ１およびＭＣＯＬＮ１；ＬＣ５Ａ１２、ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＭＩＦ、ＤＡＢ２、ＨＭＯＸ１、ＣＤＨＲ２、ＳＯＣＳ１、ＨＡＭＰ、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＡＤＯＲＡ３およびＭＣＯＬＮ１；ＴＦＲＣ、ＳＯＣＳ１、ＨＭＯＸ１、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＤＡＢ２、ＭＣＯＬＮ１、ＡＤＯＲＡ３およびＭＩＦ；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＭＩＦ、ＨＭＯＸ１、ＤＡＢ２、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＣＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３およびＭＣＯＬＮ１；ＬＣ５Ａ１２、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＡＤＯＲＡ３、ＨＡＭＰ、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＭＣＯＬＮ１、ＰＥＢＰ１およびＨＭＯＸ１；ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＣＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＭＩＦ、ＨＭＯＸ１、ＭＣＯＬＮ１、ＳＯＣＳ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＤＡＢ２およびＨＡＭＰ；ＴＦＲＣ、ＶＮＮ３、ＨＡＭＰ、ＣＤＨＲ２、ＳＬＣ５Ａ１２、ＨＭＯＸ１、ＳＯＣＳ１、ＰＥＢＰ１およびＭＩＦ；ＡＢ２、ＴＦＲＣ、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＴＴＣ３、ＨＭＯＸ１およびＳＯＣＳ１；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＶＮＮ３、ＩＦＮＧ、ＭＣＯＬＮ１およびＳＯＣＳ１；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＳＯＣＳ１およびＣＤＨＲ２；ＡＤＯＲＡ３、ＣＤＨＲ２、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＴＡＦ１５およびＴＦＲＣ；ＣＤＨＲ２、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＦ１５およびＴＦＲＣ；ＡＤＯＲＡ３、ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰ、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＳＯＣＳ１、ＴＡＦ１５およびＴＦＲＣ；ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＭＣＯＬＮ１、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＳＯＣＳ１、ＴＦＲＣおよびＶＮＮ３。

いくつかの臨床的な変化は、ヒトにおける肝移植後の操作上の寛容性の発達に影響を与え得る。特に、より長期間での移植であるほど又はより高齢であるほどレシピエントは、より高い可能性で免疫抑制の投薬をうまく中止することができる。遺伝子発現の測定に関するこれらの２つの臨床的な変化の生じうる交絡的影響を排除するために、追加のロジスティク回帰分析を行った。表３または４に表された遺伝子のうち、以下の遺伝子は、レシピエントの年齢および移植後の時間の影響を排除した後に統計的に有意であることが分かった（表７）。

臨床的な変化から独立した遺伝的な予測因子を発達させるために、表７に示される遺伝子上で、ロジスティク回帰およびＭｉＰＰソフトウェアを利用した。以下のモデルは、患者の学習群と実証群の両方における最良の予測因子であることが分かった（表８）。

したがって、本発明のさらなる実施形態は、以下の組み合わせの遺伝子の遺伝子発現を測定することによる、肝移植を受けた患者の寛容状態のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の診断及び／又は予後のための方法に言及する：ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧおよびＣＤＨＲ２。

本発明による方法の特定の実施形態において、前記方法はさらに、診断及び／又は予後に有用な少なくとも１つの追加のパラメーターを決定する工程を含み得る。このような「診断に有用なパラメーター」は、診断のために単独では使用できないが、寛容性の被験体と、明らかに免疫抑制療法を必要とする被験体との間の著しく異なる値を示すように記載されてきたパラメーターであり、そのため、本発明による上に記載される方法に従って診断を洗練及び／又は確認するためにも使用され得る。それ故、本発明のさらなる実施形態は、上に記載されるような方法であり、該方法は、患者の年齢及び／又は移植後時間の決定をさらに含む。

本発明の別の実施形態は、肝移植を受けた患者の寛容状態のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の診断及び／又は予後の方法を実行するためのキットに言及し、該キットは、（ｉ）対応する遺伝子の遺伝子発現レベルを測定するための手段、および（ｉｉ）参照ＲＮＡサンプルから得られた同じ遺伝子の発現レベルより上または下の前記遺伝子発現レベルを相互に関連付けるための説明書を含む。

前記参照サンプルは、健康な非移植肝臓組織から得られたＲＮＡのプール、Ａｍｂｉｏｎからの市販のＨｕｍａｎＬｉｖｅｒＴｏｔａｌＲＮＡなどの参照ＲＮＡ、または事前に定量化した数のＲＮＡ分子を含むサンプルに存在する絶対参照であり得る。好ましい実施形態において、手段は、核酸プローブを含むマイクロアレイまたは遺伝子チップを含み、前記核酸プローブは、マイクロアレイ分析を実行するための試薬とともに、対応する組の遺伝子の転写物に特異的にハイブリッド形成する配列を含む。本発明の別の好ましい実施形態において、キットは、定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行するための、オリゴヌクレオチドプライマー（すなわち遺伝子ＴＦＲＣのためのＨＳ０２５５９８１８ｓ１または遺伝子ＶＮＮ３のためのＨｓ０１１２５１６８ｍ１）を含み、前記プライマーは、対応する組の遺伝子の転写物に由来する相補的ＤＮＡに特にハイブリッド形成する配列を含む。その上、本発明のキットは、固体支持体（ｓｏｌｉｄｓｕｐｐｏｒｔ）を含み得、ここで、対応する組の遺伝子の転写物に特にハイブリッド形成する配列を含む核酸プローブが、その上で示される。

別の実施形態において、手段は、モノクローナル抗体またはそのフラグメントなどの、特異的結合部分を含むマイクロアレイまたはタンパク質チップを含む。

１つの実施形態において、本発明のキットは、以下の遺伝子の少なくとも１つ又はそれらの組み合わせの発現を測定する：肝移植を受けた患者の寛容状態のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の診断及び／又は予後のための、ＴＦＲＣ、ＣＤＨＲ２、ＨＭＯＸ１、ＭＩＦ、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＰＥＢＰ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＡＤＯＲＡ３およびＤＡＢ２。好ましい実施形態において、本発明のキットは、上記の引用された遺伝子の少なくとも１つと、以下の遺伝子の少なくとも１つとの組み合わせの遺伝子発現を測定する：ＬＣ５Ａ１２、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＴＴＣ３、ＲＢＭ２３、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＮＣＲ１、ＴＦＲＣ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＴＡＦ１５、ＴＩＰＡＲＰ、ＭＯＸ１、ＭＣＯＬＮ１、ＥＢＰ１、ＤＨＲ２およびＡＢ２。特に好ましい実施形態において、本発明のキットは、以下の遺伝子の組合せの遺伝子発現を測定する：ＬＣ５Ａ１２、ＶＮＮ３、ＴＦＲＣ、ＳＯＣＳ１、ＭＩＦ、ＴＴＣ３、ＲＢＭ２３、ＰＥＢＰ１、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＮＣＲ１、ＤＡＢ２およびＡＤＯＲＡ３；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＴＴＣ３、ＨＭＯＸ１、ＶＮＮ３、ＮＣＲ１、ＡＤＯＲＡ３、ＴＡＦ１５、ＩＦＮＧ、ＳＯＣＳ１およびＴＩＰＡＲＰ；ＭＯＸ１、ＣＤＨＲ２、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＴＦＲＣ、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＯＣＳ１、ＨＡＭＰ、ＶＮＮ３およびＩＦＮＧ；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＳＬＣ５Ａ１２、ＨＡＭＰ、ＳＯＣＳ１、ＩＦＮＧおよびＨＭＯＸ１；ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＣＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３、ＨＡＭＰ、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＨＭＯＸ１およびＤＡＢ２；ＴＦＲＣ、ＤＡＢ２、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＩＦＮＧ、ＨＡＭＰ、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＯＣＳ１、ＶＮＮ３、ＡＤＯＲＡ３、ＣＤＨＲ２、ＭＣＯＬＮ１およびＨＭＯＸ１；ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＨＭＯＸ１、ＭＣＯＬＮ１、ＭＩＦ、ＨＡＭＰ、ＡＤＯＲＡ３、ＣＤＨＲ２、ＰＥＢＰ１およびＳＯＣＳ１；ＥＢＰ１、ＴＦＲＣ、ＨＭＯＸ１、ＩＦＮＧ、ＭＣＯＬＮ１、ＳＯＣＳ１、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰおよびＡＤＯＲＡ３；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＩＦＮＧ、ＣＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３、ＶＮＮ３、ＨＭＯＸ１、ＤＡＢ２、ＳＯＣＳ１、ＭＩＦおよびＨＡＭＰ；ＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３、ＩＦＮＧ、ＴＦＲＣ、ＶＮＮ３、ＨＭＯＸ１、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＳＬＣ５Ａ１２、ＨＡＭＰ、ＳＯＣＳ１およびＭＣＯＬＮ１；ＬＣ５Ａ１２、ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＭＩＦ、ＤＡＢ２、ＨＭＯＸ１、ＣＤＨＲ２、ＳＯＣＳ１、ＨＡＭＰ、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＡＤＯＲＡ３およびＭＣＯＬＮ１；ＴＦＲＣ、ＳＯＣＳ１、ＨＭＯＸ１、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＤＡＢ２、ＭＣＯＬＮ１、ＡＤＯＲＡ３およびＭＩＦ；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＭＩＦ、ＨＭＯＸ１、ＤＡＢ２、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＣＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３およびＭＣＯＬＮ１；ＬＣ５Ａ１２、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＡＤＯＲＡ３、ＨＡＭＰ、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＭＣＯＬＮ１、ＰＥＢＰ１およびＨＭＯＸ１；ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＣＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＭＩＦ、ＨＭＯＸ１、ＭＣＯＬＮ１、ＳＯＣＳ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＤＡＢ２およびＨＡＭＰ；ＴＦＲＣ、ＶＮＮ３、ＨＡＭＰ、ＣＤＨＲ２、ＳＬＣ５Ａ１２、ＨＭＯＸ１、ＳＯＣＳ１、ＰＥＢＰ１およびＭＩＦ；ＡＢ２、ＴＦＲＣ、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＴＴＣ３、ＨＭＯＸ１およびＳＯＣＳ１；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＶＮＮ３、ＩＦＮＧ、ＭＣＯＬＮ１およびＳＯＣＳ１；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＳＯＣＳ１およびＣＤＨＲ２；ＡＤＯＲＡ３、ＣＤＨＲ２、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＴＡＦ１５およびＴＦＲＣ；ＣＤＨＲ２、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＦ１５およびＴＦＲＣ；ＡＤＯＲＡ３、ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰ、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＳＯＣＳ１、ＴＡＦ１５およびＴＦＲＣ；ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＭＣＯＬＮ１、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＳＯＣＳ１、ＴＦＲＣおよびＶＮＮ３。

本発明の好ましい実施形態の１つは、遺伝子の以下の組み合わせの遺伝子発現を測定する、肝移植を受けた患者の寛容状態のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の診断及び／又は予後のためのキットに言及する：ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧおよびＣＤＨＲ２。

本発明によるキットは、マイクロアレイ分析を行うための試薬、及び／又は固体支持体をさらに含み得、ここで、対応する組の遺伝子の転写物に特にハイブリッド形成する配列を含む核酸プローブが、その上で示される。

本発明の別の実施形態は、上記の開示された方法またはキットの使用により肝臓レシピエントの寛容状態を評価することによって、免疫療法処置プロトコルを選択する又は変更するためのキットに言及する。

本発明の最後の実施形態は、肝臓移植を受けた患者の免疫抑制療法を適応させる方法に言及し、前記方法は、上記の開示された方法およびキットの使用を含む。

先行技術は、寛容性の肝臓レシピエントを識別する方法として、本発明で提示されるものとは異なる遺伝子の群（ＫＬＲＦ１、ＰＴＧＤＲ、ＮＣＡＬＤ、ＣＤ１６０、ＩＬ２ＲＢ、ＰＴＣＨ１、ＥＲＢＢ２、ＫＬＲＢ１、ＮＫＧ７、ＫＬＲＤ１、ＦＥＺ１、ＧＮＰＴＡＢ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＬＩＣ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＷＤＲ６７、ＭＡＮ１Ａ１、ＣＤ９、ＦＬＪ１４２１３、ＦＥＭ１Ｃ、ＣＤ２４４、ＰＳＭＤ１４、ＣＴＢＰ２、ＺＮＦ２９５、ＺＮＦ２６７、ＲＧＳ３、ＰＤＥ４Ｂ、ＡＬＧ８、ＧＥＭＩＮ７）の発現の末梢血サンプルにおける測定を含む（ＢｅｎｉｔｅｚＣｅｔａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ #５１７，ＡｍｅｒｉｃａｎＴｒａｎｓｐｌａｎｔＣｏｎｇｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｍａｙ３ - Ｍａｙ５，２０１０）。本発明の一部を形成する遺伝子が、末梢血における以前に開示された遺伝子と比較して、より高い弁別力を有するかどうかを測定するために、比較アッセイを行った（実施例１０を参照）。肝臓の組織サンプル中の本発明に含まれる遺伝子の発現の測定は、移植に対して寛容性があるため免疫抑制の投薬をうまく断つことができる肝臓レシピエントを識別するために、末梢血中の先行技術に含まれる遺伝子の測定よりも少なくとも正確である（ａｓｌｅａｓｔａｓａｃｃｕｒａｔｅｔｈａｎ）ように結論付けられる。

その上、本発明は、肝臓同種移植片に対する操作上の寛容性の獲得における鉄代謝の役割を支持する更なる証拠を提案する：
・Ｓｃｈｅｕｅｒの変更された方法または合計の鉄スコア方法のいずれかを利用するＰｅｒｌの染色後の半定量的な方法で測定された、肝臓鉄含量（肝臓内の鉄貯蔵）は、非寛容性の肝臓レシピエントにおけるよりも寛容性の肝臓レシピエントにおいて著しく多い（図１を参照）。
・実際、ＨＡＭＰによってコード化される、全身性の鉄ホメオスタシスの調節に最も重要なホルモンである、ヘプシジンの血清レベルは、非寛容性の肝臓レシピエントにおけるよりも寛容性の肝臓レシピエントにおいて著しく高い（図３および実施例９を参照）。これは、鉄欠乏の状況での生理反応がヘプシジンの生成を減少させると仮定すれば、鉄貯蔵が非寛容性の肝臓レシピエントにおけるよりも寛容性の肝臓レシピエントにおいてより多いという観察と一致している。
・全身の鉄蓄積の最も正確なマーカーの１つである、フェリチンの血清レベルは、非寛容性の肝臓レシピエントにおけるよりも寛容性の肝臓レシピエントにおいて著しく高い（図４ＡおよびＢと実施例１１を参照）；
・肝臓組織ホスホ−Ｓｔａｔ３のタンパク質レベルは、非寛容性のレシピエントにおけるよりも寛容性のレシピエントにおける方が著しく高い（図５および実施例１２を参照）。これは、ヘプシジンがＳｔａｔ３をリン酸化し、それ故、（例えば鉄欠乏の結果として）ヘプシジンの欠如下では、ホスホ−Ｓｔａｔ３のレベルが減少するという観察と一致している。

まとめると、これらの結果は、全身性および肝臓内のレベルでの鉄代謝の調節が、転写因子Ｓｔａｔ３の活性化の移植片内の調節による肝移植中の同種免疫反応の制御において役割を果たすことを示す。同様に、肝臓内の鉄レベル、血清ヘプシジンおよび血清フェリチンの定量化もまた、本発明に記載される遺伝子の機能的な同等物と見なされるべきである。

それ故、本発明の別の実施形態は、肝移植を受けた患者の寛容状態のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の診断及び／又は予後のための方法に言及し、該方法は：検査中の患者の肝臓同種移植片から生体サンプルを得る工程、前記サンプル中で肝臓内の鉄貯蔵のレベルを測定する工程、および上に引用されるように、肝臓内の鉄貯蔵のレベルが、非寛容性の肝移植レシピエントと比較して寛容性の肝移植レシピエントにおける方が著しく高いことが分かっているため、肝臓内の鉄貯蔵のレベルを、参照サンプルから得られた肝臓内の鉄貯蔵のレベルと比較することによって、肝移植に対する、検査中の患者の寛容性または非寛容性を評価する工程を含む。肝臓内の鉄貯蔵のレベルの評価は、先行技術に公知の任意の手段によって、例えば（非徹底的なリスト）：鉄特異的な染色（例えばＰｅｒｌのプルシアンブルー）を用いて肝生検スライド（ｌｉｖｅｒｂｉｏｐｓｙｓｌｉｄｅｓ）の直接的な染色によって、原子吸光分析を利用する肝臓組織の生検からの鉄の定量化によって、または肝臓全体の磁気共鳴画像法によって、行うことができる。この場合、参照値は、図１に示されるような寛容性の肝移植患者と非寛容性の肝移植患者との間で観察される差に基づいて予め定義された、閾値である。

本発明の別の実施形態は、肝移植を受けた患者の寛容状態のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の診断及び／又は予後のための方法に言及し、該方法は：検査中の患者の血清から生体サンプルを得る工程、前記サンプルにおいてタンパク質フェリチンのレベルを測定する工程、および上に引用されるように、フェリチンの血清レベルが、非寛容性の肝移植レシピエントにおけるよりも寛容性の肝移植レシピエントにおける方が著しく高いことが分かっているため、フェリチンのレベルを、参照サンプルから得られた同じタンパク質のレベルと比較することによって、肝移植に対する、検査中の患者の寛容性または非寛容性を評価する工程を含む。タンパク質フェリチンのレベルの評価は、先行技術に公知の任意の手段によって、例えば（非徹底的なリスト）：ＥＬＩＳＡおよび放射免疫定量法によって行うことができる。この場合、参照値は、図４に示されるような寛容性の肝移植患者と非寛容性の肝移植患者との間で観察される差に基づいて予め定義された、閾値である。

本発明の別の実施形態は、肝移植を受けた患者の寛容状態のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の診断及び／又は予後のための方法に言及し、該方法は：検査中の患者の肝臓同種移植片から生体組織サンプルを得る工程、前記サンプルにおいてホスホ−Ｓｔａｔ３のタンパク質レベルを測定する工程、および上に引用されるように、ホスホ−Ｓｔａｔ３の肝臓組織レベルが、非寛容性の肝移植レシピエントにおけるよりも寛容性の肝移植レシピエントにおける方が著しく高いことが分かっているため、ホスホ−Ｓｔａｔ３のレベルを、参照サンプルから得られた同じタンパク質のタンパク質レベルと比較することによって、肝移植に対する、検査中の患者の寛容性または非寛容性を評価する工程を含む。肝臓組織ホスホ−Ｓｔａｔ３のレベルの評価は、先行技術に公知の任意の手段によって、例えば（非徹底的なリスト）：免疫組織化学、免疫蛍光法およびウェスタンブロットによって行うことができる。この場合、参照値は、上に引用されるように、肝臓内のホスホ−Ｓｔａｔ３のレベルが、図５に示されるように非寛容性の肝移植レシピエントと比較して寛容性の肝移植レシピエントにおける方が著しく高いことが分かっているため、予め定義された閾値または参照サンプルである。

本発明の別の実施形態は、肝移植を受けた患者の寛容状態のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）の診断及び／又は予後のための方法に言及し、該方法は：検査中の患者から生体サンプルを得る工程、前記サンプルにおいてヘプシジンのタンパク質レベルを測定する工程、および上に引用されるように、ヘプシジンの血清レベルが、非寛容性の肝移植レシピエントにおけるよりも寛容性の肝移植レシピエントにおける方が著しく高いことが分かっているため、ヘプシジンのタンパク質レベルを、参照サンプルから得られた同じタンパク質のタンパク質レベルと比較することによって、肝移植に対する、検査中の患者の寛容性または非寛容性を評価する工程を含む。ヘプシジンのレベルの評価は、先行技術に公知の任意の手段によって、例えば（非徹底的なリスト）：質量分析法とＥＬＩＳＡによって行うことができる。この場合、参照サンプルは、ヘプシジンの血清レベルが、図３に示されるように非寛容性の肝移植レシピエントにおけるよりも寛容性の肝移植レシピエントにおける方が著しく高いことが分かっているため、既知濃度を有するヘプシジンアナログに存在する。

（Ａ）（Ｓｃｈｅｕｅｒの変更された方法または合計の鉄スコア方法のいずれかを利用するＰｅｒｌの染色後の半定量的な方法で測定された）肝臓の鉄含量は、免疫抑制療法をうまく断ち得る寛容性（ＴＯＬ）の患者の肝臓における方が、それが不可能な非寛容性（非ＴＯＬ）の患者の肝臓におけるよりも著しく高い。（Ｂ）Ｓｃｈｅｕｅｒの方法によって評価されるような肝臓内の鉄染色の存在または欠如は、移植後経過した時間（左のパネル）、およびベースラインで利用される免疫抑制薬のタイプ（右のパネル）と無関係であり、寛容性（黒色のバー）の患者と、非寛容性（白色のバー）の患者とを区別するために利用され得る。図２は、（Ｓｃｈｅｕｅｒの変更された方法によって測定された）肝臓内の鉄のレベルに対する個々の遺伝子発現の測定の影響度を示す。最も高いバーは、最も影響力のある遺伝子（ＨＡＭＰ、ＴＦＲＣ、ＣＤＨＲ２）に相当する。参照線は、ＧｏｅｍａｎＧｌｏｂａｌｔｅｓｔによって測定されるような統計的有意差の閾値である。図３は、ヘプシジン（遺伝子ＨＡＭＰによってコード化されたペプチド）の血清レベルが、非寛容性の肝臓レシピエントと比較して、寛容性のレシピエントにおける方が著しく増加していることを示す。（Ａ）図４のＡは、フェリチン（全身性の身体鉄貯蔵のマーカー）の血清レベルが、非寛容性の肝臓レシピエントにおけるよりも寛容性の肝臓レシピエントにおける方が著しく高いことを示す。（Ｂ）図４のＢは、寛容性（ＴＯＬ）および非寛容性（非ＴＯＬ）のレシピエント間のフェリチン血清レベルの分布を示す：フェリチン＜１２ｎｇ／ｍＬ（消耗した鉄貯蔵）、フェリチン１２−３０ｎｇ／ｍＬ（減少した鉄貯蔵）、フェリチン＞３０ｎｇ／ｍＬ（十分な鉄貯蔵）。示されるように、寛容性の患者は誰も、消耗した鉄貯蔵を示さず、少数のみが、減少した鉄貯蔵を示す。対照的に、非寛容性の患者のおよそ３０％は、異常に低い全身性の鉄貯蔵を示す。図５は、リン酸化したＳＴＡＴ３に対してポジティブに染色する、肝臓組織切片の領域が、非寛容性（非ＴＯＬ）の肝臓レシピエントにおけるよりも寛容性（ＴＯＬ）の肝臓レシピエントにおける方が著しく大きいことを示す。

＜実施例＞
実施例１．患者集団および研究設計。
血液および肝生検の標本を、肝移植における免疫抑制薬の離脱の予期されるＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎに支持されたマルチセンター臨床試験に登録された肝移植レシピエントの群から収集した（名称：ＳｅａｒｃｈｆｏｒｔｈｅｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＳｉｇｎａｔｕｒｅｏｆＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌＴｏｌｅｒａｎｃｅｉｎＬｉｖｅｒＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＮＣＴ００６４７２８３）。包含基準は以下の通りであった：１）移植後３年より長い；２）包含前１２か月間で、肝機能が安定しており、拒絶反応の発症がない。３）自己免疫性肝疾患の病歴がない。４）有意な異常のない肝生検を事前に包含している（Ｂａｎｆｆ基準による急性または慢性の拒否反応の徴候がない；門脈路の＞５０％において門脈の炎症がない；中心静脈の＞５０％において中心細静脈（ｃｅｎｔｒａｌｐｅｒｉｖｅｎｕｌｉｔｉｔｓ）がない；架橋の線維症または硬変症がない）。登録されたレシピエントにおいて、免疫抑制薬を、６−９か月の期間にわたって完全に中止するまで徐々に遠ざけ、その後、さらなる１２か月のフォローアップを行った。拒絶反応の発症が研究の全期間の間に生じず、有意な組織学的変化が、１２か月のフォローアップ期間の最後に得られた肝生検において示されなかった場合、患者を寛容性であると見なした。研究の間に急性拒絶反応を受ける患者を、非寛容性として見なした。試験に登録した１０２のレシピエントのうち、７９のレシピエント（３３は寛容性であり、４６は非寛容性である）を、今回の研究に含んだ。非寛容性のレシピエント（ｎ＝１４）からの拒絶反応の時に、および寛容性のレシピエント（ｎ＝４）における研究の終わりに、免疫抑制薬が寛容性（ＴＯＬ、ｎ＝３３）および非寛容性（非ＴＯＬ、ｎ＝４６）の両方のレシピエントから中止される前に、研究に利用可能な血液と肝生検の標本を得た。さらに、肝臓組織サンプルも以下の患者群から得た：ａ）再発性Ｃ型肝炎ウイルス感染による慢性肝炎を有する肝移植レシピエント（ＨＥＰＣ、ｎ＝１２）；ｂ）移植後早期に起こる典型的な急性細胞性拒絶を有する肝移植レシピエント（ＲＥＪ、ｎ＝９）；ｃ）移植後１年の正常な肝機能および正常な肝臓組織学的検査を有する免疫抑制の維持下の肝移植レシピエント（ＣＯＮＴ−Ｔｘ、ｎ＝８）；およびｄ）結腸直腸の肝転移の手術を受けている、移植されていない患者（ＣＯＮＴ、ｎ＝１０）。参加するレシピエントは、ＨｏｓｐｉｔａｌＣｌｉｎｉｃＢａｒｃｅｌｏｎａ (Ｓｐａｉｎ)、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＴｏｒＶｅｒｇａｔａＲｏｍｅ (Ｉｔａｌｙ)およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌｓＬｅｕｖｅｎ (Ｂｅｌｇｉｕｍ)から登録された。研究は、３つの参加する機関の施設内治験審査委員会によって認可され、書面のインフォームドコンセントは、すべての研究患者から得られた。研究に含まれる患者の臨床的および人口統計的特性は、表１に要約され、研究設計の概要は図１に表される。患者集団の詳細な記載および免疫抑制離脱の臨床試験の臨床結果は、別途報告される。

実施例２．肝生検標本および組織学的評価。
肝生検を、局所麻酔下で皮膚を通して実行した。針生検肝臓シリンダーの２−３ｍｍの部分を、ＲＮＡｌａｔｅｒ試薬（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＵＳＡ）にすぐに保存し、４℃で２４時間維持し、その後、ＲＮＡｌａｔｅｒ試薬の除去後に液体窒素中に凍結保存した。残りのシリンダーを、ホルマリン固定し、パラフィン包理した。ＣＯＮＴ患者において、非腫瘍肝臓の外科的な肝生検を得て、以前に記載されたように処理した。組織学的評価のために、３μｍの厚さのスライドを、結合組織分析のために、三色のヘマトキシリン−エオシンおよびマソン３色を使用して染色した。組織学的検査を、すべての臨床的および生物学的なデータを知らされていなかった同じ病理学者によって実行した。以下の組織病理学的事項を、半定量的に評価し採点した：１）完全な門脈路の数；２）中心静脈の数；３）全体的な柔組織的アーキテクチャー；４）小葉性炎症；５）中心細静脈；６）門脈路炎症；７）胆管病変；８）胆管損失；９）門脈分岐の存在；９）門脈線維症；１０）類洞周囲線維症。

実施例３．ＲＮＡの抽出および処理。
総ＲＮＡ抽出のために、凍結保存された肝臓組織サンプルを、乳棒およびヌクレアーゼのない１．５ｍｌの反応チューブ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で均質化した。その後、総ＲＮＡを、製造業者ガイドラインに従って抽出し、その性質を、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＵＳＡ）によって評価した。

実施例４．Ｉｌｌｕｍｉｎａのマイクロアレイ実験。
１０５の肝臓ＲＮＡサンプル（２０のＴＯＬ、３２の非ＴＯＬ、１４の非ＴＯＬ−Ｒｅｊ、１２のＨＥＰＣ、９のＲＥＪ、８のＣＯＮＴ−Ｔｘおよび１０のＣＯＮＴ；それらのすべてはＨｏｓｐｉｔａｌＣｌｉｎｉｃＢａｒｃｅｌｏｎａから）を、ｃＲＮＡへと処理し、２５，０００の注釈された遺伝子に相当する４８，７７１のプローブを含む、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＨＴ−１２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＢｅａｄＣｈｉｐｓ上でハイブリッド形成した（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）。発現データを、ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏのデータ分析ソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）を使用して計算し、続いて、Ｌｕｍｉのバイオコンダクターパッケージ［６］を使用する四分位の正常化を利用して処理した。次に、５％の変動率を有するこれらのプローブを除いて、保存的なプローブフィルタリング工程を実行し、結果として、４８，７７１の元のセットから合計３３，０６２のプローブを選択した。

実施例５．アフィメトリックスのマイクロアレイ実験。
１０のＴＯＬおよび１０の非ＴＯＬのレシピエントの選択された群において、マイクロアレイ実験を、市販の核酸プローブを含む、５４，６７５のプローブによって、４７，０００の注釈された遺伝子を包含するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０のアレイ上で複製した（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）。さらなるアフィメトリックスの実験を、４のＴＯＬ−Ｐｏｓｔの肝臓サンプル（また、完全な薬物の離脱の１２か月後に得られた肝生検組織が利用可能であった１０のＴＯＬレシピエントのうち４）から抽出したＲＮＡを利用する際に行った。遺伝子発現データを、プローブ配列情報を組み込むプローブ強度から発現値を計算する、グアニジン−シトシン含量を調整したロバストなマルチアレイのアルゴリズムを使用して標準化した。その後、少なくとも１つのサンプル中で５のｌｏｇ_２発現値に達してないプローブを除いた保存的なプローブフィルタリング工程を利用し、結果として、５４，６７５の元のセットから合計１８，７６８のプローブを選択した。

実施例６．マイクロアレイの遺伝子発現データ分析。
異なるマイクロアレイ研究群の間で差次的に発現された遺伝子を識別するために、ＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＭｉｃｒｏａｒｒａｙ (ＳＡＭ)を利用した。ＳＡＭは、データセットおよび補正係数を有する各遺伝子に対して改変したｔ検定統計量を使用することで、ｔ値を計算し、それによって、各遺伝子に対する非現実的に低い標準偏差を制御する。さらに、ＳＡＭは、実際の試験結果と、試験した群の重複置換から得た結果との間の差に対する閾値を選択することによって、偽発見率（ＦＤＲ）の制御を可能にする。今回の研究に関して、ＦＤＲ＜１０％および１０００の置換を使用してＳＡＭ選択を行った。異なる研究群の間のグローバルな遺伝子発現差をグラフ式に表わすために、フィルター処理した（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）プローブリスト全体を使用して、ｍａｄｅ４パッケージに含まれるグループ間分析（ＢＧＡ）の機能において実施されるような対応分析を行った（ＣｕｌｈａｎｅＡＣ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２００５）。この方法は、楕円によって区切られた領域が、第１および第２の軸においてサンプルスコアの推測された従法線分布の９５％を表わす、２Ｄグラフ中の多重遺伝子の発現測定などの、高次元データを視覚化することができる。対象の遺伝子の群が、臨床的結果（拒絶反応に対する寛容性）、臨床的な変化（ドナーおよびレシピエントの年齢、性別、免疫抑制療法のタイプ、移植後の時間）および組織学的特徴（鉄含量）に有意に関係したかどうかを測定するために、Ｇｌｏｂａｌｔｅｓｔソフトウェアを利用した（Ｇｏｅｍａｎ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２００４）。このソフトウェア内のシンタックスも、寛容性のレシピエントと非寛容性のレシピエントとの間で統計的に異なると分かった、妨害の臨床的な共変量（ｎｕｉｓａｎｃｅｃｌｉｎｉｃａｌｃｏｖａｒｉａｔｅｓ）の生じうる交絡影響に関する遺伝子発現と臨床結果との間で見られる関連性を修正するために利用した。

実施例７．定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）実験。
マイクロアレイ発現の結果を実証するために、１０４の標的遺伝子および３のハウスキーピング遺伝子（補足の表１）の群の発現パターンを、４８のレシピエントのサブグループ（１８のＴＯＬおよび３１の非ＴＯＬ；それらのすべてはＨｏｓｐｉｔａｌＣｌｉｎｉｃＢａｒｃｅｌｏｎａから）上で、市販のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、ＡＢＩ７９００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍおよびＴａｑＭａｎＬＤＡマイクロ流体プレート（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を利用して測定した。さらに、ｑＰＣＲ実験を、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＴｏｒＶｅｒｇａｔａＲｏｍｅおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌｓＬｅｕｖｅｎによって提供された、１０のＴＯＬおよび１１の非ＴＯＬのレシピエントの独立した群において行った。該実験からのマイクロアレイデータは入手できなかった。標的遺伝子を、次のものに基づいて選択した：１）Ｉｌｌｕｍｉｎａおよびアフィメトリックスのマイクロアレイ実験結果；２）肝臓の操作上の寛容性（Ｍ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｌｌｏｒｄｅｌｌａｅｔａｌ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２００８）に関係しているとして我々のグループによって以前に記載された血液の転写バイオマーカー；および、３）文献に記載された顕著な免疫制御遺伝子。ＤＮＡを、ＴｕｒｂｏＤＮＡ-ｆｒｅｅＤＮＡｓｅ処置（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、総ＲＮＡ調製物から取り除き、ＲＮＡを、ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ (ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)を使用して、ｃＤＮＡへと逆転写した。転写レベルを定量化するために、標的遺伝子のＣｔ値を、ハウスキーピング遺伝子に標準化し、ΔＣｔ値を生成した。その後、結果を、標的サンプルのｃＤＮＡと、ΔΔＣｔ方法による較正されたサンプルとの間の相対的な発現として計算した。以下の３つのサンプルを較正物質（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒｓ）として利用した：１）８ＣＯＮＴ−ＴｘサンプルからのプールＲＮＡ；２）１０ＣＯＮＴサンプルからのプールＲＮＡ；および３）市販の肝臓ＲＮＡ（ＨｕｍａｎＬｉｖｅｒＴｏｔａｌＲＮＡ，Ａｍｂｉｏｎ）。

実施例８．遺伝子分類子の識別および確認。
我々が行なった免疫抑制の離脱の成功を予測する生検ベースのｑＰＣＲ遺伝子発現の分類子を発達させるために、線形判別分析および誤分類罰則付き事後分類（ＭｉＰＰ）ソフトウェアにおいて実施されたロジスティク回帰アルゴリズムを利用する予測モデルの徹底的な調査を行った。ＭｉＰＰは、最も簡潔な診断用モデルの発見のための段階的な漸進的分類のモデリング（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）に基づき、二重交差検定の方策を利用する。最初に、大きなスクリーニング調査の落とし穴を回避しながら最適なモデルを得るために、ＨｏｓｐｉｔａｌＣｌｉｎｉｃＢａｒｃｅｌｏｎａからの１８のＴＯＬおよび３１の非ＴＯＬの肝臓レシピエントの訓練事例上で１０倍交差検定の工程を行った。次に、診断用モデルのランダムに分割する交差検定を、外部モデル確認のために訓練事例（２／３）および独立したテスト事例（１／３）へと繰り返し分割することによって、（Ｂａｒｃｅｌｏｎａからの５６のサンプルおよびＲｏｍｅおよびＬｅｕｖｅｎからの２１のサンプルを含む）全体的なデータセット上で行った。訓練事例で識別された各モデルに関して、寛容性の最適確率のカットオフを、ＲＯＣ分析を介して計算した。テストおよび訓練の事象の多数のランダム分割の使用によって、診断の正確性に対する信頼限界を得ることが可能となった。これらの信頼限界に基づいて、診断性能および平均の誤分類のエラー率を、候補分類子の各々に関して得た。モデルの性能が中央依存ではなかったことを実証するために、その後、ＳＮ、ＳＰ、ＮＰＶ、ＰＰＶおよびＢａｒｃｅｌｏｎａから収集されたサンプルおよびＲｏｍｅおよびＬｅｕｖｅｎから得られたサンプルに関する全体的なエラー率を計算した。

実施例９．血清ヘプシジンの測定。
血清サンプルを、ＢＤバキュテーナーＳＳＴＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＵＳＡ）を使用して、ベースラインで６４の登録された肝臓レシピエントから得て、−８０℃で貯蔵した。定量的血清ヘプシジンの測定を、弱い陽イオン交換クロマトグラフィーおよび飛行時間型質量分析（ＴＯＦＭＳ）の組み合わせによって行った。定量化に関して、ヘプシジンアナログ（合成ヘプシジン−２４；ＰｅｐｔｉｄｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ．）を、内部標準として利用した。ペプチドスペクトルを、ＭｉｃｒｏｆｌｅｘＬＴのマトリックス強化したレーザー脱離／イオン化ＴＯＦＭＳのプラットフォーム（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ）上で生成した。血清ヘプシジン−２５濃度を、ｎｍｏｌ／Ｌとして表した。この方法の検出の下限は、０．５ｎＭであり；平均変動率は、２．７％（ｉｎｔｒａ−ｒｕｎ）および６．５％（ｉｎｔｅｒ−ｒｕｎ）であった。血清ヘプシジン−２５の中間の参照レベルは、４．２ｎＭ（０．５−１３．９ｎＭの範囲）である。

図３に示されるように、ヘプシジン（遺伝子ＨＡＭＰによってコード化されたペプチド）の血清レベルは、非寛容性の肝臓レシピエントと比較して寛容性のレシピエントにおいて著しく増加され、それ故、ヘプシジンのレベルは、肝移植を受ける患者の寛容状態の診断及び／又は予後のための貴重なマーカーである。

実施例１０．先行技術に含まれる肝移植における寛容性の診断のための方法と本発明の方法との間の比較アッセイ。
先行技術の方法は、本発明で提示されるものとは異なる遺伝子の群（ＫＬＲＦ１、ＰＴＧＤＲ、ＮＣＡＬＤ、ＣＤ１６０、ＩＬ２ＲＢ、ＰＴＣＨ１、ＥＲＢＢ２、ＫＬＲＢ１、ＮＫＧ７、ＫＬＲＤ１、ＦＥＺ１、ＧＮＰＴＡＢ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＬＩＣ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＷＤＲ６７、ＭＡＮ１Ａ１、ＣＤ９、ＦＬＪ１４２１３、ＦＥＭ１Ｃ、ＣＤ２４４、ＰＳＭＤ１４、ＣＴＢＰ２、ＺＮＦ２９５、ＺＮＦ２６７、ＲＧＳ３、ＰＤＥ４Ｂ、ＡＬＧ８、ＧＥＭＩＮ７）の発現の末梢血サンプルにおける測定を含む。その上、本実施例は、本発明の方法がより高い弁別力を有していることを示す。

先行技術の方法は以下の結果を生む：
Ａ）ＦＥＭ１ＣとＩＬ８の組み合わせ：
Ｓｎ＝６３％；Ｓｐ＝８０．７７％；ＥＲ＝７．０８％；ＰＰＶ＝７７．６８％；ＮＰＶ＝７２．４１％
Ｂ）ＫＬＲＦ１とＳＬＡＭＦ７の組み合わせ
Ｓｎ＝２７．７％、ＳＰ＝９２．３１％、ＥＲ＝３７．５％、ＰＰＶ＝７３．６８％、ＮＰＶ＝７２．４１％
Ｃ）ＫＬＲＦ１とＩＬ２ＲＢの組み合わせ
Ｓｎ＝５０％、ＳＰ＝８４．６２％、ＥＲ＝３１．２５％、ＰＰＶ＝７３．３３％、ＮＰＶ＝６６．６７％
Ｓｎ：感受性
ＳＰ：特異性
ＥＲ：エラー率
ＰＰＶ：陽性的中率
ＮＰＶ：陰性的中率

しかしながら、同じ４８の患者（３つの最良モデルをこの比較アッセイのために選択した）の肝臓組織中の表３、４および６に含まれる遺伝子の測定に基づいた本発明の方法は、以下の結果につながった：
Ａ）ＴＦＲＣ、ＣＤＨＲ２、ＨＭＯＸ１、ＭＩＦ、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＰＥＢＰ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＡＤＯＲＡ３の組み合わせ：
Ｓｎ＝７７．２７％、ＳＰ＝９６．１５％、ＥＲ＝１２．５％、ＰＰＶ＝９４．４４％、ＮＰＶ＝８３．３３％
Ｂ）ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＡＤＯＲＡ３の組み合わせ
ＳＮ＝９０．９１％、ＳＰ＝８４．６２％、ＥＲ＝１２．５％、ＰＰＶ＝８３．３３％、ＮＰＶ＝９１．６７％
Ｃ）ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＨＡＭＰ、ＣＤＨＲ２の組み合わせ
Ｓｎ＝７７．２７％、ＳＰ＝８８．４６％、ＥＲ＝１６．６７％、ＰＰＶ＝８５％、ＮＰＶ＝８２．１４％
Ｓｎ：感受性
ＳＰ：特異性
ＥＲ：エラー率
ＰＰＶ：陽性的中率
ＮＰＶ：陰性的中率

それ故、肝臓の組織サンプル中の本発明に含まれる遺伝子の発現の測定は、移植に対して寛容性があるため免疫抑制の投薬をうまく断つことができる肝臓レシピエントを識別するために、末梢血中の先行技術に含まれる遺伝子の測定より少なくとも正確であるように結論付けられる。

実施例１１．血清フェリチンの測定。
血清サンプルを、ＢＤバキュテーナーＳＳＴＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＵＳＡ）を使用して、ベースラインで６４の登録された肝臓レシピエントから得て、−８０℃で貯蔵した。血清フェリチンの測定を、自動化したエリザ法によって行った。フェリチン血清レベルは、血清ヘプシジンと相互に関連付けられた。したがって、フェリチン血清レベルは、非寛容性（非ＴＯＬ）のレシピエントにおけるよりも寛容性（ＴＯＬ）のレシピエントにおける方が著しく高かった（図４Ａ）。鉄貯蔵の欠如（血清フェリチン＜１２ｎｇ／ｍＬ、鉄欠乏の高度に特異的な指標）を、非ＴＯＬのレシピエントの間で専ら観察した（図４Ｂ）。ヘプシジンまたはフェリチンのいずれかと寛容性との間の関連性は、ロジスティク回帰の多変量解析におけるそれらの独立した予測値によって実証されるように、レシピエントの年齢、移植からの時間またはベースラインの免疫抑制療法によって混同されることはなかった。

図４に示されるように、フェリチンの血清レベルが、非寛容性の肝臓レシピエントと比較して寛容性のレシピエントにおける方が著しく増加されるため、フェリチンのレベルは、肝移植を受ける患者の寛容状態の診断及び／又は予後のための貴重なマーカーである。

実施例１２．ホスホ−Ｓｔａｔ３の免疫染色。
転写３（Ｓｔａｔ３）の転写因子シグナルのトランスデューサーおよび活性化因子を活性化する、ヤヌスキナーゼ２（Ｊａｋ２）のリン酸化を介したヘプシジンの能力を考慮して（ＤｅＤｏｍｅｎｉｃｏｅｔａｌ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２０１０）、１２の寛容性（ＴＯＬ）の患者および１３の非寛容性（非ＴＯＬ）の患者からの肝生検のサブセットにおいてリン酸化されたＳｔａｔ３を定量化した。パラフィン包理した肝生検切片を、脱パラフィンし、抗原回復を、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で１５分間沸騰させることによって行った。続いて、切片を、供給者の説明書に従って、バックグラウンドの還元剤（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｒｅｄｕｃｉｎｇｒｅａｇｅｎｔｓ）によって処理し（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ホスホ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）ラビット単クローン抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって染色した。免疫染色を、ＤＡＢ基質（ＤＡＫＯ）を使用して発展させ、ヘマトキシリンを使用して逆染色した。Ｉｍｍａｇｅｓを、ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＥ６００顕微鏡およびａｎａｌｙＳＩＳソフトウェアを使用して評価し、ブルーチャンネルの閾値操作された減少によってＩｍａｇｅＪＳｏｆｔｗａｒｅ (ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＵＳＡ)を使用して分析し、その後、残りの染色されたピクセルの２値化および測定が続いた。強力なホスホ−Ｓｔａｔ３染色は、生検切片に沿って無作為に分散された焦点に密集した（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎ）肝細胞核においてほぼ例外なく顕著であった。対照的に、染色は、浸潤性の単核性白血球、マクロファージおよび内皮細胞の核においてわずかであり、それほど頻繁にはなかった。

非寛容性の患者（非ＴＯＬ）のサンプルと比較して、寛容性の患者（ＴＯＬ）の肝生検は、著しく増加した肝細胞ホスホ−Ｓｔａｔ３染色を示した（図５）。そのため、ホスホ−Ｓｔａｔ３のレベルは、肝移植を受ける患者の寛容状態の診断及び／又は予後のための貴重なマーカーである。

実施例１３．肝臓の鉄含量の評価。
肝臓内の鉄貯蔵の規模を推定するために、Ｐｅｒｌの染色によって３μｍの厚さの肝臓スライドを染色した。鉄含量を、記載されるようなＳｃｈｅｕｅｒの変更された且つＴｏｔａｌＩｒｏｎＳｃｏｒｅ (ＴＩＳ)のスコアリングシステムの両方を利用して、半定量的に評価した（Ｄｅｕｇｎｉｅｒｅｔａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１９９３；Ｓｃｈｅｕｅｒｅｔａｌ．ＪＰａｔｈｏｌＢａｃｔｅｒｉｏｌ１９６２）。さらに、肝細胞および間充織（内皮細胞およびクッパー細胞）の鉄染色を別々に採点した。軽度の門脈周囲性肝細胞の鉄沈着は、寛容性（ＴＯＬ）の患者から収集した大多数の肝臓サンプルにおいて顕著であった。対照的に、肝生検において非寛容性（非ＴＯＬ）のレシピエントから染色可能な鉄は観察されなかった（図１Ａ）。これらの差は、専ら、間充織の鉄蓄積ではなく、むしろ肝細胞が原因であった。ＴＯＬと非ＴＯＬとの間の鉄貯蔵の違いは、移植後経過した時間または投与された免疫抑制薬のタイプにかかわらず、患者の２つの群を区別するために使用され得る（図１Ｂ）。

図１に示されるように、肝臓の鉄含量が、免疫抑制療法をうまく断ち得る寛容性の患者（ＴＯＬ）の肝臓における方が、それが不可能な非寛容性の患者（非ＴＯＬ）の肝臓におけるよりも著しく高いため、鉄のレベルは、肝移植を受ける患者の寛容状態の診断及び／又は予後のための貴重なマーカーとして使用され得る。

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Claims

肝移植を受けた患者の寛容状態のインビトロの診断及び／又は予後のための方法であって、前記方法は：
ａ．検査中の患者から生体サンプルを得る工程；
ｂ．工程ａ）において得られた生体サンプルにおいて全身性及び／又は肝臓内の鉄貯蔵のレベルを評価する工程；
ｃ．工程ｂ）の全身性及び／又は肝臓内の鉄貯蔵のレベルを、参照サンプルから得られた全身性または肝臓内の鉄貯蔵のレベルまたは予め決められた閾値のいずれかと比較することによって、検査中の肝移植患者の寛容または非寛容の状態を評価する工程を含むことを特徴とする方法。
前記全身性及び／又は肝臓内の鉄貯蔵のレベルが、非寛容性の肝移植レシピエントと比較して寛容性の肝移植レシピエントにおける方が著しく高いことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
肝移植を受けた患者の前記寛容状態の前記インビトロの診断及び／又は予後が：
ａ．検査中の患者の肝臓同種移植片から生体サンプルを得る工程；
ｂ．工程ａ）で得られた生体サンプルにおいて、以下の遺伝子：ＴＦＲＣ、ＣＤＨＲ２、ＨＭＯＸ１、ＭＩＦ、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＰＥＢＰ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＡＤＯＲＡ３およびＤＡＢ２の少なくとも１つの発現レベルまたはそれらの組み合わせを測定する工程；
ｃ．工程ｂ）の遺伝子の少なくとも１つ又はそれらの組み合わせの発現レベルを、参照サンプルから得られた、同じ遺伝子又はそれらの組み合わせの発現レベルと比較することによって、肝移植に対する、検査中の患者の寛容性または非寛容性を評価する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記参照サンプルが、健康な非移植肝臓組織から得られたＲＮＡのプール；市販の参照ＲＮＡ；または事前に定量化した数のＲＮＡ分子を含むサンプルに存在する絶対参照ＲＮＡの中から選択されるＲＮＡサンプルであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
参照ＲＮＡサンプルから得られた同じ遺伝子の発現レベルと比較して、寛容性の肝移植レシピエントにおいて、遺伝子ＴＦＲＣおよびＭＩＦがダウンレギュレートされ、遺伝子ＣＤＨＲ２、ＨＭＯＸ１、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＰＥＢＰ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＡＤＯＲＡ３およびＤＡＢ２もアップレギュレートされることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
以下の遺伝子：ＬＣ５Ａ１２、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＴＴＣ３、ＲＢＭ２３、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＮＣＲ１、ＴＦＲＣ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＴＡＦ１５、ＴＩＰＡＲＰ、ＭＯＸ１、ＭＣＯＬＮ１、ＥＢＰ１、ＤＨＲ２およびＡＢ２の少なくとも１つの発現レベルを測定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
以下の遺伝子の組合せ：ＬＣ５Ａ１２、ＶＮＮ３、ＴＦＲＣ、ＳＯＣＳ１、ＭＩＦ、ＴＴＣ３、ＲＢＭ２３、ＰＥＢＰ１、ＳＨ２Ｄ１Ｂ、ＮＣＲ１、ＤＡＢ２およびＡＤＯＲＡ３；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰ、ＴＵＢＡ４Ａ、ＴＴＣ３、ＨＭＯＸ１、ＶＮＮ３、ＮＣＲ１、ＡＤＯＲＡ３、ＴＡＦ１５、ＩＦＮＧ、ＳＯＣＳ１およびＴＩＰＡＲＰ；ＭＯＸ１、ＣＤＨＲ２、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＴＦＲＣ、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＯＣＳ１、ＨＡＭＰ、ＶＮＮ３およびＩＦＮＧ；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＳＬＣ５Ａ１２、ＨＡＭＰ、ＳＯＣＳ１、ＩＦＮＧおよびＨＭＯＸ１；ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＣＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３、ＨＡＭＰ、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＨＭＯＸ１およびＤＡＢ２；ＴＦＲＣ、ＤＡＢ２、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＩＦＮＧ、ＨＡＭＰ、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＯＣＳ１、ＶＮＮ３、ＡＤＯＲＡ３、ＣＤＨＲ２、ＭＣＯＬＮ１およびＨＭＯＸ１；ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＨＭＯＸ１、ＭＣＯＬＮ１、ＭＩＦ、ＨＡＭＰ、ＡＤＯＲＡ３、ＣＤＨＲ２、ＰＥＢＰ１およびＳＯＣＳ１；ＥＢＰ１、ＴＦＲＣ、ＨＭＯＸ１、ＩＦＮＧ、ＭＣＯＬＮ１、ＳＯＣＳ１、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰおよびＡＤＯＲＡ３；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＩＦＮＧ、ＣＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３、ＶＮＮ３、ＨＭＯＸ１、ＤＡＢ２、ＳＯＣＳ１、ＭＩＦおよびＨＡＭＰ；ＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３、ＩＦＮＧ、ＴＦＲＣ、ＶＮＮ３、ＨＭＯＸ１、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＳＬＣ５Ａ１２、ＨＡＭＰ、ＳＯＣＳ１およびＭＣＯＬＮ１；ＬＣ５Ａ１２、ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＭＩＦ、ＤＡＢ２、ＨＭＯＸ１、ＣＤＨＲ２、ＳＯＣＳ１、ＨＡＭＰ、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＡＤＯＲＡ３およびＭＣＯＬＮ１；ＴＦＲＣ、ＳＯＣＳ１、ＨＭＯＸ１、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＤＡＢ２、ＭＣＯＬＮ１、ＡＤＯＲＡ３およびＭＩＦ；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＭＩＦ、ＨＭＯＸ１、ＤＡＢ２、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＣＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３およびＭＣＯＬＮ１；ＬＣ５Ａ１２、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＡＤＯＲＡ３、ＨＡＭＰ、ＶＮＮ３、ＳＯＣＳ１、ＭＣＯＬＮ１、ＰＥＢＰ１およびＨＭＯＸ１；ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧ、ＣＤＨＲ２、ＡＤＯＲＡ３、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＭＩＦ、ＨＭＯＸ１、ＭＣＯＬＮ１、ＳＯＣＳ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＤＡＢ２およびＨＡＭＰ；ＴＦＲＣ、ＶＮＮ３、ＨＡＭＰ、ＣＤＨＲ２、ＳＬＣ５Ａ１２、ＨＭＯＸ１、ＳＯＣＳ１、ＰＥＢＰ１およびＭＩＦ；ＡＢ２、ＴＦＲＣ、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＰＥＢＰ１、ＶＮＮ３、ＴＴＣ３、ＨＭＯＸ１およびＳＯＣＳ１；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＣＤＨＲ２、ＶＮＮ３、ＩＦＮＧ、ＭＣＯＬＮ１およびＳＯＣＳ１；ＴＦＲＣ、ＰＥＢＰ１、ＭＩＦ、ＳＯＣＳ１およびＣＤＨＲ２；ＡＤＯＲＡ３、ＣＤＨＲ２、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＴＡＦ１５およびＴＦＲＣ；ＣＤＨＲ２、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＦ１５およびＴＦＲＣ；ＡＤＯＲＡ３、ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰ、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＳＯＣＳ１、ＴＡＦ１５およびＴＦＲＣ；ＣＤＨＲ２、ＨＡＭＰ、ＩＦＮＧ、ＭＣＯＬＮ１、ＭＩＦ、ＰＥＢＰ１、ＳＯＣＳ１、ＴＦＲＣおよびＶＮＮ３の少なくとも１つの発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
ＴＦＲＣ、ＩＦＮＧおよびＣＤＨＲ２から成る遺伝子組合せの発現レベルが測定されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
肝移植を受けた患者の寛容状態の診断及び／又は予後が、
ａ．検査中の患者の肝臓同種移植片から生体サンプルを得る工程；
ｂ．工程ａ）で得られた生体サンプルにおいて、肝臓内の鉄貯蔵のレベルを測定する工程；
ｃ．工程ｂ）の肝臓内の鉄貯蔵のレベルを、参照サンプルから得られた肝臓内の鉄貯蔵のレベルと比較することによって、肝移植に対する、検査中の患者の寛容性または非寛容性を評価する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記肝臓内の鉄貯蔵のレベルが、非寛容性の肝移植レシピエントと比較して寛容性の肝移植レシピエントにおける方が著しく高いことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
肝移植を受けた患者の寛容状態の診断及び／又は予後が、
ａ．検査中の該者の血清から生体サンプルを得る工程；
ｂ．工程ａ）において得られた生体サンプルにおいて、タンパク質フェリチンのレベルを測定する工程；
ｃ．工程ｂ）のフェリチンのレベルを、参照サンプルから得られた同じタンパク質のレベルと比較することによって、肝移植に対する、検査中の患者の寛容性または非寛容性を評価する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記フェリチンの血清レベルが、非寛容性の肝移植レシピエントにおけるよりも寛容性の肝移植レシピエントにおける方が著しく高いことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
肝移植を受けた患者の寛容状態の診断及び／又は予後が、
ａ．検査中の患者の肝臓同種移植片から生体サンプルを得る工程；
ｂ．工程ａ）において得られた生体サンプルにおいて、ホスホ−Ｓｔａｔ３のタンパク質レベルを測定する工程；
ｃ．工程ｂ）のホスホ−Ｓｔａｔ３のタンパク質レベルを、参照サンプルから得られた同じタンパク質のタンパク質レベルと比較することによって、肝移植に対する、検査中の患者の寛容性または非寛容性を評価する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
前記ホスホ−Ｓｔａｔ３の血清レベルが、非寛容性の肝移植レシピエントにおけるよりも寛容性の肝移植レシピエントにおける方が著しく高いことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
肝移植を受けた患者の寛容状態の診断及び／又は予後が、
ａ．検査中の患者の血清から生体サンプルを得る工程；
ｂ．工程ａ）において得られた生体サンプルにおいて、ヘプシジンのタンパク質レベルを測定する工程；
ｃ．工程ｂ）のヘプシジンのタンパク質レベルを、参照サンプルから得られた同じタンパク質のタンパク質レベルと比較することによって、肝移植に対する、検査中の患者の寛容性または非寛容性を評価する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ヘプシジンの血清レベルが、非寛容性の肝移植レシピエントにおけるよりも寛容性の肝移植レシピエントにおける方が著しく高いことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
肝移植を受けた患者の寛容状態の診断及び／又は予後に有用な少なくとも１つの追加のパラメーターを決定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１乃至１６のいずれかに記載の方法。
前記追加のパラメーターが、年齢及び／又は移植後時間であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。