CN109790579A - 用于区分耐受性受试者的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于区分可操作性耐受性(TOL)受试者与非可操作性耐受性(STA)受试者的方法，所述方法包括以下步骤：i)使用从所述受试者获得的生物样品中六种基因的表达水平和两种临床参数确定综合耐受性分数(cSoT)；其中所述六种基因是ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A以及MZB1，并且其中所述cSoT是通过下式确定的：(I)；ii)将该cSoT与预定的参考值进行比较；以及iii)当所述cSoT高于所述预定的参考值时，推断所述受试者是TOL，或当所述cSoT低于所述预定的参考值时，推断所述受试者是STA。

Description

用于区分耐受性受试者的方法

技术领域

本发明属于移植领域，具体地说，本发明允许鉴定在由免疫抑制治疗进行治疗的受试者中，受试者是否具有耐受性。

背景技术

实体器官移植依赖于使用免疫抑制治疗(IS)来预防移植物排斥。然而，由于长期的IS副作用，包括癌症、心血管疾病、感染以及肾毒性[1-3]，因此鼓励医师减少IS暴露，同时仍保护移植物防止免疫攻击[4]。理想化地，在不存在免疫抑制(IS)治疗的情况下，在实体器官移植中实现同种异体移植物耐受性(即同种异体移植物接受)将通过避免IS副作用而成为非常好的思路。这还将降低移植维持的成本[5]，减少再次移植的病例，同时提高接受者的生活质量。以这个目标，已经成功地尝试了几种耐受性诱导方案，主要是经由骨髓或干细胞转移建立瞬时嵌合体[6-10]。然而，到目前为止，有效性限于活体供者或零错配死亡供者，并且仅报道了很少的在HLA错配的情况下成功诱导耐受性的病例[6,11]。有趣的是，还已经由于IS因不依从或医疗决策而被中断而观测到耐受性，特别是移植后淋巴增生性病症(PTLD)[12,13]。这些患者多年来表现出稳定的和良好的移植物功能，对免疫激发有响应[12]并且没有比健康志愿者更多的机会性感染[12,13]。从临床观点来看，主要是偶然发现的这些患者[12,14,15]与在标准IS下具有稳定的移植物功能的肾接受者(STA)相当，只有很少的差异，包括增加比例的来自活体供者的移植物和更低水平的HLA错配[12]。

迄今为止，没有临床参数安全地允许断绝IS，即使是在基于激烈选择具有高度稳定的移植物功能的非致敏受者的试验中[16,17](Dugast E等,Am J Transplant.2016年11月；16(11):3255-3261)。因此，很明显，在新试验中有意复制肾移植中IS的撤除需要临床参数，而且还需要新的实验室测试，最近的报道已经为其铺平了道路。最近，对这些不同研究的综合荟萃分析进一步突出了20种基因，主要与B细胞相关，作为TOL与STA之间最显著差异表达的基因[18]。有趣的是，来自这些接受者的B细胞具有表达抑制性受体的特定表型[24]、独特的分化特征[27]并且表现出抑制特性[28]。总的来说，这些数据表明B细胞可能不仅是潜在的生物标志物，而且还可能积极调节对移植肾的免疫应答，它们的诱导和扩增可能为诱导疗法所青睐[26]。

虽然这些特征的效用现在明确确定并且是由科学界在过去几十年中的努力而产生的[29,30]，但是我们现在需要证实它们的安全性和可靠性以用于在移植中IS的最小化和患者的随访。首先，我们需要最可靠的，同时容易适用于更多数患者的特征。其次，我们需要稳定的并且不受移植患者的寿命期间发生的事件，例如恶性或免疫抑制的影响的特征。第三，虽然诱导耐受性是一种有前途的治疗方式，但是这些方案是否概括在可操作性耐受性患者中观测到的情况或者是否存在所谓的“耐受性”的不同情况尚未得到解决，因此，用于这两种情况的共同特征仍有待证实。

发明内容

本发明涉及一种用于区分可操作性耐受性(TOL)受试者与非可操作性耐受性(STA)受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

i)使用从所述受试者获得的生物样品中六种基因的表达水平和两种临床参数确定综合耐受性分数(cSoT)；

其中所述cSoT是通过下式来确定的：

ii)将该cSoT与预定的参考值进行比较；以及

iii)当所述cSoT高于所述预定的参考值时，推断所述受试者是TOL，或当所述cSoT低于所述预定的参考值时，推断所述受试者是STA。

在一个实施方案中，所述六种基因是ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A以及MZB1。

在一个实施方案中，所述两种临床参数是在测试时间时所述受试者的年龄和在移植时间时所述受试者的年龄。

在一个实施方案中，所述预定的参考值是TOL受试者的cSoT。在另一个实施方案中，所述预定的参考值是STA受试者的cSoT。

在一个实施方案中，所述受试者处于免疫抑制治疗下。

在一个实施方案中，所述受试者是人类。

在一个实施方案中，所述受试者是肾接受者。在一个实施方案中，所述肾接受者已经进一步移植有胰腺，并且任选地移植有肾供者的一段十二指肠。

本发明还涉及一种用免疫抑制疗法对移植受试者进行治疗的方法，所述方法包括以下步骤：

i)使用根据本发明的用于区分TOL受试者与STA受试者的方法来确定所述受试者是可操作性耐受性(TOL)受试者或非可操作性耐受性(STA)受试者；以及

ii)当所述受试者是STA时，用免疫抑制疗法对所述受试者进行治疗。

本发明还涉及一种用于鉴定处于免疫抑制疗法下的移植受试者作为免疫抑制疗法戒断或最小化的候选者的方法，所述方法包括以下步骤：

i)使用根据本发明的用于区分TOL受试者与STA受试者的方法来确定所述受试者是可操作性耐受性(TOL)受试者或非可操作性耐受性(STA)受试者；以及

ii)当所述受试者是TOL时，推断所述受试者对于免疫抑制疗法戒断或最小化是符合条件的。

定义

在本发明中，以下术语具有以下含义：

如本文所用的术语“AKR1C3”指的是醛酮还原酶家族1成员C3。天然存在的人类AKR1C3基因具有如基因库登录号NM_001253908.1中所示的核苷酸序列并且天然存在的人类AKR1C3蛋白质具有如基因库登录号NP_001240837.1中所示的氨基酸序列。

如本文所用的术语“生物样品”指的是从受试者，优选地从移植受试者获得的任何样品，例如血清样品、血浆样品、尿液样品、血液样品、淋巴样品、或活检。在一个具体的实施方案中，用于确定基因表达水平的生物样品包括诸如血液样品、淋巴样品、或活检的样品。在一个具体的实施方案中，所述生物样品是血液样品，更特别是外周血单核细胞(PBMC)。通常，这些细胞可以使用Ficoll从全血中提取，所述Ficoll是分离血液层的亲水性多糖，其中PBMC在血浆层下形成细胞环。此外，PBMC可以使用低渗裂解从全血中提取，所述低渗裂解将优先裂解血红细胞。这些程序是本领域专家已知的。

如本文所用的术语“CD40”指的是分化簇40。CD40是存在于抗原提呈细胞上的共刺激蛋白质并且是为它们的激活所需的。天然存在的人类CD40基因具有如基因库登录号NM_001250.5中所示的核苷酸序列并且天然存在的人类CD40蛋白质具有如基因库登录号NP_001241.1中所示的氨基酸序列。鼠类核苷酸序列和氨基酸序列也已经被描述(分别是基因库登录号NM_011611.2和NP_035741.2)。

如本文所用的术语“CTLA4”指的是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，也被称为CD152(分化簇152)。它是充当免疫检查点，下调免疫应答的蛋白受体。天然存在的人类CTLA4基因具有如基因库登录号NM_001037631.2中所示的核苷酸序列并且天然存在的人类CTLA4蛋白具有如基因库登录号NP_001032720.1中所示的氨基酸序列。鼠类核苷酸序列和氨基酸序列也已经被描述(分别是基因库登录号NM_001281976.1和NP_001268905.1)。

如本文所用的术语“区分”指的是鉴定、观测差异或区别两组。通常，根据本发明的方法适用于在接受免疫抑制药物治疗的受试者中鉴定或区别耐受性受试者。

如本文所用的术语“ID3”指的是DNA结合抑制因子3。天然存在的人类ID3基因具有如基因库登录号NM_002167.4中所示的核苷酸序列并且天然存在的人类ID3蛋白具有如基因库登录号NP_002158.3中所示的氨基酸序列。鼠类核苷酸序列和氨基酸序列也已经被描述(分别是基因库登录号NM_008321.2和NP_032347.1)。

如本文所用的术语“免疫抑制疗法”或“免疫抑制治疗”指的是向移植受试者施用一种或多种免疫抑制药物。可以用于移植程序的免疫抑制药物包括但不限于硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、FK-506(他克莫司(tacrolimus))、西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)、雷帕霉素(rapamycin)、皮质类固醇、环孢素(cyclosporin)(例如环孢素A)、霉酚酸(mycophenolicacid)、来氟米特(leflumacide)、子囊霉素(ascomycin)以及羟基脲。这些药物可以用于单一疗法或联合疗法中。

如本文所用的术语“免疫抑制疗法戒断或最小化”指的是在正施用免疫抑制药物的移植受试者中，抑制免疫抑制疗法的进行性减少，并且任选地最终抑制。

如本文所用的术语“MZB1”指的是边缘区B和B1细胞特异性蛋白1。天然存在的人类MZB1基因具有如基因库登录号NM_016459.3中所示的核苷酸序列并且天然存在的人类TCL1A蛋白具有如基因库登录号NP_057543.2中所示的氨基酸序列。鼠类核苷酸序列和氨基酸序列也已经被描述(分别是基因库登录号NM_027222.3和NP_081498.2)。

如本文所用的术语“器官移植”指的是用健康器官或组织替代患病的器官、部分器官、或组织的程序。移植的器官或组织可以从受试者本人(＝自体移植)、另外的人类供者(＝同种异体移植)或动物(＝异种移植)获得。移植的器官可以是人工的或天然的、完整的(例如肾脏、心脏以及肝脏)或部分的(例如心脏瓣膜、皮肤以及骨骼)。

如本文所用的术语“预定的参考值”指的是阈值或分界值。通常，“阈值”或“分界值”可以实验确定、经验确定或理论确定。阈值还可以基于现有的实验条件和/或临床条件任意选择，如由本领域普通技术人员所将认识到的那样。举例来说，在适当库存的历史受试者样品中进行回顾性测量可以用于确定预定的参考值。必须确定阈值以根据测试的功能和益处/风险平衡(假阳性和假阴性的临床后果)获得最佳灵敏度和特异性。通常，最佳灵敏度和特异性(以及因此，阈值)可以基于实验数据使用接受者操作特征(ROC)曲线来确定。举例来说，在确定参考组中所选择的肽的表达水平之后，可以使用算法分析对在待测试的样品中确定的表达水平进行统计处理，从而获得对样品分类具有重要性的分类标准。ROC曲线的全名是接受者操作者特征曲线(receiver operator characteristic curve)，其也被称为接受者操作特征曲线(receiver operation characteristic curve)。它主要用于临床生物化学诊断测试。ROC曲线是反映了真阳性率(灵敏度)和假阳性率(1-特异性)的连续变量的综合指标。它揭示了图像合成方法的灵敏度与特异性之间的关系。将一系列不同的分界值(阈值或临界值、诊断测试的正常结果与异常结果之间的边界值)设置为连续变量以计算一系列灵敏度值和特异性值。然后，使用灵敏度作为垂直坐标并且使用特异性作为水平坐标以绘制曲线。曲线下面积(AUC)越高，诊断的准确度越高。在ROC曲线上，最接近坐标图的最左上角的点是兼具高灵敏度值和高特异性值的临界点。ROC曲线的AUC值是1.0至0.5。当AUC>0.5时，诊断结果随着AUC接近1变得越来越好。当AUC是0.5至0.7时，准确度较低。当AUC是0.7至0.9时，准确度是中等的。当AUC高于0.9时，准确度高。这种算法方法优选地使用计算机进行。本领域中现有的软件或系统可以用于绘制ROC曲线，诸如：MedCalc 9.2.0.1医学统计软件、SPSS 9.0、ROCPOWER.SAS、DESIGNROC.FOR、MULTIREADER POWER.SAS、CREATE-ROC.SAS、GB STAT VI0.0(美国马里兰州银泉的Dynamic Microsystems公司(DynamicMicrosystems,Inc.Silver Spring,Md.,USA))等。

如本文所用的术语“用于确定基因表达水平的试剂”意指特定地允许确定所述基因表达水平的试剂，即特定地意图用于特异性确定给定基因的表达水平的试剂，所述给定基因例如ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A和/或MZB1基因。该定义因此不包括可用于确定任何基因的表达水平的通用试剂，例如taq聚合酶或扩增缓冲液，尽管这些通用试剂对于确定给定基因的表达水平可能是必要的，尽管是不足的，并且因此也可以被包括在根据本发明的试剂盒中。

如本文所用的术语“STA”指的是“非可操作性耐受性受试者”，即所述受试者处于免疫抑制下而具有稳定的功能，但是如果撤去免疫抑制治疗，则将排斥他/她的移植物。这样的受试者被认为对移植物不耐受。在一个具体的实施方案中，受试者“STA”被认为具有高免疫风险，即所述受试者有对移植物产生排斥(急性或慢性)和/或抗体的更高风险。

如本文所用的术语“受试者”指的是任何哺乳动物，例如啮齿类动物、猫科动物、犬科动物、以及灵长类动物。具体地说，在本发明中，所述受试者是人类，也被称作“患者”。在一个具体的实施方案中，所述受试者是移植受试者(transplanted subject)，也被称作“接受者”或“被移植受试者(grafted subject)”。

如本文所用的术语“TCL1A”指的是T细胞白血病或淋巴瘤蛋白1。天然存在的人类TCL1A基因具有如基因库登录号NM_001098725.1中所示的核苷酸序列并且天然存在的人类TCL1A蛋白具有如基因库登录号NP_001092195.1中所示的氨基酸序列。

如本文所用的术语“TOL”指的是“可操作性耐受性受试者”，即所述受试者处于免疫抑制下而具有稳定的功能，对其可以安全地撤除免疫抑制方案。这意味着所述受试者在不存在免疫抑制治疗的情况下不排斥他/她的移植物而具有功能良好的移植物。这样的受试者被认为对移植物具有耐受性。在一个具体的实施方案中，受试者“TOL”被认为具有低免疫风险，即所述受试者具有对移植物产生排斥反应(急性或慢性)和/或抗体的更低风险。

如本文所用的术语“移植受试者”(也被称作“接受者”或“被移植受试者”)指的是已经接受器官移植的受试者。

如本文所用的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指的是防范性或预防性治疗以及治愈性或疾病改善性治疗，包括治疗处于感染疾病的风险或疑似已经感染疾病的受试者的治疗以及患病或已经被诊断为患有疾病或医学病症的受试者的治疗，并且包括抑制临床复发。可以向患有医学病症或最终可能患上病症的受试者施用治疗以预防、治愈、延迟其发作、降低其严重程度、或缓解病症或复发病症的一个或多个症状，或以将受试者的存活期延长到在不存在这样的治疗的情况下所预期的之外。“治疗方案”意指疾患的治疗模式，例如在治疗期间使用的给药模式。治疗方案可以包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”指的是用于初步治疗疾病的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的一般目标是在治疗方案的初始阶段期间向受试者提供高水平的药物。诱导方案可以(部分或全部)使用“负荷方案”，其可以包括施用比医师将在维持方案期间使用的剂量更大剂量的药物、以比医师将在维持方案期间施用药物的频率更大的频率施用药物、或这两者。短语“维持方案”或“维持期”指的是用于在治疗疾患期间维持受试者，例如以将受试者在长时间(数月或数年)内保持缓解的治疗方案(或治疗方案的一部分)。维持方案可以使用连续疗法(例如定期施用药物，例如每周、每月、每年等)或间歇疗法(例如间断治疗、间歇治疗、在复发时治疗、或在实现特定的预定标准[例如疼痛、疾病表现等]后治疗)。

如本文所用的术语“两种临床参数”指的是在测试时间时受试者的年龄和在移植时间时受试者的年龄。

具体实施方式

基于来自他们公开的荟萃分析的20种基因特征，本申请的发明人使用一种稀少的方法来鉴定和验证最能提供信息的基因，这些基因与少数人口统计学参数结合，允许构建适用于临床常规的耐受性预测分数[31]。发明人因此鉴定和验证了6种基因与2种基本临床参数的组合的分数，这允许以极好的准确度从STA中鉴定出TOL。他们证实了该耐受性特征不会受到患者的恶性(PTLD)状态、中心来源的影响，也不会受到IS治疗的影响。可操作性耐受性接受者和受益于耐受性诱导方案的患者不享有共同的“耐受性特征”。最终，他们证实了该分数受到从头抗HLA抗体的影响，包括DSA和耐受性丧失，这增强了它追踪肾移植患者的潜力。

因此，在第一个方面，本发明涉及一种用于区分可操作性耐受性(TOL)受试者与非可操作性耐受性(STA)受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

i)使用从所述受试者获得的生物样品中至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多种基因的表达水平和至少一种、至少两种或更多种临床参数来确定综合耐受性分数(cSoT)；其中，所述分数是由下式确定的：

ii)将所述cSoT与预定参考值进行比较；以及

iii)当所述cSoT高于所述预定参考值时，推断所述受试者是TOL，或当所述cSoT低于所述预定参考值时，推断所述受试者是STA。

在一个实施方案中，所述基因选自由以下各项组成的组：ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A、MZB1、CD22、BLK、MS4A1、CD79B、BLNK、FCRL2、IRF4、HINT1、RFC4、ANXA2R、FCER2、AKIRIN2、EPS15以及PLBD1。优选的是，所述基因选自由以下各项组成的组：ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A以及MZB1。

在一个实施方案中，所述临床参数选自由以下各项组成的组：在测试时间时所述受试者的年龄、在移植时间时所述受试者的年龄、供者年龄、接受者性别、供者性别、供者类型、移植次序、HLA错配的数量、诱导治疗、接受者的肌酸血症、接受者的蛋白尿、在测试时间时在接受者中抗HLAAb的存在以及在测试时间时在接受者中DSA的存在。优选的是，所述临床参数选自由以下各项组成的组：在测试时间时所述受试者的年龄和在移植时间时所述受试者的年龄。

在一个实施方案中，用于区分受试者TOL与STA的方法包括以下步骤：

i)使用从所述受试者获得的生物样品中选自由ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A以及MZB1组成的组的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多种基因的表达水平和选自由在测试时间时所述受试者的年龄和在移植时间时所述受试者的年龄组成的组的至少一种、至少两种或更多种临床参数来确定综合耐受性分数(cSoT)；其中，所述分数是通过下式来确定的：

ii)将所述cSoT与预定参考值进行比较；以及

iii)当所述cSoT高于所述预定参考值时，推断所述受试者是TOL，或当所述cSoT低于所述预定参考值时，推断所述受试者是STA。

在一个实施方案中，用于区分受试者TOL与STA的方法包括以下步骤：

i)使用从所述受试者获得的生物样品中六种基因ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A、MZB1的表达水平和选自在测试时间时所述受试者的年龄和在移植时间时所述受试者的年龄的两种临床参数来确定综合耐受性分数(cSoT)；其中，所述分数是通过下式来确定的：

ii)将所述cSoT与预定参考值进行比较；以及

iii)当所述cSoT高于所述预定参考值时，推断所述受试者是TOL，或当所述cSoT低于所述预定参考值时，推断所述受试者是STA。

在一个实施方案中，TOL受试者在中断免疫抑制药物的情况下维持稳定的移植物功能。在一个实施方案中，STA受试者在中断免疫抑制药物的情况下不能维持稳定的移植物功能。

在一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一个具体的实施方案中，所述受试者是人类。

在一个实施方案中，所述受试者是移植受试者。在一个具体的实施方案中，所述受试者是肾移植的受试者。具体来说，所述肾移植的受试者可能已经进一步移植有肾供者的胰腺和任选的一段十二指肠。

在一个实施方案中，所述受试者由免疫抑制药物或本领域目前已知的或将在未来鉴定的其它药物治疗。在一个具体的实施方案中，所述受试者处于免疫抑制治疗下，即所述受试者接受一种或多种免疫抑制药物的施用。

可以用于移植程序的免疫抑制药物包括但不限于硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、环磷酰胺、FK-506(他克莫司)、西罗莫司、依维莫司、雷帕霉素、皮质类固醇、环孢素(例如环孢素A)、霉酚酸、来氟米特、子囊霉素以及羟基脲。

在一个实施方案中，免疫抑制药物用于单一疗法中。在另一个实施方案中，免疫抑制药物用于联合疗法中。

在肾移植的情况下，通常使用以下免疫抑制方案。接受初次肾移植的受试者一般接受诱导治疗，所述诱导治疗由以下组成：2次注射巴利昔单抗(basiliximab)(由诺华公司(Novartis)商业化的嵌合鼠类/人类单克隆抗IL2-Rα抗体)，结合他克莫司(Prograf^TM，藤泽药品工业株式会社(Fujisawa Pharmaceutical)，0.1毫克/公斤/天)、吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil)(Cellcept^TM，新得斯大药厂(SyntexLaboratories,Inc.)，2克/天)以及肾上腺皮质激素(1毫克/千克/天)，所述肾上腺皮质激素治疗每5天逐渐减少10mg直到移植后3个月治疗结束为止。接受第二次或第三次肾移植的受试者或被认为处于免疫风险(抗T群体反应性抗体(PRA)的百分比先前峰值达到高于25％或冷缺血超过36小时)的受试者一般接受短疗程的抗胸腺细胞球蛋白(ATG)(持续例如7天)，此外，从第0天起，接受吗替麦考酚酯(Cellcept^TM，新得斯大药厂，2克/天)和皮质类固醇(1毫克/千克/天)，然后类固醇每5天逐渐递减10mg直到治疗结束为止并且最终在移植后约3个月停止。他克莫司(Prograf^TM，藤泽药品工业株式会社)以延迟方式(在第6天)以0.1毫克/千克/天的剂量引入。

如本文所用的术语“综合耐受性分数(cSoT)”也被称为“分数”，指的是由下式获得的值：

该式是通过使用Bolasso算法获得的，所述Bolasso算法是通过自助法(bootstrap)重抽样(10,000次)进行的套索(lasso)(最小绝对值选择和收缩算子)分析，继而进行多次检验(错误发现率<0.05)而获得的，这允许鉴定出本发明的八种参数(六种基因和两种临床参数)。

在本发明的含义内，术语“β”指的是根据本发明的每一种基因的系数。

“β_i”表示每一种基因的回归β系数。通常，回归β系数是由本领域技术人员使用如Erickson,K.F.等,2016中所述的Bolasso方法针对每一种基因确定的。通常，可以从接受移植并且在IS下治疗的受试者获得血液样品；并且可以通过常规方法确定6种基因的表达。

考虑两种临床参数(在测试时间时受试者的年龄[年龄_测试时间]和在移植时间时受试者的年龄[年龄_移植时间])。然后将所述分数与区别TOL或STA的分界值进行比较。所述分界值可以通过在非移植受试者和移植受试者中经由相同的分析方法来分析相同基因的表达来确定。举例来说，它可以是非移植受试者的分数与移植受试者的分数之间的中点。

如本文所用的术语“β_测试时间”指的是在测试时间时受试者的年龄的β系数。

如本文所用的术语“β_移植时间”指的是在移植时间时受试者的年龄的β系数。

如本文所用的术语“截距”指的是用于校正方程式的固定值(指的是回归曲线与Y轴的截距)。

如本文所用的术语“缩放系数”指的是用于将分数中心化以将正分数和负分数分别与TOL诊断和STA诊断相关的值。

如本文所用的术语“Exprs”指的是每一种基因的表达水平。“基因表达谱”对应于一组至少2个、3个、4个、5个、6个或更多个值，所述值对应于选自由以下各项组成的组的至少2种、3种、4种、5种、6种或更多种基因中的每一种的基因表达水平：ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A、MZB1、CD22、BLK、MS4A1、CD79B、BLNK、FCRL2、IRF4、HINT1、RFC4、ANXA2R、FCER2、AKIRIN2、EPS15以及PLBD1，任选地连同另外的其它值对应于临床参数。优选的是，基因表达谱对应于一组6个值，所述值对应于ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A以及MZB1基因中的每一种的基因表达水平，任选地连同另外的其它值对应于临床参数。通常，所述基因，优选地所述6种基因的表达水平可以通过本领域技术人员已知的任何技术来确定。具体来说，每一种基因表达水平可以在基因组和/或核酸和/或蛋白质水平上测量。在一个具体的实施方案中，通过测量每一种基因的核酸转录物的量来确定基因的表达水平。在另一个实施方案中，通过测量每一种基因相应蛋白质的量来确定基因表达水平。核酸转录物的量可以通过本领域技术人员已知的任何技术来测量。具体来说，可以直接在提取的信使RNA(mRNA)样品上或在通过本领域公知的技术从提取的mRNA制备的逆转录的互补DNA(cDNA)上进行所述测量。从所述mRNA样品或cDNA样品，可以使用本领域技术人员已知的任何技术来测量核酸转录物的量，所述技术包括核酸微阵列、定量PCR、微流控卡、以及与标记探针杂交。在一个具体的实施方案中，使用定量PCR确定基因表达水平。定量或实时PCR是本领域技术人员公知的和容易使用的技术并且不需要精确的说明。用于确定mRNA量的方法是本领域公知的。举例来说，首先根据标准方法，例如使用裂解酶或化学溶液来提取生物样品中所含的核酸，或者遵循制造商的指导通过核酸结合树脂来提取。然后通过杂交(例如Northern印迹分析)和/或扩增(例如RT-PCR)检测提取的mRNA。优选的是，定量或半定量RT-PCR是优选的。实时定量或半定量RT-PCR是特别有利的。

其它扩增方法包括连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)以及基于核酸序列的扩增(NASBA)。

具有至少10个核苷酸并且表现出与本文所关注的mRNA序列互补性或同源性的核酸可用作杂交探针或扩增引物。应当了解的是，这些核酸不需要是相同的，但是通常与具有相当尺寸的同源区具有至少约80％的同一性，更优选地与具有相当尺寸的同源区具有85％的同一性，甚至更优选地90％的同一性，甚至更优选地95％或更大的同一性。在某些实施方案中，将有利的是，将核酸与适当的手段例如可检测的标记组合使用，以用于检测杂交。多种适当的指示剂是本领域已知的，包括荧光配体、放射性配体、酶配体、或其它配体(例如亲和素/生物素)。

探针通常包含长度为10个至1000个核苷酸的单链核酸，所述长度例如10个至800个，更优选地15个至700个，通常20个至500个核苷酸。引物通常是更短的单链核酸，其具有10个至25个核苷酸的长度，被设计成完全或几乎完全匹配待扩增的所关注的核酸。探针和引物对与它们杂交的核酸具有“特异性”，即它们优选地在高严格度杂交条件(对应于最高的解链温度Tm，例如50％甲酰胺、5×SCC或6×SCC缓冲液，1×SCC缓冲液包含0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠，用HCl调节到pH 7.0)下杂交。

用于上述扩增和检测方法中的核酸引物或探针可以被组装成试剂盒。这样的试剂盒包括共有引物和分子探针。试剂盒还包括确定扩增是否已发生所需的组分。所述试剂盒还可以包括例如PCR缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；以及扩增和检测特定序列的指导。

在一个具体的实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：提供从生物样品中提取的总RNA并且对所述RNA进行扩增以及与特异性探针杂交，更特别是借助于定量或半定量RT-PCR。

在另一个实施方案中，通过DNA芯片分析来确定基因表达水平。这样的DNA芯片或核酸微阵列由与基质化学连接的不同核酸探针组成，所述基质可以是微芯片、载玻片或微球尺寸的珠粒。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃、或硝化纤维素构成。探针包含核酸，例如cDNA或寡核苷酸，其可以是约10个至约60个碱基对。为了确定基因表达水平，将来自测试受试者的任选地首先经受逆转录的生物样品标记并且在杂交条件下与微阵列接触，从而引起在靶核酸之间形成复合物，所述靶核酸与连接于微阵列表面的探针序列互补。然后检测标记的杂交复合物并且可以对其进行定量或半定量。标记可以通过各种方法，例如通过使用放射性标记或荧光标记来实现。微阵列杂交技术的许多变体可供用于本领域技术人员(参见例如Hoheisel,NatureReviews,Genetics,2006,7:200-210的综述)。

本发明还涉及一种用免疫抑制疗法对移植受试者进行治疗的方法，所述方法包括以下步骤：

i)根据本发明确定所述受试者是可操作性耐受性(TOL)受试者或非可操作性耐受性(STA)受试者；以及

ii)当所述受试者是STA时，用一种或多种免疫抑制药物治疗所述受试者。

本发明还涉及一种用于鉴定处于免疫抑制疗法下的移植受试者作为免疫抑制疗法戒断或最小化的候选者的方法，所述方法包括以下步骤：

i)根据本发明确定所述受试者是可操作性耐受性(TOL)受试者或非可操作性耐受性(STA)受试者；以及

ii)当所述受试者是TOL时，推断所述受试者对于免疫抑制疗法戒断或最小化是符合条件的。

在另一个方面，本发明还涉及一种用于区分可操作性耐受性(TOL)受试者与非可操作性耐受性(STA)受试者的试剂盒，所述试剂盒包括用于确定对应于一组至少2个、3个、4个、5个、6个或更多个值的基因表达谱的至少一种试剂，，所述值对应于选自由以下各项组成的组的至少2种、3种、4种、5种、6种或更多种基因中的每一种的基因表达水平：ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A、MZB1、CD22、BLK、MS4A1、CD79B、BLNK、FCRL2、IRF4、HINT1、RFC4、ANXA2R、FCER2、AKIRIN2、EPS15以及PLBD1，任选地连同另外的其它值对应于临床参数。优选的是，根据本发明的试剂盒包括用于确定对应于一组6个值的基因表达谱的至少一种试剂，所述值对应于6种以下基因中的每一种的表达水平：ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A以及MZB1。

在一个实施方案中，根据本发明的试剂盒还可以包括用于确定至少一个参考基因的基因表达水平的至少一种试剂。参考基因的实例包括但不限于ACTB、B2M、GAPDH以及HPRT1。在一个实施方案中，确定至少一个参考基因的基因表达水平用于将根据本发明的每一种基因的相对表达归一化和/或计算所述相对表达。

在一些实施方案中，根据本发明的试剂盒还可以包括区分受试者TOL与STA的指导。区分受试者TOL与STA的指导可以包括至少一种参考基因表达谱。在一个具体的实施方案中，至少一种参考基因表达谱是可操作性耐受性(TOL)受试者的移植物耐受性表达谱，即对应于6种以下基因中的每一种的表达水平的一组6个值：ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A以及MZB1。或者，至少一种参考基因表达谱可以是非可操作性耐受性(STA)受试者的移植物非耐受性表达谱，即对应于6种以下基因中的每一种的表达水平的一组6个值：ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A以及MZB1。

将通过以下附图和实施例进一步说明本发明。然而，这些实施例和附图不应当以任何方式被解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1：综合耐受性分数(cSoT)

(A)cSoT模型：左轴显示所选择的基因和临床参数的系数(错误发现率[fdr]<0.05)(黑色条柱)并且右轴表示在100次10折交叉验证中所选择的基因和临床参数的次数，即出现率(灰色条柱)。(B)cSoT[cSoT]、6种基因(ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A以及MZB1)的组合[6种基因]、在测试时间时患者的年龄[在收集时的年龄]、在移植时间时患者的年龄[在Tx时的年龄]以及肌酸血症[肌酸血症]的接受者操作特征(ROC)曲线。(C)231名患者的cSoT值(42名TOL[灰色]和189名STA[黑色])。虚线表示ROC曲线的中心化的最佳阈值(约登指数(Youden index))。灰色区域(在虚线的两侧上)表示由具有特异性的值和低于90％的特异性界定的不确定区域。

图2：使用qPCR验证的cSoT

(A)使用qPCR，cSoT在TOL与STA之间仍然是有差异的(分别n＝9和12；平均值＝2.89±5.41和-2.58±2.37)以及(B)显示0.86(IC_95％[0.66-1])的AUC。

实施例

材料和方法

荟萃分析数据集

基因表达数据集是从先前描述的基因表达Ominbus(GEO)数据库(登录号GSE28456)[18]获得的。该数据集是来自收集了596个样品的5个独立研究的荟萃分析的结果[14,15,21,50,51]。

简单地说，将数据集使用Lowess程序重新归一化，进行对数变换，并且根据STA组进行中值中心化，所述STA组如先前所述并且由1,846种合并基因构成[18]。除了南特(Nantes)的收集之外并且凭借欧洲IoT和美国ITN网络，我们能够在不同的研究中鉴定出344名独特的非冗余患者：来自96个TOL样品的46名单个可操作性耐受性患者(TOL)和来自311个STA样品的具有稳定移植物功能的266名患者(STA)。来自TOL患者和STA患者的可用临床参数的人口统计学说明在表1和表2中给出。在技术重复的情况下(相同的血液采样时间)计算20种基因中的每一种的平均表达并且在时间重复的情况下选择最早的时间点。

表1：TOL(n＝46)和STA(n＝199)的人口统计学参数

表2：TOL(n＝46)和STA(n＝199)的人口统计学参数。

另外的微阵列数据集

从GEO收集三个可公开获得的微阵列数据集：GSE14630[34]、GSE22224[35]以及GSE45593[8]，并且使用稳健多阵列平均法(RMA)使用R软件中的affy软件包[52]将其归一化。将来自数据集GSE45218[33]的归一化的收集的表达值用于计算机交叉验证中。对于所有数据集，在应用cSoT的系数之前，将所关注的6种基因的基因表达中心化/缩放。

验证群组

招收来自南特医院(Nantes'Hospital)的另外的21名肾接受者以进行qPCR验证，包括9名TOL和12名STA。当地伦理委员会批准了本研究的所有方面并且所有患者都提供了他们的书面知情同意书。

qPCR验证

将静脉血样品收集在EDTA真空采血管中并且在4小时内处理用于分析。将外周血单核细胞(PBMC)在Ficoll层(法国于利斯的Eurobio公司(Eurobio,Les Ulis,France))上分离并且在试剂(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA USA))中冷冻在-80℃。使用TRIzol方法(赛默飞世尔科技公司)从外周血中提取RNA。分别使用Agilent 2100生物分析仪(美国加利福尼亚州的帕罗奥多(Palo Alto,CA,USA))和Nanodrop(法国帕莱索的Labtech公司(Labtech,Palaiseau,France))确定RNA的质量和数量。使用多聚dT寡核苷酸和莫洛尼白血病病毒逆转录(赛默飞世尔科技公司)将RNA逆转录。在StepOnePlus仪器(赛默飞世尔科技公司)上，使用可商购获得的引物和探针组(Taqman)对6种测试基因和4种参考基因进行实时定量PCR：AKR1C3：Hs00366267_m1；CD40：Hs00374176_m1；CTLA4：Hs00175480_m1；ID3：Hs00171409_m1；MZB1(或MGC29506)：Hs00414907_m1；TCL1A：Hs00951350_m1；以及4种参考基因：ACTB：Hs99999903_m1；B2M：Hs00984230_m1；GAPDH：Hs99999905_m1；HPRT1：Hs99999909_m1(赛默飞世尔科技公司)。使用4种参考基因的几何平均值将RNA量归一化并且根据2^-ΔΔCq方法[53]计算每一种基因的相对表达。

cSoT构建

使用逻辑单变量分析(使用R中的glm软件包)中相关于TOL与STA比较的参数进行cSoT构建。为了鉴定单变量分析中与耐受性相关的24种参数(20种基因和4种人口统计学参数)之间的最具辨别力的组合，我们使用Bolasso方法[5]，所述Bolasso方法进行自助法重抽样(10,000折)与套索(最小绝对值收缩和选择算子)回归分析的组合，继而进行多次检验以使用R中的mht软件包(3.2.2版)选择与模型相关的重要变量(错误发现率(FDR)<0.05)[2]。使用从mht中获得的系数在缩放之后计算来自其它数据集的分数，如由mht软件包所执行的那样。对于qPCR数据，使用缩放的dCq。

统计分析

使用R软件3.2.2版或GraphPrism v.4软件进行统计分析。使用参数学生T检验(student T test)、方差分析检验或Khi²检验进行组比较。当p<0.05时，差异被定义为具有统计显著性。

结果

选择与可操作性耐受性状态相关的临床参数

从我们先前描述的荟萃数据集[18]，除了南特的收集之外并且凭借欧洲耐受性指数(Indice of Tolerance，IoT)和美国免疫耐受性网络(Immune Tolerance Networks，ITN)，我们能够在不同的研究中鉴定出312名非冗余患者：来自96个TOL样品的46名单个可操作性耐受性患者(TOL)和来自311个STA样品的具有稳定移植物功能的266名患者(STA)。来自TOL患者和STA患者的可用临床参数的人口统计学说明在表1和表2中给出。为了构建预测分数，我们在患者的人口统计学临床参数中仅选择内在的和非变量患者相关参数并且所述参数对于至少一半的TOL是已知的(表1和表2)。使用单变量逻辑回归，4种参数与耐受性状态有关(p<0.20)并且选用于综合分数：在移植时间时患者的年龄(p<0.0001)、在测试时间时患者的年龄(p＝0.176)(表1)、HLA错配数量(p<0.0001)以及供者性别(p＝0.154)(表2)。

组合基因和临床参数的可操作性耐受性(cSoT)的综合分数

在技术重复的情况下(相同的血液采样时间)计算20种基因中的每一种的平均表达并且在时间重复的情况下选择最早的时间点。在单变量分析中在该312名患者的大群组中(46名TOL和266名STA；p<0.0001)确认了先前被报道为在TOL与STA之间有差异的20种基因的表达[1]。

为了鉴定上文被选择包括在cSoT中的20种原始基因和4种临床参数之间的最具辨别力的组合，我们使用Bolasso方法[5]，所述Bolasso方法进行自助法重抽样(10,000折)与套索(最小绝对值收缩和选择算子)回归分析的组合，继而进行多次检验以选择与模型相关的重要变量(错误发现率[FDR]<0.05)[2]。

我们鉴定出6种基因和2种临床参数的组合：AKR1C3、CD40、CTLA4、ID3、MZB1、TCL1A、在测试时间时患者的年龄以及在移植时间时患者的年龄(图1A和图1B)，该组合使得能够确定区分TOL和STA的cSoT(42名TOL的平均cSoT＝6.43±4.73(SD)并且189名STA的平均cSoT＝-4.04±2.81；p<0.0001)，AUC是0.973(IC_95％[0.939-1.00])，负预测值和正预测值分别是0.989和0.800(图1B和图1C)。

已经使用ROC曲线的最佳阈值(约登指数)将计算的cSoT分数中心化以使正分数和负分数分别与TOL诊断和STA诊断相关，并且不确定区域(也被称作“灰色区域”)已经通过具有特异性的值和低于90％的特异性(10％的预测耐受性)界定以易于解释(图1)[32]。经由重复100次的10折交叉验证(随机1/10的TOL和STA)验证了这8种参数的选择的一致性。我们发现这8种所选择的参数存在于1,000个模型中的至少80％中(图1A)。

最终，经由100次10折交叉验证进一步验证cSoT分数的稳健性，测试集的平均AUC是0.967IC_95％[0.966-0.968]。如所尝试的那样，所述cSoT分数区分了TOL与STA，优于单独的2种人口统计学参数(图1C)：在移植时间时的年龄(AUC＝0.737IC_95％[0.655-0.819])和在测试时间时的年龄(AUC＝0.564IC_95％[0.474-0.655]；这两个比较的p<0.0001)，优于仅6种基因的组合(AUC＝0.947IC_95％[0.902-0.992]；p＝0.38)并且优于患者功能(仅肌酸血症(AUC＝0.615IC_95％[0.519-0.711]；p<0.0001)。

最终，对于交叉验证，我们利用了最近对16名TOL和患有慢性同种异体移植肾病(CAN)的9名患者进行的微阵列数据集[33]。由于没有提供个体临床信息，因此我们只能计算6种基因表达的组合。尽管我们的基因组合没有被设计成区分TOL与CAN，而是被设计成区分TOL与STA，但是我们可以在2个群体之间观测到显著不同的分数值(p＝0.0061)和良好的区分(AUC＝0.825IC_95％[0.636-0.1.014])。

中心来源、免疫抑制方案、PTLD不影响cSoT

尽管TOL样品来自3个不同的来源(南特、IoT、以及ITN)，但是cSoT与患者来源无关(p＝0.13)。在具有稳定移植物功能的患者中停止IS的主要原因之一是出现严重副作用，例如PTLD。然而，cSoT不受PTLD经历的影响(PTLD，n＝4，p＝0.19)。

由于用于产生cSoT的两组患者的不同之处在于他们的免疫抑制方案状态，即STA处于IS下，而TOL不再接受IS，因此我们评估IS是否可以影响cSoT值。对于TOL患者，我们观测到在IS撤除之前包括环孢素A(CsA)、硫唑嘌呤、霉酚酸(MPA)以及使用诱导疗法的先前IS方案不影响cSoT值(分别p＝0.74，p＝0.61，p＝0.81以及p＝0.51；29名TOL)。我们然后分析了当前IS方案对STA群体中的cSoT的影响(n＝189)。类似地，cSoT既不受诱导疗法(p＝0.97)的影响，也不受CsA或他克莫司(p＝0.64)、皮质类固醇(p＝0.42)以及抗代谢剂(p＝0.92)的影响。我们然后使用可用的微阵列数据集在具有稳定移植物功能的肾移植接受者的两个独立群组中进一步测试了IS方案对单独或组合的来自cSoT的6种基因的影响[34,35]：

1)处于CsA(n＝14)或雷帕霉素(Rapa，n＝23)单一疗法下的第一患者群组[7]；以及

2)将硫唑嘌呤转换成MPA之后的第二患者群组(n＝5，在MPA转换之前和之后3个月配对)[6]。

在这两个群组中，这6种基因的组合和独立的6种基因(数据未示)都没有根据IS方案被改变(分别p＝0.99和0.77)。

总而言之，这些数据显示cSoT和独立的基因都不受先前或维持IS治疗的影响。

cSoT预测移植物功能障碍和从头抗体出现

主要问题之一是cSoT随时间推移的稳定性和结果。我们先前报道了，移植物功能丧失的一些病例可能在该TOL群组中观测到[36]，其中肌酸血症(>150μmol/L)或蛋白尿(>1g/24h)增加。在来自南特群组的15名TOL中，他们的大部分临床信息是可用的，9名的功能随时间推移下降(移植后17.09年±3.46年)。此外，在这15名TOL中，8名产生从头抗HLA抗体(移植后14.67年±1.13年)并且在他们当中，4名患者产生供者特异性抗体(DSA；移植后13.41年±0.21年)。此外，从头抗HLA抗体的存在与耐受性丧失有关(p＝0.034)。

我们发现，在测试时间时，当患者表现出良好的移植物功能(肌酸血症<150μmol/L和蛋白尿<1g/24h)时，cSoT在他们的功能下降(测试时间：功能减退前2.29年±2.7年)(p＝0.047，cSoT＝3.79±3.66和8.52±4.67)和产生抗HLA抗体和DSA(分别p＝0.016和p＝0.013)(测试时间：抗体检测前1.13年±1.78年和0.21年±1.10年)的患者中显著更低。

cSoT对可操作性耐受性状态具有特异性

为了根据可操作性的耐受性特征或方案诱导的耐受性特征评估cSoT的特异性，我们在耐受性诱导试验中测试了cSoT，其中在移植之后对活体供者兄弟姐妹的HLA相同的肾接受者进行随访4年[9][8]。所述方案在于淋巴细胞清除性阿仑单抗(alemtuzumab)治疗和他克莫司和MPA以及早期西罗莫司转换和输注供者造血CD34+干细胞。在移植后2年撤去免疫抑制。这些患者在完全IS停止的至少1年后具有正常的活检(即没有亚临床排斥反应的体征)和良好的肾功能。

在15名患者中，对他们中的9名的血液转录组进行随访4年，其中5名变得具有耐受性，4名没有变得具有耐受性。在停止IS之前和之后，cSoT或6种基因单独都不能将5名耐受性患者分类为TOL，无论移植后的时间如何。该结果因此支持了以下事实：来自该诱导方案的耐受性不享有可操作性的和自发的耐受性相关特征，这可能是因为涉及这两种情况的机制不同，并且该特征仅对于可操作性耐受性状态是特异性的。

适用于临床的qPCR cSoT

由于cSoT分数基于基因微阵列测量，因此我们使用定量PCR对它进行验证并且确认它的有用性以支持它在常规中的可能用途。在不同的时间对没有被包括在荟萃数据集中的5个独立的TOL样品和来自荟萃数据集的4个TOL样品进行qPCR。

我们证实，cSoT分数区分了TOL和STA(p＝0.0054，分别n＝9和12，平均值＝2.89±5.41和-2.58±2.37)，AUC是0.861(IC_95％[0.66-1])(图2)。此外，自助法程序(1,000次)确认了该验证的稳健性，平均AUC是0.852(IC_95％[0.845-0.859])。

参考文献

在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所属领域的现有技术。这些参考文献的公开内容在此以引用的方式并入本公开中。

1.Dantal,J.等,Effect of long-term immunosuppression in kidney-graftrecipients on cancer incidence:randomised comparison of two cyclosporinregimens(肾移植接受者的长期免疫抑制对癌症发病率的影响：两种环孢素方案的随机化比较),Lancet,1998.351(9103):第623-8页。

2.Miller,L.W.,Cardiovascular toxicities of immunosuppressive agents(免疫抑制剂的心血管毒性),Am J Transplant,2002.2(9):第807-18页。

3.Ojo,A.O.等,Chronic renal failure after transplantation of anonrenal organ(在非肾器官移植之后的慢性肾衰竭),N Engl J Med,2003.349(10):第931-40页。

4.Sawinski,D.等,Calcineurin Inhibitor Minimization,Conversion,Withdrawal,and Avoidance Strategies in Renal Transplantation:A SystematicReview and Meta-Analysis(在肾移植中钙调神经磷酸酶抑制剂最小化、转换、撤除、以及避免策略：系统综述和荟萃分析),Am J Transplant,2016。

5.Erickson,K.F.等,A Cost Analysis of Tolerance Induction for Two-Haplotype Match Kidney Transplant Recipients(双单倍型匹配肾移植接受者的耐受性诱导的成本分析),Am J Transplant,2016.16(1):第371-3页。

6.Kawai,T.等,Long-term results in recipients of combined HLA-mismatched kidney and bone marrow transplantation without maintenanceimmunosuppression(在没有维持免疫抑制的情况下组合HLA错配肾和骨髓移植的接受者中的长期结果),Am J Transplant,2014.14(7):第1599-611页。

7.Ciancio,G.等,A randomized pilot study of donor stem cell infusionin living-related kidney transplant recipients receiving alemtuzumab(在接受阿仑单抗的活体相关肾移植接受者中供者干细胞输注的随机化实验性研究),Transplantation,2013.96(9):第800-6页。

8.Leventhal,J.R.等,Nonchimeric HLA-Identical Renal TransplantTolerance:Regulatory Immunophenotypic/Genomic Biomarkers(非嵌合HLA相同肾移植耐受性：调节性免疫表型/基因组生物标志物),Am J Transplant,2016.16(1):第221-34页。

9.Leventhal,J.R.等,Genomic biomarkers correlate with HLA-identicalrenal transplant tolerance(基因组生物标志物与HLA相同肾移植耐受性相关),J AmSoc Nephrol,2013.24(9):第1376-85页。

10.Scandling,J.D.等,Tolerance and withdrawal of immunosuppressivedrugs in patients given kidney and hematopoietic cell transplants(接受肾和造血细胞移植的患者中的耐受性和免疫抑制药物的撤药),Am J Transplant,2012.12(5):第1133-45页。

11.Scandling,J.D.等,Chimerism,graft survival,and withdrawal ofimmunosuppressive drugs in HLA matched and mismatched patients after livingdonor kidney and hematopoietic cell transplantation(在活体供者肾和造血细胞移植之后HLA匹配和错配患者的嵌合状态、移植物存活率、以及免疫抑制药物的撤药),Am JTransplant,2015.15(3):第695-704页。

12.Massart,A.等,The DESCARTES-Nantes survey of kidney transplantrecipients displaying clinical operational tolerance identifies 35 newtolerant patients and 34 almost tolerant patients(对显示出临床可操作性耐受性的肾移植受者的DESCARTES-南特调查鉴定出35名新的耐受性患者和34名几乎耐受性患者),Nephrol Dial Transplant,2016。

13.Roussey-Kesler,G.等,Clinical operational tolerance after kidneytransplantation(在肾移植之后的临床可操作性耐受性),Am J Transplant,2006.6(4):第736-46页。

14.Newell,K.A.等,Identification of a B cell signature associated withrenal transplant tolerance in humans(与人类的肾移植耐受性相关的B细胞特征的鉴定),J Clin Invest,2010.120(6):第1836-47页。

15.Sagoo,P.等,Development of a cross-platform biomarker signature todetect renal transplant tolerance in humans(开发跨平台生物标志物特征以检测人类的肾移植耐受性),J Clin Invest,2010.120(6):第1848-61页。

16.Hricik,D.E.等,Adverse Outcomes of Tacrolimus Withdrawal in Immune-Quiescent Kidney Transplant Recipients(在免疫静息肾移植受者中他克莫司撤药的不良结果),J Am Soc Nephrol,2015。

17.Abramowicz,D.等,Cyclosporine withdrawal from a mycophenolatemofetil-containing immunosuppressive regimen:results of a five-year,prospective,randomized study(环孢素从含有吗替麦考酚酯的免疫抑制方案中撤药：五年前瞻性随机化研究的结果),J Am Soc Nephrol,2005.16(7):第2234-40页。

18.Baron,D.等,A common gene signature across multiple studies relatebiomarkers and functional regulation in tolerance to renal allograft(跨多个研究的共同基因特征将生物标志物和功能调节相关于肾同种异体移植物相关的),KidneyInt,2015.87(5):第984-95页。

19.Braudeau,C.等,Variation in numbers of CD4+CD25highFOXP3+T cellswith normal immuno-regulatory properties in long-term graft outcome(在长期移植物结果中具有正常免疫调节特性的CD4+CD25高FOXP3+T细胞的数量的变化),TransplInt,2007.20(10):第845-55页。

20.Braza,F.等,Central Role of CD45RA-Foxp3hi Memory Regulatory TCells in Clinical Kidney Transplantation Tolerance(在临床肾移植耐受性中CD45RA-Foxp3hi记忆调节性T细胞的中心作用),J Am Soc Nephrol,2015.26(8):第1795-805页。

21.Brouard,S.等,Identification of a peripheral blood transcriptionalbiomarker panel associated with operational renal allograft tolerance(与可操作性肾同种异体移植物耐受性相关的外周血转录生物标志物组的鉴定),Proc Natl AcadSci USA,2007.104(39):第15448-53页。

22.Chesneau,M.等,Tolerant Kidney Transplant Patients Produce B Cellswith Regulatory Properties(耐受性肾移植患者产生具有调节特性的B细胞),J Am SocNephrol,2015。

23.Danger,R.等,Upregulation of miR-142-3p in peripheral bloodmononuclear cells of operationally tolerant patients with a renal transplant(接受肾移植的可操作性耐受性患者的外周血单核细胞中miR-142-3p的上调),J Am SocNephrol,2012.23(4):第597-606页。

24.Pallier,A.等,Patients with drug-free long-term graft functiondisplay increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitoryphenotype(具有无药物长期移植物功能的患者显示具有记忆和抑制表型的外周B细胞的数量增加),Kidney Int,2010.78(5):第503-13页。

25.Silva,H.M.等,Preserving the B-cell compartment favors operationaltolerance in human renal transplantation(保留B细胞隔室有利于人类肾移植的可操作性耐受性),Mol Med,2012.18:第733-43页。

26.Newell,K.A.等,Longitudinal studies of a B cell-derived signatureof tolerance in renal transplant recipients(肾移植受者中耐受性的B细胞衍生特征的纵向研究),Am J Transplant,2015.15(11):第2908-20页。

27.Chesneau,M.等,Unique B cell differentiation profile in tolerantkidney transplant patients(耐受性肾移植患者的独特B细胞分化谱),Am JTransplant,2014.14(1):第144-55页。

28.Chesneau,M.等,Tolerant kidney transplant patients produce B cellswith regulatory properties(耐受性肾移植患者产生具有调节特性的B细胞),J Am SocNephrol,2015.26(10):第2588-98页。

29.Deng,M.C.等,Noninvasive discrimination of rejection in cardiacallograft recipients using gene expression profiling(使用基因表达谱的无创性辨认心脏同种异体移植受者的排斥反应),Am J Transplant,2006.6(1):第150-60页。

30.Mastoridis,S.,M.Martinez-Llordella以及A.Sanchez-Fueyo,Biomarkersand immunopathology of tolerance(耐受性的生物标志物和免疫病理学),Curr OpinOrgan Transplant,2016.21(1):第81-7页。

31.Rohart,F.,Multiple Hypotheses Testing For Variable Selection(用于变量选择的多次假设检验),2011。

32.Biais,M.等,Clinical relevance of pulse pressure variations forpredicting fluid responsiveness in mechanically ventilated intensive careunit patients:the grey zone approach(预测机械通气重症监护病房患者的流体响应性的脉压变化的临床相关性：灰色区域方法),Crit Care,2014.18(6):第587页。

33.Roedder,S.等,A three-gene assay for monitoring immune quiescencein kidney transplantation(用于监测肾移植中的免疫静息的三基因测定),J Am SocNephrol,2015.26(8):第2042-53页。

34.Dell'Oglio,M.P.等,The anti-fibrotic effect of mycophenolic acid-induced neutral endopeptidase(霉酚酸诱导的中性内肽酶的抗纤维化作用),J Am SocNephrol,2010.21(12):第2157-68页。

35.Brouard,S.等,Comparative transcriptional and phenotypic peripheralblood analysis of kidney recipients under cyclosporin A or sirolimusmonotherapy(在环孢素A或西罗莫司单一疗法下的肾受者的比较转录和表型外周血分析),Am J Transplant,2010.10(12):第2604-14页。

36.Brouard,S.等,The natural history of clinical operational toleranceafter kidney transplantation through twenty-seven cases(27例病例在肾移植之后临床可操作性耐受性的自然史),Am J Transplant,2012.12(12):第3296-307页。

37.Braza,F.,J.P.Soulillou以及S.Brouard,Reconsidering the bio-detection of tolerance in renal transplantation(重新考虑肾移植中耐受性的生物检测),Chimerism,2013.4(1):第15-7页。

38.Petrara,M.R.等,Post-transplant lymphoproliferative disorders:fromepidemiology to pathogenesis-driven treatment(移植后淋巴增生性病症：从流行病学到发病机制驱动的治疗),Cancer Lett,2015.369(1):第37-44页。

39.Everly,M.J.等,Incidence and impact of de novo donor-specificalloantibody in primary renal allografts(在初次肾同种异体移植物中从头供者特异性同种抗体的发生率和影响),Transplantation,2013.95(3):第410-7页。

40.Brouard,S.等,Identification of a gene expression profileassociated with operational tolerance among a selected group of stable kidneytransplant patients(在所选择的稳定肾移植患者组中与可操作性耐受性相关的基因表达谱的鉴定),Transpl Int,2011.24(6):第536-47页。

41.Krepsova,E.等,Effect of induction therapy on the expression ofmolecular markers associated with rejection and tolerance(诱导疗法对与排斥反应和耐受性相关的分子标志物的表达的影响),BMC Nephrol,2015.16:第146页。

42.Muller-Steinhardt,M.等,The pharmacodynamic effect of sirolimus:individual variation of cytokine mRNA expression profiles in human wholeblood samples(西罗莫司的药效动力学作用：人类全血样品中细胞因子mRNA表达谱的个体差异),Immunobiology,2009.214(1):第17-26页。

43.Roedder,S.等,The kSORT assay to detect renal transplant patientsat high risk for acute rejection:results of the multicenter AART study(kSORT测定检测处于高急性排斥反应风险的肾移植患者：多中心AART研究的结果),PLoS Med,2014.11(11):第e1001759页。

44.Lee,A.等,Validation study of peripheral blood diagnostic test foracute rejection in kidney transplantation(肾移植中急性排斥反应的外周血诊断测试的验证研究),Transplantation,2014.98(7):第760-5页。

45.Foucher,Y.等,A clinical scoring system highly predictive of long-term kidney graft survival(高度预测长期肾移植物存活率的临床评分系统),KidneyInt,2010.78(12):第1288-94页。

46.Lakkis,F.G.和M.H.Sayegh,Memory T cells:a hurdle to immunologictolerance(记忆T细胞：免疫耐受性的障碍),J Am Soc Nephrol,2003.14(9):第2402-10页。

47.Tullius,S.G.等,The combination of donor and recipient age iscritical in determining host immunoresponsiveness and renal transplantoutcome(供者和受者年龄的组合对于确定宿主免疫应答性和肾移植结果至关重要),AnnSurg,2010.252(4):第662-74页。

48.Benitez,C.等,Prospective multicenter clinical trial ofimmunosuppressive drug withdrawal in stable adult liver transplant recipients(在稳定成人肝移植受者中免疫抑制药物撤药的前瞻性多中心临床试验),Hepatology,2013.58(5):第1824-35页。

49.Heidt,S.等,B cell markers of operational tolerance candiscriminate acute kidney allograft rejection from stable graft function(可操作性耐受性的B细胞标志物可以区分急性肾同种异体移植排斥反应与稳定移植物功能),Transplantation,2014。

50.Braud,C.等,Immunosuppressive drug-free operational immunetolerance in human kidney transplant recipients:Part I.Blood gene expressionstatistical analysis(人类肾移植受者中的无免疫抑制药物可操作性免疫耐受性：部分I.血液基因表达统计分析),J Cell Biochem,2008.103(6):第1681-92页。

51.Lozano,J.J.等,Comparison of transcriptional and blood cell-phenotypic markers between operationally tolerant liver and kidney recipients(可操作性耐受性肝受者与肾受者之间转录和血细胞表型标志物的比较),Am JTransplant,2011.11(9):第1916-26页。

52.Gautier,L.等,affy--analysis of Affymetrix GeneChip data at theprobe level(在探针水平上Affymetrix GeneChip数据的affy--分析),Bioinformatics,2004.20(3):第307-15页。

53.PE Applied Biosystems,F.C.,ABI PRISM 7900用户公告,1997.2:第11-24页。

Claims (10)

1.一种用于区分可操作性耐受性(TOL)受试者与非可操作性耐受性(STA)受试者的方法，所述方法包括以下步骤：

i)使用从所述受试者获得的生物样品中六种基因的表达水平和两种临床参数确定综合耐受性分数(cSoT)；

其中所述六种基因是ID3、AKR1C3、CD40、CTLA4、TCL1A以及MZB1；并且

其中所述cSoT是通过下式确定的：

ii)将该cSoT与预定的参考值进行比较；以及

iii)当所述cSoT高于所述预定的参考值时，推断所述受试者是TOL，或当所述cSoT低于所述预定的参考值时，推断所述受试者是STA。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述两种临床参数是在测试时间时所述受试者的年龄和在移植时间时所述受试者的年龄。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述预定的参考值是TOL受试者的cSoT。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述预定的参考值是STA受试者的cSoT。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述受试者处于免疫抑制治疗下。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述受试者是肾接受者。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述肾接受者已经进一步移植有所述肾供者的胰腺和任选的一段十二指肠。

9.一种用免疫抑制疗法对移植受试者进行治疗的方法，所述方法包括以下步骤：

i)根据权利要求1确定所述受试者是可操作性耐受性(TOL)受试者或非可操作性耐受性(STA)受试者；以及

ii)当所述受试者是STA时，用免疫抑制疗法对所述受试者进行治疗。

10.一种用于鉴定处于免疫抑制疗法下的移植受试者作为免疫抑制疗法戒断或最小化的候选者的方法，所述方法包括以下步骤：

i)根据权利要求1确定所述受试者是可操作性耐受性(TOL)受试者或非可操作性耐受性(STA)受试者；以及

ii)当所述受试者是TOL时，推断所述受试者对于免疫抑制疗法戒断或最小化是符合条件的。