ES2847925T3 - Métodos para discriminar un sujeto receptor de un riñón tolerante - Google Patents

Abstract

Un método para discriminar un sujeto receptor de un riñón operacionalmente tolerante (TOL) de un sujeto receptor de un riñón no operacionalmente tolerante (STA), que comprende las siguientes etapas: i) establecer una puntuación de tolerancia compuesta (cSoT) con los niveles de expresión de seis genes en una muestra biológica que se obtiene de dicho sujeto y dos parámetros clínicos; donde dichos seis genes son ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A y MZB1; y donde dicha cSoT se establece mediante la siguiente fórmula: **(Ver fórmula)** ii) comparar esta cSoT con un valor de referencia predeterminado; y iii) concluir que el sujeto receptor de un riñón es TOL cuando la cSoT es mayor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto receptor de un riñón es STA cuando la cSoT es menor que el valor de referencia predeterminado.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para discriminar un sujeto receptor de un riñón tolerante

Campo de la invención

La invención se encuentra en el campo de los trasplantes, en particular, la invención permite identificar si un sujeto receptor de un riñón es tolerante entre los sujetos que se tratan con un tratamiento inmunosupresor.

Antecedentes de la invención

El trasplante de órganos sólidos se basa en el uso de un tratamiento inmunosupresor (IS) para prevenir el rechazo del injerto. Sin embargo, debido a los efectos secundarios del IS a largo plazo, que incluyen cánceres, enfermedades cardiovasculares, infecciones y nefrotoxicidad [1-3], se alienta a los médicos a reducir la exposición al IS sin dejar de proteger el injerto de la agresión inmunológica [4]. De manera ideal, si se logra la tolerancia del aloinjerto en el trasplante de órganos sólidos, a saber, la aceptación del aloinjerto sin un tratamiento de inmunosupresión (IS), esto significaría una gran revelación al evitar los efectos secundarios del IS. Además, esto reduciría el coste del mantenimiento del trasplante [5], reduciría los casos de retrasplante mejorando la calidad de vida de los receptores. Con este objetivo, se han intentado con éxito varios protocolos de inducción de tolerancia, principalmente a través de la creación de quimeras transitorias mediante transferencia de médula ósea o de células madre [6-10]. Sin embargo, hasta ahora, la eficacia se limita a donantes vivos o a un donante fallecido con incompatibilidad cero y solo se han informado unos pocos casos de inducción de tolerancia exitosa con incompatibilidad HLA [6, 11]. De manera interesante, se ha observado, además, tolerancia como resultado de la interrupción del IS por incumplimiento o decisión médica, de manera especial, en el trastorno linfoproliferativo postrasplante (PTLD) [12, 13]. Estos pacientes muestran estabilidad y una buena función del injerto durante años, responden al desafío inmunológico [12] y no presentan más infecciones oportunistas en comparación con los voluntarios sanos [12, 13]. Desde un punto de vista clínico, estos pacientes, que se descubren principalmente de manera fortuita [12, 14, 15], se pueden comparar con receptores renales que presentan función estable del injerto de conformidad con el IS convencional (STA), con solo unas pocas diferencias, incluido el aumento de la proporción del injerto de donantes vivos y niveles más bajos de incompatibilidad HLA [12].

Hasta la fecha, ningún parámetro clínico ha permitido retirar el IS de manera segura, incluso en ensayos sobre la base de una selección drástica de receptores no sensibilizados con función de injerto altamente estable [16, 17] (Dugast E et al., Am J Transplant. 2016 Nov.; 16 (11):3255-3261). De este modo, resulta evidente que la replicación intencional en cuanto a la supresión del IS en el trasplante renal en nuevos ensayos requiere parámetros clínicos, pero, además, nuevas pruebas de laboratorio para las cuales se ha preparado el camino a partir de informes recientes [Sagoo et al., 2010. J Clin Invest. 120 (6):1848-1861, WO2011138609, WO2011068829, EP1990425, WO2010136576, Sarwal et al., 2016 Clin Biochem. 49 (4-5): 404-410]. Recientemente, un metaanálisis integrador de estos estudios diferentes señaló 20 genes más, principalmente relacionados con células B, como los genes más significativamente expresados de manera diferencial entre TOL y STA [WO2016075232, [18]].

De manera interesante, las células B de estos receptores presentan un fenotipo específico con expresión de receptores de inhibición [24], un perfil de diferenciación único [27] y muestran propiedades supresoras [28]. De manera conjunta, estos datos sugieren que las células B pueden no solo ser biomarcadores potenciales, sino que además pueden regular de manera activa la respuesta inmune al riñón trasplantado, siendo probablemente favorecidas su inducción y expansión mediante terapias de inducción [26]. Mientras que la utilidad de tales firmas resulta ahora establecida de manera evidente, y siendo esto resultado del esfuerzo de la comunidad científica en las últimas décadas [29, 30], ahora resulta necesario demostrar su seguridad y confiabilidad para minimizar el IS y parar el seguimiento de los pacientes en los trasplantes. En primer lugar, se necesita una firma que resulte ser la de mayor confianza y que se pueda aplicar fácilmente al mayor número de pacientes. En segundo lugar, se necesita una firma que resulte estable y que no se vea influenciada por eventos que ocurren durante la vida de los pacientes trasplantados, tales como neoplasia o inmunosupresión. En tercer lugar, mientras la inducción de la tolerancia es una forma terapéutica prometedora, ante las posibilidades de si los que estos protocolos recapitulan lo que se observa en pacientes operacionalmente tolerantes o si existen diferentes situaciones de la denominada "tolerancia" sin resolver todavía, se necesita demostrar, de este modo, una firma común para las dos situaciones.

Sumario

La presente invención se ha definido en las reivindicaciones adjuntas.

La presente divulgación se refiere a un método para discriminar un sujeto receptor de un riñón operacionalmente tolerante (TOL) de un sujeto receptor de un riñón no operacionalmente tolerante (STA), que comprende las siguientes etapas:

i) establecer una puntuación de tolerancia compuesta (cSoT) con los niveles de expresión de seis genes en una muestra biológica que se obtiene de dicho sujeto y dos parámetros clínicos;

donde dicha cSoT se establece mediante la siguiente fórmula:

ii) comparar esta cSoT con un valor de referencia predeterminado; y

iii) concluir que el sujeto es TOL cuando la cSoT es mayor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto es STA cuando la cSoT es menor que el valor de referencia predeterminado.

Los seis genes son ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A y MZB1.

Los dos parámetros clínicos son la edad de dicho sujeto en el momento de la prueba y la edad de dicho sujeto en el momento del trasplante.

En una realización, el valor de referencia predeterminado es la cSoT de un sujeto TOL. En otra realización, el valor de referencia predeterminado es la cSoT de un sujeto STA. En una realización, el sujeto se somete a tratamiento inmunosupresor.

En una realización, el sujeto es un ser humano.

En una realización, dicho receptor de un riñón se ha injertado, además, con el páncreas y, de manera opcional, con una pieza de duodeno del donante del riñón.

La presente divulgación se refiere, además, a un método para tratar a un sujeto receptor de un riñón con una terapia inmunosupresora que comprende las etapas de:

i) determinar si el sujeto es un sujeto operacionalmente tolerante (TOL) o un sujeto no operacionalmente tolerante (STA) mediante el uso del método para discriminar un sujeto TOL de uno STA de acuerdo con la presente invención; y

ii) tratar al sujeto con terapia inmunosupresora cuando el sujeto es STA.

La presente divulgación se refiere, además, a un método para identificar a un sujeto receptor de un riñón que se somete a terapia inmunosupresora como un candidato para retirar o minimizar la terapia inmunosupresora que comprende las etapas de:

i) determinar si el sujeto es un sujeto operacionalmente tolerante (TOL) o un sujeto no operacionalmente tolerante (STA) mediante el uso del método para discriminar un sujeto TOL de uno STA de acuerdo con la presente invención; y

ii) concluir que el sujeto es elegible para retirar o minimizar la terapia inmunosupresora cuando el sujeto es TOL. Definiciones

En la presente invención, los siguientes términos presentan los siguientes significados:

según se utiliza en el presente documento, el término “AKR1C3” se refiere al miembro C3 de la familia 1 de las aldoceto reductasas. El gen AKR1C3 humano de origen natural presenta una secuencia de nucleótidos según se muestra en el número de acceso de Genbank NM_001253908.1 y la proteína AKR1C3 humana de origen natural presenta una secuencia de aminoácidos según se muestra en el número de acceso de Genbank NP_001240837.1.

Según se utiliza en el presente documento, la expresión “muestra biológica” se refiere a cualquier muestra obtenida de un sujeto, preferiblemente de un sujeto trasplantado, tal como una muestra de suero, una muestra de plasma, una muestra de orina, una muestra de sangre, una muestra de linfa o una biopsia. En una realización particular, las muestras biológicas para la determinación de un nivel de expresión génica incluyen muestras tales como una muestra de sangre, una muestra de linfa o una biopsia. En una realización particular, la muestra biológica es una muestra de sangre, más particularmente, células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Normalmente, estas células se pueden extraer de la sangre entera mediante el uso de Ficol, un polisacárido hidrófilo que separa las capas de sangre, formando las PBMC un anillo de células bajo una capa de plasma. De manera adicional, las PBMC se pueden extraer de la sangre entera mediante una lisis hipotónica que lisará preferiblemente glóbulos rojos. Tales procedimientos son conocidos por los expertos en la técnica.

Según se utiliza en el presente documento, el término “CD40” se refiere al grupo de diferenciación 40. CD40 es una proteína coestimuladora que se encuentra en las células que presentan antígeno y resulta necesaria para su activación. El gen CD40 humano de origen natural presenta una secuencia de nucleótidos según se muestra en el número de acceso de Genbank NM_001250.5 y la proteína CD40 humana de origen natural presenta una secuencia de aminoácidos según se muestra en el número de acceso de Genbank NP_001241.1. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos murinos se han descrito también (números de acceso de Genbank NM_011611.2 y NP_035741.2, respectivamente).

Según se utiliza en el presente documento, el término “CTLA4” se refiere a la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos, que se conoce además como CD152 (grupo de diferenciación 152). Es un receptor de proteína que, al funcionar como un punto de control inmunológico, regula las respuestas inmunitarias de manera negativa. El gen CTLA4 humano de origen natural presenta una secuencia de nucleótidos según se muestra en el número de acceso de Genbank NM_001037631.2 y la proteína CTLA4 humana de origen natural presenta una secuencia de aminoácidos según se muestra en el número de acceso de Genbank NP_001032720.1. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos murinos se han descrito también (números de acceso de Genbank NM_001281976.1 y NP_001268905.1, respectivamente).

Según se utiliza en el presente documento, el término “discriminar” se refiere a identificar, observar una diferencia o distinguir dos grupos. Normalmente, el método de acuerdo con la invención resulta adecuado para identificar o distinguir a un sujeto que es tolerante de sujetos que se tratan con un fármaco inmunosupresor.

Según se utiliza en el presente documento, el término “ID3” se refiere al inhibidor 3 de unión a ADN. El gen ID3 humano de origen natural presenta una secuencia de nucleótidos según se muestra en el número de acceso de Genbank NM_002167.4 y la proteína ID3 humana de origen natural presenta una secuencia de aminoácidos según se muestra en el número de acceso de Genbank NP_002158.3. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos murinos se han descrito también (números de acceso de Genbank NM_008321.2 y NP_032347.1, respectivamente).

Según se utilizan en el presente documento, las expresiones “terapia inmunosupresora” o “tratamiento inmunosupresor” se refieren a la administración de uno o más fármacos inmunosupresores a un sujeto trasplantado. Los fármacos inmunosupresores que se pueden emplear en procedimientos de trasplante incluyen, pero sin limitación, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, FK-506 (tacrolimus), sirolimus, everolimus, rapamicina, corticosteroides, ciclosporinas (tal como, p. ej., ciclosporina A), ácido micofenólico, leflumacida, ascomicina e hidroxiurea. Estos fármacos se pueden utilizar en monoterapia o en terapias de combinación.

Según se utiliza en el presente documento, la expresión “retirada o minimización de la terapia inmunosupresora” se refiere a la reducción progresiva, y eventualmente, de manera opcional, la supresión, de una terapia inmunosupresora en un sujeto trasplantado al que se le administran fármacos inmunosupresores.

Según se utiliza en el presente documento, el término “MZB1” se refiere a las células B de la zona marginal y la proteína 1 específica de la célula B1. El gen MZB1 humano de origen natural presenta una secuencia de nucleótidos según se muestra en el número de acceso de Genbank NM_016459.3 y la proteína TCL1A humana de origen natural presenta una secuencia de aminoácidos según se muestra en el número de acceso de Genbank NP_057543.2. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos murinos se han descrito también (números de acceso de Genbank NM_027222.3 y NP_081498.2, respectivamente).

Según se utiliza en el presente documento, la expresión “trasplante de órganos” se refiere al procedimiento de reemplazo de órganos, partes de órganos o tejidos enfermos por órganos o tejidos sanos. El órgano o tejido trasplantado se puede obtener del propio sujeto (= autoinjerto), de otro donante humano (= aloinjerto) o de un animal (= xenoinjerto). Los órganos trasplantados pueden ser artificiales o naturales, enteros (tales como riñón, corazón e hígado) o parciales (tales como válvulas cardíacas, piel y huesos).

Según se utiliza en el presente documento, la expresión “valor de referencia predeterminado” se refiere a un valor umbral o un valor de corte. Normalmente, un “valor umbral” o “valor de corte” se puede determinar de manera experimental, empírica o teórica. Un valor umbral se puede seleccionar, además, de manera arbitraria, sobre la base de condiciones experimentales y/o clínicas existentes, como una persona de capacidad ordinaria en la técnica reconocería. Por ejemplo, se puede utilizar la medición retrospectiva en muestras de sujetos históricas debidamente depositadas para establecer el valor de referencia predeterminado. El valor umbral se debe determinar para obtener la sensibilidad y la especificidad óptimas de acuerdo con la función de la prueba y el balance beneficio/riesgo (consecuencias clínicas de falsos positivos y falsos negativos). Normalmente, la sensibilidad y la especificidad óptimas (y, de esta manera, el valor umbral) se pueden determinar mediante el uso de una curva de característica operativa del receptor (ROC) sobre la base de datos experimentales. Por ejemplo, después de determinar el nivel de expresión del péptido seleccionado en un grupo de referencia, se puede utilizar el análisis algorítmico para el tratamiento estadístico de los niveles de expresión determinados en las muestras, para analizar y obtener, de este modo, un estándar de clasificación que resulta significativo para la clasificación de la muestra. El nombre completo de la curva ROC es curva de característica operativa del receptor, que se conoce además como curva de característica de operación del receptor. Se utiliza principalmente para pruebas bioquímicas de diagnóstico clínico. La curva ROC es un indicador integral que refleja las variables continuas de la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) y la tasa de falsos positivos (especificidad 1). Revela la relación entre sensibilidad y especificidad con el método de composición de imágenes. Una serie de valores de corte diferentes (valores umbrales o críticos, valores límite entre los resultados normales y anormales de la prueba de diagnóstico) se establece como variables continuas para calcular una serie de valores de sensibilidad y especificidad. Luego, la sensibilidad se utiliza como la coordenada vertical y la especificidad se utiliza como la coordenada horizontal para dibujar una curva. Cuanto mayor sea el área bajo la curva (AUC), mayor será la precisión del diagnóstico. En la curva ROC, el punto más cercano al extremo superior izquierdo del diagrama de coordenadas es un punto crítico que presenta tanto valores de alta sensibilidad como de alta especificidad. El valor AUC de la curva ROC se encuentra entre 1,0 y 0,5. Cuando AUC >0,5, el resultado del diagnóstico mejora cada vez más a medida que el AUC se aproxima a 1. Cuando el AUC se encuentra entre 0,5 y 0,7, la precisión es baja. Cuando el AUC se encuentra entre 0,7 y 0,9, la precisión es moderada. Cuando el AUC es mayor de 0,9, la precisión es alta. Este método algorítmico se realiza preferiblemente con un ordenador. El software o los sistemas existentes en la técnica se pueden utilizar para graficar la curva ROC, tal como: software estadístico médico MedCalc 9.2.0.1, SPSS 9.0, ROCPOWER.SAS, DESIGNROC.FOR, MULTILEADER POWER.SAS, CREATE-ROC.SAS, GB STAT VI0.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, Md., EE. UU.), etc.

Según se utiliza en el presente documento, la expresión “reactivo para la determinación de un nivel de expresión génica” se refiere a un reactivo que permite determinar, de manera específica, dicho nivel de expresión génica, a saber, un reactivo que se dirige de manera específica a la determinación específica del nivel de expresión de un gen dado, tal como, p. ej., de los genes ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A y/o MZB1. Esta definición excluye, por lo tanto, reactivos genéricos útiles para la determinación del nivel de expresión de cualquier gen, tal como la polimerasa taq o un regulador de amplificación, a pesar de que tales reactivos genéricos pueden ser necesarios, no obstante, insuficientes, para determinar el nivel de expresión de un gen dado y, por lo tanto, se pueden incluir en un equipo también, de acuerdo con la invención.

Según se usa en el presente documento, el término “STA” se refiere a un “sujeto no operacionalmente tolerante”, a saber, el sujeto se encuentra sometido a inmunosupresión con función estable, pero rechazará su injerto si se retira el tratamiento inmunosupresor. Un sujeto como tal se considera no tolerante al injerto. En una realización particular, se considera que el sujeto “STA” presenta un riesgo inmunológico alto, a saber, dicho sujeto presenta mayor riesgo de desarrollar rechazo (agudo o crónico) y/o anticuerpos contra el injerto.

Según se utiliza en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a cualquier mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. Particularmente, en la presente invención, el sujeto es un ser humano, que se define además como “paciente”. En una realización particular, el sujeto es un sujeto trasplantado, que se denomina además “receptor” o “sujeto injertado”.

Según se utiliza en el presente documento, el término “TCL1A” se refiere a la proteína 1 de linfoma o leucemia de células T. El gen TCL1A humano de origen natural presenta una secuencia de nucleótidos según se muestra en el número de acceso de Genbank NM_001098725.1 y la proteína TCL1A humana de origen natural presenta una secuencia de aminoácidos según se muestra en el número de acceso de Genbank NP_001092195.1.

Según se utiliza en el presente documento, el término “TOL” se refiere a un “sujeto operacionalmente tolerante”, a saber, el sujeto se encuentra sometido a inmunosupresión con función estable y el régimen de inmunosupresión puede retirarse de manera segura. Esto significa que el sujeto no rechaza su injerto ante la ausencia de un tratamiento inmunosupresor con un injerto de buen funcionamiento. Un sujeto como tal se considera tolerante al injerto. En una realización particular, se considera que el sujeto “TOL” presenta un riesgo inmunológico bajo, a saber, dicho sujeto presenta menor riesgo de desarrollar rechazo (agudo o crónico) y/o anticuerpos contra el injerto.

Según se utiliza en el presente documento, la expresión “sujeto trasplantado” (que se denomina además “receptor” o “sujeto injertado”), se refiere a un sujeto que ha recibido un trasplante de órgano.

Según se utiliza en el presente documento, los términos “tratar” y “tratamiento” se refieren tanto a tratamiento profiláctico como preventivo, así como a tratamiento curativo o modificador de la enfermedad, incluido el tratamiento del sujeto en riesgo de contraer la enfermedad o del cual se sospecha que ha contraído la enfermedad, así como el sujeto que se encuentra enfermo o que ha sido diagnosticado con una enfermedad o condición médica e incluye la supresión de la recaída clínica. El tratamiento se puede administrar a un sujeto que presenta un trastorno médico o que, en última instancia, puede adquirir el trastorno, con el fin de prevenir, curar, retrasar la aparición de, reducir la gravedad de o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de tal tratamiento. La expresión “régimen terapéutico” se refiere a la pauta de tratamiento de una enfermedad, p. ej., la pauta de dosificación que se utiliza durante la terapia. Un régimen terapéutico puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. La frase “régimen de inducción” o “período de inducción” se refiere a un régimen de tratamiento (o la parte de un régimen terapéutico) que se utiliza para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de un régimen de inducción consiste en proporcionar una concentración alta de fármaco a un sujeto durante el período inicial de un régimen de tratamiento. Un régimen de inducción puede incluir (en parte o en su totalidad) un “régimen de carga”, que puede incluir la administración de una dosis del fármaco mayor en comparación con la que un médico emplearía durante un régimen de mantenimiento, la administración de un fármaco con mayor frecuencia en comparación con la que un médico administraría el fármaco durante un régimen de mantenimiento, o ambas. La frase “régimen de mantenimiento” o “período de mantenimiento” se refiere a un régimen terapéutico (o la parte de un régimen terapéutico) que se utiliza para el mantenimiento de un sujeto durante el tratamiento de una enfermedad, p. ej., para mantener al sujeto en remisión durante largos períodos de tiempo (meses o años). Un régimen de mantenimiento puede incluir terapia continua (p. ej., la administración de un fármaco a intervalos regulares, p. ej., por semana, por mes, por año, etc.) o terapia intermitente (p. ej., tratamiento interrumpido, tratamiento intermitente, tratamiento en la recaída o el tratamiento una vez que se alcanza un criterio predeterminado particular [p. ej., dolor, manifestación de la enfermedad, etc.]).

Según se utiliza en el presente documento, la expresión “dos parámetros clínicos” se refiere a la edad del sujeto en el momento de la prueba y la edad del sujeto en el momento del trasplante.

Descripción detallada

Sobre la base de la firma de 20 genes a partir de su metaanálisis publicado, los inventores utilizaron una metodología dispersa para identificar y validar los genes más informativos, los cuales, en asociación con pocos parámetros demográficos, permiten construir una puntuación de tolerancia predictiva que se puede aplicar en la rutina clínica [31]. De este modo, los inventores identificaron y validaron una puntuación de 6 genes combinados con 2 parámetros clínicos básicos que permiten identificar a TOL de STA con excelente precisión. Se demostró que esta firma de tolerancia no se ve comprometida por el estado de neoplasia (PTLD) de los pacientes, el origen del centro, ni por tratamiento IS. Los receptores y los pacientes operacionalmente tolerantes que se benefician de un protocolo de inducción de tolerancia no comparten una “firma de tolerancia” común. Finalmente, se demostró que esta puntuación se vio influenciada por el anticuerpo anti-HLA de novo, incluyendo DSA y pérdida de tolerancia, que reforzó su potencial para seguimiento de pacientes con trasplante renal.

La divulgación se refiere a métodos para discriminar un sujeto receptor de un riñón operacionalmente tolerante (TOL) de un sujeto receptor de un riñón no operacionalmente tolerante (STA), que comprende las siguientes etapas:

i) establecer una puntuación de tolerancia compuesta (cSoT) con el nivel de expresión de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o más genes en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto y al menos uno, al menos dos o más parámetros clínicos; donde, dicha puntuación se establece mediante la siguiente fórmula:

ii) comparar dicha cSoT con un valor de referencia predeterminado; y

iii) concluir que el sujeto es TOL cuando dicha cSoT es mayor que valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto es STA cuando dicha cSoT es menor que el valor de referencia predeterminado.

En una realización, los genes se seleccionan a partir del grupo que consiste en ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A, MZB1, CD22, BLK, MS4A1, CD79B, BLNK, FCRL2, IRF4, HINT1, RFC4, ANXA2R, FCER2, AKIRIN2, EPS15 y PLBD1. Preferiblemente, los genes se seleccionan a partir del grupo que consiste en ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A y MZB1.

En una realización, los parámetros clínicos se seleccionan a partir del grupo que consiste en la edad de dicho sujeto en el momento de la prueba, la edad del sujeto en el momento del trasplante, la edad del donante, el género del receptor, el género del donante, el tipo de donante, el orden del injerto, el número de incompatibilidades HLA, el tratamiento de inducción, la creatinemia del receptor, la proteinuria del receptor, la presencia en el receptor de anti-HLA Ab en el momento de la prueba y la presencia en el receptor de DSA en el momento de la prueba. Preferiblemente, los parámetros clínicos se seleccionan a partir del grupo que consiste en la edad de dicho sujeto en el momento de la prueba y la edad del sujeto en el momento del trasplante.

En una realización, el método para discriminar un sujeto receptor de un riñón TOL de STA comprende las siguientes etapas:

i) establecer una puntuación de tolerancia compuesta (cSoT) con el nivel de expresión de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o más genes que se seleccionan a partir del grupo que consiste en ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A y MZB1 en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto y al menos uno, al menos dos o más parámetros clínicos que se seleccionan a partir del grupo que consiste en la edad de dicho sujeto en el momento de la prueba y la edad del sujeto en el momento del trasplante; donde, dicha puntuación se establece mediante la siguiente fórmula:

ii) comparar dicha cSoT con un valor de referencia predeterminado; y

iii) concluir que el sujeto es TOL cuando dicha cSoT es mayor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto es STA cuando dicha cSoT es menor que el valor de referencia predeterminado.

El método para discriminar un sujeto receptor de un riñón TOL de STA comprende las siguientes etapas:

i) establecer una puntuación de tolerancia compuesta (cSoT) con el nivel de expresión de seis genes ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A y MZB1 en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto y dos parámetros clínicos que se seleccionan a partir de la edad de dicho sujeto en el momento de la prueba y la edad del sujeto en el momento del trasplante; donde, dicha puntuación se establece mediante la siguiente fórmula:

n

^cSoT = y ¿— i = ^(3t x ^Exprés. + /? momento de X e d ü d momento de

prueba prueba

P ^{momento de x e d a d momento d e} interceptación ^- coeficiente de ^{traspl. traspl.} escala

ii) comparar dicha cSoT con un valor de referencia predeterminado; y

iii) concluir que el sujeto es TOL cuando dicha cSoT es mayor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto es STA cuando dicha cSoT es menor que el valor de referencia predeterminado.

En una realización, un sujeto TOL mantiene la función de injerto estable sin fármacos inmunosupresores. En una realización, un sujeto STA no mantiene la función de injerto estable sin fármacos inmunosupresores.

En una realización, el sujeto es un mamífero. En una realización particular, el sujeto es un ser humano.

En una realización, el sujeto es un sujeto trasplantado. En una realización particular, el sujeto es un sujeto con trasplante renal. En particular, dicho sujeto con trasplante renal puede haber sido injertado, de manera adicional, con el páncreas, y, de manera opcional, una pieza de duodeno, del donante del riñón.

En una realización, el sujeto se trata con fármacos inmunosupresores u otros fármacos que se conocen actualmente en la técnica o que se identificarán en el futuro. En una realización particular, el sujeto se somete a tratamiento inmunosupresor, a saber, se administra al sujeto uno o más fármacos inmunosupresores.

Los fármacos inmunosupresores que se pueden emplear en procedimientos de trasplante incluyen, pero sin limitación, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, FK-506 (tacrolimus), sirolimus, everolimus, rapamicina, corticosteroides, ciclosporinas (tal como, p. ej., ciclosporina A), ácido micofenólico, leflumacida, ascomicina e hidroxiurea.

En una realización, los fármacos inmunosupresores se utilizan en monoterapia. En otra realización, los fármacos inmunosupresores se utilizan en terapias de combinación.

En el caso de trasplante renal, comúnmente se utilizan los siguientes protocolos inmunosupresores. Los sujetos con trasplante renal primario reciben, de manera general, un tratamiento de inducción que consiste en 2 inyecciones de basiliximab (Simulect®, un anticuerpo anti-IL2-Ra monoclonal murino/humano quimérico comercializado por Novartis), en asociación con tacrolimus (Prograf™, Fujisawa Pharmaceutical, 0,1 mg/kg/día), micofenolato de mofetilo (Cellcept™, Syntex Laboratories, Inc., 2 g/día) y corticoides (1 mg/kg/día), siendo reducido el tratamiento, de manera progresiva, con corticoides en 10 mg cada 5 días hasta el final del tratamiento, 3 meses después del trasplante. Los sujetos con trasplante renal secundario o terciario o los sujetos que se consideran en riesgo inmunológico (porcentaje de anticuerpos reactivos del panel anti-T (PRA) que alcanzó anteriormente un pico mayor del 25 % o isquemia fría durante más de 36 horas), reciben, de manera general, un ciclo corto de globulina antitimocítica (ATG) (durante, p. ej., 7 días), además del día 0 con micofenolato de mofetilo (Cellcept™, Syntex Laboratories, Inc., 2 g/día) y corticosteroides (1 mg/kg/día), luego los esteroides se reducen de manera progresiva en 10 mg cada 5 días hasta el final del tratamiento y, finalmente, se detiene la administración alrededor de 3 meses después del trasplante. Se introduce tacrolimus (Prograf™, Fujisawa Pharmaceutical) de manera diferida (el día 6) en una dosis de 0,1 mg/kg/día.

Según se utiliza en el presente documento, el término “puntuación de tolerancia compuesta (cSoT)”, que se denomina además, “puntuación”, se refiere a un valor obtenido de la siguiente fórmula:

ti

cS° T = ^Y =Pi ^x Exprés. Pmomentode ^* edad mome,„ode ⁺ P momentode ^x edadmomemode i prueba Pr'<eba vasPl nasPl

+ interceptación — coeficiente de

escala

Esta fórmula se obtuvo mediante el uso del algoritmo Bolasso, un lasso (operador de selección y contracción mínima absoluta) que se realiza mediante remuestreo bootstrap (10.000 veces) continuando con múltiples pruebas (tasa de descubrimiento falso <0,05), que permite identificar los ocho parámetros (seis genes y dos parámetros clínicos) de la presente invención.

En cuanto a lo referido en la invención, el término “p” se refiere a un coeficiente para cada gen de acuerdo con la invención.

“pi” representa el coeficiente de regresión p para cada gen. Normalmente, los coeficientes de regresión p se determinan por el experto en la técnica para cada gen mediante el uso del método Bolasso según se describe en Erickson, K.F., et al., 2016. Normalmente, se puede obtener una muestra de sangre de un sujeto trasplantado y que se trata con IS; y se puede determinar la expresión de 6 genes mediante métodos convencionales.

Se consideran dos parámetros clínicos (la edad del sujeto en el momento de la prueba [edadmomento de la prueba] y la edad del sujeto en el momento del trasplante [edadmomento del traspl.]). Luego, la puntuación se compara con un valor de corte que distingue TOL o STA. El valor de corte se puede determinar mediante el análisis de la expresión de los mismos genes por el mismo método de análisis en sujetos no trasplantados y en sujetos trasplantados. Por ejemplo, puede ser el punto medio entre la puntuación de los sujetos no trasplantados y la de los sujetos trasplantados.

Según se utiliza en el presente documento, la expresión "pmomento de la prueba" se refiere al coeficiente p de la edad del sujeto en el momento de la prueba.

Según se utiliza en el presente documento, el término "pmomento de la prueba" se refiere al coeficiente p de la edad del sujeto en el momento del trasplante.

Según se utiliza en el presente documento, el término "interceptación" se refiere a un valor fijo que se utiliza para corregir la ecuación (se refiere a la interceptación de la curva de regresión al eje Y).

Según se utiliza en el presente documento, la expresión "coeficiente de escala" se refiere a un valor que se utiliza para centrar la puntuación con el fin de asociar puntuaciones positivas y negativas con el diagnóstico de TOL y STA, respectivamente.

Según se utiliza en el presente documento, el término “Expres.” se refiere al nivel de expresión de cada gen. El “perfil de expresión génica” corresponde a un grupo de, al menos, 2, 3, 4, 5, 6 o más valores correspondientes al nivel de expresión génica de cada uno de, al menos, 2, 3, 4, 5, 6 o más genes que se seleccionan a partir del grupo que consiste en ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A, MZB1, CD22, BLK, MS4A1, CD79B, BLNK, FCRL2, IRF4, HINT1, RFC4, ANXA2R, FCER2, AKIRIN2, EPS15 y PLBD1, de manera opcional, con otros valores adicionales correspondientes a los parámetros clínicos. Preferiblemente, el perfil de expresión génica corresponde a un grupo de 6 valores correspondientes al nivel de expresión génica de cada uno de los genes ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A y MZB1, de manera opcional, con otros valores adicionales correspondientes a los parámetros clínicos. Normalmente, el nivel de expresión de los genes, preferiblemente de los 6 genes, se puede determinar mediante cualquier tecnología que se conoce por una persona capacitada en la técnica. En particular, cada nivel de expresión génica se puede medir a nivel genómico y/o nucleico y/o proteico. En una realización particular, el nivel de expresión del gen se determina mediante la medición de la cantidad de transcritos de ácido nucleico de cada gen. En otra realización, el nivel de expresión génica se determina mediante la medición de la cantidad de proteína que corresponde a cada gen. La cantidad de transcritos de ácido nucleico se puede medir mediante cualquier tecnología que se conoce por una persona capacitada en la técnica. En particular, la medida se puede realizar de manera directa en una muestra de ARN mensajero (ARNm) extraído o en ADN complementario retrotranscrito (ADNc) que se prepara a partir de ARNm extraído mediante tecnologías que se conocen bien en la técnica. A partir de la muestra de ARNm o ADNc, la cantidad de transcritos de ácido nucleico se puede medir mediante el uso de cualquier tecnología que se conoce por una persona capacitada en la técnica, incluidos microarrays nucleicos, PCR cuantitativa, tarjetas de microfluidos e hibridación con una sonda etiquetada. En una realización particular, el nivel de expresión génica se determina mediante el uso de PCR cuantitativa. La PCR cuantitativa o en tiempo real es una tecnología que se conoce bien y que se encuentra fácilmente disponible para los expertos en la técnica y no requiere una descripción precisa. Los métodos para determinar la cantidad de ARNm se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, el ácido nucleico contenido en la muestra biológica se extrae primero de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, mediante el uso de enzimas líticas o soluciones químicas o se extrae con resinas de unión a ácidos nucleicos de conformidad con las instrucciones del fabricante. El ARNm extraído se detecta luego mediante hibridación (p. ej., análisis de Northern blot) y/o amplificación (p. ej., RT-PCR). Preferiblemente, se prefiere la RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa. La RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa en tiempo real resulta particularmente ventajosa.

Otros métodos de amplificación incluyen reacción en cadena de ligasa (LCR), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) y amplificación sobre la base de secuencia de ácido nucleico (NASBA).

Los ácidos nucleicos que presentan al menos 10 nucleótidosy exhiben complementariedad u homología de secuencia con respecto al ARNm de interés en el presente documento resultan ser útiles como sondas de hibridación o cebadores de amplificación. Se debería comprender que tales ácidos nucleicos no necesitan ser idénticos, pero, normalmente, son idénticos en al menos un 80 % con respecto a la región homóloga de tamaño comparable, más preferiblemente, idénticos en un 85 %, incluso más preferiblemente, idénticos en un 90 %, incluso más preferiblemente, idénticos en un 95 % o más con respecto a la región homóloga de tamaño comparable. En determinadas realizaciones, resultará ventajoso el uso de ácidos nucleicos en combinación con medios apropiados, tales como una etiqueta detectable, para detectar hibridación. Se conoce una amplia variedad de indicadores en la técnica incluidos ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimáticos u otros (p. ej., avidina/biotina).

Las sondas comprenden normalmente ácidos nucleicos monocatenarios de entre 10 y 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo, entre 10 y 800, más preferiblemente, entre 15 y 700, normalmente, entre 20 y 500. Los cebadores son normalmente ácidos nucleicos monocatenarios más cortos, de entre 10 y 25 nucleótidos de longitud, que se diseñan para emparejarse de manera perfecta o casi perfecta con un ácido nucleico de interés para amplificar. Las sondas y los cebadores son “específicos” de los ácidos nucleicos que hibridan, a saber, hibridan preferiblemente en condiciones de hibridación de alta rigurosidad (que se corresponden con la temperatura de fusión más alta Tm, p. ej., formamida al 50%, tampón SCC 5x o 6x. El tampón SCC 1x comprende NaCl 0,15 M y Na-citrato 0,015 M, que se ajusta a pH 7,0 con HCl).

Los cebadores o sondas de ácido nucleico que se utilizan en el método de amplificación y detección anterior se pueden ensamblar como un equipo. Dicho equipo incluye cebadores consenso y sondas moleculares. Un equipo incluye, además, los componentes necesarios para determinar si se ha producido una amplificación. Además, el equipo puede incluir, por ejemplo, tampones de PCR y enzimas; secuencias de control positivo, cebadores de control de reacción e instrucciones para amplificar y detectar las secuencias específicas.

En una realización particular, el método de la invención comprende las etapas de provisión de ARN totales extraídos a partir de una muestra biológica y sometimiento de los ARN a amplificación e hibridación con sondas específicas, más particularmente, mediante RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa.

En otra realización, el nivel de expresión génica se determina mediante análisis de chip de ADN. Tal chip de ADN o microarray de ácido nucleico consiste en diferentes sondas de ácido nucleico que se unen de manera química con un sustrato, que puede ser un microchip, un portaobjetos de vidrio o una perla del tamaño de una microesfera. Un microchip puede estar constituido por polímeros, plásticos, resinas, polisacáridos, sílice o materiales a base de sílice, carbono, metales, vidrios inorgánicos o nitrocelulosa. Las sondas comprenden ácidos nucleicos tales como ADNc u oligonucleótidos que pueden presentar aproximadamente 10 a aproximadamente 60 pares de bases. Para determinar el nivel de expresión génica, se etiqueta una muestra biológica de un sujeto de prueba, que se somete primero, de manera opcional, a una transcripción inversa y se pone en contacto con el microarray en condiciones de hibridación, lo que conduce a la formación de complejos entre los ácidos nucleicos diana que son complementarios a las secuencias de sonda unidas a la superficie del microarray. Luego, se detectan los complejos hibridados y etiquetados y se pueden cuantificar o semicuantificar. El etiquetado se puede lograr mediante varios métodos, p. ej., mediante el uso de etiquetas radiactivas o fluorescentes. Muchas variantes de la tecnología de hibridación de microarrays se encuentran disponibles para el experto en la técnica (véase, p. ej., la revisión de Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7: 200-210).

La presente divulgación se refiere, además, a un método para tratar a un sujeto receptor de un riñón con una terapia inmunosupresora que comprende las etapas de:

i) determinar si el sujeto es un sujeto operacionalmente tolerante (TOL) o un sujeto no operacionalmente tolerante (STA) de acuerdo con la invención; y

ii) tratar al sujeto con uno o más fármacos inmunosupresores cuando el sujeto es STA.

La presente divulgación se refiere, además, a un método para identificar a un sujeto receptor de un riñón que se encuentra sometido a terapia inmunosupresora como candidato para la retirada o la minimización de la terapia inmunosupresora, que comprende las etapas de:

i) determinar si el sujeto es un sujeto operacionalmente tolerante (TOL) o un sujeto no operacionalmente tolerante (STA) de acuerdo con la invención; y

ii) concluir que el sujeto es elegible para la retirada o la minimización de la terapia inmunosupresora cuando el sujeto es TOL.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere, además, a un equipo para discriminar un sujeto receptor de un riñón operacionalmente tolerante (TOL) de un sujeto receptor de un riñón no operacionalmente tolerante (STA), que comprende al menos un reactivo para la determinación de un perfil de expresión génica correspondiente a un grupo de, al menos, 2, 3, 4, 5, 6 o más valores correspondientes al nivel de expresión génica de cada uno de, al menos, 2, 3, 4, 5, 6 o más genes que se seleccionan a partir del grupo que consiste en ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A, MZB1, CD22, BLK, MS4A1, CD79B, BLNK, FCRL2, IRF4, HINT1, RFC4, ANXA2R, FCER2, AKIRIN2, EPS15 y PLBD1, de manera opcional, con otros valores adicionales correspondientes a los parámetros clínicos. Preferiblemente, el equipo de acuerdo con la presente invención comprende al menos un reactivo para la determinación de un perfil de expresión génica correspondiente a un grupo de 6 valores correspondientes al nivel de expresión de cada uno de los 6 genes siguientes: ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A y MZB1.

En una realización, el equipo puede comprender, además, al menos un reactivo para la determinación de un nivel de expresión génica de, al menos, un gen de referencia. Los ejemplos de genes de referencia incluyen, pero sin limitación, ACTB, B2M, GAPDH y HPRT1. En una realización, la determinación de un nivel de expresión génica de, al menos, un gen de referencia se utiliza para normalizar y/o calcular la expresión relativa de cada uno de los genes de acuerdo con la presente invención.

En algunas realizaciones, el equipo puede comprender, además, instrucciones para discriminar un sujeto receptor de un riñón TOL de STA. Las instrucciones para la discriminación de un sujeto TOL de STA pueden incluir al menos un perfil de expresión génica de referencia. En una realización particular, al menos un perfil de expresión génica de referencia es un perfil de expresión tolerante al injerto, a saber, un grupo de 6 valores correspondientes al nivel de expresión de cada uno de los 6 genes siguientes: ID3, AKR1C3, c D40, CTLA4, TCL1A y MZB1, en un sujeto operacionalmente tolerante (TOL). De manera alternativa, al menos un perfil de expresión génica de referencia puede ser un perfil de expresión no tolerante al injerto, a saber, un grupo de 6 valores correspondientes al nivel de expresión de cada uno de los 6 genes siguientes: ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A y MZB1, en un sujeto no operacionalmente tolerante.

La invención se ilustrará de manera adicional mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse en modo alguno como limitantes del alcance de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Puntuación de tolerancia compuesta (cSoT)

(A) Modelo de cSoT: el eje izquierdo muestra coeficientes de genes seleccionados y parámetros clínicos (tasa de descubrimiento falso [fdr] <0,05) (barras oscuras) y el eje derecho representa el número de veces, a saber, la ocurrencia, de genes seleccionados y parámetros clínicos entre las validaciones cruzadas de 10 iteraciones con 100 repeticiones (barras grises). (B) Curvas de característica operativa del receptor (ROC) de cSoT [cSoT], combinación de los 6 genes (ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A y Mz B1) [6 genes], edad del paciente en el momento de la prueba [edad en el momento de la recolección], edad del paciente en el momento del trasplante [edad en Tx] y creatinemia [creatinemia]. (C) Valores de cSoT para 231 pacientes (42 TOL [gris] y 189 s Ta [oscuro]). La línea discontinua representa el mejor umbral en el centro de la curva ROC (índice de Youden). La zona gris (a ambos lados de la línea discontinua) representa la zona no concluyente que se define por valores con especificidad y especificidad por debajo del 90 %.

Figura 2: cSoT validada mediante qPCR

(A) Mediante el uso de qPCR, la cSoT continuaba siendo diferencial entre TOL y STA (n = 9 y 12; media = 2,89 ± 5,41 y -2,58 ± 2,37, respectivamente) y (B) mostraba un AUC de 0,86 ICg5% de [0,66-1]).

Ejemplos

Materiales y métodos

Conjunto de datos de metanálisis

El conjunto de datos de expresión génica se obtuvo de la base de datos Gene Expression Ominbus (GEO) (número de acceso GSE28456) que se describe anteriormente [18]. Este conjunto de datos fue el resultado de un metanálisis de 5 estudios independientes que recopilaron 596 muestras [14, 15, 21, 50, 51].

Brevemente, los conjuntos de datos se renormalizaron mediante el uso de un procedimiento Lowess, transformado logarítmicamente y centrado en la mediana de acuerdo con el grupo STA según se describe anteriormente y que se compone de 1846 genes fusionados [18]. Además de la colección de Nantes y gracias al loT europea y las redes ITN estadounidenses, se pudieron identificar 344 pacientes no redundantes únicos entre los diferentes estudios: 46 pacientes individuales operacionalmente tolerantes (TOL) de 96 muestras de TOL y 266 pacientes con función de injerto estable (STA) de 311 muestras de STA. La Tabla 1 y la Tabla 2 proporcionan la descripción demográfica de los parámetros clínicos disponibles de los pacientes TOL y s Ta . Se calculó la expresión media para cada uno de los 20 genes en caso de réplicas técnicas (idéntico momento de muestra de sangre) y se seleccionó el punto temporal más temprano en caso de réplicas temporales.

= =

= =

Conjuntos de datos de microarrays adicionales

Se recolectaron tres conjuntos de datos de microarrays disponibles públicamente en GEO: GSE14630 [34], GSE22224 [35] y GSE45593 [8] y se normalizaron con el método de promedio robusto de múltiples arrays (RMA) mediante el uso del paquete affy [52] en el software R. Los valores de expresión normalizados que se recolectaron del conjunto de datos GSE45218 [33] se utilizaron para la validación cruzada in silico. Para todos los conjuntos de datos, las expresiones génicas de los 6 genes de interés se centraron/escalaron antes de aplicar los coeficientes de la cSoT.

Cohorte de validación

Se registraron 21 receptores de riñón adicionales del Hospital de Nantes para realizar la validación de qPCR, incluidos 9 TOL y 12 STA. El comité de ética local aprobó todos los aspectos de este estudio y todos los pacientes brindaron su consentimiento por escrito.

Validación de qPCR

Se recolectaron muestras de sangre venosa en vacutainers con EDTA y se procesaron para su análisis en 4 horas. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se separaron en una capa de Ficol (Eurobio, Les Ulis, Francia) y se congelaron en reactivo de TRIzol® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, m A EE. UU.) a -80 °C. El ARN se extrajo de sangre periférica mediante el uso del método basado en TRIzol (Thermo Fisher Scientific). La calidad y cantidad de ARN se determinaron con un BioAnalyzer Agilent 2100 (Palo Alto, CA, EE. UU.) y un Nanodrop (Labtech, Palaiseau, Francia), respectivamente. El ARN se transcribió de manera inversa mediante el uso de oligonucleótidos poli(dT) y transcripción inversa del virus de Maloney leukaemia (Thermo Fisher Scientific). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó en un instrumento StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific) utilizando un cebador disponible comercialmente y conjuntos de sondas (Taqman) para los 6 genes sometidos a prueba y los 4 genes de referencia, AKR1C3: Hs00366267_m1, CD40. Hs00374176_m1, CTLA4: Hs00175480_m1, ID3: Hs00171409_m1, MZB1 (o MGC29506): Hs00414907_m1, TCLIA: Hs00951350_m1; y 4 genes de referencia, ACTB: Hs99999903_m1, B2M: Hs00984230_m1, GAPDH: Hs99999905_m1, HPRT1: Hs99999909_m1 (Thermo Fisher Scientific). La media geométrica de los 4 genes de referencia se utilizó para normalizar las cantidades de ARN y para calcular la expresión relativa de cada uno de los genes de acuerdo con el método 2-ññCq [53].

Construcción de la cSoT

Los parámetros asociados con TOL en comparación con STA en el análisis univariado logístico (mediante el uso del paquete glm en R) se utilizaron para la construcción de la cSoT. Para identificar la combinación con mayores posibilidades de discriminación entre los 24 parámetros asociados con tolerancia en el análisis univariado (20 genes y 4 parámetros demográficos), se utilizó el método Bolasso [5] que realiza un remuestreo bootstrap (10.000 veces) combinado con un análisis de regresión lasso (operador de selección y contracción mínima absoluta) continuando con múltiples pruebas para seleccionar las variables significativas asociadas con el modelo (tasa de descubrimiento falso (FDR) <0,05) mediante el uso del paquete mht (versión 3.2.2) en R [2]. Se utilizaron los coeficientes obtenidos de mht para calcular la puntuación de otros conjuntos de datos después de escalar, como lo realiza el paquete mht. Para datos de qPCR, se utilizó dCq escalada.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software R versión 3.2.2 o el software GraphPrism v.4. La prueba t de Student paramétrica, la prueba ANOVA o la prueba Khi2 se utilizaron para las comparaciones de grupos. Las diferencias se definieron como estadísticamente significativas cuando p <0,05.

Resultados

Selección de parámetros clínicos asociados con el estado de tolerancia operacional

Del metaconjunto de datos que se describió anteriormente [18], además de la colección de Nantes y gracias al European Indice of Tolerance (loT) y las American Immune Tolerance Networks (ITN), se pudieron identificar a 312 pacientes no redundantes entre los diferentes estudios: 46 pacientes individuales operacionalmente tolerantes (TOL) de 96 muestras de TOL y 266 pacientes con función de injerto estable (STA) de 311 muestras de STA. La Tabla 1 y la Tabla 2 proporcionan la descripción demográfica de los parámetros clínicos disponibles de los pacientes TOL y STA. Para construir una puntuación predictiva, a partir de los parámetros clínicos demográficos de los pacientes, se seleccionaron solo los parámetros intrínsecos, aquellos no variables relacionados con el paciente y que se conocen para, al menos, la mitad de los TOL (Tabla 1 y Tabla 2). Se asociaron 4 parámetros con el estado de tolerancia mediante el uso de regresión logística univariante (p <0,20) y se seleccionaron para la puntuación compuesta: edad del paciente en el momento del trasplante (p <0,0001), edad del paciente en el momento de la prueba (p = 0,176) (Tabla 1), número de incompatibilidades HLA (p <0,0001) y género del donante (p = 0,154) (Tabla 2).

Puntuación compuesta de tolerancia operacional (cSoT) que combina genes y parámetros clínicos

Se calculó la expresión media para cada uno de los 20 genes en caso de réplicas técnicas (idénticos momentos de muestra de sangre) y se seleccionó el punto temporal más temprano en caso de réplicas temporales. En el análisis univariante, se confirmaron las expresiones de los 20 genes que, según se informó anteriormente, eran diferenciales entre TOL y STA [1] en esta gran cohorte de 312 pacientes (46 TOL y 266 STA; p <0,0001).

Para identificar la combinación con mayor posibilidad de discriminación entre los 20 genes originales y los 4 parámetros clínicos que se seleccionaron anteriormente para incluirlos en la cSoT, se utilizó el método Bolasso [5] que realiza un remuestreo bootstrap (10.000 veces) en combinación con un análisis de regresión lasso (operador de selección y contracción mínima absoluta) continuando con múltiples pruebas para seleccionar las variables significativas asociadas con el modelo (tasa de descubrimiento falso [FDR] <0,05) [2].

Se identificó una combinación de 6 genes y 2 parámetros clínicos: AKR1C3, CD40, CTLA4, ID3, MZB1, TCL1A, edad del paciente en el momento de la prueba y edad del paciente en el momento del trasplante (Figuras 1A y 1B), lo que permitió establecer una cSoT para discriminar entre TOL y STA (cSoT media = 6,43 ± 4,73 (DS) para 42 TOL y -4,04 ± 2,81 para 189 STA; p <0,0001) con un AUC de 0,973 (ICg5% [0,939-1,00]), con valores predictivos negativos y positivos de 0,989 y 0,800 respectivamente (Figuras 1B y 1C).

La puntuación cSoT calculada se ha centrado mediante el uso del mejor umbral de la curva ROC (índice de Youden) para asociar puntuaciones positivas y negativas con el diagnóstico de TOL y STA respectivamente, y se ha definido una zona no concluyente (denominada también "zona gris") mediante valores con especificidad y especificidad por debajo del 90 % (tolerancia predictiva del 10 %) para facilitar la interpretación (Figura 1) [32]. La consistencia de la selección de estos 8 parámetros se validó mediante una validación cruzada de 10 iteraciones (de manera aleatoria, una décima parte de TOL y STA) con 100 repeticiones. Se encontró que los 8 parámetros seleccionados se presentaron en al menos el 80 % de los 1000 modelos (Figura 1A).

Finalmente, la robustez de la puntuación cSoT se validó de manera adicional mediante una validación cruzada de 10 iteraciones con 100 repeticiones con un AUC media para conjuntos de prueba de 0,967 IC95% [0,966-0,968]. Según se intentó, la puntuación cSoT discriminó TOL de STA de mejor manera que los 2 parámetros demográficos por separado (Figura 1C): la edad en el momento del trasplante (AUC = 0,737 ICg5% [0,655-0,819]) y la edad en el momento de la prueba (AUC = 0,564, ICg5% [0,474-0,655]; p <0,0001 para ambas comparaciones), de mejor manera que la combinación de los 6 genes solamente (AUC = 0,947 ICg5% [0,902-0,992]; p = 0,38) y de mejor manera que la función de los pacientes (creatinemia sola (AUC = 0,615, ^ 5% [0,519-0,711]; p <0,0001).

Finalmente, para la validación cruzada, se aprovechó un conjunto de datos de microarrays recientes realizado en 16 TOL y 9 pacientes con nefropatía crónica del aloinjerto (CAN) [33]. Dado que no se proporcionó información clínica individual, se calculó solo la combinación de los 6 genes de expresión. A pesar de que la combinación de genes no se diseñó para discriminarTOL de CAN pero sí para discriminarTOL de STA, se pudieron observar valores de puntuación significativamente diferentes (p = 0,0061) y una buena discriminación entre las 2 poblaciones (AUC = 0,825 IC95% [0,636-0,1,014]).

El origen del centro, el régimen inmunosupresor, el PTLD no influyen en la cSoT

A pesar de que las muestras de TOL procedían de 3 orígenes diferentes (Nantes, loT e ITN), la cSoT no se asoció con el origen del paciente (p = 0,13). Una de las principales razones del cese del IS en pacientes con función del injerto estable consiste en la aparición de efectos secundarios graves tales como PTLD. Sin embargo, la cSoT no se vio influenciada por la ocurrencia de PTLD (PTLD, n = 4, p = 0,19).

Debido a que los dos grupos de pacientes que se utilizaron para crear la cSoT diferían en cuanto a su estado del régimen inmunosupresor, los STA se encontraban sometidos a IS mientras que los TOL no recibían más IS, se evaluó si el IS podía afectar los valores de cSoT. En cuanto a los pacientes TOL, se observó que el régimen del IS previo antes de retirar el IS, incluida la ciclosporina A (CsA), la azatioprina, el ácido micofenólico (MPA) y el uso de una terapia de inducción no influyeron en los valores de cSoT (p = 0,74, p = 0,61, p = 0,81 y p = 0,51, respectivamente; 29 TOL). Luego se analizó el efecto del régimen actual del IS en la cSoT en la población STA (n = 189). De manera similar, la cSoT no se vio influenciada por la terapia de inducción (p = 0,97) ni por la CsA o el Tacrolimus (p = 0,64), los corticosteroides (p = 0,42) y los agentes antimetabolitos (p = 0,92). Luego, se analizó de manera adicional el efecto del régimen del IS en los 6 genes de la cSoT por separado o en combinación en dos cohortes independientes de receptores de trasplante renal con función de injerto estable con conjuntos de datos de microarrays disponibles [34, 35]:

1) una primera cohorte de pacientes en monoterapia con CsA (n = 14) o rapamicina (Rapa, n = 23) [7]; y

2) una segunda cohorte de pacientes después de la conversión de azatioprina a MPA (n = 5 emparejados antes y 3 meses después de la conversión a MPA) [6 ].

En ambas cohortes, ni la combinación de los 6 genes ni los 6 genes de manera independiente (los datos no se muestran) se modificaron de acuerdo con el régimen del IS (p = 0,99 y 0,77, respectivamente).

En conjunto, estos datos mostraron que ni la cSoT ni los genes de manera independiente se ven influenciados por el tratamiento IS anterior o de mantenimiento.

La cSoT es predictiva de la disfunción del injerto y la aparición de anticuerpos de novo

Una de las cuestiones principales consiste en la estabilidad y el resultado de la cSoT en el tiempo. Anteriormente, se informó que se podían observar algunos casos de pérdida de la función del injerto en esta cohorte de TOL [36], con aumento de creatinemia (>150 pmol/L) o proteinuria (>1 g/24 h). De entre los 15 TOL que conforman la cohorte de Nantes, de la cual se disponía la mayor parte de la información clínica, 9 disminuyen su función en el tiempo (17,09 ± 3,46 años después del trasplante). Además, de entre estos 15 TOL, 8 desarrollan anti-HLA de novo (14,67 ±1,13 años después del trasplante) y, entre ellos, 4 pacientes desarrollan anticuerpos específicos del donante (DSA; 13,41 ± 0,21 años después del trasplante). Además, la presencia de anticuerpos anti-HLA de novo se relacionó con la pérdida de tolerancia (p = 0,034).

Se encontró que, en el momento de la prueba, cuando los pacientes mostraban una buena función del injerto (creatinemia <150 pmol/L y proteinuria <1 g/24 h), la cSoT resultó significativamente menor en pacientes que habían disminuido su función (tiempo de prueba, 2,29 ± 2,7 años antes de la disminución de la función) (p = 0,047, cSoT = 3,79 ± 3,66 y 8,52 ± 4,67) y que habían desarrollado anticuerpos anti-HLA y DSA (p = 0,016 y p = 0,013, respectivamente) (tiempo de prueba, 1,13 ± 1,78 y 0,21 ±1,10 años antes de la detección de anticuerpos).

La cSoT es específica del estado de tolerancia operacional

Para evaluar la especificidad de la cSoT de acuerdo con los perfiles de tolerancia operacionales o inducidos por el protocolo, la cSoT se sometió a prueba en un ensayo de inducción de tolerancia, en el que se realizó seguimiento de receptores renales de HLA idénticos de hermanos de donantes vivos durante 4 años después del trasplante [9] [8]. El protocolo consiste en un tratamiento que produce linfocitopenia con alemtuzumab con tacrolimus y MpA con conversión temprana de sirolimus e infusiones de células madre hematopoyéticas CD34+ del donante. Se retiró la inmunosupresión 2 años después del trasplante. Estos pacientes presentaron una biopsia normal (a saber, sin signos de rechazo subclínico) y una buena función renal al menos 1 año después del cese completo del IS.

De entre los 15 pacientes, se hizo seguimiento del transcriptoma sanguíneo hasta 4 años en 9 de ellos, 5 que se volvieron tolerantes y 4 que no lo hicieron. Tanto la cSoT como los 6 genes solo fallaron en clasificar a los 5 pacientes tolerantes como TOL, antes y después de la privación del IS, cualquiera que fuese el momento después del trasplante. De este modo, este resultado apoya el hecho de que la tolerancia de este protocolo de inducción no compartió la firma relacionada con la tolerancia operacional y espontánea, probablemente debido a diferentes mecanismos involucrados en las dos situaciones, y que esta firma es específica del estado de tolerancia operacional solamente.

Una cSoT de qPCR aplicable en la clínica

Dado que la puntuación cSoT se basa en medidas de microarrays de genes, se procedió a su validación y a la confirmación de su utilidad mediante el uso de PCR cuantitativa para avalar su uso posible en la rutina. La qPCR se realizó en 5 muestras de TOL independientes, no incluidas en el metaconjunto de datos, y en 4 TOL del metaconjunto de datos en diferentes momentos.

Se demostró que la puntuación cSoT discriminaba entre TOL y STA (p = 0,0054, n = 9 y 12, media = 2,89 ± 5,41 y -2,58 ± 2,37, respectivamente) con un AUC de 0,861 IC95% [0,66-1]) (Figura 2). Además, el procedimiento de bootstrasp (1000 veces) confirmó la robustez de esta validación con un AUC media de 0,852 (ICg5% [0,845-0,859]).

Referencias

A lo largo de esta solicitud, varias referencias describen el estado de la técnica al que pertenece esta invención.

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método para discriminar un sujeto receptor de un riñón operacionalmente tolerante (TOL) de un sujeto receptor de un riñón no operacionalmente tolerante (s Ta ), que comprende las siguientes etapas:

i) establecer una puntuación de tolerancia compuesta (cSoT) con los niveles de expresión de seis genes en una muestra biológica que se obtiene de dicho sujeto y dos parámetros clínicos;

donde dichos seis genes son ID3, AKR1C3, CD40, CTLA4, TCL1A y MZB1; y

donde dicha cSoT se establece mediante la siguiente fórmula:

x

^— coeficiente de

escala

ii) comparar esta cSoT con un valor de referencia predeterminado; y

iii) concluir que el sujeto receptor de un riñón es TOL cuando la cSoT es mayor que el valor de referencia predeterminado o concluir que el sujeto receptor de un riñón es STA cuando la cSoT es menor que el valor de referencia predeterminado.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde los dos parámetros clínicos son la edad de dicho sujeto receptor de un riñón en el momento de la prueba y la edad de dicho sujeto receptor de un riñón en el momento del trasplante.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el valor de referencia predeterminado es la cSoT de un sujeto receptor de un riñón TOL.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el valor de referencia predeterminado es la cSoT de un sujeto receptor de un riñón STA.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el sujeto receptor de un riñón se encuentra sometido a tratamiento inmunosupresor.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho sujeto receptor de un riñón es un ser humano.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho sujeto receptor de un riñón se ha injertado, de manera adicional con el páncreas y, de manera opcional, una pieza de duodeno, del donante del riñón.

8. Una terapia inmunosupresora para su uso en el tratamiento de un sujeto receptor de un riñón, donde se ha determinado que dicho sujeto receptor de un riñón es un sujeto receptor de un riñón no operacionalmente tolerante (STA) mediante el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un método para identificar a un sujeto receptor de un riñón que se encuentra sometido a terapia inmunosupresora como un candidato para la retirada o la minimización de la terapia inmunosupresora que comprende lAs etapas de:

i) determinar si el sujeto es un sujeto receptor de un riñón operacionalmente tolerante (TOL) o un sujeto receptor de un riñón no operacionalmente tolerante (STA) mediante el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

ii) concluir que el sujeto receptor de un riñón es elegible para la retirada o la minimización de la terapia inmunosupresora cuando el sujeto es TOL.