ES2850281T3 - Método para diagnosticar el rechazo agudo subclínico y clínico mediante el análisis de conjuntos de genes predictivos, un agente terapéutico para usar en el tratamiento y kits para determinar la expresión - Google Patents

Método para diagnosticar el rechazo agudo subclínico y clínico mediante el análisis de conjuntos de genes predictivos, un agente terapéutico para usar en el tratamiento y kits para determinar la expresión Download PDF

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Abstract

Un método para identificar un receptor de aloinjerto renal en riesgo de rechazo de aloinjerto que comprende las etapas de (a) determinar los niveles de expresión de un conjunto de genes preseleccionado que comprende los 7 genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 y SENP7; en una muestra de sangre obtenida del receptor de aloinjerto renal; (b) comparar los niveles de expresión de los genes preseleccionados con los niveles de expresión de los genes preseleccionados en un control, y (c) determinar que el receptor está en riesgo de rechazo del aloinjerto si el nivel de expresión de uno o más genes en el conjunto de genes de la muestra está alterado respecto del nivel de expresión del mismo uno o más genes del conjunto de genes del control.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para diagnosticar el rechazo agudo subclínico y clínico mediante el análisis de conjuntos de genes predictivos, un agente terapéutico para usar en el tratamiento y kits para determinar la expresión
CLÁUSULA DE FINANCIACIÓN DEL GOBIERNO
Esta invención fue realizada con el apoyo del gobierno con la beca n.° 1U01AI070107-01 concedida por los National Institutes of Health. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.
Campo técnico
La presente invención se refiere a métodos para diagnosticar el rechazo celular agudo (Acute Cellular Rejection, ACR) de un aloinjerto mediante el análisis de conjuntos de genes predictivos y kits para practicar estos métodos, tal como se define en las reivindicaciones. Los métodos comprenden analizar la sangre de los receptores de aloinjertos de riñón determinando el nivel de expresión de un conjunto de firmas génicas que contiene al menos 7 genes preseleccionados para identificar y tratar dichos pacientes. Un nivel de expresión alterado de uno o más genes en la sangre del receptor del aloinjerto en comparación con los mismos genes en un control indica que el paciente está en riesgo de rechazo del aloinjerto. Cuanto mayor es el nivel de alteración, mayor es el riesgo de rechazo. Se puede aplicar un modelo logístico de ajuste de la regresión a valores de la expresión normalizados (por ejemplo, lectura de recuento de genes mediante tecnología de secuenciación avanzada) para obtener un modelo estadístico a partir del cual se puede calcular una puntuación de probabilidad del riesgo de rechazo celular agudo para cada paciente.
Antecedentes de la invención
Los ensayos existentes para determinar el rechazo del aloinjerto renal son incómodos y caros. Dichos ensayos requieren normalmente obtener un espécimen de biopsia del paciente. A menudo, el momento en que se reconoce el rechazo es demasiado tarde para hacer nada. Un aumento en la creatinina sérica o un aumento de la proteína de la orina pueden ser advertencias de rechazo, pero no son completamente predictivas. Siempre ha existido en el campo la necesidad de un ensayo mejorado que sea fácil de realizar, que elimine la necesidad de hacer una biopsia y que sea más predictivo del riesgo de rechazo o fibrosis del aloinjerto renal.
El documento WO 2009/143624 divulga perfiles de expresión nucleicos para el rechazo agudo al aloinjerto.
El presente ensayo del perfil de expresión aborda esta necesidad y proporciona un ensayo sobre sangre que se administra fácilmente de forma repetitiva a los pacientes de trasplante. Los pacientes de trasplante renal son examinados por su médico muy frecuentemente después del trasplante -en la mayoría de los casos dos veces a la semana durante el primer mes pasando a semanalmente y a continuación cada dos semanas hasta llegar a ser mensualmente después de 4 a 5 meses, donde los intervalos de tiempo entre visitas aumentan de forma gradual posteriormente. Durante este tiempo, se vigilan la función renal del paciente y los niveles de inmunosupresión. Los esteroides se reducen a 5 mg a los 3 meses tras la cirugía y se reducen gradualmente los niveles de tacrolimus (un fármaco que suprime el sistema inmunitario y que se usa para evitar el rechazo de los órganos trasplantados) a un nivel estacionario en 6-12 meses si en el curso posterior al trasplante no hay complicaciones y el paciente no tiene un alto riesgo inmunitario. Los perfiles de expresión génicos descritos a continuación se pueden emplear como un ensayo patrón a realizar en el momento de una visita clínica. Un resultado de ensayo positivo (es decir, el paciente está expresando estos genes en un nivel alterado en comparación con un control) indica que el paciente está en riesgo de rechazar el órgano trasplantado, y se trataría aumentando la dosis de los fármacos inmunosupresores e interrumpiendo la reducción gradual habitual de los fármacos inmunosupresores. Un ensayo repetido (que se puede llevar a cabo económicamente ya que el ensayo es preferiblemente un ensayo sobre sangre) guiará el reinició de la disminución gradual de la inmunosupresión. Por tanto, por ejemplo, si 2 ensayos posteriores fueran negativos, se puede disminuir la dosis de prednisona en 2,5 o 5 mg, o se disminuiría el nivel diana de tacrolimus en 0,5 mg/dl. Si el perfil del ensayo es positivo en presencia de un aumento de creatinina, esto indicaría un rechazo agudo clínico como se evidencia por la lesión renal. En este caso, se trataría al paciente tanto con una dosis alta de esteroides como con agentes antilinfocíticos dependiendo del riesgo inmunitario global del individuo.
Sumario de la invención
Los aspectos y realizaciones de la siguiente descripción se refieren a aspectos y realizaciones de la divulgación que no son necesariamente aspectos o realizaciones de la invención reivindicada.
En un aspecto, se proporciona un método para identificar un receptor de aloinjerto de riñón en riesgo de rechazo o pérdida del aloinjerto obteniendo un espécimen biológico procedente del receptor del aloinjerto de riñón, medir el nivel de expresión de un conjunto de firmas génicas preseleccionado en el espécimen, comparar el nivel de expresión del conjunto de firmas génicas preseleccionado en el espécimen con el nivel de expresión del conjunto de firmas génicas preseleccionado en un control, determinar si el receptor del aloinjerto está en mayor riesgo de rechazo del aloinjerto si el nivel de expresión del conjunto de firmas génicas en el espécimen está alterado en comparación con el nivel de expresión en el control.
En otro aspecto, se proporciona un método para identificar un receptor de aloinjerto de riñón en riesgo de rechazo o pérdida del aloinjerto obteniendo un espécimen biológico procedente del receptor del aloinjerto de riñón, medir el nivel de expresión de un conjunto de firmas génicas preseleccionado en el espécimen, comparar el nivel de expresión del conjunto de firmas génicas preseleccionado en el espécimen con el nivel de expresión del conjunto de firmas génicas preseleccionado en un control, determinar si el receptor del aloinjerto está en mayor riesgo de rechazo del aloinjerto si el nivel de expresión de uno o más genes del conjunto de genes del conjunto de firmas génicas establecido en el espécimen está alterado en comparación con el nivel de expresión en el control para uno o más genes del conjunto de genes en el control.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar a un receptor de aloinjerto de riñón en riesgo de rechazo o pérdida del aloinjerto obteniendo un espécimen biológico procedente del receptor del aloinjerto de riñón, medir el nivel de expresión de un conjunto de firmas génicas preseleccionado en el espécimen, comparar el nivel de expresión del conjunto de firmas génicas preseleccionado en el espécimen con el nivel de expresión del conjunto de firmas génicas preseleccionado en una muestra del control, determinar si el receptor del aloinjerto está en mayor riesgo de rechazo del aloinjerto si el nivel de expresión del conjunto de firmas génicas en el espécimen está alterado en comparación con el nivel de expresión del conjunto de firmas génicas preseleccionado en el control y tratar a un receptor para el que se determina que está en riesgo de rechazo.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar a un receptor de aloinjerto de riñón en riesgo de rechazo o pérdida del aloinjerto obteniendo un espécimen biológico procedente del receptor del aloinjerto de riñón, medir el nivel de expresión de un conjunto de firmas génicas preseleccionado en el espécimen, comparar el nivel de expresión del conjunto de firmas génicas preseleccionado en el espécimen con el nivel de expresión de una muestra del control, determinar si el receptor del aloinjerto está en mayor riesgo de rechazo del aloinjerto si el nivel de expresión de uno o más genes del conjunto de firmas génicas en el espécimen está alterado en comparación con el nivel de expresión de uno o más genes en el conjunto de firmas génicas en el control y tratar a un receptor para el que se determina que está en riesgo de rechazo.
En otra realización, se proporciona un método para tratar un receptor de aloinjerto de riñón obteniendo un espécimen biológico procedente del receptor de aloinjerto, medir el nivel de expresión de un conjunto de genes seleccionados en el espécimen, comparar el nivel de expresión del conjunto de genes en el espécimen con el nivel de expresión de un paciente del control, determinar que el receptor presenta riesgo de rechazo del aloinjerto si el nivel de expresión del conjunto de genes en el espécimen está alterado en comparación con el nivel de expresión del conjunto de genes en el control y tratar a un receptor para el que se determina que está en riesgo de rechazo.
En otra realización, se proporciona un método para tratar un receptor de aloinjerto de riñón obteniendo un espécimen biológico procedente del receptor de aloinjerto, medir el nivel de expresión de un conjunto de genes seleccionados en el espécimen, comparar el nivel de expresión del conjunto de genes en el espécimen con el nivel de expresión de un control, determinar que el receptor está en riesgo de rechazo del aloinjerto si el nivel de expresión de uno o más elementos del conjunto de genes en el espécimen está alterado en comparación con el nivel de expresión de uno o más elementos del conjunto de firmas génicas en el control y tratar a un receptor para el que se determina que está en riesgo de rechazo.
Otra realización proporciona un método para tratar a un receptor de aloinjerto de riñón obteniendo un espécimen biológico procedente del receptor del aloinjerto, medir el nivel de expresión de un conjunto de genes seleccionados en el espécimen, comparar el nivel de expresión del conjunto de genes en el espécimen con el nivel de expresión de un control, determinar que el paciente está en riesgo de rechazo del aloinjerto si el nivel de expresión del conjunto de genes en el espécimen está alterado con respecto al nivel de expresión del conjunto de genes en el control y tratar al receptor para el que se determina que está en riesgo de rechazo administrando fármacos inmunosupresores al receptor o administrando altas dosis de esteroides o agentes antilinfocíticos.
Otra realización proporciona un método para tratar a un receptor de aloinjerto de riñón obteniendo un espécimen biológico procedente del receptor del aloinjerto, medir el nivel de expresión de un conjunto de genes seleccionados en el espécimen, comparar el nivel de expresión del conjunto de genes en el espécimen con el nivel de expresión del conjunto de genes en un control, determinar que el paciente está en riesgo de rechazo del aloinjerto si el nivel de expresión de uno o más genes del conjunto de genes en el espécimen está alterado con respecto al nivel de expresión de uno o más elementos del conjunto de genes en el control y tratar al receptor para el que se determina que está en riesgo de rechazo administrando fármacos inmunosupresores al receptor o administrando altas dosis de uno o más de esteroides o agentes antilinfocíticos.
En otro aspecto, se proporciona un kit para usar en la determinación de si el receptor de un aloinjerto está en riesgo de ACR. El kit comprende un ensayo de un conjunto de firmas génicas preseleccionado, los cebadores de un conjunto de firmas génicas preseleccionado, tampones y controles positivos y negativos e instrucciones de uso.
En un aspecto, se proporciona un panel de secuenciación que comprende al menos 7 genes escogidos entre los genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1. En otro aspecto, se proporciona un panel de secuenciación que comprende los genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFt Ud2, SENP6, y SENP7. En otro aspecto, se proporciona un panel de secuenciación que comprende los genes TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 y SENP7.
En otro aspecto, se proporciona un panel de secuenciación que comprende los genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 y C1GALT1C1.
En otro aspecto, se proporciona un panel de secuenciación que comprende los genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1.
Otro aspecto más es un kit de ensayo para identificar receptores de aloinjerto renal que padecen rechazo agudo subclínico y clínico y que están en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende uno o más recipientes diferentes: un ensayo para un conjunto de firmas génicas que comprende al menos los genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 y SENP7, tampones, controles positivos y negativos e instrucciones de uso.
Otro aspecto más es un kit de ensayo para identificar receptores de aloinjerto renal que padecen rechazo agudo subclínico y clínico y que están en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende uno o más recipientes diferentes: un ensayo para un conjunto de firmas génicas que comprende al menos los genes TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 y SENP7, tampones, controles positivos y negativos e instrucciones de uso.
Otro aspecto más es un kit de ensayo para identificar receptores de aloinjerto renal que padecen rechazo agudo subclínico y clínico y que están en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende uno o más recipientes diferentes: un ensayo para un conjunto de firmas génicas que comprende al menos los genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 y C1GALT1C1, tampones, controles positivos y negativos e instrucciones de uso.
Otro aspecto; es un kit de ensayo para identificar receptores de aloinjerto renal que padecen rechazo agudo subclínico y clínico y que están en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende en uno o más recipientes diferentes: un ensayo para un conjunto de firmas génicas que comprende al menos los genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1, tampones, controles positivos y negativos e instrucciones de uso.
Otro aspecto más es un kit de ensayo para identificar receptores de aloinjerto renal que padecen rechazo agudo subclínico y clínico y que están en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende en uno o más recipientes diferentes: un ensayo para un conjunto de firmas génicas que comprende genes seleccionados entre el grupo que consiste en SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1, tampones, controles positivos y negativos e instrucciones de uso.
Un aspecto adicional proporciona un método para identificar receptores de aloinjerto de riñón que padecen rechazo agudo subclínico y clínico y que están en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende las etapas de proporcionar una muestra de sangre de un receptor de aloinjerto renal, aislar el ARNm de la muestra de sangre, sintetizar ADNc a partir del ARNm, y medir los niveles de expresión de un panel de genes que comprende un conjunto de firmas génicas preseleccionado con el sistema de secuencias MiSEQ (Illumina, Inc. San Diego California), Nanostring (nCounter® miRNA Expression Assay-Nanostring Technologies, Inc. Seattle Washington) o qPCR. Los resultados del análisis del conjunto de genes se comparan con un control. El resultado de la expresión génica se puede usar para predecir el inicio de la respuesta de rechazo del aloinjerto, para diagnosticar una respuesta de rechazo del aloinjerto, y/o para caracterizar una respuesta de rechazo del aloinjerto en un paciente con trasplante. Si el paciente está expresando el conjunto de firmas génicas en un nivel alterado con respecto al nivel de expresión en el control, el paciente está en riesgo de rechazo. Cuánto más esté alterado el nivel de expresión del conjunto de firmas génicas en los pacientes en comparación con el control, mayor es el riesgo de rechazo.
En otro aspecto, los resultados del ensayo se aplican a un modelo de ajuste de regresión logística penalizado (log (p(x))/(1-p(x))= p*0+p*lgl+ p*igi+_+ p*ngn (donde (p(x) es la probabilidad de ACR, p*i es el coeficiente penalizado y gi es la lectura del recuento del gen i) que se puede usar para calcular una puntuación de probabilidad del rechazo agudo para cada paciente.
Otro aspecto proporciona un método para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en un paciente determinando el nivel de expresión de un conjunto de genes preseleccionado que contiene al menos los genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 y SENP7, en una muestra del paciente y comparar el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes preseleccionado en la muestra con el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes preseleccionado en un control para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en el paciente.
Otro aspecto proporciona un método para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en un paciente determinando el nivel de expresión de un conjunto de genes preseleccionado que contiene al menos los genes TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 y SENP7 en una muestra del paciente y comparar el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes preseleccionado en la muestra con el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes preseleccionado en un control para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en el paciente.
Otro aspecto proporciona un método para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en un paciente determinando el nivel de expresión de un conjunto de genes preseleccionado que contiene al menos los genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 y C1GALT1C1 en una muestra del paciente y comparar el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes preseleccionado en la muestra con el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes en un control para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en el paciente.
Otro aspecto proporciona un método para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en un paciente determinando el nivel de expresión de un conjunto de genes preseleccionado que contiene al menos los genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1 en una muestra del paciente y comparar el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes preseleccionado en la muestra con el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes preseleccionado en un control para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en el paciente.
Otro aspecto proporciona un método para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto al evaluar el nivel de expresión de un conjunto de genes que comprende al menos los genes ANXA5, TSC22D1, Ap 1 M1, CLK1, EFTUD2, SENP6, y SENP7 de una muestra del paciente que ha recibido el aloinjerto y comparar el nivel de expresión del conjunto de genes en la muestra con el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes en un control para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en el paciente.
Otro aspecto proporciona un método para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto al evaluar el nivel de expresión de un conjunto de genes que comprende al menos los genes TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 y SENP7 de una muestra del paciente que ha recibido el aloinjerto y comparar el nivel de expresión del conjunto de genes en la muestra con el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes en un control para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en el paciente.
Otro aspecto proporciona un método para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto al evaluar el nivel de expresión de un conjunto de genes que comprende al menos los genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, y C1GALT1C1 de una muestra del paciente que ha recibido el aloinjerto y comparar el nivel de expresión del conjunto de genes en la muestra con el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes en un control para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en el paciente.
Otro aspecto proporciona un método para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en un paciente determinando el nivel de expresión de un conjunto de genes preseleccionado que contiene al menos los genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1 en una muestra del paciente y comparar el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes preseleccionado en la muestra con el nivel de expresión de los genes del conjunto de genes en un control para evaluar la probabilidad de rechazo del injerto renal en el paciente.
Otro aspecto proporciona un método para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto al evaluar el nivel de expresión de un conjunto de genes que comprende al menos los genes TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, AP1M1, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 y SENP7 de una muestra del paciente que ha recibido el aloinjerto.
Otro aspecto proporciona un método para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto al evaluar el nivel de expresión de un conjunto de genes de once elementos que comprende al menos los genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 y C1GALT1C1 de una muestra del paciente que ha recibido el aloinjerto. Otro aspecto proporciona un método para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto al evaluar el nivel de expresión de un conjunto de genes de 17 elementos que comprende al menos los genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1 de una muestra del paciente que ha recibido el aloinjerto.
Otro aspecto proporciona un kit para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto que comprende en uno o más recipientes parejas de cebadores para el conjunto de genes preseleccionado, controles positivos y negativos, tampones e instrucciones de uso.
Otro aspecto proporciona un kit para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto que comprende en uno o más recipientes parejas de cebadores para un conjunto de genes de 17 elementos, controles positivos y negativos, tampones e instrucciones de uso.
Otro aspecto proporciona un kit para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto que comprende en uno o más recipientes parejas de cebadores para un conjunto de genes de 11 elementos, controles positivos y negativos, tampones e instrucciones de uso.
Otro aspecto proporciona un kit para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto que comprende en uno o más recipientes parejas de cebadores para un conjunto de genes de 9 elementos, controles positivos y negativos, tampones e instrucciones de uso.
Otro aspecto proporciona un kit para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto que comprende en uno o más recipientes parejas de cebadores para un conjunto de genes de 7 elementos, controles positivos y negativos, tampones e instrucciones de uso.
Otro aspecto proporciona un método para seleccionar un receptor del aloinjerto renal para tratamiento destinado a reducir el riesgo de rechazo del aloinjerto renal que comprende
(a) proporcionar una muestra de sangre del receptor del aloinjerto renal;
(b) determinar los niveles de expresión de un conjunto de genes preseleccionado en la muestra;
(c) comparar los niveles de expresión de los genes del conjunto de genes preseleccionado con los niveles de expresión de los genes del conjunto de genes preseleccionado en un control, y
(d) seleccionar el receptor para el tratamiento del rechazo de aloinjerto si el nivel de expresión de uno o más genes en el conjunto de genes en la muestra está alterado en comparación con el nivel de expresión de uno o más genes del conjunto de genes en el control.
Otro aspecto proporciona un método para seleccionar un paciente con aloinjerto renal para tratamiento destinado a reducir el riesgo de rechazo de aloinjerto renal o la pérdida del aloinjerto que comprende comparar el nivel de expresión de un conjunto de genes preseleccionado obtenido del paciente con el nivel de expresión del conjunto de genes preseleccionado en una muestra del control obtenida de un receptor del aloinjerto que no padece rechazo del injerto, y seleccionar el paciente para el tratamiento del rechazo o la pérdida del aloinjerto si el nivel de expresión de uno o más genes en el conjunto de genes preseleccionado del paciente está alterado en comparación con el nivel de expresión de uno o más de los genes del conjunto de genes preseleccionado en el control.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se muestran en los dibujos acompañantes y en la siguiente descripción. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Como se usa en el presente documento, la expresión "alrededor de" o el término "aproximadamente" significa, en general, dentro de un intervalo de error aceptable para el tipo de valor y método de medición. Por ejemplo, puede significar más/menos el 20 %, más preferentemente más/menos el 10 % y, lo aún más preferentemente, más/menos el 5 % de un valor o intervalo dado. Como alternativa, en especial, en los sistemas biológicos, el término "aproximadamente" significa más/menos aproximadamente un logaritmo (es decir, un orden de magnitud) preferentemente más/menos un factor de dos de un valor dado.
Como se usa en el presente documento "ACR" significa rechazo celular agudo.
De acuerdo con la presente invención, pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, inmunología, biología celular y otras técnicas relacionadas pertenecientes a la materia. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook et al., (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., eds. (2005) "Current Protocols in Molecular Biology".
John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N. J.; Bonifacino et al., eds. (2005) "Current Protocols in Cell Biology". John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N. J.; Coligan et al., eds. (2005) "Current Protocols in Immunology", John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N. J.; Coico et al., eds. (2005) "Current Protocols in Microbiology", John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N. J.; Coligan et al., eds. (2005) "Current Protocols in Protein Science", John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N. J.; Enna et al., eds. (2005) "Current Protocols in Pharmacology", John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N. J.; Hames et al., eds. (1999) "Protein Expression: A Practical Approach". Oxford University Press: Oxford; Freshney (2000) "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique". 4a ed. Wiley-Liss; entre otros. Los protocolos actuales enumerados anteriormente se actualizan varias veces al año
Los términos "disminuir", "disminuido", "reducido", "reducción" o "regulado por defecto" se usan todos generalmente en el presente documento para significar una disminución en una cantidad estadísticamente significativa. Sin embargo, para evitar cualquier duda, "reducido", "reducción", "regulado por defecto", "disminuido" o "disminuir significa una disminución en al menos un 10 % en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, una disminución en al menos aproximadamente 20 %, o al menos aproximadamente 30 %, o al menos aproximadamente 40 %, o al menos aproximadamente 50 %, o al menos aproximadamente 60 %, o al menos aproximadamente 70 %, o al menos aproximadamente 80 %, o al menos aproximadamente 90 % o hasta o incluyendo una disminución del 100 % (es decir, nivel ausente en comparación con una muestra de referencia), o cualquier disminución entre 10-100 % en comparación con un nivel de referencia, o al menos aproximadamente 0,5 veces, o al menos aproximadamente 1,0 vez, o al menos aproximadamente 1,2 veces, o al menos aproximadamente 1,5 veces, o al menos aproximadamente 2 veces, o al menos aproximadamente 3 veces, o al menos aproximadamente 4 veces, o al menos aproximadamente 5 veces o al menos una disminución de aproximadamente 10 veces, o cualquier disminución entre 1,0 veces y 10 veces o más en comparación con un nivel de referencia.
los términos "aumentado", "aumento" o "regulado en exceso" se usan todos generalmente en el presente documento para significar un aumento en una cantidad estadísticamente significativa; Para evitar cualquier duda, "aumentado" o "aumento" significa un aumento en al menos un 10 % en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, un aumento de al menos aproximadamente 20 %, o al menos aproximadamente 30 %, o al menos aproximadamente 40 %, o al menos aproximadamente 50 %, o al menos aproximadamente 60 %, o al menos aproximadamente 70 %, o al menos aproximadamente 80 %, o al menos aproximadamente 90 % o hasta e incluyendo un aumento del 100 % o cualquier aumento entre 10-100 % en comparación con un nivel de referencia, o al menos aproximadamente 0,5 veces, o al menos aproximadamente 1,0 veces, o al menos aproximadamente 1,2 veces, o al menos aproximadamente 1,5 veces, o al menos aproximadamente 2 veces, o al menos aproximadamente 3 veces, o al menos aproximadamente 4 veces, o al menos aproximadamente 5 veces o al menos aproximadamente un aumento de 10 veces, o cualquier aumento entre 1,0 veces y 10 veces o más en comparación con un nivel de referencia.
Como se usa en el presente documento, "determinar el nivel de expresión", "determinar el nivel de expresión" o "detectar el nivel de expresión", como en, por ejemplo, "determinar el nivel de expresión de un gen" se refiere a cuantificar la cantidad de ARNm presente en una muestra. Detectar la expresión de los ARNm específicos, se puede conseguir usando cualquier método conocido en la técnica o descrito en el presente documento. Típicamente, los métodos de detección del ARNm implican la detección específica de la secuencia, tal como mediante la RT-PCR. Se pueden diseñar cebadores y sondas específicos de ARNm usando secuencias de ácidos nucleicos, que se conocen en la materia.
En toda la solicitud y en las reivindicaciones adjuntas, debe entenderse, y se pretende que se entienda, que el uso de los términos "fármaco", "medicación", "agente" y "agente terapéutico" son expresiones indistintas que definen las mismas o similares entidades. Un "fármaco" se refiere generalmente a un compuesto químico, una molécula pequeña, u otra composición biológica, tal como un compuesto de sentido contrario, anticuerpo, inhibidor de la proteasa, hormona, quimioquina o citoquina, que puede inducir un efecto terapéutico o profiláctico deseado cuando se administra adecuadamente a un sujeto.
Como se usa en el presente documento, "tratar" o "tratamiento" de una patología, trastorno o dolencia incluye: (1) prevenir o retrasar la aparición de los síntomas clínicos o subclínicos del estado, trastorno o dolencia que se desarrolla en un mamífero que puede estar afectado o predispuesto a la patología, trastorno o dolencia, pero que aún no experimenta ni muestra síntomas clínicos o subclínicos de la patología, trastorno o dolencia (por ejemplo, fibrosis de un aloinjerto renal y/o pérdida del aloinjerto); y/o (2) inhibir la patología, trastorno o dolencia, es decir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad o una recaída de la misma (en caso de tratamiento de mantenimiento) o al menos un síntoma clínico o subclínico de la misma; y/o; (3) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la patología, trastorno o dolencia, o de al menos uno de sus síntomas clínicos o subclínicos; y/o (4) producir una disminución en la gravedad de uno o más síntomas de la enfermedad. El beneficio para sujeto un que se vaya a tratar es bien estadísticamente significativo o al menos perceptible para el paciente o para el médico.
Como se usa en el presente documento, el término "inhibir" una enfermedad o dolencia (por ejemplo, el ACR y/o la pérdida del aloinjerto) significa por ejemplo, detener el desarrollo de uno o más síntomas de la enfermedad en un sujeto antes de que se produzcan o sean detectables, por ejemplo, por el paciente o el médico del paciente. Preferentemente, la enfermedad o dolencia no se desarrolla totalmente, es decir, no son detectables los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, también puede dar como resultado un retraso o ralentización en el desarrollo de uno o más síntomas de la enfermedad.
Como se usa en el presente documento, un nivel de expresión "alterado" de un ARNm en comparación con un nivel de referencia o un nivel control es al menos de 0,5 veces (por ejemplo, al menos: 1, 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 15; 20; 30; 40; 50; 75; 100; 200; 500; 1.000; 2000; 5.000; o 10.000 veces) el nivel de expresión alterado del ARNm. Se entiende que la alteración puede ser un aumento o una disminución. Como alternativa, un nivel de expresión alterado se define como un aumento en la puntuación de probabilidad de rechazo agudo usando parámetros del modelo de regresión logística establecidos a partir de un grupo de pacientes de entrenamiento, en comparación con la puntuación de probabilidad para el corte obtenido del conjunto de entrenamiento.
"Control" se define como una muestra obtenida de un paciente que ha recibido un trasplante de aloinjerto que no padece rechazo celular agudo.
Se ha determinado ahora que la transcripción potenciada de un conjunto preseleccionado de genes puede usarse para predecir la probabilidad de que un receptor de aloinjerto renal rechace un riñón trasplantado antes de que el paciente manifieste cualquier síntoma de manera abierta. Se puede emplear también el ensayo para diagnosticar si un paciente de trasplante de riñón está experimentando un rechazo agudo. Se puede usar la expresión en exceso de los conjuntos de genes para identificar pacientes en riesgo de rechazo agudo.
Si el paciente está expresando los genes preseleccionados a un nivel alterado con respecto al control, el paciente está en riesgo de rechazo. Cuanto mayor es la alteración en el nivel de expresión de los genes preseleccionados en comparación con el control, mayor es el riesgo de rechazo. La información obtenida con el ensayo puede también aplicarse a un modelo de ajuste de regresión logística penalizado (log (p(x))/(1-p(x))= p*0+p*lgl+ p*igi+_+ p*ngn (donde (p(x) es la probabilidad de ACR, p*i es el coeficiente penalizado y gi es la lectura del recuento del gen i), que se puede usar para calcular una puntuación de probabilidad de rechazo agudo para cada paciente. En una realización, una puntuación mayor anterior indica que el paciente está en alto riesgo de rechazar el órgano trasplantado.
En la actualidad, el diagnóstico de rechazo agudo requiere una biopsia del aloinjerto renal activada por una elevación de la creatinina en presencia de una lesión renal. La recogida y la evaluación de muestras de biopsia del paciente es laboriosa y cara. La presente técnica de ensayo es un ensayo de tejido biológico, preferentemente un ensayo sobre sangre que evita la necesidad de extraer especímenes de biopsia. El ensayo se puede usar para predecir la probabilidad de que un receptor de aloinjerto renal rechace un riñón trasplantado antes de que el paciente manifieste cualquier síntoma de manera abierta. Se puede emplear también el ensayo para diagnosticar si un paciente de trasplante de riñón está experimentando un rechazo agudo. El ensayo es barato, muy preciso, reproducible y no invasivo.
Se han identificado firmas de sangre periférica usando conjuntos de firmas génicas que comprenden al menos 7 y hasta 17 genes preseleccionados. Estos conjuntos de genes preseleccionados se pueden usar para diagnosticar de forma precisa el rechazo subclínico de aloinjertos de riñón e identificar aloinjertos de riñón en riesgo para un posterior declive histológico y funcional así como el riesgo de rechazo del injerto.
Los conjuntos de firmas génicas útiles en la práctica de los métodos divulgados en el presente documento se seleccionan entre los siguientes genes: SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1.
El conjunto de firmas de sangre periférica de siete genes usado en la presente invención es: ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 y SENP7.
La firma de sangre periférica de nueve genes usada en la presente invención es: TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 y SENP7.
La firma de sangre periférica de 11 genes usada en la presente invención es: CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 y C1GALT1C1.
La firma de sangre periférica de 17 genes usada en la presente invención es: SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1. Cada uno de estos conjuntos de firmas de sangre se pueden usar para practicar la presente invención. Sin embargo, el conjunto de firmas de sangre de 11 genes es una realización preferida.
La presente invención proporciona un método, como se define en las reivindicaciones, para identificar receptores de aloinjerto de riñón que padecen rechazo agudo subclínico y clínico y que están en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende las etapas de proporcionar una muestra de sangre de un receptor de aloinjerto renal, aislar el ARNm de la muestra de sangre, sintetizar ADNc a partir del ARNm, y medir los niveles de expresión de un panel de genes que comprende un conjunto de firmas génicas seleccionado con el sistema de secuencias MiSEQ (Illumina, Inc. San Diego California), Nanostring (nCounter® miRNA Expression Assay-Nanostring Technologies, Inc. Seattle Washington) o qPCR. Los resultados del análisis del conjunto de genes se comparan con un control. El resultado de la expresión génica se puede usar para predecir el inicio de la respuesta de rechazo del aloinjerto, para diagnosticar una respuesta de rechazo del aloinjerto, y/o para caracterizar una respuesta de rechazo del aloinjerto en un paciente con trasplante. Si el paciente está expresando el conjunto de firmas génicas en un nivel alterado con respecto al nivel de expresión de los genes del conjunto de firmas génicas en el control, el paciente está en riesgo de rechazo. Cuánto mas esté alterado el nivel de expresión en el paciente en comparación con el control, mayor es el riesgo de rechazo.
En un aspecto, se proporciona un método para tratar un receptor de aloinjerto de riñón al obtener un espécimen biológico procedente del receptor de aloinjerto de riñón, medir el nivel de expresión de un conjunto de firmas génicas preseleccionado en el espécimen, comparar el nivel de expresión de conjunto de firmas génicas preseleccionado en el espécimen con el nivel de expresión de los genes de las firmas génicas en una muestra del control, y determinar si el receptor del aloinjerto presenta un mayor riesgo de rechazo agudo mediado por linfocitos T del aloinjerto si el nivel de expresión del conjunto de firmas génicas en el espécimen está alterado con respecto al nivel de expresión en el conjunto de firmas génicas del control.
En otra realización, se proporciona un método para tratar un receptor de aloinjerto de riñón obteniendo un espécimen biológico procedente del receptor de aloinjerto, medir el nivel de expresión de un conjunto de genes seleccionados en el espécimen, comparar el nivel de expresión del conjunto de genes en el espécimen con el nivel de expresión de un paciente del control, determinar que el receptor presenta riesgo de rechazo del aloinjerto si el nivel de expresión del conjunto de genes en el espécimen está alterado con respecto al nivel de expresión del conjunto de genes en el control y tratar a un receptor para el que se determina que está en riesgo de rechazo.
Otra realización proporciona un método para tratar a un receptor de aloinjerto de riñón obteniendo un espécimen biológico procedente del receptor del aloinjerto, medir el nivel de expresión de un conjunto de genes preseleccionado en el espécimen, comparar el nivel de expresión del conjunto de genes en el espécimen con el nivel de expresión de un control, determinar que el paciente está en riesgo de rechazo si el nivel de expresión del conjunto de genes en el espécimen está alterado con respecto al nivel de expresión del conjunto de genes en el control y tratar al receptor para el que se determina que está en riesgo de rechazo administrando fármacos inmunosupresores al receptor o administrando altas dosis de esteroides o agentes antilinfocíticos.
En otra realización más, se proporciona un kit de ensayo para identificar receptores de aloinjerto renal que padecen rechazo agudo subclínico y clínico y que están en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende en uno o más recipientes diferentes: un ensayo para un conjunto de firmas génicas que comprende al menos los genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 y SENP7, tampones, controles positivos y negativos e instrucciones de uso.
En otra realización más, se proporciona un kit de ensayo para identificar receptores de aloinjerto renal que padecen rechazo agudo subclínico y clínico y que están en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende en uno o más recipientes diferentes: un ensayo para un conjunto de firmas génicas que comprende al menos los genes TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 y SENP7, tampones, controles positivos y negativos e instrucciones de uso.
Otro aspecto más es un kit de ensayo para identificar receptores de aloinjerto renal que padecen de rechazo agudo subclínico y clínico y que están en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende en uno o más recipientes diferentes: un ensayo para un conjunto de firmas génicas que comprende al menos los genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 y C1GALT1C1, tampones, controles positivos y negativos e instrucciones de uso.
Otro aspecto más es un kit de ensayo para identificar receptores de aloinjerto renal que padecen de rechazo agudo subclínico y clínico y que están en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende en uno o más recipientes diferentes: un ensayo para un conjunto de firmas génicas que comprende al menos los genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1, tampones, controles positivos y negativos e instrucciones de uso.
Una realización adicional, proporciona un método para identificar receptores de aloinjerto de riñón que padecen rechazo agudo subclínico y clínico y que están en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende las etapas de proporcionar una muestra de sangre de un receptor de aloinjerto renal, aislar el ARNm de la muestra de sangre, sintetizar ADNc a partir del ARNm, y medir los niveles de expresión de un panel de genes que comprende un conjunto de nueve firmas génicas seleccionado con el sistema de secuencias MiSEQ (Illumina, Inc. San Diego California), Nanostring (nCounter® miRNA Expression Assay-Nanostring Technologies, Inc. Seattle Washington) o qPCR. Los resultados del análisis del conjunto de genes se comparan con el nivel de expresión de los genes del conjunto de firmas en un control. El resultado de la expresión génica se puede usar para predecir el inicio de la respuesta de rechazo del aloinjerto, para diagnosticar una respuesta de rechazo del aloinjerto, y/o para caracterizar una respuesta de rechazo del aloinjerto en un paciente con trasplante. Si el paciente está expresando el conjunto de firmas génicas en un nivel alterado con respecto al control, el paciente está en riesgo de rechazar el conjunto de firmas génicas. Cuanto mayor es la alteración (aumento y/o disminución) en el nivel de expresión de los genes de las firmas de genes en comparación con el control, mayor es el riesgo de rechazo.
En otra realización, los resultados del ensayo se aplican a un modelo de ajuste de regresión logística penalizado (log (p(x))/(1-p(x))= p*0+p*lgl+ p*igi+_+ p*ngn (donde (p(x) es la probabilidad de ACR, p*i es el coeficiente penalizado y gi es la lectura del recuento del gen i) que se puede usar para calcular una puntuación de probabilidad del rechazo agudo para cada paciente. Si la puntuación de probabilidad del paciente es mayor que la puntuación de probabilidad del control, entonces el paciente está en riesgo de rechazo celular agudo.
Otra realización proporciona un método para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto al evaluar el nivel de expresión de un conjunto de genes de 17 elementos que comprende al menos los genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, z Nf493, CCDC82, NfYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1 de una muestra del paciente que ha recibido el aloinjerto.
En algunos métodos del presente documento, es deseable detectar y cuantificar los ARNm presentes en una muestra. Se puede conseguir la detección y la cuantificación de la expresión del ARN mediante uno cualquiera de numerosos métodos bien conocidos en la técnica. Usando las secuencias conocidas para los elementos de la familia del ARN, se pueden diseñar sondas y cebadores específicos para usar en los métodos de detección descritos a continuación según sea adecuado.
En algunos casos, la detección y la cuantificación de la expresión del ARN requiere el aislamiento del ácido nucleico de una muestra, tal como una muestra de células o tejido. Los ácidos nucleicos, incluyendo el ARN y específicamente el ARNm, se pueden aislar usando cualquier técnica adecuada conocida en la materia. Por ejemplo, la extracción basada en fenol es un método común para el aislamiento del ARN. Los reactivos basados en fenol contienen una combinación de desnaturalizantes e inhibidores de la ARNasa para romper células y tejidos y la posterior separación del ARN de los contaminantes. Los procedimientos de aislamiento basados en fenol pueden recuperar especies de ARN en el intervalo de 10-200 nucleótidos (por ejemplo, miARN precursores y maduros, ARN ribosómico de 5S y 5,8S (ARNr), y ARN nuclear pequeño U1 (ARNnp). Además, procedimientos de extracción tales como los que utilizan TRIZOL™ o TRI REAGENT™, purificarán todos los ARN, grandes y pequeños, y son métodos eficaces para aislar el ARN total de muestras biológicas que contienen miARN y los ARN interferentes pequeños (ARNip). Se contemplan también procedimientos de extracción tales como los que utiliza el kit QIAGEN-ALLprep.
En algunas realizaciones, es deseable el uso de la RT-PCR cuantitativa. La RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) es una modificación de la reacción en cadena de la polimerasa usada para medir rápidamente la cantidad de un producto de la reacción en cadena de la polimerasa. La qRT-PCR se usa comúnmente para determinar si una secuencia genética está presente en una muestra, y si está presente, el número de copias en la muestra. Cualquier método de la PCR que pueda determinar la expresión de una molécula de ácido nucleico, incluyendo un ARNm, se encuentra dentro del alcance de la presente divulgación. Existen algunas variaciones del método de la qRT-PCR conocidas en la técnica, tres de las cuales se describen a continuación.
Otra realización proporciona un kit para determinar si un paciente que ha recibido un aloinjerto está experimentando un rechazo agudo del aloinjerto que comprende en uno o más recipientes parejas de cebadores para un conjunto de genes de 17 elementos, controles positivos y negativos, tampones e instrucciones de uso.
En una realización habitual, un laboratorio clínico obtendrá el valor de la expresión usando una muestra del paciente y la enviará al médico del paciente. El médico comunicará a continuación este valor a su proveedor de servicios basado en web. El proveedor de servicios introducirá este valor en el sistema bioinformático que ya tiene el coeficiente penalizado de cada gen del conjunto de genes preseleccionado y el corte según el modelo de regresión logística del conjunto de entrenamiento. El sistema bioinformático utilizará esta información para calcular la puntuación de probabilidad del paciente. La puntuación calculada reflejará el estado del ACR del paciente.
El procedimiento de aplicación global de la firma génica en el diagnóstico del ACR se describe a continuación usando la firma de nueve genes como ejemplo no limitante.
1) Selección del grupo de entrenamiento: Un grupo de pacientes con trasplante de riñón con casos de ACR equilibrado (número total N=~100) y sin ACR (control) se seleccionará cuidadosamente. El grupo de entrenamiento estará bien caracterizado con indicaciones demográficas y clínicas revisadas por al menos dos patólogos.
2) Medición de la expresión de 9 genes: Los niveles de expresión de 9 genes procedentes de la muestra de sangre después del trasplante de cada paciente en el grupo de entrenamiento se pueden medir usando cualquier técnica, y preferentemente mediante MiSEQ, RT-PCR o tecnología Nanostring. Se describe el uso de estas técnicas en los Ejemplos 1-3 siguientes.
3) Establecimiento de un modelo de regresión y del corte: Un modelo de ajuste de regresión logística penalizado usando el paquete logistf R (un paquete estadístico disponible de r-project.org) se aplicará a continuación sobre los valores de expresión de los 9 genes para obtener el modelo estadístico a partir del cual se obtendrá el valor p* de cada gen y se calculará la puntuación de probabilidad de rechazo agudo de cada paciente a partir de la siguiente ecuación:
(log (p(x))/(1-p(x))= p*0+p*lgl+ p*igi+....+ p*9g9
(donde (p(x) es la probabilidad del ACR, p*i es el coeficiente penalizado y gi es la lectura del recuento del gen i)
Basándose en la puntuación de probabilidad, la predicción estadística tal como la predicción del ABC (área bajo la curva) de la curva de ROC (recepción de la característica de funcionamiento) del índice de positivos verdaderos respecto del índice de positivos falsos, se determinarán la sensibilidad/especificidad, los valores positivos (PPV) y los valores predictivos negativos (Negative Predictive Values, NPV). A una especificidad dada (90 %), se establecerá un corte de la puntuación de probabilidad que detecta mejor la presencia del rechazo agudo. Se espera que exista una división clara entre dos grupos donde si un paciente está en el grupo superior tendrá una alta probabilidad de tener un rechazo agudo y el ensayo se considera como positivo pero si está en el grupo inferior tendrá una probabilidad muy baja de tener un rechazo agudo y el ensayo se considera como negativo.
La alternativa es que los pacientes se dividan en terciles según en su puntuación de probabilidad determinada como anteriormente. En este caso, si el paciente está en (1) el tercil superior tiene una alta probabilidad de tener un rechazo agudo y el ensayo se determina como positivo; (2) en el segundo tercil o grupo intermedio no se puede determinar con precisión su riesgo; y (3) en el tercil inferior tiene una probabilidad muy baja de tener rechazo agudo y el ensayo se determina como negativo.
El coeficiente (valor p*) y el corte obtenidos del grupo de entrenamiento se introducirán y almacenarán en un sistema de cálculo bioinformático basado en web al que se puede acceder desde el laboratorio clínico/consulta del médico mediante la Internet.
(4) Diagnóstico de un nuevo caso: Para un nuevo paciente, los niveles de expresión del conjunto de 9 genes se medirán con la misma tecnología usada para el conjunto de entrenamiento en el laboratorio clínico. Utilizando un sistema bioinformático basado en web, se calculará la puntuación de probabilidad resumiendo el valor de la expresión (gi) de los 9 genes multiplicado por sus valores p* que se han obtenido con el conjunto de entrenamiento. La puntuación de probabilidad se comparará con el corte para determinar el estado del ACR. Un aumento en la puntuación de probabilidad en el paciente con respecto a la puntuación de probabilidad en un control indica que el paciente está en mayor riesgo de rechazo al aloinjerto. Un laboratorio clínico enviará los resultados del ensayo al médico.
Los métodos divulgados en el presente documento diagnostican de forma precisa el rechazo subclínico y clínico e identifican de forma precisa los aloinjertos que presentan riesgo de un posterior declive histológico y funcional y los receptores del aloinjerto que están en riesgo de pérdida del injerto.
Cuando se identifican dichos receptores del aloinjerto, la presente divulgación incluye métodos para tratar dichos pacientes. Los métodos incluyen, sin limitación, una mayor administración de fármacos inmunosupresores, es decir, un inhibidor de la calcineurina (CNI), tal como ciclosporina o tacrolimus, o como mínimo fármacos inmunosupresores fibrogénicos tales como micofenolato mofetilo (MMF) o sirolimus. La clase principal de inmunosupresores son los inhibidores de la calcineurina (CNI), que incluye tacrolimus (Prograf® y Advagraf®/Astagraf XL (Astellas Pharma Inc.) y genéricos de Prograf®) y ciclosporina (Neoral® y Sandimmune® (Novartis AG) y genéricos). Se pueden administrar también esteroides tales como prednisona para tratar pacientes que presentan riesgo de pérdida o declive funcional del injerto. Agentes antiproliferativos tales como micofenolato mofetilo, micofenolato de sodio y azatioprina son también útiles en dichos tratamientos. Se puede conseguir la inmunosupresión con muchos fármacos diferentes, incluyendo esteroides, anticuerpos dirigidos y CNI de tipo tacrolimus. De estos, tacrolimus es uno de los más potentes en términos de supresión del sistema inmunitario o la administración de altas dosis de esteroides o agentes antilinfocíticos dependiendo de la presencia o ausencia de una concentración elevada de creatinina. El régimen de tratamiento actualmente preferido para el rechazo clínico es cualquiera que sea alto en esteroides o agentes antilinfocíticos. Otro agente preferido es Nulojix® (belatacept, Bristol-Myers Squibb), un agente biológico para infusión.
Kits
En determinadas realizaciones, se proporcionan kits para determinar el riesgo de los receptores del aloinjerto renal de pérdida del aloinjerto.
Los kits contendrán cebadores para el conjunto de firmas génicas de 17 elementos que se muestra en el Ejemplo 5 siguiente (para ensayos de tipo Nanostring), cebadores para 2 genes constitutivos, beta actina (ACTB) y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), y una sonda del control, ARN ribosómico de 18S (para ensayos de la qPCR).
Un kit puede contener además uno o más reactivos de extracción del ARNm y/o reactivos para la síntesis del ADNc. En otras realizaciones, el kit puede comprender, uno o más recipientes en los que se introducen los agentes biológicos y, preferentemente, distribuidos en alícuotas de forma adecuada. Los componentes de los kits pueden envasarse en medio acuoso o en forma liofilizada. Los kits pueden comprender también uno o más excipientes, diluyentes y/o transportadores farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos no limitantes de excipientes, diluyentes y/o transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen agua exenta de ARNasa, agua destilada, agua tamponada, solución salina fisiológica, PBS, solución de Ringer, solución de dextrosa, tampones de reacción, tampones de etiquetado, tampones de lavado y tampones de hibridación.
Los kits de la invención pueden tomar diversas formas. Típicamente, un kit incluirá los reactivos adecuados para determinar los niveles de expresión del conjunto de genes (por ejemplo, los divulgados en el presente documento) en una muestra. Opcionalmente, los kits pueden contener una o más muestras del control. Asimismo, los kits, en algunos casos, incluirán información escrita (indicios) que proporcionen una referencia (por ejemplo, valores predeterminados), en donde una comparación entre los niveles de expresión génica del sujeto y la referencia (valores predeterminados) es indicativa de un estado clínico.
En algunos casos, los kits comprenden software útil para comparar los niveles de expresión del conjunto de genes o las incidencias con una referencia (por ejemplo, un modelo de predicción). Normalmente, el software se proporcionará en un formato legible por ordenador tal como un disco compacto, pero también puede estar disponible para su descarga mediante la Internet. Sin embargo, los kits no están limitados de esta manera y serán evidentes otras variaciones para una persona normalmente experta en la materia.
Los presentes métodos pueden también utilizarse para seleccionar un tratamiento y/o determinar un plan de tratamiento para un sujeto, según los niveles de expresión de un conjunto de genes (por ejemplo, los divulgados en el presente documento).
Los niveles de expresión y/o los niveles de expresión de referencia pueden almacenarse en un medio de almacenamiento de datos adecuado (por ejemplo, una base de datos) y, por lo tanto, están también disponibles para diagnósticos futuros. Esto permite también diagnosticar eficazmente la prevalencia de una enfermedad ya que se pueden identificar resultados de referencia adecuados en la base de datos una vez que se ha confirmado (en el futuro) que el sujeto a partir del cual se obtuvo la muestra de referencia correspondiente desarrolla fibrosis del aloinjerto y/o experimenta el rechazo del aloinjerto.
Como se usa en el presente documento, una "base de datos" comprende los datos recogidos (por ejemplo, el analito y/o información del nivel de referencia y/o información del paciente) en un medio de almacenamiento adecuado. Es más, la base de datos, puede comprender además un sistema de gestión de la base de datos. El sistema de gestión de la base de datos está basado, preferentemente, en una base de datos jerárquica u orientada a objetos incluida en una red. Más preferentemente, la base de datos se implementará como un sistema distribuido (federal), por ejemplo, como un sistema cliente-servidor. Más preferentemente, la base de datos está estructurada para permitir que un algoritmo de búsqueda compare un conjunto de datos de ensayo con los conjuntos de datos comprendidos por la recogida de datos. Específicamente, utilizando dicho algoritmo, se puede investigar la base de datos buscando conjuntos de datos similares o idénticos que sean indicativos de riego de rechazo al aloinjerto renal. Por tanto, si se puede identificar un conjunto de datos idéntico o similar en la recogida de datos, el conjunto de datos se asociará con el riesgo de rechazo al aloinjerto renal.
En consecuencia, la información obtenida a partir de la recogida de datos se puede usar para diagnosticar el riesgo de un receptor de aloinjerto de la pérdida del aloinjerto o bien, basándose en un conjunto de datos de ensayo obtenidos de un sujeto. Más preferentemente, la recogida de datos comprende valores característicos de todos los analitos comprendidos por uno cualquiera de los grupos enumerados anteriormente.
La divulgación proporciona además la comunicación de los resultados del ensayo o los diagnósticos o ambos, a los técnicos, médicos o pacientes, por ejemplo. En determinadas realizaciones, los ordenadores se usarán para comunicar los resultados del ensayo o los diagnósticos o ambos a las partes interesadas, por ejemplo, los médicos y sus pacientes.
En algunas realizaciones, el método divulgado en el presente documento comprende además modificar el registro clínico del receptor para identificar si el receptor está en riesgo de desarrollar ACR y/o pérdida del aloinjerto. El registro clínico puede almacenarse en un medio de almacenamiento de datos adecuado (por ejemplo, un medio legible por ordenador).
En algunas realizaciones de la divulgación, se comunica al receptor del aloinjerto un diagnóstico basado en los métodos proporcionados en el presente documento tan pronto como sea posible una vez que se ha obtenido el diagnóstico. Se puede comunicar el diagnóstico al receptor por el médico a cargo del tratamiento del receptor. Como alternativa, se puede enviar el diagnóstico al receptor por correo electrónico o comunicarse al sujeto por teléfono. Se puede enviar el diagnóstico a un receptor en la forma de un informe. Se puede usar un ordenador para comunicar el diagnóstico por correo electrónico o teléfono. En determinadas realizaciones, el mensaje que contiene los resultados de un ensayo diagnóstico puede generarse y enviarse automáticamente al receptor utilizando una combinación de hardware y software informático con el que estarán familizarizados los técnicos expertos en telecomunicaciones.
Los aspectos incluyen productos de programas informáticos para identificar un sujeto que se ha sometido a aloinjerto renal y que está en riesgo de rechazo agudo, en donde el producto de programa informático, cuando se carga en un ordenador, se configura para emplear un resultado de expresión génica de una muestra obtenida del sujeto para determinar si un sujeto que se ha sometido a un aloinjerto renal está en riesgo de rechazo de aloinjerto en donde el resultado de la expresión génica comprende los datos de expresión de al menos un conjunto de firmas génicas.
Se proporcionan también perfiles de expresión de referencia para un fenotipo que es uno de: (a) riesgo bajo de rechazo agudo; o (b) alto riesgo; en donde el perfil de expresión se registra en un medio legible por ordenador al que puede acceder un usuario, por ejemplo, en un formato legible por un usuario. En determinadas realizaciones, el perfil de expresión incluye. En determinadas realizaciones, el perfil de expresión es un perfil de un fenotipo que es de bajo riesgo. En determinadas realizaciones, el perfil de expresión es un perfil de un fenotipo que es de alto riesgo.
Los perfiles de expresión y las bases de datos de los mismos pueden proporcionarse en una variedad de medios para facilitar su uso. "Medio" se refiere a una fabricación que contiene información sobre el perfil de expresión
Las bases de datos se pueden registrar en un medio legibles por ordenador, por ejemplo, cualquier medio que se pueda leer y al que el usuario pueda acceder directamente empleando un ordenador. Dichos medios incluyen, pero sin limitación: medios de almacenamiento magnético, tales como discos flexibles, medios de almacenamiento de disco duro y cinta magnética; medios de almacenamiento ópticos tales como CD-ROM; medios de almacenamiento eléctricos tales como RAM y ROM; e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos. Un experto en la materia puede apreciar fácilmente como cualquiera de los actuales medios legibles por ordenador se pueden usar para crear una fabricación que comprenda un registro de información de la base de datos actual.
"Grabado" se refiere a un proceso para almacenar información en un medio informático legible, usando cualquiera de dichos métodos conocidos en la materia. Se puede seleccionar cualquier estructura de almacenamiento de datos conveniente, según los medios usados para acceder a la información almacenada. Se pueden usar para el almacenamiento una variedad de programas y formatos de procesamiento de datos, por ejemplo, ficheros de procesadores de texto, formato de bases de datos, etc. Por tanto, las bases de datos de perfiles de expresión del sujeto son accesibles por un usuario, es decir, los archivos de la base de datos se guardan en un formato legible por el usuario (por ejemplo, un formato legible por ordenador, donde un usuario controla el ordenador).
Como se usa en el presente documento, "un sistema informático" se refiere a medios de hardware, medios de software y medios de almacenamiento de datos usados para analizar la información
El hardware mínimo de los sistemas informáticos comprende una unidad de procesamiento central (CPU), medios de entrada, medios de salida y medios de almacenamiento de datos. Un técnico experto puede apreciar fácilmente que uno cualquiera de los sistemas informáticos actualmente disponible es adecuado para el uso
Los medios de almacenamiento de datos pueden comprender cualquier fabricación que comprenda un registro de la información actual como se ha descrito anteriormente, o un medio de acceso a memoria que pueda acceder a dicha fabricación.
Una variedad de formatos estructurales para los medios de entrada y de salida se puede usar para introducir y extraer la información de los sistemas informáticos, por ejemplo, para y desde un usuario. Un formato para un medio de salida clasifica los perfiles de expresión que poseen varios grados de similitud con un perfil de expresión de referencia. Dicha presentación proporciona a un experto en la materia una clasificación de similitudes e identifica el grado de similitud contenido en el perfil de expresión del ensayo.
La presente invención se describe a continuación en los ejemplos previstos para describir adicionalmente la invención sin limitar el alcance de la misma.
Como se describe en los Ejemplos, a continuación, se descubrió una firma molecular para predecir el desarrollo/progresión del rechazo celular agudo del aloinjerto renal.
Los datos demostraron el uso del perfilado del ARNm periférico para vigilar y estratificar los pacientes que están en riesgo de fibrosis y pérdida del injerto, obviando la necesidad de una biopsia del aloinjerto, y par identificar aquellos que puedan beneficiarse de intervenciones tempranas para prevenir la pérdida crónica del aloinjerto.
En los ejemplos siguientes, se usaron los siguientes materiales y métodos:
Ejemplo 1: Ensayo MiSEQ
1) Ensayo personalizado (conjuntos de sondas provistos de código de barras para un panel de 9 genes incluido un panel de genes constitutivos (housekeeping gene)
2) Kit de preparación de muestras de ARN lllumina® TruSeq® v2
3) Kit para la extracción de ARN total de alta calidad QIAGEN RNeasy®
Experimentos MiSEQ
El ARN total se extraerá con el kit QIAGEN RNeasy®. Se generará la biblioteca de secuenciación usando el kit de preparación de muestras de ARN Illumina® TruSeq® v2 siguiendo el protocolo del fabricante: brevemente, ARNm que contiene poliA se purificó en primer lugar y se fragmentó a partir del ARN total. Se realizará la síntesis de las primeras hebras de ADNc usando cebadores hexaméricos aleatorios y transcriptasa inversa, y a continuación se realizará la síntesis de la segunda hebra del ADNc. Después del proceso de reparación de extremos que convierte los salientes en extremos romos de ADNc, se añadirán múltiples adaptadores de indexación al final del ADNc bicatenario, y se realizará la PCR para enriquecer las dianas usando las parejas de cebadores específicas del panel de genes y de los genes constitutivos. Finalmente, las bibliotecas indexadas se validarán, se normalizarán y se combinará para su secuenciación en el secuenciador MiSEQ.
Procesamiento de los datos del MiSEQ
Los datos de secuencia de ARN en bruto generados por el secuenciador MiSEQ se procesarán mediante el siguiente procedimiento: Las lecturas de buena calidad se alinearán en primer lugar con varias bases de datos de referencia humanas, incluido el genoma humano hg19, exones, unión de corte y empalme y base de datos de contaminación que incluye secuencias de ADN de ribosomas y mitocondrias usando el algoritmo de alineación BWA1. Después de filtrar las lecturas que se cartografiaron con la base de contaminación, las lecturas que se alineaban de manera única con un máximo de 2 emparejamientos incorrectos con las regiones deseadas del amplicón (es decir, el producto de la PCR de los cebadores emparejados) se contarán a continuación como el nivel de expresión del gen correspondiente y se someterán seguidamente a la normalización por cuantiles a través de las muestras después de su transformación tomando log2 usando los programas estadísticos R.
Ejemplo 2: Ensayo de Nanostring
1) Código de barras personalizados (conjuntos de sondas provistos de código de barras para un panel de 9 genes incluidos 3 genes constitutivos y controles negativos proporcionados por Nanostring).
2) nCounter® Master Kit que incluía el cartucho nCounter, nCounter Plate Pack y nCounter Prep Pack.
3) Kit para la extracción de ARN total de alta calidad QIAGEN RNeasy®
Experimentos de Nanostring:
El ARN total se extraerá con el kit QIAGEN Rneasy® siguiendo el protocolo del fabricante; las sondas provistas de código de barras se hibridaron con el ARN total en solución a 65 °C con el kit maestro. La sonda de captura capturará la diana para su inmovilización y obtener los datos. Tras la hibridación, la muestra se transferirá a la nCounter Pre Station y la sonda/diana se inmovilizará en el cartucho nCounter y a continuación las sondas se contarán mediante el analizador digital nCounter.
Análisis de datos transcriptomícos del ARNm
Los datos de recuento bruto para el analizador Nanostring se procesarán usando el siguiente procedimiento: los datos de recuento bruto se normalizarán en primer lugar al recuento de los genes constitutivos, y los ARNm con recuentos inferiores a la mediana más tres veces la desviación estándar del recuento de controles negativos se eliminarán con este filtrado. Debido a la variación de datos que surge del lote de reactivos, el recuento de cada ARNm procedente de diferentes lotes de reactivos se calibrarán multiplicando por un factor de la proporción de recuento promediado de las muestras sobre diferentes lotes de reactivos. Los recuentos calibrados de diferentes lotes experimentales ajustarán adicionalmente el paquete ComBat.
Ejemplo 3: Ensayo qPCR
1) Recipiente de cebadores (16 tubos con un ensayo qPCR por tubo para 12 genes incluido el panel de 9 genes y 2 genes constitutivos (ACTB y GAPDH) y la sonda del control ARN ribosómico 18S). Los ensayos fueron solicitados por LifeTech.
2) TaqMan® Universal Master Mix II: reactivos para las reacciones qPCR
3) MATRIZ DE PLACAS DE 96 POCILLOS TaqMan® 6x16
4) Kit de síntesis de ADNc Agilent AffinityScript QPCR: para conversión con la mayor eficacia de ARN en ADNc y totalmente optimizada para aplicación de PCR cuantitativa en tiempo real (QPCR).
El ARN total se extraerá de muestras de biopsia de aloinjerto usando el kit Allprep (kit QIAGEN-ALLprep, Valencia, CA EE.UU.). El ADNc se sintetizará usando el kit AffinityScript RT con cebadores oligo dt (Agilent Inc. Santa Clara, CA). Los ensayos qPCR TaqMan para el conjunto de 9 genes, 2 genes constitutivos (ACTB, GAPDH) y 18S se adquirirán de ABI Life Technology (Grand Island, NY). Los experimentos de PCR se realizarán sobre los ADNc usando la mezcla universal TAQMAN y las reacciones de la PCR se monitorizarán y se adquirirán con un sistema ABI7900HT. Las muestras se medirán por triplicado. Se generarán valores por ciclo de tiempo (Cycle Times, CT) para el conjunto de genes de predicción, así como para los 2 genes constitutivos. El valor ACT de cada gen se calculará restando el valor promedio de CT para los genes constitutivos a partir del valor CT de cada gen.
Ejemplo 4: Rendimiento del ensayo sobre pacientes trasplantados
Población del estudio
Ochenta pacientes adultos que recibieron trasplante renal fueron estudiados usando el perfil de expresión de los genes para determinar la presencia de rechazo subclínico agudo sobre su biopsia. Los receptores fueron predominantemente varones (80 %) con una edad media de 49,7, comprendida de 19 a 75. La raza del receptor fue 55 % blanca, 22,5 % afroamericana, 11,25 % asiática y 11,25 % hispana. Los donantes fueron un 40 % de donante vivo y un 60 % de donante fallecido. La edad promedio del donante fue de 41,5 con un intervalo de 3 a 75 años. Un treinta por ciento de los pacientes recibieron un bloqueante dirigido contra el receptor de IL-2 para la inducción, un 27,5 % recibió Thymoglobulin (inmunoglobulina antitimocítica), un 27,5 % no recibió inducción y un 0,5 % recibió Campath-IH. Todos los pacientes recibieron prednisona, prograf y micofenolato mofetilo.
Métodos
Se extrajeron 10 cc de 80 receptores de trasplante renal después del trasplante, y se almacenaron en un tubo Paxgene. La sangre se almacenó en una nevera a 4 °C; de no poderse realizar el ensayo inmediatamente, entonces el ensayo se puede realizar al día siguiente. Si la sangre se almacena más tiempo, debe almacenarse a -80 °C.
El ensayo MiSEQ se realizó como se describe en el Ejemplo 1 anterior.
Análisis de predicción
Los datos de expresión obtenidos del ensayo MiSEQ se introdujeron a continuación en un producto de programa informático para monitorizar un sujeto que había recibido un aloinjerto para determinar la respuesta de rechazo agudo (AR) que acompaña el kit. Este producto de programa informático, cuando se carga en un ordenador, está configurado para utilizar un resultado de expresión génica de la muestra derivada de cada uno de los sujetos para determinar una puntuación y proporcionar esta puntuación ACR al usuario en un formato legible por el usuario. La puntuación ACR está basada en puntuaciones de probabilidad derivadas de experimentos de referencia con los que se han validado los rangos de referencia para el diagnóstico.
Negativo para ACR: Puntuación de probabilidad de ACR menor de 0,16
Positivo para ACR: Puntuación de probabilidad de ACR superior a 0,5
Los resultados se muestran en la Tabla 1 y en la 2 adjuntas al presente documento.
Los siguientes resultados están basados en la cuantificación de 7 de 9 genes mediante el ensayo MiSEQ. Los 7 genes son: ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 y SENP7.
Como se muestra en la Tablas 1, de los 80 pacientes, 28 pacientes tienen una puntuación de 0,16 o menos y 18 tienen una puntuación de 0,5 o más. Treinta y dos pacientes se encuentran en el intervalo intermedio y, por tanto, se clasificaron como indeterminados.
En comparación con los métodos de diagnóstico convencionales, específicamente, la patología muestra que, según la biopsia, solamente uno de los 28 pacientes diagnosticados como sin ACR (Grupo 1) mediante el análisis de sangre periférica tenía alguna evidencia de rechazo agudo en la biopsia (Table ). Sin embargo, este paciente tenía nefropatía BK que produce inflamación durante la biopsia por otras causas. Los pacientes con este diagnóstico están tienen sobresupresión inmunitaria, y tienen un perfil de sangre periférica diferente al ACR. Estos datos muestran que la inflamación BK se puede diferenciar de la inflamación ACR en la sangre periférica usando el ensayo reivindicado. Se descubrió que cuatro de los 18 pacientes de ACR no se habían sometido a ACR durante la biopsia; sin embargo, 2 de dichos pacientes resultaron tener ACR, de esta forma, el ensayo les identificó correctamente como de alto riesgo. De los 32 pacientes intermedios (Grupo 2) se descubrió que 11 pacientes tenían biopsias con sospecha (n=7) o ACR (n=4).
De los 18 pacientes diagnosticados con ACR (Grupo 3) 4 fueron diagnosticados sin ACR pero 2 de estos pacientes resultaron tener ACR en un punto temporal posterior.
Usando un intervalo de referencia basado en estos resultados, el ensayo tuvo una sensibilidad y especificidad de 1 y 0,875 respectivamente, con valores de NPV y PPV de 1 y 0,78, respectivamente.
Gestión de los pacientes
1. Los pacientes del Grupo 1 (puntuación ACR negativa), continuaron con el protocolo normalizado de disminución de la inmunosupresión por el cual la prednisona se reducía hasta 5 mg si los pacientes seguían tomándola, el nivel diana de prograf se redujo a 5-7 mg/dl y el micofenolato mofetilo.
2. Para los pacientes del Grupo 2 (ACR indeterminada), el médico a cargo del tratamiento determinará la estrategia. Las potenciales estrategias incluyen:
a. La inmunosupresión no se disminuirá adicionalmente, y los pacientes se supervisarán de forma continuada y, si su prueba resulta positiva, recibirán tratamiento.
b. Se realizará una biopsia para confirmar o descartar la presencia de ACR.
3. Los pacientes del Grupo 3 (puntuación ACR positiva), recibirán un ciclo breve de esteroides a alta dosis, por ejemplo, 500 mg de prednisona durante 3 días. El ensayo se repetirá una semana después de completar los esteroides para determinar si el perfil de ACR es ahora normal. De lo contrario, se debe garantizar una biopsia.
Ejemplo 5: Cebadores
Los pares de cebadores de los 17 genes son como sigue:
ANXA5 CAATTT AG AG CAACT ACT CCTT G CTGT T ATT CG AAGTATACCTG CCT ACCTT G C
(SEQID N O :l) (SEQID NO:2)
ANXA5 ATGAAGCTCAAGTTGAACAAGATGCTC AGAACTTAAATGGGGGACAGATGAAGA
(SEQID NO:3) (SEQID NO:4)
AP1M1 GTTCGAGCTCATGTCCTACCGTCTCAA CCTTTGATATGGATCGAGTCGGTGATC
(SEQID NO:5) (SEQID NO:6)
AP1M1 CCACAG CCG CAT CGAGTACATGATCAA CAAAAG CCAGTT CAAG CG G CG GTCAA
(SEQ ID NO:7) (SEQID NO:8)
C1GALT1C1 GCATGTGATGATGTATGGGGTATACCG GGGCATTTGGGCATATTTTCAATGATG
(SEQID NO:9) (SEQID NQ :10)
C1GALT1C1 CCTGAAATATGCTGGAGTATTTGCAGA TGCAGAAGATGCTGATGGAAAAGATG
(SEQID N O : l l ) (SEQID NO :12)
CCDC82 CAATGACAGAAGAAGTTGAAGATGAAC AGAAACAGTGGAAAGAATTTTCAGGCG
(SEQID NO :13) (SEQID NO :14)
CCDC82 TT CT CTTT C A A ATAG ATTT C AG G CCTC T CAACCCT CACATT CAG G AAT AATTTT
(SEQID NO :15) (SEQID NO :16)
CLK1 G G ACCTCT ACCAAAACAT AT G AT ACAG ATTTTCACCACGATCGATTAGACTGGG
(SEQID NO :17) (SEQID NO :18)
CLK1 T CTG ACTACACAG AG G CGTAT AAT CCC TGATGAACGCACCTTAATAAATCCAGA
(SEQID NO :19) (SEQID NQ :20)
EFTUD2 AATTCATGATCAAAACCCGCCGTAGG GAGCATCAGCAAATTCTTCGATGATCC
(SEQID NO :21) (SEQID NO :22)
EFTUD2 AACCATAACCGAACCCCGAGGCAATGA G ACCCTT G AAGTTCAAT ACCACAT CT G
(SEQID NO :23) (SEQID NO :24)
ETAA1 TGGGAAAACTTACTAGGTAGTGAACCT AAAT ATCG ACAT G CCTG AACT CTTT CC
(SEQID NO :25) (SEQID NO :26)
ETAA1 AGT AACCCAAAT CAG ACTAGTG CAT CA TCTTTG ATG ATTG GAATG ATCCCTCAT
(SEQID NO :27) (SEQID NO :28)
F13A1 CCAATTTG AT G CACCTTTT GTTTTT G C G CG ACCT CATTT ACATT ACAG CTAAG A
(SEQID NO :29) (SEQID NQ :30)
(continuación)
F13A1 TGGAGTAACAAGACCAATGAAGAAGATG AACTCCACCGTGCAGTGGGAAGAAGT
SEQ ID NO :31) (SEQID NO :32)
MAP1A GAAAAAG ACAAG G CCCTG G AACAGAA AAGATTCCAGAAGAGAAAGACAAAGCC
(SEQ ID NO :33) (SEQID NO :34)
MAP1A CTGAAGGCAGAGAAGCGAAAGCTGAT CAAG GTAG G G AAAAAG CACCTT AAAG A
(SEQ ID NO :35) (SEQID NO :36)
NFYB CCT CTG AAATT AT ACCTT CAG AAATT CAG CTATG AAAG G AG AAAAG GGAATTG GTGG
NFYB TGTTATG GTTT ACACAACAT CAT ATCAAC TCTG GTG TTCAG CAAATTCAGTTTTCA
(SEQ ID NO:39) (SEQID NQ :40)
SENP6 G G CATTT AAAG CCTACTATCTGT AAAC TATCCT ACTT ATG G ACTCACTCCG AG G
(SEQ ID NO :41) (SEQID NO :42)
SENP6 TGAGAAGGATTTTATTTTTGTACCCCT CACTGGTTTTTGGCTGTTGTTTGTTTC
(SEQ ID NO :43) (SEQID NO :44)
SENP7 GACACTGTCTTTGAGTGCAGAGGATT GTACCGAGTCGAATATGTCAGTACCAA
(SEQ ID NO :45) (SEQID NO :46)
SENP7
ATTAG AACACT CTGT ATTAAG CCAG CA T CATTTT CCTTG AACT ACACAAT CCTG
(SEQ ID NO :47) (SEQID NO :48)
SPCS3 TTATT CCATTTGTCTT AGGAAGGCCCA TT ACAT GTG ACTAG CAACTTT CTCC AC
(SEQ ID NO :49) (SEQID NO :50)
SPCS3
GT CAAAG CTT AAAAATCAG GTGT GTCC GATAAGCCTGCAGTCTTAACCAGACCT
(SEQ ID NO :51) (SEQID NO :52)
TSC22D1 ACTG TG CCT CTTT CTT CTCAAACAATG TGAGAGTGACAAAATGGTGACAGGTAG
(SEQ ID NO :53) (SEQID NO :54)
TSC22D1 TCACCCATTTCATTGCTCG CTG CGAAA GTG AG ACTG ACAT AT G CCATT AT CT CT
(SEQ ID NO :55) (SEQID NO :56)
TUBB1 GTTCTGTCTATCCACCAG CTG ATTG AG ATG CCT GTTT CT G CATTG ACAATG AG G
(SEQ ID NO :57) (SEQID NO :58)
TUBB1 AATACCTG GTCCAAACAAG AAAAACAA GACAAGCAAAACTAAAGAACTGCAGTC
(SEQ ID NO :59) (SEQID NQ :60)
ZMAT1 ACCTAGTCATTCAAAGTAGAAACCCAC TGCTTTCAGCTTTTATCCTGAGAGTGG
(SEQ ID NO :61) (SEQID NO :62)
(continuación)
ZMAT1 CACAT G CAAG G AAGT G AACAT CAAATT ATCTAGTGAAGAATTCAAGGAAGACAC
(SEQID NO :63) (SEQID NO :64)
ZNF493 AG CCTTT AGT ATTTT CT CAACCCCT AC TCACACTGAAGAGAAATCCCACAGATG
(SEQID NO :65) (SEQID NO :66)
ZNF493
C AGTCCT CAACT CCTAGT AAACAT AAT AAACCAT ACAACT GTG AAG AAT GTG G C
(SEQID NO :67) (SEQID NO :68)
TABLA 1
Figure imgf000018_0001
continuación
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Figure imgf000020_0001
continuación
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Figure imgf000021_0002
(continuación)
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar un receptor de aloinjerto renal en riesgo de rechazo de aloinjerto que comprende las etapas de
(a) determinar los niveles de expresión de un conjunto de genes preseleccionado que comprende los 7 genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 y SENP7;
en una muestra de sangre obtenida del receptor de aloinjerto renal;
(b) comparar los niveles de expresión de los genes preseleccionados con los niveles de expresión de los genes preseleccionados en un control, y
(c) determinar que el receptor está en riesgo de rechazo del aloinjerto si el nivel de expresión de uno o más genes en el conjunto de genes de la muestra está alterado respecto del nivel de expresión del mismo uno o más genes del conjunto de genes del control.
2. El método de reivindicación 1 en donde la alteración comprende un aumento o una disminución en el nivel de expresión de uno o más de los genes del conjunto de genes de la muestra en comparación con el mismo uno o más genes del conjunto de genes del control.
3. Un fármaco antirrechazo o un esteroide en alta dosis para usar en la prevención del rechazo de aloinjerto o pérdida de aloinjerto en un paciente que se ha determinado que está en riesgo de rechazo o pérdida de aloinjerto que comprende las etapas de
(a) aislar ARNm de una muestra de sangre obtenida del receptor de aloinjerto renal;
(b) sintetizar ADNc a partir del ARNm;
(c) determinar los niveles de expresión de un conjunto de firmas génicas que comprende al menos los 7 genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 y SENP7;
en la sangre de dicho paciente; y
(d) diagnosticar que el receptor del aloinjerto está en riesgo alto de rechazo de aloinjerto y pérdida de aloinjerto si el nivel de expresión de uno o más genes del conjunto de firmas génicas en la muestra de sangre del receptor del aloinjerto está alterado respecto del nivel de expresión de los mismo uno o más genes de la muestra de sangre del control y tratar el receptor identificado como en riesgo alto para prevenir el rechazo de aloinjerto o la pérdida de aloinjerto.
4. El método de la reivindicación 1 o 2 o el fármaco antirrechazo o el esteroide en dosis alta para el uso de acuerdo con la reivindicación 3 en donde el conjunto de firmas génicas comprende al menos los genes TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 y SENP7.
5. El método de la reivindicación 1 o 2 o el fármaco antirrechazo o el esteroide en dosis alta para el uso de acuerdo con la reivindicación 3 en donde el conjunto de firmas génicas comprende al menos los genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 y C1GALT1C1.
6. El método de la reivindicación 1 o 2 o el fármaco antirrechazo o el esteroide en dosis alta para el uso de acuerdo con la reivindicación 3 en donde el conjunto de firmas génicas comprende al menos los genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1.
7. El fármaco antirrechazo para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el fármaco antirrechazo es un agente inmunosupresor o antiproliferativo.
8. El fármaco antirrechazo para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el mismo, el agente inmunosupresor es un elemento seleccionado entre el grupo que consiste de un inhibidor de calcineurina (CNI) (por ejemplo, ciclosporina o tacrolimus), micofenolato de mofetilo (Mm F), sirolimus, prednisona, Micofenolato mofetilo, Micofenolato sódico y azatioprina.
9. Un kit para identificar receptores de aloinjerto renal que padecen rechazo agudo subclínico y clínico y en riesgo de pérdida del aloinjerto que comprende uno o más recipientes de pares de cebadores separados mostrados en las SEQ ID NO:1-68 para el conjunto de firma preseleccionado, seleccionado entre los genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1, tampones, controles positivos y negativos e instrucciones de uso; en donde dicho conjunto de firmas génicas comprende al menos los genes ANx A5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 y SENp 7.
10. El kit de reivindicación 9, en donde el conjunto de firmas génicas comprende al menos los genes TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 y SENP7.
11. El kit de reivindicación 9, en donde el conjunto de firmas génicas comprende al menos los genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 y C1GALT1C1.
12. El kit de reivindicación 9, en donde el conjunto de firmas génicas comprende al menos los genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A y C1GALT1C1.
13. El kit de reivindicación 9 que comprende además genes constitutivos y cebadores de los genes constitutivos.
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