BR112016030360B1 - Métodos para diagnosticar um risco do receptor de aloenxerto renal e para selecionar um paciente com aloenxerto renal e kit para determinar um risco do receptor de aloenxerto renal - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA DIAGNOSTICAR UM RISCO DO RECEPTOR DE ALOENXERTO, PARA TRATAR UM RECEPTOR DE ALOENXERTO E PARA SELECIONAR UM PACIENTE COM ALOENXERTO E KITS. No presente pedido é divulgado um método para diagnosticar um risco do receptor de aloenxerto renal para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. O método inclui determinar os níveis de expressão de certos microRNAs, que foram determinados como sendo preditivos de um risco do receptor de aloenxerto. Também é divulgado no presente pedido um método para tratar um receptor de aloenxerto renal para inibir fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, bem como kits para uso nos métodos divulgado no presente pedido.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS DE DEPÓSITOS CORRELATOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente US 62/017.803, depositado em 26 de junho de 2014, que é integralmente incorporado ao presente pedido como referência.

CLÁUSULA DE CONCESSÃO DO GOVERNO

[002] Esta invenção foi feita com apoio do governo sob concessão n° 1U01AI070107-01, concedida pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos na invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A invenção refere-se ao campo da biologia molecular, e mais particularmente à detecção de assinaturas moleculares de microRNA. Mais particularmente, essa invenção refere-se a métodos para diagnosticar um risco do receptor de aloenxerto renal para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. Os métodos compreendem analisar o sangue de receptores de aloenxerto renal determinando o nível de expressão de um conjunto de assinaturas de miRNA contendo pelo menos 4 miRNAs pré-selecionados, a fim de identificar e tratar esses pacientes. Um modelo de ajuste de regressão logística pode ser aplicado aos valores de contagem de leitura de expressão normalizada (por exemplo, contagens de leituras de genes da tecnologia de sequenciamento de nova geração) para derivar um modelo estatístico a partir do qual um escore de probabilidade de risco de fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto pode ser calculado para cada paciente.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] A fibrose renal progressiva que leva ao declínio da função renal permanece a causa predominante de perda de aloenxerto renal. Metodologias atuais com base em parâmetros clínicos e patológicos não conseguem identificar enxertos em risco de perda antes do desenvolvimento de lesão irreversível. Esses testes geralmente necessitam da obtenção de uma amostra de biópsia do paciente. Frequentemente, quando a rejeição é reconhecida é muito tarde para se fazer alguma coisa. Um aumento na creatinina no soro ou um aumento de proteína na urina podem ser avisos de rejeição, mas não são inteiramente preditivos. Além disso, a coleta e avaliação de amostras de biópsia do paciente são demoradas e caras.

[005] Dessa forma, permanece uma necessidade para métodos de diagnóstico aprimorado para predizer um risco do receptor de aloenxerto renal para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[006] No presente pedido é divulgado um método para diagnosticar um risco do receptor de aloenxerto renal para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. O método geralmente inclui medir o nível de uma assinatura de miRNA em uma amostra de teste (por exemplo, uma amostra de sangue) do receptor. A assinatura compreende a determinação de uma alteração nos níveis de assinatura de miRNA em uma amostra teste de um receptor de aloenxerto. Em algumas realizações, a assinatura de miRNA consiste em produtos de gene de miRNA: hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p. Uma alteração nos níveis de miRNA, relativos ao nível de níveis correspondentes de miRNA em uma amostra de controle é indicativo do risco do receptor de aloenxerto de desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto.

[007] Em alguns aspectos, a divulgação fornece métodos para determinar um risco do receptor de aloenxerto renal (por exemplo, um “receptor”, um “paciente de aloenxerto renal” ou um “paciente”) para desenvolver fibrose do aloenxerto e/ou perda do aloenxerto que compreende comparar os níveis de expressão dos quatro microRNAs com um nível de controle para cada microRNA, em que os microRNAs são hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir- 302b-3p e hsa-mir-192-5p; e (i) diagnosticar o receptor como sendo de alto risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto se os níveis de expressão do hsa-miR-128 e hsa-miR-302b-3p são aumentados em relação a um nível de controle para cada microRNA, e os níveis de expressão de hsa-miR- 29b-3p e a hsa-miR-192-5p são diminuídos em relação ao nível de controle para cada microRNA com base no corte de escore de probabilidade determinado a partir do conjunto de treinamento; ou (ii) diagnosticar o receptor como sendo de baixo risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto se os níveis de expressão de hsa-miR-128 e hsa-miR-302b-3p são diminuídos em relação ao nível de controle para cada microRNA, e os níveis de expressão de hsa-miR-29b-3p e hsa-miR-192-5p são aumentados em relação ao nível de controle para cada microRNA com base no corte de escore de probabilidade determinado a partir do conjunto de treinamento.

[008] Em alguns aspectos, os métodos divulgados podem incluir a obtenção de uma amostra de sangue do destinatário; determinar os níveis de expressão de quatro microRNAs na amostra, em que os microRNAs são hsa- mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p, and hsa-mir-192-5p; comparar os níveis de expressão dos quatro microRNAs com um nível de controle para cada microRNA e diagnosticar o receptor como sendo de risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto se os níveis de expressão das amostras de miRNA são alteradas em relação a um nível de controle para cada microRNA. Determinar os níveis de expressão pode incluir, por exemplo, isolar mRNA total da amostra de sangue, sintetizar cDNA a partir de mRNA e medir os níveis de expressão de microRNAs hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b- 3p e hsa-mir-192-5p da amostra.

[009] Em alguns aspectos, os métodos divulgados podem incluir: a obtenção de uma amostra de sangue do receptor de aloenxerto renal; isolar (isto é, extrair) mRNA total a partir da amostra de sangue; sintetizar cDNA a partir do mRNA; determinar os níveis de expressão de quatro microRNAs, em que os microRNAs são hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192- 5p; comparar os níveis de expressão de cada um dos microRNAs para um nível de controle predeterminado e diagnosticar o receptor de aloenxerto como: (i) de alto risco para o desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto se os níveis de expressão de hsa-miR-128 e hsa-miR-302b-3p são aumentados em relação ao nível de controle para cada microRNA, e os níveis de expressão de hsa-miR-29b-3p e hsa-miR-192-5p são diminuídos em relação ao nível de controle para cada microRNA com base no corte de escore de probabilidade determinado a partir do conjunto de treinamento; ou (ii) de baixo risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto se os níveis de expressão de hsa-miR-128 e hsa-miR-302b-3p são diminuídos em relação ao nível de controle para cada microRNA, e os níveis de expressão de hsa-miR- 29b-3p e hsa-miR-192-5p são aumentados em relação ao nível de controle para cada microRNA com base no corte de escore de probabilidade determinado a partir do conjunto de treinamento.

[010] Em alguns aspectos do método, um alto risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto corresponde a um Índice de Danos de Aloenxerto Crônico de 12 meses CADI-12 de escore 1 ou superior. O escore de CADI é baseado em escores de componentes individuais para a) inflamação difusa ou focal, b) fibrose no interstício, c) aumentar na matriz mesangial, d) esclerose em glomérulos, e) proliferação intimal e f) atrofia tubular. Cada parâmetro individual é pontuado de 0 a 3 conforme descrito na literatura (Yilmaz et al., 2003, Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 14:773-779). Em alguns aspectos do método, um baixo risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda de aloenxerto corresponde a escore de CADI-12 menor que 1.

[011] Em alguns aspectos do método, o método compreende ainda compreende realizar uma comparação entre os níveis de expressão medidos de miRNA na amostra do receptor com uma ou mais amostras de referência (isto é, controle), as ditas referências sendo representativas de sujeitos humanos saudáveis.

[012] Em alguns aspectos, diagnosticar o risco do receptor compreende calcular o risco do receptor aplicando os níveis de expressão determinados na amostra do receptor para um modelo de ajuste de regressão logística penalizada. Em uma realização, o modelo de ajuste de regressão logística penalizada a partir do qual o risco será calculado utiliza a fórmula: log^h = β*o+β*igi+ β*igi+....+ β*4g4 1 P(X)

[013] onde ( p(x) é a probabilidade de desenvolver fibrose, β*i é o coeficiente de penalização e gi é o valor de expressão de miRNA i.

[014] Em alguns aspectos, diagnosticar o risco do receptor compreende calcular o escore de probabilidade de risco de fibrose para o dito receptor com o uso da equação: IO^T^T-. = β*o+β*igi+β*igi+....+ β*4g4 i 1 -p(θ M M v v v

[015] onde p(x) é a probabilidade de desenvolver fibrose, β*i é o coeficiente de penalização e gi é o valor de expressão de miRNA i.Em certas realizações, o método ainda compreende projetar um plano de tratamento com base no diagnóstico.

[016] Em certas realizações, o método ainda compreende administração de um tratamento com base no diagnóstico.

[017] Em alguns aspectos do método, o método ainda inclui tratar o receptor de aloenxerto para inibir fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, se o receptor do aloenxerto foi diagnosticado como sendo de risco para fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. Dessa forma, em alguns aspectos o método compreende administrar uma droga antifibrose para o receptor de aloenxerto.

[018] Dessa forma, também é divulgado no presente pedido um método para tratar um receptor de aloenxerto renal para inibir fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. O método pode incluir a obtenção de uma amostra de sangue do receptor de aloenxerto renal; isolar miRNA da amostra de sangue; sintetizar cDNA a partir do miRNA; determinar os níveis de expressão de quatro microRNAs, em que os micro RNAs são hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p, and hsa-mir-192-5p; comparar o nível de expressão de cada um dos microRNAs a um nível de controle para cada microRNA; diagnosticar o receptor de aloenxerto como: (i) de alto risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, se os níveis de expressão de hsa-miR-128 e hsa-miR-302b-3p estiverem diminuídos em relação ao nível de controle para cada microRNA, e os níveis de expressão de hsa-miR-29b-3p e hsa-miR-192-5p estiverem aumentados em relação ao nível de controle para cada microRNA, com base no corte de escore de probabilidade determinado a partir do conjunto de treinamento; ou (ii) de baixo risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, se os níveis de expressão de hsa-miR-128 e hsa-miR-302b- 3p estiverem diminuídos em relação ao nível de controle para cada microRNA, e os níveis de expressão de hsa-miR-29b-3p e hsa-miR-192-5p estiverem aumentados em relação ao nível de controle para cada microRNA, com base no corte de escore de probabilidade determinado a partir do conjunto de treinamento e administrar uma droga antirrejeição e/ou uma antifibrose ao receptor de aloenxerto e/ou modificar seus regimes de imunossupressão, se o receptor tiver níveis de expressão de hsa-miR-128 e hsa-miR-302b-3p que estão aumentados em relação a um nível de controle para cada microRNA, e os níveis de expressão de hsa-miR-29b-3p e hsa-miR-192-5p estão diminuídos em relação a um nível de controle para cada microRNA.

[019] Em alguns aspectos dos métodos de tratamento divulgados no presente pedido, o tratamento inclui administrar ao receptor de aloenxerto uma droga antirrejeição ao receptor de aloenxerto. Em alguns aspectos, a droga antirrejeição é Belatacept (uma proteína de fusão composta do fragmento Fc de uma imunoglobulina IgG1 humana ligadas ao domínio extracelular de CTLA-4). Em alguns aspectos, a droga antirrejeição é um agente imunossupressor ou antiproliferativo, micofenolato de mofetila (MMF), sirolimus, prednisona, Micofenolato de Mofetil, Micofenolato de Sódio e Azatioprina.

[020] Em alguns aspectos dos métodos de tratamento divulgados no presente pedido, o tratamento inclui administrar uma droga antifibrose (por exemplo, antifibrótica) ao receptor do aloenxerto. Em alguns aspectos, a droga antifibrose é selecionada a partir do grupo que consiste em Pirfenidona, relaxina, Proteína Óssea Morfogenética 7 (BMP-7) e Fator de Crescimento Hepático 6 (HGF). Em alguns aspectos dos métodos de tratamento divulgados no presente pedido, o método de tratamento inclui a modificar o regime imunossupressor do receptor de aloenxerto, por exemplo, alternando de um inibidor de calcineurina para uma droga que não está associada com o desenvolvimento de fibrose como as drogas antirrejeição Belatacept, rapamicina ou Micofenolato de Mofetila.

[021] Em alguns aspectos do método, determinar os níveis de expressão hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p inclui realizar um ensaio como qPCR, microarranjo ou análise de Nanostring. Para análise de Nanostring, a análise inclui anelamento de RNA total que compreende os miRNAs para sondas de código de barras específicas para os microRNAs, imobilizando o miRNA e quantificando as sondas ligadas ao miRNA por analisador digital

[022] Em outro aspecto, é fornecido no presente pedido um chip de DNA para diagnosticar um risco do receptor de aloenxerto renal desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, no qual uma sonda foi imobilizada para ensaio a níveis de expressão de hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir- 302b-3p e hsa-mir-192-5p.

[023] Em alguns aspectos, a divulgação fornece métodos para selecionar um paciente de aloenxerto renal para tratamento para reduzir fibrose do aloenxerto e para tratamento para reduzir o risco de perda do aloenxerto, os métodos compreendendo comparar os níveis de expressão dos quatro microRNAs com um nível de controle para cada microRNA, em que os microRNAs são hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p e (f) selecionar o paciente para tratamento se um dos níveis de expressão de hsa-miR-128 e hsa-miR-302b-3p estiverem aumentados em relação a um nível de controle para cada microRNA, e os níveis de expressão de hsa-miR-29b-3p e hsa-miR-192-5p estiverem diminuídos em relação ao nível de controle para cada microRNA. De acordo com alguns aspectos, os métodos podem incluir a obtenção de uma amostra de sangue do receptor, determinar os níveis de expressão de quatro microRNAs na amostra, em que os microRNAs são hsa- mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p, comparar os níveis de expressão dos quatro microRNAs com um nível de controle para cada microRNA e selecionar o paciente para tratamento se um dos níveis de expressão das amostras de miRNA estiverem alterados em relação a um nível de controle para cada microRNA. Em algumas realizações, o paciente é selecionado para tratamento se os níveis de expressão de hsa-miR-128 e hsa- miR-302b-3p estiverem aumentados em relação a um nível de controle para cada microRNA, e os níveis de expressão de hsa-miR-29b-3p e hsa-miR-192-5p estiverem diminuídos em relação ao nível de controle para cada microRNA.

[024] A presente divulgação também fornece um kit para determinar um risco do receptor de aloenxerto renal desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. Os kits incluem reagentes adequado para determinar os níveis de expressão de um miRNA em uma amostra de sangue (por exemplo, reagentes adequados para determinar os níveis de expressão de hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p); opcionalmente uma ou mais amostras de controle que compreendem níveis predeterminados do mesmo miRNA, em que a comparação dos níveis dos miRNAs em uma amostra de teste com os níveis nas amostras de controle identifica um risco do receptor de aloenxerto renal para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto; e instruções para uso do kit no método descrito no presente pedido. Em algumas realizações, o kit compreende uma ou mais sondas de código de barras que hibridizam especificamente a um ou mais dentre (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou todos os quatro) hsa- mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p. Em alguns aspectos, o kit ainda inclui um ou mais reagentes de extração de microRNA. Em alguns aspectos, o kit ainda inclui um reagente de anelamento. Em alguns aspectos, o kit ainda inclui instruções para uso.

[025] Como usado no presente pedido, “obter” ou “obtenção” pode ser qualquer meio pelo qual se chega à posse da amostra por meios “diretos” ou “indiretos”. Obter diretamente uma amostra significa realizar um processo (por exemplo, executar um método físico como extração) para obter a amostra. Obter indiretamente uma amostra refere-se a receber a amostra de outra parte ou fonte (por exemplo, um laboratório terceirizado que adquiriu diretamente a amostra). Obter diretamente uma amostra inclui realizar um processo que inclui uma alteração física em uma substância física, por exemplo, um material de partida, como sangue, por exemplo, sangue que foi isolado anteriormente a partir de um paciente. Dessa forma, obter é usado para significar coleta e/ou remoção da amostra a partir do sujeito. Além disso, “obter” também é usado para significar onde alguém recebe a amostra a partir de outro que estava na posse da amostra anteriormente.

[026] Em algumas realizações, a amostra de referência é obtida junto a pelo menos um indivíduo que não é o receptor de um aloenxerto renal. Em algumas outras realizações, a amostra de referência é obtida junto a pelo menos um receptor de aloenxerto renal anteriormente diagnosticado como sendo de risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. Em algumas realizações, a amostra de referência compreende um nível de analito de referência estatisticamente significativo predeterminado (por exemplo, níveis de expressão de miRNA de referência estatisticamente significativos predeterminados).

[027] Ainda em outra realização, os métodos ainda compreendem modificar o registro clínico do receptor do aloenxerto para identificar o receptor como sendo de risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. Preferencialmente, o registro clínico é armazenado em um meio legível por computador.

[028] Os detalhes de uma ou mais realizações da invenção são apresentados nos desenhos anexos e na descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e dos desenhos, e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[029] O arquivo de patente ou pedido contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias dessa publicação de patente ou pedido de patente com fotografias coloridas serão fornecidas pelo Escritório de Marcas e Patentes mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.

[030] A Figura 1 representa um fluxo de trabalho de análise de dados.

[031] A Figura 2 contém um mapa térmico de miRNAs expressos de maneira diferente em pacientes com CADI alto (CADI > 1) em comparação a CADI baixo (CADI <= 1). O vermelho indica expressão aumentada e o verde indica expressão diminuída.

[032] Figura 3: a Figura 3a contém um gráfico de barras de enriquecimento de Ontologia Gênica de alvos previstos que foram correlacionados negativamente com mir128; a Figura 3B contém um gráfico de barras de enriquecimento de Ontologia Gênica de alvos previstos que foram correlacionados negativamente com mir29b-3p.

[033] Figura 4: a Figura 4 contém uma curva ROC de Predição de conjuntos de predição de 4 miRNA no conjunto de treinamento; a Figura 4b representa a distribuição de AUCs no conjunto de treinamento derivado de 4 miRNA selecionados aleatoriamente. A linha vermelha vertical denotou a posição da AUC original; a Figura 4c contém uma curva ROC de Predição do conjunto de predição de 4 miRNA no conjunto de testes; e a Figura 4d representa a distribuição de AUCs sobre o conjunto de teste derivado de 4 miRNA selecionados aleatoriamente. A linha vermelha vertical denotou a posição da AUC original.

[034] A Figura 5 é um mapa térmico mostrando o agrupamento da amostra após calibragem do lote e remoção de efeito do lote para os miRNAs indicados.

[035] A Figura 6 mostra a correção de dados de amostra duplicada R281.1 em diferentes lotes.

[036] A Figura 7 mostra a correção de dados de amostra duplicada R2941.7A em diferentes lotes.

[037] A Figura 8 mostra duas quantificações de razão F, e apresenta as fontes clínicas ou demográficas contribuindo para a variação de dados antes (Figura 8a) e após (Figura 8b) correção de SVA.

[038] A Figura 9 é um diagrama esquemático ilustrando as etapas de validação cruzadas 3 vezes no conjunto de treinamento com 100 iterações.

[039] A Figura 10 contém gráficos com a curva ROC antes (painel esquerdo) e após (painel direito) correção de SVA. A taxa de verdadeiro positivo no eixo y é plotada contra a taxa de falso positivo no eixo x.

DESCRIÇÃO DETALHADA VISÃO GERAL

[040] A presente divulgação é direcionada a métodos para diagnosticar o risco do receptor de aloenxerto renal para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. A fibrose pode resultar na perda do aloenxerto. Os métodos descritos no presente pedido são úteis para identificar se um receptor de aloenxerto renal está em risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. Estabelecido de outra forma, os métodos descritos no presente pedido são úteis para determinar a probabilidade de um receptor de aloenxerto renal estar em risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, os métodos baseados em diferenças nas quantidades relativas (por exemplo, nível de expressão) de miRNA obtidos a partir do receptor, em que a probabilidade é determinada com o uso de um modelo de regressão linear conforme descrito no presente pedido.

[041] A técnica de ensaio divulgada no presente pedido é um ensaio baseado em sangue que evita a necessidade de amostras de biópsia. Os receptores de aloenxerto podem ser monitorados com o uso de ensaios divulgados no presente pedido no momento do transplante, imediatamente pós- transplante e periodicamente depois disso. Se um receptor de aloenxerto é determinado como de alto risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, o receptor de aloenxerto pode ser tratado, por exemplo, através da modificação do regime de imunossupressão do receptor de aloenxerto como, por exemplo, administração ou descontinuação da administração ou ajuste de dosagem de uma medicação imunossupressora (por exemplo, medicação antirrejeição) ou administrando um ou mais agentes antifibrose.

[042] Conforme descrito nos Exemplos, abaixo, foi descoberta uma assinatura molecular para predizer o desenvolvimento/progressão da fibrose do aloenxerto renal. Os dados demonstraram o uso de perfil de miRNA periférico para vigilância e estratificação de pacientes em risco para fibrose e perda do enxerto, livrando-se da necessidade de biópsia do aloenxerto e identificando aqueles que podem se beneficiar de intervenções precoces para prevenir a perda crônica do aloenxerto.

[043] A técnica de ensaio divulgada no presente pedido aborda a necessidade de métodos de diagnóstico aprimorados para predizer o risco do receptor de aloenxerto renal para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, e fornece um ensaio baseado em sangue que é facilmente administrado repetidamente a pacientes de transplante. Os pacientes de transplante renal são examinados pelos seus médicos muito frequentemente após o transplante, na maioria dos casos duas vezes por semana para o primeiro mês, mudando para semanalmente e, em seguida, uma semana sim outra não, até chegar a ser mensalmente após 4 a 5 meses, com intervalos de tempo entre as visitas gradualmente aumentado a partir de então. Durante este tempo, a função renal do paciente e os níveis de imunossupressão são monitorados. Os esteroides são tipicamente afunilados para 5mg por 3 meses após a cirurgia e os níveis de tacrolimo (uma droga que suprime o sistema imunológico e é usada para prevenir a rejeição de órgãos transplantados) são gradualmente reduzidos a um nível estável por 6 a 12 meses se o curso do pós-transplante não tiver complicações e o paciente não tiver alto risco imunológico. Os perfis de expressão de miRNA descritos abaixo podem ser empregados como um teste padrão a ser realizado no momento de uma visita clínica. Um resultado de teste positivo (isto é, se os níveis de expressão das amostras de miRNA estão alterados em relação a um nível de controle para cada microRNA) indica o desenvolvimento de fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, e seria tratado por aumento da modificação do regime de dosagem imunossupressora do paciente e por administração de drogas antifibrose. A repetição do teste (que pode ser feita economicamente, uma vez que o ensaio é preferencialmente um teste baseado em sangue) irá orientar as modificações continuadas, se existirem, ao regime de dosagem imunossupressora do paciente.

[044] Nos Exemplos, o perfil do miRNA foi realizado com o uso da tecnologia Nanostring no sangue periférico aos 3 meses pós-transplante de um coorte de 102 pacientes com transplante de rim do estudo Genomics of Chronic Allograft Rejection (GoCAR). As análises LIMMA dos perfis de expressão de miRNA identificaram um conjunto de 24 miRNAs significativamente associados a altos escores CADI de 12 meses (por exemplo, um escore CADI-12 >1). A correlação de perfis de expressão de miRNA com os perfis de expressão do gene RNAseq nos mesmos pacientes (N = 96) identificou alvos previstos de miRNA negativamente correlacionados e enriquecimento da Ontologia Gênica, além disso, previu os processos biológicos que os miRNAs podem participar. O mir- 128, que é conhecido por desempenhar papéis na tumorigênese, foi o mais significativamente suprarregulado em pacientes com CADI alto, e associado com genes em resposta imune e proliferação celular e apoptose. O mir-29b-3p foi o mais infrarregulado em pacientes com CADI alto (por exemplo, escore CADI-12 >1) e associado com genes na regulação da transcrição, vias de reparo de DNA através da via ATM.

[045] O perfil de miRNA identificou um conjunto de miRNA para a predição do desenvolvimento de fibrose do aloenxerto renal e perda do aloenxerto. Descobriu-se, em particular, que os 4 microRNAs, hsa-mir-128, hsa- mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p, e hsa-mir-192-5p, podem ser usados em conjunto para diagnosticar o risco do receptor de aloenxerto para desenvolver fibrose do aloenxerto perda do aloenxerto com um alto valor preditivo. Em receptores de aloenxerto que tinham CADI alto (por exemplo, escore CADI-12 >1), hsa-miR- 128, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-378e, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR- 26a-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-361-5p, e hsa-miR-22-3p foram suprarregulados; e os miRNAs, hsa-miR-7b-5p, hsa-miR- 1991-5p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-7b-5p, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-7g-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa- miR-126-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-1226-3p, e hsa-miR-29b-3p foram infrarregulados. Dessa forma, as assinaturas de miRNA podem ser desenvolvidas com base nesses dados, que identificam um paciente como de alto risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. Alternativamente, os níveis de expressão de qualquer miRNA individual podem ser determinados para avaliar o risco de fibrose do receptor de aloenxerto e perda do aloenxerto. Os miRNAs individuais particularmente preferenciais para uso nos presentes métodos de diagnóstico e/ou tratamento incluem, por exemplo, miR-128, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-29b-3p e hsa-miR-192-5p.

[046] Em certas realizações, um subconjunto particular de 4 dos miRNAs acima descritos é altamente preditivo de um receptor de aloenxerto como sendo de alto risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. Em particular, um receptor de aloenxerto pode ser diagnosticado como de alto risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, se os níveis de expressão de hsa-miR-128 e/ou hsa-miR-302b-3p estiverem aumentados com relação ao nível de controle para cada microRNA, e/ou os níveis de expressão de hsa-miR-29b-3p e/ou hsa-miR-192-5p estiverem diminuídos com relação ao nível de controle para cada microRNA.

[047] Em outras realizações, os níveis de expressão do receptor de aloenxerto miR-128, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-29b-3p e hsa-miR-192-5p são comparados com um valor de referência ou conjunto de referência (controle) para os miRNAs, e o risco relativo do receptor de aloenxerto é avaliado com base na análise estatística.

[048] Em outras realizações, um receptor de aloenxerto pode ser diagnosticado como de baixo risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, se os níveis de expressão de hsa-miR-128 e/ou hsa-miR- 302b-3p estiverem diminuídos com relação ao nível de controle ou perfil de referência para cada microRNA, e/ou se os níveis de expressão de hsa-miR-29b- 3p e/ou hsa-miR-192-5p estiverem aumentados com relação ao nível de controle ou perfil de referência para cada microRNA.

[049] Em outras realizações, os miRNAs são analisados em conjunto e o risco relativo para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto é avaliado com base na comparação do perfil de miRNA do receptor de aloenxerto com um perfil de referência (por exemplo, derivado ou baseado nos níveis de um coorte de receptores de aloenxerto que são conhecidos por não estarem em risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto), em que a comparação inclui considerar o perfil de expressão de miR-128, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-29b-3p e hsa-miR-192-5p, ou um subconjunto dos mesmos.

[050] Em algumas realizações, o perfil de expressão de miRNA pode ser determinado com o uso de um sistema de análise nCounter® (Nanostring Technologies®, Seattle, WA). O sistema de análise nCounter® da Nanostring Technologies faz o perfil de centenas de mRNAs, microRNAs ou alvos de DNA simultaneamente, com alta sensibilidade e precisão. Moléculas alvo são detectadas digitalmente. O sistema de análise Nanostring usa “códigos de barras” moleculares e a imagem de uma única molécula para detectar e contar centenas de transcrições únicas em uma única reação. O protocolo não inclui quaisquer etapas de amplificação. Embora este seja um método preferencial para a detecção rápida da expressão de miRNA, qualquer método adequado conhecido para detecção na técnica pode ser usado de acordo com os presentes métodos. Por exemplo, e sem limitação, o miRNA pode ser detectado com o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR), (q)PCR quantitativa ou microarranjo.

DEFINIÇÕES

[051] Como usado no presente pedido, um receptor de aloenxerto que está em “alto risco” para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto tem significativamente mais probabilidade de desenvolver fibrose e falha do aloenxerto, sem intervenção, do que um sujeito que está em “baixo risco”.

[052] Como usado no presente pedido, o nível de expressão de um miRNA divulgado no presente pedido significa o nível de expressão de mRNA do marcador ou o nível mensurável do marcador em uma amostra, que pode ser determinado por qualquer método adequado conhecido na técnica como, mas não se limitando a Northern blot, reação em cadeia da polimerase (PCR), por exemplo, quantitativa em tempo real, “QPCR”, microarranjo e análise Nanostring, etc.

[053] Em alguns dos métodos do presente pedido, é desejável detectar e quantificar miRNAs presentes em uma amostra. A detecção e a quantificação da expressão de RNA podem ser obtidas por qualquer um de uma série de métodos bem conhecidos na técnica. Com o uso das sequências conhecidas para membros da família de RNA, sondas e primers específicos podem ser projetados para uso nos métodos de detecção descritos abaixo conforme apropriado.

[054] Em alguns casos, a detecção e a quantificação da expressão de RNA necessitam do isolamento do ácido nucleico a partir de uma amostra, como uma célula ou amostra de tecido. Os ácidos nucleicos, incluindo RNA e especificamente miRNA, podem ser isolados com o uso de qualquer técnica adequada conhecida na técnica. Por exemplo, a extração à base de fenol é um método comum para isolamento de RNA. Os reagentes à base de fenol contêm uma combinação de desnaturantes e inibidores de RNase para a ruptura de células e tecidos e subsequente separação de RNA dos contaminantes. Os procedimentos de isolamento baseados em fenol podem recuperar espécies de RNA na faixa de 10 a 200 nucleotídeos (por exemplo, miRNAs precursores e maduros, RNA ribossômico 5S e 5,8S (rRNA) e RNA pequeno nuclear U1 (snRNA)). Além disso, procedimentos de extração, como os que usam TRIZOL™ ou TRI REAGENT™, irão purificar todos os RNAs, grandes e pequenos, e são métodos eficientes para o isolamento de RNA total de amostras biológicas que contêm miRNAs e pequenos RNAs de interferência (siRNAs). Os procedimentos de extração, como aqueles que usam kit QIAGEN-ALLprep também são contemplados.

[055] Em algumas realizações, o uso de microarranjo é desejável. Um microarranjo é um arranjo microscópico e ordenado de ácidos nucleicos, proteínas, moléculas pequenas, células ou outras substâncias que permitem a análise paralela de amostras bioquímicas complexas. Um microarranjo de DNA tem diferentes sondas de ácido nucleico, conhecidas como sondas de captura que estão quimicamente fixadas a um substrato sólido, que pode ser um microchip, uma lâmina de vidro ou uma microesfera. Os microarranjos podem ser usados, por exemplo, para medir os níveis de expressão de um grande número de RNAs mensageiros (mRNAs) e/ou miRNAs simultaneamente.

[056] A análise de miRNAs por microarranjo, por exemplo (embora esses procedimentos possam ser usados na forma modificada para qualquer análise de RNA), pode ser realizada de acordo com qualquer método conhecido na técnica. Em um exemplo, o RNA é extraído a partir de uma célula ou amostra de tecido, os RNAs pequenos (RNAs de 18 a 26 nucleotídeos) são selecionados por tamanho a partir do RNA total com o uso de eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. Os ligantes de oligonucleotídeos (por exemplo, “códigos de barras”) são fixados às extremidades 5’ e 3’ dos RNAs pequenos e os produtos de ligação resultantes são usados como moldes para uma reação de RT-PCR com 10 ciclos de amplificação. O primer de PCR de fita sense possui um fluoróforo fixado à sua extremidade 5’, marcando assim de forma fluorescente à fita sense do produto de PCR. O produto de PCR é desnaturado e depois hibridizado ao microarranjo. Um produto de PCR, citado como o ácido nucleico alvo, que é complementar à sequência de sonda de captura de miRNA correspondente no arranjo, irá hibridizar, através do pareamento de bases, até o ponto em que as sondas de captura estão fixadas. O ponto então apresenta fluorescência quando excitado com o uso de um varredor a laser do microarranjo. A intensidade de fluorescência de cada ponto é então avaliada em termos do número de cópias de um miRNA específico, com o uso de um número de controles positivos e negativos e métodos de normalização de dados do arranjo, o que resultará na avaliação do nível de expressão de um miRNA específico.

[057] Em um método alternativo, o RNA total contendo a pequena fração de RNA (incluindo o miRNA) extraído a partir de uma célula ou amostra de tecido é usado diretamente sem seleção por tamanho de RNAs pequenos e, marcado na extremidade 3’ com o uso de RNA ligase T4 e também um ligante de RNA curto marcado com fluorescência. As amostras de RNA são marcadas por incubação a 30°C por 2 horas, seguido de inativação por calor da RNA ligase T4 a 80°C por 5 minutos. Os miRNAs marcados com fluoróforo complementares às sequências de sonda de captura de miRNA correspondentes no arranjo irão hibridizar, através do pareamento de bases, até o ponto no qual as sondas de captura estão fixadas. A varredura do microarranjo e o processamento dos dados são realizados conforme descrito acima.

[058] Existem vários tipos de microarranjos que podem ser empregados, incluindo microarranjos de oligonucleotídeos manchados, microarranjos de oligonucleotídeos pré-fabricados e arranjos de oligonucleotídeos longos manchados. Em microarranjos de oligonucleotídeos manchados, as sondas de captura são oligonucleotídeos complementares às sequências de miRNA. Esse tipo de arranjo é tipicamente hibridizado com produtos de PCR amplificados de RNAs pequenos selecionados por tamanho de duas amostras a serem comparadas (como amostra de tecido não canceroso ou amostra de tecido canceroso) que são marcadas com dois fluoróforos diferentes. Alternativamente, o RNA total contendo a fração de RNA pequeno (incluindo os miRNAs) é extraído a partir das duas amostras e usado diretamente sem seleção por tamanho de RNAs pequenos, e a extremidade 3’ é marcada com o uso de RNA ligase T4 e ligantes de RNA curtos marcados com dois fluoróforos diferentes. As amostras podem ser misturadas e hibridizadas com um único microarranjo, que é então digitalizado, permitindo a visualização de genes de miRNA suprarregulados e infrarregulados em um ensaio.

[059] Em microarranjos de oligonucleotídeos pré-fabricados ou microarranjos de canal único, as sondas são projetadas para corresponderem às sequências de miRNAs conhecidos ou previstos. Existem projetos comercialmente disponíveis que abrangem genomas completos (por exemplo, da Affymetrix ou Agilent). Estes microarranjos dão estimativas do valor absoluto da expressão gênica e, portanto, a comparação de duas condições necessita do uso de dois microarranjos separados.

[060] Em algumas realizações, o uso de RT-PCR quantitativa é desejável. A RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) é uma modificação da reação em cadeia da polimerase usada para medir rapidamente a quantidade de um produto da reação em cadeia da polimerase. A qRT-PCR é comumente usada com o propósito de determinar se uma sequência genética, como um miR, está presente em uma amostra, e se estiver presente, o número de cópias na amostra. Qualquer método de PCR que possa determinar a expressão de uma molécula de ácido nucleico, incluindo um miRNA, está dentro do escopo da presente divulgação. Existem diversas variações do método de qRT-PCR conhecidas na técnica, três das quais são descritas abaixo.

[061] Como usado no presente pedido, o termo “cerca de” ou “aproximadamente” usualmente significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o tipo de valor e método de medição. Por exemplo, pode significar dentro de 20%, mais preferencialmente dentro de 10% e com a máxima preferência dentro de 5% de um dado valor ou faixa. Alternativamente, especialmente em sistemas biológicos, o termo “cerca de” significa dentro de cerca de um log (isto é, uma ordem de grandeza), preferencialmente dentro de um fator de dois de um dado valor.

[062] Como usado no presente pedido, “determinar o nível da expressão” ou “detectar o nível de expressão” como, por exemplo, “determinar o nível de expressão de miRNA” refere-se à quantificação da quantidade de miRNA presente em uma amostra. A detecção da expressão do miRNA específico, ou qualquer microRNA, pode ser obtida com o uso de qualquer método conhecido na técnica ou descrito no presente pedido. A detecção da expressão de miRNA inclui a detecção da expressão de uma forma madura de miRNA ou de uma forma precursora que está correlacionada com a expressão do miRNA. Tipicamente, os métodos de detecção de miRNA envolvem a detecção específica da sequência, como por RT-PCR.

[063] Como usado no presente pedido, um nível de expressão “alterado” de um miRNA em comparação ao nível de referência ou nível de controle é de pelo menos 0,5 vez (por exemplo, pelo menos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 ou 10000 vezes) de nível de expressão alterado do miRNA. Entende-se que a alteração pode ser um aumento ou uma diminuição. Alternativamente, o nível de expressão alterado é definido como um aumento no escore de probabilidade de risco com o uso de parâmetros no modelo de regressão logística, estabelecido a partir de um grupo de pacientes de treinamento, comparando-se o escore de probabilidade ao ponto de corte derivado do conjunto de treinamento.

[064] Os termos “diminuição”, “diminuído”, “reduzido”, “redução” ou “infrarregulado” são todos usados no presente pedido geralmente para significar uma diminuição por uma quantidade estatisticamente significativa. No entanto, para evitar dúvidas, “reduzido”, “redução”, “infrarregulado”, “diminuído” ou “diminuição” significam uma diminuição de pelo menos 10%, em comparação ao nível de referência, por exemplo, uma diminuição de pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70 ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou acima e incluindo uma diminuição de 100% (isto é, nível ausente em comparação a uma amostra de referência), ou qualquer diminuição entre 10 a 100% em comparação ao nível de referência, ou pelo menos cerca de 0,5 vez (por exemplo, pelo menos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 ou 10000 vezes) ou mais em comparação a um nível de referência.

[065] Os termos, “aumentado”, “aumento” ou “suprarregulado” são todos usados no presente pedido para significar em geral um aumento por uma quantidade estatisticamente significativa; para evitar qualquer dúvida, os termos “aumentado” ou “aumento” significam um aumento de pelo menos 10%, em comparação a um nível de referência, por exemplo, um aumento de pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou qualquer aumento entre 10 a 100%, em comparação a um nível de referência, ou pelo menos cerca de 0,5 vez (por exemplo, pelo menos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 ou 10000 vezes) ou mais em comparação a um nível de referência.

[066] Como usado no presente pedido, o termo “direciona seletivamente”, por exemplo, no contexto de uma sonda para detectar a expressão de miRNA, significa que o agente de direcionamento se liga especificamente ao alvo e não se liga de forma não específica a outros alvos.

[067] Ao longo do pedido e nas reivindicações anexas, deve-se entender e pretende-se entender que o uso dos termos “droga”, “medicamento”, “agente” e “agente terapêutico” são expressões intercambiáveis que definem a mesma entidade ou entidades similares. Uma “droga” refere-se em geral a um composto químico, molécula pequena ou outra composição biológica, como um composto antisense, anticorpo, inibidor de protease, hormônio, quimiocina ou citocina, capaz de induzir um efeito terapêutico ou profilático desejado quando administrada adequadamente a um sujeito.

[068] Como usado no presente pedido, “tratar” ou “tratamento” de um estado, disfunção ou condição inclui: (1) prevenir ou retardar o aparecimento de sintomas clínicos ou subclínicos do estado, disfunção ou condição que se desenvolve em um mamífero que pode ser afetado ou predisposto ao estado, disfunção ou condição, mas ainda não experimenta ou exibe sintomas clínicos ou subclínicos do estado, disfunção ou condição (por exemplo, fibrose do aloenxerto renal e/ou perda do aloenxerto); e/ou (2) inibir o estado, disfunção ou condição, isto é, interromper, reduzir ou retardar o desenvolvimento da doença ou uma recidiva desta (no caso de tratamento de manutenção) ou pelo menos um sintoma clínico ou subclínico do mesmo; e/ou (3) aliviar a doença, isto é, causar regressão do estado, disfunção ou condição ou pelo menos um dos seus sintomas clínicos ou subclínicos; e/ou (4) causar uma diminuição da gravidade de um ou mais sintomas da doença. O benefício para um sujeito a ser tratado é tanto estatisticamente significativo como pelo menos perceptível para o paciente ou para o médico.

[069] Como usado no presente pedido, o termo “inibição” da doença ou condição (por exemplo, fibrose do aloenxerto renal e/ou perda do aloenxerto) significa, por exemplo, interromper o desenvolvimento de um ou mais sintomas de uma doença em um sujeito antes deles ocorrerem ou serem detectáveis, por exemplo, pelo paciente ou pelo médico do paciente. Preferencialmente, a doença ou a condição não se desenvolve de maneira nenhuma, isto é, sintomas da doença não são detectáveis. No entanto, também pode resultar em retardo ou lentidão do desenvolvimento de um ou mais sintomas da doença. Alternativamente, ou em adição, pode resultar na diminuição da gravidade de um ou mais sintomas desenvolvidos subsequentemente.

[070] Como usado no presente pedido, “terapia de combinação”, significa o tratamento de um sujeito com necessidade de tratamento com uma determinada composição ou droga em que o sujeito é tratado ou recebe uma ou mais outras composições ou drogas para a doença em conjunto com a primeira e/ou em conjunto com uma ou mais outras terapias como, por exemplo, uma terapia imunossupressora ou outra terapia antirrejeição. Essa terapia de combinação pode ser uma terapia sequencial em que o paciente é tratado em primeiro lugar com uma modalidade de tratamento (por exemplo, droga ou terapia), e depois a outra (por exemplo, droga ou terapia) e assim por diante, ou todas as drogas e/ou terapias podem ser administrados simultaneamente. Em qualquer um dos casos, diz-se que estas drogas e/ou terapias são “coadministradas”. Deve-se entender que “coadministrada” não significa necessariamente que as drogas e/ou terapias são administradas de forma combinada (isto é, elas podem ser administradas separadamente ou juntas no mesmo local ou em locais diferentes, ao mesmo tempo ou em momentos diferentes).

[071] O termo “derivado farmaceuticamente aceitável”, como usado no presente pedido, significa qualquer sal, solvato ou pró-droga farmaceuticamente aceitável, por exemplo, éster, de um composto da invenção, que por administração ao receptor é capaz de fornecer (direta ou indiretamente) um composto da invenção, ou um metabolito ativo ou resíduo do mesmo. Esses derivados são reconhecíveis pelos técnicos no assunto, sem experimentação excessiva. No entanto, faz-se referência ao ensinamento de Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5a edição, vol. 1: Principles and Practice, que é incorporado ao presente pedido como referência à extensão do ensino desses derivados. Os derivados farmaceuticamente aceitáveis incluem sais, solvatos, ésteres, carbamatos, e/ou ésteres de fosfato.

[072] Como usado no presente pedido, os termos “terapeuticamente efetiva” e “quantidade efetiva”, usados de forma intercambiável, aplicados a uma dose ou quantidade referem-se a uma quantidade de uma composição, composto ou formulação farmacêutica que é suficiente para resultar em uma atividade desejada após a administração a um animal que dela necessite. No contexto da presente invenção, o termo terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade de uma composição, composto ou formulação farmacêutica que é suficiente para reduzir ou eliminar pelo menos um sintoma de uma doença ou condição especificada no presente pedido, por exemplo, fibrose de um aloenxerto e/ou perda do aloenxerto. Quando uma combinação de ingredientes ativos é administrada, a quantidade efetiva da combinação pode ou não incluir quantidades de cada ingrediente que teriam sido efetivos se administrados individualmente. A dosagem da formulação terapêutica irá variar, dependendo da natureza da doença ou condição, do histórico médico do paciente, da frequência de administração, do modo de administração, da depuração do agente do hospedeiro, e similares. A dose inicial pode ser maior, seguida por doses de manutenção menores. A dose pode ser administrada, por exemplo, semanalmente, quinzenalmente, diariamente, semi-semanalmente, etc., para manter um nível de dosagem efetiva.

[073] As dosagens terapeuticamente efetivas podem ser determinadas passo a passo por combinações de abordagens como (i) caracterização de doses efetivas da composição ou do composto em ensaios de cultura celular in vitro com o uso de crescimento e/ou sobrevivência de células tumorais como leitura seguida por (ii) caracterização em estudos em animais com o uso de inibição do crescimento tumoral e/ou sobrevida animal como leitura, seguida por (iii) caracterização em ensaios em humanos com o uso da fibrose diminuída e/ou rejeição diminuída do aloenxerto como leitura.

[074] Como usado no presente pedido, o termo “ácido nucleico” ou “oligonucleotídeo” refere-se a um desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo, tanto sob a forma de fita simples como dupla. O termo também engloba estruturas similares ao ácido nucleico com esqueleto sintético. Os análogos do esqueleto do DNA fornecidos pela invenção incluem fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriéster de alquila, sulfamato, 3’-tioacetal, metileno (metilimino), 3’-N-carbamato, morfolino carbamato, e ácidos nucleicos peptídicos (PNAs); consulte Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, editado por F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, Eds. Baserga e Denhardt (NYAS 1992); Milligan (1993) J. Med. Chem. 36:1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press). Os PNAs contêm esqueletos não iônicos, como unidades de glicina N-(2- aminoetila). As ligações fosforotioato são descritas no documento WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197). Outros esqueletos sintéticos englobados pelo termo incluem ligações metil-fosfonato ou ligações alternadas de metilfosfonato e fosfodiéster (Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698), e ligações benzilfosfonato (Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156). O termo ácido nucleico é usado de forma intercambiável com cDNA, cRNA, mRNA, oligonucleotídeo, sonda e produto de amplificação.

[075] Os termos “MicroRNA,” “miR” e “miRNA” são usados de forma intercambiável e, como usados no presente pedido, têm o mesmo significado que tipicamente na técnica, isto é, para um transcrito de RNA processado ou não processado que é capaz de regular a atividade de um mRNA alvo. O transcrito do gene miR não processado também é chamado de “precursor de miR”, e tipicamente compreende um transcrito de RNA com cerca de 70 a 100 nucleotídeos de comprimento. O precursor de miR pode ser processado por digestão com uma RNAseq em uma molécula de RNA ativa de 19 a 25 nucleotídeos. Esta molécula de RNA ativa de 18 a 25 nucleotídeos também é chamada de transcrito do gene miR “processado” ou miRNA “maduro”.

[076] O termo “hibridização de ácido nucleico” refere-se ao pareamento de fitas complementares de ácidos nucleicos. O mecanismo de pareamento envolve a ponte do hidrogênio, que pode ser do tipo Watson-Crick, Hoogsteen ou ponte de hidrogênio Hoogsteen reversa, entre bases de nucleosídeo ou de nucleotídeo complementares (nucleobases) das fitas de ácidos nucleicos. Por exemplo, adenina e timina são nucleobases complementares que se unem através da formação de pontes de hidrogênio. A hibridização pode ocorrer sob diversas circunstâncias. As moléculas de ácido nucleico são “hibridizáveis” umas às outras quando pelo menos uma fita de uma molécula de ácido nucleico pode formar pontes de hidrogênio com as bases complementares de outra molécula de ácido nucleico sob condições de estringência definidas. A estringência da hibridização é determinada, por exemplo, pela (i) temperatura à qual a hibridização e/ou a lavagem são realizadas, e (ii) a força iônica e (iii) a concentração de desnaturantes como a formamida das soluções de hibridização e de lavagem, bem como outros parâmetros. A hibridização necessita que as duas fitas contenham sequências substancialmente complementares. Dependendo da estringência da hibridização, contudo, pode tolerar-se algum grau de incompatibilidade. Sob condições de “baixa estringência”, uma porcentagem maior de incompatibilidade é tolerável (isto é, não impedirá a formação de um híbrido antiparalelo). Consulte Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 3a ed., Nova York e Londres: Garland Publ., 1994, capítulo 7.

[077] Tipicamente, a hibridização de duas fitas com alta estringência necessita que as sequências exibam um alto grau de complementaridade ao longo de uma porção prolongada do seu comprimento. Exemplos de condições de alta estringência incluem: hibridização com DNA ligado a filtro em NaHPO4 0,5 M, SDS 7%, EDTA 1 mM a 65°C, seguido por lavagem em SSC 0,1x / SDS 0,1% (em que SSC 1x é NaCl 0,15 M, citrato de sódio 0,15 M) a 68°C ou para inibidores de oligonucleotídeo (oligo) lavagem em SSC 6x/ pirofosfato de sódio a 0,5% a cerca de 37°C (para oligos com 14 nucleotídeos), a cerca de 48°C (para oligos com cerca de 17 nucleotídeos), a cerca de 55°C (para oligos com cerca de 20 nucleotídeos), e a cerca de 60°C (para oligos com cerca de 23 nucleotídeos).

[078] As condições de estringência intermediárias ou moderadas (como, por exemplo, uma solução aquosa de SSC 2x a 65°C; alternativamente, por exemplo, hibridização com DNA ligado a filtro em NaHPO4 0,5 M, SDS 7%, EDTA 1mM a 65°C seguido de lavagem em SSC 0,2 x / SDS 0,1% a 42°C) e baixa estringência (como, por exemplo, uma solução aquosa de SSC 2x at 55°C), necessitam correspondentemente menos complementaridade total para que a hibridização ocorra entre duas sequências. As condições de temperatura e sal específicas para qualquer reação de hibridização de estringência específica dependem da concentração da molécula de DNA ou RNA alvo e do comprimento e composição de base da sonda, e são normalmente determinadas empiricamente em experiências preliminares, que são rotineiras (consulte Southern, J. Mol. Biol. 1975; 98:503; Sambrook et al., Molecular Cloning: 9.50, CSH Laboratory Press, 1989; Ausubel et al. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, volume I, Green Publishing Associates, Inc., e John Wiley & Sons, Inc., Nova York, nas páginas 2.10.3). Um extenso guia para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado, por exemplo, em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I, capítulo 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, N.Y. (“Tijssen”).

[079] Como usado no presente pedido, o termo “condições de hibridização padrão” refere-se a condições de hibridização que permitem hibridização de duas moléculas de nucleotídeos que têm pelo menos 50% de identidade de sequência. De acordo com uma realização específica, podem ser usadas condições de hibridização de maior estringência para permitir a hibridização somente de sequências que têm pelo menos 75% de identidade de sequência, pelo menos 80% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, pelo menos 95% de identidade de sequência ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[080] Como usado no presente pedido, a frase “sob condições de hibridização” significa sob condições que facilitam a hibridização específica de um subconjunto de oligonucleotídeos de captura para sequências complementares presentes no cDNA ou cRNA. Os termos “que hibridiza especificamente”, “hibridização específica” e “que hibridiza seletivamente com”, como usados no presente pedido, referem-se à ligação, duplexação ou hibridização de uma molécula de ácido nucleico preferencialmente com uma sequência de nucleotídeos específica sob condições pelo menos moderadas de estringência e preferencialmente, condições de alta estringência, conforme discutido acima.

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

[081] A presente invenção refere-se a métodos úteis para a caracterização de (por exemplo, avaliação clínica, diagnóstico, classificação, predição, perfil) um risco do receptor de aloenxerto para desenvolver fibrose do aloenxerto e/ou perda do aloenxerto com base nos níveis ou ocorrência de certos analitos (por exemplo, miRNA).

[082] Em uma realização, é fornecido um método de diagnóstico para avaliar o receptor de aloenxerto que tem um risco maior que o normal para desenvolver fibrose do aloenxerto e/ou perda do aloenxerto, que compreende as etapas de comparação do nível de expressão de 4 marcadores de miRNA na amostra e o nível normal de expressão do marcador em um controle, por exemplo, uma amostra de um indivíduo saudável.

[083] Um nível alterado, incluindo, por exemplo, um nível significativamente alterado de expressão dos 4 marcadores de miRNA na amostra do receptor, em comparação ao nível de controle (por exemplo, normal) é uma indicação de que o paciente está em risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e/ou perda do aloenxerto.

[084] Como usado no presente pedido, os níveis referem-se à quantidade ou concentração de um analito em uma amostra (por exemplo, uma amostra de plasma ou de soro) ou sujeito. Enquanto que ocorrência refere-se à presença ou ausência de um analito detectável em uma amostra. Dessa forma, o nível é um indicador contínuo de quantidade, enquanto que a ocorrência é um indicador binário de um analito. Em alguns casos, uma ocorrência pode ser determinada com o uso de um nível de limiar acima do qual um biomarcador está presente e abaixo do qual um biomarcador está ausente.

[085] Os marcadores de miRNA descritos no presente pedido são particularmente úteis para caracterizar (por exemplo, avaliar ou analisar) o risco de um receptor de aloenxerto para desenvolver fibrose do aloenxerto e/ou perda do aloenxerto. Além disso, os métodos descritos no presente pedido são úteis para diagnosticar o risco de um receptor de aloenxerto para desenvolver fibrose do aloenxerto e/ou perda do aloenxerto. Como usado no presente pedido, o diagnóstico inclui tanto o diagnóstico como o auxílio ao diagnóstico. Dessa forma, outros critérios diagnósticos podem ser avaliados em conjunto com os resultados dos métodos para se fazer um diagnóstico.

[086] De acordo com algumas realizações, o método compreende a determinação do nível de expressão (isto é, determinar o nível, medir a quantidade, medir o nível) de cada (isto é, todos) do miRNA, dentro de um painel de moléculas de miRNA (por exemplo, hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir- 302b-3p e hsa-mir-192-5p).

[087] Os níveis dos analitos para um sujeito podem ser obtidos por qualquer método reconhecido na técnica. Tipicamente, o nível é determinado medindo o nível do metabolito em um fluido corporal (amostra clínica), por exemplo, sangue, soro ou plasma. O nível pode ser determinado por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), PCR quantitativa (qPCR) ou microarranjo, ou outras técnicas conhecidas para determinar a presença e/ou quantidade de miRNA.

[088] Em alguns casos, os métodos divulgados no presente pedido, envolvem a comparação dos níveis de expressão ou ocorrências com uma referência. A referência pode assumir uma variedade de formas. Em alguns casos, a referência compreende valores predeterminados para a pluralidade de miRNA (por exemplo, cada uma das pluralidades de miRNA). O valor predeterminado pode assumir uma variedade de formas. Pode ser um nível ou ocorrência de um analito obtido a partir de um receptor de aloenxerto diagnosticado anteriormente como estando em risco para fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto ou obtido a partir de um receptor de aloenxerto que não se encontra em risco para fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto (por exemplo, um sujeito assintomático). Pode ser um nível ou ocorrência obtido de um sujeito que não tenha recebido um aloenxerto renal. Pode ser um nível ou ocorrência no mesmo receptor, por exemplo, em um ponto no tempo diferente. Um valor predeterminado que representa um ou mais níveis de um analito é citado no presente pedido como um nível predeterminado. Um nível predeterminado pode ser um valor de corte único, como uma mediana ou média. Pode ser uma faixa de valores de corte (ou de limiar), como um intervalo de confiança. Pode ser estabelecido com base em grupos comparativos, como os quais onde o risco em um grupo definido é uma razão maior, ou menor (por exemplo, aproximadamente 2 vezes, 4 vezes, 8 vezes, 16 vezes ou mais) do que o risco em outro grupo definido. Pode ser uma faixa, por exemplo, onde uma população de sujeitos (por exemplo, sujeitos de controle) é dividida igualmente (ou desigualmente) em grupos, como um grupo de baixo risco, um grupo de risco médio e um grupo de alto risco, ou em quartis, sendo o menor quartil os sujeitos com menor risco e o quartil mais alto sendo os sujeitos com maior risco, ou em n-quantil (isto é, n intervalos regularmente espaçados), sendo o menor n-quantil os sujeitos com menor risco e o maior quantil sendo os sujeitos com maior risco. Além disso, a referência pode ser uma referência calculada, mais preferencialmente a média ou mediana, para a quantidade relativa ou absoluta de um analito de uma população de indivíduos que compreende o sujeito a ser investigado. As quantidades absolutas ou relativas dos analitos dos ditos indivíduos da população podem ser determinadas conforme especificado em outra parte no presente pedido. Como calcular um valor de referência adequado, preferencialmente a média ou mediana, é bem conhecido na técnica. A população de sujeitos referidos antes deve compreender uma pluralidade de sujeitos, preferencialmente, pelo menos 5, 10, 50, 100, 1000 sujeitos. Deve-se entender que o sujeito a ser diagnosticado pelo método da presente invenção e os sujeitos da dita pluralidade de sujeitos são da mesma espécie.

[089] Os sujeitos associados a valores predeterminados são tipicamente citados como sujeitos controle (ou controles). Um sujeito de controle pode ou não ter recebido um aloenxerto renal. Em alguns casos, pode ser desejável que o sujeito de controle seja um sujeito sintomático e, em outros casos, pode ser desejável que um sujeito de controle seja um sujeito assintomático.

[090] Em alguns métodos do presente pedido, é desejável detectar e quantificar os RNAs, incluindo os miRNAs, presentes em uma amostra. A detecção e a quantificação da expressão de RNA podem ser obtidas por qualquer um de uma série de métodos bem conhecidos na técnica. Com o uso das sequências conhecidas para membros da família de miRNA, sondas e primers específicos podem ser projetados para uso nos métodos de detecção descritos abaixo conforme apropriado.

[091] Em alguns casos, a detecção e a quantificação da expressão de RNA necessitam do isolamento do ácido nucleico a partir de uma amostra, como uma célula ou amostra de tecido. Os ácidos nucleicos, incluindo RNA e especificamente miRNA, podem ser isolados com o uso de qualquer técnica adequada conhecida na técnica. Por exemplo, a extração à base de fenol é um método comum para isolamento de RNA. Os reagentes à base de fenol contêm uma combinação de desnaturantes e inibidores de RNase para a ruptura de células e tecidos e subsequente separação de RNA dos contaminantes. Os procedimentos de isolamento baseados em fenol podem recuperar espécies de RNA na faixa de 10 a 200 nucleotídeos (por exemplo, miRNAs precursores e maduros, RNA ribossômico 5S e 5,8S (rRNA) e RNA pequeno nuclear U1 (snRNA)). Além disso, procedimentos de extração, como os que usam TRIZOL™ ou TRI REAGENT™, irão purificar todos os RNAs, grandes e pequenos, e são métodos eficientes para o isolamento de RNA total de amostras biológicas que contêm miRNAs e pequenos RNAs de interferência (siRNAs). Os procedimentos de extração, como aqueles que usam kit QIAGEN-ALLprep também são contemplados.

[092] Um nível, em algumas realizações, pode ele próprio ser um nível relativo que reflete uma comparação de níveis entre dois estados. Os níveis relativos que refletem uma comparação (por exemplo, razão, diferença, diferença logarítmica, variação percentual, etc.) entre dois estados (por exemplo, saudáveis e doentes) podem ser citados como valores delta. O uso de níveis relativos é benéfico em alguns casos porque, até certo ponto, eles excluem variações relacionadas às medições (por exemplo, pessoal de laboratório, laboratórios, dispositivos de medição, lotes/preparações de reagentes, kits de ensaio, etc.). No entanto, a invenção não é tão limitada.

[093] Os níveis de expressão e/ou os níveis de expressão de referência podem ser armazenados em um meio de armazenamento de dados apropriado (por exemplo, um banco de dados) e, dessa forma, também estão disponíveis para diagnósticos futuros. Isso também permite diagnosticar de forma eficiente a prevalência de uma doença, porque os resultados de referência adequados podem ser identificados no banco de dados, desde que tenham sido confirmados (no futuro) que o sujeito a partir do qual a amostra de referência correspondente foi obtida, desenvolveu fibrose do aloenxerto e/ou sofreu rejeição do aloenxerto. Como usado no presente pedido, um “banco de dados” compreende dados coletados (por exemplo, informação de analito e/ou de nível de referência e/ou informação do paciente) em um meio de armazenamento adequado. Além disso, o banco de dados pode compreender ainda um sistema de gerenciamento de banco de dados. O sistema de gerenciamento de banco de dados é, preferencialmente, um sistema de gerenciamento de banco de dados hierárquico baseado em rede ou um sistema de gerenciamento de banco de dados baseado em objeto. Mais preferencialmente, o banco de dados será implementado como um sistema distribuído (federal), e como um Sistema Cliente-Servidor. Mais preferencialmente, o banco de dados é estruturado de modo a permitir que um algoritmo de pesquisa compare um conjunto de dados de teste com os conjuntos de dados compreendidos pela coleção de dados. Especificamente, com o uso desse algoritmo, o banco de dados pode ser pesquisado para conjuntos de dados similares ou idênticos que são indicativos de risco de rejeição do aloenxerto renal. Dessa forma, se um conjunto de dados idênticos ou similares puder ser identificado na coleta de dados, o conjunto de dados de teste será associado com o risco de rejeição do aloenxerto renal. Consequentemente, a informação obtida a partir da coleção de dados pode ser usada para diagnosticar o risco de um receptor de aloenxerto para desenvolver fibrose do aloenxerto e/ou perda do aloenxerto ou com base em um conjunto de dados de teste obtido de um sujeito. Mais preferencialmente, a coleção de dados compreende valores característicos de todos os analitos compreendidos por qualquer um dos grupos referidos acima.

[094] Também são fornecidos bancos de dados de expressão gênica/assinatura proteica de diferentes categorias de transplantes, por exemplo, AR, STA, NS e similares. A expressão gênica/assinatura proteica e os bancos de dados dos mesmos podem ser fornecidos em uma variedade de meios para facilitar o seu uso (por exemplo, em um formato acessível/legível ao usuário). “Mídia” refere-se a uma fabricação que contém as informações de perfil de expressão da presente invenção. Os bancos de dados da presente invenção podem ser gravados em meio legível por computador, por exemplo, qualquer meio que possa ser lido e acessado diretamente por um usuário que utiliza um computador. Esses meios incluem, mas não se limitam a: meios de armazenamento magnéticos, como discos flexíveis, meio de armazenamento de disco rígido e fita magnética; meios de armazenamento ópticos, como CD-ROM; meios de armazenamento elétricos, como RAM e ROM; e híbridos destas categorias, como meios de armazenamento magnéticos/ópticos. Um técnico no assunto pode facilmente apreciar o modo como qualquer meio legível por computador atualmente conhecido pode ser usado para criar uma fabricação que compreende um registro da informação de banco de dados atual. “Gravado” refere-se a um processo para armazenar informação em um meio legível por computador, com o uso de qualquer um dos métodos conhecidos na técnica. Qualquer estrutura de armazenamento de dados conveniente pode ser escolhida, com base nos meios usados para acessar a informação armazenada. Uma variedade de programas e formatos de processador de dados pode ser usada para armazenamento, por exemplo, arquivo de processamento de texto, formato de banco de dados, etc. Dessa forma, os bancos de dados do perfil de expressão do sujeito são acessíveis por um usuário, isto é, os arquivos de bancos de dados são salvos em formato legível para o usuário (por exemplo, um formato legível por computador, no qual um usuário controla o computador).

[095] Em um aspecto, os métodos divulgados no presente pedido compreendem diagnosticar o risco do receptor que inclui calcular o risco do receptor aplicando os níveis de expressão determinados na amostra do receptor para um modelo de ajuste de regressão logística penalizada. Em algumas realizações, o modelo de ajuste de regressão logística penalizada a partir do qual o risco será calculado utiliza a fórmula: log^h = β*o+β*igi+ β*igi+....+ β*4g4 1 P(X)

[096] onde p(x) é a probabilidade de desenvolver fibrose, β*i é o coeficiente de penalização e gi é o valor de expressão de miRNA i. O modelo de ajuste de regressão logística penalizada pode ser usado para computar um escore de probabilidade que representa o risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. O escore de probabilidade pode ser determinado com o uso de um sistema baseado em computador. Em alguns aspectos, o escore de probabilidade é usado para determinar o valor de corte.

[097] Como usado no presente pedido, um “sistema baseado em computador” refere-se aos meios de hardware, meios de programa de computação e meios de armazenamento de dados usados para analisar as informações da presente invenção. O hardware mínimo dos sistemas baseados em computador da presente invenção compreende uma unidade de processamento central (CPU), meios de entrada, meios de saída e meios de armazenamento de dados. Um técnico no assunto pode facilmente compreender que qualquer um dos sistemas baseados em computador atualmente disponíveis é adequado para uso na presente invenção. Os meios de armazenamento de dados podem compreender qualquer fabricação compreendendo um registro da presente informação conforme descrito acima, ou um meio de acesso à memória que pode acessar essa fabricação.

[098] Uma variedade de formatos estruturais para os meios de entrada e de saída pode ser usada para introduzir e emitir a informação nos sistemas baseados em computador da presente invenção, por exemplo, para e a partir de um usuário. Um formato para um meio de saída classifica os perfis de expressão que possui diferentes graus de similaridade com um perfil de expressão de referência. Essa apresentação fornece a um técnico no assunto uma classificação de similaridades e identifica o grau de similaridade contido no perfil de expressão de teste.

[099] Em uma realização típica, um laboratório clínico obterá o valor de expressão com o uso da amostra do paciente e enviará ao médico do paciente. O médico comunicará então esse valor ao seu provedor de serviços baseado na web. O provedor de serviços introduzirá esse valor no sistema de bioinformática que já tem a coeficiência penalizada para cada gene do conjunto de genes pré-selecionado e o corte do modelo de regressão logística do conjunto de treino. O sistema de bioinformática usará esta informação para calcular o escore de probabilidade para o paciente. O escore calculado irá refletir o estado de risco do paciente.

[100] A invenção fornece ainda a comunicação de resultados de ensaio ou diagnósticos ou ambos a técnicos, médicos ou pacientes, por exemplo. Em certas realizações, os computadores serão usados para comunicar os resultados do ensaio ou diagnósticos ou ambos às partes interessadas, por exemplo, médicos e seus pacientes.

[101] Em algumas realizações, o método divulgado no presente pedido compreende ainda a modificação do registro clínico do receptor para identificar o receptor como sendo de risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e/ou perda do aloenxerto. O registro clínico pode ser armazenado em qualquer meio de armazenamento de dados adequado (por exemplo, um meio legível por computador).

[102] Em algumas realizações da invenção, um diagnóstico baseado nos métodos fornecidos no presente pedido é comunicado ao receptor de aloenxerto o mais rapidamente possível após a obtenção do diagnóstico. O diagnóstico pode ser comunicado ao receptor pelo médico assistente do receptor. Alternativamente, o diagnóstico pode ser enviado para um destinatário por e-mail ou comunicado ao sujeito por telefone. O diagnóstico pode ser enviado para um destinatário sob a forma de um relatório. Um computador pode ser usado para comunicar o diagnóstico por e-mail ou telefone. Em certas realizações, a mensagem contendo resultados de um teste de diagnóstico pode ser gerada e entregue automaticamente ao destinatário com o uso de uma combinação de hardware e programa de computador que será familiar para os técnicos especializados em telecomunicações.

[103] Os aspectos da presente invenção incluem produtos de programas de computador para identificar um sujeito que sofreu um aloenxerto renal e está em risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, em que o produto de programa de computador, quando carregado num computador, está configurado para empregar um resultado de expressão de miRNA a partir de uma amostra derivada do sujeito para determinar se um sujeito que sofreu um aloenxerto renal está em risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto em que o resultado de expressão genética compreende dados de expressão pelo menos para 4 painéis de miRNA fornecidos no presente pedido.

[104] São também fornecidos perfis de expressão de referência para um fenótipo que é um dentre: (a) baixo risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto; ou (b) risco elevado para o desenvolvimento de fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto; em que o perfil de expressão é registrado em um meio legível por computador que é acessível para um usuário, por exemplo, em um formato legível pelo usuário. Em certas realizações, inclui o perfil de expressão. Em certas realizações, o perfil de expressão é um perfil para um fenótipo que é de baixo risco. Em certas realizações, o perfil de expressão é um perfil para um fenótipo que é de alto risco.

[105] A invenção também pode fornecer kits para avaliar os níveis de expressão de miRNA em um sujeito (por exemplo, um receptor de aloenxerto renal). Os kits da invenção podem assumir uma variedade de formas. Tipicamente, os kits incluirão reagentes adequados para determinar os níveis de expressão de miRNA (por exemplo, os divulgados no presente pedido) em uma amostra. Opcionalmente, os kits podem conter uma ou mais amostras de controle. Além disso, os kits, em alguns casos, incluirão informação escrita (indícios) fornecendo uma referência (por exemplo, valores predeterminados), em que uma comparação entre os níveis de expressão de miRNA no sujeito e a referência (valores predeterminados) é indicativa de um estado clínico.

[106] Em alguns casos, os kits compreendem um programa de computação útil para comparar os níveis de expressão de miRNA ou ocorrências com uma referência (por exemplo, um modelo de predição). Normalmente, o programa de computação será fornecido em um formato legível por computador, como um disco compacto, mas também pode estar disponível para download pela Internet. No entanto, os kits não são tão limitados e outras variações serão aparentes para um técnico no assunto. Os presentes métodos também podem ser usados para a seleção de um tratamento e/ou determinação de um plano de tratamento para um sujeito, com base na ocorrência ou níveis de miRNA (por exemplo, os divulgados no presente pedido). Em algumas realizações, com o uso dos métodos divulgados no presente pedido, um prestador de cuidados de saúde (por exemplo, um médico) identifica um receptor como tendo risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e/ou perda do aloenxerto e, com base nesta identificação, o prestador de cuidados de saúde determina um plano de gerenciamento adequado para o sujeito. Em algumas formas de realização, com o uso do método divulgado no presente pedido, um prestador de cuidados de saúde (por exemplo, um médico) diagnostica um receptor como sendo de risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e/ou perda do aloenxerto com base na ocorrência ou níveis de determinado miRNA em uma amostra clínica obtida a partir do sujeito, e/ou com base em uma classificação de uma amostra clínica obtida a partir do sujeito. Por meio deste diagnóstico, o prestador de cuidados de saúde determina um tratamento ou plano de tratamento adequado para o sujeito, conforme descrito no presente pedido. Em algumas realizações, os métodos incluem ainda a administração do tratamento ao sujeito.

[107] Um procedimento exemplar que descreve a aplicação de um painel de 4 miRNAs, conforme descrito no presente pedido para o diagnóstico do risco de um receptor de aloenxerto renal para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto é fornecido da seguinte forma: 1) Seleção do grupo de treinamento: Um grupo de pacientes com transplante de rim com risco elevado e baixo de casos (Número total N = aproximadamente100) será cuidadosamente selecionado. O grupo de treinamento deve ter indicações demográficas e clínicas bem caracterizadas, que tenham sido revisadas por pelo menos dois patologistas. 2) Medição da expressão de 4 miRNAs: Os níveis de expressão de 4 miRNAs da amostra de sangue pós-transplante de cada paciente no grupo de treinamento serão medidos por Microarranjo, RT-PCR ou tecnologia Nanostring. O uso dessas técnicas é descrito nos exemplos abaixo. 3) Estabelecimento do modelo de regressão e corte: Um modelo de ajuste de regressão logística penalizado com o uso do pacote logistf R será então aplicado em valores de expressão de 4 miRNAs para derivar o modelo estatístico a partir do qual o valor de β* será derivado para cada miRNA e o escore de probabilidade de rejeição aguda para cada paciente será calculado. log^h = β*o+β*igi+ β*igi+....+ β*4g4 1 P(X)

[108] onde p(x) é a probabilidade de desenvolver fibrose, β*i é o coeficiente de penalização e gi é o valor de expressão de miRNA i.

[109] Com base no escore de probabilidade, as estatísticas de predição, como a predição AUC (área abaixo da curva), de curva de ROC (característica de operação de recepção) de taxa de verdadeiro positivo contra falso positivo, sensibilidade/especificidade, os valores positivos (PPV) e valores preditivos negativos (NPV) serão determinados. Com uma especificidade determinada (90%), será estabelecido um escore de probabilidade de corte que melhor prediz o desenvolvimento da fibrose. Isto pode ser um corte claro em dois grupos em que, se eles estão no grupo superior, eles têm uma alta probabilidade de desenvolver fibrose e o teste é determinado como sendo positivo, mas se eles estão no grupo inferior, eles têm uma probabilidade muito baixa de desenvolvimento de fibrose e o teste é determinado como sendo negativo. A alternativa é que os pacientes podem ser quebrados em tercis com base em seus escores de probabilidade determinados conforme acima. Neste caso, se os pacientes estiverem (1) no tercil superior, têm uma alta probabilidade de desenvolver fibrose e o teste é determinado como positivo; (2) se estiverem no segundo tercil ou grupo intermediário, o seu risco não pode ser determinado com precisão; e (3) se eles estiverem no tercil inferior, têm uma probabilidade muito baixa de desenvolver fibrose e o teste é determinado como sendo negativo.

[110] O coeficiente (valor β*) e o corte derivado do grupo de treino serão introduzidos e armazenados em um sistema de bioinformática baseado na web que pode ser acessado a partir do laboratório clínico/consultório médico através da Internet. 4) Critérios de diagnóstico: Para um novo paciente, os níveis de expressão do conjunto de 4 miRNA serão medidos pela mesma tecnologia como usada para o conjunto de treinamento no laboratório clínico. Com o uso de um sistema de bioinformática baseado na web, o escore de probabilidade será calculado resumindo o valor de expressão (gi) de miRNA multiplicado pelos seus valores de βi que são derivados do conjunto de treinamento, e o escore de probabilidade será comparado com o ponto de corte para determinar a probabilidade de desenvolvimento de fibrose. O resultado clínico enviará os resultados dos testes ao médico, onde se o resultado da amostra estiver acima do nosso limite de alta probabilidade de fibrose o teste será relatado como positivo, e se estiver abaixo do nosso limite de baixa probabilidade de fibrose será relatado como negativo. 5) Tratamento: Se os testes indicarem que o paciente apresenta um risco elevado para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, pode ser tratado, por exemplo, e sem limitação, pela administração ao receptor de aloenxerto de uma droga antifibrose para o receptor de aloenxerto ou imunossupressão de troca. MÉTODOS DE TRATAMENTO

[111] Em algumas realizações da divulgação, os métodos divulgados no presente pedido incluem tratar o receptor de aloenxerto para inibir a fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto (rejeição), se o receptor de aloenxerto foi diagnosticado como sendo de risco (por exemplo, de alto risco) para fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. Os métodos para determinar se um paciente é de alto risco e se deve ser tratado com uma intervenção, estão descritos acima.

[112] Em algumas realizações, o tratamento inclui a modificação do regime de imunossupressão do receptor de aloenxerto, como, por exemplo, por administração, descontinuação da administração ou ajuste da dosagem de um ou mais drogas imunossupressoras, incluindo, por exemplo, uma ou mais drogas antirrejeição.

[113] Em algumas realizações, o tratamento inclui administrar ao receptor de aloenxerto uma droga antirrejeição para o receptor de aloenxerto. Os receptores de aloenxerto identificados como sendo de alto risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto podem ser tratados, por exemplo, e sem limitação, pela administração de drogas imunossupressoras. A imunossupressão pode ser obtida com muitas drogas diferentes, incluindo esteroides, anticorpos direcionados e CNIs, como tacrolimo. Exemplos não limitantes incluem, por exemplo, um inibidor da calcineurina (CNI), como ciclosporina ou tacrolimo, ou uma droga imunossupressora menos fibrogênica, como micofenolato de mofetila (MMF) ou sirolimus. A principal classe de imunossupressores são os inibidores da calcineurina (CNIs), que inclui tacrolimo (Prograf® e Advagraf® / Astagraf XL (Astellas Pharma Inc.) e genéricos de Prograf®) e ciclosporina (Neoral® e Sandimmune® (Novartis AG) e genéricos). Os esteroides, como a prednisona, também podem ser administrados para tratar pacientes com risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. Os agentes antiproliferativos, como o micofenolato de mofetila, o micofenolato de sódio e a azatioprina também são úteis nestes tratamentos. Destes, o tacrolimo é um dos mais potentes em termos de suprimir o sistema imune. A droga antirrejeição Belatacept (Bristol Myers Squibb) também pode ser empregada para o tratamento de pacientes com risco de rejeição ou fibrose.

[114] Os receptores de aloenxerto identificados como sendo de risco elevado para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto podem ser tratados, por exemplo, e sem limitação, pelo tratamento do receptor de aloenxerto com uma droga antifibrose ou por modificação do regime de imunossupressão dos receptores de aloenxerto. Dessa forma, o tratamento do receptor de aloenxerto pode incluir a administração, a interrupção da administração ou o ajuste da dosagem de uma ou mais drogas antifibrose. Em alguns aspectos, a droga antifibrose pode incluir agentes antifibróticos como, por exemplo, pirfenidona, relaxina, proteína morfogenética óssea 7 (BMP-7) e fator de crescimento hepático 6 (HGF).

[115] A administração de um inibidor da enzima de conversão da angiotensina (ACEI), como o lisinopril ou bloqueadores do receptor da angiotensina II, como losartan, a estes pacientes também está dentro do escopo da presente divulgação.

[116] Em alguns aspectos, o método inclui a troca da imunossupressão por um inibidor de calcineurina para uma droga que não está associada com o desenvolvimento de fibrose, como a droga antirrejeição Belatacept, rapamicina ou Micofenolato de Mofetila.

[117] A administração de um inibidor da enzima de conversão da angiotensina (ACEI), como o lisinopril ou bloqueadores do receptor da angiotensina II, como losartan, a estes pacientes também está dentro do escopo da presente divulgação. KITS

[118] Em certas realizações, são fornecidos kits para determinar o risco de um receptor de aloenxerto renal para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto. Em um exemplo não limitante, os reagentes de isolamento de miRNA, marcação de miRNA e/ou avaliação de uma população de miRNA com o uso de uma matriz estão incluídos em um kit. O kit pode ainda incluir reagentes para criar ou sintetizar sondas de miRNA. Os kits compreenderão, dessa forma, em meios de recipientes adequados, uma enzima para marcar o miRNA por incorporação de nucleotídeos marcados ou nucleotídeos não marcados que são subsequentemente marcados. Pode também incluir um ou mais tampões, como tampão de reação, tampão de marcação, tampão de lavagem, ou um tampão de hibridização, compostos para preparar as sondas de miRNA e componentes para isolar miRNA. Outros kits podem incluir componentes para preparar um arranjo de ácido nucleico que compreende oligonucleotídeos complementares aos miRNAs e, assim, podem incluir, por exemplo, um suporte sólido.

[119] Para qualquer realização de kit, incluindo uma matriz, podem existir moléculas de ácido nucleico que contêm uma sequência que é idêntica ou complementar a todas ou parte de qualquer uma das sequências do presente pedido.

[120] Os kits acima podem incluir sondas de “código de barras” que hibridizam especificamente com um ou mais de hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p (por exemplo, para uso em análise Nanostring). Os kits podem ainda conter um ou mais reagentes de extração de miRNA e/ou reagentes de anelamento.

[121] Em algumas realizações, os kits conterão os primers para amplificação de um miRNA selecionado do grupo que consiste em hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p, e hsa-mir-192-5p; e opcionalmente compreendendo primers para amplificação de sequências de controle, como, por exemplo, primers para amplificar a actina beta (ACTB) e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), RNA ribossômico 18S (para ensaios de qPCR), e fragmentos dos mesmos.

[122] Em outra realização, um kit pode conter um inibidor de miRNA (por exemplo, direcionado a um miRNA que é suprarregulado em receptores do aloenxerto com alto risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto (por exemplo, hsa-miR-128, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-151a-5p, hsa- miR-30c-5p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-378e, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR- 23b-3p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-26a- 5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-361-5p, e hsa-miR-22-3p)).

[123] Os kits, independentemente do tipo, compreenderão geralmente um ou mais recipientes nos quais os agentes biológicos são colocados e, preferencialmente, adequadamente aliquotados. Os componentes dos kits podem ser embalados tanto em meios aquosos como sob a forma liofilizada. Os kits também podem compreender um ou mais excipientes, diluentes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos não limitantes de excipientes, diluentes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem água livre de RNase, água destilada, água tamponada, solução salina fisiológica, PBS, solução de Ringer, solução de dextrose, tampões de reação, tampões de marcação, tampões de lavagem e tampões de hibridização.

[124] O kit também pode incluir instruções para empregar os componentes do kit, bem como o uso de qualquer outro reagente não incluído no kit. As instruções podem incluir variações que podem ser implementadas. É contemplado que esses reagentes são realizações dos kits da invenção. Além disso, os kits não se limitam aos itens particulares identificados acima e podem incluir qualquer reagente usado para a manipulação ou caracterização de miRNA.

[125] Também é contemplado que qualquer kit, arranjo ou outra técnica ou ferramenta de detecção, ou qualquer método pode envolver o perfilamento para qualquer um destes miRNAs. Também é contemplado que qualquer realização discutida no contexto de um arranjo de miRNA pode ser implementada com ou sem o formato de arranjo nos métodos da invenção; em outras palavras, qualquer miRNA em um arranjo de miRNA pode ser triado ou avaliado em qualquer método da invenção de acordo com quaisquer técnicas conhecidas pelos técnicos no assunto. O formato de arranjo não é necessário para que os métodos de triagem e diagnóstico sejam implementados.

[126] Os kits contemplados no presente pedido podem conter ainda um ou mais reagentes de extração de mRNA e/ou reagentes para a síntese de cDNA.

[127] Os kits para uso de arranjos de miRNA para aplicações terapêuticas, de prognóstico ou de diagnóstico e esses usos são contemplados. Os kits podem incluir um arranjo de miRNA, bem como informações sobre um perfil de miRNA padrão ou normalizado para o miRNAs no arranjo. Além disso, em certas realizações, o RNA ou DNA de controle podem ser incluídos no kit. O RNA de controle pode ser um miRNA que pode ser usado como um controle positivo para marcação e/ou análise de arranjo. ENSAIO NANOSTRING O KIT PARA O ENSAIO NANOSTRING INCLUIRÁ 1) Custom CodeSet (conjuntos de sondas com “códigos de barras” para o painel de 4 miRNAs incluindo 3 miRNAs housekeeping e controles negativos fornecidos por Nanostring) 2) Kit nCounter® incluindo nCounter Cartridge, nCounter Plate Pack e nCounter Prep Pack 3) Todo o kit preparatório (kit QIAGEN-ALLprep, Valencia, CA EUA) EXPERIMENTOS NANOSTRING

[128] O RNA total será extraído com o uso do kit All prep (kit QIAGEN-ALLprep, Valencia, CA EUA) seguindo o protocolo dos fabricantes; as sondas de “código de barras” serão aneladas ao RNA total em solução a 65°C com o kit mestre. A sonda de captura irá capturar o alvo a ser imobilizado para dados. Após a hibridização, a amostra será transferida para a nCounter Pre Station e a sonda/alvo será imobilizada no nCouter Cartridge e as sondas serão então contadas pelo nCounter Digital Analyzer. ANÁLISE DOS DADOS DE TRANSCRIPTOMAS DOS MIRNAS

[129] Os dados de contagem bruta do analisador Nanostring serão processados no seguinte procedimento: os dados de contagem bruta serão primeiro normalizados para a contagem do miRNA housekeeping e dos miRNAs com contagens inferiores à mediana mais 3 desvios padrões das contagens de controles negativos serão filtradas. Devido à variação de dados resultante do lote de reagentes, a contagem para cada mRNA de lotes de reagentes diferentes será calibrada multiplicando um fator da razão das contagens médias das amostras em lotes de reagentes diferentes. As contagens calibradas de diferentes lotes experimentais serão adicionalmente ajustadas pelo pacote ComBat. ENSAIO DE QPCR OU ENSAIO DE ARRANJO DE QPCR O KIT PARA O ENSAIO DE QPCR INCLUI: 1) Recipiente de primer (8 tubos com um ensaio de qPCR por tubo para o painel de 4 miRNA e 3 miRNAs referência e as sondas de controle de RNA 5s). Os ensaios serão encomendados da LifeTech, ou arranjos de qPCR depositados com ensaios de qPCR em poços de uma placa de 96poços 2) NCode™ VILO™ miRNA cDNA Synthesis 3) TaqMan® ARRAY 96-WELL PLATE 6x16 4) NCode™ EXPRESS SYBR® GreenER™ miRNA qRT- PCR Kits

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE DE DADOS

[130] O RNA total será extraído de amostras de biópsia do aloenxerto com o uso do kit All prep (QIAGEN-ALLprep kit, Valencia, CA EUA). O cDNA será sintetizado com o uso de NCode™ VILO™ miRNA cDNA Synthesis (LifeTech). Os ensaios de qPCR de TaqMan para os 4 miRNAs, 3 miRNAs de referência e rRNA 5s serão adquiridos junto à ABI Life Technology (Grand Island, NY). Os experimentos de qPCR serão realizadas em cDNA com o uso dos kits NCode™ EXPRESS SYBR® GreenER™ miRNA qRT-PCR (LifeTech) e as reações de PCR serão monitoradas e adquiridas com o uso de um sistema ABI7900HT. As amostras serão medidas em triplicata. Os valores de tempo de ciclo (CT) para o conjunto de miRNA de predição bem como os 3 de referências serão gerados. O valor de ΔCT de cada miRNA será computado subtraindo o valor médio de CT para o miRNA de referência do valor CT de cada miRNA.

[131] De acordo com a presente invenção, podem ser empregadas biologia molecular convencional, microbiologia, DNA recombinante, imunologia, biologia celular e outras técnicas relacionadas dentro da especialidade da técnica. Consulte, por exemplo, Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley e Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Bonifacino et al., eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley e Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coico et al., eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Enna et al., eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Hames et al., eds. (1999) Protein Expression: A Practical Approach. Oxford University Press: Oxford; Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4a ed. Wiley-Liss; entre outras. Os protocolos atuais listados acima são atualizados várias vezes a cada ano.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 MÉTODOS E MATERIAIS EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL

[132] O RNA total foi extraído de amostras de sangue obtidas 3 meses após o transplante com o uso do kit All prep (QIAGEN-ALLprep kit, Valencia, CA EUA). A qualidade do RNA foi avaliada com o uso do Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies).

SEQUENCIAMENTO DE RNA

[133] O RNA total de amostras de sangue de 96 receptores, 3 meses após o transplante, foi extraído com o uso de Trizol, e a qualidade do RNA foi avaliada pelo Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). As bibliotecas foram geradas seguindo o protocolo do fabricante e foram sequenciadas no sequenciador Illumina HisSeq2000. Resumidamente, o mRNA foi extraído de 2 μg de RNA total com o uso de microesferas magnéticas oligo-dT e fragmentado a alta temperatura. Uma biblioteca de cDNA foi então preparada a partir do mRNA fragmentado por transcrição reversa, síntese da segunda fita e ligação de adaptadores específicos. O sequenciamento de nova geração foi realizado em llumina Hiseq 2000 com 51 ciclos de terminações únicas. As análises de imagem e nomenclatura das bases foram realizadas em tempo real pelo Illumina analysis pipeline.

[134] Os dados de RNAseq brutos foram processados de acordo com o seguinte procedimento: As leituras com boa qualidade foram inicialmente alinhadas com várias bases de dados de referência humanas incluindo o genoma humano hg19, o éxon, a junção de splicing e o banco de dados de contaminação incluindo sequências de RNA ribossômicos e mitocondriais com o uso do algoritmo de alinhamento BWA. Após a filtragem das leituras mapeadas para o banco de dados de contaminação, as leituras que estão unicamente alinhadas com o éxon sítios de junção de splicing com no máximo 2 incompatibilidades para cada transcrito, foram então contadas como nível de expressão para o transcrito correspondente e ainda submetidas à normalização de quantil de amostras cruzadas após a transformação log2.

EXPERIMENTOS NANOSTRING

[135] O perfil do miRNA de amostras de sangue de 102 pacientes com transplante foi realizado com Nanostring seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, o ensaio de expressão de microRNA humano V2 Nanostring nCounter em 800 miRNAs humanos (tecnologia Nanostring) foi usado para anelar 100ng de miRNAs de entrada em sondas de código de barras alvo específicas. A amostra foi imobilizada em um nCounter Cartridge com o uso de nCounter Prep Station e as sondas foram contadas pelo nCounter Digital Analyzer.

ANÁLISE DOS DADOS DE TRANSCRIPTOMA DE MICRORNA

[136] Os dados de contagem bruta do analisador Nanostring foram processados no seguinte procedimento (consulte Figura 1). Os dados da contagem bruta foram normalizados para os 100 microRNAs (miRNAs) expressos, e os miRNAs com contagens inferiores à mediana mais 3 desvios padrão das contagens de controles negativos foram excluídos. Devido à variação de dados resultante do lote de reagentes, a contagem para cada miRNA de lotes de reagentes diferentes foi calibrada multiplicando um fator da razão das contagens médias das amostras em lotes de reagentes diferentes. As contagens calibradas de diferentes lotes experimentais foram ainda ajustadas pelo pacote ComBat.

[137] Para identificar miRNA expresso diferencialmente em pacientes com alto CADI (> 1) em comparação ao CADI (< = 1) (conforme definido por Yilmaz et al., 2003, Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 14:773-779), o pacote biocondutor de análise de variáveis substituídas (SVA) foi aplicado em dados ajustados em lote para identificar e remover variações desconhecidas relativamente a estes dois grupos. O teste LIMMA (Modelos Lineares para Dados de Microarranjo) foi então realizado para identificar miRNA diferencialmente expresso com um valor-p de corte < 0,05.

[138] Para investigar os processos biológicos em que o miRNA expresso diferencialmente poderia estar envolvido, os dados de expressão genética de RNAseq e miRNA dos mesmos pacientes foram correlacionados. O coeficiente de correlação de Pearson entre os valores de expressão de miRNA e os seus alvos genéticos previstos (http://www. microRNA.org) e os genes negativamente correlacionados foram selecionados a um p <0,05 e submetidos à análise de rede e análise de enriquecimento de Ontologia Gênica.

IDENTIFICAÇÃO DO CONJUNTO DE MIRNA DE PREDIÇÃO

[139] Para identificar um conjunto ótimo de miRNA para predizer a progressão da fibrose renal, os 102 pacientes foram divididos em conjunto de treinamento (N = 68) e conjunto de teste (N = 34). O conjunto de treinamento foi submetido ao ajuste de SVA para remover variáveis indesejadas para grupos CADI altos (CADI > 1) e baixos (CADI <= 1). As características demográficas dos 102 pacientes (conjunto de treinamento (N = 68) e conjunto de teste (N = 34)) são fornecidas na Tabela 1. Legenda: CADI- índice de danos de aloenxerto crônico em 12 meses; valor-P 1 - comparação da Coluna 2 com a coluna 3, valor-P 2 - comparação da coluna 5 com a coluna 6 (teste T não pareado ou teste não paramétrico; ANOVA ou meios não paramétricos)

[140] O teste LIMMA foi realizado no conjunto de treinamento ajustado a SVA para identificar miRNA expresso diferencialmente em pacientes com CADI alto (em comparação ao CADI baixo e os dados de expressão dos miRNAs expresso diferencialmente foram ajustados no modelo de regressão logística penalizada para a predição de CADI alto e baixo. Os miRNAs com associação significativa com CADI alto/baixo (p < 0,05) foram identificados como de ótima predição do modelo de regressão. O escore de AUC e a sensibilidade e especificidade foram calculados a partir do modelo de regressão logística com o uso do conjunto final de genes. Nós comparamos as curvas características de operação do receptor do conjunto ótimo final com conjuntos de genes selecionados aleatoriamente de igual tamanho para predizer CADI alto VS baixo para demonstrar que o grupo ótimo final deu a melhor previsão. Mil conjuntos de miRNA selecionados aleatoriamente foram selecionados e a AUC destes conjuntos de miRNA foi calculada e comparada com a AUC do conjunto ótimo final.

[141] Este conjunto ótimo final foi validado de modo cruzado com o uso de um método de validação cruzada de três vezes. (Figura 9). Resumidamente, os pacientes foram divididos aleatoriamente em 3 grupos de igual tamanho e número igual de pacientes com CADI alto e baixo e os dados para quaisquer dois grupos foram usados como o conjunto de treinamento com o terceiro como o conjunto de predição. O modelo de regressão logística penalizada que foi construído no conjunto de treinamento foi aplicado no conjunto de predição para prever o desfecho e as taxas de verdadeiro e falso positivo. A precisão de predição foi calculada a partir do conjunto de dados de predição e, em seguida, média de três permutações possíveis. Repetimos as etapas mais de 100 vezes. As taxas totais de verdadeiro ou falso positivo e a exatidão de predição foram calculadas. A distribuição das AUCs no conjunto de testes com base no modelo derivado como uso do conjunto de treinamento para 100 iterações foi plotada.

[142] Finalmente, o conjunto de predição foi validado no conjunto de testes. O modelo SVA construído no conjunto de treinamento foi então usado para ajustar cada amostra no conjunto de teste e o modelo de regressão logística construído no conjunto de treinamento com o uso do conjunto de predição foi aplicado no conjunto de treinamento ajustado para calcular a probabilidade de predição para cada amostra. A curva ROC com base nessas probabilidades foi desenhada e o escore de AUC para a curva ROC foi calculado. O modelo de regressão logística do conjunto de treinamento construído a partir de um conjunto de miRNA selecionado aleatoriamente também foi aplicado ao conjunto de predição e a AUC do conjunto de treinamento de 100 iterações de seleção aleatória do conjunto de predição foi comparada com a AUC original a partir do conjunto ótimo.

RESULTADOS ANÁLISE DE TRANSCRIPTOMA DO MIRNA

[143] Para estudar os papéis dos miRNAs do sangue no desenvolvimento de fibrose renal, o perfil de expressão de miRNA foi realizado em amostras de sangue aos 3 meses após o transplante de 102 pacientes de transplante renal com o uso do kit de ensaio de expressão humana Nanostring para detecção de 800 miRNAs humanos. Os dados foram processados no procedimento descrito na Figura 1 Caixa 1 (“Processamento de Dados”). Após normalização e filtragem de estringência, os 134 miRNAs finais passaram por QC com boa qualidade e os dados foram então ajustados com êxito para variações de lotes de reagentes e lotes experimentais (Figura 5). Observou-se que os dados de duas amostras de replicatas de diferentes lotes foram muito reproduzíveis com coeficiência de correlação R > 0,94 (Figura 6 e Figura 7). Todos estes juntos indicaram que dados de alta qualidade foram gerados a partir da tecnologia Nanostring.

[144] Para identificar o miRNA expresso diferencialmente em pacientes com CADI alto relacionada com escores baixos de CADI, os dados normalizados foram submetidos, pela primeira vez, a uma análise de variáveis de substituto (SVA) para remover as variações entre dois grupos (Figura 8a e 8b). Os dois parâmetros demográficos (sexo e raça) contribuíram significativamente para a variação dos dados (Figura 8a) e foram removidos após a correção SVA (Figura 8b). O teste LIMMA em dados ajustados a SVA identificou 24 miRNAs expressos diferencialmente (13 suprarregulados e 11 infrarregulados) com um valor p de 0,05 em pacientes com CADI alto (Figura 2). Os miRNAs que estavam suprarregulados no grupo de pacientes com CADI alto eram hsa-miR-128, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-30c-5p, hsa- miR-302b-3p, hsa-miR-378e, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-423- 5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-186-5p, hsa- miR-361-5p, e hsa-miR-22-3p. Os miRNAs que estavam infrarregulados no grupo de CADI alto eram hsa-miR-7b-5p, hsa-miR-1991-5p, hsa-miR-22-3p, hsa- miR-7b-5p, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-7g-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-106b- 5p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa- miR-1226-3p, e hsa-miR-29b-3p. (Figura 2)

[145] O mir-128, um miRNA importante com miRNA com superexpressão em vários tipos de tumor, foi o miRNA com maior suprarregulação em pacientes com CADI alto. O mi29b-3p, conhecido como um supressor tumoral, foi o mais significativamente infrarregulado em pacientes com CADI alto. Para melhor elucidação dos papéis funcionais destes Mirna, expressos diferencialmente na progressão da fibrose renal, os dados de expressão dos miRNAs e os seus alvos previstos de RNAseq nos mesmos pacientes (N = 96) foram correlacionados e genes negativamente corrigidos foram identificados para cada miRNA. Os dados demonstraram uma associação da suprarregulação de mir-128 com infrarregulação do gene na resposta imune e morte celular, e infrarregulação de mir-29b-3p com suprarregulação do gene na regulação da transcrição, no ciclo celular e no reparo do dano do DNA através das vias de sinalização de ATM (Figuras 3a (mir-128) e 3b (mi29b-3p). Estes dados sugeriram o papel importante dos microRNAs na regulação da proliferação celular no sangue necessária ao posterior desenvolvimento da fibrose renal. ASSINATURAS DE MIRNA PARA PREDIÇÃO DO RISCO DE FIBROSE RENAL EM RECEPTORES DE ALOENXERTO RENAL

[146] Este exemplo demonstra que determinados miRNAs e conjuntos de miRNA podem ser usados para prever o risco de um receptor de aloenxerto renal para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto.

[147] Para identificar uma assinatura potencial de miRNA prognóstica para a predição do desenvolvimento de fibrose renal e perda do aloenxerto, os 102 pacientes foram divididos em conjunto de treinamento (N = 68) e conjunto de teste (N = 34). Foi determinado que 4 miRNAs (mir-128, mir- 29b-3p, mir-302b-3p e mir-192-5p), que foram derivados de dados ajustados pelo SVA do conjunto de treinamento com o uso do modelo de regressão logística penalizada, foram altamente preditivos. Estas assinaturas de 4-miRNA (mir-128, mir-29b-3p, mir-302b-3p e mir-192-5p), tem uma AUC de predição de 0,886 (Figura 4a), que foi maior do que qualquer AUC derivada dos 4 miRNAs selecionados aleatoriamente (Figura 4b). A validação cruzada de 3 vezes com 100 iterações mostrou que o valor preditivo positivo (PPV) e valor preditivo negativo (NPV) foram 0,87 e 0,66, respectivamente, sugerindo que o teste é altamente preciso. (Figura 9)

[148] Após ajuste de cada amostra no ensaio com o uso do modelo SVA construído no conjunto de treinamento, foi aplicado o modelo de regressão logística de 4 miRNAs do conjunto de treinamento para prever o resultado do conjunto de treinamento independente (N=34) com AUC 0,882 (Figura 10), que é também mais elevado do que qualquer AUC derivada dos 4 miRNAs selecionados aleatoriamente.

RESUMO

[149] O estudo descrito acima descreve a caracterização do miRNA com o uso da tecnologia Nanostring no sangue periférico obtido 3 meses após o transplante de um coorte de 102 pacientes com transplante de rim do estudo Genomics of Chronic Alloingraft Rejection (GoCAR).

[150] A análise LIMMA de perfis de expressão de miRNA identificou um conjunto de 24 miRNAs significativamente associados com m12 de CADI alto. A correlação dos perfis de expressão de miRNA com os perfis de expressão de genes RNAseq nos mesmos pacientes (N = 96) identificou alvos previstos com miRNA negativamente correlacionados e o enriquecimento de Ontologia Gênica previu ainda os processos biológicos em que os miRNAs poderiam fazer parte. O mir-128, que é conhecido por desempenhar papéis na tumorigênese, foi o mais significativamente suprarregulado em pacientes com CADI alto, e associado com genes em resposta imune e proliferação celular e apoptose. O mir-29b-3p é o mais infrarregulado em pacientes com CADI alto e, associado com genes na regulação da transcrição, vias de reparo do DNA através da via ATM.

[151] Além disso, os 102 pacientes foram divididos em conjunto de treinamento (N = 68) e conjunto de teste (N = 34), os 4 miRNAs (mir-128, mir- 29b-3p,mir-302b-3p e mir-192-5p) foram derivados do conjunto de treinamento para predizer pacientes com CADI alto e baixo com AUC 0,886 com o uso de modelo de regressão logística penalizada com um corte de escore de probabilidade de 0,5. A validação cruzada de três vezes indicou que a PPV e NPV foram 0,87 e 0.66, respectivamente. Esses 4 miRNAs foram ainda validados no conjunto de treinamento independente (N = 34) pelo corte com AUC de 0,882, sensibilidade de 83%, especificidade de 69%, PPV = 75% e NPV = 79%.

[152] A força de predição destes 4 miRNAs (mir-128, mir-29b-3p, mir-302b-3p e mir-192-5p) foi ainda avaliada em um corte de CADI diferente. No corte de CADI 2 (CADI baixo <=2 e CADI alto >2), os 4 miRNAs permaneceram significativamente diferencialmente expressos p<0.05 entre os grupos de CADI baixo e alto. A predição AUC no conjunto de treinamento (N = 68) foi 0,86 com o uso de modelo de regressão logística penalizada e o corte do escore de probabilidade de 0,75 foi estabelecido a FPR <10%. Esses 4 miRNAs foram validados no conjunto de testes (N = 34) por este corte com AUC de 0,86, sensibilidade de 41%, especificidade de 100%, PPV = 100% e NPV = 63%. Em comparação à predição no corte de CADI 1, a especificidade e PPV foram aumentados.

[153] Em resumo, o perfil de miRNA revelou uma assinatura molecular a partir do sangue periférico e das funções biológicas associadas ao desenvolvimento futuro de fibrose do aloenxerto de rim e ainda identificou um conjunto potencial menor para a predição de fibrose do aloenxerto de rim. Estes dados sugerem que o perfil periférico de miRNA pode ser usado como vigilância para estratificar pacientes com risco de fibrose e perda do aloenxerto, obviando a necessidade de biópsia do aloenxerto e identificando aqueles que podem se beneficiar com intervenções precoces para prevenir a perda crônica do aloenxerto.

[154] Embora a combinação de todos os quatro, mir-128, mir-29b- 3p, mir-302b-3p e mir-192-5p tenha sido altamente preditiva de alto risco (AUC de 0,886), subcombinações dos quatro miRNAs, bem como miRNAs individuais também foram preditivos de alto risco. Por exemplo, miR-128 teve um AUC de 0,77, mir-29b-3p teve um AUC de 0,65, mas menos precisa do que a predição com os 4 miRNAs. ********************************

[155] Várias realizações da invenção foram descritas. No entanto, deve-se entender que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Consequentemente, outras realizações estão dentro do escopo das seguintes reivindicações.

[156] Deve-se entender ainda que todos os valores são aproximados e são fornecidos para descrição. Patentes, pedidos de patentes, publicações, descrições dos produtos e protocolos são citados ao longo deste pedido, as divulgações destes estão integralmente incorporadas ao presente pedido como referência.

Claims (7)

1. MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR UM RISCO DO RECEPTOR DE ALOENXERTO RENAL para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, o método caracterizado por compreender: (a) determinar os níveis de expressão de quatro microRNAs em uma amostra de sangue obtida a partir de um destinatário, em que os microRNAs são hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p; (b) comparar os níveis de expressão dos quatro microRNAs com um nível de controle para cada microRNA; e (c) diagnosticar o receptor como estando em risco de desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto: (i) se os níveis de expressão de hsa-miR-128 e hsa- miR-302b-3p estiverem aumentados em relação a um nível de controle para cada microRNA, e os níveis de expressão de hsa-miR-29b-3p e hsa-miR-192-5p estiverem diminuídos em relação ao nível de controle para cada microRNA, com base no corte de escore de probabilidade determinado a partir do conjunto de treinamento, então o receptor é diagnosticado como estando em alto risco; ou (ii) se os níveis de expressão de hsa-miR-128 e hsa- miR-302b-3p estiverem diminuídos em relação ao nível de controle para cada microRNA, e os níveis de expressão de hsa-miR-29b-3p e hsa-miR-192-5p estiverem aumentados em relação ao nível de controle para cada microRNA, com base no corte de escore de probabilidade determinado a partir do conjunto de treinamento, então o receptor é diagnosticado como estando em baixo risco.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela determinação dos níveis de expressão compreender: isolar o mRNA a partir da amostra de sangue; sintetizar cDNA a partir do mRNA; e medir os níveis de expressão de microRNAs hsa-mir-128, hsa-mir- 29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p a partir da amostra.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo diagnóstico do risco do receptor compreender calcular o risco do receptor aplicando os níveis de expressão determinados na amostra do receptor para um modelo de ajuste de regressão logística penalizada, preferencialmente o risco será calculado utilizando a fórmula: onde p(x) é a probabilidade de desenvolver fibrose, β* é o coeficiente de penalização e gi é o valor de expressão de miRNA i.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por compreender a repetição do método pelo menos uma vez.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela determinação dos níveis de expressão de miRNAs hsa- mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p compreender realizar um ensaio selecionado a partir do grupo que consiste em qPCR, microarranjo e análise Nanostring, preferencialmente, o ensaio é análise Nanostring, e o método compreende anelar o cDNA que compreende os microRNAs para sondas com código de barras específicas para os microRNAs, imobilizar o cDNA e quantificar as sondas ligadas ao cDNA pelo analisador digital.

6. KIT PARA DETERMINAR UM RISCO DO RECEPTOR DE ALOENXERTO RENAL para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto, caracterizado pelo kit compreender reagentes adequados para determinar os níveis de expressão em uma amostra de sangue de hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p; que compreende. uma ou mais amostras de controle que compreendem níveis predeterminados de hsa- mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p, em que a comparação dos níveis de expressão do hsa-mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir- 302b-3p e hsa-mir-192-5p em uma amostra de teste com os níveis de expressão nas amostras de controle identifica um receptor como sendo de risco para desenvolver fibrose do aloenxerto e perda do aloenxerto; e instruções para uso do kit; em que o kit compreende primers para amplificar um hsa-mir-128, hsa- mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p.

7. MÉTODO PARA SELECIONAR UM PACIENTE COM ALOENXERTO RENAL para tratamento para reduzir o risco de desenvolvimento de fibrose do aloenxerto e/ou perda do aloenxerto, caracterizado por compreender: (a) determinar os níveis de expressão de quatro microRNAs em uma amostra de sangue obtida de um receptor, em que os microRNAs são hsa- mir-128, hsa-mir-29b-3p, hsa-mir-302b-3p e hsa-mir-192-5p; (b) comparar os níveis de expressão dos quatro microRNAs com um nível de controle para cada microRNA; e (c) selecionar o paciente para tratamento se os níveis de expressão das amostras de miRNA estiverem alterados em relação a um nível de controle para cada microRNA, em que os microRNAs são hsa-mir-128, hsa- mir-302b-3p, e selecionar o paciente para tratamento se os níveis de expressão de hsa-miR-128 e hsa-miR-302b-3p estiverem aumentados em relação a um nível de controle para cada microRNA, e os níveis de expressão de hsa-miR- 29b-3p e hsa-miR-192-5p estiverem diminuídos em relação ao nível de controle para cada microRNA.