KR20240067918A - 신장 동종이식편 섬유증 및 거부반응의 위험을 치료 및 진단하는 방법 - Google Patents

신장 동종이식편 섬유증 및 거부반응의 위험을 치료 및 진단하는 방법 Download PDF

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Abstract

신장 동종이식편 수용자의 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험을 식별하는 방법이 개시된다. 이 방법은 미리 선택된 유전자 시그니처 세트의 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 대조군 혈액 표본에서 동일한 하나 이상의 유전자의 발현 수준에 비해 변경되는 경우 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험을 나타내는 것인 동종이식편 수용자를 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 것으로 식별하는 단계를 포함한다.

Description

신장 동종이식편 섬유증 및 거부반응의 위험을 치료 및 진단하는 방법
정부 보조금 조항
본 발명은 미국국립보건원(National Institutes of Health)이 수여한 보조금 번호 5U01AI070107에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
본 발명은 분자생물학 분야에 관한 것으로, 보다 특히 mRNA 분자 시그니처(signature)의 검출에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신장 동종이식편(allograft) 수용자(recipient)의 동종이식편의 섬유증(fibrosis) 및 동종이식편 손실이 발생할 위험을 진단하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 그러한 환자를 식별하고 치료하기 위해 9개의 유전자를 포함하는 미리 선택된 유전자 시그니처 세트의 발현 수준을 결정함으로써 신장 동종이식편 수용자의 혈액을 분석하는 것을 포함한다. 섬유증이 발생하는 환자와 발생하지 않는 환자 간의 9개 유전자의 발현 값(예를 들어, 차세대 시퀀싱 기술로부터의 유전자의 판독(read) 카운트)의 차이를 요약하여 각 환자에 대해 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실에 대한 누적 위험 점수(cumulative risk score)를 결정할 수 있는 통계 모델을 도출한다.
신장 기능의 저하로 이어지는 진행성 신장 섬유증은 여전히 신장 동종이식편 손실의 주된 원인이다. 임상적 및 병리학적 파라미터를 기반으로 하는 현재 방법론은 돌이킬 수 없는 손상이 발생하기 전에 손실 위험이 있는 이식편을 식별하는 데 실패한다. 이러한 검사에는 일반적으로 환자로부터 생검 표본(biopsy specimen)을 채취해야 한다. 거부반응을 인지했을 때쯤에는 무엇을 하기에는 너무 늦은 경우가 많다. 혈청 크레아티닌의 증가 또는 소변 내 단백질의 증가는 거부반응의 경고일 수 있지만 완전히 예측할 수는 없다. 더욱이, 환자 생검 샘플의 수집 및 분석은 시간이 많이 걸리고 고가이다.
따라서, 신장 동종이식편 수용자의 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험을 예측하기 위한 개선된 진단 방법이 여전히 필요하다.
발명의 요약
본원에서는 신장 동종이식편 수용자의 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험을 식별하는 방법이 개시된다. 이 방법은 미리 선택된 유전자 시그니처 세트의 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 대조군 혈액 표본에서 동일한 하나 이상의 유전자의 발현 수준에 비해 변경되는 경우 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험을 나타내는 것인 동종이식편 수용자를 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 것으로 식별하는 단계를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 동종이식편의 섬유증이 발생할 위험이 있는 인간 신장 동종이식편 수용자를 치료하는 방법을 제공한다: (a) 동종이식편의 섬유증이 발생하지 않은 제2 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 대조군 혈액 표본의 발현 수준보다 높은 미리 선택된 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 검출된 발현 수준에 기초하여 동종이식편의 섬유증에 대한 위험이 있는 것으로 식별된 인간 신장 동종이식편 수용자를 선택하는 단계로서, 상기 발현 수준은 상기 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 혈액 표본으로부터 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, cDNA에서 유전자 시그니처 InNLRC5 및 KIAA1683에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준을 검출함으로써 수득되는 것인 단계; 및 선택된 인간 신장 동종이식편 수용자에게 유효량의 항섬유화제, 항거부반응 약물, 또는 둘 다를 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 방법은 동종이식편 수용자의 섬유증 위험을 식별하기 위해 동종이식편 수용자의 샘플에서 결정된 발현 수준을 페널티화된 로지스틱 회귀 피팅 모델(penalized logistic regression fitting model)에 적용하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가 측면에서, 페널티화된 로지스틱 회귀 피팅 모델은 다음 공식을 이용한다: r =-(log10(p1)*g1 + log10(p2)*g2 + ... + log10(pi)*gi + ... + log10(p9)*g9), 여기서 pi는 트레이닝 세트에서 섬유증이 발생한 환자와 발생하지 않은 환자 간의 유전자 ｉ(ｉ = 1...9)의 발현 값에 대한 t-검정의 유의성 p 값이고, gi는 유전자 ｉ(ｉ = 1...9)에 대한 논리 번호(logic number), 1(유전자 ｉ의 발현 값이 상향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 섬유증 그룹의 중앙 발현 값보다 큰 경우 또는 유전자 i의 발현 값이 하향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 섬유증 그룹의 중앙 발현 값보다 작은 경우), 또는 -1(유전자 ｉ의 발현 값이 상향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 비-섬유증 그룹의 중앙 값보다 작은 경우 또는 유전자 i의 발현 값이 하향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 비-섬유증 그룹의 중앙 값보다 큰 경우), 또는 0 (유전자 ｉ의 발현 값이 트레이닝 세트의 섬유증 그룹과 비섬유증 그룹의 중앙 값 사이에 있는 경우)이다.
또 다른 추가의 측면에서, 항거부반응 약물은 면역억제제 또는 항증식제이다.
다른 측면에서, 면역억제제는 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil, MMF), 프레드니손(prednisone), 마이코페놀레이트 나트륨 및 아자티오프린(Azathioprine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원(member)이다.
또 다른 측면에서, 항섬유증 약물은 피르페니돈(Pirfenidone), 릴랙신(relaxin), 골 형성 단백질 7(BMP-7) 및 간 성장 인자(HGF) 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원이다.
또 다른 측면에서, mRNA의 발현 수준을 검출하는 것은 qPCR 분석, 나노스트링(Nanostring) 분석 및 TREx 분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원인 분석을 수행하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 동종이식편의 섬유증 위험이 있는 것으로 식별된 동종이식편 수용자의 면역억제 요법을 변경하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 면역억제 요법을 변경하는 것은 벨라타셉트(Belatacept), 라파마이신(rapamycin) 및 마이코페놀레이트 모페틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 항거부반응 약물의 유효량을 동종이식편 수용자에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 면역억제 요법을 변경하는 것은 피르페니돈, 릴랙신, 골 형성 단백질 7(BMP-7) 및 간 성장 인자(HGF) 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항섬유증 약물을 동종이식편 수용자에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 혈액 샘플 내 유전자 시그니처 세트의 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준을 검출하는 단계로서, 여기서 상기 유전자는 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5 및 KIAA1683인 단계, 및 (b) 유전자 시그니처 세트의 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준이 대조군의 동일한 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준보다 높을 때 인간 신장 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 위험이 있는 것으로 식별하는 단계를 포함하는, 동종이식편의 섬유증 위험을 감소시키는 치료를 위한 인간 신장 동종이식편 수용자를 선택하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 혈액 표본으로부터 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, cDNA의 유전자 시그니처 세트에서 유전자의 mRNA 발현 수준을 검출함으로써 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 수용자의 혈액 샘플에서 결정된 mRNA 발현 수준을 페널티화된 로지스틱 회귀 피팅 모델에 적용하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 qPCR 분석, 나노스트링 분석 및 TREx 분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원인 분석을 사용하여 상기 mRNA의 발현 수준을 검출하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 혈액 샘플로부터 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5 및 KIAA1683을 포함하는 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준을 검출하는 단계, 및 (b) 시그니처 세트의 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준이 대조군의 유전자 시그니처 세트 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준보다 높을 때 인간 신장 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 것으로 식별하는 단계를 포함하는, 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 신장 동종이식편 수용자를 식별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 것으로 식별된 동종이식편 수용자에게 유효량의 항거부반응 약물, 면역억제제, 항섬유화제 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 동종이식편 수용자의 섬유증 위험을 식별하기 위해 동종이식편 수용자의 샘플에서 결정된 발현 수준을 페널티화된 로지스틱 회귀 피팅 모델에 적용하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 혈액 샘플로부터 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5 및 KIAA1683을 포함하는 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준을 검출하는 단계, 및 (b) 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준이 대조군의 유전자 시그니처 세트 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준보다 높을 때 인간 신장 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 것으로 식별하는 단계를 포함하는, 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 신장 동종이식편 수용자를 식별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 것으로 식별된 동종이식편 수용자에게 유효량의 항거부반응 약물, 면역억제제, 항섬유화제 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 동종이식편 수용자의 섬유증 위험을 식별하기 위해 동종이식편 수용자의 샘플에서 결정된 발현 수준을 페널티화된 로지스틱 회귀 피팅 모델에 적용하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대조군에서 유전자 시그니처 세트의 mRNA 발현 수준보다 높은 미리 선택된 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 검출된 발현 수준에 기초하여 동종이식편의 섬유증 위험이 있는 것으로 식별된 인간 신장 동종이식편 수용자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 발현 수준은 상기 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 혈액 표본으로부터 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, cDNA에서 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5 및 KIAA1683을 포함하는 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준을 검출함으로써 수득되고; 및 (b) 선택된 인간 신장 동종이식편 수용자에게 유효량의 항섬유화제, 항거부반응 약물 또는 둘 다를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 대조군 수준은 유전자 시그니처 세트의 mRNA 발현 수준에 기초하여 계산된다.
본 발명의 이러한 측면과 다른 측면 및 구현예는 설명, 도면 및 청구범위로부터 당업자에게 명백할 것이다.
도 1은 디스커버리 세트(N=55, 20 대 35), 검증 세트 1(N = 30, 10 대 20) 및 검증 세트 2(N=48. 31 대 17)에 대한 데이터 세트 선별을 나타낸 것이다.
도 2: 본 발명의 9개 구성원 유전자 시그니처 세트의 발견을 위한 워크플로우.
도 3: 트레이닝 세트(N=55)에서 위험 점수를 추정하기 위한 통계 모델 구축: a) 트레이닝 세트에서 9개 유전자 세트를 사용한 섬유증 예측의 ROC 곡선(AUC=0.9) b) 트레이닝 세트의 위험 점수의 점 도표. 삼분위(tertile) 컷오프 {-4.98, 1.57}에서 PPV와 NPV는 각각 0.88과 1이다.
도 4: 검증 세트 1(V1: N=30)에서 위험 점수를 추정하기 위한 통계 모델의 검증: a) V1에서 9개 유전자 세트를 사용한 섬유증 예측의 ROC 곡선(AUC=0.79); b) 트레이닝 세트의 위험 점수의 점 도표. 트레이닝 세트에서 정의된 동일한 삼분위 컷오프에서 PPV와 NPV는 각각 0.85와 0.81이다.
개요
본 발명은 신장 동종이식편 수용자의 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험을 진단하는 방법에 관한 것이다. 섬유증으로 인해 동종이식편이 손실될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 신장 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는지 여부를 식별하는 데 유용하다. 다른 방식으로 말하면, 본원에 기술된 방법은 신장 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 확률을 결정하는 데 유용하다. 이 방법은 수용자로부터 얻은 mRNA의 상대적인 양(예를 들어, 발현 수준)의 차이에 의존하며, 여기서 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 확률은 본원에 기재된 바와 같이 결정된다.
본 발명의 방법은 동종이식편 수용자로부터의 시험 샘플에서 9개 유전자 시그너처 세트의 발현 수준의 변경을 결정하는 것을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 유전자 시그니처 세트는 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5 및 KIAA1683을 포함한다. 대조군 샘플 내 동일한 하나 이상의 유전자의 발현 수준에 비해 유전자 시그니처 세트의 하나 이상의 유전자 발현 수준의 증가는 동종이식편 수용자의 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험의 증가는 12개월 만성 동종이식편 손상 지수(Chronic Allograft Damage Index) CADI-12 점수 1 이상에 해당한다. 신장 이식에 대한 CADI 점수는 a) 미만성(diffuse) 또는 국소 염증, b) 동종이식편 간질(interstitium)의 섬유증, c) 혈관간 매트릭스(mesangial matrix)의 증가, d) 사구체(glomeruli)의 경화증, e) 내막 증식, 및 f) 관상 위축(tubular atrophy)에 대한 개별 구성 요소 점수를 기반으로 한다. 각 개별 파라미터는 문헌(Yilmaz et al., 2003, Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 14:773-779)에 기재된 바와 같이 0부터 3까지 점수가 매겨진다.
본 발명을 실시함에 있어서, 동종이식편 수용자의 위험을 식별하는 것은 수용자의 샘플에서 결정된 발현 수준을 수용자와 대조군 간의 9개 유전자의 차이를 요약하는 누적 통계 모델에 적용하여 수용자의 위험 (r)을 계산하는 것을 포함한다. 위험 평가에 사용되는 공식은 r =-(log10(p1)*g1 + log10(p2)*g2 + ... + log10(pi)*gi + ... + log10(p9)*g9)이고, 여기서 pi는 트레이닝 세트에서 섬유증이 발생한 환자와 발생하지 않은 환자 간의 유전자 ｉ(ｉ = 1...9)의 발현 값에 대한 t-검정의 유의성 p 값이고, gi는 유전자 ｉ(ｉ = 1...9)에 대한 논리 번호, 1(유전자 ｉ의 발현 값이 상향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 섬유증 그룹의 중앙 발현 값보다 큰 경우 또는 유전자 i의 발현 값이 하향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 섬유증 그룹의 중앙 발현 값보다 작은 경우), 또는 -1(유전자 ｉ의 발현 값이 상향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 비-섬유증 그룹의 중앙 값보다 작은 경우 또는 유전자 i의 발현 값이 하향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 비-섬유증 그룹의 중앙 값보다 큰 경우), 또는 0 (유전자 ｉ의 발현 값이 트레이닝 세트의 섬유증 그룹과 비섬유증 그룹의 중앙 값 사이에 있는 경우)이다.
가중 누적 점수(weighted cumulative score) (r)은 각 환자의 섬유증 발병에 대한 위험 점수로 사용될 수 있다. 환자의 위험 점수가 트레이닝 데이터 세트로부터 정의된 삼분위(tertile) 발현 값 컷오프보다 높으면, 환자는 섬유증 발생의 위험이 있다. 특정 구현예에서, 방법은 진단에 기초한 치료의 투여를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 분석 방법은 생검 표본에 대한 필요성을 회피한 혈액 기반 분석이다. 동종이식편 수용자는 이식 시점, 이식 후 초기 및 이후 주기적으로 본원에 개시된 분석을 사용하여 모니터링될 수 있다. 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 증가된 것으로 결정되면, 동종이식편 수용자는 예를 들어 동종이식편 수용자의 면역억제 요법의 변형을 통해, 예컨대, 예를 들어 면역억제 약물(예를 들어, 항거부반응 약물)를 투여하거나, 투여를 중단하거나 또는 투여량을 조정하거나, 또는 하나 이상의 항섬유화제를 투여함으로써 치료될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 신장 동종이식편 수용자를 식별하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성을 해결하고, 이식 수용자에게 반복적으로 쉽게 투여되는 혈액 기반 분석을 제공한다. 신장 이식 환자는 이식 후 매우 자주 담당 의사의 검사를 받게 되며, 대부분의 경우 이식 후 첫 달 동안은 주 2회, 그 후 매주로 전환한 다음 격주로 전환하고, 4 내지 5개월 후에 매월로 전환하며, 이후 방문 간격이 점차 늘어난다. 이 기간 동안 환자의 신장 기능과 면역억제 수준을 모니터링한다. 스테로이드는 전형적으로 수술 후 3개월까지 5 mg으로 감량하고, 이식 후 과정에 합병증이 없고 환자의 면역학적 위험이 높지 않은 경우 타크로리무스(면역체계를 억제하고 이식된 장기의 거부반응을 예방하는 데 사용되는 약물) 수준은 6 - 12개월까지 점차적으로 일정한 수준으로 감소된다. 아래 설명된 발현 프로파일은 임상 방문 시 수행되는 표준 테스트로 사용될 수 있다. 양성 테스트 결과(즉, 9개 유전자 시그니처 세트의 발현 수준이 동일한 시그니처 세트의 대조군 수준에 비해 증가한 경우)는 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 증가함을 의미하며, 환자의 면역억제제 투여 요법을 증가시키고 변경하고 및/또는 항섬유증 약물을 투여함으로써 치료될 것이다. 반복 테스트(분석은 바람직하게는 혈액 기반 테스트이므로 경제적으로 수행할 수 있음)는 만일 있다면 환자의 면역억제제 투여 요법에 대한 지속적인 변경을 안내할 것이다.
본 발명에 따라, mRNA 프로파일링은 신장 동종이식편 섬유증 및 동종이식편 손실의 발생 예측을 위한 유전자 시그니처 세트를 식별하였다. 특히 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5, KIAA1683t를 포함하는 9개의 유전자 시그니처 세트를 사용하여 높은 예측 값으로 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 동종이식편 수용자를 식별할 수 있다는 사실이 발견되었다. 높은 CADI(예를 들어, CADI-12 점수)를 가진 동종이식편 수용자에서, 유전자 시그니처 세트의 9개 유전자 중 4개가 상향 조절되었고 5개 유전자가 하향 조절되었다(표 1). 따라서, 이 데이터를 기반으로 유전자 시그니처가 개발되었으며, 이를 통해 환자가 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 것으로 식별한다. 대안적으로, 유전자 시그니처 세트에 있는 개별 유전자의 발현 수준을 결정하여 동종이식편 수용자의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험을 평가할 수 있다.
본 발명의 치료 방법에 사용하기에 특히 바람직한 개별 유전자로는 예를 들어 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5, KIAA1683을 포함하는 유전자 시그니처 세트를 포함한다.
다른 구현예에서, 동종이식편 수용자의 9개 유전자 시그너처 세트의 발현 수준은 유전자에 대한 기준(reference) 값 또는 기준 세트(대조군)와 비교되고, 동종이식편 수용자의 상대적 위험은 통계적 분석에 기초하여 평가된다.
일부 구현예에 따르면, 방법은 유전자 시그니처 세트의 9개 유전자 패널 내의 각각의 (즉, 모든) 유전자의 발현 수준을 결정하는 것(즉, 수준을 결정하는 것, 양을 측정하는 것, 또는 수준을 측정하는 것)을 포함한다.
다른 구현예에서, 유전자는 집합적으로 분석되고, 동종이식편 수용자의 유전자 프로파일을 기준 프로파일(예를 들어, 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 없는 것으로 알려진 동종이식편 수용자 코호트의 수준으로부터 유래되거나 그에 기초함)과 비교하는 것에 기초하여 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실 발생에 대한 상대적 위험도를 평가하며, 여기서 비교는 본원에 개시된 9개의 유전자 시그니처 세트의 발현 프로파일을 고려하는 것을 포함한다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 "위험" 또는 "위험이 증가된" 상태에 있는 동종이식편 수용자는 개입(intervention) 없이는 섬유증 및 동종이식편 실패가 발생할 가능성이 훨씬 더 높다.
일부 구현예에서, mRNA 발현의 검출 및 정량화에는 혈액, 혈장, 세포 또는 조직과 같은 샘플로부터 핵산을 분리하는 것이 필요하다. RNA, 특히 mRNA를 포함한 핵산은 당업계에 공지된 임의의 적합한 기술을 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 페놀 기반 추출은 RNA 분리를 위한 일반적인 방법이다. 페놀 기반 시약에는 세포 및 조직 파괴와 이후에 오염 물질로부터 RNA를 분리하기 위한 변성제(denaturant)와 RNAase 억제제의 조합이 포함되어 있다. 또한 TRIZOL™ 또는 TRI REAGENT™를 사용하는 것과 같은 추출 절차는 크고 작은 모든 RNA를 정제하며 mRNA가 포함된 생물학적 시료에서 전체 RNA를 분리하는 효율적인 방법이다. QIAGEN-ALL 준비 키트를 사용하는 것과 같은 추출 절차도 고려된다.
PCR은 샘플에 유전자 서열이 존재하는지 여부, 존재하는 경우 샘플 내 카피 수를 확인하는 목적으로 통상적으로 사용된다. mRNA를 포함하여 핵산 분자의 발현을 결정할 수 있는 PCR의 모든 방법은 본 발명의 범위에 속한다. 당업자에게 잘 알려진 qRT-PCR 방법에는 여러 가지 변형이 있다.
본원에서 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 일반적으로 값의 유형 및 측정 방법에 대해 허용 가능한 오류 범위 내임을 의미한다. 예를 들어, 이는 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 보다 바람직하게는 10% 이내, 가장 바람직하게는 5% 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약"은 주어진 값의 대략 로그(즉, 자릿수(an order of magnitude)) 이내, 바람직하게는 2배(a factor of two) 이내를 의미한다.
본원에 사용된 "얻다(수득하다)" 또는 "얻는(수득하는)"는 "직접" 또는 "간접" 수단으로 샘플을 소유하게 되는 모든 수단일 수 있다. 직접적으로 샘플을 얻는다는 것은 샘플을 얻기 위해 프로세스를 수행하는 것(예를 들어, 추출 등의 물리적인 방법을 수행하는 것)을 의미한다. 간접적으로 샘플을 얻는다는 것은 다른 당사자 또는 출처(예를 들어, 샘플을 직접 획득한 제3자 실험실)로부터 샘플을 받는 것을 의미한다. 직접적으로 샘플을 얻는 것은 물리적 물질, 예를 들어 출발 물질, 예컨대 혈액, 예를 들어 이전에 환자에게서 분리된 혈액의 물리적 변화를 포함하는 프로세스를 수행하는 것을 포함한다. 따라서, 수득은 대상체로부터 샘플을 수집 및/또는 제거하는 것을 의미하는 데 사용된다. 또한, "얻다"는 이전에 샘플을 소유하고 있던 다른 사람으로부터 샘플을 받는 경우를 의미하는 데에도 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어 "mRNA의 발현 수준을 결정하는"에서와 같이 "발현의 수준을 결정하는", "발현 수준을 결정하는" 또는 "발현의 수준을 검출하는"은 샘플에 존재하는 mRNA의 양을 정량화하는 것을 의미한다. 특정 mRNA의 발현을 검출하는 것은 당업계에 공지되어 있거나 본원에 기술된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 전형적으로, mRNA 검출 방법은 RT-PCR과 같은 서열 특이적 검출을 포함한다. mRNA-특이적 프라이머 및 프로브는 당업계에 공지된 전구체 및 성숙한 mRNA 핵산 서열을 사용하여 디자인될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 기준 수준 또는 대조군 수준과 비교하여 mRNA 발현의 "변경된" 수준은 mRNA 발현의 적어도 0.5배(예를 들어, 적어도: 1- 2-; 3-; 4-; 5-; 6-; 7-; 8-; 9-; 10-; 15-; 20-; 30-; 40-; 50-; 75-; 100-; 200-; 500-; 1,000-; 2000-; 5,000-; 또는 10,000배) 변경된 수준이다. 본 발명에 따르면, 변경은 발현 수준의 증가인 것으로 이해된다. 대안적으로, 변경된 발현 수준은 트레이닝 환자 그룹으로부터 확립된 로지스틱 회귀 모델의 파라미터를 사용한 위험 확률 점수의 증가로 정의되며, 확률 점수를 트레이닝 세트로부터 유래된 컷오프와 비교한 것이다.
"증가된", "증가" 또는 "상향 조절된"이라는 용어는 모두 일반적으로 통계적으로 유의한 양만큼의 증가를 의미하기 위해 본원에서 사용되었다; 의심의 여지를 피하기 위해 "증가된" 또는 "증가"라는 용어는 기준 수준과 비교하여 적어도 10% 증가를 의미하며, 예를 들어 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 증가 또는 최대 100% 증가 또는 기준 수준과 비교하여 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 기준 수준과 비교하여 적어도 약 0.5배(예를 들어, 적어도: 1- 2-; 3-; 4-; 5-; 6-; 7-; 8-; 9-; 10-; 15-; 20-; 30-; 40-; 50-; 75-; 100-; 200-; 500-; 1,000-; 2000-; 5,000-; 또는 10,000배) 또는 그 이상이다.
예를 들어, mRNA 발현을 검출하기 위한 프로브와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "선택적으로 표적화한다"는 표적화제가 표적에 특이적으로 결합하고, 다른 표적에 비특이적으로 결합하지 않는다는 것을 의미한다.
출원 전체 및 첨부된 청구범위에서, 용어 "약물(drug)", "약(medication)", "약제(agent)" 및 "치료제"의 사용은 동일하거나 유사한 실체를 정의하는 상호 교환 가능한 표현임이 이해되어야 하며 또한 이해하도록 의도된다.
"약물"은 일반적으로 대상체에게 적절하게 투여될 때 원하는 치료적 또는 예방적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물, 소분자 또는 기타 생물학적 조성물, 예컨대 안티센스 화합물, 항체, 프로테아제 억제제, 호르몬, 케모카인 또는 사이토카인을 의미한다.
본원에 사용된 상태(state), 장애 또는 상태(condition)를 "치료하는" 또는 "치료"에는 다음이 포함된다: (1) 상태, 장애 또는 상태에 걸리거나 걸리기 쉬운 포유동물이지만 아직 상태, 장애 또는 상태의 임상적 또는 준임상적 증상(예를 들어, 신장 동종이식편의 섬유증 및/또는 동종이식편 손실)을 경험하거나 나타내지 않는 포유동물에서 발생하는 상태, 장애 또는 상태의 임상적 또는 준임상적 증상의 출현을 예방하거나 지연시키는 것; 및/또는 (2) 상태, 장애 또는 상태를 억제하는 것, 즉 질병 또는 이의 재발(유지 치료의 경우) 또는 이의 적어도 하나의 임상적 또는 준임상적 증상을 정지, 감소 또는 지연시키는 것; 및/또는 (3) 질병을 완화시키는 것, 즉 상태, 장애 또는 상태 또는 임상적 또는 준임상적 증상 중 적어도 하나를 퇴행시키는 것; 및/또는 (4) 질병의 하나 이상의 증상의 중증도의 감소를 유발하는 것. 치료할 대상체에 대한 이점은 통계적으로 유의하거나 적어도 환자 또는 의사가 인지할 수 있는 것이다.
본원에 사용된 질병 또는 상태(예를 들어, 신장 동종이식편의 섬유증 및/또는 동종이식편 손실)를 "억제하는"이라는 용어는 예를 들어 대상체에서 질병의 하나 이상의 증상이 발생하거나 예를 들어, 환자 또는 환자의 의사에 의해 검출 가능하기 전에 대상체에서 질병의 하나 이상의 증상이 발생하는 것을 중지시키는 것을 의미한다. 바람직하게는, 질병 또는 상태는 전혀 발생하지 않으며, 즉, 질병의 증상이 감지되지 않는다. 그러나, 이는 또한 질병의 하나 이상의 증상의 발달을 지연시키거나 늦추는 결과를 초래할 수도 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이는 이후에 발생하는 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 결과를 가져올 수 있다.
본원에 사용된 "병용 요법(combination therapy)"은 특정 조성물 또는 약물로 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 것으로 여기서 대상체는 첫 번째 치료법과 함께 및/또는 하나 이상의 다른 치료법, 예컨대, 예를 들어 면역억제 요법 또는 기타 항거부반응 요법과 함께 질병에 대한 하나 이상의 다른 조성물 또는 약물이 치료되거나 투여되는 것을 의미한다. 이러한 병용 요법은 환자가 먼저 한 가지 치료 방식(예를 들어, 약물 또는 치료법)으로 치료받고 그 다음 다른 치료 방식(예를 들어, 약물 또는 치료법)으로 치료되는 순차적(sequential) 요법일 수 있거나, 모든 약물 및/또는 치료법이 동시에 투여될 수 있다. 두 경우 모두 이러한 약물 및/또는 치료법은 "공동-투여된다(co-administered)"라고 한다. "공동-투여"는 반드시 약물 및/또는 치료법이 결합된 형태로 투여된다는 것을 의미하는 것은 아니라는 점을 이해하여야 한다(즉, 이들은 동일하거나 다른 시간에 동일하거나 다른 부위에 개별적으로 또는 함께 투여될 수 있다).
본원에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 유도체"는 수용자에게 투여 시에 본 발명의 화합물, 또는 이의 활성 대사산물이나 잔류물을 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 본 발명의 화합물의 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 전구약물(prodrug), 예를 들어 에스테르를 의미한다. 이러한 유도체는 과도한 실험 없이도 당업자가 인식할 수 있다. 그럼에도 불구하고 Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th Edition, Vol. 1: Principles and Practice의 교시사항을 참고하며, 이는 그러한 유도체를 교시하는 정도까지 참조로 본원에 포함된다. 약제학적으로 허용되는 유도체에는 염, 용매화물, 에스테르, 카르바메이트 및/또는 인산염 에스테르가 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "치료학적 유효량" 및 "유효량"은 상호교환적으로 사용되고, 용량 또는 양에 적용되며, 이를 필요로 하는 동물에게 투여 시 원하는 활성을 초래하기에 충분한 조성물, 화합물 또는 약제학적 제제의 양을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "치료학적으로 유효한"은 본원에 명시된 질병 또는 상태의 적어도 하나의 증상, 예를 들어 동종이식편의 섬유증 및/또는 동종이식편 손실을 감소시키거나 제거하기에 충분한 조성물, 화합물 또는 약제학적 제제의 양을 의미한다.
활성 성분의 조합이 투여되는 경우, 조합의 유효량은 개별적으로 투여하는 경우에 효과적인 각 성분의 양을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 치료학적 제제의 투여량은 질병 또는 상태의 성질, 환자의 병력, 투여 빈도, 투여 방식, 숙주로부터 제제의 제거율 등에 따라 달라질 것이다. 초기 용량은 더 클 수 있으며, 이후 유지 용량은 더 작아질 수 있다. 용량은 효과적인 투여량 수준을 유지하기 위해 예를 들어 매주, 격주, 매일, 반주 등으로 투여될 수 있다.
치료적으로 효과적인 투여량은 (i) 종양 세포 성장 및/또는 생존을 판독값(readout)으로 사용하는 시험관 내 세포 배양 분석에서 조성물 또는 화합물의 유효 용량의 특성화, 이어서 (ii) 종양 성장 억제 및/또는 동물 생존을 판독값으로 사용하는 동물 연구에서 특성화, 이어서 (iii) 섬유증 감소 및/또는 동종이식편 거부반응 감소를 판독값으로 사용하는 인간 실험에서 특성화와 같은 여러 가지 접근법을 조합하여 단계적으로 결정될 수 있다.
진단 방법
본 발명은 특정 분석물(analyte)(예를 들어, mRNA)의 수준 또는 발생에 기초하여 동종이식편의 섬유증 및/또는 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 동종이식편 수용자를 식별(예를 들어, 임상 평가, 진단, 분류, 예측, 프로파일링)하는 데 유용한 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 샘플에서 9개 유전자 시그니처 세트의 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 대조군, 예를 들어 건강한 개체로부터의 샘플에서 동일한 하나 이상의 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 및/또는 동종이식편 손실이 발생할 위험이 정상보다 높은 경우를 평가하는 방법이 제공된다.
본원에서 사용된 수준(level)은 샘플(예를 들어, 혈장 또는 혈청 샘플) 또는 대상체 내 분석물의 양 또는 농도를 의미한다. 반면, 발생은 샘플에서 검출 가능한 분석물의 존재 또는 부재를 나타낸다. 따라서 수준은 양의 연속 지표인 반면 발생은 분석물의 이진(binary) 지표이다. 일부 경우에, 발생은 그 이상에서는 바이오마커가 존재하고 그 이하에서는 바이오마커가 존재하지 않는 역치 수준(threshold level)을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 기술된 9개의 유전자 시그니처 세트는 동종이식편의 섬유증 및/또는 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 동종이식편 수용자를 식별(예를 들어, 판단 또는 평가)하는 데 특히 유용하다. 더욱이, 본원에 기술된 방법은 동종이식편의 섬유증 및/또는 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 동종이식편 수용자를 식별하는 데 유용하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 식별은 진단 및 진단에의 보조를 모두 포함한다. 따라서, 진단을 내리기 위해 본 방법의 결과와 함께 다른 진단 기준을 평가할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 방법은 유전자 시그니처 세트의 9개 유전자 패널 내의 각각의 (즉, 모든) 유전자의 발현 수준을 결정하는 것(즉, 수준을 결정하는 것, 양을 측정하는 것, 또는 수준을 측정하는 것)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 발현 수준 또는 발생을 기준(reference)과 비교하는 것을 포함한다. 기준은 다양한 형태를 취할 수 있다. 일부 경우에, 기준은 복수의 유전자 산물(예를 들어, 복수의 mRNA 각각)에 대한 미리 결정된 값을 포함한다. 미리 결정된 값은 다양한 형태를 취할 수 있다. 이는 이전에 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실 위험이 있는 것으로 진단된 동종이식편 수용자로부터 얻은 분석물의 수준 또는 발생일 수 있거나, 또는 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실 위험이 없는 것으로 알려진 동종이식편 수용자(예를 들어, 무증상 대상체)로부터 얻은 분석물의 수준 또는 발생일 수 있다. 이는 신장 동종이식을 받지 않은 대상체로부터 얻은 수준 또는 발생일 수 있다. 이는 동일한 수용자에서 예를 들어 다른 시점에서의 수준 또는 발생일 수 있다.
분석물의 수준(들)을 나타내는 미리 결정된 값은 본원에서 미리 결정된 수준으로 지칭된다. 미리 결정된 수준은 중앙값이나 평균과 같은 단일 컷오프 값일 수 있다. 이는 신뢰구간과 같은 컷오프(또는 임계값) 값의 범위일 수 있다. 이는 한 정의된 그룹에서의 위험이 또 다른 정의된 그룹에서의 위험보다 한 배 더 높은(예를 들어, 약 2배, 4배, 8배, 16배 이상) 것과 같은 비교 그룹에 기반하여 설정될 수 있다. 이는 예를 들어 대상체(예: 대조군 대상체)의 집단이 저위험군, 중위험군 및 고위험군과 같은 그룹으로, 또는 사분위수(quartile)로 나누어져 가장 낮은 사분위수는 가장 낮은 위험을 가진 대상체이고 가장 높은 사분위수는 가장 높은 위험을 가진 대상체로, 또는 n-분위수(즉, n개의 규칙적인 간격)로 나누어져 n-분위수 중 가장 낮은 것이 가장 낮은 위험을 갖는 대상체이고 n-분위 중 가장 높은 것이 가장 높은 위험을 갖는 대상체로, 균등하게(또는 불균등하게) 나누어지는 범위일 수 있다. 더욱이, 기준은 조사하고자 하는 대상체를 포함하는 개체 집단의 분석물의 상대적 또는 절대적 양에 대해 계산된 기준, 가장 바람직하게는 평균 또는 중앙값일 수 있다.
상기 집단의 개체들의 분석물의 절대적 또는 상대적 양은 본원의 다른 곳에 명시된 바와 같이 결정될 수 있다. 적절한 기준 값, 바람직하게는 평균 또는 중앙값을 계산하는 방법은 해당 분야에 잘 알려져 있다. 이전에 언급된 대상체의 집단은 복수의 대상체, 바람직하게는 적어도 5, 10, 50, 100, 1,000명의 대상체를 포함해야 한다. 본 발명의 방법에 의해 진단될 대상체와 상기 복수의 대상체의 대상체는 동일한 종인 것으로 이해되어야 한다.
미리 결정된 값과 연관된 대상체를 전형적으로 대조군 대상체(또는 대조군)이라고 한다. 대조군 대상체는 신장 동종이식편을 받았을 수도 있고 받지 않았을 수도 있다. 어떤 경우에는 대조군 대상체가 증상이 있는 대상체인 것이 바람직할 수 있으며, 다른 경우에는 대조군 대상체가 무증상 대상체인 것이 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서 수준은 그 자체로 두 상태 사이의 수준 비교를 반영하는 상대적 수준일 수 있다. 두 상태(예를 들어, 건강 상태와 질병 상태) 사이의 비교(예를 들어, 비율, 차이, 로그 차이, 백분율 변화 등)를 반영하는 상대적 수준을 델타 값이라고 할 수 있다. 상대적 수준을 사용하면 측정과 관련된 변형(예를 들어, 실험실 직원, 실험실, 측정 장치, 시약 로트/조제, 분석 키트 등)을 어느 정도 배제하기 때문에 어떤 경우에는 유익하다. 그러나, 본 발명은 그렇게 제한되지는 않는다.
발현 수준 및/또는 기준 발현 수준은 적합한 데이터 저장 매체(예를 들어, 데이터베이스)에 저장될 수 있으므로 향후 진단에도 이용 가능하다. 이는 또한 해당 참조 샘플을 얻은 대상체가 동종이식편의 섬유증을 발생시키고/시키거나 동종이식편 거부반응을 경험했다는 것이 (향후에) 확인되면 데이터베이스에서 적절한 참조 결과를 식별할 수 있기 때문에 질병의 유병률을 효율적으로 진단할 수 있다.
본원에 사용된 "데이터베이스"는 적합한 저장 매체에 수집된 데이터(예를 들어, 분석물 및/또는 기준 수준 정보 및/또는 환자 정보)를 포함한다. 더욱이, 데이터베이스는 데이터베이스 관리 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 데이터베이스 관리 시스템은 바람직하게는 네트워크 기반, 계층적 또는 객체 지향(object-oriented) 데이터베이스 관리 시스템이다. 더욱 바람직하게는, 데이터베이스는 분산형(연방(federal)) 시스템으로, 예를 들어 클라이언트-서버-시스템으로 구현될 것이다. 보다 바람직하게는, 데이터베이스는 검색 알고리즘이 테스트 데이터 세트를 데이터 수집에 의해 포함된 데이터 세트와 비교할 수 있도록 구성된다. 구체적으로, 그러한 알고리즘을 사용함으로써, 신장 동종이식편 거부반응 위험을 나타내는 유사하거나 동일한 데이터 세트를 데이터베이스에서 검색할 수 있다. 따라서, 데이터 수집에서 동일하거나 유사한 데이터 세트가 식별될 수 있는 경우, 테스트 데이터 세트는 신장 동종이식편 거부반응 위험과 연관될 것이다.
결과적으로, 데이터 수집에서 얻은 정보는 동종이식편의 섬유증 및/또는 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 동종이식편 수용자를 식별하는 데 사용되거나 대상체로부터 얻은 테스트 데이터 세트를 기반으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 데이터 수집은 위에 언급된 그룹 중 어느 하나에 포함되는 모든 분석물의 특성 값을 포함한다.
또한 다양한 이식 카테고리, 예를 들어 AR, STA, NS 등의 유전자 발현/단백질 시그니처에 대한 데이터베이스도 제공된다. 유전자 발현/단백질 시그니처 및 이의 데이터베이스는 사용을 용이하게 하기 위해 다양한 매체(예를 들어, 사용자가 접근 가능/판독 가능한 형식(format))로 제공될 수 있다.
"미디어"는 본 발명의 발현 프로파일 정보를 포함하는 제조물(manufacture)을 의미한다. 본 발명의 데이터베이스는 컴퓨터 판독 가능한 매체, 예를 들어 컴퓨터를 사용하는 사용자가 직접 읽고 접근할 수 있는 모든 매체에 기록될 수 있다. 이러한 매체에는 플로피 디스크, 하드 디스크 저장 매체 및 자기 테이프와 같은 자기 저장 매체; CD-ROM과 같은 광학 저장 매체; RAM 및 ROM과 같은 전기적 저장 매체; 및 이러한 범주의 하이브리드, 예컨대 자기/광학 저장 매체가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 현재 알려진 컴퓨터 판독 가능 매체 중 임의의 것이 현재 데이터베이스 정보의 기록을 포함하는 제조물을 생성하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 쉽게 이해할 수 있다.
"기록되는"이란 당업계에 공지된 임의의 이러한 방법을 사용하여 컴퓨터 판독 가능한 매체에 정보를 저장하는 프로세스를 의미한다. 저장된 정보에 접근하는 데 사용되는 수단에 따라 편리한 데이터 저장 구조를 선택할 수 있다. 다양한 데이터 프로세서 프로그램과 형식, 예를 들어 워드 프로세싱 텍스트 파일, 데이터베이스 형식 등을 저장에 사용할 수 있다. 따라서, 대상체 발현 프로파일 데이터베이스는 사용자가 접근할 수 있으며, 즉, 데이터베이스 파일은 사용자가 판독 가능한 형식(예를 들어, 컴퓨터 판독 가능한 형식)으로 저장된다.
본원에서 사용되는 "컴퓨터 기반 시스템"은 본 발명의 정보를 분석하는 데 사용되는 하드웨어 수단, 소프트웨어 수단 및 데이터 저장 수단을 의미한다. 본 발명의 컴퓨터 기반 시스템의 최소 하드웨어는 중앙 처리 장치(CPU), 입력 수단, 출력 수단 및 데이터 저장 수단을 포함한다. 숙련된 기술자는 현재 이용 가능한 컴퓨터 기반 시스템 중 어느 하나가 본 발명에 사용하기에 적합하다는 것을 쉽게 이해할 수 있다. 데이터 저장 수단은 전술한 바와 같은 본 발명의 정보의 기록을 포함하는 임의의 제조물, 또는 그러한 제조물에 액세스할 수 있는 메모리 액세스 수단을 포함할 수 있다.
입력 및 출력 수단에 대한 다양한 구조적 형식이 본 발명의 컴퓨터 기반 시스템에서 정보를 예를 들어 사용자에게 입력하고 출력하는 데 사용될 수 있다. 출력 수단에 대한 한 가지 형식은 기준 발현 프로파일과 다양한 정도의 유사성을 갖는 발현 프로파일의 순위를 매기는 것이다. 이러한 제시는 숙련된 기술자에게 유사성 순위를 제공하고 테스트 발현 프로파일에 포함된 유사성 정도를 식별한다.
전형적인 구현예에서, 임상 실험실은 환자의 샘플을 사용하여 발현 값을 획득하고 이를 환자의 의사에게 보낸다. 그런 다음 의사는 이 값을 웹 기반 서비스 제공업체에 전달한다. 서비스 제공자는 미리 선택된 유전자 세트의 각 유전자에 대한 공동-효율성(co-efficiency)과 트레이닝 세트로부터의 누적 위험 점수 추정 모델의 컷오프를 이미 갖고 있는 생물정보학(bioinformatics) 시스템에 해당 값을 입력한다. 생물정보학 시스템은 이 정보를 사용하여 환자의 확률 점수를 계산한다. 계산된 점수는 환자의 위험 상태를 반영한다.
본 발명은 또한 예를 들어 기술자, 의사 또는 환자에게 분석 결과 또는 진단 또는 둘 다를 전달하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 컴퓨터는 인터넷을 통해 또는 유선 또는 무선 전화 네트워크를 통해 이해 관계자, 예를 들어 의사 및 환자에게 분석 결과 또는 진단 또는 둘 다를 전달하는 데 사용될 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 수용자의 임상 기록을 수정하여 동종이식편의 섬유증 및/또는 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 수용자를 식별하는 것을 추가로 포함한다. 임상 기록은 임의의 적합한 데이터 저장 매체(예를 들어, 컴퓨터 판독 가능 매체)에 저장될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 기초한 진단은 진단이 이루어진 후 가능한 한 빨리 동종이식편 수용자에게 전달된다. 진단은 수용자의 치료 의사에 의해 수용자에게 전달될 수 있다. 대안적으로, 진단은 이메일로 수용자에게 전송되거나 전화로 대상체에게 전달될 수 있다. 진단은 보고서 형식으로 수용자에게 전송될 수 있다. 컴퓨터를 사용하여 이메일이나 전화로 진단을 전달할 수 있다. 특정 구현예에서, 진단 테스트 결과를 포함하는 메시지는 통신 분야의 숙련된 기술자에게 친숙할 컴퓨터 하드웨어와 소프트웨어의 조합을 사용하여 자동으로 생성되어 수용자에게 전달될 수 있다.
본 발명의 측면은 신장 동종이식을 받았고 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 대상체를 식별하기 위한 컴퓨터 프로그램 제품을 포함하며, 여기서 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨터에 로딩되었을 때 신장 동종이식을 받은 대상체가 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는지 여부를 결정하기 위해 대상체로부터 유래된 샘플로부터의 mRNA 발현 결과를 사용하도록 구성되며, 여기서 유전자 발현 결과는 본원에 제공된 9개 유전자 패널에 대한 발현 데이터를 포함한다.
본 발명은 또한 대상체(예를 들어, 신장 동종이식편 수용자)에서 mRNA 발현 수준을 평가하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 다양한 형태를 취할 수 있다. 전형적으로, 키트는 샘플 내 mRNA 발현 수준(예를 들어, 본원에 개시된 것)을 결정하는 데 적합한 시약을 포함할 것이다. 선택적으로, 키트는 하나 이상의 대조군 샘플을 포함할 수 있다. 또한, 일부 경우에 키트는 기준(예를 들어, 미리 결정된 값)을 제공하는 서면 정보(표시)를 포함할 것이며, 여기서 대상체의 mRNA 발현 수준과 기준(미리 결정된 값) 간의 비교는 임상 상태를 나타낸다.
일부 경우에, 키트는 mRNA 발현 수준 또는 발생을 기준(예를 들어, 예측 모델)과 비교하는 데 유용한 소프트웨어를 포함한다. 일반적으로 소프트웨어는 컴팩트 디스크와 같이 컴퓨터에서 판독 가능한 형식으로 제공되지만, 인터넷을 통해 다운로드할 수도 있다. 그러나, 키트는 그렇게 제한되지 않으며 다른 변형도 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 방법은 또한 mRNA의 발생 또는 수준(예를 들어, 본원에 개시된 것)에 기초하여 대상체에 대한 치료를 선택하고/하거나 치료 계획을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여, 의료 서비스 제공자(health care provider)(예를 들어, 의사)는 수용자가 동종이식편의 섬유증 및/또는 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 것으로 식별하고, 이러한 식별에 기초하여 의료 서비스 제공자는 대상체에 대한 적절한 관리 계획을 결정한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여, 의료 서비스 제공자(예를 들어, 의사)는 대상체로부터 얻은 임상 샘플에서 특정 유전자의 발생 또는 수준에 기초하여 및/또는 대상체로부터 얻은 임상 샘플의 분류에 기초하여 수용자가 동종이식편의 섬유증 및/또는 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 것으로 식별한다. 이러한 진단을 통해 의료 서비스 제공자는 본원에 기재된 바와 같이 대상체에 대한 적절한 치료 또는 치료 계획을 결정한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 치료를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 신장 동종이식편 수용자를 식별하기 위해 본원에 기술된 9개의 유전자 패널의 적용을 설명하는 예시적인 절차가 다음과 같이 제공된다:
1) 트레이닝 그룹 선정: 사례 발생 위험도가 높은 및 낮은 신장 이식 환자 그룹(총 수 N=~100명)을 신중하게 선정한다. 트레이닝 그룹은 적어도 두 명의 병리학자가 검토한 잘 특성화된 인구통계학적(demographics) 및 임상적 적응증을 가지고 있어야 한다.
2) 9개 mRNA의 발현 측정: 트레이닝 그룹의 각 환자의 이식 후 혈액 샘플에서 분리한 9개 유전자 시그니처 세트로부터 전사된 mRNA의 발현 수준을 RT-PCR Nanostring 또는 TREx 기술을 사용하여 측정한다. 이러한 기술의 사용은 아래 실시예에 설명되어 있다.
3) 회귀 모델 및 컷오프 구축: 사례와 대조군 간의 9개 유전자 차이를 요약하는 누적 통계 모델이 트레이닝 세트로부터 구축된다. 위험 평가에 사용되는 공식은 r =-(log10(p1)*g1 + log10(p2)*g2 + ... + log10(pi)*gi + ... + log10(p9)*g9)이고, 여기서 pi는 트레이닝 세트에서 섬유증이 발생한 환자와 발생하지 않은 환자 간의 유전자 ｉ(ｉ = 1...9)의 발현 값에 대한 t-검정의 유의성 p 값이고, gi는 유전자 ｉ(ｉ = 1...9)에 대한 논리 번호, 1(유전자 ｉ의 발현 값이 상향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 섬유증 그룹의 중앙 발현 값보다 큰 경우 또는 유전자 i의 발현 값이 하향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 섬유증 그룹의 중앙 발현 값보다 작은 경우), 또는 -1(유전자 ｉ의 발현 값이 상향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 비-섬유증 그룹의 중앙 값보다 작은 경우 또는 유전자 i의 발현 값이 하향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 비-섬유증 그룹의 중앙 값보다 큰 경우), 또는 0 (유전자 ｉ의 발현 값이 트레이닝 세트의 섬유증 그룹과 비섬유증 그룹의 중앙 값 사이에 있는 경우)이다. 가중 누적 점수 (r)은 각 환자의 섬유증 발병에 대한 위험 점수로 사용될 수 있다. 환자의 위험 점수가 트레이닝 데이터 세트로부터 정의된 삼분위 발현 값 컷오프보다 높으면, 환자는 섬유증이 발생할 위험이 있다.
확률 점수에 기초하여, 예측 통계 예컨대 참양성률 대 위양성의 ROC(Receive operating characteristic)) 곡선의 예측 AUC(곡선 아래 면적), 민감도/특이성, 양성 값(PPV) 및 음성 예측 값(NPV)이 결정된다. 주어진 특이성(90%)에서 섬유증 발병을 가장 잘 예측하는 확률 점수 컷오프가 설정된다. 이것은 상위 그룹에 있으면 섬유증이 발생할 가능성이 높고 검사 결과는 양성으로 판정되지만 하위 그룹에 있으면 섬유증이 발생할 가능성이 매우 낮고 검사 결과는 음성으로 판정된다는 점에서 두 그룹으로의 명확한 컷오프가 될 수 있다. 대안은 위와 같이 결정된 확률 점수에 따라 환자를 삼분위로 나눌 수 있다는 것이다. 이 경우 환자가 (1) 최상위 삼분위에 속하면 섬유증이 발생할 가능성이 높고 검사 결과는 양성으로 판정되고; (2) 이들이 두 번째 삼분위 또는 중간 그룹에 속하면 위험을 정확하게 판단할 수 없고; (3) 이들이 최하위에 있는 경우 섬유증이 발생할 가능성이 매우 낮으며 검사 결과는 음성으로 판정된다.
계수(log10(pi)), 사례 그룹과 대조군 그룹의 중앙 발현 값 및 트레이닝 그룹으로부터 유래된 컷오프가 웹 기반 생물정보학 시스템에 입력되고 저장되며 이는 인터넷을 통해 임상 실험실/진료실에서 액세스할 수 있다.
4) 진단 기준: 신규 환자의 경우, 임상 실험실에서 트레이닝 세트에 대해 사용된 것과 동일한 기술로 9개 유전자 시그니처 세트의 발현 수준을 측정한다. 웹 기반 생물정보학 시스템을 사용함으로써 트레이닝 세트로부터 유래된 파라미터를 사용하여 공식에서 확률 점수가 계산되고, 확률 점수는 컷오프와 비교되어 섬유증 발병 가능성을 결정한다. 임상 실험실에서는 검사 결과를 의사에게 보낼 것이며, 샘플에 대한 결과가 섬유증 가능성이 높은 컷오프를 초과하는 경우 음성으로 보고된다.
5) 치료: 검사 결과 환자가 동종이식편의 섬유증 또는 동종이식편 손실이 발생할 위험이 높은 것으로 나타나면 예를 들어 제한 없이 동종이식편 수용자에게 항섬유증 약물을 투여하거나 면역억제 요법을 전환하여 치료할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료는 예를 들어 하나 이상의 항거부반응 약물을 포함하는 하나 이상의 면역억제 약물을 예를 들어 투여하거나, 투여를 중단하거나, 또는 투여량을 조정하는 것과 같은 동종이식편 수용자의 면역억제 요법을 변경하는 것을 포함한다.
면역억제는 스테로이드, 표적 항체 및 타크로리무스와 같은 CNI를 포함한 다양한 약물을 사용하여 달성할 수 있다. CNI의 비제한적인 예로는 예를 들어 사이클로스포린 또는 타크로리무스와 같은 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor, CNI), 또는 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil, MMF) 또는 시롤리무스(sirolimus)와 같은 덜 섬유화성(less fibrogenic) 면역억제 약물을 포함한다. 면역억제제의 주요 계열은 타크로리무스(Prograf® 및 Advagraf® / Astagraf XL(Astellas Pharma Inc.) 및 Prograf®의 제네릭)와 사이클로스포린(Neoral® 및 Sandimmune®(Novartis AG) 및 제네릭)을 포함하는 칼시뉴린 억제제(CNI)이다. 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 있는 환자를 치료하기 위해 프레드니손과 같은 스테로이드를 투여할 수도 있다. 마이코페놀레이트 모페틸, 마이코페놀레이트 나트륨 및 아자티오프린과 같은 항증식제도 이러한 치료에 유용하다. 이들 중 타크로리무스는 면역 체계를 억제하는 측면에서 가장 강력한 약물 중 하나이다. 항거부반응 약물 벨라타셉트(Belatacept)(Bristol Myers Squibb) 또한 거부반응이나 섬유증 위험이 있는 환자의 치료에 사용될 수 있다.
동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 증가된 것으로 식별된 동종이식편 수용자는 또한 예를 들어 제한 없이 항섬유증 약물을 투여하거나 동종이식편 수용자의 면역억제 요법을 변경함으로써 치료될 수 있다. 따라서, 동종이식편 수용자의 치료는 하나 이상의 항섬유증 약물을 투여하거나, 투여를 중단하거나, 또는 투여량을 조정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 항섬유증 약물은 항섬유화제, 예컨대, 예를 들어 피르페니돈, 릴랙신, 골 형성 단백질 7(BMP-7) 및 간 성장 인자(HGF) 6을 포함할 수 있다.
이러한 환자에게 리시노프릴(Lisinopril)과 같은 안지오텐신 전환 효소 억제제(ACEI), 또는 로사르탄(losartan)과 같은 안지오텐신 II 수용체 차단제(blockade)를 투여하는 것도 본 개시내용의 범위 내에 있다.
일부 측면에서, 방법은 면역억제를 칼시뉴린 억제제로부터 섬유증의 발생과 관련되지 않은 약물, 예컨대 항거부반응 약물인 벨라타셉트, 라파마이신 또는 마이코페놀레이트 모페틸로 전환하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 신장 동종이식편 수용자의 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험을 결정하기 위한 키트가 제공된다. 비제한적인 예에서, mRNA 분리, mRNA 표지화 및/또는 mRNA 집단 평가를 위한 시약이 키트에 포함된다. 키트는 유전자 프로브를 생성하거나 합성하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 따라서 키트는 표지된 뉴클레오티드 또는 후속적으로 표지되는 표지되지 않은 뉴클레오티드를 통합함으로써 mRNA를 표지하기 위한 효소를 적절한 용기 수단에 포함할 것이다. 또한, 반응 완충액, 표지 완충액, 세척 완충액, 또는 혼성화(hybridization) 완충액과 같은 하나 이상의 완충액, mRNA 프로브 제조용 화합물, 및 mRNA 분리용 성분을 포함할 수도 있다.
임의의 키트 구현예의 경우, 본원의 임의의 서열의 전부 또는 일부와 동일하거나 상보적인 서열을 함유하는 핵산 분자가 있을 수 있다.
상기 키트에는 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5, KIAA1683 중 하나 이상에 특이적으로 혼성화하는 바코드 프로브가 포함될 수 있다(예를 들어, 나노스트링 분석에 사용). 키트는 하나 이상의 mRNA 추출 시약 및/또는 어닐링 시약을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5, KIAA1683을 증폭하기 위한 프라이머를 함유할 것이며 선택적으로 제어 서열 증폭용 프라이머, 예컨대, 예를 들어 베타 액틴(ACTB) 증폭용 프라이머 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), 18S 리보솜 RNA(qPCR 분석용) 및 이의 단편을 포함한다.
다른 구현예에서, 키트는 mRNA 억제제(예를 들어, 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실이 발생할 위험이 높은 동종이식편 수용자에서 상향조절되는 mRNA를 표적으로 함(예를 들어, 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5, KIAA1683)를 함유할 수 있다.
키트는 유형에 관계없이 일반적으로 생물학적 제제가 배치되고 바람직하게는 적절하게 분취되는 하나 이상의 용기를 포함한다. 키트의 구성요소는 수성 매질 또는 동결건조 형태로 포장될 수 있다. 키트는 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 및/또는 을 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 및/또는 담체의 비제한적인 예에는 RNAase가 없는 물, 증류수, 완충수, 생리식염수, PBS, 링거액, 포도당 용액, 반응 완충액, 표지 완충액, 세척 완충액 및 혼성화 완충액이 포함된다.
키트는 키트 구성요소 사용에 대한 지침과 키트에 포함되지 않은 기타 시약의 사용 지침을 또한 포함할 수 있다. 지침에는 구현 가능한 변형이 포함될 수 있다. 이러한 시약은 본 발명의 키트의 구현예인 것으로 고려된다. 또한 키트는 위에서 확인된 특정 품목에 국한되지 않으며 유전자 조작 또는 특성화에 사용되는 모든 시약을 포함할 수 있다.
본원에서 고려되는 키트는 하나 이상의 mRNA 추출 시약 및/또는 cDNA 합성을 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
치료, 예후 또는 진단 적용을 위한 키트 및 그러한 용도가 고려된다. 또한, 특정 구현예에서, 대조군 RNA 또는 DNA가 키트에 포함될 수 있다. 대조군 RNA는 본원에 개시된 진단 분석을 위한 양성 대조군으로 사용될 수 있는 mRNA일 수 있다. 본 발명의 키트와 함께 사용하기 위한 하우스키핑 유전자의 비제한적인 목록은 아래 실시예 6에 제시되어 있다.
본 발명은 본 발명의 범위를 제한하지 않고 본 발명을 추가로 설명하도록 의도된 실시예에서 아래에 설명된다.
실시예 1: RNA 시퀀싱 분석: 9개-유전자 세트의 식별 및 섬유증 예측을 위한 이의 적용.
RNA 시퀀싱 분석 키트에는 다음이 포함된다:
1) Illumina TruSeq mRNA 라이브러리 준비 키트
2) TruSeq RNA 단일 인덱스 세트
3) 고품질 총 RNA 추출을 위한 QIAGEN RNeasy® Kit
RNA 시퀀싱 및 데이터 처리를 위한 방법:
QIAGEN RNeasy® 키트를 사용하여 이식 전(기준선(baseline))에 신장 이식 수용자로부터 채취한 전혈로부터 총 RNA를 추출하였으며, TruSeq mRNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 라이브러리를 생성하고 TruSeq RNA 단일 인덱스를 사용하여 추가로 다중화하였다. 인덱싱된 라이브러리를 Illumina HiSeq4000 시퀀서에서 시퀀싱하였다. 좋은 품질의 판독(read)은 먼저 BWA 정렬 알고리즘을 사용하여 hg19 인간 게놈, 엑손, 스플라이싱 접합 세그먼트(splicing junction segment)를 포함한 인간 참조 데이터베이스 및 리보솜 및 미토콘드리아 서열을 포함한 오염(contamination) 데이터베이스에 정렬하였다. 오염 데이터베이스에 매핑된 판독을 필터링한 후, 각 전사체에 대해 최대 2개의 불일치(mismatch)가 있는 엑손 및 스플라이싱 접합 세그먼트에 고유하게 정렬된 판독을 각 해당 전사체의 발현 수준으로 카운트하였다. 샘플 전체의 전사 수준을 비교하기 위해 판독 카운트를 log2 변환하고 동일한 전역(global) 중앙값으로 정규화하였다.
결과:
a) 환자 코호트 설명: 이 연구에는 RNA 시퀀싱을 받은 좋은 품질의 기준선 혈액 RNA를 가진 총 133명의 환자가 포함되었다(도 1). 133명의 환자 중 85명의 환자는 이식 전 신장이 양호하여 이식 전 CADI <2이거나 CADI 증가와 함께 섬유증이 진행되었다(m12 CADI >=2). 조기 감시(surveillance) 생검을 받은 85명의 환자 중 55명을 무작위로 선정하여 이식 후 12개월 시점의 신장 생검의 병리학 슬라이드에서 CADI 점수 >=2를 기반으로 진단되는 섬유증 발생 예측을 위한 유전자 시그니처 세트를 식별하기 위한 디스커버리 세트로 사용하였다. 잘 특성화된 섬유증 진행(사례 그룹: 이식 후 CADI 증가) 및 비진행(pre-imp CADI <2 및 m12 CADI <2) 비섬유증 진단을 갖춘 디스커버리 및 V1 세트를 사용하여 유전자 세트를 식별 및 검증하고 유전자 위험 점수 계산을 위해 섬유증 및 비섬유증 그룹의 p 값과 중앙값 발현을 도출하였다. 나머지 30명의 환자는 첫 번째 검증 코호트(V1)로 사용되었다. 이식 전 기증자 신장 CADI 점수가 높거나(pre-imp CADI >2) 또는 병리학 등급이 없는 48명의 환자는 두 번째 검증 세트 2(V2)로 사용되었다.
b) 9개 유전자 세트의 식별: 9개 유전자 세트 식별을 위한 워크플로우를 도 2에 도시하였다. 간단히 말하면, 55명의 환자로 구성된 디스커버리 세트에 대해 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 일련의 판독 품질 관리, 원시 서열 판독에 대한 매핑 및 정규화 단계(4) 후에 정규화된 판독 카운트를 유전자의 발현 값으로 표시하였다. 디스커버리 세트(N=55)의 섬유증 그룹과 비섬유증 그룹의 발현 값을 잘 알려진 LIMMA(5) 테스트를 사용하여 비교하여 섬유증이 발생한 환자와 그렇지 않은 환자 간에 차별적으로 발현된 유전자(differentially expressed gene, DEG)를 식별하였다. 인구통계학적 및 임상적 요인을 조정하여 유전자 목록을 추가로 필터링하여 최종적으로 25개의 유전자를 얻었다. 섬유증 그룹과 비섬유증 그룹 사이의 25 DEG의 발현 값의 차이를 요약하여 섬유증 발생에 대한 누적 위험 점수를 도출하였고, 25개 유전자에 대해 전방향(forward) 섹션을 반복적으로 적용하여 최대 예측 정확도를 갖는 최종 9개 유전자 세트를 결정하였다(AUC=0.9 도 3a, 표 1). 위험 평가에 사용되는 공식은 r =-(log10(p1)*g1 + log10(p2)*g2 + ... + log10(pi)*gi + ... + log10(p9)*g9)이고, 여기서 pi는 트레이닝 세트에서 섬유증이 발생한 환자와 발생하지 않은 환자 간의 유전자 ｉ(ｉ = 1...9)의 발현 값에 대한 t-검정의 유의성 p 값이고, gi는 유전자 ｉ(ｉ = 1...9)에 대한 논리 번호, 1(유전자 ｉ의 발현 값이 상향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 섬유증 그룹의 중앙 발현 값보다 큰 경우 또는 유전자 i의 발현 값이 하향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 섬유증 그룹의 중앙 발현 값보다 작은 경우), 또는 -1 (유전자 ｉ의 발현 값이 상향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 비-섬유증 그룹의 중앙 값보다 작은 경우 또는 유전자 i의 발현 값이 하향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 비-섬유증 그룹의 중앙 값보다 큰 경우), 또는 0 (유전자 ｉ의 발현 값이 트레이닝 세트의 섬유증 그룹과 비섬유증 그룹의 중앙 값 사이에 있는 경우)이다.
표 1: 섬유증 발생의 예측을 위한 9개 유전자 세트
c) 예측 정확도를 추정하기 위해: 유전자 위험 점수에 대한 2개의 삼분위 컷오프(1.57 또는 -4.98)를 정의하고 디스커버리 세트에서 섬유증 발생의 예측에 대해 양성 예측값(PPV)>0.88 및 음성 예측값(NPV) =1을 입증하였다(도 3b).
d) 섬유증 예측을 위한 2개의 검증 세트에 9개 유전자 세트의 적용: 9개 유전자 세트에 의한 초기 급성 거부반응 예측을 디스커버리 세트로부터 정의된 삼분위 컷오프에서 V1 데이터세트(N=30, AUC=0.79, PPV=0.85, NPV=0.81)를 사용하여 검증하였으며(도 4a,b). 이는 이식 전 신장이 좋지 않거나 이식 전 CADI를 알 수 없는 V2(n=30, AUC=0.58, PPV=0.56 및 NPV=0.71)에서 섬유증 발생의 예측보다 우수하였다.
실시예 2: 나노스트링 분석
나노스트링 분석 키트에는 다음이 포함된다:
1) Custom CodeSet(Nanostring에서 제공하는 9개 유전자 패널, 하우스키핑 유전자 패널 및 음성 대조군에 대한 바코드 프로브 세트).
2) nCounter 카트리지, nCounter 플레이트 팩 및 nCounter 준비 팩을 포함하는 nCounter® 마스터 키트.
3) 고품질 총 RNA 추출을 위한 QIAGEN RNeasy® Kit.
나노스트링 실험:
제조업체의 프로토콜에 따라 QIAGEN RNeasy® 키트를 사용하여 총 RNA를 추출한다. 바코드 프로브는 데이터 수집 시점에 용액 내 총 RNA에 어닐링된다. 혼성화 후, 샘플은 nCounter Pre Station으로 이동되고 프로브/표적은 nCounter 카트리지에 고정된다. 그런 다음 nCounter 디지털 분석기에 의해 프로브가 카운트된다.
mRNA 전사체 데이터 분석
Nanostring 분석기로부터의 원시 카운트 데이터는 다음 절차에 따라 처리된다: 원시 카운트 데이터는 먼저 하우스키핑 유전자 mRNA의 카운트로 정규화되고 중앙값에 음성 대조군 카운트의 3 표준 편차를 더한 것보다 낮은 카운트를 가진 mRNA는 필터링된다. 시약 로트에서 발생하는 데이터 변동으로 인해, 다양한 시약 로트의 각 mRNA에 대한 카운트는 다양한 시약 로트에 있는 샘플의 평균 카운트 비율 계수를 곱하여 보정된다. 다양한 실험 배치에서 보정된 카운트는 ComBat 패키지에 의해 추가로 조정된다.
실시예 4: qPCR 분석 또는 qPCR
qPCR 분석 키트에는 다음이 포함된다:
1) 프라이머 용기(9개 유전자 패널 및 2개 하우스키핑 유전자(ACTB 및 GAPDH) 및 대조군 프로브(18S 리보솜 RNA)를 포함하는 9개 유전자 각각에 대해 튜브당 하나의 qPCR 분석이 포함된 12개의 튜브. 분석은 LifeTech로부터 얻는다.
2) TaqMan® Universal Master Mix II: qPCR 반응용 시약
3) TaqMan® 어레이 96-웰 플레이트(6x23).
4) Agilent AffinityScript QPCR cDNA 합성 키트: RNA를 cDNA로 변환하는 최고의 효율성을 제공하며 실시간 정량 PCR(real-time quantitative PCR, QPCR) 적용에 완전히 최적화됨.
실험 절차 및 데이터 분석
ALLprep 키트(QIAGEN-ALLprep 키트, Valencia, CA USA)를 사용하여 동종이식편 생검 샘플에서 총 RNA를 추출한다. 올리고 dT 프라이머(Agilent Inc. Santa Clara, CA)와 함께 AffinityScript RT 키트를 사용하여 cDNA를 합성한다. 9개 유전자 시그니처 세트, 2개의 하우스키핑 유전자(ACTB, GAPDH) 및 18S 리보솜 RNA에 대한 TaqMan qPCR 분석은 ABI Life Technology(Grand Island, NY)에서 구입한다. TAQMAN universal mix를 사용하여 cDNA에 대해 qPCR 실험을 수행하고 ABI7900HT 시스템을 사용하여 PCR 반응을 모니터링하고 획득한다. 샘플은 3중으로 측정한다. 예측 유전자 세트 뿐만 아니라 2개의 하우스키핑 유전자에 대한 주기 시간(Cycle Time, CT) 값이 생성된다. 각 유전자의 CT 값은 각 유전자의 CT 값에서 하우스키핑 유전자의 평균 CT 값을 빼서 계산힌다.
실시예 5: 표적화된 RNA 시퀀싱( TREx ) 분석
TREx 분석 키트에는 다음이 포함된다:
1) Custom Assay(하우스키핑 유전자 패널을 포함하는 9개 유전자 패널에 대한 바코드 프로브 세트)
2) Illumina® TruSeq® RNA 샘플 준비 키트 v2
3) 고품질 총 RNA 추출을 위한 QIAGEN RNeasy® Kit
TREx 실험
QIAGEN RNeasy® Kit를 사용하여 총 RNA를 추출한다. 시퀀싱 라이브러리는 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina® TruSeq® RNA 샘플 준비 키트 v2를 사용하여 생성한다: 간략하게 말하면, 폴리A 함유 mRNA가 먼저 총 RNA로부터 정제되고 단편화된다. 첫 번째 가닥 cDNA 합성은 무작위 6량체(hexamer) 프라이머와 역전사효소를 사용하여 수행된 후 두 번째 가닥 cDNA 합성이 수행된다. 오버행(overhang)을 무딘(blunt) 말단 cDNA로 변환하는 말단수리(endrepair) 프로세스 후에 다중 인덱싱 어댑터가 이중 가닥 cDNA의 말단에 추가되고 PCR이 수행되어 유전자 패널 및 하우스키핑 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 표적을 풍부하게 한다. 마지막으로 인덱싱된 라이브러리는 MiSEQ 시퀀서에서 시퀀싱을 위해 검증, 정규화 및 풀링된다.
TREx 데이터 처리
MiSEQ 시퀀서에 의해 생성된 원시 RNAseq 데이터는 다음 절차에 따라 처리된다: 좋은 품질의 판독은 먼저 BWA 정렬 알고리즘을 사용하여 hg19 인간 게놈, 엑손, 스플라이싱 접합을 포함한 인간 참조 데이터베이스 및 리보솜 및 미토콘드리아 RNA 서열을 포함한 오염 데이터베이스에 정렬된다. 오염 데이터베이스에 매핑된 판독을 필터링한 후, 원하는 앰플리콘(즉, 쌍을 이루는 프라이머로부터의 PCR 산물) 영역에 대해 최대 2개의 불일치로 고유하게 정렬된 판독은 해당 유전자에 대한 발현 수준으로 카운트되며 추가로 R 통계 프로그램을 사용하여 log2 변환 후 샘플 전반에 걸쳐 분위수(quantile) 정규화를 수행하였다.
실시예 6: 본 발명에 사용하기 위한 하우스키핑 유전자 패널:
본 발명의 분석에서 품질을 모니터링하기 위한 유전자 패널로 사용될 수 있는 10개의 하우스키핑 유전자를 하기에 제시하였다. 패널당 10개의 유전자를 사용하여 반응의 품질을 모니터링한다. 키트에는 하우스키핑 유전자에 대한 프라이머도 포함되어 있다. 10개의 하우스키핑 유전자는 DERL1, PPID, PRKAG1, PRPF38A, PSMD6, RNF34, RRAGA, TINF2, UBE2G1, UBE2K, USP39 및 ZNF394로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 방법의 다수의 구현예가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 구현예는 하기 청구범위의 범위 내에 있다.
또한, 모든 값은 대략적인 값이며 설명을 위해 제공된다는 점이 이해되어야 한다. 특허, 특허 출원, 간행물, 제품 설명 및 프로토콜은 본 출원 전반에 걸쳐 인용되며, 그 개시 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.

Claims (23)

  1. 하기 단계를 포함하는, 동종이식편(allograft)의 섬유증(fibrosis)이 발생할 위험이 있는 인간 신장 동종이식편 수용자(recipient)를 치료하는 방법:
    (a) 동종이식편의 섬유증이 발생하지 않은 제2 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 대조군 혈액 표본의 발현 수준보다 높은 미리 선택된 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 검출된 발현 수준에 기초하여 동종이식편의 섬유증에 대한 위험이 있는 것으로 식별된 인간 신장 동종이식편 수용자를 선택하는 단계로서, 상기 발현 수준은
    i. 상기 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 혈액 표본으로부터 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고,
    ii. cDNA에서 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5 및 KIAA1683을 포함하는 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준을 검출함으로써 수득되는 것인 단계; 및
    (b) 선택된 인간 신장 동종이식편 수용자에게 유효량의 항섬유화제, 항거부반응 약물, 또는 둘 다를 투여하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 동종이식편 수용자의 섬유증 위험을 식별하기 위해 동종이식편 수용자의 샘플에서 결정된 발현 수준을 페널티화된 로지스틱 회귀 피팅 모델(penalized logistic regression fitting model)에 적용하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 페널티화된 로지스틱 회귀 피팅 모델이 하기 공식을 이용하는 것인 방법:
    r =-(log10(p1)*g1 + log10(p2)*g2 + ... + log10(pi)*gi + ... + log10(p9)*g9),
    여기서 pi는 트레이닝 세트에서 섬유증이 발생한 환자와 발생하지 않은 환자 간의 유전자 ｉ(ｉ = 1...9)의 발현 값에 대한 t-검정의 유의성 p 값이고, gi는 유전자 ｉ(ｉ = 1...9)에 대한 논리 번호(logic number), 1(유전자 ｉ의 발현 값이 상향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 섬유증 그룹의 중앙 발현 값보다 큰 경우 또는 유전자 i의 발현 값이 하향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 섬유증 그룹의 중앙 발현 값보다 작은 경우), 또는 -1(유전자 ｉ의 발현 값이 상향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 비-섬유증 그룹의 중앙 값보다 작은 경우 또는 유전자 i의 발현 값이 하향조절된 유전자에 대한 트레이닝 세트의 비-섬유증 그룹의 중앙 값보다 큰 경우), 또는 0 (유전자 ｉ의 발현 값이 트레이닝 세트의 섬유증 그룹과 비섬유증 그룹의 중앙 값 사이에 있는 경우)이다.
  4. 제1항에 있어서, 항거부반응 약물이 면역억제제 또는 항증식제인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 항거부반응 약물이 시롤리무스(sirolimus)인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 면역억제제가 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil, MMF), 프레드니손(prednisone), 마이코페놀레이트 나트륨 및 아자티오프린(Azathioprine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원(member)인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 항섬유증 약물이 피르페니돈(Pirfenidone), 릴랙신(relaxin), 골 형성 단백질 7(BMP-7) 및 간 성장 인자(HGF) 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 검출하는 것이 qPCR 분석, 나노스트링(Nanostring) 분석 및 TREx 분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원인 분석을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 동종이식편의 섬유증 위험이 있는 것으로 식별된 동종이식편 수용자의 면역억제 요법을 변경하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 면역억제 요법을 변경하는 것이 벨라타셉트(Belatacept), 라파마이신(rapamycin) 및 마이코페놀레이트 모페틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 항거부반응 약물의 유효량을 동종이식편 수용자에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 면역억제 요법을 변경하는 것이 피르페니돈, 릴랙신, 골 형성 단백질 7(BMP-7) 및 간 성장 인자(HGF) 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항섬유증 약물을 동종이식편 수용자에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  12. 하기 단계를 포함하는, 동종이식편의 섬유증 위험을 감소시키는 치료를 위한 인간 신장 동종이식편 수용자를 선택하는 방법:
    (a) 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 혈액 샘플 내 유전자 시그니처 세트의 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준을 검출하는 단계로서, 여기서 상기 유전자는 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5 및 KIAA1683인 단계, 및
    (b) 유전자 시그니처 세트의 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준이 대조군의 동일한 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준보다 높을 때 인간 신장 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 위험이 있는 것으로 식별하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 혈액 표본으로부터 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, cDNA의 유전자 시그니처 세트에서 유전자의 mRNA 발현 수준을 검출함으로써 상기 발현 수준을 결정하는 것을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 수용자의 혈액 샘플에서 결정된 mRNA 발현 수준을 페널티화된 로지스틱 회귀 피팅 모델에 적용하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, qPCR 분석, 나노스트링 분석 및 TREx 분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원인 분석을 사용하여 상기 mRNA의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  16. 하기 단계를 포함하는, 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 신장 동종이식편 수용자를 식별하는 방법:
    (a) 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 혈액 샘플로부터 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5 및 KIAA1683을 포함하는 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준을 검출하는 단계, 및
    (b) 시그니처 세트의 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준이 대조군의 유전자 시그니처 세트 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준보다 높을 때 인간 신장 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 것으로 식별하는 단계.
  17. 제16항에 있어서, 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 것으로 식별된 동종이식편 수용자에게 유효량의 항거부반응 약물, 면역억제제, 항섬유화제 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 동종이식편 수용자의 섬유증 위험을 식별하기 위해 동종이식편 수용자의 샘플에서 결정된 발현 수준을 페널티화된 로지스틱 회귀 피팅 모델에 적용하는 것을 포함하는 방법.
  19. 하기 단계를 포함하는, 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 신장 동종이식편 수용자를 식별하는 방법:
    (a) 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 혈액 샘플로부터 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5 및 KIAA1683을 포함하는 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준을 검출하는 단계, 및
    (b) 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준이 대조군의 유전자 시그니처 세트 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준보다 높을 때 인간 신장 동종이식편 수용자가 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 것으로 식별하는 단계.
  20. 제19항에 있어서, 동종이식편의 섬유증 및 동종이식편 손실의 위험이 있는 것으로 식별된 동종이식편 수용자에게 유효량의 항거부반응 약물, 면역억제제, 항섬유화제 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 동종이식편 수용자의 섬유증 위험을 식별하기 위해 동종이식편 수용자의 샘플에서 결정된 발현 수준을 상기 페널티화된 로지스틱 회귀 피팅 모델에 적용하는 것을 포함하는 방법.
  22. 하기 단계를 포함하는, 동종이식편의 섬유증이 발생할 위험이 있는 인간 신장 동종이식편 수용자를 치료하는 방법:
    (a) 대조군에서 유전자 시그니처 세트의 mRNA 발현 수준보다 높은 미리 선택된 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 검출된 발현 수준에 기초하여 동종이식편의 섬유증 위험이 있는 것으로 식별된 인간 신장 동종이식편 수용자를 선택하는 단계로서, 상기 발현 수준은
    i. 상기 신장 동종이식편 수용자로부터 얻은 혈액 표본으로부터 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고,
    ii. cDNA에서 유전자 NTSR1, TSPAN14, CCR3, SEC22C, FCER1G, YBEY, CLDN18, NLRC5 및 KIAA1683을 포함하는 유전자 시그니처 세트에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 수준을 검출함으로써 수득되는 것인 단계; 및
    (b) 선택된 인간 신장 동종이식편 수용자에게 유효량의 항섬유화제, 항거부반응 약물 또는 둘 다를 투여하는 단계.
  23. 제22항에 있어서, 대조군 수준이 유전자 시그니처 세트의 mRNA 발현 수준에 기초하여 계산되는 것인, 방법.
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