CN103154267B - 用于肝移植中的耐受性的诊断和/或预后的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于对接受肝移植的患者的耐受状态进行体外诊断和/或预后的方法和试剂盒，其包括评估在获得自研究中的患者的生物样品中的全身和/或肝内铁储备的水平，以及将其与参比样品的铁储备的水平比较，或与预定的阈值比较。

Description

用于肝移植中的耐受性的诊断和/或预后的方法和试剂盒
发明领域
本发明涉及人类医学领域。更具体地，本发明侧重于用于接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后的方法和试剂盒，所述方法和试剂盒包括评估在获得自研究中的患者的生物样品中的全身和/或肝内铁储备的水平，以及将其与参比样品的铁储备的水平比较，或与预定的阈值比较。
现有技术
移植的移植物的长期存活主要依赖终生服用免疫抑制药物以防止移植物排斥。这些药物在防止移植物排斥上是非常有效的，但是它们也与严重的副作用相关，所述副作用如肾毒性，机会性感染和肿瘤的风险增加，以及代谢并发症如糖尿病、高脂血症和动脉性高血压。由于免疫抑制药物的副作用，耐受性的诱导是移植免疫学研究的主要目标之一，耐受性被定义为移植物在没有长期免疫抑制的情况下保持正常功能的状态。在啮齿类动物中的大量移植物实验模型中有可能获得耐受性诱导。然而，将这些实验性治疗应用于临床中却在很大程度上失败了。在人中临床应用耐受性诱导的实验性治疗不成功的一个原因涉及缺少用于无创性诊断人移植物受者中的耐受性的精确工具。最近的出版物指出迫切需要这种工具(N.Najafian等2006和Newell等2006)。另一方面，尽管完全中止所有免疫抑制药物但是仍然保持正常的同种异体移植物功能在临床器官移植中偶有报道，尤其是在肝移植后。自发接受移植物的患者通常被认为是“可操作地(operationally)”耐受的，并且提供了以下观点的证据：在人类中实际上可以获得免疫耐受性。肝移植是仅有的耐受性在大比例的患者中自发发生的临床情况。实际上，完全停止免疫抑制可以在约21％的患者中实现(Lerut，J.等2006)。不幸地，目前没有方法在尝试停止免疫抑制前鉴定这些患者。因此，免疫抑制药物的完全中止在肝移植中很少尝试，并且因此许多患者继续被不必要地免疫抑制，并且这牵扯健康和经济问题。
之前主要在肾和肝受者中进行的鉴定移植中的耐受性的尝试已经采用抗原特异性功能性测定或抗原非特异性测试。在功能性测定中，在体外或体内利用供体抗原攻击受者T淋巴细胞(J.Cai等2004)，(J.Cai等2004)和(E.Jankowska-Gan E等2002)，(P.Sagoo等2010)。从机械论的观点，这些测定是非常有价值的，因为它们是仅有的能够揭示哪些途径负责耐受性状态的特异性的测试。不幸地，这些测定也难以进行，在实验室之间高度可变(难以标准化)，并且要求小心地冷冻保存的供体细胞的可用性。出于这些原因，功能性测定对于广泛的临床应用不是最佳的，并且目前仅在有选择的、高度专业化的实验室中采用，并且基本用于研究目的。
抗原非特异性免疫监测试验构成目的在于受者免疫系统的表型表征，而不使用供体抗原攻击的多种方法。在这些测试中，对T细胞受体CDR3长度分布型式(TcLandscape)的研究，通过使用流式细胞术对外周血细胞进行免疫表型分型，和基因表达模式已经被用于鉴定对人的耐受性具有特征性的生物标志物。TcLandscape技术已经被用于外周血中以区分耐受的肾受者和经历长期排斥的受者(S.Brouard等2005)。然而，该技术是昂贵的，目前仅在一个实验室(Inserm643and TcLand Expression in Nantes，France)中可用，并且从未在肝移植中得到验证。外周血免疫表型分型的使用已经利用来自耐受的肝肾移植受者的外周血样品进行。发明人已知专注于该方法学的至少四个研究。在来自美国的匹兹堡大学(G.V.Mazariegos等2003)的第一个研究中，据说pDC和mDC树突细胞亚群之间的比率可以区分儿科肝移植中的耐受的受者和不耐受的受者。在来自京都市的第二个研究(Y.Li等2004)中，据说外周血中的δ-1和δ-2γδT细胞之间提高的比率在耐受的受者中比在不耐受的肝受者中更普遍。在由本发明人协同的第三个研究(Martínez-Llordella等2007)中，与不耐受的受者相比，在耐受的肝受者的外周血中，观察到增加的CD4+CD25+T细胞的数目以及增加的δ-1与δ-2γδT细胞的比率。然而，在来自相同课题组的后续研究(Puig-Pey等Transplant Int2010)中，δ-1与δ-2γδ的比值被质疑。此外，这些测试中没有一个能够提供广泛的临床应用所需的精确性。使用基因表达谱技术以鉴定耐受性的生物标志物已被用于肾移植和肝移植两者中(S.Brouard等PNAS2007；M.Martínez-Llordella等J Clin Invest2008；K.Newell等.J ClinInvest2010；P.Sagoo等，J Clin Invest2010)。这些技术比上述测试更容易标准化。此外，参考的研究显示已鉴定的转录生物标志物的使用是一种用于区分摆脱免疫抑制药物的耐受的受者与需要保持免疫抑制的不耐受的受者的非常精确的方式。目前文献中发表的研究的主要限制是它们未尝试前瞻性地验证它们的结果。换言之，它们不能证明是否这些生物标志物可以在中止免疫抑制前鉴定耐受的受者。在没有该证明的情况下，不可能确定在基因表达中观察到的差异不是实际上由不耐受的受者的组中的药理学免疫抑制的作用所导致的。此外，之前报道的研究中没有一个尝试研究基因表达中的差异在移植物自身的水平上是否也存在。
虽然长期使用免疫抑制药物是目前确保移植的同种异体移植物的长期存活的唯一方式，但是这些药物昂贵且与导致极大的发病率和死亡率的严重副作用(肾毒性、肿瘤和感染发生、糖尿病、心血管并发症等)有关。因此，任何能够在移植中显著减少免疫抑制药物的使用的策略对移植受者的健康和生活质量都可以具有大的影响。
总之，提供经验证能够预测肝移植患者的耐受性，并且因此能够指示免疫抑制药物对所述患者的施用可以省去的方法仍然是有挑战性的。
发明内容
因此，本发明目的在于通过提供体外方法解决上述问题，所述体外方法通过评估获得自研究中的患者的生物样品中的全身和/或肝内铁储备(iron store)的水平，并将其与参比样品的铁储备的水平或与预定的阈值相比较从而鉴定耐受的肝移植受者。这是基于以下事实：与不耐受的肝移植受者相比，全身和/或肝内铁储备的水平(存在于体内、作为游离铁或与蛋白如转铁蛋白或铁蛋白结合的铁的铁总量)在耐受的肝移植受者中显著更高。
在本发明优选的实施方案中，对全身和/或肝内铁储备水平的评估通过以下方式进行：评价在研究中的患者的肝活组织检查样品中的直接参与铁代谢的特定组的基因的表达模式，所述基因是可靠的生物标记物，其能够预测肝移植患者的耐受性。因此，为了鉴定显示可以中止免疫抑制治疗的肝受者(耐受的)和需要维持免疫抑制药物的那些肝受者(不耐受的)之间表达水平谱的统计学显著的差异的那些基因，从一组维持免疫抑制治疗的、稳定的肝移植受者收集活组织检查肝组织样品，所述受者参与停止免疫抑制药物的前瞻性临床试验。
可以通过本领域技术人员已知的任何技术确定表达谱。特别地，可以在基因组水平和/或核酸水平和/或蛋白水平测量每种基因表达水平。在优选的实施方案中，通过测量每种基因的核酸转录物的量来确定表达模式。在另一个实施方案中，通过测量每种基因生产的蛋白的量来确定表达模式。
核酸转录物的量可以通过本领域技术人员已知的任何方法测量。特别地，所述测量可以直接在提取的信使RNA(mRNA)样品上，或在通过本领域中熟知的技术制备自提取的mRNA的反转录的互补DNA(cDNA)上进行。从mRNA或cDNA样品，可以使用本领域技术人员已知的任何技术测量核酸转录物的量，所述技术包括核酸微阵列(nucleic microarrays)、定量PCR和与标记的探针的杂交。
在不应被视为限制本发明的范围的具体的实施方案中，通过使用Illumina Beadchip全基因组表达微阵列对这些活组织检查样品的表达模式进行测定，这鉴定出具有p值＜0.01且错误发现率(FDR)＜25％的基因(表1)。
表1.在耐受的和不耐受的肝活组织检查样品之间差异表达的基因的列表
然后，基于微阵列结果和在免疫耐受的实验动物模型中进行的大量研究，选择一组104个基因(列表于表2中)用于使用定量实时PCR的验证。
表2.通过实时PCR分析的基因的列表
(M＝在微阵列显著，PK＝先验知识(previous knowledge)，HK＝持家对照(houskeeping control))
NCBI加入日期：2010年7月28日
通过实时PCR进行的实验的结果揭示在表3中列出的基因显示在取自可以安全地放弃免疫抑制药物的肝移植患者(耐受的)和当中止免疫抑制药物时发生排斥的患者(不耐受的)的活组织检查样品之间表达的统计学显著的差异。如在表3中所示，与不耐受的肝移植受者相比，在耐受的肝移植受者中，基因TFRC和MIF是下调的，并且基因CDHR2、HMOX1、HAMP、IFNG、PEBP1、SLC5A12、ADORA3和DAB2是上调的。如果将取自肝移植患者的活组织检查样品与参比RNA样品(其可以是获得自健康的非移植的肝组织的RNA的库，参比RNA如可商购自Ambion的Human LiverTotal RNA(人肝总RNA)，或存在于含有之前经量化的数目的RNA分子的样品中的绝对参比RNA)比较可以获得相同的结果。
表3
重要的是注意表3中的基因共享功能途径，因为它们参与铁代谢调节。实际上，可以成功地中止免疫抑制药物治疗的耐受的患者的活组织检查样品显示更大的铁累积，如在图1A中所示。此外，肝内铁含量的这些差异独立于任何临床参数如自移植起的时间或在基线处采用的免疫抑制疗法的类型(图1B)。已知基因TFRC、HAMP、IFNG和HMOX1直接参与控制细胞铁代谢。特别地，在全身铁缺乏的情况中，TFRC表达典型地增加而HAMP表达减少。在我们的实验中，被发现在耐受的和不耐受的患者之间差异表达的基因参与调节铁代谢被以下观察进一步说明：TFRC、HAMP、CDHR2、MIF、SLC5A12、ADORA3、HMOX1、IFNG和DAB2与肝内铁沉积(通过改良的Scheuer的方法或总铁评分(total iron score)法测量的；见图2)显著相关。因此，可以说表3中包含的基因的表达模式是在耐受的患者中存在与不耐受的患者相比显著更高水平的全身和/或肝内铁储备的清楚指示(图2)，并且因此是用于鉴定耐受的肝移植受者的可靠生物标志物。
更具体地，这些结果指示：对于根据本发明的方法的设计，参与所述铁代谢调节的基因的表达水平应当是尤其相关的。因此，在所述和所要求保护的发明中，属于在肝内水平调节铁代谢的基因的任何表达模式应当被认为是相当的表达模式，或表达谱。因此，属于肝中铁代谢的所述调节的任何基因的表达应当被认为是本发明所述基因的功能等价物。
因此，本发明的优选实施方案涉及用于接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后的方法，所述方法包括：
a.从研究中的患者的肝同种异体移植物获得生物样品；
b.测量以下基因或其组合或等价物中至少一种的表达水平：TFRC、CDHR2、HMOX1、MIF、HAMP、IFNG、PEBP1、SLC5A12、ADORA3和DAB2；
c.通过将取自肝活组织检查的样品中的步骤b)的至少一个基因的移植物内表达水平与取自参比RNA样品的相同基因的表达水平相比较，评估研究中的患者对移植的肝同种异体移植物的耐受性或不耐受性。
参比样品是获得自健康的非移植受试者的肝组织的生物样品的预定表达模式。它可以是RNA的库，参比RNA如可商购自Ambion的HumanLiver Total RNA(人肝总RNA)，或存在于含有之前经量化的数目的RNA分子的样品中的绝对参比)。
如在以下表4中所示，表3中包含的每个基因的表达水平的测量可以用于鉴定可以安全地中止所有免疫抑制药物治疗而不发生排斥(耐受性)的患者。因此，该表4显示其中所列单个基因在统计学上区分在缺乏免疫抑制治疗的情况下将耐受移植的肝的患者与当免疫抑制药物治疗中止时将排斥的那些受者的能力。
表4
AUC：曲线下面积
SN：灵敏性
SP：特异性
ER：误差率
PPV：阳性预测值
NPV：阴性预测值
然而，虽然表3或4中所列基因具有单个的预测的能力，产生与所述基因的某些组合相偏离的不同的群，目标在于尽可能精确地鉴定预测的方法。此外，表3或4中所列基因也与本身不显示预测值的其他基因(单独地看)成组，所述其他基因例如：LC5A12、VNN3、SOCS1、TTC3、RBM23、SH2D1B、NCR1、TFRC、TUBA4A、TAF15、TIPARP、MOX1、MCOLN1、EBP1、DHR2和AB2。因此，在优选实施方案中，本发明还包括测量与表3或4中所列的至少一个基因组合的以下基因中至少一个的表达水平：LC5A12、VNN3、SOCS1、TTC3、RBM23、SH2D1B、NCR1、TFRC、TUBA4A、TAF15、TIPARP、MOX1、MCOLN1、EBP1、DHR2和AB2。
为了鉴定在对肝移植中停止免疫抑制药物的结果的诊断中具有最佳性能的基因表达生物标志物的一种或多种组合，我们采用在misclassification penalized posterior(MiPP)软件中执行的线性判别分析和逻辑回归算法进行对预测模型的详尽寻找。首先，我们对收集自在巴塞罗那医院门诊部(Hospital Clinic Barcelona)中参与的患者的一组肝样品(18个耐受的和31个不耐受的)进行10-折交叉验证步骤。接着，通过重复地将其划分为训练组(2/3)和独立测试组(1/3)对整个数据集(其包括来自Barcelona的56个样品和来自Rome和Leuven的21个另外的样品)进行诊断模型的随机分裂(splitting)交叉验证以用于外部模型验证。此外，对于在训练组中鉴定的每个模型，采用ROC(接受者操作曲线(Receiver OperatingCurves))分析计算耐受性的最佳概率截断值(optimal probability cut-off)。为证明模型的性能不是中心依赖的，之后我们计算了收集自Barcelona的样品和获得自Rome和Leuven的那些样品的SN、SP、NPV、PPV和总误差率。重要地，对在中止免疫抑制药物治疗前获得的样品进行所有基因表达测量。因此我们的结果指示鉴定的遗传标志物能够预测停止免疫抑制药物的成功。
如上所述，该类型的分析不仅考虑了被发现是被差异表达的基因的那些基因(表3)而且还考虑了这样的基因，虽然所述基因(单独地看)在统计上不差异地表达，在与表3的基因组合的情况下其确实有助于优化诊断。表5基于通过实时PCR测量的在肝活组织检查样品中的基因表达，显示用于预测模型的设计和评价的样品组。重要地，在将收集自Barcelona受者的样品用于微阵列和qPCR实验的同时，获得自Rome和Leuven的样品中没有一个用于微阵列实验。
表5
因此，根据qPCR表达测量的结果，表6显示其表达最好地将患者分为不耐受类或耐受类的基因的组合。任意选择在学习组中小于15％和在验证组中小于15％的分类误差以选择最精确且在临床上有用的模型。
表6
SN：灵敏性
SP：特异性
ER：误差率
PPV：阳性预测值
NPV：阴性预测值
本发明的一个实施方案涉及在用于接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后的方法中使用以下基因或其组合的至少一种：TFRC、CDHR2、HMOX1、MIF、HAMP、IFNG、PEBP1、SLC5A12、ADORA3和DAB2。在优选实施方案中，使用至少一个上述基因与至少一个以下基因的组合进行本发明的方法：LC5A12、VNN3、SOCS1、TTC3、RBM23、SH2D1B、NCR1、TFRC、TUBA4A、TAF15、TIPARP、MOX1、MCOLN1、EBP1、DHR2和AB2。在尤其优选的实施方案中，使用以下基因组合中的一个进行本发明的方法：LC5A12、VNN3、TFRC、SOCS1、MIF、TTC3、RBM23、PEBP1、SH2D1B、NCR1、DAB2和ADORA3；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、HAMP、TUBA4A、TTC3、HMOX1、VNN3、NCR1、ADORA3、TAF15、IFNG、SOCS1和TIPARP；MOX1、CDHR2、MIF、PEBP1、TFRC、SLC5A12、SOCS1、HAMP、VNN3和IFNG；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、SLC5A12、HAMP、SOCS1、IFNG和HMOX1；TFRC、IFNG、CDHR2、ADORA3、HAMP、MIF、PEBP1、VNN3、SOCS1、HMOX1和DAB2；TFRC、DAB2、MIF、PEBP1、IFNG、HAMP、SLC5A12、SOCS1、VNN3、ADORA3、CDHR2、MCOLN1和HMOX1；TFRC、IFNG、HMOX1、MCOLN1、MIF、HAMP、ADORA3、CDHR2、PEBP1和SOCS1；EBP1、TFRC、HMOX1、IFNG、MCOLN1、SOCS1、MIF、CDHR2、HAMP和ADORA3；TFRC、PEBP1、IFNG、CDHR2、ADORA3、VNN3、HMOX1、DAB2、SOCS1、MIF和HAMP；DHR2、ADORA3、IFNG、TFRC、VNN3、HMOX1、PEBP1、MIF、SLC5A12、HAMP、SOCS1和MCOLN1；LC5A12、TFRC、IFNG、MIF、DAB2、HMOX1、CDHR2、SOCS1、HAMP、PEBP1、VNN3、ADORA3和MCOLN1；TFRC、SOCS1、HMOX1、PEBP1、VNN3、CDHR2、HAMP、IFNG、DAB2、MCOLN1、ADORA3和MIF；TFRC、PEBP1、VNN3、SOCS1、MIF、HMOX1、DAB2、HAMP、IFNG、CDHR2、ADORA3和MCOLN1；LC5A12、MIF、CDHR2、TFRC、IFNG、ADORA3、HAMP、VNN3、SOCS1、MCOLN1、PEBP1和HMOX1；TFRC、IFNG、CDHR2、ADORA3、PEBP1、VNN3、MIF、HMOX1、MCOLN1、SOCS1、SLC5A12、DAB2和HAMP；TFRC、VNN3、HAMP、CDHR2、SLC5A12、HMOX1、SOCS1、PEBP1和MIF；AB2、TFRC、MIF、CDHR2、PEBP1、VNN3、TTC3、HMOX1和SOCS1；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、VNN3、IFNG、MCOLN1和SOC S1；TFRC、PEBP1、MIF、SOCS1和CDHR2；ADORA3、CDHR2、MIF、PEBP1、TAF15和TFRC；CDHR2、MIF、PEBP1、SLC5A12、SOCS1、TAF15和TFRC；ADORA3、CDHR2、HAMP、MIF、PEBP1、SOCS1、TAF15和TFRC；CDHR2、HAMP、IFNG、MCOLN1、MIF、PEBP1、SOCS1、TFRC和VNN3。
一些临床变量可以影响在人中在肝移植后可操作耐受性的发展。特别地，已经移植达较长时间段的受者或年龄较大的受者更有可能能够成功地中止免疫抑制药物治疗。我们进行了另外的逻辑回归分析以排除这2个临床变量对基因表达测量的潜在混淆作用。在表3或4中所列的基因中，在排除了受者年龄和自移植起的时间的影响后，发现以下基因是统计学显著的(表7)。
表7
基因 P值
TFRC 0,0033
PEBP1 0,0125
HMOX1 0,0177
IFNG 0,0198
CDHR2 0,0234
DAB2 0,0572
为了开发独立于临床变量的遗传预测物，我们对显示在表7中的基因使用逻辑回归和MiPP软件。发现以下模型在学习组患者和验证组患者中都是最佳预测物(表8)。
表8
因此，本发明的另外的实施方案涉及通过测量以下的基因组合的基因表达：TFRC，IFNG和CDHR2对接受肝移植的患者的耐受状态进行体外诊断和/或预后的方法。
在根据本发明的方法的特别的实施方案中，所述方法还可以包括确定可以用于诊断和/或预后的至少一个附加参数。所述“可以用于诊断的参数”是这样的参数，所述参数不能单独用于诊断，但是其被描述为在耐受的受试者和明显需要免疫抑制治疗的受试者之间显示显著不同的值并且因此也可以用于改进和/或确认根据上述的根据本发明的方法的诊断。因此，本发明的另一个实施方案是如上所述的方法并且其还包括确定患者的年龄和/或移植后的时间。
本发明的另一个实施方案涉及试剂盒，其用于进行本发明的用于对接受肝移植的患者的耐受状态进行体外诊断和/或预后的方法，上述试剂盒包括(i)用于测量相应基因的基因表达水平的装置，和(ii)用于将所述基因表达水平与取自参比RNA样品的相同基因的表达水平之上或之下相关联的使用说明。
所述参比样品可以是获得自健康的非移植的肝组织的RNA的库，参比RNA如可商购自Ambion的Human Liver Total RNA(人肝总RNA)，或存在于含有之前经量化的数目的RNA分子的样品中的绝对参比)。在优选实施方案中，所述装置包括微阵列或基因芯片，所述微阵列或基因芯片包含核酸探针，所述核酸探针包含与相应组的基因的转录物特异性杂交的序列，以及用于进行微阵列分析的试剂。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述试剂盒包含寡核苷酸引物(即用于基因TFRC的HS02559818s1或用于基因VNN3的Hs01125168m1)，以用于进行定量反转录聚合酶链式反应，所述引物包含与来源于相应组的基因的转录物的互补DNA特异性杂交的序列。此外，本发明的试剂盒可以包含固体载体，其中包含与相应组的基因的转录物特异性杂交的序列的核酸探针展示在其上。
在另一个实施方案中，所述装置包括微阵列或蛋白芯片，所述微阵列或蛋白芯片包含特异性结合部分如单克隆抗体或其片段。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒测量以下基因或其组合中的至少一种的表达：TFRC、CDHR2、HMOX1、MIF、HAMP、IFNG、PEBP1、SLC5A12、ADORA3和DAB2，以用于对接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后。在优选实施方案中，本发明的试剂盒测量至少一个上述基因与至少一个以下基因的组合的基因表达：LC5A12、VNN3、SOCS1、TTC3、RBM23、SH2D1B、NCR1、TFRC、TUBA4A、TAF15、TIPARP、MOX1、MCOLN1、EBP1、DHR2、和AB2。在尤其优选的实施方案中，本发明的试剂盒测量以下基因组合的基因表达：LC5A12、VNN3、TFRC、SOCS1、MIF、TTC3、RBM23、PEBP1、SH2D1B、NCR1、DAB2和ADORA3；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、HAMP、TUBA4A、TTC3、HMOX1、VNN3、NCR1、ADORA3、TAF15、IFNG、SOCS1和TIPARP；MOX1、CDHR2、MIF、PEBP1、TFRC、SLC5A12、SOCS1、HAMP、VNN3和IFNG；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、SLC5A12、HAMP、SOCS1、IFNG和HMOX1；TFRC、IFNG、CDHR2、ADORA3、HAMP、MIF、PEBP1、VNN3、SOCS1、HMOX1和DAB2；TFRC、DAB2、MIF、PEBP1、IFNG、HAMP、SLC5A12、SOCS1、VNN3、ADORA3、CDHR2、MCOLN1和HMOX1；TFRC、IFNG、HMOX1、MCOLN1、MIF、HAMP、ADORA3、CDHR2、PEBP1和SOCS1；EBP1、TFRC、HMOX1、IFNG、MCOLN1、SOCS1、MIF、CDHR2、HAMP和ADORA3；TFRC、PEBP1、IFNG、CDHR2、ADORA3、VNN3、HMOX1、DAB2、SOCS1、MIF和HAMP；DHR2、ADORA3、IFNG、TFRC、VNN3、HMOX1、PEBP1、MIF、SLC5A12、HAMP、SOCS1和MCOLN1；LC5A12、TFRC、IFNG、MIF、DAB2、HMOX1、CDHR2、SOCS1、HAMP、PEBP1、VNN3、ADORA3和MCOLN1；TFRC、SOCS1、HMOX1、PEBP1、VNN3、CDHR2、HAMP、IFNG、DAB2、MCOLN1、ADORA3和MIF；TFRC、PEBP1、VNN3、SOCS1、MIF、HMOX1、DAB2、HAMP、IFNG、CDHR2、ADORA3和MCOLN1；LC5A12、MIF、CDHR2、TFRC、IFNG、ADORA3、HAMP、VNN3、SOCS1、MCOLN1、PEBP1和HMOX1；TFRC、IFNG、CDHR2、ADORA3、PEBP1、VNN3、MIF、HMOX1、MCOLN1、SOCS1、SLC5A12、DAB2和HAMP；TFRC、VNN3、HAMP、CDHR2、SLC5A12、HMOX1、SOCS1、PEBP1和MIF；AB2、TFRC、MIF、CDHR2、PEBP1、VNN3、TTC3、HMOX1和SOCS1；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、VNN3、IFNG、MCOLN1和SOC S1；TFRC、PEBP1、MIF、SOCS1和CDHR2；ADORA3、CDHR2、MIF、PEBP1、TAF15和TFRC；CDHR2、MIF、PEBP1、SLC5A12、SOCS1、TAF15和TFRC；ADORA3、CDHR2、HAMP、MIF、PEBP1、SOCS1、TAF15和TFRC；CDHR2、HAMP、IFNG、MCOLN1、MIF、PEBP1、SOCS1、TFRC和VNN3。
本发明的优选的实施方案之一涉及用于接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒测量以下基因组合的基因表达：TFRC、IFNG和CDHR2。
根据本发明的试剂盒还可以包含用于进行微阵列分析的试剂和/或固体载体，其中包含与相应组的基因的转录物特异性杂交的序列的核酸探针展示在其上。
本发明的另一个实施方案涉及一种试剂盒，所述试剂盒用于通过使用上面公开的方法或试剂盒评估肝受者的耐受状态来选择或改进免疫疗法治疗方案。
本发明的最后一个实施方案涉及用于使肝移植的患者的免疫抑制治疗适应的方法，所述方法包括使用以上公开的方法和试剂盒。
现有技术包括(Benitez C等，摘要#517，American TransplantCongress，San Diego，CA，May3-May5，2010)在外周血样品中测量不同于在本发明中提出的基因的一组基因(KLRF1、PTGDR、NCALD、CD160、IL2RB、PTCH1、ERBB2、KLRB1、NKG7、KLRD1、FEZ1、GNPTAB、SLAMF7、CLIC3、CX3CR1、WDR67、MAN1A1、CD9、FLJ14213、FEM1C、CD244、PSMD14、CTBP2、ZNF295、ZNF267、RGS3、PDE4B、ALG8、GEMIN7)的表达，作为鉴定耐受的肝受者的方法。进行比较测定(见实施例10)以确定形成本发明的一部分的基因与之前公开的基因相比在外周血中是否具有更强的判别力。结论是，对肝组织样品中的包含在本发明中的基因的表达的测量，表现出至少比对外周血中的包含在现有技术中的基因的测量精确，以便鉴定因为其对移植耐受所以可以成功脱离免疫抑制药物治疗的肝受者。
此外，本发明提供另外的证据，所述证据支持铁代谢在获得对肝同种异体移植物的可操作耐受中的作用：
●在Perls染色后使用Scheuer改良方法或总铁评分法以半定量方式测量的肝铁含量(肝内铁储备)，在耐受的肝受者中比在不耐受的肝受者中显著更高(见图1)。
●铁调素(hepcidin)(在调节全身铁稳态中最重要的激素，其实际由HAMP编码)的血清水平在耐受的肝受者中比在不耐受的肝受者中显著更高(见图3和实施例9)。这与以下观察一致：假定在铁缺乏情况中生理反应是减少铁调素的产生，则铁储备在耐受的肝受者中比在不耐受的肝受者中更高。
●铁蛋白(一种最精确的总身体铁储备的标志物)的血清水平在耐受的肝受者中比在不耐受的肝受者中显著更高(见图4A和B以及实施例11)；
●肝组织磷酸化-Stat3蛋白水平在耐受的受者中比在不耐受的受者中显著更高(见图5和实施例12)。这与以下观察一致：铁调素将Stat3磷酸化，并且因此在缺乏铁调素(例如由于铁缺乏引起)的情况下，磷酸化-Stat3的水平下降。
总之，这些结果指示在全身和肝内水平上对铁代谢的调节通过对转录因子Stat3的活化的肝内调节，在控制肝移植中的同种免疫应答中起作用。类似地，肝内铁水平、血清铁调素和血清铁蛋白的量化也应当被看做是本发明所述的基因的功能等价物。
因此，本发明的另一个实施方案涉及一种用于接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后的方法，所述方法包括：从研究中的患者的肝同种异体移植物获得生物样品，测量所述样品中的肝内铁储备的水平，和通过将其肝内铁储备的水平与取自参比样品的肝内铁储备的水平相比较来评估研究中的患者对肝移植的耐受性或不耐受性，了解到，如上所述，与不耐受的肝移植受者相比，在耐受的肝移植受者中，肝内铁储备的水平显著更高。可以通过现有技术中已知的任何方法对肝内铁储备的水平进行评估，例如(非穷举列表)：通过利用铁特异性染色(例如Perls普鲁士兰)直接染色肝活组织检查切片，通过使用原子吸收分光光度法量化来自肝组织活组织检查样品的铁，或通过对整个肝磁共振成像。在此情况中，参比值是基于在耐受的和不耐受的肝移植患者之间观察到的差异而预先确定的阈值，如在图1中所示。
本发明的另一个实施方案涉及一种用于接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后的方法，所述方法包括：从研究中的患者的血清获得生物样品，测量所述样品中的蛋白铁蛋白的水平，和通过将其铁蛋白的水平与取自参比样品的相同蛋白的水平相比较来评估研究中的患者对肝移植的耐受性或不耐受性，了解到，如上所述，与不耐受的肝受者相比，在耐受的肝受者中，铁蛋白的血清水平显著更高。可以通过现有技术中已知的任何方法对蛋白铁蛋白的水平进行评估，例如(非穷举列表)：ELISA和放射免疫测定。在此情况中，参比值是基于在耐受的和不耐受的肝移植患者之间观察到的差异而预先确定的阈值，如在图4中所示。
本发明的另一个实施方案涉及一种用于接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后的方法，所述方法包括：从研究中的患者的肝同种异体移植物获得生物组织样品，测量所述样品中的磷酸化-Stat3的蛋白水平，和通过将其磷酸化-Stat3的蛋白水平与取自参比样品的相同蛋白的蛋白水平相比较来评估研究中的患者对肝移植的耐受性或不耐受性，了解到，如上所述，与不耐受的肝受者相比，在耐受的肝受者中，磷酸化-Stat3的肝组织水平显著更高。可以通过现有技术中已知的任何方法对肝组织磷酸化-Stat3的水平进行评估，例如(非穷举列表)：免疫组化、免疫荧光和蛋白印迹(Western-Blot)。在此情况中，参比值是预先确定的阈值或参比样品，了解到，如上所述，与不耐受的肝移植受者相比，在耐受的肝移植受者中，肝内磷酸化-Stat3的水平显著更高，如在图5中所示。
本发明的另一个实施方案涉及一种用于接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后的方法，所述方法包括：从研究中的患者获得生物样品，测量所述样品中的铁调素的蛋白水平，和通过将其铁调素的蛋白水平与取自参比样品的相同蛋白的蛋白水平相比较来评估研究中的患者对肝移植的耐受性或不耐受性，了解到，如上所述，与不耐受的肝受者相比，在耐受的肝受者中，铁调素的血清水平显著更高。可以通过现有技术中已知的任何方法对铁调素的水平进行评估，例如(非穷举列表)：质谱和ELISA。在此情况中，参比样品存在具有已知浓度的铁调素类似物，了解到与不耐受的肝受者相比，在耐受的肝受者中，铁调素的血清水平显著更高，如在图3中所示。
附图简述
图1.
(A)肝铁含量(在Perls染色后使用Scheuer改良方法或总铁评分法以半定量方式测量)在可以成功脱离免疫抑制治疗的耐受的患者(TOL)的肝中比在那些不耐受的患者(其中这是不可能的)(Non-TOL)中显著更高。
(B)如通过Scheuer方法评估的肝内铁染色的存在或缺乏不依赖于自移植起经过的时间(左图)和在基线处使用的免疫抑制药物的类型(右图)，并且可以用于区分耐受的(黑条)和不耐受的(白条)患者。
图2.该图显示单个的基因表达测量对肝内铁的水平(通过改良的Scheuer方法测量)的影响。最高的条对应于最有影响的基因(HAMP、TFRC、CDHR2)。参比线是如通过Goeman的Globaltest确定的统计显著性的阈值。
图3.该图显示：与不耐受的肝受者相比，在耐受的受者中，铁调素(由基因HAMP编码的肽)的血清水平显著增加。
图4.
(A)该图显示铁蛋白(全身身体铁储备的标志物)的血清水平在耐受的肝受者中比在不耐受的肝受者中显著更高。
(B)该图显示在耐受的(TOL)和不耐受的(Non-TOL)受者中铁蛋白血清水平的分布：铁蛋白＜12ng/mL(耗尽的铁储备)，铁蛋白12-30ng/mL(减少的铁储备)，铁蛋白＞30ng/mL(充足的铁储备)。如所示，没有一个耐受的患者显示耗尽的铁储备，并且仅有少数显示减少的铁储备。相对比地，大约30％的不耐受的患者显示异常低的全身铁储备。
图5.该图显示：与不耐受的(Non-TOL)肝受者相比，在耐受的(TOL)肝受者中，对磷酸化的STAT3染色呈阳性的肝组织切片的面积显著更大。
实施例
实施例1.患者群体和研究设计。
血液和肝活组织检查标本收集自一组肝移植受者，该组肝移植受者参与了前瞻性欧盟委员会支持的在肝移植中停止免疫抑制药物的多中心临床试验(标题：Search for the immunological Signature of OperationalTolerance in Liver Transplantation(寻找肝移植中可操作耐受性的免疫学标志)；clinicaltrials.gov标识符NCT00647283)。入选标准为以下：1)移植后＞3年；2)在入选前12个月期间肝功能稳定并且没有排斥事件；3)没有自体免疫肝病的历史；4)入选前肝活组织检查没有明显异常(根据Banff标准没有急性或慢性排斥的征象；在＞50％的肝门束(portal tract)中不存在肝门炎症；在＞50％的中央静脉中不存在中央静脉炎(central perivenulitits)；不存在桥接纤维化或硬化)。在参与的受者中，逐渐中断免疫抑制药物直至在6-9个月的时期内完全中止，然后随访另外的12个月。如果在研究的整个持续过程中没有发生排斥事件并且在12个月的随访期结束时获得的肝活组织检查样品中没有观察到明显的组织学变化，则患者被认为是耐受的。在研究期间经历急性排斥的患者被认为是不耐受的。在参与试验的102个受者中，79个(33个耐受的和46个不耐受的)入选本研究。在停止免疫抑制药物之前从耐受的(TOL，n＝33)和不耐受的(Non-TOL，n＝46)受者，在排斥时从不耐受的受者(n＝14)，以及在研究结束时在耐受的受者(n＝4)中，获得可用于研究的血液和肝活组织检查标本。此外，肝组织样品也获得自以下患者组：a)具有由复发性丙型肝炎病毒感染所致的慢性肝炎的肝移植受者(HEPC，n＝12)；b)具有在移植后即期期间发生的典型急性细胞排斥的肝移植受者(REJ，n＝9)；c)在移植后的1年在维持免疫抑制的情况下具有正常肝功能和正常肝组织学的肝移植受者(CONT-Tx，n＝8)；和d)经历结直肠肝转移癌手术的非移植患者(CONT，n＝10)。参与的受者入选自巴塞罗那医院门诊部(Hospital Clínic Barcelona)(西班牙)、UniversityTor Vergata Rome(意大利)和鲁汶大学医院(University Hospitals Leuven)(比利时)。该研究被参与的三个研究所的机构审查委员会批准，并且从所有的研究患者获得书面知情同意书。入选研究的患者的临床和人口统计学特征概述于表1中，并且在图1中描绘了研究设计的大纲。患者群体的详述和停止免疫抑制临床试验的临床结果将在他处报道。
实施例2.肝活组织检查标本和组织学评估。
在局麻下经皮进行肝活组织检查。将肝穿刺活检圆柱体的2-3mm部分立即保存在RNAlater试剂(Ambion，Austin，USA)中，在4℃保持24h并且然后在除去RNAlater试剂后将其冷冻保存在液氮中。剩下的圆柱体进行福尔马林固定和石蜡包埋。在CONT患者中，获得非肿瘤肝的手术肝活组织检查样品并如前所述对其进行处理。为了组织学评估，使用苏木精-伊红和用于结缔组织分析的Masson三色染色3μm厚的切片。由对所有临床和生物学数据都不了解的相同的病理学家进行组织学检查。评估以下组织病理学项目并进行半定量的打分：1)完整肝门束的数目；2)中央静脉的数目；3)整体实质结构；4)小叶炎症；5)中央静脉炎；6)肝门束炎症；7)胆管病变；8)胆管损失；9)门静脉分支的存在；9)门静脉纤维化；10)窦周纤维化。
实施例3.RNA提取和处理.
为了提取总RNA，使用研杵和不含核酸酶的1,5ml反应管(Ambion)将冷冻保存的肝组织样品在TRIzol试剂(Invitrogen，San Diego，CA，USA)中匀浆。然后遵从制造商的指导提取总RNA，并且利用Agilent2100Bioanalyzer(生物分析仪)(Agilent Technologies，Santa Clara，USA)评估质量。
实施例4.Illumina微阵列实验.
将一百零五个肝RNA样品(20个TOL，32个Non-TOL，14个Non-TOL-Rej，12个HEPC，9个REJ，8个CONT-Tx和10个CONT；它们全部来自巴塞罗那医院门诊部)加工成cRNA，并且将其杂交在含有对应于25,000个有注释的基因的48,771个探针的Illumina HumanHT-12Expression BeadChip(Illumina，Inc.San Diego，CA，USA)上。使用BeadStudio数据分析软件(Illumina，Inc.)计算表达数据，并且随后采用分位数归一化(quantiles normalisation)使用Lumi bioconductor软件包[6]进行处理。接着，我们进行保守探针过滤步骤，排除具有5％的变异系数的那些探针，这导致在原有的48,771个探针的组中选择了总计33,062个探针。
实施例5.Affymetrix微阵列实验.
在选择的10个TOL和10个Non-TOL受者的组中，在通过54,675个探针涵盖47,000个有注释的基因并且包含可商购的核酸探针的AffymetrixHuman Genome U133Plus2.0阵列(Affymetrix，Inc，Santa Clara，CA，USA)上重复微阵列实验。采用提取自4个TOL-Post肝样品(10个TOL受者中的4个，在完全停止药物后12个月从他们获得的肝活组织检查组织也是可用的)的RNA进行另外的Affymetrix实验。使用调整了胍-胞嘧啶含量的稳健多阵列算法将基因表达数据归一化，该算法从探针强度结合探针序列信息计算表达值。其后，我们采用保守探针过滤步骤，排除在至少一个样品中没有达到5的log2表达值的探针，这导致在原有的54,675个探针的组中选择了总计18,768个探针。
实施例6.微阵列基因表达数据分析.
为鉴定在不同微阵列研究组之间差异表达的基因，我们采用微阵列的显著性分析(Significant Analysis of Microarray)(SAM)。SAM使用针对数据组中的每个基因的改良t检验统计学和经验系数(fudge factor)计算t值，由此控制每个基因的不切实际地低的标准偏差。此外，SAM允许通过为实际检验结果和获得自受试组的重复排列的结果之间的差异选择阈值来控制错误发现率(FDR)。对于本研究，我们采用SAM选择，使用FDR＜10％和1000次排列。为了用图表示不同研究组之间的全面基因表达差异，将全部过滤的探针列表用于进行对应分析，如在包括在made4软件包(Culhane AC等Bioinformatics2005)中的组间分析(between-group-analysis)(BGA)功能中所实现的。该方法能够将高维数据如多基因表达测量以2D图形可视化，其中由椭圆限定的区域表示95％的在第一和第二轴中样品得分的估计的双正态分布。为确定目的基因的组是否与临床结果(耐受性相对于排斥)、临床变量(供体和受者年龄、性别、免疫抑制治疗的类型、自移植起的时间)和组织学特征(铁含量)显著相关，我们采用Globaltest软件(Goeman，等Bioinformatics2004)。该软件中的语法也被用于针对被发现在耐受的和不耐受的受者之间具有统计学差异的多余临床协变量的可能混淆作用，修正在基因表达和临床结果之间发现的联系。
实施例7.定量实时PCR(qPCR)实验.
为验证微阵列表达结果，使用ABI7900Sequence Detection System(序列检测系统)和TaqMan LDA微流体平板(Applied Biosystems，Carlsbad，USA)(包括可商购的寡核苷酸引物)，在48个受者(18个TOL和31个Non-TOL；它们都来自巴塞罗那医院门诊部)的亚组上，测量104个靶基因和3个持家基因的组(补充的表1)的表达谱。此外，在10个TOL和11个Non-TOL受者的独立组中进行qPCR实验，所述受者由University TorVergata Rome和University Hospitals Leuven提供，并且不能从其获得微阵列数据。基于以下选择靶基因：1)Illumina和Affymetrix微阵列实验结果；2)之前被我们组描述为与肝可操作耐受性相关的血液转录生物标志物(M.Martínez-Llordella等J Clin Invest2008)；和3)文献中所述的突出的免疫调节基因。使用Turbo DNA-free DNAse(不含DNA的DNA酶)处理(Ambion)将DNA从总RNA制剂中除去，并且然后使用HighCapacity cDNAReverse Transcription Kit(cDNA反转录试剂盒)(Applied Biosystems)将RNA反转录为cDNA。为量化转录物水平，相对持家基因归一化靶基因Ct值以产生ΔCt值。然后根据ΔΔCt方法将结果计算为靶样品和校准样品的cDNA之间的相对表达。使用以下三种样品作为校准物：1)来自8个CONT-Tx样品的汇集的RNA；2)来自10个CONT样品的汇集的RNA；和3)可商购的肝RNA(Human Liver total RNA(人肝总RNA)，Ambion)。
实施例8.鉴定和验证基因分类物.
为开发基于活组织检查的qPCR基因表达分类物以预测停止免疫抑制的成功性，我们使用在misclassification penalized posterior(误分类后罚分)(MiPP)软件中执行的线性判别分析和逻辑回归算法对预测模型进行了详尽的搜寻。MiPP基于用于发现最简约诊断模型的逐步增量分类建模，并且采用双交叉验证策略。首先，为获得最优模型同时避免大量筛选搜寻的缺陷，我们对来自巴塞罗那医院门诊部的18个TOL和31个Non-TOL肝受者的训练组进行10-折交叉验证步骤。接着，通过重复地将其划分为训练组(2/3)和独立测试组(1/3)对整个数据组(其包括来自巴塞罗那的56个样品和来自Rome和Leuven的21个样品)进行诊断模型的随机分裂交叉验证以用于外部模型验证。对于在训练组中鉴定的每个模型，通过ROC分析计算耐受性的最佳概率截断值。使用测试组和训练组的大量的随机分裂允许我们获得关于诊断精确性的置信界限。基于这些置信界限，获得每个候选分类物的诊断性能和平均误分类误差率。为证明模型的性能是非中心依赖的，我们之后计算收集自巴塞罗那的样品和获得自Rome和Leuven的那些样品的SN、SP、NPV、PPV和总误差率。
实施例9.血清铁调素测量.
使用BD vacutainer SST II(BD Bioscience，Franklin Lakes，USA)在基线从64名入选的肝受者获得血清样品并将其储存在-80℃。通过结合弱阳离子交换色谱和飞行时间质谱(TOF MS)进行定量血清铁调素测量。为了量化，将铁调素类似物(合成的铁调素-24；Peptide International Inc.)用作内标。在Microflex LT基质增强激光解吸附/电离TOF MS平台(Bruker Daltonics)上生成肽谱。将血清铁调素-25浓度表示为nmol/L。该方法检测的下限为0.5nM；平均变异系数为2.7％(批内(intra-run))和6.5％(批间(inter-run))。血清铁调素-25的中值参考水平是4.2nM，范围为0.5-13.9nM。
如在图3中所示，与不耐受的肝受者相比，在耐受的受者中，铁调素(由基因HAMP编码的肽)的血清水平显著增加并且，因此，铁调素的水平对于待进行肝移植的患者的耐受状态的诊断和/或预后是有价值的标志物。
实施例10.现有技术中包括的用于诊断肝移植中耐受性的方法与本发明的方法之间的比较测定.
现有技术的方法包括在外周血样品中测量一组基因(KLRF1、PTGDR、NCALD、CD160、IL2RB、PTCH1、ERBB2、KLRB1、NKG7、KLRD1、FEZ1、GNPTAB、SLAMF7、CLIC3、CX3CR1、WDR67、MAN1A1、CD9、FLJ14213、FEM1C、CD244、PSMD14、CTBP2、ZNF295、ZNF267、RGS3、PDE4B、ALG8、GEMIN7)的表达，所述基因不同于本发明中给出的基因。此外，本实施例显示本发明的方法具有更高的判别力。
现有技术的方法产生以下结果：
A)FEM1C和IL8的组合：
SN＝63％；SP＝80.77％；ER＝7.08％；PPV＝77.68％；NPV＝72.41％
B)KLRF1和SLAMF7的组合
SN＝27.7％，SP92.31％，ER＝37.5％，PPV＝73.68％，NPV＝72.41％
C)KLRF1和IL2RB的组合
SN＝50％，SP＝84.62％，ER＝31.25％，PPV＝73.33％，NPV＝66.67％
SN：灵敏性
SP：特异性
ER：误差率
PPV：阳性预测值
NPV：阴性预测值
然而，基于在相同的48名患者的肝组织中对包含在表3、4和6中的基因的测量，本发明的方法(选择三个性能最佳的模型用于该比较测定)产生以下结果：
A)TFRC、CDHR2、HMOX1、MIF、HAMP、IFNG、PEBP1、SLC5A12、ADORA3的组合：
SN＝77.27％，SP＝96.15％，ER＝12.5％，PPV＝94.44％，NPV＝83.33％
B)TFRC、PEBP1、MIF、ADORA3的组合
SN＝90.91％，SP＝84,62％，ER＝12.5％，PPV＝83.33％，NPV＝91.67％
C)TFRC、IFNG、HAMP、CDHR2的组合
SN＝77.27％，SP＝88.46％，ER＝16.67％，PPV＝85％，NPV＝82.14％
SN：灵敏性
SP：特异性
ER：误差率
PPV：阳性预测值
NPV：阴性预测值
因此，结论是：在肝组织样品中测量包含在本发明中的基因的表达，表现出至少比在外周血中测量包含在现有技术中的基因精确，从而鉴定因为其对移植耐受所以可以成功地脱离免疫抑制药物治疗的肝受者。
实施例11.血清铁蛋白测量.
使用BD vacutainer SST II(BD Bioscience，Franklin Lakes，USA)在基线从64名入选的肝受者获得血清样品，并将其储存在-80℃。通过自动ELISA方法进行血清铁蛋白测量。铁蛋白血清水平与血清铁调素相关。因此，与不耐受的(Non-TOL)受者相比，在耐受的(TOL)受者中，铁蛋白血清水平显著更高(图4A)。在Non-TOL受者中，唯一地观察到缺少的铁储备(血清铁蛋白＜12ng/mL，铁缺乏的高度特异性指标)(图4B)。铁调素或铁蛋白与耐受性之间的联系不受受者年龄，自移植起的时间或基线免疫抑制治疗干扰，如在逻辑回归多变量分析中通过其独立的预测值所证明的。
因为，如在图4中所示，与不耐受的肝受者相比，在耐受的受者中，铁蛋白的血清水平显著增加，所以铁蛋白的水平对于待进行肝移植的患者的耐受状态的诊断和/或预后是有价值的标志物。
实施例12.磷酸化-Stat3免疫染色.
假定铁调素通过Janus激酶2(Jak2)的磷酸化以激活转录因子信号转导及转录激活蛋白3(Stat3)的能力(De Domenico等J Clin Invest2010)，我们在来自12个耐受的(TOL)和13个不耐受的(Non-TOL)患者的肝活组织检查的亚组中量化磷酸化的Stat3。将石蜡包埋的肝活组织检查切片脱蜡，并通过在1mM EDTA(pH8.0)中煮沸15分钟来进行抗原修复。随后，将切片用背景减少试剂(DAKO，Glostrup，Denmark)处理并遵循供应商的说明用磷酸化-STAT3(Tyr705)兔单克隆抗体(Cell Signalling Technology，Danvers，MA，USA)染色。采用DAB底物(DAKO)使免疫染色显影，并且使用苏木精进行复染。使用Nikon Eclipse E600显微镜和analySIS软件评估图像，并且使用Image J软件(NIH，Bethesda，USA)通过蓝色通道的阈值受控的缩小，以及之后的残留染色像素的二值化和测量分析图像。几乎仅在肝细胞核中观察到强的磷酸化-Stat3染色，其沿活组织检查切片簇集成随机分布的局灶。相对比地，在浸润的单核白细胞、巨噬细胞和内皮细胞的细胞核中，染色微弱并且频率低得多。
与不耐受的患者(Non-TOL)样品相比，耐受的患者(TOL)肝活组织检查显示显著增加的肝细胞磷酸化-Stat3染色(图5)。所以，磷酸化-Stat3的水平对于待进行肝移植的患者的耐受状态的诊断和/或预后是有价值的标志物。
实施例13.评估肝铁含量.
为评估肝内铁储备的大小，我们利用Perls染色对3μm厚的肝切片进行染色。采用如所述的Scheuer改良方法和总铁评分(TIS)评分系统(Deugnier等Hepatology1993；Scheuer等J Pathol Bacteriol1962)半定量地评估铁含量。此外，单独地对肝细胞和间质(内皮细胞和Kupffer细胞)铁染色进行评分。在收集自耐受的(TOL)患者的大部分肝样品中观察到轻微门脉周围肝细胞铁沉积。相对比地，在来自不耐受的(Non-TOL)受者的肝活组织检查中没有观察到可染色的铁(图1A)。这些差异仅是由于肝细胞(而不是间质)铁累积所致。在TOL和Non-TOL之间的铁储备差异可以用于区分两组患者，而不管自移植起经过的时间或施用的免疫抑制药物的类型(图1B)。
因为，如在图1中所示，肝铁含量在可以成功脱离免疫抑制治疗的(TOL)耐受的患者的肝中比在其中不可能脱离免疫抑制治疗的(Non-TOL)那些不耐受的患者中显著更高，所以对于待进行肝移植的患者的耐受状态的诊断和/或预后，铁的水平可以用作有价值的标志物。
参考文献
1.Lerut，J.和Sanchez-Fueyo，A.2006.An appraisal of tolerance in livertransplantation(对肝移植中耐受性的评价).Am J Transplant6：1774-1780.
2.N.Najafian等，″How can we measure immunologic tolerance inhumans？(我们如何测量人的免疫耐受性？)”J.Am.Soc.Nephrol.2006，vol.17，pp.2652-63.
3.Newell等，″Tolerante assays：measuring the unknown(耐受性测定：测量未知)″，Transplantation2006，vol.81，pp.1503-9.
4.J.Cai等，″Minor H antigen HA-1-specific regulator and effector CD8+T cells，and HA-1microchimerism，in allograft tolerance(在同种异体移植物耐受性中，次要H抗原HA-1-特异性调节物和效应器CD8+T细胞和HA-1微嵌合体)″，J.Exp.Med.2004，vol.199，pp.1017-23.
5.E.Jankowska-Gan E等，″Human liver allograft acceptance and the″tolerance assay″(人肝同种异体移植物接受和‘耐受性测定’)，Hum.Immunol.2002，vol.63，pp.862-70.
6.P.Sagoo等，“Development of a cross-platform biomarker signature todetect renal transplant tolerance in humans(开发交叉平台生物标志物识别标记以检测人的肾移植耐受性)”，J.Clin.Invest.2010，vol.120，pp.1848-61.
7.S.Brouard等，″Operationally tolerant and minimallyimmunosuppressed kidney recipients display strongly altered blood T-cellclonal regulation(可操作耐受的和最小免疫抑制的肾受者显示强烈改变的血液T细胞克隆调节)″，Am.J.Transplant.2005，vol.5，pp.330-40.
8.G.V.Mazariegos等，″Dendritic cell subset ratio in peripheral bloodcorrelates with successful withdrawal of immunosuppression in liver transplantpatients(外周血中树突细胞亚群比率与肝移植患者中成功停止免疫抑制相关)″，Am.J.Transplant.2003，vol.3，pp.689-96.
9.Y.Li等，″Analyses of peripheral blood mononuclear cells inoperational tolerance after pediatric living donor liver transplantation(对外周血单核细胞分析儿科活供体肝移植之后的可操作耐受性)″，Am.J.Transplant.2004，vol.4，pp.2118-25.
10.M.Martinez-Llordella等Multiparameter of immune profiling ofoperational tolerance in liver transplantation(肝移植中可操作耐受性的免疫分型的多参数).Am.J.Transplant.2007，vol.7，pp.309-19.
11.I.Puig-Pey等Characterization of gammadelta T cell subsets in organtransplantation(器官移植中γδT细胞亚群的表征).Transplant.Int.2010.Epub.
12.S.Brouard等Identification of a peripheral blood transcriptionalbiomarker panel associated with operational renal allograft tolerance(鉴定与可操作的肾同种异体移植物耐受性相关的外周血转录生物标志物组).Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.2007，vol.104，pp.15448-53.
13.K.A.Newell等Identification of a B cell signature associated withrenal transplant tolerance in humans(鉴定与人的肾移植物耐受性相关的B细胞识别标记).J.Clin.Invest.2010，vol.120，pp.1836-47.
14.Y.M.Deugnier等Differentiation between heterozygotes andhomozygotes in genetic hemochromatosis by means of a histological hepaticiron index：a study of192cases(通过组织学肝铁指数对遗传性血色素沉着中的杂合子和纯合子进行区分：192个病例的研究).Hepatology1993，vol.17，pp.30-4.
15.P.J.Scheuer等Hepatic pathology in relatives of patients withhaemochromatosis(在患有血色素沉着的患者的亲属中的肝脏病理学).J.Pathol.Bacteriol.1962，vol.84，pp.53-64.
16.A.C.Culhane等MADE4：an R package for multivariate analysis ofgene expression data(MADE4：用于基因表达数据的多变量分析的R软件包).Bioinformatics.2005，vol.21，pp.2789-90.
17.J.J.Goeman等A global test for groups of genes：testing associationwith a clinical outcome(对多组基因的全局测试：与临床结果相关的测试).Bioinformatics.2004，vol.20，pp.93-9.
18.De Domenico，I.，等Hepcidin mediates transcriptional changes thatmodulate acute cytokine-induced inflammatory responses in mice(铁调素介导小鼠中调节急性细胞因子诱导的炎症应答的转录变化).The Journal ofclinical investigation120，2395-2405(2010).

Claims (20)

1.至少一种下述试剂：测量TFRC、CDHR2、HMOX1、MIF、HAMP、IFNG、PEBP1、SLC5A12、ADORA3和DAB2之一的表达水平的试剂或其组合或测量至少一种下述基因TFRC、CDHR2、HMOX1、MIF、HAMP、IFNG、PEBP1、SLC5A12、ADORA3和DAB2或其组合的表达水平的装置在制备用于接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后的试剂盒中的用途，其中通过比较至少一种下述基因TFRC、CDHR2、HMOX1、MIF、HAMP、IFNG、PEBP1、SLC5A12、ADORA3和DAB2或其组合的表达水平与取自参比样品的相同基因或其组合的表达水平来评估肝移植研究中患者的耐受或非耐受。
2.权利要求1的用途，其中所述基因选自TFRC、IFNG和CDHR2。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述参比样品是选自以下中的RNA样品：获得自健康的非移植肝组织的RNA库；市售的参比RNA；或存在于包含之前经量化的数目的RNA分子的样品中的绝对参比RNA。
4.根据权利要求1的用途，其特征在于与取自所述参比RNA样品的相同基因的表达水平相比较，在耐受的肝移植受者中，基因TFRC和MIF是下调的，而基因CDHR2、HMOX1、HAMP、IFNG、PEBP1、SLC5A12、ADORA3和DAB2是上调的。
5.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述试剂盒还包括至少一种用于测量以下基因中的一种的表达水平的试剂：LC5A12、VNN3、SOCS1、TTC3、RBM23、SH2D1B、NCR1、TFRC、TUBA4A、TAF15、TIPARP、MOX1、MCOLN1、EBP1、DHR2和AB2，或
还包括用于测量至少一种下述基因的表达水平的装置：LC5A12、VNN3、SOCS1、TTC3、RBM23、SH2D1B、NCR1、TFRC、TUBA4A、TAF15、TIPARP、MOX1、MCOLN1、EBP1、DHR2和AB2。
6.根据权利要求1或2的用途，其特征在于所述试剂盒还包括用于测量以下基因组合中的至少一种的表达水平的装置：LC5A12、VNN3、TFRC、SOCS1、MIF、TTC3、RBM23、PEBP1、SH2D1B、NCR1、DAB2和ADORA3；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、HAMP、TUBA4A、TTC3、HMOX1、VNN3、NCR1、ADORA3、TAF15、IFNG、SOCS1和TIPARP；MOX1、CDHR2、MIF、PEBP1、TFRC、SLC5A12、SOCS1、HAMP、VNN3和IFNG；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、SLC5A12、HAMP、SOCS1、IFNG和HMOX1；TFRC、IFNG、CDHR2、ADORA3、HAMP、MIF、PEBP1、VNN3、SOCS1、HMOX1和DAB2；TFRC、DAB2、MIF、PEBP1、IFNG、HAMP、SLC5A12、SOCS1、VNN3、ADORA3、CDHR2、MCOLN1和HMOX1；TFRC、IFNG、HMOX1、MCOLN1、MIF、HAMP、ADORA3、CDHR2、PEBP1和SOCS1；EBP1、TFRC、HMOX1、IFNG、MCOLN1、SOCS1、MIF、CDHR2、HAMP和ADOR43；TFRC、PEBP1、IFNG、CDHR2、ADORA3、VNN3、HMOX1、DAB2、SOCS1、MIF和HAMP；DHR2、ADORA3、IFNG、TFRC、VNN3、HMOX1、PEBP1、MIF、SLC5A12、HAMP、SOCS1和MCOLN1；LC5A12、TFRC、IFNG、MIF、DAB2、HMPX1、CDHR2、SOCS1、HAMP、PEBP1、VNN3、ADORA3和MCOLN1；TFRC、SOCS1、HMOX1、PEBP1、VNN3、CDHR2、HAMP、IFNG、DAB2、MCOLN1、ADORA3和MIF；TFRC、PEBP1、VNN3、SOCS1、MIF、HMOX1、DAB2、HAMP、IFNG、CDHR2、ADORA3和MCOLN1；LC5A12、MIF、CDHR2、TFRC、IFNG、ADORA3、HAMP、VNN3、SOCS1、MCOLN1、PEBP1和HMOX1；TFRC、IFNG、CDHR2、ADORA3、PEBP1、VNN3、MIF、HMOX1、MCOLN1、SOCS1、SLC5A12、DAB2和HAMP；TFRC、VNN3、HAMPP、CDHR2、SLC5A12、HMOX1、SOCS1、PEBP1和MIF；AB2、TFRC、MIF、CDHR2、PEBP1、VNN3、TTC3、HMOX1和SOCS1；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、VNN3、IF1NG、MCOLN1和SOCS1；TFRC、PEBP1、MIF、SOCS1和CDHR2；ADORA3、CDHR2、MIF、PEBP1、TAF15和TFRC；CDHR2、MIF、PEBP1、SLC5A12、SOCS1、TAF15和TFRC；ADORA3、CDHR2、HAMP、MIF、PEBP1、SOCS1、TAF15和TFRC；CDHR2、HAMP、IFNG、MCOLN1、MIF、PEBP1、SOCS1、TFRC和VNN3，
或还包括至少一种下述试剂组合：用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：LC5A12，VNN3，TERC，SOCS1，MIF，TTC3，RBM233，PEBP1，SH2D1B，NCR1，DAB2和ADORA3；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：TFRC，PEBP1，MIF，CDHR2，HAMP，TUBA4A，TTC3，HMOX1，VNN3，NCR1，ADORA3，TAF15，IFNG，SOCS1和TIPARP；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：MOX1，CDHR2，MIF，PEBP1，TFRC，SLC5A12，SOCS1，HAMP，VNN3和IFNG；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：TFRC，PEBP1，MIF，CDHR2，SLC5A12，HAMP，SOCS1，IFNG和HMOX1；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：TFRC，IFNG，CDHR2，ADORA3，HAMP，MIF，PEBP1，VNN3，SOCS1，HMOX1和DAB2；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：TFRC，DAB2，MIF，，PEBP1，IFNG，HAMP，SLC5A12，SOCS1，VNN3，ADORA3，CDHR2，MCOLN1和HMOX1；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：TFRC，IFNG，HMOX1，MCOLN1，MIF，HAMP，ADORA3，CDHR2，PEBP1和SOCS1；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：EBP1，TFRC，HMOX1，IFNG，MCOLN1，SOCS1，MIF，CDHR2，HAMP和ADORA3；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：TFRC，PEBP1，IFNG，CDHR2，ADORA3，VNN3，HMOX1，DAB2，SOCS1，MIF和HAMP；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：DHR2，ADORA3，IFNG，TFRC，VNT3，HMOX1，PEBP1，MIF，SLC5A12，HAMP，SOCS1和MCOLN1；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：LC5A12，TFRC，IFNG，MIF，DAB2，HMOX1，CDHR2，SOCS1，HAMP，PEBP1，VNN3，ADORA3和MCOLN1；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：TFRC，SOCS1，HMOX1，PEBP1，VNN3，CDHR2，HAMP，IFNG，DAB2，MCOLN1，ADORA3和MIF；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：TFRC，PEBP1，VNN3，SOCS1，MIF，HMOX1，DAB2，HAMP，IFNG，CDHR2，ADORA3和MCOLN1；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：LCSA12，MIF，CDHR2，TFRC，IFNG，ADORA3，HAMP，VNN3，SOCS1，MCOLN1，PEBP1和HMOX1；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：TFRC，IFNG，CDHR2，ADORA3，PEBP1，VNN3，MIF，HMOX1，MCOLN1，SOCS1，SLC5A12，DAB2和HAMP；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：TFRC，VNN3，HAMP，CDHR2，SLC5A12，HMOX1，SOCS1，PEBP1和MIF；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：AB2，TFRC，MIFCDHR2，PEBP1，VNN3，TTC3，HMOX1和SOCS1；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：TFRC，PEBP1，MIFCDHR2，VNN3，IFNG，MCOLN1和SOCS1；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：TFRC，PEBP1，MIFSOCS1和CDHR2；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：ADORA3，CDHR2，MIF，PEBP1，TAF15和TFRC；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：CDHR2，MIF，PEBP1，SLC5A12，SOCS1，TAF15和TFRC；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：ADORA3，CDHR2，HAMP，MIF，PEBP1，SOCS1，TAF15和TFRC；
用于测量一种下述基因的表达水平的试剂的组合：CDHR2，HAMPIFNG，MCOLN1，MIF，PEBP1，SOCS1，TFRC和VNN3。
7.根据权利要求1或2的用途，其中所述试剂盒还包括用于测量全身和/或肝内铁储备的水平的装置。
8.根据权利要求1或2的用途，其中所述试剂盒还包括用于测量蛋白铁蛋白的水平的装置。
9.根据权利要求1或2的用途，其中所述试剂盒还包括用于测量磷酸化-Stat3的蛋白水平的装置。
10.根据权利要求1或2的用途，其中所述试剂盒还包括用于测量铁调素的蛋白水平的装置。
11.一种用于接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)用于测量直接参与铁代谢的特定组基因中至少一种的基因表达水平的装置，和(ii)用于将所述基因表达水平与取自参比RNA样品的相同基因的表达水平之上或之下相关联的使用说明，其中所述特定组基因包括下述基因或其组合：TFRC、CDHR2、HMOX1、MIF、HAMP、IFNG、PEBP1、SLC5A12、ADORA3和DAB2。
12.根据权利要求11的试剂盒，其中所述装置还测量下述基因中的至少一种：LC5A12、VNN3、SOCS1、TTC3、RBM23、SH2D1B、NCR1、TFRC、TUBA4A、TAF15、TIPARP、MOX1、MCOLN1、EBP1、DHR2和AB2。
13.根据权利要求11的试剂盒，其中所述装置还测量下述基因中的至少一种：LC5A12、VNN3、TFRC、SOCS1、MIF、TTC3、RBM23、PEBP1、SH2D1B、NCR1、DAB2和ADORA3；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、HAMP、TUBA4A、TTC3、HMOX1、VNN3、NCR1、ADORA3、TAF15、IFNG、SOCS1和TIPARP；MOX1、CDHR2、MIF、PEBP1、TFRC、SLC5A12、SOCS1、HAMP、VNN3和IFNG；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、SLC5A12、HAMP、SOCS1、IFNG和HMOX1；TFRC、IFNG、CDHR2、ADORA3、HAMP、MIF、PEBP1、VNN3、SOCS1、HMOX1和DAB2；TFRC、DAB2、MIF、PEBP1、IFNG、HAMP、SLC5A12、SOCS1、VNN3、ADORA3、CDHR2、MCOLN1和HMOX1；TFRC、IFNG、HMOX1、MCOLN1、MIF、HAMP、ADORA3、CDHR2、PEBP1和SOCS1；EBP1、TFRC、HMOX1、IFNG、MCOLN1、SOCS1、MIF、CDHR2、HAMP和ADORA3；TFRC、PEBP1、IFNG、CDHR2、ADORA3、VNN3、HMOX1、DAB2、SOCS1、MIF和HAMP；DHR2、ADORA3、IFNG、TFRC、VNN3、HMOX1、PEBP1、MIF、SLC5A12、HAMP、SOCS1和MCOLN1；LC5A12、TFRC、IFNG、MIF、DAB2、HMOX1、CDHR2、SOCS1、HAMP、PEBP1、VNN3、ADORA3和MCOLN1；TFRC、SOCS1、HMOX1、PEBP1、VNN3、CDHR2、HAMP、IFNG、DAB2、MCOLN1、ADORA3和MIF；TFRC、PEBP1、VNN3、SOCS1、MIF、HMOX1、DAB2、HAMP、IFNG、CDHR2、ADORA3和MCOLN1；LC5A12、MIF、CDHR2、TFRC、IFNG、ADORA3、HAMP、VNN3、SOCS1、MCOLN1、PEBP1和HMOX1；TFRC、IFNG、CDHR2、ADORA3、PEBP1、VNN3、MIF、HMOX1、MCOLN1、SOCS1、SLC5A12、DAB2和HAMP；TFRC、VNN3、HAMP、CDHR2、SLC5A12、HMOX1、SOCS1、PEBP1和MIF；AB2、TFRC、MIF、CDHR2、PEBP1、VNN3、TTC3、HMOX1和SOCS1；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、VNN3、IFNG、MCOLN1和SOCS1；TFRC、PEBP1、MIF、SOCS1和CDHR2；ADORA3、CDHR2、MIF、PEBP1、TAF15和TFRC；CDHR2、MIF、PEBP1、SLC5A12、SOCS1、TAF15和TFRC；ADORA3、CDHR2、HAMP、MIF、PEBP1、SOCS1、TAF15和TFRC；CDHR2、HAMP、IFNG、MCOLN1、MIF、PEBP1、SOCS1、TFRC和VNN3。
14.根据权利要求11-13中任一项的试剂盒，其中所述参比样品是选自以下中的RNA样品：获得自健康的非移植肝组织的RNA库；市售的参比RNA；或存在于包含之前经量化的数目的RNA分子的样品中的绝对参比RNA。
15.根据权利要求11-13中任一项的试剂盒，其中所述装置包括微阵列或基因芯片，所述微阵列或基因芯片包含核酸探针，所述核酸探针包含与每种所述基因的转录物特异性杂交的序列，以及用于进行微阵列分析的试剂。
16.根据权利要求11-13中任一项的试剂盒，所述试剂盒还包含用于进行定量反转录聚合酶链式反应的寡核苷酸引物，其中所述引物包含与来源于每种所述基因的转录物的互补DNA特异性杂交的序列。
17.根据权利要求11-13中任一项的试剂盒，所述试剂盒还包含固体载体，其中包含与每种所述基因的转录物特异性杂交的序列的核酸探针展示在所述固体载体上。
18.根据权利要求11-13中任一项的试剂盒，其中所述装置包括微阵列或蛋自芯片，所述微阵列或蛋白芯片包含特异性结合部分。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述特异性结合部分是单克隆抗体或其片段。
20.根据权利要求11的试剂盒，其中所述装置测量下述基因组合的基因表达：TFRC、IFNG和CDHR2。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11572587B2 (en) * 2014-06-26 2023-02-07 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Method for diagnosing subclinical and clinical acute rejection by analysis of predictive gene sets
WO2018015551A1 (en) * 2016-07-22 2018-01-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for discriminating a tolerant subject
EP3516078A1 (en) * 2016-09-23 2019-07-31 Life Technologies Corporation Compositions and methods for assessing immune response
WO2019107673A1 (ko) * 2017-11-29 2019-06-06 서울대학교병원 Abo 혈액형 부적합 이식시의 항체-매개성 거부반응의 모니터링을 위한 바이오마커

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008081039A1 (en) * 2007-01-04 2008-07-10 Institut D'investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (Idibaps) Methods and kits for diagnosis and/or prognosis of the tolerant state in liver transplantation
WO2010000320A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-07 Institut D'investigations Biomediques August Pi I Sunyer (Idibaps) In vitro diagnosis/prognosis method and kit for assessment of tolerance in liver transplantation

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE1010935A7 (nl) * 1997-02-19 1999-03-02 Delanghe Joris Richard Siegfri Fenotypering van humaan haptoglobine in serum of plasma door middel van quantitatieve agglutinatie met streptococcus antigenen.
JP2004300098A (ja) * 2003-03-31 2004-10-28 Oxygenix:Kk 移植用臓器の処理方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008081039A1 (en) * 2007-01-04 2008-07-10 Institut D'investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer (Idibaps) Methods and kits for diagnosis and/or prognosis of the tolerant state in liver transplantation
WO2010000320A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-07 Institut D'investigations Biomediques August Pi I Sunyer (Idibaps) In vitro diagnosis/prognosis method and kit for assessment of tolerance in liver transplantation

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Barry R et al..Quantitative protein profiling using antibody arrays.《Proteomics》.2004,第4卷(第12期),第3717-3726页. *
Bohne F et al..Transcriptional profiling of liver grafts in spontaneous operational tolerance.《Transplantation》.2010,第90卷第13页左栏introduction部分. *
Martinez-Llordella M et al..Using transcriptional profiling to develop a diagnostic test of operational tolerance in liver transplant recipients.《J Clin Invest》.2008,第118卷(第8期),methods部分. *
Quantitative protein profiling using antibody arrays;Barry R et al.;《Proteomics》;20041201;第4卷(第12期);第3717-3726页 *
Transcriptional profiling of liver grafts in spontaneous operational tolerance;Bohne F et al.;《Transplantation》;20100727;第90卷;第13页左栏introduction部分 *
Using transcriptional profiling to develop a diagnostic test of operational tolerance in liver transplant recipients;Martinez-Llordella M et al.;《J Clin Invest》;20080801;第118卷(第8期);methods部分 *

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