WO2019107673A1 - Abo 혈액형 부적합 이식시의 항체-매개성 거부반응의 모니터링을 위한 바이오마커 - Google Patents

Abo 혈액형 부적합 이식시의 항체-매개성 거부반응의 모니터링을 위한 바이오마커 Download PDF

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WO2019107673A1
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blood type
sample
blood
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양재석
전희중
이재기
장준영
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서울대학교병원
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • a biomarker for monitoring antibody-mediated rejection in an AB0 blood type non-metastatic transplant and .
  • Lt; RTI ID 0.0 > AB0 < / RTI >
  • ABO incompatible kidney transplantation (ABOi) kidney transplantation (ABOi) kidney transplantation (ABOi) kidney transplantation (ABOi) kidney transplantation (ABOi) kidney transplantation) has been proposed as a solution to this problem.
  • ABOi KT cases have been increased and transplant outcomes are improving.
  • the presence of anti-AB0 antibody to donor blood type is becoming a major immunity barrier for successful ABOi KT.
  • Pre-transplantation desensitization with anti-depressant monoclonal antibody and plasma isher is used to remove pre-formed anti-AB0 antibodies and inhibit further formation of new anti-AB0 antibodies. .
  • This desensitization therapy can prevent the occurrence of hyperacute rejection and acute anti-body-mediated rejection (acute AMR).
  • acute AMR acute anti-body-mediated rejection
  • anti-AB0 antibodies are reproduced and persisted after ABOi KT despite adequate immunosuppression.
  • the anti-AB0 antibody continues to exist in the serum of the kidney transplant recipient and the target antigen is present in the donor kidney, if the transplantation lasts more than 4 weeks, the anti-AB0 antibody-mediated tissue damage does not occur, This phenomenon is called accommodation.
  • the adaptive mechanism between anti-AB0 antibody and kidney grafts has not yet been elucidated.
  • kidney biopsy is an invasive process and sometimes causes side effects.
  • it is required to develop a technique that distinguish between transplantation adaptation and acute AMR by noninvasive process in ABOi KT.
  • One example is a biomarker for monitoring (rejecting) a rejection response in the ABO blood-type incompatible transplatent implant and an antibody-mediated rejection in the AB0 blood-type nonconforming transplant containing the biomarker ≪ / RTI >
  • IOOKER in the group consisting of KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A and S100A8 (E.g., mRNA, cDNA, and the like) selected and / or a protein encoded by the gene.
  • the biomarker is at least one selected from the group consisting of KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, and LY96 (eg, C0X7A2L, CD69, CD14, CFD and F0XJ3) gene (for example, mRNA, cDNA, etc.) and / or a protein encoded by the gene.
  • KHK KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, and LY96 (eg, C0X7A2L, CD69, CD14, CFD and F0XJ3) gene (for example, mRNA, cDNA, etc.) and / or a protein encoded by the gene.
  • At least one member selected from the group consisting of the above-mentioned biomarkers, TPPP3, C suppressor, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6 and LY96 Or for blood samples containing serum.
  • compositions for monitoring antibody-mediated rejection in an AB0 blood group non-conforming graft comprising a detectable agent of a gene (e.g., mRNA, cDNA, and the like) and / or a protein encoded by the gene.
  • a detectable agent of a gene e.g., mRNA, cDNA, and the like
  • the monitoring composition is selected from the group consisting of KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, and LY96 2019/107673 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2018/002720
  • One or more selected from the group consisting of 0, 1, 2, 3, 4, And ⁇ gene is one or more member selected from the group consisting of 3 ⁇ 43) (e. G., US, 00) and / or the gene may be to include a detectable agent in the encoded protein.
  • the composition for monitoring may be for use in peripheral blood (separated from the transplanted patient) or in a blood sample containing serum.
  • Another example is
  • a biomarker comprising a protein encoded by the gene, or
  • the biomarker in an application according to an embodiment, the biomarker
  • the biomarker may comprise one or more of the following: 1, 1, 2, 4, 3, 3 0 show 8, or a protein encoded by the gene, and may be for use in a tissue sample.
  • the biomarker (1, 2, 3, 4, 11, 4,
  • 3100 urine can be for use in tissue samples (e.g., tissues organs isolated from transplanted organs).
  • Another example is the use of a (separate) biological sample obtained from a subject receiving a necropsy 0 blood type nonconforming transplant, (1: 3, 0014, 0 ⁇ , ⁇ ! ⁇ ,? 2, (1) 7 shows 2 ⁇ 0069, 0 ⁇ 16, one way 96,
  • a method for monitoring antibody-mediated rejection in a prophylactic blood type non-metastatic transplant comprising measuring the level of expression of the protein .
  • the biological sample may be a blood sample comprising peripheral blood or serum obtained from the subject (separated), a tissue sample comprising (detached) tissue obtained from the transplanted organ or tissue of the subject, or both.
  • the method for monitoring an antibody-mediated transplant rejection response of a ShoPrint 0 blood type non-conforming graft may include the following steps:
  • the expression level measured in the test sample is measured by using the expression
  • mRNA, cDNA, etc. selected from the group consisting of F0XJ3, 1X7A2L, CD69, CMTM6 and LY96 in the test sample and / or a protein encoded by the gene If the level of expression is high, it can be confirmed (or judged or determined) that the subject to which the test sample is derived exhibits graft rejection for AB0 blood type nonconforming graft.
  • the method for monitoring rejection of the AB0 blood type non-conforming graft may include the following steps:
  • mRNA, cDNA, etc. selected from the group consisting of C0X7A2L, CD69, CD14, CFD, and FoxJ3 and / or a protein encoded by the gene in the biological sample obtained from the subject subjected to the AB0 blood type non- Measuring an expression level;
  • Equation 1 -104.2 - 140.4 * [C0X7A2L ] - 184.3 * [CD69] + 772.5 * [CD14] - 1056.9 * [CFD] + 518.5 * [FoxJ3]
  • Gene or protein refers to the level of expression of a gene or protein, for example, the level may be the level of the gene obtained through quantitative real-time PCR (e. G., Quantitative real-time PCR). If the value obtained by the above Equation 1 is greater than 0.5, it is confirmed (or judged) that the object from which the sample is derived exhibits adaptation (no rejection or low level (acceptable level) for the AB0 blood type non- If it is less than 0.5, it can be confirmed (or judged or determined) that the subject-derived sample exhibits rejection reaction to the AB0 blood type nonconforming graft.
  • quantitative real-time PCR e. G., Quantitative real-time PCR
  • the method of monitoring rejection of the AB0 blood type non-conforming graft may include the following steps:
  • tissue samples obtained from transplant recipients (tissue samples; (E.g., mRNA, cDNA, etc.) selected from the group consisting of MGAM, TMEM106A, MUC4, ACOX1, AC01, TNFRSF12A and S100A8 in the test sample (test tissue sample) Measuring the level of expression of the protein;
  • the sample to be compared may include a tissue (e.g., a transplanted tissue) obtained from a subject showing rejection reaction or adaptation as a subject having a new 0 blood type non-conforming transplantation.
  • a tissue e.g., a transplanted tissue obtained from a subject showing rejection reaction or adaptation as a subject having a new 0 blood type non-conforming transplantation.
  • the method of monitoring rejection of a new blood type non-conforming graft may include the following steps: S (2014) Blood type non-conformity In a biological sample obtained from a recipient subject And / or 10X1), and / or a protein expression level encoded by the gene, and
  • the level may be the level of the gene obtained through quantitative PCR (e. G., Quantitative real-time PCR). If the value obtained by the above equation (2) is larger than 0.5, it is confirmed (or judged or determined) that the object from which the sample is derived indicates adaptation to the AB0 blood type nonconforming implant (no rejection or low level ). If it is less than 0.5, it can be confirmed (or judged or determined) that the subject-derived sample shows a rejection reaction for the AB0 blood type nonconforming graft.
  • quantitative PCR e. G., Quantitative real-time PCR
  • the subject may be a selected entity in a mammal such as a human.
  • (B) maintain (or judge or determine) the immunosuppressant dose or the frequency of administration when it is confirmed (or judged or determined) that the subject exhibits an adaptation to AB0 blood type nonconforming transplantation (no rejection or a low level Or terminating the administration of the immunosuppressant.
  • One example is a biomarker for monitoring the rejection response in the ABO blood-type incompatible transplantation and a technique for monitoring the antibody-mediated rejection in the AB0 blood type non-metastatic transplant using the biomarker to provide.
  • AB0 blood type nonconforming transplantation refers to the case where AB0 blood type of donor and donor do not match in transplantation of solid organs such as kidney, liver and the like.
  • the biomarker includes at least one gene selected from the group consisting of KHK TPPP3, CFD FCGR3B CD14, C1QA TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3 C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, ACOX1, AC01, TNFRSF12A, and S100A8 (for example, Etc.) and / or a protein encoded by said gene.
  • the gene and / or the protein may be derived from a mammal including humans, primates such as monkeys, rodents such as mice and rats, but the present invention is not limited thereto.
  • the biomarker is at least one selected from the group consisting of KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, and LY96 (eg, C0X7A2L, CD69, CD14, CFD and F0XJ3) gene (for example, mRNA, cDNA, etc.) and / or a protein encoded by the gene. (At least one selected from the group consisting of?, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L,? 69, CMTM6 and LY96) For example, for blood samples containing peripheral blood or serum.
  • KHK KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L,
  • the biomarker may be one or more genes (e.g., mRNA, cDNA, etc.) selected from the group consisting of MGAM, TMEM106A, MUC4, ACOX1, AC01, TNFRSF12A and S100A8 and / have.
  • the biomarker (MGAM, TMEM106A, MUC4, ACOX1, AC01, TNFRSF12A and S100A8) may be for use in a tissue sample (for example, a transplant organ or a tissue isolated from a tissue).
  • a tissue sample for example, a transplant organ or a tissue isolated from a tissue.
  • the term " rejection &quot is intended to mean a mixture of rejection reactions involving an antibody-mediated rejection and an antibody-mediated rejection This can be a meaning encompassing the power of the.
  • Blood-type incompatible ib le transplatent may be an AB0 blood-type nonconforming transplantation of solid organs such as kidney, liver, or tissues isolated therefrom.
  • Other examples include those selected from the group consisting of KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, ACOX1, AC01, TNFRSF12A, and S100A8
  • a composition for monitoring antibody-mediated rejection in an AB0 blood group non-conforming graft comprising a detectable agent of a gene (e.g., mRNA, cDNA, and the like) and / or a protein encoded by the gene.
  • the monitoring composition comprises at least one (e.g., C0X7A2L, C0X7A2L, and C0X7A2L) selected from the group consisting of KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B,? 14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, CD69, CD14, C-suppressor and F0XJ3) gene (for example, mRNA 2019/107673 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2018/002720
  • composition for monitoring may be for use in peripheral blood (separated from the transplanted patient) or in a blood sample containing serum.
  • the monitoring composition comprises at least one compound selected from the group consisting of: 1, 3, 4, 6, 11, 4, 3100 shows 8 genes selected from the group consisting of 11 genes, Etc.) and / or a detectable agent of a protein encoded by said gene.
  • the composition for monitoring may be for use in a tissue sample (for example, a tissue isolated from a transplant organ or tissue).
  • the detectable agent may be a protein that specifically binds to the gene and / or protein, such as an antibody, a peptide, an oligonucleotide (e.g., a primer (e.g., 5-50, 5-30, 5-25, 5-20, 10-50, 10-30111 with possible nucleic acid sequences; , 10-25, or 10-20 oligonucleotides), probes (e.g., 10-10 consecutive of the above genes), 10-5, or 10-30 5 ?
  • a primer e.g., 5-50, 5-30, 5-25, 5-20, 10-50, 10-30111 with possible nucleic acid sequences; , 10-25, or 10-20 oligonucleotides
  • probes e.g., 10-10 consecutive of the above genes
  • a fluorescent substance e.g., fluorescent protein, fluorescent chemical, etc.
  • the term 'hybridisable' means that complementarity can be achieved by having a sequence complementarity of 80% or more, such as 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more, or 100% It can mean.
  • Method for monitoring antibody-mediated rejection in a show-off blood type non-metastatic transplant comprising the step of determining the level of expression of the protein, or information on monitoring the antibody-mediated rejection in a blood type non-metastatic transplant.
  • the biological sample may be a blood sample comprising (isolated) peripheral blood or serum obtained from the subject, a tissue sample comprising (isolated) tissue obtained from the transplanted organ or tissue of the subject, or both.
  • the step of measuring the gene and / or protein expression level may comprise contacting (adding) the detectable agent of the gene and / or protein to the biological sample.
  • the detectable preparation is as described above.
  • a biological sample e.g., a blood sample
  • KHK TPPP3, CFD, FCGR3B
  • Relatively high expression levels of at least one gene selected from the group consisting of CD14, C1QA, TNFRSF8 and FFAR2 and / or proteins encoded by the gene, and / or F0XJ3, C0X7A2L, CD69, (MRNA, cDNA, etc.) selected from the group consisting of CMTM6, CMTM6, and LY96 and / or the protein encoded by the gene is selected so that the subject from which the sample is obtained (isolated) May indicate transplantation adaptation for the transplantation (does not indicate rejection of transplantation or is weak at an acceptable level).
  • mRNA, cDNA, etc. selected from the group consisting of CD14, C1QA, TNFRSF8 and FFAR2 and / or proteins encoded by the gene, and / or F0XJ3, C0X7A2L, CD69, (MRNA, cDNA, etc.) selected from the group consisting of CMTM6, CMTM6, and LY96 and / or
  • the step of directly determining the expression level of the gene may be performed by a conventional gene analysis method using a primer, a probe, or an aptamer capable of hybridizing with the gene, such as a polymerase chain reaction (PCR), a reverse transcription polymerase chain reaction -PCR), fluorescence in situ hybridization (FISH), microarray method, and the like, but the present invention is not limited thereto .
  • PCR polymerase chain reaction
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • microarray method and the like, but the present invention is not limited thereto .
  • the step of measuring the protein expression level can be measured by a conventional enzymatic reaction using fluorescence, luminescence, and / or radiation detection using a chemical substance, an antibody, or an extramammer that specifically binds to the protein, , Flow cytometry, immunochromatography, immunohistochemical staining, enzyme binding Immune topchak analysis (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA) , radioimmunoassay i.e.
  • the method of monitoring the antibody-mediated rejection response of the AB0 blood type non-conforming graft may include the following steps:
  • mRNAs, mRNAs, etc. selected from the group consisting of KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B CD14C1QA, TNFRSF8, FFAR2F0XJ3, C0X7A2L CD69, CMTM6 and LY96 in the test sample cDNA, etc.) and / or the protein encoded by said gene; and
  • the sample to be compared may be a (separated) blood sample obtained from an individual that has been shown to exhibit rejection or adaptation to the AB0 blood type nonconforming transplant.
  • the method may further comprise, before the step of comparing, a sample selected from the group consisting of KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, and LY96
  • the method may further comprise the step of measuring the level of expression of the gene (for example, mRNA, cDNA, etc.) and / or the protein encoded by the gene.
  • genes selected from the group consisting of KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14 C1QA, TNFRSF8 and FFAR2 in the test sample as compared with the comparative sample showing rejection of the AB0 blood type non- (For example, mRNA, cDNA, etc.) and / or a protein encoded by the gene are high and / or one or more genes selected from the group consisting of F0XJ3 C0X7A2L, CD69, CMTM6 and LY96 cDNA, etc.) and / or expression of the protein encoded by the gene (Or judging or determining) that the subject from whom the test sample is derived exhibits an adaptation (no rejection or a low level (acceptable level) to the AB0 blood type non-conforming transplantation when the level is low and / or
  • mRNA, cDNA, etc. selected from the group consisting of FCGR3B, CD14 C1QA, TNFRSF8 and FFAR2 and / or the protein encoded by the gene is low and / or the expression levels of F0XJ3, C0X7A2L , CD69, CMTM6, and LY96, and / or the protein encoded by the gene is high, the subject from which the test sample is derived is subjected to the AB0 blood type nonconforming transplantation (Or judged or determined) that it represents rejection of the transplantation.
  • the method comprises: After the comparing step, the following steps may be further included:
  • genes selected from the group consisting of KHK, TPPP3, CFD FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8 and FFAR2 for example, mRNA (for example, mRNA, cDNA, etc.) selected from the group consisting of F0XJ3, C0X7A2L, CD69 CMTM6 and LY96, and / or one or more genes selected from the group consisting of
  • KHK, TPPP3, CFD FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8 and FFAR2 for example, mRNA (for example, mRNA, cDNA, etc.) selected from the group consisting of F0XJ3, C0X7A2L, CD69 CMTM6 and LY96, and / or one or more genes selected from the group consisting of
  • One or more genes selected from the group consisting of KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B CD14, C1QA, TNFRSF8 and FFAR2 for example, mRNA, cDNA
  • the comparison sample showing accommodation for AB0 blood type non- (For example, mRNA cDNA, etc.) selected from the group consisting of F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6 and LY96, and / or the gene
  • AB0 blood type non- selected from the group consisting of F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6 and LY96, and / or the gene
  • the method for monitoring rejection of the AB0 blood type non-conforming graft may include the following steps:
  • mRNA, cDNA, etc. selected from the group consisting of C0X7A2L, CD69, CD14, CFD, and FoxJ3 and / or protein expression encoded by the gene in the biological sample obtained from the subject subjected to AB0 blood type non- Measuring a level;
  • Equation 1 -104.2 - 140.4 * [C0X7A2L ] - 184.3 * [CD69] + 772.5 * [CD14] - 1056.9 * [CFD] + 518.5 * [FoxJ ⁇
  • the level may be the level of the gene obtained through quantitative PCR (e. G., Quant i tat ive real-t ime PCR) . If the value obtained by the above Equation 1 is greater than 0.5, it is confirmed (or judged or determined) that the object from which the sample is derived exhibits adaptation (with no rejection or low level (acceptable level) to the AB0 blood type non- ), And when it is less than 0.5, it can be confirmed (or judged or determined) that the subject-derived sample shows a rejection reaction for the AB0 blood type nonconforming graft.
  • quantitative PCR e. G., Quant i tat ive real-t ime PCR
  • the method of monitoring the rejection response of the AB0 blood type non-conforming transplant may further comprise the following steps after the step of calculating Equation 1:
  • the expression level of one or more genes selected from the group consisting of MGAM, TMEM106A, A? XI and AC01 and / or the protein encoded by the gene is relatively high, and / TNFRSF12A and S100A8 (for example, mRNA, 2019/107673 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2018/002720
  • the subject from which the tissue sample is derived exhibits adaptation to the ShoYo blood type non-conforming graft (no rejection or low level (acceptable level) )can confirm.
  • the method of monitoring the rejection of a new blood type non-conforming graft may include the following steps: A new 0 blood type non-conforming biologic sample (tissue sample; Hereinafter referred to as "test sample (test tissue sample)”),
  • the sample to be compared may include a tissue (e.g., a transplanted tissue) obtained from a subject showing rejection reaction or adaptation as a subject receiving a Shoemoo 0 blood type nonconforming graft.
  • a tissue e.g., a transplanted tissue obtained from a subject showing rejection reaction or adaptation as a subject receiving a Shoemoo 0 blood type nonconforming graft.
  • the method may further comprise, prior to the comparing step, comparing X1, X1, X1, X1, X2, X1, And 3100 show 8 (for example, 111 rhymes and the like) selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3100 show 8, and / or a protein encoded by the gene.
  • 8 for example, 111 rhymes and the like
  • Steps may be further included:
  • TNFRSF12A and AClOl selected from the group consisting of TNFRSF12A and AClOl and / or the protein encoded by the gene is elevated and / or expression levels of TNFRSF12A and S100A8 selected from the group consisting of genes of two or more (e. g., mRNA, cDNA, etc.) and / or the gene when the expression level of the protein encoded low, Oh by the said test sample derived from the target or the adaptation (rejection with respect to the AB 0 blood types unsuitable transplant low (Or an acceptable level)), and / or
  • One or more genes selected from the group consisting of MGAM, TMEM106A, AC0X1, and / or the like in the test sample, and / or one or more genes selected from the group consisting of (E. G., MRNA, cDNA, etc.) selected from the group consisting of TNFRSF12A and S100A8 and / or the protein encoded by the gene is high in expression level of the protein encoded by the gene is low (Or judging or determining) that the subject from which the test sample is derived exhibits a graft rejection response to the AB0 blood type non-conforming graft.
  • genes e.g., mRNA, cDNA, etc.
  • the method for monitoring rejection of an AB0 blood type non-conforming graft may include the following steps:
  • the biological samples obtained from AB0 blood type nonconforming recipients were composed of MGAM, MUC4, AC01 S100A8, TMEM106A and AC0X1 Measuring the level of expression of at least one gene selected from the group (e.g., mRNA, cDNA, etc.) and / or the protein encoded by the gene; And
  • Equation 2 -3.2 - 15.8 * [MGAM ] + 4.0 O:. MUC4] + 23.1 * [ AC01] + ll (MS100A8] + 20.0 * [TMEM106A] - 50.6 * [AC0X1]
  • the level may be the level of the gene obtained through quantitative real-time PCR. If the value obtained by the above equation (2) is greater than 0.5, it is confirmed (or judged) that the object from which the sample is derived exhibits adaptation (no rejection or low level (acceptable level) for the AB0 blood type non- If it is less than 0.5, it can be confirmed (or judged or determined) that the subject-derived sample exhibits rejection reaction to the AB0 blood type nonconforming graft. ⁇
  • the method of monitoring the rejection response of the AB0 blood type non-conforming transplant may further comprise the following steps after the step of calculating Equation 2:
  • the subject may be selected from mammals including primates such as human monkeys, rodents such as mice and rats, and the like.
  • the immunosuppressant dose or administration frequency is maintained Or reducing or terminating the administration of the immunosuppressant.
  • Treatment of the rejection reaction can be performed by administering an effective amount of an anti-rejection immunosuppressive drug to the subject and / or plasmapheresis.
  • the anti-transplant rejection immunosuppressant or immunosuppressive agent may be at least one selected from the group consisting of all proteins having immunosuppressive activity (such as antibodies), peptides, oligonucleotides, polynucleotides, and chemical agents.
  • the anti-transplant rejection immunosuppressant is selected from the group consisting of: Vasiliepiquat 11x ⁇ 3 1, Ant i-thymoglobulin (ATG), Alemtuzumab ( 3 1 6011 ; 112111113 1) (methylprednisolone), the other claw rimuseu (1 size: 10-fold), prednisolone (prednisolone) and mycophenolate mofetil (mycophenolate mofeti 1), an immunoglobulin (; 1 0 1 111 111 for zero to _), rituximab seumap (r ituximab), Bottega jomip (1X 1 ⁇ 62011 ⁇ 1) , ekyul riju And the like, but the present invention is not limited thereto.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a procedure for monitoring a graft rejection reaction using a blood or a tissue sample according to an embodiment.
  • Figure 2 shows functional annotation and pathway analysis results in blood samples
  • FIG. 3 shows a set of genes up-regulated in ABOiA as compared to ABOiR as a result of gene set enrichment analysis (GSEA) in blood samples.
  • Figure 4 shows a set of genes down-regulated in ABOiA as compared to ABOiR as a result of GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) in blood samples.
  • FIG. 5 shows a candidate gene having a ABOiA-relative correlation with ABOiR in a blood sample.
  • Figures 6a-7b show KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14,
  • FIG. 8 shows a result of analyzing a training set and a valve id set (including 8 ABOiA and 2 ABOiR) in a blood sample using Equation 1 of Example 2.
  • FIG. 8 shows a result of analyzing a training set and a valve id set (including 8 ABOiA and 2 ABOiR) in a blood sample using Equation 1 of Example 2.
  • Figure 9 shows the set of genes that are relevant in ABOiA compared to ABOiR as a result of GSEA (gene set enrichment analysis) in tissue samples.
  • 10 shows a candidate gene having a significant correlation with ABOiA compared to ABOiR in a tissue sample.
  • FIGS. 11A and 11B show graphs showing the relationship between MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1,
  • AC01, TNFRSF12A and S100A8 genes of the present invention AC01, TNFRSF12A and S100A8 genes of the present invention.
  • ABOi KT ABO incompatible kidney transplantation
  • no protocol rejection was observed on the 10th day after transplantation (protocol biopsy) and 3 months after renal transplantation.
  • 18 ABOi KT recipients accommodating recipients: ABOiA
  • 10 ABOi KT recipients transplant rejection
  • AMR acute antibody-mediated rejection
  • ABOiR protocol biopsy
  • Peripheral blood (PB) samples of the selected recipients were taken and stored in the biorepository from June 2010 to August 20M.
  • the biopsy specimens of 16 ABOiA recipients and 6 ABOiR recipients were stored in biorepository and used for intragraft transcr iptomic analysis.
  • rituximab an anti-CD20 chimeric monoclonal antibody
  • the plasmapheresis frequency is determined by the anti-doxorubicin IgG reference titer, and the prevalence of isoagglutinin IgG is 1:16 or less before surgery.
  • the anti-ABO antibody titers were measured using a gel card test (Sigma-Aldrich, St.
  • an independent in-center PB sample (15 ABOiA and 9 ABOiR) or an independent center graft tissue sample (18 ABOiA and 9 ABOiR) and a validation set was prepared from independent samples (8 ABOiA and 2 ABOiR) from different centers and used for analysis.
  • RNA samples were collected in PAXgene® Blood RNA Tube (PreAnalyt iX GmbH, Hombrecht ikon, Switzerland). PB and tissue samples were stored at -70 ° C until total RNA extraction. RNeasy®
  • RNA was extracted from PB and tissue samples using a mini kit (Qiagen, Valencia, Calif., USA). The sample volume and integrity were checked using an Agilent 2100 Bioanalyzer. Quality control (RNA mass ⁇ 1 g and RNA Integrity 2019/107673 1 »(: 1/10/10 Public 018/002720
  • an adapter-ligated complementary DNA (cDNA) library was prepared by amplifying the shots extracted from PB and tissue samples using fragmentation, reverse transcription and random oligo-dT primers. Sequences of cDNA libraries were analyzed using the Illumina HiSeq platform (Illumina Inc., San Diego, Calif., USA). Illumina HiSeq results were imaged using HiSeq Control Software v2.2.38 (Illumina Inc.) for system control, and base call was analyzed through integrated primary analysis software called Real Time Analysis vl 18.61.0 (Illumina Inc.). base cal 1 binary data was converted to FASTQ using the Illumina package bcl2fastq (vl.8.4, Illumina Inc.).
  • FASTQ data can be obtained from FastQC: Read QC [Brown J, Pi r rung M, McCue LA. FQC Dashboard: integrates FastQC results into a web-based, interactive, and extensible FASTQ quality control tool. Quality control was performed using Bioinformatics, For alignment and quantification of transcripts, a STAR (v. 2.4. Id) mapper using the Ensembl GRch37 reference genome (Dobin A, Gingeras TR. Mapping RNA-seq Reads with STAR. Curr Protoc Bioinformatics 51: 11 M 11-19, 2015; Dobin A, Davisca, Schlesinger F, et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.
  • the 101 bp paired-end read was aligned to the human genome (GRCh37 / hgl9 assembly) via Bioinformatics 29: 15-21, 2013. Using the FPKM (fragments per ki lobase per million reads) transcript assembly and transcript abundance were determined and standardized.
  • Differential expression genes DEGs were identified by differential gene-calining method using DESeq (Bioconductor)
  • GSEA Gene set enrichment analysis
  • RNA-seq results in peripheral blood (PB) samples showed a total of 1385 differentially expressed genes (FDR ⁇ 0.05) in the ABOiA group compared to the ABOiR group.
  • FDR ⁇ 0.05 differentially expressed genes
  • FIG. 3 shows the set of genes up-regulated in ABOiA compared to ABOiR
  • Figure 4 shows the set of genes down-regulated in ABOiA compared to ABOiR.
  • a candidate gene with a significant correlation with ABOiA was selected in comparison with ABOiR, and the genetic screening standard was as follows:
  • GSEA gene set enrichment analysis
  • the standard protocol was provided to provide the parameters.
  • the reference gene for expression value calculation was GAPDH.
  • FIG. 8 The results of analyzing the training set and the valve id set (including 8 ABOiA and 2 ABOiR) by applying the above model are shown in FIG.
  • FIG. 8 in the training set, it was shown that ABOiA and ABOiR can be distinguished with 100% sensitivity, 100% specificity, and 100% accuracy when classifying using the abovementioned cital model. Also, ABOiA and ABOiR can be classified into 75% sensitivity, 100% specificity, and 80% accuracy in the Val idat ion set.
  • Example 3 Screening of genes having high correlation with ABOiA in tissue samples
  • the number of genes (DEG) differentially expressed in the ABOiA group in the ABOiR group in the RNA-seq for the tissue samples was 179 (FDR ⁇ 0.05 ).
  • the number of DEG regulated DEGs in the ABOiA group was 122 and that of the ABOiA group was 57 in the downregulated DEG group.
  • a tissue sample was prepared according to the method described in Example 1 above using GSEA
  • FIG. 9 shows the result of G state A and the gene set and ABOiA-related gene set in comparison with ABOiR. .
  • candidate genes having ABOiA-related correlation with ABOiR were selected.
  • seven genes of MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A and S100A8 were selected for initial validation (see FIG. 10).
  • the Q-PCR was performed using an Applied Biosys terns Prism 7300 (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA) according to the standard protocol provided by the manufacturer.
  • the reference gene for expression value calculation was GAPDH.

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Abstract

ABO 혈액형 부적합 이식에서 항체-매개 거부 반응을 모니터링하기 위한 바이오마커, 및 이를 이용한 ABO 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개성 거부 반응 모니터링 방법을 제공한다.

Description

【명세세
【발명의 .명칭】
AB0 혈액형 부적합 이식시의 항체-매개성 거부반응의 모니터링을 위한바이오마커
【기술분야】
AB0 혈액형 부적합 이식에서 항체-매개성 거부반응을 모니터링하기 위한 바이오마커 , 및 .이를 이용한 AB0 혈액형 부적합 이식에서의 항체- 매개성 거부반응모니터링 방법을제공한다.
【배경기술】
신장 이식 (Kidney transpl antat ion； KT)이 필요한 말기 신장 질환 환자의 수가 급속히 증가하고 있지만, 기증 장기가 부족한 실정이다. 이러한 신장 이식의 문제를 해결하기 위한 방안의 하나로 AB0 혈액형 부적합신장 이식 (ABO incompat ible (ABOi ) KT)이 제안되고 있으며， 이를 통하여 신장이식률이 약 20%정도증가된것으로알려져 있다.
최근, 보다 강력한 면역억제제와 탈감작 방법이 개발됨에 따라서, ABOi KT사례가 증가되고 이식 결과도 개선되고 있다. 공여자 (기증자)의 혈액형에 대한 항- AB0 항체의 존재가 성공적인 ABOi KT의 주요한 면역 장벽이 되고 있다. 미리 형성된 항- AB0 항체를 제거하고 새로운 항- AB0 항체의 추가 형성을 억제하기 위하여, 항-抑 20 단일 클론 항체 및 pl asmapheres i s를 이용한 이식 전 탈감작 (Pre-transpl antat ion desens i t i zat i on)이 시행되고 있다. 이러한 탈감작 요법에 의하여 초급성 거부 반응 (hyperacute rej ect ion)과 급성 항체-매개성 거부반응 (acute ant ibody-medi ated rej ect ion； acute AMR)의 발생을 예방할 수 있다. 그러나, 항- AB0 항체는 적절한 면역억제에도 불구하고 ABOi KT 이후 재생산되고 지속된다. 신장을 이식 받은 환자의 혈청에 항- AB0 항체가 계속존재하고공여자신장에 표적 항원이 존재하더라도, 이식 후 4주 이상 경과되면, 항- AB0 항체 매개성 조직 손상이 일어나지 않고 이식 장기가 기능을잘발휘할수 있는데, 이러한현상을 적응 (accommodat ion)이라한다. 항- AB0 항체와 신장이식편 사이의 적응 메커니즘은 아직 명확하게 밝혀진 바없다.
현재， ABOi KT 이후의 급성 AMR 또는 이식 적응의 진단은 신장 동종이식 생검 （kidney al lograft biopsy）에 의존하고 있다. 그러나 신장 생검은 침습적인 과정이며 때로는 부작용을 일으킨다. 이러한 문제를 해소하기 위하여， ABOi KT시에 비침습적인 과정으로 이식 적응과 급성 AMR를구분하는기술의 개발이 요구된다.
【발명의 내용】
【해결하고자하는과제】
일 예는 AB0 혈액형 부적합 이식（ABO blood-type incompat i ble transpl antat ion）에서의 거부 반응을 모니터링（진단）하기 위한 바이오마커 및 상기 바이오마커를 포함하는 AB0 혈액형 부적합 이식에서 항체-매개성 거부반응을모니터링하기 위한조성물을제공한다.
y]·이오 커는 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A, 및 S100A8 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자 （예컨대, mRNA, cDNA 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는것일수있다.
일구체 예에서 , 상기 바이오마커는 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96로 이루어진 군에서 선택된 1종이상（예컨대， C0X7A2L, CD69, CD14, CFD및 F0XJ3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상）의 유전자（예컨대， mRNA, cDNA등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질일 수 있다. 상기 바이오마커 ■ , TPPP3, C抑, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96로 이루어진 군에서 선택된 1종이상）는 （이식 받은 환자로부터 분리된） 말초혈액 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료에 사용하기 위한것일수있다.
다른 예는 KHK, TPPP3, C抑, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A, 및 S100A8 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자 （예컨대, mRNA, cDNA등） 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 검출 가능한 제제를 포함하는 AB0 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개성 거부반응모니터링용조성물을제공한다.
일 구체 예에서， 상기 모니터링용조성물은 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD 14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96 로 2019/107673 1»（：1^1{2018/002720
이루어진 군에서 선택된 1종 이상 （예컨대, 0供7쇼2ᄂ 0069 , 0）14,
Figure imgf000005_0001
및 的¾3으로이루어진군으로부터 선택된 1종이상）의 유전자（예컨대，미 , 00 등） 및/또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 검출 가능한 제제를 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 모니터링용 조성물은 （이식 받은 환자로부터 분리된） 말초혈액 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료에 사용하기 위한것일수있다.
다른예는
Figure imgf000005_0013
상기 유전자가암호화하는단백질을포함하는바이오마커,또는
상기 바이오마커의 검출가능한제제
의, 쇼80혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개 거부반응 모니터링에 사용하기 위한용도를제공한다.
일 실시 예에 따른 용도에 있어서 , 상기 바이오마커는
Figure imgf000005_0002
0?0, ! ， 0014, （： , 1 8, FFAR2, «）X13, 0供7쇼2ᄂ 0069,
Figure imgf000005_0003
및 96로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자또는상기 유전자가 암호화하는 단백질이고, 혈액 시료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 다른 실시 예에 따른 용도에 있어서, 상기 바이오마커는 能, 1표¾1106/\， «4, 쇼⑶如, 요0）1,
Figure imgf000005_0004
3 0쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질이고, 조직 시료에 사용하기 위한것일수있다.
다른예에서， 상기 바이오
Figure imgf000005_0005
8 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자
Figure imgf000005_0006
등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질일 수 있다.상기 바이오마커 （¾¾ ， 1£¾!106/\， ¾11£4， 쇼（：0）（1， 쇼0）1,
Figure imgf000005_0007
3100요8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상）는조직 시료 （예컨대, 이식 장기 또는조직으로부터 분리된조직）에사용하기 위한것일수있다.
다른 예는, 요묘0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 얻어진 （분리된） 생물학적 시료에서 볘1（，
Figure imgf000005_0008
（：抑, 1¾3氏 0014, 0^, 炯!^, ?새2,
Figure imgf000005_0010
⑴ 7쇼2ᄂ 0069, 0^16, 1方96，
Figure imgf000005_0009
■£4,
Figure imgf000005_0011
1仰!« 2/\, 및와0 8로 아루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 .（예컨대,
Figure imgf000005_0012
및/또는상기 유전자가암호화하는 2019/107673 1»（：1^1{2018/002720
단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 쇼期 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개성 거부반응을 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 생물학적 시료는상기 대상으로부터 얻은 （분리된） 말초 혈액 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료, 상기 대상의 이식된 장기 또는 조직으로부터 얻은 （분리된）조직을포함하는조직 시료, 또는이들모두일수있다.
일 예에서， 생물학적 시료가 혈액 시료일 경우, 쇼표0 혈액형 부적합 이식의 항체-매개성 이식 거부반응을 모니터링하는 방법은 다음의 단계를 포함할수있다:
쇼 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료
Figure imgf000006_0001
96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대,
Figure imgf000006_0002
등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준을 즉정하는 단계; 및
상기 시험 시료에서 측정된 발현 수준을 비교대상 시료에서의 상기
Figure imgf000006_0003
단백질의 발현 수준이 낮거나， 및/또는 시험 시료에서 F0XJ3, ⑴X7A2L, CD69, CMTM6 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대, mRNA, cDNA등） 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 발현 수준이 높은 경우， 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 이식 거부를나타내는것으로확인 （또는판단또는결정）할 수있다.
다른예에서, 생물학적 시료가혈액 시료인 경우， AB0혈액형 부적합 이식의 거부반응을모니터링하는방법은다음의 단계를포함할수있다:
AB0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터의 얻은 생물학적 시료에서 C0X7A2L, CD69, CD 14, CFD, 및 FoxJ3으로 이루어진군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대， mRNA, cDNA 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는단백질 발현수준을측정하는단계 ; 및
하기의 식 1을계산하는단계:
식 1 = -104.2 - 140.4* [C0X7A2L] - 184.3* [CD69] + 772.5* [CD14] - 1056.9* [CFD] + 518.5* [FoxJ3]
（상기 식 중, [유전자 또는 단백질]은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 의미하는 것으로， 예컨대, 상기 수준은 정량적 PCR （예컨대, quantitative real-time PCR）을통하여 얻어진유전자수준일수있다）. 상기 수학식 1에 의해 얻어진 값이 0.5보다큰 경우， 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 （거부반응이 없거나 낮은 수준（수용 가능한수준）임）을 나타내는 것으로 확인 （또는 판단또는 결정）할 수 있으며, 0.5보다 적은 경우， 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합이식에 대하여 거부반응을나타내는 것으로 확인 （또는판단 또는결정）할수있다.
일 예에서, 생물학적 시료가조직 시료인 경우, AB0 혈액형 부적합 이식의 거부반응을모니터링하는방법은다음의 단계를포함할수있다:
AB0 혈액형 부적합 이식 받은 대상으로부터의 얻은 생물학적 시료 （조직 시료; 이하 "시험 시료 （시험 조직 시료）"）에서 MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A 및 S100A8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자（예컨대， mRNA, cDNA등） 및/또는상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현수준을측정하는단계 ;
상기 시험 시료에서 측정된 발현 수준을 비교대상 시료에서의 발현 수준과비교하는단계 . 2019/107673 1»（：1^1{2018/002720
상기 비교대상시료는새0혈액형 부적합이식을받은개체로서 거부 반응 또는 적응을 나타내는 개체로부터 얻은 （분리된） 조직 （예컨대, 이식 받은조직）을포함하는것일수있다.
상기 방법에서,
（1） 쇼¾） 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응 리 !!）을 나타내는 비교대상시료와비교하여, 시험 시료에서 , 1표11106/\， ^0X1, 및쇼0）1로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자（예컨대,
Figure imgf000008_0001
등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높거나, 및/또는시험 시료에서
Figure imgf000008_0002
0（½8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대,
Figure imgf000008_0003
및/또는상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우， 상기 시험 시료가 유래한 대상이 새0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 （거부반응이 없가나 낮은 수준（수용 가능한 수준）임）을 나타내는 것으로 확인 （또는 판단 또는 결정）하거나, 및/또는
（2） 쇼130 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응（ : 0）_0<1 ）]!）을 나타내는 비교대상시료와비교하여, 시험 시료에서
Figure imgf000008_0004
11표¾1106/\， 0X1， 및此01로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자（예컨대，
Figure imgf000008_0005
등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮거나, 및/또는 州요 요쇼 및 0（½8으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대,
Figure imgf000008_0006
등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 새0 혈액형 부적합 이식에 대하여 이식 거부를 나타내는 것으로 확인 （또는 판단또는결정）할수있다.
다른예에서,생물학적 시료가조직 시료인 경우，새0혈액형 부적합 이식의 거부반응을모니터링하는방법은다음의 단계를포함할수있다: 쇼汉） 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터의 얻은 생물학적 시료에서
Figure imgf000008_0007
및 10X1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대, 이 /\, 신） 등） 및/또는 상기 유전자가암호화하는단백질 발현수준을즉정하는단계 ;및
하기의 식 2를계산하는단계:
식 2 = -3.2 - 15.8*[¾«}·] + 4.0* 1£4] + 23.1*[/\⑶ 1] +
11.0*[5100새] + 20.0*肝 £射06/\] - 50.6*[/\〔:0사]
（상기 식 중, [유전자 또는 단백질]은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 의미하는 것으로 예컨대, 상기 수준은 정량적 PCR （예컨대, quantitative real-time PCR）을통하여 얻어진유전자수준일수있다）. 상기 수학식 2에 의해 얻어진 값이 0.5보다큰 경우 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 （거부반응이 없거나 낮은수준 （수용가능한수준）임）을나타내는 것으로 확인 （또는판단또는 결정）할 수 있으며 0.5보다 적은 경우 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합이식에 대하여 거부반응을나타내는 것으로확인 （또는판단 또는결정）할수있다.
상기 대상은인간등의 포유동물에서 선택된개체일수있다.
본 명세서에 기재된 AB0 혈액형 부적합 이식의 거부 반응을 모니터링하는 방법, 상기 비교하는 단계, 계산하는 단계, 및/또는 확인 （또는 판단또는 결정）하는 단계 이후에, 다음의 단계를추가로포함할수 있다:
（a） 상기 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응을 나타내는 것으로 확인 （또는 판단 또는 결정）된 경우, 상기 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응을 치료하거나 진행중인 면역 억제 치료를 강화（면역억제제투여량증가, 투여 횟수증가등）하는단계, 및/또는
（b） 상기 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 （거부 반응이 없거나 낮은 수준 （수용 가능한 수준）임）을 나타내는 것으로 확인 （또는 판단또는 결정）된 경우, 면역억제제 투여량또는투여 횟수를유지 또는감소시키거나면역억제제 투여를종료하는단계 .
【과제의 해결수단】
일 예는 AB0 혈액형 부적합 이식（ABO blood-type incompatible transplantation）에서의 거부 반응을 모니터링（진단）하기 위한 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용하여 AB0 혈액형 부적합 이식에서 항체-매개 거부반응을모니터링하는기술을제공한다.
본 명세서에서 사용된 바로서, AB0 혈액형 부적합 이식은 신장, 간 등의 고형 장기의 이식에 있어서 수여자와 공여자의 AB0식 혈액형이 일치하지 않는경우를의미한다.
바이오 마커는 KHK TPPP3, CFD FCGR3B CD14, C1QA TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3 C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A, 및 S100A8로이루어진군에서 선택된 1종이상의 유전자 （예컨대，
Figure imgf000010_0001
등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전자및/또는단백질은인간， 원숭이 등의 영장류， 마우스, 래트등의 설치류등을포함하는포유동물유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는것은아니다.
상기 마커로 사용 가능한 유전자/단백질들 중 인간 유래의 유전자/단백질을아래의 표 1에 예시하였다:
[표 1]
Figure imgf000010_0002
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
일구체예에서 , 상기 바이오마커는 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96로 이루어진 군에서 선택된 1종이상（예컨대, C0X7A2L, CD69, CD14, CFD및 F0XJ3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상）의 유전자（예컨대， mRNA, cDNA등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질일 수 있다. 상기 바이오마커 （■, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD 14, C1QA, TNFRSF8 , FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, ⑶ 69, CMTM6, 및 LY96로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상）는（이식 받은 환자로부터 분리된） 말초혈액 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료에 사용하기 위한것일수있다.
다른 구체예에서, 상기 바이오마커는 MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A및 S100A8로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자 （예컨대, mRNA, cDNA 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질일 수 있다. 상기 바이오마커 （MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A 및 S100A8 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상）는 조직 시료 （예컨대, 이식 장기 또는조직으로부터 분리된조직）에 사용하기 위한것일수있다. 본 명세서에사 사용된 바로서, ’’거부 반응（reject ion）”은 항체- 매개성 거부반응 （ant ibody-medi ated rej ect ion） 및 항체-매개성 거부반응을 포함하는 혼합 거부 반응（mixed rej ect ion）을 포괄하는 의미일 수 있다. 또한， 본 명세서에서 사용된 바로서， .혈액형 부적합 이식 （blood-type incompat i b le transpl antat ion）은 신장, 간 등의 고형 장기 또는이들로부터 분리된조직의 AB0혈액형 부적합이식을의미할수있다. 다른 예는 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD 14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A, 및 S100A8 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자 （예컨대, mRNA, cDNA등） 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 검출 가능한 제제를 포함하는 AB0 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개성 거부반응모니터링용조성물을제공한다.
일 구체예에서, 상기 모니터링용조성물은 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, ⑶ 14， C1QA, TNFRSF8 , FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상 （예컨대, C0X7A2L, CD69, CD 14, C抑 및 F0XJ3으로이루어진군으로부터 선택된 1종이상）의 유전자（예컨대, mRNA 2019/107673 1»（：1^1{2018/002720
및/또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 검출 가능한 제제를 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 모니터링용 조성물은 （이식 받은 환자로부터 분리된） 말초혈액 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료에 사용하기 위한것일수있다.
다른 구체예에서, 상기 모니터링용조성물은 ¾¾ ， 1 £¾106/\, 11X4, 쇼（：0）（1 ,
Figure imgf000013_0001
3100쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자 （예컨대, 11浪 ,
Figure imgf000013_0002
등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 검출 가능한 제제를 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 모니터링용 조성물은 조직 시료 （예컨대, 이식 장기 또는 조직으로부터 분리된조직）에 사용하기 위한것일수있다.
상기 검출 가능한 제제는상기 유전자 및/또는 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질 （예컨대, 항체 등）, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 （예컨대， 프라이머 （예컨대, 상기 유전자 중 연속하는 50-20아 의 양 말단과혼성화가능한 핵산서열을 갖는 5-50位 , 5-30 ， 5-25 ， 5_20位， 10-50 , 10-30111; , 10-25 , 또는 10_20 의 올리고뉴클레오타이드）， 프로브 （예컨대, 상기 유전자중 연속하는 10-10아）1）, 10-5애1）, 또는 10-30 5? 와 혼성화 가능한 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드）, 압타머, ｛ 쇼 등）, 화학 물질 （＜±6111 크1） 등으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으며, 임의로 통상적으로 사용되는 표지 물질 （예컨대, 형광물질 （예컨대, 형광 단백질, 형광 화학 물질 등）, 방사성동위원소 등）로 표지된 것일 수 있다. 상기 ’혼성화 가능하다 함은 상기 유전자 부위의 핵산서열과 80%이상, 예컨대 90%이상， 95%이상， 98%이상, 99% 이상， 또는 100%의 서열 상보성을 가짐으로써 상보적 결합이 가능함을 의미할수 있다.
다른 예는, 쇼期 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 얻어진
Figure imgf000013_0003
단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는， 쇼的 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개성 거부반응을 모니터링하는 방법 또는 쇼«） 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개성 거부반응을 모니터링에 정보를.제공하는 방법 제공한다. 다른 예는, 쇼 혈액형 부적합 이식에서의 항체-매개 거부반응을 모니터링을 위하여, AB0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 얻어진 （분리된） 생물학적 시료에서 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3 , C0X7A2L, CD69, CMTM6, LY96, MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A, 및 S100A8 로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자（예컨대， mRNA, cDNA등） 및/또는상기 유전자가 암호화하는단백질의 발현수준을측정하는방법을제공한다.
상기 생물학적 시료는 상기 대상으로부터 얻은 （분리된） 말초 혈액 또는 혈청을 포함하는 혈액 시료, 상기 대상의 이식된 장기 또는 조직으로부터 얻은 （분리된） 조직을포함하는조직 시료, 또는 이들모두일 수있다.
상기 유전자 및/또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계는， 상기 생물학적 시료에 상기 유전자 및/또는 단백질의 검출 가능한 제제를 접촉 （첨가）시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 검출 가능한 제제는 앞서 설명한바와같다.
생물학적 시료 （예컨대, 혈액 시료）에서, KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B,
CD 14, C1QA, TNFRSF8 및 FFAR2 로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 유전자 （예컨대， mRNA, cDNA 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 상대적으로 높은 발현 수준, 및/또는 F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자（예컨대, mRNA, cDNA 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 상대적으로 낮은 발한수준은 상기 시료가 얻어진 （분리된） 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 이식 적응을 나타냄 （이식 거부를 나타내지 않거나 수용 가능한수준으로약하게 나타냄）을의미할수있다.
상기 유전자의 발현 수준을 즉정하는 단계는 상기 유전자와혼성화 가능한 프라이머, 프로브, 또는 앱타머를 사용하는 통상적인 유전자 분석 방법, 예컨대, 폴리머레이즈 연쇄 반응법 （PCR）, 역전사폴리머레이즈연쇄 반응법 （RT-PCR） , FISH（f luorescent in s i tu hybr idi zat ion）, 마이크로어레이법, 등을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 화학 물질, 항체, 또는 압타머 등을 이용하는 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을통하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 유세포 분석， 면역크로마토그래피（Immunochromatography） , 면역조직화학염색 , 효소결합 면역톱착 분석 (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA) , 방사선 면역즉정법 (radioimmunoassay: RIA) , 효소 면역분석 (enzyme immunoassay： EIA) 형광면역분석 (Floresence immunoassay: FIA) , 발광면역분석 (luminescence immunoassay· LIA) , 웨스턴블라팅 (Western blotting) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는것은아니다.
일 예에서, 생물학적 시료가 혈액 시료일 경우， AB0 혈액형 부적합 이식의 항체-매개성 이식 거부반응을 모니터링하는 방법은 다음의 단계를 포함할수있다:
AB0혈액형 부적합 이식을받은 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료
(혈액 시료; 이하 "시험 시료 (시험 혈액 시료n에서 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B CD 14 C1QA, TNFRSF8, FFAR2 F0XJ3, C0X7A2L CD69, CMTM6 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA 등) 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 시험 시료에서 측정된 발현 수준을 비교대상 시료에서의 상기 유전자및/또는단백질의 발현수준과비교하는단계.
상기 비교대상 시료는 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응 또는 적응을 나타내는 것이 확인된 개체로부터 얻은 (분리된) 혈액 시료일 수있다.
따라서 , 상기 방법은상기 비교하는단계 이전에 , 비교대상시료에서 KHK, TPPP3 , CFD, FCGR3B, CD 14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 발현 수준을측정하는단계를추가로포함할수있다.
상기 방법에서
(1) AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응 (rejection)을 나타내는 비교대상 시료와 비교하여, 시험 시료에서 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14 C1QA, TNFRSF8 및 FFAR2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대, mRNA, cDNA등) 및/또는상기유전자가암호화하는 단백질의 발현 수준이 높거나 및/또는 시험 시료에서 F0XJ3 C0X7A2L, CD69, CMTM6 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 (예컨대， mRNA, cDNA등) 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 발현 수준이 낮은 경우 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 （거부반응이 없거나낮은수준（수용가능한수준）임）을 나타내는것으로확인 （또는판단또는결정）하거나 및/또는
（2） AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응（accommodation）을 나타내는 비교대상 시료와 비교하여, 시험 시료에서 KHK, TPPP3, CFD,
FCGR3B, CD14 C1QA, TNFRSF8 및 FFAR2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자（예컨대， mRNA, cDNA등） 및/또는상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮거나, 및/또는 시험 시료에서 F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대 mRNA, cDNA등） 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 발현 수준이 높은 경우 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 이식 거부를나타내는 것으로 확인 （또는판단또는결정）할 수있다.
따라서， 상기 방법은. 상기 비교하는 단계 이후에, 다음의 단계를 추가로포함할수있다:
AB0혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응（rejection）을 나타내는 비교대상시료와비교하여， 시험 시료에서 KHK, TPPP3， CFD FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8 및 FFAR2로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대， mRNA cDNA등） 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 발현 수준이 높은 경우, 및/또는 F0XJ3, C0X7A2L, CD69 CMTM6 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대， mRNA, cDNA 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응
（거부반응이 없거나 낮은 수준（수용 가능한 수준）임）을 나타내는 것으로 확인 （또는판단또는결정）하는단계 , 및/또는
AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응（accommodation）을 나타내는 비교대상시료와비교하여 시험 시료에서 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B CD14, C1QA, TNFRSF8 및 FFAR2로 이루아진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대 mRNA, cDNA등） 및/또는상기 유전자가암호화하는단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 또는 F0XJ3, C0X7A2L, CD69， CMTM6 및 LY96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대, mRNA cDNA 등） 및/또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 이식 거부반응을나타내는것으로확인 （또는판단또는결정）하는단계.
다른예에서, 생물학적 시료가혈액 시료인 경우， AB0혈액형 부적합 이식의 거부반응을모니터링하는방법은다음의 단계를포함할수있다:
AB0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터의 얻은 생물학적 시료에서 C0X7A2L, CD69, CD14, CFD, 및 FoxJ3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대, mRNA, cDNA 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는단백질 발현수준을측정하는단계 ; 및
하기의 식 1을계산하는단계 :
식 1 = -104.2 - 140.4* [C0X7A2L] - 184.3* [CD69] + 772.5* [CD14] - 1056.9* [CFD] + 518.5* [FoxJ到
（상기 식 중, [유전자 또는 단백질]은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 의미하는 것으로, 예컨대, 상기 수준은 정량적 PCR （예컨대, quant i tat ive real-t ime PCR）을통하여 얻어진유전자수준일수있다）. 상기식 1에 의해 얻어진값이 0.5보다큰경우， 상기 시료가유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 （거부반응이 없거나 낮은 수준（수용 가능한 수준）임）을 나타내는 것으로 확인 （또는 판단 또는 결정）할 수 있으며， 0.5보다 적은 경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응을나타내는 것으로확인 （또는판단 또는결정）할수있다.
따라서, 상기 AB0 혈액형 부적합 이식의 거부 반응을 모니터링하는 방법은, 식 1을 계산하는 단계 이후에, 다음의 단계를 추가로 포함할 수 있다:
상기 식 1에 의해 얻어진값이 0.5보다큰경우, 상기 시료가유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 （거부반응이 없거나 낮은 수준 （수용 가능한 수준）임）을 나타내는 것으로 확인 （또는 판단 또는 결정）하는단계， 및/또는
상기 식 1에 의해 얻어진 값이 0.5보다 적은 경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응을 나타내는 것으로확인 （또는판단또는결정）하는단계.
조직 시료에서， MGAM, TMEM106A, A⑴ XI 및 AC01로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자（예컨대, mRNA, cDNA등） 및/또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 상대적으로 높거나, 및/또는 TNFRSF12A 및 S100A8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대, mRNA, 2019/107673 1»（：1^1{2018/002720
등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 상대적으로낮은경우, 상기 조직 시료가유래한대상이 쇼요0혈액형 부적합 이식에 적응을 나타냄 （거부반응이 없거나 낮은 수준 （수용 가능한 수준）임）을확인할수 있다.
일 예에서, 생물학적 시료가조직 시료인 경우， 새0혈액형 부적합 이식의 거부반응을모니터링하는방법은다음의 단계를포함할수있다: 새0 혈액형 부적합 이식 받은 대상으로부터의 얻은 생물학적 시료 （조직 시료; 이하 "시험 시료 （시험 조직 시료）"）에서 ,
Figure imgf000018_0001
1X4, 쇼0））（1， 此01，
Figure imgf000018_0002
및 3100쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대,
Figure imgf000018_0003
및/또는상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현수준을측정하는단계;
상기 시험 시료에서 측정된 발현 수준을 비교대상 시료에서의 발현 수준과비교하는단계 .
상기 비교대상시료는쇼묘0혈액형 부적합이식을받은개체로서 거부 반응 또는 적응을 나타내는 개체로부터 얻은 （분리된） 조직 （예컨대, 이식 받은조직）을포함하는것일수있다.
따라서, 상기 방법은, 상기 비교하는 단계 이전에, 비교대상 시료에서 / , 1¾£ 06/\, 狀4, 0）X1, 쇼〔:01,
Figure imgf000018_0004
및 3100쇼8으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대, 111韻 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로포함할수있다.
상기 방법에서,
（1） 쇼期 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응 0^^ 011）을 나타내는비교대상시료와비교하여 , 시험 시료에서 ¾ , 11£ 106 쇼0））（1, 및此이로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자（예컨대， 미四
Figure imgf000018_0005
등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높거나， 및/또는시험 시료에서
Figure imgf000018_0006
3100쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자（예컨대, 111 /\,
Figure imgf000018_0007
및/또는상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 쇼 ） 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 （거부반응이 없거나 낮은 수준（수용 가능한 수준）임）을 나타내는 것으로 확인 （또는 판단 또는 결정）하거나, 및/또는
（2） 쇼130 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응（^0）1^110（1^1011）을 나타내는비교대상시료와비교하여, 시험 시료에서 MGAM, TMEM106A, AC0X1 , 및 AC01로이루어진 군에서 선택된 1종이상의 유전자（예컨대 mRNA, cDNA 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮거나, 및/또는 TNFRSF12A 및 S100A8으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대 mRNA cDNA 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합이식에 대하여 이식 거부반응을나타내는 것으로 확인 （또는 판단또는결정）할수있다.
따라서, 상기 방법은， 상기 비교하는 단계 이후에， 다음의.단계를 추가로포함할수있다:
AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응（rej ect ion）을 나타내는 비교대상 시료와 비교하여, 시험 시료에서 MGAM TMEM106A, AC0X1, 및
AC01로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유·전자 （예컨대, mRNA, cDNA 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높가나 및/또는시험 시료에서 TNFRSF12A및 S100A8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자（예컨대, mRNA, cDNA등） 및/또는상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 상기 시험 시료가 유래한 대상아 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 （거부반응이 없거나 낮은 수준（수용 가능한수준）임）을나타내는 것으로확인 （또는판단또는결정）하는단계, 및/또는
AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응（accommodat ion）을 나타내는 비교대상 시료와 비교하여, 시험 시료에서 MGAM, TMEM106A, AC0X1, 및 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대， mRNA, cDNA 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮거나, 및/또는 TNFRSF12A 및 S100A8으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대, mRNA, cDNA 등） 및/또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높은 경우， 상기 시험 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합이식에 대하여 이식 거부반응을나타내는 것으로 확인 （또는 판단또는결정）하는단계 .
다른예에서 , 생물학적 시료가조직 시료인경우, AB0혈액형 부적합 이식의 거부반응을모니터링하는방법은다음의 단계를포함할수있다:
AB0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터의 얻은 생물학적 시료에서 MGAM, MUC4, AC01 S100A8, TMEM106A 및 AC0X1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 （예컨대, mRNA, cDNA등） 및/또는 상기 유전자가암호화하는단백질 발현수준을측정하는단계 ; 및
하기의 식 2를계산하는단계 :
식 2 = -3.2 - 15.8*[MGAM] + 4.0아:MUC4] + 23.1*[AC01] + ll.（MS100A8] + 20.0*[TMEM106A] - 50.6*[AC0X1]
（상기 식 중 [유전자 또는 단백질]은 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 의미하는 것으로 예컨대, 상기 수준은 정량적 PCR （예컨대, quantitative real-time PCR）을통하여 얻어진유전자수준일수있다）. 상기 수학식 2에 의해 얻어진 값이 0.5보다큰 경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 （거부반응이 없거나 낮은수준 （수용가능한수준）임）을나타내는 것으로확인 （또는판단또는 결정）할 수 있으며， 0.5보다 적은 경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합이식에 대하여 거부반응을나타내는 것으로확인 （또는판단 또는결정）할수있다. ·
따라서, 상기 AB0 혈액형 부적합 이식의 거부 반응을 모니터링하는 방법은, 식 2를 계산하는 단계 이후에, 다음의 단계를 추가로 포함할 수 있다:
상기 수학식 2에 의해 얻어진 값이 0.5보다큰 경우， 상기 시료가 유래한 대상이 AB0혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 （거부반응이 없거나 낮은 수준（수용 가능한수준）임）을 나타내는 것으로 확인 （또는 판단또는 결정）하는단계, 및/또는
상기 수학식 2에 의해 얻어진 값이 0.5보다적은경우, 상기 시료가 유래한 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응을 나타내는 것으로확인 （또는판단또는결정）하는단계.
상기 대상은 인간 원숭이 등의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류 등을포함하는포유동물에서 선택된개체일수있다.
본 명세서에 기재된 AB0 혈액형 부적합 이식의 거부 반응을 모니터링하는 방법, 상기 비교하는 단계, 계산하는 단계, 및/또는 확인 （또는판단또는 결정）하는 단계 이후에， 다음의 단계를추가로 포함할수 있다:
（a） 상기 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응을 나타내는 것으로 확인 （또는 판단 또는 결정）된 경우 상기 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응을 치료하거나 진행중인 면역 억제 치료를 강화 (면역억제제 투여량증가,투여 횟수증가등)하는단계, 및/또는
(b) 상기 대상이 AB0 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응 (거부 반응이 없거나 낮은 수준 (수용 가능한 수준)임)을 나타내든 것으로 확인 (또는 판단또는 결정)된 경우, 면역억제제 투여량또는 투여 횟수를유지 또는감소시키거나면역억제제 투여를종료하는단계.
상기 거부반응의 치료는 상기 대상에게 항-이식거부 면역억제제 (anti-rejection immunosuppressive drug)의 유효량의 투여 및/또는 혈장분리술 (plasmapheresis)등에 의하여 수행될수있다.
상기 항-이식거부 면역억제제 또는 면역억제제는 면역억제 활성을 갖는 모든 단백질 (예컨대, 항체 등), 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 화학 약물등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구체 예에서， 항-이식거부 면역억제제는 바실리시맙 크 11x^31) , 에이티지 (Ant i-thymoglobul in, ATG) , 알렘투주맙(316011；1121111131) , 메틸프레드나솔론 (methylprednisolone)， 타클로리무스 (1크:101 배) , 프레드니솔론 (prednisolone) 및 마이코페놀레이트 모페틸 (mycophenolate mofeti 1) , 면역글로불린 (;_에0용101111111) , 리툭스맙 (r ituximab)， 보테조밉 (1X1^62011^1) , 에큘리주
Figure imgf000021_0001
등으로 이루어진 군에서 선택된 1종이상일수있으나, 이에 제한되는것은아니다.
【발명의 효과】
본명세서에서 제공되는모니터링 기술에 의하여,쇼的혈액형 부적합 이식을 받은 환자에서의 이식 거부 여부를 보다 간편하면서도 정확하게 모니터링할 수 있어서, 쇼 혈액형 부적합 이식 후의 환자 상태에 따른 적절한치료를 제공할수 있어서， 이식의 성공가능성을보다높일 수 있다.
【도면의 간단한설명】
도 1은 일 실시예에 따른 혈액 또는 조직 시료를 이용한 이식 거부반응모니터링 과정을개략적으로보여주는모식도이다.
도 2는혈액 시료에서의 functional annotation및 pathway analysis 결과를보여준다
도 3은 혈액 시료에서 GSEA (gene set enrichment analysis) 수행 결과, ABOiR과비교하여 ABOiA에서 상향조절되는유전자세트를보여준다. 도 4는 혈액 시료에서 GSEA (gene set enr i chment analys i s) 수행 결과, ABOiR과비교하여 ABOiA에서 하향조절되는유전자세트를보여준다. 도 5는혈액 시료에서 ABOiR과비교하여 ABOiA와유의적 상관관계를 갖는후보유전자를보여준다.
도 6a 내지 7b는 혈액 시료에서의 KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14,
C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3, C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96 유전자의 정량적 real-t ime PCR결과를보여주는그래프이다.
도 8은 실시예 2의 식 1를 적용하여 혈액 시료에서 Training Set과 Val idat ion Set (8 개의 ABOiA와 2 개의 ABOiR이 포함됨)을 분석한 결과를 보여준다.
도 9는 조직 시료에서 GSEA (gene set enr i chment analys i s) 수행 결과, ABOiR과비교하여 ABOiA에서 관련성을갖는유전자세트를보여준다. 도 10은 조직 시료에서 ABOiR과 비교하여 ABOiA와 유의적 상관 관계를갖는후보유전자를보여준다.
도 11a 및 l ib는 조직 시료에서의 MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1,
AC01, TNFRSF12A 및 S100A8 유전자의 정량적 real-t ime PCR 결과를 보여주는그래프이다.
도 12는실시예 3의 식 2를적용하여 조직 시료에서 Training Set을 분석한결과를보여준다.
【발명을실시하기 위한구체적인내용】
이하본발명을다음의 실시예에 의하여 보다구체적으로설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가이들실시예에 의하여 제한되는것은아니다. 실시예 1. 시료의 준비 및 RNA시퀀싱
AB0 혈액형 부적합 신장 이식 (ABO incompat i ble kidney transpl antat ion； ABOi KT)을 받은 수여자들 중, 이식 후 10 일째의 프로토콜 생검 (protocol biopsy)에서 이식 거부반응을 나타내지 않고 신장 이식 후 3 개월간 비정상적인 신장 기능을 보이지 않는 18 명의 ABOi KT 수여자 (이식 적응 (accommodat ion) 수여자: ABOiA)를 선정하였다. 비교를 위하여, 10 일째 프로토콜 생검에서 급성 항체-매개 거부반응 (ant ibody- medi ated rej ect i on； AMR)을 보인 10명의 ABOi KT 수여자 (이식 거부 (rejection) 수여자: ABOiR)를 선정하였다. 상기 선정된 수여자들의 말초혈액 (per ipheral blood； PB) 시료를 취하여 2010년 6월부터 20M년 8월까지 bioreposi tory에 저장하였다. 그 중 16 명의 ABOiA 수여자와 6 명의 ABOiR 수여자의 신장 생검 조직을 biorepository에 저장하고, intragraft transcr iptomic analysis에사용하였다.
ABOi KT의 경우， 모든 수여자에 대하여 탈감작 프로토콜 (desensitization protocol)을 수행한후， 혈장분리교환술 (plasmapheresis) 개시 전 7일 이내에 항 CD20 키메라 모노클로날 항체인 리툭시맙 (rituximab)을 125 mg/m2(single dose)의 양으로 투여하였다. 혈장분리교환술은 미리 형성된 isoagglutinin (항 AB⑴ 항체를 제거하기 위하여 신장 이식 전에 수행한다. plasmapheresis의 횟수는 anti -donor isoagglutinin IgG 기준 역가에 따라 결정되고, 수술 전 허용되는 isoagglutinin IgG 역가는 1:16 이하이다. 항- ABO isoagglutinin 항체 역가는 수여자의 혈청을 2 배 연속 희석하여 측정하였다. 항- AB0 항체 역가는 gel card test (Sigma-Aldr ich, St. Louis, M0, USA)를 사용하여 즉정하였다. plasmapheresis의 각 세션 후, intravenous immunoglobul in의 저용량 (100 mg八 eg)을 투여하였다. 유도 요법으로, 모든 환자에 대하여 0 일과 4 일째에 바실리시맙 (basi 1 iximab) 20 mg을 투여하고, 타클로리무스 (tacrol imus)， 프레드니솔론 (prednisolone) 및 마이코페놀레이트 모페틸 (mycophenolate mofetil)을 포함한 통상적인 삼중 유지 면역 억제제 (triple maintenance immunosuppressive agent)를 투여하였다.
정량적 중합효소연쇄반응 (Q-PCR) 시험의 검증을 위하여, 독립적인 인센터 (in-center) PB 시료 (15 ABOiA 및 9 ABOiR) 또는 독립적 인센터 이식편 조직 (graft tissue) 시료 (18 ABOiA 및 9 ABOiR)로부터 training set을 준비하고, 다른 center의 독립적 시료 (8 ABOiA 및 2 ABOiR)로부터 validation set을준비하여 분석에 사용하였다.
세포내 RNA의 안정화를위하여 , 모든 PB시료를 PAXgene® Blood RNA Tube (PreAnalyt iX GmbH , Hombrecht ikon, Switzer land)에 수집하였다. PB 및 조직 시료는 전체 RNA 추출시까지 -70°C에서 보관하였다. RNeasy®
Mini 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)를사용하여 PB및 조직 시료로부터 전체 RNA를 추출하였다. Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 시료량과 integrity를 체크하였다. 품질 관리 (RNA mass ñ 1 g 및 RNA Integrity 2019/107673 1»(：1/10公018/002720
Number > 6)를 통과한 각각의 시료를 사용하였다. Illumina TruSeq 프로토콜에 따라， PB 및 조직 시료로부터 추출된 쇼를 단편화， 역전사 및 랜덤 올리고- dT 프라이머를 사용하여 증폭시켜， adapter-ligated complementary DNA (cDNA) 라이브러리를 제조하였다. Illumina HiSeq platform (Illumina Inc. , San Diego, CA, USA)을 사용하여 cDNA 라이브러리의 서열을 분석하였다. Illumina HiSeq 결과는 시스템 제어용 HiSeq Control Software v2.2.38 (Illumina Inc.)를 이용하여 이미지화하고， base call은 Real Time Analysis vl 18.61.0 (Illumina Inc.)라 불리는 integrated primary analysis software를 통하여 분석하였다. base cal 1 binary data는 Illumina package bcl2fastq (vl.8.4, Illumina Inc.)를 사용하여 FASTQ로변환하였다.
FASTQ데이터는 FastQC:Read QC [Brown J, Pi r rung M, McCue LA. FQC Dashboard: integrates FastQC results into a web-based, interact ive, and extensible FASTQ quality control tool. Bioinformatics, 201기를 사용하여 Quality control하였다. 전사체 (transcript)의 정렬 및 정량을 위하여, Ensembl GRch37 reference genome을 사용하는 STAR (v.2.4. Id) mapper [Dobin A, Gingeras TR. Mapping RNA-seq Reads with STAR. Curr Protoc Bioinformatics 51:11 M 11-19， 2015； Dobin A, Davis CA， Schlesinger F， et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29:15-21， 2013]를 통해， 101 bp paired-end read를 인간 유전체 (GRCh37/hgl9 assembly)에 정렬시켰다 각각의 전사체에 대하여 FPKM (fragments per ki lobase per million reads) 값을 사용하여 transcript assembly 및 transcript abundance를 결정하고， 표준화시켰다. differential gene-cal ling 방법으로 DESeq (Bioconductor)를 사용하여 차별발현유전자 (Differential ly expressed genes； DEGs)를 확인하였다
(FDR (false discovery rate)을 <0.05로 제어 (13,373 개의 유전자)). functional annotation 및 pathway analysis 를 위하여， DEG를 주가 조사하였다. 또한, gene set enrichment analysis (GSEA)를공지된 방법에 따라서 수행하였다 (Subramanian A, Tamayo P， Mootha VK， et al . Gene set enrichment analysis : a knowledge-based approach for interpret ing genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 15545— 15550， 2005). 그 후， PB 시료 및 조직 시료 각각에서， ABOiR과 비교하여 ABOiA와상관관계가있는몇몇후보유전자를선정하였다. 초기 검증을 위해， RNA-seq (Discovery Set)에서 사용된 시료와 동일한 cDNA 시료에 대하여 Q-PCR을 수행하였다. internal validation을 위하여 RNA-seq에 사용되지 않은 독립적 인센터 시료 (independent in center samples)에 대해서도 Q-PCR를 수행하였다. 독립적 인센터 시료 (Training Set)의 Q-PCR 데이터를 사용하여 로지스틱 회귀 분석을 통해 ABOiA와 ABOiR 간와 구별을 위한 분류 모델을 개발하였다. 개발된 분류 모델은 external validation을 위하여 다른 센터로부터 얻어진 2차 독립 시료 (검증세트)에 적용하였다.개략적인시험 과정을도 1에 나타내었다. 실시예 2： 말초혈액 시료에서 AB0 혈액형 부적합 이식 적응군
(ABOiA)과상관관계가높은유전자의 선별
말초혈액 (PB) 시료의 RNA-seq 결과， ABOiR 군과 비교하여 ABOiA 군에서 차별발현유전자 (DEG)의 수는 총 1385 개였다 (FDR <0.05). 이 중에서 ABOiR 군과 비교하여 ABOiA 군에서 상향 조절된 DEG의 수는 483개이고, ABOiR 군과 비교하여 ABOiA 군에서 하향 조절된 DEG의 수는
902개였다.
DEG의 functional annotation및 pathway analysis는 DAVID 6.8 Beta (https : //david.nci fcrf .gov)를 통해 수행하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난바와같이, 5가지 kegg pathways (즉,산화적 인산화， 알츠하이머병， 리보솜, 헌팅톤병, 및 파킨슨 병)은 ABOiR과 비교하여 ABOiA와보다유의한관련성이 나타났다.
PB 시료에 대하여, 상기 실시 예 1에서 설명한 방법에 따라 GSEA (gene set enrichment analysis)를 수행하여， 그 결과를 도 3및 도 4에 나타내었다. 도 3은 ABOiR과 비교하여 ABOiA에서 상향조절되는 유전자 세트를보여주고,도 4는 ABOiR과비교하여 ABOiA에서 하향조절되는유전자 세트를보여준다.
ABOiR과 비교하여 ABOiA와 유의적 상관 관계를 갖는 후보 유전자를 선별하였으며,유전자선별거준은다음과같다:
(1)차별발현유전자중에서 발현 차이가크거나 (high fold change) 유의성 (p- value & FDR)이 높은유전자들,
(2) GSEA (gene set enrichment analysis) 또는 pathway ana lysis에서의 유의한 gene set또는 pathway에 포함된유전자들,
(3)면역 기능과기능적으로관련 있는유전자들， （4） 이식 적응또는이식 거부와관련 있는것으로알려진유전자들. 상기 선별 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이， 초기 검증（initial ver i f icat ion）을 위하여 13개 유전자， 즉, KHK, TPPP3, CFD, FCGR3B, CD14, C1QA, TNFRSF8, FFAR2, F0XJ3 , C0X7A2L, CD69, CMTM6, 및 LY96이 선정되었다.
RNA-seq 에 사용된 것과 동일한 cDNA 시료（Discovery Set； RNA-seq samples） 및 RNA-seq에 사용되지 않은 독립 인센터 시료 （15 ABOiA 및 9 ABOiR을 포함하는 Training Set； Internal validation samples）에 대하여 Q-PCR를 수행하여, 그 결과를 도 6a, 6b, 7a, 및 7b에 나타내었다. 상기 Q-PCR에 사용된프라이머를하기의 표 2에 정리하였다:
[표 2]
Figure imgf000026_0001
Biosystems, Foster City, CA, USA）을 이용하여， 제조사가 .제공하는 Standard protocol에 파라서 수행하였다. Expression value 계산을 위한 reference gene은 GAPDH을이용하였다.
classification model 구죽을 위하여, two-tail t_test에 의하여 확인된 significant set （7개 유전자）를 추가 분석하였다. Training Set 시료의 Q-PCR데이터를사용하여, 다음과같은로지스틱 회귀 분석을통해， ABOiA와 ABOiR를 판단하기 위한 5 가지 유전자의 classification model을 개발하였다 （아래 식 1 중, □는 Q-PCR로 측정된 유전자 （예컨대, mRNA, cDNA등) 발현수준을의미함) .
Figure imgf000027_0002
상기 모델을 적용하여 Training Set과 Val idat ion Set (8 개의 ABOiA와 2 개의 ABOiR이 포함됨)을 분석한결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 확인되는 것과 같이, Training Set에서, 상기 c l assi f i cat ion model을 사용하여 분류시, 100% 민감도, 100% 특이성， 및 100% 정확도로 ABOiA와 ABOiR를 구분할 수 있는 것으로 나타났다. 또한， Val idat ion Set에서는 75% 민감도, 100% 특이성， 및 80% 정확도로 ABOiA와 ABOiR을 분류할수는것으로나타났다. 실시예 3： 조직 시료에서 ABOiA과상관관계가높은유전자의 선별 조직 시료에 대한 RNA-seq에서 , ABOiR군과 바교하여 ABOiA 군에서 차별 발현되는 유전자 (DEG)의 수는 총 179 개였다 (FDR <0.05) . ABOiR 군과비교하여 ABOiA군에사상향조절된 DEG의 수는 122개이고, ABOiR군과 비교하여 ABOiA군에서 하향조절된 DEG와수는 57개였다.
조직 시료에 대하여 상기 실시예 1에서 설명한 방법에 따라 GSEA
(gene set enr i chment analysi s)를수행하여， 그결과를도 9에 나타내었다. 도 9는 G況 A의 결과 및 ABOiR과 비교하여 ABOiA와 관련성을 갖는 gene set와예를보여준다. .
상기 실시예 2에서 기재한 유전자 선별 기준에 따라 ABOiR과 비교하여 ABOiA와유의적 상관관계를갖는후보유전자를선별하였다. 그 결과， MGAM, TMEM106A, MUC4, AC0X1, AC01, TNFRSF12A 및 S100A8의 7개 유전자가초기 검증을위하여 선택되었다 (도 10참조) .
RNA-seq 에 사용된 것과 동일한 cDNA 시료 (Di scovery Set ; RNA-seq samples) 및 RNA-seq에 사용되지 않은 독립 인센터 시료 (18 ABOiA 및 9 ABOiR)을 포함하는 Training Set； Internal val idat ion sampl es)에서 상기 7개 유전자에 대한 Q-PCR를 수행하여， 그 결과를 도 11a 및 lib에 나타내었다. 상기 Q-PCR에 사용된프라이머를하기의 표 3에 정리하였다:
[표 3]
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
상기 Q-PCR은 Applied Biosys terns Prism 7300 （PE Applied Biosystems , Foster City, CA, USA）을 이용하여, 제조사가 제공하는 Standard protocol에 따라 수행하였다. Expression value 계산을 위한 reference gene은 GAPDH을이용하였다.
Training Set 시료의 Q-PCR 데이터를 사용하여, 다음과 같은 로지스틱 회귀 분석을 통해，’ ABOiA와 ABOiR를 판단하기 위한 6 가지 유전자의 classification model을 개발하였다（아래 식 2중, □는요- 로 측정된유전자（예컨대， mRNA, cDNA등）발현수준을의미함）.
Figure imgf000028_0002
상기 모델을 적용하여 Training Set을 분석한 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에서 확인되는 것과 같이, Training Set에서, 상기 classification model을사용하여 분류시, 88,9%민감도， 55.5%특이도， 및 77.8%정확도로 ABOiA와 ABOiR를구분할수있는것으로나타났다.

Claims

2019/107673 1»（：1^1{2018/002720 【특허청구범위】
【청구항 1】
때 ，
Figure imgf000029_0001
CFD, 1 ¾38, 0014, 0^,
Figure imgf000029_0002
犯사3, 期 孔, 0069, 011¾6, 96, / , 11£¾06 ■¾, 쇼0¾1, 此01, 1 1¾1 2/\， 및 00쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 검출 가능한 제제를 포함하는, 쇼明 혈액형 부적합이식에서의 항체-매개성 거부반응모니터링용조성물.
【청구항 2]
제 1항에 있어서, 別 1（ , 1???3 , （：抑, [ ¾38 , 0）14 , （：½쇼 , 1½¾38 , 的 3， ⑶ 孔, 0069, 01116, 및 96로 이루어진 군에서 선택된
1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 검출 가능한 제제를포함하고, 혈액 시료에사용하기 위한것인,조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서，
Figure imgf000029_0003
3100쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 검줄 가능한 제제를 포함하고, 조직 시료에 사용하기 위한것인,조성물.
【청구항 4]
저 11항내지 제 3항중어느한항에 있어서 ,상기 검출가능한제제는 상기 유전자 또는 단백질에 결합하는 단백질， 펩타이드， 올리고뉴클레오타이드, 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 조성물.
【청구항 5】
쇼的 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 생물학적
Figure imgf000029_0004
상기 유전자가암호화하는 단백질의 발현 수준을측정하는단계를포함하는, 상기 새0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상에서의 항체-매개성 거부반응 모니터링 방법.
【청구항 6】
제 5항에 있어서,
쇼«） 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 생물학적 2019/107673 1»（：1^1{2018/002720
시료가혈액 시료이고,
상기 혈액
Figure imgf000030_0001
。!）, 1¾3民 0014,
Figure imgf000030_0002
FFAR2, 的 3， 0及7쇼2ᄂ 0예9, 附16, 및 96로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준을 측정하는단계를포함하는，
방법.
【청구항 7】
제 6항에 있어서,
상기 쇼표0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 혈액 시료에서 측정된 유전자 또는 단백질 발현 수준을 비교대상 시료에서의 상기 유전자또는단백질의 발현수준과비교하는단계를추가로포함하고，
Figure imgf000030_0003
방법.
【청구항 8】
제 7항에 있어서， 상기 비교하는 단계 이후에， 다음의 단계를추가로 포함하는, 방법:
새0 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응을 나타내는 것으로 확인된 개체로부터 분리된 비교대상 시료와 비교하여, 상기 쇼 혈액형
Figure imgf000030_0005
경우, 또는 的 3 , 0¾7쇼2ᄂ 0069 , 0附16 및 96으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 상기 대상이 쇼制 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응을
Figure imgf000030_0004
2019/107673 1»（：1^1{2018/002720
높은경우, 상기 대상이 요80혈액형 부적합이식에 대하여 이식 거부반응을 나타내는것으로확인하는단계.
【청구항 9】
제 5항에 있어서,
쇼潮 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 생물학적 시료가혈액 시료이고,
상기 혈액 시료에서 0«7쇼2ᄂ 0069 , )14, 。 !)， 및 的 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자수준을 정량적 ᄄ묘로 측정하는 단계를포함하고,
하기의 식 1을계산하는단계를추가로포함하는, 방법 :
식 1 = -104.2 - 140 , 4* [0¾7쇼2니 - 184.3* [0069] + 772.5* [0014] - 1056.9*比 1)] + 518.5아下이산3] .
【청구항 10】
제 9항에 있어서 , 상기 계산하는 단계 이후에， 다음의 단계를추가로 포함하는, 방법:
상기 식 1에 의해 얻어진 값이 0.5보다 큰 경우, 상기 대상이 쇼 혈액형 부적합이식에 대하여 적응을나타내는것으로확인하는단계; 또는 상기 식 1에 의해 얻어진 값이 0.5보다작은 경우， 상기 대상이 쇼¾) 혈액형 부적합이식에 대하여 거부반응을나타내는것으로확인하는단계.
【청구항 11】
제 5항에 있어서,
쇼묘0 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 생물학적 시료가조직 시료이고,
乂기 조직 시료에서 ， ¾^1106/\， ¾11£4，
Figure imgf000031_0001
TNFRSF12A 및 00쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가암호화하는단백질의 발현수준을측정하는단계를포함하는，
방법.
【청구항 12】
제 11항에 있어서,
상기 쇼요0 .혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 조직 시료에서 측정된 유전자 또는 단백질 발현 수준을 비교대상 시료에서의 상기 유전자또는단백질의 발현수준과비교하는단계를추가로포함하고， 상기 비교대상 시료는 쇼 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부반응 2019/107673 1»（：1^1{2018/002720
또는적응을나타내는것이 확인된개체로부터 분리된조직 시료인,
방법.
【청구항 13】
제 12항에 있어서, 상기 비교하는단계 이후에， 다음의 단계를추가로 포함하는, 방법:
쇼 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응을 나타내는 것으로 확인된 개체로부터 분리된 비교대상 시료와 비교하여， 상기 쇼明 혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 조직 시료에서，
Figure imgf000032_0001
1四 106 ^0X1, 및 쇼0)1로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높은 경우，
Figure imgf000032_0002
3100쇼8으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 상기 대상이 쇼요0 혈액형 부적합이식에 대하여 적응을나타내는것으로확인하는단계; 또는
쇼 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응을 나타내는 것으로 확인된 개체로부터 분리된 비교대상 시료와 비교하여, 상기
Figure imgf000032_0003
혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 조직 시료에서， / , 11묘¾1106 10X1， 및 01로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 낮은 경우, 또는 요온 쇼 및 310 8으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자또는상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 높은 경우, 상기 대상이 새0 혈액형 부적합이식에 대하여 이식 거부반응을나타내는것으로확인하는단계.
【청구항 14】
제 5항에 있어서,
Figure imgf000032_0004
혈액형 부적합 이식을 받은 대상으로부터 분리된 생물학적 시료가조직 시료이고，
상기 조직 시료에서
Figure imgf000032_0005
■¾, 此01, 00쇼8, 1¾¾射06 및 쇼0¾1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자수준을정량적 ᄄ요로 측정하는단계를포함하고,
하기의 식 2을계산하는단계를추가로포함하는, 방법 :
식 2 = -3.2 - 15.8* [¾« ] + 4.0* 況4] + 23. 1* [쇼0)1] +
11 .0* [3100쇼8] + 20.0* 묘附06/\] - 50.6* [/\⑴) (1] .
【청구항 15】
제 14항에 있어서 , 상기 계산하는단계 이후에 , .다음의 단계를추가로 2019/107673 1»（：1^1{2018/002720
포함하는,방법:
상기 식 1에 의해 얻어진 값이 0.5보다 큰 경우, 상기 대상이
Figure imgf000033_0001
혈액형 부적합이식에 대하여 적응을나타내는것으로확인하는단계;또는 상기 식 2에 의해 얻어진 값이 0.5보다작은경우,상기 대상이 새0 혈액형 부적합이식에 대하여 거부반응을나타내는것으로확인하는단계.
【청구항 16】
제 8항, 제 10항， 제 13항, 및 제 15항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 확인하는단계 이후에,다음의 단계를추가로포함하는,방법:
(3) 상기 대상이 쇼 혈액형 부적합 이식에 대하여 거부 반응을 나타내는 것으로확인된 경우， 상기 쇼敗혈액형 부적합이식에 대하여 거부 반응을치료하거나진행중인면역억제 치료를강화하는단계,또는
0)상기 대상이 쇼 혈액형 부적합 이식에 대하여 적응을나타내는 것으로 확인된 경우, 면역억제제 투여량 또는 투여 횟수를 유지 또는 감소시키거나면역악제제투여를종료하는단계:
【청구항 17】
01), 1 ¾3民 0)14, 0^, 1 ¾38， FFAR2， 的자3, 16, 96, ¾從·, 1¾··， 1X4， 此 , 此01,
Figure imgf000033_0002
0쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가암호화하는단백질을포함하는바이오마커,또는
상기 바이오마커의 검출가능한제제
의,새0혈액형 부적합이식에서의 항체-매개성 거부반응모니터링에 사용하기 위한용도.
【청구항 18】
제 17항에 있어서 ,상기 바이오
Figure imgf000033_0003
1¾38, 0)14, 0^,
Figure imgf000033_0004
的 3,⑶7쇼2匕, 0069, 0«16, 및 196로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질이고,혈액 시료에사용하기 위한것인,용도.
【청구항 19]
제 17항에 있어서 , 상기 바이오마커는
Figure imgf000033_0005
11표¾1106/\, ^04, 쇼⑶차, 01, 요的요쇼 및 00쇼8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질이고, 조직 시료에 사용하기 위한 것인,용도.
【청구항 20】 2019/107673 1»（：1/10公018/002720
제 17항에 있어서， 상기 검출 가능한 제제는 상기 유전자 또는 단백질에 결합하는 단백질， 펩타이드， 올리고뉴클레오타이드 및 화학물질로이루어진군에서 선택된 1종이상인， 용도.
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