JP2009506778A - 生物学的状態の診断および/または治療に有用なバイオマーカを同定する方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、生物学的状態を示すバイオマーカを同定する方法および組成物に関し、特に、転写因子のバイオマーカおよびかかる転写因子のバイオマーカによって調節することが可能な遺伝子に関する。また、本発明は、かかる転写因子および生物学的状態を示す調節遺伝子の多型を同定することに関する。同定されるバイオマーカおよび多型は、診断および治療の取り組みに用いられ、例えば、本発明のいくつかの態様において、気管支癌およびそのリスクを検出するための方法およびキットが提供される。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
Description
関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる2005年9月2日出願の米国特許仮出願第60/713,628号、第60/713,629号および60/714,138号の利益を主張するものである。
本願は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる2005年9月2日出願の米国特許仮出願第60/713,628号、第60/713,629号および60/714,138号の利益を主張するものである。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本願明細書において記載されている研究は、国立衛生研究所認可番号CA85147、CA81126、CA95806またはCA103594において、連邦政府による資金提供を受けたものである。
本願明細書において記載されている研究は、国立衛生研究所認可番号CA85147、CA81126、CA95806またはCA103594において、連邦政府による資金提供を受けたものである。
参照による引用
本明細書で述べるすべての公報及び特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願書が具体的かつ個別に示され参照により組み込まれているかのように、本願明細書において同程度に参照により組み込まれている。
本明細書で述べるすべての公報及び特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願書が具体的かつ個別に示され参照により組み込まれているかのように、本願明細書において同程度に参照により組み込まれている。
DNAの塩基配列または多型における特定の変化と特定の症状のリスクとの間の相関関係を評価することは、長年の支配的なパラダイムであった。しかし、かかる研究に共通した限界は、1つの多型、また場合によってはいくつかの多型の評価を必要とすることである。さらに、評価対象の多型は一般に特定の生物学的状態に関連した遺伝子内にあるが、研究のための多型の選定は、大部分が観察によって、例えば、既知の機能に基づくことなく行われていると考えられる。異なる部位に複数の多型が存在することがまれにあるが、その多型の全てがリスクの要因となる可能性があることや、手がかりとなる多型を機能検査で同定することはこれまで不可能であったことから、統計学的に有効な評価を行うためには、非現実的ともいえる位の膨大な数の解析対象集団が必要となる可能性がある。このように、問題となる症状の診断が可能で、治療標的としての働きをすることが可能なバイオマーカを同定する新規な方法に対する要求は、依然として存在する。
かかる症状の一例として、気管支癌(BC)がある。BCは、米国の癌関連死の主要原因である。喫煙が主要危険因子であるとはいえ、BCを発現する大量喫煙者はその一部に過ぎない。喫煙は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの他の肺動脈の症状の主因でもある。COPDは、最も一般的な慢性症状の1つであり、米国の死因の中で4番目に多い。BCおよび/またはCOPDのリスクを高める因子を同定することによって、その病気の治療および/または予防のための方法および組成物の開発だけでなく、早期発見のための方法および組成物の開発を進展させることができる。本発明は、BCおよび/またはCOPDや他の生物学的状態、例えば他の癌および/または他の肺関連症状などのリスクにおける因子を個別に同定するための、かかる方法および組成物に関する。
被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法は、該被験者からCEBPGの5’調節領域に対応する核酸領域を含む試料を得る段階;および該核酸領域をCEBPGの5’調節領域±約100塩基からなる核酸配列と比較する段階を含んでなり、ヌクレオチドの相違が該癌関連症状または該肺関連症状を示すものである。
被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法は、該被験者からCEBPGの3’非翻訳領域に対応する核酸領域を含む試料を得る段階;および該核酸領域をCEBPGの3’非翻訳領域±約100塩基からなる核酸配列と比較する段階を含んでなり、ヌクレオチドの相違が該癌関連症状または該肺関連症状を示すものである。
被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法は、該被験者からCEBPGのbZip領域に対応する核酸領域を含む試料を得る段階;および該核酸領域をCEBPGのbZip領域±約100塩基からなる核酸配列と比較する段階を含んでなり、ヌクレオチドの相違が該癌関連症状または該肺関連症状を示すものである。
被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法は、該被験者から、XRCC1、ERCC1、ERCC2、ERCC5、SOD1、GSTZ1、mGSTl、CAT、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位に対応する核酸領域を含む試料を得る段階;および該核酸領域をXRCC1、ERCC5、SOD1、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位±約100塩基からなる核酸配列と比較する段階を含んでなり、ヌクレオチドの相違が該癌関連症状または該肺関連症状を示すものである。
本発明の新規な特徴は、特に特許請求の範囲に記載される。本発明の目的、特徴および利点は、本発明の原理を利用する態様を説明する以下の詳細な説明、および図面を参照することによってさらによく理解することができる。
本発明は、生物学的状態を示すバイオマーカを同定する方法および組成物に関し、特に、転写因子のバイオマーカおよびかかる転写因子のバイオマーカによって調節することが可能な遺伝子に関する。また、本発明は、かかる転写因子および生物学的状態を示す調節遺伝子の多型を同定することに関する。同定されるバイオマーカおよび多型は、診断および治療の取り組みに用いられ、例えば、本発明は、いくつかの態様において、気管支癌およびそのリスクを検出するための方法およびキットを提供するものである。
I バイオマーカを同定する方法および組成物
A 相関関係の欠如に基づくアプローチ
一態様においては、本発明は、生物学的状態を示すバイオマーカを同定する方法に関する。いくつかの態様においては、この方法は、所定の生物学的状態における転写因子と他の遺伝子との間の発現量の相関関係の欠如を確認することを含む。いくつかの態様においては、前記他の遺伝子は、所定の生物学的状態に関連することが知られている遺伝子であり、この方法は、新たな転写因子のバイオマーカを同定することを含む。いくつかの態様においては、この転写因子は、所定の生物学的状態に関連することが知られており、この方法は、他の遺伝子である新たなバイオマーカを同定することを含む。
A 相関関係の欠如に基づくアプローチ
一態様においては、本発明は、生物学的状態を示すバイオマーカを同定する方法に関する。いくつかの態様においては、この方法は、所定の生物学的状態における転写因子と他の遺伝子との間の発現量の相関関係の欠如を確認することを含む。いくつかの態様においては、前記他の遺伝子は、所定の生物学的状態に関連することが知られている遺伝子であり、この方法は、新たな転写因子のバイオマーカを同定することを含む。いくつかの態様においては、この転写因子は、所定の生物学的状態に関連することが知られており、この方法は、他の遺伝子である新たなバイオマーカを同定することを含む。
本明細書で用いられる「生物学的状態」は、任意の表現型の状態、例えば、臨床的に意義のある表現型や他の重要な代謝に関する症状を意味することができる。生物学的状態としては、例えば、疾病の表現型、疾病状態または無病状態の素因;治療薬物反応またはかかる反応の素因、副作用(例えば薬物毒性)またはかかる副作用の素因、薬物耐性またはかかる薬物耐性の発現の素因などが挙げられる。いくつかの態様においては、前記薬物として坑腫瘍薬が挙げられる。
図1は、本願明細書において開示されるいくつかの態様におけるバイオマーカを同定するための全体的なプロセスを示す。ステップ101において、被検試料および対照試料を代表試料として一組採取する。対照試料は、ある特定の正常な生物学的状態に対応する試料である。例えば、対照試料は、ある特定の正常状態を示す個体から得ることができる。例えば、対照試料は、気管支癌またはCOPDのリスクが低い患者の正常な気管支上皮から得ることができる。反対に、被検試料は気管支癌またはCOPDのリスクが高い患者の正常な気管支上皮から得ることができるため、被検試料の生物学的状態は、低リスクの対照個体において認められる生物学的状態に一致しない。あるいは、被検試料は、薬物反応に相当する生物学的状態の癌組織から得ることができるが、薬物反応に相当しない生物学的状態の癌組織から得ることもできる。
いくつかの態様においては、複数の被検試料および対照試料を用いる。複数とは、例えば2以上を意味する。好ましくは、約10を超える被検試料および約10を超える対照試料を採取して用いる。好ましくは約20を超える被検試料および約20を超える対照試料を、好ましくは約50を超える被検試料および約50を超える対照試料を、好ましくは約100を超える被検試料および約100を超える対照試料を採取して用いる。
被検試料/対照試料としては、例えば、培養組織の採取物、上皮細胞の採取物、組織の採取物、生検採取、および1バイアルの体液を挙げることができる。組織としては、例えば、臓器、腫瘍、リンパ腺、動脈、細胞集合体および/または個別細胞を挙げることができる。体液としては、例えば、細胞懸濁液、細胞培養液または細胞培養上清だけでなく、唾液、涙液、粘液、リンパ液、喀痰、糞便、胸膜液、心膜液、肺吸引液、滲出液、腹水、血漿、血液、血清、白血球、脳脊髄液、滑液、羊水、乳、精液、尿などを挙げることができる。試料としては、例えば、各種の処理または調製ステップ後に得られた粗試料や被処理試料を挙げることができる。例えば、磁気細胞分離法などの各種細胞分離法は、血液などの体液内において対象となる被検試料の分離または濃縮に応用することができる。試料としてはまた、希釈血清あるいは他の錯体および/または高タンパク質混合物の希釈物などの希釈物を挙げることができる。本発明の好適な態様は、定量化可能な結果を得るために小さな出発材料を用いて行うことができる。
ステップ102においては、転写因子および他の少なくとも1つの遺伝子の発現量のアッセイを行う。この発現量の測定は、本技術分野で知られている技術を用いた多量の核酸転写物および/またはタンパク質翻訳産物の測定によって行うことができる。例えば、いくつかの態様において、発現量のアッセイは、多量のmRNA転写物のアッセイによって行う。好適な態様において、転写物量のアッセイは、米国特許第5,639,606号;5,643,765号;5,876,978号;米国特許出願番号第11/072,700号;および米国特許仮出願第60/646,157号に記載されている1つ以上の方法を用いて行う。
例えば、いくつかの態様においては、多量のmRNA転写物のアッセイは、競合鋳型と比較する転写因子に対応する核酸を測定すること;他の遺伝子に対応する核酸とその競合鋳型を同時測定すること;およびこの同時測定値から得られる値を比較する比較式を得ることを含む。この転写因子(または他の遺伝子)に対応する核酸は、mRNAから得られる転写因子(または他の遺伝子)またはcDNAのmRNA転写物を意味することができる。得られる前記比較式としては、転写因子、その競合鋳型、他の遺伝子およびその競合鋳型の値を比較するものが挙げられる。好適な態様においては、この転写因子および/または他の遺伝子の測定は、例えば米国特許出願番号第11/072,700号および11/103,397号に記載されているように、参照核酸を基準にして行う。
これは、競合鋳型を含む転写因子に対応する核酸を共増幅すること;競合鋳型を含む他の遺伝子に対応する核酸を共増幅すること;および共増幅物から得られる増幅物を比較する比較式を得ることを必要とする可能性がある。転写因子(または他の遺伝子)に対応する核酸は、転写因子(または他の遺伝子)のmRNA転写物またはそのmRNAから得られたcDNAを意味することができる。得られる前記比較式としては、転写因子、その競合鋳型、他の遺伝子およびその競合鋳型の増幅量を比較するものが挙げられる。好適な態様においては、転写因子および/または他の遺伝子の測定は、例えば米国特許出願番号第11/072,700号および11/103,397号に記載されたように、参照核酸を基準にして行う。あるいは、同時測定は、分枝鎖の増幅に用いられるような配列特異的プローブの結合によって、各核酸及び対応する内部標準から信号を増幅することを含む。
解析される他の核酸の内の少なくとも1つは、参照核酸の働きをする。本明細書で用いられる「参照核酸」は、解析される核酸だけでなく、増幅される核酸をも意味することができる。核酸は、参照核酸に「標準化」することができる。いくつかの態様において、参照核酸は、ローディングに対する対照、たとえば、反応にロードされるcDNAに対する対照の働きをする。例えば、いくつかの好適な態様においては、前記参照核酸には、所定の生体試料の中で、および/または一定の刺激に反応して変化する(または著しく変化する)とは考えられない核酸が含まれる。例えば、構成的に発現された遺伝子からのmRNAは、参照核酸を提供することができる。いくつかの態様において、既知あるいは潜在的なハウスキーピング遺伝子は前記参照核酸を提供することができるが、そのハウスキーピング遺伝子は、ヒト、マウスおよび/またはラットのグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDまたはGAPDH)、β−アクチン、28SRNA、18SRNA、および/または他のリボ核タンパク質遺伝子を含むが、これらに制限されない。また、遺伝子発現のノーザン分析の内部標準として使用されてきた他のハウスキーピング遺伝子を用いることもできる。例えば、Devereauxら、Nucleic Acids Res. 12:387 (1984);Barbuら、Nucleic Acids Res.17:7115(1989)を参照すること。いくつかの態様においては、参照核酸のための競合鋳型は、ハウスキーピング遺伝子のcDNAのいずれかの鎖と相似の配列を有する核酸を含んでよいが、上記したような識別可能な特徴を有する。
参照核酸を提供できる遺伝子は、それぞれ多くある。参照核酸は、アッセイ対象の組織および/または検査対象の生物学的状態によって選択することができる。例えば、β−アクチンは、種々の正常な気管支上皮細胞の試料においてはほとんど変化しないが(例えば、Crawford, E. L., Khuder, S. A., Durham, S. J.ら、(2000) Normal bronchial epithelial cell expression of glutathione transferase Pl, glutathione transferase M3, and glutathione peroxidase is low in subjects with bronchogenic carcinoma. Cancer Res. 60, 1609-1618)、リンパ球と比較した気管支上皮細胞など、種々の組織からの試料との比較においては約100倍以上変化する可能性がある。いくつかの態様においては、参照核酸は、全部またはほとんど全部または大部分の組織で発現する遺伝子;および/または、高い、実質的に高いまたは相対的に高い発現量の遺伝子に対応する。
いくつかの態様においては、競合鋳型は、標準化混合物において提供される。本明細書で用いられる「標準化混合物」は、多くの内部標準(例えば多くの競合鋳型)を含む混合物を意味することができる。なおいくつかの態様においては、一連の連続的に希釈された標準化混合物は、混合物内の被検試料のアッセイに用いる。「連続的に希釈された標準化混合物」は、標準化混合物の試薬の1種以上が連続的に希釈される2種以上の標準化混合物を意味することができる。いくつかの態様においては、標準化混合物の試薬の1種以上が、その標準化混合物の試薬の種々の1種以上を基準にして連続的に希釈される。例えば、一連の標準化混合物によって、他の遺伝子の競合鋳型を基準にして、転写因子のための競合鋳型を一連の既知の濃度で提供することができる。標準化混合物の調製および使用は、米国特許出願番号第11/072,700号および11/103,397号に記載されている。
また、多量のmRNA転写物をアッセイする他の方法も用いることができる。例えば、いくつかの態様において、リアルタイムRT−PCRおよび/またはハイブリダイゼーションアッセイを用いることができる。例えば、本技術分野で知られているように、関連の転写因子および他の遺伝子のための特定のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーション法で用いることができる。特定のRNA発現量を測定するためのあらゆるハイブリダイゼーション方式を用いることができるが、その方式は、ノーザンブロット法、スロットブロット法、ドットブロット法、並びにオリゴヌクレオチドアレイ、マイクロアレイおよび他の固相アプローチに対するハイブリダイゼーションを含むが、これらに制限されない。ハイブリダイゼーションの特異性は、ハイブリダイゼーション条件の厳密性の程度を変更することによって評価することができる。
いくつかの態様においては、発現量のアッセイは、多量のタンパク質のアッセイによって行うことができる。特定の翻訳産物(タンパク質)の発現量を評価するためには、そのタンパク質に特異的な抗体を簡単に用いることができる。また、特定のタンパク質発現量を測定するために本技術分野で知られているあらゆる方式を用いることができ、その方式は、サンドイッチアッセイ、ELISA、免疫沈降およびウエスタンブロットを含む。かかるアッセイには、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一鎖抗体および抗体フラグメントのいずれかを用いることができる。
さらにいくつかの態様においては、米国特許出願番号第11/103,397号で提供される方法を用いることができる。本特許出願においては、タンパク質のコピー数、タンパク質−DNAハイブリッドおよび/またはタンパク質−タンパク質ハイブリッドを測定するために用いることができる標準化されたイムノPCR法および組成物が記載される。簡潔に言えば、いくつかの態様においては、PCRのための鋳型として働く二本鎖DNA分子に次々に共有結合する、非常に特異的で、高い親和性のモノクローナル抗体と等モル量でハイブリッド形成する既知の分子数の抗原(例えば転写因子タンパク質)を含む内部標準を用いることができる。各同義遺伝子のための既知量の内部標準は、内部標準の標準化混合物(SMIS)に組み込むことができる。いくつかの態様におけるこのSMISは、PCRのシグナル増幅の力によって、1mgのロットで5〜10年間は世界中の要求を満足させることができる。
ステップ103においては、相関関係の有無が推定される。すなわち、この方法は、転写因子の発現量が対照および/または被検試料の他の遺伝子の発現量と相関しているのかどうかを推定することを含む。いくつかの態様において、転写因子の発現量は、野生型および変異型の両方の転写因子の転写物の総量を意味する。関心のある生物学的状態が疾病状態、例えば癌関連症状である場合、転写因子および他の遺伝子の発現量は、一般的に対照試料では相関関係があるが、被検試料においては相関関係がない。
当業者は、2つ以上の転写因子および/または他の遺伝子のアッセイが可能であることが分かっている。例えば、転写因子のバイオマーカを調べる際、生物学的状態と関連した1つ以上のさらなる遺伝子の発現量をアッセイすることができる。バイオマーカとして機能することができる他の遺伝子(推定調節遺伝子)を調べる際、生物学的状態と関連した1つ以上の転写因子の発現量をアッセイすることができる。
「相関している」は、正相関または負相関を意味することができるが、好ましくは正相関である。相関関係は、例えば実施例に記載した試験の内の1つを用いて統計学的有意性に基づくことができる。反対に、「相関していない」は、統計学的有意性が欠如していること、例えば転写因子の発現量と被検試料内の少なくとも1つの他の遺伝子の発現量の間に統計学的に有意な相関関係が欠如していることに基づくことができる。「相関していない」、「相関関係の欠如」および他の文法上のそのバリエーションは、対照試料と比較した被検試料において例えば相関性が低いまたは相対的に低いなど、2つの遺伝子の発現量の間の相関度がより低くなるまたは低下することを意味するものとする。相関関係の喪失を検出することによって、新たなバイオマーカを同定することができる。例えば、遺伝子がある生物学的状態と関連していることが知られている場合、被検試料内の前記遺伝子の発現量と所定の転写因子の発現量との間の相関関係の喪失によって、もう一方の生物学的状態のためのバイオマーカとしての転写因子を同定することができる。別の例として、転写因子が所定の生物学的状態と関連していることが知られている場合、被検試料内の前記転写因子の発現量と所定の遺伝子の発現量との間の相関関係の喪失によって、もう一方の生物学的状態のためのバイオマーカとしての遺伝子を同定することができる。
特定の理論または仮説に限定されることなく、疾病状態、例えば癌関連症状の相関関係の喪失は、転写因子によって遺伝子の機能調節が喪失したことを示唆している可能性がある。本明細書で用いられる「転写因子」または「TF」は、他の遺伝子または遺伝子産物の発現量に影響を与える可能性がある遺伝子または遺伝子産物を意味することができる。いくつかの態様においては、転写因子は、核酸結合タンパク質、例えば他の遺伝子の調節エレメントを結合することができるタンパク質である。転写因子の例としては、トランス作用因子、例えばシス調節エレメント(例えばエンハンサまたはTATAボックス)と結合し、それによって直接的または間接的に転写開始に影響を及ぼすタンパク質を挙げることができる。共通の転写因子としては、原核生物のシグマ因子だけでなく、RNAポリメラーゼがプロモーターを認識することを補助する真核生物のタンパク質が挙げられる。転写因子は遺伝子発現を活性化および/または抑制することができ、上向き調節または下向き調節を引き起こす。
一般的に、転写因子は、被検試料内ではなく、対照試料内の所定の遺伝子を調節する。かかる遺伝子は、「正常調節遺伝子」または「推定調節遺伝子」および文法的に類似のバリエーションで呼ぶことができ、「標的遺伝子」(TG)と呼ぶこともできる。調節は、種々の機械的な根拠により直接的または間接的であってもよい。下記の実施例において記載されるように、本発明の方法は、各種機械的根拠の探査を容易にするものである。
本発明の研究において用いるパラダイムによれば、a)正常な表現型は、1つ以上のTFによって一群の遺伝子の調節された転写を行うことで生じ、b)対応するリスク付与または疾病の表現型は、それらの同じ遺伝子の間で準最適相互作用によって生じ、及びc)各表現型は、発現量のアッセイによって定義可能および識別可能となる。従って、本願明細書において提供される方法および組成物は、a)正常な表現型と関連する1つ以上のTFによる一群の遺伝子の調節された転写、b)対応しているリスク付与または疾病の表現型の原因となるこの同じ遺伝子における準最適相互作用、およびc)発病またはリスクのある表現型から正常な表現型を識別する発現量プロファイルの使用を定量化することを含む。下記で示されるように、本発明で示されるデータは、BCのリスクに関連した遺伝子の同定におけるこのパラダイムの有用性を支持するものである。
気管支癌および他の癌関連症状のためのバイオマーカ
特定の一態様においては、気管支癌(BC)のための転写因子のバイオマーカを同定することができる。BCに関連する遺伝子としては、抗酸化(AO)遺伝子およびDNA修復(DNAR)遺伝子が挙げられる。かかる遺伝子は、BCの始原細胞や正常な気管支上皮細胞(NBEC)において発現し、タバコの煙の悪影響に予防的に作用すると考えられている(Willey JCら、American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 19, 16-24, 1998)。これらの遺伝子の機能の遺伝的個人間変動は、BCのリスクを決定する役割を果たすことが示されている(Spitz MR, Wei Q, Dong Q, Amos CI, Wu X, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 12, 689-98, 2003)。例えば、気管支癌患者(BCI)のNBECにおけるAO遺伝子の転写物の存在率は、非BCI(NBCI)よりも低い可能性があり、このことは、抗酸化保護に劣ることを基準にBCIが選択されることを示唆している(Crawford, E.L.ら、Cancer Research, 60, 1609-1618, 2000)。このCrawfordの研究においては、例えば、BCIではなくNBCIのAO遺伝子またはDNAR遺伝子のいくつかの対の間に転写物存在率に関する相関関係を示す傾向があった。その観察に含まれる遺伝子対は、GSTP1/GPX1、CAT/GPX3およびGPX3/SOD1であった。
特定の一態様においては、気管支癌(BC)のための転写因子のバイオマーカを同定することができる。BCに関連する遺伝子としては、抗酸化(AO)遺伝子およびDNA修復(DNAR)遺伝子が挙げられる。かかる遺伝子は、BCの始原細胞や正常な気管支上皮細胞(NBEC)において発現し、タバコの煙の悪影響に予防的に作用すると考えられている(Willey JCら、American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 19, 16-24, 1998)。これらの遺伝子の機能の遺伝的個人間変動は、BCのリスクを決定する役割を果たすことが示されている(Spitz MR, Wei Q, Dong Q, Amos CI, Wu X, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 12, 689-98, 2003)。例えば、気管支癌患者(BCI)のNBECにおけるAO遺伝子の転写物の存在率は、非BCI(NBCI)よりも低い可能性があり、このことは、抗酸化保護に劣ることを基準にBCIが選択されることを示唆している(Crawford, E.L.ら、Cancer Research, 60, 1609-1618, 2000)。このCrawfordの研究においては、例えば、BCIではなくNBCIのAO遺伝子またはDNAR遺伝子のいくつかの対の間に転写物存在率に関する相関関係を示す傾向があった。その観察に含まれる遺伝子対は、GSTP1/GPX1、CAT/GPX3およびGPX3/SOD1であった。
特定の仮説および/または理論に限定することなく、1つ以上のTFによるこのような重要なAO遺伝子およびDNAR遺伝子の調節は個人の間で変動する可能性があり、準最適調節を有する個体が喫煙者である場合、それらの個体をBCの発現に関して選択することができる。家族性パターンを示さない疾病のリスクの個人間の変動は、例えば、個体においては、細胞をDNA損傷から保護する際に冗長な機能をもつ一群の遺伝子の内の閾値数の遺伝子においてリスクを有する対立遺伝子がヘテロ接合またはホモ接合である必要があるという説明をすることができる。これによって、一部の喫煙者だけがBCや他の癌関連症状および/または肺関連症状を発現する理由を説明することができる。例えば、BCの遺伝的リスクは、NBECにおけるAO遺伝子およびDNAR遺伝子の協調的調節に反比例する可能性がある。
本明細書で用いられる「喫煙者」としては、例えばタバコおよび/または噛みタバコなどのタバコ製品などの、肺の症状に関連する1つ以上の製品を使用する、または使用してきた個体や、間接喫煙に曝露されるなどの、かかる製品に間接的に曝露される、または曝露されてきた個体が挙げられる。喫煙者としては、大量喫煙者、少量喫煙者またはその間の範囲の量の喫煙者が挙げられる。例えば、喫煙者としては、1本/日、5本/日、1箱/日またはそれ以上のタバコを吸う人が挙げられる。いくつかの態様においては、遺伝的に決定されるリスクの違いが最大になると考えられる個体を比較することができる。例えば、被検試料は、BCを発現する、比較的若い少量喫煙者または非喫煙者から得ることができるが、対照試料は、BCの発現がない、比較的年輩の大量喫煙者から得ることができる。他の因子としては、個体別の気管の解剖、タバコの種類、吸入方法、気管支上皮組織の線毛細胞および粘膜細胞の機能、および間欠的な慢性気管支炎増悪が挙げられる。同定されたバイオマーカは、BC、BCのリスク、BCの程度(例えば、転移性であるか、非転移性であるか)および/または予後(例えば、特定の化学療法に対する反応性の見込みおよび/または程度)を示唆することができる。
いくつかの態様において、例えば、本願明細書において提供される方法は、CEBPG転写因子の転写物の存在率が、NBCIのNBECの主要な抗酸化(AO)遺伝子またはDNA修復(DNAR)遺伝子と有意に(p<0.01)相関しており、BCIとは相関していないことを示している。さらに、いくつかの主要な遺伝子では、BCIのNBECにおける相関関係のほうが有意に低い。この方法の詳細については、下記の実施例で示す。簡潔にいえば、BC(例えば、GSTP1、GPX1、CAT、GPX3およびSOD1)と関連する遺伝子に共通するTF認識部位は、例えばコンピュータ上でのDNA配列分析などの配列分析によって同定することができる。かかる配列分析を、Genomatix Software GmbH、ミュンヘン、ドイツ(http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/)を用いて行うことによって(Quandt K, Frech K, Karas H, Wingender E, Werner T, NAR, 23, 4878-4884. 1995)、例えば、EV11、C/EBPファミリーメンバーおよびE2Fファミリーメンバーを含む11のTFの部位が得られる。
同定された11のTFの発現量のアッセイは、BC患者のNBEC被検試料、および健康な個体から得られるNBEC対照試料において行うことができる。例えば、標準化RT−PCR試薬は、Willey JCら、Methods in Molecular Biology(ed. Shimkets, R.A.)13-41(Humana Press, Inc., Totowa, N.J., 2004)で提供されるように、調製してTFや他の遺伝子用に選択的に最適化することができる。複数のNBEC試料の中で低いおよび/または変化しない発現量が認められるTFは、詳細解析から除外することができる。残ったTFについては、例えば、XRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1、GPX1、ERCC1、CAT、GSTZ1およびERCC2を含むAO遺伝子および/またはDNAR遺伝子の拡張群との相関関係を評価することができる。
下記の実施例で詳述されるように、XRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1およびGPX1の発現量は、BCIよりもNBCIのCEBPGの発現量と有意に、またはほとんど有意に相関している。また、E2F1の発現量とERCC5、GSTP1およびSOD1の発現量との間の相関関係の喪失も、NBCIよりもBCIにおいて認められる。
他のAO遺伝子および/またはDNAR遺伝子のアッセイを行なうこともできる。AO遺伝子の例としては、発癌物質による損傷を予防または低減することができる、これらのコード化酵素(例えば、グルタチオントランスフェラーゼ(GST、例えばGSTT1)やグルタチオンペルオキシダーゼ(GSHPx、例えばGSHPxA))が挙げられる。GSTのクラスとしてはいくつかあり、1つのミクロソームのクラス(mGST)および少なくとも5つの細胞基質のクラスがある:GSTA、GSTM(例えば、GSTM1、GSTM3)、GSTP(例えばGSTP1)、GSTTおよびGSTZ。例えば、Crawfordら、Cancer Res 60: 1609-1618 (2000); Hackettら、American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 29: 331-343 (2003);およびWilleyら、ILSI Press, Washington, D.C., U. Heinrich and U. Mohr (Eds), pp. 79-96 (2000)を参照すること。
DNAR遺伝子の例としては、特異的なヌクレオチド変化、塩基対形成の誤り、および二本鎖切断を認識および/または修復することができる、これらのコード化する酵素が挙げられる。哺乳動物細胞において同定され、突然変異に対する予防の役割を主に果たすDNAR経路としては:1)DNAミスマッチ修復(MMR)、2)ヌクレオチド除去修復(NER)、3)塩基除去修復(BER)、4)06−メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)による損傷の修復、5)相同組み換え(HR)、および6)非相同末端結合(NHEJ)が挙げられる。
特定の理論および/または仮説に限定することなく、少なくとも部分的にCEBPGによる準最適なAO遺伝子調節および/またはDNAR遺伝子調節を原因として、BCを発現する喫煙者が選択されていると考えられる。すなわち、NBCIにおいては、CEBPGによってNBECの主要なAO遺伝子および/またはDNAR遺伝子の転写を調節することが可能であり、BCを発現している喫煙者においては、リスクの増大を引き起こすのに十分な数のAO遺伝子および/またはDNAR遺伝子にとって、CEBPG調節は準最適となりうる。例えば、BCIの相関関係の損失の解釈としては、NBCIにおける相関関係をもたらす1つ以上のTFの機能が変化することが挙げられる。好適な態様においては、本願明細書において提供される方法は、肺癌のリスクに関する理解を向上させ、リスクが最も高い肺癌の早期のスクリーニングおよび化学的予防を可能にする。
当業者は、本願明細書で提供される方法が他の癌関連症状のためのバイオマーカの同定に適用可能であることが分かっている。他の癌関連症状の例としては、乳癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝癌、肺癌、脳悪性腫瘍、喉頭、胆嚢、膵臓、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頸部、大腸、胃、気管支、および腎臓の癌、基底細胞癌、潰瘍型および乳頭型の扁平上皮癌、転移性皮膚癌、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、胆石、島細胞腺腫、原発脳腫瘍、急性および慢性リンパ腫瘍および顆粒白血球腫瘍(acute and chronic lymphocytic and granulocytic tumors)、有毛細胞腫瘍(hairy-cell tumor)、腺腫瘍、過形成、髄様癌、褐色細胞腫、粘膜下神経腫、腸神経節細胞腫、過形成性角膜神経腫瘍、マルファン症候群様体質腫瘍、ウィルムの腫瘍、精上皮腫、卵巣腫瘍、平滑筋母腫瘍、子宮頸部異形成及び上皮内癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポシ肉腫、骨原性肉腫及び他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎臓細胞腫瘍、真性多血症、腺癌、多形性グリア芽細胞腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、類表皮癌ならびに他の癌腫および肉腫が挙げられるが、これに限定されるものではない。
いくつかの態様において、被検試料および対照試料は、種々のステージの癌から得ることができる。種々のステージの癌の細胞の例としては、所定の患者から、疾病経過を通して様々な時期の非癌細胞、非転移性癌細胞、転移性細胞を挙げられる。様々な種類の癌の細胞を用いることが可能であり、癌の例としては、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、内分泌癌、消化器癌、婦人科癌、頭頚部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、転移、骨髄腫、腫瘍性組織、小児癌、陰茎癌、前立腺癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌および尿路癌が挙げられる。好適な態様においては、所定の種類の癌、例えば特定の患者に最も有効な化学療法薬を予測するバイオマーカを開発することができる。
いくつかの態様において、BCのためのバイオマーカを同定する方法は、他の癌関連症状のためのバイオマーカの同定に適用することができる。例えば、これらの他の癌関連症状の内の1つと関連する遺伝子に共通のTF認識部位は、配列分析によって同定することができる。癌関連症状と関連する遺伝子の例としては、抗酸化(AO)異物代謝酵素遺伝子(XME)およびDNA修復(DNAR)遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。XME遺伝子の例としては、タバコの煙に存在する発癌物質および/または前発癌物質を代謝するヒトのNBECに発現するものが挙げられ、例えば、タバコの煙の中の多環式芳香族炭化水素という前発癌物質を代謝するシトクロムp450(CYP)1A1、1B1および2B6、多環式芳香族炭化水素を代謝するエポキシド加水分解酵素、NAPDH酸化還元酵素およびフェノールスルホトランスフェラーゼ;およびニトロソアミンなどのニトロソ化合物を代謝するCYP2A6/7およびCYP2E1が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、Willeyら、Am J Respir Cell MoI Biol 17(1): 114-124 (1997);およびWilleyら、Am J. Respir Cell MoI Biol 14(3): 262-271 (1996)を参照すること。
同定されたTFの発現量のアッセイは、癌関連症状患者の被検試料および健康な個体または種々のステージの癌から得られる対照試料において行うことができる。好適な態様において、標準化RT−PCR試薬は、例えばWilley JCら、Methods in Molecular Biology (ed. Shimkets, R.A.) 13-41 (Humana Press, Inc., Totowa, NJ., 2004)において提供されるように、調製してTFや他の遺伝子用に選択的に最適化することができる。複数の対照試料の中で低いおよび/または変化しない発現量が認められるTFは、詳細解析から除外することができる。残ったTFについては、癌関連症状と関連することが知られている遺伝子の拡張群との相関関係を評価することができる。さらなる詳細については、下記の実施例で示される。
慢性閉塞性肺疾患および他の肺関連症状のためのバイオマーカ
別の具体的な一態様においては、COPDのための転写因子バイオマーカを同定することができる。COPDの例としては、肺気腫(不均一性の肺気腫および同質性の肺気腫を含む)、喘息、気管支拡張症および慢性気管支炎が挙げられる。COPDに関連した遺伝子としては、AO遺伝子およびDNAR遺伝子も挙げられる。特定の仮説および/または理論に限定することなく、1つ以上のTFによる重要なAO遺伝子およびDNAR遺伝子の調節は個人間で変動する可能性があり、準最適調節を有する個体が喫煙者である場合、それらの個体をCOPDの発現に関して選択することができる。同定されたバイオマーカは、COPD、COPDのリスク、COPDの程度(例えば、転移性であるか、非転移性であるか)および/または予後(例えば、特定の化学療法に対する反応性の見込みおよび/または程度)を示唆することができる。
別の具体的な一態様においては、COPDのための転写因子バイオマーカを同定することができる。COPDの例としては、肺気腫(不均一性の肺気腫および同質性の肺気腫を含む)、喘息、気管支拡張症および慢性気管支炎が挙げられる。COPDに関連した遺伝子としては、AO遺伝子およびDNAR遺伝子も挙げられる。特定の仮説および/または理論に限定することなく、1つ以上のTFによる重要なAO遺伝子およびDNAR遺伝子の調節は個人間で変動する可能性があり、準最適調節を有する個体が喫煙者である場合、それらの個体をCOPDの発現に関して選択することができる。同定されたバイオマーカは、COPD、COPDのリスク、COPDの程度(例えば、転移性であるか、非転移性であるか)および/または予後(例えば、特定の化学療法に対する反応性の見込みおよび/または程度)を示唆することができる。
いくつかの態様において、例えば、本願明細書において提供される方法は、CEBPG転写因子の転写物の存在率が、健康な個体から得られる対照試料の主要な抗酸化(AO)遺伝子またはDNA修復(DNAR)遺伝子と有意に(p<0.01)相関しており、COPD患者から得られる被検試料とは相関していないことを示している。特定の仮説および/または理論に限定することなく、転写因子CEBPGによるAO遺伝子および/またはDNAR遺伝子の準最適調節に基づいて、COPDを発現する喫煙者を選択することができる。
いくつかの態様において、COPD(例えば、GSTP1、GPX1、CAT、GPX3およびSOD1)と関連する遺伝子に共通するTF認識部位は、例えば、Genomatix Software GmbH、ミュンヘン、ドイツ(http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/)を用いて、配列分析によって同定することができる(Quandt K, Frech K, Karas H, Wingender EおよびWerner T, NAR, 23, 4878-4884. 1995)。同定されたTFの発現量のアッセイは、COPD患者のNBEC被検試料、および健康な個体から得られるNBEC対照試料において行うことができる。例えば、標準化RT−PCR試薬は、Willey JCら、Methods in Molecular Biology(ed. Shimkets, R.A.)13-41(Humana Press, Inc., Totowa, N.J., 2004)で提供されているように、TFや他の遺伝子用に調製して選択的に最適化することができる。複数の対照試料の中で低いおよび/または変化しない発現量が認められるTFは、詳細解析から除外することができる。残ったTFについては、例えば、XRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1またはGPX1を含むAO遺伝子および/またはDNAR遺伝子の拡張群との相関関係を評価することができる。同様の結果は、転写因子E2F1について得ることができる。
当業者は、本願明細書において提供される方法が他の肺関連症状のためのバイオマーカの同定に適用可能であることが分かっている。肺関連症状の例としては、サルコイドーシス、肺線維症、気胸、瘻孔、気管支胸膜瘻、嚢胞性線維症、炎症状態および/または他の呼吸障害が挙げられる。また、肺関連症状の例としては、外傷性事象が原因の肺の損傷、感染性因子(例えば、細菌、ウィルス、真菌、ツベルクリンおよび/またはウィルス性因子)、毒素(例えば、化学療法剤、環境汚染物、排蒸気および/または殺虫剤)への曝露、および/または遺伝因子(例えば、肺の弾性組織および/または結合組織分解、および/または弾性組織および/または結合組織の合成障害、および/または弾性組織および/または結合組織の修復障害を伴うα−1抗トリプシン欠乏症および他のタイプの遺伝性障害)が挙げられる。
例えば、これらの他の肺関連症状の内の1つと関連する遺伝子に共通のTF認識部位は、配列分析によって同定することができる。同定されたTFの発現量のアッセイは、肺関連症状の患者からの被検試料、および健康な個体から得られる対照試料、または種々のステージの肺関連症状から得られる対照試料において行うことができる。好適な態様において、標準化RT−PCR試薬は、例えばWilley JCら、Methods in Molecular Biology (ed. Shimkets, R.A.) 13-41 (Humana Press, Inc., Totowa, NJ., 2004)において提供されているように、TFや他の遺伝子用に調製して選択的に最適化することができる。複数の対照試料の中で低いおよび/または変化しない発現量が認められるTFは、詳細解析から除外することができる。残ったTFについては、肺関連症状と関連することが知られている遺伝子の拡張群との相関関係を評価することができる。
B 多型の同定
別の態様においては、本発明は、生物学的状態を示す多型を同定する方法に関する。いくつかの態様においては、前記方法は、転写因子または他の遺伝子において被検試料と対照試料の間にヌクレオチド変化を同定すること含む。ここで、転写因子および/または他の遺伝子は、本願明細書において提供される方法を用いて同定される。いくつかの態様は、例えば、転写因子の発現量が他の遺伝子の発現量と相関している複数の対照試料を得ること;転写因子の発現量が遺伝子の発現量と相関していない複数の被検試料を得ること;および前記1つ以上の対照試料と比較して前記1つ以上の被検試料における転写因子および/または遺伝子のヌクレオチド変化を同定することを含むことができる。
別の態様においては、本発明は、生物学的状態を示す多型を同定する方法に関する。いくつかの態様においては、前記方法は、転写因子または他の遺伝子において被検試料と対照試料の間にヌクレオチド変化を同定すること含む。ここで、転写因子および/または他の遺伝子は、本願明細書において提供される方法を用いて同定される。いくつかの態様は、例えば、転写因子の発現量が他の遺伝子の発現量と相関している複数の対照試料を得ること;転写因子の発現量が遺伝子の発現量と相関していない複数の被検試料を得ること;および前記1つ以上の対照試料と比較して前記1つ以上の被検試料における転写因子および/または遺伝子のヌクレオチド変化を同定することを含むことができる。
例えばいくつかの態様においては、a)i)表現型を与えること、またはii)表現型を与えることに関与する遺伝子の転写を調節することに関与する遺伝子の発現量を測定すること、b)発現量が、低リスクおよび/または無病の個体/組織における調節遺伝子の発現量と相関し、リスクのある個体および/または疾病状態の個人/組織における正常調節遺伝子の発現量と相関していない、関連遺伝子の調節をもたらす転写因子を同定すること、およびc)関与遺伝子調節の決定の要因となる1つ以上のDNA塩基配列変化を同定することを含む、疾病および/または疾病のリスクと関連するDNA塩基配列変化を同定する方法が提供される。
本明細書で用いられる「多型」または「DNA塩基配列変化」は、染色体上の所定の座(位置)の多くの可能な形態の内のいずれか1つを意味することができる。その可能な形態は、一塩基多型(SNP)などの単一の塩基対の相違を含むことができる。いくつかの態様において、前記多型は、2つ以上の塩基対の変化を含むことができ、例えば、少なくとも約2つ、少なくとも約3つ、または少なくとも約10のヌクレオチドの相違を含むことができる。いくつかの態様において、前記多型は、約50未満、約100未満、約200未満または約500未満のヌクレオチドの相違を含むことができる。また、前記多型という用語は、所定の遺伝子または染色体部分における、例えば2つ以上のSNPなどの対立遺伝子の特定の組み合わせを示唆するために用いることもできる。いくつかの態様において、例えば、2つ以上のヌクレオチドの変化の同定は生物学的状態の同定を意味し、例えば、特定の遺伝子の対立遺伝子の特異的な組み合わせは、疾病症状のリスクを示すことができる。
ヌクレオチド変化の同定は、本技術分野で知られているいかなる方法、例えば核酸の配列情報を測定する各種方法を用いて達成することができる。例えば、ジデオキシ法(サンガー法)(例えばSangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 563-5467 (1977)参照);マクサム−ギルバート法(化学分解法)(例えばMaxamおよびGilbert、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 560-564 (1977)参照);末端ヌクレオチド、ゲル電気泳動および自動蛍光検出に関連する染料を用いるサンガー・伸長法;電気泳動法の代わりに質量分析法を用いる方法;ピロリン酸放出法(例えばRonaghiら、"A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate," Science 281: 363-365 (1998)およびHyman、"A New Method of Sequencing DNA," Anal. Biochem. 174: 423-436 (1988));蛍光標識した個別の塩基を順に放出するエキソヌクレアーゼを利用する単一分子塩基配列決定法(例えばGoodwinら、"Application of Single Molecule Detection to DNA Sequencing," Nucleos. Nucleot. 16: 543-550 (1997));切断されたヌクレオチドを空間的に切り離すために蒸解したままの液体薄膜を通してDNAを切り離す方法(例えばDapprichら、"DNA Attachment to Optically Trapped Beads in Microstructures Monitored by Bead Displacement," Bioimaging 6: 25-32 (1998));伸張固定されたDNA分子の空間配列を、走査型原子プローブ顕微鏡によって測定する方法(例えば、Hansmaら、"Reproducible Imaging and Dissection of Plasmid DNA Under Liquid with the Atomic Force Microscope," Science 256: 1180-1184 (1992));米国特許第5,302,509号(Cheeseman)および米国特許公開2003/0044781号(Korlach)に記載された方法;および、例えば米国特許公開2005/0142577号および2005/0042654号(アフィメトリクス)に記載されているような(実質的)相補型プローブのハイブリダイゼーションを用いる方法がある。同定された多型は、例えば後で詳しく述べるように、ある疾病症状において、より高いまたは有意により高い割合で発現する特定の対立遺伝子を含むことができる。
いくつかの態様において、転写因子およびその正常調節遺伝子の発現量のパターンは、生物学的状態を表す多型を同定するために、転写因子および/または遺伝子の特定の領域絞り込みを可能にする。例えば、いくつかの態様においては、方法は、対照試料の転写因子の発現量と遺伝子の発現量を比較する第1の比較式を得ること;被検試料の内の1つにおける転写因子の発現量と遺伝子の発現量を比較する第2の比較式を得ること;第1および第2の比較式を比較すること;および前記ヌクレオチド変化を同定するために前記比較に基づいて前記転写因子および/または前記遺伝子の領域を解析することをさらに含む。
本明細書で用いられる「領域」は、好ましくは全ての遺伝子より少ない塩基対を含む核酸配列を意味することができる。領域としては、コードおよび非コード領域、転写および非転写領域、および/または翻訳および非翻訳領域が挙げられる。遺伝子の領域の例としては、例えばTFのための認識部位などのコード領域の5’調節エレメントが挙げられる。TFの領域としては、そのTFの5’調節領域、3’UTRおよび/またはコード領域が挙げられる。本願明細書において提供される方法は、生物学的状態を表す多型の同定において集中すべき特異的領域を教示する。いくつかの態様において、前記領域は、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約50、少なくとも約80、または少なくとも約100の塩基にわたる。いくつかの態様において、前記領域は、約150未満、約200未満、約250未満、約300未満、または約500未満の塩基にわたる。
第1および第2の比較式は、値の間にみられるすべての数学的関係、グラフによる関係、および統計的関係を意味することができる。いくつかの態様において、例えば転写因子の発現量は、他の遺伝子の発現量に対してプロットすることができる。ここで、発現量は対照試料においてアッセイすることができる。第1の比較式としての回帰直線は、対照試料値を用いて得ることができる。第2の比較式は、他の遺伝子の発現量に対する転写因子の発現量の、例えば回帰直線をプロットした座標点を含むことができる。ここで、その発現量は所定の被検試料においてアッセイすることができる。かかる態様においては、第1および第2の比較式は、前記回帰直線の上側または下側のどちらに被検試料の座標点があるのかという観点から比較することができる。
いくつかの態様においては、座標点が回帰直線の上側にある場合、転写因子の5’調節領域および/または3’UTRに関心が向けられる。いくつかの態様においては、座標点が回帰直線の下側にある場合、転写因子のコード領域および/または他の遺伝子の転写因子のための認識部位に関心が向けられる。座標点は、種々の個体の直線の上側、直線上または直線の下側にあってよく、ここで座標は、その個体の核酸を解析するときに集中すべき領域を示す。被検試料の多型の発現頻度は、測定可能であり、対照試料の発現頻度と比較することができる。さらなる説明、考察および詳細、特にNBCIおよびBCIに関するものは、下記の実施例において示される。
気管支癌および他の癌関連症状の多型
いくつかの態様において、BCを示す多型は、本願明細書において提供される方法を用いて同定することができる。例えば被検試料と対照試料の間の変化を測定するためには、CEBPGおよびE2F1転写因子のヌクレオチド配列を解析することができる。例えば、TFの5’調節領域、3’UTRおよび/またはコード領域の解析が可能である。いくつかの態様において、被検試料と対照試料の間の変化を測定するためには、XRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1またはGPX1のヌクレオチド配列を解析することができる。好ましくは、かかる遺伝子に共通するTF認識部位の解析は、例えばXRCC1の1100塩基対(XRCC1遺伝子転写開始点の上流1000塩基対および下流100塩基対)を含む調節領域において行う。NCBIの各SNPにおける各対立遺伝子の発現頻度は、測定可能であり、BCIの各SNPにおける各対立遺伝子の発現頻度と比較することができる。当業者は、本願明細書において提供される方法が他の癌関連症状の多型の同定に適用可能であることが分かっている。
いくつかの態様において、BCを示す多型は、本願明細書において提供される方法を用いて同定することができる。例えば被検試料と対照試料の間の変化を測定するためには、CEBPGおよびE2F1転写因子のヌクレオチド配列を解析することができる。例えば、TFの5’調節領域、3’UTRおよび/またはコード領域の解析が可能である。いくつかの態様において、被検試料と対照試料の間の変化を測定するためには、XRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1またはGPX1のヌクレオチド配列を解析することができる。好ましくは、かかる遺伝子に共通するTF認識部位の解析は、例えばXRCC1の1100塩基対(XRCC1遺伝子転写開始点の上流1000塩基対および下流100塩基対)を含む調節領域において行う。NCBIの各SNPにおける各対立遺伝子の発現頻度は、測定可能であり、BCIの各SNPにおける各対立遺伝子の発現頻度と比較することができる。当業者は、本願明細書において提供される方法が他の癌関連症状の多型の同定に適用可能であることが分かっている。
転写因子のバイオマーカの構造的な知見は、バイオマーカの多型の同定の助けになる。例えば、CEBPGとはCEBPを切断したTFであることが知られている(Johnson PF, Williams SC, Liver Gene Expression (eds Yaniv M and Tranche F) 231-258 (R. G. Landes Company, 1994))。CEBPGは、DNA結合およびヘテロ二量体形成に必要な配列を有するが、トランス活性化に必要な配列を欠いている(Cooper C, Henderson A, Artandi S, Avitahl N, Calame K, NAR, 23, 4371-4377, 1995)。CEBPGは、例えば調節遺伝子の転写を増加(Hongwei G, Parkin S, Johnson PFおよびSchwartz RC, JBC, 277, 38827-38837, 2002)または減少(Cooper C, Henderson A, Artandi S, Avitahl N, Calame K, NAR, 23, 4371-4377, 1995)させる他のCEBPのファミリーメンバーによりヘテロ二量体を形成することができる。
好適な態様において、多型を示すために解析されるDNA領域としては、転写調節、タンパク質機能、転写後プロセシングおよび/またはタンパク質−タンパク質結合に影響を与える領域が挙げられ、それは5’調節領域内の領域ならびにコード領域の3'UTR内、翻訳領域内および5'UTR内の領域を含む。例えばDNA結合およびヘテロ二量体形成のための配列は、BCを示す多型のために解析することができる。具体的には、CEBPGのbZip領域の50塩基対の同一の連なりは、BCを示す多型のために解析することもできる。さらに、リスクと関連していることが知られている領域は、多型のために評価することができる。例えば、Ratnasingheら、Anticancer Res. 23: 627-32 (2003); Wang, DNA Repair (Amst), 2(8): 901-8 (2003);およびMisraら、Cancer Lett. 191: 171-8 (2003)に記載されている領域を参照すること。さらなる詳細については、下記の実施例において示される。
また、CEBPGによってXRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1およびGPX1の調節に影響する多型を同定することで、バイオマーカの産生が可能となる。いくつかの実施例において、AO遺伝子およびDNAR遺伝子の機能に影響する多型を伴う調節に影響を与える多型を結合するバイオマーカは、BCのリスクがある個体の同定に好適である。例えば、DNA塩基配列の1つ以上の変化に対し二次的なリスクの調節における機能的変化と関連するバイオマーカによって、リスクに寄与する遺伝子への絞り込みが可能となる。このことは、疫学研究において必要と考えられる個体数をかなり減らすことができる。
上記のように、特定のBCIからのTGおよびTFの発現量の比較式は、特定のBCIにおける多型のために解析するべき領域を示すことができる。下記の実施例において詳述されるように、XRCC1、ERCC5、SOD1、GSTP1および/またはGPX1などの標的遺伝子のためのCEBPG認識部位だけでなく、CEBPGの5’調節領域、コード領域および/または3’UTRの解析が特に行われる。
COPDおよび他の肺関連症状のための多型
いくつかの態様において、COPDを示す多型は、本願明細書において提供される方法を用いて同定することができる。例えば、BCについて述べたように、TF、AOおよび/またはDNAR遺伝子の類似の領域を解析することができる。所定の理論および/または仮説に限定されることなく、肺気腫のリスクとBCのリスクの間に強い相関関係があり、また、肺気腫のリスクは、ヒトの抗酸化能力とも関連している(Repine JE, Bast AおよびLankhorst, I, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 156, 341-357, 1997)。また、CEBPG−/−ノックアウトマウスは、生後24時間以内から死亡が確認され、組織学的検査で気腫性の肺が認められた(Kaisho Tら、J. Exp. Med., 190, 1573-1581, 1999)。
いくつかの態様において、COPDを示す多型は、本願明細書において提供される方法を用いて同定することができる。例えば、BCについて述べたように、TF、AOおよび/またはDNAR遺伝子の類似の領域を解析することができる。所定の理論および/または仮説に限定されることなく、肺気腫のリスクとBCのリスクの間に強い相関関係があり、また、肺気腫のリスクは、ヒトの抗酸化能力とも関連している(Repine JE, Bast AおよびLankhorst, I, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 156, 341-357, 1997)。また、CEBPG−/−ノックアウトマウスは、生後24時間以内から死亡が確認され、組織学的検査で気腫性の肺が認められた(Kaisho Tら、J. Exp. Med., 190, 1573-1581, 1999)。
例えば、いくつかの態様においては、対照試料とCOPD患者からの被検試料の間の変化を測定するために、CEBPGおよびE2F1転写因子のヌクレオチド配列を解析することができる。好ましくは、TFの5’調節領域、コード領域および3’非翻訳領域を解析する。いくつかの態様においては、対照試料とCOPD患者からの被検試料の間の変化を測定するために、XRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1またはGPX1のヌクレオチド配列を解析することができる。好ましくは、かかる遺伝子に共通するTF認識部位を解析し、より好ましくは、XRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1および/またはGPX1のCEBPG認識部位を解析する。上記のように、好適な態様においては、多型を示すために解析されるDNA領域としては、転写調節、タンパク質機能、転写後プロセシングおよび/またはタンパク質−タンパク質結合に影響を与える領域が挙げられ、それは上流の調節領域内の領域ならびにコード領域の3’UTR内、翻訳領域内および5’UTR内の領域を含む。当業者はまた、本願明細書において提供される方法が、他の肺関連症状のためのバイオマーカの同定に適用可能であることが分かっている。
また、いくつかの態様においては、COPDを示す多型を同定するための関連核酸配列からなるプローブが提供される。かかる4つのプローブの例としては、(i)CEBPGの5’調節領域±約100塩基からなる核酸配列を含むプローブ、(ii)CEBPGの3’非翻訳領域±約100塩基からなる核酸配列を含むプローブ、(iii)CEBPGのbZip領域±約100塩基からなる核酸配列を含むプローブ;および(iv)CEBPG認識部位±約100塩基からなる核酸配列を含むプローブが挙げられる。かかるプローブについては、例えばアレイなどの支持体への固定、および/またはCOPDまたはそのリスク、並びにいくつかの態様においては他の肺関連症状の同定に用いるためのキットにおける提供が可能である。
II 診断のための方法および組成物
A 相関関係の欠如に基づくアプローチ
別の態様において、本発明は、対照と比較して2つ以上のバイオマーカの間の相関関係の欠如を確認することによって生物学的状態を診断する方法および組成物に関する。いくつかの態様において、前記方法は、転写因子および他の遺伝子の間の発現量に関する相関関係の欠如を確認することを含む。一般的に、前記他の遺伝子は、生物学的状態と関連した遺伝子および/または対照における転写因子によって調節される遺伝子である。
A 相関関係の欠如に基づくアプローチ
別の態様において、本発明は、対照と比較して2つ以上のバイオマーカの間の相関関係の欠如を確認することによって生物学的状態を診断する方法および組成物に関する。いくつかの態様において、前記方法は、転写因子および他の遺伝子の間の発現量に関する相関関係の欠如を確認することを含む。一般的に、前記他の遺伝子は、生物学的状態と関連した遺伝子および/または対照における転写因子によって調節される遺伝子である。
図2は、本願明細書において開示されるいくつかの態様における生物学的状態を診断するための全体的なプロセスを示す。ステップ201で、試料は、例えば患者などの被験者から採取される。前記試料としては、例えば上記で詳細に示されたすべての組織または体液を挙げることができる。採取する試料の種類は、例えば同定すべき生物学的状態によって決めることができる。例えば、NBEC試料は、下記でさらに詳細に記載されるBCおよび/またはCOPDの検査のために得ることができる。好適な態様においては、前記試料は、容易に採取できる試料、例えば非侵襲的または軽度に侵襲的な方法によって得ることができるものである。かかる試料の例としては、尿試料、血液試料、精液試料、またはより好ましくは、唾液試料、頬側上皮細胞試料および/または鼻腔上皮細胞試料が挙げられる。
ステップ202では、被験者から得られる試料を用いて(i)転写因子および(ii)少なくとも1つの他の遺伝子の発現量のアッセイを行う。例えば上に記載されたように、発現量をアッセイするすべての方法を用いることができる。好適な態様において、前記発現量は、例えば米国特許出願番号第11/072,700号および11/103,397号に記載されているような既知量の内部標準を含む試薬の標準化混合物を用いて測定される。
ステップ203では、発現量の値をデータベースに入れる。いくつかの態様において、そのデータベースには、インターネットを通じてアクセスすることができる。いくつかの態様において、被験者に関する人口統計学的情報は、採取した試料の遺伝子発現測定値の結果とともに記録することができる。好ましくは、かかるデータは、同定情報から切り離されたデータベースに格納される。例えば、同定情報は、試料が研究機関に持ち込まれるとすぐに、試料および人口統計学的情報から切り離すことができる。好適な態様において、前記データベースは、例えば種々の患者、すなわち同じまたは異なる患者から時間をかけて(例えば疾病経過および/または治療経過を通して)得られる測定値など、各種発現測定値のための値の収集を可能にする。好適な態様においては、例えば米国特許仮出願第60/646,157号で教示されているように、これらのデータは一定のCV限界内で直接の比較が可能である。いくつかの態様において、例えば後述するように、かかるデータベースは、臨床診断検査の遺伝子発現データとともに用いることができる。
ステップ204で、発現量は、その発現量が互いに相関しているか否かを識別するモデルを用いて数学的に計算される。図2で示すように、いくつかの態様においては、(i)転写因子および(ii)他の遺伝子のアッセイされた発現量をデータベース203に入れ、そのデータベースからのデータをモデルにおいて用いる。いくつかの態様においては、(i)転写因子および(ii)他の遺伝子のアッセイされた発現量をモデルの中で直接用いる。このモデルは、(i)が(ii)と相関しているか否かについての識別を可能にする。被験者から得られた試料の相関関係の欠如は、生物学的状態を示すことができる。さらにいくつかの態様において、新しく同定されたバイオマーカ自体は、例えば以下に詳述するように、生物学的状態を同定するために用いることができる。
発現量が互いに相関しているか否かを識別するモデルは、例えば生物統計学および/またはバイオインフォーマティックスの方法を用いるなど、あらゆる手段によって得ることができる。例えば、いくつかの形態においては、前記モデルは、転写因子および他の遺伝子の複数の被検試料の発現量に関するアッセイ;転写因子および他の遺伝子の複数の対照試料の発現量に関するアッセイ;およびそのモデルを計算するための前記発現量の使用によって得られた。
いくつかの態様において、前記モデルは、二変量解析、多変量解析、遺伝的プログラミングソフトウェア解析(genetic programming software analysis)、対数変換、ピアソンの相関関係、ボンフェローニの調整、フィッシャーのZ変換、t検定、両側検定、ANOVAおよびDuncanの検定から選択される少なくとも1つの方法を用いて計算される。モデルは、被験者の訓練例を用いて導き出すことができ、被験者の追加セットから得られる発現量を用いて評価され、適切なモデルは訓練例のさらなる遺伝子の解析および追加セットのバリデーションによって改良することができる。さらに詳細については、下記の実施例において示される。
いくつかの態様において、前記モデルは、例えばBCの診断において後述するように、転写因子および他の遺伝子の発現量の間の比較式を含む。いくつかの態様において、比較式は、例えばTF/TGまたはTG/TFなどの対照用標的遺伝子の発現量に対する転写因子の発現量をプロットする回帰直線の勾配などの比率である。いくつかの態様において、試料から得られる発現量が前記比率と一致する(例えば回帰直線に沿って減少する)場合、相関関係が示され;試料から得られる発現量が前記比率と一致しない(例えば回帰直線よりも有意に上または下にある)場合、相関関係の欠如が示される。好適な態様において、各々の複数のTGにおける前記TG/TF比率は、回帰直線の比率と一致しない。例えば、前記TG/TF比率は、少なくとも約2つ、少なくとも約3つ、少なくとも約5つ、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約50、少なくとも約80、または少なくとも約100のTGにおいて一致しない。いくつかの態様において、前記TG/TF比率は、約150未満、約200未満、約300未満または約500未満のTGにおいて回帰直線の比率と一致しない。さらなる詳細については、下記の実施例で示す。
好適な態様において、高速コンピュータプログラムを用いて、例えば多数の線形および非線形関数など、無作為抽出法における複数の発現量の値を相互に関係させることができる。これにより、(a)データに最も適合する数学的法則の高速定量;および(b)各種遺伝子において実験的に観察された機能に対する発現量についての可能なスケーリングに関する情報の提供(すなわち、他の遺伝子の発現量に対する特定の遺伝子の発現量の関係を示すのは、数学的な線形関数と非線形関数の内の主にどちらなのかに基づいて)が可能になる。この目的に使用可能なソフトウェアの例としては、Genetics2、Ann ArborおよびMIが挙げられる。
ステップ205で、診断確定は、例えば(i)と(ii)の間の相互関係の有無および/または同定すべきバイオマーカの量に基づいて行うことができる。前記診断確定は、病気の症状、その症状の進行のステージまたは程度、および/または各種治療に対する反応の可能性を同定することを含む。図2で示されるように、診断に関する情報は、被験者、例えば臨床的環境における患者に伝えることができる。
癌関連症状および/または肺関連症状の診断
いくつかの態様において、本発明は、例えばBCなどの癌関連症状および/または例えばCOPDなどの肺関連症状を診断するための方法および組成物を提供する。例えば、BCの診断は、BCと関連した遺伝子および転写因子の間の相関関係(対照との比較)の欠如を確認することによって行うことができる。例えば、いくつかの態様は、被験者から得られた試料内のCEBPGおよび/またはE2F1の発現量をアッセイすること;他の遺伝子がBCと関連している場合における試料内の少なくとも一つの前記他の遺伝子の発現量をアッセイすること;および、発現量が互いに相関しているのか否かを識別するモデルを用いて発現量を数学的に算出することを含む。被験者から得られた試料に相関関係の欠如は、BC、BCのリスク、BCの程度(例えば、転移性であるか、非転移性であるか)および/または予後(例えば、特定の化学療法に対する反応性および/または程度)を示唆することができる。いくつかの態様においては、例えば個別の腫瘍における試料の採取によって化学療法剤に対する個別の腫瘍の薬物耐性を予測する方法が提供される。
いくつかの態様において、本発明は、例えばBCなどの癌関連症状および/または例えばCOPDなどの肺関連症状を診断するための方法および組成物を提供する。例えば、BCの診断は、BCと関連した遺伝子および転写因子の間の相関関係(対照との比較)の欠如を確認することによって行うことができる。例えば、いくつかの態様は、被験者から得られた試料内のCEBPGおよび/またはE2F1の発現量をアッセイすること;他の遺伝子がBCと関連している場合における試料内の少なくとも一つの前記他の遺伝子の発現量をアッセイすること;および、発現量が互いに相関しているのか否かを識別するモデルを用いて発現量を数学的に算出することを含む。被験者から得られた試料に相関関係の欠如は、BC、BCのリスク、BCの程度(例えば、転移性であるか、非転移性であるか)および/または予後(例えば、特定の化学療法に対する反応性および/または程度)を示唆することができる。いくつかの態様においては、例えば個別の腫瘍における試料の採取によって化学療法剤に対する個別の腫瘍の薬物耐性を予測する方法が提供される。
いくつかの態様において、COPDの診断は、COPDと関連した遺伝子および転写因子の間の相関関係(対照との比較)の欠如を確認することによって行うことができる。例えば、いくつかの態様は、被験者から得られた試料内のCEBPGおよび/またはE2F1の発現量をアッセイすること;他の遺伝子がCOPDと関連している場合における試料内の少なくとも一つの前記他の遺伝子の発現量をアッセイすること;および、発現量が互いに相関しているのか否かを識別するモデルを用いて発現量を数学的に算出することを含む。被験者から得られた試料に相関関係の欠如は、COPD、COPDのリスク、COPDの程度および/または予後(例えば、特定の治療に対する反応性の見込みおよび/または程度)を示唆することができる。当業者は、本願明細書において記載されている方法を用いて他の癌関連症状および/または他の肺関連症状の診断を行うことが可能であることが分かっている。
いくつかの態様において、採取される試料としては、例えばNBECなどの気管支上皮細胞が挙げられる。好適な態様においては、上記のように、前記試料としては、容易に採取できる細胞、例えば鼻腔上皮細胞、頬側上皮細胞または血液細胞が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、前記被験者は、例えば大量喫煙歴を有する個体などの、喫煙者である。
いくつかの態様において、前記他の遺伝子はAO遺伝子およびDNAR遺伝子から選択され、そのAO遺伝子およびDNAR遺伝子としては、XRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1、GPX1、ERCC1、CAT、GSTZ1および/またはERCC2が挙げられるがこれらに限定されない。一般的に、前記他の遺伝子は、対照試料内のCEBPGおよび/またはE2F1によって調節される。発現量のアッセイは、本技術分野で知られているすべての方法、例えば上記にて提供される方法のすべてによって行うことができる。好ましくは、本発明の方法は、予防効果を向上させるBCおよび/またはCOPDの早期発見を可能にする。また、本願明細書において記載されている方法によってリスクの高い個体のみをBCおよび/またはCOPDの試験に組み込むことが容易になり、そのことによってかかる試験の対費用効果も向上する。
いくつかの態様において、BCおよび/またはそのリスクを同定するために用いる前記モデルでは、例えばBCIのNBECにおいて高発生率で発現するが、NBCIでは発現しないか、もしくは低発生率で発現するAO遺伝子および/またはDNAR遺伝子などの、AO遺伝子および/またはDNAR遺伝子の1種以上とCEBPGの間の発現量の比較式を用いる。例えば、いくつかの態様においては、上記のように、TG/TFの比率が用いられる。いくつかの態様において、各AO遺伝子またはDNAR遺伝子を有するCEBPGの相関関係が欠如していることは、比較的BCになりやすい個体からのNBECの特徴である。すなわち、TGを有するCEBPGの相関関係の欠如は、BCリスクの増加を示唆している。
CEBPGは、NBEC内のAOおよび/またはDNARの保護を制御する役割を主に果たすことができるが、各個体における何十または何百もの種々のDNA塩基配列の変化の内のいずれかの組み合わせによっては、CEBPGとその他の(正常に調節された)遺伝子との間の相関関係が低下する可能性がある。好適な態様において、多くの種々の遺伝子と遺伝子内の領域の機能に影響を与えるリスク関連の対立遺伝子は、本解析によって検出できる。いくつかの態様においては、一組の遺伝子におけるTG/CEBPG比率によって、機能的に重大な変異体がBCのリスクに及ぼす影響の定量化が可能になり、例えばリスク増加のモデルが提供される。このような態様においては、相関関係の欠如は、NBCIにおいて示される回帰直線と比較して高いまたは低い(TG/CEBPG)比率を示す個体に関連するものである。
例えば、いくつかの態様において、CEBPGのbZip領域内の50塩基対の同一の連なりのいずれかにおけるリスク対立遺伝子はリスクを増加させる。各ヌクレオチドにおける極めて少ない対立遺伝子の出現率は約0.001未満でもよいが、50塩基対の同一の連なりにおいて発現するこの極めて少ない対立遺伝子の確率は50×約0.001、すなわち約0.05であり、大量喫煙者の測定BCリスクに一致している。このリスクの同定は、本発明のいくつかの態様によって、例えばTG/CEBPGの比率を用いて可能になる。かかるモデルの決定および適用に関するさらなる詳細については、下記の実施例に示す。
いくつかの態様において、本発明は、例えばBCなどの癌関連症状および/またはCOPDなどの肺関連症状を同定するためのキットなど、生物学的状態を診断するためのキットを提供する。一態様において、かかるキットは、転写因子のための競合鋳型および少なくとも1つの他の遺伝子のための競合鋳型を含む標準化混合物を含み、それらの競合鋳型は、お互いに対して公知の濃度にある。かかるキットを用いて転写因子および/または他の遺伝子の発現量を測定することができ、その発現量を算出して症状の診断ができる。
例えば、癌関連症状および/または肺関連症状を診断するためのキットの一態様において、標準化混合物は、CEPBGのための競合鋳型、例えば配列番号1±約100塩基からなる核酸配列を含む競合鋳型;および少なくとも1つの他の遺伝子、すなわち癌関連症状および/または肺関連症状と関連する他の遺伝子のための競合鋳型を含むことができる。癌関連症状および/または肺関連症状を診断するためのキットの別の一態様において、標準化混合物は、E2F1のための競合鋳型、例えば配列番号2±約100塩基からなる核酸配列を含む競合鋳型;および少なくとも1つの他の遺伝子、すなわち癌関連症状および/または肺関連症状と関連する他の遺伝子のための競合鋳型を含むことができる。前記他の遺伝子は、AO遺伝子およびDNAR遺伝子、例えばXRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1、GPX1、ERCC1、CAT、GSTZ1およびERCC2から選択することができる。例えば、いくつかの特定の態様において、前記他の遺伝子のための前記競合鋳型は、配列番号3〜7から選択される少なくとも1つの配列±約100塩基からなる核酸配列を含むことができる。好適な態様において、前記キットは、BCおよび/またはCOPDのリスクに関する検査に用いることができる。
いくつかの態様において、標準化混合物は、例えば(試料からの)転写因子およびその競合鋳型の両方を増幅するためのプライマー対および/または(試料からの)他の遺伝子およびその競合鋳型を増幅するためのプライマー対をさらに含むことができる。いくつかの特定の態様において、例えば、前記プライマー対は、表1に示されるプライマー対から選択することができる。
いくつかの態様においては、本願明細書において記載されているキットおよび方法によって、BCおよび/またはCOPDのリスクがあるものが従来の方法よりも正確に同定される。BCのリスクがあるものの同定をさらに正確に行い、かかる個体を化学的予防および/または早期発見のための検査に組み込むことによって、有効性は向上する。当業者は、本願明細書において提供される方法が他の癌関連症状および/または他の肺関連症状、例えば本願明細書において提供される他の癌関連症状および肺関連症状の診断に適用可能であることが分かっている。
B 多型に基づくアプローチ
さらに別の一態様において、本発明は、同定された多型を用いて生物学的状態を診断する方法および組成物に関する。好適な態様において、同定された多型は、対照と比較して1つ以上のヌクレオチドの相違を含むDNAの特異的領域からなる。そのヌクレオチドの相違は被験者ごとに異なる。しかしながら、その領域内の1つ以上の相違は、所定の生物学的状態を示唆する。
さらに別の一態様において、本発明は、同定された多型を用いて生物学的状態を診断する方法および組成物に関する。好適な態様において、同定された多型は、対照と比較して1つ以上のヌクレオチドの相違を含むDNAの特異的領域からなる。そのヌクレオチドの相違は被験者ごとに異なる。しかしながら、その領域内の1つ以上の相違は、所定の生物学的状態を示唆する。
癌関連症状および/または肺関連症状の診断
例えば、いくつかの態様において、被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法は、被験者から関連の多型に対応した核酸領域を含む試料を得ること、前記領域を対照内で見つかった配列からなる核酸配列と比較すること、および核酸の相違を同定することを含む。いくつかの態様において、対照からの前記配列は、例えば複数の健康な個体から得られるコンセンサス配列である。好適な態様において、得られる前記試料は、容易に採取できる試料、例えば非侵襲的または軽度に侵襲的な方法によって得ることができるものである。かかる試料の例としては、尿試料、血液試料、精液試料、またはより好ましくは、唾液試料、頬側上皮細胞試料および/または鼻腔上皮細胞試料が挙げられる。例えば、同定された多型によって、末梢血および/または頬部スミアおよび/または鼻腔上皮細胞などの容易に採取できる患者試料を用いる診断試験が可能になる。
例えば、いくつかの態様において、被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法は、被験者から関連の多型に対応した核酸領域を含む試料を得ること、前記領域を対照内で見つかった配列からなる核酸配列と比較すること、および核酸の相違を同定することを含む。いくつかの態様において、対照からの前記配列は、例えば複数の健康な個体から得られるコンセンサス配列である。好適な態様において、得られる前記試料は、容易に採取できる試料、例えば非侵襲的または軽度に侵襲的な方法によって得ることができるものである。かかる試料の例としては、尿試料、血液試料、精液試料、またはより好ましくは、唾液試料、頬側上皮細胞試料および/または鼻腔上皮細胞試料が挙げられる。例えば、同定された多型によって、末梢血および/または頬部スミアおよび/または鼻腔上皮細胞などの容易に採取できる患者試料を用いる診断試験が可能になる。
いくつかの態様において、前記核酸領域はCEBPGの5’調節領域であり;この領域は、CEBPGの5’調節領域±約10塩基、約50塩基、約100塩基、約150塩基、約200塩基、約500塩基、約800塩基または約1000塩基からなる(対照の)核酸配列と比較され、ヌクレオチドの相違は癌関連症状または肺関連症状を示す。
いくつかの態様において、前記核酸領域はCEBPGの3’非翻訳領域であり;この領域は、CEBPGの3’非翻訳領域±約10塩基、約50塩基、約100塩基、約150塩基、約200塩基、約500塩基、約800塩基または約1000塩基からなる(対照の)核酸配列と比較され、ヌクレオチドの相違は癌関連症状または肺関連症状を示す。
いくつかの態様において、前記核酸領域はCEBPGのbZip領域であり;この領域は、CEBPGのbZip領域±約10塩基、約50塩基、約100塩基、約150塩基、約200塩基、約500塩基、約800塩基または約1000塩基からなる(対照の)核酸配列と比較され、ヌクレオチドの相違は癌関連症状または肺関連症状を示す。
いくつかの態様において、前記核酸領域はCEBPG認識部位であり;この領域は、CEBPG認識部位±約10塩基、約50塩基、約100塩基、約150塩基、約200塩基、約500塩基、約800塩基または約1000塩基からなる(対照の)核酸配列と比較され、ヌクレオチドの相違は癌関連症状または肺関連症状を示す。例えば、いくつかの態様において、CEBPG認識部位は、XRCC1、ERCC5、SOD1、GSTP1および/またはGPX1のためのCEBPG認識部位である。
いくつかの態様において、前記比較は、例えば本技術分野で知られているような、および/または本願明細書において提供されるような方法を用いて、前記核酸領域の少なくとも1つの塩基を同定することを含む。例えば、いくつかの態様においては、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で試料を対照から得られた配列(またはその相補配列)からなるプローブと接触させることにより、試料から得られる領域および対照から得られる配列を比較すること;およびハイブリダイゼーションの有無を検出することを行う。本技術分野で知られているように、ハイブリダイゼーションの特異性の評価は、ハイブリダイゼーション条件の厳密性の程度を変更することによって行うことができる。適切な条件下におけるハイブリダイゼーションによって、試料の配列が対照の配列と同一、十分に同一、ほとんど同一、または実質的に同一であることを示すことが可能となり、これにより症状の欠如またはそのリスクが低いことが示唆される。ハイブリダイゼーションの低下によって、試料の配列が試料の配列(プローブ)と異なる、十分に異なる、ほとんど異なる、または実質的に異なることを示すことが可能となり、これにより症状またはそのリスクが示唆される。さらに、オリゴヌクレオチドプローブのミスマッチを完全一致と比較することによって結合の特異性を確認することができる。いくつかの態様において、前記癌関連症状は、気管支癌、そのリスクまたは化学療法剤に対する反応性である。いくつかの態様において、前記肺関連症状は、COPDまたはそのリスクである。
いくつかの態様において、前記ヌクレオチドの相違は一塩基多型である。いくつかの態様において、前記ヌクレオチドの相違は、前記領域内の連続的または異なる場所の2つ以上の塩基対の変化、例えば前記領域内の2つ以上のSNPを含む。例えば、前記ヌクレオチドの相違は、少なくとも約2つ、少なくとも約3つ、少なくとも約5つ、少なくとも約10、少なくとも約20、または少なくとも約50のヌクレオチドの相違を含む。いくつかの態様において、前記ヌクレオチドの相違は、約80未満、約100未満、約150未満、約200未満、約300未満または約500未満のヌクレオチドの相違を含む。
さらにいくつかの態様において、2つ以上の領域は、症状(あるいはそのリスクまたは予後)を診断するために、対照の領域と比較することができる。例えば、癌関連症状および/または肺関連症状の同定において、前記方法は、CEBPGの5’調節領域、CEBPGの3’非翻訳領域;CEBPGのbZipコード領域;およびXRCC1、ERCC5、SOD1、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位から選択される2つ以上の核酸領域内のヌクレオチドの相違を同定することを含むことができる。
いくつかの態様においては、癌関連症状および/または肺関連症状を示す多型を同定するための関連の核酸配列からなるプローブが提供される。この4つのプローブの例としては、(i)CEBPGの5’調節領域±約10塩基、約50塩基、約100塩基、約150塩基、約200塩基、約500塩基、約800塩基または約1000塩基からなる核酸配列を含むプローブ;(ii)CEBPGの3’非翻訳領域±約10塩基、約50塩基、約100塩基、約150塩基、約200塩基、約500塩基、約800塩基または約1000塩基からなる核酸配列を含むプローブ;(iii)CEBPGのbZip領域±約10塩基、約50塩基、約100塩基、約150塩基、約200塩基、約500塩基、約800塩基または約1000塩基からなる核酸配列を含むプローブ;および(iv)CEBPG認識部位±約10塩基、約50塩基、約100塩基、約150塩基、約200塩基、約500塩基、約800塩基または約1000塩基からなる核酸配列を含むプローブが挙げられる。この1つ以上のプローブは、例えばアレイなどの支持体への固定、および/またはキットにおける提供が可能であり、そのキットは、癌関連症状および/または肺関連症状(例えばBCおよび/またはCOPD)、そのリスク、治療に対して予測される反応などを同定するために用いられる。
III 治療のための方法および組成物
本発明のさらに別の態様は、例えば転写因子と遺伝子の間の相関関係の欠如を「補う」作用剤を提供することによって生物学的状態を治療するための方法および組成物に関する。例えば、いくつかの態様は、相関関係の欠如が確認されたことに基づいて治療薬を投与すること;および/または同定されたバイオマーカまたはバイオマーカの組み合わせを投与することを含む。一般的に、本発明は、動物被験体の治療のための方法、医薬品組成物およびキットを提供する。本明細書で用いられる「動物被験体」という用語には、他の哺乳類と同様にヒトが包含される。「治療薬」という用語は、動物被験体を治療するために用いることが可能なあらゆる作用剤を意味することができる。
本発明のさらに別の態様は、例えば転写因子と遺伝子の間の相関関係の欠如を「補う」作用剤を提供することによって生物学的状態を治療するための方法および組成物に関する。例えば、いくつかの態様は、相関関係の欠如が確認されたことに基づいて治療薬を投与すること;および/または同定されたバイオマーカまたはバイオマーカの組み合わせを投与することを含む。一般的に、本発明は、動物被験体の治療のための方法、医薬品組成物およびキットを提供する。本明細書で用いられる「動物被験体」という用語には、他の哺乳類と同様にヒトが包含される。「治療薬」という用語は、動物被験体を治療するために用いることが可能なあらゆる作用剤を意味することができる。
本明細書で用いられる「治療」という用語には、治療的利益および/または予防的利益の達成が包含される。治療的利益とは、治療すべき基礎疾患の消失または回復を意味するものである。例えば、BC患者における治療的利益として、基礎疾患の癌の消失または回復が挙げられる。また、治療的利益とは、たとえ患者が基礎疾患に苦しみ続けている可能性があったとしても、その患者に改善がみられるような、基礎疾患と関連した1つ以上の生理学的徴候の消失または回復があれば得られるものである。例えば、BCに関して、治療によって治療的利益をもたらすことが可能になるのは、咳、呼吸困難、喀血および/または閉塞性肺炎などの、BCを伴う他の疾患および/または苦痛に関する患者に改善がみられたときである。予防的利益は、たとえ診断を行うことができなかった場合であっても、例えばBCおよび/またはCOPDなどの病気の症状を発現するリスクのある患者、またはその症状の生理学的徴候を1つ以上訴える患者に治療薬を投与することで得られる可能性がある。
癌関連症状および/または肺関連症状の治療
いくつかの態様において、本発明は、例えばBCなどの癌関連症状および/または例えばCOPDなどの肺関連症状を治療するための方法および組成物を提供する。上記で示したように、本発明の方法および組成物は診断確定の際に用いることが可能であり、治療薬の投与は必要な場合に行うことができる。癌関連症状および/または肺関連症状の治療の際などに投与可能な治療薬の例としては、ブスルファン、シスプラチン、マイトマイシンCおよびカルボプラチンなどのアルキル化剤;コルヒチン、ビンブラスチン、パクリタキセルおよびドセタキセルなどの有糸分裂阻害剤;カンプトセシンおよびトポテカンなどのトポI阻害剤;ドキソルビシンおよびエトポシドなどのトポII阻害剤;5−アザシチジン、5−フルオロウラシルおよびメトトレキサートなどのRNA/DNA代謝拮抗物質;5−フルオロ−2’−デオキシウリジン、アラビノシルシトシン、ヒドロキシ尿素およびチオグアニンなどのDNA代謝拮抗物質;イレッサ(登録商標;ゲフィチニブ)およびタルセバ(登録商標;エルロチニブ)などのEGFR阻害剤;プロテオゾーム阻害剤;キャンパス、ハーセプチン(登録商標;トラスツズマブ)、アバスチン(登録商標;ベバシズマブ)またはリツキサン(登録商標;リツキシマブ)などの抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。使用可能な他の治療薬としては、メルファラン、クロランブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ビンクリスチン、ミトグアゾン(mitoguazone)、エピルビシン、アクラルビシン、ブレオマイシン、ミトキサントロン、エリプチニウム、フルダラビン、オクトレオチド、レチノイン酸、タモキシフェン、グリーベック(登録商標;メシル酸イマチニブ)およびアラノシンが挙げられる。例えば、米国特許公開2005/0137213号を参照すること。また、癌関連症状および/または肺関連症状の治療の際などに投与可能な治療薬の例としては、エルロチニブ、カネルチニブ(canertinib)、セツキシマブ、ABX−EGF、トラスツズマブ、イマチニブ、SU11274、PHA665752、AP23573、RAD001、CCI−779、ベバシズマブ、バタラニブ(vatalanib)、ベキサロテン(bexarotene)、ボルテゾミブ、フラボピリドール(flavopiridol)、オブリマーセン(oblimersen)、VEGF阻害剤、セレン、15−PGDHおよび/または15−PGDH活性化剤(例えばインドメタシンなどのNSAID)、P13K/Akt阻害剤(例えばデグエリン(deguelin)およびミオイノシトール)、PPAR−γおよび/またはPPAR−γ活性化剤(例えばp21アップレギュレータ、Eカドヘリンアップレギュレータ(up-regulator)、ゲルソリンアップレギュレータ、サイクリンDおよびEダウンレギュレータ(down-regulator)、MUC1ダウンレギュレータ、MMP2ダウンレギュレータおよびα5−インテグリン・ダウンレギュレータ)、DNAメチルトランスフェラーゼ−1阻害剤、HDACおよびメチルトランスフェラーゼ阻害剤、プロスタグランジンE2阻害剤、プロスタサイクリンおよび/またはプロスタサイクリン活性化剤、5−LOX阻害剤、COX阻害剤、LOX−COX阻害剤、12−LOX阻害剤、EGFR阻害剤、ロイコトリエンA4ヒドロラーゼモジュレータ、シクロオキシゲナーゼ−1モジュレータ、抗酸化剤、カラチノイド(caratinoids)、例えばエトレチナートなどのレチノイド、イソトレチノイン、β−カロテン、フェンレチニド(fenretinide)、アネトールジチオールチオン(anethole dithiolthione)、9−シス−レチノイン酸、レチノール、ブデソニド、α−トコフェロール、パルミチン酸レチニルなどが挙げられる。例えば、Hahnら、Hematol Oncol Clin N Am 19: 343-367 (2005)およびHirschら、J. Clinical Oncology 23(14): 3186-3179 (2005)を参照すること。また、例えば、Cohenら、Cancer Control. 10:315-324 (2003)およびHongら、Science 278: 1073-1077 (1997)も参照すること。
いくつかの態様において、本発明は、例えばBCなどの癌関連症状および/または例えばCOPDなどの肺関連症状を治療するための方法および組成物を提供する。上記で示したように、本発明の方法および組成物は診断確定の際に用いることが可能であり、治療薬の投与は必要な場合に行うことができる。癌関連症状および/または肺関連症状の治療の際などに投与可能な治療薬の例としては、ブスルファン、シスプラチン、マイトマイシンCおよびカルボプラチンなどのアルキル化剤;コルヒチン、ビンブラスチン、パクリタキセルおよびドセタキセルなどの有糸分裂阻害剤;カンプトセシンおよびトポテカンなどのトポI阻害剤;ドキソルビシンおよびエトポシドなどのトポII阻害剤;5−アザシチジン、5−フルオロウラシルおよびメトトレキサートなどのRNA/DNA代謝拮抗物質;5−フルオロ−2’−デオキシウリジン、アラビノシルシトシン、ヒドロキシ尿素およびチオグアニンなどのDNA代謝拮抗物質;イレッサ(登録商標;ゲフィチニブ)およびタルセバ(登録商標;エルロチニブ)などのEGFR阻害剤;プロテオゾーム阻害剤;キャンパス、ハーセプチン(登録商標;トラスツズマブ)、アバスチン(登録商標;ベバシズマブ)またはリツキサン(登録商標;リツキシマブ)などの抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。使用可能な他の治療薬としては、メルファラン、クロランブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ビンクリスチン、ミトグアゾン(mitoguazone)、エピルビシン、アクラルビシン、ブレオマイシン、ミトキサントロン、エリプチニウム、フルダラビン、オクトレオチド、レチノイン酸、タモキシフェン、グリーベック(登録商標;メシル酸イマチニブ)およびアラノシンが挙げられる。例えば、米国特許公開2005/0137213号を参照すること。また、癌関連症状および/または肺関連症状の治療の際などに投与可能な治療薬の例としては、エルロチニブ、カネルチニブ(canertinib)、セツキシマブ、ABX−EGF、トラスツズマブ、イマチニブ、SU11274、PHA665752、AP23573、RAD001、CCI−779、ベバシズマブ、バタラニブ(vatalanib)、ベキサロテン(bexarotene)、ボルテゾミブ、フラボピリドール(flavopiridol)、オブリマーセン(oblimersen)、VEGF阻害剤、セレン、15−PGDHおよび/または15−PGDH活性化剤(例えばインドメタシンなどのNSAID)、P13K/Akt阻害剤(例えばデグエリン(deguelin)およびミオイノシトール)、PPAR−γおよび/またはPPAR−γ活性化剤(例えばp21アップレギュレータ、Eカドヘリンアップレギュレータ(up-regulator)、ゲルソリンアップレギュレータ、サイクリンDおよびEダウンレギュレータ(down-regulator)、MUC1ダウンレギュレータ、MMP2ダウンレギュレータおよびα5−インテグリン・ダウンレギュレータ)、DNAメチルトランスフェラーゼ−1阻害剤、HDACおよびメチルトランスフェラーゼ阻害剤、プロスタグランジンE2阻害剤、プロスタサイクリンおよび/またはプロスタサイクリン活性化剤、5−LOX阻害剤、COX阻害剤、LOX−COX阻害剤、12−LOX阻害剤、EGFR阻害剤、ロイコトリエンA4ヒドロラーゼモジュレータ、シクロオキシゲナーゼ−1モジュレータ、抗酸化剤、カラチノイド(caratinoids)、例えばエトレチナートなどのレチノイド、イソトレチノイン、β−カロテン、フェンレチニド(fenretinide)、アネトールジチオールチオン(anethole dithiolthione)、9−シス−レチノイン酸、レチノール、ブデソニド、α−トコフェロール、パルミチン酸レチニルなどが挙げられる。例えば、Hahnら、Hematol Oncol Clin N Am 19: 343-367 (2005)およびHirschら、J. Clinical Oncology 23(14): 3186-3179 (2005)を参照すること。また、例えば、Cohenら、Cancer Control. 10:315-324 (2003)およびHongら、Science 278: 1073-1077 (1997)も参照すること。
いかなる所定の設計および/または理論に限定されることなく、AOおよびDNAR遺伝子転写調節をさらによく理解することによって、反応を予測する付随的なバイオマーカだけでなく、化学的予防的製剤および化学療法的製剤の改良の設計が可能になる。両系統の治療薬の効能は、AO遺伝子および/またはDNAR遺伝子の機能の影響を受ける可能性がある。CEBPGによるAO遺伝子および/またはDNAR遺伝子の調節を標的とする開発中の製剤は、炎症および/または免疫だけでなく癌予防や癌治療などの、健康に関する多くの分野において有効な手段となりうる。
また、同定された多型は、治療薬を開発するために用いることも可能であり、その治療薬の例としては、癌関連症状および/または肺関連症状の治療および/または予防のための治療薬が挙げられる。例えば、ヘテロ二量体タンパク質および/またはDNA認識部位への転写因子の結合に対する干渉または強化をすることによって治療効果を得るペプチド分子の開発を行うことができる。例えば、Vassilevら、Science 6(303): 8440848 (2004)を参照すること。そのように同定された治療薬は、例えば単独で、または他の既知の治療薬(例えば上記で提供されるような、癌関連症状および/または肺関連症状を治療するための他の既知の治療薬など)と併用して、1つ以上を投与することができる。
実施例1
NBCIおよびBCIの試料の採取
正常な気管支上皮細胞(NBEC)および末梢血の試料は、患者から得られ、各試料の一部は、本願明細書において記載されている実施例で用いることができる。個体は、診断的気管支鏡検査を受けている患者の中から採用することができる。気管支鏡検査の適応症の中には、喀血、慢性咳嗽、抗生物質耐性肺炎および異物除去の必要があるものが含まれる。これらの患者の一部は気管支癌(BCI)と診断されるかもしれないし、他は非腫瘍性症状(NBCI)を有しているかもしれない。これらの患者の年齢の範囲は、約20〜約90歳にわたっていて、大部分の関係者は約60〜約75歳の間であるかもしれない。NBEC試料は、先に述べた方法に従って得られる。例えば、Benhamou S.ら、Carcinogenesis, 8: 1343-1350 (2002)を参照すること。
NBCIおよびBCIの試料の採取
正常な気管支上皮細胞(NBEC)および末梢血の試料は、患者から得られ、各試料の一部は、本願明細書において記載されている実施例で用いることができる。個体は、診断的気管支鏡検査を受けている患者の中から採用することができる。気管支鏡検査の適応症の中には、喀血、慢性咳嗽、抗生物質耐性肺炎および異物除去の必要があるものが含まれる。これらの患者の一部は気管支癌(BCI)と診断されるかもしれないし、他は非腫瘍性症状(NBCI)を有しているかもしれない。これらの患者の年齢の範囲は、約20〜約90歳にわたっていて、大部分の関係者は約60〜約75歳の間であるかもしれない。NBEC試料は、先に述べた方法に従って得られる。例えば、Benhamou S.ら、Carcinogenesis, 8: 1343-1350 (2002)を参照すること。
各患者からのNBEC試料および20mLの末梢血の採取および処理は、例えば前述したように行うことができる(Willeyら、1997; Crawfordら、2000)。約10〜15のブラシ生検材料は、ほぼ第3次気管支にみられる正常粘膜から得ることができる。もしその患者が肺炎、外傷または気管支癌などの局部的な病態を発現しているならば、そのブラシ生検材料は、反対側から得ることができる。
各気管支鏡ブラシ生検の後、そのブラシは、約3mLの氷冷した生理的食塩水内でかきまぜ、細胞の除去および回収を行うことができる。各ブラシによって、約50万〜100万の細胞を得ることができる。したがって、10のブラシからは、約500万〜1000万の細胞を得ることができる。約3mLの氷冷した生理的食塩水内のこれらの細胞は、RNAおよびタンパク質の抽出ならびにIHC用スライドおよびFISH用スライドの調製のために分離することができる。核抽出物のタンパク質を抽出するために、約500万の細胞を用いることができる(例えば、Dignamら、Nucleic Acid Research 11: 1475-1489 (1983)を参照すること)。これにより、EMSAやウェスタンハイブリダイゼーション解析のための約100μgの核抽出物を得ることができる。発現量測定用RNA抽出のために、約100万の細胞を用いることができる。
20mLの末梢血は、約1〜2×108の白血球を含むことができる。これらの細胞の大部分を用いることによって、後述する表面プラズモン共鳴(SPR)を利用した試験のための核抽出物を得ることができる。発現量測定用RNA抽出のためには、約100万〜200万の細胞を用いることができ、配列分析用DNA抽出のためには、さらに約100万〜200万の細胞を用いることができる。
また、鼻腔上皮細胞試料および鼻腔上皮細胞試料は、SNPのための気管支鏡ブラシ試料および末梢血試料が得られるBCIおよびNBCIから採取することもできる。鼻腔上皮細胞試料および鼻腔上皮細胞試料は、口または鼻の内側のブラッシングを行うにより得ることができる。BCIおよびNBCIからの頬側上皮細胞試料は、上記で得られるようなNBEC試料と同様の方法で扱うことができる。
実施例2
(a)BCのための転写因子バイオマーカとしてのCEBPGおよびE2F1の同定
GSTP1/GPX1、CAT/GPX1、CAT/GPX3およびGPX3/SOD1に共通するTF認識部位は、配列分析によって同定され(Genomatix Software GmbH、ミュンヘン、ドイツ、http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/)(Quandt K, Frech K, Karas H, Wingender E, Werner T, NAR, 23, 4878-4884. 1995)、これにより11のTFのための部位が得られる。
(a)BCのための転写因子バイオマーカとしてのCEBPGおよびE2F1の同定
GSTP1/GPX1、CAT/GPX1、CAT/GPX3およびGPX3/SOD1に共通するTF認識部位は、配列分析によって同定され(Genomatix Software GmbH、ミュンヘン、ドイツ、http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/)(Quandt K, Frech K, Karas H, Wingender E, Werner T, NAR, 23, 4878-4884. 1995)、これにより11のTFのための部位が得られる。
標準化されたRT(StaRT)-PCR(登録商標)試薬(Willey JCら、Methods in Molecular Biology (ed. Shimkets, R.A.) 13-41 (Humana Press, Inc., Totowa, N.J., 2004)は、これらのTFの内の10種に最適化されており、そのTFとしては、CEBPB、CEBPE、CEBPG、E2F1、E2F3、E2F4、E2F5、E2F6、EVI1およびPAX5が挙げられる。複数のNBEC試料の中で低くかつ変化しない発現量が認められる4つのTFについては、もうそれ以上の評価を行わない。残った6つの、CEBPB、CEBPG、E2F1、E2F3、E2F6およびEVIについては、10のAO遺伝子および/または6のDNAR遺伝子の拡張群との相関関係を評価する。これらの遺伝子の受入番号は、解析すべき各遺伝子のための競合鋳型配列、増幅のための前方および後方プライマー対配列、プライマーがハイブリダイズする遺伝子の位置、およびPCR増幅産物のサイズとともに、下記の表1に示されている。
NBEC試料は、上記で詳述したように、診断的気管支鏡検査の最中に気管支ブラシ生検で得られる。StaRT-PCR(登録商標)を用いて事実上多重化転写物存在率(virtually-multiplexed transcript abundance; VMTA)データを生成する(Workman JおよびMark H, Spectroscopy, 19, 1-3, 2004)。この方法の詳細については、独立研究機関によるこの方法の広範囲なバリデーションを含めて、最近公表された。Willey JCら、Methods in Molecular Biology (ed. Shimkets, R.A.) 13-41 (Humana Press, Inc., Totowa, N.J., 2004)。簡潔にいえば、NBECから抽出される全mRNA試料は、前述したように、M−MLV逆転写酵素およびオリゴチミジンプライマーを用いて逆転写される。Benhamou S.ら、Carcinogenesis, 8: 134301350 (2002)。StaRT-PCR(登録商標)によって、内部標準の標準化混合物(SMIS(登録商標))内の各遺伝子の内部標準は各測定値に含まれる。各測定遺伝子のためのStaRT-PCR(登録商標)試薬は、プライマーおよび内部標準の標準化混合物(SMIS(登録商標))を含み、先述した方法に従って調製される(上記したような表1で示される競合鋳型およびプライマー配列情報)。
上記22の遺伝子のVMTA値は、24のNBCIおよび25のBCIを含む49の個体からのNBEC試料について測定される。NBEC試料を提供した患者の人口統計学的データは表2に示し、得られたVMTAデータは表3に示した。PCR中のばらつきの原因としては、いくつかのものが知られており、試料内の阻害剤が挙げられるが、その原因の対照として内部標準を用いる。例えば、阻害剤の存在は、試料147のE2F1測定値を得ることができなかった主要理由であった(表3を参照)。
ピアソン解析は、AO遺伝子およびDNAR遺伝子と推定調節TFの正規化VMTA値について行う。データは表4に示す。NBCI試料において、CEBPGのTFは、16のAO遺伝子またはDNAR遺伝子のうちの8つ、具体的にはXRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1、GPX1、ERCC1、CATおよびERCC2と、有意に相関している(p<0.01)。対照的に、BCI試料のCEBPGは、本実施例で検定されたAO遺伝子およびDNAR遺伝子のいずれとも相関していない。各VMTA値の関係の解析については、年齢との関係はピアソンの相関関係によって、性別との関係はt検定によって、喫煙歴との関係はANOVAとその後のDuncanの検定によって、解析を評価する。すべての統計的検定は、SAS version 8.0 (SAS Institute, Gary, NC)を用いて両側検定で行う。
図3(a〜f)は、XRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1またはGPX1の各5つの遺伝子に対する、各6つのTF((a)CEBPB、(b)CEBPG、(c)E2F1、(d)E2F3、(e)E2F6、(f)EVI1)の相関性を示す。各図は、各5つの遺伝子に関する1つのTFの相関係数(r値)を示す。相関性は、対数変換によるピアソンの相関関係で判定される。その変換が必要となる理由としては、個体の中の各遺伝子の発現が多様であるからという理由が考えられる。図3において、それぞれの有意な相関性を示すためのp値は、棒の上に示されている。有意水準は、多重比較、具体的にはAO遺伝子またはDNAR遺伝子の各々に対する各6つのTFの比較のためのボンフェローニの調整(p<0.01)として定義される。相関係数の組の有意差は、フィッシャーのZ変換による検定によって比較する。Workman J and Mark H, Spectroscopy, 19: 1-3 (2004)。
CEBPGに関して、図3(b)で示したように、相関した遺伝子のそれぞれにおけるr値にNBCIとBCIの間に有意差または大体の有意差が認められ、それぞれの比較におけるp値は、対応する棒の組の下に示されている。図3bが示すように、CEBPGと、XRCC1、ERCC5、GSTP1およびSOD1の各々との間の相関性は、NBCIよりもBCIのほうが有意に低く、GPX1にかなりの有意差を認めた。
NBCIにおいては、ピアソンの相関解析からのr2値に基づいて、CEBPGは、XRCC1(69%)、ERCC5(62%)、GSTP1(55%)、SOD1(44%)およびGPX1(52%)の発現のばらつきを説明する。E2F1は、残りのばらつきの一部を説明する。例えば、NBCIにおいて、E2F1はGSTPl(図3c)と相関しており、その相関性はBCIよりも低い。しかし、NBCIとBCIの間の相関性に有意差はない。さらに、49のNBCIおよびBCIのすべてからの試料を1つの群として評価したが、その際におけるE2F1は、ERCC5、GSTP1およびSOD1と有意に相関している(表4を参照)。本実施例で検定された他のTFのいずれもが、XRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1またはGPX1と相関していない(図3a、d、e、f)。
図3(g〜h)は、(g)NBCIおよび(h)BCIの散布図として示される図3bのCEBPG/XRCC1データを示す。NBCIまたはBCIのCEBPGとXRCC1の間の関係の散布図は、その他の4つの遺伝子(ERCC5、GSTP1、SOD1およびGPX1)にも当てはまる。CEBPG、XRCC1、ERCC5、GSTP1、SOD1およびGPX1は、NBCI、BCIまたはその結合群の年齢、性別または喫煙歴と有意に相関していない。
(b)BCのための転写因子バイオマーカとしてのCEBPGを同定する追加
データ
選択された16のAO遺伝子およびDNAR遺伝子の発現量は、12のNBCIの二変量解析では相関関係が認められるが、15のBCIでは認められない。NBCI群およびBCI群では、年齢、性別、喫煙歴および疾病状態がほとんど一致しており、本実施例で試験2が行われる。
(b)BCのための転写因子バイオマーカとしてのCEBPGを同定する追加
データ
選択された16のAO遺伝子およびDNAR遺伝子の発現量は、12のNBCIの二変量解析では相関関係が認められるが、15のBCIでは認められない。NBCI群およびBCI群では、年齢、性別、喫煙歴および疾病状態がほとんど一致しており、本実施例で試験2が行われる。
相関している遺伝子のTF認識部位の解析を行う。具体的には、Genomatix社のソフトウェアパッケージのEl Dorado (Build 35)プログラムを用いて、各16のAO遺伝子およびDNAR遺伝子の調節領域内のTF認識部位を探す。最初に、そのソフトウェアを用いて、ゲノム内のAO遺伝子およびDNAR遺伝子の場所を同定し、各遺伝子(Genomatix Software GmbH、ミュンヘン、ドイツ(http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/)におけるプロモーター領域域(転写開始点の上流1000塩基対および下流100塩基対)の1101の塩基対を明らかにする。その後、El Doradoプログラムから得られる1101の塩基対配列は、Matlnspector Version 4.2プログラム(Genomatix Software GmbH、ミュンヘン、ドイツ(http://genomatix.de/cgi-bin/eldorado/)を用いて推定TF認識部位を同定するための標的配列として用いられる。使用するパラメータは、標準的な(0.75)基本的類似度と最適化されたマトリックスの類似度である。相関しているAO遺伝子およびDNAR遺伝子の各々において同定されるTF認識部位は、CEBPファミリー、E2Fファミリー、EVI1およびPAX5に含まれる。
(StaRT)-PCR(登録商標)試薬は、これらの各ファミリー内の各TFのために調製される。これらの標的遺伝子で共有される認識部位を有する各TFのためのVMTAデータは、12のNBCIと15のBCIのNBEC試料から集められた。NBECには、評価対象の11のTFの内の8つが発現しており、その中には、CEBPG、CEBPA、CEBPB、E2F1、E2F3、E2F6およびEVI1が含まれる。
NBCIにおける標的遺伝子との相関関係のパターンと、BCIにおけるこの相関関係の欠如を共に有するTFが同定される。この特徴を有する前記8つの評価対象TFの内の1つは、CEBPGであった。前記8つの各TFおよび前記16のAO遺伝子およびDNAR遺伝子の各々のアッセイを、さらなる12のNBCIおよび13のBCIにおいて行うことによって、CEBPGが、NBCIの、合わせて10のAO遺伝子およびDNAR遺伝子の調節と、BCIの相関関係の欠如の原因なのか否かを判定することができる。その12のNBCIおよび13のBCIについて、試験3が行われる。
試験2および3において、25のBCIの平均年齢が68歳であったのに対して、24のNBCIの平均年齢は55歳であった。BCIの中の男性は18人、女性は7人であったが、それに対してNBCIの男性は12人、女性は12人であった。タバコ喫煙歴、年齢および性別に基づくBCリスクを予測するアルゴリズムは、CARAT試験の一部として集められた人口統計学的情報により開発された(例えば、Bachら、J Natl Cancer Inst. 95: 470 (2003)を参照すること)。このアルゴリズムに基づくと、BCIにおける平均算出BCリスクは6.8%(1〜15%の範囲)であるのに対して、NBCIにおける平均算出BCリスクは2.2%(1〜15%の範囲)である。このように、試験2および3の25のBCIにおけるBCの発現率は100%であるが、同じ年齢、性別および喫煙歴を有する一般集団の個体におけるBCの発現率はわずか6.8%である。表面的には、酸化性物質や喫煙によるDNA損傷のストレスに対する保護が遺伝的に弱く決定されていることに基づいて、25のBCIを選択することができる。
このように、CEBPGが、a)NBCIにおいて相関した各10の遺伝子と相関しているか、b)BCIの10の遺伝子と相関していないか、およびc)NBCIとBCIのいずれにおいても相関しなかった6つの遺伝子と相関しないか、を判定することができる。さらに、d)10のAO遺伝子またはDNAR遺伝子と相関していなかったその他の6つの評価対象の各TFが、このパターンを再度示すか、を予測することもできる。
結果
上記の各予測は、試験3のVMTAデータの盲検解析で確定され、さらに試験2および3のVMTAデータを併合する時に確定される。試験2および3の併合データは、表5〜8に示されている。予測を裏付けるデータは、以下の通りである:
a)AO遺伝子またはDNAR遺伝子のどちらかとのCEBPGの二変量解析において、NBCIの平均相関係数および標準偏差は0.69±0.10であり、平均P値は0.003である(表5)。NBCIにおけるCEBPGとXRCC1の間の二変量解析の例は、図4aに示される。
上記の各予測は、試験3のVMTAデータの盲検解析で確定され、さらに試験2および3のVMTAデータを併合する時に確定される。試験2および3の併合データは、表5〜8に示されている。予測を裏付けるデータは、以下の通りである:
a)AO遺伝子またはDNAR遺伝子のどちらかとのCEBPGの二変量解析において、NBCIの平均相関係数および標準偏差は0.69±0.10であり、平均P値は0.003である(表5)。NBCIにおけるCEBPGとXRCC1の間の二変量解析の例は、図4aに示される。
b)BCIの合計で10のAO遺伝子およびDNAR遺伝子に対するCEBPGの解析において、相関係数は0.23±0.13であり、平均P値は0.36である(これもまた表5に示されている)。BCIのXRCC1に対するCEBPGの二変量プロットは、図4bに示されている。
c)試験2で相関していない各6つの遺伝子に対するCEBPGの二変量解析において、試験3においてもCEBPGに対する相関関係が欠如しており、併合データは表6に示されている。
d)二変量解析において、他の7つのTF(CEBPA、CEBPB、EVI1、E2F1、E2F3、E2F6およびMYC)のいずれもが、CEBPGを伴って観察されるパターンを示さない(すなわち、NBCIにおける合計10のAO遺伝子およびDNAR遺伝子に対する有意な相関関係、およびBCIにおける相関関係の欠如)。これらの結果は、合計で10のAO遺伝子およびDNAR遺伝子の各々に対するCEBPBに関するVMTAデータの二変量解析からの結果によって表される。これは、表7において示されている。図5は、NBCIとBCIのいずれにおいてもXRCC1に対するCEBPBの相関関係が欠如している例を示すものである。
e)年齢、性別および最近または累積的な喫煙歴に対する各遺伝子の発現量の二変量解析では、相関関係が認められない。したがって、本試験に含まれるAO遺伝子およびDNAR遺伝子の調節が喫煙によって影響されるという証拠は、ほとんど、または全くない。これは、これによって対照が困難で、交絡変数と強く考えられる変数を取り除くことができるため、重要なことである。
BCのための転写因子バイオマーカとしてのE2F1に関する追加データ
8つの評価対象TFの内、E2F1は、合計で10のAO遺伝子およびDNAR遺伝子と有意に相関しているTFとしてはCEBPGを除いて唯一のTFである。各10の遺伝子に対するE2F1の二変量解析の結果は、表8に示されている。CEBPGに関する表5に示されている結果と比較して異なる点は、a)E2F1と、NBCIにおける各10の遺伝子との間の二変量解析の平均相関係数(0.49±0.11)が、CEBPGで認められる平均相関係数と比べて低いこと、b)BCIにおける10の遺伝子に対するE2F1の解析の平均相関係数は0.46±0.11であり、NBCIと比較して有意に低くないことである。これらの結果により、合計で10のAO遺伝子およびDNAR遺伝子の調節にE2F1が寄与し、NBCIよりもBCIにおいて10の遺伝子の中の相関性を減少させる役割をE2F1が果たす可能性がないことが示される。
8つの評価対象TFの内、E2F1は、合計で10のAO遺伝子およびDNAR遺伝子と有意に相関しているTFとしてはCEBPGを除いて唯一のTFである。各10の遺伝子に対するE2F1の二変量解析の結果は、表8に示されている。CEBPGに関する表5に示されている結果と比較して異なる点は、a)E2F1と、NBCIにおける各10の遺伝子との間の二変量解析の平均相関係数(0.49±0.11)が、CEBPGで認められる平均相関係数と比べて低いこと、b)BCIにおける10の遺伝子に対するE2F1の解析の平均相関係数は0.46±0.11であり、NBCIと比較して有意に低くないことである。これらの結果により、合計で10のAO遺伝子およびDNAR遺伝子の調節にE2F1が寄与し、NBCIよりもBCIにおいて10の遺伝子の中の相関性を減少させる役割をE2F1が果たす可能性がないことが示される。
実施例3
BCIからNBCIを識別するモデルの確認
BCIからNBCIを識別するモデルは、個体の訓練例のVMTAデータの多変量解析および遺伝的プログラミングソフトウェア解析から導き出される。これらのモデルの評価は、さらなる25のNCBIおよび25のBCIのテスト集合から得られ、年齢、性別および喫煙歴で一致するVMTAデータを用いて行われる。モデルは、訓練例におけるさらなる遺伝子の解析、および追加集合のバリデーションの解析によって適切に洗練される。
BCIからNBCIを識別するモデルの確認
BCIからNBCIを識別するモデルは、個体の訓練例のVMTAデータの多変量解析および遺伝的プログラミングソフトウェア解析から導き出される。これらのモデルの評価は、さらなる25のNCBIおよび25のBCIのテスト集合から得られ、年齢、性別および喫煙歴で一致するVMTAデータを用いて行われる。モデルは、訓練例におけるさらなる遺伝子の解析、および追加集合のバリデーションの解析によって適切に洗練される。
可能であれば、各遺伝子における発現量の三重測定を行う。すべての試験は、NBCI群単独、BCI群単独および併合群において行うことができる。スチューデントt検定によって、各遺伝子についてNBCIおよびBCIからのNBEC間の統計学的有意差を確認する。統計学的有意性は、p<0.05に設定される。すべての統計解析は、SAS version 6.11 (SAS Institute, Cary, NC)を用いて行うことができる。
遺伝子発現量における統計学的に有意な個人間変動を確認するために、1因子ANOVAを行う。ピアソンの相関試験を用いて、遺伝子の組の間の有意な二変量相関を確認する。各BCIに関する各遺伝子のTG/CEBPG比率は、ピアソンの相関試験によって確かめられるNBCIの信頼限界との関連において評価される。カットオフ値は、NBCIからのVMTAデータの二変量解析による回帰直線に基づいて確認される。このモデルは、個体がNBCI群とBCI群の内のどちらなのかを正確に判定するための盲検で評価される。
全体的な発想は、AO遺伝子とDNAR遺伝子の内のいずれかに対してCEBPGの相関関係が欠如していることが、BCのリスクがある個体のNBECの特性であるということにある。NBCIにおいて認められる回帰直線に対して(TG/CEBPG)比率が高い、または低い場合、相関関係の欠如が確認され、従ってBCのリスクが確認される。NBCIのCEBPGとTGの間の相関性が高いため、特定のNBCIのNBECのCEBPGの量に付随して予測される調節遺伝子発現量を高い信頼度で測定することができる。そして、選択されたAO遺伝子およびDNAR遺伝子に関するTG/CEBPG比率を用いて、各個体のリスク付与多型対立遺伝子を予測することができる。
TG/CEBPG比率が、NBCIにおけるTG/CEBPGの解析から測定される特定量より大きいまたは小さい場合、リスクを増加させる多型が示唆される。いかなる特定のBCI個体(定義上高いリスクにあるが)においても、特定の遺伝子におけるTG/CEBPGは、NBCIで認められる回帰直線に対して高い、低い、または等しい可能性がある(例えば、図4におけるCEBPG対XRCC1)。すなわち、CEBPGによる多くのTGの調節は、特定のBCIにおいて正常である可能性がある。しかし、BCの危険が増加したいかなる特定の個体に関しても、充分な数のTGの調節を変化させることが期待される。これにより、NBCIからBCIを識別するためのモデルが提供される。
NBECにおいて測定された発現量に基づいてNBCIからBCIを識別するモデルを確認すると、そのモデルの評価は、例えば、頬側上皮細胞および/または鼻腔上皮細胞などを含む、非侵襲的方法によって得ることができる組織などの、他の組織においても行われる。NBECに関してNBCIおよびBCIにおいて認められる二変量相関パターンは、これらの他の組織においても認めることができる。NBECが得られた、同じ患者から、合わせて約50の頬側上皮試料および末梢血液細胞試料が採取された。発現量は、そのモデルに用いるために測定される。データは、NBECについて得られたデータ、および同じ患者からの末梢血液細胞のSNP解析と比較される。
実施例4
(a)相関関係の欠如の確認によるBCの検出
実施例2aからの22の遺伝子のすべてのVMTAデータの判別分析によって、NBCIまたはBCIとしての各個体を同定するモデルを確認することができる。訓練例(19のNBCIおよび17のBCI)として49の個体の内の36を用いた最適モデルには、CEBPGと1以上の他の遺伝子との間の相互作用が含まれる。そして、6つの最適モデルが、年齢、性別および喫煙歴が一致した6つのNBCIおよび7つのBCIの盲検化確認集合において評価される。最適モデルによって13個体中10個体がNBCIまたはBCIとして同定され、正確度は77%、特異度は100%、感度は70%である。NBECからVMTAデータの線形判別分析で同定されるモデルは、BCのリスクがある個体を同定して化学的予防および早期発見のための臨床試験の有効性を向上させることを目的として、十分な正確度を有することができる。例えば、リスクのある個体の一部がまだBCを発現していなかったとすれば、特異度が70%であっても驚くには当たらない。
(b)相関関係の欠如を確認することでBCを検出するための追加データ
実施例2bのCEBPGおよび10の遺伝子に関するVMTAデータの多変量解析によって、BCIからNBCIを識別するモデルが確認される。最初に50の個体の内の34(17のNBCIおよび17のBCI)のVMTAデータに関する解析を行い、これによって正確度が100%のモデルをいくつか得る。これらのモデルは、残りの盲検化された16の個体(8つのNBCIおよび8つのBCI)を用いて評価することができる。CEBPGを用いるいくつかのモデルにおいて、BCIからNBCIを識別する正確度は少なくとも75%であった。
(a)相関関係の欠如の確認によるBCの検出
実施例2aからの22の遺伝子のすべてのVMTAデータの判別分析によって、NBCIまたはBCIとしての各個体を同定するモデルを確認することができる。訓練例(19のNBCIおよび17のBCI)として49の個体の内の36を用いた最適モデルには、CEBPGと1以上の他の遺伝子との間の相互作用が含まれる。そして、6つの最適モデルが、年齢、性別および喫煙歴が一致した6つのNBCIおよび7つのBCIの盲検化確認集合において評価される。最適モデルによって13個体中10個体がNBCIまたはBCIとして同定され、正確度は77%、特異度は100%、感度は70%である。NBECからVMTAデータの線形判別分析で同定されるモデルは、BCのリスクがある個体を同定して化学的予防および早期発見のための臨床試験の有効性を向上させることを目的として、十分な正確度を有することができる。例えば、リスクのある個体の一部がまだBCを発現していなかったとすれば、特異度が70%であっても驚くには当たらない。
(b)相関関係の欠如を確認することでBCを検出するための追加データ
実施例2bのCEBPGおよび10の遺伝子に関するVMTAデータの多変量解析によって、BCIからNBCIを識別するモデルが確認される。最初に50の個体の内の34(17のNBCIおよび17のBCI)のVMTAデータに関する解析を行い、これによって正確度が100%のモデルをいくつか得る。これらのモデルは、残りの盲検化された16の個体(8つのNBCIおよび8つのBCI)を用いて評価することができる。CEBPGを用いるいくつかのモデルにおいて、BCIからNBCIを識別する正確度は少なくとも75%であった。
実施例5
多型の同定
本実施例では、一定の対立遺伝子がBCIにおいて有意により高率で表現される、相関しているTFおよびAO遺伝子および/またはDNAR遺伝子における多型の同定について記載する。
多型の同定
本実施例では、一定の対立遺伝子がBCIにおいて有意により高率で表現される、相関しているTFおよびAO遺伝子および/またはDNAR遺伝子における多型の同定について記載する。
NBCIのNBECにおいて相関しているAO遺伝子およびDNAR遺伝子の調節領域に共通して、CEBPおよびE2Fファミリーのための認識部位、PAX5およびEVI1が同定される。これらの共通のTF認識部位は、Mattinspector(登録商標)ソフトウェアを用いた調節領域配列分析によって同定される。上記の認識部位と結合する可能性のある8つのTFのうち、CEBPGのTFの発現量と、合わせて10個選択されたAO遺伝子およびDNAR遺伝子の発現量との相関については、NBCIのNBECにおいては相関があるが、BCIのNBECでは相関がないことが明らかになる。E2F1の発現量は、NBCIおよびBCIの双方におけるAO遺伝子およびDNAR遺伝子の発現量と相関している。
CEBPG、CEBPA、CEBPB、FOSおよび合わせて10の相関したAO遺伝子およびDNAR遺伝子の解析は、配列変異体に関して行うことができる。優先的に評価される多型は、転写調節、タンパク質機能、転写後プロセシングおよび/または安定、および/またはタンパク質−タンパク質結合に影響を及ぼす可能性があるものであり、その多型としては、上流の調節領域の多型や、コード領域の3’UTR、翻訳領域および5’UTRの多型が挙げられる。最初に、遺伝的に決定されたリスクの差が最大であると考えられる群を比較することができる。その群としては、一方は、比較的年輩で、比較的喫煙量が多いNBCI、もう一方は、比較的若く、比較的喫煙量が少ないまたは喫煙をしないBCIが挙げられる。SNP Consortiumデータベースを用いて、例えばSNPなどの多型は、相関している遺伝子ならびにCEBPGおよびE2F1の3’非翻訳領域、翻訳領域、5’非翻訳領域および調節領域において同定される。
末梢血液のWBCから抽出されるDNAの配列決定は、商業的サービスを用いて行うことができる。C/EBP遺伝子には数千塩基対の長さがあるので、既知の機能を有するこの領域は、最も優先的に評価することができる。これらの最優先領域としては、DNA結合、ヘテロ二量体形成および活性化、および3’UTRの原因となる領域が挙げられる。これらの遺伝子の既知のSNPの大部分は、3’UTRの中にあり、その3’UTRには、転写の安定性および/またはプロセッシング(例えばポリアデニル化)の役割を果たす可能性がある。例えば、Conneら、Nature Medicine 6(6): 637-41 (2000)を参照すること。
CEBPA、BおよびGタンパク質は、NCBIで利用可能なバイオインフォーマティクスソフトウェアを用いて既知のSNPについて評価される。既知のSNPの一覧は、下記の表9に示した。この表から、CEBPGおよびAの大部分のSNPは3’非翻訳領域(UTR)で認められることが分かる。この3つのC/EBPの各々において、公知のSNPは、調節領域にもコード領域にも存在しない。これらの領域における一般的なSNPは知られていないが、数多くのまれな多型、例えばSNPが個体群の中に存在すると考えられ(Mohrenweiserら、Toxicologic Pathology 32: 1336-45 (2004))、感度のある領域におけるいくつかのヌクレオチドの内のいずれかが変化することによって、機能が変化する可能性があると考えられる。CEBPG、AおよびBならびにFOSを含むそれらのイソロイシン・ヘテロ二量体パートナーにおいて、特に関心のある領域は、トランス活性化、ヘテロ二量体形成および/またはDNA結合に関与するものである。CEBPGは、活性化領域が切断され、欠如している(Cooperら、Nucleic Acids Res. 23: 4371-4377 (1995))。しかし、それは、DNAを完全なCEBPタンパク質と同じ親和性で結合する(Romanら、Gene Dev. 4: 1404-1415 (1990))。それゆえに、CEBPに関しては、ヘテロ二量体形成およびDNA結合の原因となるbZip領域に絞り込まれる。
標的遺伝子に関しては、主な関心は、調節領域、具体的にはCEBPGのための認識部位を含む領域においてある。例えば、XRCClの1100塩基対の調節領域(転写開始点の上流1000塩基対および下流100塩基対)の既知のSNPは、表10に示される。NCBIの各多型の各対立遺伝子の頻度は、測定が可能であり、BCLの各多型での各対立遺伝子の頻度と比較することができる。下記は、遺伝的に決定された増加リスクの推定発生率が5〜10%であることを説明するための、特定の個体において存在しうる多くのシナリオの内の3つが、下記に示されている。
(i)リスクに寄与する各5つの共調節された遺伝子は、CEBPGにおける認識部位の多型を有する。各認識部位におけるリスク対立遺伝子の出現率は、0.5である。0.5×0.5×0.5×0.5×0.5=0.5×0.0625=0.0312。それらのいずれかにおける多型の発生率が0.5未満である場合、または表現型が低いことにより遺伝子のいずれかにおいてホモ接合性が必要となる場合、表現型の頻度はこれより低い。
(ii)5つの遺伝子すべてを制御する転写因子に関する認識部位の多型がある。頻度が0.25であり、ホモ接合性が必要となる(0.25×0.25=0.052)か、頻度が0.05であり、ヘテロ接合性が原因となる(0.05×0.95=0.0475)。
(iii)Mohrenwiener (2004)が報告したように、AO機能および/またはDNAR機能に影響を及ぼす低頻度の多型が多くある。例えば、bZip領域の50の塩基対の同一の連なりのいずれかで発現するリスク対立遺伝子は、リスクを増加させる。各ヌクレオチドに関するまれな対立遺伝子の出現率は0.001未満でもよいにもかかわらず、50の塩基対の同一の連なりにおいてこれらのまれな対立遺伝子の内の1つが発現する確率は、50×0.001、すなわち0.05である。
(iii)Mohrenwiener (2004)が報告したように、AO機能および/またはDNAR機能に影響を及ぼす低頻度の多型が多くある。例えば、bZip領域の50の塩基対の同一の連なりのいずれかで発現するリスク対立遺伝子は、リスクを増加させる。各ヌクレオチドに関するまれな対立遺伝子の出現率は0.001未満でもよいにもかかわらず、50の塩基対の同一の連なりにおいてこれらのまれな対立遺伝子の内の1つが発現する確率は、50×0.001、すなわち0.05である。
種々のヌクレオチドの変化は各個体におけるAO機能および/またはDNAR機能の変化の原因となりうるので、BCIの中では、機能に関する関心領域の全体におけるまれな対立遺伝子の全体的な出現率が残りの遺伝子よりも高い可能性があり、この差をNBCIの中で認めることはできない。例えば、CEBPGのbZip領域の全体におけるBCIの中のまれな対立遺伝子の出現率が残りのCEBPGと比較して高い可能性があるが、それに対してNBCIの中では差がない。データは、一方向のANOVAで有意差(p<0.05)について評価することが可能である。
相対的に数の少ない個体において多くの多型の部位を評価する場合、多型部位のパターンがBC患者と関連しているようにみえるのは偶然である可能性がある。これについては、各多型部位パターンにはモデルとしてのBCとの関連があると最初から判断することによって対応することができる。上で詳述されるように、例えば、これらの各モデルは、後続の盲検試験で確認することができる。
検出力分析は、相関しているTF、AO遺伝子および/またはDNAR遺伝子の既知のSNPの対立遺伝子頻度に基づいて行う。各遺伝子に適した試料数は、一方の群で5%、他方の群で95%の対立遺伝子頻度を仮定して算出される。少なくとも80%の検出力を達成するために、1群につき被験者の数を5人とする。例えば、10のSNP(例えば各遺伝子に1つ)に対して、被験者の数を100人とする。検出力の算出は、Fisher Exact Procedure on nQuery 5.0を用いて行うことができる。CEBPGによって調節される、および/または予防に寄与するさらなるAO遺伝子および/またはDNAR遺伝子が評価されない場合、感度が減少する可能性がある(例えば、高い疑陰性が認められる可能性がある)が、特異度は影響されない可能性がある(例えば、偽陽性が低いままである)。
実施例6
BCIではなくNBCIにおいて認められる、CEBPGに対するAO遺伝子およびDNAR遺伝子の相関関係について機構的な塩基を調べることによる多型の同定
BCIではなくNBCIにおいて認められる、CEBPGに対するAO遺伝子およびDNAR遺伝子の相関関係について機構的な塩基を調べることによって、BCを示す多型領域を同定することができる。確率された技術を適用して一次細胞/組織の転写調節を評価することができる。転写調節の測定には、3つの要素が必要となる可能性がある:(a)TFによって調節されるVMTA測定値標的遺伝子、(b)標的遺伝子の調節領域にあるTFのためのDNA認識部位配列の解析、および(c)各認識部位を有するTF相互作用の解析。StaRT-PCR(登録商標)によって生成されるVMTAデータを用いて、(a)に関する標的遺伝子の発現量を測定する;(b)のためにDNA塩基配列決定および他の方法をSNPの高スループット解析に容易に用いることができる;および、EMSA、SPRおよびウエスタンブロット法を、(c)のために用いることができる。気管支鏡ブラシ生検によって得られるNBEC試料の数が少ないため、比較的高感度な方法、例えば標準化されたイムノPCR法 (SiPCR)がいくつかの態様において好ましい。例えば、米国特許出願番号第11/103,397号を参照すること。これらの方法を用いて、特定のDNA塩基配列のためのTFの親和性、および気管支鏡生検よって得られた少ないNBEC試料に対する、種々の推定TFヘテロ二量体タンパク質間の親和性を測定することができる。
BCIではなくNBCIにおいて認められる、CEBPGに対するAO遺伝子およびDNAR遺伝子の相関関係について機構的な塩基を調べることによる多型の同定
BCIではなくNBCIにおいて認められる、CEBPGに対するAO遺伝子およびDNAR遺伝子の相関関係について機構的な塩基を調べることによって、BCを示す多型領域を同定することができる。確率された技術を適用して一次細胞/組織の転写調節を評価することができる。転写調節の測定には、3つの要素が必要となる可能性がある:(a)TFによって調節されるVMTA測定値標的遺伝子、(b)標的遺伝子の調節領域にあるTFのためのDNA認識部位配列の解析、および(c)各認識部位を有するTF相互作用の解析。StaRT-PCR(登録商標)によって生成されるVMTAデータを用いて、(a)に関する標的遺伝子の発現量を測定する;(b)のためにDNA塩基配列決定および他の方法をSNPの高スループット解析に容易に用いることができる;および、EMSA、SPRおよびウエスタンブロット法を、(c)のために用いることができる。気管支鏡ブラシ生検によって得られるNBEC試料の数が少ないため、比較的高感度な方法、例えば標準化されたイムノPCR法 (SiPCR)がいくつかの態様において好ましい。例えば、米国特許出願番号第11/103,397号を参照すること。これらの方法を用いて、特定のDNA塩基配列のためのTFの親和性、および気管支鏡生検よって得られた少ないNBEC試料に対する、種々の推定TFヘテロ二量体タンパク質間の親和性を測定することができる。
相関関係の欠如は、CEBPGによるTGの直接的または間接的な調節に起因する可能性がある。例えば、CEBPG発現量は、AO遺伝子およびDNAR遺伝子の発現量と相関している可能性があるが、例えば、a)CEBPGが、他の遺伝子のトランスフェクションのために必要であるが十分でない共存因子である場合、または、b)CEBPGが、共調節されたAO遺伝子と同じTFによって共調節されるが、それらに影響を及ぼさない場合、CEBPGはそれらを調節することができない。CEBPGがAO遺伝子およびDNAR遺伝子を調節しているのか否かを判定するために、CEBPGおよび適切な標的遺伝子を発現する量が少ない細胞内にCEBPG発現ベクターを導入する。一定の個体から培養されたNBECは、この目的のために適切である可能性がある。例えば、Willeyら、Am J Respir Cell MoI Biol. 19(1): 6-17 (1998)を参照すること。また、内生量が変化するCEBPGを発現する気管支癌細胞株の中に、GSTP1のための調節領域を含むレポーター構築体をトランスフェクションすることができる。種々の機能的影響を有するSNPに対する測定可能な生物学的相関物の一覧は、表11に示されている。
図6は、1つのNBCI(NBCI1)および5つのBCI(BCI1〜5)のTG/CEBPG発現量の二変量解析の図式を示す。この図式において、AO発現量またはDNAR発現量は、NBCIの個体のCEBPG発現量との相関が高い。このように、個別のNCBI1を含むNBCIにおける二変量の座標は、太線で示した回帰直線に沿って減少する。細い横線は、大量喫煙者において発現する酸化性物質およびDNA損傷のストレスに対して保護をするのに十分なTG発現量を表す。NBCIにおいて、例えばCEBPGによる調節が原因の、AO標的遺伝子またはDNAR標的遺伝子の発現量およびCEBPG発現量の間の相関関係は、酸化性物質およびDNA損傷のストレスからのNBECの保護と関連している(NBCI1の座標は、細い横線より上側にある)。
BCI1〜5によって表されるBCIにおいて、矢印によって示されるTG発現量は減少している。さらに、TG発現量およびCEBPG発現量の間の相関性は低いか、またはなく、大部分の二変量の座標は、回帰直線に沿うようには表されていない。この図式が表しているのは、a)CEBPGは主要なAOおよびDNARのTGの転写を調節し、酸化性物質およびDNA損傷のストレスからの保護が低下することによって相関性が減少する、およびb)保護の低下に基づいてBCIが選択されるために、BCIにおいては、それらのNBECにおけるCEBPG発現量とTG発現量の間の相関性の低下が明らかになる、ということである。
個別のBCIのCEBPG発現量がNBCIよりも小さいのか大きいのかが明らかとなることによって、相関関係が欠如するメカニズムとして考えられるものと、その結果病気のリスクを示す多型について解析すべき領域とが示される。また、個別のBCIのTG/CEBPG比率が回帰直線の上側、直線上、または下側のいずれにあるのかによっても、相関関係が欠如するメカニズムとして考えられるものと、その結果病気のリスクを示す多型について解析すべき領域とが示される。表12は、NBCIの回帰直線の上側、直線上、または下側にある個別のBCIのTB/CEBPGデータを示す。相関性が減少するメカニズムとして考えられるものとしては、CEBPG調節領域とTG調節領域の間のCEBPG転写の低下および/または機能的相互作用の低下が挙げられる:
CEBPG転写の低下
BCI1およびBCI2において、CEBPG転写の低下が認められ、それによって、喫煙者が経験するAO/DNA損傷に対する保護に十分なTG発現量を下回ることになる。BCI1とBCI2の間のTG発現量のばらつきは、ストレスによって種々の個体に種々の程度で誘導されるTGを調節する他のTFに起因している可能性がある。CEBPG発現量が減少したBCIにおいて、CEBPGの調節領域は、例えば以下に詳述するように、例えば認識部位のためのTFの親和性に影響を及ぼすかもしれないNBCIとは異なる多型について解析される。
CEBPG転写の低下
BCI1およびBCI2において、CEBPG転写の低下が認められ、それによって、喫煙者が経験するAO/DNA損傷に対する保護に十分なTG発現量を下回ることになる。BCI1とBCI2の間のTG発現量のばらつきは、ストレスによって種々の個体に種々の程度で誘導されるTGを調節する他のTFに起因している可能性がある。CEBPG発現量が減少したBCIにおいて、CEBPGの調節領域は、例えば以下に詳述するように、例えば認識部位のためのTFの親和性に影響を及ぼすかもしれないNBCIとは異なる多型について解析される。
CEBPGおよびTG調節領域間の機能的相互作用の低下
BCI3、BCI4およびBCI5において、たとえCEBPG発現量がNBCI1と(実質的に)等しい、またはそれより高い場合であっても、TG発現量は、大量喫煙者のAOおよびDNA損傷のストレスに対して十分な保護をするに必要な量を下回る。例えば、そのCEBPG発現量は、BCI3およびBCI4においてCEBPG機能が比較的高い個体と等しい。そのCEBPG発現量は、例えば保護が不十分なフィードバック信号が原因で、BCI5よりも高い。BCI3において、TGを調節する非CEBPGのTFの量は、BCI4よりも高い。各状況において達成されたTGの発現量では、十分な保護には不十分である。CEBPG発現量が(実質的に)等しい、またはより高いBCIにおいて、NBCIよりもCEBPGの機能が低いことに関連する多型は、例えば以下に詳述するように調べられる。
BCI3、BCI4およびBCI5において、たとえCEBPG発現量がNBCI1と(実質的に)等しい、またはそれより高い場合であっても、TG発現量は、大量喫煙者のAOおよびDNA損傷のストレスに対して十分な保護をするに必要な量を下回る。例えば、そのCEBPG発現量は、BCI3およびBCI4においてCEBPG機能が比較的高い個体と等しい。そのCEBPG発現量は、例えば保護が不十分なフィードバック信号が原因で、BCI5よりも高い。BCI3において、TGを調節する非CEBPGのTFの量は、BCI4よりも高い。各状況において達成されたTGの発現量では、十分な保護には不十分である。CEBPG発現量が(実質的に)等しい、またはより高いBCIにおいて、NBCIよりもCEBPGの機能が低いことに関連する多型は、例えば以下に詳述するように調べられる。
表12で示されているように、BCI1、BCI2またはBCI3〜4とほとんど等しいTG/CEBPG比率を有するBCIは、AOまたはDNARの10のTGの各々について確認される。本願明細書において記載されているメカニズムによれば、BCI1またはBCI2と等しい、またはほぼ等しい比率を有するBCIは、NBCI1と比較してCEBPGの転写が低下することの原因となる多型を有するが、それに対してBCI3〜5と等しい、またはほぼ等しい比率有するものは、CEBPGの機能が低下することの原因となる多型を有する。これらの仮説は、後述するように特徴的なTG/CEBPG比率を有するBCIを評価することによって検証される。
NCBIの回帰直線の上側のTG/CEBPGを有するBCI
BCI061102(表12)は、NBCIの回帰直線の上側にTG/CEBPG比率があるという点でBCI1(図6)と類似している。表12で示されているように、TG/CEBPG比率の増加は、合成率の低下および/またはCEBPG転写物の安定性の低下に起因する可能性がある。CEBPGの転写の低下は、CEBPGの調節領域を含むか、またはCEBPGを調節するTFの機能に影響する多型に起因する可能性がある。安定性の低下は、3’非翻訳領域(UTR)の多型と関連している可能性がある。
BCI061102(表12)は、NBCIの回帰直線の上側にTG/CEBPG比率があるという点でBCI1(図6)と類似している。表12で示されているように、TG/CEBPG比率の増加は、合成率の低下および/またはCEBPG転写物の安定性の低下に起因する可能性がある。CEBPGの転写の低下は、CEBPGの調節領域を含むか、またはCEBPGを調節するTFの機能に影響する多型に起因する可能性がある。安定性の低下は、3’非翻訳領域(UTR)の多型と関連している可能性がある。
TG/CEBPG値が増加したBCI(例えばBCI061102)において、CEBPGの調節領域は、例えば、認識部位のためのTFの親和性に影響するかもしれないNBCIとは異なる多型について解析される。相違が認められる場合、配列の合成および評価は、SPR解析によってTF(市販の供給元から購入される)との親和性について行われる。
TG/CEBPG値が増加したBCI(例えばBCI061102)において、CEBPGの3’UTRは、安定性の低下の原因となるNBCIとは異なる多型について解析することができる。低下した安定性は、本技術分野で知られているような核ランオンアッセイ(nuclear run-on assay)によって測定することができる。
また、CEBPGを調節するTFの機能は、例えばNBCIとBCIのPMNに、CEBPGの調節領域を含むルシフェラーゼレポーター構築体を一時的にトランスフェクションさせることによって分析される。
NCBIの回帰直線の下側のTG/CEBPGを有するBCI
BCI010902(表12)は、NBCIの回帰直線の下側にTG/CEBPG比率があるという点でBCI3〜5(図6)と類似している。BCI010902において、TG/CEBPGは、AOまたはDNARの10の評価対象TGの内の8つについてNBCIの回帰直線と比較して有意に減少している。例えば、NBCI回帰直線から予測されるERCC5/CEBPG比率は61であるが、BCI010902についての値は5である。
BCI010902(表12)は、NBCIの回帰直線の下側にTG/CEBPG比率があるという点でBCI3〜5(図6)と類似している。BCI010902において、TG/CEBPGは、AOまたはDNARの10の評価対象TGの内の8つについてNBCIの回帰直線と比較して有意に減少している。例えば、NBCI回帰直線から予測されるERCC5/CEBPG比率は61であるが、BCI010902についての値は5である。
NBCIの回帰直線の下側にTG/CEBPGがあるBCIの一部において、このことは、CEBPG内、あるいはCEBPA、CEBPBまたはFOSなどのCEBPGを有するヘテロ二量体を形成する遺伝子内の多型(例えばSNP)に起因する可能性がある。このシナリオでは、CEBP認識部位におけるCEBPGの結合効率は、NBCIよりも低い。このことを検証するために、CEBPG、CEBPA、CEBPBおよびFOSを、BCI010902のような、TG/CEBPG値を有するBCIの末梢血液細胞から分離する。最初にビオチンに結合する配列特異的オリゴを用いてTFを精製し、アビジン金属ビーズと混合し、その後磁気分離機を使用して分離を行う(Kroegerら、Analytical Biochemistry 250: 127-129 (1997))。その後、SPRを用いて、確立された方法に従って、TG内のCEBP認識部位に対するCEBPGの親和性およびCEBPAまたはCEBPBの存在下での認識部位に対するCEBPGの親和性を評価する(例えば、Rutiglianoら、Int J Oncol 12(2): 337-43 (1998); Linnellら、J Biol Chem 275: 12231-12236 (2004)を参照すること)。これらの結果は、TB/CEBPG比率がNBCIの回帰直線上にあるNBCIの試料から得られる結果と比較される。
CEBPG結合効率の低下を示す、TG/CEBPGの低下が認められるBCIにおいて、CEBPG、CEBPA、CEBPBおよび/またはFOSの解析は、例えばCEBPGによるTGの転写の低下と関連する多型のように、NBCIとは異なる多型について行うことができる。
このことは、TG/CEBPGがNBCIの回帰直線の下側にあるBCIの一部においては、影響を受けるTGの各々のためのCEBPG認識部位の多型(例えばSNP)に起因する可能性がある。このことを検証するために、かかるBCIからのTGの認識部位は、NBCIと異なる多型について解析される。また、NBCIまたはBCIのNBECから抽出されたCEBPA、BまたはGの親和性も、多型の有無にかかわらず、認識部位との親和性について比較することができる。精製されたCEBPA、BおよびGは、商業的に入手可能であり(例えば、Abeam、AbnovaまたはActive Motif)、例えば上記のような、SPR測定方法を確認して調整するために得ることができる。上記で言及した、標準化されたイムノPCR法によって、標的遺伝子発現量に関連して、すなわち気管支鏡検査から得られるNBECの少数の一次試料の中で対象となる認識部位に関連して、結合した、または結合していないCEBPGの濃度を定量化することができる。例えば、標準化イムノPCR試薬を、CEBPA、B、GおよびFOSについて開発することによって、比較的検知閾値が低い(例えば、ElisaまたはEMSAにおける約1千万を超える分子と対比しての、いくつかの態様における約50未満の分子)各TFの、標準化された数値的測定が可能になる。これにより、酸化性物質およびDNA傷害物質からのNBECの保護を調節する遺伝子の中におけるこれらの重要な相互作用についてさらによく理解することができる。
このことは、TG/CEBPGがNBCIの回帰直線の下側にあるBCIの一部においては、影響を受けるTGの各々のためのCEBPG認識部位の多型(例えばSNP)に起因する可能性がある。このことを検証するために、かかるBCIからのTGの認識部位は、NBCIと異なる多型について解析される。また、NBCIまたはBCIのNBECから抽出されたCEBPA、BまたはGの親和性も、多型の有無にかかわらず、認識部位との親和性について比較することができる。精製されたCEBPA、BおよびGは、商業的に入手可能であり(例えば、Abeam、AbnovaまたはActive Motif)、例えば上記のような、SPR測定方法を確認して調整するために得ることができる。上記で言及した、標準化されたイムノPCR法によって、標的遺伝子発現量に関連して、すなわち気管支鏡検査から得られるNBECの少数の一次試料の中で対象となる認識部位に関連して、結合した、または結合していないCEBPGの濃度を定量化することができる。例えば、標準化イムノPCR試薬を、CEBPA、B、GおよびFOSについて開発することによって、比較的検知閾値が低い(例えば、ElisaまたはEMSAにおける約1千万を超える分子と対比しての、いくつかの態様における約50未満の分子)各TFの、標準化された数値的測定が可能になる。これにより、酸化性物質およびDNA傷害物質からのNBECの保護を調節する遺伝子の中におけるこれらの重要な相互作用についてさらによく理解することができる。
本発明の好適な態様が本願明細書に記載されたが、これらの態様は例示目的のみに示されていることは当業者にとって明らかである。当業者は、本発明から逸脱することなく、数多くの変化、変更および代替を思いつくことができる。本願明細書において記載されている本発明の態様の各種の変形例は本発明を実施する際に用いることができるということがわかる。請求項は本発明の範囲を規定し、これらの請求項およびそれらの均等物の範囲内の方法および組成物はそれにより包含されていることが意図されている。
本明細書で述べるすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれているものとして具体的かつ個別に示されたのと同程度に、本願明細書において参照により組み込まれている。
g〜h:(g)NBCIおよび(h)BCIの散布図として提示された図3bのCEBPG/XRCC1のデータを示す。
NBCIにおけるCEBPGとXRCC1の二変量解析を示す。
BCIにおけるCEBPGとXRCC1の二変量解析を示す。
NBCIおよびBCIにおいてCEBPBとXRCC1との間に相関関係がないことを示す。
1つのNBCI(NBCI1)および5つのBCI(BCI1〜5)におけるTG/CEBPGの発現量の二変量解析の概略を示す。
Claims (120)
- 被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法であって、
該被験者からCEBPGの5’調節領域に対応する核酸領域を含む試料を得る段階;および
該核酸領域をCEBPGの5’調節領域±約100塩基からなる核酸配列と比較する段階を含んでなり、ヌクレオチドの相違が該癌関連症状または該肺関連症状を示す、方法。 - 該比較は該核酸領域の少なくとも1つの塩基を同定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 該比較は、
ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、CEBPGの5’調節領域±約100塩基またはその相補配列からなるプローブに該試料を接触させること;および
該ハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項1に記載の方法。 - 該癌関連症状が気管支癌またはそのリスクである、請求項1に記載の方法。
- 該癌関連の症状が化学療法薬への反応性である、請求項1に記載の方法。
- 該肺関連症状がCOPDまたはそのリスクである、請求項1に記載の方法。
- ヌクレオチドの該相違が一塩基多型である、請求項1に記載の方法。
- ヌクレオチドの該相違が2つのヌクレオチドの相違を含む、請求項1に記載の方法。
- ヌクレオチドの該相違が3つのヌクレオチドの相違を含む、請求項1に記載の方法。
- ヌクレオチドの該相違が約10のヌクレオチドの相違を含む、請求項1に記載の方法。
- ヌクレオチドの該相違が約50のヌクレオチドの相違を含む、請求項1に記載の方法。
- ヌクレオチドの該相違が約100のヌクレオチドの相違を含む、請求項1に記載の方法。
- 該方法は、CEBPGの3’非翻訳領域;CEBPGのbZipコード領域;並びにXRCC1、ERCC1、ERCC2、ERCC5、SOD1、SOD1、CAT、GSTZ1、mGSTl、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位から選択される少なくとも1つの更なる核酸領域において、更なるヌクレオチドの相違を同定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- BCおよび/またはCOPDを示す多型を同定するためのプローブであって、CEBPGの5’調節領域±約100塩基からなる核酸配列を含むプローブ。
- 該プローブが支持体に固定化されている、請求項14に記載のプローブ。
- 被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法であって、
該被験者からCEBPGの3’非翻訳領域に対応する核酸領域を含む試料を得る段階;および
該核酸領域をCEBPGの3’非翻訳領域±約100塩基からなる核酸配列と比較する段階を含んでなり、ヌクレオチドの相違が該癌関連症状または該肺関連症状を示す、方法。 - 該比較は該核酸領域の少なくとも1つの塩基を同定することを含む、請求項16に記載の方法。
- 該比較は、
ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、CEBPGの3’非翻訳領域±約100塩基またはその相補配列からなるプローブに該試料を接触させること;および
該ハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項16に記載の方法。 - 該癌関連症状が気管支癌またはそのリスクである、請求項16に記載の方法。
- 該癌関連症状が化学療法薬への反応性である、請求項16に記載の方法。
- 該肺関連症状がCOPDまたはそのリスクである、請求項16に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が一塩基多型である、請求項16に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が2つのヌクレオチドの相違を含む、請求項16に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が3つのヌクレオチドの相違を含む、請求項16に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約10のヌクレオチドの相違を含む、請求項16に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約50のヌクレオチドの相違を含む、請求項16に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約100のヌクレオチドの相違を含む、請求項16に記載の方法。
- 該方法は、CEBPGの5’調節領域;CEBPGのbZipコード領域;並びにXRCC1、ERCC1、ERCC2、ERCC5、SOD1、SOD1、CAT、GSTZ1、mGSTl、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位から選択される少なくとも1つの更なる核酸領域において、更なるヌクレオチドの相違を同定することをさらに含む、請求項16に記載の方法。
- BCおよび/またはCOPDを示す多型を同定するためのプローブであって、CEBPGの3’非翻訳領域±約100塩基からなる核酸配列を含むプローブ。
- 該プローブが支持体に固定化されている、請求項29に記載のプローブ。
- 被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法であって、
該被験者からCEBPGのbZip領域に対応する核酸領域を含む試料を得る段階;および
該核酸領域をCEBPGのbZip領域±約100塩基からなる核酸配列と比較する段階を含んでなり、ヌクレオチドの相違が該癌関連症状または該肺関連症状を示す、方法。 - 該比較は該核酸領域の少なくとも1つの塩基を同定することを含む、請求項31に記載の方法。
- 該比較は、
ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、CEBPGのbZip領域±約100塩基またはその相補配列からなるプローブに該試料を接触させること;および
該ハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項31に記載の方法。 - 該癌関連症状が気管支癌またはそのリスクである、請求項31に記載の方法。
- 該癌関連症状が化学療法薬への反応性である、請求項31に記載の方法。
- 該肺関連症状がCOPDまたはそのリスクである、請求項31に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が一塩基多型である、請求項31に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が2つのヌクレオチドの相違を含む、請求項31に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が3つのヌクレオチドの相違を含む、請求項31に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約10のヌクレオチドの相違を含む、請求項31に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約50のヌクレオチドの相違を含む、請求項31に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約100のヌクレオチドの相違を含む、請求項31に記載の方法。
- 該方法は、CEBPGの5’調節領域;CEBPGの3’非翻訳領域;並びにXRCC1、ERCC1、ERCC2、ERCC5、SOD1、SOD1、CAT、GSTZ1、mGSTl、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位から選択される少なくとも1つの更なる核酸領域において、更なるヌクレオチドの相違を同定することをさらに含む、請求項31に記載の方法。
- BCおよび/またはCOPDを示す多型を同定するためのプローブであって、CEBPGのbZip領域±約100塩基からなる核酸配列を含むプローブ。
- 該プローブが支持体に固定化されている、請求項44に記載のプローブ。
- 被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法であって、
該被験者から、XRCC1、ERCC5、SOD1、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位に対応する核酸領域を含む試料を得る段階;および
該核酸領域をXRCC1、ERCC1、ERCC2、ERCC5、SOD1、SOD1、CAT、GSTZ1、mGSTl、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位±約100塩基からなる核酸配列と比較する段階を含んでなり、ヌクレオチドの相違が該癌関連症状または該肺関連症状を示す、方法。 - 該比較は該核酸領域の少なくとも1つの塩基を同定することを含む、請求項46に記載の方法。
- 該比較は、
ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、XRCC1、ERCC1、ERCC2、ERCC5、SOD1、SOD1、CAT、GSTZ1、mGSTl、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位±約100塩基またはその相補配列からなるプローブに該試料を接触させること;および
該ハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項46に記載の方法。 - 該癌関連症状が気管支癌またはそのリスクである、請求項46に記載の方法。
- 該癌関連症状が化学療法薬への反応性である、請求項46に記載の方法。
- 該肺関連症状がCOPDまたはそのリスクである、請求項46に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が一塩基多型である、請求項46に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が2つのヌクレオチドの相違を含む、請求項46に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が3つのヌクレオチドの相違を含む、請求項46に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約10のヌクレオチドの相違を含む、請求項46に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約50のヌクレオチドの相違を含む、請求項46に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約100のヌクレオチドの相違を含む、請求項46に記載の方法。
- 該方法は、CEBPGの5’調節領域;CEBPGの3’非翻訳領域;並びにCEBPGのbZip領域から選択される少なくとも1つの更なる核酸領域において、更なるヌクレオチドの相違を同定することをさらに含む、請求項46に記載の方法。
- BCおよび/またはCOPDを示す多型を同定するためのプローブであって、CEPBG認識部位±約100塩基からなる核酸配列を含むプローブ。
- 該プローブが支持体に固定化されている、請求項59に記載のプローブ。
- 被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法であって、
該被験者からCEBPGの5’調節領域に対応する核酸領域を含む試料を得る段階;および
該核酸領域をCEBPGの5’調節領域±約100塩基からなる核酸配列と比較する段階を含んでなり、ヌクレオチドの相違が該癌関連症状または該肺関連症状を示す、方法。 - 該比較は該核酸領域の少なくとも1つの塩基を同定することを含む、請求項61に記載の方法。
- 該比較は、
ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、CEBPGの5’調節領域±約100塩基またはその相補配列からなるプローブに該試料を接触させること;および
該ハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項61に記載の方法。 - 該癌関連症状が気管支癌またはそのリスクである、請求項61に記載の方法。
- 該癌関連症状が化学療法薬への反応性である、請求項61に記載の方法。
- 該肺関連症状がCOPDまたはそのリスクである、請求項61に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が一塩基多型である、請求項61に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が2つのヌクレオチドの相違を含む、請求項61に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が3つのヌクレオチドの相違を含む、請求項61に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約10のヌクレオチドの相違を含む、請求項61に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約50のヌクレオチドの相違を含む、請求項61に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約100のヌクレオチドの相違を含む、請求項61に記載の方法。
- 該方法は、CEBPGの3’非翻訳領域;CEBPGのbZipコード領域;並びにXRCC1、ERCC1、ERCC2、ERCC5、SOD1、SOD1、CAT、GSTZ1、mGSTl、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位から選択される少なくとも1つの更なる核酸領域において、更なるヌクレオチドの相違を同定することをさらに含む、請求項61に記載の方法。
- BCおよび/またはCOPDを示す多型を同定するためのプローブであって、CEBPGの5’調節領域±約100塩基からなる核酸配列を含むプローブ。
- 該プローブが支持体に固定化されている、請求項74に記載のプローブ。
- 被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法であって、
該被験者からCEBPGの3’非翻訳領域に対応する核酸領域を含む試料を得る段階;および
該核酸領域をCEBPGの3’非翻訳領域±約100塩基からなる核酸配列と比較する段階を含んでなり、ヌクレオチドの相違が該癌関連症状または該肺関連症状を示す、方法。 - 該比較は該核酸領域の少なくとも1つの塩基を同定することを含む、請求項76に記載の方法。
- 該比較は、
ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、CEBPGの3’非翻訳領域±約100塩基またはその相補配列からなるプローブに該試料を接触させること;および
該ハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項76に記載の方法。 - 該癌関連症状が気管支癌またはそのリスクである、請求項76に記載の方法。
- 該癌関連症状が化学療法薬への反応性である、請求項76に記載の方法。
- 該肺関連症状がCOPDまたはそのリスクである、請求項76に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が一塩基多型である、請求項76に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が2つのヌクレオチドの相違を含む、請求項76に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が3つのヌクレオチドの相違を含む、請求項76に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約10のヌクレオチドの相違を含む、請求項76に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約50のヌクレオチドの相違を含む、請求項76に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約100のヌクレオチドの相違を含む、請求項76に記載の方法。
- 該方法は、CEBPGの5’調節領域;CEBPGのbZipコード領域;並びにXRCC1、ERCC1、ERCC2、ERCC5、SOD1、SOD1、CAT、GSTZ1、mGSTl、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位から選択される少なくとも1つの更なる核酸領域において、更なるヌクレオチドの相違を同定することをさらに含む、請求項76に記載の方法。
- BCおよび/またはCOPDを示す多型を同定するためのプローブであって、CEBPGの3’非翻訳領域±約100塩基からなる核酸配列を含むプローブ。
- 該プローブが支持体に固定化されている、請求項89に記載のプローブ。
- 被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法であって、
該被験者からCEBPGのbZip領域に対応する核酸領域を含む試料を得る段階;および
該核酸領域をCEBPGのbZip領域±約100塩基からなる核酸配列と比較する段階を含んでなり、ヌクレオチドの相違が該癌関連症状または該肺関連症状を示す、方法。 - 該比較は該核酸領域の少なくとも1つの塩基を同定することを含む、請求項91に記載の方法。
- 該比較は、
ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、CEBPGのbZip領域±約100塩基またはその相補配列からなるプローブに該試料を接触させること;および
該ハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項91に記載の方法。 - 該癌関連症状が気管支癌またはそのリスクである、請求項91に記載の方法。
- 該癌関連症状が化学療法薬への反応性である、請求項91に記載の方法。
- 該肺関連症状がCOPDまたはそのリスクである、請求項91に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が一塩基多型である、請求項91に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が2つのヌクレオチドの相違を含む、請求項91に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が3つのヌクレオチドの相違を含む、請求項91に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約10のヌクレオチドの相違を含む、請求項91に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約50のヌクレオチドの相違を含む、請求項91に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約100のヌクレオチドの相違を含む、請求項91に記載の方法。
- 該方法は、CEBPGの5’調節領域;CEBPGの3’非翻訳領域;並びにXRCC1、ERCC1、ERCC2、ERCC5、SOD1、SOD1、CAT、GSTZ1、mGSTl、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位から選択される少なくとも1つの更なる核酸領域において、更なるヌクレオチドの相違を同定することをさらに含む、請求項91に記載の方法。
- BCおよび/またはCOPDを示す多型を同定するためのプローブであって、CEBPGのbZip領域±約100塩基からなる核酸配列を含むプローブ。
- 該プローブが支持体に固定化されている、請求項104に記載のプローブ。
- 被験者の癌関連症状または肺関連症状を同定する方法であって、
該被験者から、XRCC1、ERCC1、ERCC2、ERCC5、SOD1、SOD1、CAT、GSTZ1、mGSTl、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位に対応する核酸領域を含む試料を得る段階;および
該核酸領域をXRCC1、ERCC1、ERCC2、ERCC5、SOD1、SOD1、CAT、GSTZ1、mGSTl、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位±約100塩基からなる核酸配列と比較する段階を含んでなり、ヌクレオチドの相違が該癌関連症状または該肺関連症状を示す、方法。 - 該比較は該核酸領域の少なくとも1つの塩基を同定することを含む、請求項106に記載の方法。
- 該比較は、
ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、XRCC1、ERCC1、ERCC2、ERCC5、SOD1、SOD1、CAT、GSTZ1、mGSTl、GSTP1および/またはGPX1のCEPBG認識部位±約100塩基またはその相補配列からなるプローブに該試料を接触させること;および
該ハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項106に記載の方法。 - 該癌関連症状が気管支癌またはそのリスクである、請求項106に記載の方法。
- 該癌関連症状が化学療法薬への反応性である、請求項106に記載の方法。
- 該肺関連症状がCOPDまたはそのリスクである、請求項106に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が一塩基多型である、請求項106に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が2つのヌクレオチドの相違を含む、請求項106に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が3つのヌクレオチドの相違を含む、請求項106に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約10のヌクレオチドの相違を含む、請求項106に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約50のヌクレオチドの相違を含む、請求項106に記載の方法。
- 該ヌクレオチドの相違が約100のヌクレオチドの相違を含む、請求項106に記載の方法。
- 該方法は、CEBPGの5’調節領域;CEBPGの3’非翻訳領域;並びにCEBPGのbZip領域から選択される少なくとも1つの更なる核酸領域において、更なるヌクレオチドの相違を同定することをさらに含む、請求項106に記載の方法。
- BCおよび/またはCOPDを示す多型を同定するためのプローブであって、CEPBG認識部位±約100塩基からなる核酸配列を含むプローブ。
- 該プローブが支持体に固定化されている、請求項119に記載のプローブ。
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