CN112812179A - 高亲和力高特异性抗cmtm6单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高特异性高亲和力的抗人CMTM6单克隆抗体；以及所述CMTM6抗体用于医学基础研究、肿瘤进展和预后诊断的用途、及协助选择治疗方案的用途。

Description

高亲和力高特异性抗CMTM6单克隆抗体及其用途
技术领域
本发明属于免疫学和生物技术领域，首先涉及一种小鼠抗人CMTM6单克隆抗体；本发明还涉及上述CMTM6抗体在基础研究及临床诊断中的用途。
技术背景
CMTM是北京大学人类基因研究中心于2003年在国际上首次报道的基因家族。在人类，该家族包括9个基因，即：CKLF和CMTM1-8。前期系列研究表明，CMTM家族成员参与膜分子转运、降解及信号转导，在免疫系统、男性生殖系统发挥重要作用，并参与肿瘤的发生发展。2017年8月，两篇文章同日在Nature上线发表，通过不同技术路线发现CMTM6与PD-L1存在相互作用，共同定位于细胞质膜，而这一相互作用和共定位与肿瘤细胞对免疫应答的抑制可能相关。
PD-L1高表达于肿瘤细胞，通过与T细胞膜上的PD-1相互作用，抑制抗原特异性CD8+T细胞的功能，帮助肿瘤逃避机体免疫系统的攻击。目前，阻断PD-1/PD-L1的相互作用是肿瘤免疫治疗的热点，在肿瘤免疫治疗中取得了巨大成功。FDA已批准5种针对PD-1/PD-L1的抗体上市，包括2个PD-1抗体和3个PD-L1抗体，用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、尿路上皮癌、头颈部鳞癌、肾细胞癌、胃癌、转移性食管癌、经典型霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、默克尔细胞癌、小细胞肺癌、乳腺癌和微卫星不稳定(MSI)实体瘤(如结直肠癌)等多种肿瘤的适应症，其中肺癌和黑色素瘤是进行临床试验最多的适应症，其疗效也相对更加确切。2017年，此类抗体药物合计实现销售额100.35亿美元。此外，全球正在进行的临床实验有800多项。2018年6月和7月，百时美施贵宝生产的Opdivo(Nivolumab)和默沙东生产的Keytruda(Pembrolizumab)先后在我国正式上市，获批适应症分别为经过系统治疗的非小细胞肺癌(不包括敏感基因突变患者)和一线治疗失败的不可切除或转移性黑色素瘤；2018年12月17日，国家药品监督管理局(NMPA)有条件批准首个国产PD-1单抗——君实生物的特瑞普利单抗注射液(商品名：拓益)上市，用于治疗既往标准治疗失败后的局部进展或转移性黑色素瘤；随后，信达生物的PD-1抗体药物信迪利单抗注射液正式被NMPA批准上市，用于至少经过二线系统化疗的复发或难治性经典型霍奇金淋巴瘤的治疗。此外，国内其他多家药企如恒瑞医药、百济神州、康宁杰瑞、中山康方、嘉和生物、科伦博泰、基石药业、药明康德、康方生物、百奥泰、丽珠单抗等生产的抗体也处于不同临床阶段或正在申请临床研究。预期未来会有大批抗PD-1/PD-L1上市，用于治疗更多类型的肿瘤。
PD-1/PD-L1抗体虽然在非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤、肾细胞癌和霍奇金淋巴瘤的治疗中取得了重大的突破，但总体平均客观缓解率仅约20％。目前的临床共识是，PD-L1的表达情况是影响肿瘤对PD-1/PD-L1抗体治疗的响应的重要因素之一。因而，为了达到“精准治疗”的要求，主张使用PD-L1表达水平作为预测指标，并且美国FDA和欧盟CE IVD已批准了4种PD-L1检测抗体：Ventana生产的SP263和SP142以及Dako生产的22C3和28-8。2019年8月30日，Dako North America(代理人：安捷伦科技(中国)有限公司)的PD-L1免疫组织化学法检测试剂盒PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(下简称“DAKO 22C3”)正式获得国家药品监督管理局(NMPA)批准上市，可辅助鉴别可使用帕博利珠单抗治疗的非小细胞肺癌患者，成为国内获批的首个PD-L1检测试剂盒。2020年5月8日，Ventana PD-L1(SP263)免疫组织化学(IHC)伴随诊断正式获得NMPA批准上市。SP142的抗体试剂在我国也已进入注册申请过程。然而，很多PD-L1阳性患者对PD-1/PD-L1抗体的治疗反应性仍然不理想，原因可能是：PD-L1除了定位于细胞质膜，还广泛存在于胞浆，少量存在于核内，仅质膜定位的PD-L1与免疫抑制有关；而单一检测PD-L1的表达水平高低，难以进行准确定位和区分，因而没有达到精准选择的目的。
如前所述，CMTM6与PD-L1仅共定位于细胞质膜、早期内体、循环内体，二者共定位分析将提高精准治疗率。CMTM6在人体正常组织细胞及多种肿瘤细胞系如黑色素瘤，甲状腺瘤，结直肠癌，非小细胞肺癌中广泛表达。组织化学病理切片分析显示CMTM6在黑色素瘤病人的肿瘤细胞高表达，与PD-L1分布一致。有多个报道表明，CMTM6和PD-L1在非小细胞肺癌组织中表达高度相关，CMTM6的表达水平与PD-1抑制剂治疗反应性正相关，可作为PD-1抑制剂反应性的独立预测因素(Koh YW,Han JH,Haam S,Jung J,Lee HW.Increased CMTM6 canpredict the clinical response to PD-1inhibitors in non-small cell lung cancerpatients.Oncoimmunology.2019Jun 14；8(10):e1629261.)；CMTM6和PD-L1在间质组织及巨噬细胞中的共同高表达与免疫治疗后的生存期正相关(Zugazagoitia J,Liu Y,Toki M,McGuire J,Ahmed FS,Henick BS,Gupta R,Gettinger S,Herbst R,Schalper KA,RimmDL.Quantitative assessment of CMTM6 in the tumor microenvironment andassociation with response to PD-1pathway blockade in advanced-stage non-small-cell lung cancer.J Thorac Oncol.2019Oct 9.pii:S1556-0864(19)33342-8.doi:10.1016/j.jtho.2019.09.014.)。因此，CMTM6可能作为PD-1/PD-L1抗体治疗的新标志物。高特异性高亲和力的CMTM6单克隆抗体对于基础研究及临床诊断均具有重要价值。
目前商品化的CMTM6抗体均为多克隆抗体且特异性不高。本发明制备的小鼠抗CMTM6单克隆抗体，可用于不同细胞、组织CMTM6表达水平的研究，适用于Western blot、免疫组织化学(IHC)等试验，特异性和亲和力显著优于商品化CMTM6抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高特异性高亲和力的CMTM6单克隆抗体；以及所述CMTM6抗体用于医学基础研究的用途；以及所述CMTM6抗体用于疾病进展和预后诊断的用途，所述疾病为肿瘤；以及所述CMTM6抗体用于协助选择治疗方案的用途。
本发明的目的还在于，提供上文所述的CMTM6单克隆抗体用于制备疾病进展和预后诊断试剂盒的用途，所述疾病为肿瘤；以及所述CMTM6抗体用于制备协助选择治疗方案的试剂盒用途。进一步地，本发明还提供了这样的试剂盒。
在一些实施方案中，本发明提供包含轻链(LC)和重链(HC)的抗人CMTM6的抗体，其中所述轻链包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述轻链互补决定区分别由氨基酸序列QSIVYRDGNTY(SEQ ID NO:1)、KVS(SEQ ID NO:2)和FQGSLFPYT(SEQ ID NO:3)组成，且其中所述重链包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述重链互补决定区分别由氨基酸序列GFNIKDTY(SEQ ID NO:4)、IDPANGKT(SEQ ID NO:5)和AFLYDGPIDY(SEQ ID NO:6)组成。
在一些实施方案中，本发明提供包含轻链(LC)和重链(HC)的抗人CMTM6抗体，其中所述轻链进一步包含轻链可变区框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，所述轻链可变区框架区分别由氨基酸序列DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS(SEQ ID NO:7)、LDWYLQKPGQSPKLLIY(SEQID NO:8)、NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO:9)和FGGGTKLEI(SEQ IDNO:10)组成，且其中所述重链进一步包含重链可变区框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，所述重链可变区框架区分别由氨基酸序列EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCASS(SEQ ID NO:11)、IHWVKRRPEQGLEWIGR(SEQ ID NO:12)、YFHSNFQGKATITADTSSNTAHLELSSLTSEDTAVYYC(SEQ IDNO:13)和WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:14)组成。
在一些实施方案中，本发明提供包含轻链(LC)和重链(HC)的抗体，其中轻链包含轻链可变区(VL)且重链包含重链可变区(VH)，其中VL具有SEQ ID NO:15中给出的氨基酸序列，且VH具有SEQ ID NO:16中给出的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供包含两条轻链和两条重链的抗体，其中每一轻链具有SEQ ID NO:15中给出的VL序列，且每一重链具有SEQ ID NO:16中给出的VH序列。
在一个实施方案中，本发明提供抗人CMTM6的抗体，其中重链之一与轻链之一形成链间二硫键，且另一重链与另一轻链形成链间二硫键，且两个重链之间形成两个链间二硫键。
在一个实施方案中，本发明提供抗人CMTM6的抗体，其中所述抗体是糖基化的。
在一些实施方案中，该抗CMTM6抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体为IgG1抗体。
在一些实施方案中，该抗CMTM6抗体为嵌合抗体。在一个实施方案中，嵌合抗体包含小鼠可变区和非小鼠恒定区(比如包括但不限定于大鼠、仓鼠、家兔、猴和人的恒定区)；在另一个实施方案中，嵌合抗体可以是“类转换的”抗体，其类或亚类不同于亲本抗体的类或亚类。
在一些实施方案中，该抗CMTM6抗体为抗体片段。所述抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2，双抗体，线性抗体，单链抗体分子(例如scFv)，和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一些实施方案中，提供了本发明的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，与CMTM6结合。
在一些实施方案中，该抗CMTM6抗体结合人CMTM6。在一些实施方案中，该抗CMTM6抗体结合包含人CMTM6氨基酸序列2到24位氨基酸(CMTM6 N2-24)的多肽、或与包含人CMTM6氨基酸序列2到24位氨基酸的多肽具有至少70％、80％、90％、95％、98％序列同一性或相似性的多肽。
在一些实施方案中，该抗CMTM6抗体结合天然构象的CMTM6。在一些实施方案中，该抗CMTM6抗体结合变性的CMTM6。在一些实施方案中，该抗CMTM6抗体结合经抗原修复的CMTM6。在一些实施方案中，使用流式细胞技术来检测抗CMTM6抗体对CMTM6的结合。在一些实施方案中，使用Western blot来检测抗CMTM6抗体对CMTM6的结合。在一些实施方案中，使用免疫组织化学来检测抗CMTM6抗体对CMTM6的结合。
在一些实施方案中，该抗CMTM6抗体结合内源性表达的CMTM6。在一些实施方案中，该抗CMTM6抗体结合外源性表达的CMTM6。在一些实施方案中，该抗CMTM6抗体结合真核表达的CMTM6。在一些实施方案中，该抗CMTM6抗体结合原核表达的CMTM6。
在一些实施方案中，本发明还提供编码本文所述任何抗体的核酸。在一些实施方案中，所述核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列和编码具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。优选的，所述核酸分子包含SEQID NO:17和SEQ ID NO:18的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明还提供包含所述核酸分子的载体。
在一些实施方案中，本发明还提供包含本文所述任何核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，所述细胞能够表达包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区的抗体。所述细胞可以是细菌、真菌、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，本发明还提供了生产抗体的方法。所述抗体包含具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的轻链可变区和具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区。所述方法包括培养本文所述宿主细胞，使得本文所述抗体生成。在一些实施方案中，该方法进一步包括自该宿主细胞回收该抗体。
在一个实施方案中，本发明提供通过本发明的方法产生的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供组合物，其包含本发明的抗体和可接受的载体、缓冲液或赋形剂。
在另一个实施方案中，本发明提供本发明的抗体用于医学基础研究的用途。所述的医学基础研究包括但不限于CMTM6在生物学样品中的表达水平研究，所述CMTM6表达水平与疾病发生、进展、疗效预测、预后相关的病理生理研究及CMTM6/PD-L1免疫检查点调节机体免疫功能的机理研究。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，提供了检测生物学样品中CMTM6表达水平的方法，所述检测包括定性检测和/或定量检测。在某些实施方案中，该方法包括在容许抗CMTM6抗体结合CMTM6的条件下使生物学样品与抗CMTM6抗体接触，并检测是否在抗CMTM6抗体与CMTM6之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。
在另一个实施方案中，本发明提供本发明的抗体用于选择恶性肿瘤治疗方案和判断预后的用途。所述肿瘤治疗方案包括但不限于抗PD-1/PD-L1抗体治疗，或进一步结合手术治疗和/或放疗和/或化疗和/或其他靶向药物(例如，抗HER2单克隆抗体、CAR-T等等)治疗。所述抗PD-1/PD-L1抗体的适应症恶性肿瘤包括但不限于黑色素瘤、肺癌、头颈癌(如头颈部鳞癌)、淋巴瘤、结直肠癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌或乳腺癌。
在一个实施方案中，本发明还提供了抗体用于制备试剂盒的用途，所述抗体具有与上文所述抗体相同的意思，所述试剂盒用于疾病(优选为恶性肿瘤)进展和预后诊断和/或协助选择治疗方案。
在某些实施方案中，提供了经标记的抗CMTM6抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(比如荧光、显色、电子致密、化学发光和放射性标记物)、及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块，比如酶或配体。在一个实施方案中，上文所述的试剂盒包含这样的经标记的抗CMTM6抗体。
附图简述
附图1.SDS-PAGE检测本发明抗体1-19纯度。
附图2.ELISA鉴定抗体亲和常数。使用CMTM6 N2-24多肽包被ELISA板(200ng/孔)，倍比稀释的1-19mAb(1:200～1:204800)作为检测抗体。亲和常数≈150000×A/抗体浓度(1mg/mL)，A代表平台OD值1/2所对应的抗体稀释倍数。
附图3.ELISA检测1-19重链(HC)和轻链(LC)超表达上清识别CMTM6的能力。使用倍比稀释的CMTM6 N2-24多肽包被ELISA板，纯化的1-19mAb作为检测的阳性对照，无关mAb的重链和轻链超表达上清作为阴性对照。
附图4：Crispr-Cas9基因编辑技术构建CMTM6基因敲除的人肾透明细胞癌786-O细胞株测序结果。A，CMTM6基因(NM_017801)序列及gRNA位置；B，2E7细胞克隆序列比对结果；C，4D10细胞克隆序列比对结果。
附图5：Western Blot鉴定本发明抗体1-19。A，超表达Flag-CMTM6的HEK293T细胞(空载体转染作为对照)检测结果；B，Crispr-Cas9基因编辑敲除CMTM6基因的786-O细胞克隆2E7和4D10(野生型WT和空载体转染的Crispr-Cas9基因编辑细胞克隆3F和9B作为对照)检测结果。
附图6：流式细胞技术鉴定本发明抗体1-19。2E7和4D10，敲除CMTM6基因的786-O细胞克隆；3F和9B，未敲除CMTM6基因的786-O细胞克隆。
附图7：结肠癌组织免疫组织化学分析。A，本发明抗体1-19检测结果；B，商品化CMTM6抗体(Sigma，HPA026980)检测结果。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。应当理解，以下描述和具体实施例仅用来说明本发明的技术内容，而不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1抗CMTM6单克隆抗体的制备和鉴定
根据人CMTM6蛋白质序列(NP_060271.1)信息，合成C末端耦联KLH或BSA的人CMTM6氨基酸序列2到24位氨基酸的多肽(CMTM6 N2-24，委托北京华大蛋白质研发中心有限公司完成)，分别用于免疫实验动物和ELISA筛选阳性克隆。
采用上述合成的KLH耦联的CMTM6 N2-24多肽免疫BALB/c小鼠，初次免疫(60ug多肽/只，皮下注射)后每两周加强免疫一次(60ug多肽/只，皮下注射)，第三次加强免疫后两周取眶血通过ELISA验证效价，取效价最高小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞采用PEG法进行融合，有限稀释法获得单克隆，使用BSA耦联的CMTM6 N2-24多肽预包被96孔板(200ng/孔)，通过ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗CMTM6特异性抗体的杂交瘤细胞株。通过Western Blot、免疫组织化学分析对阳性杂交瘤细胞培养上清进行进一步鉴定，挑选出特异性最好的克隆1-19。使用Protein G(GE Healthcare)柱料对杂交瘤细胞培养上清中的抗体进行纯化，SDS-PAGE检测抗体纯度>90％(图1)；使用SBA ClonotpyingTM System ELISA试剂盒(Southern Biotechnology Associates,Inc)鉴定抗体类型，结果显示该抗体为IgG1亚类、κ型；经ELISA鉴定亲和常数为2.49E+09(图2)。
实施例2抗CMTM6抗体轻链和重链基因的测序及表达载体构建
离心收获1-19杂交瘤细胞，使用TRIzol(Invitrogen)提取细胞总RNA。使用
Figure BDA0002905604710000081
RACE 5’/3’试剂盒(Takara)进行逆转录构建cDNA文库，并通过5’RACE PCR扩增轻链和重链的可变区并测序。其中轻链恒定区外侧引物L-GSP1：GCCTCACAGGTATAGCTGTTATGTCG(SEQ ID NO.19)；轻链恒定区引物L-GSP2：CGTTCACTGCCATCAATCTTCCAC(SEQ ID NO.20)；重链恒定区外侧引物H-GSP1：GAGTTCCAGGTCACTGTCACTGGC(SEQ ID NO.21)；重链恒定区内侧引物H-GSP2：ACCAGGCATCCCAGGGTCACC(SEQ ID NO.22)。PCR反应按照试剂盒说明进行。扩增的条带进行琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，克隆到T载体上进行测序。轻链可变区(VL)多核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，编码SEQ ID NO.15所示氨基酸序列；重链可变区(VH)多核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，编码SEQ ID NO.16所示氨基酸序列。经Igblast(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)比对分析，VL包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别由氨基酸序列QSIVYRDGNTY(SEQ ID NO:1)、KVS(SEQ ID NO:2)和FQGSLFPYT(SEQ ID NO:3)组成；VH包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述重链互补决定区分别由氨基酸序列GFNIKDTY(SEQ ID NO:4)、IDPANGKT(SEQ ID NO:5)和AFLYDGPIDY(SEQ IDNO:6)组成。
进一步根据得到的可变区序列，设计引物，利用1-19杂交瘤细胞cDNA文库扩增抗体轻链和重链全长序列。轻链正向引物：CGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG(SEQ ID NO.23)；轻链反向引物：CCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTCAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG(SEQ ID NO.24)；重链正向引物：CGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTC(SEQ ID NO.25)；重链反向引物：CCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCCTAGGGCGCTTGCCCAATCATG(SEQ ID NO.26)；其中下划线部分为载体同源重组序列。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，使用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(全式金生物)利用同源重组原理将其克隆到pcDNA3.1载体哺乳动物表达载体中。
使用摩尔比1:1混合的轻链：重链载体，转染HEK293T细胞。转染后72h收获细胞培养上清，通过间接法ELISA检测其识别CMTM6的能力。结果显示，共转染本发明抗体1-19重轻链质粒的HEK293T细胞上清能够识别包被于ELISA板的CMTM6 N2-24多肽，并且包被浓度越高，反应孔颜色越深，具有浓度依赖性(图3)。该结果说明所得可变区序列表达的抗体，能特异性识别CMTM6，具有1-19杂交瘤抗体的特点。
实施例4构建CMTM6基因敲除的人肾透明细胞癌786-O细胞株
为了更好的鉴定抗体的特异性，我们采用Crispr-Cas9基因编辑技术制备了CMTM6基因敲除的786-O细胞。经测序鉴定，结果如图4所示。2E7细胞克隆为纯合敲除，在gRNA1附近发生了14个碱基突变(图4B)。4D10细胞克隆为杂合敲除，一条链在gRNA2位置插入1个碱基，另一条链在gRNA2上游71bp发生点突变形成终止密码子(图4C)。
实施例5Western Blot检测
将超表达Flag-CMTM6的HEK293T细胞(空载体转染作为对照)及Crispr-Cas9基因编辑敲除CMTM6基因的786-O细胞克隆(野生型和空载体转染的Crispr-Cas9基因编辑细胞克隆作为对照)的蛋白裂解液经SDS-PAGE电泳分离，转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，经封闭后，以本发明的鼠抗人CMTM6单克隆抗体1-19(1ug/mL)为一抗进行检测。结果如图5A所示，应用本发明抗体，空载体转染HEK293T细胞未见信号，而转染了Flag-CMTM6融合表达载体的样本呈现单一条带，信号特异，大小为26kD，与预期分子量相符。
如图5B所示，与敲除CMTM6基因的786-O细胞克隆(2E7和4D10)相比，野生型(WT)和空载体转染的Crispr-Cas9基因编辑786-O细胞克隆(3F和9B)中可检测到单一特异性条带，大小约为20kD，与预期分子量相符。
实施例6流式细胞分析
收获Crispr-Cas9基因编辑敲除CMTM6基因的786-O细胞克隆(经Crispr-Cas9基因编辑但未敲除CMTM6的细胞克隆作为对照)各1*106于流式管中，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞一遍；每管加入100μL 4％PFA，室温固定15min；加入PBS洗涤细胞一遍；每管加入100μL含有2％FBS和0.1％TritonX-100的PBS，室温30min；加入PBS洗涤细胞一遍；用100μL含有2％FBS/PBS重悬细胞，向每管中加入2μg本发明的抗体或相应的同型对照抗体，冰上孵育1小时；向每管中加入大体积预冷的PBS，4℃，500×g，5min，洗去游离的一抗；用100μL 2％FBS/PBS重悬细胞，加入1μL PE标记的山羊抗小鼠的二抗，冰上避光孵育30min；向每管中加入大体积预冷的PBS，4℃，500×g，5min，洗去游离的二抗；用200μL预冷PBS重悬细胞，400目筛网过滤细胞后上机检测。流式细胞仪型号为BD FACSVerse，使用FACSuite软件对数据进行分析处理。结果如图6所示，在CMTM6敲除细胞克隆2E7和4D10中CMTM6阳性峰较未敲除克隆3F和9B明显左移。
实施例7免疫组织化学分析(IHC)
取结肠癌组织样本固定后进行石蜡包埋，使用Leica RM2235型组织切片机进行切片，切片厚度为3μm。使用Dako Autostainer Link 48免疫组化自动染色机比较商品化CMTM6多克隆抗体(Sigma，HPA026980)和本发明抗体1-19免疫组化染色效果。脱蜡与水化条件为：73℃孵育60min，二甲苯浸泡15min两次，无水乙醇，95％无水乙醇，85％无水乙醇，75％无水乙醇各1min。抗原修复采用高PH抗原修复液(EnVision FLEX，Dako)，97℃孵育20min。使用内源性过氧化物酶封闭液150μL，室温孵育5min。使用抗体稀释液(中杉金桥)将本发明抗体及商品化CMTM6抗体稀释到终浓度为0.5μg/ml作为一抗，用量150μL，室温孵育20min。山羊抗小鼠二抗(Dako)150μL，室温孵育25min。使用DAB显色液(Leica)150μL，室温孵育5min。苏木素复染，室温孵育5s。去离子水清洗1min，75％乙醇1min，85％乙醇1min，95％乙醇1min，100％乙醇2min x 2次，二甲苯2min x 3次，胶带封片。镜下观察染色结果如图3所示，可见使用本发明抗体(图7A)呈现明显上皮细胞膜染色，与商品化CMTM6抗体(图7B)呈现相同的染色模式，且信号强于后者，未见明显非特异染色。
序列表
<110> 北京大学
<120> 高亲和力高特异性抗CMTM6单克隆抗体及其用途
<141> 2020-10-30
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Gln Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Lys Val Ser
1
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Phe Gln Gly Ser Leu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Ala Phe Leu Tyr Asp Gly Pro Ile Asp Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 9
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
1 5
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Ala Ser Ser
20 25
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Ile His Trp Val Lys Arg Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 13
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 13
Tyr Phe His Ser Asn Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ser Asn Thr Ala His Leu Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 14
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 15
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Arg
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Leu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
<210> 16
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 16
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Arg Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr Tyr Phe His Ser Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala His
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Phe Leu Tyr Asp Gly Pro Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 334
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gatgttttga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatccagtca gagcattgtg tatagggatg gaaacaccta tttagactgg 120
tatctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc actttttcct 300
tatacgttcg gaggggggac caagttggag ataa 334
<210> 18
<211> 352
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gaggttcagc tgcaacagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcgcat cttctggctt caatatcaaa gacacctata tacactgggt gaagaggagg 120
cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg attgatcctg cgaatggaaa aacttatttc 180
cactcgaact tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcccac 240
ctggaactca gcagcctgac atcagaggac actgccgtct attactgtgc ttttctctat 300
gatggtccta tagactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc ag 352
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gcctcacagg tatagctgtt atgtcg 26
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
cgttcactgc catcaatctt ccac 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gagttccagg tcactgtcac tggc 24
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
accaggcatc ccagggtcac c 21
<210> 23
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
cgggccctct agactcgagc ggccgccacc atgaagttgc ctgttaggct gttg 54
<210> 24
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
ccactagtcc agtgtggtgg aattctcaac actcattcct gttgaagctc ttg 53
<210> 25
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
cgggccctct agactcgagc ggccgccacc atgaaatgca gctgggttat cttc 54
<210> 26
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
ccactagtcc agtgtggtgg aattcctagg gcgcttgccc aatcatg 47

Claims (10)

1.一种能结合人CMTM6的抗体，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述轻链互补决定区分别由氨基酸序列QSIVYRDGNTY(SEQ ID NO:1)、KVS(SEQ ID NO:2)和FQGSLFPYT(SEQ ID NO:3)组成，且其中所述重链包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述重链互补决定区分别由氨基酸序列GFNIKDTY(SEQ ID NO:4)、IDPANGKT(SEQ ID NO:5)和AFLYDGPIDY(SEQ ID NO:6)组成。
2.权利要求1的抗体，其中所述轻链进一步包含轻链可变区框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，所述轻链可变区框架区分别由氨基酸序列DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS(SEQ IDNO:7)、LDWYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:8)、NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQID NO:9)和FGGGTKLEI(SEQ ID NO:10)组成，和/或其中所述重链进一步包含重链可变区框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，所述重链可变区框架区分别由氨基酸序列
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCASS(SEQ ID NO:11)、
IHWVKRRPEQGLEWIGR(SEQ ID NO:12)、
YFHSNFQGKATITADTSSNTAHLELSSLTSEDTAVYYC(SEQ ID NO:13)和WGQGTSVTVSS(SEQ IDNO:14)组成；优选地，所述轻链进一步包含轻链可变区(VL)序列SEQ ID NO:15，和/或所述重链进一步包含重链可变区(VH)序列SEQ ID NO:16。
3.权利要求1-2任一项的抗体，其为单克隆抗体，或嵌合抗体，或抗体片段。
4.一种核酸，其编码权利要求1-3任一项的抗体。优选的，所述核酸包含SEQ ID NO:17所示的编码轻链可变区的多核苷酸序列和/或SEQ ID NO:18所示的编码重链可变区的多核苷酸序列。
5.一种基因工程载体，其含有权利要求6所述的核酸。
6.一种宿主细胞，其包含以下两者之一：
a)权利要求6的核酸；
b)权利要求7的载体。
7.一种生产抗体的方法，其包括培养权利要求6的宿主细胞，使得抗体生成；优选地，还包括自宿主细胞回收抗体。
8.一种抗体组合物，其包含权利要求1-3任一项的抗体以及可接受的载体、缓冲液和赋形剂。
9.一种试剂盒，其包含权利要求1-3任一项的抗体，或权利要求8的抗体组合物，任选地，抗体是经过标记的。
10.权利要求1-3任一项的抗体，或权利要求8的抗体组合物，或权利要求9的试剂盒，在选自由以下组成的组中的用途：
a)在医学基础研究中的用途，优选的，可用于Western Blot、免疫组织化学和流式细胞分析；
b)在制备用于医学基础研究的试剂中的用途；
c)用于选择恶性肿瘤治疗方案和判断预后的用途；和
d)在制备用于选择恶性肿瘤治疗方案和判断预后的试剂中的用途。
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