JP2023508277A

JP2023508277A - 新規のｄｄｒ１抗体およびその使用

Info

Publication number: JP2023508277A
Application number: JP2022537312A
Authority: JP
Inventors: ニンヤンジャン; ジーチャンアン; フイデン; シュージエスン; ロンリー
Original assignee: George Washington University
Current assignee: George Washington University
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2023-03-02
Also published as: AU2020407089A1; IL294019A; CN115443150A; CA3160181A1; US20230235078A1; MX2022007353A; EP4076526A1; BR112022011037A2; EP4076526A4; WO2021127185A1; US20230130372A1; AU2020407089B2

Abstract

本開示は、腫瘍ジスコイジンドメイン受容体１（ＤＤＲ１）に結合する抗体、ならびにがんの検出および治療における抗体の使用に関する。したがって、一態様では、本開示は、ＤＤＲ１に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＤＤＲ１に結合すると、ＤＤＲ１の活性を調節する、すなわち、ＤＤＲ１を抑制する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９４９，３００号の優先権の利益を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

政府主催の研究に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＣＡ２２０５７８に基づく政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

配列表の参照
配列表は、明細書と同時にＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして提出され、ファイル名はＰ０３６２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、作成日は２０２０年１２月１７日、サイズは１２７キロバイトである。配列表の電子形式の情報は、明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

１．分野
本開示は、概して、医学、腫瘍学、および免疫学の分野に関する。より具体的には、本開示は、ＤＤＲ１に結合し、乳がんを含むがんを治療することができる抗体に関する。

２．関連技術の記載
腫瘍ジスコイジンドメイン受容体１（ＤＤＲ１）および２（ＤＤＲ２）タンパク質の異常な発現は、乳がんを含む複数の固形がんタイプの進行と関連付けられる（Ｖａｌｉａｔｈａｎｅｔａｌ．，２０１２、Ｒａｍｍａｌｅｔａｌ．，２０１６、Ｇａｏｅｔａｌ．，２０１６、Ｂａｙｅｒｅｔａｌ．，２０１９）。公開されたデータは、腫瘍の進行および転移可能性を促進するためのＤＤＲタンパク質の役割を支持する（Ｇａｏｅｔａｌ．，２０１６、Ｂａｙｅｒｅｔａｌ．，２０１９、Ｈｉｄａｌｇｏ－Ｃａｒｃｅｄｏｅｔａｌ．，２０１１、Ｍａｒｃｏｔｔｅｅｔａｌ．，２０１２）。しかしながら、ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウスにおけるＤｄｒ１の遺伝子切除は、自発的腫瘍形成を促進し（Ｔａｋａｉｅｔａｌ．，２０１８）、がんの発生および進行における段階依存性腫瘍ＤＤＲ１機能を示唆する。

概要
したがって、一態様では、本開示は、ＤＤＲ１に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＤＤＲ１に結合すると、ＤＤＲ１の活性を調節する、すなわち、ＤＤＲ１を抑制する。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＤＤＲ１に結合すると、ＤＤＲ１に対するリガンドの結合を特異的に遮断する。

一態様では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ、表１および表２に記載のクローン対のＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＬ）および重鎖（ＨＣ）可変領域（ＶＨ）、ならびにそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲの１つ以上および／もしくはＨＣ－ＣＤＲの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、マウス抗体、げっ歯類抗体、ウサギ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ、表３および表４のクローン対の配列と少なくとも９０％または９５％同一のアミノ酸配列を有するＶＬおよびＶＨ鎖を有し得る。いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ、表８および表９のクローン対の配列と少なくとも８０％または９０％同一の核酸配列によってコードされているＶＬおよびＶＨ鎖を有し得る。いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ、表３および表４のクローン対の配列と同一のアミノ酸配列を有するＶＬおよびＶＨ鎖を有する。いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ、表８および表９のクローン対の配列と同一の核酸配列によってコードされているＶＬおよびＶＨ鎖を有し得る。

バリアントは、ＨＣ－ＣＤＲまたはＬＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、または３つのアミノ酸の置換、付加、欠失、またはそれらの組み合わせを有するバリアントであってもよい。ある特定の実施形態では、各ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＩＭＧＴ定義、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の組み合わせ、ＡｂＭ定義、またはＣＤＲの接触定義に従って定義される。

別の態様では、本開示は、それぞれ表１および表２からのクローン対の軽鎖および重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を有する抗体と同じエピトープについて競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の単離されたモノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の単離されたモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合断片は、組換えＳｃＦｖ（単鎖可変領域断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはＦｖ断片である。

別の態様では、本明細書に提供される単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物が提供される。

別の態様では、本明細書に提供される単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離された核酸が提供される。

別の態様では、本明細書に提供される単離された核酸を含む、ベクターが提供される。

別の態様では、本明細書に提供されるベクターを含む、宿主細胞が提供される。宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞は、ＣＨＯ細胞であり得る。

別の態様では、本明細書に提供される単離されたモノクローナル抗体をコードまたは産生する、ハイブリドーマが提供される。

別の態様では、抗体を産生する方法が提供される。本方法は、抗体を発現させ、抗体を回収するのに好適な条件下で本明細書に提供される宿主細胞を培養することを含み得る。

別の態様では、本明細書に提供される抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）タンパク質が提供される。

別の態様では、本明細書に提供されるＣＡＲタンパク質をコードする、単離された核酸が提供される。

別の態様では、本明細書に提供される単離された核酸を含む、操作された細胞が提供される。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または骨髄細胞である。別の態様では、対象におけるがんの影響を治療または緩和する方法、または線維症（例えば、臓器線維症）を治療または緩和する方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に定義される抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む、方法が提供される。がんの治療では、本方法は、対象における腫瘍負荷を減少させるかまたは根絶することができ、腫瘍細胞の数を減少させることができ、腫瘍サイズを減少させることができ、対象における腫瘍を根絶することができる。いくつかの実施形態では、治療されるがんは、乳がんである。

抗体またはその抗原結合断片は、局所的に、静脈内に、動脈内に、腫瘍内に、または皮下に投与され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、対象に、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリントポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリン、ダウノルビシン、ヌクレオシド代謝阻害剤、シタラビン、低メチル化剤、低用量シタラビン（ＬＤＡＣ）、ダウノルビシンおよびシタラビンの組み合わせ、注射用のダウノルビシンおよびシタラビンリポソーム、Ｖｙｘｅｏｓ（登録商標）、アザシチジン、Ｖｉｄａｚａ（登録商標）、デシタビン、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ヒ素、三酸化ヒ素、ヒスタミン二塩酸塩、Ｃｅｐｌｅｎｅ（登録商標）、インターロイキン－２、アルデスロイキン、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、ゲツムズマブオゾガマイシン、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、ＦＬＴ－３阻害剤、ミドスタウリン、Ｒｙｄａｐｔ（登録商標）、クロファラビン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、ＩＤＨ１阻害剤、イボシデニブ、Ｔｉｂｓｏｖｏ（登録商標）、ＩＤＨ２阻害剤、エナシデニブ、Ｉｄｈｉｆａ（登録商標）、スムーズンド（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）（ＳＭＯ）阻害剤、グラスデギブ、アルギナーゼ阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、エパカドスタット、ＢＣＬ－２阻害剤、ベネトクラクス、Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（登録商標）、白金複合体誘導体、オキサリプラチン、キナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、イブルチニブ、ＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（登録商標）、アカラブルチニブ、ＣＡＬＱＵＥＮＣＥ（登録商標）、ザヌブルチニブ、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＬＡＧ３抗体、ＩＣＯＳ抗体、ＴＩＧＩＴ抗体、ＴＩＭ３抗体、ＣＤ４０抗体、４－１ＢＢ抗体、ＣＤ４７抗体、ＳＩＲＰ１α抗体または融合タンパク質、Ｅ－セレクチン拮抗剤、腫瘍抗原に結合する抗体、Ｔ細胞表面マーカーに結合する抗体、骨髄細胞またはＮＫ細胞表面マーカーに結合する抗体、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物由来のアルカロイド、ホルモン療法薬、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、およびＰ糖タンパク質阻害剤からなる群から選択される１つ以上の薬物を投与する工程をさらに含む。

いくつかの実施形態では、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、それに連結された抗腫瘍薬物を含み得る。抗腫瘍薬物は、光不安定性リンカーを介して、前述の抗体に連結され得る。抗腫瘍薬物は、酵素的に切断可能なリンカーを介して、前述の抗体に連結され得る。抗腫瘍薬物は、毒素、放射性同位体、サイトカイン、または酵素であり得る。

別の実施形態では、試料または対象におけるがん細胞または線維組織を検出する方法であって、（ａ）対象または対象からの試料を、本明細書に定義される抗体またはその抗原結合断片と接触させることと、（ｂ）前述の対象または試料におけるがん細胞または線維組織に対する前述の抗体の結合を検出することと、を含む方法が提供される。試料は、体液もしくは生検、または血液、骨髄、痰、涙、唾液、粘膜、血清、尿もしくは糞便であり得る。検出は、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、またはウエスタンブロットを含み得る。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）および（ｂ）を再度実行することと、１回目と比較したときの検出レベルの変化を決定することと、をさらに含み得る。単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ペプチドタグ、酵素、磁性粒子、発色団、蛍光分子、化学発光分子、または染料などの標識をさらに含んでもよい。単離されたモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合断片は、リポソームもしくはナノ粒子にコンジュゲートされ得る。

「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において「含む」という用語とともに使用される場合、「１つ」を意味してもよいが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１または１を超える」の意味とも一致してもよい。「約」という単語は、記載された数値のプラスまたはマイナス５％を意味する。

本明細書に記載される任意の方法または組成物が、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して実装され得ることが企図される。本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、本開示の趣旨および範囲内の種々の変更および修正は、この詳細な記載から当業者には明らかになるであろうため、本発明の特定の実施形態を示すが、詳細な記載および特定の実施例は、例示としてのみ与えられることを理解されたい。

図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。
ＤＤＲ１は、免疫担当宿主において乳房腫瘍増殖を付与する。（図１ａ）ＤＤＲ１ＷＴ／ＫＯ乳房腫瘍Ｅ０７７１細胞におけるＤＤＲ１、ＤＤＲ２、およびローディングコントロールＧＡＰＤＨの免疫ブロット。（図１ｂ）ＭＴＴアッセイによって測定したＷＴ／ＫＯＥ０７７１細胞の細胞増殖（ｎ＝６）。（図１ｃ～ｄ）ＤＤＲ１ＷＴ／ＫＯＭ－Ｗｎｔ細胞遊走（ｃ）および侵入（ｄ）の定量化（ｎ＝６ランダムフィールド）。（図１ｅ）Ｒａｇ１^－／－（ｎ＝６、ｅ）宿主におけるＤＤＲ１ＷＴ／ＫＯＥ０７７１腫瘍の成長。（図１ｆ～ｈ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＷＴ／ＫＯＥ０７７１（ｎ＝６、ｆ）、Ｍ－Ｗｎｔ（ｎ＝７、ｇ）およびＡＴ－３（ｎ＝７、ｈ）腫瘍の成長。（図１ｉ～ｊ）Ｒａｇ１^－／－からＣ５７ＢＬ／６宿主（ｎ＝８）に移植したＥ０７７１ＤＤＲ１ＷＴ／ＫＯ腫瘍のエンドポイントにおける腫瘍の成長動態（ｉ）および重量（ｊ）。（図１ｋ）腫瘍再チャレンジについての図。最初のラウンドの接種では、鼠径部の乳腺の片側に対して、生理食塩水緩衝液またはＤＤＲ１ＫＯＥ０７７１細胞を用いて、マウスをチャレンジした。３０日後、鼠径部の乳腺の両側に対して、ＤＤＲ１ＷＴＥ０７７１腫瘍細胞を用いて、マウスを再チャレンジした。Ｌ、左；Ｒ、右。（図１ｌ～ｍ）再チャレンジしたマウス（ｎ＝６）からの腫瘍曲線（図１ｌ）および重量（図１ｍ）。値は、示されるように、平均±ＳＥＭ、ｐ値を表す。ＤＤＲ１は、抗腫瘍免疫細胞浸潤を除外する。（図２ａ）腫瘍の縁部（上部パネル、赤い破線で示される）および腫瘍の中心部（下部パネル）におけるＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞染色の代表的な画像（ｎ＝３）。スケールバー：５０μｍ。（図２ｂ～ｇ）１グラム当たりの腫瘍重量によって正規化された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞の数。ＣＤ８^＋（図２ｂ）およびＣＤ４^＋（図２ｃ）Ｔ細胞、サイトカインＩＦＮ－γ^＋ＣＤ８^＋細胞（図２ｄ）およびＣＤ４^＋（図２ｅ）Ｔ細胞、ならびにＣＤ４４^高ＣＤ６２Ｌ^低活性化ＣＤ８^＋（図２ｆ）およびＣＤ４^＋（図２ｇ）Ｔ細胞の細胞数。（図２ｈ～ｊ）抗ＩｇＧまたは抗ＣＤ８抗体（ｎ＝５）のいずれかの以前の処置を伴う、Ｃ５７ＢＬ／６宿主におけるＷＴ／ＫＯＥ０７７１腫瘍成長。エンドポイントにおける腫瘍の体積（図２ｈ）、画像（図２ｉ）、および重量（図２ｊ）が示される。スケールバー：１ｃｍ。（図２ｋ～ｍ）ＤＤＲ１ＷＴ／ＫＯＥ０７７１腫瘍を負荷したＲａｇ１^－／－（ｎ＝６）マウスへの、ＣＤ８^＋Ｔ細胞または培地（偽）の養子移入。矢印（図２ｋ）は、１７日目のＣＤ８^＋Ｔ細胞の移入を示す。腫瘍の画像（図２ｌ）および重量（図２ｍ）を示す。スケールバー：１ｃｍ。値は、示されるように、平均±ＳＥＭ、ｐ値を表す。ＤＤＲ１依存性ＥＣＭリモデリングは、抗腫瘍免疫浸潤を阻止する。（図３ａ）様々なＤＤＲ１発現ベクター：野生型（ＷＴ）、空ベクター（ＥＶ）、キナーゼドメインの欠失（ΔＫＤ）、および細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のみを有するＤＤＲ１ＫＯＥ０７７１腫瘍細胞の全長ＤＤＲ１の図（上）および腫瘍曲線。ＫＯ群と比較したすべてのｐ値。ＴＭ：膜貫通ドメイン。（図３ｂ）ＤＳおよびＤＳ様（ＤＳＬ）ドメインからなるＥＣＤ図（上）、ならびにＪｍｏｌソフトウェアによって生成されたマウスＤＤＲ１ＤＳドメインの結晶構造（下）。変異解析で標的化されたアミノ酸残基を示す。（図３ｃ）ＥＬＩＳＡ（ｎ＝４）によって評価された、ＫＯＥ０７７１細胞で発現されたＷＴおよび点変異ＥＣＤのコラーゲン結合。（図３ｄ～ｋ）異所的に発現されたＥＣＤＷＴまたは点変異を有するＫＯＥ０７７１腫瘍細胞の個々の腫瘍成長曲線。腫瘍発生率を各パネルについて括弧書きで示した。（図３ｌ）インビトロで培養されたＷＴ／ＫＯＥ０７７１腫瘍細胞の代表的なＳＥＭ画像。（図３ｍ）Ｅ０７７１細胞からの脱細胞化されたＥＣＭは、ＥＣＤ依存的様式でＴ細胞遊走を阻害する。左に示されているのは、トランズウェル遊走アッセイの図である。（図３ｎ）Ｒａｇ１^－／－からＣ５７ＢＬ／６宿主に移植されたＷＴ／ＫＯＥ０７７１腫瘍を、ＳＨＧ（灰色）、ＣＤ３染色（緑色）、Ｔｏ－ｐｒｏ－３染色（赤色）、およびコラーゲン繊維個別化（一番右のパネル）によって分析した。ブロック矢印は、腫瘍の縁部を示す。スケールバー：５０μｍ。（図３ｏ～ｐ）ＣＴＦｉｒｅソフトウェアによる腫瘍繊維アラインメント（ｏ）および繊維長（ｐ）の定量化。値は、示されるように、平均±ＳＥＭ、ｐ値を表す。ＤＤＲ１は、抗腫瘍免疫を増強するための潜在的な治療標的である。（図４ａ）Ｅ０７７１由来細胞の細胞溶解物および培地中の異所性ヒト（ｈｕ）ＤＤＲ１および内因性マウスＤＤＲ１の免疫ブロット。（図４ｂ～ｃ）Ｅ０７７１由来ＤＤＲ１ＷＴ、ＫＯ、ＫＯ＋ｈｕＤＤＲ１細胞（ｎ＝６）の腫瘍の成長曲線（図４ｂ）および重量（図４ｃ）。腫瘍の画像を上に示す。（図４ｄ～ｅ）アイソタイプＩｇＧ（図４ｄ）または抗ｈｕＤＤＲ１抗体＃９（図４ｅ）で処置したＣ５７ＢＬ／６宿主における個々のＫＯ＋ｈｕＤＤＲ１腫瘍の成長曲線。矢印は、抗体投与の開始日を示す。（図４ｆ）アイソタイプＩｇＧおよび抗ｈｕＤＤＲ１処置群の生存曲線。（図４ｇ）ＫＯ＋ｈｕＤＤＲ１腫瘍を、ＳＨＧ（灰色）、ＣＤ３染色（緑色）、Ｔｏ－ｐｒｏ－３染色（赤色）、およびコラーゲン繊維個別化（一番右のパネル）によって分析した。ブロック矢印は、腫瘍の縁部を示す。スケールバー：５０μｍ。（図４ｈ～ｉ）腫瘍繊維パラメータの定量化。繊維アラインメント（係数変動の角度、図４ｈ）、繊維長（図４ｉ）。（図４ｊ）１，０９３個の乳がん患者試料（ＴＩＭＥＲ）におけるｈｕＤＤＲ１ｍＲＮＡと腫瘍浸潤性ＣＤ８^＋Ｔの存在量との間の相関関係。（図４ｋ～ｍ）３７個のＴＮＢＣ患者試料（ＧＳＥ８８８４７）における、ＤＤＲ１ｍＲＮＡレベルと、抗腫瘍免疫マーカーＩＦＮＧ（図４ｋ）、ＣＤ８Ａ（図４ｌ）、およびＧＺＭＢ（図４ｍ）との相関。（図４ｎ）免疫細胞浸潤を防止するためのバリアを形成する、ＥＣＤ（赤丸）再形成コラーゲン繊維（曲線）のモデル図。値は、示されるように、平均±ＳＥＭ、ｐ値を表す。腫瘍ＤＤＲ１切除は、免疫担当宿主における腫瘍成長を阻害する。（図５ａ）ＴＣＧＡデータベースにおける正常（Ｎ）組織および乳房腫瘍（Ｔ）試料におけるＤＤＲ１発現。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を使用してＰ値を解析する。（図５ｂ）マウス乳房腫瘍細胞Ｍ－ＷｎｔおよびＡＴ－３に由来するＷＴ／ＫＯ細胞のＤＤＲ１免疫ブロット。（図５ｃ～ｄ）マウスＤｄｒ１遺伝子座におけるｓｇＲＮＡ標的部位のゲノムＤＮＡ配列決定。ＡＴ－３およびＥ０７７１ＫＯクローンの両方は、１つの塩基対挿入を含有する（図５ｃ）（配列番号：３１２；配列番号：３１３；配列番号：３１４）。Ｍ－ＷｎｔＤＤＲ１ＫＯクローンは、８ｂｐの欠失を有する（図５ｄ）。切断は、ＰＡＭ配列の上流で行われた。（図５ｅ）ＤＤＲ１ＷＴ／ＫＯＭ－ＷｎｔおよびＡＴ－３細胞の遊走および浸潤についての代表的な画像。（配列番号：３１５、配列番号：３１６）。（図５ｆ）ＷＴ／ＫＯＭ－Ｗｎｔ腫瘍細胞のインビトロ細胞増殖。（図５ｇ）ヌードマウス（ｎ＝４）におけるＭ－Ｗｎｔ腫瘍成長。（図５ｈ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに種々の数で接種したＤＤＲ１ＫＯＥ０７７１細胞の個々の腫瘍成長曲線（マウス当たり０．５、５、１０、および２０×１０^６、ｎ＝４）。（図５ｉ～ｋ）接種時のＭ－ＷｎｔＤＤＲ１ＷＴ、ＫＯ、および１：１混合物の腫瘍の体積（図５ｉ）、画像（図５ｊ）、および重量（図５ｋ）（ｎ＝８）。値は、示されるように、平均±ＳＥＭ、ｐ値を表す。ＣＤ８＋細胞の免疫枯渇および養子移入。（図６ａ～ｄ）Ｋｉ６７（図６ａのＣＤ４^＋、および図６ｂのＣＤ８^＋）、ＩＦＮγ（図６ｃのＣＤ８^＋）、またはＧｚｍｂ（図６ｄのＣＤ８^＋）に対して陽性である、ＫＯおよび親コントロールからのＴ細胞の割合。（図６ｅ～ｆ）抗ＩｇＧ２ｂ処置マウスまたは抗ＣＤ８抗体処置Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｅ）の脾細胞からのＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー、ならびに血液中のＣＤ３^＋Ｔ細胞中のＣＤ８^＋の割合（ｆ、ｎ＝５）。（図６ｇ）Ｒａｇ１^－／－マウス（ｎ＝６）における腫瘍重量によって正規化されたＴＩＬにおけるＣＤ８^＋Ｔ細胞数。（図６ｈ～ｉ）Ｒａｇ１^－／－からＣ５７ＢＬ／６宿主に移植されたＤＤＲ１ＷＴ／ＫＯＥ０７７１腫瘍に由来するＴ細胞ホーミング遺伝子およびケモカイン遺伝子についてのＲＮＡ－ｓｅｑヒートマップ。＊＊＊、ｐ＜０．００１。値は、示されるように、平均±ＳＥＭ、ｐ値を表す。ＤＤＲ１媒介性コラーゲンリモデリングは、免疫除外のために必要である。（図７ａ～ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６宿主（ｎ＝１０）におけるＥ０７７１ＤＤＲ１ＫＯ＋ＥＣＤ、ＫＯ、ＫＯ＋ＤＳ、ＫＯ＋ＤＳＬ腫瘍の成長曲線（図７ａ）および腫瘍重量（図７ｂ）。（図７ｃ）Ｉ型コラーゲンおよびＦｌａｇタグ付きＥＣＤＷＴおよび変異体のＣｏ－ＩＰ。（図７ｄ）マウス（左）および種々のヒト（右）乳がん細胞株からの、条件培地中の細胞内の全長ＤＤＲ１および可溶性ＥＣＤの免疫ブロット。（図７ｅ）Ｒａｇ１^－／－からＣ５７ＢＬ／６宿主に移植されたＥ０７７１ＤＤＲ１ＷＴおよびＫＯ腫瘍からのＲＮＡ－ｓｅｑデータの遺伝子オントロジー解析に基づく上位１０位の生物学的プロセス（ＢＰ）。値は、示されるように、平均±ＳＥＭ、ｐ値を表す。ｈｕＤＤＲ１中和抗体のスクリーニング。（図８ａ）内因性ＤＤＲ１ＷＴ、ＤＤＲ１ＫＯ、およびＤＤＲ１ＫＯを含有するＥ０７７１細胞からの条件培地の存在下での精製されたＣＤ８^＋Ｔ細胞についてのトランズウェル遊走アッセイ、ならびにｈｕＤＤＲ１の異所性発現。（図８ｂ）ＫＯまたはＫＯ^＋ｈｕＤＤＲ１Ｅ０７７１細胞からの条件培地を使用するＣＤ８^＋Ｔ細胞遊走アッセイによる代表的な中和抗体スクリーニング。対照：アイソタイプＩｇＧ；抗ｈｕＤＤＲ１抗体：＃３、＃９、＃１４、および＃３３。（図８ｃ）対照（α－ＩｇＧ）および抗ｈｕＤＤＲ１抗体＃９で処置したマウスの体重測定（ｎ＝５）。（図８ｄ～ｅ）アイソタイプＩｇＧまたは抗ｈｕＤＤＲ１＃３３抗体のいずれかで処置したＣ５７ＢＬ／６（図８ｄ）およびＲａｇ１^－／－宿主（図８ｅ）におけるＫＯ＋ｈｕＤＤＲ１Ｅ０７７１腫瘍。（図８ｆ）ＫＯ＋ｈｕＤＤＲ１腫瘍中心部を、ＳＨＧ（灰色）、ＣＤ３染色（緑色）、Ｔｏ－ｐｒｏ－３染色（赤色）、およびコラーゲン繊維個別化（一番右のパネル）によって分析した。スケールバー：５０μｍ。（図８ｇ～ｉ）ＴＩＭＥＲデータベース内の１，０９３個の乳がん腫瘍における、ｈｕＤＤＲ１ｍＲＮＡレベルと、免疫細胞傷害性マーカー遺伝子ＩＦＮＧ（図８ｇ）、ＧＺＭＢ（図８ｈ）、およびＰＲＦ１（図８ｉ）との間の相関。値は、示されるように、平均±ＳＥＭ、ｐ値を表す。ＥＬＩＳＡによって分析された、ＤＤＲ１に対するＤＤＲ１－ｍＡｂの結合。ｔｉｔｒａｔｉｏｎＥＬＩＳＡを使用した、ヒトＤＤＲ１およびマウスＤＤＲ１に対する抗体結合親和性の決定。Ｏｃｔｅｔ機器を用いて測定した抗ＤＤＲ１抗体の動態結合曲線。抗ｈＥＣＤ抗体は、自発的な腫瘍成長を阻害する。様々な段階での乳がん発生に対する抗ＤＤＲ１抗体治療の効果を実証するために、ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統のバックグラウンド）を、平均腫瘍サイズが１００ｍｍ^３に達したときに（「腫瘍後」）、対照ＩｇＧまたは抗ＤＤＲ１抗体で２週間処置した。（図１２Ａ～Ｂ）Ｃｔｒｌ（ｎ＝７）またはヒト化抗ＤＤＲ１＃９抗体（ｎ＝８）で「腫瘍後」スキームにて処置した、Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的バックグラウンドのＭＭＴＶ－ＰｙＭＴ自発的乳腺腫瘍モデルにおける腫瘍成長動態（マウス当たり、図１２Ａ）および腫瘍発生率（マウス当たり、図１２Ｂ）。（図１２Ｃ）ＳＨＧ（灰色）、ＣＤ３染色（緑色）、Ｔｏ－ｐｒｏ－３染色（赤色）、およびコラーゲン繊維個別化（一番右のパネル）によって分析した、腫瘍後処置群からの腫瘍の代表的な画像。スケールバー：５０μｍ。抗ｈＥＣＤ抗体とＤＤＲ１キナーゼ阻害剤の比較。Ｅ０７７１乳腺腫瘍を抗ｈＥＣＤ抗体で治療し、腫瘍成長（図１３Ａ）および宿主体重（図１３Ｂ）を評価した。以前に発表された小分子ＤＤＲ１キナーゼ阻害剤７ｒｈは、腫瘍成長を減少させなかった（図１３Ｃ）。これは、抗腫瘍免疫のＤＤＲ１依存的排除がそのキナーゼ活性から独立しているという主張と一致する。（図１３Ｄ）７ｒｈは宿主の体重に影響を及ぼさなかった。（図１３Ｅ）７ｒｈで処置された腫瘍は、ＤＤＲ１チロシンキナーゼ活性のマーカーであるＤＤＲ１自己リン酸化が実質的に低かった（Ｇａｏｅｔａｌ．，ＪＭｅｄＣｈｅｍ２０１３）。ＤＤＲ１は、いくつかの腫瘍型の成長に必要である。（図１４Ａ）腫瘍Ｄｄｒ１のＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子切除は、ＩＤ８ａｇｇの卵巣腫瘍を有する免疫担当宿主の生存を有意に増加させた。（図１４Ｂ～Ｃ）Ｂ１６黒色腫またはＭＣ３８結腸直腸腫瘍におけるＤｄｒ１ＫＯは、同系免疫担当宿主における腫瘍増殖に影響を及ぼさなかった。ＤＤＲ１および抗腫瘍免疫マーカーの相関。（図１５Ａ）複数のがんにおけるＤＤＲ１ｍＲＮＡレベルは、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）などの細胞傷害性免疫マーカーと負の相関関係にあり、これは、ＤＤＲ１が多くのがんタイプにおいて抗腫瘍免疫を拮抗し得ることを示唆する。ＤＤＲ１および抗腫瘍免疫マーカーの相関。（図１５Ｂ）ＴＣＧＡ乳がんプロテオームデータセット（ＮＣＩＣＰＴＡＣ）の分析は、ＤＤＲ１タンパク質レベルがまた、細胞溶解性エフェクター経路におけるＣＤ８およびタンパク質と負の相関関係を有することを示した。ＤＤＲ１および抗腫瘍免疫マーカーの相関。（図１５Ｃ）ＴＣＧＡ乳がんプロテオームデータセット（ＮＣＩＣＰＴＡＣ）の分析は、ＤＤＲ１タンパク質レベルがまた、細胞溶解性エフェクター経路におけるＣＤ８およびタンパク質と負の相関関係を有することを示した。高腫瘍ＤＤＲ１タンパク質は、ＴＮＢＣにおける免疫と相関する。（左）治療未経験のＤＤＲ１^高（ｎ＝７）およびＤＤＲ１^低（ｎ＝５）ＴＮＢＣ腫瘍試料を使用した、ＤＤＲ１、ＣＤ８、および腫瘍特異的ｐａｎＣＫの多重ＩＨＣの画像。スケールバー：２００ｍｍ。多重ＩＨＣにおける治療未経験のＴＮＢＣコホートを使用して、ＤＤＲ１^高腫瘍は、腫瘍全体に分布するＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージがより高いＤＤＲ１^低腫瘍と比較すると、腫瘍内に存在するＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージがより低いこと、および腫瘍縁部に存在するＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージがより高いことを示す（右）ことが示された。ＨＥＫ２９３細胞における発現のためのＤＤＲ１細胞外（ＥＣＤ）タンパク質のドメインの組換え構築物についての概略図。ＤＳ：Ｎ－末端ジスコイジンドメイン；ＤＳＬ：ＤＳ様ドメイン；ＪＭ：膜近傍ドメイン。ＥＬＩＳＡ法を用いたＥＣＤおよびＤＳまたはＤＳＬドメインへのＤＤＲ１抗体の結合の決定。組換えＤＤＲ１細胞外（ＥＣＤ）タンパク質およびドメインタンパク質を、２μｇ／ｍｌの濃度で高結合９６ウェルプレート上にコーティングした。（図１８Ａ）ＤＤＲ１－９Ｈｕ抗体の滴定を使用して、結合曲線およびＥＣ_５０を決定した。ＤＤＲ１ＥＣＤのＤＳまたはＤＳＬドメインの欠失は、ヒト化ＤＤＲ１－９ｈｕ抗体による結合の減少をもたらした。ＤＳドメイン単独の欠失は、１６８ｎｇ／ｍｌ対８３ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で結合を減少させ、一方、ＤＳＬドメインの欠失は、ＤＤＲ１－９（図１８Ｂ）およびＤＤＲ１－１４抗体結合を完全に廃止した。（図１８Ｃ）図18Aの説明を参照のこと。図18Aの説明を参照のこと。ＥＬＩＳＡ法を使用した、ヒトＤＤＲ２に対するモノクローナル抗体のパネルの交差反応性の決定。ＤＤＲ１またはＤＤＲ２ＥＣＤタンパク質を高結合プレート上にコーティングし、ＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ、ＰＡ）による結合検出のために、１ｕｇ／ｍｌ濃度でモノクローナル抗体の各々を添加した。

例示的な実施形態の説明
本発明者らは、腫瘍ジスコイジンドメイン受容体１（ＤＤＲ１）が宿主免疫の制御に重要な役割を果たすと判断した。ＤＤＲ１は、チロシンキナーゼ活性を有するコラーゲン受容体である。本発明者らは、ＤＤＲ１が、宿主免疫細胞が腫瘍組織に浸潤し、キナーゼ非依存的な方法で腫瘍自体を攻撃するのを防ぐ腫瘍防御を誘導することを見出した。本発明者らは、ＤＤＲ１タンパク質を認識する新規のモノクローナル抗体のパネルを単離しており、これはがんの治療に使用することができる。抗ヒトＤＤＲ１抗体は、ＤＤＲ１機能の拮抗剤であり、ＤＤＲ１の腫瘍防御の誘導を防止する。

本開示の以下の説明は、単に本開示の様々な実施形態を例示することを意図しているにすぎない。したがって、考察される特定の修正は、本開示の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。本開示の範囲から逸脱することなく種々の等価物、変更、および修正が行われ得ることは当業者には明らかであろう。そのような等価な実施形態は本明細書に含まれることが理解される。刊行物、特許、および特許出願を含む本明細書で引用されるすべての参照文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Ｉ．定義
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的および説明的なものにすぎず、特許請求される本発明を限定するものではないことを理解されたい。本出願では、特に断りのない限り、単数形の使用は、複数形を含む。本出願では、「または」の使用は、別段明記されない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的ではない。また、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」などの用語は、別段明記されない限り、１つのユニットを含む要素および構成要素、ならびに１つを超えるサブユニットを含む要素および構成要素の両方を包含する。また、「部分」という用語の使用は、部分の一部または部分全体を含むことができる。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により明確に他のことが指示されない限り、複数への参照を含む。

量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、本明細書で使用される「約」という用語は、指定された値からの最大±１０％の変動を包含することを意味する。特に指示しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分、分子量などの特性、反応条件などの量を表すすべての数字は、すべての場合で、「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、開示される主題によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、かつ、等価物の見解の適用を特許請求の範囲に限定しようとするものではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告された有意な桁の数に照らし合わせて、かつ通常の四捨五入技法を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメータは、近似値であるにもかかわらず、特定の例において記載される数値は、できる限り正確に報告される。しかしながら、あらゆる数値は、それらのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に得られる特定の誤差を本質的に含有する。

「抗体」という用語は、任意のアイソタイプの無傷の免疫グロブリン、または標的抗原への特異的結合について無傷の抗体と競合することができるそれらの断片を指し、例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト、および二重特異性抗体を含む。「抗体」は、抗原結合タンパク質の類である。無傷の抗体は、概して、少なくとも２本の全長重鎖および２本の全長軽鎖を含むが、場合によっては、重鎖のみを含むことができるラクダ科に天然に存在する抗体などのように、より少ない鎖を含むことができる。抗体は、単一の供給源のみに由来することができるか、または「キメラ」であることができ、すなわち、抗体の異なる部分は、以下でさらに説明するように、２つの異なる抗体に由来することができる。抗原結合タンパク質、抗体、または結合断片は、ハイブリドーマでは、組換えＤＮＡ技法によって、または無傷な抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生され得る。別途示されない限り、「抗体」という用語は、２本の全長重鎖および２本の全長軽鎖を含む抗体に加えて、それらの誘導体、バリアント、断片およびムテインを含み、それらの例は以下に記載される。さらに、明示的に除外されない限り、抗体には、それぞれ、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣物」と呼ばれることがある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書では「抗体コンジュゲート」と呼ばれることがある）、およびそれらの断片が含まれる。いくつかの実施形態では、この用語はまた、ペプチボディを包含する。

天然に存在する抗体構造単位は、典型的には四量体を含む。このような四量体の各々は、典型的には、２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、１本の全長「軽」鎖（特定の実施形態では、約２５ｋＤａ）と、１本の全長「重」鎖（特定の実施形態では、約５０～７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識に関与する約１００～１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能に関与し得る定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、典型的には、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むがこれらに限定されないサブクラスを有する。ＩｇＡは同様に、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないサブクラスに細分化される。全長の軽鎖および重鎖内では、典型的には、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄｅｄ．ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい（参照によりそのすべてがすべての目的のためのに組み込まれる）。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の軽鎖および／または重鎖の一部分を指し、典型的には、重鎖中のアミノ末端およそ１２０～１３０のアミノ酸および軽鎖中の約１００～１１０のアミノ末端のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、異なる抗体の可変領域は、同じ種の抗体間でもアミノ酸配列が広範囲に異なる。抗体の可変領域は、典型的には、その標的に対する特定の抗体の特異性を決定する。

可変領域は、典型的には、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的な構造を示す。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列され、これにより、特定のエピトープへの結合を可能にすることができる。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、典型的には、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４のドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、典型的には、ＫａｂａｔＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７ａｎｄ１９９１）），Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）またはＣｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７８－８８３（１９８９）の定義に従う。

ある特定の実施形態では、抗体重鎖は、抗体軽鎖の不在下で抗原に結合する。ある特定の実施形態では、抗体軽鎖は、抗体重鎖の不在下で抗原に結合する。ある特定の実施形態では、抗体結合領域は、抗体軽鎖の不在下で抗原に結合する。ある特定の実施形態では、抗体結合領域は、抗体重鎖の不在下で抗原に結合する。ある特定の実施形態では、個々の可変領域は、他の可変領域の不在下で抗原に特異的に結合する。

ある特定の実施形態では、ＣＤＲの確定的な説明および抗体の結合部位を含む残基の同定は、抗体の構造を解明することおよび／または抗体－リガンド複合体の構造を解明することによって達成される。ある特定の実施形態では、これは、Ｘ線結晶学などの、当業者に既知の様々な技術のうちのいずれかによって達成され得る。ある特定の実施形態では、様々な分析方法を用いて、ＣＤＲ領域を特定または概算することができる。そのような方法の例には、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、ＩＭＧＴ定義、および接触の定義が含まれるが、これらに限定されない。

Ｋａｂａｔ定義は、抗体中の残基を番号付けするための標準であり、典型的には、ＣＤＲ領域を特定するために使用される。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２８：２１４－８（２０００）を参照されたい。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、Ｋａｂａｔ定義と類似しているが、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、特定の構造的ループ領域の位置を考慮している。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－１７（１９８６）、Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８３（１９８９）を参照されたい。ＡｂＭの定義は、抗体構造をモデル化する、ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒｏｕｐによって生成された統合された一揃いのコンピュータプログラムを使用する。例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ（ＵＳＡ），８６：９２６８－９２７２（１９８９）、“ＡｂＭ（商標），ＡＣｏｍｐｕｔｅｒＰｒｏｇｒａｍｆｏｒＭｏｄｅｌｉｎｇＶａｒｉａｂｌｅＲｅｇｉｏｎｓｏｆＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ、ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄ．ＴｈｅＡｂＭｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｍｏｄｅｌｓｔｈｅｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｎａｎｔｉｂｏｄｙｆｒｏｍｐｒｉｍａｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅｕｓｉｎｇａｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｋｎｏｗｌｅｄｇｅｄａｔａｂａｓｅｓａｎｄａｂｉｎｉｔｉｏｍｅｔｈｏｄｓ，ｓｕｃｈａｓｔｈｏｓｅｄｅｓｃｒｉｂｅｄｂｙＳａｍｕｄｒａｌａｅｔａｌ．，“ＡｂＩｎｉｔｉｏＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎＵｓｉｎｇａＣｏｍｂｉｎｅｄＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，”ｉｎＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓＳｕｐｐｌ．，３：１９４－１９８（１９９９）を参照されたい。接触の定義は、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく。例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：７３２－４５（１９９６）を参照されたい。ＩＭＧＴ定義は、ＬｅｆｒａｎｃＭ－Ｐｅｔａｌ．，“ＩＭＧＴｕｎｉｑｕｅｎｕｍｂｅｒｉｎｇｆｏｒｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎａｎｄＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｓａｎｄＩｇｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙＶ－ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎｓ，”ＤｅｖＣｏｍｐＩｍｍｕｎｏｌ２７：５５－７７（２００３）によって記載されているように、フレームワーク（ＦＲ）およびＣＤＲ領域の定義、Ｘ線回折研究からの構造データ、および超可変ループの特徴付けを組み合わせる、独特の番号付けシステムを利用する。好ましい一実施形態では、ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ定義に基づく。

慣例により、重鎖中のＣＤＲ領域は、典型的には、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端までの方向に順次番号付けされる。軽鎖中のＣＤＲ領域は、典型的には、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端までの方向に順次番号付けされる。本開示では、軽鎖可変領域のＣＤＲ領域は、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３としても示され、重鎖可変領域のＣＤＲ領域は、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３として示される。

「軽鎖」という用語は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する全長軽鎖およびその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメイン、ＶＬ、および定常領域ドメイン、ＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖としては、カッパ鎖およびラムダ鎖が挙げられる。

「重鎖」という用語は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する全長重鎖およびその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメイン、ＶＨ、および３つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ＣＨ３はポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ、およびＩｇＥを含む任意のアイソタイプであり得る。

二重特異性または二機能性抗体は、典型的には、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含むがこれらに限定されない様々な方法によって産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５－３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７－１５５３（１９９２）を参照されたい。

「抗原」という用語は、適応免疫応答を誘導することができる物質を指す。具体的には、抗原とは、適応免疫応答の受容体の標的となる物質である。典型的には、抗原は、抗原特異的受容体に結合するが、それ自体で体内で免疫応答を誘導することができない分子である。抗原は通常、タンパク質や多糖であるが、頻度はより低いが、脂質であることもある。好適な抗原としては、細菌の一部（コート、カプセル、細胞壁、鞭毛、線毛、および毒素）、ウイルス、および他の微生物が挙げられるが、これらに限定されない。抗原には、腫瘍抗原、例えば、腫瘍における突然変異によって生成される抗原も含まれる。本明細書で使用される場合、抗原はまた、免疫原およびハプテンを含む。

「抗原結合タンパク質」（「ＡＢＰ」）という用語は、本明細書で使用される場合、特定の標的抗原に結合する任意のタンパク質を意味する。本出願では、特定の標的抗原は、ＤＤＲ１タンパク質またはその断片である。「抗原結合タンパク質」は、限定されないが、抗体およびその抗原結合断片を含む。ペプチボディは、抗原結合タンパク質の別の例である。

「抗原結合断片」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合することができるタンパク質の一部を指す。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、１つ以上のＣＤＲを含む抗体、または抗原に結合するが、無傷の天然抗体構造を含まない任意の他の抗体断片に由来する。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、抗体に由来するものではなく、むしろ受容体に由来するものである。抗原結合断片の例としては、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、多重特異性抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ラクダ抗体、またはナノボディ、ドメイン抗体、および二価ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合することができる。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、１つ以上の異なるヒト抗体からフレームワーク領域にグラフトされた特定のヒト抗体からの１つ以上のＣＤＲを含み得る。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、受容体に由来し、１つ以上の突然変異を含有する。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、抗原結合断片が由来する受容体の天然リガンドには結合しない。

「Ｆａｂ断片」という用語は、１つの軽鎖と、１つの重鎖のＣＨ１および可変領域とを含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。

「Ｆａｂ’断片」という用語は、１つの軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン、ならびにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域を含有する１つの重鎖の一部とを含み、これにより、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されて、Ｆ（ａｂ’）_２分子を形成することができる。

「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、２つの軽鎖と、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含有する２つの重鎖と、を含有する。したがって、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ’断片からなる。

「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって一緒に保持される。

「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。

「単鎖抗体」は、重鎖および軽鎖可変領域が可撓性リンカーによって連結されて、抗原結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成するＦｖ分子である。単鎖抗体は、国際特許出願公開第８８／０１６４９号、ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号に詳細に記載されており、これらの開示は、参照により組み入れられる。

「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫機能性免疫グロブリン断片である。いくつかの例では、２つ以上のＶＨ領域は、ペプチドリンカーと共有結合して、二価ドメイン抗体を作製する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同じまたは異なる抗原を標的にすることができる。

「二価抗原結合タンパク質」または「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの場合では、２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。二価抗原結合タンパク質および二価抗体は、二重特異性であり得る（下記参照）。ある特定の実施形態では、「多重特異性」または「多機能性」抗体以外の二価抗体は、典型的には、その結合部位のそれぞれが同一であると理解される。

「多重特異性抗原結合タンパク質」または「多重特異性抗体」は、複数の抗原またはエピトープを標的とするものである。

「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異性（ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「二機能性」抗原結合タンパク質または抗体は、それぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。二重特異性抗原結合タンパク質および抗体は、多重特異性抗原結合タンパク質抗体の類であり、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含むがこれらに限定されない様々な方法によって産生され得る。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉａｎｄＬａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－１５５３を参照されたい。二重特異性抗原結合タンパク質または抗体の２つの結合部位は、同じまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。

「結合親和性」は、概して、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹについての親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で知られる一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般に、抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で既知であり、それらのいずれも本発明の目的のために使用することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｖｅ）かつ例示的（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）な実施形態は、以下に記載される。

特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」または「それに特異的である」抗体は、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する抗体である。例えば、本発明のＤＤＲ１特異的抗体は、ＤＤＲ１に特異的である。いくつかの実施形態では、ＤＤＲ１に結合する抗体は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。

同じエピトープについて競合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）の文脈で使用される場合、「競合する」という用語は、試験される抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）が共通の抗原（例えば、ＤＤＲ１またはその断片）に対する参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）の特異的結合を防止または阻害する（例えば、減少させる）アッセイによって決定される抗原結合タンパク質間の競合を意味する。様々な種類の競合的結合アッセイを用いて、１つの抗原結合タンパク質が他に競合しているかどうかを決定することができ、例えば、固相直接または間接放射免疫測定法（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉｅｔａｌ．，１９８３，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ９：２４２－２５３を参照されたい）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄｅｔａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４－３６１９を参照されたい）固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓを参照されたい）、１－１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌｅｔａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７－１５を参照されたい）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６：５４６－５５２を参照されたい）、および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒｅｔａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７－８２）が挙げられる。典型的には、このようなアッセイは、これら、非標識試験抗原結合タンパク質および標識参照抗原結合タンパク質のいずれかを有する固体表面または細胞に結合した精製された抗原の使用を伴う。競合阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は、過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質（競合抗原結合タンパク質）は、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質、および立体障害が生じるために参照抗原結合タンパク質によって結合されるエピトープに十分に近接した隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質を含む。競合結合を決定する方法に関するさらなる詳細が、本明細書の実施例に提供される。通常、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、それは、参照抗原結合タンパク質の共通抗原への特異的結合を少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、または７５％以上阻害する（例えば、減少させる）。場合によっては、結合は少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、または９７％以上阻害される。

「エピトープ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体が結合する抗原上の原子またはアミノ酸の特定の基を指す。エピトープは、直鎖状エピトープまたは立体構造エピトープのいずれかであり得る。直鎖状エピトープは、抗原由来のアミノ酸の連続的な配列によって形成され、その一次構造に基づいて抗体と相互作用する。一方、立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続な断片から構成され、抗原の３Ｄ構造に基づいて抗体と相互作用する。一般に、エピトープは、およそ５または６アミノ酸長である。２つの抗体は、抗原に対して競合的な結合を示す場合、抗原内の同じエピトープに結合し得る。

「細胞」は、本明細書で使用される場合、原核生物であっても真核生物であってもよい。原核細胞は、例えば、細菌を含む。真核細胞は、例えば、真菌、植物細胞、および動物細胞を含む。動物細胞（例えば、哺乳動物細胞またはヒト細胞）の型としては、例えば、循環系／免疫系または器官からの細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞、顆粒球（例えば、好塩基球、好酸球、好中球、および過分葉した好中球）、単球またはマクロファージ、赤血球（例えば、網赤血球）、肥満細胞、血小板または巨核球、および樹状細胞；内分泌系または臓器からの細胞、例えば、甲状腺細胞（例えば、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞）、副甲状腺細胞（例えば、上皮小体主細胞、好酸性細胞）、副腎細胞（例えば、クロム親和性細胞）、および松果体の細胞（例えば、松果体細胞）；神経系または臓器からの細胞、例えば、グリオブラスト（例えば、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト）、ミクログリア、大細胞神経内分泌細胞、星状細胞、ベッチェル細胞、および下垂体細胞（例えば、性腺刺激ホルモン分泌細胞、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン分泌細胞、成長ホルモン分泌細胞、および乳腺刺激ホルモン分泌細胞）；呼吸器系または臓器からの細胞、例えば、肺細胞（Ｉ型肺細胞およびＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、ゴブレット細胞、ならびに肺胞マクロファージ；循環系または臓器からの細胞（例えば、心筋細胞および周辺細胞）；消化器系または臓器からの細胞、例えば、胃主細胞、壁細胞、ゴブレット細胞、パネート細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、Ｉ細胞、Ｋ細胞、Ｓ細胞、腸内分泌細胞、腸クロム親和性細胞、ＡＰＵＤ細胞、および肝細胞（例えば、肝細胞、およびクッパ－細胞）；外皮系または臓器からの細胞、例えば、骨細胞（例えば、骨芽細胞、骨細胞、および破骨細胞）、歯の細胞（例えば、セメント芽細胞、およびエナメル芽細胞）、軟骨細胞（例えば、軟骨芽細胞および軟骨細胞）、皮膚／髪の細胞（例えば、毛母細胞、ケラチノサイト、およびメラノサイト（母斑細胞）、筋肉の細胞（例えば、筋細胞）、脂肪細胞、線維芽細胞、および腱細胞；泌尿器系または臓器からの細胞（例えば、有足細胞、傍糸球体細胞、糸球体内メサンギウム細胞、糸球体外メサンギウム細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、および緻密斑細胞）、ならびに生殖系または臓器からの細胞（例えば、精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵子、卵母細胞）が挙げられる。細胞は、正常で健康な細胞、または罹患した細胞もしくは不健康な細胞（例えば、がん細胞）であってもよい。細胞は、哺乳動物接合細胞、または胚性幹細胞、胎児幹細胞、誘導多能性幹細胞、および成体幹細胞を含む幹細胞をさらに含む。幹細胞は、未分化状態を維持しながら細胞分裂のサイクルを経て、特殊な細胞型に分化することができる細胞である。幹細胞は、全能性幹細胞、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、寡能性幹細胞、および単能性幹細胞であってもよく、いずれも体細胞から誘導され得る。幹細胞はまた、がん幹細胞を含み得る。哺乳動物細胞は、げっ歯類細胞、例えば、マウス、ラット、ハムスター細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、ウサギ目の細胞、例えば、ウサギ細胞であり得る。哺乳動物細胞はまた、霊長類の細胞、例えば、ヒト細胞であり得る。

本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を活性化するドメインまたはシグナル伝達、例えば、Ｔ細胞シグナル伝達またはＴ細胞活性化ドメインに結合した抗体の抗原結合部位（例えば、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ））を含有する人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドを指す（例えば、Ｋｅｒｓｈａｗｅｔａｌ．，上記、Ｅｓｈｈａｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（２）：７２０－７２４（１９９３）、およびＳａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（２）：２１５－２２３（２００９）を参照されたい）。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、ＭＨＣ拘束性ではない様式で、免疫細胞特異性および反応性を選択された標的にリダイレクトすることができる。ＭＨＣ拘束性ではない抗原認識は、ＣＡＲを発現する免疫細胞に、抗原処理に依存することなく抗原を認識する能力を付与し、したがって、腫瘍エスケープの主要なメカニズムを迂回する。加えて、Ｔ細胞で発現される場合、ＣＡＲは、有利には、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファおよびベータ鎖と二量体化しない。

本明細書で使用される場合、特定の成分に関して「本質的に含有していない」は、特定の成分のいずれもが、組成物に意図的に製剤化されていないこと、かつ／または汚染物質としてのみまたは微量で存在することを意味するために本明細書で使用される。したがって、組成物の任意の意図しない汚染から生じる特定の成分の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％を下回る。最も好ましいのは、標準的な分析方法を用いて特定の成分の存在を検出することができない組成物である。

「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換したか、または形質転換することが可能であり、それによって目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、目的の遺伝子が存在する限り、子孫が元の親細胞と形態的または遺伝的構成において同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫を含む。

「同一性」という用語は、配列を整列および比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列の間の関係を指す。「同一性パーセント」とは、比較される分子中のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一の残基のパーセントを意味し、比較される分子のうちの最小のサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、アラインメントのギャップ（ある場合）は、好ましくは、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によってアドレス指定される。整列された核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法には、ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、ＢｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ，ＰａｒｔＩ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ：ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｍ．ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ、およびＣａｒｉｌｌｏｅｔａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭＪ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．４８：１０７３に記載されたものを含む。

同一性パーセントを計算する際、比較される配列は、典型的には、配列間で最大の一致をもたらす方法で整列される。同一性パーセントを決定するために使用することができるコンピュータプログラムの１つの例は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１２：３８７、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）。コンピュータアルゴリズムのＧＡＰは、配列同一性パーセントが決定される２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを整列させるために使用される。配列は、それぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適なマッチングのために整列される（アルゴリズムによって決定される「マッチングされたスパン」）。ギャップ開始ペナルティ（平均対角線の３倍として計算され、ここで、「平均対角線」は、使用される比較行列の対角線の平均であり、「対角線」は、特定の比較行列によって完全なアミノ酸一致の各々に割り当てられたスコアまたは数値である）、およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較行列が、アルゴリズムと併用される。ある特定の実施形態では、標準的な比較行列もアルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆｅｔａｌ．，１９７８，ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ５：３４５－３５２ｆｏｒｔｈｅＰＡＭ２５０ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｍａｔｒｉｘ、Ｈｅｎｉｋｏｆｆｅｔａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９ｆｏｒｔｈｅＢＬＯＳＵＭ６２ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｍａｔｒｉｘを参照されたい）。

ＧＡＰプログラムを使用してポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するために用いることができるパラメータの例は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎｅｔａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３に見出すことができる。

２つのアミノ酸配列を整列するためのある特定のアラインメントスキームは、２つの配列の短い領域のみのマッチングをもたらす可能性があり、この整列された小さな領域は、２つの全長配列間に有意な関係がないにもかかわらず、非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、選択されたアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、そのようにして、標的ポリペプチドの少なくとも５０個または他の数の連続アミノ酸にわたるアラインメントをもたらすように所望される場合に調整することができる。

本明細書で使用される「結合」という用語は、分子内相互作用、例えば、共有結合、金属結合、および／またはイオン結合、または分子間相互作用、例えば、水素結合または非共有結合を介した会合を指す。

「動作可能に連結された」という用語は、そのように記述された構成要素がそれらの通常の機能を実行するように構成される要素の配置を指す。したがって、ポリペプチドに動作可能に連結された所与のシグナルペプチドは、細胞からのポリペプチドの分泌を指示する。プロモーターの場合、コード配列に動作可能に連結されたプロモーターは、コード配列の発現を指示する。プロモーターまたは他の制御エレメントは、それらがその発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。例えば、介在する未翻訳であるが転写された配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は依然としてコード配列に「動作可能に連結されている」とみなされ得る。

特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替案のみを指すように明示的に示されない限り、または代替案が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替案および「および／または」のみを指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のもの、またはそれ以上を意味し得る。

「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、単鎖および二本鎖ヌクレオチドポリマーの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態であり得る。前述の修飾には、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体等の塩基修飾、２’，３’－ジデオキシリボース等のリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデートおよびホスホロアミデート等のヌクレオチド間連結修飾が含まれる。

「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する高分子、すなわち、天然に存在する非組換え細胞によって産生されるタンパク質を意味し、またはそれは、遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞によって産生され、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有する分子を含む。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸およびポリマーの化学的類似体であるアミノ酸ポリマーも含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、抗原結合タンパク質の１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換を有するＤＤＲ１抗原結合タンパク質、抗体、または配列を具体的に包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、全長天然タンパク質と比較して、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失を有するポリペプチドを指す。かかる断片はまた、天然タンパク質と比較して、修飾されたアミノ酸を含有することができる。ある特定の実施形態では、断片は、約５～５００アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であり得る。有用なポリペプチド断片は、結合ドメインを含む抗体の免疫機能性断片を含む。ＤＤＲ１結合抗体の場合、有用な断片としては、ＣＤＲ領域、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部分、または２つのＣＤＲを含むその可変領域だけなどが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明において有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（１９７５）は、本明細書に開示される融合タンパク質の薬学的送達に好適な組成物および製剤を記載している。概して、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射可能な流体を含む。固形組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、またはカプセル形態）については、従来の非毒性固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトは、出生前および出生後の形態を含む。多くの実施形態では、対象は、ヒトである。対象は、疾患の診断または治療のために医療サービス提供者に提示されたヒトを指す患者であり得る。「対象」という用語は、本明細書では、「個体」または「患者」と同義で使用される。対象は、疾患もしくは障害に罹患しているか、または疾患もしくは障害に感受性があり得るが、それらの症状を示してもよいし、示さなくてもよい。

本明細書で使用されるとき、「治療有効量」または「有効用量」という用語は、疾患または状態を治療するのに有効な薬物の投薬量または濃度を指す。例えば、がんを治療するための本明細書に開示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用に関して、治療有効量とは、腫瘍体積を減少させるか、腫瘍のすべてもしくは一部を根絶するか、腫瘍増殖もしくは他の臓器へのがん細胞浸潤を阻害するかもしくは遅延させるか、がん状態を媒介する細胞の成長もしくは増殖を阻害するか、腫瘍細胞転移を阻害するかもしくは遅延させるか、腫瘍もしくはがん状態に関連する任意の症状もしくはマーカーを改善するか、腫瘍もしくはがん状態の発症を予防するかもしくは遅延させることができるか、またはそれらのいくつかの組み合わせを可能とする、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の投薬量または濃度である。

本明細書で使用される状態の「治療」または「処置」は、状態を予防もしくは緩和すること、状態の発症もしくは発症速度を緩和すること、状態を発症する危険性を減少させること、状態に関連する症状の発症を予防するかもしくは遅延させること、状態に関連する症状を減少させるかもしくは終了すること、状態の完全または部分的な退縮を生み出すこと、状態を治癒すること、またはそれらのいくつかの組み合わせを含む。

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞に導入され、それによって形質転換された宿主細胞を産生する核酸分子を指す。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、１つ以上の治療遺伝子および／または選択可能なマーカー遺伝子および当該技術分野で知られている他の遺伝子要素を含み得る。ベクターは、細胞を形質導入、形質転換、または感染させることができ、それにより、細胞は、細胞に天然のもの以外の核酸および／またはタンパク質を発現させる。ベクターは、任意選択で、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティング等の、細胞内への核酸の侵入の達成を補助する材料を含む。

ＩＩ．ＤＤＲ１およびＤＤＲ１抗体
Ａ．ＤＤＲ１
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、細胞とその微小環境とのコミュニケーションにおいて重要な役割を果たす。これらの分子は、細胞成長、分化、および代謝の調節に関与している。ＤＤＲ１遺伝子によってコードされるＤＤＲ１タンパク質は、正常上皮細胞および形質転換された上皮細胞において広範に発現され、様々なタイプのコラーゲンによって活性化されるＲＴＫである。ＤＤＲ１タンパク質は、その細胞外ドメイン内にキイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）のタンパク質ジスコイジンＩに対して相同な領域を有するチロシンキナーゼ受容体のサブファミリーに属する。その自己リン酸化は、これまでに試験されたすべてのコラーゲン（Ｉ型～ＶＩ型）によって達成される。密接に関連するファミリーメンバーは、ＤＤＲ２タンパク質である。Ｉｎｓｉｔｕ研究およびノーザンブロット分析は、ＤＤＲ１にコードされたタンパク質の発現が、上皮細胞、特に、腎臓、肺、消化管、および脳において限定されることを示した。加えて、ＤＤＲ１タンパク質は、乳房、卵巣、食道、および小児の脳からのいくつかのヒト腫瘍において有意に過剰発現される。この遺伝子は、いくつかのＨＬＡクラスＩ遺伝子に近接して染色体６ｐ２１．３上に位置する。この遺伝子の代替的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。ＤＤＲ１の代表的なｍＲＮＡ配列は、ＮＭ＿００１２０２５２１（配列番号：１）であり、代表的なアミノ酸配列は、ＮＰ＿００１１８９４５０（配列番号：２）である。

Ｂ．ＤＤＲ１タンパク質に対する抗体
本開示による抗体またはその抗原結合断片は、まず、この場合では、ＤＤＲ１に対するそれらの結合特異性によって定義され得る。当業者は、当業者に周知の技術を使用して所与の抗体の結合特異性／親和性を評価することによって、かかる抗体が本特許請求の範囲内に含まれるかどうかを決定することができる。

一態様では、ＤＤＲ１に特異的に結合する抗体および抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態では、ＤＤＲ１に結合した場合、そのような抗体は、ＤＤＲ１の活性化を調節する。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＤＤＲ１に結合すると、ＤＤＲ１を活性化する。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＤＤＲ１に結合すると、ＤＤＲ１の活性化を抑制する。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＤＤＲ１に結合すると、ＤＤＲ１とその結合パートナーとの間の相互作用を特異的に妨害するか、遮断するか、または減少させることができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供する抗体または抗原結合断片は、ヒトＤＤＲ１に特異的または選択的に結合する。

いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ヒトＤＤＲ１に特異的に結合し、および／またはヒトＤＤＲ１のその結合パートナーへの結合を少なくとも約２０％～４０％、４０～６０％、６０～８０％、８０～８５％、またはそれ以上（例えば、実施例に開示されるアッセイによって）実質的に阻害する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、１０^－７、１０^－８、１０^－９、１０^－１０、１０^－１１、１０^－１２、１０^－１３Ｍよりも少ない（より緊密に結合する）Ｋｄを有する。

本開示の抗体は、ＩｇＧとして生成されたが、定常領域を修飾してそれらの機能を変化させることが有用であり得る。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、抗体の宿主組織または因子への結合を媒介する。したがって、「抗体」という用語は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭの種類の無傷の免疫グロブリン（ならびにそれらのサブタイプ）を含み、免疫グロブリンの軽鎖は、カッパまたはラムダの類であり得る。軽鎖および重鎖内では、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的には、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＣｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２^ｎｄｅｄ．ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体は、表３に示される軽鎖可変領域配列中のＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３、ならびに表４に示される重鎖可変領域配列中のＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３を含むか、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくは組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、表３に示される軽鎖可変領域配列中のＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３、ならびに表４に示される重鎖可変領域配列中のＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３を含むか、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくは組み合わせを有するバリアントを含み、ここで、軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列は、それぞれ、表３および表４に示される（例えば、同じｍＡｂ指定の）クローン対の軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列である。軽鎖可変領域配列の「クローン対の」ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３、ならびに重鎖可変領域配列のＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３の例示的な実施形態は、それぞれ、ｍＡｂＤＤＲ１－１の軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列のＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲである。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、表１に示される各ｍＡｂについてのＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３配列から選択されるＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびに表２に示される各ｍＡｂについてのＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３配列から選択されるＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくは組み合わせを有するバリアントを含む。いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ表１および表２に示されるクローン対のＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲの、ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくは組み合わせを有するバリアントを含む。

（表１）ＤＤＲ１抗体の軽鎖アミノ酸可変領域配列のＣＤＲ

（表２）ＤＤＲ１抗体の重鎖アミノ酸可変領域配列のＣＤＲ

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＮＩＹＳＮ（配列番号：３）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＳＧＹＹＳＳＳＴＤＩＡ（配列番号：４）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＳＬＳＲＹＡ（配列番号：４５）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＧＳＳＧＬＴ（配列番号：４６）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＧＭＷＹＤＤＳＤＤＹＥＤＹＦＮＬ（配列番号：４７）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－１）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＴＩＳＳＷ（配列番号：５）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＡＦを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＧＩＳＳＳＮＶＤＮＶ（配列番号：６）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＩＤＬＳＳＹＡ（配列番号：４８）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＩＧＧＧＴ（配列番号：４９）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＤＶＤＡＨＴＬＴＹＦＴＬ（配列番号：５０）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－３）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＴＩＳＳＷ（配列番号：７）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＡＦを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＣＴＹＧＳＧＳＳＳＳＹＧＣＡ（配列番号：８）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＴＬＳＮＮＡ（配列番号：５１）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＹＡＳＧＲＴ（配列番号：５２）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＧＤＴＥＴＤＹＧＩＰＹＦＤＬ（配列番号：５３）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－５）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＳＶＹＳＮＹ（配列番号：９）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＴＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＧＧＹＳＥＩＩＥＮＴ（配列番号：１０）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＳＦＳＳＳＹＹ（配列番号：５４）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＹＡＳＳＧＳＴ（配列番号：５５）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＩＬＧＡＤＹＲＬＴＲＬＤＬ（配列番号：５６）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－６）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＳＩＧＳＶ（配列番号：１１）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＶＦを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＹＩＰＹＧＳＳＰ（配列番号：１２）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＳＬＮＲＹＹ（配列番号：５７）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＳＹＧＤＴＴ（配列番号：５８）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＡＤＴＧＤＮＧＹＬＧＬＱＬ（配列番号：５９）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－９）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくは組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＳＩＧＳＴＹ（配列番号：１３）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＫＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＬＹＧＧＦＧＳＳＴＧＤＡ（配列番号：１４）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＳＦＳＳＧＹＹ（配列番号：６０）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＹＴＧＲＴＤＦＴ（配列番号：６１）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＧＤＹＳＧＧＶＧＧＮＹＷＬＤＬ（配列番号：６２）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－１１）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＴＩＹＳＮ（配列番号：１５）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＱＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＳＹＹＧＡＤＤＹＴ（配列番号：１６）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＩＤＬＳＮＴＷ（配列番号：６３）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＴＤＳＧＴＴ（配列番号：６４）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＧＲＤＰＧＤＩＴＳＧＴＮＤＬ（配列番号：６５）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－１２）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＫＳＶＹＮＮＮＡ（配列番号：１７）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＶＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＧＤＹＳＤＩＳＤＮＮ（配列番号：１８）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＳＧＦＳＬＮＮＹ（配列番号：６６）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＦＮＮＧＤＩ（配列番号：６７）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＴＧＹＲＴＧＧＷＬ（配列番号：６８）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－１３）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（配列番号：１９）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＮＮＮＧＦＳＧＳＮＦＮＮ（配列番号：２０）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＩＤＬＳＹＹＡ（配列番号：６９）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＧＲＧＤＴ（配列番号：７０）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＥＤＳＡＩＰＦＩＶＧＮＹＹＧＭＤＬ（配列番号：７１）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－１４）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＴＩＹＳＳ（配列番号：２１）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＫＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＧＳＳＩＳＮＶＤＫＮＡ（配列番号：２２）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＴＦＳＦＮＳＲＹＷ（配列番号：７２）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＮＧＤＩＳ（配列番号：７３）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＫＧＧＮＬＡＧＤＣＹＧＬ（配列番号：７４）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－１５）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＳＩＧＳＹ（配列番号：２３）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＮＮＮＧＭＴＶＳＤＦＮＡ（配列番号：２４）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＳＬＮＲＹＡ（配列番号：７５）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＧＳＳＧＳＴ（配列番号：７６）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＤＬＤＤＳＹＧＹＴＹＡＴＧＭＤＩＲＬＤＬ（配列番号：７７）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－１７）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＩＩＤＨＤＨ（配列番号：２５）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＮＮＮＧＭＴＶＳＤＦＮＡ（配列番号：２６）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＳＬＳＤＹＡ（配列番号：７８）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＳＲＤＤＴ（配列番号：７９）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＥＤＳＳＩＰＦＩＶＧＮＹＹＧＭＤＬ（配列番号：８０）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－２０）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＳＶＶＤＫＮＷ（配列番号：２７）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＥＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＧＤＦＥＳＧＶＳＧ（配列番号：２８）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳＹＧ（配列番号：８１）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＹＰＳＧＳＩ（配列番号：８２）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＶＲＹＬＴＧＳＳＤＬＨＬ（配列番号：８３）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－２１）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＫＮＩＹＮＮＮＡ（配列番号：２９）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＡＤＹＳＤＩＳＤＮＮ（配列番号：３０）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＳＬＳＤＹＡ（配列番号：８４）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＮＧＤＩＹ（配列番号：８５）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＰＧＹＲＴＧＩＷＬ（配列番号：８６）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－２２）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＳＶＹＳＮＮＹ（配列番号：３１）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＬＧＧＹＮＤＤＡＮ（配列番号：３２）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＤＬＲＳＹＹＹ（配列番号：８７）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＨＧＧＥＧＮＴ（配列番号：８８）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＲＧＧＷＴＮＹＦ（配列番号：８９）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－２３）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＥＳＶＹＳＮＮＨ（配列番号：３３）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＬＧＧＹＮＤＤＡＮ（配列番号：３４）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＤＬＳＳＮＹＹ（配列番号：９０）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＹＳＳＮＴＲＴ（配列番号：９１）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＲＧＧＷＴＮＹＬ（配列番号：９２）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－２６）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＳＩＤＮＮＤ（配列番号：３５）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＴＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＳＹＣＶＮＴＹＧＹＴ（配列番号：３６）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳＨＤ（配列番号：９３）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＩＳＳＧＮＴ（配列番号：９４）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＤＶＹＳＧＡＳＰ（配列番号：９５）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－２８）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＱＳＩＳＮＨ（配列番号：３７）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＳＹＹＩＩＮＲＳＮＹＡＮＳ（配列番号：３８）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＴＦＳＦＮＳＲＹＷ（配列番号：９６）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＮＮＧＤＩＴ（配列番号：９７）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＫＧＧＮＬＡＧＤＣＹＧＬ（配列番号：９８）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－２９）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＥＳＩＮＳＷ（配列番号：３９）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＳＹＹＩＩＮＲＳＮＹＧＮＳ（配列番号：４０）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳＹＹ（配列番号：９９）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＴＴＡＧＰＬ（配列番号：１００）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＧＨＡＧＳＩＹＹＳＹＦＤＬ（配列番号：１０１）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－３２）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＥＴＩＳＳＲ（配列番号：４１）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＱＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＧＣＹＹＧＧＧＳＦＹＤＳＡ（配列番号：４２）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳＹＤ（配列番号：１０２）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＷＮＳＧＦＶ（配列番号：１０３）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＬＧＡＤＤＩＹＹＦＮＬ（配列番号：１０４）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－３３）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＥＮＬＹＫＤＮＹ（配列番号：４３）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＧＧＹＤＳＶＶＤ（配列番号：４４）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＧＦＤＬＳＳＹＹＹ（配列番号：１０５）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＩＹＴＳＳＧＡＴ（配列番号：１０６）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＲＧＧＷＣＤＦＮＬ（配列番号：１０７）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含むか（ＤＤＲ１－３４）、またはそれらのバリアントであって、ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくはＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有するバリアントを含む。

いくつかの実施形態では、表１のＬＣ－ＣＤＲおよび表２のＨＣ－ＣＤＲは、以下でさらに考察されるように、それぞれ表６および表７のポリヌクレオチドによってコードされる。

いくつかの実施形態では、ＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）配列の好適な文脈に配置され、抗体の結合特異性を定義する軽鎖可変領域および重鎖可変領域を形成する。いくつかの実施形態では、同定されたＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲを有する抗体のフレームワーク領域配列は、元の抗体単離物のフレームワーク配列である。いくつかの実施形態では、ＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲは、異なる哺乳動物の種、例えば、霊長類に由来するフレームワーク領域配列とともに使用される。いくつかの実施形態では、フレームワーク配列は、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体を形成するためのヒト化またはヒトフレームワーク配列である。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、例えば、ＦＲ_ＬＣ１、ＦＲ_ＬＣ２、ＦＲ_ＬＣ３、およびＦＲ_ＬＣ４として指定される４つの軽鎖フレームワーク領域と、ＬＣ－ＣＤＲとを含み、ＮＨ_２からＣＯＯＨの方向に、以下の構成に従う：ＦＲ_ＬＣ１－－ＬＣ－ＣＤＲ１－－ＦＲ_ＬＣ２－ＬＣ－ＣＤＲ２－ＦＲ_ＬＣ３，－ＬＣ－ＣＤＲ３－ＦＲ_ＬＣ４。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、例えば、ＦＲ_ＨＣ１、ＦＲ_ＨＣ２、ＦＲ_ＨＣ３、およびＦＲ_ＨＣ４として指定される４つの重鎖フレームワーク領域と、ＨＣ－ＣＤＲとを含み、ＮＨ_２からＣＯＯＨの方向に、以下の構成に従う：ＦＲ_ＨＣ１－－ＨＣ－ＣＤＲ１－－ＦＲ_ＨＣ２－ＨＣ－ＣＤＲ２－ＦＲ_ＨＣ３，－ＨＣ－ＣＤＲ３－ＦＲ_ＨＣ４。いくつかの実施形態では、親軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト軽鎖可変領域のフレームワーク領域と置き換えられて、ヒト化軽鎖可変領域を形成する。いくつかの実施形態では、親重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト重鎖可変領域のフレームワーク領域と置き換えられて、ヒト化重鎖可変領域を形成する。

いくつかの実施形態では、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片は、表３に示される配列、すなわち、配列番号：１０８～１２８から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片は、表４に示される配列、すなわち、配列番号：１２９～１４９から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１０８～１２８から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号：１２９～１４９から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖可変領域とを含む。様々な実施形態では、配列番号：１０８～１２８に対応する可変軽鎖アミノ酸配列のいずれか１つは、配列番号：１２９～１４９に対応する可変重鎖アミノ酸配列のいずれか１つとともに使用することができる。

いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１０８～１２８から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号：１２９～１４９から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖可変領域とを含む。様々な実施形態では、配列番号：１０８～１２８に対応する可変軽鎖アミノ酸配列のいずれか１つは、配列番号：１２９～１４９に対応する可変重鎖アミノ酸配列のいずれか１つとともに使用することができる。いくつかの実施形態では、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ、表３および表４に示されるクローン対の軽鎖可変領域アミノ酸配列および重鎖可変領域アミノ酸配列の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。

（表３）抗ＤＤＲ１抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列

（表４）抗ＤＤＲ１抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１０８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１Ｋ）と、配列番号：１２９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１０９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３Ｋ）と、配列番号：１３０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－５Ｋ）と、配列番号：１３１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－５Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－６Ｋ）と、配列番号：１３２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－６Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－９Ｋ）と、配列番号：１３３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－９Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１１Ｋ）と、配列番号：１３４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１１Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１２Ｋ）と、配列番号：１３５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１２Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１３Ｋ）と、配列番号：１３６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１３Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１４Ｋ）と、配列番号：１３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１４Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１５Ｋ）と、配列番号：１３８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１５Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１７Ｋ）と、配列番号：１３９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１７Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２０Ｋ）と、配列番号：１４０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２０Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２１Ｋ）と、配列番号：１４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２１Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２２Ｋ）と、配列番号：１４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２２Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２３Ｋ）と、配列番号：１４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２３Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２６Ｋ）と、配列番号：１４４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２６Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２８Ｋ）と、配列番号：１４５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２８Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２９Ｋ）と、配列番号：１４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２９Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３２Ｋ）と、配列番号：１４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３２Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３３Ｋ）と、配列番号：１４８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３３Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３４Ｋ）と、配列番号：１４９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３４Ｈ）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、実施例に記載される親抗体ＤＤＲ１－９のヒト化抗体である。軽鎖可変領域および重鎖可変領域を表５に示す。ヒト化可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を以下の表１０に示す。

（表５）ヒト化ＤＤＲ１－９ｈｕ抗体アミノ酸配列

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１５０（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｖ１）の軽鎖可変領域アミノ酸配列内にＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１５１（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｃ２）の軽鎖可変領域アミノ酸配列内にＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１５１（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｃ２）の重鎖可変領域アミノ酸配列内にＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１５０（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｖ１）または配列番号：１５１（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｃ２）の軽鎖可変領域アミノ酸配列内にＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号：１５１（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｃ２）の重鎖可変領域アミノ酸配列内にＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１５０（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｖ１）または配列番号：１５１（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｃ２）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号：１５２（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｈｖ）のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１５０（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｖ１）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号：１５２（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｈｖ）のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１５１（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｃ２）のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号：１５２（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｈｖ）のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域とを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、バリアントであり、バリアントの軽鎖可変領域配列および／または重鎖可変領域配列は、親軽鎖可変領域配列または重鎖可変領域配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多くのアミノ酸置換、付加、欠失、またはそれらの組み合わせを有し、バリアントは、ＤＤＲ１タンパク質に対する結合特異性および／または他の機能特性を保持する。いくつかの実施形態では、バリアントの軽鎖可変領域配列および／または重鎖可変領域配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多くの保存的または非保存的アミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、親ＬＣ－ＣＤＲまたはＨＣ－ＣＤＲと比較して、バリアント軽鎖可変領域またはバリアント重鎖可変領域の１つ以上のＬＣ－ＣＤＲおよび／またはＨＣ－ＣＤＲにおいて１、２、または３個のアミノ酸置換、付加、欠失、またはそれらの組み合わせを有する。いくつかの実施形態では、バリアント抗体またはその抗原結合断片は、親軽鎖可変領域配列または重鎖可変領域配列と比較して、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のフレームワーク領域配列において１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換、付加、欠失、またはそれらの組み合わせを有する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のフレームワーク領域配列では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換を有する。上述の変形形態は、表３および表５の軽鎖可変領域のそれぞれ、ならびに表４および表５の重鎖可変領域のそれぞれに適用される。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表３の配列番号：１０８～１２８、および表５の配列番号：１５０および１５１から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表４の配列番号：１２９～１４９、および表５の配列番号：１５２から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表３の配列番号：１０８～１２８、および表５の配列番号：１５０および１５１から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列と、表４の配列番号：１２９～１４９、および表５の配列番号：１５２から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列と、を含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１２の軽鎖可変領域アミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１３３の重鎖可変領域アミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１１２の軽鎖可変領域アミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号：１３３の重鎖可変領域アミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列と、を含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２７の軽鎖可変領域アミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１４８の重鎖可変領域アミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１２７の軽鎖可変領域アミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号：１４８の重鎖可変領域アミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列と、を含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１５０もしくは１５１の軽鎖可変領域アミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１５２の重鎖可変領域アミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号：１５０もしくは１５１の軽鎖可変領域アミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号：１５２の重鎖可変領域アミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域アミノ酸配列と、を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載（例えば、表１）のＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３、または特定の軽鎖可変領域（例えば、表３および表５）を含み、および抗体またはその抗原結合断片に存在する軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域のすべてまたは一部に付加または連結して、抗体またはその抗原結合断片の軽鎖を形成する。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域は、抗体が単離された種のもの、例えば、ウサギ軽鎖定常領域のものである。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域に付加または連結された軽鎖定常領域は、本明細書に記載のカッパ（κ）またはラムダ（λ）定常領域である。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域は、存在する場合、既知のλサブタイプのいずれか１つ、例えば、λ_１、λ_２、λ_３、またはλ_４であり得る。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラムダ軽鎖定常領域配列である。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域は、カッパ軽鎖定常領域配列である。好ましい一実施形態では、ラムダまたはカッパ定常領域は、ヒトラムダまたはヒトカッパ定常領域配列のものである。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載（例えば、表２）のＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３、または特定の重鎖可変領域のそれぞれ（例えば、表４および表５）を含み、および抗体またはその抗原結合断片に存在する重鎖可変領域のそれぞれは、重鎖定常領域のすべてまたは一部に付加または連結して、抗体またはその抗原結合断片の重鎖を形成する。いくつかの実施形態では、重鎖定常ドメインは、げっ歯類、霊長類、または他の哺乳動物の重鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域に連結または付加された重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、以下、ヒトＣＨ１、ヒトヒンジ、ヒトＣＨ２、およびヒトＣＨ３ドメインのうちの少なくとも１つまたはすべてを含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、Ｆｃ部分を含み、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭアイソタイプである。いくつかの実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、以下でさらに説明するように、Ｆｃ定常領域の特性、例えば、安定性、グリコシル化、およびＦｃ受容体結合を改変するための１つ以上の変異を有し得る。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、抗ＤＤＲ１抗体は、非修飾の抗体と比較して少なくとも１つの定常領域媒介性生物学的エフェクター機能を減少させるように修飾されてもよく、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、および／またはＦｃγＲＩＩＩＢなどのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）のうちの１つ以上への結合が減少される。ＦｃγＲ結合は、ＦｃγＲ相互作用に必要な特定の領域で抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを変異させることによって減少させることができる（例えば、ＣａｎｆｉｅｌｄａｎｄＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３－１４９１、およびＬｕｎｄｅｔａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７－２６６２）を参照されたい）。抗体のＦｃγＲ結合能の低下はまた、ＦｃγＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能、例えば、オプソニン化、食作用、および抗原依存性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）を減少させることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、未修飾の抗体に対して少なくとも１つの定常領域媒介性生物学的エフェクター機能を獲得または改善するように、例えば、ＦｃγＲ相互作用を増強するように修飾された抗体を含む（例えば、米国公開第２００６／０１３４７０９号を参照されたい）。例えば、本開示の抗体は、対応する野生型定常領域よりも高い親和性でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、および／またはＦｃγＲＩＩＩＢに結合する定常領域を有することができる。

したがって、本開示の抗体は、オプソニン化、食作用、またはＡＤＣＣの増加または減少をもたらす生物学的活性の変化を有し得る。例えば、ＡＤＣＣ活性を低下させる抗体における修飾は、米国特許第５，８３４，５９７号に記載されている。例示的なＡＤＣＣ低下バリアントは、米国特許第５，８３４，５９７号における「変異体３」（「Ｍ３」としても知られている）に対応し、残基２３４および２３７（ＥＵ番号付けを使用する）は、アラニンで置換されている。変異体３（「Ｍ３」としても知られる）の変形形態は、多数の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ_２において使用することができる。ＦｃγＲ結合および／またはＡＤＣＣエフェクター機能を修飾することができる追加の置換としては、Ｆｃ領域におけるＫ３２２Ａ置換またはＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ二重置換が挙げられる（例えば、Ｈｅｚａｒｅｈ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００１，７５（２４）：１２１６１－１２１６８を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、低レベルのフコースを有するか、または欠如している。フコースを欠く抗体は、特に低用量の抗体で、増強されたＡＤＣＣ活性と相関している（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７：２６７３３－２６７４０、Ｓｈｉｎｋａｗａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８：３４６６－７３．Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆｐｒｅｐａｒｉｎｇｆｕｃｏｓｅ－ｌｅｓｓａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｃｌｕｄｅｇｒｏｗｔｈｉｎｒａｔｍｙｅｌｏｍａＹＢ２／０を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、対応する野生型ＣＨ２またはＦｃ領域の結合と比較して、ＦｃγＲＩＩＢへの結合を増加させるか、および／またはＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を減少させるアミノ酸置換を含む修飾された（またはバリアント）ＣＨ２ドメインまたはＦｃドメイン全体を含むことができる。バリアントＣＨ２またはバリアントＦｃドメインは、米国特許公開第２０１４／０３７７２５３号に記載されており、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。バリアントＣＨ２またはバリアントＦｃドメインは、典型的には、２６３位、２６６位、２７３位、および３０５位に１つ以上の置換を含み、Ｆｃドメイン内の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスのものである。いくつかの実施形態では、抗ＤＤＲ１抗体は、野生型ＣＨ２ドメインに対して、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２６６Ｌ、Ｖ２７３Ｃ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｌ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、Ｖ２７３Ｙ、Ｖ３０５Ｋ、およびＶ３０５Ｗから選択される１つ以上の置換を含む。特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインの１つ以上の置換は、ヒトＩｇＧ_１のＣＨ２ドメインに対して、Ｖ２６３Ｌ、Ｖ２７３Ｅ、Ｖ２７３Ｆ、Ｖ２７３Ｍ、Ｖ２７３Ｓ、およびＶ２７３Ｙから選択される。例えば、ＣＨ２ドメインの１つ以上の置換は、Ｖ２７３Ｅであり得る。別の特定の実施形態では、本開示の抗ＤＤＲ１抗体は、アミノ酸置換Ｖ２６３Ｌを含むバリアントＣＨ２ドメインを含む。対応する野生型ＣＨ２またはＦｃ領域の結合と比較して、ＦｃγＲＩＩＢへの結合の増加および／またはＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の減少をもたらすことができるバリアントＣＨ２またはバリアントＦｃドメインの他の例としては、Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，ｅｔａｌ．Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，１９（５），１０３５－１０４３（２０１３）において見出されるもの、例えば、ヒトＩｇＧ_１におけるＳ２６７ＥまたはＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＤＤＲ１抗体は、例えば、ＦｃＲｎ相互作用に関与する特定の領域で免疫グロブリン定常領域セグメントを変異させることによって、胎児Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎに対するそれらの結合親和性を増加または減少させる修飾を含む（例えば、ＷＯ２００５／１２３７８０を参照されたい）。特定の実施形態では、ＩｇＧクラスの抗ＤＤＲ１抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４、および４２８のうちの少なくとも１つが単独で、またはそれらの任意の組み合わせで置換されるように、例えば、２５０位および４２８位で、または２５０位および３１４位で、または３１４位および４２８位で、または２５０位、３１４位、および４２８位で、ならびに２５０位および４２８位の特定の組み合わせで置換されるように、変異される。２５０位について、置換アミノ酸残基は、スレオニン以外の任意のアミノ酸残基であってもよく、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシンを含むが、これらに限定されない。３１４位について、置換アミノ酸残基は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であってもよく、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシンを含むが、これらに限定されない。４２８位について、置換アミノ酸残基は、メチオニン以外の任意のアミノ酸残基であってもよく、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシンを含むが、これらに限定されない。Ｆｃエフェクター機能を修飾することが知られている例示的な置換は、Ｆｃ置換Ｔ２５０Ｑと併せて生じ得るＦｃ置換Ｍ４２８Ｌである。好適なアミノ酸置換の特定の組み合わせは、米国特許第７，２１７，７９７号の表１で特定され、これは、参照により本明細書に組み込まれる。かかる変異は、抗体を分解から保護し、その半減期を増加させる、ＦｃＲｎへの結合を増加させる。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に開示されるＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲを含む単鎖抗体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に開示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む単鎖抗体である。特定の実施形態では、単鎖抗体は、本明細書に開示されるクローン対の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲ、または軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗原結合断片は、本明細書に記載されるように、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、多重特異性抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ラクダ抗体もしくはナノボディ、ドメイン抗体、または二価ドメイン抗体である。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に開示されるＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲ、または軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むキメラ抗体であり、ここで、Ｆｃ重鎖定常領域は、本明細書に開示されるＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲ、または軽鎖可変領域および重鎖可変領域の起源とは異なる種に由来する。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、ヒトＦｃ領域を含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体またはその抗原結合断片であり、本開示のＬＣ－ＣＤＲを含む軽鎖可変領域およびＨＣ－ＣＤＲを含む重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒトフレームワーク配列で置き換えられる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体またはその抗原結合断片であり、配列番号：１０８～１２８ならびに配列番号：１５０および１５１から選択される軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列で置き換えられる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体またはその抗原結合断片であり、配列番号：１２９～１４０および配列番号：１５２から選択される重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト重鎖可変領域フレームワーク配列で置き換えられる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体またはその抗原結合断片であり、配列番号：１０８～１２８ならびに配列番号：１５０および１５１から選択される軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列で置き換えられ、配列番号：１２９～１４０および配列番号：１５２から選択される重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト重鎖可変領域フレームワーク配列で置き換えられる。

Ｃ．例示的なエピトープおよび競合する抗原結合タンパク質
別の態様では、本開示は、抗ＤＤＲ１抗体が結合するエピトープを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体によって結合されるエピトープが有用である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるエピトープを利用して、ＤＤＲ１に結合する抗体または抗原結合タンパク質を単離することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるエピトープを利用して、ＤＤＲ１に結合する抗体または抗原結合タンパク質を生成することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるエピトープまたはエピトープを含む配列は、ＤＤＲ１に結合する抗体または抗原結合タンパク質を生成するための免疫原として利用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のエピトープまたは本明細書に記載のエピトープを含む配列を利用して、ＤＤＲ１の生物学的活性を妨害することができる。

いくつかの実施形態では、エピトープのいずれかに結合する抗体またはその抗原結合断片が特に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるエピトープは、抗体によって結合されるとき、ＤＤＲ１の生物学的活性を妨げるかまたは阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するエピトープは、抗体によって結合されるとき、ＤＤＲ１とその結合パートナーとの間の相互作用を遮断する。

いくつかの実施形態では、抗体と接触するか、または抗体によって埋設される残基を含むドメイン／領域は、ＤＤＲ１内の特定の残基を変異させ、抗体が変異したＤＤＲ１タンパク質に結合できるかどうかを決定することによって識別することができる。多数の個々の変異を作製することによって、結合に直接的な役割を果たす残基か、または変異が抗体と抗原との間の結合に影響を及ぼすことができるように、抗体に十分に近接している残基を特定することができる。これらのアミノ酸の知識から、抗原結合タンパク質と接触する残基か、または抗体によって覆われる残基を含有する抗原のドメインまたは領域を解明することができる。そのようなドメインは、抗原結合タンパク質の結合エピトープを含み得る。

別の態様では、本開示は、ＤＤＲ１への特異的結合について本明細書に記載されるエピトープに結合する例示される抗体または抗原結合断片のうちの１つと競合する抗原結合タンパク質を提供する。そのような抗原結合タンパク質は、本明細書に例示される抗体もしくは抗原結合断片、または重複したエピトープのうちの１つと同じエピトープに結合することもできる。例示される抗体と同じエピトープと競合または結合する抗原結合タンパク質は、同様の機能的特性を示すと予想される。例示される抗体には、表１および表２にそれぞれ示される軽鎖および重鎖可変領域ＣＤＲ、表３および表４に示される軽鎖および重鎖可変領域、ならびに表８および表９に示される軽鎖および重鎖コード領域を有する抗体を含む、上述の抗体が含まれる。

ＩＩＩ．ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含むベクター、ならびに、例えば、抗体またはその抗原結合断片の発現のためのポリヌクレオチドを含む宿主細胞、を提供する。

特に、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御して、目的のポリペプチドを発現することが可能な組換えポリヌクレオチドを作製する１つ以上の異種制御配列に動作可能に連結され得る。関連するポリペプチドまたはタンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するポリペプチドを発現させることができる。

当業者に明らかであるべきであるように、タンパク質配列の知識は、様々なアミノ酸に対応するすべての可能なコドンの知識のために、主題のタンパク質配列をコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの説明を提供する。前述のポリペプチドをコードする極めて多数の核酸は、考えられるコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって作製することができ、すべてのそのような変形は、本明細書に記載されるポリペプチドのいずれかおよびすべてに対して具体的に開示されると考えられる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表１に記載されるＬＣ－ＣＤＲを含む、本明細書に開示される軽鎖可変領域のＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、および／またはＬＣ－ＣＤＲ３をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表１に記載されるＬＣ－ＣＤＲを含む、本明細書に開示される軽鎖可変領域のＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、および／またはＬＣ－ＣＤＲ３のバリアントをコードし、バリアントのＬＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上は、親ＬＣ－ＣＤＲと比較して、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換、付加、欠失、またはそれらの組み合わせを有する。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表２に記載されるＨＣ－ＣＤＲを含む、本明細書に開示される重鎖可変領域のＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、および／またはＨＣ－ＣＤＲ３をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表２に記載されるＬＣ－ＣＤＲを含む、本明細書に開示される重鎖可変領域のＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、および／またはＨＣ－ＣＤＲ３のバリアントをコードし、バリアントのＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上は、親ＨＣ－ＣＤＲと比較して、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換、付加、欠失、またはそれらの組み合わせを有する。

いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域のＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、および／またはＬＣ－ＣＤＲ３をコードするポリヌクレオチドは、表６に示されるポリヌクレオチドから選択される。

（表６）ＤＤＲ１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域のＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、および／またはＨＣ－ＣＤＲ３をコードするポリヌクレオチドは、表７に示されるポリヌクレオチドから選択される。

（表７）ＤＤＲ１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：１０８～１２８または配列番号：１５０もしくは１５１のアミノ酸配列の軽鎖可変領域内の少なくとも１、２、または３個のＬＣ－ＣＤＲをコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：１２９～１４９または配列番号：１５３のアミノ酸配列の重鎖可変領域内の少なくとも１、２、または３個のＨＣ－ＣＤＲをコードする。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：１０８～１２８または配列番号：１５０もしくは１５１のアミノ酸配列の軽鎖可変領域内の少なくとも１、２、または３個のＬＣ－ＣＤＲと、配列番号：１２９～１４９または配列番号：１５３のアミノ酸配列の重鎖可変領域内の少なくとも１、２、または３個のＨＣ－ＣＤＲと、をコードする。いくつかの実施形態では、選択されるＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲは、クローン対のＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲのものである。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表６に示される各ｍＡｂのＬＣ－ＣＤＲのポリヌクレオチド配列の少なくとも１、２、または３個を含む。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表７に示される各ｍＡｂのＨＣ－ＣＤＲのポリヌクレオチド配列の少なくとも１、２、または３個を含む。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表６に示される各ｍＡｂのＬＣ－ＣＤＲのポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１、２、または３個、表７に示される各ｍＡｂのＨＣ－ＣＤＲのポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１、２、または３個を含み、選択されるＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲは、それぞれ、表６および表７に示されるクローン対のＬＣ－ＣＤＲおよびＨＣ－ＣＤＲのものである。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表３の配列番号：１０８～１２８および表５の配列番号：１５０～１５１から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域をコードする。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表４の配列番号：１２９～１４９および表５の配列番号：１５３から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する重鎖可変領域をコードする。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、表３の配列番号：１０８～１２８または表５の配列番号：１５０および１５１から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する軽鎖可変領域と、表４の配列番号：１２９～１４９および表５の配列番号：１５３から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する重鎖可変領域と、をコードする。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下から選択される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体または抗原結合断片をコードする：
配列番号：１０８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１Ｋ）、および配列番号：１２９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１Ｈ）、
配列番号：１０９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３Ｋ）、および配列番号：１３０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３Ｈ）、
配列番号：１１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－５Ｋ）、および配列番号：１３１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－５Ｈ）、
配列番号：１１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－６Ｋ）、および配列番号：１３２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－６Ｈ）、
配列番号：１１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－９Ｋ）、および配列番号：１３３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－９Ｈ）、
配列番号：１１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１１Ｋ）、および配列番号：１３４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１１Ｈ）、
配列番号：１１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１２Ｋ）、および配列番号：１３５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１２Ｈ）、
配列番号：１１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１３Ｋ）、および配列番号：１３６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１３Ｈ）、
配列番号：１１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１４Ｋ）、および配列番号：１３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１４Ｈ）、
配列番号：１１７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１５Ｋ）、および配列番号：１３８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１５Ｈ）、
配列番号：１１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１７Ｋ）、および配列番号：１３９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１７Ｈ）、
配列番号：１１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２０Ｋ）、および配列番号：１４０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２０Ｈ）、
配列番号：１２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２１Ｋ）、および配列番号：１４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２１Ｈ）、
配列番号：１２１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２２Ｋ）、および配列番号：１４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２２Ｈ）、
配列番号：１２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２３Ｋ）、および配列番号：１４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２３Ｈ）、
配列番号：１２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２６Ｋ）、および配列番号：１４４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２６Ｈ）、
配列番号：１２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２８Ｋ）、および配列番号：１４５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２８Ｈ）、
配列番号：１２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２９Ｋ）、および配列番号：１４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２９Ｈ）、
配列番号：１２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３２Ｋ）、および配列番号１４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３２Ｈ）、
配列番号：１２７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３３Ｋ）、および配列番号：１４８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３３Ｈ）、
配列番号：１２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３４Ｋ）、および配列番号：１４９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３４Ｈ）、
配列番号：１５０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｖ）、および配列番号：１５３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｈｖ）、ならびに
配列番号：１５１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｃ２）、および配列番号：１５３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｈｖ）。

いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、表８に示されるポリヌクレオチドから選択される。

（表８）抗ＤＤＲ１抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列

いくつかの実施形態では、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、表９に示されるポリヌクレオチドから選択される。

（表９）抗ＤＤＲ１抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列

いくつかの実施形態では、抗体ＤＤＲ１－９（ＤＤＲ１－９ｈｕ）のヒト化軽鎖可変領域および／またはヒト化重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、表１０に示されるポリヌクレオチドから選択される。

（表１０）ヒト化ＤＤＲ１－９ｈｕ抗体配列－核酸

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２：５８～２７８および配列番号：３０１～３０２から選択される参照ポリヌクレオチド配列に対して、ヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有し、配列番号：１０８～１２８または配列番号：１５０～１５１から選択される対応する軽鎖可変領域をコードする。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：２７９～２９９および配列番号：３００から選択される参照ポリヌクレオチド配列に対して、ヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有し、配列番号：１２９～１４９または配列番号：１５２から選択される対応する軽鎖可変領域をコードする。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：２６２または２７６の参照ポリヌクレオチド配列に対して、ヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有し、配列番号：１１２または配列番号：１２６の対応する軽鎖可変領域をコードする。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：２８３または２９７の参照ポリヌクレオチド配列に対して、ヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有し、配列番号：１３３または１４７の対応する軽鎖可変領域をコードする。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：３０１または３０２の参照ポリヌクレオチド配列に対して、ヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有し、配列番号：１５０または配列番号：１５１の対応する軽鎖可変領域をコードする。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：３００の参照ポリヌクレオチド配列に対して、ヌクレオチドレベルで少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有し、配列番号：１５２の対応する軽鎖可変領域をコードする。

さらなる実施形態では、本開示の核酸は、本明細書に開示される抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：２５８～２７８および配列番号：３０１～３０２から選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズし、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号：２７９～２９９および配列番号：３００から選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズし、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域をコードする。

一般に、核酸は、本明細書に開示される抗体をコードし、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する能力を維持する抗体もコードする核酸と、中程度または高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。第１の核酸分子は、第１の核酸分子の単鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で第２の核酸分子にアニーリングすることができる場合、第２の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，３^ｒｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１）を参照されたい）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、４２℃での、５×または６×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを伴う４０％のホルムアミドである。高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件は、５０％のホルムアミド、５×または６×ＳＳＣ（０．１５ＭのＮａＣ１および０．０１５ＭのＮａ－クエン酸塩）、４２℃、または任意選択で、より高い温度（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃、または６８℃）である。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチも可能である。核酸をハイブリダイゼーションするための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合いが大きいほど、核酸がハイブリダイゼーションし得るストリンジェンシーがより高くなる。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドについては、融解温度を計算するための方程式が導出されている（上記のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．を参照されたい）。より短い核酸、例えば、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記のＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、本明細書に開示される軽鎖可変領域または重鎖可変領域などのコードされたポリペプチドの発現を提供するための様々な方法で操作され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドおよび／または対応するポリペプチドの発現のための制御配列、とりわけ、転写プロモーター、リーダー配列、転写エンハンサー、リボソーム結合またはエントリー部位、終結配列、およびポリアデニル化配列を含む制御配列に動作可能に連結される。ベクターへの挿入前の、単離されたポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに応じて、望ましいか、または必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾するための技術は、当技術分野で既知である。ガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（２００１）、およびＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．ｅｄ．，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９８），ｕｐｄａｔｅｓｔｏ２０２０にて提供される。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現ベクターの一部であってもよく、ここで、ベクターおよびポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現および／またはコードされたポリペプチドの発現を制御するための１つ以上の動作可能に連結された制御配列を含む。組換え発現ベクターは、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよく、これは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供することができ、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とベクターとの適合性に依存する。ベクターは、線状または閉環状プラスミドであってもよい。例示的な発現ベクターとしては、とりわけ、Ｔ７またはＴ７ｌａｃプロモーターに基づくベクター（ｐＡＣＹ：Ｎｏｖａｇｅｎ；ｐＥＴ）、バキュロウイルスプロモーターに基づくベクター（例えば、ｐＢＡＣ）、Ｅｆ１－αおよびＨＴＬＶプロモーターに基づくベクター（例えば、ｐＦＵＳＥ２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＭＶエンハンサーおよびヒトフェリチン軽鎖遺伝子プロモーターに基づくベクター（例えば、ｐＦＵＳＥ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＭＶプロモーターに基づくベクター（例えば、ｐＦＬＡＧ：Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）、ならびにジヒドロ葉酸還元酵素プロモーターに基づくベクター（例えば、ｐＥＡＳＥ：Ａｍｇｅｎ、ＵＳＡ）が挙げられる。様々なベクターは、目的のポリペプチドの一過性または安定した発現のために使用することができる。

別の態様では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞でのポリペプチドの発現のために１つ以上の制御配列に動作可能に連結される。ポリペプチドの発現に使用する宿主細胞は当該技術分野で周知であり、大腸菌、酵母細胞などの細菌細胞、ショウジョウバエＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９細胞などの昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、アフリカミドリザル腎臓（ＣＯＳ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、マウス骨髄腫（例えば、ＮＳ０およびＳｐ２／０）、およびヒト胚腎臓（ＨＥＫ）などの動物細胞、ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上述の宿主細胞のための適切な培養培地および増殖条件は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、宿主細胞および発現ベクターは、目的のポリペプチドを発現するために使用される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現ベクターおよびポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、好適な培地中およびコードされたポリペプチド、例えば、配列番号：１０８～１２８、配列番号：１５０および１５１、配列番号：１２９～１４９、および配列番号：１５２から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現に好適な培養条件下で培養する。いくつかの実施形態では、インビトロ発現系は、ポリペプチドを発現するために発現ベクターとともに使用することができる。インビトロ発現系には、大腸菌、ウサギ網赤血球、小麦胚芽、昆虫細胞、およびヒト細胞に基づくものが挙げられる。宿主細胞で発現されるか、またはインビトロで発現されるかにかかわらず、発現されるポリペプチドは、本明細書にさらに記載されるように、単離または精製され得る。

ＩＶ．抗体の調製方法およびその修飾方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のモノクローナル抗体は、標準的な方法を使用して調製することができ、続いてスクリーニング、特徴付け、および機能評価が行われる。例えば、可変領域を配列決定し、次いで、ヒト発現ベクターにサブクローニングして、キメラ抗体遺伝子を生成し、次いで、それを発現および精製することができる。これらのキメラ抗体は、抗原結合、シグナル伝達の遮断、および異種移植片実験において試験することができる。

Ａ．一般的な方法
ＤＤＲ１に結合するモノクローナル抗体は、いくつかの用途を有することが理解されるであろう。これらには、がんの検出および診断、ならびにがん療法に使用するための診断キットの製造が含まれる。これらの文脈では、かかる抗体を診断剤または治療剤に連結し、それらを競合アッセイにおいて捕捉剤または競合剤として使用し、または加の薬剤が付着することなくそれらを個別に使用してもよい。抗体は、以下でさらに考察されるように、変異されてもよく、または修飾されてもよい。抗体を調製および特徴付けるための方法は当該技術分野において周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；米国特許第４，１９６，２６５号を参照されたい）。

モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成するための方法は、概して、ポリクローナル抗体の調製方法と同じラインに沿って開始する。これらの両方の方法の最初のステップは、適切な宿主の免疫化である。当該技術分野で周知であるように、免疫化のための所与の組成物は、その免疫原性において変化し得る。したがって、ペプチドまたはポリペプチド免疫原を担体に結合することによって達成され得るように、宿主免疫系を増強することがしばしば必要である。例示的かつ好ましい担体は、キーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。他のアルブミン、例えば、卵白アルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンも担体として使用することができる。ポリペプチドを担体タンパク質にコンジュゲートするための手段は、当技術分野で既知であり、グルタルアルデヒド、ｍ－マレイミドベンコイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、およびビス－ビアゾ化ベンジジンを含む。当該技術分野においても周知であるように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激剤の使用によって増強することができる。例示的かつ好ましいアジュバントとしては、完全フロインドアジュバント（死滅した結核菌を含有する免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全フロインドアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。

ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原組成物の量は、免疫原の性質、および免疫化に使用される動物によって変化する。様々な経路を使用して、免疫原を（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、および腹腔内）投与することができる。ポリクローナル抗体の産生は、免疫化後の様々な時点で免疫化された動物の血液を採取することによって監視され得る。また、第二のブースター注入を行う場合もある。好適な力価が得られるまで、ブーストおよび力価測定のプロセスを繰り返す。所望のレベルの免疫原性が得られると、免疫化された動物を出血させ、血清を単離して保存することができ、かつ／または動物を使用してＭＡｂを生成することができる。

免疫化後、抗体、具体的にはＢリンパ球（Ｂ細胞）を産生する可能性のある体細胞を、ＭＡｂ生成プロトコルでの使用のために選択する。これらの細胞は、生検された脾臓またはリンパ節から、または循環血液から得ることができる。次に、免疫化された動物由来の抗体産生Ｂリンパ球を、不死性骨髄腫細胞の細胞、概して、免疫化された動物と同じ種またはヒトもしくはヒト／マウスのキメラ細胞の１つと融合させる。ハイブリドーマ産生融合手順での使用に適した骨髄腫細胞株は、好ましくは、抗体産生はせず、高い融合効率を有し、次いで、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）の成長のみを支持する特定の選択的培地で成長することができなくなる酵素欠損を有する。当業者に既知であるように、多数の骨髄腫細胞のうちの任意の１つを使用してもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，ｐｐ．６５－６６，１９８６、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｐｐ．７５－８３，１９８４）。抗体産生脾臓またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを生成する方法は、通常、細胞膜の融合を促進する物質（化学的または電気的）の存在下で、体細胞と骨髄腫細胞を２：１の割合で混合することを含むが、その割合は、それぞれ約２０：１～約１：１で変化し得る。センダイウイルスを用いた融合方法は、ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９７６）によって記載されており、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧなどを用いたものは、Ｇｅｆｔｅｒｅｔａｌ．（１９７７）によって記載されている。電気的に誘導された融合法の使用も適切である（Ｇｏｄｉｎｇ，ｐｐ．７１－７４，１９８６）。融合手順は、通常、１×１０^－６～１×１０^－８の低頻度で生存可能なハイブリッドを生成する。しかしながら、これは、生存している融合したハイブリッドは、選択的培地中で培養することによって、親の注入された細胞（特に、通常は無限に分裂し続けるであろう注入された骨髄腫細胞）から分化するため、問題を提起しない。選択培地は、一般に、組織培養培地中のヌクレオチドのデノボ合成を遮断する薬剤を含有するものである。例示的かつ好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方の新規合成をブロックするが、アザゼリンはプリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、培地は、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンで補充される（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合、培地は、ヒポキサンチンで補充される。骨髄腫に融合していないＥＢＶ形質転換細胞株を排除するために、Ｂ細胞源がエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換ヒトＢ細胞株である場合、ウアバインが追加される。

いくつかの実施形態では、好ましい選択媒体は、ＨＡＴ、またはウアバインを有するＨＡＴである。ＨＡＴ培地で生存できるのは、ヌクレオチドサルベージ経路を操作できる細胞のみである。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の主要な酵素、例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）に欠陥があり、それらは生存することができない。Ｂ細胞はこの経路を操作することができるが、それらは培養において限られた寿命を有し、一般的に約２週間以内に死亡する。したがって、選択培地中で生存できる細胞は、骨髄腫およびＢ細胞から形成されるハイブリッドのみである。融合に使用されるＢ細胞の源が、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の系統である場合、ここでのように、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞は薬物死の影響を受けやすいが、使用される骨髄腫パートナーは、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞耐性であることを選択するために使用されるため、ウアバインは、ハイブリッドの薬物選択にも使用される。

培養は、特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中のシングルクローン希釈によって細胞を培養し、続いて（約２～３週間後に）個々のクローン上清を所望の反応性について試験することによって行われる。アッセイは、感受性が高く、単純かつ迅速でなければならず、例えば、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、細胞毒性測定法、プラークアッセイ、ドット免疫結合測定法等である。次いで、選択されたハイブリドーマを、フローサイトメトリー選別によって連続希釈または単一細胞選別し、個々の抗体産生細胞株にクローニングし、次いで、このクローンを無制限に増殖させて、ｍＡｂを提供することができる。細胞株は、２つの基本的な方法でＭＡｂ産生のために利用され得る。ハイブリドーマの試料は、動物（例えば、マウス）に（しばしば腹腔内に）注入され得る。任意選択で、動物は、注射前に炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）などの油でプライミングされる。この方法でヒトハイブリドーマを使用する場合、腫瘍拒絶を防止するために、ＳＣＩＤマウス等の免疫不全マウスに注射することが最適である。注射された動物は、融合した細胞ハイブリッドによって産生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。次に、血清または腹水などの動物の体液をタップして、高濃度のＭＡｂを提供することができる。個々の細胞株はまた、インビトロで培養することができ、ＭＡｂは高濃度で容易に得られる培養培地に天然分泌される。あるいは、ヒトハイブリドーマ細胞株をインビトロで使用して、細胞上清中に免疫グロブリンを産生することができる。細胞株は、高純度のヒトモノクローナル免疫グロブリンを回収する能力を最適化するために、無血清培地中での成長に適合させることができる。

いずれかの手段によって産生されるＭＡｂは、所望の場合、濾過、遠心分離、およびＦＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフィー方法を使用して、さらに精製され得る。本開示のモノクローナル抗体の断片は、ペプシンまたはパパインなどの酵素による消化を含む方法によって、かつ／または化学還元によるジスルフィド結合の切断によって、精製されたモノクローナル抗体から得ることができる。あるいは、本開示によって包含されるモノクローナル抗体断片は、自動ペプチドシンセサイザーを使用して合成され得る。

また、分子クローニングアプローチを使用してモノクローナルを生成することができると考えられる。このため、ＲＮＡをハイブリドーマ株から単離し、ＲＴ－ＰＣＲによって抗体遺伝子を得、免疫グロブリン発現ベクターにクローニングすることができる。あるいは、細胞株から単離されたＲＮＡから組み合わせ免疫グロブリンファージミドライブラリーを調製し、適切な抗体を発現するファージミドを、ウイルス抗原を使用してパンニングすることによって選択する。従来のハイブリドーマ技法に勝るこのアプローチの利点は、およそ１０^４倍もの抗体が単一のラウンドで産生およびスクリーニングされ得ること、ならびにＨおよびＬ鎖の組み合わせによって新しい特異性が生成されることであり、これは、適切な抗体を見つける可能性をさらに増加させる。

本開示において有用な抗体の産生を教示する他の米国特許（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）には、組み合わせアプローチを使用したキメラ抗体の産生を記載する米国特許第５，５６５，３３２号、組換え免疫グロブリン調製を記載する米国特許第４，８１６，５６７号、および抗体治療剤コンジュゲートを記載する米国特許第４，８６７，９７３号が含まれる。

Ｂ．抗体配列の操作
様々な実施形態では、発現の改善、交差反応性の改善、またはオフターゲット結合の減少などの様々な理由で、同定された抗体の配列を操作することを選択してもよい。以下は、抗体操作に関する関連技術の一般的な説明である。

ハイブリドーマを培養し、次いで細胞を溶解し、総ＲＮＡを抽出してもよい。ランダム六量体をＲＴとともに使用して、ＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成し、次いで、すべてのヒト可変遺伝子配列を増幅すると予想されるＰＣＲプライマーのマルチプレックス混合物を使用してＰＣＲを行ってもよい。ＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙベクターにクローニングされ、次いで、標準的なベクタープライマーを使用して、自動化されたＤＮＡ配列決定によって配列決定され得る。結合および中和のアッセイは、ハイブリドーマ上清から収集した抗体を使用して、プロテインＧカラムを使用して、ＦＰＬＣによって精製して行ってもよい。組換え全長ＩｇＧ抗体は、重鎖および軽鎖ＦｖＤＮＡをクローニングベクターからＩｇＧプラスミドベクターにサブクローニングし、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞またはＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、抗体を２９３またはＣＨＯ細胞上清から精製して収集することによって生成され得る。

最終的なｃＧＭＰ製造プロセスと同じ宿主細胞および細胞培養プロセスにおいて産生される抗体の迅速な利用可能性は、プロセス開発プログラムの持続時間を短縮する可能性を有する。Ｌｏｎｚａは、ＣＤＡＣＦ培地中で成長したプールされたトランスフェクタントを使用して、ＣＨＯ細胞における少量（最大５０ｇ）の抗体の迅速な産生のための一般的な方法を開発した。真の一過性系よりも若干遅いが、利点は、生成物濃度がより高く、生成細胞株と同じ宿主およびプロセスを使用することを含む。使い捨てバイオリアクターにおける、すなわち、流加培養モードで操作した使い捨てバッグバイオリアクター培養物（５Ｌの作業容積）における、モデル抗体を発現するＧＳ－ＣＨＯプールの成長および生産性の例では、トランスフェクションから９週間以内に２ｇ／Ｌの収穫時抗体濃度を達成した。

抗体分子は、例えば、ｍＡｂのタンパク質分解切断によって産生される断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２）、または例えば、組換え手段を介して産生可能な単鎖免疫グロブリンを含み得る。かかる抗体誘導体は、一価である。一実施形態では、そのような断片は、互いに、または他の抗体断片もしくは受容体リガンドと組み合わせて、「キメラ」結合分子を形成することができる。重要なことに、そのようなキメラ分子は、同じ分子の異なるエピトープに結合することができる置換基を含有し得る。

１．抗原結合修飾
関連する実施形態では、抗体は、開示した抗体の誘導体、例えば、開示した抗体中のものと同一のＣＤＲ配列を含む抗体（例えば、キメラまたはＣＤＲ移植抗体）である。あるいは、抗体分子に保存的変化を導入するなどの修飾を行うことを望んでもよい。そのような変更を行う際、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮される場合がある。タンパク質に相互作用的生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当該技術分野で一般に理解されている（ＫｙｔｅａｎｄＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性特性が、結果として生じたタンパク質の二次構造に寄与し、次いで、それが、タンパク質と、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を定義することが認められている。

同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該技術分野で理解されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接アミノ酸の親水性によって管理される、タンパク質の最大の局所平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関することを述べている。米国特許第４，５５４，１０１号において詳細に記載されているとおり、以下の親水性の値がアミノ酸残基に割り当てられている：塩基性アミノ酸：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、およびヒスチジン（－０．５）；酸性アミノ酸：アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、アスパラギン（＋０．２）、およびグルタミン（＋０．２）；親水性の非イオン性アミノ酸：セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、およびスレオニン（－０．４）、硫黄含有アミノ酸：システイン（－１．０）およびメチオニン（－１．３）；疎水性の非芳香族アミノ酸：バリン（－１．５）、ロイシン（－１．８）、イソロイシン（－１．８）、プロリン（－０．５±１）、アラニン（－０．５）、およびグリシン（０）；疎水性の芳香族アミノ酸：トリプファン（－３．４）、フェニルアラニン（－２．５）、およびチロシン（－２．３）。

アミノ酸を、同様の親水性を有し、生物学的または免疫学的に修飾されたタンパク質を産生する別のアミノ酸で置換することができることを理解されたい。かかる変更では、親水性の値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらに特に好ましい。

上で概説されるように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づいている。前述の様々な特性を考慮した例示的な置換が当業者に周知であり、これらには、アルギニンおよびリジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸、セリンおよびスレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。

本開示はまた、アイソタイプ修飾を企図する。異なるアイソタイプを有するようにＦｃ領域を修飾することにより、異なる官能性を達成することができる。例えば、ＩｇＧ_１への変更は、抗体依存性細胞傷害性を増加させることができ、クラスＡへの切り替えは、組織分布を改善することができ、クラスＭへの切り替えは、価数を改善することができる。

修飾された抗体は、標準的な分子生物学的技法による発現、またはポリペプチドの化学的合成を含む、当業者に既知の任意の技法によって作製することができる。組換え発現のための方法は、この文書の別の箇所で扱われている。

２．Ｆｃ領域修飾
上述のように、本明細書に開示される抗体はまた、Ｆｃ領域内に修飾を含むように、典型的には、抗体の１つ以上の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／またはエフェクター機能（例えば、抗原依存性細胞傷害）を改変するように操作され得る。さらに、本明細書に開示される抗体は、化学修飾され得る（例えば、１つ以上の化学的部分が抗体に結合し得る）か、またはそのグリコシル化を改変するように修飾されて、この場合も同様に抗体の１つ以上の機能特性を改変することができる。これらの実施形態のそれぞれについて、以下にさらに詳細に記載される。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けである。本明細書に開示される抗体は、改変されたエフェクター機能を提供するために修飾された（またはブロックされた）Ｆｃ領域を有する抗体も含む。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、ＷＯ２００３／０８６３１０、ＷＯ２００５／１２０５７１、ＷＯ２００６／００５７７０２を参照されたい。そのような修飾を使用して、診断および療法における可能性のある有益な効果を伴う、免疫系の様々な反応を増強または抑制することができる。Ｆｃ領域の改変は、アミノ酸変化（置換、欠失、および挿入）、グリコシル化、または脱グリコシル化、および複数のＦｃの添加を含む。Ｆｃに対する変更はまた、治療用抗体における抗体の半減期を変化させることができ、より少ない頻度の投薬を可能にし、したがって、利便性の増加および材料の使用の減少を可能にする。この変異は、ヒンジ領域における重鎖間ジスルフィド架橋の不均一性を廃止することが報告されている。

いくつかの実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が増加または減少するように修飾される。例示的なアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載される。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを容易にするように、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるように改変される。別の実施形態では、本抗体は、その生物学的半減期を増加させるように修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号に記載されるように、以下の変異のうちの１つ以上が導入され得る：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加するために、本抗体は、米国特許第５，８６９，０４６号および同第６，１２１，０２２号に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含むようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変され得る。さらに他の実施形態では、抗体のエフェクター機能を改変するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによりＦｃ領域が改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０、および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力は保持されるように、異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が改変するエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチについては、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載される。

別の例では、アミノ酸２３１位および２３９位内の１つ以上のアミノ酸残基が改変され、それにより抗体の補体を固定する能力が改変される。このアプローチについては、ＰＣＴ公開第９４／２９３５１号にさらに記載される。さらに別の例では、Ｆｃ領域は、以下の位置で１つ以上のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加もしくは減少させるように、かつ／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加もしくは減少させるように修飾される：２３８、２３９、２４３、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、または４３９。このアプローチについては、ＰＣＴ公開第００／４２０７２号にさらに記載される。さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が改善されたバリアントが記載されている。２５６、２９０、２９８、３３３、３３４、および３３９位での特異的変異が、ＦｃγＲＩＩＩへの結合を改善することが示された。加えて、以下のバリアントの組み合わせが、ＦｃγＲＩＩＩ結合を改善することが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ、およびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ。

一実施形態では、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を媒介する抗体の能力を低下させるように、かつ／または残基２４３および２６４を修飾することによって抗炎症特性を増加させるように、修飾される。一実施形態では、抗体のＦｃ領域は、２４３位および２６４位の残基をアラニンに変化させることによって修飾される。一実施形態では、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を媒介する抗体の能力を低下させるように、かつ／または残基２４３、２６４、２６７および３２８を修飾することによって抗炎症特性を増加させるように、修飾される。さらに別の実施形態では、本抗体は、特定のグリコシル化パターンを含む。例えば、非グリコシル化抗体（すなわち、抗体がグリコシル化を欠いている）が作製され得る。抗体のグリコシル化パターンは、例えば、抗原に対する本抗体の親和性またはアビディティを増加させるように改変され得る。かかる修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変することによって達成され得る。例えば、可変領域フレームワークグリコシル化部位のうちの１つ以上の除去をもたらし、それにより、その部位でのグリコシル化を排除する１つ以上のアミノ酸置換が行われ得る。かかるアグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性またはアビディティを増加させ得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号を参照されたい。

グリコシル化パターンが、低フコシル化または非フコシル化グリカンを含む抗体も作製されてもよく、例えば、低フコシル化抗体または非フコシル化抗体は、グリカン上のフコシル残基の量を減少させる。抗体はまた、増加した量の二分ＧｌｃＮａｃ構造を有するグリカンを含んでもよい。かかるグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。かかる修飾は、例えば、グリコシル化経路が特定のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作された宿主細胞で抗体を発現させることによって達成され得る。これらの細胞については、当該技術分野で説明されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が改変された抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ）を欠き、これにより、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞株で発現される抗体が、それらの炭水化物上でフコースを欠く。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９ＦＵＴ８－／－細胞株は、２つの組換えベクターを用いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化破壊によって作製される（例えば、米国特許公開第２００４／０１１０７０４号を参照されたい）。別の例として、ＥＰ１１７６１９５は、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株について記載しており、かかる細胞株で発現された抗体は、α－１，６結合関連酵素を減少させるかまたは排除することによって低フコシル化を呈する。ＥＰ１１７６１９５は、抗体のＦｃ領域と結合するＮ－アセチルグルコサミンにフコースを追加する低い酵素活性を有する、または酵素活性を有さない細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣＣＲＬ１６６２）についても記載している。ＰＣＴ公開第０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に結合させる能力が減少されており、その宿主細胞で発現された抗体の低フコシル化ももたらすバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞について記載している。修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、ＰＣＴ公開第０６／０８９２３１号に記載されるように、鶏卵においても産生することができる。あるいは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、Ｌｅｍｎａ（米国特許第７，６３２，９８３号）などの植物細胞において産生され得る。植物系における抗体の産生方法は、米国特許第６，９９８，２６７号および同第７，３８８，０８１号に開示されている。ＰＣＴ公開第９９／５４３４２号は、操作された細胞株で発現された抗体が、本抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす二分ＧｌｃＮａｃ構造の増加を呈するように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させるように操作された細胞株について記載している。

あるいは、フコシダーゼ酵素を使用して、抗体のフコース残基を切断することができ、例えば、フコシダーゼα－Ｌ－フコシダーゼは、フコシル残基を抗体から除去する。本明細書に開示される抗体には、下位真核生物宿主細胞、特に、酵母および糸状菌などの真菌宿主細胞で産生されるものがさらに含まれ、哺乳動物またはヒト様のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている。これらの遺伝子修飾された宿主細胞の、現在使用されている哺乳動物細胞株に勝る特定の利点は、特定のＮ－グリカン構造が優勢である糖タンパク質の組成物を産生することができるように、細胞内で産生される糖タンパク質のグリコシル化プロファイルを制御する能力である（例えば、米国特許第７，０２９，８７２号および同第７，４４９，３０８号を参照されたい）。これらの遺伝子修飾された宿主細胞は、主に特定のＮ－グリカン構造を有する抗体を産生するために使用されている。

加えて、酵母または糸状菌等の真菌は、フコシル化糖タンパク質を産生する能力を欠くため、かかる細胞内で産生される抗体は、細胞が、フコシル化糖タンパク質を産生するための酵素経路をさらに含むように改変されない限り、フコースを欠くことになる（例えば、ＰＣＴ国際公開第２００８／１１２０９２号を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、下位真核宿主細胞において産生され、フコシル化および非フコシル化ハイブリッドならびに複合体Ｎ－グリカンを含む抗体をさらに含み、これは、ＧｌｃＮＡｃ（１－４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ（１－４）ＧｌｃＮＡｃ（１－４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡ（１－４）Ｇａｌ（１－４）ＧｌｃＮＡｃ（１－４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２などのＮ－グリカンを含むが、これらに限定されない二分および多分岐の種を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供する抗体組成物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される少なくとも１つのハイブリッドＮ－グリカンを有する抗体を含み得る。特定の態様では、ハイブリッドＮ－グリカンは、組成物中で優勢なＮ－グリカン種である。さらなる態様では、ハイブリッドＮ－グリカンは、組成物中に約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のハイブリッドＮ－グリカンを含む特定のＮ－グリカン種である。

特定の実施形態では、本明細書で提供する抗体組成物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される少なくとも１つの複合体Ｎ－グリカンを有する抗体を含む。特定の態様では、複合体Ｎ－グリカンは、組成物中で優勢なＮ－グリカン種である。さらなる態様では、複合体Ｎ－グリカンは、組成物中に約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の複合体Ｎ－グリカンを含む特定のＮ－グリカン種である。特定の実施形態では、Ｎ－グリカンは、フコシル化される。一般に、フコースは、Ｎ－グリカンの還元末端のＧｌｃＮＡｃとのα１，３－結合、Ｎ－グリカンの還元末端のＧｌｃＮＡｃとのα１，６－結合、Ｎ－グリカンの非還元末端のＧａｌとのα１，２－結合、Ｎ－グリカンの非還元末端のＧｌｃＮａｃとのα１，３－結合、またはＮ－グリカンの非還元末端のＧｌｃＮＡｃとのα１，４－結合にある。

したがって、上記糖タンパク質組成物の特定の態様では、糖形態は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）からなる群から選択される糖形態を生成するために、α１，３結合もしくはα１，６結合フコースにあるか、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１－２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１－２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１－２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１－２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１－２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される糖形態を生成するために、α１，３結合もしくはα１，４結合フコースにあるか、またはＧａｌ（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１－２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２（Ｆｕｃ１－２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１－２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される糖形態を生成するためにα１，２結合フコースにある。

さらなる態様では、抗体は、限定するものではないが、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２を含む高マンノースＮ－グリカン、またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ－グリカン構造からなるＮ－グリカンを含む。上記のさらなる態様では、複合体Ｎ－グリカンは、フコシル化ならびに非フコシル化の二分ならびに多分岐の種をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「Ｎ－グリカン」および「糖形態」は交換可能に使用され、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基に対するアスパラギン－Ｎ－アセチルグルコサミン結合によって結合されるＮ結合オリゴ糖を指す。Ｎ結合糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素と結合したＮ－アセチルグルコサミン残基を含有する。

Ｃ．単鎖抗体
単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、短い（通常はセリン、グリシン）リンカーと一緒に連結された、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合物である。このキメラ分子は、定常領域の除去およびリンカーペプチドの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。この修飾は通常、特異性を経変することなく保持する。これらの分子は、抗原結合ドメインを単一のペプチドとして発現することが非常に便利であるファージディスプレイを容易にするために歴史的に作成された。あるいは、ｓｃＦｖは、ハイブリドーマに由来するサブクローニングされた重鎖および軽鎖から直接作成することができる。単鎖可変断片は、完全抗体分子に見られる定常Ｆｃ領域を欠き、したがって、抗体を精製するために使用される共通結合部位（例えば、タンパク質Ａ／Ｇ）を欠く。これらの断片は、プロテインＬがカッパ軽鎖の可変領域と相互作用するので、プロテインＬを使用して精製／固定化することができることが多い。

可撓性リンカーは、一般に、アラニン、セリン、およびグリシンなどの螺旋および旋回促進アミノ酸残基からなる。しかしながら、他の残基も同様に機能し得る。Ｔａｎｇｅｔａｌ．（１９９６）は、タンパク質リンカーライブラリーから単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のための調整されたリンカーを迅速に選択する手段としてファージディスプレイを使用した。重鎖および軽鎖可変ドメインの遺伝子が、可変組成物の１８アミノ酸ポリペプチドをコードするセグメントによって連結されたランダムリンカーライブラリーを構築した。ｓｃＦｖレパートリー（およそ５×１０^６個の異なるメンバー）を糸状ファージ上に表示し、ハプテンを用いて親和性選択に供した。選択されたバリアントの集団は、結合活性の有意な増加を示したが、かなりの配列多様性を保持した。続いて、１０５４個のバリアントをスクリーニングして、可溶性形態で効率的に作製された触媒活性のあるｓｃＦｖを得た。配列解析により、選択されたテザーの唯一の共通の特徴として、Ｖ_ＨＣ末端の後の２つの残基のリンカー内の保存されたプロリンと、他の位置での多量のアルギニンおよびプロリンが明らかになった。

本開示の組換え抗体は、受容体の二量体化または多量体化を可能にする配列または部分も含み得る。かかる配列には、Ｊ鎖と併せて多量体の形成を可能にする、ＩｇＡに由来する配列が含まれる。別の多量体化ドメインは、Ｇａｌ４二量体化ドメインである。他の実施形態では、鎖は、２つの抗体の組み合わせを可能にするビオチン／アビジンなどの薬剤で修飾され得る。

別の実施形態では、単鎖抗体は、非ペプチドリンカーまたは化学単位を使用して受容体軽鎖および重鎖を結合することによって作製することができる。一般に、軽鎖および重鎖は、異なる細胞内で産生され、精製され、その後、適切な様式で一緒に連結される（すなわち、重鎖のＮ末端が、適切な化学架橋を介して軽鎖のＣ末端に結合される）。

架橋試薬は、２つの異なる分子、例えば、安定化剤および凝固剤の官能基を結び付ける分子ブリッジを形成するために使用される。しかしながら、同じ類似体の二量体もしくは多量体または異なる類似体からなるヘテロマー複合体を作製することができることも企図される。２つの異なる化合物を段階的に連結するために、不要なホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤を使用することができる。

例示的なヘテロ二官能性架橋剤は、２つの反応性基を含有する。１つは、第一級アミン基（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）と反応し、もう１つは、チオール基（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応する。第一級アミン反応性基を介して、架橋剤は、１つのタンパク質（例えば、選択された抗体または断片）のリジン残基と反応し、チオール反応性基を介して、すでに第１のタンパク質に結合している架橋剤は、他のタンパク質（例えば、選択剤）のシステイン残基（遊離スルフヒドリル基）と反応し得る。

血液中で合理的な安定性を有する架橋剤が用いられることが好ましい。多数の種類のジスルフィド結合含有リンカーが知られており、これらは、標的化および治療／予防用薬剤をコンジュゲートするために首尾よく用いることができる。立体障害されるジスルフィド結合を含有するリンカーは、インビボでより大きな安定性をもたらし、作用部位に到達する前に標的化ペプチドの放出を防止することが証明され得る。したがって、これらのリンカーは、連結剤の１つの基である。

別の架橋試薬はＳＭＰＴであり、これは、隣接するベンゼン環およびメチル基によって「立体障害される」ジスルフィド結合を含有する二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織および血液中に存在することができるグルタチオン等のチオレートアニオンによる攻撃から結合を保護する機能を果たし、それによって結合した薬剤の標的部位への送達前のコンジュゲートの脱離を防止するのに役立つと考えられる。

ＳＭＰＴ架橋試薬は、他の多くの既知の架橋試薬と同様に、システインのＳＨまたは一級アミン（例えば、リジンのイプシロンアミノ基）などの官能基を架橋する能力を付与する。架橋剤の別の可能なタイプとしては、スルホスクシンイミジル－２－（ｐ－アジドサリチルアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオン酸塩などの切断可能なジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドが挙げられる。Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル基は、第一級アミノ基と反応し、フェニルアジド（光分解時）は、任意のアミノ酸残基と非選択的に反応する。

障害された架橋剤に加えて、障害されていないリンカーもまた、本明細書に従って使用され得る。保護されたジスルフィドを含有または生成するとは考えられない他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ、および２－イミノチオランが挙げられる（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ＆Ｔｈｏｒｐｅ，１９８７）。そのような架橋剤の使用は、当技術分野で十分に理解されている。別の実施形態は、可撓性リンカーの使用を含む。

米国特許第４，６８０，３３８号は、アミン含有ポリマーおよび／またはタンパク質とのリガンドのコンジュゲートを産生するのに有用な、特に、キレート剤、薬物、酵素、検出可能な標識等との抗体コンジュゲートを形成するのに有用である、二官能性リンカーを記載している。米国特許第５，１４１，６４８号および同第５，５６３，２５０号は、様々な穏やかな条件下で切断可能な不安定な結合を含有する切断可能なコンジュゲートを開示する。このリンカーは、目的とする薬剤がリンカーに直接結合し、切断により活性薬剤が放出され得る点で特に有用である。特定の用途は、遊離アミノまたは遊離スルフヒドリル基を、抗体または薬物などのタンパク質に添加することを含む。

米国特許第５，８５６，４５６号は、融合タンパク質、例えば、単鎖抗体を作製するためにポリペプチド成分を接続する際に使用するためのペプチドリンカーを提供する。リンカーは、最大約５０アミノ酸長であり、荷電アミノ酸（好ましくは、アルギニンまたはリジン）、続いてプロリンの少なくとも１つの存在を含有し、より高い安定性および減少した凝集を特徴とする。米国特許第５，８８０，２７０号は、様々な免疫診断および分離技法に有用なアミノオキシ含有リンカーを開示している。

Ｄ．精製
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、精製され得る。本明細書で使用される場合、「精製される」という用語は、他の構成要素から単離可能な組成物を指すことが意図され、タンパク質は、その天然に達成可能な状態と比較して任意の程度まで精製される。したがって、精製されたタンパク質は、それが天然に存在し得る環境から遊離したタンパク質も指す。「実質的に精製される」という用語が使用される場合、この指定は、タンパク質またはペプチドが、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ以上を構成するなどの組成物の主要成分を形成する組成物を指す。

タンパク質精製技術は、当業者によく知られている。これらの技術は、あるレベルで、ポリペプチドおよび非ポリペプチド画分への細胞環境の粗分画を伴う。ポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、目的のポリペプチドをクロマトグラフィーおよび電気泳動技術を使用してさらに精製して、部分的または完全な精製（または均質性への精製）を達成し得る。純粋なペプチドの調製に特に好適な分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点集束である。タンパク質精製のための他の方法には、硫酸アンモニウムによる沈殿、ＰＥＧ、抗体等による、または熱変性、続いて遠心分離、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイトおよび親和性クロマトグラフィー、ならびにそのような技法および他の技法の組み合わせが含まれる。

本開示の抗体を精製する際には、原核生物または真核生物の発現系においてポリペプチドを発現させ、変性条件を用いてタンパク質を抽出することが望ましい場合がある。ポリペプチドは、ポリペプチドのタグ付けされた部分に結合する親和性カラムを使用して、他の細胞成分から精製され得る。当該技術分野で一般的に知られているように、種々の精製ステップを行う順序が変更されてもよく、または特定のステップが省略されてもよいと考えられ、依然として実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に好適な方法がもたらされる。

一般に、完全抗体は、抗体のＦｃ部分に結合する物質（すなわち、プロテインＡ）を利用して分画される。あるいは、抗原を使用して、適切な抗体を同時に精製および選択することができる。かかる方法は、多くの場合、カラム、フィルタまたはビーズ等の支持体に結合した選択物質を利用する。抗体は、支持体に結合し、汚染物質を除去し（例えば、洗い流す）、抗体は、条件（塩、熱など）を適用することによって放出される。

タンパク質またはペプチドの精製度を定量するための様々な方法は、本開示に照らして当業者に知られているであろう。これらには、例えば、活性画分の特異的活性を決定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分内のポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価する別の方法は、画分の比活性を計算し、初期抽出物の比活性と比較して、そのように純度の程度を計算することである。活性の量を表すために使用される実際の単位は、もちろん、精製を行うときに選択された特定のアッセイ技術、および発現したタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存するであろう。

ポリペプチドの移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件により、時に有意に変化し得ることが知られている（Ｃａｐａｌｄｉｅｔａｌ．，１９７７）。したがって、異なる電気泳動条件下では、精製または部分的に精製された発現産物の見かけの分子量が変化し得ることが理解されるであろう。

Ｖ．抗ＤＤＲ１抗体の使用および組成物
Ａ．治療的方法および使用
１．がんの治療
過剰増殖性疾患は、細胞が制御不能に増殖し始める任意の疾患と関連付けることができるが、典型的な例は、がんである。がんの重要な要素の１つは、細胞の正常なアポトーシスサイクルが妨害されることであり、したがって、細胞の成長を妨害する薬剤は、これらの疾患を治療するための治療剤として重要である。本開示では、本明細書に記載される抗ＤＤＲ１抗体またはその抗原結合断片を使用して、がん細胞数を減少させることができ、したがって、様々な種類のがん細胞株を治療するために潜在的に使用することができる。いくつかの態様では、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、固形腫瘍を含むがん、特に、ＤＤＲ１タンパク質またはその一部（ＤＤＲ１細胞外ドメインなど）を分泌するがん、および／またはがん細胞もしくはがん幹細胞の表面に存在するＤＤＲ１を有するがんを治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＤＤＲ１タンパク質を過剰発現するがんまたはがん細胞は、本開示の抗体による治療のために選択される。

いくつかの実施形態では、本開示に従って治療することができるがんおよびがん細胞の種類としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、膵臓、精巣、舌、頸部、または子宮のがんまたはがん細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。加えて、がんは、具体的には、限定されるものではないが、以下の組織学的な種類であってもよい：悪性新生物、悪性腫瘍、がん種；未分化型のがん種；巨細胞がん、および紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；毛母細胞がん；移行細胞がん；乳頭状移行細胞がん；腺がん；悪性ガストリノーマ；胆管がん；肝細胞がん；肝細胞がんと胆管がんの複合がん；索状腺腫；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープの腺がん；家族性腺腫性ポリポーシス；固形がん；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺がん；乳頭腺がん；嫌色素性がん；好酸球がん；好親和性腺がん；好塩基球がん；明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞腺がん；乳頭・濾胞腺がん；非被包性硬化性がん；副腎皮質がん；子宮内膜がん；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；脂腺がん；耳下腺がん；粘表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭状嚢胞腺がん；乳頭状漿液性嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性乳管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；乳腺パジェット病；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；腺扁平上皮化生；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜腫瘍；悪性顆粒膜細胞腫瘍；悪性アンドロブラストーマ；セルトリ細胞がん；悪性ライディッヒ細胞腫瘍；悪性脂質細胞腫瘍；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；グロマンギオ肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫；類上皮細胞型黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；混合ミュラー腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；がん肉腫；悪性間葉系腫瘍；悪性ブレナー腫瘍；悪性フィロデス腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；異形成腫瘍；胚細胞性がん；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛がん；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管外皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉系軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮歯肉腫；悪性エナメル状脾腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫瘍；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星細胞腫；原形星細胞腫；線維性星細胞腫；星芽腫；神経膠腫；乏突起膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉腫；小脳肉腫；神経節細胞芽腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；側肉芽腫；悪性小リンパ球性リンパ腫；悪性大細胞びまん性リンパ腫；悪性毛包性リンパ腫；菌状息肉腫；その他の特定非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤血白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核球性白血病；骨髄肉腫；および有毛細胞性白血病。ある特定の態様では、腫瘍は、骨肉腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、ユーイング肉腫、膠芽腫、神経芽腫、または白血病を含み得る。

いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、膵臓がん、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん、結腸および結腸直腸がん、頭頸部がん、胃（胃部）がん、卵巣がん、乳がん、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、子宮頸がん、脳がん、黒色腫を含む皮膚がん、および骨がんを治療するために使用される。いくつかの実施形態では、治療のために選択されるがんは、以下でさらに論じるように、種々の乳がんサブタイプを含む乳がんである。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片での治療のために選択される対象は、ＤＤＲ１タンパク質またはその一部を分泌するがんを有し、かつ／またはがん細胞の細胞表面に存在するＤＤＲ１タンパク質を有する。いくつかの実施形態では、がんの治療方法は、治療のためのがんが、ＤＤＲ１タンパク質を分泌するかどうか、および／またはがん細胞の表面上に発現されたＤＤＲ１タンパク質を有するかどうかを決定するステップを含む。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、悪性リンパ腫、ホジキン病、側肉芽腫、悪性小リンパ球性リンパ腫、悪性大細胞びまん性リンパ腫、悪性毛包性リンパ腫、菌状息肉腫、他の特定の非ホジキンリンパ腫、悪性組織球増殖症、多発性骨髄腫、肥満細胞肉腫、免疫増殖性小腸疾患、白血病、リンパ性白血病、形質細胞白血病、赤血白血病、リンパ肉腫細胞白血病、骨髄性白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、単球性白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、骨髄肉腫、および白血病を含むが、これらに限定されない血液学的または血液のがんの治療に使用される。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片での治療のために選択される対象は、ＤＤＲ１タンパク質またはその一部を分泌するがんを有し、かつ／またはがん細胞の細胞表面に存在するＤＤＲ１タンパク質を有する。いくつかの実施形態では、がんの治療方法は、治療のためのがんが、ＤＤＲ１タンパク質を分泌するかどうか、および／またはがん細胞の表面上に発現されたＤＤＲ１タンパク質を有するかどうかを決定するステップを含む。したがって、いくつかの実施形態では、対象においてがんを治療する方法は、対象において分泌されたＤＤＲ１タンパク質の存在、またはがん細胞の表面上にＤＤＲ１タンパク質の存在を決定することを含み、がん細胞が、分泌されたＤＤＲ１タンパク質を有するか、またはがん細胞の表面上に存在するＤＤＲ１を有すると決定された場合、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片の治療有効量を投与することによって、対象においてがんを治療することを含む。

２．乳がんの治療
いくつかの実施形態では、治療のためのがんは、乳がんであり、乳がんは、典型的には、乳房、通常は、乳管または乳葉の内層に由来する。乳がんには様々なタイプがあり、ステージ（広がり）、攻撃性、遺伝的構成が異なる。最良の治療では、１０年間の無病生存率は９８％～１０％まで変化する。治療は、手術、薬物（化学療法）、および放射線から選択される。米国では、２００４年に２１６，０００例の侵襲性乳がんの症例があり、４０，０００人が死亡した。世界的に、乳がんは、肺がんに次いで２番目に多いがんであり（男女を問わず、全がん発生率の１０．４％）、がんの死因としては５番目に多い。２００４年、乳がんは世界で５１９，０００人の死者を出した（がんによる死者の７％、全死亡者のほぼ１％）。乳がんは女性の頻度が男性の約１００倍であるが、生存率は男女とも等しい。

乳がんの最初の症状、または主観的徴候は、典型的には、周囲の乳房組織とは異なる違和感を生じるしこりである。メルクのマニュアルによると、乳がんの症例の８０％以上が、女性がしこりを感じたときに発見される。米国がん学会によると、医師が検出した乳がんの最初の医学的徴候、または客観的徴候は、マンモグラフィによって発見される。脇の下に位置するリンパ節に見られるしこりは、乳がんを示すこともある。しこり以外の乳がんの適応症としては、乳房の大きさまたは形状の変化、皮膚の陥没、乳頭の反転、または片方の乳頭からの自発的な分泌が挙げられ得る。疼痛（「乳房痛」）は、乳がんの有無を決定するためには信頼性の低いツールであるが、他の乳房の健康問題を示す可能性がある。

乳がん細胞が乳房の皮膚の皮膚リンパ管、小リンパ管に侵入するとき、その様相は、皮膚の炎症に類似している可能性もあるので、炎症性乳がん（ＩＢＣ）として知られている。炎症性乳がんの症状は、乳房全体にわたる疼痛、腫脹、熱感、および赤み、ならびに「ｐｅａｕｄ’ｏｒａｎｇｅ」と称されるオレンジ色の皮の質感を含む。乳がんのもう一つの報告されている複合的な症状は、乳房のパジェット病である。この症候群は、乳頭部分の皮膚の赤みや軽度の剥離などの湿疹様の皮膚の変化として現れる。パジェットが進行するにつれて、症状は、ピリピリ感、かゆみ、感受性の増加、灼熱感、および疼痛を含む場合がある。乳頭からの分泌物がある場合もある。パジェット病と診断された女性のおよそ半数も乳房にしこりがある。

時に、乳がんは、転移性疾患、すなわち、元の臓器を超えて広がったがんとして現れることがある。転移性乳がんは、転移の場所に依存する症状を引き起こすことになる。転移の一般的な部位には、骨、肝臓、肺、および脳が含まれる。原因不明の体重減少は、時に、発熱や悪寒の症状と同様に、潜伏乳がんを予感させる可能性がある。骨または関節の疼痛は、黄疸または神経症状と同様に、転移性乳がんの症状であることがある。これらの症状は、「非特異的」であり、多くの他の疾患の症状でもあり得ることを意味する。

同定されている主な危険因子は、性別、年齢、出産、ホルモン、高脂肪食、アルコール摂取、肥満、ならびにタバコの利用、放射線およびシフトワークなどの環境因子である。乳がんの症例の９５％については病因が知られていないが、新規の乳がんのおよそ５％は遺伝性症候群に起因する。特に、乳がん感受性遺伝子、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２のキャリアは、変異が発生するタンパク質の部分に応じて、乳がんおよび卵巣がんのリスクが３０～４０％増加する。専門家は、遺伝性乳がんの９５％は、これら２つの遺伝子の１つに遡ることができると考えている。遺伝性乳がんは、部位特異的遺伝性乳がん、乳房のみに影響を及ぼすがん、または乳房－卵巣および他のがん症候群の形態をとることができる。乳がんは、女性および男性の両方の親族から遺伝することができる。

乳がんサブタイプは、典型的には、免疫組織化学的に分類される。サブタイプの定義は一般的に次のとおりである：
・正常（ＥＲ＋、ＰＲ＋、ＨＥＲ２＋、サイトケラチン５／６＋、およびＨＥＲ１＋）
・ルミナルＡ（ＥＲ＋および／またはＰＲ＋、ＨＥＲ２－）
・ルミナルＢ（ＥＲ＋および／またはＰＲ＋、ＨＥＲ２＋）
・トリプルネガティブ（ＥＲ－、ＰＲ－、ＨＥＲ２－）
・ＨＥＲ２＋／ＥＲ－（ＥＲ－、ＰＲ－、およびＨＥＲ２＋）
・未分類（ＥＲ－、ＰＲ－、ＨＥＲ２－、サイトケラチン５／６－、およびＨＥＲ１－）

トリプルネガティブ乳がん細胞の場合、がんの成長は、エストロゲンまたはプロゲステロン、またはＨＥＲ２タンパク質から得られる成長シグナルによって駆動されない。同様に、そのようながん細胞は、タモキシフェンまたはアロマターゼ阻害剤などのホルモン療法、またはＨＥＲ２受容体を標的とする療法、例えば、ハーセプチン（登録商標）に応答しない。乳がんの約１０～２０％はトリプルネガティブであることが判明している。成功しそうにない治療法の費用と毒性の影響を回避することができるように、これらの種類のがんを同定して、トリプルネガティブ乳がんを治療するために使用することができる治療に焦点を当てることが重要である。他の形態の乳がんと同様に、トリプルネガティブ乳がんは、手術、放射線療法、および／または化学療法で治療することができる。特に有望なアプローチの１つは、手術の前に化学療法および／または放射線療法が提供される「ネオアジュバント」療法である。別の薬物療法は、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ、またはＰＡＲＰ阻害剤の使用である。

上述のスクリーニング技術は、がんの可能性を決定するのに有用であるが、単純嚢胞などの良性代替物とは対照的に、スクリーニングで検出されたしこりががんであるかどうかを確認するために、さらなる試験が必要である。臨床現場では、乳がんは、一般的に、臨床乳房検査（熟練の医師による乳房検査）、マンモグラフィ、および細針吸引細胞診の「トリプルテスト」を使用して診断される。スクリーニングにも使用されるマンモグラフィおよび臨床乳房検査の両方は、しこりががんであることのおよその可能性を示すことができ、任意の他の病変も同定することができる。局所麻酔薬を使用して外来処置として実施される細針吸引および細胞診（ＦＮＡＣ）では、しこりから少量の液体を抽出する試みを含む。透明な液体では、しこりががん性である可能性が非常に低くなるが、血液が混じった液は、がん性細胞の顕微鏡検査のために輸送されることがある。これら３つのツールを組み合わせて用いることで、乳がんを高い精度で診断することができる。生検の他のオプションには、乳房のしこりの一部を除去するコア生検、およびしこり全体が除去される切除生検が含まれる。

乳がんスクリーニングは、そうでなければ健康な個体においてがんを見つける試みである。女性の最も一般的なスクリーニング方法は、Ｘ線マンモグラフィと臨床乳房検査の組み合わせである。強いがんの家族歴を有する女性など、通常よりもリスクが高い女性では、追加のツールとして、遺伝子検査または乳房磁気共鳴画像診断が含まれる場合がある。

乳房の自己検診は、過去に強く提唱されたスクリーニングの一形態であったが、いくつかの大規模な研究が、それが女性にとって生存の利益をもたらさず、かなりの不安を引き起こすことも多いことを示したために、その後、失敗に終わった。これは、検出可能ながんがすでに比較的進行している傾向があったのに対し、他の方法では治癒的治療がより頻繁に可能な早期にがんを同定することが推奨されているためと考えられる。

Ｘ線マンモグラフィは、Ｘ線を使用して、特徴のない腫瘤またはしこりがないか乳房を検査する。いくつかの国では、定期的なマンモグラフィは、スクリーニングツールとして特定の年齢以上の女性に推奨されている。

乳がんの遺伝子検査は、典型的には、ＢＲＣＡ遺伝子の変異に関する検査を伴う。これは、乳がんのリスクが高いものを除いては、一般的に推奨されない手法である。

腫瘍の場所が特定されている場合には、乳がん治療の主体は、手術であり、アジュバントホルモン療法（タモキシフェンまたはアロマターゼ阻害剤を使用）、化学療法、および／または放射線療法を用いる可能性もある。現在、術後の推奨治療法（アジュバント療法）はパターンを踏襲している。臨床的基準（年齢、がんの種類、サイズ、転移）に応じて、患者は大まかに高リスク症例と低リスク症例に分けられ、各リスクカテゴリーは異なる治療ルールに従う。治療の可能性としては、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、および免疫療法が挙げられる。

標的がん療法は、がん細胞が迅速または異常な方法で成長することを可能にするタンパク質などの、がん細胞の特定の特徴を標的とする治療である。標的療法は、一般に、正常で健康な細胞を傷つける可能性が化学療法よりも低い。いくつかの標的療法は、自分の免疫系によって自然に作製される抗体のように働く抗体である。これらのタイプの標的療法は、免疫標的療法と呼ばれることがある。

現在、医師が乳がんの治療に用いる標的療法は３つある。ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）は、細胞が成長するように指示する化学シグナルを受け取るがん細胞の能力を遮断することによって、ＨＥＲ２陽性乳がんに対して作用する。タイケルブ（登録商標）（ラパチニブ）は、無制御の細胞成長を引き起こす可能性のある特定のタンパク質を遮断することにより、ＨＥＲ２陽性乳がんに対して作用する。アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）は、がん細胞が成長および機能するために依存する新しい血管の成長を遮断することによって機能する。

ホルモン（抗エストロゲン）療法は、２つの方法でホルモン受容体陽性乳がんに効果がある。第一に、体内のホルモンエストロゲンの量を減少させること、第二に、体内のエストロゲンの作用を遮断することである。女性の体内のエストロゲンのほとんどは卵巣によって作られている。エストロゲンはホルモン受容体陽性乳がんを成長させる。したがって、エストロゲンの量を減少させるか、またはその作用を遮断することは、ホルモン受容体陽性乳がんを縮小させ、ホルモン受容体陽性乳がんが舞い戻る（再発する）リスクを減少させるのに役立つ。ホルモン療法薬はホルモン受容体陰性乳がんに対しては有効ではない。

ホルモン療法薬には、アロマターゼ阻害剤、選択的エストロゲン受容体調節剤、およびエストロゲン受容体下方調節剤を含むいくつかの種類がある。ある場合には、ホルモン受容体陽性乳がんを治療するために、または乳がんになるリスクが非常に高い女性の予防措置として、卵巣および卵管が、外科的に除去され得る。卵巣は、薬剤を使用して一時的に閉鎖される場合もある。

治療計画においては、ＯｎｃｏｔｙｐｅＤＸのようなＰＣＲ検査や、遺伝子発現に基づいて乳がん再発リスクを予測するマイクロアレイ検査を使用することもできる。２００７年２月、第１回乳がん予知テストが米国食品医薬品局から正式に承認された。これは、早期乳がんを有する女性が５年後または１０年後に再発するかどうかを予測するのに役立つ新しい遺伝子検査であり、初期腫瘍がどれだけ積極的に治療されるかに影響を与える可能性がある。

放射線療法は、術後に残存し得るがん細胞の破壊を助けるためにも使用される。放射線は、正しい用量で投与されると、再発の危険性を５０～６６％低下させることができる。

したがって、いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、上述の乳がんの各サブタイプを含む乳がんを治療するために使用される。いくつかの実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、第２の治療剤と組み合わせて使用され、第２の治療剤は、本明細書に記載される１つ以上の薬剤（例えば、放射線、化学療法剤、ホルモン、および免疫療法剤）を含む。いくつかの実施形態では、細胞表面上にＤＤＲタンパク質を有するか、またはＤＤＲ１タンパク質を分泌すると判定される乳がんまたはそのサブタイプは、抗体または抗原結合断片で治療される。

３．線維性障害の治療
がんにおける発現に加えて、ＤＤＲ１タンパク質は、他の臓器のうち、腎臓、肺、消化管、皮膚、および脳においても発現され、皮膚、肺、および肝臓の線維症に関与している（Ｍｏｌｌ，ｅｔａｌ．２０１９、参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の抗ＤＤＲ１抗体またはその抗原結合断片を、単独でまたは他の治療法と組み合わせて使用して、線維性障害を治療することができる。いくつかの実施形態では、線維性障害は、臓器線維症である。いくつかの実施形態では、線維性障害は、皮膚、腎臓、肝臓、肺、または心臓の線維症である。いくつかの実施形態では、治療される線維性障害は、皮膚肥厚性瘢痕、特発性肺線維症、肝硬変および腎線維症であるが、これに限定されない。

いくつかの実施形態では、治療のための線維性障害は、肺の線維症である。いくつかの実施形態では、治療される対象は、間質性肺疾患を有する。いくつかの実施形態では、治療される対象は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または肺の瘢痕を有する。

Ｂ．製剤および投与
別の態様では、本開示は、抗ＤＤＲ１抗体およびそれを生成するための抗原を含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、予防的または治療的に有効な量の抗体またはその断片、および薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、米国連邦政府または州政府の規制当局によって承認されるか、または動物、特にヒトにおいて使用するために米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に記載されることを意味する。「担体」という用語は、治療剤とともに投与される希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、無菌液体、例えば、水および油であってもよく、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む。薬学的組成物が、静脈内投与される場合、水は、特定の担体である。生理食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。他の好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。

所望の場合、組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤等の形態をとることができる。経口製剤は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの医薬品グレードの標準的な担体を含むことができる。好適な医薬品の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は、患者に適切な投与のための形態を提供するように、適切な量の担体とともに、好ましくは精製された形態で、予防的有効量または治療有効量の抗体またはその断片を含有する。製剤は、経口、静脈内、動脈内、口腔内、鼻腔内、噴霧、気管支吸入、または人工呼吸器によって送達され得る、投与様式に適合しなければならない。

本明細書に記載の本開示の抗体は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、皮内、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、またはさらには腹腔内経路を介した注射用に製剤化することができる。あるいは、抗体は、粘膜への直接的な局所的経路によって、例えば、点鼻、吸入、またはネブライザーによって投与することができる。薬学的に許容される塩には、酸性塩、および無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などで形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来してもよい。

一般に、本開示の組成物の成分は、別々に供給されるか、または単位剤形で一緒に混合されて、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉密封された容器内の乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、それは、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を収容する注入ボトルで分配することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、中性形態または塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するもの等の陰イオンで形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するもの等の陽イオンで形成されるものが含まれる。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、疾患または障害、特に、乳がんなどのがんを治療するために有効量で投与される。投与される抗ＤＤＲ１抗体の量は、治療されるがんの特定のタイプ、治療されるがんの病期、投与様式、投与頻度、所望の治療効果、ならびに患者の年齢、体重、および他の特徴などの他のパラメータなどを含むがこれらに限定されない、様々な要因に依存するであろう。

治療的利益を提供するのに有効な投薬量は、インビボ動物モデルまたは臨床試験から最初に推定され得る。様々な疾患に対する好適な動物モデルは、当該技術分野において既知であり、特定のモードおよび投与頻度に対する治療的利益を提供するのに有効な用量の決定は、当業者の能力の範囲内である。

いくつかの実施形態では、抗ＤＤＲ１抗体またはその抗原結合断片は、０．０００１～１００ｍｇ／体重１ｋｇの範囲で投与され得る。利用可能な抗体組成物の多様性および様々な投与経路の異なる効率性を鑑みると、投与される投与量の幅広い変動が、予想される。これらの投与量レベルの変動は、当該技術分野で十分に理解されているように、最適化のための標準的な経験的ルーチンを使用して調整することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の適応症の治療のために、本開示の抗体の有効用量は、約０．００１～約７５ｍｇ／ｋｇ体重、０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１～５ｍｇ／体重１ｋｇの範囲であり得る。

Ｃ．細胞療法
別の態様では、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、本明細書に提供される抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端までに、リーダーペプチド、抗ＤＤＲ１重鎖可変ドメイン、リンカードメイン、抗ＤＤＲ１軽鎖可変ドメイン、ヒトＩｇＧ１－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、スペーサー領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、抗ＤＤＲ１細胞内共刺激シグナル伝達およびＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。

有効量の本開示の免疫細胞を投与する工程を含む、免疫療法のための方法も提供される。一実施形態では、医学的疾患または障害は、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の移入によって治療される。本開示のある特定の実施形態では、がんまたは感染は、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の移入によって治療される。個体におけるがんの治療または進行の遅延のための方法であって、個体に有効量の抗原特異的細胞療法を投与する工程を含む方法が本明細書に提供される。

免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはガンマデルタＴ細胞）、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはマクロファージであり得る。本明細書では、免疫細胞の産生および操作方法、ならびに養子細胞療法のために細胞を使用および投与する方法も提供され、この場合、細胞は、自家性または同種異系であり得る。したがって、免疫細胞は、例えば、がん細胞を標的とするためなどの免疫療法として使用され得る。

免疫細胞は、対象、特にヒト対象から単離され得る。免疫細胞は、健康なヒト対象、健康なボランティア、または健康なドナーから得ることができる。免疫細胞は、目的とする対象、例えば、特定の疾患もしくは状態を有することが疑われる対象、特定の疾患もしくは状態に対する素因を有することが疑われる対象、または特定の疾患もしくは状態に対する治療を受けている対象から得ることができる。免疫細胞は、血液、臍帯血、脾臓、胸腺、リンパ節、および骨髄を含むがこれらに限定されない、対象中の存在する任意の場所から収集され得る。単離された免疫細胞は、直接使用され得るか、または凍結などによって一定期間保存され得る。

免疫細胞は、血液（血液バンクもしくは臍帯血バンクによって収集される血液を含む）、脾臓、骨髄、外科的処置中に除去および／または曝露される組織、ならびに生検処置を介して得られる組織を含む、それらが存在する任意の組織から濃縮／精製され得る。免疫細胞が濃縮、単離、および／または精製される組織／臓器は、生存対象および非生存対象の両方から単離され得、非生存対象は、臓器ドナーである。特定の実施形態では、免疫細胞は、末梢血または臍帯血等の血液から単離される。いくつかの態様では、臍帯血から単離された免疫細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔ細胞抑制によって測定されるような、増強された免疫調節能力を有する。特定の態様では、免疫細胞は、増強された免疫調節能力のために、プールされた血液、特にプールされた脊髄血から単離される。プールされた血液は、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の供給源（例えば、ドナー対象）などの２個以上の供給源からであり得る。

免疫細胞の集団は、治療を必要とする対象、または免疫細胞活性の低下に関連する疾患に罹患している対象から得られ得る。したがって、細胞は、治療を必要とする対象にとって自家性である。あるいは、免疫細胞の集団は、ドナー、好ましくは組織適合性適合ドナーから得ることができる。免疫細胞集団は、末梢血、臍帯血、骨髄、脾臓、または免疫細胞が前述の対象もしくはドナーに存在する任意の他の臓器／組織から採取することができる。免疫細胞は、対象および／またはドナーのプールから、例えば、プールされた脊髄血から単離され得る。

免疫細胞集団が対象とは異なるドナーから得られる場合、ドナーは好ましくは同種異系であるが、得られる細胞が対象に導入され得るという点で対象適合性である。同種異系ドナー細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合であってもなくてもよい。対象適合性を付与するために、同種異系細胞を処理して、免疫原性を低下させることができる。

免疫細胞は、操作されたＴＣＲおよび／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体を発現するように遺伝子操作されることができる。例えば、宿主細胞（例えば、自家性または同種異系Ｔ細胞）は、がん抗原に対する抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように修飾される。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＴＣＲを発現するように操作される。ＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現するようにさらに操作され得る。異なる抗原に対するなどの複数のＣＡＲおよび／またはＴＣＲは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの単一細胞型に添加され得る。

好適な修飾方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，上記、およびＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照されたい。例えば、細胞は、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋｅｔａｌ．（２００８）およびＪｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．（２００９）に記載の形質導入技術を使用して、がん抗原に対する抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように形質導入され得る。

いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の抗原受容体をコードする遺伝子操作を介して導入される１つ以上の核酸、およびそのような核酸の遺伝子操作された産物を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、異種であり、すなわち、細胞から得られた細胞または試料、例えば、別の生物または細胞から得られたものには通常存在せず、例えば、操作される細胞および／またはそのような細胞が由来する生物には通常見られない。いくつかの実施形態では、核酸は、天然で見出されない核酸（例えば、キメラ）など、天然には存在しない。

Ｄ．併用療法
追加の抗がん療法と併せて、本開示の抗体を使用した併用治療を提供することも望ましい場合がある。これらの療法は、１つ以上の疾患パラメータの減少を達成するのに有効な組み合わせ量で提供される。このプロセスは、例えば、両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的製剤を使用することによって、または同時に２つの異なる組成物または製剤（１つの組成物は抗体を含み、もう１つの組成物はもう１つの薬剤を含む）を細胞／対象に接触させることによって、細胞／対象を両方の薬剤／療法と同時に接触させることを含み得る。

あるいは、抗体は、数分から数週間の範囲の間隔で他の治療に先行または後行することができる。一般的に、各送達時間の間に相当な期間が経過しないようにして、その結果、治療は、依然として細胞／対象に対して有利に組み合わされた効果を発揮することができる。そのような場合、互いに約１２～２４時間以内、互いに約６～１２時間以内、またはわずか約１２時間だけ遅らせて、両方のモダリティで細胞を接触させることが企図される。いくつかの状況では、治療期間を大幅に延長することが望ましい場合があるが、それぞれの投与の間に、数１０日（２、３、４、５、６、または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）が経過する。

抗ＤＤＲ１抗体または他の療法のいずれかの１つを超える投与が所望されることも考えられる。様々な組み合わせを用いることができ、ここで、抗体を「Ａ」、他の療法を「Ｂ」として、以下に、例を示す：
Ａ／Ｂ／ＡＢ／Ａ／ＢＢ／Ｂ／ＡＡ／Ａ／ＢＢ／Ａ／ＡＡ／Ｂ／ＢＢ／Ｂ／Ｂ／ＡＢ／Ｂ／Ａ／Ｂ
Ａ／Ａ／Ｂ／ＢＡ／Ｂ／Ａ／ＢＡ／Ｂ／Ｂ／ＡＢ／Ｂ／Ａ／ＡＢ／Ａ／Ｂ／ＡＢ／Ａ／Ａ／ＢＢ／Ｂ／Ｂ／Ａ
Ａ／Ａ／Ａ／ＢＢ／Ａ／Ａ／ＡＡ／Ｂ／Ａ／ＡＡ／Ａ／Ｂ／ＡＡ／Ｂ／Ｂ／ＢＢ／Ａ／Ｂ／ＢＢ／Ｂ／Ａ／Ｂ

他の組み合わせが企図される。本発明の方法および組成物を使用して、細胞を死滅させる、細胞成長を阻害する、転移を阻害する、血管新生を阻害する、またはそれ以外の方法で腫瘍細胞の悪性表現型を逆転または減少させるために、標的細胞または部位を抗体および少なくとも１つの他の治療法と接触させることができる。これらの療法は、がん細胞の死滅または増殖を阻害するのに有効な組み合わせ量で提供される。このプロセスは、細胞／部位／対象を、薬剤／療法と同時に接触させることを含み得る。

本開示の抗体との併用療法が企図される特定の薬剤としては、化学療法および造血幹細胞移植が挙げられる。化学療法としては、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）およびアントラサイクリン（最も多くの場合、ダウノルビシン）、高用量シタラビン単独、誘導化学療法に加えての、通常はアントラサイクリンに加えての、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、強化療法の完了後のヒスタミン二塩酸塩（Ｃｅｐｌｅｎｅ）とインターロイキン２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、大量化学療法に適さない６０歳以上の再発ＡＭＬ患者に対するゲムツズマブ・オゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）、クロファラビン、ならびに標的治療、例えば、キナーゼ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、およびＭＤＲ１（多剤耐性タンパク質）阻害剤、または三酸化ヒ素もしくは再発急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）が挙げられ得る。

ある特定の実施形態では、併用療法のための薬剤は、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリントポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリン、ダウノルビシン、ヌクレオシド代謝阻害剤、シタラビン、低メチル化剤、低用量シタラビン（ＬＤＡＣ）、ダウノルビシンおよびシタラビンの組み合わせ、注射用のダウノルビシンおよびシタラビンリポソーム、Ｖｙｘｅｏｓ（登録商標）、アザシチジン、Ｖｉｄａｚａ（登録商標）、デシタビン、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ヒ素、三酸化ヒ素、ヒスタミン二塩酸塩、Ｃｅｐｌｅｎｅ（登録商標）、インターロイキン－２、アルデスロイキン、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、ゲツムズマブオゾガマイシン、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、ＦＬＴ－３阻害剤、ミドスタウリン、Ｒｙｄａｐｔ（登録商標）、クロファラビン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、ＩＤＨ１阻害剤、イボシデニブ、Ｔｉｂｓｏｖｏ（登録商標）、ＩＤＨ２阻害剤、エナシデニブ、Ｉｄｈｉｆａ（登録商標）、スムーズンド（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）（ＳＭＯ）阻害剤、グラスデギブ、アルギナーゼ阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、エパカドスタット、ＢＣＬ－２阻害剤、ベネトクラクス、Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（登録商標）、白金複合体誘導体、オキサリプラチン、キナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、イブルチニブ、ＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（登録商標）、アカラブルチニブ、ＣＡＬＱＵＥＮＣＥ（登録商標）、ザヌブルチニブ、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＬＡＧ３抗体、ＩＣＯＳ抗体、ＴＩＧＩＴ抗体、ＴＩＭ３抗体、ＣＤ４０抗体、４－１ＢＢ抗体、ＣＤ４７抗体、ＳＩＲＰ１α抗体または融合タンパク質、Ｅ－セレクチン拮抗剤、腫瘍抗原に結合する抗体、Ｔ細胞表面マーカーに結合する抗体、骨髄細胞またはＮＫ細胞表面マーカーに結合する抗体、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物由来のアルカロイド、ホルモン療法薬、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、およびＰ糖タンパク質阻害剤からなる群から選択される１つ以上の薬物である。いくつかの実施形態では、併用療法で使用される薬剤は、特定の種類のがんなどの特定の適応症の療法として以前に使用された薬剤である。いくつかの実施形態では、特定の適応症は乳がんであり、抗体またはその抗原結合剤と併用される薬剤は、乳がんの治療として許容される薬剤である。

ＶＩ．抗体コンジュゲート
本開示の抗体は、抗体コンジュゲートを形成するために少なくとも１つの薬剤に連結され得る。診断剤または治療剤としての抗体分子の有効性を増加させるために、少なくとも１つの所望の分子または部分を連結または共有結合または複合体化することが従来の方法である。かかる分子または部分は、少なくとも１つのエフェクターまたはレポーター分子であり得るが、これらに限定されない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば、細胞傷害活性を有する分子を含む。抗体に結合されているエフェクター分子の非限定的な例としては、毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、放射性核種、抗ウイルス剤、キレート剤、サイトカイン、成長因子、およびオリゴまたはポリヌクレオチドが挙げられる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出され得る任意の部分として定義される。抗体にコンジュゲートされているレポーター分子の非限定的な例には、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、光親和性分子、着色粒子、またはビオチン等のリガンドが含まれる。

抗体－薬物コンジュゲートは、がん治療薬の開発にとって画期的なアプローチとして現れた。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞死滅薬物に共有結合的に連結されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。このアプローチは、抗原標的に対するＭＡｂの高い特異性と、強力な細胞傷害性薬物とを組み合わせ、抗原のレベルが濃縮された腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装した（ａｒｍｅｄ）」ＭＡｂをもたらす。薬物の標的送達はまた、正常組織におけるその曝露を最小限に抑え、毒性の低下および治療指数の改善をもたらす。２０１１年にＡＤＣＥＴＲＩＳ（アドセトリス）（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）、２０１３年にＫＡＤＣＹＬＡ（カドサイラ）（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ－ＤＭ１）の２つのＡＤＣ医薬品がＦＤＡによって承認されたことにより、このアプローチが確証された。現在、がん治療のために、臨床試験の様々な段階に３０を超えるＡＤＣ薬剤候補がある（Ｌｅａｌｅｔａｌ．，２０１４）。抗体工学およびリンカー－ペイロード最適化がますます成熟するにつれて、新しいＡＤＣの発見および開発は、このアプローチおよび標的化ＭＡｂの生成に適した新しい標的の同定および検証にますます依存している。ＡＤＣ標的についての２つの基準は、腫瘍細胞における上方制御／高レベルの発現および堅牢な内在化である。

抗体コンジュゲートはまた、診断剤として使用することも好ましい。抗体診断は、概して、様々な免疫アッセイ等のインビトロ診断における使用のためのものと、一般に「抗体－指向性画像診断」として知られるインビボ診断プロトコルにおける使用のためのものとの２つのクラスに分類される。多くの適切な撮像剤、ならびに抗体へのそれらの付着方法が当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３号、同第４，９３８，９４８号、および同第４，４７２，５０９号を参照されたい）。使用される撮像部位は、常磁性イオン、放射性同位体、蛍光色素、ＮＭＲ検出可能物質、およびＸ線撮像剤であり得る。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片に結合する部分は、常磁性イオンであり、とりわけ、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、および／またはエルビウム（ＩＩＩ）から選択することができ、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線撮像などの他の文脈で有用なイオンとして、限定されないが、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、および特にビスマス（ＩＩＩ）が挙げられる。

治療および／または診断用途のための放射性同位体の場合、同位体は、アスタチン^２１１、^１４炭素、^５１クロム、^３６塩素、^５７コバルト、^５８コバルト、銅^６７、^１５２Ｅｕ、ガリウム^６７、^３水素、ヨウ素^１２３、ヨウ素^１２５、ヨウ素^１３１、インジウム^１１１、^５９鉄、^３２リン、レニウム^１８６、レニウム^１８８、^７５セレン、^３５硫黄、テクネチウム^９９ｍおよび／またはイットリウム^９０から選択され得る。^１２５Ｉは、ある特定の実施形態において使用するために好ましいことが多く、テクネチウム^９９ｍおよび／またはインジウム^１１１も、それらの低エネルギーおよび長距離検出に対する好適性から好ましいことが多い。本開示の放射性標識されたモノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法に従って生成され得る。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムおよび／またはヨウ化カリウム、ならびに次亜塩素酸ナトリウムなどの化学的酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素的酸化剤との接触によってヨウ素化され得る。本開示によるモノクローナル抗体は、リガンド交換プロセスによって、例えば、第一スズ溶液で過テクネートを還元し、還元されたテクネチウムをＳｅｐｈａｄｅｘカラム上でキレート化し、抗体をこのカラムに適用することによって、テクネチウム^９９ｍで標識され得る。あるいは、例えば、過テクネート、ＳＮＣｌ_２などの還元剤、フタル酸ナトリウム－カリウム溶液などの緩衝液、および抗体をインキュベートすることによって、直接標識技術を使用してもよい。金属イオンとして存在する放射性同位体を抗体に結合するためにしばしば使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。

コンジュゲートとして使用することが企図される蛍光標識には、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲＸ、カスケードブルー（ＣａｓｃａｄｅＢｌｕｅ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６－ＦＡＭ、イソチオシアン酸フルオレセイン、ＨＥＸ、６－ＪＯＥ、オレゴングリーン（ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ）４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）、ＲＥＧ、ローダミングリーン（ＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ）、ローダミンレッド（ＲｈｏｄａｍｉｎｅＲｅｄ）、レノグラフィン（Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ）、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッド（ＴｅｘａｓＲｅｄ）が含まれる。

本開示で企図される別の種類の抗体コンジュゲートは、主にインビトロでの使用を意図したものであり、抗体は、発色基質との接触時に着色生成物を生成する二次結合リガンドおよび／または酵素（酵素タグ）に連結される。好適な酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、（ホースラディッシュ）水素ペルオキシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい二次結合リガンドは、ビオチンおよびアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。かかる標識の使用は、当業者によく知られており、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、および同第４，３６６，２４１号に記載されている。

さらに別の、抗体への分子の部位特異的結合の既知の方法は、抗体とハプテンベースの親和性標識との反応を含む。本質的に、ハプテンベースの親和性標識は、抗原結合部位のアミノ酸と反応し、それによってこの部位を破壊し、特異的抗原反応を遮断する。しかし、これは、抗体コンジュゲートによる抗原結合の喪失をもたらすため、有利ではない場合がある。

アジド基を含有する分子は、低強度紫外線によって生成される反応性ニトレン中間体を介してタンパク質への共有結合を形成するためにも使用され得る（ＰｏｔｔｅｒａｎｄＨａｌｅｙ，１９８３）。特に、プリンヌクレオチドの２－および８－アジド類似体を、部位指向性の光プローブとして使用して、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質が同定された（Ｏｗｅｎｓ＆Ｈａｌｅｙ，１９８７、Ａｔｈｅｒｔｏｎｅｔａｌ．，１９８５）。２－および８－アジドヌクレオチドはまた、精製されたタンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするために使用されており（Ｋｈａｔｏｏｎｅｔａｌ．，１９８９、Ｋｉｎｇｅｔａｌ．，１９８９、Ｄｈｏｌａｋｉａｅｔａｌ．，１９８９）、抗体結合剤として使用され得る。

抗体のそのコンジュゲート部分への結合またはコンジュゲートのためのいくつかの方法が当該技術分野で既知である。いくつかの付着方法は、例えば、抗体に付着したジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）、エチレントリアミン四酢酸、Ｎ－クロロ－ｐ－トルエンスルホンアミド、および／またはテトラクロロ－３α－６α－ジフェニルグリコウリル－３（米国特許第４，４７２，５０９号および同第４，９３８，９４８号）等の有機キレート剤を用いる金属キレート複合体の使用を伴う。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製される。米国特許第４，９３８，９４８号では、モノクローナル抗体を使用して乳房腫瘍の撮像を達成し、検出可能な撮像部分を、メチル－ｐ－ヒドロキシベンズイミデートまたはＮ－スクシンイミジル－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオネートなどのリンカーを使用して、抗体に結合させる。

他の実施形態では、抗体結合部位を変化させない反応条件を使用して、免疫グロブリンのＦｃ領域にスルフヒドリル基を選択的に導入することによる免疫グロブリンの誘導体化が企図される。この方法に従って生成された抗体コンジュゲートは、改善された寿命、特異性および感受性を示すことが開示されている（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１９６，０６６号）。レポーターまたはエフェクター分子が、Ｆｃ領域内の炭水化物残基にコンジュゲートされている、エフェクターまたはレポーター分子の部位特異的結合もまた、文献に開示されている（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙｅｔａｌ．，１９８７）。このアプローチは、現在臨床評価中の診断的および治療的に有望な抗体を産生することが報告されている。

ＶＩＩ．免疫検出方法
なおさらなる実施形態では、本開示は、結合、精製、除去、定量化、およびそれ以外の場合一般的にＤＤＲ１関連がんを検出するための免疫検出方法に関する。かかる方法は、従来の意味で適用することができるが、別の使用は、ワクチンおよび他のウイルスストックの品質管理および監視であり、ここで、本開示による抗体を使用して、ウイルス中のＨ１抗原の量または完全性（すなわち、長期安定性）を評価することができる。代替的に、方法を使用して、適切な／所望の反応性プロファイルについて様々な抗体をスクリーニングすることができる。

いくつかの免疫検出方法には、いくつか例を挙げると、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫放射線測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、およびウエスタンブロットなどが含まれる。特に、ＤＤＲ１の検出および定量化のための競合アッセイも提供される。種々の有用な免疫検出方法のステップは、例えば、ＤｏｏｌｉｔｔｌｅａｎｄＢｅｎ－Ｚｅｅｖ（１９９９）、ＧｕｌｂｉｓａｎｄＧａｌａｎｄ（１９９３）、ＤｅＪａｇｅｒｅｔａｌ．（１９９３）、およびＮａｋａｍｕｒａｅｔａｌ．（１９８７）などの科学文献に記載されている。一般に、免疫結合方法は、ＤＤＲ１関連がんを含有する疑いのある試料を得ることと、場合によっては、免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、本開示に従う第１の抗体とその試料を接触させることと、を含む。

これらの方法は、試料からＤＤＲ１またはＤＤＲ１関連がん細胞を検出または精製するための方法を含む。抗体は、好ましくは、カラムマトリックスの形態などの固体支持体に連結され、ＤＤＲ１関連がん細胞を含有する疑いのある試料は、固定化抗体に適用される。ＤＤＲ１発現細胞を固定化抗体に免疫複合体化したまま、不必要な成分はカラムから洗い流され、次いで、生物または抗原をカラムから除去することによって収集される。

免疫結合方法はまた、試料中のＤＤＲ１関連がん細胞または関連成分の量の検出および定量化、ならびに結合プロセス中に形成された任意の免疫複合体の検出および定量化のための方法を含む。本明細書では、ＤＤＲ１関連がん細胞を含有する疑いのある試料を得て、試料を、ＤＤＲ１に結合する抗体またはその構成要素と接触させ、続いて、特定の条件下で形成される免疫複合体の量を検出および定量する。抗原検出に関して、分析される生体試料は、組織切片もしくは標本、均質化組織抽出物、血液および血清を含む生体液、または糞便もしくは尿等の分泌物等のＤＤＲ１関連がんを含有すると疑われる任意の試料であってもよい。

選択された生体試料を、有効な条件下で、免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にするのに十分な期間にわたって抗体と接触させることは、一般的には、単に、抗体組成物を試料に追加し、抗体が免疫複合体を形成するのに十分な期間、すなわち、ＤＤＲ１に結合するのに十分な期間にわたって、混合物をインキュベートすることである。この時間の後、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロットまたはウエスタンブロットなどの試料－抗体組成物は一般に洗浄されて、任意の非特異的に結合した抗体種を除去し、一次免疫複合体内で特異的に結合した抗体のみが検出されることを可能にする。

一般に、免疫複合体形成の検出は、当該技術分野で周知であり、多数のアプローチの適用によって達成され得る。これらの方法は、概して、放射性、蛍光、生物学的、および酵素的タグのいずれかなどの標識またはマーカーの検出に基づいている。かかる標識の使用に関する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。もちろん、当該技術分野で既知であるように、第２の抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合配置等の二次結合リガンドの使用を通じて、さらなる利点を見出すことができる。

検出に用いられる抗体は、それ自体が、検出可能な標識に連結されてもよく、次いで、この標識を単純に検出し、それによって、組成物中の一次免疫複合体の量を決定することを可能にする。あるいは、一次免疫複合体内で結合するようになる第１の抗体は、抗体に対する結合親和性を有する第２の結合リガンドによって検出され得る。これらの場合では、第２の結合リガンドは、検出可能な標識に連結され得る。第２の結合リガンド自体が、したがって、「二次」抗体と称され得る抗体であることが多い。一次免疫複合体を、二次免疫複合体の形成を可能にするのに十分な期間、有効な条件下で、標識された二次結合リガンドまたは抗体と接触させる。次に、二次免疫複合体を一般的に洗浄して、任意の非特異的に結合した標識された二次抗体またはリガンドを除去し、次いで、二次免疫複合体中の残存する標識を検出する。

さらなる方法としては、２段階のアプローチによる一次免疫複合体の検出が挙げられる。上記のように、第２の結合リガンド、例えば、抗体に対する結合親和性を有する抗体が、二次免疫複合体を形成するために使用される。洗浄後、二次免疫複合体を、免疫複合体（三次免疫複合体）の形成を可能にするのに十分な期間、再び有効な条件下で、第２の抗体に対する結合親和性を有する第３の結合リガンドまたは抗体と接触させる。第３のリガンドまたは抗体は、検出可能な標識に連結され、このようにして形成される三次免疫複合体の検出を可能にする。このシステムは、望ましい場合、シグナル増幅を提供し得る。

１つの免疫検出方法は、２つの異なる抗体を使用する。第１のビオチン化抗体は、標的抗原を検出するために使用され、次いで、第２の抗体は、複合体化ビオチンに結合されたビオチンを検出するために使用される。その方法では、試験される試料は、最初に、第１のステップの抗体を含有する溶液中でインキュベートされる。標的抗原が存在する場合、抗体のいくつかは抗原に結合して、ビオチン化抗体／抗原複合体を形成する。次いで、抗体／抗原複合体は、ストレプトアビジン（またはアビジン）、ビオチン化ＤＮＡ、および／または相補的ビオチン化ＤＮＡの連続溶液中でのインキュベーションによって増幅され、各ステップは、抗体／抗原複合体にさらなるビオチン部位を付加する。増幅ステップは、好適なレベルの増幅が達成されるまで繰り返され、その時点で、試料は、ビオチンに対する第２のステップの抗体を含有する溶液中でインキュベートされる。この第２のステップ抗体を、例えば、クロモゲン基質を使用する組織酵素学によって抗体／抗原複合体の存在を検出するために使用することができる酵素で標識する。好適な増幅により、巨視的に見えるコンジュゲートを産生することができる。

免疫検出の別の既知の方法は、免疫－ＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）方法論を利用する。ＰＣＲ法は、ビオチン化ＤＮＡでのインキュベーションまではＣａｎｔｏｒ法と同様であるが、複数ラウンドのストレプトアビジンおよびビオチン化ＤＮＡのインキュベーションを使用する代わりに、ＤＮＡ／ビオチン／ストレプトアビジン／抗体複合体を、抗体を放出する低ｐＨまたは高塩緩衝液で洗浄する。次いで、得られた洗浄液を使用して、適切な対照を有する好適なプライマーでＰＣＲ反応を実施する。少なくとも理論的には、ＰＣＲの膨大な増幅能力および特異性を利用して、単一の抗原分子を検出することができる。

Ａ．ＥＬＩＳＡ
免疫アッセイは、その最も単純かつ直接的な意味で、結合アッセイである。ある特定の好ましい免疫測定法は、当該技術において既知である様々な種類の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）である。組織切片を用いた免疫組織化学的検出も特に有用である。しかしながら、検出はそのような技術に限定されず、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、ＦＡＣＳ分析なども使用され得ることは容易に理解されるであろう。

１つの例示的なＥＬＩＳＡでは、本開示の抗体は、ポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェル等の、タンパク質親和性を示す選択された表面上に固定される。次に、ＤＤＲ１関連がん細胞を含有する疑いのある試験組成物をウェルに添加する。非特異的に結合した免疫複合体を除去するために結合および洗浄した後、結合した抗原が検出され得る。検出は、検出可能な標識に結合される別の抗－ＤＤＲ１抗体を添加することによって達成され得る。この種類のＥＬＩＳＡは、単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出はまた、第２の抗－ＤＤＲ１抗体の添加、続いて、第２の抗体に対する結合親和性を有する第３の抗体の添加によって達成され得、第３の抗体は、検出可能な標識に連結される。

別の例示的なＥＬＩＳＡでは、ＤＤＲ１関連がん細胞を含有すると疑われる試料をウェル表面に固定し、次いで、本開示の抗ＤＤＲ１抗体と接触させる。非特異的に結合した免疫複合体を除去するために結合および洗浄した後、結合した抗ＤＤＲ１抗体が検出される。初期抗ＤＤＲ１抗体が検出可能な標識に連結される場合、免疫複合体は、直接検出され得る。再び、免疫複合体は、第１の抗－ＤＤＲ１抗体に対する結合親和性を有する第２の抗体を使用して検出されてもよく、第２の抗体は検出可能な標識に連結されている。

採用する形式にかかわらず、ＥＬＩＳＡは、コーティング、インキュベート、および結合、非特異的に結合した種を除去するための洗浄、ならびに結合した免疫複合体の検出などの共通するある種の特徴を有する。これらについては、以下に記載される。

プレートを抗原または抗体のいずれかでコーティングする際には、概して、プレートのウェルを、抗原または抗体の溶液とともに、一晩または特定の時間、インキュベートすることになる。次いで、プレートのウェルを洗浄して、吸着が不完全な材料を除去する。次に、ウェルの任意の残りの利用可能な表面を、試験抗血清に関して抗原的に中性である非特異的タンパク質で「コーティング」する。これらには、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、またはミルクパウダーの溶液が含まれる。コーティングにより、固定化表面上の非特異的吸着部位の遮断が可能になるため、表面上への抗血清の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドが減少される。

ＥＬＩＳＡにおいては、直接的な処置ではなく、二次的または三次的な検出手段を使用する方が慣例的である。したがって、タンパク質または抗体をウェルに結合させ、非反応性材料でコーティングしてバックグラウンドを減少させ、非結合性材料を除去するために洗浄した後、固定化された表面を、免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするのに有効な条件下で、試験される生体試料と接触させる。次に、免疫複合体の検出には、標識された二次結合リガンドまたは抗体、および標識された三次抗体または第３の結合リガンドと併せた二次結合リガンドまたは抗体が必要である。

「免疫複合体（抗原／抗体）の形成を可能にするのに有効な条件下で」とは、条件が、好ましくは、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎなどの溶液で抗原および／または抗体を希釈することを含むことを意味する。これらの添加剤はまた、非特異的なバックグラウンドの減少を補助する傾向がある。

「適切な」条件はまた、インキュベーションが有効な結合を可能にするのに十分な温度または期間にあることを意味する。インキュベーションステップは、典型的には、約１～２～４時間程度、好ましくは２５℃～２７℃程度の温度であるか、または約４℃程度で一晩であってもよい。

ＥＬＩＳＡ中のすべてのインキュベーションステップに続いて、接触した表面を洗浄して、複合体化されていない材料を除去する。好ましい洗浄手順は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ、またはホウ酸緩衝液などの溶液で洗浄することを含む。試験試料と最初に結合した物質との間で特異的な免疫複合体が形成され、その後に洗浄された後、微量の免疫複合体の発生が決定され得る。

検出手段を提供するために、第２または第３の抗体は、検出を可能にするための関連する標識を有する。好ましくは、これは、適切な発色基質とインキュベートする際に発色を生成する酵素である。したがって、例えば、第１および第２の免疫複合体を、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは水素ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体と一定期間、およびさらなる免疫複合体形成の発達に有利な条件下で、接触またはインキュベートする（例えば、ＰＢＳ－ＴｗｅｅｎなどのＰＢＳ含有溶液中で室温で２時間インキュベート）ことを望むであろう。

標識された抗体とのインキュベーション、および非結合物質を除去するための洗浄の後、例えば、酵素標識としてのペルオキシダーゼを用いた場合、尿素、またはブロモクレゾールパープル、または２，２’－アジノ－ジ（３－エチル－ベンズチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）、またはＨ_２Ｏ_２などの発色性基質を用いてインキュベーションすることにより、標識の量が定量化される。次いで、例えば、可視スペクトル分光光度計を使用して生成される色の程度を測定することによって、定量化を達成する。

Ｂ．ウエスタンブロット
ウエスタンブロット（代替的に、タンパク質免疫ブロット）は、所与の組織ホモジネートまたは抽出物の試料中の特定のタンパク質を検出するために使用される分析技術である。それは、ゲル電気泳動を使用して、ポリペプチドの長さ（変性条件）またはタンパク質の３Ｄ構造（天然／非変性条件）によって天然または変性タンパク質を分離する。次いで、タンパク質をメンブレン（典型的には、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）に移し、そこで標的タンパク質に特異的な抗体を使用してプローブ（検出）する。

試料は、組織全体から、または細胞培養物から採取され得る。多くの場合、固体組織は、最初にブレンダー（より大きな試料体積の場合）を使用して、ホモジナイザー（より小さい体積）を使用して、または超音波処理によって、機械的に分解される。細胞は、上記の機械的方法の１つによって開放されてもよい。しかしながら、細菌、ウイルス、または環境試料は、タンパク質の供給源であり得、したがって、ウエスタンブロッティングは、細胞研究のみに限定されないことに留意すべきである。様々な洗剤、塩、および緩衝液を用いて、細胞の溶解を促し、タンパク質を可溶化できる。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤が、しばしば添加されて、それ自体の酵素による試料の消化を防止する。組織調製は、多くの場合、タンパク質の変性を回避するために低温で行われる。

試料のタンパク質は、ゲル電気泳動を使用して分離される。タンパク質の分離は、等電点（ｐＩ）、分子量、電荷、またはこれらの因子の組み合わせによってであり得る。分離の性質は、試料の処理およびゲルの性質に依存する。これは、タンパク質を決定するために非常に有用な方法である。また、単一の試料からタンパク質を２次元に広げる２次元（２Ｄ）ゲルを使用することも可能である。タンパク質は、第１の次元では等電点（中性正味電荷を有するｐＨ）に従って、および第２の次元では分子量に従って分離される。

抗体検出にアクセス可能なタンパク質を作製するために、それらをゲル内からニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）で作製されたメンブレン上に移動させる。メンブレンはゲルの上に置かれ、その上にろ紙が積み重ねて置かれる。スタック全体を緩衝液中に入れ、キャピラリー作用によって紙まで移動させ、タンパク質はそれと一緒に運ばれる。タンパク質を移動させるための別の方法は、電気ブロッティングと呼ばれ、電流を使用して、タンパク質をゲルからＰＶＤＦまたはニトロセルロースメンブレンに引き込む。タンパク質は、ゲル内の構成を維持しながら、ゲル内からメンブレン上に移動する。このブロッティングプロセスの結果として、タンパク質は、検出のために薄い表面層上に露出される（以下を参照のこと）。両方の種類のメンブレンは、その非特異的なタンパク質結合特性（すなわち、すべてのタンパク質を等しく良好に結合する）のために選択される。タンパク質結合は、疎水性相互作用、ならびにメンブレンとタンパク質との間の荷電相互作用に基づいている。ニトロセルロースメンブレンは、ＰＶＤＦよりも安価であるが、はるかに壊れやすく、反復されるプロービングに対して耐性がない。ゲルからメンブレンへのタンパク質の移動の均一性および全体的な有効性は、メンブレンをクマシーブリリアントブルーまたはポンソーＳ染料で染色することによって確認することができる。転写されると、タンパク質は、標識された一次抗体、または非標識の一次抗体を使用して検出され、続いて、一次抗体のＦｃ領域に結合する標識されたプロテインＡまたは二次標識された抗体を使用して間接的に検出される。

Ｃ．免疫組織化学
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、免疫組織化学（ＩＨＣ）による研究のために調製された新鮮凍結および／またはホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックの両方と併せて使用されてもよい。これらの微粒子標本から組織ブロックを調製する方法は、様々な予後因子の以前のＩＨＣ研究で首尾よく使用されており、当業者に周知である（Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，１９９０、Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏｅｔａｌ．，１９９０、Ａｌｌｒｅｄｅｔａｌ．，１９９０）。

簡潔に述べると、凍結切片は、５０ｎｇの凍結された「粉砕された」組織を室温でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再水和すること、遠心分離によって粒子をペレット化すること、粘性包埋培地（ＯＣＴ）中に粒子を再懸濁させること、遠心分離によってカプセルおよび／もしくはペレットを再度反転させること、－７０℃のイソペンタン中で急速凍結すること、プラスチックカプセルの切断および／もしくは凍結した組織シリンダーの取り出すこと、組織シリンダーをクライオスタットミクロトームチャックへ固定すること、ならびに／またはカプセルから２５～５０個の連続切片を切り出すこと、によって調整され得る。あるいは、全凍結組織試料が、連続切片を切り出すために使用され得る。

永久切片は、プラスチックマイクロ遠心チューブ中の５０ｍｇの試料を再水和すること、ペレット化、１０％のホルマリン中に再懸濁して４時間固定化すること、洗浄／ペレット化、温かい２．５％の寒天中で再懸濁させること、ペレット化、寒天を硬化させるために氷水中で冷却すること、チューブから組織／寒天ブロックを除去すること、ブロックをパラフィン中に浸潤および／もしくは包埋すること、ならびに／または最大５０個の連続永久切片を切り出すことを含む同様の方法によって調製され得る。再び、組織試料全体が置換され得る。

Ｄ．免疫検出キット
なおさらなる実施形態では、本開示は、上述の免疫検出方法とともに使用するための免疫検出キットも企図する。抗体は、ＤＤＲ１関連がん細胞を検出するために使用され得るので、抗体は、キットに含まれ得る。したがって、免疫検出キットは、適切な容器手段中に、ＤＤＲ１に結合する第１の抗体、および任意選択で免疫検出試薬を含む。

ある特定の実施形態では、抗体は、カラムマトリックスおよび／またはマイクロタイタープレートのウェルなどの固体支持体に事前に結合され得る。キットの免疫検出試薬は、所与の抗体に関連付けられているか、または結合している検出可能な標識を含む、様々な形態のうちのいずれか１つを採用することができる。二次結合リガンドに関連するか、または二次結合リガンドに結合する検出可能な標識も企図される。例示的な二次リガンドは、第１の抗体に対して結合親和性を有する二次抗体である。

本キットで使用するためのさらなる好適な免疫検出試薬としては、第１の抗体に対する結合親和性を有する二次抗体を含む二成分の試薬と、第２の抗体に対する結合親和性を有する第３の抗体が挙げられ、第３の抗体は検出可能な標識に連結されている。上述のように、いくつかの例示的な標識は当該技術分野で既知であり、すべてのそのような標識は、本開示に関連して用いられ得る。

検出アッセイの標準曲線を作成するために使用できるように、標識または非標識にかかわらず、このキットは、ＤＤＲ１の適切に等分された組成物をさらに含み得る。キットは、完全にコンジュゲートされた形態、中間体の形態、またはキットの使用者によってコンジュゲートされる別個の部分のいずれかで、抗体標識コンジュゲートを含有し得る。キットの構成要素は、水性媒体または凍結乾燥された形態のいずれかで包装され得る。

キットの容器手段は、一般に、抗体を入れることができるか、または好ましくは分注することができる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含む。本開示のキットはまた、典型的には、抗体、抗原、および任意の他の試薬容器を商業的販売のために厳重に封じ込めて含有するための手段を含む。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形のプラスチック容器を含み得る。

Ｅ．フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ
本開示の抗体は、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳでも使用することができる。フローサイトメトリーは、細胞計数、細胞選別、バイオマーカー検出およびタンパク質工学を含む多くの検出アッセイで使用されるレーザーまたはインピーダンスに基づく技術である。この技術は、細胞を流体の流れに懸濁させ、それらを電子検出装置に通過させることで、毎秒最大数千個の粒子の物理的および化学的特性の同時多パラメトリック的分析を可能にする。フローサイトメトリーは、障害、特に血液がんの診断において日常的に使用されるが、基礎研究、臨床実践および臨床試験においても多くの他の用途を有する。

蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）は、サイトメトリーの専門的なタイプである。各細胞の特定の光散乱および蛍光特性に基づいて、一度に１つの細胞ずつ、生体細胞の異種混合物を２つ以上の容器に選別するための方法を提供する。一般に、本技術は、急速に流れる液体の狭い流れの中心に巻き込まれる細胞懸濁液を含む。フローは、その直径に対して細胞間に大きな分離があるように配置される。振動機構は、細胞の流れを個々の液滴に分解させる。流れが液滴に分解する直前に、フローは、各細胞の蛍光が測定される蛍光測定ステーションを通過する。電気帯電リングは、流れが液滴に分解する地点に配置されている。電荷は、蛍光強度が測定される直前に、リング上に置かれ、反対の電荷は、流れから崩壊する際に、液滴上に捕捉される。次いで、帯電した液滴は、その電荷に基づいて液滴を容器に分流させる静電偏向システムを通って落下する。

特定の実施形態では、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳで使用されるために、本開示の抗体は、フルオロフォアで標識され、次いで、フローサイトメトリーで分析されるか、またはＦＡＣＳ機器によって選別される目的の細胞に結合させる。

ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。当業者であれば、以下の実施例に開示される技術が、発明者が本発明の実施において良好に機能することを発見した技術を表しており、したがって、その実施のための好ましいモードを構成しているとみなすことができることを理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多数の変更を行うことが可能であり、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、なおも同様または類似の結果が得られることを理解されたい。

実施例１－材料および方法
ＣＲＩＳＰＲＫＯ。ＤＤＲ１ｓｇＲＮＡＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅレンチベクターセット（ＡＢＭ；カタログ番号Ｋ４３３１００５）を製造元の指示に従って使用して、ＤＤＲ１をＭ－ＷＮＴ、ＡＴ－３、およびＥ０７７１においてノックアウトした。簡潔に述べると、レンチウイルスパッケージングは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１６６８０２７）により、ＤＤＲ１ＫＯベクターおよび２つのヘルパーベクター（ｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２．Ｇ）を用いて同時トランスフェクションすることによって、実施した。２日後、レンチウイルス含有上清を回収し、標的腫瘍細胞に感染させるために使用した。単一クローンを採取し、抗生物質選択後に拡大した。すべての選択されたＫＯクローンのゲノムＤＮＡを抽出し、配列決定して、所望の変異を検証した。ｓｇＲＮＡ配列は、以下のとおりである：ｓｇＲＮＡ１、ＡＡＧＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧ（配列番号：３０３）；ｓｇＲＮＡ２、ＴＧＴＧＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧ（配列番号：３０４）；ｓｇＲＮＡ３、ＧＡＣＣＡＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＧ（配列番号：３０５）。スクランブルｓｇＲＮＡ配列を対照として使用した。

ウエスタンブロッティング。細胞溶解物調製のため、細胞をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で溶解した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、２３２２５）によって評価した。次いで、タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって実行し、確立されたプロトコルに従ってメンブレンに移した。一次抗体は、抗ＤＤＲ１（希釈：１：１０００；ＣＳＴ、５５８３Ｓ）および抗ＧＡＰＤＨ（希釈：１：５０００；ＣＳＴ、２１１８Ｓ）である。

調節した培地中でタンパク質を回収するために、培地を回収し、６，０００ｒｐｍで遠心分離した後、０．４５ｕｍの細孔サイズを有するろ紙に通過させ、任意の細胞破片を除去した。培地にＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施し、続いて、抗ＤＤＲ１ＥＣＤ抗体（希釈：１：１０００；Ｒ＆Ｄ、ＡＦ２３９６）で免疫ブロットした。

ｑＲＴ－ＰＣＲ。ＲＮＡ抽出およびＲＴ－ｑＰＣＲを、以前記載されているように行った（Ｓｕｎｅｔａｌ．，２０１８）。簡潔に述べると、ＩｍＰｒｏｍ－ＩＩ逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ３８００）を使用してＲＮＡを逆転写し、ＬｕｍｉｎａｒｉｓＣｏｌｏｒＨｉＧｒｅｅｎｑＰＣＲマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ０３６４）を使用して、リアルタイムＰＣＲを設定した。関連するプライマーは、ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒソフトウェアを通じて作製した。プライマー配列は以下のとおりである：

ＭＴＴ。腫瘍細胞を９６ウェルプレートに播種し、分析する前に、指定された期間培養した。回収日に、ＭＴＴ溶液（３ｍｇ／ｍｌ）を個々のウェルに加え、プレートを１時間インキュベートした。その後、培地を除去し、紫色の沈殿物を１００μｌのＤＭＳＯによって溶解させた。５７０ｎｍにおける吸光度を個々のウェルについて測定した。

腫瘍細胞の遊走および浸潤。細胞遊走のために、腫瘍細胞を血清なしの培養培地に懸濁させ、次いでトランスウェルチャンバの上に播種した。１０％のＦＢＳを有する培地をチャンバの下部に配置した。細胞を１２時間培養した後、分析した。

細胞湿潤のために、マトリゲルマトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４４８３）を製造業者の指示に従ってインサートに充填し、３７℃で３０分間インキュベートした。腫瘍細胞を、下部チャンバ内の１０％のＦＢＳ含有培地を用いて、インサートの上部チャンバに播種した。次いで、細胞を３７℃で２０時間インキュベートした。上部チャンバの上側の細胞を穏やかに除去し、上部チャンバの下側の細胞をクリスタルバイオレットで染色し、６つのランダムフィールドを標準顕微鏡で計数した。

マウス処置および腫瘍研究。すべての動物実験は、ジョージ・ワシントン大学の動物愛護および使用機関委員会（ｔｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅａｔｔｈｅＧｅｏｒｇｅＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって承認された。８週齢のＷＴＣ５７ＢＬ／６（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂ、０００６６４）、Ｒａｇ１^－／－（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂ、００２２１６）またはヌード（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂ、００２０１９）マウスを、腫瘍研究に使用した。Ｅ０７７１、ＡＴ－３およびＭ－Ｗｎｔ細胞を、それぞれ接種当たり５×１０^５、２×１０^５、および２×１０^５細胞の用量で、マウス乳腺脂肪パッド中に１００μｌの体積で注射した。腫瘍体積（０．５×長さ×幅^２）を、指示された日にキャリパーを用いて測定した。腫瘍回収時に、腫瘍を計量し、試料を免疫表現型分類およびＩＨＣに使用した。

腫瘍移植アッセイのために、まず、腫瘍細胞をＲａｇ１^－／－マウスに接種した。腫瘍体積がおよそ２００～３００ｍｍ^３に達したとき（通常、接種後２０日）、６０ｍｇの腫瘍オルガノイドをＷＴＣ５７ＢＬ／６マウスに移植した。１２日目に、免疫染色のために腫瘍試料を収集した。

腫瘍再チャレンジ実験のために、ＷＴＣ５７ＢＬ／６マウスに、まず、鼠径部乳腺脂肪パッドの片側に、５０万個のＤＤＲ１ＫＯＥ０７７１またはＰＢＳ単独を接種した。３０日後、同じマウスに乳腺脂肪パッドの両側に５０万個のＤＤＲ１ＷＴＥ０７７１腫瘍細胞を接種した。腫瘍体積を上述のように測定した。

ＤＤＲ１抗体をインビボで処置するために、サイズが１００ｍｍ^３より大きくなった後、実験の終了まで、１０ｍｇ／ｋｇで隔日で、自家製対照ＩｇＧおよび抗ｈｕＤＤＲ１ＥＣＤ抗体の両方を腫瘍に局所的に注入した。

脱細胞化。Ｅ０７７１細胞を、５μｍの孔径（Ｃｏｓｔａｒ、ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．、３４２２）を有する挿入物中に、挿入物当たり２，０００個の細胞で播種し、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋１％のＰＳ培地中で２日間培養した。得られたＤＤＲ１ＷＴまたはＫＯ細胞からのＥＣＭをＰＢＳで洗浄し、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００および２０ｍＭのＮＨ_４ＯＨを含有するＰＢＳ中で３７℃で５分間インキュベーションすることによって脱細胞化した。脱細胞化されたＥＣＭをＰＢＳで３回洗浄し、続いて、蒸留水で３回すすぎ、直ちにＴ細胞遊走実験で使用した。

インビトロＣＤ８^＋Ｔ細胞単離および遊走アッセイ。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＣＤ８^＋ネガティブ単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１９８５３）を製造者マニュアルに従って使用して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６ナイーブマウスの脾細胞から単離した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞遊走アッセイを、６．５ｍｍのポリカーボネート膜および５μｍ孔径のインサート（Ｃｏｓｔａｒ、ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．、３４２２）を用いて行った。５０万個の精製されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を上部チャンバに添加し、組換えＣＣＬ２１（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄシステム、４５７６Ｃ０２５ＣＦ）の存在下で、底部チャンバ内の腫瘍条件付け培地とともに３７℃で２時間遊走させた。底部チャンバに遊走したＣＤ８^＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって定量した。ｈｕＤＤＲ１抗体中和のために、抗体を最初に３７℃で条件付け培地と１時間共インキュベートし、次いで、上記の手順に従った。

第二次高調波発生および免疫蛍光。マウス乳房腫瘍組織を埋め込み、－８０℃で最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中で保存した。切断前に、試料を少なくとも２時間－２０℃とし、２０μｍ厚の切片をクライオスタットを使用して切断した。スライドを解凍し、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、沸騰抗原マスキング解除溶液（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ、Ｈ－３３００）に１０分間移した。試料を、ＣＤ３ｅ（ＢＤ、５５３０５７）一次抗体およびＡｌｅｘａ－４８８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）二次抗体とともにインキュベートした。各腫瘍切片に蛍光Ｇ培地（ＶＷＲ）を加え、顕微鏡のカバースリップ（Ｎｏ１．５）に取り付けた。

すべての試料を、ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ８多光子共焦点顕微鏡を使用して画像化し、２０倍、ＨＣＰＬＡｐｏ、ＮＡ０．７油浸対物レンズを、実験全体を通して使用した。

８４０ｎｍまでの励起波長（Ｅｒｉｋｓｏｎｅｔａｌ．，２００７）を調整し、４２０±５ｎｍの狭帯域通過放出フィルタを用いて、コラーゲンのＳＨＧシグナルを検出した。ＳＨＧ信号は、２つの入射光の光子がコラーゲン繊維の非中心対称構造と相互作用するときに生成され、結果として、入射光子の波長の半分の波長を持つ光子が得られる。ＬＡＳＸソフトウェアを使用して、１０２４×１０２４ピクセルの画像を取得した。コラーゲン測定は、ＣＴＦｉｒｅソフトウェア（ｌｏｃｉ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｃｔｆｉｒｅで自由に入手可能）を使用して行った。腫瘍縁部分析からのコラーゲンについては、腫瘍の境界から６０μｍの面積をとった。

免疫組織化学染色（ＩＨＣ）。マウス乳房腫瘍組織を１０％の緩衝ホルマリン（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３－４２７０９８）で４℃で一晩固定した。固定腫瘍試料をパラフィンに埋め込み、染色のために４μｍの切片に切断した。試料を脱パラフィン化し、ＰＢＳ中で再水和した。切片を抗原マスキング解除溶液（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ、Ｈ－３３００）で２０分間煮沸し、次いで、ＰＢＳ中１０％の正常ヤギ血清で１時間ブロッキングした。ＣＤ８（Ｂｉｏｒｂｙｔ、ｏｒｂ１０３２５）およびＣＤ４（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｃ．、５０１３４－Ｒ００１）一次抗体を４℃で一晩インキュベートした。一次抗体の検出には、ＡＢＣペルオキシダーゼ検出システム（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ、ＰＫ－６１０５）を製造業者の指示に従って使用し、ＤＡＢ（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ、ＳＫ－４１０５）を基質として使用した。

ＣＤ８^＋Ｔ細胞枯渇および養子移入。ＣＤ８^＋Ｔ細胞枯渇に関して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、腫瘍接種の２日前に、２００μｇ／マウスの抗マウスＣＤ８（クローン２．４３、ＢｉｏｘＣｅｌｌ、ＢＥ００６１）またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（クローンＬＴＦ－２、ＢｉｏｘＣｅｌｌ、ＢＥ００９０）を腹腔内投与し、次いで、週２回投与した。

ＣＤ８^＋Ｔ細胞の養子移入については、腫瘍接種の１７日後、精製されたＣＤ８^＋Ｔ細胞（＞９０％）を、５×１０^６細胞／マウスの濃度で、Ｅ０７７１乳腺腫瘍を有するＲａｇ１^－／－マウスに移した。

ピクロシリウスレッド染色。固定された乳房腫瘍試料を調製し、すでに記載されているように切片化した（Ｓｕｎｅｔａｌ．，２０１８）。簡潔に述べると、パラフィン包埋された腫瘍組織を４μｍのスライドに切断し、ピクロシリウスレッド染色キット（Ａｂｃａｍ，カタログ番号番号ａｂ１５０６８１）で染色した。切片を脱パラフィン化し、蒸留水中で水和し、ピクロシリウスレッド溶液をスライドに１時間塗布した。次いで、スライドを酢酸溶液中ですすぎ、絶対アルコール中で脱水した。次いで、取り付けられたスライドを標準顕微鏡下で調べ、陽性コラーゲンファイバーシグナルをＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量化した。

ＥＬＩＳＡ。Ｉ型コラーゲンをＰＢＳ中で５０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート（５０μｌ／ウェル）に添加した。プレートを密封し、室温で一晩インキュベートし、洗浄緩衝液（Ｒ＆Ｄ、ＷＡ１２６）で３回洗浄し、次いで、２００μｌの試薬希釈剤（Ｒ＆Ｄ、ＤＹ９９５）で１時間ブロッキングした。３回洗浄した後、１００μｌの条件付き培地または組換えＥＣＤ（標準として使用、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０７３０－Ｈ０８Ｈ）をプレートに室温で２時間添加した。続いて、３回洗浄し、１００μｌの希釈抗ＤＤＲ１Ｎ末端抗体（１：５００、Ｒ＆Ｄ、ＡＦ２３９６）を添加し、２時間インキュベートした。ビオチン結合抗体との１時間の反応後、１：２０００（Ｒ＆Ｄ、８９３９７５）の希釈でストレプトアビジン－ＨＲＰを各ウェルに添加し、暗所で２０分間インキュベートした。１００μｌの基質溶液（Ｒ＆Ｄ、ＤＹ９９９）を添加し、さらに２０分間インキュベートした。５０μｌのストップ溶液（Ｒ＆Ｄ、ＤＹ９９４）を添加した後、プレートをＥＬＩＳＡリーダーにて４５０ｎｍにて分析した。

フローサイトメトリー。細胞を、ＰＢＳ中で１：１０００の希釈で、暗所で４℃で２０分間、ＧｈｏｓｔＤｙｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ４５０（ＴｏｎｂｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１３－０８６３－Ｔ１００）を使用して生存率について染色し、続いて、ＰＢＳで洗浄した。試料を抗ＣＤ１６／３２で１：１００の希釈でブロッッキングした（クローン２．４Ｇ２、ＴｏｎｂｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、７０－０１６１－Ｕ１００）。抗体を暗所で４℃で３０分間インキュベートした。以下の市販抗体を使用した：ＣＤ４５－ＢＶ６４５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、６４－０４５１－８２）、ＣＤ３－ｅｆｌｏｕｒ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５０－００３２－８２）、ＣＤ４－ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３５－００４２－Ｕ５００）、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｃｙ（商標）７（ＢＤ、５５７６５４）、ＣＤ４４－ＢＶ７８６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０３０５９）、ＣＤ６２Ｌ－ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０４４２４）。データをＢＤＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター上で取得し、ＦＡＣＳＤｉｖａまたはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ）によって分析した。

走査電子顕微鏡法。ＷＴおよびＤＤＲ１ＫＯの両方のＥ０７７１細胞を、０．１×１０^６の密度で播種し、ＤＭＥＭ（１０％のＦＢＳ）中で２日間培養して、ガラスカバースリップの表面に均等に接着させた。次に、細胞を２．５％のグルタルアルデヒドおよび１％のパラホルムアルデヒド溶液で固定し、続いて、ＯｓＯ_４および水ですすいだ。その後、試料をアルコール勾配で順次脱水し、臨界点で乾燥させた。ＳＥＭスタブに取り付けると、カバースリップをイリジウムでコーティングし、ＥＴＤ検出器を備えた走査型電子顕微鏡（ＭｏｄｅｌＦＥＩ）下で、１０ｍｓの滞留時間および１２，０００の倍率で観察した。

抗ＤＤＲ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のスクリーニングおよび生成。ヒトＤＤＲ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０７３０－Ｈ０８Ｈ）を使用して、ウサギを免疫化し、前述の方法を使用して抗ｈｕＤＤＲ１モノクローナル抗体を生成した（Ｇｕｉｅｔａｌ．，２０１９ｂ）。簡単に述べると、ニュージーランド白ウサギに、３週間の間隔でプライミングおよびプライミング免疫化後の一連の３～４ブースターのために、０．５ｍｇの組換えヒトＤＤＲ１ＥＣＤタンパク質を腹腔内（ｉｐ）注射することによって投与した。ＰＢＭＣからメモリーＢ細胞を単離し、抗体産生のために、１０～１４日間、９６ウェル細胞培養プレート中で単一Ｂ細胞を培養した。ＥＬＩＳＡを用いて細胞培養上清をＤＤＲ１結合について分析し、抗体遺伝子クローニングおよび配列解析のために陽性ヒットを選択した。

Ｂ細胞培養ウェルからの陽性細胞を溶解し、全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを、製造業者の提案に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成した。重鎖および軽鎖の両方からの抗体可変領域のＤＮＡ配列を、設計されたプライマーのセットを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、各抗体の可変領域を配列決定するためのベクターにクローニングした。重鎖および軽鎖の両方のクローニングされた抗体可変配列を、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３（ＨＥＫ２９３Ｆ）細胞（ＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における全長組換え抗体発現のために、それぞれ、ＩｇＧ１重鎖およびカッパ軽鎖の定常領域と融合して、哺乳動物発現ベクターに構築した。モノクローナル抗体は、以前に記載された方法（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌｅｔａｌ．，２０１９）を使用して、プロテイン－Ａ親和性樹脂を使用して９５％超の純度までＨＥＫ２９３細胞培養培地から精製された。精製された抗体を、細胞培養アッセイにおける中和機能およびマウス腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性についてスクリーニングした。

統計。スチューデントｔ検定を使用して、２群間の平均差を比較した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）および事後多重比較を使用して、複数の群間の平均差を比較した。生存曲線をログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）分析によって解析した。ピアソン相関分析およびその他のすべての統計は、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍで実施した。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。

実施例２－結果
本発明者らは、基底様／ＴＮＢＣの特徴を有する複数のマウス乳房腫瘍細胞において、Ｄｄｒ１を特異的に欠失させた（Ｅ０７７１、ＡＴ－３、およびＭ－Ｗｎｔ；図１ａ、図５ｂ～ｄ）。ノックアウト（ＫＯ）腫瘍細胞は、インビトロでの細胞増殖、遊走、または浸潤では、いずれの顕著な欠陥も示さなかった（図１ｂ～ｄ、図５ｅ～ｆ）。加えて、免疫不全宿主におけるＤｄｒ１－ＫＯ腫瘍は、野生型（ＷＴ）対照マウスと同じ速度で増殖した（図１ｅおよび図５ｇ）。全く対照的に、免疫能のある宿主（Ｃ５７ＢＬ／６）におけるＤｄｒ１－ＫＯ腫瘍は、試験した３つの乳房腫瘍モデル（図１ｆ～ｈ）のすべてで、接種後２週間で完全に退縮した。免疫能のある宿主におけるＫＯ腫瘍のこの成長欠失は、増加した数のＫＯ腫瘍細胞の移植（１接種当たり０．５～２０×１０^６個の細胞、図５ｈ）によっては、実質的に緩和されず、また、免疫不全宿主（Ｒａｇ１^－／－）における初期成長およびその後の免疫能のあるナイーブマウスへの再移植によっても、成長不全が救済されなかった（図１ｉ～ｊ）。さらに、同数の親ＷＴおよびＫＯ腫瘍細胞の混合物を使用した同時移植は、免疫能を有する宿主における堅牢な腫瘍増殖を生じさせ（図５ｉ～ｋ）、腫瘍ＤＤＲ１の優性な作用を示した。ＷＴ腫瘍細胞を、同じ乳腺または対側の乳腺のいずれかで、以前にＫＯ腫瘍細胞でチャレンジした免疫能のあるマウスに注射したところ、再チャレンジした親腫瘍の顕著な増殖は観察されなかった（図１ｋ～ｍ）。これは、ＫＯ腫瘍細胞がＷＴ腫瘍に対して宿主にワクチン接種可能であることを示す。まとめると、これらのデータは、腫瘍ＤＤＲ１が免疫能のある宿主における腫瘍増殖において特徴的な役割を果たすことを強く示唆する。

免疫組織化学（ＩＨＣ）は、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞が、免疫不全宿主から免疫能のある宿主に再移植した後、親の腫瘍の末梢領域に限定されることを示した（図２ａ）。対照的に、これらのリンパ球は、Ｄｄｒ１－ＫＯ腫瘍の縁部および中心部の両方に豊富に存在した（図２ａ）。裏付けとして、フローサイトメトリーは、腫瘍浸潤ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の総数（腫瘍重量で正規化）が、ＫＯ腫瘍群では、親対照と比較して実質的に上昇したことを示した（図２ｂ～ｃ）。インターフェロン（ＩＦＮ）－γ－産生ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋細胞はまた、ＷＴ対応物よりもＫＯ腫瘍でより豊富であった（図２ｄ～ｅ）。さらに、エフェクターおよびヘルパーＴ細胞は、それらの親対照と比較して、ＫＯ腫瘍においてより強力に活性化された（ＣＤ４４^高ＣＤ６２Ｌ^低）（図２ｆ～ｇ）。しかしながら、対応する総Ｔ細胞数で正規化した場合、ＫＯおよび親対照は、Ｋｉ６７（図６ａ～ｂ）、ＩＦＮγ、またはＧｚｍｂ（図２ｃ～ｄ）に対して陽性であるＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージに差異を示さなかった。これは、腫瘍ＤＤＲ１が、Ｔ細胞の増殖または抗腫瘍活性自体を減衰させることなく、Ｔ細胞の腫瘍除外を付与する可能性が高いことを示す。

腫瘍ＤＤＲ１が抗腫瘍免疫に拮抗する役割を確かめるために、本発明者らは、抗体中和によって免疫能のあるマウスのＣＤ８^＋Ｔ細胞を枯渇させた。Ｄｄｒ１－ＫＯ腫瘍は、免疫不全宿主（図１ｅ）における発明者の知見と同様に、ＣＤ８^＋細胞枯渇宿主（図２ｈ～ｊ、図２ｅ～ｆ）におけるアイソジェニックＷＴ対照と同様に堅牢に成長した。相互実験では、本発明者らは、精製されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を免疫不全マウスに養子移入し、親およびＫＯ腫瘍の成長を比較した。偽処置した免疫不全宿主とは異なり、移植されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を有するマウスは、親腫瘍よりも有意に小さいＫＯ腫瘍を産生した（図２ｋ～ｍ、図６ｇ）。集合的に、これらの結果は、乳房腫瘍の固有の成長のために必ずしも必要ではないが、腫瘍ＤＤＲ１がＴ細胞浸潤の抑止において重要な役割を果たすという概念を裏付けている。

Ｔ細胞の腫瘍内輸送は、血管を通る血管外遊出、腫瘍誘発性化学遊走、およびＥＣＭに基づく物理バリアを通過することを含む、非常に動的なマルチステッププロセスである（Ｓｌａｎｅｙｅｔａｌ．，２０１４、Ｓａｃｋｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，２０１７、Ａｇｅｒｅｔａｌ．，２０１６）。ＣＤ３１に基づく組織学的解析では、ＷＴ腫瘍とＫＯ腫瘍との間の顕著な免疫血管変化は明らかにされず（データは示さず）、またＲＮＡ－ｓｅｑでは、Ｄｄｒ１－ＫＯ群における増強された免疫浸潤を説明できるＴ細胞ホーミング遺伝子またはケモカインコーディング遺伝子のｍＲＮＡレベルの差異も示されなかった（図６ｈ～ｉ）。コラーゲンに対するＤＤＲ１の親和性を考慮すると、本発明者らは、腫瘍ＤＤＲ１－コラーゲン相互作用により、腫瘍が免疫細胞によって浸透しにくくなる代替モデルを試験しようとした。この目的のために、本発明者らはまず、Ｄｄｒ１－ＫＯ腫瘍細胞に以下の構築物を導入することによって、ＤＤＲ１の免疫調節機能がそのキナーゼ活性に依存するかどうかを決定した（図３ａ）：（１）空のベクター（ＥＶ）、（２）全長マウスＤＤＲ１（ＦＬ）、（３）ΔＫＤ、細胞内キナーゼドメインＫＤを欠くが、その膜貫通（ＴＭ）ドメインを保持する切断型ＤＤＲ１、および（４）ＥＣＤのみ。免疫能のある宿主におけるＫＯ腫瘍の成長欠損は、異所的に発現したＦＬＤＤＲ１および２つの切断バリアント、ΔＫＤおよびＥＣＤによって同様の程度に救済された（図３ａ）。さらなる欠失分析は、コラーゲン結合に関与するＮ末端ジスコイジンホモロジードメイン（ＤＳ、図３ｂ）が、ＤＤＲ１ＫＯ細胞の腫瘍成長を完全に救済したことを示す（図７ａ～ｂ）。総合すると、これらのデータは、腫瘍ＤＤＲ１がキナーゼ非依存的な方法で抗腫瘍免疫を抑制することを明確に示す。

コラーゲン－ＤＳドメイン結晶構造（Ｌｅｔｉｎｇｅｒ，２０１４、Ｃａｒａｆｏｌｉｅｔａｌ．，２０１２、Ｃａｒａｆｏｌｉ＆Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ，２０１３）に基づいて、本発明者らは、ヒトＤＤＲ１におけるＷ５３、Ｔ５７、Ｄ７０、Ｋ１１２、Ｅ１１３およびＳ１７５に対応するマウスＤＤＲ１における多数の主要なコラーゲン結合アミノ酸残基（Ｗ５４、Ｔ５８、Ｄ７１、Ｋ１１３、Ｅ１１４およびＳ１７６、図３ｂ）を変異させた。本発明者らはまた、コラーゲン結合ポケットの遠位にあり、ＤＤＲ１膜貫通シグナル伝達を担う残基であるＲ３３を変異させた。ＷＴおよび変異ＥＣＤのコラーゲン結合親和性を、ＥＬＩＳＡおよび共ＩＰによってインビトロで検証し（図３ｃ、図７ｃ）、それらのＫＯ腫瘍成長を救出する能力をインビボで評価した（図３ｄ～ｋ）。予想通り、ＥＣＤのコラーゲン結合領域の外側に位置するＲ３３Ａは、コラーゲンに結合し、腫瘍成長を支持する能力を保持した（ＷＴＥＣＤについては１０／１０腫瘍、およびＲ３３Ａについては６／６、図３ｃ～ｅ）。対照的に、Ｗ５４Ａは、インビトロでのコラーゲン結合および腫瘍成長を支持する能力を完全に失った（０／６部位、図３ｆ）。変異Ｄ７１Ａ、Ｋ１１３Ａ、Ｅ１１４Ａ、およびＳ１７６Ａは、ＷＴＥＣＤの中程度のコラーゲン結合活性を保持し（図３ｃ）、一部の宿主において腫瘍成長をもたらした（それぞれ、２／６、１／６、３／６、および１／６腫瘍、図３ｈ～ｋ）。一方で、Ｔ５８Ａは、ＷＴコラーゲン結合親和性のおよそ５０％（図３ｃ）および１００％の腫瘍発生率（６／６）を保持したが、ＷＴよりも遅い腫瘍成長率を示した（図３ｇ）。本発明者らは、ＥＣＤ変異体のコラーゲン結合親和性および腫瘍救出能力の強い相関関係に照らして、ＥＣＤが抗腫瘍免疫を阻害するためには、コラーゲン結合が必要であると結論づける。

異所性ＤＤＲ１ＥＣＤ単独で免疫能のある宿主の腫瘍成長を支持するのに十分であるという事実は、完全長ＤＤＲ１からのＥＣＤ脱落の以前の報告を彷彿とさせる（Ｖｏｇｅｌ，２０２０、Ｆｌｙｎｎｅｔａｌ．，２０１０、Ｓｈｉｔｏｍｉｅｔａｌ．，２０１５）が、脱落したＥＣＤの生物学的有意性は知られていなかった。裏付けとして、発明者らは、親マウス乳房腫瘍細胞およびヒト乳がん細胞株のサブセットで条件付けられた培地中のＥＣＤを検出した（図７ｄ）。インビトロ生化学研究で発表された研究では、組換えＤＤＲ１ＥＣＤがコラーゲン繊維構造をリモデリングすることができることが示されている（Ｆｌｙｎｎｅｔａｌ．，２０１０、Ａｇａｒｗａｌｅｔａｌ．，２００７）。裏付けとして、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）は、インビトロで培養されたＤＤＲ１－ＷＴ腫瘍細胞が、それらのＫＯ対応物と比較して、より顕著なＥＣＭネットワークと関連していることを示した（図３ｌ）。腫瘍細胞関連ＥＣＭの機能性を決定するために、本発明者らは、トランスウェルアッセイでは、親およびＫＯ腫瘍細胞を脱細胞化し（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００７）（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００７）、脱細胞化ＥＣＭを通して精製されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の浸透度を評価した（図３ｍ）。親腫瘍由来ＥＣＭは、Ｄｄｒ１－ＫＯ腫瘍から脱細胞化されたＥＣＭにおいて軽減されたＴ細胞の遊走を有意に減少させた（図３ｍ）。Ｔ細胞妨害効果は、ＥＣＤ発現ＫＯ腫瘍に由来するＥＣＭの親レベルまで回復した（図３ｍ）。インビトロ所見を裏付けるために、本発明者らは、免疫不全宿主から免疫能のある宿主に再移植された親およびＤｄｒ１－ＫＯ腫瘍におけるコラーゲン繊維を直接可視化するために、第２の高調波発生（ＳＨＧ）顕微鏡を使用した。親腫瘍の縁部にあるコラーゲン繊維は、腫瘍縁部に平行に配向する傾向があり（ブロック矢印で示される、図３ｎの上部パネル）、侵入する腫瘍細胞に対する防御ラインを想起させる。予想通り、同じ親腫瘍からのＣＤ３^＋Ｔ細胞は、腫瘍縁部に限定された（図３ｎ）。全く対照的に、ＫＯ腫瘍中のコラーゲン繊維は比較的短く、無秩序であった（図３ｎ）。一貫して、免疫細胞は、ＷＴ腫瘍と比較して、ＫＯ腫瘍の中により深く浸透した（図３ｎ）。繊維アラインメントの測定値として、コラーゲン繊維の角度の変動係数は、親腫瘍に対して、ＫＯ腫瘍の方が有意に大きかった（図３ｏ）。加えて、ＫＯ腫瘍における平均コラーゲン繊維長は、それらの親対応物よりも実質的に短かった（図３ｐ）。ＤＤＲ１依存性コラーゲン繊維リモデリングを支持するために、初代Ｄｄｒ１－ＷＴおよびＫＯ腫瘍からのＲＮＡ－ｓｅｑデータの経路分析は、細胞外マトリックスおよびコラーゲン原線維組織に関与する遺伝子が最も影響を受けることを示す（ｐ＜１×１０^－１２、図７ｅ）。併せて、これらのデータは、ＤＤＲ１ＥＣＤが、抗腫瘍免疫細胞の腫瘍微小環境への浸透を妨げるコラーゲンに基づく物理的バリアを強化するのに役立つことを強く示唆する。

ＤＤＲ１のすべての現在の小分子阻害剤は、その治療電位が細胞内キナーゼドメインを標的とするかどうかを調べた（Ｋｏｔｈｉｗａｌｅｅｔａｌ．，２０１５、Ｌｉｅｔａｌ．，２０１５）。免疫細胞浸潤を遮断するキナーゼ非依存性ＥＣＤ活性を効果的に中和するために、本発明者らは、以前に記載されているように、組換えヒトＤＤＲ１（ｈｕＤＤＲ１）ＥＣＤおよびその後の抗体記憶Ｂ細胞単離によるウサギの免疫化によって、一連のモノクローナル抗体クローンを作製した（Ｍｅｎｇｅｔａｌ．，２０１５、Ｇｕｉｅｔａｌ．，２０１９ａ）。ｈｕＤＤＲ１特異的中和抗体をスクリーニングするために、本発明者らは、マウスＤｄｒ１－ＫＯ乳房腫瘍細胞においてｈｕＤＤＲ１を異所的に発現した（図４ａ）。ｈｕＤＤＲ１は、免疫能のある宿主におけるＫＯマウス腫瘍の成長欠損を完全に救出した（図４ｂ、ｃ）。Ｔ細胞遊走に対する腫瘍細胞の効果を評価するインビトロ共培養アッセイ（図８ａ）を使用して、本発明者らは、Ｔ細胞遊走のｈｕＤＤＲ１依存性干渉を効果的に中和することができる抗ｈｕＤＤＲ１抗体をスクリーニングした（図８ｂ）。いくつかの上位の中和抗体を、その腫瘍阻害ポテンシャルについてインビボでさらに調べた。ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して、抗ｈｕＤＤＲ１抗体の投与は、ｈｕＤＤＲ１発現腫瘍の成長を著しく遅くし、腫瘍の発生率を低下させ、宿主の体重に明らかな影響を全く与えることなく宿主の生存期間を延長させた（図４ｄ～ｆ、図８ｃ～ｄ）。注目すべきことに、免疫不全宿主における同じ抗体投与は、任意の明らかな腫瘍阻害をもたらさず（図８ｅ）、治療が主にＤＤＲ１の免疫除外機能を中和することを示唆した。ＳＨＧ顕微鏡検査は、免疫能のある宿主における抗ｈｕＤＤＲ１抗体処置腫瘍が、アラインメントのより低い、より短いコラーゲン繊維、および有意に増強された抗腫瘍免疫浸潤と関連していたことを示す（図４ｇ～ｉ、図８ｆ）。総合すると、本発明者らの知見は、潜在的な抗腫瘍療法としての抗ｈＤＤＲ１抗体アプローチの原理の証明を提供する。

腫瘍－免疫相関の臨床的影響を推定するための公開のバイオインフォマティクスリソースであるＴＣＧＡＲＮＡ－ｓｅｑデータセットおよびＴＩＭＥＲ（Ｌｉｅｔａｌ．，２０１８）を使用して、本発明者らは、乳がんが、ＤＤＲ１ｍＲＮＡレベルと、ＣＤ８、ＩＦＮＧ、ＧＺＭＢ、およびＰＲＦ１を含む様々な抗腫瘍免疫シグネチャー遺伝子との間で逆相関を示すことを見出した（図４ｊ、図８ｇ～ｉ）。注目すべきことに、ＤＤＲ１について観察される負の相関の程度は、免疫調節機能を有する他の最近特定された腫瘍関連遺伝子と同等である（Ｐａｎｅｔａｌ．，２０１８）。免疫除外表現型に基づいてＴＮＢＣを層別化するために使用された、治療未経験のＴＮＢＣ患者（ｎ＝３７、図４ｋ～ｍ）からの試料の別個のコホートにおいて、同じ相関が、観察された（Ｇｒｕｓｓｏｅｔａｌ．，２０１９）。まとめると、これらの臨床的相関は、高いＤＤＲ１発現が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の低い腫瘍浸潤および低い細胞傷害活性と関連することを強く示唆する。本研究は、免疫除外のための防御ラインを誘発することにおける、以前に探索されていない、キナーゼ非依存性のＤＤＲ１機能を明らかにすることにより（図４ｎ）、ＥＣＭリモデリングおよび抗腫瘍免疫の遮断におけるＤＤＲ１活性を標的とする新規の単独治療薬の開発を提供する。本発明者らはまた、乳がんおよび膵臓がん等の他の線維性がん型に対する現在の免疫療法の臨床転帰および有効性の改善に役立つことができることを想定している。

ヒトＤＤＲ１を標的とするモノクローナル抗体の生成およびクローニング。ＤＤＲ１に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ウサギの免疫化および単一Ｂ細胞からの抗体の単離によって生成された。ヒトＤＤＲ１タンパク質を抗体生成に使用し、ＨＥＫ２９３細胞で発現させた。タンパク質は６ＸＨＩＳタグを有し、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用して９５％を超える純度になるまで精製される。ウサギ（ＮＺＷ、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）を、プライミング一次免疫化後の３回のブースト注射による標準免疫化手順を使用して、組換え産生されたＤＤＲ１で免疫化した。抗ＤＤＲ１血清の力価を、９６ウェルプレート（ｍａｘ－ｓｏｒｂプレート、Ｎｕｎｃ）上にコーティングされたＤＤＲ１タンパク質に結合するためのＥＬＩＳＡ中の血清の一連の希釈によって決定した。血清価が＞１０^６に達し、蛍光補助細胞選別（ＦＡＣＳ）器具（ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、新たに調製した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＢ細胞単離のために、免疫化されたウサギから末梢血試料を収集した。選別した単一Ｂ細胞を９６ウェル細胞培養プレート（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に収集し、５％のＣＯ_２および９５％の湿度を有する細胞培養インキュベーターで、１０％のＦＢＳおよびサイトカインを添加したＲＰＭＩ培地中で、７～１０日間培養した。培養上清中の抗体をＤＤＲ１結合についてアッセイした。培養ウェルからの陽性細胞を溶解し、全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを、製造業者の提案に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成した。重鎖および軽鎖の両方からの抗体可変領域のＤＮＡ配列を、設計されたプライマーのセットを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、各抗体の可変領域を配列決定するためのベクターにクローニングした。抗体可変領域のアミノ酸およびＤＮＡ配列は、それぞれ表３および４、ならびに表８および９に列挙されている。抗ＤＤＲ１モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれ表１および２に列挙されている。

選択されたＤＤＲ１結合ヒットを、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における哺乳動物発現ベクター系を使用して、完全長ヒトＩｇＧまたはウサギ／ヒトキメラＩｇＧとして発現させた。抗体を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって、プロテイン－Ａ親和性樹脂を使用して精製した。精製されたＤＤＲ１結合抗体を、それらの生物学的特性について特徴付けた。

バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）センサーに基づくＯｃｔｅｔ器具を使用して決定された抗ＤＤＲ１モノクローナル抗体の結合親和性。抗体親和性測定のために、抗体（３０μｇ／ｍＬ）をプロテインＡバイオセンサーに４分間充填した。動態緩衝液中での短いベースラインに引き続き、充填されたバイオセンサーを、０．１～２００ｎＭの一連の組換えＤＤＲ１タンパク質に曝露し、バックグラウンドを減算して、センサーのドリフトを補正した。すべての実験は、１，０００ｒｐｍで振盪しながら行った。バックグラウンドの波長シフトを、抗体のみを充填した参照バイオセンサーから測定した。各抗体の動態センサーグラムを図１０Ａ～Ｂに示す。ＦｏｒｔｅＢｉｏのデータ分析ソフトウェアを使用して、会合速度および解離速度を抽出するために、データを１：１の結合モデルに適合させた。Ｋ_Ｄは、表１３中のＤＤＲ１ｍＡｂについて、ｋ_オフ／ｋ_オンの比およびＫ_Ｄの推定値を使用して計算した。

ＤＤＲ１ｍＡｂのエピトープビニング。抗ＤＤＲ１ｍＡｂ間の対結合競合を使用して、Ｏｃｔｅｔ器具およびプロテインＡバイオセンサーを使用して、各ｍＡｂの結合エピトープを決定した。エピトープビンを、表１４に要約する。

抗ｈＥＣＤ抗体は、自発的な腫瘍成長を阻害する：様々な段階での乳がん発生に対する抗ＤＤＲ１抗体治療の効果を実証するために、ＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統のバックグラウンド）を、平均腫瘍サイズが１００ｍｍ^３に達したときに（「腫瘍後」）、対照ＩｇＧまたは抗ＤＤＲ１抗体で２週間処置した。ＤＤＲ１＃９ヒト化抗体は、マウスおよびヒトＥＣＤの両方に対するその高い親和性のために、本研究のために選択された（データ図示せず）。抗体処理は、宿主の体重に影響を及ぼさなかった。しかしながら、それは、腫瘍体積（図１２ａ）および腫瘍発生率（図１２ｂ）を有意に減少させた。一貫して、抗体処置は、コラーゲンのアラインメントを著しく破壊し、大規模な免疫細胞浸潤を促進した（図１２ｃ）。異なるバックグラウンドの株（ＦＶＢ）のＭＭＴＶ－ＰｙＭＴマウスにおいても、様々な段階での抗ＤＤＲ１抗体処置および乳房腫瘍形成を用いて、同様の結果を得た。

抗ｈＥＣＤ抗体およびＤＤＲ１キナーゼ阻害剤の比較：抗ｈＥＣＤ抗体が顕著な腫瘍阻害活性を示した同じ乳房腫瘍モデルでは、以前に発表された小分子ＤＤＲ１キナーゼ阻害剤、７ｒｈは、腫瘍におけるＤＤＲ１のチロシンキナーゼ活性を阻害したが、腫瘍成長を低下させなかった。これは、抗腫瘍免疫のＤＤＲ１依存的排除がそのキナーゼ活性から独立しているという主張と一致する（図１３ａ～ｅ）。

ＤＤＲ１は、いくつかの腫瘍タイプにおける成長に必要である：腫瘍Ｄｄｒ１のＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子切除を用いて、ＩＤ８ａｇｇの卵巣腫瘍を有する免疫担当宿主の生存を有意に増加させた。しかし、Ｂ１６黒色腫またはＭＣ３８結腸直腸腫瘍におけるＤｄｒ１ＫＯは、同系免疫担当宿主における腫瘍増殖に影響を及ぼさなかった（図１４ｂ～ｃを参照されたい）。本研究は、乳房腫瘍で得られた知見と組み合わせて、ＤＤＲ１を標的とすることにより、複数のがんタイプにおいて腫瘍阻害をもたらすことができることを示す。

ＤＤＲ１および抗腫瘍免疫マーカーの相関：ＴＣＧＡトランスクリプトームデータセットをマイニングすることにより、対応する正常組織と比較して、複数のヒトがんにおけるＤＤＲ１の異常に高い発現が示された（データ図示せず）。さらに、複数のがんにおけるＤＤＲ１ｍＲＮＡレベルは、グランザイムＢ（ＧＺＭＢ、図１５ａを参照されたい）などの細胞傷害性免疫マーカーと負の相関関係にあり、これは、ＤＤＲ１が複数のがんタイプにおいて抗腫瘍免疫を拮抗し得ることを示唆する。さらに、ＴＣＧＡプロテオームデータセットの分析は、ＤＤＲ１タンパク質とＣＤ８との間（図１５ｂ）、ならびにＤＤＲ１と抗腫瘍免疫の細胞溶解性エフェクター経路に関与するタンパク質との間（図１５ｃ）に負の相関をもたらした。したがって、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方では、ＤＤＲ１の高発現は、低レベルの抗腫瘍免疫マーカー発現と相関する。ＤＤＲ１は、抗腫瘍免疫の拮抗剤として機能するように見えるので、例えば、ＤＤＲ１抗体を使用した、この拮抗剤の阻害は、複数のがんタイプにおける抗腫瘍免疫を増加させる可能性がある。

高腫瘍ＤＤＲ１タンパク質は、免疫除外と相関する。図１６に示されるように、多重ＩＨＣ画像において治療未経験のトリプルメガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）コホートを使用して、腫瘍内および腫瘍縁部に存在するＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージがより高いＤＤＲ１^低腫瘍と比較すると、ＤＤＲ１^高腫瘍は、腫瘍内に存在するＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージがより低いこと、および腫瘍縁部に存在するＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージがより高いことが、実証された。このような臨床的相関は、腫瘍ＤＤＲ１が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞による細胞傷害活性のレベルの低下およびそのような細胞による低い腫瘍浸潤と関連していることを強く示唆する。

抗体結合ドメインの判定ＤＤＲ１－９（図１８Ｂ）およびＤＤＲ１－１４（図１８Ｃ）、およびヒト化ＤＤＲ１－９ｈｕ－Ａｂ１のＥＣＤおよびＤＳまたはＤＳＬドメインへの結合を決定するために、ＥＬＩＳＡ法を使用した（図１８Ａ）。組換えＤＤＲ１細胞外（ＥＣＤ）タンパク質およびドメイン欠失タンパク質を、２ｕｇ／ｍｌの濃度で高結合９６ウェルプレート上にコーティングした。ＤＤＲ１抗体滴定を使用して、図１８に示される結合曲線およびＥＣ５０を決定したＥＣＤおよびドメインタンパク質をＨＥＫ２９３細胞で発現させ、ＮＴＡ樹脂を使用して８５％超の純度で精製した。組換え発現ドメインタンパク質は、２ｕｇ／ｍｌの濃度で、高結合９６ウェルプレート（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にコーティングした。一連の抗体滴定を使用して、結合ＥＣ５０を決定した。ＤＤＲ１ＥＣＤのＤＳＬドメインの欠失は、ＤＤＲ１－９およびＤＤＲ１－１４抗体の両方の結合を損なった。ＤＳドメインの欠失を伴う断片は、ＥＣＤタンパク質と同様またはより良好な結合を示した。ＤＳＬ欠失を有する断片は、ＤＤＲ１－９、ＤＤＲ１－１４、およびＤＤＲ１－９Ｈｕ結合を完全に廃止した。

ＤＤＲ１ＥＣＤのＤＳドメインの欠失は、ＤＤＲ１－９およびＤＤＲ１－１４抗体の結合には影響しなかったが、ヒト化ＤＤＲ１－９ｈｕ抗体による結合の低下をもたらした。ＤＳドメイン単独の欠失は、１６８ｎｇ／ｍｌ対８３ｎｇ／ｍｌのＥＣ_５０を伴って、結合を減少させ、一方で、ＤＳＬドメイン単独の欠失は、３つのＤＤＲ１抗体すべての結合を完全に廃止した。

（表１１）ＢＬＩに基づくＯｃｔｅｔ法を使用して決定された結合親和性

（表１２）抗ＤＤＲ１モノクローナル抗体のＥＣ_５０

（表１３）Ｏｃｔｅｔ（９６－Ｒｅｄ）器具を使用して決定したヒトＤＤＲ１への結合親和性

（表１４）ＤＤＲ１ｍＡｂのエピトープ基

ヒトＤＤＲ２ＥＣＤに対する抗ヒトＤＤＲ１モノクローナル抗体のパネルの交差反応性を決定するために、ＥＬＩＳＡ法を使用した。ＤＤＲ１ＥＣＤまたはＤＤＲ２ＥＣＤタンパク質を高結合プレートにコーティングし、モノクローナル抗体の各々を１ｕｇ／ｍｌ濃度で適用し、結合を、ＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ、ＰＡ）を使用して検出した。結果を図１９に示す。モノクローナル抗体ＤＤＲ１－３、ＤＤＲ１－９、ＤＤＲ１－１０、ＤＤＲ１－１４およびＤＤＲ１－３３は、ＤＤＲ１エピトープに特異的であったが、クローンＤＤＲ１－１３、ＤＤＲ１－１５、ＤＤＲ１－２１、ＤＤＲ１－２２およびＤＤＲ１－３４は、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２ＥＣＤの両方に存在するエピトープを認識するようである。

本明細書に開示され特許請求されるすべての方法は、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製され、実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態の観点から記載されているが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法およびステップまたは一連のステップに変形が適用され得ることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤に置き換えても、同じまたは同様の結果が達成されることは、明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置換および修正はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念内であるとみなされる。

参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されるものを補足する、例示的な手順的な詳細または他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。

Claims

ジスコイジンドメイン受容体１（ＤＤＲ１）タンパク質に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
配列番号：１０８～１２８から選択される軽鎖可変領域内にＬＣ－ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびに
配列番号：１２９～１４９から選択される重鎖可変領域内にＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域
を含むか、または
それらのバリアントであって、前記ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくは前記ＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有する、前記バリアント
を含む、
前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
表１から選択されるクローン対のＬＣ－ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２、およびＬＣ－ＣＤＲ３、ならびに
表２から選択されるＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２、およびＨＣ－ＣＤＲ３
を含むか、または
それらのバリアントであって、前記ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくは前記ＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有する、前記バリアント
を含む、
請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
アミノ酸配列ＱＳＩＧＳＶ（配列番号：１１）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＶＦを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＹＩＰＹＧＳＳＰ（配列番号：１２）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびに
アミノ酸配列ＧＦＳＬＮＲＹＹ（配列番号：５７）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＳＹＧＤＴＴ（配列番号：５８）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＡＤＴＧＤＮＧＹＬＧＬＱＬ（配列番号：５９）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域
を含むか（ＤＤＲ１－９）、または
それらのバリアントであって、前記ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくは前記ＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有する、前記バリアント
を含む、
請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
アミノ酸配列ＥＳＩＮＳＷ（配列番号：４１）を含むＬＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＡＳを含むＬＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＳＹＹＩＩＮＲＳＮＹＧＮＳ（配列番号：４２）を含むＬＣ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域、ならびに
アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＳＹＹ（配列番号：１０２）を含むＨＣ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＩＴＴＡＧＰＬ（配列番号：１０３）を含むＨＣ－ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＧＨＡＧＳＩＹＹＳＹＦＤＬ（配列番号：１０４）を含むＨＣ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域
を含むか（ＤＤＲ１－３２）、または
それらのバリアントであって、前記ＬＣ－ＣＤＲおよび／もしくは前記ＨＣ－ＣＤＲのうちの１つ以上が１つ、２つ、もしくは３つのアミノ酸置換、付加、欠失、もしくはそれらの組み合わせを有する、前記バリアント
を含む、
請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
配列番号：１０８～１２８から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号：１２９～１４９から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
（ａ）配列番号：１０８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１Ｋ）、および配列番号：１２９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１Ｈ）、
（ｂ）配列番号：１０９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３Ｋ）、および配列番号：１３０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３Ｈ）、
（ｃ）配列番号：１１０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－５Ｋ）、および配列番号：１３１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－５Ｈ）、
（ｄ）配列番号：１１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－６Ｋ）、および配列番号：１３２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－６Ｈ）、
（ｅ）配列番号：１１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－９Ｋ）、および配列番号：１３３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－９Ｈ）、
（ｆ）配列番号：１１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１１Ｋ）、および配列番号：１３４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１１Ｈ）、
（ｇ）配列番号：１１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１２Ｋ）、および配列番号：１３５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１２Ｈ）、
（ｈ）配列番号：１１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１３Ｋ）、および配列番号：１３６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１３Ｈ）、
（ｉ）配列番号：１１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１４Ｋ）、および配列番号：１３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１４Ｈ）、
（ｊ）配列番号：１１７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１５Ｋ）、および配列番号：１３８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１５Ｈ）、
（ｋ）配列番号：１１８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－１７Ｋ）、および配列番号：１0３９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－１７Ｈ）、
（ｌ）配列番号：１１９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２０Ｋ）、および配列番号：１４０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２０Ｈ）、
（ｍ）配列番号：１２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２１Ｋ）、および配列番号：１４１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２１Ｈ）、
（ｎ）配列番号：１２１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２２Ｋ）、および配列番号：１４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２２Ｈ）、
（ｏ）配列番号：１２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２３Ｋ）、および配列番号：１４３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２３Ｈ）、
（ｐ）配列番号：１２３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２６Ｋ）、および配列番号：１４４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２６Ｈ）、
（ｑ）配列番号：１２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２８Ｋ）、および配列番号：１４５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２８Ｈ）、
（ｒ）配列番号：１２５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－２９Ｋ）、および配列番号：１４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－２９Ｈ）、
（ｓ）配列番号：１２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３２Ｋ）、および配列番号：１４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３２Ｈ）、
（ｔ）配列番号：１２７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３３Ｋ）、および配列番号：１４８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３３Ｈ）、もしくは
（ｕ）配列番号：１２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３４Ｋ）、および配列番号：１４９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３４Ｈ）
を含むか、または
それらのバリアントであって、前記軽鎖可変領域が前記親軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ前記重鎖可変領域が前記親重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有する、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する前記バリアント
を含む、
請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
配列番号：１１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－９Ｋ）、および配列番号：１３３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－９Ｈ）
を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
配列番号：１２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－３２Ｋ）、および配列番号：１４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－３２Ｈ）
を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
前記単離されたモノクローナル抗体が、マウス抗体、げっ歯類抗体、ウサギ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１または２に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
前記単離されたモノクローナル抗体が、ウサギ抗体またはキメラ抗体である、請求項９に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
前記単離されたモノクローナル抗体が、ウサギ抗体またはキメラ抗体である、請求項９に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
前記単離されたモノクローナル抗体が、ヒト化抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
配列番号：１５０もしくは１５１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｖ１またはＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｌｃ２）、および
配列番号：１５２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＤＤＲ１－９ｈｕ＿Ｈｖ）
を含むか、または
それらのバリアントであって、前記軽鎖可変領域が前記親軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して８０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ前記重鎖可変領域が前記親重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有する、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する前記バリアント
を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
前記抗原結合断片が、ＳｃＦｖ（単鎖可変領域断片）抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、またはＦｖ断片である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片によって特異的に結合されるエピトープまたは同じエピトープの全部または一部に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープに対して競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、前記抗体またはその抗原結合断片に連結されている抗腫瘍薬物とを含む、抗体－薬物コンジュゲート。
前記抗腫瘍薬物が、光不安定性リンカーまたは酵素的に切断可能なリンカーを介して前記抗体に連結されている、請求項１７に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
前記抗腫瘍薬物が、毒素、放射性同位体、サイトカイン、または酵素である、請求項１７または１８に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
請求項２１に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
前記コードされた抗体またはその抗原結合断片を発現することができる発現ベクターを含む、請求項２２に記載のベクター。
請求項２１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２２もしくは２３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
哺乳動物細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
ＣＨＯ細胞である、請求項２５に記載の宿主細胞。
請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体をコードするおよび／または産生する、ハイブリドーマまたは操作された細胞。
前記モノクローナル抗体またはその抗原断片を発現することができる請求項２４～２６のいずれか一項に記載の宿主細胞
を培養する工程を含む、抗体を産生する方法であって、
前記抗体またはその抗原結合断片を発現するのに好適な条件下で前記宿主細胞を培養する工程、および前記抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含む、前記方法。
請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）タンパク質。
請求項２９に記載のＣＡＲタンパク質をコードする、単離された核酸。
請求項３０に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
前記ＣＡＲタンパク質を発現することができる、請求項３１に記載のベクター。
請求項３０に記載の単離された核酸または請求項３２に記載のベクターを含む、操作された細胞。
Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージである、請求項３３に記載の操作された細胞。
治療有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項３３もしくは３４に記載の操作された細胞を、対象に投与する工程
を含む、対象におけるがんの影響を治療または緩和する方法。
前記対象における腫瘍負荷を減少させるかまたは根絶する、請求項３５に記載の方法。
腫瘍細胞の数を減少させるか、または腫瘍サイズを減少させる、請求項３６に記載の方法。
前記がんが、固形がんまたは腫瘍である、請求項３５に記載の方法。
前記がんが、膵臓がん；小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む肺がん；結腸および結腸直腸がん；頭頸部がん；胃（胃部）がん；卵巣がん；乳がん；腎臓がん；肝臓がん；前立腺がん；子宮頸がん；脳がん；黒色腫を含む皮膚がん；および骨がんから選択される、請求項３８に記載の方法。
前記がんが、乳がんである、請求項３８に記載の方法。
前記乳がんが、（ａ）ルミナルＡ（ＥＲ＋および／またはＰＲ＋、ＨＥＲ２－）、（ｂ）ルミナルＢ（ＥＲ＋および／またはＰＲ＋、ＨＥＲ２＋）、（ｃ）トリプルネガティブ（ＥＲ－、ＰＲ－、ＨＥＲ２－）、（ｄ）ＨＥＲ２＋／ＥＲ－（ＥＲ－、ＰＲ－、およびＨＥＲ２＋）、ならびに（ｅ）未分類（ＥＲ－、ＰＲ－、ＨＥＲ２－、サイトケラチン５／６－、およびＨＥＲ１－）から選択される乳がんサブタイプである、請求項４０に記載の方法。
前記がんのがん細胞が、分泌されたＤＤＲ１タンパク質および／または前記がん細胞の表面上のＤＤＲ１タンパク質を発現していると同定されるか、または発現すると決定される、請求項３５～４１のいずれか一項に記載の方法。
前記抗体またはその抗原結合断片が、静脈内、動脈内、腫瘍内、または皮下に投与される、請求項３５～４２のいずれか一項に記載の方法。
前記対象に、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリントポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリン、ダウノルビシン、ヌクレオシド代謝阻害剤、シタラビン、低メチル化剤、低用量シタラビン（ＬＤＡＣ）、ダウノルビシンおよびシタラビンの組み合わせ、注射用のダウノルビシンおよびシタラビンリポソーム、Ｖｙｘｅｏｓ（登録商標）、アザシチジン、Ｖｉｄａｚａ（登録商標）、デシタビン、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ヒ素、三酸化ヒ素、ヒスタミン二塩酸塩、Ｃｅｐｌｅｎｅ（登録商標）、インターロイキン－２、アルデスロイキン、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、ゲツムズマブオゾガマイシン、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、ＦＬＴ－３阻害剤、ミドスタウリン、Ｒｙｄａｐｔ（登録商標）、クロファラビン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、ＩＤＨ１阻害剤、イボシデニブ、Ｔｉｂｓｏｖｏ（登録商標）、ＩＤＨ２阻害剤、エナシデニブ、Ｉｄｈｉｆａ（登録商標）、スムーズンド（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）（ＳＭＯ）阻害剤、グラスデギブ、アルギナーゼ阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、エパカドスタット、ＢＣＬ－２阻害剤、ベネトクラクス、Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（登録商標）、白金複合体誘導体、オキサリプラチン、キナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、イブルチニブ、ＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（登録商標）、アカラブルチニブ、ＣＡＬＱＵＥＮＣＥ（登録商標）、ザヌブルチニブ、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＬＡＧ３抗体、ＩＣＯＳ抗体、ＴＩＧＩＴ抗体、ＴＩＭ３抗体、ＣＤ４０抗体、４－１ＢＢ抗体、ＣＤ４７抗体、ＳＩＲＰ１α抗体または融合タンパク質、Ｅ－セレクチン拮抗剤、腫瘍抗原に結合する抗体、Ｔ細胞表面マーカーに結合する抗体、骨髄細胞またはＮＫ細胞表面マーカーに結合する抗体、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物由来のアルカロイド、ホルモン療法薬、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、およびＰ糖タンパク質阻害剤からなる群から選択される１つ以上の薬物を投与する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、それに連結された抗腫瘍薬物をさらに含む、請求項３５～４４のいずれか一項に記載の方法。
前記抗腫瘍薬物が、毒素、放射性同位体、サイトカイン、または酵素である、請求項４５に記載の方法。
治療有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項３３もしくは３４に記載の操作された細胞を、前記対象に投与する工程
を含む、対象における線維症の影響を治療または緩和する方法。
前記対象が、臓器線維症を有する、請求項４７に記載の方法。
前記対象が、腎臓、肝臓、肺、または心臓の線維症を有する、請求項４８に記載の方法。
前記対象が、肺の線維症を有する、請求項４９に記載の方法。
前記対象が、間質性肺疾患を有する、請求項５０に記載の方法。
前記対象が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または肺の瘢痕化を有する、請求項５０に記載の方法。
試料または対象におけるがん細胞またはがん幹細胞を検出する方法であって、
（ａ）対象または対象からの試料を、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程、および
（ｂ）前記対象または前記試料におけるがん細胞またはがん幹細胞に対する前記抗体の結合を検出する工程
を含む、前記方法。
前記試料が、体液または生検である、請求項５３に記載の方法。
前記試料が、血液、骨髄、痰、涙、唾液、粘膜、血清、尿、または糞便である、請求項５４に記載の方法。
前記検出が、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、またはウエスタンブロットを含む、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
工程（ａ）および工程（ｂ）を再度実行する工程、ならびに
１回目と比較したときの検出レベルの変化を決定する工程
をさらに含む、請求項５３に記載の方法。
前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、標識をさらに含む、請求項５３～５７のいずれか一項に記載の方法。
前記標識が、ペプチドタグ、酵素、磁性粒子、発色団、蛍光分子、化学発光分子、または色素である、請求項５８に記載の方法。
前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、リポソームまたはナノ粒子にコンジュゲートされている、請求項３５～５９のいずれか一項に記載の方法。