CN116963747A - 用于鉴定lilrb阻断抗体的方法 - Google Patents

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CN116963747A CN202180092931.7A CN202180092931A CN116963747A CN 116963747 A CN116963747 A CN 116963747A CN 202180092931 A CN202180092931 A CN 202180092931A CN 116963747 A CN116963747 A CN 116963747A
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Abstract

本文提供了用于鉴定LILRB3活化的调节剂的方法和组合物。本文还提供了治疗癌症的方法，所述方法包括施用LILRB3活化的抑制剂。还提供了治疗自身免疫性疾病或抑制移植物排斥发作或治疗炎性病症的方法，所述方法包括向受试者施用LILRB3活化的激动剂。

Description

用于鉴定LILRB阻断抗体的方法
优先权要求
本申请要求美国临时申请序列号63/121,057(于2020年12月3日提交)、63/238,717(于2021年8月30日提交)和63/240,684(于3021年9月3日提交)的优先权的权益，每个申请的整个内容特此通过引用并入。
发明领域
本公开总体上涉及分子生物学领域。更具体地，其涉及用于鉴定LILRB3抗体的方法和组合物以及此类抗体在癌症疗法和诊断中的用途。
背景技术
免疫检查点阻断疗法有效治疗一些类型的癌症。然而，对于大多数癌症患者来说，免疫逃避和抗性导致使之无法对这些疗法作出应答或在治疗后复发(Robert等人,2015a；2015b；Postow等人,2015)。对于白血病患者，低突变负荷和低水平的IFN-γ导致对免疫检查点阻断的应答较弱(Curran等人,2017)。具体地，CTLA4和PD-1/PD-L1靶向单一疗法对于治疗患有急性髓系白血病(AML)的患者是无效的(Curran等人,2017)。几种新的免疫治疗剂最近已经得到批准。这些免疫治疗剂包括脂质体封装的化学药物、抗CD33药物缀合物以及BCL-2、IDH1、IDH2、Flt3和hedgehog的抑制剂。这些治疗剂中的一些治疗剂有明显的毒性。此外，这些治疗剂仅在AML患者的一些亚群中是有效的，并且经常导致复发(Click等人,2018)。重要的是，鉴定AML发展和免疫抑制的分子机制，以指导更有效的治疗的开发。
具有基于胞内免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的LILRB可以募集酪氨酸磷酸酶SHP1、SHP2和/或肌醇磷酸酶SHIP(Trowsdale等人,2015；Daeron等人,2008；Takai等人,2011；Katz,2016；Kang等人,2016；Hirayasu和Arase,2015；Deng等人,2021；van der Touw等人,2017)。由于磷酸酶在免疫活化中的负面作用，LILRB被视为是免疫检查点因子(Carosella等人,2015)。许多小组对目前对于LILRB的功能的理解做出了贡献(Trowsdale等人,2015；Daeron等人,2008；Takai等人,2011；Katz,2016；Kang等人,2016；Hirayasu和Arase,2015；Deng等人,2021；van der Touw等人,2017)。发明人研究了由LILRB介导的信号传导如何影响癌症发展。其显示出，LILRB2为激素Angptl2的受体，并且几种LILRB和相关的ITIM受体LAIR1支持AML发展(John等人,2018；Zheng等人,2012；Kang等人,2015；Deng等人,2018；Gui等人,2019；Anami等人,2020；Li等人,2019；Churchill等人,2020；Bergstrom等人,2021)。最近，发明人和其它人已经证明，阻断人髓系细胞或自然杀伤细胞中由LILRB1、LILRB2或LILRB4介导的信号传导促进其促炎活性并且增强抗肿瘤应答(Deng等人,2018；Gui等人,2019；Li等人,2019；Barkal等人,2018；Chen等人,2018)。
LILRB3为LILRB家族的成员，其在髓系细胞上限制性地表达，所述髓系细胞包括单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞(以及体外分化的肥大细胞和破骨细胞)(Deng等人,2021；Tedia等人,2003)。LILRB3含有四个胞质ITIM基序，所述胞质ITIM基序可以促进免疫应答的负调节(Coxon等人,2017)。在人髓系细胞中LILRB3的配体连接会导致对免疫活化的抑制(Sloane等人,2004；Yeboah等人,2020)。LILRB3可以是过敏性炎症和自身免疫的抑制剂(Renauer等人,2015)。然而，尚未鉴定出LILRB3的配体(Jones等人,2016)，并且LILRB3的下游信号传导不清楚。值得注意的是，包括LILRB3在内的lLILRB是灵长类动物特有的。小鼠中LILRB3的对应蛋白PirB的其表达模式和配体不同于LILRB3的表达模式和配体(Kang等人,2016)。PirB比LILRB3更广泛地进行表达(Kang等人,2016)。LILRB3还在一些髓系白血病、B淋巴性白血病和骨髓瘤细胞中表达(Deng等人,2021；Pfistershammer等人,2009)。据报告，其与干细胞标志物CD34和骨髓瘤标志物CD138共表达(Pfistershammer等人,2009)。
发明内容
本公开的实施方式提供了一种鉴定LILRB3活化的调节剂的方法，所述方法包括(a)使报告细胞与半乳凝素-4和候选物质接触，其中所述报告细胞表达具有LILRB3的外部结构域的嵌合受体；以及(b)检测所述报告细胞中的受体活化的水平，其中所述受体活化的水平相比于对照水平的变化表明，所述候选物质为LILRB3活化的调节剂。所述细胞可以为小鼠T细胞杂交瘤细胞。所述受体可以包含配对免疫球蛋白样受体β(PILRβ)的胞内结构域。所述受体可以在所述细胞中通过病毒表达载体，如逆转录病毒表达载体进行表达。
所述报告细胞可以表达报告基因，所述报告基因编码可检测的标记，并且与通过所述受体的活化调节的启动子可操作地连接。所述启动子可以为经活化的T细胞核因子(NFAT)启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或组成型启动子。所述可检测标记可以为比色标记、荧光标记、生物发光标记或化学发光标记，并且具体地可以为GFP、YFP、RFP或D-荧光素。检测可以包括流式细胞术分析或对发光的定量。
所述候选物质可以为抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。所述对照水平可以在所述报告细胞与半乳凝素-4接触时在所述报告细胞中获得。所述受体活化的水平相比于所述对照水平的提高表明，所述调节剂为激动剂。所述受体活化的水平相比于所述对照水平的降低表明，所述调节剂为拮抗剂。所述候选物质可以与底物连接，或者所述候选物质可以与表达FcR的细胞连接。
还提供了一种组合物，其包含候选LILRB3调节剂；半乳凝素-4；以及报告细胞，所述报告细胞表达具有LILRB3的胞外结构域的嵌合受体，其中所述报告细胞具有指示受体活化的表型。
在另一实施方式中，提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：重链(HC)可变区(VH)和轻链(LC)可变区(VL)，所述VH和所述VL包含如表3和4中所示的克隆配对的CDR序列；以及其变体，其中所述HC-CDR和/或所述LC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。所述分离的单克隆抗体或抗原结合片段可以为鼠类抗体、啮齿动物抗体、兔抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。所述分离的抗原结合片段可以为重组ScFv(单链片段可变)抗体、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。所述分离的单克隆抗体为人抗体。
所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以有具有分别与附录II和IV的克隆配对的序列至少90％或95％相同的氨基酸序列的VH链和VL链。所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以具有由分别与附录I和III的克隆配对的序列至少80％或90％相同的核酸序列编码的VH链和VL链。所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以有具有分别与附录II和IV的克隆配对的序列相同的氨基酸序列的VH链和VL链。所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以具有由分别与附录I和III的克隆配对的序列相同的核酸序列编码的VH链和VL链。
所述分离的单克隆抗体可以为人源化抗体。所述分离的单克隆抗体可以为嵌合抗体。所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以诱导LILRB3的活化。所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以抑制LILRB3的活化。
在仍其它实施方式中，提供了：(a)一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与本文所定义的分离的单克隆抗体或抗原结合片段竞争同一表位；(b)一种药物组合物，其包含如本文所定义的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段；(c)一种分离的核酸，其编码本文所定义的分离的单克隆抗体；一种载体，其包含此分离的核酸；或一种宿主细胞，其包含此载体；或(d)一种杂交瘤细胞或经工程化的细胞，其编码和/或产生本文所定义的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。所述宿主细胞可以为哺乳动物细胞，如CHO细胞。还提供了一种用于产生抗体的方法，所述方法包含在适于表达所述抗体的条件下培养此宿主细胞，以及回收所述抗体。
在一另外的实施方式中，提供了：一种嵌合抗原受体(CAR)蛋白，其包含本文所定义的抗体或其抗原结合片段的序列；以及一种分离的核酸，其编码所述CAR；一种载体，其包含此分离的核酸；和/或一种经工程化的细胞，其包含此分离的核酸，所述经工程化的细胞如T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
在仍一另外的实施方式中，提供了一种治疗受试者的癌症或改善受试者的癌症的效应的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所定义的抗体或其抗原结合片段或如本文所定义的经工程化的细胞。
所述方法可以减小或消除所述受试者的肿瘤负荷。所述方法可以减少所述受试者的肿瘤细胞的数量、减小肿瘤大小、减少或防止肿瘤转移或根除肿瘤。所述癌症可以为实体癌，如肾上腺癌、胆管癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、结直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌(merkel cell cancer)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、松果体瘤、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌和阴道癌。所述方法可以靶向单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞和其它髓系细胞、髓系源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和其它免疫抑制髓系细胞。
所述癌症可以为血液系统恶性病，如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、B细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、母细胞性浆细胞样树突状细胞赘生物(BPDCN)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)、慢性髓细胞白血病(CML)、前B急性淋巴细胞性白血病(前B ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、重链疾病、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′slymphoma)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖性赘生物和真性红细胞增多症。
所述抗体或其抗原结合片段可以静脉内、动脉内、肿瘤内或皮下施用。所述方法可以进一步包括向所述受试者施用一种或多种药物，所述一种或多种药物选自由以下组成的组：拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素、柔红霉素、核苷代谢抑制剂、阿糖胞苷、低甲基化剂、低剂量阿糖胞苷(LDAC)、柔红霉素和阿糖胞苷的组合、注射用柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、氮杂胞苷、/>地西他滨(decitabine)、全反式视黄酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、组胺二盐酸盐、/>白介素-2、阿地白介素、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、/>FLT-3抑制剂、米哚妥林(midostaurin)、/>氯法拉滨(clofarabine)、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨、IDH1抑制剂、艾伏尼布(ivosidenib)、/>IDH2抑制剂、伊那尼布(enasidenib)、平滑受体(SMO)抑制剂、格拉吉布(glasdegib)、精氨酸酶抑制剂、IDO抑制剂、艾卡哚司他(epacadostat)、BCL-2抑制剂、维奈托克(venetoclax)、/>铂络合物衍生物、奥沙利铂(oxaliplatin)、激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、BTK抑制剂、依鲁替尼(ibrutinib)、/>阿卡替尼(acalabrutinib)、/>泽布替尼(zanubrutinib)、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、ICOS抗体、TIGIT抗体、TIM3抗体、CD40抗体、4-1BB抗体、CD47抗体、SIRP1α抗体或融合蛋白、CD70抗体和CLL1抗体、CD123抗体、E-选择素的拮抗剂、与肿瘤抗原结合的抗体、与T细胞表面标志物结合的抗体、与髓系细胞或NK细胞表面标志物结合的抗体、烷化剂、亚硝基脲剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、源自植物的生物碱、激素疗法药物、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。
所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以进一步包含与其连接的抗肿瘤药物。所述抗肿瘤药物可以通过光不稳定接头或通过酶促切割的接头与所述抗体连接。所述抗肿瘤药物可以为毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
还提供了一种检测样品或受试者中的癌细胞或癌症干细胞的方法，所述方法包括(a)使受试者或来自所述受试者的样品与如本文所定义的抗体或其抗原结合片段接触；以及(b)检测所述抗体与所述受试者或所述样品中的癌细胞或癌症干细胞的结合。所述样品可以为体液或活检。所述样品可以为血液、骨髓、痰、眼泪、唾液、粘液、血清、尿液或粪便。检测可以包括免疫组织化学、流式细胞术、免疫测定(包括ELISA、RIA等)或蛋白质印迹。所述方法可以进一步包括第二次执行步骤(a)和(b)以及确定检测水平相比于第一次的检测水平的变化。所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以进一步包括标记，如肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以与脂质体或纳米颗粒缀合。
一另外的实施方式为一种治疗受试者的自身免疫性疾病或改善受试者的自身免疫性疾病的影响的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所定义的抗体或其抗原结合片段或如本文所定义的经工程化的细胞。所述方法可以靶向单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞以及其它髓系细胞。所述抗体或其抗原结合片段可以静脉内、动脉内、肿瘤内或皮下施用。所述方法可以进一步包括向所述受试者施用一种或多种药物，所述一种或多种药物选自由类固醇或NSAID组成的组。所述自身免疫性疾病可以为格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、未分化型脊椎关节病变、青少年脊椎关节病变、白塞氏病(Behcet's disease)、肌腱端炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、肠易激综合征、炎性肠病、纤维肌痛、慢性疲劳综合征、与全身性炎性疾病相关的疼痛病状、全身性红斑狼疮、舍格伦综合征(Sjogren'ssyndrome)、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、青少年发作型糖尿病(也被称为I型糖尿病)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、多肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特氏综合征(Schmidt's syndrome)、自身免疫性葡萄膜炎、阿狄森氏病(Addison's disease)、格雷夫氏病(Grave′s Disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、狼疮性肝炎、动脉粥样硬化症、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、甲状旁腺功能减退症、德雷斯勒氏综合征(Dressler's syndrome)、重症肌无力、伊顿-兰伯特综合征(Eaton-Lambert syndrome)、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常型天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、脱发、硬皮病、进行性全身性硬化症、CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏现象(Raynaud's phenomenon)、食管运动障碍、指端硬化和毛细管扩张)、成人发作型糖尿病(也被称为II型糖尿病)、混合性结缔组织病、结节性多动脉炎、全身性坏死性血管炎、肾小球肾炎、特应性皮炎、特应性鼻炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、恰加斯氏病(Chagas'disease)、结节病、风湿热、哮喘、抗磷脂综合征、多形性红斑、库欣氏综合征(Cushing's syndrome)、自身免疫性慢性活动性肝炎、变应性疾病、变应性脑脊髓炎、输血反应、麻风病、疟疾、利什曼病、锥虫病、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞动脉炎、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、川崎氏病(Kawasaki's disease)、眼内炎、银屑病、胎儿成红细胞增多病、嗜酸性筋膜炎、舒尔曼氏综合征(Shulman'ssyndrome)、费耳蒂氏综合征(Felty's syndrome)、富克斯氏睫状体炎(Fuch's cyclitis)、IgA肾病、亨-舒二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、移植物抗宿主病、移植排斥、兔热病、周期性发热综合征、化脓性关节炎、家族性地中海热、TNF受体相关周期性综合征(TRAPS)、穆-韦二氏综合征(Muckle-Wells syndrome)或高IgD综合征。
还提供了一种非人细胞，其包含人LILRB3的编码区，所述非人细胞如小鼠细胞。LILBR3编码区可以处于启动子，如异源启动子等的控制下，所述启动子包含诱导型启动子或组成型启动子。LILRB3的表达可以由转录或翻译抑制剂元件，如侧接有Lox位点的终止密码子负调节。所述细胞可以位于转基因非人动物，如转基因小鼠体内。
本公开的其它目的、特征和优点将根据以下详细描述而变得显而易见。然而，应当理解，尽管详细描述和具体实例表示本公开的优选实施方式，然而其仅以说明的方式给出，因为根据此详细描述，本公开的精神和范围内的不同变化和修改对于本领域的技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
以下附图形成本发明说明书的一部分，并且被包括在内以进一步展示本公开的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，结合本文中所呈现的具体实施例的详细说明，可以更好地理解本公开。
图1A-M.LILRB3促进单核细胞AML进展。(图1A)基于LILRB3表达分组的AML患者的总体存活率；对来自TCGA数据库的数据进行了分析。(图1B)不同AML亚型中的相对LILRB3表达(mRNA表达相对于GAPDH归一化)；数据来自TCGA数据库。(图1C)AML细胞系上的LILRB3表达。(图1D)用抗LILRB3抗体或IgG处理的AML培养物中的死亡细胞的百分比(n＝3个独立细胞培养物)。(图1E)表达对照shRNA(shRNA-C)或LILRB3特异性shRNA(shRNA-1或-2)的AML细胞上的LILRB3表达。(图1F)左图：随时间推移植入有表达荧光素酶并且表示shRNA的Molm13细胞的NSG小鼠的荧光素酶的全身图像。右图：小鼠存活率(n＝3只独立小鼠)。(图1G)左图：植入有THP-1AML并且在植入后19天用dox处理(一次，灌胃2mg/小鼠)以诱导shRNA表达的NGS小鼠的图像。右图：小鼠存活率(n＝3只独立小鼠)。(图1H)用于创建小鼠模型以研究LILRB3功能的逆转录病毒载体的示意图。(图1I)所植入小鼠的外周血中表达B3-FL和B3delICD的GFP+AML细胞的代表性FACS分析和百分比图(正常外周血样品作为分选GFP阳性群体的阴性对照)。(图1J)植入后27天小鼠的骨髓(BM)、脾脏(SPL)和肝脏中表达B3-FL和B3delICD的GFP+AML细胞的百分比(n＝4只独立小鼠)。(图1K)27天时植入有表达B3-FL和B3delICD的GFP+AML细胞的小鼠的脾脏和肝脏的代表性图像和平均重量(n＝4只独立小鼠)。(图1L)从骨髓分离出的表达B3-FL或B3del ICD的GFP+AML细胞的克隆形成测定(CFU)(n＝3个独立细胞培养物)。(图1M)植入有表达B3-FL和B3del ICD的AML细胞的小鼠的存活率(n＝4只独立小鼠)。数据以平均值±s.e.m呈现，并且除了a、f、g和m通过对数秩测试计算外，p值是通过双尾t测试计算的。
图2A-N.LILRB3提高单核AML细胞对细胞毒性T细胞的敏感性。(图2A-B)CFSE染色的(图2A)THP-1细胞或(图2B)Molm13细胞在其与经活化的T细胞以不同比率共培养时的细胞死亡。右图的FACS图像的效应细胞与靶细胞(E:T)比率为2(n＝3个独立细胞培养物)。(图2C-D)在使用或不使用人T细胞移植的情况下，引入有shRNA-C或LILRB3特异性shRNA-1的Molm13-荧光素酶细胞的NSG异体移植体。小鼠的图像(图2C)。总体存活率(图2D)。(图2E)用IgG或抗mCD8处理的C57BL/6小鼠的外周血(PB)、骨髓(BM)、脾脏(SPL)和肝脏中的表达B3-FL或B3del ICD的GFP+AML细胞的百分比(n＝4只独立小鼠)。(图2F)图2E的小鼠的存活率。(图2G)用MLL-AF9小鼠AML细胞使CD45.1 B6小鼠获得免疫的流程图。(图2H)MLL-AF9 AML细胞在其与AML特异性T-AF9或非特异性T-LPS T细胞共培养12小时时的CFU。(n＝3个独立细胞培养物)。(图2I)未用T细胞处理(noT)或用T-LPS或T-AF9处理的小鼠的外周血(PB)、骨髓(BM)、脾脏(SPL)和肝脏中的表达B3-FL或B3del ICD的GFP+AML细胞的百分比(n＝4只独立小鼠)。(图2J)植入有表达B3-FL或B3del ICD的AML细胞并且用CD45.1 T细胞注射的小鼠的总体存活率(n＝4只独立小鼠)。(图2K)图18I中的小鼠的外周血中的CD45.1+/CD4+和CD45.1+/CD8+T细胞分别占总CD4+和CD8+T细胞群体的百分比(n＝4只独立小鼠)。(图2L)用野生型T细胞(T-WT，CD45.1)或GFP特异性T细胞(T-GFP，CD45.1)处理的小鼠的外周血(PB)、骨髓(BM)、脾脏(SPL)和肝脏中的表达B3-FL或B3del ICD的GFP+AML细胞的百分比(n＝3只独立小鼠)。(图2M)植入有以上指出的AML细胞和T细胞的小鼠的存活率(n＝3只小鼠)。(图2N)图l中的小鼠的外周血中的CD45.1+/CD4+和CD45.1+/CD8+T细胞分别占总CD4+和CD8+T细胞群体的百分比。数据以平均值±s.e.m呈现，并且除了图2D、图2F、图2J和图2M通过对数秩测试计算外，p值是通过双尾t测试计算的。
图3A-I.LILRB3通过TRAF2增强NF-κB信号传导和单核细胞AML存活率。(图3A)来自在用抗LILRB3抗体或IgG涂覆的板中培养的THP-1细胞的RNA-seq数据的基因本体富集分析。(图3B)NF-κB信号传导与LILRB3信号传导之间的相关性的GSEA分析(在GSEA分析中，p值是通过Kolmogorov Smirnov(K-S)测试计算的)。(图3C)在TNF-α(10ng/ml)存在或不存在的情况下，在用抗LILRB3抗体或IgG涂覆的板中培养之后稳定表达NF-κB-诱导型荧光素酶报告基因的THP-1-LuciaTM细胞的荧光素酶信号(n＝3个独立细胞培养物)。(图3D)在涂覆了抗LILRB3抗体或IgG的板中培养的THP-1细胞中的磷酸化的p65(p-p65)和p65水平。(图3E)与用于表达NF-κB启动子驱动的萤火虫荧光素酶和对照海肾荧光素酶(Renillaluciferase)以及空载体(EV)的质粒或TRADD、FADD或TRAF2表达质粒与用于表达LILRB3的载体或对照载体一起转染的293T细胞中的荧光素酶信号(n＝3个独立细胞培养物)。(图3F)来自与空载体(EV)或用于表达显性抑制TRAF2(dnTRAF2)的载体一起转染的在涂覆了抗LILRB3抗体或IgG的板中培养的THP-1-LuciaTM细胞的荧光素酶信号(n＝3个独立细胞培养物)。(图3G-H)表达dnTRAF2或空载体并且在涂覆有抗LILRB3抗体或IgG的板中培养的THP-1细胞(图3G)或Molm13细胞(图3H)的培养物中的死亡细胞的百分比(n＝3个独立细胞培养物)。(图3I)左图：在dnTRAF2存在或不存在的情况下，移植有表达荧光素酶和shRNA-C或LILRB3特异性shRNA的THP-1细胞的NSG小鼠的图像。右图：NSG小鼠的总体存活率(n＝3只独立小鼠，p值是通过对数秩测试计算的)。数据以平均值±s.e.m表示，并且除了图3B和图3I外，p值是通过双尾t测试计算的。
图4A-M.LILRB3与TRAF2相互作用。(图4A)M5 AML患者样品中的通过用人抗LILRB3抗体进行的免疫沉淀检测到的TRAF2和LILRB3的相互作用。(图4B)LILRB3与TRAF2在体外相互作用。左图：在293T细胞中外源表达的与C末端处的hFc(B3ICDhFc)或单独的hFc融合的经纯化的LILRB3胞内结构域的SDS-PAGE。右图：经纯化的GST-TRAF2(0.5M)与经纯化的B3ICDhFc或hFc相互作用。(图4C-E)外源HA-TRAF2与LILRB3片段在293T细胞中的免疫共沉淀分析。LILRB3片段的C末端与人Fc和CAR，即充当对照的不相关的蛋白质的胞外结构域和跨膜结构域融合。(图4F)外源HA-TRAF2和LILRB3突变体在293T细胞中的免疫共沉淀分析。(图4G)表达TRAF2和指出的LILRB3突变体的293T细胞中的相对NF-κB活性(n＝3个独立细胞培养物)。(图4H)对于与其它LILRB中的TRAF2结合至关重要的LILRB3序列(SEQ ID NO:444-448)的保守。(图4I)外源HA-TRAF2与和人融合的LILRB在293T细胞中的免疫共沉淀分析。(图4J)TRAF2与不同LILRB的胞内区段的相互作用。(图4K)外源HA-TRAF2片段和与人Fc融合的LILRB3胞内结构域(B3ICD)在293T细胞中的免疫共沉淀分析。(图4L)外周血(PB)、骨髓(BM)、脾脏(SPL)和肝脏中的表达B3-FL、B3del ICD、B3AAA突变体(n＝4只独立小鼠)或空载体(n＝3只独立小鼠)的GFP+MLL-AF9 AML细胞(使用PirB敲除)的百分比。(图4M)植入有以上指出的AML细胞的小鼠的存活率(n＝4只独立小鼠)。数据以平均值±s.e.m呈现，并且除了m通过对数秩测试计算外，p值是通过双尾t测试计算的。
图5A-J.NF-κB信号传导的LILRB3增强依赖于cFLIP。(图5A)在存在DMSO、胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-FMK或胱天蛋白酶8抑制剂z-IETD-FMK的情况下，用抗LILRB3抗体或IgG活化的THP-1-LuciaTM细胞中的NF-κB报告基因活性(n＝3个独立细胞培养物)。(图5B)由抗LILRB3抗体或IgG活化的THP-1细胞中的cFLIP的蛋白质印迹分析。(图5C)不同dox浓度下，用tet-on cFLIP加上空载体(EV)或用于表达LILRB3的载体共转染的293T细胞中的相对NF-κB报告基因活性(n＝3个独立实验)。(图5D)在存在DMSO或z-VAD-FMK(在0.2ug/ml dox的情况下)的情况下，与tet-on cFLIP加上空载体或用于表达LILRB3的载体共转染的293T细胞中的相对NF-κB报告基因活性(n＝3个独立实验)。(图5E)外源表达的FLAG-cFLIP和hFc加标签的B3-FL或B3del ICD在293T细胞中的免疫共沉淀测定。(图5F)在存在HA-TRAF2或空载体的情况下，外源表达的FLAG-cFLIP和LILRB3-hFc在293T细胞中的免疫共沉淀测定。(图5G)在不同dox浓度下，在存在LILRB3和dnTRAF2或空载体的情况下与tet-on cFLIP共转染的293T细胞中的相对NF-κB报告基因活性(n＝3个孔)。(图5H)在存在DMSO或z-VAD-FMK的情况下，与TRAF2或LILRB3共转染的293T细胞中的相对NF-κB报告基因活性(n＝3个独立实验)。(图5I)在不同dox浓度下，在存在LILRB3和TRAF2或空载体的情况下与tet-on cFLIP共转染的293T细胞中的相对NF-κB报告基因活性(n＝3个独立实验)。(图5J)将强迫表达TRAF2、FLIP或空载体(EV)的CFSE染色的THP-1细胞与经活化的T细胞在涂覆有抗LILRB3或IgG的板中共培养12小时，之后进行细胞死亡分析。图为CSFE阳性细胞中的死亡细胞百分比(n＝3个独立实验)。数据以平均值±s.e.m呈现，并且p值是通过双尾t测试计算的。
图6A-O.在强LPS刺激时LILRB3负调节NF-κB信号传导。(图6A-B)在存在或不存在200μg/L LPS的情况下，来自THP-1-LuciaTM细胞的信号(a)(n＝3个独立细胞培养物)以及在用抗LILRB3抗体或IgG处理12小时时THP-1细胞中的磷酸化的p65(p-p65)和p65的水平(b)。(图6C)内源SHP-1和SHP-2在稳定表达LILRB3-hFc(B3hFc)或空载体(EV)的THP-1细胞中的免疫共沉淀。(图6D)在存在外源表达的Lyn或不存在外源表达的Lyn(EV)的情况下，外源SHP-1和具有或不具有ITIM突变的CARECD-B3ICDhFc在293T细胞中的免疫共沉淀。Y4xF表示具有四个ITIM突变的蛋白质。(图6E-G)如下293T细胞中的相对NF-κB信号传导活性：在使用或不使用Lyn表达的情况下，在存在空载体或用于表达SHP-1或SHP-2的载体的情况下，用载体tet-on cFLIP和CARECD-B3ICD或CARECDTM共转染(图6E)；在存在200μg/L LPS的情况下表达TLR4、CD14、MD2、SHP-1和Lyn加上CARECDTM或具有不同ITIM突变的CARECD-B3ICD(图6F)；或在存在空载体、cFLIP-FL或p22的情况下用CARECD-B3ICD或CARECDTM共转染(图6G)。(n＝3个孔)。(图6H)来自用空载体或FL-cFLIP一起转染并且用抗LILRB3抗体或IgG活化的THP-1-LuciaTM细胞的信号。(n＝3个独立细胞培养物)。(图6I)在LPS或PBS的情况下，内源TRAF2与LILRB3-hFc在THP-1细胞中的免疫共沉淀。(图6J)在存在或不存在A20的FLAG加标签的N末端(A20N)的情况下，外源HA-TRAF2与B3ICDhFc、CARECDTMhFc或CARECD-B3ICDhFc的相互作用。(图6K)在存在空载体或A20N的情况下，用CARECD-B3ICD或CARECDTM共转染的293T细胞中的相对NF-κB信号传导活性。(n＝3个独立实验)。(图6L)在不同LPS浓度下，在存在DMSO或z-VAD-FMK的情况下，用抗LILRB3抗体或IgG活化的THP-1-LuciaTM细胞的信号。(n＝3个孔)。(图22M-N)在使用或不使用Lyn的情况下，SHP-1(图6M)或SHP-2(图6N)与TRAF2和CARECD-B3ICDhFc的免疫共沉淀。(图6O)使用或不使用200μg/L LPS的情况下，在存在抗LILRB3抗体或IgG的情况下，正常单核细胞(CD14+细胞)培养物中的NF-κB靶基因表达的qPCR。(n＝3个独立实验)。数据以平均值±s.e.m呈现，并且P值是通过双尾t测试计算的。
图7A-N.阻断性的抗LILRB3抗体阻止单核细胞AML发展。(图7A)30个高亲和力IgG的表位分箱。(图7B)存在以上IgG的情况下小鼠MLL-AF9 AML细胞的CFU测定(n＝3个独立实验)。(图7C)来自箱3号的两个IgG的结合亲和力。(图7D)上图：处理的示意图。下图：移植有表达B3-FL或B3delICD的AML细胞并且注射了IgG或抗LILRB31号N297A的小鼠的外周血(PB)、骨髓(BM)、脾脏(SPL)和肝脏(LV)中的GFP+MLL-AF9小鼠AML细胞的百分比(n＝3只独立小鼠)。(图7E)移植有如上所指出的AML细胞的小鼠的总体存活率。(图7F)在存在IgG或抗LILRB3 1号N297A的情况下，表达B3-FL或B3delICD的MLL-AF9小鼠AML细胞的CFU测定(n＝3个独立实验)(图7G)。上图：处理的示意图。接受者小鼠注射有用于耗竭CD8 T细胞的小鼠IgG或抗mCD8。下图：移植有表达B3-FL或B3delICD的AML细胞并且注射了IgG或抗LILRB31号LALAPG的小鼠的外周血(PB)、骨髓(BM)、脾脏(SPL)和肝脏(LV)中的GFP+MLL-AF9小鼠AML细胞的百分比(n＝4只小鼠)。(图7H)小图h中的小鼠的存活率(n＝4只独立小鼠)。(图7I)上图：治疗的示意图。下图：移植有表达荧光素酶的THP-1细胞并且用IgG或抗LILRB3 1号N297A(1号NA)处理的NSG小鼠的全身图像。(图7J)小图h中示出的小鼠的总体存活率(n＝3只独立小鼠)。(图7K)上图：处理的示意图。下图：移植有表达荧光素酶的Molm13细胞、注射了经活化的T细胞并且用IgG或1号NA处理的NSG小鼠的全身图像。(图7L)如小图k中描述的处理的小鼠的随时间的推移变化的荧光素酶信号传导。(图7M)如小图k中描述的处理的小鼠的总体存活率(n＝3只独立小鼠)。(图7N)对在Molm13 AML细胞移植后22天如小图l中描述的处理的小鼠的外周血中的T细胞的分析。上图：流式细胞术分析。下图：T细胞百分比图(n＝3只独立小鼠)。数据以平均值±s.e.m呈现，并且除了图7E、图7H、图7J和图7M通过对数秩测试计算外，p值是通过双尾t测试计算的。
图8A-I.抗LILRB3阻断抗体阻止患者源性AML的发展。(图8A)上图：处理的示意图。向NSG小鼠移植单核细胞AML患者外周血样品(耗竭的红细胞)并且给予IgG或1号NA。下图：小鼠骨髓细胞(用同种型IgG染色的骨髓样品用作阴性对照)的FACS分析。(图8B)如小图a中所指示的处理的注射IgG或1号NA后的NSG小鼠中的人类AML细胞(CD45+/CD33+)的百分比(n＝8只独立小鼠)。(图8C)如小图a中所指示的处理的NSG小鼠中的人T细胞的百分比(n＝8只独立小鼠)。(图8D)如小图a中所指示的处理的NSG小鼠的总体存活率(n＝8只独立小鼠)。(图8E)处理的示意图。在用IgG或抗LILRB3 1号LALAPG处理的情况下向NSG小鼠移植单核AML细胞(源自植入有单核细胞AML患者外周血样品的NSG小鼠的BM)。(图8F)小鼠骨髓中的人AML细胞上的LILRB3表达的流式细胞术分析。(图8G)如小图e中所指示的进行IgG或1号NA处理后的NSG小鼠的人AML细胞(CD45+/CD33+)的百分比(n＝5只独立小鼠)。(图8H)如小图e中所指示的处理的NSG小鼠中的人T细胞的百分比(n＝5只独立小鼠)。(图8I)如小图e中所指示的处理的NSG小鼠的存活率(n＝5只独立小鼠)。数据以平均值±s.e.m呈现，并且除了d和i通过对数秩测试计算外，p值是通过双尾t测试计算的。
图S1A-K.LILRB3增强AML细胞存活并且促进单核细胞AML进展。(图S1a)对如通过流式细胞术确定的患者AML样品(n＝35)中的LILRB3和LILRB4表达的分析。(图S1b)用所涂覆的抗LILRB3或IgG培养的THP-1细胞在存在DMSO、ABT199(1μM)或AZA(10μM)的情况下的细胞死亡。(n＝3个孔)。(图S1c)AML细胞系中的LILRB3的敲降不影响培养物中的细胞生长(n＝3个孔)。(图S1d)将表达Tet-on Cre和loxp U6驱动的shRNA的THP-1细胞用Dox(1μg/ml)处理一天，并在一周后通过流式细胞术分析表面LILRB3表达。(图S1e)在存在不同浓度的TNFα的情况下，用抗LILRB3抗体或IgG处理的AML培养物中的死亡细胞的百分比(n＝3个孔)。(图S1f)在存在抗TNFα(5μg/ml)或对照IgG(n＝3个孔)的情况下，用抗LILRB3抗体或IgG处理的THP-1细胞的死亡细胞的百分比。(图S1g)移植有表达B3-FL或B3del ICD的C1498AML细胞的小鼠的外周血(PB)、骨髓(BM)、脾脏(SPL)和肝脏中的GFP+AML细胞的百分比(n＝4只小鼠)。(图S1h)如图S1e中处理的小鼠的存活率曲线。(图S6a)涂覆有抗LILRB3或IgG(n＝3个孔)的板中的THP-1细胞生长。(图S1j)用MLL-AF9小鼠AML细胞重新铺板的连续集落形成单元(CFU)(n＝3个孔)。(图S1k)过表达LILRB3或对照载体的U937细胞中的死亡细胞的百分比(n＝3孔)。数据以平均值±s.e.m呈现，并且除了h通过对数秩测试计算外，p值是通过双尾t测试计算的。
图S2A-C.LILRB3使单核AML细胞对抗细胞毒性T细胞的存活率有所提高。(图S7a)注射了小鼠IgG或抗mCD8(10mg/kg)的小鼠的脾脏中的CD4和CD8 T细胞的百分比。(图S2b)与对MLL-AF9 AML细胞具有特异性的小鼠T细胞(T-AF9)或非特异性T细胞(T-LPS)混合的常规BM细胞的CFU测定(MethoCultTMGF M3434)(n＝3个孔)。(图S2C)INFγ、TNFα和PD-1在来自植入了表达LILRB3 FL或LILRB3的胞内结构域截短的MLL-AF9 AML细胞的小鼠的脾脏的CD4和CD8 T细胞上的表达。
图S3A-C.LILRB3增强NF-κB信号传导，但不增强JNK信号传导。(图S3a)用全基因组RNA-seq分析对小鼠MLL-AF9 AML细胞中受LILRB3影响的前20个过程的KEGG分析。将RNA从表达B3-FL或B3del ICD的小鼠MLL-AF9 AML细胞中分离。“下”和“上”表示表达B3del ICD的AML细胞中以相对于表达B3-FL的那些细胞的水平较低或较高的水平表达的基因。(图S3b)小鼠MLL-AF9 AML细胞中的NF-κB信号传导与LILRB3之间的相关性的GSEA(在GSEA分析中，p值是通过Kolmogorov Smirnov(K-S)测试计算的)。(图S3c)LILRB3不增强JNK信号传导。在涂覆有抗LILRB3抗体或IgG的板中培养的THP-1细胞中的基因表达的GSEA。
图S4A-G.TRAF2和cFLIP相互作用，刺激NF-κB信号传导，并且提高AML细胞对细胞 毒性T细胞杀伤的抗性。(图S4a)与NF-κB报告基因加空载体、p22-FLIP、p43-CFLIP或全长cFLIP共转染的293T细胞中的相对NF-κB活性(n＝3个孔)。(图S4b)在存在dox的情况下，与NF-κB报告基因加空载体或tet-on cFLIP共转染的293T细胞中的相对NF-κB活性(n＝3个孔)。(图S4c)293T细胞中的外源表达的FLAG-cFLIP和HA-TRAF2的免疫共沉淀测定。(图S4d-e)TRAF2和cFLIP的过表达增加单核AML细胞对细胞毒性T细胞的抗性。将过表达TRAF2或空载体(EV)(图S4d)或cFLIP或空载体(图S4e)的CFSE染色的THP-1细胞与经活化的T细胞以不同比率共培养12小时，并且对细胞死亡进行定量。左图：死亡细胞的百分比相对于E:T比的图。右图：E:T比为2的FACS分析(n＝3个孔)。(图S4f)用所涂覆的IgG或抗LILRB3处理12小时的THP-1细胞中的pMLKL(pS358)和MLKL的蛋白质印迹。(图S4g)在存在DMSO或NF-κB抑制剂QNZ(10μM)的情况，用抗LILRB3抗体或IgG处理的THP-1细胞的死亡细胞的百分比(n＝3个孔)。数据以平均值±s.e.m呈现，并且p值是通过双尾t测试计算的。
图S5A-E.LILRB3通过TRAF2和SHP1/2平衡NF-κB信号传导。(图S5a)来自用抗LILRB3抗体或IgG进行活化后的不同时间时的THP-1-LuciaTM细胞的相对荧光素酶活性(n＝3个单独样品)。(图S5b)AML细胞系和正常单核细胞中的TRAF2 mRNA水平(n＝3个孔)。(图S5c)用PBS或LPS处理的小鼠的外周血(PB)、骨髓(BM)、脾脏(SPL)和肝脏中的表达B3-FL或B3del ICD的GFP+MLL-AF9 AML细胞(其中PirB敲除)的百分比(n＝4只小鼠)。(图S5d)如小图d中处理的植入有AML细胞的小鼠的存活率(n＝4只小鼠)。数据以平均值±s.e.m呈现，并且除了图1S0e通过对数秩测试计算外，p值是通过双尾t测试计算的。(图S5e)LILRB3信号传导的机制方案。在LILRB3没有配体诱导的交联的情况下，TRAF2仍然与LILRB3结合，但不刺激下游信号传导。当NF-κB信号传导处于低水平时，在LILRB3进行配体诱导的交联时，TRAF2募集cFLIP，并且cFLIP被胱天蛋白酶8(其活性可以被zVAD-FMK抑制)切割为p22-FLIP。p22-FLIP与IKK复合物结合并且刺激NF-κB信号传导。同时，在与LILRB3进行配体结合后，LILRB3的ITIM被磷酸化，所述磷酸化募集SHP-1和SHP-2。当其它诱因(例如，LPS)刺激高水平的NF-κB信号传导时，cFLIP和A20(TNFAIP3)的高表达被诱导。增加的cFLIP抑制胱天蛋白酶8活性，并且A20破坏TRAF2与LILRB3之间的相互作用。因此，LILRB3对由SHP介导的NF-κB信号传导的抑制作用成为主导。
图S6A-J.用于抑制AML发展的抗LILRB3阻断抗体的开发。(图S6a)上图：开发针对LILRB3的完全人源化抗体所用策略的流程图。下图：对经鉴定的抗体在LILRB3嵌合受体报告细胞测定中进行测试。(图S6b)LILRB3结合剂的ELISA结果。(图S6c)基于ELISA的抗LILRB3抗体的EC50值。(图S6d)如通过Octet确定的抗体32号、33号、67号和45号对LILRB3的亲和力。(图S6e)通过LILRA结合分析评估的抗LILRB3抗体与LILRA的交叉反应性。(图S6f)通过LILRB结合分析评估的抗LILRB3抗体与其它LILRB的交叉反应性。(图S6g)与TRAF2的相互作用促进LILRB3对AML发展的影响。在存在对照或抗LILRB3抗体的情况下，表达野生型LILRB3或突变型LILRB3的具有破坏TRAF2结合(AAA，QEE509-511AAA)或破坏SHP-1/2相互作用(Y596/626F)的突变的MLL-AF9 AML细胞的CFU测定(n＝3孔)。(图S6h)对抗LILRB3的Fc介导的效应功能的影响的评估。上图：治疗的示意图。下图：移植有表达B3-FL或B3delICD的AML细胞并且注射了IgG或抗LILRB3 6号的小鼠的PB、BM、SPL和LV中的GFP+MLL-AF9小鼠AML细胞的百分比(n＝4只小鼠)。(图S6i)如小图S6h中处理的小鼠的存活率。(图S6j)来自用抗LILRB3 1号NA或IgG处理的异种移植的NSG小鼠的BM的THP-1细胞中的NF-κB信号传导靶基因表达(通过qPCR测量)(n＝3个单独样品)。数据以平均值±s.e.m呈现，并且除了图S6i通过对数秩测试计算外，p值是通过双尾t测试计算的。
图S7A-C.抗LILRB3 1号N297A抗体不影响正常血生成和白细胞增多。(图S7a)髓系特异性LILRB3转基因小鼠的产生的示意图。(图S7b-c)LILRB3在用抗LILRB3 1号抗体(n＝2只小鼠)或IgG(n＝3只小鼠)处理的LysM-Cre驱动的LILRB3在转基因小鼠的外周血(PB)、脾脏(SPL)和骨髓(BM)中的髓系细胞上表达。示出了代表性流式细胞术图(图S7b)和结果总结(图S7c)。
图S8.将THP-1细胞在用所涂覆的抗LILRB3或IgG处理的96孔板中培养，然后将细胞用DMSO、ABT199(1μM)或AZA(10μM)处理。细胞死亡在24小时后被检测为PI阳性。
图S9.将THP-1NF-κB荧光素酶报告细胞感染慢病毒，并且用所涂覆的抗LILRB3或IgG处理。在指定时间点测量NF-κB报告细胞的荧光素酶活性。
图S10A-B.AML细胞系中的LILRB3的敲低不影响培养物中的细胞生长(图S10A)和存活(图S10B)。
图S11A1/2-B.LILRB3和PirB表达模式以及LILRB3转基因小鼠。(图S11A1/2)LILRB3在人组织中的表达以及PirB在小鼠组织中的表达。(图S11B)。LILRB3在用抗LILRB31号抗体或IgG处理的LysM-Cre驱动的LILRB3在转基因小鼠的髓系细胞上表达。
图S12.将THP-1细胞用LPS或PBS进行处理，并且通过流式细胞术检测表面LILRB3表达。
具体实施方式
靶向疗法可以诱导肿瘤快速消退，而免疫疗法可以实现持久的抗肿瘤作用。因此，理想的鉴定能实现靶向疗法和免疫疗法的优势的组合的分子靶标。在免疫细胞和白血病细胞两者上都表达的白细胞免疫球蛋白样受体家族(LILRB)的功能尚不清楚。
本公开涉及在某些髓系白血病、B淋巴性白血病和骨髓瘤细胞上表达的LILRB3(Pfistershammer等人,2009)。据报道，其与干细胞标志物CD34和骨髓瘤标志物CD138共表达(Pfistershammer等人,2009)。在这项研究中，发明人发现单核AML细胞上的LILRB3表达通过募集TRAF2和cFLIP以刺激NF-κB活性，来增强这些白血病细胞在存在或不存在细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的情况下的存活。其还显示出，用拮抗抗体阻断LILRB3信号传导增加了白血病细胞死亡和CTL的细胞毒性作用。因此，LILRB3是用于治疗AML以及可能地其它癌症的潜在靶标。本公开还提供了鉴定LILRB3拮抗剂(例如，抗LILRB3抗体)的方法。因此，本公开的方法和组合物提供了鉴定半乳凝素诱导的LILRB3活化的方法以及其在治疗癌症，具体地AML中的用途。
下面对本公开的描述仅旨在说明本公开的各个实施方式。因此，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开的范围的限制。对于本领域的技术人员来说显而易见的是，可以在不脱离本公开的范围的情况下进行各种等效形式、变化和修改，并且应当理解，这些等效实施方式将包含在本文中。本文引用的所有参考文献，包含出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本文。
I.定义
应当理解，前述一般性描述和以下详细说明都仅是示例性和解释性的，并且不限制所要求保护的本发明。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括/包含(including)”以及如“包括/包含(includes)”和“包括/包含(included)”等其它形式的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，否则如“元件”或“组件”等术语涵盖包括一个单元的元件和组件以及包括多于一个亚单元的元件和组件两者。此外，术语“部分”的使用可以包括部分的一部分或整个部分。
如本文所用，除非上下文清楚地另外指明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。
如本文所用，术语“约”在提及如量、持续时间等可测量值时，意在涵盖所指定值的最大±10％的变化。除非另外指明，否则本说明书和权利要求中使用的表示成分的量、如分子量、反应条件等性质的所有数字应被理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。因此，除非有相反地指示，否则在以下说明书和所附权利要求中所阐述的数值参数是可以根据寻求通过所公开主题获得的期望特性而改变的近似值。至少，并且不是试图将等效原则的应用限制到权利要求的范围，每个数值参数至少应该根据所报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。虽然阐述本发明的广泛范围的数字范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可能地精确地报告。然而，任何数值固有地含有必然由在其相应测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。
术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其可以与完整抗体竞争与靶抗原特异性结合的片段，并且包含例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体和双特异性抗体。“抗体”是一种抗原结合蛋白。完整抗体将通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情况下可以包含更少的链，如天然存在于骆驼科中的可以仅包含重链的抗体。抗体可以仅源自单一来源，或者可以是“嵌合的”，即，抗体的不同部分可以源自两种不同的抗体，如下文进一步描述的。抗原结合蛋白、抗体或结合片段可以在杂交瘤中通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。除非另有指示，否则除了包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体以外，术语“抗体”包含其衍生物、变体、片段以及突变蛋白，所述抗体的实例如下描述。此外，除非明确排除，否则抗体分别包含单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体(在本文中有时称为“抗体缀合物”)和其片段。在一些实施方式中，所述术语也涵盖肽体。
天然存在的抗体结构单位通常包含四聚体。每个此类四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一条全长“轻”链(在某些实施方式中，约25kDa)和一条全长“重”链(在某些实施方式中，约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分通常包含通常负责抗原识别的具有约100到110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分通常限定可以负责效应子功能的恒定区。人轻链通常被分类为κ和λ轻链。重链通常被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA类似地分为亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链中，可变区和恒定区通常通过具有约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括具有约10个以上氨基酸的“D”区。参见例如，《基础免疫学(Fundamental Immunology)》,第7章(Paul,W.编辑,第2版,纽约的雷文出版社(RavenPress,N.Y.)(1989))(所述文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文)。每个轻/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链和/或重链的一部分，通常包含重链中大约氨基末端120个到130个氨基酸以及轻链中约100个到110个氨基末端氨基酸。在某些实施方式中，不同抗体的可变区在氨基酸序列上存在很大差异，甚至在同一种类的抗体中也是如此。抗体的可变区通常决定特定抗体对其靶标的特异性。
可变区通常展现出由三个超可变区，也称为互补性决定区或CDR连接的相对保守的框架区(FR)的相同一般结构。来自每对的两条链的CDR通常通过框架区比对，所述框架区可以实现与特定表位结合。从N末端到C末端，轻链可变区和重链可变区两者通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对每个结构域的氨基酸的分配通常符合以下的定义：免疫学相关蛋白的Kabat序列(Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)(马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,Bethesda,Md.)(1987和1991)),Chothia和Lesk,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,196:901-917(1987)或Chothia等人,《自然(Nature)》,342:878-883(1989)。
在某些实施方式中，抗体重链在不存在抗体轻链的情况下与抗原结合。在某些实施方式中，抗体轻链在不存在抗体重链的情况下与抗原结合。在某些实施方式中，抗体结合区在不存在抗体轻链的情况下与抗原结合。在某些实施方式中，抗体结合区在不存在抗体重链的情况下与抗原结合。在某些实施方式中，单个可变区在不存在其它可变区的情况下与抗原特异性结合。
在某些实施方式中，通过解析抗体的结构和/或解析抗体-配体复合物的结构来完成CDR的明确描绘和包括抗体结合位点的残基的鉴定。在某些实施方式中，这可以通过本领域的技术人员已知的多种技术中的任何技术来完成，如X射线晶体学。在某些实施方式中，可以采用各种分析方法来鉴定或模拟CDR区。此类方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和接触定义。
Kabat定义是用于对抗体中的残基进行编号的标准，并且通常用于鉴定CDR区。参见例如，Johnson和Wu,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,28:214-8(2000)。Chothia定义类似于Kabat定义，但Chothia定义考虑了某些结构环区的位置。参见例如，Chothia等人,《分子生物学杂志》196:901-17(1986)；Chothia等人,《自然》,342:877-83(1989)。AbM定义使用由牛津分子集团(Oxford Molecular Group)生产的对抗体结构进行建模的计算机程序的集成套件(integrated suite)。参见例如，Martin等人,《美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci(USA))》,86:9268-9272(1989)；“AbMTM，用于对抗体可变区进行建模的计算机程序(AbMTM,A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies)”,英国牛津的牛津分子有限公司(Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd.)。AbM定义使用知识数据库和从头计算方法的组合，对来自一级序列的抗体的三级结构进行建模，如以下文献所描述的那些：Samudrala等人,“使用组合分层方法的从头计算蛋白质结构预测(Ab InitioProtein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach)”,《蛋白质，结构、功能和基因学(PROTEINS,Structure,Function and Genetics)》增刊,3:194-198(1999)。接触定义是基于对可用的复杂晶体结构的分析。参见例如，MacCallum等人,《分子生物学杂志》5:732-45(1996)。
按照惯例，重链中的CDR区通常被称为H1、H2和H3，并且是按从氨基末端到羧基末端的方向依序编号的。轻链中的CDR区通常被称为L1、L2和L3，并且是按从氨基末端到羧基末端的方向依序编号的。
术语“轻链”包含具有足够可变区序列以赋予结合特异性的全长轻链和其片段。全长轻链包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端处。轻链包含κ链和λ链。
术语“重链”包含具有足够可变区序列以赋予结合特异性的全长重链和其片段。全长重链包含可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端处，并且CH结构域位于羧基末端处，其中CH3最接近多肽的羧基末端。重链可以是任何同种型，包含IgG(包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包含IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
“双特异性”或“双官能抗体”通常是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括但不限于杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如，Songsivilai等人,《临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)》,79:315-321(1990)；Kostelny等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》,148:1547-1553(1992)。
术语“抗原”是指能够诱导适应性免疫应答的物质。具体而言，抗原是用作适应性免疫应答受体的靶标的物质。通常，抗原是与抗原特异性受体结合但自身不能在体内诱导免疫应答的分子。抗原通常是蛋白质和多糖，不太常见的也有脂质。合适的抗原包括但不限于细菌的部分(衣壳、荚膜、细胞壁、鞭毛、菌毛和毒素)、病毒和其它微生物。抗原还包括肿瘤抗原，例如，由肿瘤中的突变产生的抗原。如本文所用，抗原还包括免疫原和半抗原。
如本文所用，“抗原结合蛋白”(“ABP”)意指与特定靶抗原结合的任何蛋白质。在本申请中，特定靶抗原是LILRB蛋白或其片段。“抗原结合蛋白”包括但不限于抗体和其抗原结合片段。肽体是抗原结合蛋白的另一个实例。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指能够与抗原特异性结合的蛋白质的一部分。在某些实施方式中，抗原结合片段源自包括一个或多个CDR的抗体，或与抗原结合但不包括完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。在某些实施方式中，抗原结合片段不是源自抗体而是源自受体。抗原结合片段的实例包括但不限于双体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv′)、二硫键稳定的双体(ds双体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双体)、多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、骆驼化抗体或纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。在某些实施方式中，抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的同一抗原结合。在某些实施方式中，抗原结合片段可以包括来自移植到来自一种或多种不同人抗体的框架区的特定人抗体的一个或多个CDR。在某些实施方式中，抗原结合片段源自受体并且含有一个或多个突变。在某些实施方式中，抗原结合片段不与抗原结合片段所衍生的受体的天然配体结合。
“Fab片段”包含一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fab′片段”包含一条轻链和一条重链的一部分，使得可以在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab′)2分子，所述一条重链的一部分含有VH结构域和CH1结构域以及还含有位于CH1结构域与CH2结构域之间的区。
“F(ab')2片段”含有两条轻链和两条重链，使得在两条重链之间形成链间二硫键，所述两条重链含有位于CH1结构域与CH2结构域之间的恒定区的一部分。因此，F(ab′)2片段由两个Fab′片段构成，所述两个Fab′片段由位于两条重链之间的二硫键保持在一起。
“Fc”区域包含两个重链片段，所述重链片段包含抗体的CH1结构域和CH2结构域。两个重链片段由两个或更多个二硫键并且通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fv区”包含来自重链和轻链两者的可变区但是缺乏恒定区。
“单链抗体”是Fv分子，其中重链可变区和轻链可变区通过柔性接头连接以形成单个多肽链，所述单个多肽链形成抗原结合区。单链抗体在国际专利申请公开第WO 88/01649号和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号中进行了详细讨论，所述文献的公开内容通过引用并入。
“结构域抗体”是仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。
“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。二价抗原结合蛋白和二价抗体可以是双特异性的，参见下文。在某些实施方式中，除了“多特异性”或“多功能”抗体之外的二价抗体通常被理解为其结合位点中的每个结合位点相同。
“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是一种靶向多于一个抗原或表位的抗体。
“双特异性(bispecific)”、“双特异性(dual-specific)”或“双官能”抗原结合蛋白或抗体分别是具有两个不同的抗原结合位点的杂合抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗原结合蛋白和抗体是一种多特异性抗原结合蛋白抗体，并且可以通过多种方法产生，包含但不限于杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见例如，Songsivilai和Lachmann,1990,《临床与实验免疫学》79:315-321；Kostelny等人,1992,《免疫学杂志》148:1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将与两个不同的表位结合，所述两个不同的表位可以驻留在相同或不同的蛋白质靶标上。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所使用的，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法来测量，包括本文所描述的那些方法。低亲和力抗体通常会缓慢地与抗原结合并且往往容易解离，而高亲和力抗体通常更快地与抗原结合并且往往保持更长的结合。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，所述方法中的任何方法可以用于本发明的目的。以下描述了用于测量结合亲和力的具体说明性实施方式和示例性实施方式。
与特定多肽或特定多肽上的表位“特异性结合”或对其“具有特异性”的抗体是与所述特定多肽或特定多肽上的表位结合而不与任何其它多肽或多肽表位实质性结合的抗体。例如，本发明的LILRB3特异性抗体对LILRB3具有特异性。在一些实施方式中，与LILRB3结合的抗体的解离常数(Kd)≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如，10-8M到10-13M，例如，10-9M到10-13M)。本文所使用的解离常数Kd是指解离速率与缔合速率的比率(koff/kon)，所述比率可以使用本领域已知的任何常规方法来确定，包括但不限于表面等离子体共振法、微量热泳法、HPLC-MS法和流式细胞术(如FACS)法。在某些实施方式中，Kd值可以通过使用流式细胞术适当地确定。
术语“竞争”在用于竞争同一表位的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的上下文时，意指由测定确定的抗原结合蛋白之间的竞争，在所述测定中，所测试的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)阻止或抑制(例如，减少)参考抗原结合蛋白(例如，配体或参考抗体)与共同抗原(例如，LILRB或其片段)的特异性结合。可以使用多种类型的竞争性结合测定来确定一种抗原结合蛋白是否与另一种抗原结合蛋白竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如，Stahli等人,1983,《酶学方法(Methods in Enzymology)》9:242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等人,1986,《免疫学杂志》137:3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如，Harlow和Lane,1988,《抗体：实验室手册(Antibodies,A Laboratory Manual)》,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))；使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见例如，Morel等人,1988,《分子免疫学(Molec.Immunol.)》25:7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如，Cheung等人,1990,《病毒学(Virology)》176:546-552)；以及直接标记RIA(Moldenhauer等人,1990,《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》32:77-82)。通常，此类测定涉及使用与固体表面结合的经纯化的抗原或携带这些经纯化的抗原中的任一一种经纯化的抗原的细胞、未标记的测试抗原结合蛋白和标记的参考抗原结合蛋白。通过在存在测试抗原结合蛋白的情况下确定与固体表面或细胞结合的标记量来测量竞争抑制。通常，测试抗原结合蛋白以过量存在。通过竞争测定鉴定的抗原结合蛋白(竞争抗原结合蛋白)包括与参考抗原结合蛋白结合同一表位的抗原结合蛋白，以及与相邻表位结合的抗原结合蛋白，所述相邻表位与所述参考抗原结合蛋白结合的表位足够近，以发生空间位阻。本文的实例提供了关于用于确定竞争性结合的方法的另外的详细信息。通常，当竞争抗原结合蛋白以过量存在时，所述竞争抗原结合蛋白将参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合抑制(例如，减少)至少40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％或75％或更多。在一些情况下，结合被抑制至少80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-97％或97％或更多。
如本文所用，术语“表位”是指与抗体所结合的抗原上的特定组的原子或氨基酸。表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由从抗原开始的连续氨基酸序列形成并且基于其一级结构与抗体相互作用。另一方面，构象表位由抗原的氨基酸序列的不连续区段构成并且基于抗原的3D结构与抗体相互作用。通常，表位的长度为大约五个或六个氨基酸。如果两种抗体对抗原表现出竞争性结合，则这两种抗体可以与抗原内的同一表位结合。
如本文所用，“细胞”可以是原核的或真核的。原核细胞包括例如细菌。真核细胞包括例如真菌、植物细胞和动物细胞。动物细胞的类型(例如，哺乳动物细胞或人细胞)包括例如，来自循环/免疫系统或器官的细胞，例如，B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、粒细胞(例如，嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和分叶过多中性粒细胞(hypersegmented neutrophil))、单核细胞或巨噬细胞、红细胞(例如，网织红细胞)、肥大细胞、血小板或巨核细胞以及树突状细胞；来自内分泌系统或器官的细胞，例如，甲状腺细胞(例如，甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺细胞(例如，甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺细胞(例如，嗜铬细胞)以及松果体细胞(例如，松果腺细胞)；来自神经系统或器官的细胞，例如，胶质母细胞(例如，星形胶质细胞和少突胶质细胞)、小胶质细胞、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、伯特歇尔细胞(boettchercell)和垂体细胞(例如，促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、促甲状腺激素细胞、促生长激素细胞和催乳激素细胞)；来自呼吸系统或器官的细胞，例如，肺细胞(I型肺细胞和II型肺细胞)、克拉拉细胞(clara cell)、杯状细胞和肺泡巨噬细胞；来自循环系统或器官的细胞(例如，心肌细胞和周细胞)；来自消化系统或器官的细胞，例如，胃粘膜主细胞、壁细胞、杯状细胞、潘氏细胞(paneth cell)、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞和肝细胞(例如，肝细胞和库普弗细胞(Kupffer cell))；来自外皮系统或器官的细胞，例如，骨细胞(例如，成骨细胞、骨细胞和破骨细胞)、齿细胞(例如，成牙骨质细胞和造釉细胞)、软骨细胞(例如，成软骨细胞和软骨细胞)、皮肤/毛发细胞(例如，毛细胞、角化细胞和黑色素细胞(痣细胞)、肌肉细胞(例如，肌细胞)、脂肪细胞、纤维母细胞和肌腱细胞；来自泌尿系统或器官的细胞(例如，足状突细胞、球旁细胞、球内系膜细胞、球外系膜细胞、肾近端刷状缘细胞和致密斑细胞)；以及来自生殖系统或器官的细胞(例如，精子、塞尔托利氏细胞(Sertoli cell)、莱氏细胞(leydig cell)、卵子、卵母细胞)。细胞可以是正常的、健康的细胞；或患病或不健康的细胞(例如，癌细胞)。细胞进一步包括哺乳动物受精卵或干细胞，所述哺乳动物受精卵或干细胞包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、诱导的多能干细胞和成体干细胞。干细胞是能够在保持未分化的状态的同时经历细胞分裂的循环并且分化成特化细胞类型的细胞。干细胞可以是全能干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cell)、多能干细胞(multipotent stem cell)、寡能干细胞和单能干细胞，所述干细胞中的任何干细胞可能是由体细胞诱导的。干细胞还可以包括癌症干细胞。哺乳动物细胞可以是啮齿动物细胞，例如，小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞。哺乳动物细胞可以是兔类细胞，例如，兔细胞。哺乳动物细胞也可以是灵长类动物细胞，例如，人细胞。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂合蛋白或多肽，其含有与活化免疫细胞，例如，T细胞或NK细胞的结构域或信号传导，例如，T细胞信号传导或T细胞活化结构域连接的抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))(参见例如，Kershaw等人,同上,Eshhar等人,《美国国家科学院院刊》,90(2):720-724(1993)以及Sadelain等人,《当前免疫学观点(Curr.Opin.Immunol.)》21(2):215-223(2009))。CAR能够利用单克隆抗体的抗原结合性质，以非MHC限制性方式将免疫细胞特异性和对所选靶标的反应性重定向。非MHC限制性抗原识别使表达CAR的免疫细胞能够识别独立于抗原处理的抗原，从而绕开肿瘤逃逸的主要机制。另外，当在T细胞中表达时，有利地，CAR不会与内源性T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。
如本文所用，就指定组分而言，“本质上不含”在本文中用于意指指定组分没有被故意调配成组合物和/或仅作为污染物或以微量存在。因此，由组合物的任何非预期污染产生的指定组分的总量远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选的是其中使用标准分析方法检测不到到指定组分的量的组合物。
术语“宿主细胞”意指已经被核酸序列转化或能够被转化并由此表达所关注的基因的细胞。所述术语包括亲本细胞的后代，无论后代与原始亲本细胞在形态上或遗传构成上是否相同，只要存在所关注基因即可。
术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列确定的。“同一性百分比”意指比较分子中氨基酸或核苷酸之间的相同残基的百分比，并且是基于所比较的分子中的最小分子的大小计算的。对于这些计算，优选地通过特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)来解决比对中的空位(如果有的话)。可以用于计算所比对的核酸或多肽的同一性的方法包括以下文献中描述的那些方法：《计算分子生物学(Computational Molecular Biology)》,(Lesk,A.M.编辑),1988,纽约：牛津大学出版社(New York:Oxford University Press)；《生物计算信息学和基因组计划(Biocomputing Informatics and Genome Projects)》,(Smith,D.W.编辑),1993,纽约：学术出版社(New York:Academic Press)；《序列数据的计算机分析(Computer Analysisof Sequence Data)》,第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑),1994,新泽西州：胡马纳出版社(New Jersey:Humana Press)；von Heinje,G.,1987,《分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)》,纽约：学术出版社；《序列分析引物(Sequence Analysis Primer)》,(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑),1991,纽约：米斯托克顿出版社(New York:M.Stockton Press)；以及Carillo等人,1988,《工业与应用数学学会应用数学杂志(SIAM J.Applied Math.)》48:1073。
在计算同一性百分比时，进行比较的序列通常以使序列之间的匹配最大的方式比对。可以用于确定同一性百分比的计算机程序的一个实例是GCG程序包，所述程序包包括GAP(Devereux等人,1984,《核酸研究》12:387；威斯康星州麦迪逊威斯康星大学遗传学计算机组(Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.))。计算机算法GAP用于比对要确定序列同一性百分比的两个多肽或多核苷酸。对序列进行比对，以实现其相应氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配范围”，如由算法确定的)。空位开放罚分(其计算为3×平均对角线，其中“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是特定比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的评分或数字)和空位延伸罚分(其通常是空位开放罚分的1/10倍)以及如PAM 250或BLOSUM 62等比较矩阵与算法一起使用。在某些实施方式中，标准比较矩阵(参见例如，Dayhoff等人,1978,《蛋白序列和结构图谱学(Atlas ofProtein Sequence and Structure)》,5:345-352中关于PAM 250比较矩阵的内容；Henikoff等人,1992,《美国国家科学院院刊》89:10915-10919中关于BLOSUM 62比较矩阵的内容)也被算法使用。
可以用于使用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的参数的实例可以见于以下文献中：Needleman等人,1970,《分子生物学杂志》48:443-453。
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可能仅导致两个序列中的一个短区匹配，并且此小的所比对的区可能具有非常高的序列同一性，尽管两个全长序列之间没有明显关系。因此，如果期望，可以调整所选比对方法(GAP程序)以产生跨越靶多肽的至少50个或其它数量的连续氨基酸的比对。
如本文所用，术语“连接”是指通过分子内相互作用，例如，共价键、金属键和/或离子键或分子间相互作用，例如，氢键或非共价键缔合。
白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2(LILRB3)是人体中由LILRB3基因编码的蛋白质。此基因是白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族的成员，所述家族存在于染色体区19q13.4处的基因簇中。经编码的蛋白质属于LIR受体的亚家族B类，所述受体含有两个或四个胞外免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和两个至四个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。
术语“可操作地连接”是指其中如此描述的组分被配置成执行其常用功能的元件的布置。因此，与多肽可操作地连接的给定信号肽从细胞中引导多肽的分泌。在启动子的情况下，与编码序列可操作地连接的启动子将引导编码序列的表达。启动子或其它控制元件不必与编码序列相连，只要所述启动子或其它控制元件起到引导其表达的作用。例如，中间的未经翻译的但仍经转录的序列可以存在于启动子序列与编码序列之间，并且启动子序列仍然可以被视为与编码序列“可操作地连接”。
权利要求中使用术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或替代方案相互排斥，但本公开支持仅指替代方案以及“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链核苷酸聚合物和双链核苷酸聚合物两者。包括多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸类型的经修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，如溴尿嘧啶核苷和肌苷衍生物、核糖修饰，如2′,3′-二脱氧核糖以及核苷酸间键合修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。
术语“多肽”或“蛋白质”意指具有天然蛋白质的氨基酸序列的大分子，即，由天然存在的和非重组细胞产生的蛋白质；或者所述蛋白质是由经基因工程化的细胞或重组细胞产生的，并且包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。所述术语还包括氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸是对应天然存在的氨基酸的化学类似物以及聚合物。术语“多肽”和“蛋白质”具体地涵盖LILRB抗原结合蛋白、抗体或具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白相比，具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。与天然蛋白质相比，此类片段还可以含有经修饰的氨基酸。在某些实施方式中，片段的长度为约五个至500个氨基酸。例如，片段的长度可以为至少5个、6个、8个、10个、14个、20个、50个、70个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个或450个氨基酸。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能片段，包括结合结构域。在LILRB结合抗体的情况下，有用的片段包括但不限于CDR区、重链和/或轻链的可变结构域、抗体链的一部分或仅包括两个CDR的其可变区等。
可用于本发明的药学上可接受的载体是常规的。E.W.Martin,《雷明顿氏药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(MackPublishing Co.,Easton,PA),第15版(1975)描述了适用于本文所公开的融合蛋白的药物递送的组合物和调配物。通常，载体的性质将取决于所采用的特定施用模式。例如，肠胃外调配物通常包括可注射流体，所述可注射流体包括药学上和生理学上可接受的流体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为媒剂。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的载体之外，要施用的药物组合物可以含有少量无毒的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如，乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
如本文所用，术语“受试者”是指人类或任何非人类动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前形式和出生后形式。在许多实施方式中，受试者是人类。受试者可以是患者，所述患者是指呈现给医疗提供者以进行疾病的诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中与“个体”或“患者”可互换使用。受试者可以患有或易于患上疾病或病症，但是可以或可以不展示出疾病或病症的症状。
如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指有效治疗疾病或病状的药物的剂量或浓度。例如，关于本文所公开的单克隆抗体或其抗原结合片段治疗癌症的用途，治疗有效量是能够减少肿瘤体积、根除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长或癌细胞向其它器官的浸润、抑制介导癌症病状的细胞的生长或增殖、抑制或减缓肿瘤细胞转移、改善与肿瘤或癌性病状相关的任何症状或标志物、防止或延缓肿瘤或癌性病状的发展或其一些组合的单克隆抗体或其抗原结合片段的剂量或浓度。
如本文所使用的，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”病状包括预防或减轻病状、减缓病状的发作或发展速率、降低罹患病状的风险、预防或延缓与病状相关的症状的发展、减轻或结束与病状相关的症状、产生病状的完全或部分消退、治愈病状或其某种组合。
如本文所用，“载体”是指引入到宿主细胞中由此产生经转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在宿主细胞，如复制起点中进行复制的核酸序列。载体还可以包括一个或多个治疗基因和/或可选标志物基因以及本领域中已知的其它遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此使细胞表达除对细胞来说天然的核酸和/或蛋白质之外的核酸和/或蛋白质。载体任选地包括有助于实现核酸进入到细胞中的材料，如病毒颗粒、脂质体、蛋白质包衣等。
II.LILRB3和相关疾病
白细胞免疫球蛋白样受体(LILR)是一类具有胞外免疫球蛋白结构域的受体。所述受体还被称为CD85、ILT和LIR，并且可以对多种免疫细胞发挥免疫调节作用。编码这些受体的人类基因存在于染色体区19q13.4处的基因簇中。所述受体包括LILRA1、LILRA2、LILRA3、LILRA4、LILRA5或LILRB7、LILRA6或LILRB6、LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4和LILRB5。这些LILR中的一部分能识别MHC I类分子(在人类中也被称为HLA I类)。在这些受体中，抑制性受体LILRB1和LILRB2显示出对经典和非经典MHC等位基因的广泛特异性，并与β2m缔合的复合物优先结合。相比之下，活化受体LILRA1和LILRA3更倾向于在不依赖于b2m的MHC I类((特别是HLA-C等位基因))自由重链。有关LILR和以下对LILRB1-5和LAIR1的描述，请参见综述22。
白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员3是一种在人类中由LILRB3基因编码的蛋白质。此基因存在于染色体区19q13.4处的基因簇中。LILRB3在髓系细胞中限制性地进行表达，所述髓系细胞包括单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞(以及肥大细胞和一些破骨细胞，这是基于体外分化实验的证据)。LILRB3含有四个细胞质ITIM基序，并且促进免疫应答的负调节。LILRB3的配体是未知的，并且关于LILRB3的功能了解的相对较少。LILRB3与人嗜碱性细胞中的活化受体的共连接导致对细胞活化的抑制。LILRB3也表明是过敏性炎症和自身免疫的抑制剂。值得注意的是，包括LILRB3在内的LILRB家族受体是灵长类动物特有的。小鼠直接同源物PirB对LILRB3的表达模式和配体是不同的。
发明人已经证明，表达急性髓系白血病(AML)细胞的LILRB3提高了存活率并且抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性。在机制上，发明人发现LILRB3的胞内结构域与衔接蛋白TRAF2是组成上相关的，所述衔接蛋白TRAF2在AML细胞中的水平也很高。LILRB3活化引起对NF-kB信号传导的刺激以及AML细胞存活的增强。经活化的LILRB3可以通过TRAF2进一步募集信号传导蛋白cFLIP。由于全长cFLIP可以被胱天蛋白酶8切割成p22-FLIP以刺激NF-kB，因此LILRB3的活化使全长cFLIP被切割并且诱导NF-kB信号传导。所述活化还显示，对胱天蛋白酶活性的抑制阻止LILRB3刺激NF-kB信号传导。被高水平的LPS刺激的NF-kB信号传导的上调，其通过A20破坏了LILRB3与TRAF2的相互作用，所述A20是由高水平的NF-kB快速诱导的蛋白质。因此，LILRB3的SHP-1/2介导的抑制功能成为主导。因此，LILRB3可以起到NF-kB的刺激剂或抑制剂的作用，这取决于信号传导上下文。
一方面，可以使用LILRB3的拮抗剂以治疗增生性疾病。尽管过度增殖性疾病可能与导致细胞开始不受控制地繁殖的任何疾病相关，但典型的实例是癌症。癌症的实例通常可以分类为实体瘤和血液系统恶性病。实体瘤包括但不限于肾上腺癌、胆管癌、骨癌、脑癌(例如，星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、成血管细胞瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、少突胶质细胞瘤、脊柱轴肿瘤)、乳腺癌(包括听神经瘤、基底乳腺癌、导管癌和小叶乳腺癌)、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、结直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肾癌(包括威尔姆氏肿瘤(Wilms tumor))、肝癌(包括肝细胞癌(HCC))、肺癌(包括支气管癌、非小细胞肺癌(鳞状/非鳞状)、细支气管肺泡细胞肺癌、乳头状腺癌)、间皮瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、松果体瘤、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤(包括软骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、粘液肉瘤、成骨性肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤)、皮肤癌(包括基底细胞癌、皮脂腺癌、鳞状细胞癌)、睾丸癌(包括精原细胞瘤)、胸腺癌、甲状腺癌(例如，甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌)、子宫癌和阴道癌。
血液系统恶性病包括但不限于母细胞性浆细胞样树突状细胞赘生物(BPDCN)、重链疾病、白血病(包括但不限于急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)(包括但不限于急性早幼粒细胞性白血病(APL)或M3 AML、急性髓单核细胞白血病或M4 AML、急性单核细胞白血病或M5 AML)、B细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)、慢性髓细胞白血病(CML)、前B急性淋巴细胞性白血病(前B ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤)、淋巴瘤(包括但不限于霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖性赘生物和真性红细胞增多症。
免疫疗法有很大希望实现持久抗肿瘤作用。免疫检查点PD-1和CTLA-4阻断疗法已经成功治疗一些类型的癌症，而在其它类型的癌症中不行。这些免疫疗法靶向T细胞上的抑制性分子，以在肿瘤微环境(TME)内再活化功能性失调的T细胞。其它免疫细胞群体，包括单核细胞，以甚至比T细胞的数量更大的数量存在于TME中。事实上，单核细胞源性巨噬细胞是肿瘤组织中最丰富的免疫细胞群体。尽管这些先天细胞具有杀伤肿瘤细胞和引发或再活化T细胞的能力，但所述先天细胞在TME中变得功能失调并且变成支持肿瘤发展并且抑制免疫监测和攻击的MDSC和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。包括单核细胞MDSC(M-MDSC)和多形核MDSC(PMN-MDSC)在内的MDSC表示未能终末分化的未成熟髓系细胞的异质群体。TAM是TME中的混合巨噬细胞群体。TAM是抗炎性的并且与不良预后相关。尽管具有表型可塑性，但MDSC和TAM是由其免疫抑制功能定义的。去除、重新编程或阻断这些免疫抑制单核细胞的运输正成为有吸引力的抗癌治疗策略。
治疗性活化或激动LILRB3具有治疗自身免疫性疾病或炎性疾病的潜力。自身免疫性疾病或炎性疾病包括但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS，其是具有自身免疫性组分的病毒性疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生氏病(autoimmuneAddison's disease)、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、心肌病、乳糜泻疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、肢端硬皮综合征、克罗恩氏病、德戈斯氏病(Degos′disease)、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、必须混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病(Graves′disease)、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型慢性关节炎(斯提耳氏病)、青少年类风湿性关节炎、美尼尔氏病(Meniere's disease)、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏现象(Raynaud's phenomena)、莱特尔氏综合征(Reiter'ssyndrome)、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、全身性硬皮病、进行性全身性硬化症(PSS)、全身性硬化症(SS)、舍格伦综合征、僵人综合征、全身性红斑狼疮(SLE)、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、科恩氏病(Cohn's disease)、肠粘膜炎症、与结肠炎相关的消耗病、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病、阿尔茨海默氏病、哮喘、特应性过敏、过敏、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、败血症、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病性视网膜病、呼吸机诱导的肺损伤、病毒感染、自身免疫性糖尿病等。炎性病症包括例如慢性和急性炎性病症。
III.单克隆抗体以及其产生
本文所描述的单克隆抗体可以使用标准方法来制备，随后进行筛选、表征和功能性评估。可以对可变区进行测序，并且然后将其亚克隆到人表达载体中以产生嵌合抗体基因，然后对所述嵌合抗体基因进行表达和纯化。这些嵌合抗体可以被测试用于抗原结合、信号传导阻断和异种移植实验。本文所描述的单克隆抗体也可以使用噬菌体展示方法来制备，其中针对靶蛋白淘选噬菌体展示的人scFv的大文库。可以对被选择成与靶蛋白特异性结合的人scFv进行测序，并且然后将其亚克隆到人表达载体中以产生期望的人抗体。
A.一般方法
应当理解，与LILRB3结合的单克隆抗体将具有若干种应用。这些应用包括产生用于检测和诊断癌症以及用于癌症疗法的诊断试剂盒。在这些上下文中，可以将此类抗体与诊断剂或治疗剂联系起来，将所述诊断剂或治疗剂用作竞争性测定中的捕获剂或竞争剂，或单独使用所述诊断剂或治疗剂而无需附加另外的试剂。抗体可以被突变或修饰，如下文进一步讨论的。用于制备和表征抗体的方法在本领域中是众所周知的(参见例如，《抗体：实验室手册》,冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory),1988；美国专利4,196,265)。
用于产生单克隆抗体(MAb)的经典方法通常开始沿着与用于制备多克隆抗体的方法的路线相同的路线。这两种方法的第一步骤都是对适当的宿主进行免疫接种。如本领域众所周知的，用于免疫接种的给定组合物在其免疫原性方面可能不同。因此，通常需要增强宿主免疫系统，如可以通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来实现的。示例性和优选的载体是钥孔海螺血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白等其它白蛋白也可以用作载体。用于将多肽与载体蛋白缀合的方法在本领域中是众所周知的，并且包括戊二醛、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳化二亚胺和双重氮化联苯胺。如本领域众所周知的，可以通过使用免疫应答的被称为佐剂的非特异性刺激剂来增强特定免疫原组合物的免疫原性。示例性和优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant)(含有杀伤的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的免疫应答的非特异性刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量因免疫原的性质以及用于免疫接种的动物而不同。多种途径可以用于施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。多克隆抗体的产生可以通过在免疫接种后的不同时间点处对经免疫接种的动物的血液进行采样来监测。也可以给予第二次加强注射。重复加强和滴定的过程，直到达到合适的滴度。当获得期望水平的免疫原性时，可以对经免疫接种的动物取血，并且将血清分离并储存，和/或可以使用所述动物以产生MAb。
免疫接种后，选择具有产生抗体潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)以用于MAb生成方案。这些细胞可以从经活检的脾脏或淋巴结中获得，或者从循环血液中获得。然后将来自经免疫接种的动物的产生抗体的B淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞的细胞融合，所述细胞通常是与作为免疫接种的动物或人或人/小鼠嵌合细胞相同的物种之一。适用于产生杂交瘤的融合程序的骨髓瘤细胞系优选地是不产生抗体的，具有高融合效率并且酶缺乏，使得其不能够在仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)的生长的某些选择性培养基中生长。可以使用多种骨髓瘤细胞中的任何一种，如本领域技术人员已知的(Goding,第65-66页,1986；Campbell,第75-83页,1984)。
用于生成产生抗体的脾脏或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂合体的方法通常包括将体细胞与骨髓瘤细胞以2:1的比例混合，但是在存在促进细胞膜的融合的一种或多种药剂(化学或电)的情况下比例可以分别从约20:1至约1:1变化。使用仙台病毒(Sendaivirus)的融合方法由Kohler和Milstein(1975；1976)描述，并且使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)PEG的融合方法由Gefter等人(1977)描述。电感应融合方法的使用也是合适的(Goding,第71-74页,1986)。融合程序通常以约1×10-6至1×10-8的低频率产生可存活的杂合体。然而，这不会造成问题，因为可存活的融合的杂合体是通过在选择性培养基中培养而从亲本、输注的细胞(特别是能继续无限期地分裂的输注的骨髓瘤细胞)中分化的。选择性培养基通常是一种含有阻断的核苷酸的从头合成的药剂的组织培养基。示例性和优选的药剂为氨基蝶呤(aminopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶两者的新发合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。在使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤的情况下，培养基是用次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)补充的。在使用重氮丝氨酸的情况下，培养基是用次黄嘌呤补充的。如果B细胞来源是爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)转化的人B细胞系，则添加哇巴因(ouabain)，以消除未与骨髓瘤融合的被EBV转化的细胞系。
优选的选择培养基为HAT或具有哇巴因的HAT。只有能启动核苷酸补救通路的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救通路的关键酶，例如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)中是有缺陷的，因此所述骨髓瘤细胞不能存活。B细胞可以启动此通路，但其在培养物中的寿命有限，并且通常会在约两周内死亡。因此，唯一可以在选择性培养基中存活的细胞是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂合体。当用于融合的B细胞来源是EBV转化的B细胞系时，如在此的，还使用哇巴因以用于杂合体的药物选择，因为EBV转化的B细胞容易被药物杀伤，而所使用的骨髓瘤配偶体被选择为对哇巴因具有抗性。
培养提供了从中选择特定杂交瘤的杂交瘤群体。通常，杂交瘤的选择是通过在微量滴定板中通过单克隆稀释培养细胞，随后测试单个克隆上清液(约两到三周后)的期望的反应性来进行的。测定应灵敏、简单且快速，如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、点免疫结合测定等。然后将所选杂交瘤连续稀释或通过流式细胞术进行单细胞分选并克隆到单个产生抗体的细胞系中，然后所述克隆可以无限期增殖以提供mAb。细胞系可以用于以两种基本方式进行MAb产生。可以将杂交瘤的样品注射(通常注射到腹膜腔)到动物(例如，小鼠)中。任选地，动物在注射前用烃，特别是如姥鲛烷(四甲基十五烷)等油进行致敏。当以此方式使用人杂交瘤时，最好对如SCID小鼠等免疫受损的小鼠进行注射，以防止肿瘤排斥。注射的动物产生分泌由融合的细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后可以提取动物的体液，如血清或腹水，以提供高浓度的MAb。单个细胞系也可以在体外培养，其中MAb自然分泌到培养基中，从所述培养基中可以很容易地获得高浓度的MAb。可替代地，人杂交瘤细胞系可以用于体外以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。细胞系可以适于在无血清培养基中生长，以优化回收高纯度的人单克隆免疫球蛋白的能力。
如果期望的话，通过任一方式产生的MAb可以使用过滤、离心和如FPLC或亲和色谱等各种色谱方法进一步纯化。可以通过包括用如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等酶消化和/或通过化学还原切割二硫键的方法从经纯化的单克隆抗体获得本公开的单克隆抗体片段。可替代地，本公开所涵盖的单克隆抗体片段可以使用自动化肽合成仪来合成。
还设想可以使用分子克隆方法来生成单克隆。为此，可以从杂交瘤细胞系中分离RNA，并且通过RT-PCR获得抗体基因，并将所述抗体基因克隆到免疫球蛋白表达载体中。可替代地，组合免疫球蛋白噬菌粒文库是由从细胞系中分离的RNA制备的，并且表达合适抗体的噬菌粒是通过使用病毒抗原淘选来选择的。与常规杂交瘤技术相比，这种方法的优势在于在单个轮次中可以产生和筛选大约104倍的抗体，并且通过H链和L链组合产生新的特异性，这进一步增加了找到适当抗体的机会。
最近，已经开发了用于产生mAb的另外的方法，如scFv噬菌体展示(参见CMHammers和JR Stanley,抗体噬菌体展示：技术和应用(Antibody phage display:technique and applications),《皮肤病学研究杂志(J Invest Dermatol)》(2014)134:e17)。通常，通过淘选大量不同的人scFv噬菌体展示的抗体文库来产生与靶蛋白，例如，人LILRB3结合的人mAb套组。
为了产生人scFv噬菌体展示的抗体文库，从所选择细胞来源，例如外周血单核细胞中提取RNA。然后将RNA逆转录成cDNA，所述cDNA用于经编码抗体的VH和VL链的PCR。对不同的VH和VL链区基因家族具有特异性的引物的限定集合允许扩增给定免疫球蛋白谱系内的所有经转录的重排可变区，反映特定个体的所有抗体特异性。
将代表抗体谱系的VH和VL PCR产物连接到噬菌体展示载体中，所述噬菌体展示载体被工程化为将VH和VL表达为与最初源自M13噬菌体的大肠杆菌(E.coli)的丝状细菌噬菌体的pIII次要衣壳蛋白融合的scFv。这产生噬菌体文库，所述噬菌体中的每个噬菌体在其表面上表达scFv并且携带其中具有相应核苷酸序列的载体。
然后通过被称为生物淘选的技术，针对通过其表达的表面scFv与靶抗原结合的噬菌体来筛选文库。简而言之，将靶蛋白涂覆在固相上，以用于与噬菌体文库一起温育。在洗涤和洗脱之后，将富集抗原的噬菌体回收并且用于下一轮次的噬菌体淘选。在至少三个轮次的噬菌体淘选之后，挑取单个细菌菌落用于噬菌体ELISA和其它功能性/遗传分析。
对scFv区的阳性命中进行测序，并且将所述阳性命中转化为全人IgG重链和轻链构建体，所述构建体用于使用上文所公开的方法产生所关注mAb。例如，使用转染试剂PEI来将IgG表达质粒共转染到Expi293细胞中。表达7天后，收获上清液，并且将抗体使用蛋白A树脂通过亲和色谱进行纯化。
教导了可用于本公开的抗体的产生的其它美国专利(每个都通过引用并入本文)包括描述了使用组合方法产生嵌合抗体的美国专利5,565,332；描述了重组免疫球蛋白制剂的美国专利4,816,567；以及描述了抗体治疗剂缀合物的美国专利4,867,973。
B.本公开的抗体
1.LILRB3的抗体
在第一种情况下，根据本公开的抗体或其抗原结合片段可以通过其结合特异性来定义，在这种情况下所述结合特异性是针对LILRB3的。本领域的技术人员通过使用本领域的技术人员众所周知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力，可以确定此类抗体是否落入本权利要求的范围内。
一方面，提供了与LILRB3特异性结合的抗体和抗原结合片段。在一些实施方式中，在与LILRB3结合时，此类抗体调节LILRB3的活化。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段在与LILRB3结合时活化LILRB3。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段在与LILRB3结合时抑制LILRB3的活化。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段在与LILRB3结合时可以特异性地干扰、阻断或减少LILRB3与其结合配偶体之间的相互作用。在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段能够抑制MDSC和如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和致耐受性树突状细胞(DC)等其它实体瘤浸润性髓系细胞的免疫抑制性活性。在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段与人LILRB3特异性地或选择性地结合。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段与人LILRB3特异性地结合和/或基本上将人LILRB3与半乳凝素-4的结合抑制至少约20％-40％、40％-60％、60％-80％、80％-85％或更多(例如，通过实例中公开的测定)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段的Kd小于(更紧密地结合)10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13M。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段的用于阻断半乳凝素-4与LILRB3的结合的IC50小于10uM、10uM至1uM、1000nM至100nM、100nM至10nM、10nM至1nM、1000pM至500pM、500pM至200pM、小于200pM、200pM至150pM、200pM至100pM、100pM至10pM、10pM至1pM。
在一些实施方式中，本文提供的具有表3和4中所示的克隆配对的CDR的抗体或抗原结合片段。
在某些实施方式中，抗体可以由抗体的可变序列来定义，所述可变序列包括另外的“框架”区。抗体的特征在于来自附录I和III的克隆配对的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列。此外，抗体序列可以不同于这些序列，特别是在CDR以外的区中。例如，氨基酸可以通过给定百分比，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性而不同于以上列出的氨基酸，或者氨基酸可以通过允许保守取代(下文讨论的)而不同于以上列出的氨基酸。前述中的每一个适用于附录I和附录III的氨基酸序列。在另一实施方式中，本公开的抗体衍生物包括具有至多0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代同时仍展现出期望的结合和功能性性质的VL结构域和VH结构域。
尽管本公开的抗体是作为IgG产生的，但修饰恒定区以改变其功能可能是有用的。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子，包括免疫系统的不同细胞(例如，效应子细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。因此，术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及其亚型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ型或λ型。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过具有约12个或更多个氨基酸的35“J”区连接，其中重链还包括具有约10个以上的氨基酸的“D”区。通常参见《基础免疫学(Fundamental Immunology)》第7章(Paul,W.编辑,第2版纽约的雷文出版社(Raven Press,N.Y.)(1989))。
本公开进一步包括与编码本文公开的抗体的核酸杂交的核酸。通常，核酸在中等或高严格条件下与编码本文公开的抗体并且还编码保持与LILRB3特异性结合能力的抗体的核酸杂交。当第一核酸分子的单链形式可以在适当的温度和溶液离子强度条件下退火到第二核酸分子时，第一核酸分子可与第二核酸分子“杂交”(参见Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第3版,纽约冷泉港的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)2001)。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。典型的中等严格性杂交条件是40％甲酰胺与5X或6X SSC和0.1％ SDS，42℃。高严格性杂交条件为50％甲酰胺、5X或6X SSC(0.15M NaC1和0.015M柠檬酸钠)，42℃，或任选地更高温度(例如，57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)。杂交要求两个核酸含有互补序列，但是由于杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。用于使核酸杂交的适当严格性取决于核酸的长度和互补的程度，这是本领域众所周知的变量。两个核苷酸序列之间的类似性或同源性程度越高，核酸可以杂交的严格性越高。对于长度大于100个核苷酸的杂合体，已经得出用于计算熔解温度的方程(参见Sambrook等人,同上)。为了与较短的核酸，例如，寡核苷酸杂交，错配的位置变得更加重要，并且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人,同上)。
2.示例性表位和竞争抗原结合蛋白
另一方面，本公开提供了抗LILRB3抗体所结合的表位。在一些实施方式中，通过本文所描述的抗体结合的表位是有用的。在某些实施方式中，本文提供的表位可以用于分离与LILRB3结合的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方式中，本文提供的表位可以用于产生与LILRB3结合的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方式中，表位或包括本文提供的表位的序列可以用作免疫原以产生与LILRB3结合的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方式中，本文所描述的表位或包括本文所描述的表位的序列可以用于干扰LILRB3的生物活性。
在一些实施方式中，与表位中的任何表位结合的抗体或其抗原结合片段是特别有用的。在一些实施方式中，本文提供的表位在通过抗体结合时调节LILRB3的生物活性。在一些实施方式中，本文提供的表位在通过抗体结合时活化LILRB3。在一些实施方式中，本文提供的表位在通过抗体结合时抑制LILRB3的活化。在一些实施方式中，本文提供的表位在通过抗体结合时阻断LILRB3与其结合配偶体之间的相互作用。
在一些实施方式中，含有与抗体接触或被抗体掩埋的残基的结构域/区可以通过使LILRB3中的特定残基突变并确定抗体是否可以与经突变的LILRB3蛋白结合来鉴定。通过进行许多单独突变，可以鉴定在结合中起直接作用或与抗体足够接近以致突变可以影响抗体与抗原之间的结合的残基。根据这些氨基酸的知识，可以阐明含有与抗原结合蛋白接触或被抗体覆盖的残基的抗原的结构域或区。此类结构域可以包括抗原结合蛋白的结合表位。
另一方面，本公开提供抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白与和本文所描述的表位结合的例示的抗体或抗原结合片段之一竞争与LILRB3的特异性结合。此类抗原结合蛋白还可以与和本文例示的抗体或抗原结合片段之一相同的表位或重叠表位结合。预期与如例示的抗体相同的表位竞争或结合的抗原结合蛋白显示出类似的功能性质。例示的抗体包括上文描述的那些抗体，包括具有表3和4中包括的重链可变区和轻链可变区以及CDR、附录I和III中所示的重链和轻链以及附录II和IV中所示的重链和轻链编码区的那些抗体。
C.抗体序列的工程化
在各个实施方式中，可以出于各种原因，如改进表达、改进交叉反应性或减少脱靶结合来选择对经鉴定的抗体的序列进行工程化。以下是抗体工程化的相关技术的一般讨论。
可以培养杂交瘤，然后裂解细胞并提取总RNA。可以将随机六聚体与RT一起使用以产生RNA的cDNA拷贝，并且然后使用预期扩增所有人可变基因序列的PCR引物的多重混合物进行PCR。PCR产物可以克隆到pGEM-T Easy载体中，然后可以使用标准载体引物通过自动化DNA测序进行测序。结合和中和的测定可以使用从杂交瘤上清液中收集并通过使用蛋白G柱的FPLC纯化的抗体来进行。可以通过将来自克隆载体的重链和轻链Fv DNA亚克隆到IgG质粒载体中，转染到293Freestyle细胞或CHO细胞中来产生重组全长IgG抗体，并从293或CHO细胞上清液中收集经纯化的抗体。
在与最终cGMP制造过程相同的宿主细胞和细胞培养过程中产生快速获得抗体能减少过程开发计划的时长。龙沙公司(Lonza)开发了一种使用在CDACF培养基中生长的汇集的转染子以在CHO细胞中快速生产少量(至多50g)的抗体的通用方法。虽然比真正的瞬时系统稍慢，但优势包括更高的产物浓度和使用与产生细胞系相同的宿主和过程。在一次性生物反应器中表达模型抗体的GS-CHO池的生长和生产力的实例：在以分批进料模式操作的一次性袋式生物反应器培养物(5L工作体积)中，在转染的9周内达到2g/L的采集抗体浓度。
抗体分子将包括例如通过mAb的蛋白水解切割产生的片段(如F(ab')、F(ab')2)或例如通过重组方式可产生的单链免疫球蛋白。此类抗体衍生物是单价的。在一个实施方式中，此类片段可以彼此组合，或与其它抗体片段或受体配体组合以形成“嵌合”结合分子。重要的是，此类嵌合分子可能含有能够与同一分子的不同表位结合的取代基。
1.抗原结合修饰
在相关实施方式中，抗体是所公开抗体的衍生物，例如，包括与所公开抗体中的CDR序列相同的CDR序列的抗体(例如，嵌合抗体或CDR移植抗体)。可替代地，可能希望进行修饰，如将保守改变引入到抗体分子中。在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质交互性生物功能方面的重要性在本领域中是被普遍理解的(Kyte和Doolittle,1982)。可以理解的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，这进而定义了蛋白质与其它分子，例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。
在本领域中还应理解，可以基于亲水性来有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(通过引用并入本文)指出，由蛋白质的相邻氨基酸的亲水性支配的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质相关。如美国专利4,554,101中所详述的，已经为氨基酸残基分配以下亲水性值：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性、非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)；含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水性、非芳香族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性、芳香族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。
应当理解的是，氨基酸可以取代为具有类似亲水性的另一种氨基酸，并且产生经生物学或免疫学修饰的蛋白质。在此类改变时，亲水性值在±2内的氨基酸的取代是优选的，亲水性值在±1内的氨基酸的取代是特别优选的，并且亲水性值在±0.5内的氨基酸的取代是更特别优选的。
如上文所概述的，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种上述特征的示例性取代是本领域的技术人员众所周知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本公开还设想了同种型修饰。通过将Fc区修饰成具有不同的同种型，可以实现不同的功能。例如，改为IgG1可以增加抗体依赖性细胞毒性，转变为A类可以改进组织分布，并且转变为M类可以改进化合价。
经修饰抗体可以通过本领域的技术人员已知的任何技术制备，包括通过标准分子生物技术的表达或多肽的化学合成。用于重组表达的方法在本文档的其它地方进行了讨论。
2.Fc区修饰
本文公开的抗体还可以被工程化为包括Fc区内的修饰，通常是改变抗体的一种或多种功能性质，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或效应子功能(例如，抗原依赖性细胞毒性)。此外，本文公开的抗体可以被化学修饰(例如，一种或多种化学部分可以与抗体连接)或被修饰以改变其糖基化，以再次改变抗体的一种或多种功能性质。这些实施方式中的每个实施方式在下文进一步详细描述。Fc区中的残基的编号为Kabat的EU索引的编号。本文公开的抗体还包括具有经修饰的(或阻断的)Fc区以提供改变的效应功能的抗体。参见例如，美国专利5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。此类修饰可以用于增强或抑制免疫系统的各种反应，这对诊断和疗法可能具有有益影响。Fc区的改变包括氨基酸变化(取代、缺失和插入)、糖基化或去糖基化以及添加多个Fc。Fc的变化还可以改变治疗性抗体中的抗体的半衰期，从而实现不太频繁的给药，并且因此增加便利性并减少材料的使用。据报告，此突变消除了铰链区中的重链间二硫键的异质性。
在一个实施方式中，CH1的铰链区被修饰成使得绞链区中的半胱氨酸残基的数量增加或减少。这种方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变CH1的绞链区中的半胱氨酸残基的数量，以例如促进轻链和重链的组装或以提高或降低抗体的稳定性。在另一实施方式中，抗体被修饰成增加其生物学半衰期。各种方法是可能的。例如，可以引入以下突变中的一种或多种突变：T252L、T254S、T256F，如美国专利6,277,375中所描述的。可替代地，为了增加生物学半衰期，可抗体以在CH1或CL区内被改变成含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如美国专利5,869,046和6,121,022中所描述的。在又其它实施方式中，Fc区是这样改变的，即通过用不同的氨基酸残基取代至少一个氨基酸残基，以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基取代，使得抗体具有针对效应子配体的改变的亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力被改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法在美国专利5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。
在另一实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基以由此改变抗体固定补体的能力。这种方法在PCT公开WO 94/29351中进一步描述。在另一实例中，Fc区被修饰成通过在以下位置处修饰一个或多个氨基酸来提高或降低抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高或降低抗体对Fcγ受体的亲和力：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这种方法在PCT公开WO 00/42072中进一步描述。此外，已经定位出人IgG1上针对FcγR1、FcγRII、FcγRIII以及FcRn的结合位点，并且已经描述具有改进的结合的变体。位置256、290、298、333、334和339处的特异性突变显示出改进与FcγRIII的结合。另外，以下组合突变体显示出提高FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在一个实施方式中，Fc区被修饰成通过修饰残基243和264来降低抗体介导效应子功能的能力和/或提高抗炎特性。在一个实施方式中，通过将位置243和264处的残基改变为丙氨酸来修饰抗体的Fc区。在一个实施方式中，Fc区被修饰成通过修饰残基243、264、267和328来降低抗体介导效应子功能的能力和/或提高抗炎特性。
在一个实施方式中，Fc区被修饰成通过将残基234、235和329修饰为丙氨酸或甘氨酸(L234A-L235A-P329G)来消除抗体介导效应子功能的能力。
在另一实施方式中，抗体包括特定的糖基化模式。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变抗体的糖基化模式以例如提高抗体对抗原的亲和力或亲合力。此类修饰可以通过例如改变抗体序列内的糖基化位点中的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致可变区框架糖基化位点中的一个或多个可变区框架糖基化位点去除，以由此消除所述位点处的糖基化。此类去糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力或亲合力。参见例如，美国专利5,714,350和6,350,861。
还可以制备包括低岩藻糖基化或无岩藻糖基化聚糖的糖基化模式的抗体，如具有聚糖上的减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或无岩藻糖基化抗体。抗体还可以包括具有增加量的二等分GlcNac结构的聚糖。已经证实此类经改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。此类修饰可以通过例如在宿主细胞中表达抗体来完成，其中糖基化通路被基因工程化为产生具有特定糖基化模式的糖蛋白。这些细胞已在本领域中进行了描述，并且可以用作使本发明的重组抗体在其中表达，以由此产生具有经改变的糖基化的抗体的宿主细胞。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)-岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系是通过使用两种替代载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因而产生的(参见美国专利公开第20040110704号)。另举一例，EP 1 176 195描述了具有功能上破坏的FUT8基因的细胞系，所述基因编码岩藻糖基转移酶，使得通过减少或消除α-1,6键相关的酶，在此类细胞系中所表达的抗体展现出低岩藻糖基化。EP 1 176 195还描述了具有低酶活性的细胞系，所述细胞系用于将岩藻糖添加到与抗体的Fc区结合或不具有酶活性的N-乙酰氨基葡萄糖，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系，即Lec13细胞，所述细胞系具有将岩藻糖连接到Asn(297)连接的碳水化合物的降低的能力，这还引起所述宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化。具有经修饰的糖基化谱的抗体也可以在鸡蛋中产生，如PCT公开WO 06/089231中所描述的。可替代地，具有经修饰的糖基化谱的抗体可以在如浮萍属(Lemna)(美国专利7,632,983)等植物细胞中产生。用于在植物系统中产生抗体的方法在美国专利6,998,267和7,388,081中公开。PCT公开WO 99/54342描述了被工程化为表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在经工程化的细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，这使抗体的ADCC活性增加。
可替代地，可以使用岩藻糖苷酶将抗体的岩藻糖残基切割掉，例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖基残基。本文所公开的抗体进一步包括在低等真核宿主细胞中产生的抗体，具体地真菌宿主细胞，如酵母和丝状真菌，已被基因工程化为产生具有哺乳动物或人样糖基化模式的糖蛋白。这些经基因修饰的宿主细胞相比于目前使用的哺乳动物细胞系的具体优势是能够控制细胞中产生的糖蛋白的糖基化谱，使得可以产生糖蛋白的组合物，其中特定的N-聚糖结构占主导地位(参见例如，美国专利7,029,872和7,449,308)。这些经基因修饰的宿主细胞已经用于产生主要具有特定的N-聚糖结构的抗体。
另外，由于如酵母或丝状真菌的真菌缺乏产生岩藻糖基化的糖蛋白的能力，因此在此类细胞中产生的抗体将缺乏岩藻糖，除非细胞被进一步修饰成包括用于产生岩藻糖基化的糖蛋白的酶促通路(参见例如，PCT公开WO2008112092)。在具体实施方式中，本文所公开的抗体进一步包括在低等真核宿主细胞中产生的那些抗体，并且所述抗体包括岩藻糖基化的和非岩藻糖基化的杂合和复合N-聚糖，包括二等分和多触角种类，包括但不限于N-聚糖，如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。在具体实施方式中，本文所提供的抗体组合物可以包括具有至少一种杂合N-聚糖的抗体，所述杂合N-聚糖选自由以下组成的组：GlcNAcMan5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2；以及NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。在具体方面，杂合N-聚糖是组合物中的主要N-聚糖种类。在另外的方面，杂合N-聚糖是在组合物中包括约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的杂合N-聚糖的具体N-聚糖种类。
在具体实施方式中，本文所提供的抗体组合物包含具有至少一种复合N-聚糖的抗体，所述复合N-聚糖的抗体选自由以下组成的组：GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；以及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在具体方面，复合N-聚糖是组合物中的主要N-聚糖种类。在另外的方面，复合N-聚糖是在组合物中包括约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的复合N-聚糖的具体N-聚糖种类。在具体实施方式中，N-聚糖是岩藻糖基化的。通常，岩藻糖与N-聚糖的还原端处的GlcNAc呈α1,3-键形式；与N-聚糖的还原端处的GlcNAc呈α1,6-键形式；与N-聚糖的非还原端处的Gal呈α1,2-键形式；以及与N-聚糖的非还原端处的GlcNac呈α1,3-键形式；或与N-聚糖的非还原端处的GlcNAc呈α1,4-键形式。
因此，在上述糖蛋白组合物的具体方面中，糖型呈α1,3-键或α1,6-键岩藻糖以产生选自由以下组成的组的糖型：Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；呈α1,3-键或α1,4-键岩藻糖中以产生选自由以下组成的组的糖型：GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或呈α1,2-键岩藻糖以产生选自由以下组成的组的糖型：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在另外的方面，抗体包括高甘露糖N-聚糖，包括但不限于Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2，或由Man3GlcNAc2 N-聚糖结构组成的N-聚糖。在上述另外的方面，复合N-聚糖进一步包括岩藻糖基化的和非岩藻糖基化的二等分和多触角种类。如本文所使用的，术语“N-聚糖”和“糖型”可互换使用并且指N-连接的寡糖，例如，通过天冬酰胺-N-乙酰氨基葡萄糖键与多肽的天冬酰胺残基连接的寡糖。N-连接的糖蛋白含有与蛋白质中的天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰氨基葡萄糖残基。
D.单链抗体
单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合体，所述重链的可变区和所述轻链的可变区通过短(通常是丝氨酸、甘氨酸)接头连接在一起。此嵌合分子保留原始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区并引入了接头肽。这种修饰通常使特异性保持不变。这些分子在历史上是为了促进噬菌体展示而产生的，其中将抗原结合结构域表达为单个肽非常方便。可替代地，可以由源自杂交瘤的亚克隆的重链和轻链直接产生scFv。单链可变片段缺乏存在于完整抗体分子中的恒定Fc区，并且因此缺乏用于纯化抗体的常见结合位点(例如，蛋白A/G)。这些片段通常可以使用蛋白L进行纯化/固定，因为蛋白L与κ轻链的可变区相互作用。
柔性接头通常包括促进螺旋和转角的氨基酸残基，如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。然而，其它残基也可以发挥作用。Tang等人(1996)使用噬菌体展示作为从蛋白质接头文库中快速选择单链抗体(scFv)的定制接头的一种手段。构建了随机接头文库，其中重链和轻链可变结构域的基因通过编码可变组合物的18个氨基酸多肽的区段连接。scFv谱系(大约5×106个不同成员)展示在丝状噬菌体上，并且与半抗原进行亲和力选择。所选变体的群体展现出结合活性显著增加，但保留了相当大的序列多样性。筛选1054个单独变体随后产生了有催化活性的scFv，所述scFv是以可溶形式高效地产生的。序列分析揭示了接头中在VH C末端后的两个残基处的保守脯氨酸以及在其它位置处的大量精氨酸和脯氨酸作为所选系链的唯一共同特征。
本公开的重组抗体还可以涉及允许受体二聚化或多聚化的序列或部分。此类序列包括源自IgA的允许与J链结合形成多聚体的序列。另一个多聚化结构域是Gal4二聚化结构域。在其它实施方式中，可以用如生物素/亲和素等药剂修饰链，所述药剂允许两种抗体的组合。
在一单独实施方式中，可以通过使用非肽接头或化学单元接合受体轻链和重链来产生单链抗体。通常，轻链和重链将在不同的细胞中产生、纯化，然后以适当的方式连接在一起(即，重链的N末端通过适当的化学桥与轻链的C末端连接)。
交联剂用于形成绑定两个不同分子的官能团的分子桥，例如，稳定剂和凝结剂。然而，设想的是，可以产生相同类似物或包括不同类似物的异聚复合物的二聚体或多聚体。为了将两种不同的化合物逐步连接，可以使用异型双官能交联剂，所述异型双官能交联剂消除不需要的均聚物形成。
示例性异型双官能交联剂包括两个反应性基团：一个反应性基团与伯胺基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)反应，并且另一个反应性基团与硫醇基团(例如，吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)反应。通过伯胺反应性基团，交联剂可以与一种蛋白质(例如，所选抗体或片段)的赖氨酸残基反应，并且通过硫醇反应性基团，已经与第一种蛋白质连接的交联剂与其它蛋白质(例如，选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基)反应。
优选的采用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知多种类型的含有二硫键的接头可以成功用于缀合靶向剂和治疗剂/预防剂。含有空间位阻的二硫键的接头可能会在体内提供更大的稳定性，从而防止靶向肽在到达作用位点之前释放。因此，这些接头是一组连接剂。
另一种交联剂是SMPT，其是含有被相邻苯环和甲基“空间位阻”的二硫键的双官能交联剂。据信，二硫键的空间位阻起到保护键免受可以存在于组织和血液中的硫醇根阴离子，如谷胱甘肽的攻击的作用，并且由此有助于防止缀合物在将所连接的药剂递送到靶位点之前解偶。
与许多其它已知的交联剂一样，SMPT交联剂具有使官能团，如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)交联的能力。另一种可能类型的交联剂包括含有可切割二硫键的异型双官能光活性苯基叠氮化物，如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰氨基)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯氨基反应，并且苯叠氮化物(在光解时)与任何氨基酸残基非选择性反应。
除了受阻的交联剂之外，也可以根据本文使用非受阻的交联剂。被视为不含有或不产生受保护的二硫化物的其它有用的交联剂包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫烷(Wawrzynczak和Thorpe,1987)。此类交联剂的使用在本领域中是众所周知的。另一个实施方式涉及使用柔性接头。
美国专利4,680,338描述了可用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的缀合物的双官能接头，特别是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物。美国专利5,141,648和5,563,250公开了含有不稳定键的可在各种温和条件下切割的可切割缀合物。此接头特别有用，因为所关注药剂可以直接与接头键合，其中切割导致活性剂的释放。特定用途包括将游离氨基或游离巯基添加到蛋白质，如抗体或药物。
美国专利5,856,456提供了用于连接多肽成分以制备融合蛋白，例如，单链抗体的肽接头。接头的长度为至多约50个氨基酸，含有至少一次出现的带电荷的氨基酸(优选地，精氨酸或赖氨酸)，随后是脯氨酸，并且特征在于更高的稳定性和减少的聚集。美国专利5,880,270公开了可用于多种免疫诊断和分离技术的含氨氧基的接头。
E.纯化
在某些实施方式中，本公开的抗体可以是经纯化的。如本文所用，术语“经纯化”旨在指代从其它组分中分离的组合物，其中蛋白质相对于其天然可获得状态被纯化到任何程度。因此，经纯化的蛋白质也指不受其可能天然存在的环境的影响的蛋白质。当使用术语“基本上纯化的”时，此名称将指代其中蛋白质或肽形成所述组合物的主要组分，如构成所述组合物中的蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的组合物。
蛋白质纯化技术对于本领域的技术人员来说是众所周知的。这些技术在一个水平上涉及将细胞环境粗分级为多肽和非多肽级分。将多肽与其它蛋白质分离后，可以使用色谱和电泳技术进一步纯化所关注多肽以实现部分或完全纯化(或纯化至均质)。特别适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱法、排阻色谱法；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。用于蛋白质纯化的其它方法包括用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀或通过热变性，随后离心；凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱法；以及此类和其它技术的组合。
在纯化本公开的抗体时，可能需要在原核或真核表达系统中表达多肽并使用变性条件提取蛋白质。可以使用与多肽的加标签部分结合的亲和柱从其它细胞组分中纯化多肽。如本领域通常已知的，据信可以改变进行各种纯化步骤的顺序，或者可以省略某些步骤，并且仍然产生用于制备基本上纯化的蛋白质或肽的合适方法。
通常，使用与抗体的Fc部分结合的试剂(即，蛋白A)对完整抗体进行分离。可替代地，可以使用抗原以同时纯化和选择适当的抗体。此类方法通常利用与载体结合的选择剂，所述载体如柱、过滤器或珠。抗体与载体结合，去除污染物(例如，清洗掉)，并且通过施加条件(盐、热等)释放抗体。
根据本公开内容，对蛋白质或肽的纯化程度进行定量的各种方法对于本领域的技术人员来说将是已知的。这些方法包括例如确定活性级分的比活性或通过SDS/PAGE分析评估级分内的多肽的量。用于评估级分的纯度的另一种方法是计算级分的比活性，以将所述比活性与初始提取物的比活性进行比较，并且因此计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于选择用于纯化之后的特定测定技术以及所表达的蛋白质或肽是否展现出可检测活性。
各种已知多肽的迁移可以随着SDS/PAGE的不同条件而变化，有时变化是显著变化(Capaldi等人,1977)。因此应当理解，在不同的电泳条件下，经纯化或经部分纯化的表达产物的表观分子量可能有所不同。
IV.癌症的治疗
A.调配物和施用
本公开提供了包括药物组合物，所述药物组合物包括抗LILRB抗体和用于产生所述抗体的抗原。此类组合物包括预防或治疗有效量的抗体或其片段以及药学上可接受的载体。在具体实施方式中，术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的管理机构批准或在美国药典或其它普遍认可的药典中列出用于动物并且更具体地用于人的。术语“载体”是指治疗剂与其一起施用的稀释剂、赋形剂或媒剂。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是特定载体。还可以采用盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液作为液体载体，尤其是用于可注射溶液的液体载体。其它合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释调配物等形式。口服调配物可以包括标准载体，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药剂的实例在《雷明顿氏药物科学》中描述。此类组合物将含有预防或治疗有效量的优选地纯化形式的抗体或其片段连同合适的量的载体，以便提供适当施用于患者的形式。调配物应适合施用模式，所述施用模式可以是口服、静脉内、动脉内、颊内、鼻内、雾化、支气管吸入或通过机械通气递送。
如本文所描述的，本公开的抗体可以调配用于肠胃外施用，例如，调配用于通过皮内、静脉内、动脉内、肌内、皮下、肿瘤内或甚至腹膜内途径注射。可替代地，抗体可以通过局部途径直接施用于粘膜，例如通过滴鼻剂、吸入或通过雾化器。药学上可接受的盐包括酸式盐以及用例如盐酸或磷酸等无机酸或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸等形成的盐。用游离羧基形成的盐也可以源自无机碱，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱，如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等。
抗体的被动转移，称为人工获得的被动免疫，通常将涉及使用静脉内注射。抗体的形式可以是人或动物血浆或血清，作为用于静脉内(IVIG)或肌内(IG)使用的汇集的人免疫球蛋白，作为来自免疫接种的或来自从疾病恢复的供体的高滴度人IVIG或IG，以及作为单克隆抗体(MAb)。这种免疫通常仅持续很短的时间段，并且还存在超敏反应和血清病的潜在风险，尤其是非人来源的γ球蛋白。然而，被动免疫提供即时保护。抗体将在适于注射的，即，无菌和可注射的载体中调配。
通常，本公开的组合物的成分是单独或混合在一起以单位剂型提供的，例如，作为气密封容器中的干燥冻干粉或无水浓缩剂，所述气密封容器如指示活性剂的量的安瓿或小药囊。在通过输注施用组合物时，所述组合物可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶分配。当组合物通过注射施用时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，使得成分可以在施用之前混合。
本公开的组合物可以被调配为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括用阴离子，如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些阴离子形成的那些盐以及用阳离子，如源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等那些阳离子形成的那些盐。
B.细胞疗法
另一方面，本公开提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞。在一些实施方式中，所述CAR包括本文提供的抗原结合片段。在一实施方式中，所述CAR蛋白从N末端到C末端包括：前导肽、抗LILRB3重链可变结构域、接头结构域、抗LILRB3轻链可变结构域、人IgG1-CH2-CH3结构域、间隔子区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内共刺激信号传导和CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域。
还提供了用于免疫疗法的方法，所述方法包括施用有效量的本公开的免疫细胞。在一个实施方式中，通过转移引发免疫应答的免疫细胞群体来治疗医学疾病或病症。在本公开的某些实施方式中，通过转移引发免疫应答的免疫细胞群体来治疗癌症或感染。本文提供了用于治疗个体的癌症或延缓癌症的进展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗原特异性细胞疗法。
免疫细胞可以是T细胞(例如，调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、NK细胞、不变NK细胞、NKT细胞或巨噬细胞。本文还提供了产生免疫细胞并且对所述免疫细胞进行工程化的方法以及使用和施用所述细胞以用于过继性细胞疗法的方法，在所述过继性细胞疗法情况下，细胞可以是自体的或同种异体的。因此，免疫细胞可以用作免疫疗法，如靶向癌细胞。
免疫细胞可以从受试者，特别是人类受试者中分离。免疫细胞可以从健康人类受试者、健康志愿者或健康供体获得。免疫细胞可以从所关注受试者，如疑似患有特定疾病或病状的受试者、疑似对特定疾病或病状的具有易感性的受试者或正在接受针对特定疾病或病状的疗法的受试者获得。免疫细胞可以从免疫细胞存在于受试者体内的任何位置收集，所述位置包括但不限于血液、脐带血、脾脏、胸腺、淋巴结和骨髓。分离的免疫细胞可以直接使用，或者所述分离的免疫细胞可以如通过冷冻而储存一定时间段。
免疫细胞可以从免疫细胞存在于的任何组织中富集/纯化，所述组织包括但不限于血液(包括由血库或脐带血库收集的血液)、脾脏、骨髓、外科手术程序期间取出和/或暴露的组织，以及通过活检程序获得的组织。免疫细胞从中富集、分离和/或纯化的组织/器官可以从活体和非活体受试者中分离，其中非活体受试者是器官供体。在特定实施方式中，免疫细胞从如外周血或脐带血等血液中分离。在一些方面，从脐带血中分离的免疫细胞具有增强的免疫调节能力，如通过CD4或CD8阳性T细胞抑制测量的。在具体方面，免疫细胞从汇集的血液，特别是汇集的脐带血中分离，以增强免疫调节能力。汇集的血液可以来自2个或更多个来源，如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个来源(例如，供体受试者)。
免疫细胞群体可以从需要疗法或患有与免疫细胞活性降低相关的疾病的受试者获得。因此，细胞对于需要疗法的受试者来说将是自体的。可替代地，免疫细胞群体可以从供体，优选地组织相容性匹配的供体获得。免疫细胞群体可以从外周血、脐带血、骨髓、脾脏或免疫细胞存在于在所述受试者或供体中的任何其它器官/组织中采集。免疫细胞可以从一组受试者和/或供体，如从汇集的脐带血中分离。
当免疫细胞群体是从与受试者不同的供体获得时，所述供体优选地是同种异体的，前提是所获得的细胞与受试者相容，因为所述细胞可以引入到受试者中。同种异体供体细胞可以是或可以不是人白细胞抗原(HLA)相容的。为了使同种异体细胞成为受试者相容的，可以对其进行处理以降低免疫原性。
免疫细胞可以被基因工程化为表达如经工程化的TCR和/或嵌合抗原受体(CAR)等抗原受体。例如，宿主细胞(例如，自体或同种异体T细胞)被修饰以表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。在具体实施方式中，NK细胞被工程化为表达TCR。NK细胞可以被进一步工程化为表达CAR。多个CAR和/或TCR，如针对不同抗原，可以添加到单个细胞类型，如T细胞或NK细胞。
合适的修饰方法是本领域已知的。参见例如Sambrook等人,同上；以及Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,格林出版协会(Greene Publishing Associates)与约翰威利父子公司(John Wiley和Sons),纽约,1994。例如，所述细胞可以使用以下中所述的转导技术进行转导以表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)：Heemskerk等人(2008)和Johnson等人(2009))。
在一些实施方式中，细胞包括通过基因工程引入的编码一种或多种抗原受体的一种或多种核酸，以及此类核酸的经基因工程化的产物。在一些实施方式中，核酸是异源的，即，通常不存在于细胞或从所述细胞获得的样品中，如从另一生物体或细胞获得的样品中，所述生物体或细胞，例如，通常不存在于被工程化的细胞和/或此类细胞来源的生物体中。在一些实施方式中，核酸不是天然存在的，如自然界中不存在的核酸(例如，嵌合的)。
C.组合疗法
还可能期望提供使用本公开的抗体与另外的抗癌疗法结合的组合疗法。这些疗法将以有效实现一个或多个疾病参数的降低的组合量提供。此过程可以涉及同时使细胞/受试者与两种药剂/疗法接触，例如，使用包括两种药剂的单一组合物或药理调配物、或通过同时使细胞/受试者与两种不同的组合物或调配物接触，其中一种组合物包括抗体，并且另一种组合物包括另一种药剂。
可替代地，抗体可以在其它治疗之前或之后间隔数分钟到数周。通常将确保在每次递送时间之间不会超过显著的时间段，使得疗法仍将能够对细胞/受试者发挥有利的组合作用。在此类情况下，设想的是在彼此相隔约12-24小时内、在彼此相隔约6-12小时内、或仅约12小时的延缓时间内以两种方式接触细胞。在一些情况下，可以期望显著延长治疗时间段；然而，其中在相应施用之间需要间隔若干10(2、3、4、5、6或7)天到若干(1、2、3、4、5、6、7或8)周。
还可以设想的是，将期望多于一次施用抗LILRB3抗体或其它疗法。可以采用各种组合，其中抗体是“A”，而另一种疗法是“B”，如下所例示：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
设想了其它组合。为了杀伤细胞、抑制细胞生长、抑制转移、抑制血管生成或以其它方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型，使用本发明的方法和组合物，可以将靶细胞或位点与抗体和至少一种其它疗法接触。这些疗法将以有效杀死癌细胞或抑制癌细胞增殖的组合量提供。此过程可能涉及同时将细胞/位点/受试者与药剂/疗法接触。
设想考虑用于与本公开的抗体的组合疗法的特定药剂包括化学疗法和造血干细胞移植。化学疗法可以包括阿糖胞苷(ara-C)和蒽环霉素(最常见的是柔红霉素)、单独的高剂量阿糖孢苷、除了诱导化学疗法之外的全反式视黄酸(ATRA)，在巩固疗法完成后通常是蒽环霉素、组胺二盐酸盐(Ceplene)和白介素2(Proleukin)、针对不是高剂量化学疗法的候选者的60岁以上的患有复发性AML的患者的吉妥珠单抗奥唑米星(Mylotarg)、氯法拉滨以及靶向疗法，如激酶抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨以及MDR1(多药耐药蛋白)或三氧化二砷或复发性急性早幼粒细胞性白血病(APL)的抑制剂。
在某些实施方式中，用于组合疗法的药剂是选自由以下组成的组的一种或多种药物：拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素、柔红霉素、核苷代谢抑制剂、阿糖胞苷、低甲基化剂、低剂量阿糖胞苷(LDAC)、柔红霉素和阿糖胞苷的组合、注射用柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、氮杂胞苷、/>地西他滨、全反式视黄酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、组胺二盐酸盐、/>白介素-2、阿地白介素、/>吉妥珠单抗奥唑米星、/>FLT-3抑制剂、米哚妥林、/>氯法拉滨、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨、IDH1抑制剂、艾伏尼布、/>IDH2抑制剂、依那昔布、/>平滑(SMO)抑制剂、格拉吉布、精氨酸酶抑制剂、IDO抑制剂、艾卡哚司他、BCL-2抑制剂、维奈托克、铂络合物衍生物、奥沙利铂、激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、BTK抑制剂、依鲁替尼、/>阿卡替尼、/>赞布替尼、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、ICOS抗体、TIGIT抗体、TIM3抗体、CD40抗体、4-1BB抗体、CD47抗体、SIRP1α抗体或融合蛋白、CD70抗体和CLL1抗体、CD123抗体、E-选择蛋白的拮抗剂、与肿瘤抗原结合的抗体、与T细胞表面标志物结合的抗体、与髓系细胞或NK细胞表面标志物结合的抗体、烷化剂、亚硝基脲剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、源自植物的生物碱、激素疗法药物、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。
V.抗体缀合物
本公开的抗体可以与至少一种药剂连接以形成抗体缀合物。为了提高抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，通常连接或共价结合或复合至少一种期望的分子或部分是方便的。此类分子或部分可以是但不限于至少一种效应子或报告分子。效应子分子包括具有期望活性，例如细胞毒性活性的分子。已经与抗体连接的效应子分子的非限制性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗酶、放射性核素、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报告分子被定义为可以使用测定检测到的任何部分。已经与抗体缀合的报告分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、光亲和分子、有色颗粒或配体，如生物素。
抗体-药物缀合物已成为开发癌症治疗剂的突破性方法。抗体-药物缀合物(ADC)包括与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。这种方法将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效的细胞毒性药物组合，从而产生将有效负载(药物)递送到具有富集抗原水平的肿瘤细胞的“武装的”MAb。药物的靶向递送还可以最小化其在正常组织中的暴露，从而降低毒性并提高治疗指数。FDA对两种ADC药物：2011年的(维布本妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年的/>(曲妥珠单抗美坦新(trastuzumabemtansine)或T-DM1)的批准验证了所述方法。目前有30多种处于癌症治疗临床试验的各个阶段的ADC药物候选物(Leal等人,2014)。随着抗体工程化和接头-有效负载优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合这种方法的新靶标的鉴定和验证以及靶向MAb的产生。ADC靶标的两个标准是肿瘤细胞中上调/高水平的表达和稳健的内化。
抗体缀合物对于作为诊断剂的使用也是优选的。抗体诊断通常分为两类，用于体外诊断，如各种免疫测定的一类，以及用于体内诊断方案，通常称为“抗体-定向成像”的一类。许多合适的成像剂在本领域中是已知的，以及其与抗体连接的方法也是已知的(参见例如，美国专利5,021,236、4,938,948和4,472,509)。所使用的成像部分可以是顺磁离子、放射性同位素、荧光染料、NMR可检测物质和X射线成像剂。
在顺磁离子的情况下，可以通过举例提及离子，如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，其中钆是特别优选的。可用于其它上下文，如X射线成像的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)，并且尤其是铋(III)。
在用于治疗应用和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，可以提及砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m和/或钇90。125I通常优选用于某些实施方式中，而锝99m和/或铟111由于其能量低且适于长距离检测也通常是优选的。本公开的放射性标记的单克隆抗体可以根据本领域众所周知的方法产生。例如，单克隆抗体可以通过与碘化钠和/或碘化钾以及如次氯酸钠的化学氧化剂或如乳过氧化物酶的酶氧化剂接触而碘化。根据本公开的单克隆抗体可以通过配体交换过程用锝99m标记，例如通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到葡聚糖凝胶柱(Sephadex column)上，并且将抗体施涂到此柱上。可替代地，可以使用直接标记技术，例如通过温育高锝酸盐、如SNCl2的还原剂、如邻苯二甲酸钠钾溶液的缓冲溶液和抗体。通常用于将作为金属离子存在的放射性同位素与抗体结合的中间官能团是二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
设想用作缀合物的荧光标记包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、级联蓝、Cy3、Cy5、6-FAM、荧光素异硫氰酸盐、HEX、6-JOE、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或得克萨斯州红。
本公开中设想的另一种类型的抗体缀合物是旨在主要用于体外的抗体缀合物，其中抗体与二级结合配体和/或酶(酶标签)连接，所述酶在与显色底物接触时将产生有色产物。合适的酶的实例包括尿素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的二级结合配体是生物素和亲和素以及链霉亲和素化合物。此类标记的使用对于本领域的技术人员是众所周知的并且描述于例如美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中。
分子与抗体的位点特异性连接的另一种已知方法包括抗体与基于半抗原的亲和标记的反应。本质上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的氨基酸进行反应，从而破坏此位点并阻断特异性抗原反应。然而，这可能不是有利的，因为其导致抗体缀合物失去抗原结合。
含有叠氮基的分子也可以用于通过低强度紫外线生成的反应性氮烯中间体与蛋白质形成共价键(Potter和Haley,1983)。具体地，嘌呤核苷酸的2-和8-叠氮基类似物已经用作定点光探针来鉴定粗细胞提取物中的核苷酸结合蛋白(Owens和Haley,1987；Atherton等人,1985)。2-和8-叠氮基核苷酸也已用于映射经纯化的蛋白质的核苷酸结合结构域(Khatoon等人,1989；King等人,1989；Dholakia等人,1989)并且可以用作抗体结合剂。
本领域已知若干种用于将抗体与其缀合物部分连接或缀合的方法。一些连接方法涉及使用金属螯合络合物，所述金属螯合络合物使用例如，有机螯合剂，如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；乙烯三胺四乙酸；N-氯对甲苯磺酰胺；和/或与抗体连接的四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(美国专利4,472,509和4,938,948)。单克隆抗体也可以在存在如戊二醛或高碘酸盐等偶联剂的情况下与酶反应。在存在这些偶联剂的情况下或通过与异硫氰酸酯反应，制备与荧光素标志物的缀合物。在美国专利4,938,948中，乳腺肿瘤的成像是使用单克隆抗体实现的，并且可检测的成像部分使用如甲基-对羟基苯甲酸酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯等接头与抗体结合。
在其它实施方式中，设想了通过使用不改变抗体组合位点的反应条件在免疫球蛋白的Fc区中选择性地引入巯基来衍生免疫球蛋白。公开了根据这种方法产生的抗体缀合物展现出改进的持续时间、特异性和敏感性(美国专利5,196,066，所述美国专利通过引用并入本文)。效应或报告分子的位点特异性连接也已在文献中公开(O′Shannessy等人,1987)，其中报告或效应分子与Fc区中的碳水化合物残基缀合。据报告，这种方法产生目前处于临床评估的有诊断前景和治疗前景的抗体。
VI.免疫检测方法
在仍另外的实施方式中，本公开涉及用于结合、纯化、去除、定量和通常以其它方式检测LILRB相关癌症的免疫检测方法。尽管此类方法可以在传统意义上应用，但另一种用途将是对疫苗和其它病毒原液的质量控制和监测，其中根据本公开的抗体可以用于评估病毒中H1抗原的量或完整性(即，长期稳定性)。可替代地，所述方法可以用于筛选各种抗体以获得合适的/期望的反应谱。
一些免疫检测方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定和蛋白质印迹，仅举几例。具体地，还提供了用于检测LILRB和对其进行定量的竞争性测定。各种有用的免疫检测方法的步骤已在科学文献中进行了描述，例如Doolittle和Ben-Zeev(1999)；Gulbis和Galand(1993)；DeJager等人(1993)以及Nakamura等人(1987))。通常，免疫结合方法包括获得疑似含有LILRB相关癌症的样品，以及视情况而定在有效允许形成免疫复合物的条件下使样品与根据本公开的第一抗体接触。
这些方法包括用于从样品中检测或纯化LILRB或LILRB相关癌细胞的方法。抗体将优选地与固体载体连接，如以柱基质的形式，并且将疑似含有LILRB相关癌细胞的样品应用于固定化抗体。将不想要的组分从柱中洗涤掉，使表达LILRB的细胞与固定化抗体免疫复合，然后通过从柱中去除生物体或抗原来收集所述固定化抗体。
免疫结合方法还包括用于检测样品中的LILRB相关癌细胞或相关组分的量和对其进行定量以及检测结合过程期间形成的任何免疫复合物和对其进行定量的方法。在此，将获得疑似含有LILRB相关癌细胞的样品，并且将样品与和LILRB或其组分结合的抗体接触，随后检测在特定条件下形成的免疫复合物的量并且对其进行定量。在抗原检测方面，所分析的生物样品可以是任何疑似含有LILRB相关癌症的样品，如组织切片或样本、均质化组织提取物、包括血液和血清在内的生物流体或如粪便或尿液等分泌物。
使所选择生物样品与抗体在有效条件下接触并且持续足以允许形成免疫复合物(一级免疫复合物)的时间段通常只需将抗体组合物添加到样品中并将混合物温育长到足以使抗体与LILRB形成免疫复合物，即，与LILRB结合的时间段。在此时间后，通常将洗涤如组织切片、ELISA板、斑点印迹或蛋白质印迹等样品-抗体组合物，以去除任何非特异性结合的抗体种类，从而仅检测在一级免疫复合物内特异性结合的那些抗体。
通常，对免疫复合物形成的检测在本领域是众所周知的，并且可以通过应用许多方法来实现。这些方法通常基于对如那些放射性、荧光、生物和酶标签中的任何一种等标记或标志物的检测。有关此类标记的使用的专利包括美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。当然，如本领域已知的，通过使用如第二抗体和/或生物素/亲和素配体结合布置二级级结合配体可以发现另外的优势。
检测中采用的抗体本身可以与可检测标记连接，其中然后可以简单地检测此标记，从而允许确定组合物中的一级免疫复合物的量。可替代地，可以通过对抗体具有结合亲和力的第二结合配体来检测在一级免疫复合物内结合的第一抗体。在这些情况下，第二结合配体可以与可检测标记连接。第二结合配体本身通常是抗体，因此其可以被称为“二级”抗体。一级免疫复合物与标记的二级结合配体或抗体在有效条件下接触并且持续足以允许形成二级免疫复合物的时间段。然后通常洗涤二级免疫复合物以去除任何非特异性结合的标记的二级抗体或配体，并且然后检测二级免疫复合物中剩余的标记。
另外的方法包括通过两步方法检测一级免疫复合物。如上文所描述的，使用第二结合配体，如对抗体具有结合亲和力的抗体，以形成二级免疫复合物。洗涤后，将二级免疫复合物与对第二抗体具有结合亲和力的第三结合配体或抗体再次在有效条件下接触并且持续足以允许形成免疫复合物(三级免疫复合物)的时间段。第三配体或抗体与可检测标记连接，从而允许检测由此形成的三级免疫复合物。此系统可以提供信号放大，如果这是期望的。
一种免疫检测方法使用两种不同的抗体。第一生物素化抗体用于检测靶抗原，并且然后第二抗体用于检测与复合的生物素连接的生物素。在所述方法中，要检测的样品首先在含有第一步抗体的溶液中温育。如果存在靶抗原，则抗体中的某个抗体与抗原结合以形成生物素化抗体/抗原复合物。然后通过在链霉亲和素(或亲和素)、生物素化DNA和/或互补生物素化DNA的连续溶液中温育来扩增抗体/抗原复合物，其中每个步骤将另外的生物素位点添加到抗体/抗原复合物。重复扩增步骤直到达到合适的扩增水平，此时将样品在含有针对生物素的第二步抗体的溶液中温育。此第二步抗体被标记，例如用可以用于通过使用显色底物的组织酶学检测抗体/抗原复合物的存在的酶。通过合适的扩增，可以产生肉眼可见的缀合物。
另一种已知的免疫检测方法利用免疫-PCR(聚合酶链反应)方法。直到与生物素化DNA一起温育之前，PCR方法与Cantor方法是类似的，然而，与使用多个轮次的链霉亲和素和生物素化DNA温育相反，用释放抗体的低pH或高盐缓冲液洗涤掉DNA/生物素/链霉亲和素/抗体复合物。然后使用所产生的洗涤溶液以利用合适的引物和合适的对照进行PCR反应。至少在理论上，可以利用PCR的巨大扩增能力和特异性以检测单个抗原分子。
1.ELISA
在免疫测定的最简单且最直接的意义上，免疫测定是结合测定。某些优选的免疫测定是本领域已知的各种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也特别有用。然而，很容易理解，检测不限于此类技术，并且也可以使用蛋白质印迹、斑点印迹、FACS分析等。
在一个示例性ELISA中，将本公开的抗体固定到展现出蛋白质亲和力的所选表面，如聚苯乙烯微量滴定板中的孔上。然后，将疑似含有LILRB相关癌细胞的测试组合物添加到孔中。在结合和洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物后，可以检测到结合的抗原。检测可以通过添加与可检测标记连接的另一种抗LILRB抗体来实现。这种类型的ELISA是简单的“夹心ELISA”。检测还可以通过添加第二抗LILRB3抗体，随后添加对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来实现，其中第三抗体与可检测标记连接。
在另一个示例性ELISA中，将疑似含有LILRB3相关癌细胞的样品固定到孔表面上，并且然后与本公开的抗LILRB3抗体接触。在结合和洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物后，检测结合的抗LILRB3抗体。在最初的抗LILRB3抗体与可检测标记连接的情况下，可以直接检测免疫复合物。同样，可以使用对第一抗LILRB3抗体具有结合亲和力的第二抗体检测免疫复合物，其中第二抗体与可检测标记连接。
无论采用何种形式，ELISA都具有某些共同特征，如涂覆、温育和结合、洗涤以去除非特异性结合的种类，以及检测结合的免疫复合物。这些在下文进行了描述。
在用抗原或抗体涂覆板时，通常将板的孔与抗原或抗体的溶液一起温育过夜或持续指定的数小时时间段。然后将洗涤板的孔以去除不完全吸附的材料。然后用对测试抗血清呈抗原中性的非特异性蛋白质“涂覆”孔的任何其余可用表面。这些非特异性蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。所述涂层允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点，并且因此减少由抗血清非特异性结合到表面上引起的背景。
在ELISA中，可能更习惯于使用二级或三级检测手段，而不是直接程序。因此，在蛋白质或抗体与孔结合，用非反应性材料涂覆以降低背景，并且洗涤以去除未结合的材料之后，使固定表面与要测试的生物样品在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下接触。然后免疫复合物的检测需要标记的二级结合配体或抗体，以及与标记的三级抗体或第三结合配体结合的二级结合配体或抗体。
“在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下”意指所述条件优选地包括用如BSA、牛γ球蛋白(BGG)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)/Tween等溶液稀释抗原和/或抗体。这些添加的药剂也有助于减少非特异性背景。
“合适的”条件还意味着温育处于足以允许有效结合的温度或持续足以允许有效结合的时间段。温育步骤通常为在优选地大约25℃至27℃的温度下约1小时至2小时至4小时等，或者可以在约4℃下过夜。
在ELISA中的所有温育步骤之后，将接触的表面洗涤以去除未复合的材料。优选的洗涤程序包括用如PBS/Tween或硼酸盐缓冲液等溶液洗涤。在测试样品与最初结合的材料之间形成特异性免疫复合物并随后洗涤后，可以确定甚至微量的免疫复合物的出现。
为了提供检测手段，第二或第三抗体将具有允许检测的相关标记。优选地，这将是酶，所述酶将在与适当的显色底物一起温育时产生颜色显影。因此，例如，将期望使第一和第二免疫复合物与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀合的抗体在有利于进一步的免疫复合物形成的发展的时间段内和条件下(例如，在室温下在如PBS-Tween等含有PBS的溶液中温育2小时)接触或一起温育。
在与标记的抗体一起温育，并且随后洗涤以去除未结合的材料后，例如通过在过氧化物酶作为酶标记的情况下与如脲或溴甲酚紫或2,2'-叠氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)或H2O2等显色底物一起温育来对标记的量进行定量。然后通过测量例如使用可见光谱分光光度计产生的颜色度来实现定量。
2.蛋白质印迹
蛋白质印迹(可替代地，蛋白质免疫印迹)是用于检测给定组织匀浆或提取物的样品中的特定蛋白质的分析技术。蛋白质印迹使用凝胶电泳以根据多肽的长度(变性条件)或蛋白质的3-D结构(天然/非变性条件)分离天然或变性蛋白质。然后将蛋白质转移到膜(通常是硝酸纤维素或PVDF)上，在膜上使用对靶蛋白具有特异性的抗体对所述蛋白质进行探测(检测)。
样品可以取自整个组织或细胞培养物。在大多数情况下，首先使用搅拌器(用于较大的样品体积)、使用均质器(较小的体积)或通过超声对固体组织进行机械分解。细胞也可以通过上述机械方法之一被打开。然而，应注意细菌、病毒或环境样品可以是蛋白质的来源，并且因此蛋白质印迹不仅限于细胞研究。可以采用各种去污剂、盐和缓冲液来促进细胞裂解并且使蛋白质溶解。通常添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止样品被其自身的酶消化。组织制备通常在寒冷温度下进行以避免蛋白质变性。
使用凝胶电泳分离样品的蛋白质。可以通过等电点(pI)、分子量、电荷或这些因素的组合来进行蛋白质的分离。分离的性质取决于样品的处理和凝胶的性质。这是确定蛋白质的一种非常有用的方法。也可以使用二维(2-D)凝胶，所述凝胶使来自单个样品的蛋白质在两个维度上展开。在第一维度上根据等电点(其具有中性净电荷的pH)，并且在第二维度上根据其分子量来分离蛋白质。
为了使蛋白质可用于抗体检测，将蛋白质从凝胶内移动到由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的膜上。将膜放置于凝胶的顶部，并且在所述凝胶的顶部放置滤纸的堆叠。将整个堆叠放置在缓冲溶液中，所述缓冲溶液通过毛细作用移动到纸上，从而使蛋白质随缓冲溶液一起移动。另一种用于转移蛋白质的方法被称为电印迹，并且使用电流以将蛋白质从凝胶拉入到PVDF或硝酸纤维素膜中。蛋白质从凝胶内移动到膜上，同时保持蛋白质在凝胶内的组织。由于此印迹过程，蛋白质暴露在薄表面层上以用于检测(参见下文)。选择这两种膜是因为其非特异性蛋白质结合特性(即，与所有蛋白质均同等地充分结合)。蛋白质结合基于疏水相互作用，以及膜与蛋白质之间的带电相互作用。硝酸纤维素膜比PVDF便宜，但脆弱得多，并且不能很好地经受反复探测。可以通过用考马斯亮蓝(CoomassieBrilliant Blue)或丽春红S(Ponceau S)染料染色膜来检查蛋白质从凝胶转移到膜的均匀性和整体有效性。转移后，使用标记的一级抗体或未标记的一级抗体检测蛋白质，随后使用与一级抗体的Fc区结合的标记的蛋白质A或二级标记的抗体进行间接检测。
3.免疫组织化学
本公开的抗体也可以与新鲜冷冻的和/或福尔马林固定的、石蜡包埋的组织块结合使用，所述组织块是针对通过免疫组织化学(IHC)进行的研究制备的。由这些颗粒样本制备组织块的方法已成功用于各种预后因素的先前IHC研究，并且是本领域的技术人员众所周知的(Brown等人,1990；Abbondanzo等人,1990；Allred等人,1990)。
简而言之，冷冻切片可以通过以下来制备：将50ng冷冻的“粉碎”组织在室温下在小塑料胶囊中的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中再水合；通过离心使颗粒团粒化；将颗粒重新悬浮于粘性包埋介质(OCT)中；翻转胶囊和/或通过离心再次团粒化；在-70℃异戊烷中速冻；切割塑料胶囊和/或取出组织的冷冻圆筒；将组织圆筒固定在低温冷冻切片机卡盘上；和/或从胶囊上切下25个至50个连续切片。可替代地，可以使用整个冷冻组织样品以进行连续切片切割。
永久性切片可以通过类似的方法制备，所述类似的方法涉及将50mg样品在塑料微量离心管中再水合；团粒化；重新悬浮于10％福尔马林以进行4小时固定；洗涤/团粒化；重新悬浮于温热的2.5％琼脂中；团粒化；在冰水中冷却以使琼脂樱花；从管中取出组织/琼脂块；将块浸入和/或包埋在石蜡中；和/或切割至多50个连续永久性切片。同样，可以取代整个组织样品。
4.免疫检测试剂盒
在仍另外的实施方式中，本公开涉及用于与上文描述的免疫检测方法一起使用的免疫检测试剂盒。由于抗体可以用于检测LILRB相关的癌细胞，因此所述抗体可以包括在试剂盒中。因此，免疫检测试剂盒在合适的容器装置中将包括与LILRB结合的第一抗体，以及任选地免疫检测试剂。
在某些实施方式中，抗体可以与固体载体，如柱基质和/或微量滴定板的孔预结合。试剂盒的免疫检测试剂可以采用多种形式中的任何一种形式，包括与给定抗体缔合或连接的那些可检测标记。还设想了与二级结合配体缔合或连接的可检测标记。示例性二级配体是对第一抗体具有结合亲和力的那些二级抗体。
用于本试剂盒中的另外合适的免疫检测试剂包含双组分试剂，所述双组分试剂包括对第一抗体具有结合亲和力的二级抗体，以及对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体，所述第三抗体与可检测标记连接。如上所述，许多示例性标记在本领域中是已知的，并且所有此类标记都可以与本公开结合使用。
试剂盒可以进一步包括适当等分的LILRB组合物，无论是标记的还是未标记的，如可以用于制备检测测定的标准曲线。试剂盒可以含有完全缀合形式、中间体形式或作为由试剂盒的用户缀合的单独部分的抗体-标记缀合物。试剂盒的组分可以以水性介质或冻干形式包装。
试剂盒的容器装置通常包括抗体可以放置于其中，或优选地适当地等分的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置。本公开的试剂盒通常还将包括一种用于以紧密封闭的方式容纳抗体、抗原和任何其它试剂容器以供商业销售的装置。此类容器可以包括将期望的小瓶保留在其中的注射或吹气模制的塑料容器。
5.流式细胞术和FACS
本公开的抗体也可以用于流式细胞术或FACS。流式细胞术是一种基于激光或阻抗的技术，其用于许多检测测定，包括细胞计数、细胞分选、生物标志物检测和蛋白质工程化。所述技术将细胞悬浮于流体流中，并将细胞穿过电子检测设备，从而允许对每秒至多数千个颗粒的物理和化学特性进行同时多参数分析。流式细胞术常规用于诊断病症，尤其是血癌，但在基础研究、临床实践和临床试验中还有许多其它应用。
荧光活化的细胞分选(FACS)是一种特殊类型的细胞术。其提供了一种用于基于每个细胞的特定光散射和荧光特性一次一个细胞将生物细胞的非均质混合物分选到两个或多个容器中的方法。通常，所述技术涉及一种细胞悬浮液，所述细胞悬浮液夹在狭窄、快速流动的液体流的中心。该液体流被配置成使得细胞之间相对于其直径有很大的分离。振动机制使细胞流分裂成单独的液滴。就在流分裂成液滴之前，流穿过荧光测量站，在所述荧光测量站中测量每个细胞的荧光。在流分裂成液滴的点处放置充电环。在即将测量荧光强度之前，将电荷放置于环上，并且在液滴从流中分裂时，相反的电荷被捕获在液滴上。带电的液滴然后下落通过静电偏转系统，所述系统会基于其电荷将液滴转向到容器中。
在某些实施方式中，为了用于流式细胞术或FACS，本公开的抗体用荧光团标记，然后允许与所关注的细胞结合，所述细胞在流式细胞仪中分析或通过FACS机器分选。
VII.实施例
包括了以下实施例以说明本公开的优选实施例。本领域的技术人员应当理解，以下实施例中所公开的技术表示由本发明人发现的在本公开的实践中很好地起作用并且因此可以被认为构成其实践的优选模式的技术。然而，根据本公开，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果。
实施例1-材料和方法
小鼠。C57BL/6J和NOD-SCID IL2Rγ缺失(NSG)小鼠购买并饲养于德克萨斯大学西南医学中心的动物核心设施(animal core facility of the University of TexasSouthwestern Medical Center)。从杰克森实验室(Jackson Lab)购买GFP特异性TCR小鼠(Jedi小鼠，JAX实验室库存号：028062)。向C57BL/6J CD45.1小鼠腹膜内注射1x 106个经辐照的MLL-AF9小鼠AML细胞(3000cGy)和LPS或作为对照的单独的LPS。10天后重复注射。对C57BL/6J CD45.2受体小鼠进行致死辐照(1000cGy)，并且注射小鼠MLL-AF9AML细胞和0.5x106个CD45.2骨髓细胞。通过尾部注射向5-8周龄的NSG小鼠植入AML细胞或人T细胞。每个实验中的小鼠均为5-8周龄的雌性小鼠。此研究中的所有工作都得到德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理和使用委员会(UT Institutional Animal Care and Use Committee)批准。
LILRB3转基因小鼠。将LILRB3 cDNA构建进pR26 CAG AsiSI/MluI中。然后，在不存在内毒素的情况下，纯化高浓度的质粒。在UTSW转基因核心研究所，将Cas9RNA、靶向小鼠Rosa26基因座的gRNA和LILRB3质粒共同注射到小鼠卵母细胞中。通过LILRB3特异性引物鉴定LILRB3阳性小鼠，并使其与LysMcre小鼠(JAX，004781)杂交。通过LILRB3与Mac-1或Gr-1在外周血、脾脏和骨髓中的共表达对LILRB3+LysMcre+小鼠进行分析。
细胞培养。从ATCC购买THP-1、MV4-11、Molm13、U937、C1498和293T细胞。在具有10％ FBS的RPMI-1640中培养AML细胞系。将具有N297A突变的人抗LILRB3抗体涂覆到板上以活化LILRB3信号传导，并且将用人IgG(N297A)涂覆的板用作对照。分析LILRB3信号传导之前，将感染了病毒的细胞培养至少另外3周。使用PI染色鉴定死亡细胞。将原代人T细胞用autoMACS从供体的PBMC中分离，用抗CD3和抗CD28进行刺激，并且在有IL-2的RPMI-1640中培养。对于T淋巴细胞细胞毒性的测定，将人AML细胞用CFSE染色，并且与经活化的T细胞以不同比率混合。10小时后，通过FACS确定PI阳性CFSE染色的AML细胞百分比。
流式细胞术。使用一级抗体，所述一级抗体包含抗小鼠CD8a-PE(百进公司(biolgend)，100707，53-6.7，1:100)、抗小鼠CD45-PE(碧迪公司Pharmingen(BDpharingen)，561087，30-F11，1:100)、抗小鼠CD45.1-FITC(百进公司，110705，A20，1:100)、抗小鼠CD45.2-PE(百进公司，109807，104，1:100)、抗人CD45-PE(碧迪公司Pharmingen，555483，HI30，1:100)、抗人CD33-APC(百进公司，366605，P67.6，1:100)、抗人CD3-FITC(百进公司，300305，HIT3a，1:100)、抗人CD8-PE(碧迪公司pharingen，555367，RPA-T8，1:100)抗体。使细胞在Calibur上运行以进行分析或在FACSAria上运行以进行分选。
质粒。从人cDNA中克隆TRAF2和cFLIP。将LILRB3、TRAF2、cFLIP和显性抑制的TRAF2(245-501)基因构建入pLVX-IRES-ZsGreen载体中。使LILRB、LAIR1、LILRB3片段和嵌合蛋白CAR-LILRB3在pFLAG-CMV5.1载体中与C末端处的hFc融合。在pLL3.7中构建LILRB3特异性shRNA。通过分别用FL-cFLIP和Cre取代质粒pCW-Cas9中的Cas9构建Tet-on cFLIP和Cre。对于小鼠细胞的转染，将全长LILRB3插入到MSCV-IRES-GFP载体中，以产生B3-FL；将胞内结构域缺失的LILRB3插入到MSCV-IRES-GFP载体中，以产生B3del ICD。
NF-κB报告基因测定和LILRB3嵌合受体报告基因测定。从InvivoGen公司(InvivoGen)购买THP-1-LuciaTMNF-κB细胞。将具有N297A突变的人抗LILRB3抗体涂覆到板上以活化LILRB3信号传导，并且使用涂覆有hIgG(N297A)的板作为对照。通过监测荧光素酶信号来评估NF-κB信号传导的活化。将感染的THP-1报告细胞培养另外一个月之后用抗LILRB3刺激。为了在293T细胞中进行NF-κB报告基因测定，将与NF-κB驱动的萤火虫荧光素酶报告基因质粒，CMV驱动的编码海肾荧光素酶的质粒，以及表达LILRB3、TRAF2或cFLIP的质粒共转染到细胞中。使用Dual-报告基因(DLRTM)测定系统(普洛麦格公司(Promega))检测荧光素酶活性。按照发明人所描述的(Deng等人,2014；2018；Kang等人,2015)，用与配对免疫球蛋白样受体的跨膜结构域和胞内结构域融合的LILRB3-ECD构建LILRB3嵌合受体报告细胞，β所述LILRB3嵌合受体报告细胞通过衔接子DAP-12传导信号以活化NFAT启动子。
病毒产生和感染。为了产生慢病毒，将质粒pLL3.7 shRNA和pLVX-IRES-ZsGreencFLIP、显性抑制TRAF2或tet-on pCW-Cre与psPAX2和pMD2.G以4:3:1的比率混合，并且使用polyjet(SignaGen公司(SignaGen))转染到293T细胞中。为了产生逆转录病毒，将具有B3-FL或B3del ICD的质粒MSCV-IRES-GFP与pCL-ECO(2:1)混合，并且转染到293T细胞中。转染后48-72小时收集含有病毒的上清液。使人AML细胞系通过在37℃下以1800rpm离心2小时，以及三小时温育感染病毒上清液，随后替换为常规培养基。使新鲜小鼠MLL-AF9 AML细胞感染有与具有mSCF、IL3和IL6的StemSpan培养基(StemCell公司(StemCell))混合的病毒上清液。感染后，用具有mSCF、IL3和IL6的StemSpan培养基替代病毒上清液。将细胞培养另外2天，之后分离感染的细胞。
人白血病原代细胞。从德克萨斯大学西南医学中心获得人类原代AML样品。由德克萨斯大学西南医学中心机构审查委员会(IRB STU 122013-023)获得知情同意书并批准。对于初次移植时，将从供体外周血中分离的白血病细胞注射到经辐照的NSG小鼠(200cGy)体内，并且注射后8天静脉内引入抗体或IgG。对于二次移植，将来自植入有患者AML细胞的NSG小鼠的冷冻BM的人白血病细胞移植到亚致死照射的NSG接受者体内。
蛋白质印迹和免疫共沉淀。用含有蛋白酶抑制剂(罗氏诊断公司(RocheDiagnostic))的RIPA缓冲液使细胞裂解。将样品与2XSDS上样缓冲液混合，并且通过SDS-PAGE分离。在将蛋白质转移到硝化纤维素膜后，用特异性一级抗体和HRP缀合的二级抗体检测蛋白质。一级抗体为抗cFLIP(R&D系统公司(R&D Systems)，MAB8430，1:500)、抗LILRB3(R&D系统公司，MAB1806，1:500)、抗TRAF2(Novus Biologicals公司(Novus Biologicals)，NB100-56715，1:500)、抗HA(百进公司，901513，1:2000)、抗FLAG(百进公司，637319，1:2000)、抗MLKL(磷酸S358，艾博抗公司(abcam)，ab187091，1:500)、抗MLKL(艾博抗公司，ab184718，1:1000)和抗肌动蛋白(百进公司，664801，1:10000)。对于免疫沉淀，使用PierceIP裂解缓冲液(赛默飞世尔科技公司，87787)使细胞裂解。使总计1x 109个原代M5 AML白血病细胞裂解，以分析LILRB3与TRAF2的相互作用，并且用人抗LILRB3 N297A突变体使LILRB3和TRAF2复合物免疫沉淀。使带有HA或FLAG标签的TRAF2和cFLIP与带hFc标签的LILRB3或LILRB3片段在293T细胞中共表达。所有免疫共沉淀中使用Dynabeads蛋白A(赛默飞世尔科技公司，10001D)。为了评估TRAF2与LILRB3在体外的相互作用，将经纯化的GST-TRAF2(MyBioSource公司(MyBioSource)，MBS515700)与Dynabeads蛋白A一起在4℃下温育过夜，Dynabeads蛋白A结合于在C末端处与hFc融合的LILRB3的胞内结构域。
定量RT-PCR。从AML细胞或从PBMC分离的原代CD14+单核细胞中分离出总RNA。用高性能cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems))合成第一链cDNA。从西格玛公司(Sigma)订购以下引物：5′-GAAGAAACTCAACTGGTGTCG-3′(SEQ ID NO:422)和5′-CCAAGTCTGTGTCCTGAACG-3′(SEQ ID NO:423)，其用于检测TNFAIP3F；5′-GAAGGCTACCAACTACAATGG-3′(SEQ ID NO:424)和5'-TTCAACAGGAGTGACACCAG-3'(SEQ IDNO:425)，其用于检测NFKB1AF；5'-GAATCACCAGCAGCAAGTG-3'(SEQ ID NO:426)和5'-CTTCGGAGTTTGGGTTTG-3′(SEQ ID NO:427)，其用于检测CCL2；5′-TTGTGCGTCTCCTCAGTAAA-3'(SEQ ID NO:428)和5'-CAAGTGAAACCTCCAACCC-3'(SEQ ID NO:429)，其用于检测CCL20；5'-CATTGAGGAGGATTGCCAAA-3'(SEQ ID NO:430)和5'-ACAAACTGGATGTCGCTGG-3'(SEQ IDNO:431)，其用于检测Myd88；5'-ACGCTCTTCTGCCTGCT-3′(SEQ ID NO:432)和5'-GCTTGAGGGTTTGCTACAA-3'(SEQ ID NO:433)，其用于检测TNFa；5'-TGGCTTATTACAGTGGCAATG-3'(SEQ ID NO:434)和5'-TGGTGGTCGGAGATTCGT-3'(SEQ ID NO:435)，其用于检测IL1B；5'-CTTTCTGCTGACATCGCC-3'(SEQ ID NO:436)和5'-GTCTGCCGTAGGTTGTTGTA-3'(SEQ ID NO:437)，其用于检测BCL3；5'-ACGCAGACATCGTCATCC-3'(SEQ ID NO:438)和5'-CAAACCGAGTTGGAACCAC-3'(SEQ ID NO:439)，其用于检测MMP9；5'-CATACTTACCCACTTCAAGGG-3'(SEQ ID NO:440)和5'-TTGTAGCCATAGTCAGCATTGT-3'(SEQID NO:441)，其用于检测PTGS2；5'-GATGGGGTCTTCATCTG-3'(SEQ ID NO:442)和5'-CGTAGGTGGATGCCTCC-3'(SEQ ID NO:443)，其用于检测TRAF2。将mRNA水平相对于同一样品中存在的GAPDH的水平归一化。
TCGA分析。AML患者数据从TCGA(版本：2016年8月16日)获得，并且分类为AML亚型(FAB分类)。通过RNA-seq确定mRNA水平，并且对每个亚型的LILRB3表达求平均。基于LILRB3表达以及对应患者存活率数据分析总体存活率。基于显著LILRB3表达截止值对患者进行分组，以进行存活率分析。
RNA-seq分析。使用凯捷公司RNeasy Mini试剂盒(Qiagen RNeasy Mini kit)根据制造商的说明从AML细胞中提取RNA，并且之后用SuperScript III逆转录酶(英杰公司(Invitrogen))进行逆转录。按照先前报告的进行RNA-seq(Deng等人，2018)。
GESA分析。使用GSEA v4.0软件(Subramanian等人,2005)(万维网地址broadinstitute.org/gsea/index.jsp)利用1000个表型排布进行基因集富集分析。
LILRB3抗体的产生。噬菌体淘选：在内部自行构建了完整的人scFv噬菌体文库，并且将其用于LILRB3抗体淘选。简单地说，将人LILRB3胞外结构域蛋白涂覆到96孔板的孔上，将预先阻断的噬菌体文库添加到经LILRB3涂覆的孔中，并且将样品在室温下温育2小时。将孔洗涤，以去除未结合的噬菌体，并且将结合的噬菌体洗脱，并且用于感染用于扩增的TG1细菌。重复淘选过程以富集高亲和力结合剂。
VH和VL序列评估：使用GeneBank IgBLAST1.10.0对与LILRB3结合的噬菌体的序列进行分析，以鉴定种系V(D)J基因区段。将单独VH和VL基因定位到主要IGL和IGH基因座的种系。根据IMGT(万维网地址imgt.org/)命名法对框架和CDR序列进行注释。
VH和VL编码基因克隆到完全人IgG载体：将来自噬菌体质粒的VH和VL编码基因克隆到人IgG表达载体中。简单地说，将编码VH和VL的DNA片段用家族前导区特异性引物通过PCR进行扩增。收集VH和VL基因的大约400bp的PCR产物，并且将所述产物纯化，以进行融合PCR。使用In-HD克隆试剂盒(Clontech公司(Clontech))进行融合PCR。
抗体通过HEK293F细胞表达：使人抗LILRB3抗体在哺乳动物细胞(HEK293F)中表达，并且使用亲和色谱利用蛋白A树脂进行纯化。简单地说，将相等摩尔量的重链质粒和轻链质粒共转染到HEK293F细胞中，以用于抗体的短暂表达。培养7天后采集上清液，并且用蛋白A树脂(通用电气医疗公司(GE Healthcare))对IgG进行纯化。
亲和力测量和表位分箱：亲和力测量和表位分箱如先前所述进行(Gui等人,2019)。简单地说，用Octet RED96仪器分析抗体亲和力。将抗体(30mg/mL)上样到蛋白A生物传感器上，然后暴露于一系列浓度的重组LILRB3(0.1-200nmol/L)中，并且减去背景以校正传感器偏差。假设1:1结合模型，使用ForteBio公司(ForteBio)的数据分析软件以提取缔合速率和解离速率。Kd以比率koff/kon计算。利用Octet RED96仪器使用经典夹心表位分箱测定进行抗LILRB3兔抗体的表位分箱。在这些表位分箱测定中，将一级抗体(40μg/ml)上样到蛋白A生物传感器上，并且用人非靶向IgG(200μg/ml)阻断传感器上的其余Fc结合位点。然后将传感器暴露于稀释在1×动力学缓冲液中的1μM LILRB3中，然后是第二抗体(40μg/ml)。使用ForteBio公司的数据分析软件7.0对原始数据进行处理。评估抗体对的竞争结合。二级抗体的额外的结合表明表位未被占用(所述抗体对不是竞争者)，并且没有结合表明表位阻断(所述抗体对是同一表位的竞争者)。
统计和再现性。使用双尾Student t测试评估差异的统计显著性。用对数秩测试评估动物存活率分析。0.05或更小的p值被视为是显著的。数值以平均值±s.e.m呈现。体外数据的所有重复均来自独立实验。未使用统计方法以预先确定样品大小。分析中没有排除数据。使用培养的细胞和小鼠的实验是随机化的。为了检测细胞内的蛋白质水平和蛋白质的相互作用，进行免疫印迹，并且重复两次以确认结果。
实施例2-结果
LILRB3通过增强白血病细胞存活率支持AML。此分析表明，LILRB3的表达与AML患者的总体存活率负相关(图1a)。此外，这些结果表明，LILRB3在单核AML细胞(FAB M4和M5AML亚型；图1b)中高度表达。对35名AML患者样品的分析表明，LILRB3与LILRB4，即单核AML细胞标志物(Deng等人,2018)在AML细胞上共表达(图S1a)。这表明LILRB3主要在单核AML细胞上表达。几种AML细胞系，包括THP-1、Molm13和MV4，都具有LILRB3的细胞表面表达(图1c)。在AML细胞中，通过利用固定化的抗LILRB3抗体进行处理活化LILRB3信号传导，所述抗体引起受体簇聚。在存在或不存在AML药物的情况下，用固定化的抗LILRB3抗体处理的这些AML细胞的细胞死亡百分比明显低于用对照IgG处理的AML细胞的细胞死亡百分比(图1d、图S1b)。
用LILRB3特异性shRNA处理的AML细胞(图1e)在培养另外3周后增殖正常(图S1c)。相比之下，植入了LILRB3沉默的Molm-13细胞的NSG小鼠的AML进展明显延缓(图1f)。接下来，发明人向NSG小鼠植入了THP-1AML细胞，并且应用可以通过tet-on CRE诱导的shRNA递送系统以使这些细胞中的LILRB3沉默(Tiscornia等人,2004)(图S1d)。当在AML细胞移植后19天时诱导时，靶向LILRB3的shRNA的表达使AML发展减缓(图1g)。
白血病患者的TNF-α水平通常高于健康个体的水平(Sanchez-Correa等人,2013)。发明人观察到，LILRB3活化使与TNF-α的水平提高相关的细胞死亡显著减少(图S1e)。TNF-α在细胞凋亡和存活中具有双重作用(McEwan,2002)。这些结果表明，LILRB3增强TNF-α存活信号传导并且减弱其细胞死亡信号传导。然而，通过用抗TNFα中和抗体进行的处理经活化的LILRB3仍然增强了细胞存活率(图S1f)，这表明LILRB3的功能不依赖于TNFα。
发明人通过逆转录病毒感染(Syken等人,2006)(图1h)将过表达全长LILRB3(B3-FL)或具有胞内结构域缺失(B3del ICD)的突变型LILRB3的PirB缺陷型MLL-AF9 AML细胞植入到有同基因免疫能力的C57BL/6小鼠中。LILRB3胞内结构域的缺乏导致AML负荷显著降低，脾脏和肝脏的大小减小，集落形成单位(CFU)活性降低，并且存活期延长(图1i-m)。用异位表达全长LILRB3或胞内结构域缺失的突变型LILRB3的小鼠AML C1498细胞进行的实验也表明，LILRB3能在有免疫能力的小鼠中支持AML发展(图S1g-h)。固定化的抗LILRB3对培养中的THP-1细胞生长影响很小(图S1i)。具有全长或胞内结构域截短的LILRB3的表达MLL-AF9的小鼠AML细胞在连续复制后保持类似的集落形成能力(图S1j)，这表明LILRB3不影响体外AML细胞自我更新。LILRB3在LILRB3阴性U937 AML细胞中的过表达提高了细胞存活率(图S1k)，这证实LILRB3的促存活功能。
LILRB3+AML细胞抑制T细胞活性。单核AML细胞抑制T细胞功能(Deng等人,2018)。用固定化的抗LILRB3抗体活化的LILRB3+THP-1细胞在存在CTL的情况下显著降低AML细胞死亡的水平(图2a、b)。为了进一步评估在AML细胞上表达的LILRB3是否对T细胞功能有影响，在Molm13 AML细胞移植到NSG小鼠体内4天后注射T细胞。在存在T细胞的情况下，相比于表达对照shRNA的AML细胞，LILRB3沉默的Molm13 AML细胞显著更缓慢地发展(图2c、d)。这些结果表明，AML细胞中的LILRB3抑制T细胞功能。
为了进一步测试T细胞的重要性，发明人用抗mCD8抗体使C57BL/6接受者小鼠体内的CD8 T细胞耗竭(图S2a)，并且评估了具有B3-FL或B3del ICD的PirB缺陷型MLL-AF9 AML细胞引发的白血病发展。在CD8 T细胞耗竭的情况下，具有B3-FL的AML细胞仍然比具有B3del ICD的那些AML细胞更快地实现白血病发展，但这两组之间的差异远小于两组在对照条件下的差异(图2e、f)。结果表明，T细胞在LILRB3功能方面在AML发展中起关键作用。随后，发明人通过在10天间隔两次用表达MLL-AF9的小鼠AML细胞(Hasegawa等人,2015)对CD45.1 C57BL/6小鼠进行免疫接种使肿瘤特异性小鼠T细胞发展，并且从脾脏中分离出CD3+细胞。将这些T细胞与MLL-AF9 AML细胞一起共同注射到接受者CD45.2 C57BL/6小鼠体内(图2g)。来自用LPS进行免疫接种的小鼠的T细胞用作对照。对MLL-AF9 AML细胞具有特异性的T细胞(T-AF9细胞)在体外显示出比来自经LPS处理的小鼠的T细胞(T-LPS细胞)更强杀伤MLL-AF9 AML细胞的能力(图2h)，但是T-AF9细胞不杀伤正常BM细胞(图S2b)。具有B3-FL的AML细胞比其具有B3del ICD的对应物对T-AF9细胞的杀伤更具抗性，这表明AML细胞中的LILRB3信号传导减少了T细胞介导的杀伤。
然后，发明人向C57BL/6小鼠移植表达B3del ICD或B3-FL的PirB缺陷型AML细胞(其中移植到每只小鼠体内的具有B3del ICD的AML细胞的数量是具有B3 FL的AML细胞的两倍，这使得更容易比较存在肿瘤特异性T细胞的情况下的白血病发展)。两组小鼠的AML发展在不存在注射的CD45.1 T细胞或具有非特异性T细胞(T-LPS)的情况下是相似的(图2i)。相比之下，共同注射了肿瘤特异性T细胞(T-AF9)的小鼠的AML发展明显减慢。重要的是，在存在特异性T细胞的情况下，B3del ICD AML比B3-FL AML发展地更慢(图2i、j)。肿瘤特异性CD45.1+T细胞的百分比在具有B3del ICD AML的小鼠中更高。相比之下，非特异性CD45.1+T细胞的百分比在两组小鼠中是相同的(图2k)。
为了进一步研究LILRB3在使用抗原特异性T细胞的AML发展中的功能，发明人向MLL-AF9 AML C57BL/6CD45.2小鼠注射了从CD45.1转基因小鼠的脾脏中分离的GFP特异性CD3+细胞，这些小鼠的T细胞表达靶向GFP的TCR。在注射了GFP特异性T细胞的小鼠中，具有B3del ICD的PirB缺陷型MLL-AF9 AML细胞的进展比具有B3-FL的细胞的进展慢得多，而在注射了WT天然T细胞的小鼠中，这两个组的AML细胞具有相似发展(图2l、m)。与具有B3 FLAML细胞的小鼠相比，在具有B3del ICD AML细胞的小鼠中检测到更多数量的CD8 GFP特异性T细胞、更高的INFγ和TNFα表达以及更低的PD1表达(图2n和图S2c)。总之，这些结果表明，在AML细胞上表达的LILRB3能抑制T细胞活性，并且LILRB3的信号传导结构域在这一功能中很重要。
LILRB3通过招募TRAF2来活化NF-κB信号传导。在用固定化的抗LILRB3抗体或对照IgG处理的THP-1细胞中进行RNA-seq。GO富集分析表明，LILRB3活化与TNF信号传导、Toll样受体信号传导和NOD样受体信号传导相关(图3a)。已知这些信号传导通路全部能刺激NF-κB信号传导(MacEwan,2002；Kawasaki和Kawai,2014；Shaw等人,2010)。GSEA分析显示，固定化的抗LILRB3抗体能活化NF-κB信号传导(图3b)。对异位表达B3-FL或B3del ICD的MLL-AF9小鼠AML细胞进行RNA-seq分析。该分析的结果也表明，LILRB3能增强NF-κB信号传导(图S3a-b)。这些结果与之前的发现一致，即肿瘤细胞中的NF-κB信号传导支持细胞存活和T细胞抑制活性(Taniguchi和Karin,2018)。
在表达受NF-κB信号传导调节的荧光素酶报告基因的THP-1细胞中，存在固定化的抗LILRB3抗体的培养刺激荧光素酶活性(图3c)并且提高磷酸化p65蛋白水平(图3d)。为了研究LILRB3是否与TNFa信号传导蛋白相互作用，研究者将LILRB3与介导TNFa信号传导的TRADD、FADD或TRAF2一起转染到293T细胞中。然后，研究者检查NF-κB报告基因的表达是否受到影响。TRADD、FADD或TRAF2在293T细胞中的过表达活化NF-κB信号传导(图3e)。LILRB3显著增强了TRAF2的活性，但没有改变TRADD或FADD的活性(图3e)。在存在固定化的抗LILRB3抗体的情况下，显性抑制TRAF2(dnTRAF2)(Cannons等人,2002)在THP-1细胞中的过表达、消除了NF-κB报告基因的刺激和对AML细胞存活的影响(图3f-h)。进行了异种移植实验以评估植入了过表达dnTRAF2的AML细胞的NSG小鼠的疾病进展。结果显示，这一进展与植入了其中LILRB3表达沉默的细胞的小鼠相似(图3i)。在原代M5 AML患者样品中通过免疫共沉淀检测到LILRB3与TRAF2之间的相互作用(图4a)，并且通过对经纯化的重组蛋白的免疫共沉淀在体外证实了所述相互作用(图4b)。除了刺激NF-κB信号传导外，TRAF2被报道为能活化TNFa通路中的JNK信号传导(Nishitoh等人,1998)。LILRB3的表达不增强JNK信号传导(图S8c)。这一结果表明，TRAF2与LILRB3的相互作用通过与TNFa信号传导不同的途径活化NF-κB信号传导。这与之前的发现一致，即TRAF2介导的信号传导不需要与TNF受体复合物相作用(Reinhard等人,1997)。
293T细胞中的免疫共沉淀实验表明，含有LILRB3的氨基酸500-520的片段是与TRAF2相互作用所必需的(图4c-e)。具有从QEE突变为AAA的氨基酸509-511或氨基酸505-515缺失的LILRB3不与TRAF2相互作用(图4f)，并且这些突变体中的任一者都没有活化NF-κB报告基因表达的能力(图4g)。LILRB3中与TRAF2的结合的相关的序列在其它LILRB中是保守的(图4h)。然而，在测试的LILRB中，仅LILRB3与TRAF2强结合(图4i)。对于LILRB的胞内结构域与TRAF2之间的相互作用的进一步分析表明，LILRB的胞内结构域的膜近侧区段抑制LILRB与TRAF2之间的相互作用(图4j)。对TRAF2片段的分析表明，TRAF-C结构域(aa 351-501)介导了与LILRB3的相互作用(图4k)。在有免疫功能的小鼠中，与具有全长LILRB3的对应物相比，表达具有从QEE突变为AAA(不结合TRAF2)的氨基酸509-511的LILRB3的PirB缺陷型MLL-AF9小鼠AML细胞的AML发展更慢(图4l、m)。这表明与TRAF2相互作用的能力对LILRB3在AML细胞中的功能很重要。
LILRB3通过cFLIP活化NF-κB信号传导。cFLIP抑制细胞凋亡。其N末端片段p22-FLIP，作为胱天蛋白酶8消化cFLIP的产物(Golks等人,2006)能活化293T细胞中的NF-κB信号传导(图S4a)，如先前报道的(Kataoka和Tschopp,2004)。胱天蛋白酶8抑制剂z-VAD-FMK和z-IETD-FMK(Kataoka和Tschopp,2004)抑制LILRB3活化的NF-κB报告基因活性(图5a)。这一结果表明，胱天蛋白酶8是由LILRB3刺激的NF-κB信号传导所需要的。固定化的抗LILRB3处理能提高THP-1细胞中的cFLIP和p22-FLIP蛋白水平(图5b)。低水平的cFLIP能刺激胱天蛋白酶8活性，而高水平的cFLIP则抑制胱天蛋白酶8活性(Hughes等人,2016；Chang等人,2002)。在将Tet-on cFLIP构建体转染到293T细胞中时，低浓度的多西环素(doxycycline，dox)刺激NF-κB报告基因活性(图S4b)。LILRB3增强cFLIP在低浓度氧化还原下活化NF-κB的能力(图5c)。这些结果表明，LILRB3对NF-κB的活化依赖于低水平的cFLIP。与在THP-1细胞中一样，z-VAD-FMK也阻断了293T细胞中的LILRB3诱导的NF-κB活性(图5d)。
TRAF2可以与cFLIP结合(图S9c)(Kataoka和Tschopp,2004)。与TRAF2不同，仅全长LILRB3在293T细胞中共表达时才募集cFLIP(图5e)。单独的LILRB3的细胞内结构域无法募集cFLIP表明了LILRB3在膜上的交联是形成LILRB3与cFLIP的复合物所必需的。TRAF2的共表达增强了LILRB3和cFLIP的相互作用(图5f)，这表明LILRB3同时与TRAF2和cFLIP相互作用。在存在低水平的cFLIP的情况下，dnTRAF2的过表达阻断了NF-κB信号传导的LILRB3介导的增强(图5g)。z-VAD-FMK还阻断LILRB3通过TRAF2刺激NF-κB的能力(图5h)。总之，这些结果表明，cFLIP和TRAF2的相互作用对LILRB3信号传导至关重要。在293T细胞中，内源性TRAF2在没有cFLIP的情况下不刺激NF-κB信号传导(Kataoka等人,2004)。在293T细胞中存在和不存在外源TRAF2的情况下，LILRB3在低水平的cFLIP存在时增强NF-κB信号传导，但在高水平的cFLIP存在时不增强信号传导(图5i)，这证实了TRAF2和cFLIP在LILRB3信号传导中的协同作用。
当过表达TRAF2或cFLIP的THP-1细胞与经活化的T细胞共培养时，T细胞的细胞毒性显著降低(图S4d-e)。在TRAF2或FLIP在THP-1细胞中过表达的情况下，经活化的T细胞在涂覆有抗LILRB3和涂覆有IgG的板中杀伤相同百分比的THP-1细胞(图5j)。这些结果表明，LILRB3通过TRAF2和FLIP保护AML细胞免受T细胞杀伤。胱天蛋白酶8可以诱导细胞凋亡，并且抑制坏死性凋亡(Fritsch等人,2019)，并且细胞凋亡不诱导免疫应答，并且坏性状凋亡引起免疫应答(Bertheloot等人,2021)。用固定化的抗LILRB3处理的THP-1细胞降低磷酸化的MLKL(坏死性凋亡的介导子)，这表明LILRB3信号传导抑制坏死性死亡并降低免疫应答(图S4f)。
用抑制剂QNZ阻断THP-1细胞中的NF-κB信号传导部分地消除了LILRB3对THP-1细胞的存活的影响(图S4g)。这一结果加强了发明人的发现，即LILRB3至少部分通过刺激NF-κB信号传导增强AML细胞存活率。
LILRB3在NF-κB超活化时抑制NF-κB信号传导。接下来，发明人的目标是鉴定LILRB3作为抑制性受体的情况。在LPS水平相对高(200μg/L)的情况下，固定化的抗LILRB3对THP-1细胞中的LILRB3信号传导的活化导致对NF-κB报告基因活性的抑制(图6a)，以及磷酸化p65的水平下降(图6b)。
SHP-1和SHP-2介导了LILRB的抑制作用(Kang等人,2016)。在稳定表达LILRB3的THP-1细胞中，LILRB3与内源性SHP-1和SHP-2免疫共沉淀(图6c)。为了鉴定介导相互作用的LILRB3 ITIM，发明人制备了一种用于表达在N末端处与紧密连接蛋白CAR(Wu和Zhang,2020)的胞外结构域融合并且在C末端与hFc(CARECD-B3ICD-hFc)融合的LILRB3的跨膜结构域和胞内结构域的载体。发明人预期，嵌合蛋白的CAR胞外结构域的同种相互作用将增强LILRB3聚集，以促进受体的活化。当此融合蛋白在293T细胞中与SHP-1和Lyn(LILRB ITIM磷酸化所需的Drc样激酶)(Pereira和Lowell,2003)异位共表达时，发明人发现LILRB3主要通过C末端最后两个ITIM与SHP-1相互作用(图6d)。
接下来，发明人进行了研究，以表征在SHP-1和SHP-2缔合的情况下LILRB3对NF-κB信号传导的影响。在存在或不存在Lyn的情况下，将CARECD-B3ICD和对照CARECDTM(具有LILRB3胞内结构域缺失的CARECD-B3ICD)与SHP-1或SHP-2、NF-κB报告基因和tet-on cFLIP一起共转染。在0.4μg/ml dox处理下，CARECD-B3ICD在没有Lyn的情况下增强NF-κB报告基因活性，而当Lyn在存在SHP-1或SHP-2的情况下表达时，抑制NF-κB报告细胞活性(图6e)。
将用于表达具有不同ITIM突变的CARECD-B3ICD或CARECDTM的载体共转染到外源地表达了TLR4、CD14和MD2的293T细胞中(Medvedev和Vogel,2003)。这使得细胞能对LPS处理作出应答。在存在SHP-1的情况下，野生型CARECD-B3ICD显著抑制LPS刺激的NF-κB，而具有双ITIM突变的Y596/626F和具有四个ITIM突变的Y4xF使抑制作用被恢复(图6f)。
在NF-κB信号传导高度活跃时观察到高水平的全长cFLIP可以抑制胱天蛋白酶8活性(Hughes等人,2016；Chang等人,2002；Micheau等人,2001)。事实上，发明人发现全长cFLIP或p22-FLIP与CARECD-B3ICD在293T细胞中的共表达阻断被LILRB3增强的NF-κB活化(图6g)。全长cFLIP的过表达还抑制在涂覆了抗LILRB3抗体的板中培养的THP-1细胞中的NF-κB活化(图6h)。
此外，高LPS刺激显著降低TRAF2和LILRB3在THP-1细胞中的缔合(图6i)。A20(也被称为TNFAIP3)，作为NF-κB信号传导的负反馈调节器作用的蛋白质(Shembade和Harhaj,2012)，介导TRAF2降解(Li等人,2009)。已知与TRAF2(Song等人,1996)缔合的A20 N末端(氨基酸1-386)与HA-TRAF2和CARECD-B3ICDhFc、B3ICDhFc或CARECDTMhFc异位表达。A20的N末端片段破坏通过CAR胞外结构域的相互作用聚集的TRAF2与CARECD-B3ICDhFc之间的相互作用。然而，其并没有显著影响不交联的TRAF2与B3ICDhFc的缔合(图6j)。此外，A20 N末端片段与CARECD-B3ICD在293T细胞中的共表达破坏LILRB3对NF-κB信号传导的积极影响(图6k)。
在THP-1细胞中，LILRB3在低浓度的LPS的情况下增强NF-κB信号传导，但在高水平的LPS的情况下抑制NF-κB信号传导(图6l)。当LPS的浓度低时，胱天蛋白酶8抑制剂z-VAD-FMK阻断LILRB3诱导的NF-κB。然而，在高浓度的LPS下在存在z-VAD-FMK的情况下，固定化的抗LILRB3对LILRB3的活化会抑制NF-κB信号传导(图6l)。有趣的是，当SHP-1/2和TRAF2在293T细胞中共同过表达时，能够同时与LILRB3结合(图6m、n)。
在正常人单核细胞中，NF-κB靶基因的表达在用固定化的抗LILRB3处理5小时后显著升高，并且在处理24小时后，特别是在存在高水平的LPS的情况下，显著降低(图6o)。这一结果表明，相对长期的LILRB3活化在正常单核细胞中产生了抑制作用，这可能是由于cFLIP(Micheau等人,2001)和A20(Shembade*Harhaj,2012)的表达增加引起的，所述增加的表达阻断LILRB3阳性信号传导。然而，THP-1AML细胞可以将抗LILRB3抗体活化的NF-κB信号传导维持长达2天(图S5a)。一种可能的解释是相比于正常单核细胞的表达，AML细胞表达更高水平的TRAF2(图S5b)。
与此一致的是，当用LPS对有免疫能力的小鼠进行处理时，具有全长LILRB3的表达MLL-AF9的小鼠AML细胞导致白血病发展减缓，而以LILRB3胞内结构域截断为特征的AML发展在LPS处理的情况下未改变(图S5c-d)。综上所述，这些结果表明，LILRB3/TRAF2/cFLIP回路维持平衡的NF-κB信号传导(图S5e)。
LILRB3阻断抗体抑制AML进展。为了开发完全人抗LILRB3阻断抗体，发明人对高度多样化的天然scFv噬菌体文库使用了更加严格的顺序淘选轮次，以选择LILRB3-ECD结合的噬菌体(图S6a)。将独特的scFv序列转化为完全人源化IgG模式(图S6a)。62种独特的IgG中的五十种与细胞上的LILRB3结合(图S6a)。三十种对LILRB3具有高亲和力，如通过ELISA证实的(图S6b-c)。将这些IgG通过基于Octet的表位分箱测定分组到三个LILRB3表位箱(图7a)。仅第三个箱中的IgG(1号和26号)能阻断MLL-AF9细胞的集落形成(图7b)。对每个表位箱中的选定IgG的亲和力进行了评估(图S6d、图7c)。抗体1号和26号两者都对LILBR3具有特异性(图S6e-f)。由于IgG 1号比26号具有更高的亲和力(图7c)，因此生产了这种抗体。这种IgG 1号抗体在Fc糖基化N297A突变或LALAPG突变的情况下进一步开发，所述突变具备有缺陷的Fc介导的效应功能(Tao和Morrison,1989；Hristodorov等人,2013；Lo等人,2017)。
将抗LILRB3 1号N297A注射到移植了表达B3-FL或B3delICD的MLL-AF9 AML细胞的有免疫能力的小鼠中。与用对照IgG注射相比，抗LILRB3 1号N297A显著延缓了表达LILRB3的AML的发展(图7d、e)。相比之下，用抗LILRB3 1号N297A和对照IgG处理的小鼠的B3delICD AML发展无可检测到的差异(图7d、e)。此外，抗LILRB3 1号N297A降低B3-FL而非B3delICD AML细胞的CFU形成(图7f)。用抗LILRB3 1号N297A处理并没有减少表达了不能与TRAF2相互作用的突变型LILRB3的AML细胞的CFU形成(图S6g)。在向接受者有免疫能力的小鼠注射抗mCD8以耗竭小鼠CD8 T细胞时，抗LILRB3 1号(具有LALAPG突变体)对具有B3-FL的AML的抗AML作用减弱(图7g、h)。这表明阻断LILRB3信号传导增强了T细胞对AML细胞的杀伤。发明人还向AML有免疫能力的小鼠注射了抗LILRB3 6号抗体，所述抗体不可以抑制LILRB3信号传导(图7b)。抗LILRB3 6号以相似的功效抑制具有B3-FL的AML和具有B3del ICD的AML两者的进展(图S6h-i)。这一结果表明，Fc介导的功能，包括抗体依赖性细胞毒性，在不涉及LILRB3信号传导的情况下，有助于抗LILRB3的抗AML作用。
与对照相比，用抗LILRB3 1号N297A对异种移植了THP-1细胞的NSG小鼠的处理也显著延缓了白血病发展(图7i、j)。用抗LILRB3 1号N297A处理的NSG小鼠中，THP-1细胞中的LILRB3信号传导降低(图S6j)。
在Molm13 AML细胞移植后四天，发明人向NSG小鼠注射了活化的人T细胞(图7k)。第8天时注射了抗LILRB3 1号N297A和对照IgG。白血病进展在抗LILRB3处理后明显比IgG处理后慢。经抗LILRB3处理的小鼠之一的白血病很大程度上消除了(图7k、l)。然而，在这些条件下，抗LILRB3对没有注射T细胞的小鼠显示出很少作用(图7k-m)，这表明抗LILRB3 1号N297A增强T细胞的抗AML活性。经抗LILRB3处理的小鼠的T细胞明显多于经IgG处理的小鼠的T细胞(图7n)。
在M5 AML患者源性异种移植物模型中进一步测试了抗LILRB3抗体处理的功效。如通过流式细胞术分析显示的，LILRB3在所植入NSG小鼠的骨髓中的AML细胞上表达(图8a)。用抗LILRB3 1号N297A处理过的小鼠在外周血、骨髓、脾脏和肝脏中的AML负荷明显低于用IgG处理的小鼠的负荷(图8b)。抗LILRB3处理还提高了NSG小鼠中的人类自体T细胞的百分比(图8c)。与用对照组IgG处理的小鼠相比，用抗LILRB3处理的小鼠具有显著的存活优势(图8d)。为了进一步剖析抗LILRB3的细胞自主效应和免疫效应用，在用IgG或抗LILRB3 1号LALAPG处理后向NSG小鼠移植单核AML细胞(源自植入有单核细胞AML患者外周血样品的NSG小鼠的BM)(图8e-i)。然后向NSG小鼠注射经活化的人T细胞或PBS。抗LILRB3 1号LALAPG显著降低此模型中的AML发展，并且经活化的人T细胞移植增强了抗LILRB3 1号LALAPG的抗AML作用(图8e-i)。这些结果表明，抗LILRB3的抗AML功效是由于肿瘤特异性T细胞的活性增强和直接杀伤白血病的组合作用的结果。
最后，发明人开发了髓系LysM-Cre驱动的LILRB3转基因C57BL/6小鼠(图S7a-c)。转基因LILRB3在髓系细胞上表达。用抗LILRB3 1号N297A抗体对这些小鼠进行处理不影响正常血生成和白细胞增多(图S7a-c)，这表明抗LILRB3 1号N297A的毒性低。
实施例3-讨论
在此，发明人证明了，在AML细胞上表达的LILRB3通过募集TRAF2和cFLIP刺激NF-κB信号传导，并且这种NF-κB信号传导的上调增强了AML细胞的存活率并且抑制了T细胞的抗白血病活性。发明人还开发了一种与LILRB3结合并抑制AML进展的阻断抗体。此外，发明人表明，NF-κB信号传导的过度活化导致负面反馈和LILRB3抑制性信号传导的主导。
ITIM是LILRB中唯一已知的信号传导基序；向经活化的ITIM募集磷酸酶SHP-1或SHP-2导致信号传导抑制(Kang等人,2016)。在此，发明人证明了LILRB3也可以通过与TRAF2和cFLIP相互作用而起到活化受体的作用。未配体的LILRB3与TRAF2组成性地缔合。在LILRB3通过配体结合活化后，cFLIP被募集到LILRB3/TRAF2复合物上，从而引起NF-κB活化。经活化的LILRB3还募集SHP-1或SHP-2以抑制包括NF-κB通路在内的下游信号传导。发明人表明，在某些条件下，LILRB3、TRAF2、cFLIP、SHP-1和SHP-2存在于同一复合物中。然而，高水平的NF-κB活化可以产生多个负反馈信号，包括介导TRAF2降解的A20上调(Shembade和Harhaj,2012)。这进而使LILRB3/TRAF2相互作用不稳定性；因此，由SHP-1/2启动的抑制性信号传导成为主导。
有人提出，含ITIM的抑制受体的活性需要含ITAM的受体(Dietrich等人,2001)，而含ITIM的受体不能自行活化，而是需要与活化受体相互作用。当含有ITAM的活化受体被活化时，其ITAM募集Src酪氨酸激酶(Dietrich等人,2001)，所述酪氨酸激酶磷酸化并且由此活化附近的抑制受体的ITAM。此模型解释了T细胞和B细胞中的TCR、BCR、FcR偶联的LILRB信号传导。然而，在单核细胞中，没有与ITAM受体交联的LILRB4簇本身可以诱导SHP-1募集(Cella等人,1997)。在此，发明人的新颖发现，即LILRB3可以募集TRAF2和cFLIP以活化NF-κB，进一步表明LILRB可以介导ITAM无关的信号传导。
LILRB3对NF-κB信号传导的刺激作用和抑制作用的平衡在不同的细胞类型中可能有所不同。发明人推测，在正常单核细胞中LILRB3的抑制性信号传导占主导地位。相反，AML细胞具有异常高的表达的TRAF2(Sawanobori等人,2003)倾向于更积极的信号传导。这通过提供存活因素和免疫抑制来支持肿瘤发展。
LILRB已显示出对白血病进展至关重要10,16,18,63。不同LILRB的胞内结构域不同(Li等人,2019)，这表明这些受体介导不同的下游信号传导事件。在目前的研究中，发明人发现，在被评估的LILRB中，仅LILRB3募集TRAF2。TRAF2可以通过SKEE样基序被TNFR亚家族特异性募集(Rodriguez等人,2011)。有趣的是，发明人鉴定了LILRB3的细胞内结构域中对于与TRAF2结合至关重要的基序为VQEE。在没有活化的情况下，TRAF2以相对低的亲和力与TNFR家族成员结合(Ye和Wu,2000)。然而，LILRB3与TRAF2组成性地结合。
由于AML细胞中的LILRB3介导的信号传导支持这些白血病细胞的存活并且抑制细胞毒性T细胞的活性，因此开发可以阻断AML发展的抗LILRB3拮抗抗体是期望的。在此，发明人使用功能测定来筛选噬菌体文库，并且鉴定出表现出抗AML功效的抗LILRB3拮抗抗体。缺乏PirB的小鼠，即LILRB3的小鼠同源物，的血生成总体正常(Syken等人,2006；Takai等人,2011)；因此，靶向LILRB3可能以低毒性有效地阻断AML发展。这项研究可以导向一种将靶向疗法和免疫疗法组合以治疗AML和其它类型的癌症的新策略的发展。
表1：LILRB3抗体-重链CDR的DNA序列
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表2：LILRB3抗体-轻链CDR的核酸序列
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表3：LILRB3抗体-重链CDR的氨基酸序列
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表4：LILRB3抗体-轻链CDR的氨基酸序列
表5：LILRB3抗体-重链的DNA序列
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根据本公开，无需过度实验即可以制备和执行本文所公开和要求保护的所有方法。虽然已经根据优选实施例描述了本公开的组合物和方法，但是对于本领域的技术人员来说将显而易见的是，在不脱离本公开的概念、精神和范围的情况下，可以对所述方法以及本文所描述的方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地，将显而易见的是，化学和生理学相关的某些药剂可以取代本文所述的药剂，同时将实现相同或类似的结果。对于本领域的技术人员来说显而易见的是，所有此类类似的取代和修改都被视为处于由所附权利要求限定的本公开的精神、范围和概念内。
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以下参考文献就其为本文所阐述的彼等提供示例性程序性或其它细节补充的程度而言，通过引用明确地并入本文。
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<220>
<223> 合成抗体
<400> 90
ggtgggtcct tcagtggtta ctac 24
<210> 91
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 91
gcgagaggcc tcctgtatag cagtggtttt gactac 36
<210> 92
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 92
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<210> 93
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 95
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<223> 合成抗体
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<220>
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<223> 合成抗体
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 合成抗体
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成抗体
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 114
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 115
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 116
agcagtgacg ttggtggtta taactat 27
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<220>
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<220>
<223> 合成抗体
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cagagcatta gcagctat 18
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成抗体
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成抗体
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 124
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 125
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 126
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 127
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 128
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 129
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<210> 130
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 130
agcagtgacg ttggtggtta taactat 27
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 131
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<210> 132
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 132
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 133
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<210> 134
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 134
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 135
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<210> 136
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<210> 138
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 138
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<210> 139
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 139
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<210> 141
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 141
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<210> 142
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 142
cagagcatta gcaactat 18
<210> 143
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 143
caacagagtt acagtacccc cacc 24
<210> 144
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 144
agctccaaca ttgggaagaa ttat 24
<210> 145
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 145
ggagcttggg atagcagcct gagtgcttat gtc 33
<210> 146
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 146
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<210> 147
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 147
agctcatatg caggcagcaa caatataaat tatgtc 36
<210> 148
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 148
cagagcatta gcagctat 18
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 149
caacagagtt acagtacccc cact 24
<210> 150
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 150
agctccaaca ttgggaagaa ttat 24
<210> 151
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 151
ggagcttggg atagcagcct gagtgcttat gtc 33
<210> 152
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 152
cagagcatta gcagctct 18
<210> 153
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 153
cagcagagtt tcagtagccc cacc 24
<210> 154
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 154
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<210> 155
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 155
caacagagtt acagtacccc gctcact 27
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<210> 158
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 158
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 159
caacaatata atggttaccc tact 24
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
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<223> 合成抗体
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成抗体
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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caacaggcta acagtttccc gatcacc 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 166
agcagtgacg ttggtggtta taactat 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 167
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 170
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<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 171
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 172
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 174
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 176
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1 5 10 15
Val
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 177
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 178
Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 179
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala
1 5 10
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 181
Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 182
Ala Arg Ala Leu Ala Gly Ile Asp Gly Phe Asp Val
1 5 10
<210> 183
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 183
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala
1 5 10
<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 184
Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 185
Ala Arg Val Ser Pro Gly Leu Ala Phe Asp Ile
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 186
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala
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<210> 187
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<223> 合成抗体
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 188
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 189
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<223> 合成抗体
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<220>
<223> 合成抗体
<400> 192
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala
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<223> 合成抗体
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<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<223> 合成抗体
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<223> 合成抗体
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<223> 合成抗体
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<220>
<223> 合成抗体
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<223> 合成抗体
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<220>
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<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
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<223> 合成抗体
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<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<223> 合成抗体
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<223> 合成抗体
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<223> 合成抗体
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<220>
<223> 合成抗体
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<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<220>
<223> 合成抗体
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<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 224
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Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 225
Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<400> 233
000
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
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<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 245
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<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<211> 6
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 262
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 263
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Ser His Val Val
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 264
Gln Ser Ile Ser Lys Tyr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 265
Gln Glu Lys Asp Asn
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 266
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 267
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Gln Gly Thr
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 268
Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 269
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Tyr Thr
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 270
Ser Ser Thr Ile Gly Thr Asn Pro
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<210> 271
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 271
Ala Thr Leu Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val
1 5 10
<210> 272
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 272
Thr Ser Asn Ile Arg Gly Asn Thr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 273
Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val
1 5 10
<210> 274
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 274
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 275
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr His Ile Thr
1 5
<210> 276
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 276
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 277
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 277
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
1 5
<210> 278
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 278
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 279
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 279
Cys Gln Gln Ser Leu Gln Val Pro Leu Arg Gly Thr
1 5 10
<210> 280
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 280
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 281
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 282
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
1 5
<210> 283
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 283
Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 284
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 284
Gln Ser Ile Gly Thr Trp
1 5
<210> 285
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 285
Gln Gln Tyr Asn Leu Tyr Ser Arg Thr
1 5
<210> 286
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 286
Gln Ser Leu Leu Gln His Asn Gly Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 287
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 287
Met Gln Ala Leu His Ser Pro Thr
1 5
<210> 288
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 288
Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 289
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 289
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Thr
1 5
<210> 290
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 290
Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn Tyr
1 5
<210> 291
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 291
Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val
1 5 10
<210> 292
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 292
Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr Lys Ser
1 5
<210> 293
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 293
Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Ile Asn Tyr Val
1 5 10
<210> 294
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 294
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 295
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 295
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 296
Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn Tyr
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<210> 297
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 297
Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val
1 5 10
<210> 298
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 298
Gln Ser Ile Ser Ser Ser
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 299
Gln Gln Ser Phe Ser Ser Pro Thr
1 5
<210> 300
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 300
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 301
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 301
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 302
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 302
Gln Ser Val Ser Asn Asn
1 5
<210> 303
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 303
Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Ser
1 5
<210> 304
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 304
Glu Ser Phe Ser Thr Trp
1 5
<210> 305
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 305
Gln Gln Tyr Asn Gly Tyr Pro Thr
1 5
<210> 306
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 306
Gln Gly Ile Arg Asn Asp
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 307
Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Pro Asp Val
1 5 10
<210> 308
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 308
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 309
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 309
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 310
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 310
Gln Gly Ile Ser Arg Trp
1 5
<210> 311
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 311
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 312
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 312
Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5
<210> 313
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 313
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Pro Leu Ile Ser
1 5 10
<210> 314
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 314
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcattt atacggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaagccggg 300
ttcagtggct ggtactacta cggtatggac gtctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360
tcttca 366
<210> 315
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 315
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aataattatg cagtgtctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgcc 300
agagctttgg ctgggattga tggttttgat gtatggggcc aagggaccac ggtcagcgtc 360
tcttca 366
<210> 316
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 316
gaagtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggcgaa 300
acagggaggt tcggggagtt aatacggggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctctt ca 372
<210> 317
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 317
gaagtgcagc tggtgcagtc tgggggaggt gtggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctctggt attaattgga atggtggtag cacaggttat 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttgt attactgtgc gagagagggc 300
catgtgtctg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 318
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 318
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aataattatg cagtgtctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgcc 300
agagctttgg ctgggattga tggttttgat gtatggggcc aagggaccac ggtcagcgtc 360
tcttca 366
<210> 319
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 319
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agagtgtcgc cggggcttgc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360
tca 363
<210> 320
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 320
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agacgggggg aatacggaat ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctct 360
tca 363
<210> 321
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 321
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agagattata cggttcgggg agcgtctctc tactactacg gtatggacgt ctggggccaa 360
gggaccacgg tcaccgtctc ttca 384
<210> 322
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 322
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agagatagga gtgtaggcag catagagaca aggtactact actactacgg tatggacgtc 360
tggggccaag ggaccacggt cagcgtctcc tca 393
<210> 323
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 323
caggtacagc tgcagcagtt aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agactccgct cctatggtga tgatgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 324
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 324
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagcaccg 300
gtcgggtgta gtagtaccag ctgctatact tggggctact actactacgg tatggacgtc 360
tggggccaag ggaccacggt caccgtctct tca 393
<210> 325
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 325
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agagcccgat acgcatcctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac tgtctcctca 360
<210> 326
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 326
caggtgcaga tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gaccactacc tgagctggat ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attgatcttt ctggtagtac cgtatactac 180
ggagactctg tgaagggtcg atttaccatc tccagggaca acgccaggaa ctcagtatac 240
ttgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaggggtcac 300
tacggtttgg acgtctgggg ccaagggaca atggtcaccg tctcttca 348
<210> 327
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 327
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatgggac 300
agtggcgtcc gggtctacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 328
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 328
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatgggac 300
agtggcgtcc gggtctacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 329
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 329
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggctgg 300
aactggttcg acccctgggg ccagggaaca atggtcatcg tctcctca 348
<210> 330
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 330
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagattcg 300
cgagtaaagc agtggcaggc acatgatgct tttgatatct ggggccaagg gacaatggtc 360
accgtctctt ca 372
<210> 331
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 331
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
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aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agactccgct cctatggtga tgatgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 332
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 332
caggtgcttc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagattgg 300
gggcgtttgg ggtactgggg ccagggaacc acggtcaccg tctcttca 348
<210> 333
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 333
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agactccgct cctatggtga tgatgctttt gatatctggg gccaagggac cacggtcacc 360
gtctcttca 369
<210> 334
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 334
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggcctcctg 300
tatagcagtg gttttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 335
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 335
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga caatctctct agggacactg ctgcttggaa ttggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
caattctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgcg 300
agaagtatag gaggttttga ctattggggc cagggaacca tggtcaccgt ctcttca 357
<210> 336
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 336
caggtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 180
gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccacg 300
tatagtggtt atttaggcta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ctca 354
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 337
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
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cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cacttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成抗体
<400> 338
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acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
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ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
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tatagcagtg gtctcgacaa ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ttca 354
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成抗体
<400> 339
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 340
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ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttgt attactgtgc gagagatcag 300
ttcttggctt ttgatatctg gggccaaggg accacggtca tcgtctcctc a 351
<210> 341
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 341
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Gly Phe Ser Gly Trp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 342
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 342
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asn Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Ala Gly Ile Asp Gly Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Ser Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 343
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 344
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 345
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asn Tyr Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Ala Gly Ile Asp Gly Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Ser Val Ser Ser
115 120
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 346
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
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Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
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100 105 110
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 347
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
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Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
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Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
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115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 348
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
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65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 349
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
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Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ser Val Gly Ser Ile Glu Thr Arg Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ser
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 350
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 350
Gln Val Gln Leu Gln Gln Leu Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
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Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
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Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
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115 120
<210> 351
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 351
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
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Val Ser Ser
130
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 352
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
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Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 353
Gln Val Gln Met Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Asp Leu Ser Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 354
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
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100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 355
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
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65 70 75 80
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100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 356
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 356
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Ile Val Ser Ser
115
<210> 357
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 357
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120
<210> 358
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 358
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
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Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
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100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 359
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 359
Gln Val Leu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
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<210> 360
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 360
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 361
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 362
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 362
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Asn Leu Ser Arg Asp
20 25 30
Thr Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ile Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 363
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 363
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Tyr Ser Gly Tyr Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 364
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 364
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Ile Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
His Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Leu Arg Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 365
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 365
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Leu Tyr Ser Ser Gly Leu Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 366
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 366
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Arg Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Val Gly Gly Ala Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser
115 120
<210> 367
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 367
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Phe Leu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Ile Val Ser Ser
115
<210> 368
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 368
gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagactcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc acttatttaa attggtatca acaaaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttactt ctgtcagcag agttacggtc tccccctcac tttcggcgga 300
gggaccaaag tggatatcaa a 321
<210> 369
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 369
cagcctgtgc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcac tttttgggtg 300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta 330
<210> 370
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 370
gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagttc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaag tataacagtg cccctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 371
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 371
cagtctgccc tgaatcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag ctcccatgtg 300
gtattcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 372
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 372
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcct ctgtaggaga cagaatcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aaatatttaa attggtatca acaaaagcca 120
ggagaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg ggtcccatcc 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttatta ttgtcaagag aaggacaatt ttggccaggg gaccaagctg 300
gagatcaaa 309
<210> 373
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 373
aacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccaagggac gttcggccaa 300
gggaccaaag tggatatcaa a 321
<210> 374
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 374
aacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attacacttt tggccagggg 300
accaagctgg agatcaaa 318
<210> 375
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 375
cagcctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caccatcgga actaatcctg taaactggta ccggcacctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgagtct ctggctccaa gtccggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca acattggatg acagcctgaa tggttatgtc 300
ttcggaactg ggacccagct gaccgtccta 330
<210> 376
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 376
cagcctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcacctc caacatcaga ggtaatactg taaactggta ccaacaactc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aataataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctattta ttactgtgga gcatgggatg acagcctgaa tggtcctgtc 300
ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta 330
<210> 377
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 377
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccacatcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggacattaa a 321
<210> 378
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 378
aacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tcccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggatatcaa a 321
<210> 379
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 379
aacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatgca tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg 180
ttcagcggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct gcagcctgaa 240
gattttgcaa cttactattg tcaacaggct aacagtttcc ctccgacgtt cggccaaggg 300
accaaggtgg agatcaaa 318
<210> 380
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 380
aacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atctcttgcc gggccagtca gagtattggt acgtggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctcaactcct gatctataag gcgtctagtc tacatagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacctatta ttgccaacag tataatcttt attctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 381
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 381
gatattgtga tgacccagtc tccactctcc ctggccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcttgca cgtctagtca gagcctcctg caacataacg gatacaacta tttggattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ttttgggctc tactcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtgccagt ggatcaggca cggattttac actgaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggagta tattattgca tgcaagctct acatagtccg 300
acgttcggcc aagggaccaa ggtggagatc aaa 333
<210> 382
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 382
gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aactatttaa attggtatca acagaaacca 120
gggacagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg ctacttacta ctgtcaacag agttacagta cccccacctt cggccaaggg 300
acacgactgg agattaaa 318
<210> 383
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 383
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggacc cagggcagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aagaattatg tatcgtggta tcagcagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacgataata ggcgactctc agggactcct 180
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actggggacg aggccgatta ttactgcgga gcttgggata gcagcctgag tgcttatgtc 300
ttcggaactg ggaccacggt gaccgtcctg 330
<210> 384
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 384
cagtctgtgc tgactcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaattagcag tgacattggt ggttataagt ctgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaagcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccgt ctctggcctc 240
caggctgaag atgaggctga ttattactgc agctcatatg caggcagcaa caatataaat 300
tatgtcttcg gaactgggac ccagctgacc gtccta 336
<210> 385
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 385
gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccccacttt cggcggaggg 300
accaagctgg agatcaaa 318
<210> 386
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 386
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggacc cagggcagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aagaattatg tatcgtggta tcagcagctc 120
ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacgataata ggcgactctc agggactcct 180
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actggggacg aggccgatta ttactgcgga gcttgggata gcagcctgag tgcttatgtc 300
ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta 330
<210> 387
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 387
aacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
attacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctctttaa attggtatgc gcagaaacca 120
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acacgactgg acattaaa 318
<210> 388
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 388
gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 389
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 389
gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtcggcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcgtcagc aacaatttaa attggtatca gcagaaaacg 120
ggaaaagccc ctaagctcct gatctctgcc gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatta 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gacgattatg caacttacta ctgtcaacag agttacagta tctcgttcgg ccaggggact 300
acagtggata tcaaa 315
<210> 390
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 390
gccatccgga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgctt ctgtaggaga cacagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtga gagttttagt acctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatagg gcgtctactt tacaaagtgg ggtcccgtca 180
agattcagcg gccataaatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg cgacttatta ttgtcaacaa tataatggtt accctacttt cggcggaggg 300
accaaggtgg aaatcaaa 318
<210> 391
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 391
aacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120
gggacagccc ctaagcgcct aatctatgct gcatccaatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg cgacttatta ctgtctacag cataatagtt accctcccga cgtttcggcc 300
agggggacca aagtggatat caaa 324
<210> 392
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 392
gccatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 393
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 393
gacgtccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agatggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctacgaa gtatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tggggctgat ttcactctca ccatcagtag cctgcagcct 240
gaagattatg gaacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tcccgatcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa a 321
<210> 394
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 394
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggta aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag ccctccctta 300
atctctatcg gaactgggac caaggtcacg gtccta 336
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 395
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1 5 10 15
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20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
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1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 397
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
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65 70 75 80
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 398
Gln Ser Ala Leu Asn Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
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<220>
<223> 合成抗体
<400> 399
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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100
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 400
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<220>
<223> 合成抗体
<400> 401
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<220>
<223> 合成抗体
<400> 402
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<220>
<223> 合成抗体
<400> 403
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 404
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 405
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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100 105
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 406
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 407
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 408
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 409
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 410
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 411
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Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ile Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 412
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成抗体
<400> 413
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 414
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<211> 107
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 415
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 416
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<220>
<223> 合成抗体
<400> 417
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<220>
<223> 合成抗体
<400> 418
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 419
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 420
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成抗体
<400> 421
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<211> 21
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 422
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<210> 423
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 423
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<210> 424
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 424
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<210> 425
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 425
ttcaacagga gtgacaccag 20
<210> 426
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 426
gaatcaccag cagcaagtg 19
<210> 427
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 427
cttcggagtt tgggtttg 18
<210> 428
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 428
ttgtgcgtct cctcagtaaa 20
<210> 429
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 429
caagtgaaac ctccaaccc 19
<210> 430
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 430
cattgaggag gattgccaaa 20
<210> 431
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 431
acaaactgga tgtcgctgg 19
<210> 432
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 432
acgctcttct gcctgct 17
<210> 433
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 433
gcttgagggt ttgctacaa 19
<210> 434
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 434
tggcttatta cagtggcaat g 21
<210> 435
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 435
tggtggtcgg agattcgt 18
<210> 436
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 436
ctttctgctg acatcgcc 18
<210> 437
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 437
gtctgccgta ggttgttgta 20
<210> 438
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 438
acgcagacat cgtcatcc 18
<210> 439
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 439
caaaccgagt tggaaccac 19
<210> 440
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 440
catacttacc cacttcaagg g 21
<210> 441
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 441
ttgtagccat agtcagcatt gt 22
<210> 442
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 442
gatggggtct tcatctg 17
<210> 443
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 443
cgtaggtgga tgcctcc 17
<210> 444
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 444
Arg Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Val Gln Glu Glu Asn Leu Tyr Ala
1 5 10 15
Ala Val Lys Asp Thr
20
<210> 445
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 445
Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln Glu Glu Asn Leu Tyr Ala
1 5 10 15
Ala Val Lys His Thr
20
<210> 446
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 446
Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln Glu Glu Asn Leu Tyr Ala
1 5 10 15
Ala Val Lys Asp Thr
20
<210> 447
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 447
Arg Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Val Gln Gly Glu Asn Phe Cys Ala
1 5 10 15
Ala Val Lys Asn Thr
20
<210> 448
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 448
Lys Arg Ala Ser Pro Val Ala Asp Ile Gln Glu Glu Ile Leu Asn Ala
1 5 10 15
Ala Val Lys Asp Thr
20

Claims (80)

1.一种鉴定LILRB3活化的调节剂的方法，所述方法包括：
(a)使报告细胞与半乳凝素-4和候选物质接触，其中所述报告细胞表达具有LILRB3的外部结构域的嵌合受体；以及
(b)检测所述报告细胞中的受体活化的水平，其中所述受体活化的水平相比于对照水平的变化表明，所述候选物质为LILRB3活化的调节剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为小鼠T细胞杂交瘤细胞。
3.根据权利要求1至2所述的方法，其中所述受体包含配对免疫球蛋白样受体β(PILRβ)的胞内结构域。
4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述受体是在所述细胞中通过病毒表达载体表达的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述病毒表达载体为逆转录病毒表达载体。
6.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述报告细胞表达报告基因，所述报告基因编码可检测的标记并且与通过所述受体的活化所调节的启动子可操作地连接。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述启动子为经活化的T细胞核因子(NFAT)启动子。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述启动子为诱导型启动子、组织特异性启动子或组成型启动子。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述可检测标记为比色标记、荧光标记、生物发光标记或化学发光标记。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述可检测标记为GFP、YFP、RFP或D-荧光素。
11.根据权利要求6所述的方法，其中检测步骤包括流式细胞术分析或对发光的定量。
12.根据权利要求1至11所述的方法，其中所述候选物质为抗体。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或scFv。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
15.根据权利要求1至14所述的方法，其中所述对照水平是在所述报告细胞与半乳凝素-4接触时在所述报告细胞中获得的。
16.根据权利要求1至15所述的方法，其中所述受体活化的水平相比于所述对照水平的提高表明，所述调节剂为激动剂。
17.根据权利要求1至15所述的方法，其中所述受体活化的水平相比于所述对照水平的降低表明，所述调节剂为拮抗剂。
18.根据权利要求1至17所述的方法，其中所述候选物质与底物连接。
19.根据权利要求1至18所述的方法，其中所述候选物质与表达FcR的细胞连接。
20.一种组合物，其包含：
候选LILRB3调节剂；
半乳凝素-4；以及
报告细胞，所述报告细胞表达具有LILRB3的胞外结构域的嵌合受体，其中所述报告细胞具有指示受体活化的表型。
21.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：重链(HC)可变区(VH)和轻链(LC)可变区(VL)，所述VH和所述VL包含如表3和4中所示的克隆配对的CDR序列；以及其变体，其中所述HC-CDR和/或所述LC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
22.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体为鼠类抗体、啮齿动物抗体、兔抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
23.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为重组ScFv(单链片段可变)抗体、Fab片段、F(ab′)2片段或Fv片段。
24.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体为人抗体。
25.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中VH链和VL链具有分别与附录II和IV的克隆配对的序列至少90％或95％相同的氨基酸序列。
26.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中VH链和VL链由分别与附录I和III的克隆配对的序列至少80％或90％相同的核酸序列编码。
27.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中VH链和VL链具有分别与附录II和IV的克隆配对的序列相同的氨基酸序列。
28.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中VH链和VL链由分别与附录I和III的克隆配对的序列相同的核酸序列编码。
29.根据权利要求21至28所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体为人源化抗体。
30.根据权利要求21至28所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为嵌合抗体。
31.根据权利要求21至30所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其诱导LILRB3的活化。
32.根据权利要求21至30所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其抑制LILRB3的活化。
33.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与根据权利要求21至32中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争同一表位。
34.一种药物组合物，其包含根据权利要求21至33中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
35.一种分离的核酸，其编码根据权利要求21至33中任一项所述的分离的单克隆抗体。
36.一种载体，其包含根据权利要求35所述的分离的核酸。
37.一种宿主细胞，其包含根据权利要求36所述的载体。
38.根据权利要求37所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
39.根据权利要求37所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为CHO细胞。
40.一种杂交瘤或经工程化的细胞，其编码和/或产生根据权利要求21至33中任一项所述的分离的单克隆抗体。
41.一种产生抗体的方法，所述方法包括在适于表达所述抗体的条件下培养根据权利要求37所述的宿主细胞，以及回收所述抗体。
42.一种嵌合抗原受体(CAR)蛋白，其包含根据权利要求21至33中任一项所述的抗原结合片段。
43.一种分离的核酸，其编码根据权利要求42所述的CAR蛋白。
44.一种载体，其包含根据权利要求43所述的分离的核酸。
45.一种经工程化的细胞，其包含根据权利要求43所述的分离的核酸。
46.根据权利要求45所述的经工程化的细胞，其中所述细胞为T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
47.一种治疗受试者的癌症或改善受试者的癌症的效应的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求21至33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求45或46所述的经工程化的细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法减少或根除所述受试者的肿瘤负荷。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法减少肿瘤细胞的数量。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法减小肿瘤大小。
51.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法减少或预防肿瘤转移。
52.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法根除所述受试者的肿瘤。
53.根据权利要求47所述的方法，其中所述癌症为实体癌。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述实体癌选自由以下组成的组：肾上腺癌、胆管癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、结直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌(merkel cellcancer)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、松果体瘤、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌和阴道癌。
55.根据权利要求47所述的方法，其中靶向单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞和其它髓系细胞、髓系源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和其它免疫抑制髓系细胞。
56.根据权利要求47所述的方法，其中所述癌症为血液系统恶性病。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述血液系统恶性病选自由以下组成的组：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、B细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、母细胞性浆细胞样树突状细胞赘生物(BPDCN)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)、慢性髓细胞白血病(CML)、前B急性淋巴细胞性白血病(前B ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、重链疾病、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′slymphoma)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖性赘生物和真性红细胞增多症。
58.根据权利要求47所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是静脉内、动脉内、肿瘤内或皮下施用的。
59.根据权利要求47所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用一种或多种药物，所述一种或多种药物选自由以下组成的组：拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素、柔红霉素、核苷代谢抑制剂、阿糖胞苷、低甲基化剂、低剂量阿糖胞苷(LDAC)、柔红霉素和阿糖胞苷的组合、注射用柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、氮杂胞苷、地西他滨(decitabine)、全反式视黄酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、组胺二盐酸盐、白介素-2、阿地白介素、/>吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumabozogamicin)、/>FLT-3抑制剂、米哚妥林(midostaurin)、/>氯法拉滨(clofarabine)、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨、IDH1抑制剂、艾伏尼布(ivosidenib)、IDH2抑制剂、伊那尼布(enasidenib)、/>平滑受体(SMO)抑制剂、格拉吉布(glasdegib)、精氨酸酶抑制剂、IDO抑制剂、艾卡哚司他(epacadostat)、BCL-2抑制剂、维奈托克(venetoclax)、/>铂络合物衍生物、奥沙利铂(oxaliplatin)、激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、BTK抑制剂、依鲁替尼(ibrutinib)、/>阿卡替尼(acalabrutinib)、/>泽布替尼(zanubrutinib)、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、ICOS抗体、TIGIT抗体、TIM3抗体、CD40抗体、4-1BB抗体、CD47抗体、SIRP1α抗体或融合蛋白、CD70抗体和CLL1抗体、CD123抗体、E-选择素的拮抗剂、与肿瘤抗原结合的抗体、与T细胞表面标志物结合的抗体、与髓系细胞或NK细胞表面标志物结合的抗体、烷化剂、亚硝基脲剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、源自植物的生物碱、激素疗法药物、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。
60.根据权利要求47至59中任一项所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段进一步包含与其连接的抗肿瘤药物。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述抗肿瘤药物通过光不稳定接头与所述抗体连接。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述抗肿瘤药物通过酶促切割接头与所述抗体连接。
63.根据权利要求60所述的方法，其中所述抗肿瘤药物为毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
64.一种检测样品或受试者中的癌细胞或癌症干细胞的方法，所述方法包括：
(a)使受试者或来自所述受试者的样品与根据权利要求21至33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及
(b)检测所述抗体与所述受试者或所述样品中的癌细胞或癌症干细胞的结合。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述样品为体液或活检样品。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述样品为血液、骨髓、痰、眼泪、唾液、粘液、血清、尿液或粪便。
67.根据权利要求64所述的方法，其中检测包括免疫组织化学、流式细胞术、免疫测定(包括ELISA、RIA等)或蛋白质印迹。
68.根据权利要求64所述的方法，其进一步包括第二次执行步骤(a)和(b)以及确定检测水平相比于第一次的检测水平的变化。
69.根据权利要求64所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段进一步包含标记。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述标记为肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。
71.根据权利要求47至70中任一项所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与脂质体或纳米颗粒缀合。
72.一种治疗受试者的自身免疫性疾病或改善受试者的自身免疫性疾病的影响的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求21至33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求45或46所述的经工程化的细胞。
73.根据权利要求72所述的方法，其中靶向单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞以及其它髓系细胞。
74.根据权利要求72所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是静脉内、动脉内、肿瘤内或皮下施用的。
75.根据权利要求72所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用一种或多种药物，所述一种或多种药物选自由类固醇或NSAID组成的组。
76.根据权利要求72所述的方法，其中所述自身免疫性疾病为格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、未分化型脊椎关节病变、青少年脊椎关节病变、白塞氏病(Behcet′s disease)、肌腱端炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、肠易激综合征、炎性肠病、纤维肌痛、慢性疲劳综合征、与全身性炎性疾病相关的疼痛病状、全身性红斑狼疮、舍格伦综合征(Sjogren′s syndrome)、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、青少年发作型糖尿病(也被称为I型糖尿病)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、多肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特氏综合征(Schmidt's syndrome)、自身免疫性葡萄膜炎、阿狄森氏病(Addison'sdisease)、格雷夫氏病(Grave's Disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、狼疮性肝炎、动脉粥样硬化症、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、甲状旁腺功能减退症、德雷斯勒氏综合征(Dressler'ssyndrome)、重症肌无力、伊顿-兰伯特综合征(Eaton-Lambert syndrome)、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常型天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、脱发、硬皮病、进行性全身性硬化症、CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏现象(Raynaud's phenomenon)、食管运动障碍、指端硬化和毛细管扩张)、成人发作型糖尿病(也被称为II型糖尿病)、混合性结缔组织病、结节性多动脉炎、全身性坏死性血管炎、肾小球肾炎、特应性皮炎、特应性鼻炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、恰加斯氏病(Chagas'disease)、结节病、风湿热、哮喘、抗磷脂综合征、多形性红斑、库欣氏综合征(Cushing's syndrome)、自身免疫性慢性活动性肝炎、变应性疾病、变应性脑脊髓炎、输血反应、麻风病、疟疾、利什曼病、锥虫病、高安氏动脉炎(Takayasu′sarteritis)、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞动脉炎、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、川崎氏病(Kawasaki′s disease)、眼内炎、银屑病、胎儿成红细胞增多病、嗜酸性筋膜炎、舒尔曼氏综合征(Shulman′s syndrome)、费耳蒂氏综合征(Felty'ssyndrome)、富克斯氏睫状体炎(Fuch's cyclitis)、IgA肾病、亨-舒二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、移植物抗宿主病、移植排斥、兔热病、周期性发热综合征、化脓性关节炎、家族性地中海热、TNF受体相关周期性综合征(TRAPS)、穆-韦二氏综合征(Muckle-Wellssyndrome)或高IgD综合征。
77.一种非人细胞，其包含人LILRB3的编码区，所述非人细胞如小鼠细胞。
78.根据权利要求77所述的细胞，其中所述LILBR3编码区处于启动子，如异源启动子的控制下，所述启动子包含诱导型启动子或组成型启动子。
79.根据权利要求77至78所述的细胞，其中LILRB3的表达由转录或翻译抑制剂元件负向调节，如侧接有Lox位点的终止密码子。
80.一种转基因非人动物，如转基因小鼠，所述转基因非人动物包含根据权利要求77至79所述的细胞。
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