CN112672760A - 新颖lilrb4抗体和其用途 - Google Patents

新颖lilrb4抗体和其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112672760A
CN112672760A CN201980059865.6A CN201980059865A CN112672760A CN 112672760 A CN112672760 A CN 112672760A CN 201980059865 A CN201980059865 A CN 201980059865A CN 112672760 A CN112672760 A CN 112672760A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cells
cell
antigen
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980059865.6A
Other languages
English (en)
Inventor
安志强
张成城
张凝艳
桂勋
邓觅
黄涛
刘强
廖晓伶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immunomedics Inc
University of Texas System
Original Assignee
Immunomedics Inc
University of Texas System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunomedics Inc, University of Texas System filed Critical Immunomedics Inc
Publication of CN112672760A publication Critical patent/CN112672760A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1069—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from blood cells, e.g. the cancer being a myeloma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本发明提供了与LILRB4结合的抗体以及所述抗体用于检测和治疗癌症的用途。

Description

新颖LILRB4抗体和其用途
优先权要求
本申请要求2018年9月13日提交的美国临时申请第62/730,715号的优先权，其全部内容特此以引用的方式并入。
序列表
序列表包含于名为“UTFH_P0349WO_ST25”的文档中，所述文档为4KB(如在Microsoft Windows中所测量)且创建于2019年9月9日，其通过电子提交方式随本文一同提交且以引用的方式并入。
技术领域
本公开大体上涉及医学、肿瘤学和免疫学领域。更具体地说，本发明涉及与LILRB结合的抗体且可治疗包括白血病在内的癌症。
背景技术
急性骨髓性白血病(AML)是最常见的成人急性白血病和常见儿科癌症。当前用于AML的治疗涉及强化细胞毒性化学疗法，通常之后是清髓性调理和干细胞移植。然而，尽管进行治疗，但大部分患者在5年内复发或死于疾病。为了有效地治疗AML，必须确认新的分子靶标和治疗方法。最近，已展示抑制性白细胞免疫球蛋白样受体(LILRB)和相关的含有基于免疫受体酪氨酸的抑制性模体(ITIM)的受体LAIR1在各种造血和实体癌细胞中具有肿瘤促进功能。含有ITIM的受体在广泛范围的免疫细胞上表达且通过募集磷酸酶SHP-1、SHP-2或SHIP来转导信号，致使免疫细胞活化的负调节。与CTLA4及PD-1类似，LILRB被视为免疫检查点因子。
LILRB可抑制促进肿瘤免疫逃逸的多种免疫细胞类型的活性。LILRB4在单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞上表达且可以细胞自主方式抑制先天性免疫，且经由间接机理抑制T细胞活化。LILRB4是用于单核细胞性AML(包括难治愈和复发性疾病)的特异性标记。LILRB1-5具有灵长类动物和人类特异性，同时存在两种小鼠直系同源物：成对的免疫球蛋白样受体B(PirB)和gp49B1。含有基于免疫受体酪氨酸的抑制性模体(ITIM)的相关受体LAIR1具有人类与小鼠形式的蛋白质。由于小鼠模型的价值有限和若干LILRB(包括LILRB4)的配体未知的事实，这些受体的生物功能和临床意义仍然知之甚少。
发明内容
因此，在一个方面中，本公开提供与LILRB4特异性结合的经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段在与LILRB4结合时，调节LILRB4的活化。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段在与LILRB4结合时，活化LILRB4。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段在与LILRB4结合时，抑制LILRB4的活化。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段在与LILRB4结合时，特异性地阻断ApoE与LILRB4的结合。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含(a)包含以下互补决定区(CDR)的重链(HC)可变区(VH)：重链CDR(HC-CDR)1，其为SEQ ID NO:1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、99、223、225、226、228、229、230或231中的CDR1；HC-CDR2，其为SEQ ID NO:1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、99、223、225、226、228、229、230或231中的CDR2；以及HC-CDR3，其为SEQ ID NO:1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、99、223、225、226、228、229、230或231中的CDR3，和其变体，其中所述HC-CDR中的一或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合；以及(b)包含以下CDR的轻链(LC)可变区(VL)：轻链CDR(LC-CDR)1，其为SEQ ID NO:5、12、19、26、33、40、47、54、61、68、75、82、89、96、103、232、235、236或237中的CDR1；LC-CDR2，其为SEQ ID NO:5、12、19、26、33、40、47、54、61、68、75、82、89、96、103、232、235、236或237中的CDR2；以及LC-CDR3，其为SEQ ID NO:5、12、19、26、33、40、47、54、61、68、75、82、89、96、103、232、235、236或237中的CDR3，和其变体，其中所述LC-CDR中的一或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。在某些实施例中，各CDR是根据以下各者定义：Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义与Chothia定义的组合、AbM定义或CDR的接触定义。
在某些实施例中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含：HC-CDR1，其具有SEQ ID NO:2、9、16、23、30、37、44、51、58、65、72、79、86、93或100中所示的氨基酸序列；HC-CDR2，其具有SEQ ID NO:3、10、17、24、31、38、45、52、59、66、73、80、87、94或101中所示的氨基酸序列；以及HC-CDR3，其具有SEQ ID NO:4、11、18、25、32、39、46、53、60、67、74、81、88、95、102、224或227中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含：LC-CDR1，其具有SEQ ID NO:6、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、97或104中所示的氨基酸序列；LC-CDR2，其具有SAS、KAS、GAS、ATS、DAS或AAS的氨基酸序列或SEQ ID NO:233中所示的氨基酸序列；以及LC-CDR3，其具有SEQ ID NO:7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84、91、98、105或234中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，抗体的特征在于克隆配对的重链和轻链具有与图28A至28C和图30A至30C的克隆配对序列至少约70％、80％、90％或95％一致的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、99、223、225、226、228、229、230或231中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:5、12、19、26、33、40、47、54、61、68、75、82、89、96、103、232、235、236或237中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，以克隆配对的重链和轻链为特征的抗体与表1和表2中的CDR具有0、1或2个氨基酸差异的CDR。
在另一方面中，本发明提供经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与具有表1和表2的克隆配对重链及轻链CDR序列的抗体竞争相同的表位。在某些实施例中，抗体与具有图28A至28C和图30A至30C的克隆配对重链和轻链可变区的抗体竞争相同的表位。
在某些实施例中，由抗体或抗原结合片段结合的表位位于人类LILRB4的D1与D2结构域之间的连接区内。在某些实施例中，表位包含表9中所列出的LILRB4的一或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸。在某些实施例中，表位包含选自SEQ ID NO:238(人类LILRB4蛋白的D1及D2结构域)的W18、G96、A97、Y98、S99、K100、Q122、S123、R124、S125、P126、H153及Q154的一或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸。
在某些实施例中，本文所描述的经分离单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。在某些实施例中，本文所描述的经分离单克隆抗体属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型。在某些实施例中，本文所描述的抗原结合片段是重组ScFv(单链可变片段)抗体、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。
在另一方面中，提供一种医药组合物，其包含如本文所提供的经分离单克隆抗体或其抗原结合片段，以及至少一种药学上可接受的载体。
在另一方面中，提供一种经分离的核酸，其编码如本文所提供的经分离单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一方面中，提供一种载体，其包含如本文所提供的经分离核酸。
在另一方面中，提供一种宿主细胞，其包含如本文所提供的载体。宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是CHO细胞。
在另一方面中，提供一种杂交瘤，其编码或产生如本文所提供的经分离单克隆抗体。
在另一方面中，提供一种产生抗体的方法。方法可包含在适合于表达抗体且回收抗体的条件下培养如本文所提供的宿主细胞。
在另一方面中，提供一种包含如本文所提供的抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)蛋白。
在另一方面中，提供一种编码如本文所提供的CAR蛋白的经分离核酸。
在另一方面中，提供一种包含如本文所提供的经分离核酸的经工程改造的细胞。在某些实施例中，细胞是T细胞、NK细胞或骨髓细胞。
在另一方面中，提供一种治疗或改善癌症在受试者中的影响的方法。方法可包含向受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段或如本文所提供的经工程改造的细胞。在某些实施例中，癌症是急性骨髓性白血病。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段通过静脉内、动脉内、肿瘤内或皮下方式施用。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含与其连接的抗肿瘤药物(例如毒素、放射性同位素、细胞因子或酶)。在某些实施例中，经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与脂质体或纳米粒子共轭。
在又另一方面中，提供一种检测样品或受试者中的癌细胞或癌症干细胞的方法。在某些实施例中，方法包含使受试者或来自受试者的样品与如本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触以及检测所述抗体与所述受试者或样品中的癌细胞或癌症干细胞的结合。样品可以是体液或生物检体。样品可以是血液、痰、泪液、唾液、黏液、血清、尿液或粪便。在某些实施例中，检测包含免疫组织化学、流式细胞术、FACS、ELISA、RIA或蛋白质印记法。在某些实施例中，经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段进一步包含标记(例如肽标签、酶、磁性粒子、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料)。在某些实施例中，经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与脂质体或纳米粒子共轭。
“一(a/an)”一词当在权利要求书和/或说明书中结合术语“包含”使用时，可以指“一个”，但其还与“一或多个”、“至少一个”及“一个或多于一个”的含义相符。“约”一词是指所述数字的加或减5％。
预期本文所描述的任何方法或组合物均可根据本文所描述的任何其它方法或组合物实施。本发明的其它目的、特征和优势从以下详细描述而将变得显而易见。然而，应理解，详细描述和具体实例虽然指示本发明的特定实施例，但仅以说明方式给出，因为本领域的技术人员由此详细描述将显而易见地知晓属于本发明精神和范围内的各种改变和修改。
附图说明
下图形成本说明书的一部分且为了进一步展现本发明的某些方面而包括内。参照这些图式中的一或多者，结合本文中呈现的特定实施例的详细描述，可更好地理解本发明。
图1A至1B说明LILRA与LILRB家族成员之间的序列保守性。图1A说明LILRB和LILRA家族成员的D1结构域间的氨基酸序列一致性百分比。图1B说明LILRB和LILRA家族成员的D1结构域的系统树。
图2A至2K说明白血病细胞上表达的LILRB4抑制T细胞增殖。图2A，LILRB4表面表达是通过对来自105名患者的样品进行流式细胞术分析来定量。图2B，比较来自相同AML患者(n＝6)的正常单核细胞和赘生性单核细胞上的LILRB4表面表达。MFI：平均荧光强度。图2C，从患有单核细胞性AML(AML#19)的患者分离出的自体性T细胞(pT，患者T细胞)或自健康供体分离出的同种异体T细胞(nT，正常T细胞)与来自患者AML#19(n＝3个生物独立样品，平均值±标准偏差)的经辐射LILRB4+或LILRB4-(B4+或B4-)原代白血病细胞一起培育。不同亚群的绝对T细胞数目(CD3+CD8-CD4-、CD3+CD8+CD4+、CD3+CD8-CD4+及CD3+CD8+CD4-)以堆栈条形图的不同颜色展示。图2D，从健康供体分离出的T细胞(E：效应细胞)以细胞接触方式与指示的经辐射THP-1细胞(T：目标细胞)一起培育。CD3+T细胞的数目以不同E:T比率展示。图2E至2F，人类T细胞和静脉内移植的多西环素(Dox)-诱导性lilrb4基因敲除THP-1细胞(GFP+)移植到NOD-SCID IL2Rγ-空白(NSG)小鼠(n＝5)中。LV，肝脏；BM，骨髓。图2G，在不存在或存在抗CD8的情况下，用抗LILRB4-N297A抗体或对照抗体治疗(n＝5)的C57BL/6小鼠皮下植入的表达人类LILRB4的小鼠AML C1498细胞(hlilrb4-C1498)的肿瘤生长。图2H，皮下hlilrb4-C1498荷瘤的小鼠(n＝12)的存活曲线。图2I，从对照小鼠或通过抗LILRB4-N297A治疗治愈的荷瘤小鼠(n＝5)过继性移植脾细胞。根据时间监测肿瘤尺寸。箭头指示用白血病已消除的小鼠(n＝4)中AML细胞的3倍数目再次攻击的时日。图2J至2K，用抗LILRB4抗体或对照IgG(n＝8个生物独立样品)治疗后，从异种移植人类原代单核细胞性AML细胞的小鼠骨髓中CD45+LILRB4+细胞百分比的代表性流程图和定量。对16个独立患者样品重复实验，其具有类似结果。
图3A至3D展示LILRB4促进AML细胞迁移和浸润。在重构或不重构LILRB4(wt)或缺乏胞内域的LILRB4(intΔ)的情况下，使用WT及lilrb4-KO THP-1细胞(GFP+)。通过流式细胞术测定骨髓(BM)、肝脏(LV)和脾(SP)中的白血病细胞(GFP+)数目且相对于外周血液中的数目归一化。图3A，NSG小鼠(n＝5)中的指定WT细胞或经修饰的THP-1细胞的短期(20小时)浸润的比较。图3B至3D，在用抗LILRB4抗体或IgG对照物治疗后的NSG小鼠(n＝5)中，人类原代单核细胞性AML细胞的短期(20小时)浸润的比较。n.s.，不显著；p值来自双尾学生t检验(two-tailed student t-test)。
图4A至4M展示APOE为LILRB4的胞外结合蛋白。图4A，在存在10％人类血清、10％小鼠血清或PBS对照的情况下，活化的指定LILRB报道子细胞(GFP+)的百分比。图4B，通过重组APOE(10μg/ml)活化的指示LILRB报告细胞的百分比。图4C，通过从野生型或apoe-基因敲除KO小鼠或PBS对照组收集的10％小鼠血清活化的LILRB4报告细胞的百分比。图4D，通过10μg/ml的APOE、APOE-POPC、APOA1或APOA1-POPC活化的LILRB4报告细胞的百分比。图4E，His标记的APOE与WT及lilrb4-KO THP-1细胞的结合。图4F，使用微量热泳(MST)来测量人类His标记的APOE-3与LILRB4-ECD的结合动力学。上图：荧光强度(Flu.Int.)标绘图和结合的回归；下图：对应的残差(Resi.)与拟合标绘图。图4G，通过WT和突变APOE蛋白活化的LILRB4报告细胞的百分比。Mut-N，R142A/K143A/R145A/K146A/R147A/R150A；Mut-C1，残基245-299的缺失；以及Mut-C2，残基279-299的缺失。图4H，通过APOE蛋白活化的指定LILRB4突变报告细胞的百分比。干扰结合的突变体数据以红色在(图4G至4H)中突出显示。图4I，从健康供体中分离出的T细胞与lilrb4或apoe基因未敲除(WT)或敲除(lilrb4-KO、apoe-KO-1、apoe-KO-2)的指定的经辐射THP-1细胞一起培育。在7天后通过流式细胞术分析T细胞。图4J至4L，C57bl/6小鼠脾细胞(作为效应细胞或E)与经辐射的表达人类lilrb4(GFP-hlilrb4)或对照(GFP)C1498细胞(作为靶细胞或T)以指示的E:T比率一起培育。在细胞中补充从WT或apoe-KO小鼠收集的5％血清，与抗CD3/CD28涂覆的珠粒一起培养60小时，且随后用抗CD3抗体染色。展示样品在E:T为20:1时的代表性流程图(图4J)、CD3+T细胞的百分比(图4K)和apoe-KO血清的APOE-POPC拯救效果(图4L)。图4M，人类lilrb4在小鼠白血病C1498细胞中的强制表达增加WT接受小鼠中的白血病细胞浸润，但未增加apoe-KO接受小鼠(n＝5)中的白血病细胞浸润。n.s.，不显著；p值来自双尾学生t检验。
图5A至5M展示LILRB4介导的胞内信号传导控制AML细胞迁移和T细胞抑制。图5A，三种磷酸酶在野生型和lilrb4-KO THP-1细胞中的表达和磷酸化。图5B，原代T细胞和经辐射的指定THP-1细胞分别在下部及上部腔室中培养。在7天后通过流式细胞术分析T细胞。图5C至5D，shp-2的基因敲除减少了NSG小鼠(n＝5)中THP-1细胞的短期和长期浸润。图5E，从lilrb4-KO及WT THP-1细胞产生的RNA-seq数据的上游转录因子分析。黄色圆点突出显示参与JAK/STAT及NF-κB路径的转录因子。图5F，lilrb4-KO THP-1细胞中IKKα/β的磷酸化降低。图5G，lilrb4-KO THP-1细胞的核部分中的NFκB降低。图5H至5I，NF-κB抑制剂逆转WT THP-1细胞对T细胞的抑制(图5H)，以及以LILRB4依赖型方式减少MV4-11细胞的浸润(图5I)。图5J，从健康供体分离出的T细胞补充有WT或lilrb4-KO THP-1细胞的25％条件培养基(CM)。拍摄代表性细胞(比例尺，100μm)且通过流式细胞术分析T细胞。图5K至5L，将T细胞与补充有指示浓度的重组uPAR(uPA受体，也称为尿激酶受体)(图5K)或ARG-1(精氨酸酶-1)(图5L)蛋白的经辐射的指定THP-1细胞一起培育7天，且通过流式细胞术进行分析。图5M，uPAR(plaur)或ARG1的过度表达拯救lilrb4-KO MV4-11细胞(n＝5)的浸润缺陷。n.s.，不显著；p值来自双尾学生t检验。
图6A至6B展示人类AML患者中的LIRB4表达且与患者总存活率负相关。图6A，lilrb4 mRNA水平与来自TCGA数据库的AML患者(n＝160)的总存活率之间的相关性分析。低，n＝57；中等，n＝48；高，n＝55。图6B，在混杂因子(包括年龄、细胞遗传学，和TCGA数据库中的PML-RAR突变)存在调整的情况下，用以评估相关性的多变量Cox回归分析。总样本尺寸是79。*，p<0.05视为显著的。
图7A至7F展示表达LILRB4的原代AML细胞抑制T细胞增殖。将自个别单核细胞性AML或B-ALL患者分离出的自体T细胞与来自同一患者的经辐射lilrb4阳性(B4+)或lilrb4阴性(B4-)原代白血病细胞一起培育。pT，患者T细胞。将自健康供体分离出的同种异体T细胞与来自指示的AML或B-ALL患者的经辐射lilrb4阳性或lilrb4阴性原代白血病细胞以10:1的E:T一起培育。nT，正常T细胞。在与抗CD3/CD28/CD137涂覆的珠粒及rhIL-2一起培养14天之后，T细胞用抗CD3、抗CD4及抗CD8抗体染色且通过流式细胞术进行分析。黑色p值指示CD3+CD8+细胞的显著性；红色p值指示CD3+CD4+细胞的显著性。n.s.，不显著。
图8A至8O展示LILRB4抑制试管内T细胞增殖。图8A，lilrb4调节的THP-1细胞的制备及通过流式细胞术检测细胞表面上的LILRB4表达的示意图。WT，用加扰对照处理的THP-1细胞；lilrb4-KO，lilrb4基因敲除的THP-1细胞；lilrb4-KO-wt，野生型lilrb4于lilrb4-KOTHP-1细胞上的强制表达；lilrb4-KO-intΔ，胞内域缺失突变lilrb4于lilrb4-KO THP-1细胞上的强制表达。图8B，通过流式细胞术检测lilrb4-KO MV4-11细胞的细胞表面上的LILRB4表达。图8C至8D，lilrb4在MV4-11细胞上的缺失降低T细胞抑制。自健康供体分离出的T细胞在96孔跨孔板(transwell plate)的下部腔室中与通过具有3μm孔隙的膜间隔开的上部腔室中的经辐射MV4-11细胞(2:1的E:T)一起培育。在与抗CD3/CD28涂覆的珠粒及rhIL-2一起培养7天之后，使用倒置显微镜(比例尺，100μm)拍摄代表性细胞(图8C)，且T细胞用抗CD3染色且通过流式细胞术进行分析(图8D)。n＝3。图8E，lilrb4在MV4-11细胞上的缺失不影响细胞增殖。图8F至8G，将自健康供体分离出的T细胞(E：效应细胞)与指示的经辐射THP-1细胞(T：目标细胞)在跨孔中不直接接触的情况下一起培育2天。E:T＝2:1。用BrdU处理T细胞30min，继之进行BrdU及7-AAD染色用于流式细胞术分析。代表性流式细胞术标绘图展示于图8F中且细胞周期状态概述于图8G中。在不存在THP-1细胞的情况下培养T对照、T细胞。图8H至8I，将自健康供体分离出的T细胞(E：效应细胞)用CFSE染色且与指示的经辐射THP-1细胞(T：目标细胞)在跨孔中不直接接触的情况下一起培育2天。代表性流式细胞术标绘图展示于图8H中且通过CFSE低染色指示的增殖性T细胞的百分比展示于图8I中。图8J，LILRB4在白血病细胞及T细胞的共培养中增加T细胞上的PD-1表达。将从健康供体分离出的T细胞(E：效应细胞)以非接触方式与指示的经辐射THP-1细胞(T：靶细胞)一起培育5天。E:T＝2:1。T细胞用抗LAG-3、抗TIM-3、抗TIGIT、抗PD-1和抗FasL抗体染色以用于流式细胞术分析。展示代表性流式细胞术标绘图且荧光强度的平均值经计算并展示于右上角(黑色，WT；红色，KO)。实验进行三次，具有类似结果。图8K，抗LILRB4抗体对T细胞的增殖无影响。展示IgG或抗LILRB4抗体试管内处理5天后的人类原代T细胞的数目(n＝3个具有平均值及标准偏差的生物独立样品)。图8L，将原代T细胞及经辐射THP-1细胞(E:T比率，2:1)分别放置于下部腔室及上部腔室且用10μg/ml对照IgG或抗LILRB4抗体处理。用抗CD3染色T细胞且通过流式细胞术进行分析。图8M，用抗CD3/CD28/CD137涂覆的珠粒刺激的原代T细胞与WT或lilrb4-KO-THP-1细胞以指示的E:T比率共培养4小时。白血病细胞的细胞毒性通过流式细胞术分析中的PI染色来测定(n＝3个具有平均值及标准偏差的生物独立样品)。图8N至8O，用抗CD3/CD28/CD137涂覆的珠粒刺激的CD8+T细胞(5×104个细胞)与稳定表达GFP的5×103个THP-1细胞共培养，且用100μg/ml抗LILRB4抗体或对照IgG处理5天。n＝4。展示GFP+白血病细胞的定量(图8N，n＝4个生物独立样品)及IFNγ的分泌(图8O，n＝3个具有平均值及标准偏差的生物独立样品)。n.s.，不显著。
图9A至9J展示LILRB4的抑制减少了人源化免疫功能不全小鼠中的白血病发展。图9A至9C，将WT或lilrb4-KO THP-1细胞(3×106个细胞/小鼠)皮下植入hPBMC繁殖的NSG小鼠(WT，n＝14只具有平均值及标准偏差的小鼠；lilrb4-KO，n＝10只具有平均值及标准偏差的小鼠)中。展示肿瘤尺寸(图9A)、第31天接受小鼠的外周血液中CD3+的定量(图9B)及展示CD4+及CD8+T细胞的代表性流程图(图9C)。图9D至9E，LILRB4增加肿瘤浸润的T细胞上的PD-1表达。将WT或lilrb4-KO THP-1细胞皮下植入hPBMC繁殖的NSG小鼠中。在植入后三周，10只WT组小鼠中的7只具有较大肿瘤且10只KO组小鼠中的3只具有微小肿瘤。这些肿瘤经解剖用于通过抗LILRB4、抗CD3、抗PD-1或抗精氨酸酶-1抗体染色进行免疫组织化学及流式细胞术。图9D，自黄色突出显示区放大左角影像。在CD3及PD-1染色影像中，橙色虚线指示肿瘤边界。黑色箭头指示PD-1阳性细胞。比例尺，100μm。图9E，解剖肿瘤且肿瘤区中的细胞用抗CD3及抗PD-1抗体染色用于流式细胞术分析。计算PD-1+T细胞的百分比(PD-1+CD3+细胞/CD3+细胞的比率)。图9F至9G，将THP-1细胞移植至hPBMC-繁殖的NSG小鼠中，且在6天后用对照IgG或抗LILRB4抗体治疗小鼠(10mg/kg；n＝5)。还展示了第26天代表性小鼠中的T细胞数目。图9H至9I，在Dox施用前第7天，在NSG小鼠(n＝5)中，人类T细胞及静脉内移植的多西环素(Dox)诱导性lilrb4基因敲除THP-1细胞(GFP+)的移植。图9J，代表性流程图表明，在终点、在Dox喂食小鼠的骨髓中的移植白血病细胞中，成功地使LILRB4缺失。n.s.，不显著。
图10A至10D展示抗LILRB4抗体减轻了同基因型小鼠的白血病发展。图10A，将稳定表达LILRB4-IRES-GFP的小鼠AML C1498细胞(3×106个细胞/小鼠)皮下植入C57bl/6小鼠中。在肿瘤细胞植入后第6、9、12、15、18及21天静脉内注射抗LILRB4-N297A抗体或对照IgG。两组小鼠在肿瘤细胞植入后第3、6、9及12天用抗CD8抗体治疗以实现CD8+T细胞清除。抗LILRB4抗体减少白血病细胞浸润至例如肝脏(LV，图10A中)等宿主组织中，即使在CD8+细胞清除时(图10A)。图10B至10D，C57bl/6小鼠经静脉内植入表达人类LILRb4的小鼠AML C1498细胞(3×106个细胞/小鼠)，所述细胞表达GFP。抗LILRB4-N297A抗体(n＝9只小鼠)或对照IgG(n＝9只小鼠)在肿瘤细胞植入后第6、9、12、15及18天经静脉内注射。抗LILRB4抗体降低骨髓(BM)中白血病细胞的百分比(图10B)。抗LILRB4抗体增加骨髓中的CD8+T细胞(图10C)。骨髓中CD8+T细胞的百分比与白血病细胞的百分比显著负相关(图10D)。n.s.，不显著。所有p值(除依据皮尔森相关(Pearson's correlation)的图10D外)来自双尾学生t检验。
图11A至11B展示抗LILRB4抗体在PDX小鼠中减轻了白血病发展且恢复自体T细胞。图11A，将来自十六名人类患者(三名展示于图2J至2K中)中的每一者的外周血液或骨髓原代单核AML细胞(5×106至1×107个细胞/小鼠)注射至NSG小鼠中，随后用IgG或抗LILRB4抗体(10mg/kg，一周两次静脉内注射)治疗。展示移植后第2至4个月从包括骨髓、脾、肝脏和外周血液的造血组织采集的人类CD45+LILRB4+AML细胞的百分比，如通过流式细胞术所测定。图11B，展示移植后第2至4个月从包括骨髓、脾、肝脏及外周血液在内的造血组织采集的自体人类T细胞的百分比，如通过流式细胞术所测定；以及三种PDX小鼠骨髓中CD3+CD8+T细胞的代表性流程图。n.s.，不显著。除具有n＝20个生物独立样品的AML#11外，所有PDX具有n＝8个生物独立样品。
图12A至12J展示LILRB4促进AML细胞的浸润。图12A及12B，小鼠AML细胞C1498(图12A)或稳定表达lilrb4的WEHI-3(图12B)上的人类LILRB4表达的检测。图12C，LILRB4的强制表达不影响例如WEHI-3的小鼠AML细胞(n＝3)的细胞增殖。图12D，人类LILRB4的强制表达促进小鼠AML WEHI-3细胞(n＝3)的跨内皮迁移。图12E，向NSG小鼠(n＝6)注射1×106个THP-1细胞，随后立即通过IgG或抗LILRB4抗体治疗且通过生物发光成像进行监测。图12F至12G，抗LILRB4抗体减少AML细胞浸润至内脏中。在移植1×106个表达荧光素酶的THP-1细胞后第21天处死小鼠以用于内脏的离体生物发光成像。展示代表性小鼠的发光通量(辐射)的影像(图12F)。1：胃肠(GI)道；2：腿；3：肺；4：脾；5：肝脏；6：肾脏；7：大脑；8：心脏。浸润的白血病细胞在肝脏中形成肿瘤节结(图12G)。图12H，抗LILRB4抗体对LILRB4阴性癌细胞无影响。LILRB4表达于THP-1及MV4-11人类AML细胞上，而非U937细胞上。向NSG小鼠注射有不表达LILRB4的U937人类AML细胞，且随后用抗LILRB4抗体治疗(图12H)。IgG充当对照抗体。移植后第25天处死小鼠以通过流式细胞术分析LV、BM、SP及PB。人类AML细胞的存在通过抗人类CD45抗体染色来检测(n＝3)。图12I，NSG小鼠中的靶向免疫细胞群已耗竭。代表性流式细胞术标绘图表明与未耗竭(野生型)的NSG小鼠相比，通过分别用抗去唾液酸GM1抗体、氯屈膦酸盐脂质体及抗Ly6G抗体治疗而使各个免疫细胞亚型耗竭的NSG小鼠中的NK细胞(CD45+CD49b+)、巨噬细胞(CD11b+F4/80+)及嗜中性白细胞(CD11b+CD11c-)频率成功降低。图12J，将CFSE标记的MV4-11细胞(5×106个/小鼠)注射至各别先天性免疫细胞已耗竭的NSG小鼠中，随后立即用IgG或抗LILRB4-N297A抗体治疗(n＝5)。所示为注射后的20小时，LV、SP及BM中的白血病细胞(CFSE阳性)数目，其相对于PB中的数目归一化。n.s.，不显著。
图13A至13C展示抗LILRB4抑制原代AML细胞的浸润。人类原代单核细胞性AML细胞在用抗LILRB4抗体或IgG对照物治疗后的NSG小鼠(n＝5)中的浸润的比较。图13A至13B，注射来自单核细胞性AML患者的人类外周血液原代单核细胞。图13C，注射具有异种移植的原代人类单核细胞性AML细胞(人类CD45+LILRB4+细胞)的小鼠肝细胞。n.s.，不显著。所有p值来自双尾学生t检验。
图14A至14G展示AML细胞中APOE的缺失在体外恢复T细胞增殖且抑制AML细胞迁移。通过免疫印记法检测apoe-基因敲除THP-1及MV4-11细胞中的APOE表达(图14A及14C)。原代T细胞及经辐射THP-1或MV4-11细胞(E:T＝2:1)分别在下部及上部腔室中培育。拍摄T细胞(图14B及14D，比例尺，100μm)且在7天后通过流式细胞术定量(图4I及14E)。图14F至14G，APOE的缺失抑制人类AML THP-1及MV4-11细胞的跨内皮迁移(n＝4个具有平均值及标准偏差的生物独立样品)。
图15A至15D展示LILRB4上调SHP-2及NF-kB信号传导的磷酸化。图15A，在MV4-11细胞中的lilrb4基因敲除(KO)后，磷酸化SHP-2、磷酸化IKB、uPAR及ARG1被下调。图15B，免疫共沉淀证实LILRB4与THP-1细胞中的SHP-2相互作用。图15C至15D，两种不同NF-κB抑制剂以LILRB4依赖型方式恢复了被THP-1细胞抑制的T细胞增殖。THP-1细胞用各种剂量的NF-κB抑制剂预处理1小时。原代T细胞及经辐射预处理的THP-1细胞(E:T＝2:1)分别在下部及上部腔室中培养。拍摄T细胞(图15C，比例尺，100μm)且在7天后通过流式细胞术进行分析(图15D)。n.s.，不显著。
图16A至16H展示LILRB4上调uPAR及精氨酸酶-1以抑制T细胞活性且促进白血病迁移。图16A，表面uPAR在lilrb4基因敲除的THP-1及MV4-11 AML细胞中下调。图16B，自健康供体分离出的T细胞与抗CD3/CD28涂覆的珠粒及rhIL-2一起培养且用指示浓度的uPAR蛋白补充3天(n＝4个生物独立样品)。使用倒置显微镜拍摄代表性细胞且通过流式细胞术分析T细胞。图16C，uPAR及精氨酸酶-1(ARG1)的表达在lilrb4基因敲除的THP-1及MV4-11 AML细胞中下调。图16D，如通过比色方法(DARG-100，BioAssay系统)所测定的精氨酸酶活性在lilrb4-KO THP-1及MV4-11细胞的条件培养基中降低。图16E，原代T细胞及经辐射指示的THP-1细胞(E:T＝2:1)分别在下部及上部腔室中培育且用0.002U/L重组ARG1蛋白补充7天。拍摄T细胞。图16F，自健康供体分离出的T细胞与抗CD3/CD28涂覆的珠粒及rhIL-2一起培养且用指示浓度的ARG1蛋白补充3天(n＝4个生物独立样品)。使用倒置显微镜拍摄代表性细胞且通过流式细胞术分析T细胞。图16G，将自个别单核细胞性AML患者分离的自体T细胞与来自同一患者的经辐射lilrb4阳性或lilrb4阴性原代白血病细胞以10:1的E:T一起培育，补充重组抗LILRB4抗体、APOE-VLDL、uPAR或ARG1。pT，患者T细胞。在与抗CD3/CD28/CD137涂覆的珠粒及rhIL-2一起培养14天之后，T细胞用抗CD3、抗CD4及抗CD8抗体染色且通过流式细胞术进行分析。图16H，向培养基中补充重组uPAR或ARG1拯救lilrb4-KO THP-1或lilrb4-KO MV4-11细胞跨内皮的反式迁移能力的降低(n＝3)。比例尺，100μm。n.s.，不显著。所有p值来自双尾学生t检验。
图17A至17B展示原代人类单核细胞性AML细胞中的SHP-2/NF-κB信号传导及uPAR及精氨酸酶-1表达的检测。图17A，对LILRB4阳性或高CD33+AML细胞(红色方框)及LILRB4阴性或低CD33+AML细胞(蓝色方框)进行门控，以便对Y580磷酸化的SHP-2、S176/S180磷酸化的IKKα/β、S529磷酸化的NF-κB、uPAR及精氨酸酶-1(ARG1)实现进一步细胞内染色。同型IgG用作阴性对照。红色数字指示LILRB4阳性或高CD33+AML细胞的MFI(平均荧光强度)；蓝色数字指示LILRB4阴性或低CD33+AML细胞的MFI。图17B，LILRB4阳性或高CD33+AML细胞对比LILRB4阴性或低CD33+AML细胞中的个别染色的定量。
图18展示LILRB4抑制T细胞且促进白血病浸润的机理的示意图。
图19A至19D展示在白血病细胞中及正常造血细胞中LILRB4介导的胞内信号传导的比较。图19A至19B，APOE激活白血病细胞中的LILRB4胞内信号传导。指示的THP-1细胞及原代AML(M5)细胞经血清饥饿整夜，且随后用指示浓度的人类重组APOE蛋白处理指定的时间。通过蛋白质印记法检测磷酸化SHP-2、磷酸化NFκB及精氨酸酶-1。图19C，APOE对正常单核细胞或体外分化的巨噬细胞的影响。自健康供体分离出正常单核细胞且在体外分化一周之后自这些单核细胞衍生巨噬细胞。细胞经血清饥饿整夜且随后用指示浓度的人类重组APOE蛋白处理指定的时间。通过蛋白质印记法检测磷酸化SHP-2、磷酸化NFκB及精氨酸酶-1。图19D，APOE诱导AML细胞上而非正常单核细胞中的uPAR上调。自健康供体分离出正常单核细胞。指示的原代AML细胞及正常单核细胞经血清饥饿整夜且随后用20μg/ml人类重组APOE蛋白处理八小时。通过流式细胞术检测表面uPAR。展示代表性流程图且平均荧光强度展示于右上角(黑色，PBS对照；红色，APOE处理)。实验进行三次，具有类似结果。p值来自双尾学生t检验。
图20A至20B展示抗LILRB4不影响正常造血细胞的移植。图20A，来自两个健康供体的正常单核细胞上以及WT及lilrb4-KO THP-1细胞上的LILRB4表面表达的比较。图20B，抗LILRB4抗体不影响正常单核细胞的归巢(homing)能力。人类正常单核细胞(如图20A中所展示)经由CD14阳性选择来分离。这些经分离的单核细胞通过CFSE合并且染色。在染色之后，将单核细胞(各小鼠5×106个)注射至NSG小鼠中，随后立即通过抗体治疗，且随后在移植后的20小时处死小鼠(n＝4)。肝脏、脾及骨髓中的CFSE+细胞数目如通过流式细胞术所测定，相对于外周血液中的数目归一化。
图21A至21C展示在MDSC上表达的LILRB4抑制T细胞。图21A，通过菲科尔密度梯度离心(ficoll density gradient centrifugation)从UTSW组的11个实体癌症患者血液样品中分离出外周血液单核细胞。通过流式细胞术测定LILRB4在MDSC(CD14+HLA-DRlow/-)上的表面表达。图21B，将自体T细胞与LILRB4阳性或阴性MDSC以指示的E:S比率(E，效应T细胞；S，MDSC抑制细胞)在T细胞培养基(补充有10％FBS、珠粒与细胞比率为1:1的30U/ml人类IL-2及抗CD3/CD28戴诺珠粒(Dynabead)的RPMI-1640培养基)中培养5天。展示T细胞的代表性照片。图21C，在骨髓源抑制细胞(MDSC)/T细胞试管内共培养物中，抗LILRB4增加T细胞的IFNγ分泌。T细胞(E：效应细胞；CD3+)及MDSC(S：抑制细胞；HLA-DRlow/-CD14+)是从黑色素瘤患者的外周血液中分离。T细胞与MDSC共培育5天。E:S＝2:1。收集培养基的上清液，且通过ELISA测定IFNγ的含量。实验重复三次。
图22说明通过ELISA使用浓度滴定(0-10μg/ml)来测定与人类LILRB4 ECD结合的示例性LILRB4单克隆抗体(mAb)。X轴指示抗体浓度且Y轴是OD(450nm)中的结合信号。将LILRB4 ECD重组蛋白涂覆于高吸收96孔板上。将连续稀释(3倍)的LILRB4 mAb添加至被涂覆/阻断的且使用山羊抗兔IgG F(ab)2共轭的HRP作为二级抗体检测。滴定曲线使用4参数拟合曲线进行拟合，使用GraphPad软件估计EC50。
图23A至23B.图23A为LILRB4胞外域(ECD)的示意图。所示的显著降低APOE对LILRB4的活化的两种残基(W106及Y121)的突变分别位于第一Ig结构域中及两个Ig结构域之间的连接子中。图23B说明了与人类LILRB4的Ig结构域-1(D1结构域)结合的示例性LILRB4 mAb的判定。X轴指示抗体浓度且Y轴是OD(450nm)中的结合信号。LILRB4D1重组蛋白被涂覆于高吸收96孔板上。将连续稀释(3倍)的LILRB4 mAb添加至被涂覆/阻断的板且使用山羊抗兔IgG F(ab)2共轭的HRP作为二级抗体进行检测。在此分析中，LILRB4中仅D1结构域足以与七个mAb结合，而单独的D1不足以与B4-193结合(蓝色空心三角形)。
图24A至24B.图24A是LILRB4膜蛋白的示意图。所示为胞外域中的Ig结构域-1(D1)、Ig结构域-2(D2)及柄区(SR)，以及识别D1结构域的抗体的说明。图24B说明了B4-193结合域的判定。将人类LILRB4重组蛋白的LILRB4 D1结构域(D1)、D2结构域(D2)、茎部区(SR)、D1+D2、D2+SR及全长ECD(D1+D2+SR)涂覆于高吸收96孔板上。将连续稀释(3倍)的B4-193添加至被涂覆/阻断的板且使用山羊抗兔IgG F(ab)2共轭的HRP作为二级抗体进行检测。在此分析中，B4-193仅与人类LILRB4的全长ECD结合。
图25说明了LILRB4上的氨基酸Y121(位置121的酪氨酸。请注意，Y在此位置121的编号是在D1之前的额外N端序列中；此位置与SEQ ID No:238中的Y98相同，其始于D1而前面没有N端序列)对B4-193结合的贡献。将野生型及Y121A突变的人类LILRB4ECD重组蛋白涂覆于高吸收96孔板上。将连续稀释(3倍)的mAb B4-193添加至被涂覆/阻断的板且使用山羊抗兔IgG F(ab)2共轭的HRP作为二级抗体进行检测。LILRB4的Y121A突变显著降低B4-193与LILRB4的结合。
图26说明使用Octet测定的示例性LILRB4抗体的动力学结合测量值(感测图谱)。将30μg/mL的抗体装载至蛋白质A传感器上4分钟。遵循动力学缓冲液的短基线，将装载的传感器暴露于一系列重组人类LILRB4浓度(0.1-200nM)且使用背景减法校正传感器漂移。所有实验在1,000rpm下振荡进行。背景波长位移是利用仅装载有抗体的参考传感器测量。ForteBio的数据分析软件用于将数据与1:1结合模型进行拟合以提取缔合速率及解离速率。使用ForteBio的数据分析软件7.0、依据比率koff/kon来计算KD。
图27说明示例性LILRB4 mAb的表位结合。经典的夹心表位分组(epitopebinning)实验在8通道Red96中进行。将第一抗体(40μg/mL)装载至蛋白A传感器上4分钟且传感器上剩余的Fc结合位点用不相关兔抗体(20μg/ml)阻断4分钟，随后将传感器浸泡于动力学缓冲液中10秒。随后将传感器暴露于重组LILRB4(25μg/mL)中4分钟。最后，将传感器暴露于第二抗体(40μg/mL)中4分钟以检查结合。原始数据使用ForteBio的数据分析软件7.0处理且评估抗体对的竞争性结合。第二抗体的额外结合指示未占用的表位(非竞争者“-”)，而无结合指示表位阻断(竞争者“+”)。
图28A至28C说明示例性LILRB4抗体的重链可变区的氨基酸序列。
图29A至29C说明示例性LILRB4抗体的重链可变区的核酸序列。
图30A至30C说明示例性LILRB4抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
图31A至31C说明示例性LILRB4抗体的轻链可变区的核酸序列。
图32说明不同浓度(0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml)的示例性抗LILRB4抗体的APOE竞争。与PBS对照相比，APOE活性的有效阻断表现为减少的GFP阳性(％)。
图33说明了LILRB4报告细胞/K562与不同浓度(0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml)的示例性抗LILRB4抗体的共培养。由于K562细胞上的Fc受体对抗体的潜在交联，因此在此分析中，潜在的促效抗体引起的GFP阳性(％)可相对高于PBS对照。
图34说明用不同浓度(0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml)的涂覆抗LILRB4抗体处理的LILRB4报告细胞。由于在此分析中抗体固定于塑料表面上，因此与PBS对照相比，识别LILRB4胞外域的抗体倾向于记录阳性GFP(％)信号。
图35说明用不同浓度(0.1μg/ml、1μg/ml及10μg/ml)的可溶性抗LILRB4抗体处理的LILRB4报告细胞。
图36说明通过流式细胞术确定结合表达食蟹猕猴LILRB4(cynob4)的CHO细胞的示例性抗LILRB4抗体。
图37说明通过示例性抗LILRB4抗体与LILRB家族成员、LILRA家族成员以及食蟹猕猴LILRB4(cynoB4)的交叉反应性。“+”指示抗体与特定重组蛋白的结合。
图38说明示例性抗LILRB4抗体兔#B4-193拯救被THP-1细胞抑制的T细胞。
图39A至39C说明示例性抗LILRB4抗体Rab-#128-3及Rab-#193抑制THP-1异种移植小鼠的白血病发展。
图40说明通过流式细胞术测定的h193抗体与人类LILRB4蛋白的结合。各直方图线条下的数字是指表8中展示的特异性重组人源化抗体。抗体39是不相关抗体。抗体39与PBS均充当阴性对照。
图41A至41M说明h193抗体与LILRB4蛋白的特异性结合。图41A至41L说明通过LILR报告体分析测定的h193抗体的特异性，其中将LILR报告细胞添加至涂覆有h193抗体的板中。h193抗体在报告细胞的表面上与LILR成员的ECD的结合诱导GFP信号。图41M说明通过ELISA测定的示例性h193抗体的特异性。将LILRA及LILRB重组蛋白涂覆于高吸收96孔板上。将连续稀释(5倍)的mAb h193添加至被涂覆/阻断的板且使用山羊抗人类IgG F(ab)2共轭的HRP作为二级抗体进行检测。
图42说明通过流式细胞术测定的h193抗体与食蟹猕猴LILRB4的结合。各直方图线条下的数字是指表8中展示的特异性重组人源化抗体。抗体39是不相关抗体。抗体39与PBS均充当阴性对照。
图43A及43B说明使用ApoE竞争分析(图43A)及K562共培养分析(图43B)得到的h193抗体的效果。各直方图线条下的数字是指表8中展示的特异性重组人源化抗体。抗体39是不相关抗体。抗体39与PBS均充当阴性对照。
图44A至44D说明细胞因子阵列分析的结果，所述分析测量h193抗体在调节PBMC(外周血液单核细胞)中的细胞因子分泌方面的效果。
图45A至45D说明细胞因子阵列分析的结果，所述分析测量h193抗体在调节与THP-1细胞共培养的PBMC细胞中的细胞因子分泌方面的效果。
图46A至46D说明细胞因子阵列分析的结果，所述分析比较了经人类IgG处理的PBMC及与人类IgG处理的THP-1细胞共培养的PBMC中的细胞因子分泌。
图47展示图44至46的细胞因子阵列分析的示例性影像(双重复)。
图48说明示例性h193抗体抑制异种移植小鼠模型的白血病发展。
图49A至49D说明LILRB4与h193的复合物的晶体结构。图49A，LILRB4/h193 scFv复合物的整体结构以草图展示。h193(重链，橙色；轻链，黄色)结合至LILRB4分子(洋红色)的D2结构域的D1D2铰链环及BC及C'E环。展示h193的重链(图49B)及轻链(图49C)与LILRB4部分结合的原子相互作用细节。参与相互作用的残基展示为棒状且经标记。氢键展示为红色短划线。图49D，由h193接触的LILRB4的结合表面。与h193重链或轻链接触的残基分别标为橙色或黄色，且通过重链及轻链两者结合的重叠残基标为绿色。
具体实施方式
本发明人已分离出一组识别LILRB4蛋白(含ITIM的受体)的新颖单克隆抗体，其能用于癌症治疗。LILRB4在一些肿瘤细胞(尤其白血病细胞)上被上调且促进肿瘤生长。已鉴别的抗人类ILIRB4抗体阻断LILRB4信号传导且能调节免疫来抵抗癌症。
本公开的以下描述仅希望说明本公开的各种实施例。因此，所论述的特定修饰不应解释为对本公开的范围的限制。本领域的技术人员显而易知，在不脱离本公开的范围的情况下，可以实现各种等效物、改变及修改，且应理解此类等效实施例将包括在本文中。本文引用的全部文献(包括公开、专利及专利申请)以全文引用的方式并入本文中。
I.定义
应理解，前文一般描述与以下详细说明仅举例说明及解释而非限制所要求的本发明。在本申请中，除非另外明确陈述，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另外陈述，否则使用“或”意指“和/或”。此外，使用术语“包括(including)”以及其它形式，例如“包括(includes)”及“包括(included)”，不具限制性。此外，除非另外明确陈述，否则例如“元件”或“组件”等术语涵盖包含一个单元的元件与组件以及包含多于一个次单元的元件与组件。此外，术语“部分(portion)”的使用能包括部分的一部分或整个部分。
除非上下文另外明确规定，否则如本文所用，单数形式“一(a/an)”及“所述(the)”包括多个(种)参考物。
如本文所使用，当提及例如量、时距等可测量值时，术语“约(about)”意指涵盖指定值的至多±10％的变化。除非另外指示，否则说明书及权利要求书中所使用的表示成分的量，例如分子量、反应条件等特性的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非与此相反地指示，否则在以下说明书及所附权利要求书中给出的数值参数皆为近似值，其可根据所公开的标的欲获得的期望特性而变。至少，且不试图将均等论的应用限于权利要求书的范围，各数值参数至少应根据所报道的有效数字的位数且通过应用普通舍位技术来解释。尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围及参数为近似值，但特定实例中所述的数值应尽可能精确地报道。然而，任何数值均内在地含有某些误差，其必然地由存在于其各别测试测量中的标准偏差产生。
术语“抗体”是指任何同型的完整免疫球蛋白或能够与完整抗体竞争与靶标抗原特异性结合的片段，且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人类抗体和双特异性抗体。“抗体”是抗原结合蛋白种类。完整抗体通常将包含至少两条全长重链及两条全长轻链，但在一些情况下可包括较少链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。抗体可仅仅来源于单一来源，或可以是“嵌合的”，即如下文中进一步描述抗体的不同部分可来源于两种不同抗体。抗原结合蛋白、抗体或结合片段可在杂交瘤中通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶或化学裂解来产生。除非另外指示，否则术语“抗体”包括除包含两条全长重链及两条全长轻链的抗体以外的其衍生物、变体、片段及突变蛋白，其实例描述于下文中。此外，除非明确排除，否则抗体分别包括单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、抗体融合物(有时在本文中称为“抗体共轭物”)及其片段。在一些实施例中，术语还涵盖肽体。
天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。各此类四聚体通常由两对相同多肽链构成，每一对具有一条全长“轻”链(在某些实施例中，约25kDa)及一条全长“重”链(在某些实施例中，约50-70kDa)。各链的氨基端部分通常包括通常负责抗原识别的具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区。各链的羧基端部分通常界定可负责效应功能的恒定区。人类轻链通常分为κ轻链及λ轻链。重链通常分为μ、δ、γ、α或ε，且将抗体的同型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有包括(但不限于)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4的若干亚类。IgM具有包括(但不限于)IgM1及IgM2的亚类。IgA类似地细分为包括(但不限于)IgA1及IgA2在内的亚类。在全长轻链及重链内，可变区及恒定区通常通过具有约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链还包括具有约超过10个氨基酸的“D”区。参见例如《基础免疫学(Fundamental Immunology)》,第7章(Paul,W.编,第2版Raven Press,N.Y.(1989))(出于所有目的以全文引用的方式并入本文中)。各轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
术语“可变区”或“可变域”是指抗体的轻链和/或重链的一部分，其通常包括重链中的大致120至130个氨基端氨基酸及轻链中的约100至110个氨基端氨基酸。在某些实施例中，不同抗体的可变区在氨基酸序列方面差异悬殊，甚至在相同物种的抗体中。抗体的可变区通常决定特定抗体对其靶标的特异性。
可变区通常展现由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)接合的相对保守构架区(FR)的相同通用结构。来自各对的两条链的CDR通常由构架区对准，其可实现与特异性表位结合。轻链及重链可变区的N端至C端通常均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。氨基酸指配给各结构域通常根据《免疫学感兴趣的蛋白质的Kabat序列(KabatSequences of Proteins of Immunological Interest)》(国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health),Bethesda,Md.(1987与1991)),Chothia和Lesk,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987)或Chothia等人,《自然(Nature)》,342:878-883(1989)的定义。
在某些实施例中，在不存在抗体轻链的情况下，抗体重链与抗原结合。在某些实施例中，在不存在抗体重链的情况下，抗体轻链与抗原结合。在某些实施例中，在不存在抗体轻链的情况下，抗体结合区与抗原结合。在某些实施例中，在不存在抗体重链的情况下，抗体结合区与抗原结合。在某些实施例中，在不存在其它可变区的情况下，单个可变区与抗原特异性结合。
在某些实施例中，CDR的明确描画及包含抗体的结合位点的残基的鉴别是通过求解抗体的结构和/或求解抗体-配体复合物的结构来实现。在某些实施例中，其可通过本领域的技术人员已知的各种技术中的任一者来实现，例如X射线结晶法。在某些实施例中，可采用各种分析方法鉴别或近似鉴别CDR区。此类方法的实例包括(但不限于)Kabat定义、Chothia定义、AbM定义及接触定义(contact definition)。
Kabat定义是用于对抗体中的残基编号的标准且通常用以鉴别CDR区。参见例如Johnson和Wu,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,28:214-8(2000)。Chothia定义类似于Kabat定义，但Chothia定义考虑某些结构环区的位置。参见例如Chothia等人,《分子生物学杂志》,196:901-17(1986)；Chothia等人,《自然》,342:877-83(1989)。AbM定义使用通过Oxford Molecular Group所产生的用于抗体结构建模的计算机程序的整合套件。参见例如Martin等人,《美国国家科学院院刊Proc Natl Acad Sci(USA)》,86:9268-9272(1989)；“AbMTM，一种对抗体可变区建模的计算机程序”，英国牛津(Oxford,UK)；Oxford Molecular,Ltd。AbM定义使用知识数据库与全始算法(ab initio method)的组合建模来自一级序列的抗体的三级结构，所述方法例如通过以下所描述的那些：Samudrala等人，《蛋白质：结构、功能和遗传学(PROTEINS,Structure,Function and Genetics.)》增刊,3:194-198(1999)中的“使用组合的分级方法重新预测蛋白质结构(Ab Initio Protein StructurePrediction Using a Combined Hierarchical Approach)”。接触定义是基于可用复合晶体结构的分析。参见例如MacCallum等人,《分子生物学杂志》,5:732-45(1996)。
按照惯例，重链中的CDR区通常称为H1、H2及H3且在氨基端至羧基端的方向上连续编号。轻链中的CDR区通常称为L1、L2及L3且在氨基端至羧基端的方向上连续编号。
术语“轻链”包括全长轻链及具有足以赋予结合特异性的可变区序列的其片段。全长轻链包括可变区域VL及恒定区CL。轻链的可变区域在多肽的氨基端处。轻链包括κ链及λ链。
术语“重链”包括全长重链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长重链包括可变区域VH及三个恒定区CH1、CH2及CH3。VH结构域位于多肽的氨基端，且CH结构域位于羧基端，其中CH3最接近多肽的羧基端。重链可以是任何同型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亚型)、IgA(包括IgA1及IgA2亚型)、IgM及IgE。
双特异性或双功能抗体通常为具有两个不同重链/轻链对及两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过各种方法(包括(但不限于)杂交瘤融合或连接Fab'片段)来产生。参见例如Songsivilai等人,《临床和实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)》,79:315-321(1990)；Kostelny等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》,148:1547-1553(1992)。
术语“抗原”是指能够诱导适应性免疫反应的物质。具体地说，抗原是充当适应性免疫反应的受体的靶标的物质。通常，抗原是与抗原特异性受体结合的分子，但无法通过自身在体内诱导免疫反应。抗原通常是蛋白质及多糖，不常见的还有脂质。适合的抗原包括(但不限于)细菌(包衣、胶囊、细胞壁、鞭毛、纤毛和毒素)、病毒以及其它微生物的部分。抗原还包括肿瘤抗原，例如，通过肿瘤中的突变产生的抗原。如本文所使用，抗原还包括免疫原及半抗原。
如本文所使用的“抗原结合蛋白”(“ABP”)意指结合指定的靶标抗原的任何蛋白。在本申请中，指定的靶标抗原为LILRB蛋白或其片段。“抗原结合蛋白”包括(但不限于)抗体及其抗原结合片段。肽体是抗原结合蛋白的另一实例。
如本文所使用的术语“抗原结合片段”是指能够与抗原特异性结合的蛋白质的一部分。在某些实施例中，抗原结合片段来源于包含一或多个CDR的抗体，或与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。在某些实施例中，抗原结合片段不来源于抗体而实际上来源于受体。抗原结合片段的实例包括(但不限于)双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、单域抗体(sdAb)、骆驼抗体或纳米抗体、域抗体及二价域抗体。在某些实施例中，抗原结合片段能够与亲本抗体结合的相同抗原结合。在某些实施例中，抗原结合片段可包含一或多种来自特定人类抗体的CDR，所述人类抗体移植至一或多种不同人类抗体的构架区。在某些实施例中，抗原结合片段来源于受体且含有一或多个突变。在某些实施例中，抗原结合片段不结合衍生所述抗原结合片段的受体的天然配体。
“Fab片段”包含一条轻链及一条重链的CH1及可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
“Fab'片段”包含一条轻链及一条重链的一部分，所述部分含有VH结构域及CH1结构域以及CH1与CH2结构域之间的区域，使得可在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。
“F(ab')2片段”含有两条轻链及两条重链，所述重链含有CH1与CH2结构域之间的一部分恒定区，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由两个Fab'片段构成，所述片段通过两条重链之间的二硫键保持在一起。
“Fc”区包含两条重链片段，所述重链片段包含抗体的CH1及CH2结构域。两个重链片段通过两个或多于两个二硫键及通过CH3结构域的疏水性相互作用保持在一起。
“Fv区”包含来自重链与轻链的可变区，但缺乏恒定区。
“单链抗体”是Fv分子，其中重链与轻链可变区已由柔性连接子连接而形成单一多肽链，从而形成抗原结合区。单链抗体详细论述于国际专利申请公开第WO 88/01649号及美国专利第4,946,778号及第5,260,203号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
“域抗体”是仅含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或多于两个VH区通过肽连接子共价接合而产生二价域抗体。二价域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同抗原。
“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同抗原特异性。二价抗原结合蛋白及二价抗体可以是双特异性的，参见下文。在某些实施例中，除“多特异性”或“多功能性”抗体外的二价抗体通常应理解为其每一个结合位点都相同。
“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向超过一种抗原或表位的抗原结合蛋白或抗体。
“双特异性”、“双重特异性”或“双功能性”抗原结合蛋白或抗体分别是具有两个不同抗原结合位点的杂交抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗原结合蛋白及抗体是多特异性抗原结合蛋白抗体种类且可通过各种方法产生，所述方法包括(但不限于)杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如Songsivilai及Lachmann,1990,《临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)》79:315-321；Kostelny等人,1992,《免疫学杂志(J.Immunol.)》148:1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将与两个不同的表位结合，所述两个不同的表位可存在于相同或不同蛋白质靶标上。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合搭档(例如抗原)之间的全部非共价相互作用的强度。除非另外指示，否则如本文所使用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体与抗原)成员之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。可通过本领域中已知的常见方法(包括本文所描述的方法)测量亲和力。低亲和力抗体一般缓慢结合抗原且倾向于容易分解，而高亲和力抗体一般较快结合抗原且倾向于较长时间保持结合状态。本领域中已知多种测量结合亲和力的方法，其中任一者可用于本发明的目的。用于测量结合亲和力的特定说明性及示例性实施例描述于下文中。
“与特定多肽或特定多肽上的表位特异性结合”或“对特定多肽或特定多肽上的表位具有特异性”的抗体是结合于特定多肽或特定多肽上的表位而实质上不结合于任何其它多肽或多肽表位的抗体。举例来说，本发明的LILRB4特异性抗体特异于LILRB4。在一些实施例中，与LILRB4结合的抗体的解离常数(Kd)为≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如10-8M或更低；例如10-8M至10-13M；例如10-9M至10-13M)。
术语“竞争”当用于抗原结合蛋白(例如抗体或其抗原结合片段)竞争相同的表位的情形时，意指如通过分析所测定的抗原结合蛋白之间的竞争，其中测试的抗原结合蛋白(例如抗体或其抗原结合片段)阻止或抑制(例如减少)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与普通抗原(例如LILRB或其片段)的特异性结合。可使用许多类型的竞争性结合分析来确定一个抗原结合蛋白是否与另一抗原结合蛋白竞争，例如：固相直接或间接放射免疫分析(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析(EIA)、夹心竞争分析(参见例如Stahli等人,1983,《酶学方法(Methods in Enzymology)》9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Kirkland等人,1986,《免疫学杂志(J.Immunol.)》137:3614-3619)；固相直接标记分析、固相直接标记夹心分析(参见例如Harlow及Lane,1988,《抗体：实验室手册(Antibodies,A Laboratory Manual)》,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))；使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见例如Morel等人,1988,《分子生物学(Molec.Immunol.)》25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Cheung等人,1990,《病毒学(Virology)》176:546-552)；以及直接标记的RIA(Moldenhauer等人,1990,《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》32:77-82)。通常，此类分析涉及使用与携带未标记的测试抗原结合蛋白及经标记的参考抗原结合蛋白的任一者的固体表面或细胞结合的纯化抗原。通过测定在测试抗原结合蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记量来测量竞争性抑制。通常存在过量的测试抗原结合蛋白。由竞争分析识别的抗原结合蛋白(完全抗原结合蛋白)包括与参考抗原结合蛋白结合至同一表位的抗原结合蛋白及结合至与参考抗原结合蛋白所结合的表位足够接近的相邻表位而使得位阻存在的抗原结合蛋白。关于测定竞争结合的方法的其它细节提供于本文中的实例中。通常，当竞争抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如减少)参考抗原结合蛋白与普通抗原的特异性结合至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更高。在一些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更高。
如本文所使用的术语“表位”是指抗体所结合的抗原上的特定原子或氨基酸群。表位可以是线性表位或构形表位。线性表位通过来自抗原的连续氨基酸序列形成且基于其一级结构与抗体相互作用。在另一方面，构形表位由抗原氨基酸序列的非连续部分构成且基于抗原的3D结构与抗体相互作用。一般而言，表位的长度大致为五个或六个氨基酸。如果两个抗体对某个抗原展现竞争性结合，则其可结合所述抗原内的同一个表位。
如本文所使用，“细胞”可以是原核或真核的。原核细胞包括例如细菌。真核细胞包括例如真菌、植物细胞及动物细胞。动物细胞的类型(例如哺乳动物细胞或人类细胞)包括例如来自循环/免疫系统或器官的细胞，例如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀手T细胞、调节T细胞、T辅助细胞)、自然杀手细胞、粒细胞(例如嗜碱性球粒细胞、嗜伊红血球粒细胞、嗜中性白细胞粒细胞和多分叶核嗜中性白细胞)、单核细胞或巨噬细胞、红血球(例如网状红血球)、肥大细胞、凝血细胞或巨核细胞及树突状细胞；来自内分泌系统或器官的细胞，例如甲状腺细胞(例如甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、副甲状腺细胞(例如副甲状腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺细胞(例如嗜铬细胞)及松果体细胞(例如松果腺细胞)；来自神经系统或器官的细胞，例如神经胶质细胞(例如星形胶质细胞及寡树突神经胶质细胞)、微神经胶质细胞、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、贝契尔(boettcher)细胞及垂体细胞(例如促性腺激素(gonadotrope)、促肾上腺皮质激素(corticotrope)、促甲状腺激素(thyrotrope)、促生长激素(somatotrope)及催乳激素(lactotroph))；来自呼吸系统或器官的细胞，例如肺胞壁细胞(I型肺胞壁细胞及II型肺胞壁细胞)、克拉拉(clara)细胞、杯状细胞及肺泡巨噬细胞；来自循环系统或器官的细胞(例如心肌细胞及外被细胞)；来自消化系统或器官的细胞，例如胃主细胞、壁细胞、杯状细胞、潘氏(paneth)细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞、肠内分泌细胞、肠亲铬细胞、APUD细胞及肝细胞(例如肝细胞及库普弗(Kupffer)细胞)；来自表皮系统或器官的细胞，例如骨骼细胞(例如成骨细胞、骨细胞及破骨细胞)、牙齿细胞(例如成垩质细胞及成釉细胞)、软骨细胞(例如软骨母细胞及软骨细胞)、皮肤/毛发细胞(例如毛细胞、角质细胞及黑色素细胞(斑痣细胞(Nevuscell)))、肌肉细胞(例如肌细胞)、脂肪细胞、纤维母细胞及肌腱细胞；来自泌尿系统或器官的细胞(例如，足细胞、近肾小球细胞、肾小球内系膜细胞、肾小球外膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞及致密斑细胞)；以及来自生殖系统或器官的细胞(例如精子、塞特利氏(Sertoli)细胞、雷迪格(leydig)细胞、卵细胞、卵母细胞)。细胞可以是正常健康的细胞；或病变或不健康的细胞(例如癌细胞)。细胞进一步包括哺乳受精卵或干细胞，所述干细胞包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、诱导性多能干细胞及成体干细胞。干细胞是能够经历细胞分裂周期，同时保持未分化状态且分化成特定细胞类型的细胞。干细胞可以是全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞、寡能干细胞以及单能干细胞，其中的任一者可由体细胞诱导。干细胞也可包括癌症干细胞。哺乳动物细胞可以是啮齿动物细胞，例如小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞。哺乳动物细胞可以是兔类细胞，例如家兔细胞。哺乳动物细胞还可以以是灵长类动物细胞，例如人类细胞。
如本文所使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂交蛋白或多肽，其含有连接至活化免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)的结构域或信号传导(例如T细胞信号传导或T细胞活化结构域)的抗体(例如单链可变片段(scFv))的抗原结合域(参见例如前述Kershaw等人,Eshhar等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,90(2):720-724(1993),及Sadelain等人,《免疫学新见(Curr.Opin.Immunol.)》21(2):215-223(2009))。CAR能够利用单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制性方式将免疫细胞特异性及反应性导向至所选靶标。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的免疫细胞不依赖抗原加工来识别抗原的能力，从而绕过主要的肿瘤逃逸机理。另外，当在T细胞中表达时，CAR不与内源性T细胞受体(TCR)α及β链二聚合是有利的。
如本文所使用，关于指定组分“基本上无”在本文中用于意指指定组分中无一者有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期污染产生的指定组分总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选其中指定组分的量无法用标准分析方法检测到的组合物。
术语“宿主细胞”意指已用或能够用核酸序列转化且借此表达相关基因的细胞。术语包括亲本细胞的子代，而不管子代在形态或遗传构成方面是否与原始亲本细胞一致，只要存在相关基因即可。
术语“一致性”是指两种或超过两种多肽分子或两种或超过两种核酸分子的序列之间的关系，如通过比对及比较所述序列所测定。“一致性百分比”意指所比较分子中的氨基酸或核苷酸之间的相同残基的百分比，且是基于所比较分子中最小的尺寸来计算。对于这些计算，优选地通过特定数学模型或计算机程序(即“算法”)来处理比对中的空隙(若存在)。可用于计算所比对核酸或多肽的一致性的方法包括以下文献中所描述的方法：《计算分子生物学(Computational Molecular Biology)》,(Lesk,A.M.编),1988,纽约：牛津大学出版社(New York:Oxford University Press)；《生物计算信息和基因组规划(Biocomputing Informatics and Genome Projects)》,(Smith,D.W.编),1993,纽约：学术出版社(New York:AcademicPress)；《序列数据的计算机分析(Computer Analysis ofSequence Data)》,第I部分,(Griffin,A.M.及Griffin,H.G.编),1994,新泽西：哈马纳出版社(New Jersey:Humana Press)；von Heinje,G.,1987,《分子生物学的序列分析(SequenceAnalysis in Molecular Biology)》,纽约：学术出版社(New York:Academic Press)；《序列分析引物(Sequence Analysis Primer)》,(Gribskov,M.及Devereux,J.编),1991,纽约：M.斯托克顿出版社(New York:M.Stockton Press)；以及Carillo等人,1988,SIAM《应用数学杂志(J.Applied Math.)》48:1073。
在计算一致性百分比时，通常以在序列之间得到最大匹配的方式比对所比较的序列。可用于测定一致性百分比的计算机程序的一个实例是GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人,(1984)《核酸研究(Nucl.Acid Res.)》12:387；遗传学计算机基团(GeneticsComputer Group),威斯康辛州，威斯康辛大学麦迪逊分校(University of Wisconsin,Madison,Wis.))。使用计算机算法GAP来比对待测定序列一致性百分比的两个多肽或聚核苷酸。比对序列以获得其各别氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配跨度”，如由算法所测定)。空位开放罚分(gap opening penalty)(其按3×平均对角线计算，其中“平均对角线”是所用比较基质的对角线的平均值；“对角线”是由特定比较基质分配给各完美氨基酸匹配的得分或数值)及空位扩展罚分(gap extension penalty)(其通常为1/10倍空位开放罚分)以及比较基质(例如PAM250或BLOSUM 62)与算法结合使用。在某些实施例中，算法还使用标准比较基质(对于PAM 250比较基质，参见Dayhoff等人,1978,《蛋白质序列和结构图册(Atlasof Protein Sequence and Structure)》5:345-352；对于BLOSUM 62比较基质，参见Henikoff等人,1992,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》89:10915-10919)。
可用于使用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的一致性百分比的参数实例可见于Needleman等人,1970,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:443-453中。
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可产生两个序列的仅较短区域的匹配，且此较小比对区可具有极高序列一致性，即使两个全长序列之间不存在显著关系。因此，如果有此需要，则可调整所选择的比对方法(GAP程序)以产生跨越靶标多肽的至少50个或其它数目的连续氨基酸的比对。
如本文所使用的术语“连接”是指经由分子内相互作用(例如共价键、金属键和/或离子键)或分子间相互作用(例如氢键或非共价键)的缔合。
白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4(LILRB4)是人类中由LILRB4基因编码的蛋白质。此基因是白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族成员，其发现于染色体区19q13.4的基因丛中。所编码蛋白质属于LIR受体的亚家族B类，其含有两个或四个胞外免疫球蛋白域、跨膜域以及两个至四个基于细胞质免疫受体酪氨酸的抑制性模体(ITIM)。受体在免疫细胞上表达，其中其与抗原呈递细胞上的I类MHC分子结合且转导抑制免疫反应刺激的负信号。受体也可在抗原捕获及呈递中起作用。认为控制发炎反应及细胞毒性有助于集中免疫反应且限制自身反应性。LILRB4还在人类胃癌细胞中表达且可促进肿瘤生长。已发现此基因的编码不同同功异型物的多种转录变体。LILRB4已展示与PTPN6相互作用。
术语“可操作地连接”是指元件的排列，其中如此描述的元件经配置以便执行其常见功能。因此，与多肽可操作地连接的给定信号肽引导细胞分泌多肽。在启动子的情况下，与编码序列可操作地连接的启动子将引导编码序列的表达。启动子或其它控制元件不需要与编码序列相邻，只要其发挥引导其表达的作用即可。举例来说，未转译但经转录的介入序列可存在于启动子序列与编码序列之间且启动子序列仍可视为与编码序列“可操作地连接”。
尽管本公开支持仅指替代物及“和/或”的定义，但除非明确指示为仅指替代物或替代物相互排斥，否则术语“或”在权利要求书中的使用用于指“和/或”。如本文所使用，“另一”可意指至少第二个或更多个。
术语“聚核苷酸”或“核酸”包括单链与双链核苷酸聚合物。包含聚核苷酸在内的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的经修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，例如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修饰，例如2',3'-二脱氧核糖；以及核苷酸间键联修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯及磷酰氨酸酯。
术语“多肽”或“蛋白质”意指具有天然蛋白质氨基酸序列的大分子，即，由天然存在且非重组的细胞产生的蛋白质；或其由经基因工程改造或重组细胞产生，且包含具有天然蛋白质氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语还包括氨基酸聚合物及聚合物，其中一或多个氨基酸为对应天然存在的氨基酸的化学类似物。术语“多肽”及“蛋白质”具体涵盖LILRB抗原结合蛋白、抗体或具有抗原结合蛋白的一或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白质相比具有氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失的多肽。与天然蛋白质相比，此类片段还可以含有经修饰的氨基酸。在某些实施例中，片段具有约五至500个氨基酸长。举例来说，片段可以具有至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸长。适用的多肽片段包括抗体的免疫功能性片段，包括结合域。在LILRB结合抗体的情况下，适用的片段包括(但不限于)CDR区、重链和/或轻链的可变域、抗体链的一部分或刚好其包括两个CDR的可变区等。
用于本发明的药学上可接受的载体是常规的。《雷明顿氏医药科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》，由E.W.Martin,Mack联合出版，Easton,PA,第15版(1975)，描述适合于本文所公开的融合蛋白的医药递送的组合物及配制物。一般而言，载体的性质将视采用的特定施用模式而定。举例来说，肠胃外配制物通常包含可注射流体，包括医药学上及生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为媒剂。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包括例如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性载体以外，待施用的医药组合物可含有少量无毒辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂及pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
如本文所使用，术语“受试者”是指人类或任何非人类动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人类包括产前及产后形式。在许多实施例中，受试者是人类。受试者可以是患者，其是指呈递给医疗提供者以诊断或治疗疾病的人类。术语“受试者(subject)”在本文中与“个体(individual)”或“患者”可互换地使用。受试者可罹患或易患疾病或病症，但可能会或可能不会显示所述疾病或病症的症状。
如本文所使用的术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指可有效治疗疾病或病状的剂量或药物浓度。举例来说，关于本文所公开的单克隆抗体或其抗原结合片段用于治疗癌症的用途，治疗有效量是能够减少肿瘤体积、根除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长或癌细胞浸润至其它器官中、抑制介导癌性病状的细胞的生长或增殖、抑制或减缓肿瘤细胞癌转移、改善与肿瘤或癌性病状相关的任何症状或标记、预防或推迟肿瘤或癌性病状的恶化或其某一组合的单克隆抗体或其抗原结合片段的剂量或浓度。
如本文所使用，病状的“治疗(Treating或treatment)”包括预防或减轻病状、减缓病状恶化的发作或速率、降低出现病状的风险、预防或推迟与病状相关的症状的恶化、减少或终止与病状相关的症状、产生病状的完全或部分消退、治愈病状或其某一组合。
如本文所使用，“载体”是指引入宿主细胞中，借此产生经转化宿主细胞的核酸分子。载体可包括准许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一或多个治疗基因和/或可选标记基因及本领域中已知的其它基因元件。载体能够转导、转化或感染细胞，借此使细胞表达除细胞原生之外的核酸和/或蛋白质。载体任选地包括有助于实现核酸进入细胞中的材料，例如病毒颗粒、脂质体、蛋白质包被等。
II.癌症
A.癌症
虽然过度增殖性疾病可与任何导致细胞开始不受控制地再生的疾病相关，但原型实例为癌症。癌症的关键要素之一是细胞的正常凋亡周期被中断且因此中断细胞生长的药剂作为治疗这些疾病的治疗剂是重要的。在本发明中，本文所描述的特吡莱辛(tubulysin)类似物可用于引起细胞计数减少且因此可潜在地用于治疗各种类型的癌症系。在一些方面中，预期本文所描述的特吡莱辛类似物可用于治疗几乎任何恶性肿瘤。此处，唯一要求是在癌细胞的表面上，且尤其在癌症干细胞的表面上存在LILRB。
可根据本公开治疗的癌细胞包括(但不限于)来自以下的细胞：膀胱、血液、骨骼、骨髓、大脑、乳房、结肠、食道、肠胃、齿龈、头、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、胰脏、睾丸、舌、子宫颈或子宫。另外，癌症可特定地具有以下组织学类型，但其不限于这些：恶性肿瘤；癌瘤；未分化癌瘤；巨细胞及梭状细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；肝细胞癌与胆管癌的组合；小梁腺癌；腺样囊性癌症；腺瘤息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠多发性息肉；实体癌；恶性类癌；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性癌；嗜氧性腺癌；嗜碱性癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状及滤泡腺癌；无包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺腺癌；耵聍腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；戒环细胞癌；浸润性导管癌；髓性癌；小叶癌；炎性癌；乳房佩吉特氏病(Paget's disease)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌w/鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞肿瘤；恶性睾丸母细胞瘤；塞特利氏细胞癌(sertolicell carcinoma)；恶性雷迪格细胞肿瘤(Leydig cell tumor)；恶性脂质细胞肿瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素斑痣内恶性黑色素瘤；上皮状细胞黑色素瘤；恶性蓝色斑痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合肿瘤；苗勒氏管(Mullerian)混合肿瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间质瘤；恶性布伦纳氏瘤(Brennertumor)；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)；恶性血管外皮瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶细胞软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；肌原纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；神经胶母细胞瘤；寡树突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经性肿瘤；恶性脊膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞肿瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病(Hodgkin'sdisease)；类肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；，大细胞弥散性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样霉菌病；其它指定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓白血病；嗜碱性白血病；嗜伊红血球性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；骨髓性肉瘤；以及毛细胞白血病。在某些方面中，肿瘤可包含骨肉瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤文氏肉瘤、神经胶母细胞瘤、神经母细胞瘤或白血病。
B.急性骨髓性白血病
急性骨髓性白血病(AML)，也称为急性骨髓白血病或急性非淋巴球性白血病(ANLL)，是一种骨髓系血细胞的癌症，其特征为异常白细胞的迅速生长，所述白细胞在骨髓中积累且干扰正常血细胞的产生。AML是最常见的影响成年人的急性白血病，且其发病率随年龄而增加。在美国，尽管AML是相对罕见的疾病，但其占癌症死亡的大致1.2％，其发病率预期会随群体年龄而增加。
AML的症状是由白血病细胞替代正常骨髓引起的，其导致红血球、血小板及正常白细胞的下降。这些症状包括疲乏、呼吸短促、容易瘀伤及出血，以及感染风险升高。已确认若干危险因素及染色体异常，但具体原因尚不清楚。作为急性白血病，AML进展迅速，且若未加治疗，则通常在数周或数月内致命。
AML具有若干亚型；治疗及预后随亚型而变。五年存活率在15-70％内变化，且复发率在33-78％内变化，其取决于亚型。AML最初用旨在诱导缓解的化学疗法治疗；患者可继续接受额外的化学疗法或造血干细胞移植。最近对AML遗传学的研究已产生可预测何种药物对特定患者可起最佳作用，以及患者可能存活多久的测试可用性。
AML的大部分体征及症状由白血病细胞替代正常血细胞引起的。缺乏正常的白细胞生成使患者易遭受感染；虽然白血病细胞本身来源于白细胞前体，但其没有抗感染能力。红血球计数下降(贫血)可导致疲乏、苍白及呼吸短促。血小板的缺乏可导致轻微外伤后容易擦伤或出血。
AML的早期体征通常为模糊的及非特异性的，且可与流感或其它常见疾病的体征类似。一些一般性症状包括发热、疲乏、体重减轻或食欲不振、呼吸短促、贫血、容易擦伤或出血、瘀斑(出血引起的皮肤下扁平的大头针尺寸的斑点)、骨骼及关节痛及持续或频繁感染。
AML中可出现脾增大，但其通常为轻微及无症状的。与急性淋巴母细胞白血病相比，AML中的淋巴结肿胀为罕见的。所累及的皮肤约10％的时间呈白血病皮肤的形式。AML可很少伴发斯威特氏综合症(Sweet's syndrome)，一种皮肤的副肿瘤炎症。
由于白血病细胞浸润至齿龈组织中，一些患有AML的患者可遭受齿龈的肿胀。罕见地，白血病的第一病征可以是骨髓外的实体白血病肿块或肿瘤的恶化，称为绿色瘤。偶尔，一个人可不展示症状且白血病可在常规血液检测期间偶然地发现。
已确认多种使AML恶化的危险因素，其包括：其它血液病症、化学暴露、电离辐射及遗传。
“白血病前期”血液病症，例如骨髓发育不良综合症或骨髓增生性疾病，可演变成AML；准确的风险取决于MDS/MPS的类型。暴露于抗癌化学疗法，具体地说烷基化剂，可增加随后使AML恶化的风险。化学疗法后约三至五年的风险为最高。其它化学疗法剂，具体地说表鬼臼毒素及蒽环霉素，也与治疗相关的白血病相关。这些治疗相关的白血病通常与白血病细胞中的特定染色体异常相关。职业性化学暴露苯及其它芳香族有机溶剂作为AML的病因是有争议的。苯及其许多衍生物在试管内已知为致癌的。虽然一些研究已表明职业性暴露于苯与AML的风险增加之间的关联，但其它研究已表明可归因风险(若存在)为轻微的。大量电离辐射暴露可增加AML的风险。AML似乎存在遗传风险。已报导多个AML病例在家庭中的恶化速率高于仅偶然的预测。若干先天性病状可增加白血病的风险；最常见的可能为唐氏综合症(Down syndrome)，其与AML的风险增加10至18倍相关。
AML诊断的第一条线索通常是全血球计数的异常结果。虽然异常白细胞过多(白细胞增多症)为常见的结果，且有时发现白血病母细胞，但AML还可以出现血小板、红血球的单独减少，或甚至低白细胞计数(白细胞减少症)。虽然AML的假定诊断可经由在循环白血病母细胞存在时检查外周血液涂片来进行，但决定性诊断通常需要充分的骨髓抽吸及活组织检查。
经由光学显微术以及流式细胞术检查骨髓或血液以诊断白血病的存在，区分AML与其它类型的白血病(例如急性淋巴母细胞白血病-ALL)，且对疾病的亚型进行分类(参见下文)。骨髓或血液样品通常还通过常规细胞遗传学或荧光原位杂交来检测染色体异常。还可以进行基因研究以寻找基因中的特定突变，例如FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)、核仁磷酸蛋白(nucleophosmin)及KIT，其可影响疾病的结果。
血液及骨髓涂片上的细胞化学染色有助于区分AML与ALL且有助于AML的细分。骨髓过氧化酶或苏丹黑(Sudan black)染色与非特异性酯酶染色的组合将提供大多数情况所需的信息。骨髓过氧化酶或苏丹黑反应最适用于确立AML的鉴定及将其与ALL区分开来。非特异性酯酶染色是用于鉴别AML中的单核细胞组件及将分化不良的单核母细胞性白血病与ALL区分开来。
AML的诊断及分类可具挑战性且应由合格的血液病理学家或血液学家进行。在简单情况下，某些形态学特征(例如奥尔氏(Auer)棒)或特定流式细胞术结果的存在可区分AML与其它白血病；然而，在此类特征不存在下，诊断可能较困难。
根据广泛使用的WHO准则，AML的诊断是通过证实超过20％的血液和/或骨髓被白血病骨髓母细胞累及而确定。法国-美国-英国(FAB)分类较严格，诊断AML要求骨髓(BM)或外周血液(PB)中存在至少30％的母细胞百分比。必须小心地将AML与“白血病前期”病状(例如骨髓发育不良或骨髓增生性综合症)区分开来，那些病状的治疗不同。
因为急性早幼粒细胞白血病(APL)具有最高可治愈性且需要独特的治疗形式，所以快速确定或排除此白血病亚型的诊断是重要的。对血液或骨髓进行荧光原位杂交常用于此目的，因为其容易鉴别出表征APL的染色体易位[t(15；17)(q22；q12)；]。还需要以分子形式检测PML/RARA融合蛋白的存在，其为易位的致癌产物。
AML的一线治疗主要由化学疗法组成且分成两个阶段：诱导及缓解后(或巩固)疗法。诱导疗法的目标是通过将白血病细胞的数目减少至不可检测水平来实现完全缓解；巩固疗法的目标是消除任何残留的不可检测疾病且实现治愈。如果诱导化学疗法失败或患者复发后，则通常考虑造血干细胞移植，但移植有时也用作患有高风险疾病的患者的一线疗法。
除M3外的所有FAB亚型通常给出用阿糖胞苷(ara-C)及蒽环霉素(最常为道诺霉素)的诱导化学疗法。此诱导化学疗法方案被称为“7+3”(或“3+7”)，因为阿糖胞苷连续七日作为连续IV输注给药，而蒽环霉素连续三日作为IV推注给药。至多70％的患者将通过此方案实现缓解。还可以使用其它替代诱导方案，包括单独高剂量阿糖胞苷、FLAG样方案或研究性药剂。由于疗法的毒性作用(包括骨髓抑制及感染风险的增加)，诱导化学疗法可不提供给高龄老人，且选项可包括强度较小的化学疗法或姑息护理。
AML的M3亚型，也称为急性早幼粒细胞白血病(APL)，除诱导化学疗法(通常为蒽环霉素)以外，几乎普遍地用药物全反式视黄酸(ATRA)治疗。必须小心地预防弥散性血管内凝血(DIC)，当早幼粒细胞释放其颗粒的内含物至外周循环时，使APL的治疗复杂化。根据充分证明的治疗方案，APL是非常容易治愈的，。
诱导阶段的目标应是实现完全缓解。完全缓解并非指疾病已治愈；相反，其表示可用的诊断方法无法检测到疾病。约50％-75％的新诊断成人获得完全缓解，尽管此可基于上述的预后因子而变化。缓解的时长取决于初始白血病的预后特征。一般而言，没有额外的巩固疗法，所有缓解将失败。
即使在实现完全缓解后，白血病细胞的数目可能仍太小而无法用当前诊断技术来检测。若不给出进一步的缓解后疗法或巩固疗法，则几乎所有患者将最终复发。因此，需要更多疗法以消除不可检测到的疾病且防止复发，即实现治愈。
特定类型的缓解后疗法基于患者的预后因子(参见上文)及一般健康状况进行个体化。对于预后良好的白血病(即，inv(16)、t(8；21)及t(15；17))，患者将通常进行额外的三至五个疗程的强化化学疗法，称为巩固化学疗法。对于复发风险高的患者(例如具有高风险细胞遗传学、潜在MDS或疗法相关的AML的患者)，如果患者能够耐受移植且具有适合的供体，则通常建议异源干细胞移植。中危AML(正常细胞遗传学或不属于良好风险或高风险群组的细胞遗传学变化)的最佳缓解后疗法为不太明晰的且取决于具体情况，包括患者的年龄及总体健康状况、患者的个人价值及适合的干细胞供体是否为可用的。
对于不适合干细胞移植的患者，在巩固完成之后用组胺二盐酸盐(Ceplene)与白介素2(Proleukin)的组合进行免疫疗法，已展示绝对复发风险降低14％，换算为维持缓解的可能性增加50％。
对于复发AML的患者，唯一证实的潜在治愈疗法是造血干细胞移植(如果造血干细胞移植尚未进行)。在2000年，与单克隆抗体连接的细胞毒性剂吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg)在美国批准用于年龄大于60岁患有复发AML的患者，所述患者不是高剂量化学疗法的候选者。此药物于2010年被其制造商辉瑞(Pfizer)自愿退市。由于复发AML的治疗选项非常有限，因此可提供姑息护理。
不是干细胞移植候选者或在干细胞移植后已复发的复发AML患者可在临床试验中提供治疗，因为常规治疗选项有限。正研究的药剂包括细胞毒性药物，例如氯法拉滨(clofarabine)，以及靶向疗法，例如法呢基转移酶抑制剂、地西他滨(decitabine)及MDR1(多药耐药性蛋白)抑制剂。对于复发的急性前髓细胞性白血病(APL)，三氧化二砷已在试验中测试且经美国FDA批准。如同ATRA，三氧化二砷对其它亚型的AML不起作用。
虽然急性骨髓性白血病为可治愈疾病，但特定患者治愈的机会取决于多种预后因子。AML中唯一最重要的预后因子为细胞遗传学或白血病细胞的染色体结构。某些细胞遗传学异常与极佳结果相关(例如，急性前髓细胞性白血病中的(15:17)易位)。约一半的AML患者具有“正常”细胞遗传学；其属于中危群组。已知多种其它细胞遗传学异常与治疗后的不良预后及高复发风险有关。
由预先存在的骨髓发育不良综合症(MDS)或骨髓增生性疾病(所谓的继发性AML)引起的AML具有更差的预后，因为在针对另一前述恶性肿瘤的化学疗法后引起的治疗相关AML亦如此。这些实体皆与高比率的不利细胞遗传学异常相关。
在一些研究中，年龄>60岁及乳酸脱氢酶含量升高也与不良结果相关。如同大部分癌症形式，机能状态(即，患者的一般身体状况及活动性水平)对预后同样起重要作用。
FLT3内部串联复制(ITD)已展示对AML赋予不良预后。用更积极的疗法治疗这些患者，例如第一次缓解中的干细胞移植，尚未展示提高长期存活率。FLT3的ITD可与白细胞淤滞相关。2012年，FLT3抑制剂喹杂替尼(quizartinib)在具有FLT3-ITD突变的AML患者中展示II期阳性试验结果。2017年，由FDA批准的FLT3抑制剂
Figure BDA0002973222510000341
(米哚妥林(midostaurin)，以前为PKC412)用于治疗新诊断的FLT3突变阳性(FLT3+)的AML患者，如FDA批准的测试结合化学疗法所检测。
研究人员正研究AML中c-KIT突变的临床意义。由于酪氨酸激酶抑制剂(例如伊马替尼(imatinib)及舒尼替尼(sunitinib))可用于在药理学上阻断c-KIT的活性，因此这些是普遍的且临床上相关。其它正作为预后因子或治疗靶标研究的基因包括CEBPA、BAALC、ERG及NPM1。
B.慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)
CMML是具有骨髓增生性肿瘤与骨髓发育不良综合症的临床及病理特征的恶性造血干细胞病症。患者可能出现由先前未识别的细胞减少症(例如感染、疲乏、呼吸困难、瘀斑、出血)、皮肤病变或脾肿大相关的症状(例如，早期饱腹感、腹部饱胀)导致的症状或并发症。CMML的特征在于外周血液单核细胞增多症伴随骨髓发育不良。在美国，每年诊断大致2,000例新的CMML病例。15至30％的病例恶化为AML(Swerdlow等人,2017)，且整个WHO预后小组在初始诊断后的10至48个月范围内的中值存活率令人沮丧。只有HSCT使CMML患者的疾病发生临床上显著程度的改善，包括细胞减灭及低甲基化剂的其它疗法提供症状缓解(Schuler等人,2014)。因此，迫切需要新的疗法以降低CMML患者的罹病率且延长存活期。
C.急性淋巴母细胞白血病(ALL)
急性淋巴母细胞白血病(ALL)或急性淋巴白血病是白血病或白细胞癌的急性形式，其特征在于癌性未成熟白细胞(称为淋巴母细胞)的过度产生。在患有ALL的个人中，淋巴母细胞在骨髓中过度产生且不断倍增，通过抑制骨髓中正常细胞(例如红血球及白细胞及血小板)的生成且通过浸润至其它器官而造成损伤及死亡。ALL在儿童期为最常见，其中峰值发病率在2-5岁，且另一峰值在老年时。
ALL的症状指示功能性血细胞的产生减少，因为白血病浪费骨髓的资源，所述骨髓通常用于产生新的功能性血细胞。这些症状可包括发热、感染风险的增加(尤其如肺炎的细菌感染，由于嗜中性白细胞减少症；此种感染的症状包括呼吸短促、胸部疼痛、咳嗽、呕吐、肠道或膀胱习性变化)、出血倾向增加(由于血小板减少)及指示贫血的病征，包括苍白、心搏过速(高心跳速率)、疲乏及头痛。
美国每年报导约6,000例病例；难以获得其它国家的统计数据，但已知在美国、意大利及哥斯达黎加更常见。治愈为现实目标且在超过80％的已感染儿童中实现，但仅20-40％的成人可治愈。“急性”是指与慢性淋巴球性白血病有别的相对较短的疾病时程，所述慢性淋巴球性白血病具有多年的潜在时程。
症状对ALL不具特异性但恶化至寻求医疗帮助的程度。其由缺乏正常及健康的血细胞所造成，因为其被恶性及未成熟白血球(白细胞)挤出。因此，患有ALL的人经历了其红血球(红血细胞)、白血球、血小板的功能障碍所导致的症状。可展示异常的实验室测试包括血球计数测试、肾功能测试、电解质测试及肝酶测试。
ALL的病征及症状为可变的，但源自骨髓置换和/或器官浸润，且包括全身性无力及疲乏、贫血、眩晕、频繁或不可解释的发热及感染、体重减轻和/或食欲不振、过度及不可解释的擦伤、骨痛、关节痛(由“母细胞”细胞扩散至骨骼表面或骨髓腔的关节中引起)、呼吸困难、淋巴结、肝和/或脾增大、下肢和/或腹部的指压性水肿(肿胀)及瘀斑，其由于血小板含量低而在皮肤中呈微小红色斑点或纹路。
一般而言，癌症由DNA损伤引起，DNA损伤导致不可控的细胞生长且通过增加引起生长的化学信号或通过中断控制生长的化学信号而扩散至全身。融合基因的形成可引起损伤，原癌基因经由其与另一基因(例如T细胞受体基因)的启动子并接而调节异常也可引起损伤。此损伤可由例如化学物质、药物或辐射的环境因素引起，且在有丝分裂或其它正常过程期间自然发生(尽管细胞具有多种有助于减少此损伤的DNA修复机理)。
ALL与动物及人类暴露于辐射及化学物质相关。如对广岛及长崎原子弹爆炸的生还者的研究发现，高水平辐射暴露是罹患白血病的已知风险因素。在动物中，暴露于苯及其它化学物质可导致白血病。流行病学研究已将白血病与工作场所暴露于化学物质相关联，但这些研究不作为结论性的。一些证据表明在用辐射及化学疗法治疗其它癌症的个体中，继发性白血病可作为所述治疗的结果而恶化。
诊断ALL开始于病史、身体检查、全血球计数及血液涂片。因为症状如此普遍，所以必须排除具有类似症状的许多其它疾病。通常，白细胞计数越高，预后越差。在大多数情况下，在血液涂片上发现母细胞(母细胞是所有免疫细胞系的前体(干细胞))。骨髓活组织检查是ALL的结论性证据。腰椎穿刺(也称为脊椎穿刺)将指示脊柱及大脑是否已被侵袭。
病理学检查、细胞遗传学(具体地说，费城染色体的存在)及免疫表型分型确定骨髓母细胞(嗜中性白血球、嗜伊红血球或嗜碱性球)或淋巴母细胞(B淋巴细胞或T淋巴细胞)细胞是否存在问题。RNA测试可确定疾病的侵袭性程度；不同突变已与较短或较长存活期相关。免疫组织化学测试可以揭露白血病细胞表面上的TdT或CALLA抗原。TdT是在前T细胞及前B细胞的发育早期表达的蛋白质，而CALLA是在80％的ALL病例中以及CML的“母细胞危象”中发现的抗原。医学成像(例如超声波或CT扫描)可发现其它器官的侵袭，通常为肺、肝脏、脾、淋巴结、大脑、肾脏及生殖器官。
急性淋巴球性白血病检测越早，治疗越有效。目的为诱导持续缓解，其定义为体内不存在可检测到的癌细胞(骨髓中的母细胞通常小于5％)。急性白血病的治疗可包括化学疗法、类固醇、放射疗法、强化组合治疗(包括骨髓或干细胞移植)及生长因子。
化疗是精选的初始疗法。大部分ALL患者将接受不同疗法的组合。由于恶性细胞的全身分布，因此没有手术选择。一般而言，ALL的细胞毒性化学疗法将多种抗白血病药物以各种组合形式进行组合。ALL的化疗由三个阶段组成：诱导缓解疗法、强化疗法及维持疗法。
因为化疗方案可以强化及延长(在GMALL UKALL、HyperCVAD或CALGB方案的情况下通常约2年；对于约3年的ALL，男性有2个月的COG方案；对于2年的ALL，女性为2个月-男性更长，因为睾丸为潜在储集器)，许多患者采用静脉内导管(称为中心静脉导管或希克曼线(Hickman line))插入大静脉中，或采用中枢静脉注射座(Portacath)，一种具有硅树脂鼻的锥状端口，其以手术方式植入皮肤下(通常在锁骨附近)且由于低感染风险及中枢静脉注射座的长期耐久性而使药品得到最有效的利用。
辐射疗法(或放射线疗法)用于高疾病负担的疼痛性骨区域，或作为骨髓移植(全身辐射)准备的一部分。呈全脑辐射形式的辐射也用于中枢神经系统预防以防止白血病在大脑中的复发。全脑预防辐射是治疗儿童ALL的常用方法。近期研究表明CNS化学疗法提供有利的结果，而恶化副作用较小。因此，全脑辐射的使用更加有限。擅长成人白血病的大部分专家已放弃使用辐射疗法用于CNS预防，而使用鞘内化学疗法。
对于一些复发ALL的亚型，针对例如蛋白酶体等生物靶标，结合化学疗法，在临床试验中已给出有希望的结果。基于生物靶标对白血病淋巴母细胞的组合效应来选择生物靶标能够使临床试验的ALL治疗效果改善。在进行中的临床试验中，CD19-CD3双特异性单克隆鼠类抗体-布尔莫单抗(Blinatumomab)展示巨大的前景。
嵌合抗原受体(CAR)已开发为ALL的有前景的疗法。此技术使用为了识别细胞表面标记CD19而设计的单链可变片段(scFv)作为治疗ALL的方法。CD19是在所有B细胞上发现的分子且可用作区分患者中潜在恶性B细胞群的方法。在此疗法中，小鼠经CD19抗原免疫且产生抗CD19抗体。从与骨髓瘤细胞系融合的小鼠脾细胞产生的杂交瘤可开发为编码CD19特异性抗体的cDNA的来源。cDNA经测序且使用小肽连接子将编码这些抗体的可变重链及可变轻链的序列克隆在一起。此所得序列编码scFv。此序列可克隆至转基因中，所述转基因编码将变为CAR的胞内域。用作胞内域的次单元有不同排列，但其通常由连接至scFv的铰链区、跨膜区、例如CD28的共刺激分子的胞内区及含有ITAM重复序列的CD3-ζ的胞内域组成。其它经常包括在内的序列是4-1bb及OX40。随后将含有scFv及胞内域序列的最终转基因序列插入自患者获得的且在试管内扩增的免疫效应细胞中。在前述试验中，这些是具有细胞毒性的T细胞类型。将DNA插入效应细胞中可通过若干方法实现。最常见地，此使用编码转基因的慢病毒来完成。假型、自失活慢病毒已表明是将所需转基因稳定插入靶细胞基因组DNA的有效方法。其它方法包括电穿孔及转染，但这些方法的功效有限，因为转基因表达将随时间推移削弱。随后将基因修饰的效应细胞移植回患者中。通常，此过程与例如环磷酰胺等调理方案一起进行，所述调理方案已展示可增强输注的T细胞的效应。此效应已归因于免疫空间生态栖位的形成。整个过程产生效应细胞，通常为可以主要组织兼容复合物独立方式识别肿瘤细胞抗原且启动细胞毒性反应的T细胞。
D.慢性淋巴母细胞白血病(CLL)
B细胞慢性淋巴球性白血病(B-CLL)，也称为慢性淋巴白血病(CLL)，是成人中最常见的白血病类型(白细胞癌的一种类型)。CLL影响起源于骨髓、在淋巴结中发育的B细胞淋巴细胞，且通常通过产生抗体来对抗感染。在CLL中，B细胞生长失控且在骨髓及血液中积累，其中其挤出健康血细胞。CLL处于小淋巴球性淋巴瘤(SLL)的阶段，一种主要出现在淋巴结中的B细胞淋巴瘤类型。CLL及SLL被视为仅具有不同表现形式的相同潜在疾病。CLL是成人疾病。大部分(>75％)新诊断患有CLL的人超过50岁，且大多数为男性。然而，在罕见的情况下，其可在青少年中出现及偶尔在儿童中出现。其中一些可与遗传倾向性有关。
作为常规血液测试报告高白细胞计数的结果，大部分人诊断时无症状，但是随着其恶化，CLL导致淋巴结、脾及肝脏肿胀，且最终引起贫血及感染。早期CLL不治疗，而晚期CLL用化学疗法及单克隆抗体治疗。
DNA分析已区分出生存时间不同的两种主要类型的CLL。对于标记ZAP-70呈阳性的CLL具有平均8年的存活期，而对于ZAP-70呈阴性的CLL具有平均大于25年的存活期。许多疾病进展缓慢的患者，尤其老年人，可放心且在其一生中可不需要任何治疗。
作为常规血液测试报告高白细胞计数的结果，大部分人诊断时无症状。不太常见的是，CLL可出现淋巴结肿大，但血液中白细胞计数高或无疾病的迹象。此称为小淋巴球性淋巴瘤。在一些个体中，只有在赘生性细胞爆满骨髓，导致贫血产生疲劳或虚弱之后，疾病才显露出来。
对于全血球计数(CBC)测试，CLL通常首先被怀疑存在淋巴细胞增多，其为一种白细胞类型增加。此通常为常规医师访诊时偶然发现的。最常见的是淋巴细胞计数大于每微升(μl)血液4000个细胞，但是可以高得多。老年个体中存在淋巴细胞增多会引起对CLL的强烈怀疑，且除非临床上不必要的，否则应进行确认诊断测试，具体地说，流式细胞术。
CLL的诊断是基于证明血液、骨髓或组织中存在异常B淋巴细胞群，所述B淋巴细胞群的细胞表面上显示异常但特征化的分子模式。此非典型分子模式包括细胞表面标记分化簇5(CD5)与分化簇23(CD23)的共表达。另外，一位个体内的所有CLL细胞是克隆的，即在基因一致。实际上，此通过在全部异常B细胞群中仅检测到彼此互斥的抗体轻链κ或λ中的一者来推断。正常B淋巴细胞由不同抗体产生细胞组成，产生κ表达细胞与λ表达细胞的混合物。产生κ的B细胞及产生λ的B细胞缺乏常态分布为证明克隆性的一个基础，所述克隆性为确诊任何B细胞恶性肿瘤(B细胞非霍奇金淋巴瘤)的关键要素。
CLL的确诊需要将外周血液显微镜检查与流式细胞术分析淋巴细胞组合以确认克隆性及标记分子表达。两者皆容易用少量血液完成。流式细胞仪是可检查体液中个别细胞上分子表达的仪器。此需要使用特异性抗体来标记具有被仪器识别的荧光标签的分子。在CLL中，淋巴细胞为遗传克隆，属于B细胞谱系(表达标记分子分化簇19(CD19)及CD20)，且典型地表达标记分子CD5及CD23。在显微镜下这些B细胞类似于正常淋巴细胞，虽然稍微较小，但涂至玻璃载片上时为易碎的，进而产生许多破碎的细胞，所述细胞称为“涂抹”或“涂片”细胞。
马图特斯(Matutes)的CLL评分允许鉴别经典CLL的均质亚组，所述亚组对于五种标记的表达(CD5、CD23、FMC7、CD22及免疫球蛋白轻链)不同于非典型/混合CLL，马图特斯的CLL评分系统对经典CLL与其它B细胞慢性淋巴增生病症之间的差别诊断非常有帮助，但对混合/非典型CLL与套细胞淋巴瘤(MCL恶性B细胞)之间的免疫区别无帮助。通过添加例如CD54及CD200等非常规标记，可改善CLL与MCL之间的辨别。在常规标记中，大部分辨别特征为CD20/CD23平均荧光强度比率。相比之下，FMC7表达对于边缘型病例可出人意料地具误导性。
确定疾病程度的分期用Rai分期系统或Binet分类(参见细节)进行且主要基于存在低血小板或红血球计数。早期疾病不需要治疗。
CLL治疗集中于控制疾病及其症状，而非彻底治愈。CLL通过化学疗法、放射疗法、生物疗法或骨髓移植来治疗。症状有时以外科手术方式(摘除肿大脾脏的脾切除术)或通过放射疗法(肿胀淋巴结“去膨胀”)治疗。
初始CLL治疗视疾病的准确诊断及恶化而变化，且甚至视健康护理执业医生的偏好及经验而变化。几十种药剂用于CLL疗法。含有氟达拉宾(fludarabine)、环磷酰胺及利妥昔单抗(rituximab)(称为FCR)的初始治疗方案已证实较高的总体反应率及完全反应率。
通过宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)的研究人员进行的研究使用遗传修饰的T细胞攻击表达CD19蛋白的细胞来对抗疾病。在2013年，研究人员宣布59名患者中的26名已实现完全缓解且原患者仍无肿瘤。
白血病很少与妊娠相关，10,000名妊娠期妇女中仅约1名受其影响。慢性淋巴球性白血病的治疗通常可推迟直至妊娠结束后。如果必需治疗，则在中期或晚期妊娠期间进行化学疗法比在早期妊娠期间治疗更不大可能导致妊娠缺失或出生缺陷。
虽然CLL通常视为不可治愈的，但在大多数情况下恶化缓慢。许多患有CLL的人多年来过着正常且积极的生活-在某些状况下持续数十年。由于其发作缓慢，因此早期CLL一般不治疗，因为人们认为早期CLL干预并不改善存活时间或生活质量。替代地，随时间推移监测病状以检测疾病模式的任何变化。
当患者临床症状或血液计数指示疾病已恶化到其中可能影响患者生活质量的时刻时，决定开始进行CLL治疗。例如Rai 4平台系统及Binet分类的临床“分期系统”可有助于确定何时及如何治疗患者。确定何时开始治疗及通过何种方法通常为困难的；研究已表明过早治疗疾病不具有存活优势。国家癌症研究所工作组(The National Cancer InstituteWorking Group)已发布治疗指南，其中在其起始之前应满足特定标记。
组合化学疗法方案对新诊断与复发的CLL均有效。氟达拉宾与烷基化剂(环磷酰胺)的组合比单一药剂产生更高的反应率及更长的无进展存活期：FC(氟达拉宾与环磷酰胺)；FR(氟达拉宾与利妥昔单抗)；FCR(氟达拉宾、环磷酰胺及利妥昔单抗)；以及CHOP(环磷酰胺、小红莓(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)及泼尼松龙(prednisolone))。
尽管嘌呤类似物氟达拉宾作为主要疗法展示的反应率优于苯丁酸氮芥，但无证据表明早期使用氟达拉宾提高总存活期，且一些临床医师更喜欢保留氟达拉宾用于复发疾病。
在选择身体健康良好的CLL患者的大型随机试验中，用FCR的化学免疫疗法已展示提高反应率、无进展存活期及总存活期。此为第一次临床试验，其表明选择一线疗法可提高CLL患者的总存活期。批准用于CLL的烷基化剂包括苯达莫司汀(bendamustine)及环磷酰胺。
靶向疗法攻击癌细胞的特定靶标，其目的在于不伤害正常细胞。在CLL中使用单克隆抗体，例如阿仑单抗(alemtuzumab)(针对CD52)及利妥昔单抗及奥伐木单抗(ofatumumab)(针对CD20)。在CLL中还可以使用酪氨酸激酶抑制剂疗法。2014年2月，FDA批准依鲁替尼(ibrutinib)用于治疗慢性淋巴球性白血病。依鲁替尼是布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂。2014年7月，FDA及EMA批准艾代昔布(idelalisib)用于治疗不同类型的白血病。艾代昔布是靶向PI3Kδ路径的PI3K抑制剂。其采用口服。
使用接受者自身细胞的自体干细胞移植不具有可治愈性。较年轻的个体如果处于死于CLL的高风险下，则可考虑同种异体造血干细胞移植(HSCT)。清髓性(骨髓杀灭)形式的同种异体干细胞移植(一种使用来自健康供体的血细胞进行的高风险治疗)可以是治愈的，但治疗相关的毒性为显著的。中间水平，称为强度降低的调节型同种异体干细胞移植，可更佳地被年老或虚弱的患者耐受。
“难治性”CLL是对治疗不再积极反应的疾病。在此情况下，考虑更积极的疗法，包括来那度胺(lenalidomide)、夫拉平度(flavopiridol)及骨髓(干细胞)移植。单克隆抗体，阿仑单抗(针对CD52)，可用于患有基于骨髓的难治性疾病的患者。
并发症包括里克特(Richter's)综合症、导致反复感染的低γ球蛋白血症、10-15％患者的温热自体免疫溶血性贫血、转化为高恶性度淋巴瘤。慢性淋巴球性白血病可转化为里克特综合症，即在患有慢性淋巴球性白血病的患者中恶化为快速生长的弥漫性大B细胞淋巴瘤、前淋巴球性白血病、霍奇金氏淋巴瘤或急性白血病。CLL患者的发病率估计约为5％。
慢性淋巴球性白血病很少能累及肠胃(GI)。一些已报道的临床表现包括肠套叠、小肠细菌污染、结肠炎及其它。通常，CLL的GI并发症在里克特转化(Richtertransformation)之后出现。到目前为止，有两个病例报告无里克特转化的慢性淋巴球性白血病出现GI累及。
III.单克隆抗体及其产生
本文所描述的单克隆抗体可使用标准方法制备，随后进行筛选、表征及功能评估。可变区可经测序且随后亚克隆至人类表达载体中以产生嵌合抗体基因，随后表达且纯化所述嵌合抗体基因。这些嵌合抗体可在抗原结合、信号传导阻断及异种移植实验中进行测试。
A.通用方法
应理解与LILRB4结合的单克隆抗体将具有若干应用。这些应用包括制造用于检测及诊断癌症的诊断试剂盒，以及用于癌症疗法。在这些背景下，可将此类抗体与诊断剂或治疗剂联合，使用其作为竞争性分析中的捕捉剂或竞争剂，或其独立地使用，而不连接另外的药剂。抗体可经突变或修饰，如以下进一步论述。用于制备及表征抗体的方法为本领域中所熟知(参见例如《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory),1988；美国专利4,196,265)。
用于产生单克隆抗体(MAb)的方法一般沿着与用于制备多克隆抗体相同的生产线开始。这些方法的第一步皆为适当宿主的免疫接种。如本领域中所熟知的，给定的免疫接种组合物的免疫原性可能不同。因此，通常需要增强宿主免疫系统，此可通过使肽或多肽免疫原与载体偶合来实现。示例性及优选的载体是匙孔螺血氰蛋白(KLH)及牛血清白蛋白(BSA)。其它白蛋白，例如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白，也可以用作载体。将多肽与载体蛋白共轭的方式为本领域中熟知的且包括戊二醛、间顺丁烯二酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳化二亚胺及双重氮化联苯胺。还如本领域中所熟知，可通过使用非特异性免疫反应刺激剂(称为佐剂)来增加特定免疫原组合物的免疫原性。示例性及优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant)(含有杀灭的结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的非特异性免疫反应刺激剂)、不完全弗氏佐剂及氢氧化铝佐剂。
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫接种的动物而变化。可使用多种途径施用免疫原(皮下、肌肉内、皮内、静脉内及腹膜内)。多克隆抗体的产生可通过在免疫接种之后的不同时间点取得免疫接种动物的血样来进行监测。还可以给予第二次增强注射。重复增强免疫及滴定的过程，直至达到适合滴度。当获得期望的免疫原性水平时，可对免疫接种的动物抽血且分离出血清并储存，且/或可使用动物产生MAb。
在免疫接种之后，选择可能产生抗体的体细胞(具体地说，B淋巴细胞(B细胞))用于MAb产生方案中。这些细胞可自活组织检查的脾或淋巴结，或自循环血液获得。随后使来自免疫接种动物的抗体产生B淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞的细胞(一般与免疫接种的动物属于同一物种的动物的永生骨髓瘤细胞)或人类或人类/小鼠嵌合细胞融合。适用于产生杂交瘤的融合程序中的骨髓瘤细胞优选不产生抗体，具有高融合效率，且酶不足而使其不能在仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长。本领域的技术人员已知可以使用多种骨髓瘤细胞中的任一者(Goding,第65-66页,1986；Campbell,第75-83页,1984)。
用于产生抗体产生脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包含在促进细胞膜融合的一或多种药剂(化学试剂或电)存在下，将体细胞与骨髓瘤细胞以2:1比例混合，但所述比例可各别地在约20:1至约1:1间变化。Kohler及Milstein(1975；1976)已经描述使用仙台病毒(Sendai virus)的融合方法，且Gefter等人(1977)已经描述使用聚乙二醇(PEG)，例如37％(v/v)PEG的融合方法。使用电诱导融合方法也为适合的(Goding,第71-74页,1986)。融合程序通常以约1×10-6至1×10-8的较低频率产生有活力的杂交体。然而，此不会造成问题，因为有活力的融合杂交体是由输注的亲本细胞(具体地说，通常会持续无限分裂的输注骨髓瘤细胞)通过在选择培养基中培养而分化。选择培养基一般是含有阻止核苷酸在组织培养基中重新合成的药剂的培养基。示例性及优选的药剂是氨基喋呤(aminopterin)、甲胺喋呤(methotrexate)及偶氮丝氨酸。氨基喋呤及甲胺喋呤阻止嘌呤及嘧啶的重新合成，而偶氮丝氨酸仅阻止嘌呤合成。在使用氨基喋呤或甲胺喋呤情况下，培养基补充有次黄嘌呤及胸苷作为核苷酸来源(HAT培养基)。在使用偶氮丝氨酸情况下，所述培养基补充有次黄嘌呤。如果B细胞源是埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus，EBV)转化的人类B细胞系，则为了除去未与骨髓瘤融合的EBV转化系，添加乌本苷(Ouabain)。
优选的选择培养基是HAT或含乌本苷的HAT。只有能够操作核苷酸补救路径的细胞能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺乏补救路径的关键酶，例如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，且其无法存活。B细胞可操作此路径，但其在培养时寿命有限且一般在约两周内死亡。因此，能够在选择培养基中存活的唯一细胞是由骨髓瘤及B细胞形成的那些杂交体。当用于融合的B细胞源是EBV转化的B细胞系时，如此处，也将乌本苷用于杂交体的药物选择，因为EBV转化的B细胞易被药物杀灭，而所用骨髓瘤搭配物应选择耐乌本苷的。
培养提供一群杂交瘤，从中选择特异性杂交瘤。通常，杂交瘤的选择是通过在微量滴定板中以单一克隆的稀释液培养细胞，随后测试个别克隆上清液(在约两至三周之后)的所需反应性来进行。分析法应为灵敏、简单且快速的，例如放射免疫分析法、酶免疫分析法、细胞毒性分析法、蚀斑分析法、斑点免疫结合分析法等。随后对所选杂交瘤进行连续稀释或通过流式细胞分选进行单细胞分选，且克隆至个别抗体产生细胞系中，所述克隆可随后无限繁殖以提供MAb。可采用细胞系以两种基本方式产生MAb。可将杂交瘤样品注射至动物(例如小鼠)体内(通常注射至腹腔中)。任选地，在注射之前，用烃(尤其油，例如姥鲛烷(四甲基十五烷))使动物预致敏。当以此方式使用人类杂交瘤时，最佳向免疫功能不全的小鼠(例如SCID小鼠)进行注射，以防止肿瘤排斥反应。注射过的动物产生肿瘤，分泌由融合的细胞杂交体产生的特异性单克隆抗体。随后可抽取动物的体液，例如血清或腹水，以提供高浓度MAb。个别细胞系还可以在试管内培养，其中MAb天然地分泌至培养基中，从所述培养基可容易地获得高浓度MAb。或者，可在试管内使用人类杂交瘤细胞系以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。细胞系可适合于在无血清培养基中生长以使回收高纯度人类单克隆免疫球蛋白的能力达到最佳。
必要时，通过任一方式产生的MAb可使用过滤、离心及各种色谱方法(例如FPLC或亲和色谱法)进一步纯化。通过包括用酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化的方法和/或通过化学还原来裂解二硫键，能够由纯化的单克隆抗体获得本公开的单克隆抗体的片段。或者，本公开所涵盖的单克隆抗体片段可使用自动肽合成仪合成。
还考虑可以使用分子克隆方法产生单克隆抗体。为此，可从杂交瘤株系中分离出RNA且通过RT-PCR获得抗体基因并克隆至免疫球蛋白表达载体中。或者，由自细胞系分离的RNA制备组合免疫球蛋白噬质体库且通过使用病毒抗原淘选来选择表达适当抗体的噬质体。此方法相较于常规杂交瘤技术的优势在于，一轮便可产生且筛选出约104倍多的抗体，且由H链与L链组合产生新特异性，从而进一步增加了发现适当抗体的几率。
传授制造适用于本公开中的抗体的其它美国专利(各自以引用的方式并入本文中)包括美国专利5,565,332，其描述使用组合方法产生嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述重组免疫球蛋白制剂；以及美国专利4,867,973，其描述抗体-治疗剂共轭物。
B.本公开的抗体
1.LILRB4的抗体
根据本公开的抗体或其抗原结合片段在第一种情形中可通过其结合特异性(在此情况下针对LILRB4)来定义。本领域的技术人员通过使用本领域的技术人员熟知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力，可确定此类抗体是否属于本发明权利要求书的范围内。
在一个方面中，提供与LILRB4特异性结合的抗体及抗原结合片段。在一些实施例中，当与LILRB4结合时，此类抗体调节LILRB4的活化。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段在与LILRB4结合时，活化LILRB4。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段在与LILRB4结合时，抑制LILRB4的活化。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段在与LILRB4结合时可特异性干扰、阻断或减少ApoE与LILRB4之间的相互作用。在某些实施例中，本文所提供的抗体或抗原结合片段能够抑制ApoE介导的LILRB4活性。在某些实施例中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与人类LILRB4特异性地或选择性地结合。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段与人类LILRB4特异性地结合和/或将人类LILRB4与ApoE的结合基本上抑制至少约20％-40％、40-60％、60-80％、80-85％或更高(例如依据如实例中所公开的分析)。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的Kd小于(结合更紧密)10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13M。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段阻断ApoE与LILRB4结合的IC50小于1μM、1000nM至100nM、100nM至10nM、10nM至1nM、1000pM至500pM、500pM至200pM；小于200pM、200pM至150pM、200pM至100pM、100pM至10pM、10pM至1pM。
在一些实施例中，本文所提供的抗体或抗原结合片段具有来自图28A至28C中所说明的重链及图30A至30C中所说明的轻链的克隆配对CDR。此类抗体可使用本文所描述的方法，由以下实例部分中论述的克隆产生。在某些实施例中，各CDR根据以下各者定义：Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义与Chothia定义的组合、AbM定义或CDR的接触定义。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段的特征在于表1及表2的克隆配对的重链及轻链CDR序列。
在某些实施例中，抗体可由其可变序列定义，其包括额外的“构架”区。抗体的特征在于图28A至28C及图30A至30B的克隆配对的重链及轻链氨基酸序列。此外，抗体序列可不同于这些序列，具体地说，CDR之外的区域。举例来说，氨基酸与上文陈述的那些可具有一定百分比的差异，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性，或氨基酸可通过允许保守性取代(下文论述)而不同于上文陈述的那些。前述中的每一者适用于图28A至28C及图30A至30C的氨基酸序列。在另一实施例中，本公开的抗体衍生物包含VL及VH结构域，其具有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个保守或非保守氨基酸取代，同时仍展现所期望的结合及功能特性。
虽然本公开的抗体以IgG形式产生，但修饰恒定区以改变其功能可以是适用的。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，其包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)及经典补体系统的第一组分(Clq)。因此，术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及其亚型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ型。在轻链及重链内，可变区及恒定区由具有约12个或更多个氨基酸的35“J”区接合，其中重链还包括具有约10个以上的氨基酸的“D”区。通常参见《基础免疫学(Fundamental Immunology)》第7章(Paul,W.编,第2版Raven Press,N.Y.(1989))。
本公开进一步包含与编码本文所公开的抗体的核酸杂交的核酸。一般而言，核酸在中等或高严格度条件下与编码本文所公开的抗体且还编码保持与LILRB4特异性结合的能力的抗体的核酸杂交。当第一核酸分子的单链形式能够在温度及溶液离子强度的适当条件下退火至与第二核酸分子配对时，第一核酸分子与第二核酸分子“可杂交”(参见Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)》,第3版,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.)2001)。温度及离子强度的条件决定杂交的“严格度”。典型的中等严格度杂交条件是在42℃下，40％甲酰胺、5×或6×SSC及0.1％SDS。高严格度杂交条件是在42℃或任选地在较高温度(例如57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下，50％甲酰胺、5×或6×SSC(0.15MNaC1及0.015M柠檬酸钠)。杂交要求两个核酸含有互补序列，但视杂交的严格度而定，碱基之间的错配是可能的。适用于核酸杂交的严格度视核酸的长度及互补程度、本领域中熟知的变量而定。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越大，核酸可借以杂交的严格度越高。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已推导出用于计算解链温度的等式(参见Sambrook等人，见上文)。对于较短核酸(例如寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更加重要，且寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrook等人，见上文)。
表1.重链CDR序列、氨基酸
Figure BDA0002973222510000461
表2.κ轻链CDR、氨基酸序列
Figure BDA0002973222510000462
Figure BDA0002973222510000471
表3.LILRB4抗体的序列ID编号
Figure BDA0002973222510000472
表4.人源化193(h193)抗体重链的序列ID编号
Figure BDA0002973222510000473
Figure BDA0002973222510000481
表5.人源化193(h193)抗体轻链的序列ID编号
轻链 可变区(CDR1、CDR2、CDR3)A.A.SEQ ID NO.
h193-K1 232(104,233,234)
h193-K2 235(104,233,234)
h193-K3 236(104,233,234)
h193-K4 237(104,233,234)
2.示例性表位和竞争型抗原结合蛋白
在另一方面中，本公开提供与抗LILRB4抗体结合的表位。
在一些实施例中，由本文所描述的抗体结合的表位是有用的。在某些实施例中，本文所提供的表位可用以分离与LILRB4结合的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施例中，本文所提供的表位可用以产生与LILRB4结合的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施例中，表位或包含本文所提供的表位的序列可用作免疫原以产生与LILRB4结合的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施例中，本文所描述的表位或包含本文所描述的表位的序列可用以干扰LILRB4的生物活性。
在一些实施例中，与任何表位结合的抗体或其抗原结合片段尤其适用。在一些实施例中，本文所提供的表位在与抗体结合时调节LILRB4的生物活性。在一些实施例中，本文所提供的表位在与抗体结合时活化LILRB4。在一些实施例中，本文所提供的表位在与抗体结合时抑制LILRB4的活化。在一些实施例中，本文所提供的表位在与抗体结合时阻断ApoE与LILRB4之间的相互作用。
在一些实施例中，含有与抗体接触或被抗体埋入的残基的结构域/区域可通过使LILRB4中的特定残基突变且确定抗体是否能结合突变的LILRB4蛋白来识别。通过进行多种个别突变，能够鉴别出在结合中起直接作用或与抗体充分接近以使得突变能影响抗体与抗原之间的结合的残基。根据对这些氨基酸的了解，能够阐明含有与抗原结合蛋白接触或被抗体覆盖的残基的抗原结构域或区域。此类结构域可包括抗原结合蛋白的结合表位。
在另一方面中，本发明提供与结合至本文所描述的表位的示例性抗体或抗原结合片段之一竞争以特异性结合LILRB4的抗原结合蛋白。此类抗原结合蛋白还可以结合至与本文例示的抗体或抗原结合片段之一相同的表位或重叠表位。预期与示例性抗体竞争或结合于相同表位的抗原结合蛋白展示类似功能特性。示例性抗体包括上文描述的抗体，包括表1及表2中所包括的重链及轻链可变区及CDR的抗体。在某些实施例中，表位位于人类LILRB4的D1与D2结构域之间的连接子区域内。在某些实施例中，表位包含表9中所列出的一或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸。在某些实施例中，表位包含选自SEQ ID NO:238(人类LILRB4蛋白的D1及D2结构域)的W18、G96、A97、Y98、S99、K100、Q122、S123、R124、S125、P126、H153及Q154的一或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸。
C.抗体序列的工程改造
在各种实施例中，出于各种原因，例如改善表达、改善交叉反应性或降低脱靶结合，可选择对所鉴别的抗体的序列进行工程改造。以下大致论述了用于抗体工程改造的相关技术。
可培养杂交瘤，随后裂解细胞且提取总RNA。可在RT下使用随机六聚体以产生RNA的cDNA拷贝，且随后使用预期可扩增所有人类可变基因序列的PCR引物的多元混合物进行PCR。PCR产物可克隆至pGEM-T Easy载体中，随后通过自动DNA测序，使用标准载体引物进行测序。结合及中和的分析可使用抗体进行，所述抗体从杂交瘤上清液收集且通过使用蛋白质G柱的FPLC纯化。重组全长IgG抗体可通过将来自克隆载体的重链及轻链Fv DNA亚克隆至IgG质体载体中，转染至293Freestyle细胞或CHO细胞中来产生，且从293或CHO细胞上清液中收集抗体且纯化。
在与最终cGMP制造方法相同的宿主细胞及细胞培养方法中产生的抗体的快速可用性有可能缩短方法开发程序的持续时间。Lonza开发出一种通用方法，其使用在CDACF培养基中生长的经汇集的转染物，用于在CHO细胞中快速产生少量(至多50g)抗体。尽管比实际瞬时系统略慢，但优势包括较高产物浓度及使用与生产细胞系相同的宿主及方法。在抛弃式生物反应器中表达模型抗体的GS-CHO池的生长及生产力的实例：在以分批进料模式操作的抛弃式袋式生物反应器培养(5L工作体积)中，在转染9周内达到2g/L的采集抗体浓度。
抗体分子将包含由例如mAb蛋白水解裂解产生的片段(例如F(ab')、F(ab')2)，或可例如经由重组方法产生的单链免疫球蛋白。此类抗体衍生物为单价的。在一个实施例中，此类片段可彼此组合，或与其它抗体片段或受体配体组合以形成“嵌合”结合分子。很明显，此类嵌合分子可含有能够结合至同一分子的不同表位的取代基。
1.抗原结合修饰
在相关实施例中，抗体是所公开的抗体的衍生物，例如所含CDR序列与所公开的抗体(例如嵌合抗体或CDR移植抗体)中的CDR序列一致的抗体。或者，可希望进行修饰，例如将保守变化引入抗体分子中。在进行此类变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。在本领域中一般了解氨基酸的亲水指数在赋予蛋白质相互作用生物功能方面的重要性(Kyte及Doolittle,1982)。公认氨基酸的相对亲水性特征促成所得蛋白质的二级结构，所述二级结构又界定蛋白质与其它分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
在本领域中还了解，可基于亲水性有效进行类似氨基酸的取代。以引用的方式并入本文中的美国专利4,554,101陈述，通过其邻近氨基酸的亲水性调节的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物特性相关。如美国专利4,554,101中详述，以下亲水值已赋予氨基酸残基：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)及组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸盐(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)及谷酰胺(+0.2)；亲水性、非离子性氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷酰胺(+0.2)及苏氨酸(-0.4)；含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)及甲硫氨酸(-1.3)；疏水性、非芳香族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)及甘氨酸(0)；疏水性、芳香族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)及酪氨酸(-2.3)。
应了解，一种氨基酸可被具有类似亲水性的另一氨基酸取代且产生在生物学或免疫学上改变的蛋白质。在此类变化中，优选亲水值在±2内的氨基酸的取代，特别优选亲水值在±1内的氨基酸的取代，且甚至更特别优选亲水值在±0.5内的氨基酸的取代。
如上文所概述，氨基酸取代一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。考虑各种前述特征的示例性取代是本领域的技术人员所熟知的，且包括：精氨酸及赖氨酸；谷氨酸及天冬氨酸；丝氨酸及苏氨酸；谷酰胺及天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸。
本公开还涵盖同型修饰。通过修饰Fc区以使其具有不同的同型，可实现不同功能。举例来说，改变成IgG1可增加抗体依赖性细胞毒性，转变成A类可改善组织分布，且转变成M类可改善价态。
经修饰的抗体可通过本领域的技术人员已知的任何技术制备，包括经由标准分子生物技术表达，或多肽的化学合成。重组表达的方法述于本文件中其它地方。
2.Fc区修饰
本文所公开的抗体还可以经工程改造以包括Fc区内的修饰，通常改变抗体的一或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或效应功能(例如抗原依赖性细胞毒性)。此外，本文所公开的抗体可经化学修饰(例如一或多个化学部分可连接至抗体)或经修饰以改变其糖基化，再次改变抗体的一或多个功能特性。这些实施例各自进一步详细描述于下文中。Fc区中的残基编号是Kabat的EU索引编号。本文所公开的抗体还包括具有经修饰(或阻断)的Fc区的抗体以提供改变的效应功能。参见例如美国专利5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。此类修饰可用于增强或抑制免疫系统的各种反应，在诊断及疗法中可能具有有益作用。Fc区的改变包括氨基酸变化(取代、缺失及插入)、糖基化或去糖基化及添加多个Fc。Fc的改变还可以改变治疗抗体中的抗体的半衰期，从而降低给药频率且因此增加便利性且减少物质使用。据报道，此突变消除铰链区中的重链间二硫桥键的异质性。
在一个实施例中，CH1的铰链区经修饰以使得铰链区中的半胱氨酸残基的数目增加或减少。此方法进一步详细描述于美国专利5,677,425中。CH1铰链区中的半胱氨酸残基的数目经改变以例如促进轻链与重链组装或提高或降低抗体的稳定性。在另一实施例中，抗体经修饰以增加其生物半衰期。各种方法为可能的。举例来说，可引入以下突变中的一或多者：T252L、T254S、T256F，如美国专利6,277,375中所描述。或者，如美国专利5,869,046及6,121,022中所描述，为了增加生物半衰期，抗体可在CH1或CL区内改变以含有从IgG的Fc区的CH2域的两个环获得的救助受体结合表位。在另外其它实施例中，通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应功能。举例来说，一或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320及322的氨基酸可被不同氨基酸残基置换，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。此方法进一步详细地描述于美国专利5,624,821及5,648,260中。
在另一实例中，改变氨基酸位置231及239内的一或多个氨基酸残基，借此改变抗体固定补体的能力。此方法进一步描述于PCT公开WO 94/29351中。在又另一实例中，通过修饰以下位置的一或多个氨基酸来修饰Fc区以增加或降低抗体介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的能力且/或增加或降低抗体对Fcγ受体的亲和力：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此方法进一步描述于PCT公开WO 00/42072中。此外，人类IgG1上的针对FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn的结合位点已定位且结合改善的变体已描述。位置256、290、298、333、334及339处的特定突变已展示可改善与FcγRIII的结合。另外，以下组合突变体已展示可改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及S298A/E333A/K334A。
在一个实施例中，通过修饰残基243及264来修饰Fc区以降低抗体介导效应功能的能力且/或提高消炎特性。在一个实施例中，抗体的Fc区通过将位置243及264的残基改变成丙氨酸来修饰。在一个实施例中，通过修饰残基243、264、267及328来修饰Fc区以降低抗体介导效应功能的能力且/或提高消炎特性。在另一实施例中，抗体包含特定糖基化模式。举例来说，可产生去糖基化抗体(即，缺乏糖基化的抗体)。可改变抗体的糖基化模式以例如提高抗体对抗原的亲和力或亲合力。此类修饰可通过例如改变抗体序列内的一或多个糖基化位点来实现。举例来说，可进行一或多个氨基酸取代，从而去除一或多个可变区构架糖基化位点，借此消除所述位点的糖基化。此类去糖基化可提高抗体对抗原的亲和力或亲合力。参见例如美国专利5,714,350及6,350,861。
还可以制备其中糖基化模式包括低岩藻糖基化或去岩藻糖基化聚糖的抗体，例如在聚糖上具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或去岩藻糖基化抗体。抗体还可以包括具有增加量的等分GlcNac结构的聚糖。已证明此类改变的糖基化模式会提高抗体的ADCC能力。此类修饰可通过例如在宿主细胞中表达抗体来实现，其中糖基化路径经基因工程改造以产生具有特定糖基化模式的糖蛋白。这些细胞已描述于本领域中且可用作表达本发明的重组抗体、从而产生具有改变的糖基化的抗体的宿主细胞。举例来说，细胞系Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)-岩藻糖基转移酶)，使得Ms704、Ms705及Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705及Ms709FUT8-/-细胞系是通过使用两种置换载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因来产生(参见美国专利公开第20040110704号)。作为另一实例，EP 1 176 195描述具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，使得此类细胞系中表达的抗体通过减少或消除α-1,6键相关酶而展现低岩藻糖基化。EP 1 176 195还描述了对于添加岩藻糖至结合到抗体Fc区的N-乙酰基葡糖胺中具有低酶活性或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lec13细胞，其中将岩藻糖连接至与Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，也使得所述宿主细胞中表达的抗体发生低岩藻糖基化。糖基化分布改变的抗体还可以产生于鸡蛋中，如PCT公开WO 06/089231中所描述。可替代地，糖基化分布改变的抗体还可以产生于植物细胞(例如浮萍(Lemna))中(美国专利7,632,983)。用于在植物系统中产生抗体的方法公开于美国专利6,998,267及7,388,081中。PCT公开WO 99/54342描述经工程改造以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰胺基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在经工程改造的细胞系中表达的抗体展现增加的等分GlcNac结构，引起抗体的ADCC活性提高。
可替代地，抗体的岩藻糖残基可使用岩藻糖苷酶切割；例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶将抗体中的岩藻糖基残基去除。本文所公开的抗体进一步包括低级真核生物宿主细胞中产生的抗体，具体地说，例如酵母及丝状真菌等真菌宿主细胞已经基因工程改造以产生具有哺乳动物样或人样糖基化模式的糖蛋白。相对于当前使用的哺乳动物细胞系，这些经基因修饰的宿主细胞的特定优势是能够控制细胞中产生的糖蛋白的糖基化分布，使得可产生其中特定N-聚糖结构占优势的糖蛋白的组合物(参见例如美国专利7,029,872及7,449,308)。这些经基因修饰的宿主细胞已用于产生特定N-聚糖结构占优势的抗体。
另外，由于例如酵母或丝状真菌等真菌缺乏产生岩藻糖基化糖蛋白的能力，因此此类细胞中产生的抗体将缺乏岩藻糖，除非细胞经进一步修饰以包括用于产生岩藻糖基化糖蛋白的酶路径(参见例如PCT公开WO2008112092)。在特定实施例中，本文所公开的抗体进一步包括在低级真核宿主细胞中产生且包含岩藻糖基化及非岩藻糖基化杂合及复合N-聚糖的那些抗体，包括等分及多触角(multiantennary)物种，包括(但不限于)N-聚糖，例如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。在特定实施例中，本文所提供的抗体组合物可包含具有至少一种杂交N-聚糖的抗体，所述N-聚糖选自由GlcNAcMan5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2；以及NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2组成的群组。在特定方面中，杂交N-聚糖是组合物中的主要N-聚糖物种。在其它方面中，杂交N-聚糖是特定N-聚糖物种，其在组合物中包含约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％杂交N-聚糖。
在特定实施例中，本文所提供的抗体组合物包含具有至少一种选自由以下组成的群组的复合N-聚糖的抗体：GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；以及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在特定方面中，复合N-聚糖是组合物中的主要N-聚糖物种。在其它方面中，复合N-聚糖是特定N-聚糖物种，其在组合物中包含约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％复合N-聚糖。在特定实施例中，N-聚糖发生岩藻糖基化。一般而言，岩藻糖在N-聚糖的还原末端与GlcNAc发生α1,3键联，在N-聚糖的还原末端与GlcNAc发生α1,6键联，在N-聚糖的非还原末端与Gal发生α1,2键联，在N-聚糖的非还原末端与GlcNac发生α1,3键联，或在N-聚糖的非还原末端与GlcNac发生α1,4键联。
因此，在以上糖蛋白组合物的特定方面中，糖型采取α1,3键联或α1,6键联的岩藻糖形式以产生选自由以下组成的群组的糖型：Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；采取α1,3键联或α1,4键联的岩藻糖形式以产生选自由以下组成的群组的糖型：GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2及NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或采取α1,2键联的岩藻糖形式以产生选自由以下组成的群组的糖型：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2及NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在其它方面中，抗体包含高甘露糖N-聚糖，包括(但不限于)Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2或由Man3GlcNAc2 N-聚糖结构组成的N-聚糖。在上述其它方面中，复合N-聚糖进一步包括岩藻糖基化及非岩藻糖基化的等分及多触角物种。如本文所使用，术语“N-聚糖”与“糖型”可互换使用且是指N连接的寡醣，例如通过天冬酰胺-N-乙酰基葡糖胺键联连接至多肽的天冬酰胺残基。N连接的糖蛋白含有在蛋白质中连接至天冬酰胺残基的酰胺氮的N-乙酰基葡糖胺残基。
D.单链抗体
单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白重链与轻链的可变区经由短(通常为丝氨酸、甘氨酸)连接子连接在一起的融合物。尽管恒定区去除且连接子肽引入，但此嵌合分子保留原始免疫球蛋白的特异性。此修饰通常未改变特异性。历史上产生这些分子是为了帮助噬菌体呈现，其中特别适宜以单一肽形式表达抗原结合域。可替代地，scFv可直接由来源于杂交瘤的亚克隆的重链及轻链产生。单链可变片段缺乏完整抗体分子中所发现的恒定Fc区，且因此缺乏用于纯化抗体的共同结合位点(例如蛋白A/G)。这些片段通常可使用蛋白质L纯化/固定，因为蛋白质L与κ轻链的可变区相互作用。
柔性连接子一般包含促成螺旋及转角的氨基酸残基，例如丙氨酸、丝氨酸及甘氨酸。然而，其它残基还可以起作用。Tang等人(1996)使用噬菌体呈现作为从蛋白质连接子库快速选择单链抗体(scFv)的定制连接子的方法。构建随机连接子库，其中重链及轻链可变域的基因是通过编码具有不同组成的18个氨基酸多肽的区段连接。将scFv谱(大约5×106个不同成员)呈现于丝状噬菌体上且用半抗原进行亲和力选择。所选变体群展现结合活性的显著增加，同时保持相当大的序列多样性。随后筛选1054种个别变体得到以可溶形式高效产生的催化活性scFv。序列分析揭露了在VH C末端之后两个残基的连接子中的保守脯氨酸及在其它位置处的大量精氨酸及脯氨酸作为所选系链(tether)的唯一共同特征。
本公开的重组抗体还可以涉及允许受体二聚合或多聚合的序列或部分。此类序列包括衍生自IgA的那些序列，其允许与J链一起形成多聚体。另一多聚合结构域是Gal4二聚合结构域。在其它实施例中，所述链可用例如生物素/抗生素蛋白等药剂修饰，从而允许两种抗体组合。
在独立实施例中，单链抗体可通过使用非肽连接子或化学单元连接受体轻链及重链来产生。一般而言，轻链及重链将在不同细胞中产生，纯化，且随后以适当方式(即，重链的N端经由适当化学桥接连接至轻链的C端)连接在一起。
使用交联试剂形成分子桥接，从而将两个不同分子(例如稳定剂及凝聚剂)的官能团系在一起。然而，预期可产生相同类似物的二聚体或多聚体或包含不同类似物的异聚复合物。为了以逐步方式连接两种不同化合物，可使用异双官能交联剂消除不想要的均聚物形成。
示例性异双官能交联剂含有两个反应性基团：一个与伯胺基团(例如N-羟基丁二酰亚胺)反应，且另一个与硫醇基(例如吡啶基二硫化物、顺丁烯二酰亚胺、卤素等)反应。经由伯胺反应基团，交联剂可与一种蛋白质(例如选定抗体或片段)的赖氨酸残基反应，且经由硫醇反应基团，已经系栓至第一蛋白质上的交联剂与另一蛋白质(例如选择性药剂)的半胱氨酸残基(游离硫氢基)反应。
优选将采用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知众多类型的含有二硫键的连接子，其可成功地用于共轭靶向剂及治疗剂/预防剂。含有位阻性二硫键的连接子可证明在活体内得到较大稳定性，从而防止靶向肽在到达作用部位之前释放。因此这些连接子是一组连接药剂。
另一交联试剂是SMPT，其为含有被相邻的苯环及甲基“位阻”的二硫键的双官能交联剂。相信二硫键的位阻起到保护所述键免受可存在于组织及血液中的硫醇根阴离子(例如谷胱甘肽)攻击的作用，且借此有助于防止共轭物在将所连接的药剂递送至靶点之前解偶合。
如同许多其它已知的交联试剂，SMPT交联试剂能够使例如半胱氨酸的SH或伯胺(例如赖氨酸的ε氨基)等官能团交联。另一种类型的可能交联剂包括含有可裂解二硫键的异双官能光反应性叠氮苯，例如磺基丁二酰亚氨基-2-(对叠氮基水杨酰胺基)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯。N-羟基-琥珀酰亚氨基与伯胺基反应且叠氮苯(在光解后)与任何氨基酸残基发生非选择性反应。
除位阻交联剂外，据此还可以采用非位阻连接子。不认为可含有或产生被保护的二硫键的其它有用交联剂包括SATA、SPDP及2-亚氨基硫杂环戊烷(Wawrzynczak和Thorpe,1987)。本领域中充分了解此类交联剂的使用。另一实施例涉及使用柔性连接子。
美国专利4,680,338描述适用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的共轭物，尤其用于形成抗体与螯合剂、药物、酶、可检测标记等的共轭物的双官能连接子。美国专利5,141,648及5,563,250公开了含有在多种温和条件下可裂解的不稳定键的可裂解共轭物。此连接子特别适用于所关注的药剂可直接键接至所述连接子且裂解引起活性剂释放的情形。特定使用包括将游离氨基或游离硫氢基添加至蛋白质(例如抗体或药物)中。
美国专利5,856,456提供用于连接多肽组分以形成融合蛋白(例如单链抗体)的肽连接子。连接子具有至多约50个氨基酸长度，含有出现至少一次的带电荷氨基酸(优选精氨酸或赖氨酸)，继之为脯氨酸，且特征在于稳定性较大及聚集减少。美国专利5,880,270公开了适用于多种免疫诊断及分离技术中的含胺氧基的连接子。
E.纯化
在某些实施例中，本公开的抗体可加以纯化。如本文中所使用，术语“纯化”意指可与其它组分分离的组合物，其中蛋白质相对于其天然可获得的状态已纯化至任何程度。因此，纯化的蛋白质还指脱离其可天然存在的环境的蛋白质。在使用术语“基本上纯化”的情况下，此名称是指一种组成，其中蛋白质或肽形成组合物的主要组分，例如蛋白质在组合物中占约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更高。
蛋白质纯化技术是本领域的技术人员熟知的。这些技术在一个层面上涉及细胞环境大致分级分离成多肽及非多肽部分。使多肽与其它蛋白质分离后，所关注的多肽可进一步使用色谱及电泳技术纯化以实现部分或完全纯化(或纯化至均质)。特别适合于制备纯肽的分析方法是离子交换色谱法、排阻色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦。用于蛋白质纯化的其它方法包括使用硫酸铵、PEG、抗体等进行沉淀，或通过热变性进行沉淀，随后进行离心；凝胶过滤、逆相色谱、羟磷灰石色谱及亲和色谱；以及此类技术与其它技术的组合。
在纯化本公开的抗体时，可能需要在原核或真核表达系统中表达多肽且使用变性条件提取蛋白质。可使用结合至多肽的标记部分的亲和柱从其它细胞组分纯化多肽。如本领域中一般所知，相信执行多个纯化步骤的次序可改变，或可省略某些步骤，且仍为适用于制备基本上纯化的蛋白质或肽的方法。
通常，利用结合抗体Fc部分的药剂(即，蛋白A)将完整抗体分级分离出来。可替代地，可使用抗原同时纯化及选择适当抗体。此类方法通常利用结合至载体(例如柱、过滤器或珠粒)的选择剂。抗体结合至载体，去除(例如洗掉)污染物且通过应用条件(盐、热等)释放抗体。
本领域的技术人员根据本公开将获知用于定量蛋白质或肽的纯化程度的各种方法。这些方法包括例如测定活性洗脱份的比活性，或通过SDS/PAGE分析评估洗脱份内的多肽含量。用于评估洗脱份的纯度的另一方法是计算洗脱份的比活性，将其与初始提取物的比活性比较，且由此计算纯度。用于表示活性的量的实际单位当然将取决于选择用于跟踪纯化的特定分析技术及被表达的蛋白质或肽是否展现可检测的活性。
已知多肽的迁移有时可随SDS/PAGE的不同条件而明显变化(Capaldi等人,1977)。因此，应理解，在不同电泳条件下，纯化或部分纯化的表达产物的表观分子量可变化。
V.癌症的疗法
A.配方和施药
本公开提供了包含抗LILRB抗体及用于产生所述抗体的抗原的医药组合物。此类组合物包含预防或治疗有效量的抗体或其片段，和药学上可接受的载体。在一个特定实施例中，术语“药学上可接受”意指经联邦政府或州政府的监管机构批准或在美国药典或其它公认的药典中列出适用于动物，且更具体地说适用于人类。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、赋形剂或媒剂。此类医药载体可以是无菌液体，例如水及油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用医药组合物时，水是特定载体。还可以使用生理盐水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作为液体载体，尤其用于可注射溶液。其它适合的医药赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻谷、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
如果需要，则组合物还可以含有少量湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可呈溶液、悬浮液、乳化液、片剂、丸剂、药丸、胶囊、粉末、持续释放配制物等形式。口服配制物可包括标准载体，例如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的医药剂的实例描述于“雷明顿氏医药科学(Remington's PharmaceuticalSciences)”中。此类组合物将含有预防或治疗有效量的抗体或其片段(优选呈纯化形式)，以及适量载体，以便提供适合施用于患者的形式。配方应适合施药模式，所述施药模式可以是口服、静脉内、动脉内、颊内、鼻内、喷雾、支气管吸入或通过机械通气递送。
如本文所描述的本公开的抗体可配制成肠胃外施用，例如，配制成经由皮内、静脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内或甚至腹膜内途径注射。或者，抗体可通过局部途径，例如通过鼻滴剂、吸入或通过喷雾器直接施用至黏膜。药学上可接受的盐包括酸盐及与无机酸(例如氢氯酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等)形成的那些盐。与自由羧基形成的盐还可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等。
抗体的被动转移，称为人工获得性被动免疫，一般将涉及使用静脉内注射。抗体的形式可以是人类或动物血浆或血清、用于静脉内(IVIG)或肌肉内(IG)使用的汇集的人类免疫球蛋白、来自免疫接种或从疾病恢复的供体的高滴度人类IVIG或IG，以及单克隆抗体(MAb)。此类免疫一般仅持续较短时段，且还存在超敏反应及血清疾病(尤其是由非人类起源的γ球蛋白引起的超敏反应及血清疾病)的潜在风险。然而，被动免疫提供直接保护。抗体将以适于注射(即，无菌且可注射)的载体配制。
一般而言，本公开的组合物的成分分开供应或在一起混合成单位剂型(例如干燥冻干粉末或无水浓缩物)置于指示活性剂的数量的密闭密封容器(例如安瓿或药囊)中。当通过输注施用组合物时，可用含有无菌医药级水或生理盐水的输液瓶分配组合物。当通过注射施用组合物时，可提供具有注射用无菌水或生理盐水的安瓿，以使所述成分可在施用前混合。
本公开的组合物可配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐；以及与阳离子形成的盐，例如衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
B.细胞疗法
在另一方面中，本公开提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞。在一些实施例中，CAR包含本文所提供的抗原结合片段。在一实施例中，CAR蛋白从N端至C端包括：前导肽、抗LILRB4重链可变域、连接子域、抗LILRB4轻链可变域、人类IgG1-CH2-CH3域、间隔区、CD28跨膜域、4-1BB胞内共刺激信号传导域及CD3ζ胞内T细胞信号传导域。
还提供了包含施用有效量的本公开的免疫细胞的免疫疗法的方法。在一个实施例中，医学疾病或病症是通过转移引发免疫反应的免疫细胞群来治疗。在本公开的某些实施例中，癌症或感染是通过转移引发免疫反应的免疫细胞群来治疗。本文提供治疗个体癌症或延迟恶化的方法，其包含向个体施用有效量的抗原特异性细胞疗法。
免疫细胞可以是T细胞(例如调节T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、NK细胞、恒定(invariant)NK细胞、NKT细胞或巨噬细胞。本文还提供了产生及工程改造免疫细胞的方法以及使用及施用所述细胞用于过继性细胞疗法的方法，在此情况下，细胞可以是自体或同种异体细胞。因此，所述免疫细胞可用作免疫疗法，例如靶向癌细胞的免疫疗法。
免疫细胞可分离自受试者，特别是人类受试者。免疫细胞可获自健康人类受试者、健康志愿者或健康供体。免疫细胞可获自所关注的受试者，例如怀疑患有特定疾病或病状的受试者、怀疑易患特定疾病或病状的受试者，或正经历用于特定疾病或病状的疗法的受试者。免疫细胞可从其驻留于受试者中的任何位置收集，包括(但不限于)血液、脐带血、脾、胸腺、淋巴结及骨髓。经分离的免疫细胞可直接使用，或可储存一段时间，例如通过冷冻。
免疫细胞可从其所驻留的任何组织中富集/纯化，包括(但不限于)血液(包括由血库或脐带血库收集的血液)、脾、骨髓、手术程序期间移出和/或暴露的组织，以及经由活组织检查程序获得的组织。从中富集、分离和/或纯化免疫细胞的组织/器官可从存活的受试者与非存活的受试者中分离出来，其中非存活的受试者是器官供体。在特定实施例中，免疫细胞是从血液(例如外周血液或脐带血)中分离出来。在一些方面中，免疫细胞是从具有增强的免疫调节能力(例如根据CD4阳性或CD8阳性T细胞抑制所测量)的脐带血中分离出来。在特定方面中，免疫细胞是从汇集的血液(特别是汇集脐带血)中分离出来，以增强免疫调节能力。汇集的血液可来自2个或更多个来源，例如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个来源(例如供体受试者)。
免疫细胞群可获自需要疗法或罹患与降低的免疫细胞活性相关的疾病的受试者。因此，所述细胞是需要疗法的受试者的自体细胞。或者，免疫细胞群可获自供体，优选组织兼容性匹配供体。免疫细胞群可从外周血液、脐带血、骨髓、脾中采集，或从免疫细胞驻留于所述受试者或供体中的任何其它器官/组织中采集。免疫细胞可从受试者和/或供体的池中(例如汇集的脐带血)分离出来。
当免疫细胞群获自不同于受试者的供体时，供体优选同种异体的，其限制条件为所得细胞是受试者相容的以便其可引入受试者中。同种异体供体细胞可以是或可以不是人类白血球抗原(HLA)相容的。为了使受试者相容，可处理同种异体细胞以降低免疫原性。
可对免疫细胞进行基因工程改造以表达抗原受体，例如经工程改造的TCR和/或嵌合抗原受体(CAR)。举例来说，修饰宿主细胞(例如，自体或同种异体T细胞)以表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。在特定实施例中，NK细胞经工程改造以表达TCR。NK细胞可进一步经工程改造以表达CAR。多种CAR和/或TCR(例如针对不同抗原)可添加至单一细胞类型(例如T细胞或NK细胞)中。
适合的修饰方法在本领域中为已知的。参见例如Sambrook等人，见上文；以及Ausubel等人,《现代分子生物学实验指南(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)》,格林纳出版协会和约翰威立父子出版集团(Greene Publishing Associates and JohnWiley&Sons),NY,1994。举例来说，细胞可使用Heemskerk等人(2008)及Johnson等人(2009)中所描述的转导技术来转导以表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。
在一些实施例中，细胞包含经由基因工程改造引入的编码一或多种抗原受体的一或多种核酸，以及此类核酸的经基因工程改造的产物。在一些实施例中，核酸是异质核酸，即通常不存在于细胞或从所述细胞获得的样品中的核酸，例如从另一生物体或细胞获得的核酸，所述核酸例如在经工程改造的细胞和/或此类细胞所来源的生物体中通常未发现。在一些实施例中，核酸并非天然存在的，例如自然界中未发现的核酸(例如嵌合)。
C.组合疗法
还可能希望提供使用本公开的抗体联合其它抗癌疗法的组合疗法。这些疗法将以有效实现一或多个疾病参数降低的组合量来提供。此方法可涉及使细胞/受试者与药剂/疗法同时接触，例如使用包括两种药剂的单一组合物或药理学配制物，或通过使细胞/受试者与两种不同组合物或配制物同时接触，其中一种组合物包括抗体且另一种包括另一药剂。
可替代地，抗体可以数分钟至数周范围内的时间间隔先于或后于另一种治疗。通常确保每次递送的时间之间存在显著的时段，使得疗法将仍能够对细胞/受试者发挥有利的组合效果。在此类情况下，考虑了使细胞与两种形式在彼此约12-24小时内，彼此约6-12小时内，或经由仅约12小时的延迟时间接触。在某些情况下，可能希望显著地延长治疗时段；无论如何，各别施药之间会流逝若干个10天(2、3、4、5、6或7个10天)至若干周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
还可以设想将需要超过一次施用抗DC-HIL抗体或其它疗法。可采用各种组合，其中抗体为“A”且另一种疗法为“B”，举例如下：
Figure BDA0002973222510000611
涵盖其它组合。为了使用本发明的方法及组合物杀死细胞、抑制细胞生长、抑制转移、抑制血管生成或以其它方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型，可使靶细胞或靶点与抗体及至少一种其它疗法接触。这些疗法将以有效杀死或抑制癌细胞增殖的组合量提供。此方法可涉及使细胞/位点/受试者与药剂/疗法同时接触。
预期与本公开的抗体组合治疗的特定药剂包括化学疗法及造血干细胞移植。化学疗法可包括阿糖胞苷(ara-C)及蒽环霉素(最常为道诺霉素)、单独高剂量阿糖胞苷、全反式视黄酸(ATRA)以及诱导化学疗法，在完成巩固疗法之后通常为蒽环霉素、组胺二盐酸盐(Ceplene)及白介素2(Proleukin)，吉妥珠单抗奥佐米星(Mylotarg)用于年龄大于60岁患有复发的AML或复发的急性前髓细胞性白血病(APL)的患者，所述患者不是高剂量化学疗法、氯法拉滨以及靶向疗法(例如激酶抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨及多药物耐性蛋白(MDR1)的抑制剂)或三氧化二砷的候选者。
在某些实施例中，用于组合疗法的药剂是一或多种选自由以下组成的群组的药物：拓朴异构酶抑制剂、蒽环霉素拓朴异构酶抑制剂、蒽环霉素、道诺霉素、核苷代谢抑制剂、阿糖胞苷、低甲基化剂、低剂量阿糖胞苷(LDAC)、道诺霉素及阿糖胞苷的组合、用于注射的道诺霉素及阿糖胞苷脂质体、
Figure BDA0002973222510000621
氮胞苷、
Figure BDA0002973222510000622
地西他滨、全反式视黄酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、组胺二盐酸盐、
Figure BDA0002973222510000623
白介素-2、阿地白介素、
Figure BDA0002973222510000624
吉妥珠单抗奥佐米星、
Figure BDA0002973222510000625
FLT-3抑制剂、米哚妥林、
Figure BDA0002973222510000626
氯法拉滨、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨、IDH1抑制剂、艾伏尼布(ivosidenib)、
Figure BDA0002973222510000627
IDH2抑制剂、伊那尼布(enasidenib)、
Figure BDA0002973222510000628
斯莫森德(smoothened，SMO)抑制剂、格拉吉布(glasdegib)、精氨酸酶抑制剂、IDO抑制剂、艾卡哚司他(epacadostat)、BCL-2抑制剂、维奈托克(venetoclax)、
Figure BDA0002973222510000629
铂复合物衍生物、奥沙利铂(oxaliplatin)、激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、BTK抑制剂、依鲁替尼、
Figure BDA00029732225100006211
阿卡替尼(acalabrutinib)、
Figure BDA00029732225100006210
赞鲁替尼(zanubrutinib)、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、ICOS抗体、TIGIT抗体、TIM3抗体、CD40抗体、4-1BB抗体、CD47抗体、SIRP1α抗体或融合蛋白、E-选择素的拮抗剂、与肿瘤抗原结合的抗体、与T细胞表面标记结合的抗体、与骨髓细胞或NK细胞表面标记结合的抗体、烷基化剂、亚硝基脲药剂、抗代谢产物、抗肿瘤抗生素、衍生自植物的生物碱、激素疗法药品、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂及P-糖蛋白抑制剂。
VI.抗体共轭物
本公开的抗体可连接至至少一种药剂以形成抗体共轭物。为了增加抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，通常连接或共价结合至少一个所期望的分子或部分，或与其形成复合物。此类分子或部分可以是(但不限于)至少一个效应分子或报告体分子。效应分子包含具有所期望活性(例如细胞毒性活性)的分子。已经连接至抗体的效应分子的非限制性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗性酶、放射性核素、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子及寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报告体分子定义为可使用分析法检测的任何部分。已与抗体共轭的报告体分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、光亲和性分子、着色粒子或配体，例如生物素。
抗体-药物共轭物已作为研究癌症疗法的突破方法出现。抗体-药物共轭物(ADC)包含共价连接至细胞杀灭药物的单克隆抗体(MAb)。此方法将MAb对其抗原靶标的高度特异性与高度有效的细胞毒性药物组合，从而产生“武装的”Mab，其将有效负载物(药物)递送至抗原水平富集的肿瘤细胞。药物的靶向递送还将其在正常组织中的暴露量减至最少，从而降低毒性且提高治疗指数。FDA对两种ADC药物(2011年的
Figure BDA0002973222510000631
(贝伦妥单抗维多汀(brentuximab vedotin))及2013年的
Figure BDA0002973222510000632
(曲妥珠单抗恩他新(trastuzumabemtansine)或T-DM1))的批准证实了所述方法。当前在用于癌症治疗的临床试验的各种阶段存在超过30种ADC候选药物(Leal等人,2014)。随着抗体工程改造及连接子-有效负载物优化变得愈来愈成熟，新的ADC的发现及研发越来越取决于适于此方法的新靶标的鉴别和验证以及靶标MAb的产生。ADC靶标的两个准则是肿瘤细胞中的表达上调/高水平及稳固内化。
抗体共轭物还优选用作诊断剂。抗体诊断剂一般分为两类：用于试管内诊断，例如用于多种免疫分析法中的诊断剂；以及用于活体内诊断方案的诊断剂，一般称为“抗体引导的成像”。本领域中已知许多适当成像剂，以及其连接至抗体的方法(参见例如美国专利5,021,236、4,938,948及4,472,509)。所用成像部分可以是顺磁性离子、放射性同位素、荧光染料、NMR可检测的物质及X射线成像剂。
在顺磁性离子的情况下，可提及例如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钙(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)等离子，其中钆尤其优选。用于其它情形(例如X射线成像)的离子包括(但不限于)镧(III)、金(III)、铅(II)且尤其为铋(III)。
在用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，可提及砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m和/或钇90。125I通常优选用于某些实施例中，且锝99m和/或铟111也由于其能量低及适用于远程检测而通常优选。本公开的放射性标记的单克隆抗体可根据本领域中熟知的方法制备。举例来说，单克隆抗体可通过与碘化钠和/或碘化钾及化学氧化剂(例如次氯酸钠)或酶氧化剂(例如乳过氧化酶)接触而碘化。根据本公开的单克隆抗体可通过配体交换法(例如用亚锡溶液还原高锝酸盐，将被还原的锝螯合至Sephadex柱上且将抗体施加至此柱上)、用锝99m标记。或者，可以使用直接标记技术，例如通过培育高锝酸盐、还原剂(例如SNCl2)、缓冲溶液(例如邻苯二甲酸钠-钾溶液)及抗体。通常用于使以金属离子形式存在的放射性同位素结合至抗体的中间官能团是二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
在考虑用作共轭物的荧光标记中，包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、级联蓝(CascadeBlue)、Cy3、Cy5,6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、俄勒冈绿(Oregon Green)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、REG、若丹明绿(Rhodamine Green)、若丹明红、肾造影剂(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明和/或得克萨斯红(TexasRed)。
本公开所涵盖的另一类抗体共轭物是预期主要在试管内使用的那些共轭物，其中抗体连接至二级结合配体和/或酶(酶标签)，在与显色底物接触后，产生着色产物。适合酶的实例包括尿素酶、碱性磷酸酶、(辣根)氢过氧化酶或葡萄糖氧化酶。优选的二级结合配体是生物素及抗生素蛋白及抗生蛋白链菌素化合物。此类标记的使用是本领域的技术人员熟知的且描述于例如美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149及4,366,241中。
将分子定点连接至抗体的又一已知方法包含使抗体与基于半抗原的亲和标记反应。本质上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的氨基酸反应，由此破坏此位点且阻断特异性抗原反应。然而，由于其导致抗体共轭物对抗原的结合减少，因此这是不利的。
还可以使用含有叠氮基的分子，经由低强度紫外光产生的反应性亚氨体中间物而与蛋白质形成共价键(Potter及Haley,1983)。具体地说，已使用嘌呤核苷酸的2-叠氮基类似物及8-叠氮基类似物作为定点光探针以鉴别粗细胞提取物中的核苷酸结合蛋白(Owens和Haley,1987；Atherton等人,1985)。2-叠氮基核苷酸及8-叠氮基核苷酸也用于对纯化的蛋白质的核苷酸结合域进行定位(Khatoon等人,1989；King等人,1989；Dholakia等人,1989)且可用作抗体结合剂。
本领域中已知用于将抗体与其共轭部分连接或共轭的若干方法。一些连接方法涉及使用金属螯合剂络合物，采用例如有机螯合剂，例如二乙三胺五乙酸酐(DTPA)；乙三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3连接至抗体(美国专利4,472,509及4,938,948)。单克隆抗体还可以与酶在例如戊二醛或高碘酸盐等偶合剂存在下反应。与荧光素标记物的共轭物是在这些偶合剂存在下或通过与异硫氰酸盐反应来制备。在美国专利4,938,948中，乳房肿瘤的成像是使用单克隆抗体实现且可检测到的成像部分是使用例如甲基-对羟基苯甲亚氨酸酯或N-琥珀酰亚氨基-3-(4-羟苯基)丙酸酯等连接子结合至抗体。
在其它实施例中，考虑了通过使用不改变抗体组合位点的反应条件，在免疫球蛋白Fc区中选择性引入硫氢基进行免疫球蛋白的衍生化。所公开的根据此方法产生的抗体共轭物展现改善的耐久性、特异性及敏感性(美国专利5,196,066，其以引用的方式并入本文中)。文献中也已公开了效应分子或报告体分子的定点连接，其中报告体分子或效应分子与Fc区中的碳水化合物残基共轭(O'Shannessy等人,1987)。据报道，此方法制造出在诊断上及治疗上颇具前景的抗体，所述抗体当前处于临床评价中。
VII.免疫检测方法
在又其它实施例中，本公开涉及用于结合、纯化、去除、定量及以其它方式大体上检测LILRB相关的癌症的免疫检测方法。尽管此类方法可在传统意义上应用，但另一用途是疫苗及其它病毒储备液的品质控制及监测，其中可使用根据本公开的抗体评估病毒中的H1抗原的含量或完整性(即，长期稳定性)。或者，可使用所述方法、根据适当/期望的反应特征筛选各种抗体。
一些免疫检测方法包括例如酶联免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫放射分析法、荧光免疫分析法、化学发光分析法、生物发光分析法及蛋白质印记法。具体地说，还提供了用于检测及定量LILRB的竞争性分析。各种适用免疫检测方法的步骤已描述于科学文献中，例如Doolittle及Ben-Zeev(1999)、Gulbis及Galand(1993)、DeJager等人(1993)及Nakamura等人(1987)。一般而言，免疫结合方法包括获得怀疑含有LILRB相关癌症的样品，以及视具体情况而定，在有效允许免疫复合体形成的条件下，使样品与根据本公开的第一抗体接触。
这些方法包括从样品中检测或纯化LILRB或LILRB相关癌细胞的方法。抗体优选地连接至固体载体(例如呈柱基质形式)，且将怀疑含有LILRB相关癌细胞的样品施加至被固定的抗体上。不想要的组分从柱中洗掉，留下与固定的抗体免疫复合的LILRB表达细胞，随后通过从柱中去除生物体或抗原进行收集。
免疫结合方法还包括用于检测及定量样品中的LILRB相关癌细胞或相关组分的量以及检测及定量在结合过程期间形成的任何免疫复合体的方法。在此，将获得怀疑含有LILRB相关癌细胞的样品且将样品与结合LILRB或其组分的抗体接触，随后检测及定量在特定条件下形成的免疫复合体的量。就抗原检测而言，所分析的生物样品可以是怀疑含有LILRB相关癌症的任何样品，例如组织切片或试样、均质化组织提取物、生物流体(包括血液及血清)，或分泌物，例如粪便或尿液。
使所选生物样品与抗体在有效条件下接触一段足以允许免疫复合体(主要免疫复合体)形成的时间通常仅仅是将抗体组合物添加至样品中且将混合物培育长足以使抗体与LILRB形成免疫复合体(即，结合至LILRB)的时间。此后，一般将洗涤样品-抗体组合物，例如组织切片、ELISA板、斑点印记或蛋白质印记，以去除任何非特异性结合的抗体物种，使得仅在主要免疫复合体内特异性结合的那些抗体得到检测。
一般而言，免疫复合体形成的检测为本领域中熟知的且可经由应用众多方法实现。这些方法一般是基于标记或标记物(例如那些放射性标签、荧光标签、生物标签及酶标签中的任一者)的检测。关于使用此类标记的专利包括美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149及4,366,241。当然，如本领域中已知，经由使用二级结合配体(例如第二抗体和/或生物素/抗生素蛋白配体结合配置)可发现额外的优势。
用于检测的抗体本身可连接至可检测的标记，其中然后仅仅检测此标记，由此测定组合物中主要免疫复合体的量。或者，可借助于对抗体具有结合亲和力的第二结合配体检测主要免疫复合体内结合的第一抗体。在这些情况下，第二结合配体可连接至可检测标记。第二结合配体本身通常是抗体，其因此可称为“二级”抗体。主要免疫复合体与经标记的二级结合配体或抗体在有效条件下接触一段足以允许二级免疫复合体形成的时间。随后一般洗涤二级免疫复合体以去除任何非特异性结合的经标记二级抗体或配体，且随后检测二级免疫复合体中的残留标记。
其它方法包括通过两步法检测主要免疫复合体。使用第二结合配体，例如对抗体具有结合亲和力的抗体，形成如上文所描述的二级免疫复合体。洗涤之后，使二级免疫复合体与对第二抗体具有结合亲和力的第三结合配体或抗体再次在有效条件下接触一段足以允许免疫复合体(三级免疫复合体)形成的时间。第三配体或抗体连接至可检测标记，从而允许检测由此形成的三级免疫复合体。若需要，此系统可提供信号放大。
一种免疫检测方法使用两种不同抗体。使用第一生物素化抗体检测靶抗原，且随后使用第二抗体检测连接至复合生物素的生物素。在所述方法中，首先在含有第一步骤抗体的溶液中培育待测试的样品。若存在靶抗原，则一些抗体结合至抗原以形成生物素化抗体/抗原复合体。抗体/抗原复合体随后通过在具有抗生蛋白链菌素(或抗生素蛋白)、生物素化DNA和/或互补生物素化DNA的连续溶液中培育以进行扩增，其中各步骤将额外的生物素位点添加至抗体/抗原复合体中。重复扩增步骤，直至达到适合的扩增程度，此时，在含有针对生物素的第二步骤抗体的溶液中培育样品。此第二步骤抗体例如用酶标记，所述酶可通过使用色素原底物的组织酶学检测抗体/抗原复合体的存在。在适当扩增情况下，可产生在宏观上可见的共轭物。
另一已知的免疫检测方法利用了免疫PCR(聚合酶链反应)方法。PCR方法与Cantor方法类似之处在于与生物素化DNA一起培育，但并非使用多轮抗生蛋白链菌素及生物素化DNA培育，用低pH或高盐缓冲液洗涤DNA/生物素/抗生蛋白链菌素/抗体复合体以释放出抗体。随后使用所得洗涤溶液在适合引物及适当对照物存在下进行PCR反应。至少在理论上，可利用PCR的巨大扩增能力及特异性检测单抗原分子。
1.ELISA
免疫分析法在其最简单且最直接的意义上为结合分析法。某些优选的免疫分析法是本领域中已知的各种类型的酶联免疫吸附分析法(ELISA)及放射免疫分析法(RIA)。使用组织切片进行的免疫组织化学检测也是特别有用的。然而，容易理解的是，检测不限于此类技术，且还可以使用蛋白质印记法、斑点印记法、FACS分析等。
在一种示例性ELISA中，将本公开的抗体固定至展现蛋白质亲和力的选定表面上，例如聚苯乙烯微量滴定板的孔中。随后，将怀疑含有LILRB相关癌细胞的测试组合物添加至孔中。在结合及洗涤去除非特异性结合的免疫复合体之后，可检测到被结合的抗原。检测可通过添加连接至可检测标记的另一抗LILRB抗体来实现。此类ELISA是简单的“夹心ELISA”。检测还可以通过添加第二抗LILRB4抗体，随后添加对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体实现，其中第三抗体连接至可检测标记。
在另一示例性ELISA中，将怀疑含有LILRB4相关癌细胞的样品固定至孔表面上且随后与本公开的抗LILRB4抗体接触。在结合及洗涤去除非特异性结合的免疫复合体之后，检测被结合的抗LILRB4抗体。在初始抗LILRB4抗体连接至可检测标记的情况下，可直接检测免疫复合体。再次，可使用对第一抗LILRB4抗体具有结合亲和力的第二抗体检测免疫复合体，其中第二抗体连接至可检测标记。
无论采用何种形式，ELISA均具有某些共同特征，例如涂覆、培育及结合、洗涤去除非特异性结合的物质，以及检测被结合的免疫复合体。下文中描述这些方式。
在用抗原或抗体涂覆板时，一般将所述板的孔与抗原或抗体溶液培育整夜或指定的数小时时间。随后洗涤所述板的孔以去除不完全吸附的材料。所述孔的任何残留可用表面随后用对测试抗血清呈抗原中性的非特异性蛋白质“涂覆”。这些蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。所述涂覆允许阻断固定表面上的非特异性吸附位点且因此减小由所述表面上抗血清的非特异性结合引起的背景。
在ELISA中，可能更常见的是使用二级或三级检测方式而非直接程序。因此，在蛋白质或抗体结合至孔、用非反应性材料涂覆以减小背景且洗涤去除未结合的材料之后，使固定表面与待测试的生物样品在有效允许免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下接触。免疫复合体的检测随后需要经标记的二级结合配体或抗体，以及二级结合配体或抗体与经标记的三级抗体或第三结合配体的组合。
“在有效允许免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下”意指，条件优选地包括用例如BSA、牛γ球蛋白(BGG)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)/Tween等溶液稀释抗原和/或抗体。这些添加的药剂也往往有助于减小非特异性背景。
“适合”条件还指，培育是在足以允许有效结合的温度或时间段下进行。培育步骤通常是在优选约25℃至27℃的温度下培育约1至2至约4小时左右，或可在约4℃左右下培育整夜。
在ELISA中的所有培育步骤之后，洗涤所接触的表面，以便去除未复合的材料。优选的洗涤程序包括用例如PBS/Tween或硼酸盐缓冲液等溶液洗涤。在测试样品与最初结合的材料之间形成特定免疫复合体且随后洗涤之后，可测定甚至微量免疫复合体的存在。
为了提供检测方式，第二或第三抗体将具有相关标记以允许检测。优选地，此标记将为在与适当显色底物一起培育时显色的酶。因此，举例来说，需要使第一及第二免疫复合体与尿素酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或氢过氧化酶共轭抗体在促进其它免疫复合体形成的条件下接触或培育一段时间(例如，在室温下，在含PBS的溶液(例如PBS-Tween)中培育2小时)。
在与经标记的抗体一起培育及随后洗涤以去除未结合材料之后，定量标记的量，例如通过与显色底物(例如脲，或溴甲酚紫，或2,2'-次偶氮基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)或H2O2(在过氧化酶作为酶标记的情况下))一起培育。随后，通过例如使用可见光谱分光光度计测量所产生的颜色的色度来实现定量。
2.蛋白质印记法
蛋白质印记法(或者，蛋白质免疫印记法)是用于检测给定的组织匀浆或提取物样品中的特定蛋白质的分析技术。其使用凝胶电泳，根据多肽的长度(变性条件)或根据蛋白质的三维结构(天然/非变性条件)来分离出天然或变性的蛋白质。随后将蛋白质转移至膜(通常为硝化纤维素或PVDF)上，其中使用对靶标蛋白质具有特异性的抗体探测(检测)所述蛋白质。
样品可获自完整组织或细胞培养物。在大多数情况下，首先使用掺混机(对于较大样品体积)、使用均质机(较小体积)或通过声波处理，以机械方式分解固体组织。还可以通过以上机械方法之一使细胞破裂。然而，应注意，细菌、病毒或环境样品可以是蛋白质的来源且因此蛋白质印记法不仅仅局限于细胞研究。可采用选定的清洁剂、盐及缓冲剂促进细胞溶解及溶解蛋白质。通常添加蛋白酶及磷酸酶抑制剂以防止样品被其自身的酶消化。组织准备通常是在低温下进行以避免蛋白质变性。
使用凝胶电泳分离样品中的蛋白质。蛋白质的分离可根据等电点(pI)、分子量、电荷或这些因素的组合进行。分离的性质取决于样品的处理及凝胶的性质。这是测定蛋白质的极有用方式。还可以使用二维(2-D)凝胶，其在两个维度上扩散来自单一样品的蛋白质。蛋白质在第一维度上根据等电点(使其具有中性净电荷的pH)分离，且在第二维度上根据其分子量分离。
为了使蛋白质可用于抗体检测，将其从凝胶内移至由硝化纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的膜上。将膜放置于凝胶顶部上，且在其顶部上放置一叠滤纸。将整个堆叠放置于缓冲溶液中，所述缓冲溶液在毛细作用下使蛋白质与其一起在滤纸上向前移动。用于转移蛋白质的另一方法称为电印记法(electroblotting)且使用电流将蛋白质从凝胶拉至PVDF或硝化纤维素膜中。蛋白质从凝胶内移至膜上，同时维持其在凝胶内所具有的组织。此印记法的结果是，蛋白质暴露于薄表面层上供检测(参见下文)。膜的两个种类是针对其非特异性蛋白质结合特性(即，同等地结合所有蛋白质)来选择。蛋白质结合是基于疏水相互作用，以及膜与蛋白质之间的带电相互作用。相较于PVDF，硝化纤维素膜更便宜，但要脆弱得多且无法经受住反复探测。蛋白质从凝胶转移至膜的均一性及总体效用可通过用考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)或丽春红S染料(Ponceau S dye)对膜染色来检查。一旦转移，即使用经标记的初级抗体或使用未标记的初级抗体检测蛋白质，随后使用经标记的蛋白质A或结合至初级抗体Fc区的二级经标记抗体间接检测。
3.免疫组织化学
本公开的抗体还可以与制备用于免疫组织化学(IHC)研究的新鲜冷冻和/或福尔马林固定、石蜡包埋的组织块一起使用。由这些颗粒试样制备组织块的方法已成功地用于先前针对各种预后因子的IHC研究中且为本领域的技术人员熟知的(Brown等人,1990；Abbondanzo等人,1990；Allred等人,1990)。
简单地说，可如下制备冷冻切片：在室温下使50ng冷冻“粉碎”组织在小塑料胶囊中的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中复水；通过离心使粒子集结；将其再悬浮于粘性包埋介质(OCT)中；倒置胶囊和/或再通过离心使其集结；在-70℃异戊烷中急速冷冻；切割塑料胶囊和/或移出冷冻的组织圆柱；将组织圆柱固定于低温薄片切片机夹盘上；和/或从胶囊切割25-50个连续切片。或者，可使用完整的冷冻组织样品进行连续切片切割。
永久性切片可通过类似方法制备，所述方法涉及在塑料微量离心管中使50mg样品复水；集结；再悬浮于10％福尔马林中固定4小时；洗涤/集结；再悬浮于温热的2.5％琼脂中；集结；在冰水中冷却以使琼脂变硬；从管中移出组织/琼脂块；使所述块浸润和/或包埋于石蜡中；和/或切割至多50个永久性连续切片。又，可取代完整组织样品。
4.免疫检测试剂盒
在又其它实施例中，本公开涉及结合上述免疫检测方法使用的免疫检测试剂盒。由于抗体可用于检测LILRB相关癌细胞，因此抗体可包括于试剂盒中。因此，免疫检测试剂盒将在适合容器构件中包含结合至LILRB的第一抗体，以及任选的免疫检测试剂。
在某些实施例中，抗体可预先结合至固体载体，例如柱基质和/或微量滴定板孔。试剂盒中的免疫检测试剂可呈多种形式中的任一者，包括与给定抗体结合或连接的那些可检测标记。还考虑了与二级结合配体结合或连接的可检测标记。示例性二级配体是对第一抗体具有结合亲和力的那些二级抗体。
适用于本发明试剂盒中的其它免疫检测试剂包括双组分试剂，其包含对第一抗体具有结合亲和力的二级抗体，以及对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体，第三抗体连接至可检测标记。如上所述，本领域中已知多种示例性标记且所有此类标记均可结合本公开使用。
试剂盒可进一步包含适当等分的LILRB组合物，无论标记或未标记，其可用于制备供检测分析用的标准曲线。试剂盒可含有呈完全共轭形式、呈中间物形式的抗体-标记共轭物或由试剂盒的使用者完成共轭的各别部分。试剂盒的组分可封装于水性介质中或以冻干形式封装。
试剂盒的容器构件一般将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器，或其中可放入抗体或优选适当等分的抗体的其它容器构件。本公开的试剂盒通常还将包括用于容纳抗体、抗原及任何其它试剂容器的构件，其呈紧密围封形式以供商业销售。此类容器可包括所期望小瓶保留于其中的注射成型或吹塑成型塑料容器。
5.流式细胞术及FACS
本发明的抗体还可以用于流式细胞术或FACS。流式细胞术是基于激光或阻抗的技术，其用于许多检测分析，包括细胞计数、细胞分选、生物标记检测及蛋白质工程改造。所述技术将细胞悬浮于流体液流中且使其通过电子检测装置，所述电子检测装置允许同时对多达每秒数千粒子的物理及化学特征进行多参数分析。流式细胞术通常用于诊断病症，尤其血癌，但在基础研究、临床实践及临床试验中具有许多其它应用。
荧光活化细胞分选(FACS)是特定类型的细胞测量术。其提供一种基于各细胞的特定光散射及荧光特征，将生物细胞的非均质混合物分选至两个或更多个容器中的方法，每次一个细胞。一般而言，所述技术涉及细胞悬浮液夹带于狭窄的、快速流动的液体流的中心。所述流经配置以使得细胞之间存在较大间距(相对于其直径)。振动机理使细胞液流分裂成单个液滴。在液流刚好分裂成液滴之前，所述流通过荧光测量台，在荧光测量台中测量各细胞的荧光。充电环刚好放置于液流分裂成液滴的位置。使所基于的环带电，随即测量荧光强度，且在液流分裂时，使相反电荷截留于液滴上。带电液滴随后经由静电偏转系统落下，所述系统根据其电荷将液滴转移至容器中。
在某些实施例中，为了用于流式细胞术或FACS中，本公开的抗体用荧光团标记且随后允许与所关注的细胞结合，所述细胞在流式细胞仪中分析或通过FACS机器分选。
VIII.实例
以下实例是为了展现本发明的优选实施例而纳入。本领域的技术人员应了解，以下实例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明实施中运行良好的技术，且因此可视为构成其优选的实施方式。然而，根据本公开，本领域的技术人员应了解，在不脱离本发明的精神及范围的情况下可在所公开的具体实施例中作出许多改变且仍获得相同或类似结果。
实例1
小鼠.C57 BL/6J及NOD-SCID IL2Rγ空白(NSG)小鼠购自得克萨斯大学西南医学中心(University of Texas Southwestern Medical Center，UTSW)的动物核心机构且在所述处饲养。如此前所描述的Apoe基因敲除(apoe-KO，Apoetm1Unc)小鼠31购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。动物研究已经批准且在UT西南机构动物护理及使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的监管下进行。各实验使用相同性别及年龄匹配(4-8周)的小鼠且随机分配至各组；且对于肿瘤尺寸测量及活体内腔成像实验来说，对小鼠的处理条件不知情。基于此前相关研究的结果计算各组小鼠的最少数目。对于皮下肿瘤模型，根据(宽度×宽度×长度)cm3计算肿瘤尺寸。UTSW IACUC准许的最大肿瘤测量值是肿瘤直径2cm。
细胞培养.293T细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏改进伊格尔氏培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中在37℃下、在5％CO2及正常含量O2中培养。在37℃下、在5％CO2及正常含量的O2中，人类脐带静脉/血管内皮细胞(HUVEC)(ATCC，CRL-1730)在内皮细胞生长培养基加生长因子、细胞因子及补充剂(EGM-BulletKit，Lonza)中培养。在37℃下、在5％CO2及正常含量的O2中，人类单核细胞性AML细胞THP-1(ATCC，TIB-202)、MV4-11(ATCC，CRL-9591)及U937(ATCC，CRL-1593.2)及小鼠AML细胞WEHI-3(ATCC，TIB-68)在补充有10％FBS的洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park MemorialInstitute，RPMI)1640中培养。在37℃下、在5％CO2及正常含量的O2中，小鼠AML细胞C1498(ATCC，TIB-49)在补充有10％FBS的DMEM中培养。使用霉浆菌污染试剂盒(R&D systems)对所有细胞系进行常规测试。
原代人类白血病细胞.原代人类AML及B-ALL样品获自UTSW的组织库。知情同意书是根据由UTSW的机构审查委员会审查及批准的方案获得。UTSW组包括105名根据法-美-英(FAB)分类以AML亚型为代表的AML患者、成熟度最小的急性骨髓母细胞白血病(M1，n＝9)、成熟的急性骨髓母细胞白血病(M2，n＝34)、急性前髓细胞性白血病(M3，n＝10)、急性骨髓单核细胞性白血病(M4，n＝34)、急性单核细胞性白血病(M5，n＝25)、急性红血球系白血病(M6，n＝2)及急性巨核母细胞白血病(M7，n＝1)及患有未分化的白血病的患者(AUL；n＝1)及暂时性骨髓增生病症(TAM；n＝2)。样品在含有10％DMSO的FBS中冷冻且于液氮中储存。
人类正常单核细胞及巨噬细胞.人类正常单核细胞(CD14+细胞)是通过AutoMACSPro分离系统(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)从正常外周血液的单核细胞部分中分离出来。简单地说，白细胞层购自州际血库(Interstate Blood Bank)(Memphis,TN)且单核细胞层通过Ficoll Hypaque(17144003,GE Lifesciences)密度梯度分离法进行分离。单核细胞用红血细胞裂解缓冲液处理以去除红血细胞且随后在4℃下与CD14微珠共轭抗体(130-050-201,Miltenyi Biotech,Auburn,CA)一起培育15分钟。随后根据制造商的方案使用正向选择程序分离出CD14阳性细胞。将一百万个CD14+细胞于巨噬细胞培养基(补充有10％人类AB血清(MT35060CI，Fisher Scientific)、1％NEAA(11-140-050，Fisher)、2μM L-丙氨酸-L-谷酰胺(SH3003402，Fisher)的伊氏改进达尔伯克氏培养基(Iscove's modifiedDulbecco's medium，IMDM)(12440053，Thermo fisher))中接种于6孔板的每个孔中且培养7天。在培育之后，大部分细胞粘附至塑料表面且染色对于CD14及特异于巨噬细胞的其它标记呈阳性。
TCGA分析.数据获自TCGA急性骨髓性白血病数据库(版本：2016年8月16日)。将患者分类为AML亚型(FAB分类)M0(未分化的急性骨髓母细胞白血病)(n＝16)、M1(n＝42)、M2(n＝39)、M3(n＝16)、M4(n＝35)、M5(n＝18)、M6(n＝2)、M7(n＝3)；两个病例未依据亚型分类。指定基因的mRNA水平是通过RNA-seq(polyA+IlluminaHiSeq)来测定。报告RESM归一化计数且用UCSC Xena(xena.ucsc.edu)对数据进行分析及可视化。为分析总存活期，将160名具有可用存活期数据的患者基于其是否具有高、中等或低基因表达分成三组，且随后通过Xena Kaplan Meier标绘图(http://xena.ucsc.edu/survival-plots/)进行分析。
流式细胞术.使用的初级抗体包括：抗人类CD45-PE(BD Pharmingen，HI30，1:100)、CD45-FITC(BD Pharmingen，HI30，1:100)、CD45-APC(BD Pharmingen，HI30，1:100)、抗人类CD34-FITC(BD Pharmingen，55582，1:100)、抗人类CD19-PE(eBioscience，HIB19，1:100)、抗人类CD20-PE(BD Pharmingen，555623，1:100)、抗人类CD11b-APC(eBioscience，ICRF44，1:100)、抗人类LILRB4-APC(eBioscience，ZM4.1，1:100)、抗人类LILRB4-PE(Biolegend，ZM4.1，1:100)、抗人类CD14-APC(eBioscience，61D3，1:100)、抗人类CD33-APC(Biolegend，P67.6，1:100)、抗人类CD4-APC(eBioscience，RPA-T4，1:100)、抗人类CD3-FITC(BioLegend，HIT3a，1:100)、抗人类CD3-太平洋蓝(BD Pharmingen，SP34-2，1:100)、抗人类CD8-PE(BD Pharmingen，555367，1:100)、抗人类CD28-APC(eBioscience，CD28.2，1:100)、抗人类CD40L-APC(eBioscience，24-31，1:100)、抗人类PD1-APC(Biolegend，EH12.2H7，1:100)、抗人类TIM3-APC(eBioscience，F38-2E2，1:100)、抗人类TIGIT-APC(eBioscience，MBSA43，1:100)、抗人类LAG3-APC(eBioscience，3DS223H，1:100)、抗人类FasL-PE(eBioscience，24-31，1:100)、抗uPAR-APC(Biolegend，VIM5，1:100)、抗小鼠CD3-APC(BioLegend，17A2，1:200)、抗小鼠CD8a-PE(BioLegend，53-6.7，1:200)、抗小鼠CD45-PE(BD Pharmingen，30-F11，1:200)、抗小鼠CD49b-APC(eBioscience，DX5，1:200)、抗小鼠CD49f-PE(eBioscience，GoH3，1:200)、抗小鼠CD11b-APC(BioLegend，M1/71，1:200)、抗小鼠CD11b-PE(BioLegend，M1/71，1:200)、抗小鼠CD11c-APC(eBioscience，N418，1:200)、抗小鼠F4/80-APC(BioLegend，BM8，1:200)、抗His标签-APC(R&D systems，AD1.1.10，1:400)以及IgG同型对照APC(eBioscience，P3.6.2.8.1，1:400)抗体。细胞在Calibur上进行分析或在FACSAria上进行分析及分选。流动数据通过Flowjo软件分析。为分析NSG小鼠中的人类造血移植，遵循此前公开的方案。PI染色用于在分析及分选中排除死细胞。对于胞内染色，本发明人遵循来自eBioscience的固定/甲醇两步骤方案。简单地说，针对LILRB4(抗LILRB4-Alexa Fluor 647，Biolegend，ZM4.1，1:100)及CD33(抗人类CD33-FITC，Biolegend，HIM3-4，1:100)及可固定的细胞活力染料eFluor450(Bioscience，目录号65-0863-14，1:100)的表面表达，对人类原代AML细胞进行染色，随后进行固定(IC固定缓冲液，eBioscience，目录号00-8222)及甲醇处理。此后，通过抗p-SHP-2(Y580)-PE(Cellsignaling，目录号13328S，1:100)、抗pIKKα/β(S176/180)(16A6)(Cell signaling，目录号2697，1:100)、抗NFκB(S529)-PE(eBioscience，B33B4WP，1:100)、抗uPAR-PE(Biolegend，VIM5，1:100)、抗精氨酸酶-1(D4E3M)(Cell signaling，目录号93668，1:100)、兔IgG同型对照-PE(Cell signaling，目录号5742，1:100)、小鼠IgG同型对照-PE(eBioscience，m2a-15F8，1:100)及抗兔IgG-PE(Jackson Immunoresearch Lab，目录号111-116-144，1:400)对细胞的胞内抗原进行染色用于流式细胞术分析。
病毒结构及感染.对于逆转录病毒封装来说，将质体构建体XZ201-IRES-GFP及XZ201-人类lilrb4(hlilrb4)-IRES-GFP与PCL-ECO(2:1)混合，随后使用脂染胺2000(Invitrogen)转染至293T细胞中。对于慢病毒封装来说，将基于CRISPER/Cas-9的gRNA(向导RNA)构建体及用于基因过度表达的其它构建体(包括pLentiLox3.7-荧光素酶-IRES-GFP、ZsGreen-hlilrb4及ZsGreen-hlilrb4-intΔ、pLVX-plaur-IRES-tdTomato、pLVX-arg1-IRES-tdTomato)与psPAX2及pMD2.G(Addgene)以4:3:1的比率混合且使用脂染胺2000(Invitrogen)转染至293T细胞中。含病毒的上清液在转染后48-72小时收集且如此前所描述用于感染。
AML细胞中基于CRISPR/Cas9的基因敲除.人类AML细胞用表达多西环素诱导性Cas9的慢病毒(pCW-Cas9，Addgene 50661)感染。在1μg/ml嘌呤霉素选择之后，存活的细胞用表达sgRNA的慢病毒感染，所述慢病毒是由pSLQ1651(Addgene 51024)修饰的质体、通过分选用的GFP置换puro-mcherry来产生。通过线上工具(http://crispr.mit.edu)设计的加扰对照sgRNA(sgRNA 5'-GAACGACTAGTTAGGCGTGTA-3'(SEQ ID NO:211))、靶向lilrb4的sgRNA(sgRNA1 5'-TGTTACTATCGCAGCCCTGT-3'(SEQ ID NO:212)；sgRNA2
5'-GTAGGTCCCCCCGTGCACTG-3'(SEQ ID NO:213)；sgRNA3
5'-CCTGTGACCTCAGTGCACGG-3'(SEQ ID NO:214))、靶向apoe的sgRNA(sgRNA1
5'-CTTTTGGGATTACCTGCGC-3'(SEQ ID NO:215)；sgRNA2
5'-AACTGGCACTGGGTCGCTTT-3'(SEQ ID NO:216))、靶向shp-1的sgRNA (sgRNA1
5'-TAAGACCTACATCGCCAGCC-3'(SEQ ID NO:217)；sgRNA2
5'-GAAGAACTTGCACCAGCGTC-3'(SEQ ID NO:218))、靶向shp-2的sgRNA(sgRNA15'-GAGACTTCACACTTTCCGTT-3'(SEQ ID NO:219)；sgRNA2
5'-TACAGTACTACAACTCAAGC-3'(SEQ ID NO:220))、靶向ship的sgRNA(sgRNA1
5'-CACGCAGAGCGCGTATGCCC-3'(SEQ ID NO:221)；sgRNA2
5'-TGGCAACATCACCCGCTCCA-3'(SEQ ID NO:222))分别克隆至sgRNA质体中。在用1μg/ml多西环素(Sigma，目录号PHR1789)处理1周之后，这些细胞用抗LILRB4抗体染色且LILRB4阴性细胞分选为lilrb4基因敲除细胞。对于apoe-、shp-1-、shp-2-及ship-基因敲除细胞，将GFP+细胞以每孔单个细胞分选至96孔板中。在细胞扩增之后，基因敲除的细胞通过蛋白质印记法验证。为活体内诱导CRISPR/Cas9以实现基因敲除，本发明人如所描述用多西环素喂食小鼠。简单地说，在Cas9/lilrb4-sgRNA转染的THP-1细胞植入后7天，小鼠经由每天管饲用每只小鼠2mg多西环素处理5天以在移植的白血病细胞中实现Cas9表达。通过流式细胞术验证基因敲除。
白血病细胞及T细胞共培养分析.在共培养分析中，将从健康供体外周血液(PB009-1-0，AllCells)分离出的人类T细胞(5×104个/孔)与被辐射(28Gy)的指定人类白血病细胞混合于U形底96孔板中。对于T细胞与白血病细胞的非接触式共培养，白血病细胞在U形底96孔板的跨孔插件(孔径，3μM，#09-761-80，Thermo Fisher)的上部腔室中培养。将从健康供体分离出的T细胞放置于96孔跨孔板的下部腔室中。将被辐射的指定白血病细胞(若未指示，则E:T比率＝2:1)添加至上部腔室中且用指定的抗体、蛋白质及试剂处理。在与抗CD3/CD28涂覆的珠粒(11161D，Thermo Fisher)及50U/ml rhIL-2一起培养5至7天之后，使用倒置显微镜拍摄代表性细胞，且T细胞用抗CD3抗体染色且通过流式细胞术进行分析。
对于原代AML或B-ALL样品来说，分别分选出对AML及B-ALL呈CD33+及CD19+的患者白血病细胞。这些白血病细胞与来自同一患者的自体CD3+T细胞或来自健康供体的同种异体T细胞一起培养(E:T比率＝2:1)。在与抗CD3/CD28涂覆的珠粒(11161D，Thermo Fisher)及50U/ml rhIL-2一起培养14天之后，使用倒置显微镜拍摄代表性细胞，且T细胞用抗CD3、抗CD4及抗CD8抗体染色且通过流式细胞术进行分析。
对于细胞毒性分析来说，在96孔板中用抗CD3/CD28/CD137涂覆的珠粒(11163D，Thermo Fisher)刺激从健康供体的PBMC分离出的人类CD8+T细胞(5×104个/孔)2天。随后，添加指定的5×103个白血病细胞及50至500μg/ml抗LILRB4抗体或对照IgG。细胞数目在第7天在三重复孔中测定。或在三重复孔中用T细胞以指定的E:T比率培养指定的白血病细胞4至6小时。抗CD3及抗CD8用于检测人类CTL细胞；指定的活THP-1对于GFP呈阳性且对于PI呈阴性。使用来自被刺激的CTL细胞与经抗LILRB4或IgG处理的THP-1细胞的共培养物的细胞上清液，使用人类细胞因子阵列(AAH-CYT-6，RayBiotech)检测细胞因子产生。
对于小鼠白血病/T细胞共培养来说，来自野生型C57bl/6的脾细胞与2.5×104个被辐射(28Gy)的小鼠白血病C1498细胞在U形底96孔板中共培养60小时。将抗CD3/CD28涂覆的珠粒(11452D，Thermo Fisher)、50U/ml重组人类IL-2及来自野生型C57bl/6小鼠或来自apoe-KO小鼠的5％血清添加至培养基中。在一些实验中，将50μg/ml脂质结合的APOE蛋白(APOE-POPC)添加至培养基中。如所描述进行APOE重组蛋白的脂质化。
跨内皮迁移分析.为测量AML细胞经由内皮细胞迁移的能力，在跨孔膜(微孔尺寸为8μm)上培养3×105个HUVEC细胞。在3天之后，将1×105个指定的白血病细胞接种于上部腔室中。在指定的实验中，白血病细胞在上部腔室中用抗体或蛋白质处理。在18小时之后，对下部腔室中的细胞进行计数。
白血病细胞的短期浸润分析及造血干/祖细胞(HSPC)的归巢分析.静脉内注射细胞(5×106个细胞/小鼠)至NSG小鼠中。在注射白血病细胞之后立即用10mg/kg的抗LILRB4抗体或对照IgG治疗动物。在20小时之后，处死小鼠。采集外周血液、骨髓、肝脏及脾，且通过流式细胞术检测单细胞悬浮液。在指定的实验中，CFSE、GFP或例如抗人类CD45及抗人类CD33等指定标记用于检测白血病靶细胞。白血病细胞在接受者肝脏、脾及骨髓中的数目以相对于外周血液中的细胞数目的比率报告。
为测试小鼠白血病细胞的浸润能力，静脉内注射5×106个C1498-GFP-hLILRB4细胞或C1498-GFP至野生型C57BL/6J或APOE-空白小鼠中。在20小时之后，处死小鼠。GFP用于通过流式细胞术检测白血病细胞。白血病细胞在接受者肝脏、脾及骨髓中的数目相对于外周血液中的数目归一化且以比率报告。
为测试HSPC归巢能力，静脉内注射1×107个人类脐带血单核细胞至NSG小鼠中。小鼠在注射单核细胞之后立即用10mg/kg的抗LILRB4抗体或对照IgG治疗且在20小时之后处死。抗人类CD45及抗人类CD34用于通过流式细胞术检测人类HSPC。类似地，为测试正常人类单核细胞的浸润能力，来自健康供体PBMC的5×106个CD14阳性选择单核细胞通过CFSE标记且静脉内注射至NSG小鼠中。小鼠在注射单核细胞之后立即用10mg/kg的抗LILRB4抗体或对照IgG治疗且在20小时之后处死。通过流式细胞术分析CFSE阳性细胞。
先天性免疫细胞耗竭.在白血病细胞植入前3天，通过腹膜内注射50μl抗脱唾液酸GM1抗体(CL8955，Cedarlane)进行NK细胞耗竭，其导致NSG小鼠循环中的CD45+CD49b+NK细胞耗竭>90％。巨噬细胞通过用氯屈膦酸盐(二氯亚甲基双膦酸盐)脂质体(SKU8909，Clodrosome)(白血病细胞植入前3天，200μl储备溶液)处理NSG小鼠而清除，其导致NSG小鼠循环中的CD45+CD11b+F4/80+巨噬细胞耗竭>70％。白血病细胞植入后第-3、-2、-1及0天，通过腹膜内注射200μg抗Ly-6G mAb(BP0075-1，Bioxcell)，使NSG小鼠呈现中性白细胞减少，其导致NSG小鼠循环中的CD45.1+CD11b+CD11c-嗜中性白细胞耗竭>80％。
人类AML异种移植.异种移植基本上如所描述进行2,3,6,7。简单地说，6-8周龄的NSG小鼠用于移植。对于各静脉内注射的小鼠，将1×106个人类白血病细胞再悬浮于200μl PBS中。立即静脉内给予小鼠10mg/kg抗LILRB4抗体或对照IgG。在移植之后三至四周，评估外周血液、骨髓、脾及肝脏的移植。通过发光成像(最大值，3×108p/sec/cm2/sr；最小值，5×106p/sec/cm2/sr)随时间推移监测白血病生长。对于存活曲线实验，当对濒死的动物实施安乐死时，记录小鼠的死亡。对于患者来源的原代异种移植(PDX)，经由尾部静脉注射给予各NSG小鼠5至10×106个人类原代外周血液或骨髓单核细胞，其含有白血病细胞及其它正常区室，例如正常造血干细胞祖细胞及自体T细胞。立即静脉内给予小鼠10mg/kg抗LILRB4抗体或对照IgG且一周治疗两次直至安乐死。对于AML#11，小鼠在白血病细胞植入后7天静脉内给予10mg/kg抗LILRB4抗体或对照IgG且一周治疗两次直至安乐死。通过对外周血液中人类细胞执行流式细胞术、随时间推移来监测白血病生长。小鼠组织中超过1％的人类白血病细胞被视为原代AML细胞的成功移植。在移植之后一至四个月，评估外周血液、骨髓、脾及肝脏的移植。
对于hPBMC人源化模型，静脉内注射1×107个人类PBMC至各NSG小鼠中。在植入之后三周，小鼠具有30至50％的人类T细胞植入。在植入后3周，皮下植入1×106个人类AMLTHP-1细胞，包括野生型、lilrb4-KO THP-1细胞或稳定表达荧光素酶的THP-1细胞(THP-1-Luc-GFP细胞)。立即静脉内给予小鼠10mg/kg抗LILRB4抗体或对照IgG且一周治疗两次直至安乐死。通过发光成像(最大值，1×108p/sec/cm2/sr；最小值，5×106p/sec/cm2/sr)随时间推移监测肿瘤生长。肿瘤尺寸通过测径规测量(宽度×宽度×长度)测定。对于诱导性lilrb4基因敲除实验，将1×106个Cas9/lilrb4-sgRNA转染的THP-1细胞通过静脉内注射于各NSG小鼠中，随后立即静脉内注射从健康供体分离出的0.5×106个人类正常T细胞。在THP-1及T细胞植入后7天，小鼠经由每天每只小鼠管饲2mg多西环素治疗5天以在移植的THP-1细胞中实现Cas9表达。在植入后3周，评估外周血液、骨髓、脾及肝脏的移植。
对于人类脐带血(hCB)-异种移植模型，静脉内注射2×104个人类CD34+hCB细胞至各NSG小鼠中。在植入之后六周，小鼠具有10至50％的人类细胞植入。静脉内植入1×106个稳定表达荧光素酶的THP-1细胞(THP-1-Luc-GFP细胞)。立即静脉内给予小鼠10mg/kg抗LILRB4抗体或对照IgG。通过发光成像(最大值，1×108p/sec/cm2/sr；最小值，5×106p/sec/cm2/sr)、随时间推移监测肿瘤生长。通过流式细胞术分析人类正常血细胞的谱系。
小鼠AML同种异体移植.小鼠AML同种异体移植的程序与人类AML异种移植的程序类似。简单地说，6-8周龄的野生型C57bl/6小鼠用于移植。对于静脉内或皮下植入的各小鼠，将1×106个表达人类LILRB4的小鼠白血病细胞再悬浮于200μl PBS中。小鼠在白血病细胞植入后第7天静脉内给予10mg/kg抗LILRB4-N297A抗体或对照IgG且一周治疗两次直至安乐死。在移植之后三周，评估外周血液、骨髓、脾及肝脏的移植。对于皮下植入的小鼠，肿瘤尺寸通过测径规测量(宽度×宽度×长度)测定。对于存活曲线实验，当对濒死的动物实施安乐死时，记录小鼠的死亡。对于CD8+T耗竭，在白血病细胞植入之后3天静脉内注射10mg/kg抗CD8抗体(YTS 169.4.2，Bioxcell)且每3天额外治疗两次。为确定抗LILRB4抗体治疗是否产生针对肿瘤或针对LILRB4的肿瘤特异性记忆T细胞，本发明人将脾细胞(5×106个/小鼠)从抗LILRB4治疗的小鼠中过继转移至正常接受者C57bl/6小鼠中。五分之四的移植小鼠排斥对照C1498-GFP小鼠白血病细胞，且这些小鼠不易遭受高3倍数目(3×106/小鼠)的C1498-GFP白血病细胞的再攻击。而从未治疗小鼠过继转移脾细胞的5只小鼠中无一者排斥对照C1498-GFP小鼠白血病细胞。
嵌合受体报告体分析.如所描述构建稳定嵌合受体报告细胞系统，以测试配体结合至个别LILRB、PirB、gp49B1及LILRB4位点突变的ECD且触发成对免疫球蛋白样受体β的嵌合融合胞内域活化或抑制的能力，所述胞内域经由衔接子DAP-12传导信号以活化NFAT启动子。若促效剂或拮抗剂结合ECD且活化或抑制嵌合信号传导域，则观察到GFP表达分别增加或减少。竞争分析用于筛选LILRB4阻断抗体。简单地说，将APOE蛋白(CI02，Novoprotein；10μg/ml)或人类AB血清(10％，以PBS稀释)在37℃下预涂覆于96孔板上3小时。在用PBS洗涤两次之后，将2×104个LILRB4报告细胞接种于各孔中；同时，将指定的抗LILRB4抗体添加至培养基中。在16小时之后，通过流式细胞术分析GFP+报告细胞的百分比。活化的临限值是阴性对照处理的2倍。
快速蛋白质液相色谱(FPLC)及质谱.将含10％人类AB血清的PBS装载至16/60Superdex 200凝胶过滤柱上且用PBS及2mM EDTA溶离。收集八十个洗脱份(40ml)，且各洗脱份(0.5ml)通过嵌合受体报告体分析进行分析。将活性洗脱份(#26-30)装载至PAGE凝胶上且加以处理以进行LC-MS/MS分析(Orbitrap Elite)用于UTSW蛋白质组研究中心的蛋白质鉴别。用于验证的重组或纯化蛋白质是ZA2G(MBS145455,MyBioSource)、AMBP(13141-H08H1,北京义翘神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc))、TTHY(12091-H08H,北京义翘神州科技股份有限公司)、PEDF(11104-H08H,北京义翘神州科技股份有限公司)、A2MG(MBS173010,MyBioSource)、HEMO(MBS143111,MyBioSource)、ANGT(MBS173525,MyBioSource)、A1AT(MBS173006,MyBioSource)、S100A9(pro-814,Prospecbio)、HORN(EBP08267,Biotrend USA)、VTDB(CSB-EP009306HU,Biotrend USA)、LRG1(pro-141,Prospecbio)、A1BG(RPE570Hu01,Cloud-Clone Corp)、CRSP3(RD172262100,BioVendor)、APOA1(16-16-120101-LEL,Athens Research&Technology)、APOA2(16-16-120102,AthensResearch&Technology)、APOA4(16-16-120104,Athens Research&Technology)、APOB(16-16-120200,Athens Research&Technology)、APOC1(16-16-120301,Athens Research&Technology)、APOC2(16-16-120302,Athens Research&Technology)、APOC3(16-16-120303,Athens Research&Technology)、hAPOE(16-16-120500,Athens Research&Technology)、mAPOE(CJ05,Novoprotein)、APOE2(350-12,Peprotech)、APOE3(350-02,Peprotech)、APOE4(350-04,Peprotech)、PODXL2(1524-EG-050,R&D systems)、CD44(12211-H08H,北京义翘神州科技股份有限公司)、HCK(PV6128,Thermo Fisher)、VEGFR3(10806-H08H,北京义翘神州科技股份有限公司)、NRG3(16071-H08H,北京义翘神州科技股份有限公司)、PI16(H00221476-P01,Novusbio)、hMAG(8940-MG-050,R&D systems)、mMAG(8580-MG-100,R&D systems)、CNTF(303-CR-050,R&D systems)、ANGPTL-7(914-AN-025/CF,R&D systems)、整合素-α1β1(7064-AB-025,R&D systems)、整合素-α2β1(5698-AB-050,R&D systems)、整合素-α2β3(7148-AB-025,R&D systems)、整合素-α3β1(2840-A3-050,R&Dsystems)、整合素-α4β1(5668-A4-050,R&D systems)、整合素-α4β7(5397-A3-050,R&Dsystems)、整合素-α5β1(3230-A5-050,R&D systems)、整合素-α5β3(3050-AV-050,R&Dsystems)、整合素-α5β5(2528-AV-050,R&D systems)、整合素-α5β6(CT039-H2508H,北京义翘神州科技股份有限公司)、整合素-α5β6(CT051-M2508H,北京义翘神州科技股份有限公司)、整合素-α5β8(4135-AV-050,R&D systems)、整合素-α6β4(5497-A6-050,R&Dsystems)、整合素-α8β1(CT016-H2508H,北京义翘神州科技股份有限公司)、整合素-α9β1(5438-A9-050,R&D systems)、整合素-α10β1(5895-AB-050,R&D systems)、整合素-α11β1(6357-AB-050,R&D systems)、整合素-αEβ7(5850-A3-050,R&D systems)、整合素-αXβ2(CT017-H2508H,北京义翘神州科技股份有限公司)及正常小鼠血清(NS03L,Milliporesigma)。
生物层干扰测量法.LILRB4-Fc与APOE2、APOE3及APOE4之间的结合相互作用分析在Octet RED96(ForteBio,Pall Corporation)上进行。所有相互作用研究均用蛋白A浸入即读式生物传感器(ForteBio)进行。所有结合实验均在30℃下使用Octet Red及动力学缓冲液进行。在监测APOE的缔合(300s)及解离(600s)之前，在动力学缓冲液中洗涤LILRB4-Fc涂覆的生物传感器(25μg/ml LILRB4-Fc装载420s)。背景波长位移是用仅装载有LILRB4-Fc的参考传感器测量。
表面等离子体共振(SPR).Biacore 2000及CM5芯片用于分析重组APOE与融合至hFc的LILRB4胞外域的结合，使用如先前所描述的方法2。使用来自GE的胺偶合试剂盒将重组蛋白A(Pierce)预固定于两个流动池中。将LILRB4-hFc注射至待由蛋白A捕获的一个流动池中。对于蛋白A偶合的细胞对照，校正含有捕获的LILRB4-hFc的样品流动池的各结合感测图谱。在每次注射诱导结合反应的抗原溶液及输注操作缓冲液的解离期之后，通过注射含有10mM Na3PO4(pH 2.5)及500mM NaCl的再生溶液来再生蛋白A表面。所有捕获的LILRB4-hFc，在存在及不存在APOE结合的情况下均完全去除，且开始另一循环。所有测量在25℃下以30μL/min的流动速率进行。
微量热泳(MST).使用80％LED及20％IR激光功率，在Monolith NT.115系统(NanoTemper Technologies)上进行MST实验。激光开启及关闭时间分别设定为30秒及5秒。重组LILRB4-ECD蛋白(SinoBio)用4488-NHS(NanoTemper Technologies)标记且以5.9nM的最终浓度施加。对PBS中未标记的His-APOE(CI06，Novoprotein)制备双重稀释系列，且各稀释点类似地转移至LILRB4-ECD溶液中。His-APOE的最终浓度范围为0.36nM至12μM。将样品填充至经标准物处理的毛细管(NanoTemper Technologies)中进行测量。
蛋白质印记法及共免疫沉淀.全细胞在补充有蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics)的勒姆利(Laemmli)样品缓冲液(Sigma-Aldrich)中裂解。样品在SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad)上分离且转移到硝化纤维素膜(Bio-Rad)上以进行蛋白质检测。使用的初级抗体包括：抗SHP-1(Cell signaling,3759,1:1000)、抗磷酸化SHP-1Tyr564(Cellsignaling,8849,1:500)、抗磷酸化SHP-1Tyr564(Invitrogen,PA537708,1:500)、抗SHP-2(Cell signaling,3397,1:1000)、抗磷酸化SHP-2Tyr580(Cell signaling,3703,1:500)、抗SHIP1(Cell signaling,2727,1:1000)、抗磷酸化SHIP1 Tyr1020(Cell signaling,3941,1:500)、抗NFκB p65(Cell signaling,8242,1:1000)、抗IKKα(Cell signaling,11930,1:1000)、抗IKKβ(Cell signaling,8943,1:1000)、抗磷酸化IKKα/βSer176/180(Cell signaling,2697,1:500)、抗IκBα(Cell signaling,4814,1:1000)、抗磷酸化IκBαSer32(Cell signaling,2859,1:500)、抗核纤层蛋白-B2(Cell signaling,12255,1:1000)及抗精氨酸酶-1(Cell signaling,9819,1:1000)、抗uPAR(Invitrogen,MON R-4-02,1:500)、抗LILRB4(Santa cruz,sc-366213,1:200)、抗APOE(Creative diagnostics,DCABH-2367,1:250)、抗β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich,A2066,1:1000)及抗α-微管蛋白(Sigma-Aldrich,MABT205,1:1000)，以及辣根过氧化酶(HRP)共轭的二级抗体(Cell signaling,7074,1:1,000及7076,1:1,000)及化学发光底物(Invitrogen)。使用NE-PER核/细胞质提取试剂盒(Thermo fisher,78833)或质膜蛋白提取试剂盒(Abcam,ab65400)进行特定的细胞区室分离。来自质膜部分的蛋白质进一步与抗LILRB4抗体及戴诺珠粒蛋白A(Thermofisher,10001D)一起培育用于进一步免疫沉淀及蛋白质印记法。
免疫组织化学.对肿瘤的石蜡切片进行苏木精染色及免疫染色。使用的抗体是针对LILRB4(实验室产生，1:100)、CD3(Abcam,ab16669,1:100)、PD-1(Thermo Fisher,J116,14-9989-82,1:100)及精氨酸酶-1(Cell signaling,9819S,1:100)。使用HamamatsuNanoZoomer2.0-HT(Meyer instruments Inc.,得克萨斯休斯顿(Houston,TX))观测影像且在NPDview2软件(日本滨松(Hamamatsu,Japan))中检视。
细胞因子抗体阵列及精氨酸酶活性分析.为检测白血病细胞的分泌蛋白，将条件培养基施加于人类细胞因子抗体阵列(AAH-CYT-1000,RayBio)以进行120种人类蛋白质的半定量检测。Image J(NIH)用于定量。精氨酸酶活性通过QuantiChrom精氨酸酶分析试剂盒(DARG-100,BioAssay系统)在指定的白血病细胞的条件培养基中测定。
RNA-seq分析.用Qiagen RNeasy Mini试剂盒从分选的细胞纯化RNA且随后根据制造商的说明书用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)进行逆转录。RNA-seq是在UTSW基因组学及微阵列核心机构(UTSW Genomics and Microarray Core Facility)处进行。使用Covaris S2超声波处理器对cDNA进行声波处理，且用KAPA高通量库制备试剂盒(HighThroughput Library Preparation Kit)制备文库。对样品进行端修复，且3'端用多重衔接子进行腺苷酸化及条形码化。PCR扩增的库用AmpureXP珠粒纯化且在Agilent 2100生物分析仪上验证。在归一化及汇集之前，样品通过Qubit(Invitrogen)定量且随后使用PE100SBS v3试剂、在Illumina Hiseq 2500仪器上运行，以产生51-bp单端读段。在定位之前，对读段进行修整以去除末端中的低品质区。利用来自Illumina的UCSC iGenomes GTF文档，使用TopHat v2.0.1227将经修整的读段相对于人类基因组(HM19)定位。
数据归一化及分析的方法是基于使用“内部标准”，所述内部标准表征系统行为的一些方面，例如技术可变性，如别处所示。log2(倍数变化)>2、P<0.01及RPKM>0.1的基因被视为在两个条件之间表达显著不同且用于路径分析及上游转录因子分析。使用DAVID(david.ncifcrf.gov/tools.jsp)进行路径分析。使用QIAGEN的独创性工具(在ingenuity.com/的万维网)进行上游转录因子分析。
LILRB4与APOE的分子对接.LILRB4与APOE的对接系在Insight II封装的ZDOCKpro模块上进行。运行ZDOCK的通用协议包括描述为几何检索及能量检索的两个连续的计算步骤，其分别在程序ZDOCK及RDOCK中运行。自PDB数据库获得LILRB4晶体结构(3P2T)及APOE3结构(2L7B)。前50个ZDOCK位姿提供至RDOCK改进。在ZDOCK及RDOCK中均具有较高得分的位姿选择为LILRB4/APOE相互作用分析的候选复合物。
统计分析.来自四个独立实验或指示的独立样品的代表性数据以点图(平均值±标准偏差)或箱线图(中间值(线)、第25个-第75个百分位数(箱式轮廓)以及最小值及最大值(触须))呈现。通过双尾学生t检验计算两个样品比较的统计显著性。存活的统计显著性通过对数秩试验计算。TCGA数据的多变量分析通过Cox回归进行分析。若p<0.05，则差异视为在统计学上显著。n.s.，不显著；p值表示为精确值。皮尔森相关分析(Pearson'scorrelation analyses)用RStudio软件(R基金会)进行。
LILRB4及h193复合物的制备.编码LILRB4(成熟蛋白的残基1-196)的胞外域的DNA克隆于具有NdeI及XhoI限制位点的载体pET21a(Novagen)中且表达于大肠杆菌病毒株BL21(DE3)(Novagen)中。细菌在含有对应抗生素(100μg/ml安比西林)的LB培养基中于37℃振荡培育箱中培养。当培养物达到0.8-1.0的OD600时，通过添加1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，且随后在采集之前继续培养4-6小时。将离心的细胞悬浮于PBS缓冲液(20mM Na3PO4，280mM NaCl，6mM KCl，pH 7.4)中且使用均质机(JNBIO，China)破碎。对重组蛋白的包涵体进行纯化及再折叠，如所描述进行一些修饰。简单地说，在4℃下将包涵体的等分试样在搅拌再折叠缓冲液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA，400mM L-精氨酸，0.5mM经氧化麸胱甘肽及5mM还原的麸胱甘肽)中逐滴稀释8小时。再折叠的蛋白质经浓缩且使用Amicon8400浓缩器，相对于含有20mM Tris-HCl及50mM NaCl(pH 8.0)的溶液进行缓冲交换。随后，在前述相同交换缓冲液中，在
Figure BDA0002973222510000831
16/60
Figure BDA0002973222510000832
75PG柱(GE Healthcare)上，通过凝胶过滤色谱进一步纯化蛋白质。合格的峰值分离蛋白质经浓缩用于进一步研究或结晶。h193-scFv构建为VL-(GGGGS)4-VH且克隆至具有NdeI及XhoI限制位点的载体pET21a(Novagen)中。scFv作为包涵体在大肠杆菌中过量表达且随后如上文所描述再折叠及纯化为LILRB4蛋白。随后将LILRB4及h193-scFv以1:2的摩尔比混合在一起且在冰上培育1小时。LILRB4及h193-scFv复合物通过
Figure BDA0002973222510000833
16/60
Figure BDA0002973222510000834
75PG(GE Healthcare)色谱进一步纯化以从任何过量的LILRB4中纯化LILRB4/Hu193-scFv复合物。
LILRB4/h193复合物的结晶.LILRB4/h193-scFv复合晶体通过气相扩散以沉滴形式生长。将总共1μl的5mg/ml或10mg/ml复合物蛋白溶液与等体积的储集溶液混合。晶体在18℃下在1％w/v胰化蛋白、0.05M HEPES钠(pH 7.0)、20％w/v聚乙二醇3,350中生长。晶体在补充有17％甘油(体积/体积)作为低温保护剂的储集溶液中、在液氮中冷冻。在100K下收集X射线衍射数据且用HKL2000编索引、求积分及缩放。复合物结构通过分子置换方法使用来自CCP4程序套件的Phaser求解，分别以LILRB4(PDB:3P2T)及抗体(PDB:4OQT)的结构作为检索模型。初始受约束的刚体改进及手动建模分别使用REFMAC5及COOT进行，且使用Phenix进一步改进。
实例2
白血病细胞上表达的LILRB4抑制T细胞增殖.为确定AML发展及免疫调节的新颖机理，本发明人分析已知共刺激及共抑制受体的基因表达与AML患者的总存活期之间的关系，如TCGA数据库中所记录。蛋白表达及编码白细胞免疫球蛋白样受体B4(LILRB4)(一种在单核细胞性细胞上限制性表达的免疫抑制性受体)的mRNA的表达(Kang等人,2016；Hirayasu及Arase,2015；Trowsdale等人,2015)及单核细胞性AML细胞(FAB M4及M5 AML亚型)(Dobrowolska等人,2013)排列在与AML患者存活率呈负相关的清单顶部(图2A及图6A)。重要的是，赘生性单核细胞的表面上的LILRB4蛋白水平高于正常单核细胞的表面上的水平(图2B)。
前述研究报道了LILRB4的胞外域抑制T细胞活性(Vlad等人,2010)。为测试在AML细胞上表达的LILRB4是否具有T细胞抑制功能，本发明人将LILRB4阳性白血病细胞、LILRB4阴性白血病细胞或正常造血细胞与自体T细胞或来自健康供体的T细胞共培养。仅LILRB4阳性单核细胞性AML细胞显著抑制T细胞增殖(图2C及图7A至7F)。随后本发明人从人类单核细胞性AML THP-1及MV4-11细胞删除lilrb4且发现在lilrb4基因敲除(lilrb4-KO)后，AML细胞的T细胞抑制能力显著降低，且通过野生型lilrb4(如lilrb4-KO-wt)的强制表达而恢复，而未通过具有缺失的胞内域的突变lilrb4(如lilrb4-KO-intΔ)恢复(图2D及图8A至8E)。此外，当野生型THP-1细胞及人类T细胞在分开的跨孔中培养时，也观察到LILRB4介导的T细胞抑制且能够通过抗LILRB4阻断抗体拯救(图8F至8L)。阻断LILRB4引起细胞毒性T细胞的增加、AML细胞减少及T细胞细胞因子释放增加(图8M至8O)。这些试管内数据表明，AML细胞需要LILRB4的胞内信号传导用于抑制T细胞活性，而非胞外域(Vlad等人,2010)。
随后，本发明人使用人源化小鼠异种移植模型及免疫胜任小鼠模型研究免疫检查点阻断时的LILRB4功能。皮下植入THP-1细胞，而非lilrb4-KO THP-1细胞，导致人类T细胞重构小鼠的AML恶化，其通过抗LILRB4治疗阻断(Mosier等人,1988)(图9A至9G)。在人源化小鼠中建立的播散性白血病模型中，多西环素诱导的LILRB4缺失还减弱白血病恶化且恢复T细胞(图2E至2F及图9H至9J)。另外，本发明人将表达人类LILRB4的小鼠C1498 AML细胞(hlilrb4-C1498)皮下植入C57BL/6小鼠中以建立同基因型免疫胜任小鼠模型。为了从Fc效应功能排除抗肿瘤效应，本发明人用具有Fc糖基化位点N297A突变的抗LILRB4治疗荷瘤小鼠(Ha等人,2011)。LILRB4阻断有效降低肿瘤负荷且延长存活期；清除CD8+T细胞消除抗LILRB4抗体的抗肿瘤效应(图2G至2H)。这些结果表明LILRB4的肿瘤支持效应取决于宿主T细胞抑制。抗LILRB4抗体治疗产生肿瘤特异性记忆T细胞(图2I)。在播散性hlilrb4-C1498同基因型小鼠模型中获得类似结果(图10A至10D)。最后，LILRB4的阻断显著减少原代人类单核细胞性AML衍生的异种移植中的白血病发展(图2J至2K)且增加可移植自体人类T细胞的数目。总的，试管内及活体内结果指示单核细胞性AML细胞中的LILRB4信号传导抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫。
LILRB4促进AML细胞迁移及浸润.单核细胞性AML的表征特征之一是肿瘤细胞的髓外浸润增强(Straus等人,1980)。本发明人观察到LILRB4的抗体阻断导致白血病向内脏(包括骨髓、肝脏及大脑)中的浸润显著减少。尽管抗LILRB4抗体治疗未减小CD8+T细胞清除的C57BL/6小鼠中皮下C1498肿瘤的尺寸(图2G)，但用抗LILRB4抗体的治疗确实引起白血病细胞向肝脏的浸润减少(图10A)。本发明人假设除T细胞抑制以外，LILRB4促进白血病浸润。为测试此假设，本发明人进行跨内皮迁移及归巢分析且监测与白血病细胞上的LILRB4表达有关的白血病浸润。LILRB4清除的人类AML THP-1细胞在试管内的跨内皮迁移低于表达LILRB4的细胞。lilrb4的缺失减少归巢及AML细胞移植至造血器官，进而导致异种移植小鼠的存活期延长且体重减轻延迟。相比之下，人类LILRB4在小鼠AML C1498或WEHI-3细胞中的强制表达具有相反的效果(图12A至12D)。抗体介导的LILRB4阻断展示在表达LILRB4的AML细胞中与lilrb4基因敲除相同的效果(图12E至12G)。此效果取决于白血病细胞中的LILRB4表达及其胞内信号传导，而非抗体的Fc效应功能(图3A及图12H至12J)。此外，LILRB4阻断减少原代单核细胞性AML细胞的浸润能力(图3B至3D及图13A至13C)。与前述研究一致的结果展示LILRB4+AML母细胞的循环频率显著低于LILRB4-AML母细胞(Dobrowolska等人,2013)的循环频率且LILRB4+慢性淋巴球性白血病细胞与淋巴组织损害相关(Colovai等人,2007)。已知LILRB4+AML细胞倾向于迁移的骨髓、肝脏及大脑具有某些免疫赦免(Crispe等人,2006；Carson等人,2006；Fujisaki等人,2001)。因此，支持单核细胞性AML细胞的髓外浸润增强的LILRB4介导的迁移还可以有助于免疫逃避。
APOE为LILRB4的胞外结合蛋白.抗LILRB4抗体阻断AML细胞的免疫抑制及迁移菜单明LILRB4的那些功能为配体依赖型。整合素-αvβ3，此前经鉴别为gp49B1的配体，即小鼠LILRB4直系同源物(Castells等人,2001)。然而，不同的整合素-αβ复合物并未活化人类LILRB4报告细胞。出人意料地，人类血清及小鼠血清能够活化LILRB4报告子但不能活化其它LILRB的报告子(图4A)。经由蛋白质液相色谱分离，继之以报告体分析及质谱，本发明人鉴别特异性活化LILRB4及小鼠PirB的报告子的APOE(图4B)。来自野生型而非APOE空白小鼠的血清活化LILRB4报告子(图4C)。另外，脂质体重构的APOE蛋白(APOE-POPC)及无脂质的APOE两者活化LILRB4报告细胞(图4D)。通过lilrb4-KO显著降低APOE与THP-1细胞的结合(图4E)。使用微量热泳(MST)、表面等离子体共振(SPR)及生物层干扰测量法(Octet)确认重组APOE与LILRB4的特异性结合。如通过MST所测定的解离常数为210nM(图4F)。突变诱发研究展示APOE的N端结构域及LILRB4的第一Ig结构域中的P35及W106及两个Ig结构域之间的连接区中的Y121对于APOE介导的LILRB4活化至关重要(图4G至4H)。
APOE活化免疫抑制性受体LILRB4的发现与APOE的充分证明的免疫抑制功能一致(Grainger等人,2004；Ali等人,2005)。为确定LILRB4的T细胞抑制活性是否依赖于APOE，本发明人检测与对照或apoe-基因敲除人类AML细胞共培养的T细胞的增殖。APOE中缺乏的AML细胞恢复T细胞的增殖且抑制白血病细胞的迁移(图4I及图14)。此外，与用apoe-基因敲除小鼠血清处理的那些细胞相比，当用野生型小鼠血清处理LILRB4异位表达的C1498细胞时，T细胞在共培养物中的百分比显著降低(图4J至4K)。向小鼠脾细胞及表达LILRB4的AML细胞的共培养物中添加脂质体重构的APOE降低T细胞百分比(图4L)。此外，在野生型小鼠中，LILRB4的表达显著增加向骨髓及肝脏浸润的C1498细胞，但在APOE-空白受体中未增加(图4M)。这些数据指示APOE活化人类单核细胞性AML细胞上的LILRB4以抑制T细胞增殖且支持AML细胞迁移。
LILRB4介导的胞内信号传导控制AML细胞迁移及T细胞抑制.本发明人设法鉴别T细胞抑制及白血病浸润所需要的LILRB4的下游信号传导。磷酸酶SHP-1、SHP-2及SHIP可补充至LILRB的胞内域(Kang等人,2016)。lilrb4-KO AML细胞中的SHP-2而非SHP-1或SHIP的磷酸化水平低于野生型细胞(图5A及图15A)。SHP-2的缺失，而非SHP-1或SHIP的缺失，逆转THP-1细胞对T细胞的抑制(图5B及图15B)，且减少THP-1细胞的短期及长期浸润(图5C至5D)。结果表明SHP-2是LILRB4信号传导的介体。
独创性路径分析展示由SHP-2(You等人,2001)积极调节的NF-κB路径(DiDonato等人,2012)中的关键转录因子NFkB1及RELA的活性通过lilrb4的缺失而最显著地被抑制(图5E)。不断地，在lilrb4-KO AML细胞中IKKα/β的磷酸化及核NF-κB的水平降低(图5F至5G及图15A)。NF-κB信号传导的抑制以LILRB4依赖型方式恢复T细胞抑制且减少AML细胞浸润(图5H至5I及图15C至15D)。因此，LILRB4活化的作用经由NF-κB路径介导，其在AML亚型中的单核细胞性AML中特别稳固(Baumgartner等人,2002)。
与AML细胞抑制跨孔中的T细胞增殖的结果一致(图2D)，野生型THP-1细胞的条件培养基抑制T细胞活性，但lilrb4-KO细胞的培养基并未抑制(图5J)。在WT THP-1细胞的条件培养基中比lilrb4-KO对应物中存在更高的蛋白质中(图16A)，uPAR由单核细胞性AML细胞高度表达(Bene等人,2004)。熟知uPAR(NF-κB目标)促进癌症侵袭、癌转移、存活及血管生成(Su等人,2016；Wang等人,2000)。重组uPAR的添加以剂量依赖型方式降低与lilrb4-KOTHP-1细胞共培养的T细胞的增殖(图5K)。uPAR的此活性可能通过AML细胞中的下游效应子介导，因为uPAR并不直接有效地降低T细胞增殖(图16B)。
精氨酸酶-1(ARG1)，如uPAR，在lilrb4-KO AML细胞中的表达显著低于野生型细胞(图16C至16D)。ARG1通过uPAR介导的信号传导上调且抑制T细胞增殖(Hu等人,2014；Ilkovitch及Lopez,2009)，且可通过APOE(Baitsch等人,2011)及NF-κB(Hagemann等人,2008)提高免疫抑制功能。本发明人假设ARG1是LILRB4-NF-kB-uPAR信号传导的关键下游效应子。ARG1可由AML细胞分泌以抑制T细胞活性27。重组ARG1在与lilrb4-KO、apoe-KO及shp-2-KO AML或原代AML细胞的共培养中降低T细胞增殖(图5L及图16E至16G)。另外，uPAR或ARG1的添加及过度表达分别在试管内及活体内拯救lilrb4-KO AML细胞的迁移能力(图16H及图5M)。总的，结果指示LILRB4/SHP-2/NF-κB/uPAR/ARG1是单核细胞性AML细胞(图17至18)中抑制免疫活性且支持白血病迁移的信号传导路径。
靶向LILRB4不仅可引起单核细胞性AML细胞的特异性攻击，而且再活化包括T细胞及可能单核细胞/巨噬细胞的多种免疫细胞类型(Kang等人,2016)。重要的是，因为LILRB4在正常单核细胞性细胞上限制性地表达(Kang等人,2016)，其中LILRB4信号传导可不同于白血病细胞(图19)且LILRB4阻断并未显著干扰正常造血功能(图20A至20B)，所以LILRB4靶向可具有最低毒性。最后，LILRB4也在某些其它类型的癌症及骨髓衍生的抑制细胞、耐受性树突状细胞及肿瘤相关巨噬细胞上表达(Kang等人,2016；de Goeje等人,2015；Chang等人,2002；Suciu-Foca等人,2007)。靶向LILRB4因此可在癌症治疗中实现免疫疗法及靶向疗法的组合。
本发明人还发现LILRB4在从实体癌症患者分离的骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)上表达(图21A)。LILRB4的表达与MDSC的自体T细胞抑制能力正相关(图21B)。本发明人在MDSC/T细胞共培养中进行抗LILRB4治疗且发现抗LILRB4治疗增加共培养的T细胞的IFNγ分泌(图21C)。
实例3
本发明人随后产生一批针对人类LILRB4胞外域(ECD)的兔单克隆抗体(mAb)。示例性LILRB4抗体的重链及轻链可变区的氨基酸及核酸序列展示于图28A至28C、图29A至29C、图30A至30C及图31A至31C中。八种示例性LILRB4 mAb与LILRB4 ECD结合的ELISA结合结果展示于图22及表6中。使用Octet测定的示例性LILRB4抗体的动力学结合测量值(感测图谱)展示于图26及表7中。
如图23A中所说明，LILRB4 ECD具有两个Ig结构域D1及D2。其突变显著降低APOE对LILRB4的活化的两种残基(W106及Y121)分别位于第一Ig结构域D1中及两个Ig结构域之间的连接子或铰链区中。如图23B中所展示，在与LILRB4 ECD结合的八种示例性mAb中，除B4-193以外的七种mAb结合至LILRB4的D1结构域。
表6.通过ELISA测定与人类LILRB4结合的LILRB4抗体的EC50
抗体 EC50(nM)
B4-15-1 0.99
B4-116-1 2.58
B4-116-2 1.7
B4-49 1.01
B4-72-2 0.29
B4-86 1.02
B4-87 2.54
B4-193 1.81
表7.使用Octet生物传感器芯片测定的LILRB4抗体的动力学结合常数
抗体 Kd Kon Koff R<sup>2</sup>
B4-116-1 8.20E-10 2.31E+05 1.89E-04 0.9972
B4-116-2 4.95E-10 2.05E+05 1.01E-04 0.9983
B4-49 2.33E-11 1.11E+05 2.58E-06 0.834
B4-87 2.38E-10 7.04E+04 1.68E-05 0.9991
B4-86 3.44E-10 7.96E+04 2.74E-05 0.9992
B4-72-2 3.73E-09 4.26E+04 1.59E-04 0.6988
B4-193 1.33E-10 1.31E+05 1.74E-05 0.9997
本发明人随后使用人类LILRB4重组蛋白的LILRB4 D1结构域(D1)、D2结构域(D2)、柄区(SR)、D1+D2、D2+SR及全长ECD(D1+D2+SR)确定B4-193的结合域。如图24B中所展示，在此特定ELISA分析中，B4-193仅与人类LILRB4的全长ECD结合。
本发明人随后使用野生型及Y121A突变的人类LILRB4 ECD重组蛋白确定LILRB4上的氨基酸Y121对B4-193的结合的贡献。如图25中所展示，LILRB4的Y121A突变显著降低B4-193与LILRB4的结合。
本发明人使用APOE竞争分析(图32)、LILRB4-报告细胞/K562-共培养分析(图33)及LILRB4报告细胞分析(图34及图35)测量示例性LILRB4 mAb在调节LILRB4活性中的作用。
本发明人还通过示例性抗LILRB4抗体测试与LILRB家族成员、LILRA家族成员以及食蟹猕猴LILRB4(cynoB4)的交叉反应性(图36及图37)。
如图38中所展示，示例性抗LILRB4抗体B4-193拯救THP-1细胞对T细胞的抑制。
如图39A至39C中所展示，示例性抗LILRB4抗体128-3及B4-193抑制THP-1异种移植小鼠的白血病恶化，而对小鼠体重无显著不良影响。
实例4
本发明人进一步产生一组基于B4-193的人源化抗LILRB4抗体。人源化B4-193抗体(h193)的重链及轻链可变区及其CDR的氨基酸序列展示于图28B至28C、图30B至30C、表4及表5中。本发明人使用流式细胞术、ELISA及Octet分析测量h193抗体与人类LILRB4的结合，其结果展示于图40及表8中。
表8.h193抗体结合至人类LILRB4
Figure BDA0002973222510000891
Figure BDA0002973222510000901
本发明人还通过h193抗体测试与LILRB家族成员、LILRA家族成员以及食蟹猕猴LILRB4(cynoB4)的交叉反应性(图41A至41M及图42)。结果展示h193抗体不与LILRA家族成员或LILRB家族成员交叉反应，LILRB4除外。H193抗体还可以不同程度结合至食蟹猕猴LILRB4蛋白。
本发明人使用ApoE竞争分析及K562共培养分析进一步测量h193抗体的拮抗及促效作用。如图43A(ApoE竞争分析)及图43B(K562细胞共培养分析)中所展示，大部分h193抗体抑制ApoE诱导的LILRB4活性。
本发明人还使用细胞因子阵列分析测量h193抗体在调节细胞因子释放中的作用(图44至47)。简而言的，人类PBMC(1.5×106个细胞/毫升)用h193抗体(20μg/ml)处理48小时且随后进行细胞因子阵列以测量120种细胞因子的含量。在另一分析中，在用h193抗体处理之前，人类PBMC与THP-1细胞(0.3×106个细胞/毫升)共培养。人类IgG用作阴性对照。如图44A至44D中所展示，h193抗体处理仅在PBMC中减少某些免疫调节及发炎过程细胞因子的分泌。如图45A至45D中所展示，h193抗体处理增加与THP-1细胞共培养的PBMC中的某些免疫调节及发炎过程细胞因子的分泌。
在异种移植小鼠模型中，h193抗体抑制白血病恶化(图48)。
实例5
此实例说明经由LILRB4/h193复合物的结晶，LILRB4与h193抗体之间的相互作用的分子基础。LILRB4的D1及D2结构域以及h193抗体的单链Fv片段(scFv)在大肠杆菌中作为包涵体表达，且分别通过试管内再折叠方法获得可溶性蛋白质。LILRB4-D1D2/h193scFv复合物随后经制备用于晶体筛选且复合物结构通过分子置换以
Figure BDA0002973222510000902
的分辨率确定。
整体结构公开了h193抗体主要结合至LILRB4的D1与D2之间的连接区(图49A)。抗体利用重链(VH)及轻链(VL)两者与LILRB4相互作用，涉及h193抗体VH及VL区中的所有三个CDR环，VL中的CDR2环除外(图49A及表9)。具体地说，h193抗体与D1D2铰链环及LILRB4分子的D2结构域的BC及C'E环结合。LILRB4 D1及D2结构域的铰链环中的残基K100、G96及S99与HCDR1(S32)及HCDR2(S59及D53)区两者中的残基形成三个氢键(图49B)，而D2结构域的BC环中的残基R124不仅通过形成两个氢键与VH中HCDR3的残基H101相互作用，而且与VL中的残基I93(LCDR3)贡献一个氢键(图49C)。另外，LILRB4-D2的BC环中的H153通过形成两个氢键与HCDR3环的R94接触(图49C)。LILRB4-D2的BC环中的残基Q122及C'E环中的Q154与LCDR1环的残基W32及N30形成三个氢键(图49C)。综合而言，h193抗体经由包括多个氢键相互作用的连续接触而靶向LILRB4的三个环。特别地，与h193抗体结合促成重要接触的残基Q122及H153在所有LILR分子中的LILRB4中为独特的。此可促成h193抗体与LILRB4的特异性结合。
表9.h193与LILRB4之间的相互作用
Figure BDA0002973222510000911
数字表示抗体残基与LILRB4残基之间的原子与原子接触数目，其通过CCP4套件中的接触程序进行分析(距离截止值为
Figure BDA0002973222510000921
)。
圆括号中的数字表示在抗体残基与LILRB4残基之间的氢键数目。
本文所公开及要求权利的所有方法可在不依据本发明进行不当实验的情况下进行及执行。虽然已根据优选实施例描述本发明的组合物及方法，但本领域的技术人员应清楚变化可在不背离本发明的概念、精神及范围的情况下应用于本文所描述的方法中及方法的步骤或步骤顺序中。更具体地说，显而易见，在化学上及生理上相关的某些药剂可取代本文所描述的药剂，同时获得相同或类似结果。对本领域的技术人员显而易见的所有此类类似取代及修改视为在由随附权利要求书所定义的本发明的精神、范围及概念内。
参考文献
以下参考文献特别以引用的方式并入本文中，以便其对本文所述内容提供示例性程序或其它细节补充。
1 Curran,E.K.,Godfrey,J.和Kline,J.白血病和淋巴瘤的免疫耐受性机理(Mechanisms of Immune Tolerance in Leukemia and Lymphoma),《免疫学趋势(TrendsImmunol)》,doi:10.1016/j.it.2017.04.004(2017).
2 Kang,X.等人,抑制性白血球免疫球蛋白样受体：免疫检查点蛋白质和肿瘤维持因子(Inhibitory leukocyte immunoglobulin-like receptors:Immune checkpointproteins and tumor sustaining factors),《细胞周期(Cell Cycle)》15,25-40,doi:10.1080/15384101.2015.1121324(2016).
3 Hirayasu,K.和Arase,H.白血球免疫球蛋白样受体的功能和基因多样性以及关于疾病相关性的暗示(Functional and genetic diversity of leukocyteimmunoglobulin-like receptor and implication for disease associations),《人类遗传学杂志(Journal of human genetics)》,doi:10.1038/jhg.2015.64(2015).
4 Trowsdale,J.,Jones,D.C.,Barrow,A.D.和Traherne,J.A.监测LRC中的受体对细胞和组织的干扰(Surveillance of cell and tissue perturbation by receptors inthe LRC),《免疫学评论(Immunol Rev)》267,117-136,doi:10.1111/imr.12314(2015).
5 Dobrowolska,H.等人,免疫抑制受体ILT3在单核细胞分化的急性骨髓性白血病中的表达(Expression of immune inhibitory receptor ILT3 in acute myeloidleukemia with monocytic differentiation),《血细胞计数B部分：临床血细胞计数(Cytometry B Clin Cytom)》84,21-29,doi:10.1002/cyto.b.21050(2013).
6 Vlad,G.等人,膜和可溶性ILT3是产生T抑制细胞和诱导免疫耐受性的关键(Membrane and soluble ILT3 are critical to the generation of T suppressorcells and induction of immunological tolerance),《国际免疫学评论(Int RevImmunol)》29,119-132,doi:10.3109/08830180903281185(2010).
7 Mosier,D.E.,Gulizia,R.J.,Baird,S.M.和Wilson,D.B.人类功能免疫系统向重度联合免疫缺陷小鼠的转移(Transfer of a functional human immune system tomice with severe combined immunodeficiency),《自然(Nature)》335,256-259,doi:10.1038/335256a0(1988).
8 Ha,S.等人,Fc糖基化不对称的IgG1的分离和表征(Isolation andcharacterization of IgG1 with asymmetrical Fc glycosylation),《糖生物学(Glycobiology)》21,1087-1096,doi:10.1093/glycob/cwr047(2011).
9 Straus,D.J.等人,急性单核细胞性白血病：45名患者的多学科研究(The acutemonocytic leukemias:multidisciplinary studies in 45patients),《医药(Medicine)》(Baltimore)59,409-425(1980).
10 Colovai,A.I.等人,抑制受体ILT3在赘生性B细胞上的表达与慢性淋巴细胞性白血病累及的淋巴组织有关(Expression of inhibitory receptor ILT3 on neoplasticB cells is associated with lymphoid tissue involvement in chronic lymphocyticleukemia),《血细胞计数B部分：临床血细胞计数(Cytometry B Clin Cytom)》72,354-362,doi:10.1002/cyto.b.20164(2007).
11 Crispe,I.N.等人,肝脏耐受性的细胞和分子机理(Cellular and molecularmechanisms of liver tolerance),《免疫学评论(Immunol Rev)》213,101-118,doi:10.1111/j.1600-065X.2006.00435.x(2006).
12 Carson,M.J.,Doose,J.M.,Melchior,B.,Schmid,C.D.和Ploix,C.C.CNS免疫特权：藏在明处(CNS immune privilege:hiding in plain sight)《免疫学评论(ImmunolRev)》213,48-65,doi:10.1111/j.1600-065X.2006.00441.x(2006).
13 Fujisaki,J.等人,Treg细胞的活体内成像提供了造血干细胞小生境的免疫特权(In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to thehaematopoietic stem-cell niche),《自然》474,216-219,doi:10.1038/nature10160(2011).
14 Castells,M.C.等人,gp49B1-α(v)β3相互作用抑制了抗原诱导的肥大细胞活化(gp49B1-alpha(v)beta3 interaction inhibits antigen-induced mast cellactivation),《自然·免疫学(Nat Immunol)》2,436-442,doi:10.1038/87749(2001).
15 Grainger,D.J.,Reckless,J.和McKilligin,E.载脂蛋白E在试管内和活体内调节细胞凋亡体的清除，使得载脂蛋白E缺乏小鼠产生全身促炎性状态(Apolipoprotein Emodulates clearance of apoptotic bodies in vitro and in vivo,resulting in asystemic proinflammatory state in apolipoprotein E-deficient mice),《免疫学杂志(J Immunol)》173,6366-6375(2004).
16 Ali,K.,Middleton,M.,Pure,E.和Rader,D.J.载脂蛋白E在活体内抑制I型发炎反应(Apolipoprotein E suppresses the type I inflammatory response in vivo),《循环研究(Circ Res)》97,922-927,doi:10.1161/01.res.0000187467.67684.43(2005).
17 DiDonato,J.A.,Mercurio,F.和Karin,M.NF-κB以及炎症与癌症之间的关系(NF-kappaB and the link between inflammation and cancer),《免疫学评论(ImmunolRev)》246,379-400,doi:10.1111/j.1600-065X.2012.01099.x(2012).
18 You,M.,Flick,L.M.,Yu,D.和Feng,G.S.Shp-2酪氨酸磷酸酯酶调节核因子κB路径以介导IL-1或肿瘤坏死因子诱导白介素(IL)-6(Modulation of the nuclear factorkappa B pathway by Shp-2tyrosine phosphatase in mediating the induction ofinterleukin(IL)-6by IL-1or tumor necrosis factor),《实验医学杂志(J Exp Med)》193,101-110(2001).
19 Baumgartner,B.等人,增强的IκB激酶活性与急性骨髓母细胞中活化的NF-κB有关(Increased IkappaB kinase activity is associated with activated NF-kappaBin acute myeloid blasts),《白血病(Leukemia)》16,2062-2071,doi:10.1038/sj.leu.2402641(2002).
20 Bene,M.C.等人,CD87(尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化剂受体)在血液病症中的功能和病理学：评论(CD87(urokinase-type plasminogen activator receptor),function and pathology in hematological disorders:a review),《白血病(Leukemia)》18,394-400,doi:10.1038/sj.leu.2403250(2004).
21 Su,S.C.,Lin,C.W.,Yang,W.E.,Fan,W.L.和Yang,S.F.尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化剂(uPA)系统作为人类恶性肿瘤的生物标记和治疗标靶(The urokinase-typeplasminogen activator(uPA)system as a biomarker and therapeutic target inhuman malignancies),《专家对治疗靶标的见解(Expert Opin Ther Targets)》20,551-566,doi:10.1517/14728222.2016.1113260(2016).
22 Wang,Y.等人,鉴别尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化剂受体表达所涉及的新颖核因子-κB序列(Identification of a novel nuclear factor-kappaB sequence involvedin expression of urokinase-type plasminogen activator receptor),《欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem)》267,3248-3254(2000).
23 Hu,J.等人,uPAR诱导癌细胞表达转化生长因子β和白介素-4以促进肿瘤容许的巨噬细胞调理(uPAR induces expression of transforming growth factor beta andinterleukin-4in cancer cells to promote tumor-permissive conditioning ofmacrophages),《美国病理学杂志(Am J Pathol)》184,3384-3393,doi:10.1016/j.ajpath.2014.08.003(2014).
24 Ilkovitch,D.和Lopez,D.M.尿激酶介导骨髓源抑制细胞募集且其抑制机理被MUC1/sec阻断(Urokinase-mediated recruitment of myeloid-derived suppressorcells and their suppressive mechanisms are blocked by MUC1/sec),《血液(Blood)》113,4729-4739,doi:10.1182/blood-2008-08-176438(2009).
25 Baitsch,D.等人,载脂蛋白E诱导巨噬细胞的消炎表型(Apolipoprotein Einduces antiinflammatory phenotype in macrophages),《动脉硬化、血栓形成与血管生物学(Arterioscler Thromb Vasc Biol)》31,1160-1168,doi:10.1161/atvbaha.111.222745(2011).
26 Hagemann,T.等人,通过靶向NF-κB来“重新教育”肿瘤相关的巨噬细胞("Re-educating"tumor-associated macrophages by targeting NF-kappaB),《实验医学杂志(J Exp Med)》205,1261-1268,doi:10.1084/jem.20080108(2008).
27 Mussai,F.等人,急性骨髓性白血病产生了精氨酸酶依赖性免疫抑制性微环境(Acute myeloid leukemia creates an arginase-dependent immunosuppressivemicroenvironment),《血液(Blood)》122,749-758,doi:10.1182/blood-2013-01-480129(2013).
28 de Goeje,P.L.等人,免疫球蛋白样转录物3是由骨髓源抑制细胞表达且与非小细胞肺癌患者的生存期相关(Immunoglobulin-like transcript 3is expressed bymyeloid-derived suppressor cells and correlates with survival in patientswith non-small cell lung cancer),《肿瘤免疫学(Oncoimmunology)》4,e1014242,doi:10.1080/2162402x.2015.1014242(2015).
29 Chang,C.C.等人,T(S)细胞对树突状细胞的耐受：抑制性受体ILT3和ILT4的关键作用(Tolerization of dendritic cells by T(S)cells:the crucial role ofinhibitory receptors ILT3 and ILT4),《自然·免疫学(Nat Immunol)》3,237-243,doi:10.1038/ni760(2002).
30 Suciu-Foca,N.等人,可溶Ig样转录物3抑制了人源化SCID小鼠中的肿瘤同种异体移植排斥和癌症患者中的T细胞反应(Soluble Ig-like transcript 3inhibitstumor allograft rejection in humanized SCID mice and T cell responses incancer patients),《免疫学杂志(J Immunol)》178,7432-7441(2007).
31 Piedrahita,J.A.,Zhang,S.H.,Hagaman,J.R.,Oliver,P.M.和Maeda,N.产生载有突变型载脂蛋白E基因的小鼠，所述基因通过靶向胚胎干细胞的基因而不活化(Generation of mice carrying a mutant apolipoprotein E gene inactivated bygene targeting in embryonic stem cells),《美国国家科学院院刊(Proc Natl AcadSci U S A)》89,4471-4475(1992).
32 Zheng,J.等人,抑制性受体结合ANGPTL且支持血液干细胞和白血病恶化(Inhibitory receptors bind ANGPTLs and support blood stem cells and leukaemiadevelopment),《自然》485,656-660,doi:10.1038/nature11095(2012).
33 Kang,X.等人,含ITIM受体LAIR1是急性骨髓白血病恶化所必需的(The ITIM-containing receptor LAIR1 is essential for acute myeloid leukaemiadevelopment),《自然·细胞生物学(Nat Cell Biol)》17,665-677,doi:10.1038/ncb3158(2015).
34 Deng,M.等人,LILRB2中的模体是Angptl2结合和活化的关键(A motif inLILRB2critical for Angptl2 binding and activation),《血液(Blood)》124,924-935,doi:10.1182/blood-2014-01-549162(2014).
35 Zheng,J.等人,离体扩增的造血干细胞克服了同种异体移植的MHC屏障(Exvivo expanded hematopoietic stem cells overcome the MHC barrier in allogeneictransplantation),《细胞干细胞(Cell Stem Cell)》9,119-130,doi:10.1016/j.stem.2011.06.003(2011).
36 Lu,Z.等人,空腹经由瘦素受体上调而选择性地阻断了急性淋巴母细胞性白血病的恶化(Fasting selectively blocks development of acute lymphoblasticleukemia via leptin-receptor upregulation),《自然·医学(Nat Med)》23,79-90,doi:10.1038/nm.4252(2017).
37 Zhang,C.C.,Kaba,M.,Iizuka,S.,Huynh,H.和Lodish,H.F.血管生成素样5和IGFBP2刺激了人类脐带血造血干细胞的离体扩增，如根据NOD/SCID移植所分析(Angiopoietin-like 5and IGFBP2 stimulate ex vivo expansion of human cordblood hematopoietic stem cells as assayed by NOD/SCID transplantation),《血液(Blood)》111,3415-3423,doi:blood-2007-11-122119[pii]10.1182/blood-2007-11-122119[doi](2008).
38 Zheng,J.,Huynh,H.,Umikawa,M.,Silvany,R.和Zhang,C.C.血管生成素样蛋白质3支持造血干细胞在骨髓小生境中的活性(Angiopoietin-like protein 3supportsthe activity of hematopoietic stem cells in the bone marrow niche),《血液(Blood)》117,470-479,doi:10.1182/blood-2010-06-291716(2011).
39 Cawthorne,C.,Swindell,R.,Stratford,I.J.,Dive,C.和Welman,A.就皮下异种移植模型中的Tet诱导型基因表达而言的多西环素递送方法的比较(Comparison ofdoxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in asubcutaneous xenograft model),《生物分子技术杂志(J Biomol Tech)》18,120-123(2007).
40 Denisov,I.G.,Grinkova,Y.V.,Lazarides,A.A.和Sligar,S.G.尺寸可控的单分散性磷脂双层纳米盘的定向自组装(Directed self-assembly of monodispersephospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size),《美国化学学会杂志(J AmChem Soc)》126,3477-3487,doi:10.1021/ja0393574(2004).
41 Swerdlow,S.,Campo,E.,Harris,N.L.,Jaffe,E.S.,Pileri,S.A.,Stein,H.,Thiele,J.,Arber,D.,Hasserjian,R.和Le Beau,M.(2017).造血组织和淋巴组织的肿瘤WHO分类(WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues)(WHO).
42 Schuler,E.,Schroeder,M.,Neukirchen,J.,Strupp,C.,Xicoy,B.,Kundgen,A.,Hildebrandt,B.,Haas,R.,Gattermann,N.和Germing,U.(2014).基于慢性骨髓单核细胞性白血病分类而改进的髓质母细胞和白血细胞计数(Refined medullary blast andwhite blood cell count based classification of chronic myelomonocyticleukemias),《白血病研究(Leuk Res)》38,1413-1419.
序列表
<110> 德克萨斯大学体系董事会
免疫医疗公司
<120> 新颖LILRB4抗体和其用途
<130> UTFH.P0349WO
<150> US 62/730,715
<151> 2018-09-13
<160> 238
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 1
Glu Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg
1 5 10 15
Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly
20 25 30
Phe Thr Ile Asn Ser Ala His Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
35 40 45
Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ser Thr Thr Gly Gly Pro Ser Tyr
50 55 60
Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr
65 70 75 80
Thr Val Asp Leu Glu Ile Thr Ser Pro Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr
85 90 95
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Gly Pro Gly Asn Asn Ile Asp Met Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Thr Ser
115 120
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 2
Gly Phe Thr Ile Asn Ser Ala His
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 3
Ser Thr Thr Gly Gly Pro Ser
1 5
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 4
Ala Arg Asp Gly Pro Gly Asn Asn Ile Asp Met Asp Leu
1 5 10
<210> 5
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 5
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Asn Arg Gly Gly Ser
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Ile Tyr Ser Ile Ser
85 90 95
Asp Ile Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 6
Gln Asn Arg Gly Gly Ser
1 5
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 7
Gln Ser Thr Ile Tyr Ser Ile Ser Asp Ile Gly Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 8
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Thr Asn Tyr Ala
20 25 30
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
35 40 45
Thr Ile Thr Gly Ser Ser Asn Thr Phe Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Ser Asn Pro
85 90 95
Asp Ser His Asn Ala Asn Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 9
Gly Ile Asp Leu Thr Asn Tyr Ala
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 10
Ile Thr Gly Ser Ser Asn Thr
1 5
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 11
Ala Ser Asn Pro Asp Ser His Asn Ala Asn Gly Val
1 5 10
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 12
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Glu
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn
20 25 30
Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu
65 70 75 80
Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Gly Ile Thr Asn
85 90 95
Lys Asn Asn Tyr Asn Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 13
Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asn
1 5
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 14
Gln Ser Tyr Gly Ile Thr Asn Lys Asn Asn Tyr Asn Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 15
Glu Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Cys Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile His Gly Val Ser Thr Asn Asn Arg Trp Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Pro Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Asp Thr Asp Tyr Glu Trp Gly Leu Ser Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 16
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr Tyr Cys
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 17
Ile His Gly Val Ser Thr Asn Asn Arg
1 5
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 18
Ala Arg Ser Asp Thr Asp Tyr Glu Trp Gly Leu Ser Leu
1 5 10
<210> 19
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 19
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Val Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Val Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Cys Ala Gly Gln Ser Ser Thr
85 90 95
Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 20
Glu Ser Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 21
Gln Cys Ala Gly Gln Ser Ser Thr Trp Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 22
Glu Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Cys Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Cys Ile His Gly Val Ser Thr Asn Asn Arg Trp Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Pro Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65 70 75 80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Asp Thr Asp Tyr Glu Trp Gly Leu Ser Leu Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 23
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr Tyr Cys
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 24
Ile His Gly Val Ser Thr Asn Asn Arg
1 5
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 25
Ala Arg Ser Asp Thr Asp Tyr Glu Trp Gly Leu Ser Leu
1 5 10
<210> 26
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 26
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Val Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Val Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Val Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Cys Ala Gly Gln Ser Ser Thr
85 90 95
Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 27
Glu Ser Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 28
Gln Cys Ala Gly Gln Ser Ser Thr Trp Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 29
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Asn Gly
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Val Gly Ser Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Arg Gly
85 90 95
Phe Gly Val Gly Asp Trp Gln Glu Trp Phe Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 30
Gly Phe Ser Leu Ser Asn Asn Gly
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 31
Ile Tyr Val Gly Ser Gly Thr Thr
1 5
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 32
Ala Arg Gly Phe Gly Val Gly Asp Trp Gln Glu Trp Phe Phe Asp Leu
1 5 10 15
<210> 33
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 33
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Tyr Trp Gly Thr Ser Thr
85 90 95
Met Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Asn
100 105
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 34
Glu Ser Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 35
Gln Ala Tyr Trp Gly Thr Ser Thr Met Ala
1 5 10
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 36
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Asn Gly
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Tyr Val Gly Ser Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Pro Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Arg Gly
85 90 95
Phe Gly Val Gly Asp Trp Gln Glu Trp Phe Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 37
Gly Phe Ser Leu Ser Asn Asn Gly
1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 38
Ile Tyr Val Gly Ser Gly Thr Thr
1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 39
Ala Arg Gly Phe Gly Val Gly Asp Trp Gln Glu Trp Phe Phe Asp Leu
1 5 10 15
<210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 40
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Tyr Trp Gly Thr Ser Thr
85 90 95
Met Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Asn
100 105
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 41
Glu Ser Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 42
Gln Ala Tyr Trp Gly Thr Ser Thr Met Ala
1 5 10
<210> 43
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 43
Ser Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Gly Thr Gly Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asn Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Asn Asp
85 90 95
Val Tyr Trp Ala Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 44
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 45
Ile Gly Thr Gly Thr Thr Thr
1 5
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 46
Val Arg Asn Asp Val Tyr Trp Ala Phe Asn Leu
1 5 10
<210> 47
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 47
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Val Asn Asn
20 25 30
Asn Ala Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ala Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Tyr Ile
85 90 95
Gly Ile Ser Asp Tyr Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 48
Gln Ser Val Val Asn Asn Asn Ala
1 5
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 49
Gln Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Ile Ser Asp Tyr Pro
1 5 10
<210> 50
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 50
Ser Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ile Ile Gly Thr Gly Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Asn Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Asn Asp
85 90 95
Val Tyr Trp Ala Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 51
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 52
Ile Gly Thr Gly Thr Thr Thr
1 5
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 53
Val Arg Asn Asp Val Tyr Trp Ala Phe Asn Leu
1 5 10
<210> 54
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 54
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Val Asn Asn
20 25 30
Asn Ala Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ala Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Tyr Ile
85 90 95
Gly Ile Ser Asp Tyr Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 55
Gln Ser Val Val Asn Asn Asn Ala
1 5
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 56
Gln Gly Gly Tyr Tyr Ile Gly Ile Ser Asp Tyr Pro
1 5 10
<210> 57
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 57
Glu Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Cys Ile Gly Thr Gly Gly Ser Ala Phe Tyr Ala Ile Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asn
85 90 95
Asp Ile Tyr Trp Ala Phe Gly Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 58
Gly Phe Ser Ile Ser Thr Tyr Ala
1 5
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 59
Ile Gly Thr Gly Gly Ser Ala
1 5
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 60
Ala Arg Asn Asp Ile Tyr Trp Ala Phe Gly Leu
1 5 10
<210> 61
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 61
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Gly Ile Arg Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Arg Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Val Tyr Ser Ser Ser
85 90 95
Ile Tyr Gly Tyr Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 62
Glu Gly Ile Arg Asn Trp
1 5
<210> 63
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 63
Gln Gly Gly Val Tyr Ser Ser Ser Ile Tyr Gly Tyr Pro
1 5 10
<210> 64
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 64
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Ser Gly
20 25 30
Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Ser Gly Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Val Asp Tyr Val Asp Tyr Asp Tyr Ile Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 65
Gly Phe Asp Phe Ser Ser Ser Gly Trp
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 66
Ile Tyr Ser Gly Arg Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 67
Ala Arg Ala Leu Tyr Val Asp Tyr Val Asp Tyr Asp Tyr Ile Asp Leu
1 5 10 15
<210> 68
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 68
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Thr Gly Ile Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Met
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Tyr Ser Tyr Tyr Gly Ser Ser
85 90 95
Tyr Val Phe Asp Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 69
Gln Ser Thr Gly Ile Arg
1 5
<210> 70
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 70
Gln Tyr Ser Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Phe Asp
1 5 10
<210> 71
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 71
Glu Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Thr Gly Gly Ser Ala Val Tyr Ala Thr Trp Thr Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Gly Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly
85 90 95
Trp Ser Arg Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser
100 105 110
Ser
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 72
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 73
Ile Asn Thr Gly Gly Ser Ala
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 74
Ala Arg Gly Trp Ser Arg Gly Asp Leu
1 5
<210> 75
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 75
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Val Phe His Asp Gly Ile
85 90 95
Asn Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 76
Glu Ser Val Asp Asn Trp
1 5
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 77
Leu Gly Val Phe His Asp Gly Ile Asn Asn Ala
1 5 10
<210> 78
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 78
Glu Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Thr Gly Gly Ser Ala Val Tyr Ala Thr Trp Thr Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Gly Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly
85 90 95
Trp Ser Arg Gly Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser
100 105 110
Ser
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 79
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 80
Ile Asn Thr Gly Gly Ser Ala
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 81
Ala Arg Gly Trp Ser Arg Gly Asp Leu
1 5
<210> 82
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 82
Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ser Ser Gln Asn Val Tyr Asp Asp
20 25 30
Asp Thr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Val Phe His Asp
85 90 95
Gly Ile Asn Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 83
Gln Asn Val Tyr Asp Asp Asp Thr
1 5
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 84
Leu Gly Val Phe His Asp Gly Ile Asn Asn Ala
1 5 10
<210> 85
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 85
Glu Gln Ser Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Cys Ile Gly Thr Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Ser Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val
85 90 95
Arg Gly Ala Gly Tyr Ser Ser Tyr Arg Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Ile Ser Ser
115
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 86
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp
1 5
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 87
Ile Gly Thr Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 88
Val Arg Gly Ala Gly Tyr Ser Ser Tyr Arg Leu
1 5 10
<210> 89
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 89
Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Asp Trp Asp Asn
85 90 95
Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 90
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 90
Glu Ser Val Ser Asn Trp
1 5
<210> 91
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 91
Gln Gln Gly Tyr Asp Trp Asp Asn Ile Asp Asn Ala
1 5 10
<210> 92
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 92
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Ile
35 40 45
Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Val Asp Tyr Val Asp Tyr Asp Tyr Ile Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 93
Gly Phe Ser Phe Ile Ser Thr Tyr Trp
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 94
Ile Tyr Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 95
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 95
Ala Arg Ala Leu Tyr Val Asp Tyr Val Asp Tyr Asp Tyr Ile Asp Leu
1 5 10 15
<210> 96
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 96
Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Cys Ser Tyr Tyr Gly Ser Thr
85 90 95
Tyr Val Phe Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 97
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 97
Glu Asn Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 98
Gln Cys Ser Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Val Phe Gly
1 5 10
<210> 99
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 99
Glu Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Met Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Cys Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ser Thr Ser Leu Asn Thr
65 70 75 80
Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Gly Ala Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
Phe Ser Val Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 100
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser Tyr Trp
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 101
Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr
1 5
<210> 102
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 102
Ser Val Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 103
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 103
Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 104
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 104
Gln Ser Ile Asn Ser Trp
1 5
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 105
Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp Leu Asp Asn Val
1 5 10
<210> 106
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 106
gagcagtcgt tggaggagtc cgggggtctg gaggagtccg ggggtcgcct ggtcacgcct 60
gggacacccc tgacactcac ctgcacagcc tctggattca ccatcaatag cgcccacatg 120
tcttgggtcc gccaggctcc agggaagggg ctggaatgga tcggattcag tactactggt 180
ggtccctcat attacgcgaa ctgggcaaaa ggccgattca ccatctccag aacctcgacc 240
acggtggatc tggagatcac cagtccgaca atcgaggaca cggccaccta tttctgtgcc 300
agagatggtc ctggtaataa tattgatatg gacttgtggg gccaaggcac cctggtcacc 360
atcacctca 369
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 107
ggattcacca tcaatagcgc ccac 24
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 108
agtactactg gtggtccctc a 21
<210> 109
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 109
gccagagatg gtcctggtaa taatattgat atggacttg 39
<210> 110
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 110
gagctcgatc tgacccagac accagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtca gaataggggc ggtagcatag cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctattct gcatccactc tggcatctgg ggtcccatcg 180
cggttcagcg gcagtggata tgggacagag ttcactctca ccatcagcgg cgtgcagtgt 240
gccgatgctg gcacttacta ctgccaatct actatttata gtataagtga tattggggct 300
ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa 330
<210> 111
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 111
cagaataggg gcggtagc 18
<210> 112
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 112
caatctacta tttatagtat aagtgatatt ggggct 36
<210> 113
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 113
cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60
tgcacagtct ctggaatcga cctcactaac tatgcaataa actgggtccg ccaggctcca 120
ggggaggggc tggaatacat cggaaccatt actggtagta gtaacacatt ctacgcgagc 180
tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaaaatcacc 240
agtccgacaa ctgaggacac gggcacctat ttctgtgcca gtaatcctga tagtcacaac 300
gctaatggcg tgtggggcca aggcaccctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 114
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 114
ggaatcgacc tcactaacta tgca 24
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 115
attactggta gtagtaacac a 21
<210> 116
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 116
gccagtaatc ctgatagtca caacgctaat ggcgtg 36
<210> 117
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 117
gagctcgtga tgacccagac accagcctcc gtgtctgaac ctgtggaagg cacagtcacc 60
atcaagtgtc aggccagtca gagtgtttat gataacaact tagcctggta tcagcagaaa 120
ccagggcagc ctcccaagct cctgatctat tctgcatcca ctctggcatc tggggtccca 180
tcgcggttca gcggcagtgg atatgggaca gagttcactc tcaccatcag cggcgtggag 240
tgtgccgatg ctgccactta ctattgtcaa agctatggta ttactaataa gaataattat 300
aatagtttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaa 336
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 118
cagagtgttt atgataacaa c 21
<210> 119
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 119
caaagctatg gtattactaa taagaataat tataatagt 39
<210> 120
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 120
gagcagtcgg tggaggagtc cgggggagac ctggtcaagc ctggggcatc cctgacactc 60
acctgcgcag cctctggatt ctccttcagt agcacctact gcatgtgctg ggtccgccag 120
gctccaggga agggcctgga gtggatcgca tgcattcatg gtgtaagtac taataataga 180
tggtacgcga gctggccgaa aggccgattc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg 240
actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctacttctg tgcgagaagt 300
gacactgact atgagtgggg tctttccttg tggggcccag gcaccctggt caccatctct 360
tca 363
<210> 121
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 121
ggattctcct tcagtagcac ctactgc 27
<210> 122
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 122
attcatggtg taagtactaa taataga 27
<210> 123
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 123
gcgagaagtg acactgacta tgagtggggt ctttccttg 39
<210> 124
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 124
gagctcgatc tgacccagac accagcctcc gtgtctgagc ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtga gagcattggt agtagattag cctggtatca acagaaacca 120
gggcagcgtc ccaagctcct gatctacaag gcatccactc tggcatctgg ggtcccatcg 180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccgtcagcga cctggagtgt 240
gccgatgttg ccgcttacta ttgtcaatgc gctggtcaga gtagtacttg ggctttcggc 300
ggagggaccg aggtggaaat caaa 324
<210> 125
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 125
gagagcattg gtagtaga 18
<210> 126
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 126
caatgcgctg gtcagagtag tacttgggct 30
<210> 127
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 127
gagcagtcgg tggaggagtc cgggggagac ctggtcaagc ctggggcatc cctgacactc 60
acctgcgcag cctctggatt ctccttcagt agcacctact gcatgtgctg ggtccgccag 120
gctccaggga agggcctgga gtggatcgca tgcattcatg gtgtaagtac taataataga 180
tggtacgcga gctggccgaa aggccgattc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg 240
actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctacttctg tgcgagaagt 300
gacactgact atgagtgggg tctttccttg tggggcccag gcaccctggt caccatctct 360
tca 363
<210> 128
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 128
ggattctcct tcagtagcac ctactgc 27
<210> 129
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 129
attcatggtg taagtactaa taataga 27
<210> 130
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 130
gcgagaagtg acactgacta tgagtggggt ctttccttg 39
<210> 131
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 131
gagctcgtga tgacccagac accagcctcc gtggaggcag ttgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtga gagcattggt agtagattag cctggtatca acagaaacca 120
gggcagcgtc ccaagctcct gatctacaag gcatccactc tggcatctgg ggtcccatcg 180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccgtcagcga cctggagtgt 240
gccgatgttg ccgcttacta ttgtcaatgc gctggtcaga gtagtacttg ggctttcggc 300
ggagggaccg aggtggtggt caaa 324
<210> 132
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 132
gagagcattg gtagtaga 18
<210> 133
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 133
caatgcgctg gtcagagtag tacttgggct 30
<210> 134
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 134
cagtcggtga aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60
tgcaccgtct ctggattctc cctcagtaac aatggaatga gctgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggagtggat cggaatcatt tatgttggga gtggtaccac agactacgcg 180
acctgggcga aaggccgatt caccatctcc agaacctcga ccacggtgga tctgaaaatg 240
accagtctga caaccgagga cacggccacc tatttatgtg ccagaggttt tggtgttggg 300
gattggcaag aatggttttt tgatctctgg ggcccaggca ccctggtcac catctcttca 360
<210> 135
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 135
ggattctccc tcagtaacaa tgga 24
<210> 136
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 136
atttatgttg ggagtggtac caca 24
<210> 137
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 137
gccagaggtt ttggtgttgg ggattggcaa gaatggtttt ttgatctc 48
<210> 138
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 138
gagctcgtga tgacccagac accagcctcc gtgtctgagc ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtga aagcattagc aactacttat cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctataag gcatccactc tggcatctgg ggtctcatcg 180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaagcc tattggggta cttctactat ggctttcggc 300
ggagggaccg aggtggaaat caac 324
<210> 139
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 139
gaaagcatta gcaactac 18
<210> 140
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 140
caagcctatt ggggtacttc tactatggct 30
<210> 141
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 141
cagtcgttgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60
tgcaccgtct ctggattctc cctcagtaac aatggaatga gctgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggagtggat cggaatcatt tatgttggga gtggtaccac agactacgcg 180
agctggccga aaggccgatt caccatctcc agaacctcga ccacggtgga tctgaaaatg 240
accagtctga caaccgagga cacggccacc tatttatgtg ccagaggttt tggtgttggg 300
gattggcaag aatggttttt tgatctctgg ggcccaggca ccctggtcac cgtctcttct 360
<210> 142
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 142
ggattctccc tcagtaacaa tgga 24
<210> 143
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 143
atttatgttg ggagtggtac caca 24
<210> 144
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 144
gccagaggtt ttggtgttgg ggattggcaa gaatggtttt ttgatctc 48
<210> 145
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 145
gagctcgtga tgacccagac accagcctcc gtgtctgagc ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtga aagcattagc aactacttat cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctataag gcatccactc tggcatctgg ggtctcatcg 180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaagcc tattggggta cttctactat ggctttcggc 300
ggagggaccg aggtggaaat caac 324
<210> 146
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 146
gaaagcatta gcaactac 18
<210> 147
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 147
caagcctatt ggggtacttc tactatggct 30
<210> 148
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 148
agcagttcgg tggaggagtc cgggggtcgc ctggtcacgc ctgggacacc cctgacactc 60
acctgcacag tctctggatt ctccctcagt agctatgcaa tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaatg gatcggaatc attggtactg gtaccaccac atactacgcg 180
acctgggtga atggtcgatt caccatctcc aaaacctcga ccacggtgga cctgaaaatg 240
accagtctga caaccgagga cacggccact tatttctgtg tcagaaatga tgtttattgg 300
gcgtttaatt tgtggggcca aggcaccctg gtcaccgtct cttca 345
<210> 149
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 149
ggattctccc tcagtagcta tgca 24
<210> 150
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 150
attggtactg gtaccaccac a 21
<210> 151
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 151
gtcagaaatg atgtttattg ggcgtttaat ttg 33
<210> 152
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 152
gagctcgtga tgacccagac accagccccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaactgcc aggccagtca gagtgttgtt aataataatg ccttatcttg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacaaggctt ccactctggc atctggggtc 180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg gcacagttca ctctcaccat cagcggcgtg 240
cagtgtgacg atgctgccac ttattattgt caaggcggtt attatattgg tattagtgac 300
tatcctttcg gcggcgggac cgaggtggtg gtcaaa 336
<210> 153
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 153
cagagtgttg ttaataataa tgcc 24
<210> 154
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 154
caaggcggtt attatattgg tattagtgac tatcct 36
<210> 155
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 155
agcagttcgg tggaggagtc cgggggtcgc ctggtcacgc ctgggacacc cctgacactc 60
acctgcacag tctctggatt ctccctcagt agctatgcaa tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaatg gatcggaatc attggtactg gtaccaccac atactacgcg 180
acctgggtga atggtcgatt caccatctcc aaaacctcga ccacggtgga cctgaaaatg 240
accagtctga caaccgagga cacggccact tatttctgtg tcagaaatga tgtttattgg 300
gcgtttaatt tgtggggcca aggcaccctg gtcaccgtct cttca 345
<210> 156
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 156
ggattctccc tcagtagcta tgca 24
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 157
attggtactg gtaccaccac a 21
<210> 158
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 158
gtcagaaatg atgtttattg ggcgtttaat ttg 33
<210> 159
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 159
gagctcgatc tgacccagac accatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcagc 60
atcagttgcc agtccagtca gagtgttgtt aataataatg ccttatcttg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacaaggctt ccactctggc atctggggtc 180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg gcacagttca ctctcaccat cagcggcgtg 240
cagtgtgacg atgctgccac ttattattgt caaggcggtt attatattgg tattagtgac 300
tatcctttcg gcggcgggac cgaggtggaa atcaaa 336
<210> 160
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 160
cagagtgttg ttaataataa tgcc 24
<210> 161
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 161
caaggcggtt attatattgg tattagtgac tatcct 36
<210> 162
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 162
gagcagtcgg tggaggagtc cggaggaggc ctggtaacgc ctggaggaac cctgacactc 60
acctgcacag cctctggatt ctccatcagt acctatgcaa tgatctgggt ccgccaggct 120
ccaggggagg ggctggaata catcggatgc attggtactg gtggtagcgc attctacgcg 180
atctgggcaa aaggccgatt caccatctcc agaacctcga ccacggtgga tctgaagatg 240
accagtctga caaccgagga cacggccaca tatttctgtg ccagaaatga tatttattgg 300
gcctttggct tatggggcca aggcacgctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 163
ggattctcca tcagtaccta tgca 24
<210> 164
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 164
attggtactg gtggtagcgc a 21
<210> 165
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 165
gccagaaatg atatttattg ggcctttggc tta 33
<210> 166
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 166
gagctcgatc tgacccagac accagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaactgcc aggccagtga gggcattagg aactggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctatggt gcatccactc tggaatctgg ggtcccatcg 180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagagg tgtgcagtgt 240
gacgatgctg ccacttacta ctgtcaaggc ggtgtttata gtagtagtat ttatggttat 300
cctttcggcg gagggaccga gctggaaatc aaa 333
<210> 167
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 167
gagggcatta ggaactgg 18
<210> 168
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 168
caaggcggtg tttatagtag tagtatttat ggttatcct 39
<210> 169
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 169
gagcagtcgt tggaggagtc cgggggagac ctggtcaagc ctggggcatc cctgacactc 60
acctgcacag cctctggatt cgactttagt agtagtggtt ggatatgttg ggtccgccag 120
gctccaggga agggactgga gttgatcgca tgcatttata gtggtcgcag tggtagcact 180
tactacgcga gctgggcgaa aggccgagtc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg 240
actctgcaga tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagagcc 300
ctctatgttg attatgttga ttatgattat atagatttgt ggggcccagg caccctggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 170
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 170
ggattcgact ttagtagtag tggttgg 27
<210> 171
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 171
atttatagtg gtcgcagtgg tagcact 27
<210> 172
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 172
gcgagagccc tctatgttga ttatgttgat tatgattata tagatttg 48
<210> 173
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 173
gagctcgatc tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtca gagcactggt attagattag cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaaactcct gatgtatgct acatccaatc tggcatctgg ggtctcatcg 180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt 240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaatat agttattatg gtagtagtta tgtttttgat 300
ttcggcggag ggaccgaggt ggaaatcaaa 330
<210> 174
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 174
cagagcactg gtattaga 18
<210> 175
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 175
caatatagtt attatggtag tagttatgtt tttgat 36
<210> 176
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 176
gagcagtcgg tggaggagtc cgggggtcgc ctggtcacgc ctgggacacc cctgacactc 60
acctgcacag cctctggatt ctccctcagt agctactaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaggg gactggaata catcggagtc attaatactg gtggtagcgc agtctacgcg 180
acctggacaa aaggccgatt caccatctcc agaacctcga ccacggtgga tctgaaaatg 240
accggtctga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagaggatg gagtaggggt 300
gacttgtggg gccaaggcac cctggtcacc atctcctca 339
<210> 177
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 177
ggattctccc tcagtagcta ctac 24
<210> 178
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 178
attaatactg gtggtagcgc a 21
<210> 179
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 179
gccagaggat ggagtagggg tgacttg 27
<210> 180
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 180
gagctcgatc tgacccagac accagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtga aagcgttgac aactggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaaactcct gatctacgat gcatccaaat tggcatctgg ggtcccagat 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacacag ttcactctca ccatcagcgg cgtgcagtgt 240
gacgatgctg ccacttacta ctgtctaggc gtttttcatg atggtattaa taatgctttc 300
ggcggaggga ccgaggtgga aatcaaa 327
<210> 181
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 181
gaaagcgttg acaactgg 18
<210> 182
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 182
ctaggcgttt ttcatgatgg tattaataat gct 33
<210> 183
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 183
gagcagtcgg tggaggagtc cgggggtcgc ctggtcacgc ctgggacacc cctgacactc 60
acctgcacag cctctggatt ctccctcagt agctactaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaggg gactggaata catcggagtc attaatactg gtggtagcgc agtctacgcg 180
acctggacaa aaggccgatt caccatctcc agaacctcga ccacggtgga tctgaaaatg 240
accggtctga caaccgagga cacggccacc tatttctgtg ccagaggatg gagtaggggt 300
gacttgtggg gccaaggcac cctggtcacc atctcctca 339
<210> 184
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 184
ggattctccc tcagtagcta ctac 24
<210> 185
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 185
attaatactg gtggtagcgc a 21
<210> 186
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 186
gccagaggat ggagtagggg tgacttg 27
<210> 187
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 187
gagctcgata tgacccagac accatcgccc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc agtccagtca gaatgtttat gatgacgata ctttatcctg gtatcagcag 120
aaaccagggc agcctcccaa actcctgatc tacgatgcat ccaaattggc atctggggtc 180
ccagataggt tcagcggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcggcgtg 240
cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt ctaggcgttt ttcatgatgg tattaataat 300
gctttcggcg gagggaccga ggtggaaatc aaa 333
<210> 188
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 188
cagaatgttt atgatgacga tact 24
<210> 189
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 189
ctaggcgttt ttcatgatgg tattaataat gct 33
<210> 190
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 190
gagcagtcgg tggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg agggatccct gacactcacc 60
tgcacagtct ctggattctc cttcagtagc agctactgga tatgctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaatg gatcggatgc attggtactg gtagtggtag cacttactac 180
gggagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctg 240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgtgag aggggctggt 300
tatagttctt ataggttgtg gggcccaggc accctggtca ccatctcctc a 351
<210> 191
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 191
ggattctcct tcagtagcag ctactgg 27
<210> 192
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 192
attggtactg gtagtggtag c 21
<210> 193
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 193
gtgagagggg ctggttatag ttcttatagg ttg 33
<210> 194
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 194
gagctcgata tgacccagac accagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtga aagcgttagc aactggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcgtc ccaagctcct gatctatggt gcatccactc tggaatctgg ggtcccatcg 180
cggttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcaa cctggagtgt 240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaacag ggttatgatt gggataatat cgataatgct 300
ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa 330
<210> 195
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 195
gaaagcgtta gcaactgg 18
<210> 196
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 196
caacagggtt atgattggga taatatcgat aatgct 36
<210> 197
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 197
cagtcggtga aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc 60
tgcacagcct ctggattctc cttcattagc acctactgga tatgctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtt gatcgcatgc atttatactg gtggtagtgg tagcacttac 180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact 240
ctgcaactga acagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagagccctc 300
tatgttgatt atgttgatta tgattatata gatttgtggg gcccaggcac cctggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 198
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 198
ggattctcct tcattagcac ctactgg 27
<210> 199
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 199
atttatactg gtggtagtgg tagcact 27
<210> 200
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 200
gcgagagccc tctatgttga ttatgttgat tatgattata tagatttg 48
<210> 201
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 201
gagctcgatc tgacccagac accagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtga gaacattggt agtagattag cctggtatca gcagaaacca 120
gggcagcctc ccaagctcct gatctatgct gcatccaatc tggcatctgg ggtctcatcg 180
cggttcaaag gcagtagatc tgggacacag ttcactctca ccatcagcga cctagagtgt 240
gccgatgctg ccatttacta ctgtcaatgt agttattatg gtagtactta tgtttttggt 300
ttcggcggag ggaccgaggt ggaaatcaaa 330
<210> 202
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 202
gagaacattg gtagtaga 18
<210> 203
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 203
caatgtagtt attatggtag tacttatgtt tttggt 36
<210> 204
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 204
gagcagtcgg tggaggagtc cgggggagac ctggtcaagc ctgggacatc cctgacactc 60
acttgtaaaa tgtctggatt ctccctcagt agcagctatt ggatatgctg ggtccgccag 120
gctccaggga agggactgga gtggatcgga tgcatcgata gtggtagtgt tggtatcact 180
tactacgcga cctgggcgaa aggccgattc accatctcca gaagcaccag cctaaacacg 240
gtgactctgc aaatgaccag tctgacaggc gcggacacgg ccatgtattt ctctgtgagg 300
catggtgata attgggcttt ggatttgtgg ggcccaggca ccctggtcac catctcctca 360
<210> 205
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 205
ggattctccc tcagtagcag ctattgg 27
<210> 206
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 206
atcgatagtg gtagtgttgg tatcact 27
<210> 207
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 207
tctgtgaggc atggtgataa ttgggctttg gatttg 36
<210> 208
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 208
gagctcgtgc tgacccagac accagcctcc gtgtctgagc ctgtgggagg cacagtcacc 60
atcaagtgcc aggccagtca gagtatcaac agttggttag cctggtatca gcagaaacca 120
ggacagcctc ccaagctcct gatctacaag gcgtccactc tggcatctgg ggtcccatcg 180
cggttcagtg ccagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcaccgg cgtgcagtgc 240
gacgatgctg ccacttacta ctgtcaacat ggctatattc gtggtgatct tgataatgtt 300
ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa 330
<210> 209
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 209
cagagtatca acagttgg 18
<210> 210
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 210
caacatggct atattcgtgg tgatcttgat aatgtt 36
<210> 211
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成单导向RNA
<400> 211
gaacgactag ttaggcgtgt a 21
<210> 212
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成单导向RNA
<400> 212
tgttactatc gcagccctgt 20
<210> 213
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成单导向RNA
<400> 213
gtaggtcccc ccgtgcactg 20
<210> 214
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成单导向RNA
<400> 214
cctgtgacct cagtgcacgg 20
<210> 215
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成单导向RNA
<400> 215
cttttgggat tacctgcgc 19
<210> 216
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成单导向RNA
<400> 216
aactggcact gggtcgcttt 20
<210> 217
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成单导向RNA
<400> 217
taagacctac atcgccagcc 20
<210> 218
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成单导向RNA
<400> 218
gaagaacttg caccagcgtc 20
<210> 219
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成单导向RNA
<400> 219
gagacttcac actttccgtt 20
<210> 220
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成单导向RNA
<400> 220
tacagtacta caactcaagc 20
<210> 221
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成单导向RNA
<400> 221
cacgcagagc gcgtatgccc 20
<210> 222
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成单导向RNA
<400> 222
tggcaacatc acccgctcca 20
<210> 223
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 223
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 224
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 224
Val Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 225
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 225
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 226
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 226
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 227
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 227
Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 228
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 228
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 229
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 229
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Val Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 230
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 230
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 231
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 231
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 232
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 232
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 233
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 233
Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 234
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 234
His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp Leu Asp Asn Val
1 5 10
<210> 235
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 235
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 236
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 236
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 237
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 237
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 238
<211> 236
<212> PRT
<213> 智人
<400> 238
Gly Pro Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile
1 5 10 15
Ser Trp Gly Asn Ser Val Thr Ile Trp Cys Gln Gly Thr Leu Glu Ala
20 25 30
Arg Glu Tyr Arg Leu Asp Lys Glu Glu Ser Pro Ala Pro Trp Asp Arg
35 40 45
Gln Asn Pro Leu Glu Pro Lys Asn Lys Ala Arg Phe Ser Ile Pro Ser
50 55 60
Met Thr Glu Asp Tyr Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Arg Ser Pro
65 70 75 80
Val Gly Trp Ser Gln Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Met Thr Gly
85 90 95
Ala Tyr Ser Lys Pro Thr Leu Ser Ala Leu Pro Ser Pro Leu Val Thr
100 105 110
Ser Gly Lys Ser Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Arg Ser Pro Met Asp
115 120 125
Thr Phe Leu Leu Ile Lys Glu Arg Ala Ala His Pro Leu Leu His Leu
130 135 140
Arg Ser Glu His Gly Ala Gln Gln His Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser
145 150 155 160
Pro Val Thr Ser Val His Gly Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Ser His
165 170 175
Gly Phe Ser His Tyr Leu Leu Ser His Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Val Ser Gly Ser Leu Glu Asp Pro Arg Pro Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Val Ser Thr Ala Ala Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Met Pro Thr Gly
210 215 220
Ser Val Pro His Ser Gly Leu Arg Arg His Trp Glu
225 230 235

Claims (45)

1.一种经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)重链(HC)可变区(VH)，其包含：
重链互补决定区(HC-CDR)1，其具有SEQ ID NO:100中所示的氨基酸序列，
HC-CDR2，其具有SEQ ID NO:101中所示的氨基酸序列，和
HC-CDR3，其具有SEQ ID NO:102、224或227中所示的氨基酸序列；和
其变体，其中所述HC-CDR中的一或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合；和
(b)轻链(LC)可变区(VL)，其包含：
轻链互补决定区(LC-CDR)，其具有SEQ ID NO:104中所示的氨基酸序列，
LC-CDR2，其具有KAS或SEQ ID NO:233中所示的氨基酸序列，和
LC-CDR3，其具有SEQ ID NO:105或234中所示的氨基酸序列，和
其变体，其中所述LC-CDR中的一或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
2.根据权利要求1所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中(a)所述HC-CDR1具有SEQ ID NO:100中所示的氨基酸序列，所述HC-CDR2具有SEQ ID NO:101中所示的氨基酸序列，且所述HC-CDR3具有SEQ ID NO:102,224或227中所示的氨基酸序列；以及(b)所述LC-CDR1具有SEQ ID NO:104中所示的氨基酸序列，所述HC-CDR2具有KAS或SEQ ID NO:233中所示的氨基酸序列，且所述HC-CDR3具有SEQ ID NO:105或234中所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述经分离的单克隆抗体是鼠类抗体、啮齿动物抗体、兔抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。
4.根据权利要求1所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是重组ScFv(单链可变片段)抗体、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。
5.根据权利要求1所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述经分离的单克隆抗体是兔抗体或嵌合抗体。
6.根据权利要求5所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中(a)所述VH具有与SEQ ID NO:99至少约90％一致的氨基酸序列；以及(b)所述VL具有与SEQ ID NO:103至少90％一致的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中(a)所述VH具有SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列；以及(b)所述VL具有SEQ ID NO:103中所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述经分离的单克隆抗体是人源化抗体。
9.根据权利要求8所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中(a)所述VH具有与SEQ ID NO:223、225、226、228、229、230或231至少约90％一致的氨基酸序列；以及(b)所述VL具有与SEQ ID NO:232、235、236或237至少90％一致的氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中(a)所述VH具有SEQ ID NO:223、225、226、228、229、230或231中所示的氨基酸序列；以及(b)所述VL具有SEQ ID NO:232、235、236或237中所示的氨基酸序列。
11.一种经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与根据权利要求1至10中任一项所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合相同的表位。
12.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
13.一种经分离的核酸，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的经分离的单克隆抗体。
14.一种载体，其包含根据权利要求13所述的经分离的核酸。
15.一种宿主细胞，其包含根据权利要求14所述的载体。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
17.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
18.一种杂交瘤，其编码或产生根据权利要求1至11中任一项所述的经分离的单克隆抗体。
19.一种产生抗体的方法，其包含将根据权利要求15所述的宿主细胞在适合于表达所述抗体的条件下培养以及回收所述抗体。
20.一种嵌合抗原受体(CAR)蛋白，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的抗原结合片段。
21.一种经分离的核酸，其编码根据权利要求20所述的CAR蛋白。
22.一种载体，其包含根据权利要求21所述的经分离的核酸。
23.一种经工程改造的细胞，其包含根据权利要求21所述的经分离的核酸。
24.根据权利要求23所述的经工程改造的细胞，其中所述细胞是T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
25.一种治疗或改善癌症在受试者中的影响的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求23或24所述的经工程改造的细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述方法降低或根除所述受试者中的肿瘤负荷。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述方法减少肿瘤细胞的数目。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述方法减小肿瘤尺寸。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述方法根除所述受试者的肿瘤。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述癌症是恶性血液疾病。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述恶性血液疾病选自由以下组成的群组：骨髓发育不良综合症、骨髓增生性肿瘤、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、慢性髓细胞白血病，或急性髓细胞白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)或M3 AML、急性粒单核细胞白血病或M4 AML、急性单核细胞白血病或M5 AML、急性骨髓母细胞白血病，以及真性红细胞增多症。
32.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段通过静脉内、动脉内、肿瘤内或皮下方式施用。
33.根据权利要求25所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用一或多种选自由以下组成的群组的药物：拓朴异构酶抑制剂、蒽环霉素拓朴异构酶抑制剂、蒽环霉素、道诺霉素、核苷代谢抑制剂、阿糖胞苷、低甲基化剂、低剂量阿糖胞苷(LDAC)、道诺霉素与阿糖胞苷的组合、用于注射的道诺霉素和阿糖胞苷脂质体、
Figure FDA0002973222500000031
氮胞苷、
Figure FDA0002973222500000032
地西他滨、全反式视黄酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、组胺二盐酸盐、
Figure FDA0002973222500000033
白介素-2、阿地白介素、
Figure FDA0002973222500000041
吉妥珠单抗奥佐米星、
Figure FDA0002973222500000042
FLT-3抑制剂、米哚妥林、
Figure FDA0002973222500000043
氯法拉滨、法呢基转移酶抑制剂、IDH1抑制剂、艾伏尼布、
Figure FDA0002973222500000044
IDH2抑制剂、伊那尼布、
Figure FDA0002973222500000045
斯莫森德(SMO)抑制剂、格拉吉布、精胺酸酶抑制剂、IDO抑制剂、艾卡哚司他、BCL-2抑制剂、维奈托克、
Figure FDA0002973222500000046
铂复合物衍生物、奥沙利铂、激酶抑制剂、酪胺酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、BTK抑制剂、依鲁替尼、
Figure FDA0002973222500000047
阿卡拉布替尼、
Figure FDA0002973222500000048
赞鲁替尼、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、ICOS抗体、TIGIT抗体、TIM3抗体、CD40抗体、4-1BB抗体、CD47抗体、SIRP1α抗体或融合蛋白、E-选择素拮抗剂、与肿瘤抗原结合的抗体、与T细胞表面标记结合的抗体、与骨髓细胞或NK细胞表面标记结合的抗体、烷化剂、亚硝基脲药剂、抗代谢产物、抗肿瘤抗生素、衍生自植物的生物碱、激素疗法药品、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。
34.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段进一步包含与其连接的抗肿瘤药物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗肿瘤药物经由光不稳定连接子与所述抗体连接。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗肿瘤药物经由酶裂解连接子与所述抗体连接。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗肿瘤药物是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
38.一种检测样品或受试者中的癌细胞或癌症干细胞的方法，其包括：
(a)使受试者或来自所述受试者的样品与根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；和
(b)检测所述抗体对所述受试者或样品中的癌细胞或癌症干细胞的结合。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述样品是体液或生物检体。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述样品是血液、骨髓、痰、泪液、唾液、黏液、血清、尿液或粪便。
41.根据权利要求38所述的方法，其中检测包含免疫组织化学、流式细胞术、FACS、ELISA、RIA或蛋白质印记法。
42.根据权利要求38所述的方法，其进一步包含第二次执行步骤(a)和(b)以及测定检测水平与第一次相比的变化。
43.根据权利要求38所述的方法，其中所述经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段进一步包含标记。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述标记是肽标签、酶、磁性粒子、发色团、荧光分子、化学发光分子，或染料。
45.根据权利要求25至44中任一项所述的方法，其中所述经分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与脂质体或纳米粒子共轭。
CN201980059865.6A 2018-09-13 2019-09-12 新颖lilrb4抗体和其用途 Pending CN112672760A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862730715P 2018-09-13 2018-09-13
US62/730,715 2018-09-13
PCT/US2019/050727 WO2020056077A1 (en) 2018-09-13 2019-09-12 Novel lilrb4 antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112672760A true CN112672760A (zh) 2021-04-16

Family

ID=69777846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980059865.6A Pending CN112672760A (zh) 2018-09-13 2019-09-12 新颖lilrb4抗体和其用途

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20210371518A1 (zh)
EP (1) EP3849608B1 (zh)
JP (1) JP2022500084A (zh)
KR (1) KR20210061341A (zh)
CN (1) CN112672760A (zh)
AU (1) AU2019339469A1 (zh)
CA (1) CA3109366A1 (zh)
TW (1) TW202019480A (zh)
WO (1) WO2020056077A1 (zh)
ZA (1) ZA202100943B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114716553A (zh) * 2022-06-08 2022-07-08 北京科诺信诚科技有限公司 靶向人lilrb4的纳米抗体及其应用
CN114716554A (zh) * 2022-06-08 2022-07-08 尚健单抗（北京）生物技术有限公司 抗原结合蛋白及其应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220152316A (ko) * 2020-03-12 2022-11-15 이뮨-온크 테라퓨틱스, 인코포레이티드 신규한 항-lilrb4 항체 및 유도체 생성물
US20230400471A1 (en) * 2020-10-15 2023-12-14 Bioincept, Llc Systems, compositions and methods of determining viability of embryos using the same
TW202346337A (zh) 2022-03-29 2023-12-01 美商恩格姆生物製藥公司 Ilt3及cd3結合劑以及其使用方法
WO2023209716A1 (en) 2022-04-25 2023-11-02 Biond Biologics Ltd. Anti-ilt3 antibodies and use thereof
WO2023235699A1 (en) * 2022-05-31 2023-12-07 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to lilrb4 and uses thereof
WO2023236891A1 (en) * 2022-06-06 2023-12-14 Antengene (Hangzhou) Biologics Co., Ltd. Novel anti-lilrb4 antibodies and uses thereof
WO2024026019A1 (en) * 2022-07-28 2024-02-01 Merck Sharp & Dohme Llc Methods for treating chronic myelomonocytic leukemia with anti-ilt3 antibodies

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150110714A1 (en) * 2011-09-02 2015-04-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Diagnosis and Treatment of Cancer Expressing ILT3 or ILT3 Ligand
CN107530402A (zh) * 2015-03-06 2018-01-02 德克萨斯大学体系董事会 抗lilrb抗体及其在检测和治疗癌症中的用途
WO2018089300A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Ilt3 ligand
WO2018148494A1 (en) * 2017-02-09 2018-08-16 Bluefin Biomedicine, Inc. Anti-ilt3 antibodies and antibody drug conjugates

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4957939A (en) 1981-07-24 1990-09-18 Schering Aktiengesellschaft Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging
US4867973A (en) 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US4472509A (en) 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4938948A (en) 1985-10-07 1990-07-03 Cetus Corporation Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5141648A (en) 1987-12-02 1992-08-25 Neorx Corporation Methods for isolating compounds using cleavable linker bound matrices
US5563250A (en) 1987-12-02 1996-10-08 Neorx Corporation Cleavable conjugates for the delivery and release of agents in native form
JPH049249A (ja) 1990-04-27 1992-01-14 Kusuda:Kk 塗型剤吹き付け機
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
PT1137789E (pt) 1998-12-09 2010-10-21 Phyton Holdings Llc Um método para produzir glicoproteínas possuindo glicosilação de tipo humano
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
KR100787073B1 (ko) 2000-06-28 2007-12-21 글리코파이, 인크. 변형된 당단백질의 제조방법
US7632983B2 (en) 2000-07-31 2009-12-15 Biolex Therapeutics, Inc. Expression of monoclonal antibodies in duckweed
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
AU2003226356A1 (en) 2002-04-12 2003-10-27 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Prevention of brain inflammation as a result of induced autoimmune response
US7410483B2 (en) 2003-05-23 2008-08-12 Novare Surgical Systems, Inc. Hand-actuated device for remote manipulation of a grasping tool
WO2005120571A2 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Method of passive immunization against disease or disorder characterized by amyloid aggregation with diminished risk of neuroinflammation
MX2007009935A (es) 2005-02-18 2007-10-10 Medarex Inc Anticuerpos monoclonales que carecen de residuos fucosilo contra antigeno membranal especifico de prostata (psma).
JP5597793B2 (ja) * 2006-06-19 2014-10-01 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション Ｉｌｔ３結合分子およびその使用
RU2479629C2 (ru) 2007-03-07 2013-04-20 Гликофи, Инк. Продукция гликопротеинов с модифицированным фукозилированием
WO2013181438A2 (en) * 2012-05-30 2013-12-05 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Compositions and methods for modulating pro-inflammatory immune response

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150110714A1 (en) * 2011-09-02 2015-04-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Diagnosis and Treatment of Cancer Expressing ILT3 or ILT3 Ligand
CN107530402A (zh) * 2015-03-06 2018-01-02 德克萨斯大学体系董事会 抗lilrb抗体及其在检测和治疗癌症中的用途
WO2018089300A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Ilt3 ligand
US20190241655A1 (en) * 2016-11-10 2019-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Ilt3 ligand
WO2018148494A1 (en) * 2017-02-09 2018-08-16 Bluefin Biomedicine, Inc. Anti-ilt3 antibodies and antibody drug conjugates
US20200031926A1 (en) * 2017-02-09 2020-01-30 Bluefin Biomedicine, Inc. Anti-ilt3 antibodies and antibody drug conjugates

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114716553A (zh) * 2022-06-08 2022-07-08 北京科诺信诚科技有限公司 靶向人lilrb4的纳米抗体及其应用
CN114716554A (zh) * 2022-06-08 2022-07-08 尚健单抗（北京）生物技术有限公司 抗原结合蛋白及其应用
CN114716553B (zh) * 2022-06-08 2022-08-23 北京科诺信诚科技有限公司 靶向人lilrb4的纳米抗体及其应用
CN114716554B (zh) * 2022-06-08 2022-08-26 尚健单抗（北京）生物技术有限公司 抗原结合蛋白及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
ZA202100943B (en) 2022-07-27
TW202019480A (zh) 2020-06-01
EP3849608A4 (en) 2022-06-15
AU2019339469A1 (en) 2021-03-11
EP3849608A1 (en) 2021-07-21
CA3109366A1 (en) 2020-03-19
JP2022500084A (ja) 2022-01-04
WO2020056077A1 (en) 2020-03-19
EP3849608C0 (en) 2023-08-30
KR20210061341A (ko) 2021-05-27
US20210371518A1 (en) 2021-12-02
EP3849608B1 (en) 2023-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11498963B2 (en) Anti-LILRB antibodies and their use in detecting and treating cancer
EP3849608B1 (en) Novel lilrb4 antibodies and uses thereof
CN110381998B (zh) 抗lair1抗体及其用途
CN115768793A (zh) 新型lilrb2抗体和其用途
US20230235055A1 (en) Monoclonal antibodies against lilrb1 for diagnostic and therapeutic use
WO2021216876A2 (en) Antibodies to coronavirus spike protein and methods of use thereof
US20230235078A1 (en) Novel ddr1 antibodies and uses thereof
US20240101667A1 (en) Methods for identifying lilrb-blocking antibodies
CN115916347A (zh) 针对壳多糖酶3样1的抗体及其使用方法
CN116963747A (zh) 用于鉴定lilrb阻断抗体的方法
CN116997354A (zh) 用于诊断和治疗用途的针对lilrb1的单克隆抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40048964

Country of ref document: HK