TW202019480A - 新穎lilrb4抗體及其用途 - Google Patents

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成城 張
凝豔 張
桂動
鄧覓
濤 黃
曉伶 廖
強 劉
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Abstract

本發明提供與LILRB4結合之抗體及該等抗體偵測及治療癌症之用途。

Description

新穎LILRB4抗體及其用途
本發明大體上係關於醫學、腫瘤學及免疫學領域。更特定言之，本發明係關於與LILRB結合之抗體且可治療包括白血病之癌症。
急性骨髓性白血病(AML)為最常見之成人急性白血病及常見兒科癌症。當前用於AML之治療涉及強化細胞毒性化學療法，通常之後為清髓性調理及幹細胞移植。然而，儘管進行治療，但大部分患者在5年內復發或死於疾病。為有效地治療AML，必須確認新的分子目標及治療方法。最近，已展示抑制性白血球免疫球蛋白樣受體(LILRB)及相關之含有基於免疫受體酪胺酸之抑制性基元(ITIM)之受體LAIR1在各種造血及實體癌細胞中具有腫瘤促進功能。含有ITIM之受體在廣泛範圍之免疫細胞上表現且藉由募集磷酸酶SHP-1、SHP-2或SHIP來轉導信號，致使免疫細胞活化之負調節。與CTLA4及PD-1類似，LILRB經視為免疫檢查點因子。
LILRB可抑制促進腫瘤免疫逃逸之多種免疫細胞類型之活性。LILRB4在單核球、巨噬細胞及樹突狀細胞上表現且可以細胞自主方式抑制先天性免疫，且經由間接機制抑制T細胞活化。LILRB4為用於單核球性AML (包括難治癒及復發性疾病)之特異性標記。LILRB1-5為靈長類動物及人類特異性，而存在兩種小鼠直系同源物：成對的免疫球蛋白樣受體B (PirB)及gp49B1。相關之含有基於免疫受體酪胺酸之抑制性基元(ITIM)之受體LAIR1具有人類及小鼠兩種版本的蛋白質。由於小鼠模型之有限價值及包括LILRB4之若干LILRB之配位體未知的事實，此等受體之生物功能及臨床意義仍然知之甚少。
因此，在一個態樣中，本發明提供與LILRB4特異性結合之經分離單株抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段在與LILRB4結合時，調節LILRB4之活化。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段在與LILRB4結合時，活化LILRB4。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段在與LILRB4結合時，抑制LILRB4之活化。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段在與LILRB4結合時，特異性地阻斷ApoE與LILRB4之結合。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含(a)包含以下互補決定區(CDR)之重鏈(HC)可變區(VH)：重鏈CDR (HC-CDR) 1，其為SEQ ID NO: 1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、99、223、225、226、228、229、230或231中之CDR1；HC-CDR2，其為SEQ ID NO: 1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、99、223、225、226、228、229、230或231中之CDR2；及HC-CDR3，其為SEQ ID NO: 1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、99、223、225、226、228、229、230或231中之CDR3，及其變體，其中該等HC-CDR中之一或多者具有一個、兩個或三個胺基酸取代、添加、缺失或其組合；及(b)包含以下CDR之輕鏈(LC)可變區(VL)：輕鏈CDR (LC-CDR) 1，其為SEQ ID NO: 5、12、19、26、33、40、47、54、61、68、75、82、89、96、103、232、235、236或237中之CDR1；LC-CDR2，其為SEQ ID NO: 5、12、19、26、33、40、47、54、61、68、75、82、89、96、103、232、235、236或237中之CDR2；及LC-CDR3，其為SEQ ID NO: 5、12、19、26、33、40、47、54、61、68、75、82、89、96、103、232、235、236或237中之CDR3，及其變體，其中該等LC-CDR中之一或多者具有一個、兩個或三個胺基酸取代、添加、缺失或其組合。在某些實施例中，各CDR係根據以下各者定義：Kabat定義、Chothia定義、Kabat定義及Chothia定義之組合、AbM定義或CDR之接觸定義。
在某些實施例中，抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：HC-CDR1，其具有述於SEQ ID NO: 2、9、16、23、30、37、44、51、58、65、72、79、86、93或100中之胺基酸序列；HC-CDR2，其具有述於SEQ ID NO: 3、10、17、24、31、38、45、52、59、66、73、80、87、94或101中之胺基酸序列；及HC-CDR3，其具有述於SEQ ID NO: 4、11、18、25、32、39、46、53、60、67、74、81、88、95、102、224或227中之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：LC-CDR1，其具有述於SEQ ID NO: 6、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、97或104中之胺基酸序列；LC-CDR2，其具有SAS、KAS、GAS、ATS、DAS或AAS之胺基酸序列或述於SEQ ID NO: 233中之胺基酸序列；及LC-CDR3，其具有述於SEQ ID NO: 7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84、91、98、105或234中之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗體之特徵在於純系配對的重鏈及輕鏈具有與圖 28A 至 28C 及圖 30A 至 30C 之純系配對序列至少約70%、80%、90%或95%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有述於SEQ ID NO: 1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、99、223、225、226、228、229、230或231中之胺基酸序列。在某些實施例中，抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有述於SEQ ID NO: 5、12、19、26、33、40、47、54、61、68、75、82、89、96、103、232、235、236或237中之胺基酸序列。在某些實施例中，以純系配對重鏈及輕鏈為特徵之抗體與表 1 及表 2 中之CDR具有0、1或2個胺基酸差異之CDR。
在另一態樣中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合片段，其與具有表 1 及表 2 之純系配對重鏈及輕鏈CDR序列之抗體競爭相同的抗原決定基。在某些實施例中，抗體與具有圖 28A 至 28C 及圖 30A 至 30C 之純系配對重鏈及輕鏈可變區之抗體競爭相同的抗原決定基。
在某些實施例中，由抗體或抗原結合片段結合之抗原決定基位於人類LILRB4之D1與D2結構域之間的連接區內。在某些實施例中，抗原決定基包含表 9 中所列出之LILRB4之一或多個胺基酸序列內的至少一個胺基酸。在某些實施例中，抗原決定基包含選自SEQ ID NO: 238 (人類LILRB4蛋白之D1及D2結構域)之W18、G96、A97、Y98、S99、K100、Q122、S123、R124、S125、P126、H153及Q154之一或多個胺基酸序列內的至少一個胺基酸。
在某些實施例中，本文所描述之經分離單株抗體為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在某些實施例中，本文所描述之經分離單株抗體屬於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4類型。在某些實施例中，本文所描述之抗原結合片段為重組ScFv (單鏈可變片段)抗體、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。
在另一態樣中，提供一種包含如本文所提供之經分離單株抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物，及至少一種醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，提供一種編碼如本文所提供之經分離單株抗體或其抗原結合片段的經分離核酸。
在另一態樣中，提供一種包含如本文所提供之經分離核酸的載體。
在另一態樣中，提供一種包含如本文所提供之載體之宿主細胞。宿主細胞可為哺乳動物細胞。宿主細胞可為CHO細胞。
在另一態樣中，提供一種編碼或產生如本文所提供之經分離單株抗體之融合瘤。
在另一態樣中，提供一種產生抗體之方法。方法可包含在適合於表現抗體且回收抗體之條件下培養如本文所提供之宿主細胞。
在另一態樣中，提供一種包含如本文所提供之抗原結合片段之嵌合抗原受體(CAR)蛋白。
在另一態樣中，提供一種編碼如本文所提供之CAR蛋白之經分離核酸。
在另一態樣中，提供一種包含如本文所提供之經分離核酸之工程改造細胞。在某些實施例中，細胞為T細胞、NK細胞或骨髓細胞。
在另一態樣中，提供一種治療或改善癌症在個體中之影響的方法。方法可包含向個體投與治療有效量之抗體或其抗原結合片段或如本文所提供之工程改造細胞。在某些實施例中，癌症為急性骨髓性白血病。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為經靜脈內、動脈內、腫瘤內或皮下投與。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含連接至其上之抗腫瘤藥物(例如，毒素、放射性同位素、細胞介素或酶)。在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段與脂質體或奈米粒子共軛。
在又另一態樣中，提供一種偵測樣品或個體中之癌細胞或癌症幹細胞之方法。在某些實施例中，方法包含使個體或來自個體之樣品與如本文所提供之抗體或其抗原結合片段接觸且偵測該抗體與該個體或樣品中之癌細胞或癌症幹細胞之結合。樣品可為體液或生物檢體。樣品可為血液、痰、淚液、唾液、黏液、血清、尿液或糞便。在某些實施例中，偵測包含免疫組織化學、流式細胞量測術、FACS、ELISA、RIA或西方墨點法。在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段進一步包含標記(例如，肽標記、酶、磁性粒子、發色團、螢光分子、化學發光分子或染料)。在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合片段與脂質體或奈米粒子共軛。
當與術語「包含」結合用於申請專利範圍及/或本說明書中時，字組「一(a/an)」之使用可意謂「一個」，但其亦與「一或多個」、「至少一個」及「一個或多於一個」之含義相符。字組「約」意謂所陳述數字之加或減5%。
預期本文所描述之任何方法或組合物均可根據本文所描述之任何其他方法或組合物實施。本發明之其他目的、特徵及優勢將自以下詳細描述而變得顯而易知。然而，應理解，詳細描述及具體實例雖然指示本發明之特定實施例，但僅以說明方式給出，因為熟習此項技術者由此詳細描述將對在本發明之精神及範疇內的各種改變及修改變得顯而易知。
優先權要求
本申請案主張2018年9月13日申請之美國臨時申請案第62/730,715號之優先權，其全部內容特此以引用之方式併入。序列表
含於名為「UTFH_P0349WO_ST25」之檔案中之序列表係藉由電子提交在此申請且以引用之方式併入本文中，該檔案為4 KB (如在微軟視窗(Microsoft Windows)中所量測)且創建於2019年9月9日。
本發明人已分離一組識別LILRB4蛋白(含ITIM之受體)之新穎單株抗體，其可用於癌症治療。LILRB4在一些腫瘤細胞，尤其白血病細胞上經上調且促進腫瘤生長。識別之抗人類ILIRB4抗體阻斷LILRB4信號傳導且可調節抗癌症免疫。
本發明之以下描述僅意欲說明本發明之各種實施例。因此，所論述之特異性修飾不應解釋為對本發明之範疇的限制。對熟習此項技術者將為顯而易見的係，在不脫離本發明之範疇的情況下，可進行各種等效物、改變及修改，且應理解此類等效實施例將包括在本文中。本文引用之全部文獻(包括公開案、專利及專利申請案)以全文引用之方式併入本文中。 I.         定義
應理解，前文一般描述與以下詳細說明僅舉例說明及解釋而非限制所主張之本發明。在本申請案中，除非另外明確陳述，否則單數之使用包括複數。在本申請案中，除非另外陳述，否則使用「或」意謂「及/或」。此外，使用術語「包括(including)」以及其他形式，諸如「包括(includes)」及「包括(included)」，不具限制性。此外，除非另外明確陳述，否則諸如「元件」或「組件」之術語涵蓋包含一個單元之元件及組件以及包含多於一個次單元之元件及組件兩者。此外，術語「部分(portion)」之使用可包括部分的一部分或整個部分。
除非上下文另外明確規定，否則如本文所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個(種)參考物。
如本文所使用，當提及諸如量、時距及類似者之可量測值時，術語「約(about)」意謂涵蓋指定值之至多±10%的變化。除非另外指示，否則說明書及申請專利範圍中所使用之表示成分之量，諸如分子量、反應條件等之特性的所有數字應理解為在所有情況下均由術語「約」修飾。因此，除非與此相反地指示，否則在以下說明書及所附申請專利範圍中給出之數值參數皆為可視藉由本發明標的物設法獲得之所需特性而改變之近似值。至少，且不試圖將均等論之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位的數目且藉由應用普通捨位技術來解釋。儘管述本發明之廣泛範疇的數值範圍及參數為近似值，但特定實例中所述之數值應儘可能精確地報導。然而，任何數值均固有地含有某些存在於其各別測試量測中之必然產生自標準差之誤差。
術語「抗體」係指任何同型之完整免疫球蛋白或其可與完整抗體競爭與目標抗原特異性結合之片段，且包括例如嵌合抗體、人類化抗體、完全人類抗體及雙特異性抗體。「抗體」為抗原結合蛋白物質。完整抗體通常將包含至少兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈，但在一些情況下可包括較少鏈，諸如駱駝中天然存在之抗體可僅包含重鏈。抗體可僅僅來源於單一來源，或可為「嵌合的」，亦即如下文中進一步描述抗體之不同部分可來源於兩種不同抗體。抗原結合蛋白、抗體或結合片段可在融合瘤中藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶或化學裂解來產生。除非另外指示，否則術語「抗體」包括除包含兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈之抗體以外的其衍生物、變體、片段及突變蛋白，其實例描述於下文中。此外，除非明確排除，否則抗體分別包括單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、域抗體、合成抗體(有時在本文中稱為「抗體模擬物」)、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、抗體融合物(有時在本文中稱為「抗體共軛物」)及其片段。在一些實施例中，術語亦涵蓋肽體。
天然存在之抗體結構單元通常包含四聚體。各此類四聚體通常由兩對相同多肽鏈構成，各對具有一條全長「輕」鏈(在某些實施例中，約25 kDa)及一條全長「重」鏈(在某些實施例中，約50-70 kDa)。各鏈之胺基端部分通常包括通常負責抗原識別之具有約100至110個或更多個胺基酸之可變區。各鏈之羧基端部分通常界定可負責效應功能之恆定區。人類輕鏈通常分為κ輕鏈及λ輕鏈。重鏈通常分為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有包括(但不限於) IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之若干亞類。IgM具有包括(但不限於) IgM1及IgM2之亞類。IgA類似地細分為包括(但不限於) IgA1及IgA2之亞類。在全長輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區通常藉由具有約12個或更多個胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括具有約超過10個胺基酸之「D」區。參見例如Fundamental Immunology, 第7章 (Paul, W.編, 第2版 Raven Press, N.Y. (1989)) (出於所有目的以全文引用之方式併入本文中)。各輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體之輕鏈及/或重鏈之一部分，其通常包括重鏈中的大致120至130個胺基端胺基酸及輕鏈中的約100至110個胺基端胺基酸。在某些實施例中，不同抗體之可變區在胺基酸序列方面有很廣泛地差異，甚至在相同物種之抗體中。抗體之可變區通常決定特定抗體對其目標之特異性。
可變區通常展現由三個高變區(亦稱為互補決定區或CDR)接合之相對保守構架區(FR)之相同通用結構。來自各對之兩條鏈之CDR通常由構架區對準，其可實現與特異性抗原決定基結合。輕鏈及重鏈可變區之N端至C端通常均包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。胺基酸至各結構域之指配通常根據Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987與1991)), Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)或Chothia等人, Nature, 342:878-883 (1989)之定義。
在某些實施例中，在不存在抗體輕鏈之情況下，抗體重鏈與抗原結合。在某些實施例中，在不存在抗體重鏈之情況下，抗體輕鏈與抗原結合。在某些實施例中，在不存在抗體輕鏈之情況下，抗體結合區與抗原結合。在某些實施例中，在不存在抗體重鏈之情況下，抗體結合區與抗原結合。在某些實施例中，在不存在其他可變區之情況下，單個可變區與抗原特異性結合。
在某些實施例中，CDR之確定性描畫及包含抗體之結合位點之殘基的確認藉由求解抗體之結構及/或求解抗體-配位體複合物之結構來實現。在某些實施例中，其可藉由熟習此項技術者已知之各種技術中之任一者來實現，諸如X射線結晶法。在某些實施例中，可採用各種分析方法以鑑別或近似鑑別CDR區。此類方法之實例包括(但不限於) Kabat定義、Chothia定義、AbM定義及接觸定義(contact definition)。
Kabat定義為用於編號抗體中之殘基之標準且通常用以鑑別CDR區。參見例如Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28: 214-8 (2000)。Chothia定義類似於Kabat定義，但Chothia定義考量某些結構環區之位置。參見例如Chothia等人, J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986)；Chothia等人, Nature, 342: 877-83 (1989)。AbM定義使用藉由Oxford Molecular Group所產生之模擬抗體結構之電腦程式的整合套件。參見例如Martin等人, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272 (1989)；「AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies,」 Oxford, UK；Oxford Molecular, Ltd。AbM定義使用知識資料庫與全始算法(ab initio method)之組合模擬來自一級序列之抗體的三級結構，該等方法諸如藉由以下所描述之彼等：Samudrala等人，PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198 (1999)中之「Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach」。接觸定義係基於可用複合晶體結構之分析。參見例如MacCallum等人, J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996)。
按照慣例，重鏈中之CDR區通常稱為H1、H2及H3且在自胺基端至羧基端之方向上連續編號。輕鏈中之CDR區通常稱為L1、L2及L3且在自胺基端至羧基端之方向上連續編號。
術語「輕鏈」包括全長輕鏈及其具有足以賦予結合特異性之可變區序列之片段。全長輕鏈包括可變區域VL及恆定區域CL。輕鏈之可變區域在多肽之胺基端處。輕鏈包括κ鏈及λ鏈。
術語「重鏈」包括全長重鏈及其具有足以賦予結合特異性之可變區序列之片段。全長重鏈包括可變區域VH及三個恆定區域CH1、CH2及CH3。VH結構域位於多肽之胺基端，且CH結構域位於羧基端，其中CH3最接近多肽之羧基端。重鏈可為任何同型，包括IgG (包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型)、IgA (包括IgA1及IgA2亞型)、IgM及IgE。
雙特異性或雙功能抗體通常為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜交抗體。雙特異性抗體可藉由各種方法，包括(但不限於)融合瘤融合或連接Fab'片段來產生。參見例如Songsivilai等人, Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990)；Kostelny等人, J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)。
術語「抗原」係指能夠誘導適應性免疫反應之物質。特定言之，抗原為充當適應性免疫反應之受體的目標之物質。通常，抗原為與抗原特異性受體結合之分子，但無法藉由自身在體內誘導免疫反應。抗原通常為蛋白質及多糖，不常見的亦為脂質。適合之抗原包括(但不限於)細菌(包衣、膠囊、細胞壁、鞭毛、纖毛及毒素)、病毒及其他微生物之部分。抗原亦包括腫瘤抗原，例如，藉由腫瘤中之突變產生之抗原。如本文所使用，抗原亦包括免疫原及半抗原。
如本文所使用之「抗原結合蛋白」(「ABP」)意謂結合指定目標抗原之任何蛋白。在本申請案中，指定目標抗原為LILRB蛋白或其片段。「抗原結合蛋白」包括(但不限於)抗體及其抗原結合片段。肽體為抗原結合蛋白之另一實例。
如本文所使用之術語「抗原結合片段」係指能夠與抗原特異性結合之蛋白的一部分。在某些實施例中，抗原結合片段來源於包含一或多個CDR之抗體，或與抗原結合但不包含完整天然抗體結構之任何其他抗體片段。在某些實施例中，抗原結合片段不來源於抗體而實際上來源於受體。抗原結合片段之實例包括(但不限於)雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv片段、二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)、(dsFv)2 、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定之雙功能抗體(ds雙功能抗體)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(二價雙功能抗體)、多特異性抗體、單域抗體(sdAb)、駱駝抗體或奈米抗體、域抗體及二價域抗體。在某些實施例中，抗原結合片段能夠與親本抗體結合之相同抗原結合。在某些實施例中，抗原結合片段可包含一或多種來自特定人類抗體之CDR，該人類抗體經移植至一或多種不同人類抗體之構架區。在某些實施例中，抗原結合片段來源於受體且含有一或多個突變。在某些實施例中，抗原結合片段不結合衍生該抗原結合片段之受體的天然配位體。
「Fab片段」包含一條輕鏈及一條重鏈之CH1及可變區。Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。
「Fab'片段」包含一條輕鏈及一條重鏈之含有VH結構域及CH1結構域以及CH1與CH2結構域之間的區的一部分，使得在兩個Fab'片段之兩條重鏈之間可形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')2 分子。
「F(ab')2 片段」含有兩條輕鏈及兩條含有CH1與CH2結構域之間的一部分恆定區之重鏈，使得在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab')2 片段由藉由兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab'片段構成。
「Fc」區包含兩條重鏈片段，該等重鏈片段包含抗體之CH1及CH2結構域。兩個重鏈片段藉由兩個或多於兩個二硫鍵及CH3結構域之疏水性相互作用保持在一起。
「Fv區」包含來自重鏈與輕鏈兩者之可變區，但缺乏恆定區。
「單鏈抗體」為其中重鏈及輕鏈可變區已由可撓性連接子連接以形成單一多肽鏈的Fv分子，該單一多肽鏈形成抗原結合區。單鏈抗體詳細論述於國際專利申請公開案第WO 88/01649號及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
「域抗體」為僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區之免疫功能免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或多於兩個VH區與肽連接子共價接合以產生二價域抗體。二價域抗體之兩個VH區可以相同或不同抗原為目標。
「二價抗原結合蛋白」或「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原特異性。二價抗原結合蛋白及二價抗體可為雙特異性的，參見下文。在某些實施例中，除「多特異性」或「多功能性」抗體外之二價抗體通常應理解為其結合位點中之每一者相同。
「多特異性抗原結合蛋白」或「多特異性抗體」為靶向超過一種抗原或抗原決定基之抗原結合蛋白或抗體。
「雙特異性」、「雙重特異性」或「雙功能性」抗原結合蛋白或抗體分別為具有兩個不同抗原結合位點之雜交抗原結合蛋白或抗體。雙特異性抗原結合蛋白及抗體為多特異性抗原結合蛋白抗體物種且可藉由各種方法產生，該等方法包括(但不限於)融合瘤之融合或Fab'片段之連接。參見例如Songsivilai及Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321；Kostelny等人, 1992, J. Immunol. 148:1547-1553。雙特異性抗原結合蛋白或抗體之兩個結合位點將與兩個不同的抗原決定基結合，該兩個不同的抗原決定基可存在於相同或不同蛋白目標上。
「結合親和力」通常係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如，抗原)之間的全部非共價相互作用之強度。除非另外指示，否則如本文所使用，「結合親和力」係指反映結合對(例如，抗體與抗原)成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示。可藉由此項技術中已知之常見方法(包括本文所描述之方法)量測親和力。低親和力抗體一般緩慢結合抗原且傾向於容易分解，而高親和力抗體一般較快結合抗原且傾向於較長時間保持結合狀態。此項技術中已知多種量測結合親和力之方法，其中任一者可用於本發明之目的。用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例描述於下文中。
「與特定多肽或特定多肽上之抗原決定基特異性結合」或「對特定多肽或特定多肽上之抗原決定基具有特異性」之抗體為結合於特定多肽或特定多肽上之抗原決定基而實質上不結合於任何其他多肽或多肽抗原決定基的抗體。舉例而言，本發明之LILRB4特異性抗體特異於LILRB4。在一些實施例中，與LILRB4結合之抗體的解離常數(Kd)為≦100 nM、≦10 nM、≦1 nM、≦0.1 nM、≦0.01 nM或≦0.001 nM (例如，10- 8 M或更低；例如，自10- 8 M至10- 13 M；例如，自10- 9 M至10- 13 M)。
術語「競爭」當用於抗原結合蛋白(例如，抗體或其抗原結合片段)競爭相同的抗原決定基之情形時，意謂如藉由分析所測定之抗原結合蛋白之間的競爭，其中測試之抗原結合蛋白(例如，抗體或其抗原結合片段)阻止或抑制(例如，減少)參考抗原結合蛋白(例如，配位體或參考抗體)與普通抗原(例如，LILRB或其片段)之特異性結合。可使用許多類型之競爭性結合分析來確定一個抗原結合蛋白是否與另一抗原結合蛋白競爭，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心競爭分析(參見例如，Stahli等人, 1983, Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (參見例如，Kirkland等人, 1986, J. Immunol. 137:3614-3619)；固相直接標記分析、固相直接標記夾心分析(參見例如，Harlow及Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用1-125標記之固相直接標記RIA (參見例如，Morel等人, 1988, Molec. Immunol. 25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (參見例如，Cheung等人, 1990, Virology 176:546-552)；及直接標記之RIA (Moldenhauer等人, 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)。通常，此類分析涉及使用與攜帶未經標記之測試抗原結合蛋白及經標記之參考抗原結合蛋白之任一者的固體表面或細胞結合的經純化抗原。藉由測定在測試抗原結合蛋白存在下與固體表面或細胞結合之標記量來量測競爭性抑制。通常存在過量之測試抗原結合蛋白。由競爭分析識別之抗原結合蛋白(完全抗原結合蛋白)包括與參考抗原結合蛋白結合至同一抗原決定基的抗原結合蛋白及結合至與參考抗原結合蛋白所結合之抗原決定基足夠接近之相鄰抗原決定基而使得位阻存在的抗原結合蛋白。關於測定競爭結合之方法的其他細節提供於本文中之實例中。通常,當競爭抗原結合蛋白過量存在時，其將抑制(例如，減少)參考抗原結合蛋白與普通抗原之特異性結合至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更高。在一些情況下，結合經抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更高。
如本文所使用之術語「抗原決定基」係指抗體所結合之抗原上之特定原子或胺基酸群。抗原決定基可為線性抗原決定基或構形抗原決定基。線性抗原決定基藉由來自抗原之連續胺基酸序列形成且基於其一級結構與抗體相互作用。在另一方面，構形抗原決定基由抗原胺基酸序列之非連續部分構成且基於抗原之3D結構與抗體相互作用。一般而言，抗原決定基之長度大致為五個或六個胺基酸。若兩個抗體對某個抗原展現競爭性結合，則其可結合該抗原內之同一個抗原決定基。
如本文所使用，「細胞」可為原核或真核的。原核細胞包括例如細菌。真核細胞包括例如真菌、植物細胞及動物細胞。動物細胞之類型(例如，哺乳動物細胞或人類細胞)包括例如，來自循環/免疫系統或器官之細胞，例如，B細胞、T細胞(細胞毒性T細胞、自然殺手T細胞、調節T細胞、T輔助細胞)、自然殺手細胞、粒細胞(例如，嗜鹼性球粒細胞、嗜伊紅血球粒細胞、嗜中性白血球粒細胞及多分葉核嗜中性白血球)、單核球或巨噬細胞、紅血球(例如，網狀紅血球)、肥大細胞、凝血細胞或巨核細胞及樹突狀細胞；來自內分泌系統或器官之細胞，例如，甲狀腺細胞(例如，甲狀腺上皮細胞、濾泡旁細胞)、副甲狀腺細胞(例如，副甲狀腺主細胞、嗜酸性細胞)、腎上腺細胞(例如，嗜鉻細胞)及松果體細胞(例如，松果腺細胞)；來自神經系統或器官之細胞，例如，神經膠質細胞(例如，星形膠質細胞及寡樹突神經膠質細胞)、微神經膠質細胞、大細胞神經分泌細胞、星狀細胞、貝契爾(boettcher)細胞及垂體細胞(例如，促性腺激素(gonadotrope)、促腎上腺皮質激素(corticotrope)、促甲狀腺激素(thyrotrope)、促生長激素(somatotrope)及催乳激素(lactotroph))；來自呼吸系統或器官之細胞，例如，肺胞壁細胞(I型肺胞壁細胞及II型肺胞壁細胞)、克拉拉(clara)細胞、杯狀細胞及肺泡巨噬細胞；來自循環系統或器官之細胞(例如，心肌細胞及外被細胞)；來自消化系統或器官之細胞，例如，胃主細胞、壁細胞、杯狀細胞、潘勒斯(paneth)細胞、G細胞、D細胞、ECL細胞、I細胞、K細胞、S細胞、腸內分泌細胞、腸親鉻細胞、APUD細胞及肝細胞(例如，肝細胞及庫普弗(Kupffer)細胞)；來自表皮系統或器官之細胞，例如，骨骼細胞(例如，成骨細胞、骨細胞及破骨細胞)、牙齒細胞(例如，成堊質細胞及成釉細胞)、軟骨細胞(例如，軟骨胚細胞及軟骨細胞)、皮膚/毛髮細胞(例如，毛細胞、角質細胞及黑色素細胞(斑痣細胞(Nevus cell)))、肌肉細胞(例如肌細胞)、脂肪細胞、纖維母細胞及肌腱細胞；來自泌尿系統或器官之細胞(例如，足細胞、近腎小球細胞、腎小球內系膜細胞、腎小球外膜細胞、腎近端小管刷狀緣細胞及緻密斑細胞)；及來自生殖系統或器官之細胞(例如精子、塞特利氏(Sertoli)細胞、雷迪格(leydig)細胞、卵細胞、卵母細胞)。細胞可為正常健康的細胞；或病變或不健康的細胞(例如癌細胞)。細胞進一步包括哺乳受精卵或幹細胞，該幹細胞包括胚胎幹細胞、胎兒幹細胞、誘導性多能幹細胞及成體幹細胞。幹細胞為能夠經歷細胞分裂週期，同時保持未分化狀態且分化成特定細胞類型之細胞。幹細胞可為全能幹細胞、多能幹細胞、多潛能幹細胞、寡能幹細胞及單能幹細胞，其中之任一者可由體細胞誘導。幹細胞亦可包括癌症幹細胞。哺乳動物細胞可為嚙齒動物細胞，例如，小鼠細胞、大鼠細胞、倉鼠細胞。哺乳動物細胞可為兔類細胞，例如，家兔細胞。哺乳動物細胞亦可為靈長類動物細胞，例如，人類細胞。
如本文所使用之術語「嵌合抗原受體」或「CAR」係指人工構築之雜交蛋白或多肽，其含有連接至活化免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)之結構域或信號傳導(例如，T細胞信號傳導或T細胞活化結構域)之抗體(例如，單鏈可變片段(scFv))之抗原結合域(參見例如，前述Kershaw等人, Eshhar等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993), 及Sadelain等人, Curr. Opin. Immunol. 21(2): 215-223 (2009))。CAR能夠利用單株抗體之抗原結合特性以非MHC限制性方式將免疫細胞特異性及反應性重定向至所選擇之目標。非MHC限制性抗原識別賦予表現CAR之免疫細胞不依賴抗原加工識別抗原之能力，從而繞過主要的腫瘤逃逸機制。另外，當在T細胞中表現時，CAR不宜與內源性T細胞受體(TCR) α及β鏈二聚合。
如本文所使用，關於指定組分「基本上無」在本文中用於意謂指定組分中無一者有目的地調配入組合物中及/或僅作為污染物或以痕量存在。因此，由組合物之任何非預期污染產生的指定組分總量遠低於0.05%，較佳低於0.01%。最佳為其中指定組分之量不可用標準分析方法偵測到之組合物。
術語「宿主細胞」意謂已用或能夠用核酸序列轉化且藉此表現相關基因之細胞。術語包括親本細胞之子代，而不管子代在形態或遺傳構成方面是否與原始親本細胞一致，只要存在相關基因即可。
術語「一致性」係指兩種或超過兩種多肽分子或兩種或超過兩種核酸分子之序列之間的關係，如藉由比對及比較該等序列所測定。「一致性百分比」意謂所比較分子中之胺基酸或核苷酸之間的相同殘基之百分比，且係基於所比較分子中最小之尺寸來計算。對於此等計算，較佳地藉由特定數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)來處理比對中之空隙(若存在)。可用於計算所比對核酸或多肽之一致性的方法包括以下文獻中所描述之方法：Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M.編), 1988, New York: Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith,D.W.編), 1993, New York: Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data, 第I部分, (Griffin, A.M.及Griffin, H.G.編), 1994, New Jersey: Humana Press；von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press；Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M.及Devereux, J.編), 1991, New York: M. Stockton Press；及Carillo等人, 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073。
在計算一致性百分比時，通常以在序列之間得到最大匹配之方式比對所比較之序列。可用於測定一致性百分比之電腦程式之一個實例為GCG程式包，其包括GAP (Devereux等人, (1984) Nucl. Acid Res. 12:387；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)。使用電腦演算法GAP來比對待測定序列一致性百分比之兩個多肽或聚核苷酸。比對序列以獲得其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配跨度」，如由演算法所測定)。空隙開放罰分(gap opening penalty) (其係按3×平均對角線計算，其中「平均對角線」為所用比較矩陣之對角線的平均值；「對角線」為由特定比較矩陣分配給各完美胺基酸匹配之得分或數值)及空隙擴展罰分(gap extension penalty) (其通常為1/10倍空隙開放罰分)以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)與演算法結合使用。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(對於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352；對於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919)。
可用於使用GAP程式確定多肽或核苷酸序列之一致性百分比的參數實例可見於Needleman等人, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453中。
用於比對兩個胺基酸序列之某些比對方案可產生兩個序列之僅較短區域的匹配，且此較小比對區可具有極高序列一致性，即使兩個全長序列之間不存在顯著關係。因此，若有此需要，則可調整所選擇之比對方法(GAP程式)以產生跨越目標多肽之至少50個或其他數目的連續胺基酸之比對。
如本文所使用之術語「連接」係指經由分子內相互作用(例如，共價鍵、金屬鍵及/或離子鍵)或分子間相互作用(例如，氫鍵或非共價鍵)之締合。
白血球免疫球蛋白樣受體亞科B成員4 (LILRB4)為人類中由LILRB4 基因編碼之蛋白。此基因為白血球免疫球蛋白樣受體(LIR)科之成員，其發現於染色體區19q13.4之基因叢中。所編碼蛋白質屬於LIR受體之亞科B綱，其含有兩個或四個胞外免疫球蛋白域、跨膜域及兩個至四個基於細胞質免疫受體酪胺酸之抑制性基元(ITIM)。受體在免疫細胞上表現，其中其與抗原呈遞細胞上之I類MHC分子結合且轉導抑制免疫反應刺激之負信號。受體亦可在抗原捕獲及呈遞中起作用。認為控制發炎反應及細胞毒性有助於集中免疫反應且限制自身反應性。LILRB4亦在人類胃癌細胞中表現且可促進腫瘤生長。已發現此基因之多種編碼不同同功異型物之轉錄變體。LILRB4已展示與PTPN6相互作用。
術語「可操作地連接」係指元件之排列，其中如此描述之組件經組態以便執行其常見功能。因此，與多肽可操作地連接之給定信號肽引導多肽自細胞分泌。在啟動子之情況下，與編碼序列可操作地連接之啟動子將指導編碼序列之表現。啟動子或其他控制元件不需要與編碼序列相鄰，只要其對指導其表現起作用。舉例而言，介入未轉譯但經轉錄序列可存在於啟動子序列與編碼序列之間且啟動子序列仍可視為與編碼序列「可操作地連接」。
儘管本發明支持僅指代替代物及「及/或」之定義，但除非明確指示為僅指代替代物或替代物相互排斥，否則術語「或」在申請專利範圍中之使用用於意謂「及/或」。如本文所使用，「另一」可意謂至少第二個或更多個。
術語「聚核苷酸」或「核酸」包括單股及雙股核苷酸聚合物兩者。包含聚核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型之核苷酸之經修飾形式。該等修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，諸如2',3'-二去氧核糖；及核苷酸間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯及磷醯胺酸酯。
術語「多肽」或「蛋白質」意謂具有天然蛋白質胺基酸序列之大分子，亦即，由天然存在且非重組細胞產生之蛋白質；或其由經基因工程改造或重組細胞產生，且包含具有天然蛋白質胺基酸序列之分子，或具有天然序列之一或多個胺基酸之缺失、添加及/或取代的分子。術語亦包括胺基酸聚合物及聚合物，其中一或多個胺基酸為對應天然存在之胺基酸之化學類似物。術語「多肽」及「蛋白質」具體涵蓋LILRB抗原結合蛋白、抗體或具有抗原結合蛋白之一或多個胺基酸之缺失、添加及/或取代的序列。術語「多肽片段」係指與全長天然蛋白質相比具有胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失之多肽。與天然蛋白質相比，此類片段亦可含有經修飾胺基酸。在某些實施例中，片段為約五至500個胺基酸長。舉例而言，片段可為至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸長。適用的多肽片段包括抗體之免疫功能性片段，包括結合域。在LILRB結合抗體之情況下，適用的片段包括(但不限於)CDR區、重鏈及/或輕鏈之可變域、抗體鏈之一部分或剛好其包括兩個CDR之可變區，及類似者。
用於本發明之醫藥學上可接受之載劑為習知的。Remington's Pharmaceutical Sciences，由E.W. Martin, Mack聯合出版，Easton, PA, 第15版(1975)，描述適合於本文所揭示之融合蛋白之醫藥遞送的組合物及調配物。一般而言，載劑之性質將視採用之特定投與模式而定。舉例而言，非經腸調配物通常包含包括醫藥學上及生理學上可接受之流體的可注射流體，諸如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油或其類似物作為媒劑。對於固體組合物(例如粉末、丸劑、錠劑或膠囊形式)，習知無毒固體載劑可包括例如醫藥級之甘露醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。除生物學中性載劑以外，待投與之醫藥組合物可含有少量無毒輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑及pH緩衝劑及類似者，例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯。
如本文所使用，術語「個體」係指人類或任何非人類動物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物)。人類包括產前及產後形式。在許多實施例中，個體為人類。個體可為患者，其係指呈遞給醫療提供者以診斷或治療疾病之人類。術語「個體(subject)」在本文中與「個體(individual)」或「患者」可互換地使用。個體可罹患或易患疾病或病症但可能會或可能不會顯示該疾病或病症之症狀。
如本文所使用之術語「治療有效量」或「有效劑量」係指可有效治療疾病或病況之劑量或藥物濃度。舉例而言，關於本文所揭示之單株抗體或其抗原結合片段對治療癌症之用途，治療有效量為能夠減少腫瘤體積、根除全部或部分腫瘤、抑制或減緩腫瘤生長或癌細胞浸潤至其他器官中、抑制介導癌性病況之細胞的生長或增殖、抑制或減緩腫瘤細胞癌轉移、改善與腫瘤或癌性病況相關之任何症狀或標記、預防或延緩腫瘤或癌性病況之發展或其某一組合之單株抗體或其抗原結合片段的劑量或濃度。
如本文所使用之病況之「治療(Treating或treatment)」包括預防或減輕病況、減緩病況發展之發作或速率、降低出現病況之風險、預防或延緩與病況相關之症狀的發展、減少或終止與病況相關之症狀、產生病況之完全或部分消退、治癒病況或其某一組合。
如本文所使用，「載體」係指引入至宿主細胞中，藉此產生經轉化宿主細胞之核酸分子。載體可包括准許其在宿主細胞中複製之核酸序列，諸如複製起點。載體亦可包括一或多個治療性基因及/或可選標記基因及此項技術中已知的其他遺傳元件。載體可轉導、轉化或感染細胞，藉此使細胞表現除細胞天然之核酸及/或蛋白質外的核酸及/或蛋白質。載體視情況包括有助於實現核酸進入至細胞中之材料，諸如病毒顆粒、脂質體、蛋白質包衣或類似者。 II.      癌症A. 癌症
雖然過度增殖性疾病可與任何導致細胞開始不受控制地再生之疾病相關，但原型實例為癌症。癌症之關鍵要素中之一者為細胞的正常凋亡週期經中斷且因此中斷細胞生長之藥劑作為治療此等疾病之治療劑係重要的。在本發明中，本文所描述之特吡萊辛(tubulysin)類似物可用於引起細胞計數減少且因此可潛在地用於治療各種類型之癌症株。在一些態樣中，預期本文所描述之特吡萊辛類似物可用於治療幾乎任何惡性腫瘤。此處，唯一要求係在癌細胞之表面上，且尤其在癌症幹細胞之表面上存在LILRB。
可根據本發明治療之癌細胞包括(但不限於)來自以下之細胞：膀胱、血液、骨骼、骨髓、大腦、乳房、結腸、食道、腸胃、齒齦、頭、腎臟、肝臟、肺、鼻咽、頸、卵巢、前列腺、皮膚、胃、胰臟、睪丸、舌、子宮頸或子宮。另外，癌症可特定地具有以下組織學類型，儘管其不限於此等：贅瘤，惡性；癌瘤；癌瘤，未分化；巨細胞及梭狀細胞癌；小細胞癌；乳頭狀癌；鱗狀細胞癌；淋巴上皮癌；基底細胞癌；毛母質癌；移行細胞癌；乳頭狀移行細胞癌；腺癌；胃泌素瘤，惡性；膽管癌；肝細胞癌；組合肝細胞癌及膽管癌；小樑腺癌；腺樣囊性癌症；腺瘤息肉中之腺癌；腺癌，家族性結腸多發性息肉；實體癌；類癌，惡性；細支氣管肺泡腺癌；乳頭狀腺癌；嫌色細胞癌；嗜酸性癌；嗜氧性腺癌；嗜鹼性癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾泡腺癌；乳頭狀及濾泡腺癌；無包膜硬化性癌；腎上腺皮質癌；子宮內膜樣癌；皮膚附屬器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺腺癌；耵聹腺癌；黏液表皮樣癌；囊腺癌；乳頭狀囊腺癌；乳頭狀漿液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；戒環細胞癌；浸潤性導管癌；髓性癌；小葉癌；炎性癌；佩吉特氏病(Paget's disease)，乳房；腺泡細胞癌；腺鱗癌；腺癌w/鱗狀化生；胸腺瘤，惡性；卵巢間質腫瘤，惡性；泡膜細胞瘤，惡性；粒層細胞腫瘤，惡性；睾丸母細胞瘤，惡性；塞特利氏細胞癌(sertoli cell carcinoma)；雷迪格細胞腫瘤(Leydig cell tumor)，惡性；脂質細胞腫瘤，惡性；副神經節瘤，惡性；乳房外副神經節瘤，惡性；嗜鉻細胞瘤；血管球肉瘤；惡性黑素瘤；無黑色素性黑素瘤；淺表擴散性黑素瘤；巨大色素斑痣內惡性黑素瘤；上皮狀細胞黑素瘤；藍色斑痣，惡性；肉瘤；纖維肉瘤；纖維組織細胞瘤，惡性；黏液肉瘤；脂肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎性橫紋肌肉瘤；肺泡橫紋肌肉瘤；間質肉瘤；混合腫瘤，惡性；苗勒氏管(Mullerian)混合腫瘤；腎母細胞瘤；肝母細胞瘤；癌肉瘤；間質瘤，惡性；布倫納氏瘤(Brenner tumor)，惡性；葉狀腫瘤，惡性；滑膜肉瘤；間皮瘤，惡性；無性細胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，惡性；卵巢甲狀腺瘤，惡性；絨毛膜癌；中腎瘤，惡性；血管肉瘤；血管內皮瘤，惡性；卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)；血管外皮瘤，惡性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮質旁骨肉瘤；軟骨肉瘤；軟骨母細胞瘤，惡性；間葉細胞軟骨肉瘤；骨巨細胞瘤；尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)；牙源性腫瘤，惡性；成釉細胞牙肉瘤；成釉細胞瘤，惡性；成釉細胞纖維肉瘤；松果體瘤，惡性；脊索瘤；神經膠質瘤，惡性；室管膜瘤；星形細胞瘤；原生質星形細胞瘤；肌原纖維性星形細胞瘤；星形母細胞瘤；神經膠母細胞瘤；寡樹突神經膠質瘤；成少突神經膠質細胞瘤；原始神經外胚層瘤；小腦肉瘤；成神經節細胞瘤；神經母細胞瘤；視網膜母細胞瘤；嗅神經性腫瘤；脊膜瘤，惡性；神經纖維肉瘤；神經鞘瘤，惡性；顆粒細胞腫瘤，惡性；惡性淋巴瘤；霍奇金氏病(Hodgkin's disease)；類肉芽腫；惡性淋巴瘤，小淋巴細胞性；惡性淋巴瘤，大細胞，彌散性；惡性淋巴瘤，濾泡性；蕈樣黴菌病；其他指定之非霍奇金氏淋巴瘤；惡性組織細胞增多病；多發性骨髓瘤；肥大細胞肉瘤；免疫增殖性小腸疾病；白血病；淋巴白血病；漿細胞白血病；紅白血病；淋巴肉瘤細胞白血病；骨髓白血病；嗜鹼性白血病；嗜伊紅血球性白血病；單核球性白血病；肥大細胞白血病；巨核母細胞白血病；骨髓性肉瘤；及毛細胞白血病。在某些態樣中，腫瘤可包含骨肉瘤、血管肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤文氏肉瘤、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤或白血病。B. 急性骨髓性白血病
急性骨髓性白血病(AML)，亦稱為急性骨髓白血病或急性非淋巴球性白血病(ANLL)，為一種骨髓系血細胞之癌症，其特徵為異常白血球之迅速生長，該白血球在骨髓中積累且干擾正常血細胞之產生。AML為最常見之影響成年人的急性白血病，且其發病率隨年齡而增加。在美國，儘管AML為相對罕見的疾病，但其佔癌症死亡之大致1.2%，其發病率預期會隨群體年齡而增加。
AML之症狀為由白血病細胞替代正常骨髓引起的，其導致紅血球、血小板及正常白血球之下降。此等症狀包括疲乏、呼吸短促、容易瘀傷及出血，及感染風險升高。已確認若干危險因素及染色體異常，但具體原因尚不清楚。作為急性白血病，AML進展迅速，且若未加治療，則通常在數週或數月內致命。
AML具有若干亞型；治療及預後在亞型中變化。五年存活率在15-70%內變化，且復發率在33-78%內變化，其取決於亞型。AML最初用旨在誘導緩解之化學療法治療；患者可繼續接受額外的化學療法或造血幹細胞移植。最近對AML遺傳學之研究已產生可預測何種藥物對特定患者可起最佳作用，以及患者可能存活多久之測試可用性。
AML之大部分體徵及症狀由白血病細胞替代正常血細胞引起的。缺乏正常之白血球生成使患者易遭受感染；雖然白血病細胞本身來源於白血球前驅體，但其沒有抗感染能力。紅血球計數下降(貧血)可導致疲乏、蒼白及呼吸短促。血小板之缺乏可導致輕微外傷後容易擦傷或出血。
AML之早期體徵通常為模糊的及非特異性的，且可與流感或其他常見疾病之體徵類似。一些一般性症狀包括發熱、疲乏、體重減輕或食慾不振、呼吸短促、貧血、容易擦傷或出血、瘀斑(出血引起之皮膚下扁平的大頭針大小之斑點)、骨骼及關節痛及持續或頻繁感染。
AML中可出現脾增大，但其通常為輕微及無症狀的。與急性淋巴母細胞白血病相比，AML中之淋巴結腫脹為罕見的。皮膚約10%之時間為以白血病皮膚之形式參與。AML可很少出現斯威特氏症候群(Sweet's syndrome)，一種皮膚之副腫瘤炎症。
由於白血病細胞浸潤至齒齦組織中，一些患有AML之患者可遭受齒齦之腫脹。罕見地，白血病之第一體徵可為骨髓外之實體白血病腫塊或腫瘤之發展，稱為綠色瘤。偶爾，一個人可未展示症狀且白血病可在常規血液檢測期間偶然地發現。
已確認多種發展AML之危險因素，其包括：其他血液病症、化學暴露、電離輻射及遺傳。
諸如骨髓發育不良症候群或骨髓增生性疾病之「白血病前期」血液病症可演變成AML；準確的風險取決於MDS/MPS之類型。暴露於抗癌化學療法，特定言之烷基化劑，可增加隨後發展AML之風險。化學療法後約三至五年之風險為最高。其他化學療法劑，特定言之表鬼臼毒素及蒽環黴素，亦與治療相關之白血病相關。此等治療相關之白血病通常與白血病細胞中之特異性染色體異常相關。職業性化學暴露苯及其他芳族有機溶劑作為AML之病因係有爭議的。苯及其許多衍生物在活體外已知為致癌的。雖然一些研究已表明職業性暴露於苯與AML之風險增加之間的關聯，但其他研究已表明可歸因風險(若存在)為輕微的。大量電離輻射暴露可增加AML之風險。AML似乎存在遺傳風險。已報導多個AML案例在家庭中之發展速率高於僅偶然之預測。若干先天性病況可增加白血病之風險；最常見的可能為唐氏症候群(Down syndrome)，其與AML之風險增加10至18倍相關。
AML診斷之第一條線索通常為全血球計數之異常結果。雖然異常白血球過多(白血球增多症)為常見的結果，且有時發現白血病母細胞，但AML亦可出現血小板、紅血球之單獨減少，或甚至低白血球計數(白血球減少症)。雖然AML之假定診斷可經由存在循環白血病母細胞時之外周血液塗片之檢查進行，但決定性診斷通常需要充分的骨髓抽吸及活組織檢查。
經由光學顯微術以及流式細胞量測術檢查骨髓或血液以診斷白血病之存在，區分AML與其他類型之白血病(例如急性淋巴母細胞白血病-ALL)，且分類疾病之亞型(參見下文)。骨髓或血液樣品通常亦藉由常規細胞遺傳學或螢光原位雜交來檢測染色體異常。亦可進行基因研究以尋找基因中之特異性突變，諸如FMS樣酪胺酸激酶3 (FLT3)、核仁磷酸蛋白(nucleophosmin)及KIT，其可影響疾病之結果。
血液及骨髓塗片上之細胞化學染色有助於AML與ALL之區別，且有助於AML之子分類。骨髓過氧化酶或蘇丹黑染色及非特異性酯酶染色之組合將提供大多數情況所需之資訊。骨髓過氧化酶或蘇丹黑反應最適用於確立AML之身分及將其與ALL區分。非特異性酯酶染色係用於鑑別AML中之單核球組分及區分分化不良之單核母細胞性白血病與ALL。
AML之診斷及分類可挑戰且應由合格之血液病理學家或血液學家進行。在簡單案例中，某些形態學特徵(諸如奧爾氏(Auer)棒)或特定流式細胞量測術結果之存在可區分AML與其他白血病；然而，在此類特徵不存在下，診斷可能較困難。
根據廣泛使用之WHO準則，AML之診斷係由證實超過20%之血液及/或骨髓包含白血病骨髓母細胞而確定。法國-美國-英國(FAB)分類較嚴格，要求骨髓(BM)或外周血液(PB)中至少30%之母細胞百分比用於AML之診斷。AML必須小心地與諸如骨髓發育不良或骨髓增生性症候群之「白血病前期」病況區分，彼等之治療不同。
因為急性前髓細胞性白血病(APL)具有最高可治癒性且需要獨特的治療形式，所以快速確定或排除此白血病亞型之診斷為重要的。對血液或骨髓進行螢光原位雜交常用於此目的，因為其容易識別表徵APL之染色體易位[t(15;17)(q22;q12);]。亦需要以分子形式偵測PML/RARA融合蛋白質之存在，其為易位之致癌產物。
AML之一線治療主要由化學療法組成且分成兩個階段：誘導及緩解後(或鞏固)療法。誘導療法之目標為藉由將白血病細胞之數目減少至不可偵測水準來實現完全緩解；鞏固療法之目標為消除任何殘留之不可偵測疾病且實現治癒。若誘導化學療法失敗或患者復發後，則通常考慮造血幹細胞移植，但移植有時亦用作患有高風險疾病之患者的一線療法。
除M3外之所有FAB亞型通常給出用阿糖胞苷(ara-C)及蒽環黴素(最常為道諾黴素)之誘導化學療法。此誘導化學療法方案經稱為「7+3」(或「3+7」)，因為阿糖胞苷連續七日作為連續IV輸注給藥，而蒽環黴素連續三日作為IV推注給藥。至多70%之患者將藉由此方案實現緩解。亦可使用其他替代誘導方案，包括單獨高劑量阿糖胞苷、FLAG樣方案或研究性藥劑。由於療法之毒性作用(包括骨髓抑制及感染風險之增加)，誘導化學療法可不提供給非常老的人，且選項可包括強度較小之化學療法或緩解性照護。
AML之M3亞型，亦稱為急性前髓細胞性白血病(APL)，除誘導化學療法(通常為蒽環黴素)以外，幾乎普遍地用藥物全反式視黃酸(ATRA)治療。必須進行照護以預防彌散性血管內凝血(DIC)，當前骨髓細胞釋放其顆粒之內含物至外周循環時，使APL之治療複雜化。APL為極其可治癒的，具有充分證明之治療方案。
誘導階段之目標應實現完全緩解。完全緩解不意謂疾病已治癒；相反，其表示沒有可用的診斷方法可偵測到疾病。約50%-75%之新診斷成人獲得完全緩解，儘管此可基於上述之預後因子而變化。緩解之時長取決於初始白血病之預後特徵。一般而言，沒有額外的鞏固療法，所有緩解將失敗。
即使在實現完全緩解後，白血病細胞之數目可能仍太小而無法用當前診斷技術來偵測。若不給出進一步緩解後或鞏固療法，則幾乎所有患者將最終復發。因此，需要更多療法以消除不可偵測疾病且防止復發-亦即，實現治癒。
特定類型之緩解後療法基於患者之預後因子(參見上文)及一般健康進行個體化。對於預後良好之白血病(亦即，inv(16)、t(8;21)及t(15;17))，患者將通常進行額外的三至五個療程之強化化學療法，經稱為鞏固化學療法。對於復發風險高之患者(例如，具有高風險細胞遺傳學、潛在MDS或療法相關之AML的患者)，若患者能夠耐受移植且具有適合之供體，則通常建議異源幹細胞移植。中危AML (正常細胞遺傳學或不屬於良好風險或高風險群組之細胞遺傳學變化)之最佳緩解後療法為不太明晰的且取決於具體情況，包括患者之年齡及總體健康、患者之個人價值及適合之幹細胞供體是否為可用的。
對於不適合幹細胞移植之患者，在鞏固完成之後用組胺二鹽酸鹽(Ceplene)及介白素2 (Proleukin)之組合進行免疫療法，已展示絕對復發風險降低14%，變換為維持緩解之可能性增加50%。
對於復發AML之患者，唯一經證實之潛在治癒療法為造血幹細胞移植，若患者尚未進行。在2000年，單株抗體連接之細胞毒性劑吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin) (Mylotarg)在美國批准用於年齡大於60歲患有復發AML之患者，該等患者不為高劑量化學療法之候選者。此藥物於2010年由其製造商Pfizer自願退出市場。由於復發AML之治療選項非常有限，因此可提供緩解性照護。
不適合幹細胞移植或幹細胞移植後已復發之復發AML患者可在臨床試驗中提供治療，因為習知治療選項有限。所研究的藥劑包括細胞毒性藥物，諸如氯法拉濱(clofarabine)，以及靶向療法，諸如法呢基轉移酶抑制劑、地西他濱(decitabine)及多藥物耐性蛋白(multidrug-resistance protein，MDR1)之抑制劑。對於復發之急性前髓細胞性白血病(APL)，三氧化二砷已在試驗中測試且經美國FDA批准。如ATRA，三氧化二砷對其他亞型之AML不起作用。
雖然急性骨髓性白血病為可治癒疾病，但特定患者治癒之機會取決於多種預後因子。AML中唯一最重要的預後因子為細胞遺傳學或白血病細胞之染色體結構。某些細胞遺傳學異常與極佳結果相關(例如，急性前髓細胞性白血病中之(15:17)易位)。約一半之AML患者具有「正常」細胞遺傳學；其屬於中危群組。已知多種其他細胞遺傳學異常與治療後之不良預後及高復發風險有關。
由預先存在之骨髓發育不良症候群(MDS)或骨髓增生性疾病(所謂的繼發性AML)引起之AML具有更差的預後，因為在針對另一前述惡性腫瘤之化學療法後引起之治療相關AML亦如此。此等實體皆與高比率之不利細胞遺傳學異常相關。
在一些研究中，年齡＞60歲及乳酸脫氫酶含量升高亦與不良結果相關。如同大部分癌症形式，機能狀態(亦即，患者之一般身體狀況及活動性水準)對預後同樣起重要作用。
FLT3 內部串聯複製(ITD)已展示在AML中賦予不良預後。用更積極的療法治療此等患者，諸如第一次緩解中之幹細胞移植，尚未展示提高長期存活率。FLT3之ITD可與白血球淤滯相關。2012年，FLT3抑制劑喹雜替尼(quizartinib)在具有FLT3-ITD突變之AML患者中展示第II階段陽性試驗結果。2017年，由FDA批准FLT3抑制劑Rydapt® (米哚妥林(midostaurin)，以前為PKC412)用於治療新診斷的FLT3突變陽性(FLT3+)之AML患者，如由FDA批准之測試結合化學療法所偵測。
研究人員正研究AML中c-KIT 突變之臨床意義。由於酪胺酸激酶抑制劑(諸如伊馬替尼(imatinib)及舒尼替尼(sunitinib))可在藥理學上阻斷c-KIT 之活性的可用性，因此此等為普遍的且臨床上相關。其他經研究作為預後因子或治療目標之基因包括CEBPA 、BAALC 、ERG 及NPM1 。B. 慢性骨髓單核細胞性白血病 (CMML)
CMML為具有骨髓增生性贅瘤及骨髓發育不良症候群兩者之臨床及病理特徵之惡性造血幹細胞病症。患者可出現由先前未辨識之細胞減少症(例如，感染、疲乏、呼吸困難、瘀斑、出血)、皮膚病變或脾腫大相關之症狀(例如，早期飽腹感、腹部飽脹)導致之症狀或併發症。CMML之特徵在於外周血液單核細胞增多症伴隨骨髓發育不良。在美國，每年診斷大致2,000例新的CMML病例。15至30%之病例進展為AML出現(Swerdlow等人, 2017)，且在WHO預後亞組中在初始診斷後的10至48個月範圍內之中等存活率令人沮喪。僅HSCT在臨床上顯著的改善CMML患者之疾病，包括細胞減滅及低甲基化劑之其他療法提供症狀緩解(Schuler等人, 2014)。因此，迫切需要新的療法以降低CMML患者之罹病率且延長存活期。C. 急性淋巴母細胞白血病 (ALL)
急性淋巴母細胞白血病(ALL)或急性淋巴白血病為白血病或白血球癌之急性形式，其特徵在於癌性未成熟白血球(稱為淋巴母細胞)之過度產生。在患有ALL之個人中，淋巴母細胞在骨髓中過度產生且不斷倍增，藉由抑制骨髓中正常細胞(諸如紅血球及白血球及血小板)之生成且藉由浸潤至其他器官而造成損傷及死亡。ALL在兒童期為最常見，其中峰值發病率在2-5歲，且另一峰值在老年時。
ALL之症狀指示功能性血細胞之產生減少，因為白血病浪費骨髓之資源，該骨髓通常用於產生新的功能性血細胞。此等症狀可包括發熱、感染風險之增加(尤其如肺炎之細菌感染，由於嗜中性白血球減少症；此種感染之症狀包括呼吸短促、胸部疼痛、咳嗽、嘔吐、腸道或膀胱習性變化)、出血傾向增加(由於血小板減少)及指示貧血之體徵，包括蒼白、心搏過速(高心跳速率)、疲乏及頭痛。
美國每年報導約6,000例病例；難以獲得自其他國家之統計資料，儘管已知在美國、意大利及哥斯達黎加更常見。治癒為現實目標且在超過80%之經感染兒童中實現，但僅20-40%之成人可治癒。「急性」係指將該疾病與慢性淋巴球性白血病區分之相對較短之時程，該慢性淋巴球性白血病具有多年之潛在時程。
症狀對ALL不具特異性但惡化至尋求醫療幫助之程度。其由缺乏正常及健康的血細胞所造成，因為其藉由惡性及未成熟白血球(白血球)擠出。因此，患有ALL之人經歷其紅細胞(紅血球)、白血球、血小板之功能障礙之症狀。可展示異常之實驗室測試包括血球計數測試、腎功能測試、電解質測試及肝酶測試。
ALL之體徵及症狀為可變的，但源自骨髓置換及/或器官浸潤，且包括全身性無力及疲乏、貧血、眩暈、頻繁或不可解釋的發熱及感染、體重減輕及/或食慾不振、過度及不可解釋的擦傷、骨痛、關節痛(由「母細胞」細胞擴散至骨骼表面或骨髓腔之關節中引起)、呼吸困難、淋巴結、肝及/或脾增大、下肢及/或腹部之指壓性水腫(腫脹)及瘀斑，其由於低血小板含量在皮膚中為微小紅色斑點或紋路。
一般而言，癌症藉由導致不受控之細胞生長且擴散至全身之DNA損傷，抑或藉由增加引起生長之化學信號或藉由中斷控制生長之化學信號引起。損傷可經由融合基因之形成，以及原癌基因經由其與另一基因(例如，T細胞受體基因)之啟動子併接之失調來引起。此損傷可由諸如化學物質、藥物或輻射之環境因素引起，且在有絲分裂或其他正常過程期間自然發生(儘管細胞具有多種有助於減少此損傷之DNA修復機制)。
ALL與動物及人類中暴露輻射及化學物質相關。如對廣島及長崎原子彈爆炸之生還者的研究發現，高水準輻射暴露為罹患白血病之已知風險因素。在動物中，暴露於苯及其他化學物質可導致白血病。流行病學研究已將白血病與工作場所暴露於化學物質相關聯，但此等研究不作為結論性的。一些證據表明在用輻射及化學療法治療其他癌症之個體中，繼發性白血病可由於該治療而發展。
診斷ALL開始於病史、身體檢查、全血球計數及血液塗片。因為症狀如此普遍，所以必須排除具有類似症狀之許多其他疾病。通常，白血球計數越高，預後越差。在大多數情況下，在血液塗片上發現母細胞(母細胞為所有免疫細胞株之前驅體(幹細胞))。骨髓活組織檢查為ALL之結論性證據。腰椎穿刺(亦稱為脊椎穿刺)將指示脊柱及大腦是否已經侵襲。
病理學檢查、細胞遺傳學(特定言之費城染色體之存在)及免疫表型確定骨髓母細胞(嗜中性白血球、嗜伊紅血球或嗜鹼性球)或淋巴母細胞(B淋巴細胞或T淋巴細胞)細胞是否為該問題。RNA測試可確定疾病之侵襲性程度；不同突變已與較短或較長存活期相關。免疫組織化學測試可揭示白血病細胞之表面上的TdT或CALLA抗原。TdT為在前T細胞及前B細胞之發育早期表現之蛋白質，而CALLA為在80%之ALL病例中以及CML之「母細胞危象」中發現之抗原。醫學成像(諸如超音波或CT掃描)可發現其他器官之侵襲，通常為肺、肝臟、脾、淋巴結、大腦、腎臟及生殖器官。
急性淋巴球性白血病偵測越早，治療越有效。目的為誘導持續緩解，經定義為體內不存在可檢測癌細胞(骨髓中通常小於5%之母細胞)。急性白血病之治療可包括化學療法、類固醇、放射療法、強化組合治療(包括骨髓或幹細胞移植)及生長因子。
化療為精選的初始治療。大部分ALL患者將接受不同治療之組合。由於惡性細胞之全身分佈，因此沒有手術選擇。一般而言，ALL之細胞毒性化學療法將多種抗白血病藥物以各種組合形式進行組合。ALL之化療由三個階段組成：誘導緩解療法、強化療法及維持療法。
因為化學療法方案可為強化的及延長的(在GMALL UKALL、HyperCVAD或CALGB方案之情況下通常約2年；對於約3年之ALL，男性有2個月之COG方案；對於2年之ALL，女性為2個月-男性更長，因為睾丸為潛在儲集器)，許多患者具有插入至大靜脈中之靜脈內導管(稱為中心靜脈導管或希克曼線(Hickman line))，或中樞靜脈注射座(Portacath)，以手術方式植入於皮膚下之具有矽膠鼻之錐狀端口，通常在鎖骨附近，且可獲得最有效的產品，由於低感染風險及中樞靜脈注射座之長期耐久性。
輻射療法(或放射線療法)用於疼痛性骨區域、高疾病負擔或作為骨髓移植(全身輻射)準備之一部分。以全腦輻射形式之輻射亦用於中樞神經系統預防以防止白血病在大腦中之復發。全腦預防輻射為治療兒童ALL之常用方法。近期研究表明CNS化學療法提供有利的結果，但具有較小之發展副作用。因此，全腦輻射之使用更加有限。大部分成人白血病專家已放棄使用輻射療法用於CNS預防，而使用鞘內化學療法。
對於一些復發ALL之亞型，針對諸如蛋白酶體之生物目標，結合化學療法，在臨床試驗中已給出有希望的結果。基於其對白血病淋巴母細胞之組合效應來選擇生物目標可導致臨床試驗在ALL治療效果中之改善。在進行中的臨床試驗中，CD19-CD3雙特異性單株鼠類抗體-布林莫單抗(Blinatumomab)展示巨大的前景。
嵌合抗原受體(CAR)已開發為ALL之有前景的療法。此技術使用經設計以識別細胞表面標記CD19之單鏈可變片段(scFv)作為治療ALL之方法。CD19為在所有B細胞上發現之分子且可用作區分患者中潛在惡性B細胞群之方法。在此療法中，小鼠經CD19抗原免疫且產生抗CD19抗體。自與骨髓瘤細胞株融合之小鼠脾細胞產生之融合瘤可發育為編碼CD19特異性抗體之cDNA的來源。cDNA經測序且使用小肽連接子將編碼此等抗體之可變重鏈及可變輕鏈之序列選殖在一起。此所得序列編碼scFv。此序列可選殖至轉基因中，該轉基因編碼將變為CAR之胞內域。用作胞內域之次單元有不同排列，但其通常由連接至scFv之鉸鏈區、跨膜區、諸如CD28之共刺激分子之胞內區及含有ITAM重複序列之CD3-ζ之胞內域組成。其他經常包括之序列為4-1bb及OX40。隨後將含有scFv及胞內域序列之最終轉基因序列插入至自患者獲得的且在活體外擴增之免疫效應細胞中。在前述試驗中，此等為具有細胞毒性之T細胞類型。將DNA插入至效應細胞中可藉由若干方法實現。最常見地，此使用編碼轉基因之慢病毒來完成。假型、自失活慢病毒已經展示為將所需轉基因穩定插入至目標細胞基因組DNA之有效方法。其他方法包括電穿孔及轉染，但此等方法之功效有限，因為轉基因表現將隨時間推移削弱。隨後將基因修飾之效應細胞移植回患者中。通常，此過程與諸如環磷醯胺之調理方案一起進行，該調理方案已展示為增強輸注之T細胞的效應。此效應已歸因於免疫空間生態棲位之創建。過程在整體上產生效應細胞，通常為可以主要組織相容複合物獨立方式識別腫瘤細胞抗原且啟動細胞毒性反應的T細胞。D. 慢性淋巴母細胞白血病 (CLL)
B細胞慢性淋巴球性白血病(B-CLL)，亦稱為慢性淋巴白血病(CLL)，為成人中最常見的白血病類型(白血球癌之一種類型)。CLL影響起源於骨髓、在淋巴結中發育之B細胞淋巴細胞，且通常藉由產生抗體來對抗感染。在CLL中，B細胞生長失控且在骨髓及血液中積累，其中其擠出健康血細胞。CLL為小淋巴球性淋巴瘤(SLL)之階段，一種主要出現在淋巴結中之B細胞淋巴瘤類型。CLL及SLL經視為僅具有不同表現形式之同一潛在疾病。CLL為成人之疾病。大部分(＞75%)新診斷患有CLL之人超過50歲，且大多數為男性。然而，在罕見的情況下，其可在青少年中出現及偶爾在兒童中出現。此等情況中之一些可與遺傳傾向性有關。
大部分人經診斷無症狀，因為常規血液測試返回高白血球計數，但隨其發展，CLL導致淋巴結、脾及肝臟腫脹，且最終貧血及感染。早期CLL不治療，及晚期CLL用化學療法及單株抗體治療。
DNA分析已區分兩個主要類型的具有不同存活時間之CLL。對於標記ZAP-70為陽性之CLL具有平均8年之存活期，而對於ZAP-70為陰性之CLL具有平均大於25年之存活期。許多疾病進展緩慢之患者，尤其老年人，可放心且在其一生中可不需要任何治療。
大部分人經診斷無症狀，因為常規血液測試返回高白血球計數。不太常見的係，CLL可出現淋巴結增大但白血球計數高或血液中無疾病之跡象。此稱為小淋巴球性淋巴瘤。在一些個體中，只有在贅生性細胞爆滿骨髓，導致貧血產生疲勞或虛弱之後，疾病才顯露出來。
對於全血球計數(CBC)測試，CLL通常首先經懷疑存在淋巴細胞增多，其為一種白血球類型增加。此通常為常規醫師訪視時偶然發現的。最常見的係淋巴細胞計數大於每微升(µl)血液4000個細胞，但可更高。老年個體中存在淋巴細胞增多會引起對CLL之強烈懷疑，且除非臨床上不必要的，否則應進行確認診斷測試，特定言之流式細胞量測術。
CLL之診斷係基於血液、骨髓或組織中之異常B淋巴細胞群之論證，該B淋巴細胞群在細胞表面上顯示異常但特徵化的分子模式。此非典型分子模式包括細胞表面標記分化叢集5 (CD5)及分化叢集23 (CD23)之共表現。另外，一個個體內之所有CLL細胞為純系的，亦即在基因遺傳上相同。實際上，此藉由在全部異常B細胞群中僅偵測到彼此互斥之抗體輕鏈κ或λ中之一者來推斷。正常B淋巴細胞由大量不同抗體產生細胞組成，產生κ及λ表現細胞兩者之混合物。κ及λ產生之B細胞缺乏常態分佈為證明選殖性之一個基礎，該選殖性為確定任何B細胞惡性腫瘤(B細胞非霍奇金淋巴瘤)診斷之關鍵要素。
需要組合外周血液之顯微鏡檢查及藉由流式細胞量測術對淋巴細胞之分析以確認選殖性及標記分子表現來確定CLL之診斷。兩者皆易於在少量血液中完成。流式細胞儀為可檢查體液中個別細胞上分子表現之儀器。此需要使用特異性抗體以標記具有經儀器識別之螢光標記之分子。在CLL中，淋巴細胞為遺傳純系，屬於B細胞譜系(表現標記分子分化叢集19 (CD19)及CD20)，且典型地表現標記分子CD5及CD23。此等B細胞類似在顯微鏡下之正常淋巴細胞，雖然稍微較小，但塗至玻璃載片上時為易碎的，進而產生許多破碎之細胞，該等細胞稱為「污染」或「塗片」細胞。
馬圖特斯(Matutes)之CLL得分允許鑑別經典CLL之均質亞組，該亞組對於五種標記之表現(CD5、CD23、FMC7、CD22及免疫球蛋白輕鏈)不同於非典型/混合CLL，馬圖特斯之CLL得分系統對經典CLL與其他B細胞慢性淋巴增生病症之間的差別診斷非常有幫助，但對混合/非典型CLL與套細胞淋巴瘤(MCL惡性B細胞)之間的免疫區別無幫助。藉由添加諸如CD54及CD200之非常規標記，可改善CLL與MCL之間的辨別。在常規標記中，大部分辨別特徵為CD20/CD23平均螢光強度比率。相比之下，FMC7表現對於邊緣型病例可出人意料地具誤導性。
確定疾病之程度的分期用Rai分期系統或Binet分類(參見細節)進行且主要基於存在低血小板或紅血球計數。早期疾病不需要治療。
CLL治療集中於控制疾病及其症狀，而非徹底治癒。CLL藉由化學療法、放射療法、生物療法或骨髓移植來治療。症狀有時以外科手術方式(增大脾臟之脾切除術移除)或藉由放射療法(腫脹淋巴結「去膨脹」)治療。
初始CLL治療視疾病之準確診斷及進展而變化，且甚至視健康照護執業醫生之偏好及經驗而變化。幾十種藥劑用於CLL療法。含有氟達拉賓(fludarabine)、環磷醯胺及利妥昔單抗(rituximab) (稱為FCR)之初始治療方案已證實較高之總體反應率及完全反應率。
藉由賓夕法尼亞大學(University of Pennsylvania)之研究人員進行之研究使用遺傳修飾之T細胞攻擊表現CD19蛋白之細胞來對抗疾病。在2013年，研究人員宣佈59名患者中之26名已實現完全緩解且原患者仍無腫瘤。
白血病很少與妊娠相關，10,000名妊娠期婦女中僅約1名受其影響。慢性淋巴球性白血病之治療通常可推遲直至妊娠結束後。若治療為必需的，則在中期或晚期妊娠期間進行化學療法比在早期妊娠期間治療更不大可能導致妊娠丟失或出生缺陷。
雖然CLL通常視為不可治癒的，但在大多數情況下進展緩慢。許多患有CLL之人多年來過著正常且積極之生活-在某些狀況下持續數十年。由於其發作緩慢，因此早期CLL一般不治療，因為人們認為早期CLL干預並不改善存活時間或生活品質。替代地，隨時間推移監測病況以偵測疾病模式中之任何變化。
當患者臨床症狀或血液計數指示疾病已進行至其中可能影響患者生活品質之時刻時，決定開始進行CLL治療。諸如Rai 4平台系統及Binet分類之臨床「分期系統」可有助於確定何時及如何治療患者。確定何時開始治療及藉由何種方法通常為困難的；研究已表明過早治療疾病不具有存活優勢。國家癌症研究所工作組(The National Cancer Institute Working Group)已發佈治療指南，其中在其起始之前應滿足特定標記。
組合化學療法方案對新診斷及復發之CLL兩者有效。氟達拉賓與烷基化劑(環磷醯胺)之組合比單一藥劑產生更高之反應率及更長之無進展存活期：FC (氟達拉賓與環磷醯胺)；FR (氟達拉賓與利妥昔單抗)；FCR (氟達拉賓、環磷醯胺及利妥昔單抗)；及CHOP (環磷醯胺、小紅莓(doxorubicin)、長春新鹼(vincristine)及潑尼松龍(prednisolone))。
儘管嘌呤類似物氟達拉賓展示對苯丁酸氮芥作為主要療法得到優良的反應率，但無證據表明早期使用氟達拉賓提高總存活率，且一些臨床醫師更喜歡保留氟達拉賓用於復發疾病。
在選擇良好身體健康之CLL患者的大型隨機試驗中，用FCR之化學免疫療法已展示提高反應率、無進展存活期及總存活率。此為第一次臨床試驗，其表明選擇一線療法可提高CLL患者之總存活率。批准用於CLL之烷基化劑包括苯達莫司汀(bendamustine)及環磷醯胺。
靶向療法攻擊特定目標處之癌細胞，其目的在於不傷害正常細胞。在CLL中使用單株抗體，諸如阿侖單抗(alemtuzumab) (針對CD52)及利妥昔單抗及奧伐木單抗(ofatumumab) (針對CD20)。在CLL中亦可使用酪胺酸激酶抑制劑療法。在2014年2月，FDA授予之依魯替尼(ibrutinib)經批准以治療慢性淋巴球性白血病。依魯替尼為布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑。在2014年7月，FDA及EMA授予之艾代拉裏斯(idelalisib)經批准以治療不同類型的白血病。艾代拉里斯為靶向PI3Kδ路徑之PI3K抑制劑。其採用口服。
使用接受者自身細胞之自體幹細胞移植為不可治癒的。較年輕之個體若處於死於CLL之高風險下，則可考慮同種異體造血幹細胞移植(HSCT)。清髓性(骨髓殺滅)形式之同種異體幹細胞移植(一種使用來自健康供體之血細胞進行的高風險治療)可為治癒的，但治療相關之毒性為顯著的。中間水準，稱為降低強度調節的同種異體幹細胞移植，對於年老或虛弱的患者可更佳地耐受。
「難治癒」CLL為對治療不再積極反應之疾病。在此情況下，考慮更積極之療法，包括來那度胺(lenalidomide)、夫拉平度(flavopiridol)及骨髓(幹細胞)移植。單株抗體，阿侖單抗(針對CD52)，可用於難治癒的基於骨髓之疾病的患者。
併發症包括里克特(Richter's)症候群、導致反覆感染之低γ球蛋白血症、10-15%患者之溫熱自體免疫溶血性貧血、轉化為高級淋巴瘤。慢性淋巴球性白血病可轉化為里克特症候群，即患有慢性淋巴球性白血病之患者中快速生長之彌漫性大B細胞淋巴瘤、前淋巴球性白血病、霍奇金氏淋巴瘤或急性白血病之發展。據估計CLL患者中之發病率約為5%。
慢性淋巴球性白血病可很少出現腸胃(GI)損害。一些報導之表現包括腸套疊、小腸細菌污染、結腸炎及其他。通常，CLL之GI併發症在里克特轉化(Richter transformation)之後出現。到目前為止，已有兩個病例報導在慢性淋巴球性白血病中無里克特轉化亦具有GI損害。 III.    單株抗體及其產生
本文所描述之單株抗體可使用標準方法製備，隨後進行篩選、表徵及功能評估。可變區可經測序且隨後次選殖至人類表現載體中以產生嵌合抗體基因，隨後表現且純化該等嵌合抗體基因。此等嵌合抗體可在抗原結合、信號傳導阻斷及異種移植實驗中進行測試。A. 一般方法
應理解與LILRB4結合之單株抗體將具有若干應用。此等應用包括用於偵測及診斷癌症之診斷套組的製造，以及用於癌症療法。在此等情形中，吾人可將此類抗體與診斷劑或治療劑相關聯，使用其作為競爭性分析中之捕捉劑或競爭劑，或獨立地使用其，而不附加另外的藥劑。抗體可經突變或修飾，如以下進一步論述。用於製備及表徵抗體之方法為此項技術中所熟知(參見例如，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988；美國專利4,196,265)。
用於產生單株抗體(MAb)之方法一般沿著與用於製備多株抗體相同之生產線開始。此等方法之第一步皆為適當宿主之免疫接種。如此項技術中所熟知的，給定的免疫接種組合物之免疫原性可能不同。因此，通常需要增強宿主免疫系統，此可藉由使肽或多肽免疫原與載體偶合來實現。例示性及較佳之載體為匙孔螺血氰蛋白(KLH)及牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白，諸如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白，亦可用作載體。將多肽共軛至載體蛋白之方式為此項技術中熟知的且包括戊二醛、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯、碳化二亞胺及雙重氮化聯苯胺。此項技術中亦熟知，可藉由使用非特異性免疫反應刺激劑(稱為佐劑)來增加特定免疫原組合物之免疫原性。例示性及較佳之佐劑包括完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant) (含有經殺滅之結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis )的非特異性免疫反應刺激劑)、不完全弗氏佐劑及氫氧化鋁佐劑。
用於產生多株抗體之免疫原組合物的量取決於免疫原之性質以及用於免疫接種之動物而變化。可使用多種途徑投與免疫原(皮下、肌肉內、皮內、靜脈內及腹膜內)。多株抗體之產生可藉由在免疫接種之後各個時間點取得經免疫接種動物之血樣來進行監測。亦可給與第二次輔助劑注射。重複增強免疫及滴定之過程，直至達到適合滴度。當獲得所需免疫原性水準時，可對經免疫接種之動物抽血且分離血清並儲存，及/或可使用該動物產生MAb。
在免疫接種之後，選擇可能產生抗體之體細胞，具體言之，B淋巴細胞(B細胞)用於MAb產生方案中。此等細胞可自活組織檢查之脾或淋巴結，或自循環血液獲得。隨後使來自經免疫接種動物之抗體產生B淋巴細胞與永生骨髓瘤細胞之細胞(一般與經免疫接種之動物屬於同一物種的動物之永生骨髓瘤細胞)或人類或人類/小鼠嵌合細胞融合。適用於產生融合瘤之融合程序中之骨髓瘤細胞株較佳不產生抗體，具有高融合效率，且酶不足而使其不能在僅支持所需融合細胞(融合瘤)生長之某些選擇性培養基中生長。熟習此項技術者已知可以使用多種骨髓瘤細胞中之任一者(Goding, 第65-66頁, 1986；Campbell, 第75-83頁, 1984)。
用於產生抗體產生脾或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞之雜交體的方法通常包含在促進細胞膜融合之一或多種藥劑(化學試劑或電)存在下，將體細胞與骨髓瘤細胞以2:1比例混合，但該比例可各別地在約20:1至約1:1間變化。Kohler及Milstein(1975；1976)已經描述使用仙台病毒(Sendai virus)之融合方法，且Gefter等人(1977)已經描述使用聚乙二醇(PEG)，諸如37% (v/v) PEG的融合方法。使用電誘導融合方法亦為適合的(Goding, 第71-74頁, 1986)。融合程序通常以約1 × 10-6 至1 × 10-8 之較低頻率產生有活力的雜交體。然而，此不會造成問題，因為有活力的融合雜交體係藉由在選擇培養基中培養而由輸注的親本細胞(特定言之，將通常持續無限分裂的輸注骨髓瘤細胞)分化。選擇培養基一般為含有阻止核苷酸在組織培養基中重新合成之藥劑的培養基。例示性及較佳之藥劑為胺基喋呤(aminopterin)、甲胺喋呤(methotrexate)及偶氮絲胺酸。胺基喋呤及甲胺喋呤阻止嘌呤及嘧啶之重新合成，而偶氮絲胺酸僅阻止嘌呤合成。在使用胺基喋呤或甲胺喋呤情況下，培養基補充有次黃嘌呤及胸苷作為核苷酸來源(HAT培養基)。在使用偶氮絲胺酸情況下，該培養基補充有次黃嘌呤。若B細胞源為埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus，EBV)轉化之人類B細胞株，則為了除去未與骨髓瘤融合之EBV轉化株，添加烏本苷(Ouabain)。
較佳之選擇培養基為HAT或含烏本苷之HAT。只有能夠操作核苷酸補救路徑之細胞能夠在HAT培養基中存活。骨髓瘤細胞缺乏補救路徑之關鍵酶，例如次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)，且其無法存活。B細胞可操作此路徑，但其在培養時壽命有限且一般在約兩週內死亡。因此，只有可在選擇培養基中存活的細胞為由骨髓瘤及B細胞形成之彼等雜交體。當用於融合之B細胞源為EBV轉化之B細胞株時，如此處，亦將烏本苷用於雜交體之藥物選擇，因為EBV轉化之B細胞易經藥物殺滅，而所用骨髓瘤搭配物應選擇耐烏本苷的。
培養提供一群融合瘤，從中選擇特異性融合瘤。通常，融合瘤之選擇係藉由在微量滴定盤中以單一純系之稀釋液培養細胞，隨後測試個別純系上清液(在約兩至三週之後)的所需反應性來進行。分析法應為靈敏、簡單且快速的，諸如放射免疫分析法、酶免疫分析法、細胞毒性分析法、蝕斑分析法、斑點免疫結合分析法及其類似方法。隨後所選融合瘤進行連續稀釋或藉由流動式細胞分選進行單細胞分選，且選殖至個別抗體產生細胞株中，該等純系可隨後無限繁殖以提供MAb。可採用細胞株以兩種基本方式產生MAb。融合瘤樣品可注射至動物(例如，小鼠)體內(通常注射至腹腔中)。視情況，在注射之前，用烴，尤其為油，諸如姥鮫烷(四甲基十五烷)使動物預致敏。當以此方式使用人類融合瘤時，最佳向免疫功能不全之小鼠，諸如SCID小鼠進行注射，以防止腫瘤排斥反應。經注射動物產生腫瘤，分泌由融合之細胞雜交體產生之特異性單株抗體。隨後可抽取動物之體液，諸如血清或腹水，以提供高濃度MAb。個別細胞株亦可在活體外培養，其中MAb天然地分泌至培養基中，自該培養基可容易地獲得高濃度MAb。或者，可在活體外使用人類融合瘤細胞株以在細胞上清液中產生免疫球蛋白。細胞株可適合於在無血清培養基中生長以使回收高純度人類單株免疫球蛋白之能力達至最佳。
必要時，藉由任一方式產生之MAb可使用過濾、離心及各種層析方法，諸如FPLC或親和層析法進一步純化。本發明之單株抗體的片段可自純化之單株抗體，藉由包括用酶(諸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化之方法，及/或藉由化學還原來裂解二硫鍵而獲得。或者，本發明所涵蓋之單株抗體片段可使用自動肽合成儀合成。
預期亦可使用分子選殖方法產生單株抗體。為此，可自融合瘤株分離RNA且藉由RT-PCR獲得抗體基因並選殖至免疫球蛋白表現載體中。或者，由自細胞株分離之RNA製備組合免疫球蛋白噬質體文庫且藉由使用病毒抗原淘選來選擇表現適當抗體之噬質體。此方法相較於習知融合瘤技術之優勢在於，可在一輪中產生且篩選出多達約104 倍之抗體，且由H鏈與L鏈組合產生新特異性，從而使發現適當抗體之幾率進一步增加。
教示適用於本發明中之抗體之產生的其他美國專利(各自以引用的方式併入本文中)包括美國專利5,565,332，其描述使用組合方法產生嵌合抗體；美國專利4,816,567，其描述重組免疫球蛋白製劑；及美國專利4,867,973，其描述抗體-治療劑共軛物。B. 本發明之抗體 1.  LILRB4 之 抗體
根據本發明之抗體或其抗原結合片段在第一實例中可藉由其在此情況下針對LILRB4之結合特異性來定義。熟習此項技術者藉由使用熟習此項技術者熟知之技術評估給定抗體之結合特異性/親和力，可確定此類抗體是否屬於本發明申請專利範圍之範疇內。
在一個態樣中，提供與LILRB4特異性結合之抗體及抗原結合片段。在一些實施例中，當與LILRB4結合時，此類抗體調節LILRB4之活化。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段在與LILRB4結合時，活化LILRB4。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段在與LILRB4結合時，抑制LILRB4之活化。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段在與LILRB4結合時可特異性干擾、阻斷或減少ApoE與LILRB4之間的相互作用。在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段能夠抑制ApoE介導之LILRB4活性。在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段與人類LILRB4特異性地或選擇性地結合。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段與人類LILRB4特異性地結合及/或實質上抑制人類LILRB4與ApoE之結合至少約20%-40%、40-60%、60-80%、80-85%或更高(例如，如實例中所揭示之分析)。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段之Kd小於(結合更緊密)10- 7 、10- 8 、10- 9 、10- 10 、10- 11 、10- 12 、10- 13 M。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段用於阻斷ApoE與LILRB4之結合的IC50小於1 μM、1000 nM至100 nM、100 nM至10 nM、10 nM至1 nM、1000 pM至500 pM、500 pM至200 pM；小於200 pM、200 pM至150 pM、200 pM至100 pM、100 pM至10 pM、10 pM至1 pM。
在一些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合片段具有來自圖 28A 至 28C 中所說明之重鏈及圖 30A 至 30C 中所說明之輕鏈的純系配對CDR。此類抗體可使用本文所描述之方法，由以下實例部分中論述之純系產生。在某些實施例中，各CDR係根據以下各者定義：Kabat定義、Chothia定義、Kabat定義及Chothia定義之組合、AbM定義或CDR之接觸定義。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段之特徵在於表 1 及表 2 之純系配對重鏈及輕鏈CDR序列。
在某些實施例中，抗體可由其可變序列定義，其包括額外的「構架」區。抗體之特徵在於圖 28A 至 28C 及圖 30A 至 30B 之純系配對重鏈及輕鏈胺基酸序列。此外，抗體序列可不同於此等序列，特定言之在CDR之外的區。舉例而言，胺基酸可藉由給定百分比，例如，80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源性不同於上文陳述之彼等，或胺基酸可藉由允許保守性取代(下文論述)而不同於上文陳述之彼等。前述中之每一者適用於圖 28A 至 28C 及圖 30A 至 30C 之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明之抗體衍生物包含VL及VH結構域，其具有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個保守或非保守胺基酸取代，同時仍展現所需之結合及功能特性。
雖然本發明之抗體為以IgG形式產生，但修飾恆定區以改變其功能可為適用的。抗體之恆定區通常介導抗體與宿主組織或因子之結合，其包括各種免疫系統之細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。因此，術語「抗體」包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及其亞型)之完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白之輕鏈可具有κ或λ型。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區由具有約12個或更多個胺基酸之35「J」區接合，其中重鏈亦包括具有多於約10個胺基酸之「D」區。通常參見Fundamental Immunology第7章(Paul, W.編, 第2版 Raven Press, N.Y. (1989))。
本發明進一步包含與編碼本文所揭示之抗體的核酸雜交之核酸。一般而言，核酸在中等或高嚴格度條件下與編碼本文所揭示之抗體及亦編碼保持與LILRB4特異性結合之能力之抗體的核酸雜交。當第一核酸分子之單股形式可在適當之溫度及溶液離子強度的條件下退火至第二核酸分子時，第一核酸分子與第二核酸分子「可雜交」(參見Sambrook等人, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第3版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001)。溫度及離子強度之條件決定雜交之「嚴格度」。典型中等嚴格度雜交條件為在42℃下，40%甲醯胺、5×或6× SSC及0.1% SDS。高嚴格度雜交條件為在42℃或視情況在較高溫度(例如57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下，50%甲醯胺、5×或6× SSC (0.15M NaC1及0.015M檸檬酸鈉)。雜交要求兩個核酸含有互補序列，但視雜交之嚴格度而定，鹼基之間的錯配係可能的。用於雜交核酸之適當嚴格度視核酸之長度及互補程度、此項技術中熟知之變量而定。兩個核苷酸序列之間的相似性或同源性程度愈大，核酸可雜交之嚴格度愈高。對於長度超過100個核苷酸之雜交體，已推導出用於計算解鏈溫度之等式(參見Sambrook等人，見上文)。對於較短核酸(例如，寡核苷酸)之雜交，錯配之位置變得更加重要，且寡核苷酸之長度決定其特異性(參見Sambrook等人，見上文)。表 1. 重鏈 CDR 序列、 胺基酸
Figure 108133096-A0304-0001
 表 2. κ 輕鏈 CDR 、胺基酸序列
Figure 108133096-A0304-0002
 表 3 .LILRB4 抗體之序列 ID 編號
Figure 108133096-A0304-0003
 表 4. 人類化 193 (h193) 抗體重鏈之序列 ID 編號
Figure 108133096-A0304-0004
 表 5. 人類化 193 (h193) 抗體輕鏈之序列 ID 編號
Figure 108133096-A0304-0005
 2. 例示性抗原決定基及競爭抗原結合蛋白
在另一態樣中，本發明提供與抗LILRB4抗體結合之抗原決定基。
在一些實施例中，由本文所描述之抗體結合之抗原決定基係有用的。在某些實施例中，本文所提供之抗原決定基可用以分離與LILRB4結合之抗體或抗原結合蛋白。在某些實施例中，本文所提供之抗原決定基可用以產生與LILRB4結合之抗體或抗原結合蛋白。在某些實施例中，抗原決定基或包含本文所提供之抗原決定基的序列可用作免疫原以產生與LILRB4結合之抗體或抗原結合蛋白。在某些實施例中，本文所描述之抗原決定基或包含本文所描述之抗原決定基的序列可用以干擾LILRB4之生物活性。
在一些實施例中，與任何抗原決定基結合之抗體或其抗原結合片段為尤其適用的。在一些實施例中，本文所提供之抗原決定基在與抗體結合時調節LILRB4之生物活性。在一些實施例中，本文所提供之抗原決定基在與抗體結合時活化LILRB4。在一些實施例中，本文所提供之抗原決定基在與抗體結合時抑制LILRB4之活化。在一些實施例中，本文所提供之抗原決定基在與抗體結合時阻斷ApoE與LILRB4之間的相互作用。
在一些實施例中，含有與抗體接觸或經抗體埋入之殘基的結構域/區可藉由突變LILRB4中之特定殘基且確定抗體是否可結合突變之LILRB4蛋白來識別。藉由進行多種個別突變，可識別在結合中起直接作用或與抗體充分貼近以使得突變可影響抗體與抗原之間的結合之殘基。根據此等胺基酸之瞭解，可闡明含有與抗原結合蛋白接觸或由抗體覆蓋之殘基的抗原結構域或區。此類結構域可包括抗原結合蛋白之結合抗原決定基。
在另一態樣中，本發明提供與結合至本文所描述之抗原決定基之例示性抗體或抗原結合片段中之一者競爭以特異性結合LILRB4的抗原結合蛋白。此類抗原結合蛋白亦可結合至與本文例示之抗體或抗原結合片段中之一者相同的抗原決定基或重疊抗原決定基。預期與例示性抗體競爭或結合於相同抗原決定基之抗原結合蛋白展示類似功能特性。例示性抗體包括上文描述之抗體，包括表 1 及表 2 中所包括之重鏈及輕鏈可變區及CDR之抗體。在某些實施例中，抗原決定基位於人類LILRB4之D1與D2結構域之間的連接區內。在某些實施例中，抗原決定基包含表 9 中所列出之一或多個胺基酸序列內的至少一個胺基酸。在某些實施例中，抗原決定基包含選自SEQ ID NO: 238 (人類LILRB4蛋白之D1及D2結構域)之W18、G96、A97、Y98、S99、K100、Q122、S123、R124、S125、P126、H153及Q154之一或多個胺基酸序列內的至少一個胺基酸。C. 抗體序列之工程改造
在各種實施例中，出於各種原因，諸如改善表現、改善交叉反應性或降低脫靶結合，吾人可選擇對所鑑別之抗體的序列進行工程改造。以下為用於抗體工程改造之相關技術的大致論述。
可培養融合瘤，隨後裂解細胞且提取總RNA。可在RT下使用隨機六聚體以產生RNA之cDNA複本，且隨後使用預期可擴增所有人類可變基因序列之PCR引子之多元混合物進行PCR。PCR產物可選殖至pGEM-T Easy載體中，隨後藉由自動DNA測序，使用標準載體引子進行測序。結合及中和之分析可使用自融合瘤上清液收集且藉由使用蛋白質G管柱之FPLC純化的抗體進行。重組全長IgG抗體可藉由將來自選殖載體之重鏈及輕鏈Fv DNA次選殖至IgG質體載體中，轉染至293 Freestyle細胞或CHO細胞中來產生，且自293或CHO細胞上清液中收集且抗體純化。
在與最終cGMP製造方法相同之宿主細胞及細胞培養方法中產生的抗體之快速可用性有可能縮短方法進展程式之持續時間。Lonza開發出一種使用彙集的在CDACF培養基中生長之轉染物的通用方法，用於在CHO細胞中快速產生少量(至多50 g)抗體。儘管比實際瞬時系統略慢，但優勢包括較高產物濃度及與產生細胞株相同之宿主及方法的使用。在拋棄式生物反應器中表現模型抗體之GS-CHO池之生長及生產率的實例：在以分批進料模式操作之拋棄式袋式生物反應器培養(5 L工作體積)中，在轉染9週內達至2 g/L之採集抗體濃度。
抗體分子將包含由例如mAb蛋白水解裂解產生之片段(諸如F(ab')、F(ab')2 )，或可例如經由重組方法產生的單鏈免疫球蛋白。此類抗體衍生物為單價的。在一個實施例中，此類片段可彼此組合，或與其他抗體片段或受體配位體組合以形成「嵌合」結合分子。很明顯，此類嵌合分子可含有能夠結合至同一分子之不同抗原決定基的取代基。1. 抗原結合修飾
在相關實施例中，抗體為所揭示之抗體之衍生物，例如包含與所揭示之抗體(例如，嵌合抗體或CDR移植抗體)中之CDR序列相同之CDR序列的抗體。或者，吾人可希望進行修飾，諸如將保守變化引入抗體分子中。在進行此類變化時，可考慮胺基酸之親水指數。在此項技術中一般瞭解胺基酸之親水指數在賦予蛋白質相互作用生物功能方面之重要性(Kyte及Doolittle, 1982)。公認胺基酸之相對親水性特徵促成所得蛋白質之二級結構，該二級結構又界定蛋白質與其他分子(例如酶、受質、受體、DNA、抗體、抗原及其類似物)之相互作用。
在此項技術中亦瞭解，可基於親水性有效進行類似胺基酸之取代。以引用的方式併入本文中之美國專利4,554,101陳述，藉由其鄰近胺基酸之親水性調節的蛋白質之最大局部平均親水性與蛋白質之生物特性相關。如美國專利4,554,101中詳述的，已經指定胺基酸殘基以下親水值：鹼性胺基酸：精胺酸(+3.0)、離胺酸(+3.0)及組胺酸(-0.5)；酸性胺基酸：天冬胺酸(+3.0±1)、麩胺酸(+3.0±1)、天冬醯胺(+0.2)及麩醯胺酸(+0.2)；親水性、非離子性胺基酸：絲胺酸(+0.3)、天冬醯胺(+0.2)、麩醯胺酸(+0.2)及蘇胺酸(-0.4)；含硫胺基酸：半胱胺酸(-1.0)及甲硫胺酸(-1.3)；疏水性、非芳族胺基酸：纈胺酸(-1.5)、白胺酸(-1.8)、異白胺酸(-1.8)、脯胺酸(-0.5±1)、丙胺酸(-0.5)及甘胺酸(0)；疏水性、芳族胺基酸：色胺酸(-3.4)、苯丙胺酸(-2.5)及酪胺酸(-2.3)。
應瞭解，一種胺基酸可經具有類似親水性之另一胺基酸取代且產生在生物學或免疫學上改變之蛋白質。在此類變化中，用親水值在±2內之胺基酸取代較佳，用親水值在±1內之彼等胺基酸取代尤佳，且用親水值在±0.5內之彼等胺基酸取代甚至更佳。
如上文所概述，胺基酸取代一般係基於胺基酸側鏈取代基之相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小及其類似特性。考慮各種前述特徵之例示性取代為熟習此項技術者所熟知的，且包括：精胺酸及離胺酸；麩胺酸及天冬胺酸；絲胺酸及蘇胺酸；麩醯胺酸及天冬醯胺；以及纈胺酸、白胺酸及異白胺酸。
本發明亦涵蓋同型修飾。藉由修飾Fc區以使其具有不同之同型，可實現不同功能。舉例而言，改變成IgG1 可增加抗體依賴性細胞毒性，轉變成A類可改善組織分佈，且轉變成M類可改善價態。
經修飾抗體可藉由熟習此項技術者已知之任何技術製備，包括經由標準分子生物技術表現，或多肽之化學合成。重組表現之方法述於本文件中其他地方。2.  Fc 區 修飾
本文所揭示之抗體亦可經工程改造以包括Fc區內之修飾，通常改變抗體之一或多個功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或效應功能(例如，抗原依賴性細胞毒性)。此外，本文所揭示之抗體可經化學修飾(例如，一或多個化學部分可連接至抗體)或經修飾以改變其糖基化，再次改變抗體之一或多個功能特性。此等實施例中之每一者進一步詳細描述於下文中。Fc區中之殘基編號為Kabat之EU索引編號。本文所揭示之抗體亦包括具有修飾(或阻斷)Fc區之抗體以提供改變之效應功能。參見例如美國專利5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。此類修飾可用於增強或抑制免疫系統之各種反應，在診斷及療法中可能具有有益作用。Fc區之改變包括胺基酸變化(取代、缺失及插入)、糖基化或去糖基化及添加多個Fc。Fc之改變亦可改變治療抗體中抗體之半衰期，實現較不頻繁之給藥且因此增加便利性且減少物質使用。據報導，此突變消除鉸鏈區中重鏈間二硫橋鍵之異質性。
在一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得鉸鏈區中的半胱胺酸殘基之數目增加或減少。此方法進一步詳細描述於美國專利5,677,425中。CH1之鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目經改變以例如促進輕鏈與重鏈組裝或提高或降低抗體之穩定性。在另一實施例中，抗體經修飾以增加其生物半衰期。各種方法為可能的。舉例而言，可引入以下突變中之一或多者：T252L、T254S、T256F，如美國專利6,277,375中所描述。或者，如美國專利5,869,046及6,121,022中所描述，為了增加生物半衰期，抗體可在CH1或CL區內改變以含有獲自IgG之Fc區之CH2域之兩個環的救助受體結合抗原決定基。在另外其他實施例中，Fc區藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變，以改變抗體之效應功能。舉例而言，一或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之胺基酸可由不同胺基酸殘基置換，使得抗體對效應配位體具有改變之親和力，但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應配位體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細地描述於美國專利5,624,821及5,648,260中。
在另一實例中，改變胺基酸位置231及239內之一或多個胺基酸殘基，藉此改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於PCT公開案WO 94/29351中。在又另一實例中，藉由修飾以下位置：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439之一或多個胺基酸，Fc區經修飾以增加或降低抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力且/或增加或降低抗體對Fcγ受體之親和力。此方法進一步描述於PCT公開案WO 00/42072中。此外，已定位人類IgG1上對FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點且已描述結合改良之變體。展示位置256、290、298、333、334及339處之特異性突變以改良與FcγRIII之結合。另外，展示以下組合突變體以改良FcγRIII結合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及S298A/E333A/K334A。
在一個實施例中，藉由修飾殘基243及264來修飾Fc區以降低抗體介導效應功能之能力且/或提高消炎特性。在一個實施例中，抗體之Fc區藉由將位置243及264之殘基改變成丙胺酸來修飾。在一個實施例中，藉由修飾殘基243、264、267及328來修飾Fc區以降低抗體介導效應功能之能力且/或提高消炎特性。在另一實施例中，抗體包含特定糖基化型態。舉例而言，可產生去糖基化抗體(亦即，缺乏糖基化之抗體)。抗體之糖基化型態可經改變以例如提高抗體對抗原之親和力或親合力。此類修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個糖基化位點來實現。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，從而移除一或多個可變區構架糖基化位點，藉此消除該位點之糖基化。此類去糖基化可提高抗體對抗原之親和力或親合力。參見例如美國專利5,714,350及6,350,861。
亦可製備其中糖基化型態包括低岩藻糖基化或去岩藻糖基化聚糖之抗體，諸如在聚糖上具有減少量之岩藻糖基殘基的低岩藻糖基化抗體或去岩藻糖基化抗體。抗體亦可包括具有增加量之等分GlcNac結構之聚糖。已證明此類改變之糖基化型態會提高抗體之ADCC能力。此類修飾可藉由例如在宿主細胞中表現抗體來實現，其中糖基化路徑經基因工程改造以產生具有特定糖基化型態之糖蛋白。此等細胞已描述於此項技術中且可用作其中表現本發明之重組抗體從而產生具有改變之糖基化之抗體的宿主細胞。舉例而言，細胞株Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖基轉移酶基因、FUT8 (α (1,6)-岩藻糖基轉移酶)，使得表現於Ms704、Ms705及Ms709細胞株中之抗體缺乏在其碳水化合物上之岩藻糖。Ms704、Ms705及Ms709 FUT8-/-細胞株係藉由使用兩種替換載體靶向破壞CHO/DG44細胞中之FUT8基因來產生(參見美國專利公開案第20040110704號)。作為另一實例，EP 1 176 195描述具有經功能性破壞之FUT8基因之細胞株，其編碼岩藻糖基轉移酶，使得表現於此類細胞株中之抗體藉由減少或消除α-1,6結合相關酶而展現低岩藻糖基化。EP 1 176 195亦描述對於添加岩藻糖至結合於抗體之Fc區之N-乙醯基葡糖胺具有低酶活性或不具有酶活性之細胞株，例如大鼠骨髓瘤細胞株YB2/0 (ATCC CRL 1662)。PCT公開案WO 03/035835描述變體CHO細胞株、Lec13細胞，其中將岩藻糖連接至Asn(297)連接之碳水化合物之能力降低，亦導致宿主細胞中表現之抗體的低岩藻糖基化。具有經修飾之糖基化分佈之抗體亦可產生於雞蛋中，如PCT公開案WO 06/089231中所描述。可替代地，具有經修飾之糖基化分佈之抗體亦可產生於植物細胞(諸如浮萍(Lemna ))中(美國專利7,632,983)。用於在植物系統中產生抗體之方法揭示於美國專利6,998,267及7,388,081中。PCT公開案WO 99/54342描述經工程改造以表現糖蛋白修飾之糖基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III (GnTIII))的細胞株，使得在經工程改造之細胞株中表現的抗體展現增加之等分GlcNac結構，引起抗體之ADCC活性提高。
可替代地，抗體之岩藻糖殘基可使用岩藻糖苷酶切割；例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗體中移除岩藻糖基殘基。本文所揭示之抗體進一步包括產生於低級真核生物宿主細胞中之抗體，特定言之，諸如酵母及絲狀真菌之真菌宿主細胞已經基因工程改造以產生具有哺乳動物樣或人類樣糖基化型態之糖蛋白。相對於當前使用之哺乳動物細胞株，此等經基因修飾之宿主細胞之特定優勢為能夠控制細胞中產生的糖蛋白之糖基化分佈，使得可產生其中特定N-聚糖結構佔優勢之糖蛋白之組合物(參見例如，美國專利7,029,872及7,449,308)。此等經基因修飾之宿主細胞已用於產生主要具有特定N-聚糖結構之抗體。
另外，由於諸如酵母或絲狀真菌之真菌缺乏產生岩藻糖基化糖蛋白之能力，在此類細胞中產生之抗體將缺乏岩藻糖，除非細胞經進一步修飾以包括用於產生岩藻糖基化糖蛋白之酶路徑(參見例如，PCT公開案WO2008112092)。在特定實施例中，本文所揭示之抗體進一步包括在低級真核宿主細胞中產生且包含岩藻糖基化及非岩藻糖基化雜合及複合N- 聚糖的彼等抗體，包括等分及多觸角(multiantennary)物種，包括(但不限於)N- 聚糖，諸如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4) Man3GlcNAc2。在特定實施例中，本文所提供之抗體組合物可包含具有至少一種選自由GlcNAcMan5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2；及NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2組成之群的雜交N -聚糖之抗體。在特定態樣中，雜交N -聚糖為組合物中之主要N -聚糖物種。在其他態樣中，雜交N -聚糖為特定N -聚糖物種，其在組合物中包含約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%雜交N -聚糖。
在特定實施例中，本文所提供之抗體組合物包含具有至少一種選自由以下組成之群的複合N- 聚糖之抗體：GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在特定態樣中，複合N -聚糖為組合物中之主要N -聚糖物種。在其他態樣中，複合N -聚糖為特定N -聚糖物種，其在組合物中包含約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%複合N -聚糖。在特定實施例中，N- 聚糖經岩藻糖基化。一般而言，岩藻糖在N -聚糖之還原末端與GlcNAc之α1,3-鍵中，在N -聚糖之還原末端與GlcNAc之α1,6-鍵中，在N -聚糖之非還原末端與Gal之α1,2-鍵中，在N -聚糖之非還原末端與GlcNac之α1,3-鍵中，或在N -聚糖之非還原末端與GlcNac之α1,4-鍵中。
因此，在以上糖蛋白組合物之特定態樣中，糖型呈α1,3-鍵或α1,6-鍵岩藻糖形式以產生選自由以下組成之群的糖型：Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；呈α1,3-鍵或α1,4-鍵岩藻糖形式以產生選自由以下組成之群的糖型：GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2及NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或呈α1,2-鍵岩藻糖形式以產生選自由以下組成之群的糖型：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2及NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在其他態樣中，抗體包含高甘露糖N- 聚糖，包括(但不限於) Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2或由Man3GlcNAc2N- 聚糖結構組成之N- 聚糖。在上述其他態樣中，複合N -聚糖進一步包括岩藻糖基化及非岩藻糖基化等分及多觸角物種。如本文所使用，術語「N -聚糖」及「糖型」可互換使用且係指N 連接之寡醣，例如藉由天冬醯胺-N -乙醯基葡糖胺鍵連接至多肽之天冬醯胺殘基。N 連接之糖蛋白含有在蛋白質中連接於天冬醯胺殘基之醯胺氮的N -乙醯基葡糖胺殘基。D. 單鏈抗體
單鏈可變片段(scFv)為免疫球蛋白重鏈及輕鏈之可變區與短(通常為絲胺酸、甘胺酸)連接子連接在一起的融合物。儘管移除恆定區且引入連接肽，但此嵌合分子保留原始免疫球蛋白之特異性。此修飾通常未改變特異性。歷史上產生此等分子係為了幫助噬菌體呈現，其中特別適宜以單一肽形式表現抗原結合域。可替代地，scFv可直接由來源於融合瘤的次選殖之重鏈及輕鏈產生。單鏈可變片段缺乏完整抗體分子中所發現之恆定Fc區，且因此無法使用常用結合位點(例如，蛋白A/G)來純化抗體。此等片段通常可使用蛋白質L純化/固定，因為蛋白質L與κ輕鏈之可變區相互作用。
可撓性連接子一般包含促進螺旋及轉角之胺基酸殘基，諸如丙胺酸、絲胺酸及甘胺酸。然而，其他殘基亦可起作用。Tang等人(1996)使用噬菌體呈現作為自蛋白連接子文庫快速選擇單鏈抗體(scFv)之定製連接子之方法。構建隨機連接子文庫，其中重鏈及輕鏈可變域之基因係藉由編碼具有不同組成之18個胺基酸多肽的片段連接。將scFv組庫(大約5 × 106 個不同成員)呈現於絲狀噬菌體上且用半抗原進行親和力選擇。所選變體群展現結合活性之顯著增加，同時保持相當大的序列多樣性。隨後篩選1054種個別變體得到以可溶形式高效產生的催化活性scFv。序列分析揭示在VH C末端之後兩個殘基之連接子中的保守脯胺酸及在其他位置處之大量精胺酸及脯胺酸作為所選繫鏈(tether)之唯一常見特徵。
本發明之重組抗體亦可涉及允許受體二聚合或多聚合之序列或部分。此類序列包括衍生自IgA之彼等序列，其允許與J鏈一起形成多聚體。另一多聚合域為Gal4二聚合域。在其他實施例中，該等鏈可用允許兩個抗體組合的諸如生物素/抗生素蛋白之藥劑修飾。
在獨立實施例中，單鏈抗體可藉由使用非肽連接子或化學單元連接受體輕鏈及重鏈來產生。一般而言，輕鏈及重鏈將在不同細胞中產生，純化，且隨後以適當方式(亦即，重鏈之N端經由適當化學橋接連接至輕鏈之C端)連接在一起。
使用交聯試劑形成分子橋接，將兩個不同分子，例如穩定劑及凝聚劑之官能基系在一起。然而，預期可產生相同類似物之二聚體或多聚體或包含不同類似物之雜聚物複合物。為了以逐步方式連接兩種不同化合物，可使用異雙官能交聯劑消除不想要的均聚物形成。
例示性異雙官能交聯劑含有兩個反應性基團：一個與一級胺基團(例如，N-羥基丁二醯亞胺)反應，且另一個與硫醇基(例如，吡啶基二硫化物、順丁烯二醯亞胺、鹵素等)反應。經由一級胺反應性基團，交聯劑可與一種蛋白質(例如，選定抗體或片段)之離胺酸殘基反應，且經由硫醇反應性基團，已經繫栓至第一蛋白質上的交聯劑與另一蛋白質(例如，選擇性藥劑)之半胱胺酸殘基(游離硫氫基)反應。
較佳將採用在血液中具有合理穩定性之交聯劑。已知眾多類型的含有二硫鍵之連接子，其可成功地用於共軛靶向劑及治療劑/預防劑。含有位阻性二硫鍵之連接子可證明在活體內得到較大穩定性，從而防止靶向肽在到達作用部位之前釋放。因此此等連接子為一組連接藥劑。
另一交聯試劑為SMPT，其為含有藉由鄰近苯環及甲基「位阻」之二硫鍵的雙官能交聯劑。咸信二硫鍵之位阻起到保護該鍵免受可存在於組織及血液中之硫醇根陰離子(諸如谷胱甘肽)侵襲的功能，且藉此有助於防止共軛物在將連接藥劑遞送至目標位點之前解偶合。
如同許多其他已知之交聯試劑，SMPT交聯試劑能夠交聯諸如半胱胺酸之SH或一級胺(例如，離胺酸之ε胺基)之官能基。另一可能的交聯劑類型包括含有可裂解二硫鍵之異雙官能光反應性疊氮苯，諸如磺基丁二醯亞胺基-2-(對疊氮基水楊醯胺基)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯。N-羥基-琥珀醯亞胺基與一級胺基反應且疊氮苯(在光解後)與任何胺基酸殘基發生非選擇性反應。
除受阻交聯劑外，亦可根據本發明採用非受阻連接子。除含有或產生保護性二硫化物外，其他有用交聯劑包括SATA、SPDP及2-亞胺基硫雜環戊烷(Wawrzynczak & Thorpe, 1987)。在此項技術中充分瞭解此類交聯劑之使用。另一實施例涉及使用可撓性連接子。
美國專利4,680,338描述適用於產生配位體與含胺聚合物及/或蛋白質之共軛物，尤其用於形成抗體與螯合劑、藥物、酶、可偵測標記及類似者之共軛物的雙官能連接子。美國專利5,141,648及5,563,250揭示含有在多種溫和條件下可裂解之不穩定鍵的可裂解共軛物。此連接子特別適用於所關注之藥劑可直接鍵接至該連接子且裂解導致活性劑之釋放的情形。特定使用包括將游離胺基或游離硫氫基添加至蛋白質，諸如抗體或藥物。
美國專利5,856,456提供用於連接多肽組分以形成融合蛋白(例如單鏈抗體)之肽連接子。連接子為至多約50個胺基酸長度，含有出現至少一次之帶電荷胺基酸(較佳為精胺酸或離胺酸)，繼之以脯胺酸，且藉由較大穩定性及較少聚集表徵。美國專利5,880,270揭示適用於多種免疫診斷及分離技術中的含胺氧基之連接子。E. 純化
在某些實施例中，本發明之抗體可經純化。如本文中所使用，術語「純化」意圖指可與其他組分分離之組合物，其中相對於其天然可獲得之狀態，蛋白質經純化至任何程度。因此，純化之蛋白質亦指脫離其可天然存在之環境的蛋白質。在使用術語「實質上純化」之情況下，此名稱將指代其中蛋白質或肽形成組合物之主要組分的組合物，諸如蛋白質在組合物中佔約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%或更高。
蛋白質純化技術為熟習此項技術者熟知的。此等技術一方面涉及細胞環境粗品部分分離成多肽及非多肽部分。多肽已與其他蛋白質分離，所關注之多肽可進一步使用層析及電泳技術純化以實現部分或完全純化(或純化至均質)。特別適合於製備純肽之分析方法為離子交換層析法、排阻層析法、聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電聚焦。用於蛋白質純化之其他方法包括用硫酸銨、PEG、抗體及其類似物沈澱，或藉由熱變性，隨後離心；凝膠過濾、逆相層析、羥磷灰石層析及親和層析；及此類及其他技術之組合。
在純化本發明之抗體時，可能需要在原核或真核表現系統中表現該多肽且使用變性條件提取蛋白質。可使用結合至多肽之標記部分的親和管柱自其他細胞組分純化多肽。如此項技術中一般所知，咸信執行多個純化步驟之次序可改變，或可省略某些步驟，且仍為適用於製備實質上純化之蛋白質或肽的方法。
通常，利用結合抗體Fc部分之藥劑(亦即，蛋白A)部分分離完整抗體。可替代地，可使用抗原同時純化及選擇適當抗體。此類方法通常利用結合至支撐物，諸如管柱、過濾器或珠粒之選擇劑。抗體結合至支撐物，移除(例如，洗掉)污染物且藉由施加條件(鹽、熱等)釋放抗體。
熟習此項技術者根據本發明將獲知用於定量蛋白質或肽之純化程度的各種方法。該等方法包括例如，測定活性部分之比活性，或藉由SDS/PAGE分析評估一個部分內的多肽量。用於評估一個部分之純度的另一方法為計算該部分之比活性，將其與初始提取物之比活性相比較，且由此計算純度。用於表示活性之量的實際單位當然將取決於選擇用於跟蹤純化之特定分析技術及表現之蛋白質或肽是否展現可偵測之活性。
已知多肽之遷移有時可隨SDS/PAGE之不同條件而明顯變化(Capaldi等人, 1977)。因此，應理解，在不同電泳條件下，純化或部分純化之表現產物的表觀分子量可變化。V. 癌症之治療 A. 調配物及投藥
本發明提供包含抗LILRB抗體及用於產生該等抗體之抗原的醫藥組合物。此類組合物包含預防或治療有效量之抗體或其片段，及醫藥學上可接受之載劑。在一特定實施例中，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或洲政府之監管機構批准或在美國藥典或其他公認之藥典中列出適用於動物，且更特定言之適用於人類。術語「載劑」係指與治療劑一起投與之稀釋劑、賦形劑或媒劑。此類醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。當經靜脈內投與醫藥組合物時，水為特定載劑。亦可使用生理鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。其他適合之醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其類似物。
若需要，組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑，或pH值緩衝劑。此等組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、藥丸、膠囊、散劑、持續釋放調配物及其類似物之形式。口服調配物可包括標準載劑，諸如醫藥級之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適合之藥劑之實例描述於「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。此類組合物將含有預防或治療有效量的較佳呈純化形式之抗體或其片段，以及適量載劑，以便提供適合向患者投與之形式。調配物應適合投與模式，該投與模式可為經口、靜脈內、動脈內、頰內、鼻內、噴霧、支氣管吸入或藉由機械通氣遞送。
如本文所描述之本發明之抗體可經調配用於非經腸投與，例如，經調配用於經由皮內、靜脈內、肌肉內、皮下、腫瘤內或甚至腹膜內途徑注射。或者，抗體可藉由局部途徑，例如藉由鼻滴劑、吸入或藉由噴霧器直接投與至黏膜。醫藥上可接受之鹽包括酸鹽及與無機酸(諸如氫氯酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸及其類似酸)形成的彼等鹽。與游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；及有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)及其類似物。
抗體之被動轉移，稱為人工獲得性被動免疫，一般將涉及使用靜脈內注射。抗體之形式可為人類或動物血漿或血清、用於靜脈內(IVIG)或肌肉內(IG)使用的彙集之人類免疫球蛋白、來自免疫接種或由疾病恢復之供體的高滴度人類IVIG或IG，及單株抗體(MAb)。此類免疫一般僅持續較短時段，且亦存在超敏反應及血清疾病，尤其由非人類起源之γ球蛋白引起之超敏反應及血清疾病的潛在風險。然而，被動免疫提供即時保護。抗體將以適於注射(亦即，無菌及可注射)之載劑調配。
一般而言，本發明組合物之成分係單獨或混合在一起以單位劑型形式(例如以乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式)於指示活性劑之量的密閉密封容器(諸如安瓿或藥囊)中提供。當藉由輸注投與組合物時，可用含有無菌醫藥級水或生理鹽水之輸液瓶分配組合物。當藉由注射投與組合物時，可提供具有注射用無菌水或生理鹽水之安瓿，以使該等成分可在投與前混合。
本發明之組合物可調配為中性或鹽形式。醫藥學上可接受之鹽包括與陰離子形成之鹽，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及與陽離子形成之鹽，諸如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因等之鹽。 B.  細胞療法
在另一態樣中，本發明提供表現嵌合抗原受體(CAR)之免疫細胞。在一些實施例中，CAR包含本文所提供之抗原結合片段。在一實施例中，CAR蛋白自N端至C端包括：前導肽、抗LILRB4重鏈可變域、連接子域、抗LILRB4輕鏈可變域、人類IgG1-CH2-CH3域、間隔區、CD28跨膜域、4-1BB胞內共刺激信號傳導及CD3 ζ胞內T細胞信號傳導域。
亦提供包含投與本發明之有效量的免疫細胞之免疫療法的方法。在一個實施例中，醫學疾病或病症係藉由轉移引發免疫反應之免疫細胞群體來治療。在本發明之某些實施例中，癌症或感染係藉由轉移引發免疫反應之免疫細胞群體來治療。本文提供治療或延遲個體中癌症之進展的方法，其包含向個體投與有效量的抗原特異性細胞療法。
免疫細胞可為T細胞(例如調節T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或γ-δ T細胞)、NK細胞、恆定(invariant) NK細胞、NKT細胞或巨噬細胞。本文亦提供產生及工程改造免疫細胞之方法以及使用及投與該等細胞用於授受細胞療法之方法，在此情況細胞可為自體或同種異體細胞。因此，該等免疫細胞可用作免疫療法，以靶向癌細胞。
免疫細胞可分離自個體，特別是人類個體。免疫細胞可獲自健康人類個體、健康志願者或健康供體。免疫細胞可獲自所關注之個體，諸如懷疑患有特定疾病或病況之個體、懷疑易患特定疾病或病況之個體，或經歷用於特定疾病或病況之療法的個體。免疫細胞可收集自駐留於個體中任何位置，包括(但不限於)血液、臍帶血、脾、胸腺、淋巴結及骨髓之免疫細胞。經分離之免疫細胞可直接使用，或可儲存一段時間，諸如藉由冷凍。
免疫細胞可自其所駐留之任何組織，包括(但不限於)血液(包括由血庫或臍帶血庫收集之血液)、脾、骨髓、手術程序期間移除及/或暴露之組織，及經由活組織檢查程序獲得之組織富集/純化。富集、分離及/或純化免疫細胞之組織/器官可分離自活個體及非活個體兩者，其中非活個體為器官供體。在特定實施例中，免疫細胞分離自血液，諸如外周血液或臍帶血。在一些態樣中，免疫細胞分離自具有增強之免疫調節能力(諸如由CD4-或CD8-陽性T細胞抑制量測)之臍帶血。在特定態樣中，免疫細胞分離自彙集血液，特別是彙集臍帶血，以增強免疫調節能力。彙集血液可來自2個或更多個來源，諸如3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個來源(例如供體個體)。
免疫細胞群體可獲自需要療法或罹患與降低免疫細胞活性相關疾病的個體。因此，該等細胞對於需要療法之個體為自體的。或者，免疫細胞群體可獲自供體，較佳組織相容性匹配供體。免疫細胞群體可採集自外周血液、臍帶血、骨髓、脾，或免疫細胞駐留於該個體或供體中之任何其他器官/組織。免疫細胞可分離自個體及/或供體之彙集，諸如彙集臍帶血。
當免疫細胞群體獲自不同於個體之供體時，供體較佳為同種異體的，其限制條件為獲得之細胞為個體相容的以便其可引入至個體中。同種異體供體細胞可為或可不為人類白血球抗原(HLA)相容的。為呈現個體相容，可治療同種異體細胞以降低免疫原性。
可基因工程改造免疫細胞以表現諸如經工程改造之TCR及/或嵌合抗原受體(CAR)之抗原受體。舉例而言，修飾宿主細胞(例如，自體或同種異體T細胞)以表現針對癌症抗原具有抗原特異性的T細胞受體(TCR)。在特定實施例中，NK細胞經工程改造以表現TCR。NK細胞可進一步經工程改造以表現CAR。諸如針對不同抗原之多種CAR及/或TCR可添加至諸如T細胞或NK細胞之單一細胞類型中。
修飾之適合方法在此項技術中為已知的。參見，例如，Sambrook等人，見上文；及Ausubel等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY,1994。舉例而言，細胞可使用Heemskerk等人(2008)及Johnson等人(2009)中所描述之轉導技術來轉導以表現針對癌症抗原具有抗原特異性之T細胞受體(TCR)。
在一些實施例中，細胞包含編碼一或多種抗原受體之一或多種經由基因工程改造引入之核酸，及此類核酸之經基因工程改造之產物。在一些實施例中，核酸為異質核酸，亦即通常不存在於細胞或自該細胞獲得之樣品中的核酸，諸如自另一生物體或細胞獲得之核酸，該等核酸例如在經工程改造之細胞及/或此類細胞所來源之生物體中通常未發現。在一些實施例中，核酸並非天然存在的，諸如未在自然界中發現之核酸(例如，嵌合)。C. 組合療法
亦可能需要提供使用本發明之抗體與額外抗癌療法一起之組合治療。此等療法將以有效實現降低一或多個疾病參數之組合量來提供。此方法可涉及使細胞/個體與藥劑/療法兩者同時接觸，例如，使用包括兩種藥劑之單一組合物或藥理學調配物，或藉由使細胞/個體與兩種不同組合物或調配物同時接觸，其中一種組合物包括抗體且另一種包括另一藥劑。
可替代地，抗體可以數分鐘至數週範圍內之時間間隔先於或後於另一種治療。吾人通常將確保顯著時段在各遞送時間之間不終止，使得療法將仍能夠對細胞/個體發揮有利的組合效果。在此類情況下，預期吾人將在彼此約12-24小時內，彼此約6-12小時內，或僅約12小時之延遲時間用兩種模式接觸細胞。在某些情況下，可能需要延長進行顯著治療之時段；無論如何，在各別投藥之間會流逝若干10天(2、3、4、5、6或7)至若干週(1、2、3、4、5、6、7或8)。
亦可設想將需要超過一次投與抗DC-HIL抗體或其他療法。可採用各種組合，其中抗體為「A」及其他療法為「B」，如以下例示：
Figure 02_image001
涵蓋其他組合。為使用本發明之方法及組合物殺死細胞、抑制細胞生長、抑制癌轉移、抑制血管生成或以其他方式逆轉或減少腫瘤細胞之惡性表型，吾人可用抗體及至少一種其他療法接觸目標細胞或位點。此等療法將以有效殺死或抑制癌細胞之增殖的組合量提供。此過程可涉及使細胞/位點/個體與藥劑/療法同時接觸。
預期用於與本發明之抗體組合治療之特定藥劑包括化學療法及造血幹細胞移植。化學療法可包括阿糖胞苷(ara-C)及蒽環黴素(最常為道諾黴素)、單獨高劑量阿糖胞苷、全反式視黃酸(ATRA)以及誘導化學療法，在完成鞏固療法之後通常為蒽環黴素、組胺二鹽酸鹽(Ceplene)及介白素2 (Proleukin)，吉妥珠單抗奧佐米星(Mylotarg)用於年齡大於60歲患有復發之AML或復發之急性前髓細胞性白血病(APL)的患者，該等患者不為高劑量化學療法、氯法拉濱以及靶向療法(諸如激酶抑制劑、法呢基轉移酶抑制劑、地西他濱及多藥物耐性蛋白(MDR1)之抑制劑)或三氧化二砷之候選者。
在某些實施例中，用於組合療法之藥劑為一或多種選自由以下組成之群的藥物：拓樸異構酶抑制劑、蒽環黴素拓樸異構酶抑制劑、蒽環黴素、道諾黴素、核苷代謝抑制劑、阿糖胞苷、低甲基化劑、低劑量阿糖胞苷(LDAC)、道諾黴素及阿糖胞苷之組合、用於注射之道諾黴素及阿糖胞苷脂質體、Vyxeos®、氮胞苷、Vidaza®、地西他濱、全反式視黃酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、組胺二鹽酸鹽、Ceplene®、介白素-2、阿地介白素、Proleukin®、吉妥珠單抗奧佐米星、Mylotarg®、FLT-3抑制劑、米哚妥林、Rydapt®、氯法拉濱、法呢基轉移酶抑制劑、IDH1抑制劑、艾伏尼布(ivosidenib)、Tibsovo®、IDH2抑制劑、艾那尼布(enasidenib)、Idhifa®、斯莫森德(smoothened，SMO)抑制劑、格拉吉伯(glasdegib)、精胺酸酶抑制劑、IDO抑制劑、艾帕斯塔(epacadostat)、BCL-2抑制劑、維奈托克(venetoclax)、Venclexta®、鉑複合物衍生物、奧沙利鉑(oxaliplatin)、激酶抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、PI3激酶抑制劑、BTK抑制劑、依魯替尼、IMBRUVICA®、阿卡拉布魯替尼(acalabrutinib)、CALQUENCE®、贊魯替尼(zanubrutinib)、PD-1抗體、PD-L1抗體、CTLA-4抗體、LAG3抗體、ICOS抗體、TIGIT抗體、TIM3抗體、CD40抗體、4-1BB抗體、CD47抗體、SIRP1α抗體或融合蛋白、E-選擇蛋白之拮抗劑、與腫瘤抗原結合之抗體、與T細胞表面標記結合之抗體、與骨髓細胞或NK細胞表面標記結合之抗體、烷基化劑、亞硝基脲藥劑、抗代謝產物、抗腫瘤抗生素、衍生自植物之生物鹼、激素療法藥品、激素拮抗劑、芳香酶抑制劑及P-糖蛋白抑制劑。VI. 抗體共軛物
本發明之抗體可連接至至少一種藥劑以形成抗體共軛物。為了增加抗體分子作為診斷劑或治療劑之功效，通常連接或共價結合至少一個所需分子或部分，或與其形成複合物。此類分子或部分可為(但不限於)至少一個效應分子或報導子分子。效應分子包含具有所需活性，例如細胞毒性活性之分子。已經連接至抗體之效應分子的非限制性實例包括毒素、抗腫瘤劑、治療性酶、放射性核素、抗病毒劑、螯合劑、細胞介素、生長因子及寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，報導子分子定義為可使用分析法偵測之任何部分。已經共軛至抗體之報導子分子的非限制性實例包括酶、放射性標記、半抗原、螢光標記、磷光分子、化學發光分子、發色團、光親和性分子、著色粒子或配位體，諸如生物素。
抗體-藥物共軛物已出現作為研究癌症療法之突破方法。抗體-藥物共軛物(ADC)包含共價連接至細胞殺滅藥物之單株抗體(MAb)。此方法組合MAb對其抗原目標之高特異性與高度有效之細胞毒性藥物，產生將有效負載物(藥物)遞送至具有富集含量之抗原之腫瘤細胞的「武裝」MAb。藥物之靶向遞送亦將其在正常組織中之暴露量減至最少，其導致毒性降低且提高治療指數。FDA對兩種ADC藥物，2011年之ADCETRIS® (貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin))及2013年之KADCYLA® (曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine)或T-DM1)的批准證實了該方法。當前在用於癌症治療之臨床試驗之各種階段存在超過30種ADC候選藥物(Leal等人, 2014)。隨著抗體工程改造及連接子-有效負載物優化變得愈來愈成熟，新的ADC之發現及研發日益視適合於此方法之新的目標之鑑別及驗證以及靶向MAb之產生而定。ADC目標之兩個準則為腫瘤細胞中之上調/高水準表現及穩固內化。
抗體共軛物亦較佳用作診斷劑。抗體診斷劑一般分為兩類：用於活體外診斷，諸如用於多種免疫分析法中之診斷劑；及用於活體內診斷方案之診斷劑，一般稱為「抗體引導之成像」。此項技術中已知許多適當成像劑，以及其連接至抗體之方法(參見例如，美國專利5,021,236、4,938,948及4,472,509)。所用成像部分可為順磁性離子、放射性同位素、螢光染料、NMR可偵測之物質及X射線成像劑。
在順磁性離子之情況下，吾人可提及諸如鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、鈣(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)及/或鉺(III)之離子，其中釓尤佳。用於其他情形，諸如X射線成像之離子包括(但不限於)鑭(III)、金(III)、鉛(II)且尤其為鉍(III)。
在用於治療及/或診斷應用之放射性同位素之情況下，吾人可提及砹211 、14 碳、51 鉻、36 氯、57 鈷、58 鈷、銅67 、152 Eu、鎵67 、3 氫、碘123 、碘125 、碘131 、銦111 、59 鐵、32 磷、錸186 、錸188 、75 硒、35 硫、鎝99m 及/或釔90 。125 I通常較佳用於某些實施例中，且鎝99m 及/或銦111 亦由於其能量低及適用於遠程偵測而通常較佳。本發明之放射性標記之單株抗體可根據此項技術中熟知之方法製備。舉例而言，單株抗體可藉由與碘化鈉及/或碘化鉀及化學氧化劑(諸如次氯酸鈉)或酶氧化劑(諸如乳過氧化酶)接觸而碘化。根據本發明之單株抗體可用鎝99m 藉由配位體交換法，例如藉由用亞錫溶液還原高鎝酸鹽，將經還原之鎝螯合至葡聚糖凝膠管柱上且將抗體施加至此管柱上來進行標記。或者，可以使用直接標記技術，例如藉由培育高鎝酸鹽、還原劑(諸如SNCl2 )、緩衝溶液(諸如鄰苯二甲酸鈉-鉀溶液)及抗體。通常用於使以金屬離子形式存在之放射性同位素結合至抗體的中間官能基為二伸乙三胺五乙酸(DTPA)或伸乙基二胺四乙酸(EDTA)。
在預期用作共軛物之螢光標記中包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、級聯藍(Cascade Blue)、Cy3、Cy5,6-FAM、異硫氰酸螢光素、HEX、6-JOE、俄勒岡綠(Oregon Green) 488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、太平洋藍(Pacific Blue)、REG、若丹明綠(Rhodamine Green)、若丹明紅、腎造影劑(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明及/或德克薩斯紅(Texas Red)。
本發明所涵蓋之另一類抗體共軛物為預期主要在活體外使用的彼等共軛物，其中抗體連接至在與顯色受質接觸時將產生著色產物之二級結合配位體及/或酶(酶標記)。適合酶之實例包括尿素酶、鹼性磷酸酶、(辣根)氫過氧化酶或葡萄糖氧化酶。較佳之二級結合配位體為生物素及抗生素蛋白及抗生蛋白鏈菌素化合物。此類標記之使用為熟習此項技術者熟知的且描述於例如美國專利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149及4,366,241中。
將分子位點特異性連接至抗體之又一已知方法包含使抗體與基於半抗原之親和標記反應。本質上，基於半抗原之親和標記與抗原結合位點中之胺基酸反應，由此破壞此位點且阻斷特異性抗原反應。然而，由於其因抗體共軛物引起抗原結合之損失，此可為不利的。
亦可使用含有疊氮基之分子，經由低強度紫外光產生之反應性亞氨體中間物而與蛋白質形成共價鍵(Potter及Haley, 1983)。特定言之，已使用嘌呤核苷酸之2-疊氮基類似物及8-疊氮基類似物作為定點光探針以鑑別粗細胞提取物中之核苷酸結合蛋白(Owens & Haley, 1987；Atherton等人, 1985)。2-疊氮基核苷酸及8-疊氮基核苷酸亦用於定位純化蛋白質之核苷酸結合域(Khatoon等人, 1989；King等人, 1989；Dholakia等人, 1989)且可用作抗體結合劑。
此項技術中已知用於將抗體連接或共軛至其共軛物部分之若干方法。一些連接方法涉及使用金屬螯合劑複合物，採用例如有機螯合劑，諸如二伸乙三胺五乙酸酐(DTPA)；伸乙基三胺四乙酸；N-氯-對甲苯磺醯胺；及/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3連接至抗體(美國專利4,472,509及4,938,948)。單株抗體亦可與酶在諸如戊二醛或高碘酸鹽之偶合劑存在下反應。帶有螢光素標記物之共軛物係在此等偶合劑存在下或藉由與異硫氰酸鹽反應來製備。在美國專利4,938,948中，乳房腫瘤之成像係使用單株抗體實現且可偵測成像部分使用諸如甲基-對羥基苯甲亞胺酸酯或N-琥珀醯亞胺基-3-(4-羥苯基)丙酸酯之連接子結合至抗體。
在其他實施例中，涵蓋藉由使用不改變抗體組合位點之反應條件，在免疫球蛋白Fc區中選擇性引入硫氫基進行免疫球蛋白之衍生作用。根據此方法產生之抗體共軛物經揭示以展現改良之耐久性、特異性及敏感性(美國專利5,196,066，以引用的方式併入本文中)。文獻中亦已揭示效應分子或報導子分子之位點特異性連接，其中報導子分子或效應分子共軛至Fc區中之碳水化合物殘基(O'Shannessy等人, 1987)。據報導，此方法製造出在診斷上及治療上頗具前景之抗體，該等抗體當前處於臨床評價中。VII. 免疫偵測方法
在又其他實施例中，本發明涉及用於結合、純化、移除、定量及以其他方式大體上偵測LILRB相關之癌症的免疫偵測方法。儘管此類方法可在傳統意義上應用，但另一用途將為疫苗及其他病毒儲備液之品質控制及監測，其中可使用根據本發明之抗體評估病毒中H1抗原之量或完整性(亦即，長期穩定性)。或者，可使用該等方法針對適當/所需反應性型態篩選各種抗體。
一些免疫偵測方法包括例如酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫放射分析法、螢光免疫分析法、化學發光分析法、生物發光分析法及西方墨點法。特定言之，亦提供用於偵測及定量LILRB之競爭性分析。各種適用免疫偵測方法之步驟已描述於科學文獻中，諸如例如，Doolittle及Ben-Zeev (1999)、Gulbis及Galand (1993)、De Jager等人(1993)及Nakamura等人(1987)。一般而言，免疫結合方法包括獲得懷疑含有LILRB相關癌症之樣品，及視具體情況在有效允許免疫複合體形成之條件下，使樣品與根據本發明之第一抗體接觸。
此等方法包括自樣品偵測或純化LILRB或LILRB相關癌細胞之方法。抗體將較佳地諸如以管柱矩陣之形式連接至固體支撐物，且懷疑含有LILRB相關癌細胞之樣品將施加至固定之抗體上。不想要的組分將自管柱洗掉，留下與固定之抗體免疫複合之LILRB表現細胞，隨後藉由自管柱移除生物體或抗原進行收集。
免疫結合方法亦包括用於偵測及定量樣品中LILRB相關癌細胞或相關組分之量以及偵測及定量在結合方法期間形成之任何免疫複合體的方法。此處，吾人將獲得懷疑含有LILRB相關癌細胞之樣品且將樣品與結合LILRB或其組分之抗體接觸，隨後偵測及定量在特定條件下形成之免疫複合體的量。就抗原偵測而言，所分析之生物樣品可為懷疑含有LILRB相關癌症之任何樣品，諸如組織切片或試樣、均質化組織提取物、生物流體(包括血液及血清)，或分泌物，諸如糞便或尿液。
使所選生物樣品與抗體在有效條件下接觸且持續一段足以允許免疫複合體(主要免疫複合體)形成之時間一般約為僅僅將抗體組合物添加至樣品中且培育該混合物一段長至足以使該等抗體與LILRB形成免疫複合體(亦即，結合至LILRB)之時間。此後，一般將洗滌樣品-抗體組合物，諸如組織切片、ELISA盤、點漬墨或西方墨點，以移除任何非特異性結合之抗體物種，使得僅在主要免疫複合體內特異性結合之彼等抗體得到偵測。
一般而言，免疫複合體形成之偵測為此項技術中熟知的且可經由應用眾多方法實現。此等方法一般係基於標記或標記物，諸如彼等放射性標籤、螢光標籤、生物標籤及酶標籤中之任一者的偵測。關於使用此類標記之專利包括美國專利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149及4,366,241。當然，如此項技術中已知，吾人可經由使用二級結合配位體，諸如第二抗體及/或生物素/抗生素蛋白配位體結合排列發現額外的優勢。
用於偵測之抗體本身可連接至可偵測標記，其中吾人將僅僅偵測此標記，由此測定組合物中主要免疫複合體之量。或者，可藉助於對抗體具有結合親和力之第二結合配位體偵測主要免疫複合體內結合之第一抗體。在此等情況下，第二結合配位體可連接至可偵測標記。第二結合配位體本身通常為一種抗體，其因此可稱為「二級」抗體。主要免疫複合體與經標記之二級結合配位體或抗體在有效條件下接觸且持續一段足以允許二級免疫複合體形成之時間。隨後一般洗滌二級免疫複合體以移除任何非特異性結合之經標記二級抗體或配位體，且隨後偵測二級免疫複合體中之殘留標記。
其他方法包括藉由兩步法偵測主要免疫複合體。使用第二結合配位體，諸如對抗體具有結合親和力之抗體，形成如上文所描述之二級免疫複合體。洗滌之後，使二級免疫複合體與對第二抗體具有結合親和力之第三結合配位體或抗體再次在有效條件下接觸且持續一段足以允許形成免疫複合體(三級免疫複合體)之時間。第三配位體或抗體連接至可偵測標記，從而允許偵測由此形成之三級免疫複合體。若需要，此系統可提供信號放大。
一種免疫偵測方法使用兩種不同抗體。第一生物素化抗體用於偵測目標抗原，且隨後第二抗體用於偵測連接至複合生物素的生物素。在該方法中，首先在含有第一步驟抗體之溶液中培育待測試之樣品。若存在目標抗原，則一些抗體結合至抗原以形成生物素化抗體/抗原複合體。抗體/抗原複合體隨後藉由在具有抗生蛋白鏈菌素(或抗生素蛋白)、生物素化DNA及/或互補生物素化DNA之連續溶液中培育以進行擴增，其中各步驟將另外的生物素位點添加至抗體/抗原複合體中。重複擴增步驟，直至達到適合的擴增程度，此時，在含有針對生物素之第二步驟抗體的溶液中培育樣品。此第二步驟抗體例如用酶標記，該酶可藉由使用色原體受質之組織酶學偵測抗體/抗原複合體之存在。在適當擴增情況下，可產生在宏觀上可見之共軛物。
另一已知的免疫偵測方法利用了免疫-PCR (聚合酶鏈反應)方法。PCR方法在與生物素化DNA一起培育之前類似於Cantor方法，但並非使用多輪抗生蛋白鏈菌素及生物素化DNA培育，用低pH或高鹽緩衝液洗滌DNA/生物素/抗生蛋白鏈菌素/抗體複合體以釋放出抗體。隨後使用所得洗滌溶液在適合引子及適當對照物存在下進行PCR反應。至少在理論上，可利用PCR之巨大擴增能力及特異性偵測單抗原分子。1.  ELISA
免疫分析法在其最簡單且最直接之意義上為結合分析法。某些較佳的免疫分析法為此項技術中已知的各種類型之酶聯免疫吸附分析法(ELISA)及放射免疫分析法(RIA)。使用組織切片進行之免疫組織化學偵測亦為特別有用的。然而，易於理解的係，偵測不限於此類技術，且亦可使用西方墨點法、點漬墨法、FACS分析及其類似方法。
在一種例示性ELISA中，將本發明之抗體固定至展現蛋白質親和力之選定表面上，諸如聚苯乙烯微量滴定盤之孔中。隨後，將懷疑含有LILRB相關癌細胞之測試組合物添加至孔中。在結合及洗滌移除非特異性結合之免疫複合體之後，可偵測經結合之抗原。偵測可藉由添加連接至可偵測標記之另一抗LILRB抗體來實現。此類ELISA為簡單的「夾心ELISA」。偵測亦可藉由添加第二抗LILRB4抗體，隨後添加對第二抗體具有結合親和力之第三抗體實現，其中第三抗體連接至可偵測標記。
在另一例示性ELISA中，將懷疑含有LILRB4相關癌細胞之樣品固定至孔表面上且隨後與本發明之抗LILRB4抗體接觸。在結合及洗滌移除非特異性結合之免疫複合體之後，偵測經結合之抗LILRB4抗體。在初始抗LILRB4抗體連接至可偵測標記之情況下，可直接偵測免疫複合體。再次，可使用對第一抗LILRB4抗體具有結合親和力之第二抗體偵測免疫複合體，其中第二抗體連接至可偵測標記。
無論採用何種形式，ELISA均具有某些共同特徵，諸如塗覆、培育及結合、洗滌移除非特異性結合之物質，及偵測經結合之免疫複合體。下文中描述此等方式。
在用抗原或抗體塗覆盤時，吾人一般將該盤之孔與抗原或抗體溶液培育隔夜或指定的數小時時間。隨後洗滌該盤之孔以移除不完全吸附之材料。隨後，該等孔之任何殘留可用表面利用對測試抗血清呈抗原中性之非特異性蛋白質「塗覆」。此等蛋白質包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。該塗覆允許阻斷固定表面上之非特異性吸附位點且因此減小由該表面上抗血清之非特異性結合引起的背景。
在ELISA中，可能更常用的係，使用二級或三級偵測方式而非直接程序。因此，在蛋白質或抗體結合至孔，用非反應性材料塗覆以減小背景且洗滌移除未結合之材料之後，使固定表面與待測試之生物樣品在有效允許免疫複合體(抗原/抗體)形成的條件下接觸。隨後免疫複合體之偵測需要經標記之二級結合配位體或抗體，及二級結合配位體或抗體與經標記之三級抗體或第三結合配位體之組合。
「在有效允許免疫複合體(抗原/抗體)形成之條件下」意謂，條件較佳地包括用諸如BSA、牛γ球蛋白(BGG)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)/Tween之溶液稀釋抗原及/或抗體。此等添加之藥劑亦往往有助於減小非特異性背景。
「適合」條件亦意謂，培育係在足以允許有效結合之溫度或時間段下進行。培育步驟通常為較佳在約25℃至27℃之溫度下約1至2至約4小時左右，或可在約4℃左右下隔夜。
在ELISA中之所有培育步驟之後，洗滌接觸之表面，以便移除未形成複合體之材料。較佳洗滌程序包括用諸如PBS/Tween或硼酸鹽緩衝液之溶液洗滌。在測試樣品與最初結合之材料之間形成特定免疫複合體且隨後洗滌之後，可測定甚至微量免疫複合體之存在。
為提供偵測方式，第二或第三抗體將具有相關標記以允許偵測。較佳地，此標記將為在與適當顯色受質一起培育時顯色的酶。因此，舉例而言，吾人將需要使第一及第二免疫複合體與尿素酶、葡萄糖氧化酶、鹼性磷酸酶或氫過氧化酶共軛抗體在促進其他免疫複合體形成發展的條件下接觸或培育一段時間(例如，在室溫下於含PBS之溶液，諸如PBS-Tween中培育2小時)。
在與經標記抗體一起培育及隨後洗滌以移除未結合材料之後，定量標記之量，例如藉由與顯色受質，諸如脲，或溴甲酚紫，或2,2'-次偶氮基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)或H2 O2 (在過氧化酶作為酶標記之情況下)一起培育。隨後，藉由例如使用可見光譜分光光度計量測所產生之顏色的色度來實現定量。2. 西方墨點法
西方墨點法(或者，蛋白質免疫墨點法)為用於偵測給定組織勻漿或提取物樣品中之特異性蛋白質的分析技術。其使用凝膠電泳，藉由多肽之長度(變性條件)或藉由蛋白質之3-D結構(天然/非變性條件)來分離天然或變性之蛋白質。隨後將蛋白質轉移至膜(通常為硝化纖維素或PVDF)上，在其中使用目標蛋白質特異性抗體探測(偵測)該等蛋白質。
樣品可獲自完整組織或細胞培養物。在大多數情況下，首先使用摻混機(對於較大樣品體積)、使用均質機(較小體積)或藉由音波處理，以機械方式分解固體組織。亦可藉由以上機械方法中之一者破碎打開細胞。然而，應注意，細菌、病毒或環境樣品可為蛋白質之來源且因此西方墨點法並不僅僅侷限於細胞研究。可採用選定之清潔劑、鹽及緩衝劑促進細胞溶解及溶解蛋白質。通常添加蛋白酶及磷酸酶抑制劑以防止樣品經其自身酶消化。組織準備通常係在較冷溫度下進行以避免蛋白質變性。
使用凝膠電泳分離樣品中之蛋白質。蛋白質之分離可藉由等電點(pI)、分子量、電荷或此等因素之組合進行。分離之性質取決於樣品之處理及凝膠之性質。此為測定蛋白質之極有用方式。亦可使用二維(2-D)凝膠，其在兩個維度上擴散來自單一樣品之蛋白質。蛋白質在第一維度上根據等電點(使其具有中性淨電荷之pH)分離，且在第二維度上根據其分子量分離。
為了使蛋白質可用於抗體偵測，將其自凝膠內移至由硝化纖維素或聚偏二氟乙烯(PVDF)製成之膜上。將膜置放於凝膠頂部上，且在其頂部上置放一疊濾紙。將整個疊層置放於緩衝溶液中，該緩衝溶液在毛細作用下使蛋白質與其一起在濾紙上向前移動。用於轉移蛋白質之另一方法稱為電墨點法(electroblotting)且使用電流將蛋白質自凝膠拉至PVDF或硝化纖維素膜中。蛋白質自凝膠內移至膜上，同時維持其在凝膠內所具有之組織。此墨點法之結果為，蛋白質暴露於薄表面層上以進行偵測(參見下文)。膜之兩個種類係針對其非特異性蛋白質結合特性(亦即，同等地結合所有蛋白質)來選擇。蛋白質結合係基於疏水相互作用，以及膜與蛋白質之間的帶電相互作用。相較於PVDF，硝化纖維素膜更便宜，但要脆弱得多且無法經受住反覆探測。蛋白質自凝膠轉移至膜之均一性及總體效用可藉由用考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)或麗春紅染料(Ponceau S dye)對膜染色來檢查。一旦轉移，即使用經標記初級抗體或使用未標記初級抗體偵測蛋白質，隨後使用經標記蛋白質A或結合至初級抗體Fc區之二級經標記抗體間接偵測。3. 免疫組織化學
本發明之抗體亦可與製備用於免疫組織化學(IHC)研究之新鮮冷凍及/或福馬林固定、石蠟包埋之組織塊一起使用。由此等顆粒試樣製備組織塊之方法已成功地用於先前針對各種預後因子之IHC研究中且為熟習此項技術者熟知的(Brown等人, 1990；Abbondanzo等人, 1990；Allred等人, 1990)。
簡言之，可藉由以下方式製備冷凍切片：在室溫下使50 ng冷凍「粉碎」組織在小塑膠膠囊中之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中復水；藉由離心使粒子粒化；將其再懸浮於黏性包埋介質(OCT)中；倒轉膠囊及/或再藉由離心使其粒化；在-70℃異戊烷中急速冷凍；切割塑膠膠囊及/或移除冷凍之組織圓柱；將組織圓柱固定於低溫薄片切片機夾盤上；及/或自膠囊切割25-50個連續切片。或者，可使用完整的冷凍組織樣品進行連續切片切割。
永久性切片可藉由類似方法製備，該方法涉及在塑膠微量離心管中使50 mg樣品復水；粒化；再懸浮於10%福馬林中固定4小時；洗滌/粒化；再懸浮於溫熱的2.5%瓊脂中；粒化；在冰水中冷卻以使瓊脂變硬；自管中移除組織/瓊脂塊；使該塊浸潤及/或包埋於石蠟中；及/或切割至多50個永久性連續切片。又，可取代完整組織樣品。4. 免疫偵測套組
在又其他實施例中，本發明涉及與上文描述之免疫偵測方法一起使用的免疫偵測套組。由於抗體可用於偵測LILRB相關癌細胞，因此抗體可包括於套組中。因此，免疫偵測套組將在適合容器構件中包含結合至LILRB之第一抗體，及視情況選用之免疫偵測試劑。
在某些實施例中，抗體可預先結合至固體支撐物，諸如管柱矩陣及/或微量滴定盤之孔。套組中之免疫偵測試劑可呈多種形式中之任一者，包括與給定抗體關聯或連接至給定抗體之彼等可偵測標記。亦涵蓋與二級結合配位體關聯或連接至二級結合配位體之可偵測標記。例示性二級配位體為對第一抗體具有結合親和力之彼等二級抗體。
用於本發明套組中之其他適合的免疫偵測試劑包括兩組分試劑，其包含對第一抗體具有結合親和力之二級抗體，以及對第二抗體具有結合親和力之第三抗體，第三抗體連接至可偵測標記。如上所述，此項技術中已知多種例示性標記且所有此類標記均可結合本發明使用。
套組可進一步包含適合的LILRB等分組合物，無論標記或未標記，其可用於製備偵測分析之標準曲線。套組可含有呈完全共軛形式、呈中間物形式或呈有待套組之使用者共軛之獨立部分形式的抗體-標記共軛物。套組之組分可封裝於水性介質中或以凍乾形式封裝。
套組之容器構件將一般包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器，或可放入抗體或較佳適宜等分之其他容器構件。本發明之套組將通常亦包括用於容納抗體、抗原及任何其他試劑容器的呈緊密限制形式以供商業銷售的構件。此類容器可包括注射模製或吹塑模製塑膠容器，其中保留所需小瓶。5. 流式細胞量測術及 FACS
本發明之抗體亦可用於流式細胞量測術或FACS。流式細胞量測術為基於雷射或阻抗之技術，其用於許多偵測分析，包括細胞計數、細胞分選、生物標記偵測及蛋白質工程改造。該技術將細胞懸浮於流體液流中且使其通過電子偵測裝置，該電子偵測裝置允許同時對至多每秒數千粒子之物理及化學特徵進行多參數分析。流式細胞量測術通常用於診斷病症，尤其為血癌，但在基礎研究、臨床實踐及臨床試驗中具有許多其他應用。
螢光活化細胞分選(FACS)為特定類型之細胞量測術。其提供一種基於各細胞之特定光散射及螢光特徵，將生物細胞之非均質混合物分選至兩個或多於兩個容器中之方法，每次一個細胞。一般而言，該技術涉及細胞懸浮液夾帶於狹窄的、快速流動之液體流之中心。該流經配置以使得相對於其直徑細胞之間存在較大間隔。振動機制使細胞液流分裂成單個液滴。僅在液流分裂成液滴之前，該流通過量測各細胞之螢光的螢光量測台。充電環剛好置放於液流分裂成液滴之位置。在量測螢光強度之前，緊接著將電荷置放於環基上，且相反電荷在其分裂形成液流時經捕獲於液滴上。帶電液滴隨後經由靜電偏轉系統落下，該系統根據其電荷將液滴轉移至容器中。
在某些待用於流式細胞量測術或FACS之實施例中，本發明之抗體用螢光團標記且隨後允許與所關注的細胞結合，該細胞在流式細胞儀中分析或藉由FACS機器分選。 VIII.     實例
包括以下實例以表明本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術代表本發明人發現在本發明之實踐中運行良好之技術，且因此可視為構成其實踐之較佳模式。然而，根據本發明，熟習此項技術者應瞭解，在不脫離本發明之精神及範疇之情況下可在所揭示之具體實施例中作出許多改變且仍獲得相同或類似結果。實例 1
小鼠 . C57 BL/6J及NOD-SCID IL2Rγ空白(NSG)小鼠購自德克薩斯大學西南醫學中心(University of Texas Southwestern Medical Center，UTSW)之動物核心機構且在該處飼養。如先前所描述之Apoe 基因剔除(apoe -KO，Apoetm1Unc )小鼠31 購自Jackson Laboratory。動物研究已經批准且在UT西南機構動物護理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)之監管下進行。對於各實驗，使用相同性別及年齡匹配(4-8週)之小鼠且隨機分配至各組；且對於腫瘤大小量測及活體內腔成像實驗，小鼠之治療條件為盲化的。基於先前相關研究之結果計算各組中小鼠之最小數目。對於皮下腫瘤模型，藉由(寬度×寬度×長度) cm3 計算腫瘤大小。藉由UTSW IACUC准許之最大腫瘤量測值為腫瘤直徑2 cm。
細胞培養 . 293T細胞在補充有10%胎牛血清(FBS)之達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中在37℃於5% CO2 及正常含量O2 中培養。在37℃下於5% CO2 及正常含量之O2 中，人類臍帶靜脈/血管內皮細胞(HUVEC) (ATCC，CRL-1730)在內皮細胞生長培養基加生長因子、細胞介素及補充劑(EGM-BulletKit，Lonza)中培養。在37℃下於5% CO2 及正常含量之O2 中，人類單核球性AML細胞THP-1 (ATCC，TIB-202)、MV4-11 (ATCC，CRL-9591)及U937 (ATCC，CRL-1593.2)及小鼠AML細胞WEHI-3 (ATCC，TIB-68)在補充有10% FBS之洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI) 1640中培養。在37℃下於5% CO2 及正常含量之O2 中，小鼠AML細胞C1498 (ATCC，TIB-49)在補充有10% FBS之DMEM中培養。使用黴漿菌污染套組(R&D systems)對所有細胞株進行常規測試。
原代人類白血病細胞 . 原代人類AML及B-ALL樣品獲自UTSW之組織庫。知情同意書係根據由UTSW之機構審查委員會審查及批准之協定獲得。UTSW組包括105名根據法-美-英(FAB)分類表示AML亞型之AML患者、輕度成熟的急性骨髓母細胞白血病 (M1，n=9)、成熟的急性骨髓母細胞白血病(M2，n=34)、急性前髓細胞性白血病(M3，n=10)、急性骨髓單核細胞性白血病(M4，n=34)、急性單核球性白血病(M5，n=25)、急性紅血球系白血病(M6，n=2)及急性巨核母細胞白血病(M7，n=1)及患有未分化的白血病之患者(AUL；n=1)及暫時性骨髓增生病症(TAM；n=2)。樣品在含有10% DMSO之FBS中冷凍且儲存於液氮中。
人類正常單核球及巨噬細胞 . 人類正常單核球(CD14+ 細胞)係藉由AutoMACS Pro分離系統(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)自正常外周血液之單核細胞部分分離。簡言之，白血球層購自州際血庫(Interstate Blood Bank ) (Memphis, TN)且單核細胞層藉由Ficoll Hypaque (17144003, GE Lifesciences)密度梯度分離法進行分離。單核細胞用紅血球裂解緩衝液處理以移除紅血球且隨後在4℃下用CD14微珠粒共軛抗體(130-050-201, Miltenyi Biotech, Auburn, CA)培育15 min。隨後根據製造商之方案使用陽性選擇程式分離CD14陽性細胞。將一百萬個CD14+ 細胞接種於巨噬細胞培養基(6孔盤之各孔補充有10%人類AB血清(MT35060CI，Fisher Scientific)、1% NEAA (11-140-050，Fisher)、2 µM L-丙胺酸-L-麩醯胺酸(SH3003402，Fisher)之伊氏改良達爾伯克培養基(Iscove's modified Dulbecco's medium，IMDM) (12440053，Thermo fisher))中且培養7天。在培育之後，大部分細胞黏附至塑膠表面且對於CD14及特異於巨噬細胞之其他標記為陽性染色。
TCGA 分析 . 資料獲自TCGA急性骨髓性白血病資料庫(版本：2016年8月16日)。將患者分類為AML亞型(FAB分類) M0 (未分化之急性骨髓母細胞白血病) (n=16)、M1 (n=42)、M2 (n=39)、M3 (n=16)、M4 (n=35)、M5 (n=18)、M6 (n=2)、M7 (n=3)；兩種病例未藉由亞型分類。指示基因之mRNA水準係藉由RNA-seq(polyA+IlluminaHiSeq)來測定。報導RESM標準化計數且用UCSC Xena (xena.ucsc.edu)對資料進行分析及可視化。為分析總存活率，將160名具有可用存活率資料之患者基於其是否具有高、中等或低基因表現分成三組，且隨後藉由Xena Kaplan Meier標繪圖(http://xena.ucsc.edu/survival-plots/)進行分析。
流式細胞量測術 . 使用包括以下之初級抗體：抗人類CD45-PE (BD Pharmingen，HI30，1:100)、CD45-FITC (BD Pharmingen，HI30，1:100)、CD45-APC (BD Pharmingen，HI30，1:100)、抗人類CD34-FITC (BD Pharmingen，55582，1:100)、抗人類CD19-PE (eBioscience，HIB19，1:100)、抗人類CD20-PE (BD Pharmingen，555623，1:100)、抗人類CD11b-APC (eBioscience，ICRF44，1:100)、抗人類LILRB4-APC (eBioscience，ZM4.1，1:100)、抗人類LILRB4-PE (Biolegend，ZM4.1，1:100)、抗人類CD14-APC (eBioscience，61D3，1:100)、抗人類CD33-APC (Biolegend，P67.6，1:100)、抗人類CD4-APC (eBioscience，RPA-T4，1:100)、抗人類CD3-FITC (BioLegend，HIT3a，1:100)、抗人類CD3-太平洋藍(BD Pharmingen，SP34-2，1:100)、抗人類CD8-PE (BD Pharmingen，555367，1:100)、抗人類CD28-APC (eBioscience，CD28.2，1:100)、抗人類CD40L-APC (eBioscience，24-31，1:100)、抗人類PD1-APC (Biolegend，EH12.2H7，1:100)、抗人類TIM3-APC (eBioscience，F38-2E2，1:100)、抗人類TIGIT-APC (eBioscience，MBSA43，1:100)、抗人類LAG3-APC (eBioscience，3DS223H，1:100)、抗人類FasL-PE (eBioscience，24-31，1:100)、抗uPAR-APC (Biolegend，VIM5，1:100)、抗小鼠CD3-APC (BioLegend，17A2，1:200)、抗小鼠CD8a-PE (BioLegend，53-6.7，1:200)、抗小鼠CD45-PE (BD Pharmingen，30-F11，1:200)、抗小鼠CD49b-APC (eBioscience，DX5，1:200)、抗小鼠CD49f-PE (eBioscience，GoH3，1:200)、抗小鼠CD11b-APC (BioLegend，M1/71，1:200)、抗小鼠CD11b-PE (BioLegend，M1/71，1:200)、抗小鼠CD11c-APC (eBioscience，N418，1:200)、抗小鼠F4/80-APC (BioLegend，BM8，1:200)、抗His標記APC (R&D systems，AD1.1.10，1:400)及IgG同型對照APC (eBioscience，P3.6.2.8.1，1:400)抗體。細胞在Calibur上進行分析或在FACSAria上進行分析及分選。流量資料藉由Flowjo軟體分析。為分析NSG小鼠中之人類造血移植，遵循先前公開之方案。PI染色用於在分析及分選中排除死細胞。對於胞內染色，本發明人遵循來自eBioscience之固定/甲醇兩步驟方案。簡言之，針對LILRB4 (抗LILRB4-Alexa Fluor 647，Biolegend，ZM4.1，1:100)及CD33 (抗人類CD33-FITC，Biolegend，HIM3-4，1:100)及可固定的細胞活力染料eFluor 450 (Bioscience，目錄號65-0863-14，1:100)之表面表現，對人類原代AML細胞進行染色，隨後為固定(IC固定緩衝液，eBioscience，目錄號00-8222)及甲醇處理。此後，藉由抗p-SHP-2 (Y580)-PE (Cell signaling，目錄號13328S，1:100)、抗pIKKα/β (S176/180) (16A6) (Cell signaling，目錄號2697，1:100)、抗NFκB (S529)-PE (eBioscience，B33B4WP，1:100)、抗uPAR-PE (Biolegend，VIM5，1:100)、抗精胺酸酶-1 (D4E3M) (Cell signaling，目錄號93668，1:100)、兔IgG同型對照-PE (Cell signaling，目錄號5742，1:100)、小鼠IgG同型對照-PE (eBioscience，m2a-15F8，1:100)及抗兔IgG-PE (Jackson Immunoresearch Lab，目錄號111-116-144，1:400)針對胞內抗原對細胞進行染色以用於流式細胞量測術分析。
病毒結構及感染 . 對於逆轉錄病毒封裝，將質體構築體XZ201-IRES-GFP及XZ201-人類lilrb4 (hlilrb4 )-IRES-GFP與PCL-ECO (2:1)混合，隨後使用脂染胺2000 (Invitrogen)轉染至293T細胞中。對於慢病毒封裝，將基於CRISPER/Cas-9之gRNA (導向RNA)構築體及用於基因過度表現之其他構築體(包括-pLentiLox3.7-螢光素酶-IRES-GFP、ZsGreen-hlilrb4 及ZsGreen-hlilrb4 -intΔ、pLVX-plaur -IRES-tdTomato、pLVX-arg1 -IRES-tdTomato)與psPAX2及pMD2.G (Addgene)以4:3:1之比率混合且使用脂染胺2000 (Invitrogen)轉染至293T細胞中。含病毒之上清液在轉染後48-72小時收集且如先前所描述用於感染。
AML 細胞中基於 CRISPR/Cas9 之 基因剔除 . 人類AML細胞經表現多西環素-誘導性Cas9之慢病毒(pCW-Cas9，Addgene 50661)感染。在選擇1 μg/ml嘌呤黴素之後，存活細胞經表現sgRNA之慢病毒感染，該慢病毒由pSLQ1651 (Addgene 51024)修飾之質體產生，藉由GFP替換puro-mcherry進行分選。藉由在線工具(http://crispr.mit.edu)設計的加擾對照sgRNA (sgRNA 5'-GAACGACTAGTTAGGCGTGTA-3' (SEQ ID NO:211))、lilrb4 靶向sgRNA (sgRNA1 5'-TGTTACTATCGCAGCCCTGT- 3' (SEQ ID NO:212)；sgRNA2 5'-GTAGGTCCCCCCGTGCACTG-3' (SEQ ID NO:213)；sgRNA3 5'-CCTGTGACCTCAGTGCACGG-3' (SEQ ID NO:214))、apoe 靶向sgRNA (sgRNA1 5'-CTTTTGGGATTACCTGCGC-3' (SEQ ID NO:215)；sgRNA2 5'-AACTGGCACTGGGTCGCTTT-3' (SEQ ID NO:216))、shp-1 靶向sgRNA (sgRNA1 5'-TAAGACCTACATCGCCAGCC -3' (SEQ ID NO:217)；sgRNA2 5'-GAAGAACTTGCACCAGCGTC-3' (SEQ ID NO:218))、shp-2 靶向sgRNA (sgRNA1 5'- GAGACTTCACACTTTCCGTT -3' (SEQ ID NO:219)；sgRNA2 5'-TACAGTACTACAACTCAAGC-3' (SEQ ID NO:220))、ship 靶向sgRNA (sgRNA1 5'-CACGCAGAGCGCGTATGCCC-3' (SEQ ID NO:221)；sgRNA2 5'-TGGCAACATCACCCGCTCCA-3' (SEQ ID NO:222))分別選殖至sgRNA質體中。在用1 μg/ml多西環素(Sigma，目錄號PHR1789)處理1週之後，此等細胞用抗LILRB4抗體染色且LILRB4陰性細胞經分選為lilrb4 基因剔除細胞。對於apoe -、shp-1- 、shp-2- 及ship -基因剔除細胞，將GFP+ 細胞以每孔單個細胞分選至96孔盤中。在細胞擴增之後，基因剔除細胞藉由西方墨點法驗證。為活體內誘導CRISPR/Cas9以實現基因剔除，本發明人如所描述用多西環素餵食小鼠。簡言之，在Cas9/lilrb4 -sgRNA轉染之THP-1細胞植入後7天，小鼠經由每天管飼用2 mg/小鼠多西環素處理5天以在移植之白血病細胞中實現Cas9表現。藉由流式細胞量測術驗證基因剔除。
白血病細胞及 T 細胞 共培養分析 . 在共培養分析中，將自健康供體外周血液(PB009-1-0，AllCells)分離之人類T細胞(5 × 104 個/孔)與輻射(28 Gy)指示之人類白血病細胞混合於U形底96孔盤中。對於T細胞與白血病細胞之非接觸式共培養，白血病細胞在U形底96孔盤中之跨孔插入物(微孔尺寸，3 μM，#09-761-80，Thermo Fisher)之上部腔室中培養。將自健康供體分離之T細胞置放於96孔跨孔盤之下部腔室中。將輻射指示之白血病細胞(若未指示，則E:T比率=2:1)添加至上部腔室中且用指示之抗體、蛋白質及試劑處理。在用抗CD3/CD28塗覆之珠粒(11161D，Thermo Fisher)及50 U/ml rhIL-2培養5至7天之後，使用倒置顯微鏡拍攝代表性細胞，且T細胞用抗CD3抗體染色且藉由流式細胞量測術進行分析。
對於原代AML或B-ALL樣品，針對AML及B-ALL將患者白血病細胞分別分選為CD33+ 及CD19+ 。此等白血病細胞與來自同一患者之自體CD3+ T細胞或來自健康供體之同種異體T細胞一起培養(E:T比率=2:1)。在用抗CD3/CD28塗覆之珠粒(11161D，Thermo Fisher)及50 U/ml rhIL-2培養14天之後，使用倒置顯微鏡拍攝代表性細胞，且T細胞用抗CD3、抗CD4及抗CD8抗體染色且藉由流式細胞量測術進行分析。
對於細胞毒性分析，在96孔盤中用抗CD3/CD28/CD137塗覆之珠粒(11163D，Thermo Fisher)刺激自健康供體之PBMC分離的人類CD8+ T細胞(5 × 104 個/孔) 2天。隨後，添加指示之5 × 103 個白血病細胞及50至500 µg/ml抗LILRB4抗體或對照IgG。細胞數目在第7天在三個重複孔中測定。或在三個重複孔中用T細胞以指示之E:T比率培養指示之白血病細胞4至6小時。抗CD3及抗CD8用於偵測人類CTL細胞；指示之活THP-1對於GFP呈陽性且對於PI呈陰性。來自刺激之CTL細胞及用抗LILRB4或IgG處理之THP-1細胞之共培養物的細胞上清液用於使用人類細胞介素陣列(AAH-CYT-6，RayBiotech)檢測細胞介素產生。
對於小鼠白血病/T細胞共培養，來自野生型C57bl/6之脾細胞與2.5 × 104 個輻射(28 Gy)之小鼠白血病C1498細胞在U形底96孔盤中共培養60小時。將抗CD3/CD28塗覆之珠粒(11452D，Thermo Fisher)、50 U/ml 重組人類IL-2及來自野生型C57bl/6小鼠或來自apoe -KO小鼠之5%血清添加至培養基中。在一些實驗中，將50 μg/ml脂質結合之APOE蛋白(APOE-POPC)添加至培養基中。如所描述進行APOE重組蛋白之脂質化。
跨內皮遷移分析 . 為量測AML細胞經由內皮細胞遷移之能力，在跨孔膜(微孔尺寸為8 µm)上培養3 × 105 個HUVEC細胞。在3天之後，將1 × 105 個指示之白血病細胞接種於上部腔室中。在指示之實驗中，白血病細胞在上部腔室中用抗體或蛋白質處理。在18 h之後，對下部腔室中之細胞進行計數。
白血病細胞之短期浸潤分析及造血幹 / 先驅細胞 ( HSPC ) 之歸巢分析 . 將細胞(5×106 個細胞/小鼠)經靜脈內注射至NSG小鼠中。在注射白血病細胞之後立即用10 mg/kg之抗LILRB4抗體或對照IgG治療動物。在20小時之後，處死小鼠。採集外周血液、骨髓、肝臟及脾，且藉由流式細胞量測術檢測單細胞懸浮液。在指示之實驗中，CFSE、GFP或諸如抗人類CD45及抗人類CD33之指示標記用於偵測目標白血病細胞。白血病細胞在接受者肝臟、脾及骨髓中之數目以相對於外周血液中之細胞數目的比率報導。
為測試小鼠白血病細胞之浸潤能力，將5 × 106 個C1498-GFP-hLILRB4細胞或C1498-GFP經靜脈內注射至野生型C57BL/6J或APOE -空白小鼠中。在20 h之後，處死小鼠。GFP用於藉由流式細胞量測術偵測白血病細胞。白血病細胞在接受者肝臟、脾及骨髓中之數目經標準化為外周血液中之數目且以比率報導。
為測試HSPC歸巢能力，將1 × 107 個人類臍帶血單核細胞經靜脈內注射至NSG小鼠中。小鼠在注射單核細胞之後立即用10 mg/kg之抗LILRB4抗體或對照IgG治療且在20小時之後處死。抗人類CD45及抗人類CD34用於藉由流式細胞量測術偵測人類HSPC。類似地，為測試正常人類單核球之浸潤能力，來自健康供體PBMC之5 × 106 個CD14陽性選擇單核球藉由CFSE標記且經靜脈內注射至NSG小鼠中。小鼠在注射單核球之後立即用10 mg/kg之抗LILRB4抗體或對照IgG治療且在20小時之後處死。藉由流式細胞量測術分析CFSE陽性細胞。
先天性免疫細胞清除 . 在白血病細胞植入前3天，藉由腹膜內注射50 μl抗脫唾液酸GM1抗體(CL8955，Cedarlane)進行NK細胞清除，其導致NSG小鼠循環中CD45+CD49b+ NK細胞之清除＞90%。巨噬細胞藉由用氯屈膦酸鹽(二氯亞甲基雙膦酸鹽)脂質體(SKU8909，Clodrosome) (白血病細胞植入前3天200 μl儲備溶液)處理NSG小鼠而清除，其導致NSG小鼠循環中CD45+CD11b+F4/80+巨噬細胞之清除＞70%。白血病細胞植入後第-3、-2、-1及0天，藉由腹膜內注射200 μg抗Ly-6G mAb (BP0075-1，Bioxcell)，使NSG小鼠呈現中性白血球減少，其導致NSG小鼠循環中CD45.1+ CD11b+ CD11c- 嗜中性白血球之清除＞80%。
人類 AML 異種移植 .異種移植基本上如所描述進行2,3,6,7 。簡言之，6-8週齡之NSG小鼠用於移植。對於各靜脈內注射之小鼠，將1 × 106 個人類白血病細胞再懸浮於200 μl PBS中。小鼠立即經靜脈內給與10 mg/kg之抗LILRB4抗體或對照IgG。在移植之後三至四週，評估外周血液、骨髓、脾及肝臟之移植。藉由發光成像(最大值，3 × 108 p/sec/cm2 /sr；最小值，5 × 106 p/sec/cm2 /sr)隨時間推移監測白血病生長。對於存活曲線實驗，當瀕死的動物經安樂死時，記錄小鼠之死亡。對於患者來源之原代異種移植(PDX)，經由尾部靜脈注射給與各NSG小鼠5至10 × 106 個人類原代外周血液或骨髓單核細胞，其含有白血病細胞及其他正常區室，諸如正常造血幹細胞先驅細胞及自體T細胞。小鼠立即經靜脈內給與10 mg/kg之抗LILRB4抗體或對照IgG且一週治療兩次直至安樂死。對於AML#11，小鼠在白血病細胞植入後7天經靜脈內給與10 mg/kg之抗LILRB4抗體或對照IgG且一週治療兩次直至安樂死。白血病生長藉由外周血液中人類細胞之流式細胞量測術隨時間推移來監測。小鼠組織中超過1%之人類白血病細胞經視為原代AML細胞之成功移植。在移植之後一至四個月，評估外周血液、骨髓、脾及肝臟之移植。
對於hPBMC人類化模型，將1 × 107 個人類PBMC經靜脈內注射至各NSG小鼠中。在植入之後三週，小鼠具有30至50%之人類T細胞植入。在植入後3週，皮下植入1 × 106 個人類AML THP-1細胞，包括野生型、lilrb4 -KO THP-1細胞或穩定表現螢光素酶之THP-1細胞(THP-1-Luc-GFP細胞)。小鼠立即經靜脈內給與10 mg/kg之抗LILRB4抗體或對照IgG且一週治療兩次直至安樂死。藉由發光成像(最大值，1×108 p/sec/cm2 /sr；最小值，5×106 p/sec/cm2 /sr)隨時間推移監測腫瘤生長。腫瘤大小藉由測徑規量測(寬度×寬度×長度)測定。對於誘導性lilrb4 基因剔除實驗，將1 × 106 個Cas9/lilrb4 -sgRNA轉染之THP-1細胞藉由靜脈內注射於各NSG小鼠中，隨後立即靜脈內注射自健康供體分離之0.5 × 106 個人類正常T細胞。在THP-1及T細胞植入後7天，小鼠經由每天管飼用2 mg/小鼠多西環素治療5天以在移植之THP-1細胞中實現Cas9表現。在植入後3週，評估外周血液、骨髓、脾及肝臟之移植。
對於人類臍帶血(hCB)-異種移植模型，將2 × 104 個人類CD34+ hCB細胞經靜脈內注射至各NSG小鼠中。在植入之後六週，小鼠具有10至50%之人類細胞植入。靜脈內植入1 × 106 個穩定表現螢光素酶之THP-1細胞(THP-1-Luc-GFP細胞)。小鼠立即經靜脈內給與10 mg/kg之抗LILRB4抗體或對照IgG。藉由發光成像(最大值，1 × 108 p/sec/cm2 /sr；最小值，5 × 106 p/sec/cm2 /sr)隨時間推移監測腫瘤生長。藉由流式細胞量測術分析人類正常血細胞之譜系。
小鼠 AML 同種異體移植 . 小鼠AML同種異體移植之程序與人類AML異種移植之程序類似。簡言之，6-8週齡之野生型C57bl/6小鼠用於移植。對於各經靜脈內或皮下植入之小鼠，將1 × 106 個表現人類LILRB4之小鼠白血病細胞再懸浮於200 μl PBS中。小鼠在白血病細胞植入後7天經靜脈內給與10 mg/kg之抗LILRB4-N297A抗體或對照IgG且一週治療兩次直至安樂死。在移植之後三週，評估外周血液、骨髓、脾及肝臟之移植。對於皮下植入之小鼠，腫瘤大小藉由測徑規量測(寬度×寬度×長度)測定。對於存活曲線實驗，當瀕死的動物經安樂死時，記錄小鼠之死亡。對於CD8+ T清除，在白血病細胞植入之後3天靜脈內注射10 mg/kg抗CD8抗體(YTS 169.4.2，Bioxcell)且每3天額外治療兩次。為確定抗LILRB4抗體治療是否產生針對腫瘤或針對LILRB4之腫瘤特異性記憶體T細胞，本發明人進行脾細胞(5 × 106 個/小鼠)自抗LILRB4治療之小鼠至正常接受C57bl/6小鼠中之過繼轉移。五分之四的經移植小鼠排斥對照C1498-GFP小鼠白血病細胞，且此等小鼠不易遭受高3倍數目(3 × 106 /小鼠)之C1498-GFP白血病細胞的再攻擊。而自未治療小鼠過繼轉移脾細胞之5隻小鼠中無一者排斥對照C1498-GFP小鼠白血病細胞。
嵌合受體報導子分析 . 如所描述構築穩定嵌合受體報導子細胞系統，以測試配位體結合至單個LILRB、PirB、gp49B1及LILRB4位點突變之ECD且觸發成對免疫球蛋白樣受體β之嵌合融合之胞內域的活化或抑制之能力，該胞內域經由銜接子DAP-12傳導信號以活化NFAT啟動子。若促效劑或拮抗劑結合ECD且活化或抑制嵌合信號傳導域，則觀察到GFP表現分別增加或減少。競爭分析用於篩選LILRB4阻斷抗體。簡言之，將APOE蛋白(CI02，Novoprotein；10 μg/ml)或人類AB血清(10%，以PBS稀釋)在37℃下預塗覆於96孔盤上3小時。在用PBS洗滌兩次之後，將2 × 104 個LILRB4報導子細胞接種於各孔中；同時，將指示之抗LILRB4抗體添加至培養基中。在16小時之後，藉由流式細胞量測術分析GFP+ 報導子細胞之百分比。活化之臨限值為陰性對照處理之2倍。
快速蛋白質液相層析 (FPLC) 及質譜 . 將含10%人類AB血清之PBS裝載至16/60 Superdex 200凝膠過濾管柱上且用PBS及2mM EDTA溶離。收集八十個溶離份(40 ml)，且各溶離份(0.5 ml)藉由嵌合受體報導子分析進行分析。將活性溶離份(#26-30)裝載至PAGE凝膠上且經處理以進行LC-MS/MS分析(Orbitrap Elite)用於UTSW蛋白質組研究中心之蛋白質鑑別。用於驗證之重組或純化蛋白質為ZA2G (MBS145455, MyBioSource)、AMBP (13141-H08H1, Sino Biological Inc)、TTHY (12091-H08H, Sino Biological Inc)、PEDF (11104-H08H, Sino Biological Inc)、A2MG (MBS173010, MyBioSource)、HEMO (MBS143111, MyBioSource)、ANGT (MBS173525, MyBioSource)、A1AT (MBS173006, MyBioSource)、S100A9 (pro-814, Prospecbio)、HORN (EBP08267, Biotrend USA)、VTDB (CSB-EP009306HU, Biotrend USA)、LRG1 (pro-141, Prospecbio)、A1BG (RPE570Hu01, Cloud-Clone Corp)、CRSP3 (RD172262100, BioVendor)、APOA1 (16-16-120101-LEL, Athens Research & Technology)、APOA2 (16-16-120102, Athens Research & Technology)、APOA4 (16-16-120104, Athens Research & Technology)、APOB (16-16-120200, Athens Research & Technology)、APOC1 (16-16-120301, Athens Research & Technology)、APOC2 (16-16-120302, Athens Research & Technology)、APOC3 (16-16-120303, Athens Research & Technology)、hAPOE (16-16-120500, Athens Research & Technology)、mAPOE (CJ05, Novoprotein)、APOE2 (350-12, Peprotech)、APOE3 (350-02, Peprotech)、APOE4 (350-04, Peprotech)、PODXL2 (1524-EG-050, R&D systems)、CD44 (12211-H08H, Sino Biological Inc)、HCK (PV6128, Thermo Fisher)、VEGFR3 (10806-H08H, Sino Biological Inc)、NRG3 (16071-H08H, Sino Biological Inc)、PI16 (H00221476-P01, Novusbio)、hMAG (8940-MG-050, R&D systems)、mMAG (8580-MG-100, R&D systems)、CNTF (303-CR-050, R&D systems)、ANGPTL-7 (914-AN-025/CF, R&D systems)、整合素-α1β1 (7064-AB-025, R&D systems)、整合素-α2β1 (5698-AB-050, R&D systems)、整合素-α2β3 (7148-AB-025, R&D systems)、整合素-α3β1 (2840-A3-050, R&D systems)、整合素-α4β1 (5668-A4-050, R&D systems)、整合素-α4β7 (5397-A3-050, R&D systems)、整合素-α5β1 (3230-A5-050, R&D systems)、整合素-α5β3 (3050-AV-050, R&D systems)、整合素-α5β5 (2528-AV-050, R&D systems)、整合素-α5β6 (CT039-H2508H, Sino Biological Inc)、整合素-α5β6 (CT051-M2508H, Sino Biological Inc)、整合素-α5β8 (4135-AV-050, R&D systems)、整合素-α6β4 (5497-A6-050, R&D systems)、整合素-α8β1 (CT016-H2508H, Sino Biological Inc)、整合素-α9β1 (5438-A9-050, R&D systems)、整合素-α10β1 (5895-AB-050, R&D systems)、整合素-α11β1 (6357-AB-050, R&D systems)、整合素-αEβ7 (5850-A3-050, R&D systems)、整合素-αXβ2 (CT017-H2508H, Sino Biological Inc)及正常小鼠血清(NS03L, Millipore sigma)。
生物層干擾量測法 . LILRB4-Fc與APOE2、APOE3及APOE4之間的結合相互作用分析在Octet RED96 (ForteBio, Pall Corporation)上進行。所有相互作用研究均用蛋白A浸入即讀生物感測器(ForteBio)進行。所有結合實驗均在30℃下使用Octet Red及動力學緩衝液進行。在監測APOE之締合(300 s)及解離(600 s)之前，在動力學緩衝液中洗滌LILRB4-Fc塗覆之生物感測器(25 μg/ml LILRB4-Fc經裝載420 s)。背景波長變化為自僅裝載有LILRB4-Fc之參考感測器量測。
表面電漿子共振 (SPR). Biacore 2000及CM5晶片用於分析重組APOE與融合至hFc之LILRB4胞外域之結合，使用如先前所描述之方法2 。使用來自GE之胺偶合套組將重組蛋白A (Pierce)預固定於兩個流動細胞中。將LILRB4-hFc注射至待由蛋白A捕獲之流動細胞中之一者中。對於蛋白A偶合之細胞對照，校正含有捕獲之LILRB4-hFc的樣品流動細胞之各結合感測器圖譜。在每次注射誘導結合反應之抗原溶液及輸注操作緩衝液之解離期之後，藉由注射含有10 mM Na3 PO4 (pH 2.5)及500 mM NaCl之再生溶液來再生蛋白A表面。所有捕獲之LILRB4-hFc，在存在及不存在APOE結合之情況下均完全移除，且開始另一循環。所有量測在25℃下以30 µL/min之流動速率進行。
微尺度熱泳 (MST). 使用80% LED及20% IR雷射功率，在Monolith NT.115系統(NanoTemper Technologies)上進行MST實驗。雷射開啟及關閉時間分別設定為30 s及5 s。重組LILRB4-ECD蛋白(SinoBio)用4488-NHS (NanoTemper Technologies)標記且以5.9 nM之最終濃度施加。對PBS中未標記之His-APOE (CI06，Novoprotein)製備雙重稀釋系列，且各稀釋點類似地轉移至LILRB4-ECD溶液中。His-APOE之最終濃度範圍為0.36 nM至12 μM。將樣品填充至經標準處理之毛細管(NanoTemper Technologies)中進行量測。
西方墨點法及共免疫沈澱 . 全細胞在補充有蛋白酶抑制劑混合物(Roche Diagnostics)之勒姆利樣品緩衝液(Sigma-Aldrich)中裂解。樣品在SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad)上分離且轉移於硝化纖維素膜(Bio-Rad)上以進行蛋白質偵測。使用包括以下之初級抗體：抗SHP-1 (Cell signaling, 3759, 1:1000)、抗磷酸基-SHP-1 Tyr564 (Cell signaling, 8849, 1:500)、抗磷酸基-SHP-1 Tyr564 (Invitrogen, PA537708, 1:500)、抗SHP-2 (Cell signaling, 3397,1:1000)、抗磷酸基-SHP-2 Tyr580 (Cell signaling, 3703,1:500)、抗SHIP1 (Cell signaling, 2727, 1:1000)、抗磷酸基-SHIP1 Tyr1020 (Cell signaling, 3941, 1:500)、抗NFκB p65 (Cell signaling, 8242, 1:1000)、抗IKKα (Cell signaling, 11930, 1:1000)、抗IKKβ (Cell signaling, 8943,1:1000)、抗磷酸基-IKKα/β Ser176/180 (Cell signaling, 2697, 1:500)、抗IκBα (Cell signaling, 4814, 1:1000)、抗磷酸基-IκBα Ser32 (Cell signaling, 2859, 1:500)、抗核纖層蛋白-B2 (Cell signaling, 12255, 1:1000)及抗精胺酸酶-1 (Cell signaling, 9819, 1:1000)、抗uPAR (Invitrogen, MON R-4-02, 1:500)、抗LILRB4 (Santa cruz, sc-366213, 1:200)、抗APOE (Creative diagnostics, DCABH-2367, 1:250)、抗β-肌動蛋白(Sigma-Aldrich, A2066, 1:1000)及抗α-微管蛋白(Sigma-Aldrich, MABT205, 1:1000)，以及辣根過氧化酶(HRP)共軛之二級抗體(Cell signaling, 7074, 1:1,000及7076, 1:1,000)及化學發光受質(Invitrogen)。使用NE-PER核/細胞質提取套組(Thermo fisher, 78833)或質膜蛋白提取套組(Abcam, ab65400)進行特定之細胞區室分離。來自質膜部分之蛋白質進一步與抗LILRB4抗體及戴諾珠粒蛋白A (Thermo fisher, 10001D)一起培育用於進一步免疫沈澱及西方墨點法。
免疫組織化學 . 對腫瘤之石蠟切片進行蘇木精染色及免疫染色。使用之抗體係針對LILRB4 (實驗室生產，1:100)、CD3 (Abcam, ab16669, 1:100)、PD-1 (Thermo Fisher, J116, 14-9989-82, 1:100)及精胺酸酶-1 (Cell signaling, 9819S, 1:100)。使用Hamamatsu NanoZoomer 2.0-HT (Meyer instruments Inc., Houston, TX)觀測影像且在NPDview2軟體(Hamamatsu, Japan)中檢視。
細胞介素抗體陣列及精胺酸酶活性分析 . 為檢測白血病細胞之分泌蛋白，將條件培養基應用於人類細胞介素抗體陣列(AAH-CYT-1000, RayBio)以進行120種人類蛋白質之半定量偵測。影像J (NIH)用於定量。精胺酸酶活性藉由定量鉻精胺酸酶分析套組(DARG-100, BioAssay系統)在指示之白血病細胞之條件培養基中測定。
RNA-seq 分析 . 用Qiagen RNeasy迷你套組自分選之細胞純化RNA且隨後根據製造商之說明書用上標III逆轉錄酶(Invitrogen)進行逆轉錄。RNA-seq係在UTSW基因組學及微陣列核心設施(UTSW Genomics and Microarray Core Facility)處進行。使用Covaris S2超音波處理器對cDNA進行音波處理，且用KAPA高通量文庫製備套組(High Throughput Library Preparation Kit)製備文庫。樣品經末端修復，且3'末端用多重銜接子進行腺苷酸化及條碼化。PCR擴增之文庫用AmpureXP珠粒純化且在Agilent 2100生物分析儀上驗證。在標準化及彙集之前，樣品藉由Qubit (Invitrogen)定量且隨後在Illumina Hiseq 2500儀器上運行，使用PE100 SBS v3試劑以產生51-bp單端讀數。在定位之前，讀數經微調以移除末端中之低品質區。利用來自Illumina之UCSC iGenomes GTF檔案，使用TopHat v2.0.1227將微調的讀數定位至人類基因組(HM19)。
資料標準化及分析之方法係基於使用「內部標準」，該內部標準表徵系統行為之一些態樣，諸如技術可變性，如別處所示。log2 (倍數變化) ＞ 2、P ＜ 0.01及RPKM ＞ 0.1之基因經視為在兩個條件之間表現顯著不同且用於路徑分析及上游轉錄因子分析。使用DAVID (david.ncifcrf.gov/tools.jsp)進行路徑分析。使用QIAGEN之獨創性工具(在ingenuity.com/之萬維網)進行上游轉錄因子分析。
LILRB4 與 APOE 之分子對接 . LILRB4與APOE之對接係在Insight II封裝之ZDOCKpro模組上進行。運行ZDOCK之通用協定包括描述為幾何檢索及能量檢索之兩個連續的計算步驟，其分別在程式ZDOCK及RDOCK中運行。自PDB資料庫獲得LILRB4晶體結構(3P2T)及APOE3結構(2L7B)。前50個ZDOCK位姿經提供至RDOCK改進。在ZDOCK及RDOCK中均具有較高得分之位姿經選擇為LILRB4/APOE相互作用分析之候選複合物。
統計分析 . 來自四個獨立實驗或指示之獨立樣品的代表性資料以點圖(平均值±標準差)或箱線圖(中間值(線)、第25個-第75個百分位數(箱式輪廓)以及最小值及最大值(觸鬚))呈現。藉由雙尾學生t檢驗計算兩個樣品比較之統計顯著性。存活之統計顯著性藉由對數秩試驗計算。TCGA資料之多變量分析藉由Cox回歸進行分析。若p ＜0.05，則差異視為在統計學上顯著。n.s.，不顯著；p 值表示為精確值。皮爾森相關分析(Pearson's correlation analyses)用RStudio軟體(R基金會)進行。
LILRB4 及 h193 複合物之製備 。 編碼LILRB4 (成熟蛋白之殘基1-196)之胞外域的DNA經選殖於具有NdeI及XhoI限制位點之載體p ET21a (Novagen)中且表現於大腸桿菌病毒株BL21 (DE3) (Novagen)中。細菌在含有對應抗生素(100 μg/ml安比西林)之LB培養基中於37℃振盪培育箱中培養。當培養物達至0.8-1.0之OD600 時，藉由添加1 mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表現，且隨後在採集之前繼續培養4-6 h。將離心之細胞懸浮於PBS緩衝液(20 mM Na3 PO4 ，280 mM NaCl，6 mM KCl，pH 7.4)中且使用均質機(JNBIO，China)破碎。重組蛋白之包涵體經純化及再摺疊，如所描述進行一些修飾。簡言之，在4℃下將包涵體之等分試樣在攪拌再摺疊緩衝液(100 mM Tris-HCl，2 mM EDTA，400 mM L-精胺酸，0.5 mM經氧化麩胱甘肽及5 mM經還原麩胱甘肽)中逐滴稀釋8 h。再摺疊之蛋白質經濃縮且使用Amicon 8400濃縮器緩衝交換至含有20 mM Tris-HCl及50 mM NaCl (pH 8.0)之溶液。隨後，在前述相同交換緩衝液中，在HiLoad® 16/60 Superdex® 75 PG管柱(GE Healthcare)上，藉由凝膠過濾層析進一步純化蛋白質。合格的峰值分離蛋白質經濃縮用於進一步研究或結晶。h193-scFv經構築為VL-(GGGGS)4-VH且選殖至具有NdeI及XhoI限制位點之載體p ET21a (Novagen)中。scFv作為包涵體在大腸桿菌中過量表現且隨後如上文所描述經再摺疊及純化為LILRB4蛋白。隨後將LILRB4及h193-scFv以1:2之莫耳比混合在一起且在冰上培育1 h。LILRB4及h193-scFv複合物藉由HiLoad® 16/60 Superdex® 75 PG (GE Healthcare)層析進一步純化以自任何過量LILRB4中純化LILRB4/Hu193-scFv複合物。
LILRB4/h193 複合物之結晶 。 LILRB4/h193-scFv複合晶體為藉由氣相擴散以沉滴形式生長。將總共1 μl之5 mg/ml或10 mg/ml之複合物蛋白溶液與等體積的儲集溶液混合。晶體在18℃下在1% w/v胰化蛋白、0.05 M HEPES鈉(pH 7.0)、20% w/v聚乙二醇3,350中生長。晶體在液氮中冷凍於補充有17%甘油(體積/體積)作為低溫保護劑之儲集溶液中。在100 K下收集X射線繞射資料且用HKL2000進行索引、整合及縮放。複合物結構藉由分子置換方法使用來自CCP4程式套件之Phaser求解，分別以LILRB4 (PDB:3P2T)及抗體(PDB:4OQT)之結構作為檢索模型。初始受約束的剛體改進及手動建模分別使用REFMAC5及COOT進行，且使用Phenix進一步改進。實例 2
白血病細胞 上 表現之 LILRB4 抑制 T 細胞增殖 。 為確定AML發展及免疫調節之新穎機制，本發明人分析已知共刺激及共抑制受體之基因表現與AML患者之總存活率之間的關係，如TCGA資料庫中所記錄。蛋白表現及編碼白血球免疫球蛋白樣受體B4 (LILRB4) (一種在單核球性細胞上限制性表現之免疫抑制性受體)之mRNA之表現(Kang等人, 2016；Hirayasu及Arase, 2015；Trowsdale等人, 2015)及單核球性AML細胞(FAB M4及M5 AML亞型) (Dobrowolska等人, 2013)排列在與AML患者存活率呈負相關之清單頂部(圖 2A 及圖 6A )。重要的係，贅生性單核球之表面上的LILRB4蛋白水準高於正常單核球之表面上的水準(圖 2B )。
前述研究報導LILRB4之胞外域抑制T細胞活性(Vlad等人, 2010)。為測試在AML細胞上表現之LILRB4是否具有T細胞抑制功能，本發明人將LILRB4陽性白血病細胞、LILRB4陰性白血病細胞或正常造血細胞與自體T細胞或來自健康供體之T細胞共培養。僅LILRB4陽性單核球性AML細胞顯著抑制T細胞增殖(圖 2C 及圖 7A 至 7F )。隨後本發明人自人類單核球性AML THP-1及MV4-11細胞刪除lilrb4 且發現在lilrb4 基因剔除(lilrb4 -KO)後，AML細胞之T細胞抑制能力顯著降低，且藉由野生型lilrb4 (如lilrb4 -KO-wt)之強制表現而恢復，而未藉由具有缺失之胞內域之突變lilrb4 (如lilrb4 -KO-intΔ)恢復(圖 2D 及圖 8A 至 8E) 。 此外，當野生型THP-1細胞及人類T細胞在分開的跨孔中培養時，亦觀察到LILRB4介導之T細胞抑制且能夠藉由抗LILRB4阻斷抗體挽救(圖 8F 至 8L )。阻斷LILRB4導致細胞毒性T細胞之增加、AML細胞減少及T細胞細胞介素釋放增加(圖 8M 至 8O )。此等活體外資料表明，AML細胞需要LILRB4之胞內信號傳導用於抑制T細胞活性，而非胞外域(Vlad等人, 2010)。
隨後，本發明人使用人類化小鼠異種移植模型及免疫勝任小鼠模型以研究免疫檢查點阻斷中之LILRB4功能。皮下植入THP-1細胞，而非lilrb4 -KO THP-1細胞，導致人類T細胞重構小鼠中之AML發展，其藉由抗LILRB4治療阻斷(Mosier等人, 1988) (圖 9A 至 9G )。在人類化小鼠中建立之播散性白血病模型中，多西環素誘導之LILRB4缺失亦減弱白血病發展且恢復T細胞(圖 2E 至 2F 及圖 9H 至 9J )。另外，本發明人將表現人類LILRB4之小鼠C1498 AML細胞(hlilrb4 -C1498)皮下植入至C57BL/6小鼠中以建立同基因型免疫勝任小鼠模型。為自Fc效應功能排除抗腫瘤效應，本發明人用具有Fc糖基化位點N297A突變之抗LILRB4治療腫瘤攜帶小鼠(Ha等人, 2011)。LILRB4阻斷有效降低腫瘤負荷且延長存活期；清除CD8+ T細胞消除抗LILRB4抗體之抗腫瘤效應(圖 2G 至 2H )。此等結果表明LILRB4之腫瘤支持效應取決於宿主T細胞抑制。抗LILRB4抗體治療產生腫瘤特異性記憶體T細胞(圖 2I )。在播散性hlilrb4 -C1498同基因型小鼠模型中獲得類似結果(圖 10A 至 10D )。最後，LILRB4之阻斷顯著減少原代人類單核球性AML衍生之異種移植中之白血病發展(圖 2J 至 2K )且增加可移植自體人類T細胞之數目。總之，活體外及活體內結果指示單核球性AML細胞中之LILRB4信號傳導抑制T細胞介導之抗腫瘤免疫。
LILRB4 促進 AML 細胞遷移及浸潤。 單核球性AML之表徵特徵中之一者為腫瘤細胞之髓外浸潤增強(Straus等人, 1980)。本發明人觀察到LILRB4之抗體阻斷導致白血病向內臟(包括骨髓、肝臟及大腦)中之浸潤顯著減少。儘管抗LILRB4抗體治療未減小CD8+ T細胞清除之C57BL/6小鼠中皮下C1498腫瘤之大小(圖 2G )，但用抗LILRB4抗體之治療確實引起白血病細胞向肝臟之浸潤減少(圖 10A )。本發明人假設除T細胞抑制以外，LILRB4促進白血病浸潤。為測試此假設，本發明人進行跨內皮遷移及歸巢分析且監測與白血病細胞上之LILRB4表現有關之白血病浸潤。LILRB4清除之人類AML THP-1細胞在活體外的跨內皮遷移低於表現LILRB4之細胞。lilrb4 之缺失減少歸巢及AML細胞移植至造血器官，進而導致異種移植小鼠之存活期延長且體重減輕延遲。相比之下，人類LILRB4在小鼠AML C1498或WEHI-3細胞中之強制表現具有相反的效果(圖 12A 至 12D )。抗體介導之LILRB4阻斷展示在表現LILRB4之AML細胞中與lilrb4 基因剔除相同的效果(圖 12E 至 12G )。此效果取決於白血病細胞中之LILRB4表現及其胞內信號傳導，而非抗體之Fc效應功能(圖 3A 及圖 12H 至 12J )。此外，LILRB4阻斷減少原代單核球性AML細胞之浸潤能力(圖 3B 至 3D 及圖 13A 至 13C )。與前述研究一致之結果展示LILRB4+ AML胚細胞之循環頻率顯著低於LILRB4- AML母細胞(Dobrowolska等人, 2013)之循環頻率且LILRB4+ 慢性淋巴球性白血病細胞與淋巴組織損害相關(Colovai等人, 2007)。已知LILRB4+ AML細胞傾向於遷移之骨髓、肝臟及大腦具有某些免疫赦免(Crispe等人, 2006；Carson等人, 2006；Fujisaki等人, 2001)。因此，支援單核球性AML細胞之髓外浸潤增強的LILRB4介導之遷移亦可有助於免疫逃避。
APOE 為 LILRB4 之胞外結合蛋白。 抗LILRB4抗體阻斷AML細胞之免疫抑制及遷移功能表明LILRB4之彼等功能為配位體依賴型。整合素-αv β3 ，此前經鑑別為gp49B1之配位體，即小鼠LILRB4直系同源物(Castells等人, 2001)。然而，不同的整合素-αβ複合物並未活化人類LILRB4報導子細胞。出人意料地，人類血清及小鼠血清能夠活化LILRB4報導子但不能活化其他LILRB之報導子(圖 4A )。經由蛋白質液相層析分離，繼之以報導子分析及質譜，本發明人鑑別特異性活化LILRB4及小鼠PirB之報導子的APOE (圖 4B )。來自野生型而非APOE -空白小鼠之血清活化LILRB4報導子(圖 4C )。另外，脂質體重構之APOE蛋白(APOE-POPC)及無脂質之APOE兩者活化LILRB4報導子細胞(圖 4D )。藉由lilrb4 -KO顯著降低APOE與THP-1細胞之結合(圖 4E )。使用微尺度熱泳(MST)、表面電漿子共振(SPR)及生物層干擾量測法(Octet)確認重組APOE與LILRB4之特異性結合。如藉由MST所測定之解離常數為210 nM (圖 4F )。突變誘發研究展示APOE之N端結構域及LILRB4之第一Ig結構域中之P35及W106及兩個Ig結構域之間的連接區中之Y121對於APOE介導之LILRB4活化至關重要(圖 4G 至 4H )。
APOE活化免疫抑制性受體LILRB4之發現與APOE之充分證明的免疫抑制功能一致(Grainger等人, 2004；Ali等人, 2005)。為確定LILRB4之T細胞抑制活性是否依賴於APOE，本發明人檢測與對照或apoe -基因剔除人類AML細胞共培養之T細胞的增殖。APOE中缺乏之AML細胞恢復T細胞之增殖且抑制白血病細胞之遷移(圖 4I 及圖 14) 。此外，與用apoe -基因剔除小鼠血清處理之彼等細胞相比，當用野生型小鼠血清處理LILRB4異位表現之C1498細胞時，T細胞在共培養物中之百分比顯著降低(圖 4J 至 4K )。向小鼠脾細胞及表現LILRB4之AML細胞的共培養物中添加脂質體重構之APOE降低T細胞百分比(圖 4L )。此外，在野生型小鼠中，LILRB4之表現顯著增加向骨髓及肝臟浸潤之C1498細胞，但在APOE -空白受體中未增加(圖 4M )。此等資料指示APOE活化人類單核球性AML細胞上之LILRB4以抑制T細胞增殖且支援AML細胞遷移。
LILRB4 介導之胞內信號傳導控制 AML 細胞遷移及 T 細胞抑制。 本發明人設法鑑別T細胞抑制及白血病浸潤所需要的LILRB4之下游信號傳導。磷酸酶SHP-1、SHP-2及SHIP可補充至LILRB之胞內域(Kang等人, 2016)。lilrb4 -KO AML細胞中之SHP-2而非SHP-1或SHIP之磷酸化水準低於野生型細胞(圖 5A 及圖 15A )。SHP-2之缺失，而非SHP-1或SHIP之缺失，逆轉THP-1細胞對T細胞之抑制(圖 5B 及圖 15B )，且減少THP-1細胞之短期及長期浸潤(圖 5C 至 5D )。結果表明SHP-2為LILRB4信號傳導之介體。
獨創性路徑分析展示由SHP-2 (You等人, 2001)積極調節之NF-κB路徑(DiDonato等人, 2012)中之關鍵轉錄因子NFkB1及RELA之活性藉由lilrb4 之缺失而經最顯著地抑制(圖 5E )。不斷地，在lilrb4 -KO AML細胞中IKKα/β之磷酸化及核NF-κB之水準降低(圖 5F 至 5G 及圖 15A )。NF-κB信號傳導之抑制以LILRB4依賴型方式恢復T細胞抑制且減少AML細胞浸潤(圖 5H 至 5I 及圖 15C 至 15D )。因此，LILRB4活化之作用係經由NF-κB路徑介導的，其在AML亞型中之單核球性AML中特別地穩固(Baumgartner等人, 2002)。
與AML細胞抑制跨孔中之T細胞增殖的結果一致(圖 2D )，野生型THP-1細胞之條件培養基抑制T細胞活性，但lilrb4 -KO細胞之培養基並未抑制(圖 5J )。在WT THP-1細胞之條件培養基中比lilrb4 -KO對應物中存在更高之蛋白質中(圖 16A )，uPAR由單核球性AML細胞高度表現(Bene等人, 2004)。熟知uPAR (NF-κB目標)促進癌症侵襲、癌轉移、存活及血管生成(Su等人, 2016；Wang等人, 2000)。重組uPAR之添加以劑量依賴型方式降低與lilrb4 -KO THP-1細胞共培養之T細胞的增殖(圖 5K )。uPAR之此活性可能藉由AML細胞中之下游效應子介導，因為uPAR並不直接有效地降低T細胞增殖(圖 16B )。
精胺酸酶-1 (ARG1)，如uPAR，在lilrb4 -KO AML細胞中之表現顯著低於野生型細胞(圖 16C 至 16D )。ARG1藉由uPAR介導之信號傳導上調且抑制T細胞增殖(Hu等人, 2014；Ilkovitch及Lopez, 2009)，且可藉由APOE (Baitsch等人, 2011)及NF-κB (Hagemann等人, 2008)提高免疫抑制功能。本發明人假設ARG1為LILRB4-NF-kB-uPAR信號傳導之關鍵下游效應子。ARG1可由AML細胞分泌以抑制T細胞活性27 。重組ARG1在與lilrb4 -KO、apoe -KO及shp-2- KO AML或原代AML細胞之共培養中降低T細胞增殖(圖 5L 及圖 16E 至 16G )。另外，uPAR或ARG1之添加及過度表現分別在活體外及活體內挽救lilrb4 -KO AML細胞之遷移能力(圖 16H 及圖 5M )。總之，結果指示LILRB4/SHP-2/NF-κB/ uPAR/ARG1為單核球性AML細胞(圖 17 至 18 )中抑制免疫活性且支援白血病遷移之信號傳導路徑。
靶向LILRB4不僅可引起單核球性AML細胞之特異性攻擊，而且再活化包括T細胞及可能單核球/巨噬細胞之多種免疫細胞類型(Kang等人, 2016)。重要的係，因為LILRB4在正常單核球性細胞上限制性地表現(Kang等人, 2016)，其中LILRB4信號傳導可不同於白血病細胞(圖 19 )且LILRB4阻斷並未顯著干擾正常造血功能(圖 20A 至 20B )，所以LILRB4靶向可具有最低毒性。最後，LILRB4亦在某些其他類型之癌症及骨髓衍生之抑制細胞、耐受性樹突狀細胞及腫瘤相關巨噬細胞上表現(Kang等人, 2016；de Goeje等人, 2015；Chang等人, 2002；Suciu-Foca等人, 2007)。靶向LILRB4因此可在癌症治療中實現免疫療法及靶向療法之組合。
本發明人亦發現LILRB4在自實體癌症患者分離之骨髓衍生的抑制細胞(MDSC)上表現(圖 21A )。LILRB4之表現與MDSC之自體T細胞抑制能力正相關(圖 21B )。本發明人在MDSC/T細胞共培養中進行抗LILRB4治療且發現抗LILRB4治療增加共培養之T細胞的IFNγ分泌(圖 21C )。實例 3
本發明人隨後產生一批針對人類LILRB4胞外域(ECD)之兔單株抗體(mAb)。例示性LILRB4抗體之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸及核酸序列展示於圖 28A 至 28C 、圖 29A 至 29C 、圖 30A 至 30C 及圖 31A 至 31C 中。八種例示性LILRB4 mAb與LILRB4 ECD結合之ELISA結合結果展示於圖 22 及表 6 中。使用Octet測定之例示性LILRB4抗體之動力學結合量測值(感測器-公克)展示於圖 26 及表 7 中。
如圖 23A 中所說明，LILRB4 ECD具有兩個Ig結構域D1及D2。其突變顯著降低APOE對LILRB4之活化的兩種殘基(W106及Y121)分別位於第一Ig結構域D1中及兩個Ig結構域之間的連接子或鉸鏈區中。如圖 23B 中所展示，在與LILRB4 ECD結合之八種例示性mAb中，除B4-193以外的七種mAb結合至LILRB4之D1結構域。表 6. 藉由 ELISA 測定與人類 LILRB4 結合之 LILRB4 抗體之 EC50
Figure 108133096-A0304-0006
 表 7. 使用 Octet 生物感測器晶片測定的 LILRB4 抗體之動力學結合常數
Figure 108133096-A0304-0007
本發明人隨後使用人類LILRB4重組蛋白之LILRB4 D1結構域(D1)、D2結構域(D2)、柄區(SR)、D1+D2、D2+SR及全長ECD (D1+D2+SR)確定B4-193之結合域。如圖 24B 中所展示，在此特定ELISA分析中，B4-193僅與人類LILRB4之全長ECD結合。
本發明人隨後使用野生型及Y121A突變之人類LILRB4 ECD重組蛋白確定LILRB4上之胺基酸Y121對B4-193之結合的貢獻。如圖 25 中所展示，LILRB4之Y121A突變顯著降低B4-193與LILRB4之結合。
本發明人使用APOE競爭分析(圖 32 )、LILRB4-報導子細胞/K562-共培養分析(圖 33 )及LILRB4報導子細胞分析(圖 34 及圖 35 )量測例示性LILRB4 mAb在調節LILRB4活性中之作用。
本發明人亦藉由例示性抗LILRB4抗體測試與LILRB家族成員、LILRA家族成員以及食蟹獼猴LILRB4 (cynoB4)之交叉反應性(圖 36 及圖 37 )。
如圖 38 中所展示，例示性抗LILRB4抗體B4-193挽救THP-1細胞對T細胞之抑制。
如圖 39A 至 39C 中所展示，例示性抗LILRB4抗體128-3及B4-193抑制THP-1異種移植小鼠中之白血病發展，而對小鼠體重無顯著不良影響。實例 4
本發明人進一步產生一組基於B4-193之人類化抗LILRB4抗體。人類化B4-193抗體(h193)之重鏈及輕鏈可變區及其CDR之胺基酸序列展示於圖 28B 至 28C 、圖 30B 至 30C 、表 4 及表 5 中。本發明人使用流式細胞量測術、ELISA及Octet分析量測h193抗體與人類LILRB4之結合，其結果展示於圖 40 及表 8 中。表 8.h193 抗體結合至人類 LILRB4
Figure 108133096-A0304-0008
本發明人亦藉由h193抗體測試與LILRB家族成員、LILRA家族成員以及食蟹獼猴LILRB4 (cynoB4)之交叉反應性(圖 41A 至 41M 及圖 42 )。結果展示h193抗體不與LILRA家族成員或LILRB家族成員交叉反應，LILRB4除外。H193抗體亦可以不同程度結合至食蟹獼猴LILRB4蛋白。
本發明人使用ApoE競爭分析及K562共培養分析進一步量測h193抗體之拮抗及促效作用。如圖 43A (ApoE競爭分析)及圖 43B (K562細胞共培養分析)中所展示，大部分h193抗體抑制藉由ApoE誘導之LILRB4活性。
本發明人亦使用細胞介素陣列分析量測h193抗體在調節細胞介素釋放中之作用(圖 44 至 47 )。簡而言之，人類PBMC (1.5 × 106 個細胞/毫升)用h193抗體(20 μg/ml)處理48小時且隨後進行細胞介素陣列以量測120種細胞介素之含量。在另一分析中，在用h193抗體處理之前，人類PBMC與THP-1細胞(0.3 × 106 個細胞/毫升)共培養。人類IgG用作陰性對照。如圖 44A 至 44D 中所展示，h193抗體處理僅在PBMC中減少某些免疫調節及炎症過程細胞介素之分泌。如圖 45A 至 45D 中所展示，h193抗體處理增加與THP-1細胞共培養之PBMC中之某些免疫調節及炎症過程細胞介素的分泌。
在異種移植小鼠模型中，h193抗體抑制白血病發展(圖 48 )。實例 5
此實例說明經由LILRB4/h193複合物之結晶，LILRB4與h193抗體之間的相互作用之分子基礎。LILRB4之D1及D2結構域以及h193抗體之單鏈Fv片段(scFv)在大腸桿菌中表現為包涵體，且分別藉由活體外再摺疊方法獲得可溶性蛋白質。LILRB4-D1D2/h193 scFv複合物隨後經製備用於晶體篩選且複合物結構藉由分子置換以2.0 Å之解析度確定。
整體結構揭示h193抗體主要結合至LILRB4之D1與D2之間的連接區(圖 49A )。抗體利用重鏈(VH )及輕鏈(VL )兩者與LILRB4相互作用，涉及h193 抗體VH 及VL 區中之所有三個CDR環，VL 中之CDR2環除外(圖 49A 及表 9 )。特定言之，h193抗體與D1D2鉸鏈環及LILRB4分子之D2結構域之BC及C'E環結合。LILRB4 D1及D2結構域之鉸鏈環中之殘基K100、G96及S99與HCDR1 (S32)及HCDR2 (S59及D53)區兩者中之殘基形成三個氫鍵(圖 49B )，而D2結構域之BC環中之殘基R124不僅藉由形成兩個氫鍵與VH 中HCDR3之殘基H101相互作用，而且與VL 中之殘基I93 (LCDR3)貢獻一個氫鍵(圖 49C )。另外，LILRB4-D2之BC環中之H153藉由形成兩個氫鍵與HCDR3環之R94接觸(圖 49C )。LILRB4-D2之BC環中之殘基Q122及C'E環中之Q154與LCDR1環之殘基W32及N30形成三個氫鍵(圖 49C )。綜合而言，LILRB4之三個環經由包括多個氫鍵相互作用之連續接觸經h193抗體靶向。特別地，與h193抗體結合促成重要接觸之殘基Q122及H153在所有LILR分子中之LILRB4中為獨特的。此可促成h193抗體與LILRB4之特異性結合。表 9.h193 與 LILRB4 之間的相互作用
Figure 108133096-A0304-0009
數字表示抗體殘基與LILRB4殘基之間的原子與原子接觸數目，其藉由CCP4套件中之接觸程式進行分析(距離截止值為4.5 Å)。
圓括號中之數字表示在抗體殘基與LILRB4殘基之間的氫鍵數目。
本文所揭示及主張之所有方法可在不依據本發明進行不當實驗之情況下進行及執行。雖然已根據較佳實施例描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者應清楚變化可在不背離本發明之概念、精神及範疇的情況下應用於本文所描述之方法中及方法之步驟或步驟順序中。更特定言之，顯而易知在化學上及生理上相關之某些藥劑可取代本文所描述之藥劑，同時獲得相同或類似結果。對熟習此項技術者顯而易見的所有此類類似取代及修改視為在由隨附申請專利範圍所定義之本發明之精神、範疇及概念內。參考文獻 以下參考文獻特定地以引用之方式併入本文中，以便其對本文所述內容提供例示性程序或其他細節補充。 1 Curran, E. K., Godfrey, J. & Kline, J. Mechanisms of Immune Tolerance in Leukemia and Lymphoma.Trends Immunol , doi:10.1016/j.it.2017.04.004 (2017). 2 Kang, X.et al. Inhibitory leukocyte immunoglobulin-like receptors: Immune checkpoint proteins and tumor sustaining factors.Cell Cycle 15 , 25-40, doi:10.1080/15384101.2015.1121324 (2016). 3 Hirayasu, K. & Arase, H. Functional and genetic diversity of leukocyte immunoglobulin-like receptor and implication for disease associations.Journal of human genetics , doi:10.1038/jhg.2015.64 (2015). 4 Trowsdale, J., Jones, D. C., Barrow, A. D. & Traherne, J. A. 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以下圖式形成本說明書之部分且包括在此以進一步顯示本發明之某些態樣。參照此等圖式中之一或多者，結合本文中呈現之特定實施例之詳細描述，可更好地理解本發明。
圖 1A 至 1B 說明LILRA與LILRB家族成員之間的序列保守性。圖 1A 說明LILRB及LILRA家族成員之D1結構域中胺基酸序列一致性百分比。圖 1B 說明LILRB及LILRA家族成員之D1結構域之系統樹。
圖 2A 至 2K 說明表現於白血病細胞上之LILRB4抑制T細胞增殖。圖 2A ，LILRB4表面表現藉由對來自105名患者之樣品進行流式細胞量測術分析來定量。圖 2B ，比較來自相同AML患者(n=6)之正常單核球及贅生性單核球上之LILRB4表面表現。MFI：平均螢光強度。圖 2C ，自患有單核球性AML (AML#19)之患者分離的自體性T細胞(pT，患者T細胞)或自健康供體分離之同種異體T細胞(nT，正常T細胞)與來自患者AML#19 (n=3個生物獨立樣品，平均值±標準差)之經輻射LILRB4+或LILRB4- (B4+或B4-)原代白血病細胞一起培育。不同亞群之絕對T細胞數目(CD3+ CD8- CD4- 、CD3+ CD8+ CD4+ 、CD3+ CD8- CD4+ 及CD3+ CD8+ CD4- )以堆疊條形圖之不同顏色展示。圖 2D ，自健康供體分離之T細胞(E：效應細胞)以細胞接觸方式與指示之經輻射THP-1細胞(T：目標細胞)一起培育。CD3+ T細胞之數目以不同E:T比率展示。圖 2E 至 2F ，在NOD-SCID IL2Rγ-空白(NSG)小鼠(n=5)中，人類T細胞及靜脈內移植的多西環素(Dox)-誘導性lilrb4 基因剔除THP-1細胞(GFP+ )之移植。LV，肝臟；BM，骨髓。圖 2G ，在不存在或存在抗CD8之情況下，用抗LILRB4-N297A抗體或對照抗體治療(n=5)之C57BL/6小鼠中皮下植入之表現人類LILRB4的小鼠AML C1498細胞(hlilrb4 -C1498)之腫瘤生長。圖 2H ，皮下hlilrb4 -C1498腫瘤攜帶小鼠(n=12)之存活曲線。圖 2I ，自對照小鼠或藉由抗LILRB4-N297A治療治癒之腫瘤攜帶小鼠(n=5)過繼性移植脾細胞。根據時間監測腫瘤大小。箭頭指示用已消除白血病之小鼠(n=4)中AML細胞之3倍數目再次攻擊之時日。圖 2J 至 2K ，用抗LILRB4抗體或對照IgG (n=8個生物獨立樣品)治療後，自異種移植人類原代單核球性AML細胞之小鼠骨髓中CD45+ LILRB4+ 細胞百分比之代表性流程圖及定量。對16個獨立患者樣品重複實驗，其具有類似結果。
圖 3A 至 3D 展示LILRB4促進AML細胞遷移及浸潤。在重構或不重構LILRB4 (wt)或缺乏胞內域之LILRB4 (intΔ)的情況下，使用WT及lilrb4 -KO THP-1細胞(GFP+)。藉由流式細胞量測術測定在骨髓(BM)、肝臟(LV)及脾(SP)中之白血病細胞(GFP+)數目且將其標準化為外周血液中之數目。圖 3A ，NSG小鼠(n=5)中指示之WT或經修飾之THP-1細胞的短期(20小時)浸潤之比較。圖 3B 至 3D ，在用抗LILRB4抗體或IgG對照治療後之NSG小鼠(n=5)中，人類原代單核球性AML細胞之短期(20小時)浸潤之比較。n.s.，不顯著；p 值來自雙尾學生 t 檢驗(two-tailedstudent t-test )。
圖 4A 至 4M 展示APOE為LILRB4之胞外結合蛋白。圖 4A ，在存在10%人類血清、10%小鼠血清或PBS對照之情況下，活化之指示LILRB報導子細胞(GFP+ )之百分比。圖 4B ，藉由重組APOE (10 µg/ml)活化之指示LILRB報導子細胞之百分比。圖 4C ，藉由自野生型或apoe -基因剔除KO小鼠或PBS對照收集之10%小鼠血清活化之LILRB4報導子細胞之百分比。圖 4D ，藉由10 µg/ml之APOE、APOE-POPC、APOA1或APOA1-POPC活化之LILRB4報導子細胞的百分比。圖 4E ，His標記之APOE與WT及lilrb4 -KO THP-1細胞之結合。圖 4F ，使用微尺度熱泳(MST)來量測人類His標記之APOE-3與LILRB4-ECD之結合動力學。上圖：螢光強度(Flu.Int.)標繪圖及結合之回歸；下圖：對應之殘差(Resi.)與擬合標繪圖。圖 4G ，藉由WT及突變APOE蛋白活化之LILRB4報導子細胞之百分比。Mut-N，R142A/K143A/R145A/K146A/R147A/R150A；Mut-C1，殘基245-299之缺失；及Mut-C2，殘基279-299之缺失。圖 4H ，藉由APOE蛋白活化之指示LILRB4突變報導子細胞之百分比。干擾結合之突變資料以紅色在(圖 4G 至 4H )中突出顯示。圖 4I ，自健康供體分離之T細胞與指示之經輻射THP-1細胞(不具有(WT)或具有lilrb4 或apoe 基因剔除(lilrb4 -KO、apoe- KO-1、apoe -KO-2))一起培育。在7天後藉由流式細胞量測術分析T細胞。圖 4J 至 4L ，C57bl/6小鼠脾細胞(作為效應細胞或E)與經輻射表現人類lilrb4 (GFP-hlilrb4 )或對照(GFP) C1498細胞(作為靶細胞或T)以指示之E:T比率一起培育。細胞經補充有自WT或apoe -KO小鼠收集之5%血清，用抗CD3/CD28塗覆之珠粒培養60小時，且隨後用抗CD3抗體染色。展示樣品在20:1之E:T處之代表性流程圖(圖 4J )、CD3+ T細胞之百分比(圖 4K )及apoe -KO血清之APOE-POPC挽救效果(圖 4L )。圖 4M ，人類lilrb4 在小鼠白血病C1498細胞中之強制表現增加WT接受小鼠中之白血病細胞浸潤，但未增加apoe -KO接受小鼠(n=5)中的白血病細胞浸潤。n.s.，不顯著；p 值來自雙尾學生 t 檢驗。
圖 5A 至 5M 展示LILRB4介導之胞內信號傳導控制AML細胞遷移及T細胞抑制。圖 5A ，三種磷酸酶在野生型及lilrb4- KO THP-1細胞中之表現及磷酸化。圖 5B ，原代T細胞及經輻射指示THP-1細胞分別在下部及上部腔室中培養。在7天後藉由流式細胞量測術分析T細胞。圖 5C 至 5D ，shp-2 之基因剔除減少NSG小鼠(n=5)中THP-1細胞之短期及長期浸潤。圖 5E ，自lilrb4 -KO及WT THP-1細胞產生之RNA-seq資料之上游轉錄因子分析。黃色圓點突出顯示參與JAK/STAT及NF-κB路徑之轉錄因子。圖 5F ，lilrb4 -KO THP-1細胞中IKKα/β之磷酸化降低。圖 5G ，lilrb4 -KO THP-1細胞中核部分中之NFκB降低。圖 5H 至 5I ，NF-κB抑制劑逆轉WT THP-1細胞對T細胞之抑制(圖 5H )，及以LILRB4依賴型方式減少MV4-11細胞之浸潤(圖 5I )。圖 5J ，自健康供體分離之T細胞補充有WT或lilrb4 -KO THP-1細胞之25%條件培養基(CM)。拍攝代表性細胞(比例尺，100 µm)且藉由流式細胞量測術分析T細胞。圖 5K 至 5L ，將T細胞與補充有指示濃度之重組uPAR (uPA受體，亦稱為尿激酶受體) (圖 5K )或ARG-1 (精胺酸酶-1) (圖 5L )蛋白的輻射指示之THP-1細胞一起培育7天，且藉由流式細胞量測術進行分析。圖 5M ，uPAR (plaur )或ARG1之過度表現挽救lilrb4 -KO MV4-11細胞(n=5)之浸潤缺陷。n.s.，不顯著；p 值來自雙尾學生 t 檢驗。
圖 6A 至 6B 展示人類AML患者中之LIRB4表現且與患者總存活率負相關。圖 6A ，lilrb4 mRNA水準與來自TCGA資料庫之AML患者(n=160)之總存活率之間的相關性分析。低，n=57；中等，n=48；高，n=55。圖 6B ，在調節TCGA資料庫中包括年齡、細胞遺傳學及PML-RAR突變之混雜因子的情況下，用以評定相關性的多變量Cox回歸分析。總樣本大小為79。*，p ＜0.05視為顯著的。
圖 7A 至 7F 展示表現原代LILRB4之AML細胞抑制T細胞增殖。將自單個單核球性AML或B-ALL患者分離之自體性T細胞與來自同一患者之經輻射lilrb4 陽性(B4+)或lilrb4 陰性(B4-)原代白血病細胞一起培育。pT，患者T細胞。將自健康供體分離之同種異體T細胞與來自指示之AML或B-ALL患者的經輻射lilrb4 陽性或lilrb4 陰性原代白血病細胞以10:1之E:T一起培育。nT，正常T細胞。在用抗CD3/CD28/CD137塗覆之珠粒及rhIL-2培養14天之後，用抗CD3、抗CD4及抗CD8抗體染色T細胞且藉由流式細胞量測術進行分析。黑色p 值指示CD3+ CD8+ 細胞之顯著性；紅色p 值指示CD3+ CD4+ 細胞之顯著性。n.s.，不顯著。
圖 8A 至 8O 展示LILRB4抑制活體外T細胞增殖。圖 8A ，lilrb4 調節之THP-1細胞之製備及藉由流式細胞量測術檢測細胞表面上之LILRB4表現的示意圖。WT，用加擾對照處理之THP-1細胞；lilrb4- KO，lilrb4 基因剔除之THP-1細胞；lilrb4- KO-wt，野生型lilrb4 於lilrb4 -KO THP-1細胞上之強制表現；lilrb4- KO-intΔ，胞內域缺失突變lilrb4 於lilrb4 -KO THP-1細胞上之強制表現。圖 8B ，藉由流式細胞量測術檢測lilrb4 -KO MV4-11細胞之細胞表面上之LILRB4表現。圖 8C 至 8D ，lilrb4 在MV4-11細胞上之缺失降低T細胞抑制。自健康供體分離之T細胞在96孔跨孔盤(transwell plate)之下部腔室中與藉由具有3 µm孔隙之膜間隔開的上部腔室中之經輻射MV4-11細胞(2:1之E:T)一起培育。在用抗CD3/CD28塗覆之珠粒及rhIL-2培養7天之後，使用倒置顯微鏡(比例尺，100 µm)拍攝代表性細胞(圖 8C )且用抗CD3染色T細胞，且藉由流式細胞量測術進行分析(圖 8D )。n=3。圖 8E ，lilrb4 在MV4-11細胞上之缺失不影響細胞增殖。圖 8F 至 8G ，將自健康供體分離之T細胞(E：效應細胞)與指示之經輻射THP-1細胞(T：目標細胞)在跨孔中不直接接觸的情況下一起培育2天。E:T=2:1。用BrdU處理T細胞30 min，繼之以BrdU及7-AAD染色用於流式細胞量測術分析。代表性流式細胞量測術標繪圖展示於圖 8F 中且細胞週期狀態概述於圖 8G 中。在不存在THP-1細胞之情況下培養T對照、T細胞。圖 8H 至 8I ，將自健康供體分離之T細胞(E：效應細胞)用CFSE染色且與指示之經輻射THP-1細胞(T：目標細胞)在跨孔中不直接接觸的情況下一起培育2天。代表性流式細胞量測術標繪圖展示於圖 8H 中且藉由CFSE低染色指示之增殖性T細胞之百分比展示於圖 8I 中。圖 8J ，LILRB4在白血病細胞及T細胞之共培養中增加T細胞上之PD-1表現。將自健康供體分離之T細胞(E：效應細胞)以非接觸方式與指示之經輻射THP-1細胞(T：靶細胞)一起培育5天。E:T=2:1。用抗LAG-3、抗TIM-3、抗TIGIT、抗PD-1及抗FasL抗體染色T細胞以用於流式細胞量測術分析。展示代表性流式細胞量測術標繪圖且螢光強度之平均值經計算並展示於右上角(黑色，WT；紅色，KO)。實驗進行三次，具有類似結果。圖 8K ，抗LILRB4抗體對T細胞之增殖無影響。展示IgG或抗LILRB4抗體活體外處理5天後之人類原代T細胞之數目(n=3個具有平均值及標準差之生物獨立樣品)。圖 8L ，將原代T細胞及經輻射THP-1細胞(E:T比率，2:1)分別置放於下部腔室及上部腔室且用10 µg/ml對照IgG或抗LILRB4抗體處理。用抗CD3染色T細胞且藉由流式細胞量測術進行分析。圖 8M ，用抗CD3/CD28/CD137塗覆之珠粒刺激之原代T細胞與WT或lilrb4 -KO-THP-1細胞以指示之E:T比率共培養4小時。白血病細胞之細胞毒性藉由流式細胞量測術分析中之PI染色來測定(n=3個具有平均值及標準差之生物獨立樣品)。圖 8N 至 8O ，用抗CD3/CD28/CD137塗覆之珠粒刺激之CD8+ T細胞(5 × 104 個細胞)與穩定表現GFP之5 × 103 個THP-1細胞共培養，且用100 µg/ml抗LILRB4抗體或對照IgG處理5天。n=4。展示GFP+ 白血病細胞之定量(圖 8N ，n=4個生物獨立樣品)及IFNγ之分泌(圖 8O ，n=3個具有平均值及標準差之生物獨立樣品)。n.s.，不顯著。
圖 9A 至 9J 展示LILRB4之抑制減少人類化免疫功能不全小鼠中之白血病發展。圖 9A 至 9C ，將WT或lilrb4 -KO THP-1細胞(3 × 106 個細胞/小鼠)皮下植入至hPBMC-繁殖之NSG小鼠(WT，n=14隻具有平均值及標準差之小鼠；lilrb4 -KO，n=10隻具有平均值及標準差之小鼠)中。展示腫瘤大小(圖 9A )、第31天接受小鼠之外周血液中CD3+ 之定量(圖 9B )及展示CD4+ 及CD8+ T細胞之代表性流程圖(圖 9C )。圖 9D 至 9E ，LILRB4增加腫瘤浸潤之T細胞上之PD-1表現。將WT或lilrb4 -KO THP-1細胞皮下植入於hPBMC繁殖之NSG小鼠中。在植入後三週，10隻WT組小鼠中之7隻具有較大腫瘤且10隻KO組小鼠中之3隻具有微小腫瘤。此等腫瘤經解剖用於藉由抗LILRB4、抗CD3、抗PD-1或抗精胺酸酶-1抗體染色進行免疫組織化學及流式細胞量測術。圖 9D ，自黃色突出顯示區放大左角影像。在CD3及PD-1染色影像中，橙色虛線指示腫瘤邊界。黑色箭頭指示PD-1陽性細胞。比例尺，100 μm。圖 9E ，解剖腫瘤且用抗CD3及抗PD-1抗體染色腫瘤區中之細胞以用於流式細胞量測術分析。計算PD-1+ T細胞之百分比(PD-1+ CD3+ 細胞/CD3+ 細胞之比率)。圖 9F 至 9G ，將THP-1細胞移植至hPBMC-繁殖之NSG小鼠中，且在6天後用對照IgG或抗LILRB4抗體治療小鼠(10 mg/kg；n=5)。亦展示第26天代表性小鼠中之T細胞數目。圖 9H 至 9I ，在Dox投與前第7天在NSG小鼠(n=5)中，人類T細胞及靜脈內移植的多西環素(Dox)-誘導性lilrb4 基因剔除THP-1細胞(GFP+ )之移植。圖 9J ，代表性流程圖展示LILRB4在終點在Dox餵食小鼠之骨髓中之移植白血病細胞中經成功刪除。n.s.，不顯著。
圖 10A 至 10D 展示抗LILRB4抗體降低同基因型小鼠中之白血病發展。圖 10A ，將穩定表現LILRB4-IRES-GFP之小鼠AML C1498細胞(3 × 106 個細胞/小鼠)皮下植入至C57bl/6 小鼠中。抗LILRB4-N297A抗體或對照IgG在腫瘤細胞植入後第6、9、12、15、18及21天經靜脈內注射。兩組小鼠在腫瘤細胞植入後第3、6、9及12天用抗CD8抗體治療以實現CD8+ T細胞清除。抗LILRB4抗體減少白血病細胞浸潤至諸如肝臟(LV，圖 10A 中)之宿主組織中，即使在CD8+ 細胞清除時(圖 10A )。圖 10B 至 10D ，C57bl/6 小鼠經靜脈內植入表現人類LILRb4之小鼠AML C1498細胞(3 × 106 個細胞/小鼠)，該細胞表現GFP。抗LILRB4-N297A抗體(n=9隻小鼠)或對照IgG (n=9隻小鼠)在腫瘤細胞植入後第6、9、12、15及18天經靜脈內注射。抗LILRB4抗體降低骨髓(BM)中白血病細胞之百分比(圖 10B )。抗LILRB4抗體增加骨髓中之CD8+ T細胞(圖 10C )。骨髓中CD8+ T細胞之百分比與白血病細胞之百分比顯著負相關(圖 10D )。n.s.，不顯著。所有p 值(皮爾森相關(Pearson's correlation)之圖10D除外)來自雙尾學生 t檢驗。
圖 11A 至 11B 展示抗LILRB4抗體在PDX小鼠中降低白血病發展且恢復自體T細胞。圖 11A ，將來自十六名人類患者(三名展示於圖 2J 至 2K 中)中之每一者之原代外周血液或骨髓單核AML細胞(5 × 106 至1 × 107 個細胞/小鼠)注射至NSG小鼠中，隨後用IgG或抗LILRB4抗體(10 mg/kg，一週兩次靜脈內注射)治療。展示移植後第2至4個月自包括骨髓、脾、肝臟及外周血液之造血組織採集的人類CD45+ LILRB4+ AML細胞之百分比，如藉由流式細胞量測術所測定。圖 11B ，展示移植後第2至4個月自包括骨髓、脾、肝臟及外周血液之造血組織採集的自體人類T細胞之百分比，如藉由流式細胞量測術所測定；及三種PDX小鼠骨髓中CD3+ CD8+ T細胞之代表性流程圖。n.s.，不顯著。除具有n=20個生物獨立樣品之AML#11外，所有PDX具有n=8個生物獨立樣品。
圖 12A 至 12J 展示LILRB4促進AML細胞之浸潤。圖 12A 及 12B ，小鼠AML細胞C1498 (圖 12A )或穩定表現lilrb4 之WEHI-3 (圖 12B )上之人類LILRB4表現的檢測。圖 12C ，LILRB4之強制表現不影響諸如WEHI-3之小鼠AML細胞(n=3)之細胞增殖。圖 12D ，人類LILRB4之強制表現促進小鼠AML WEHI-3細胞(n=3)之跨內皮遷移。圖 12E ，NSG小鼠(n=6)經注射有1 × 106 個THP-1細胞，隨後立即藉由IgG或抗LILRB4抗體治療且藉由生物發光成像進行監測。圖 12F 至 12G ，抗LILRB4抗體減少AML細胞浸潤至內臟中。在移植1 × 106 個表現螢光素酶之THP-1細胞後第21天處死小鼠以用於內臟之離體生物發光成像。展示代表性小鼠之發光通量(輻射)之影像(圖 12F )。1：胃腸(GI)道；2：腿；3：肺；4：脾；5：肝臟；6：腎臟；7：大腦；8：心臟。浸潤之白血病細胞在肝臟中形成腫瘤節結(圖 12G )。圖 12H ，抗LILRB4抗體對LILRB4陰性癌細胞無影響。LILRB4經表現於THP-1及MV4-11人類AML細胞上，而非U937細胞上。NSG小鼠經注射有不表現LILRB4之U937人類AML細胞，且隨後用抗LILRB4抗體治療(圖 12H )。IgG充當對照抗體。移植後第25天處死小鼠以藉由流式細胞量測術分析LV、BM、SP及PB。人類AML細胞之存在藉由抗人類CD45抗體染色來偵測(n=3)。圖 12I ，NSG小鼠中之靶向免疫細胞群體經清除。代表性流式細胞量測術標繪圖表明與未清除(野生型) NSG小鼠相比，藉由分別用抗去唾液酸GM1抗體、氯屈膦酸鹽脂質體及抗Ly6G抗體治療清除各別免疫細胞亞型之NSG小鼠中NK細胞(CD45+ CD49b+ )、巨噬細胞(CD11b+ F4/80+ )及嗜中性白血球(CD11b+ CD11c- )頻率之成功降低。圖 12J ，將CFSE標記之MV4-11細胞(5×106 個/小鼠)注射至NSG小鼠中，其中各別先天性免疫細胞經清除，隨後立即藉由IgG或抗LILRB4-N297A抗體治療(n=5)。展示注射後之20小時LV、SP及BM中之白血病細胞(CFSE陽性)數目標準化為PB中之數目。n.s.，不顯著。
圖 13A 至 13C 展示抗LILRB4抑制原代AML細胞之浸潤。在用抗LILRB4抗體或IgG對照治療後之NSG小鼠(n=5)中人類原代單核球性AML細胞浸潤之比較。圖 13A 至 13B ，注射來自單核球性AML患者之原代人類外周血液單核細胞。圖 13C ，注射具有異種移植之原代人類單核球性AML細胞(人類CD45+ LILRB4+ 細胞)之小鼠肝細胞。n.s.，不顯著。所有p 值來自雙尾學生 t 檢驗。
圖 14A 至 14G 展示AML細胞中APOE之缺失在活體外恢復T細胞增殖且抑制AML細胞遷移。藉由免疫墨點法檢測apoe- 基因剔除THP-1及MV4-11細胞中之APOE表現(圖 14A 及14C )。原代T細胞及經輻射THP-1或MV4-11細胞(E:T=2:1)分別在下部及上部腔室中培育。拍攝T細胞(圖 14B 及14D ， 比例尺，100 µm)且在7天後藉由流式細胞量測術定量(圖 4I 及14E )。圖 14F 至 14G ，APOE之缺失抑制人類AML THP-1及MV4-11細胞之跨內皮遷移(n=4個具有平均值及標準差之生物獨立樣品)。
圖 15A 至 15D 展示LILRB4上調SHP-2及NF-kB信號傳導之磷酸化。圖 15A ，磷酸化SHP-2、磷酸化IKB、uPAR及ARG1在MV4-11細胞中在lilrb4 基因剔除(KO)時經下調。圖 15B ，共免疫沈澱證實LILRB4與THP-1細胞中之SHP-2相互作用。圖 15C 至 15D ，兩種不同NF-κB抑制劑以LILRB4依賴型方式恢復由THP-1細胞抑制之T細胞增殖。THP-1細胞用各種劑量之NF-κB抑制劑預處理1小時。原代T細胞及經輻射預處理之THP-1細胞(E:T=2:1)分別在下部及上部腔室中培養。拍攝T細胞(圖 15C ，比例尺，100 µm)且在7天後藉由流式細胞量測術進行分析(圖 15D )。n.s.，不顯著。
圖 16A 至 16H 展示LILRB4上調uPAR及精胺酸酶-1以抑制T細胞活性且促進白血病遷移。圖 16A ，表面uPAR在lilrb4 基因剔除之THP-1及MV4-11 AML細胞中經下調。圖 16B ，自健康供體分離之T細胞用抗CD3/CD28塗覆之珠粒及rhIL-2培養且用指示濃度之uPAR蛋白補充3天(n=4個生物獨立樣品)。使用倒置顯微鏡拍攝代表性細胞且藉由流式細胞量測術分析T細胞。圖 16C ，uPAR及精胺酸酶-1 (ARG1)之表現在lilrb4 基因剔除之THP-1及MV4-11 AML細胞中下調。圖 16D ，如藉由比色方法(DARG-100，BioAssay系統)所測定之精胺酸酶活性在lilrb4 -KO THP-1及MV4-11細胞之條件培養基中降低。圖 16E ，原代T細胞及經輻射指示之THP-1細胞(E:T=2:1)分別在下部及上部腔室中培育且用0.002 U/L重組ARG1蛋白補充7天。拍攝T細胞。圖 16F ，自健康供體分離之T細胞用抗CD3/CD28塗覆之珠粒及rhIL-2培養且用指示濃度之ARG1蛋白補充3天(n=4個生物獨立樣品)。使用倒置顯微鏡拍攝代表性細胞且藉由流式細胞量測術分析T細胞。圖 16G ，將自單個單核球性AML患者分離之自體T細胞與來自同一患者之經輻射lilrb4 陽性或lilrb4 陰性原代白血病細胞以10:1之E:T一起培育，補充有重組抗LILRB4抗體、APOE-VLDL、uPAR或ARG1。pT，患者T細胞。在用抗CD3/CD28/CD137塗覆之珠粒及rhIL-2培養14天之後，用抗CD3、抗CD4及抗CD8抗體染色T細胞且藉由流式細胞量測術進行分析。圖 16H ，向培養基中補充重組uPAR或ARG1挽救lilrb4 -KO THP-1或lilrb4 -KO MV4-11細胞跨內皮之反式遷移能力之降低(n=3)。比例尺，100 µm。n.s.，不顯著。所有p 值來自雙尾學生 t 檢驗。
圖 17A 至 17B 展示在原代人類單核球性AML細胞中SHP-2/NF-κB信號傳導及uPAR及精胺酸酶-1表現之偵測。圖 17A ，LILRB4陽性或高CD33+ AML細胞(紅色方框)及LILRB4陰性或低CD33+ AML細胞(藍色方框)經閘控用於在Y580之磷酸化SHP-2、在S176/S180之磷酸化IKKα/β、在S529之磷酸化NF-κB、uPAR及精胺酸酶-1 (ARG1)的進一步細胞內染色。同型IgG用作陰性對照。紅色數字指示LILRB4陽性或高CD33+ AML細胞之MFI(平均螢光強度)；藍色數字指示LILRB4陰性或低CD33+ AML細胞之MFI。圖 17B ，LILRB4陽性或高CD33+ AML細胞對比LILRB4陰性或低CD33+ AML細胞中之個別染色之定量。
圖 18 展示LILRB4抑制T細胞且促進白血病浸潤之機制的示意圖。
圖 19A 至 19D 展示在白血病細胞中及正常造血細胞中LILRB4介導之胞內信號傳導之比較。圖 19A 至 19B ，APOE激活白血病細胞中之LILRB4胞內信號傳導。指示之THP-1細胞及原代AML (M5)細胞經血清饑餓隔夜，且隨後用指示濃度之人類重組APOE蛋白處理指示之時間。藉由西方墨點法檢測磷-SHP-2、磷光體-NFκB及精胺酸酶-1。圖 19C ，APOE對正常單核球或活體外分化之巨噬細胞之影響。自健康供體分離正常單核球且在活體外分化一週之後自此等單核球衍生巨噬細胞。細胞經血清饑餓隔夜且隨後用指示濃度之人類重組APOE蛋白處理指示之時間。藉由西方墨點法檢測磷-SHP-2、磷光體-NFκB及精胺酸酶-1。圖 19D ，APOE誘導在AML細胞上而非正常單核球中之uPAR上調。自健康供體分離正常單核球。指示之原代AML細胞及正常單核球經血清饑餓隔夜且隨後用20 μg/ml人類重組APOE蛋白處理八小時。藉由流式細胞量測術檢測表面uPAR。展示代表性流程圖且平均螢光強度展示於右上角(黑色，PBS對照；紅色，APOE處理)。實驗進行三次，具有類似結果。p 值來自雙尾學生 t檢驗。
圖 20A 至 20B 展示抗LILRB4不影響正常造血細胞之移植。圖 20A ，自兩個健康供體之正常單核球上以及WT及lilrb4 -KO THP-1細胞上之LILRB4表面表現之比較。圖 20B ，抗LILRB4抗體不影響正常單核球之歸巢(homing)能力。人類正常單核球(如圖 20A 中所展示)經由CD14陽性選擇來分離。此等經分離單核球藉由CFSE合併且染色。在染色之後，將單核球(各小鼠5 × 106 個)注射至NSG小鼠中，隨後立即藉由抗體治療，且隨後在移植後之20小時處死小鼠(n=4)。肝臟、脾及骨髓中之CFSE+ 細胞數目如藉由流式細胞量測術所測定經標準化為外周血液中之數目。
圖 21A 至 21C 展示在MDSC上表現之LILRB4抑制T細胞。圖 21A ，外周血液單核細胞藉由菲科爾密度梯度離心(ficoll density gradient centrifugation)自UTSW組之11個實體癌症患者血液樣品分離外周血液。藉由流式細胞量測術測定LILRB4在MDSC (CD14+ HLA-DRlow/- )上之表面表現。圖 21B ，自體T細胞與LILRB4陽性或陰性MDSC以指示之E:S比率(E，效應T細胞；S，MDSC抑制細胞)在T細胞培養基(補充有10% FBS、呈1:1之珠粒與細胞比率的30 U/ml人類IL-2及抗CD3/CD28戴諾珠粒(Dynabead)之RPMI-1640培養基)中培養5天。展示T細胞之代表性照片。圖 21C ，在活體外骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)/T細胞共培養中，抗LILRB4增加自T細胞之IFNγ分泌。T細胞(E：效應細胞；CD3+)及MDSC (S：抑制細胞；HLA-DRlow/- CD14+ )自黑素瘤患者之外周血液中分離。T細胞與MDSC共培育5天。E:S=2:1。收集培養基之上清液，且藉由ELISA測定IFNγ之含量。實驗以一式三份進行。
圖 22 說明藉由ELISA使用濃度滴定(0-10 μg/ml)來測定與人類LILRB4 ECD結合之例示性LILRB4單株抗體(mAb)。X軸指示抗體濃度及Y軸為OD (450nm)中之結合信號。將LILRB4 ECD重組蛋白塗覆於高吸收96孔盤上。將系列稀釋(3倍)之LILRB4 mAb添加至塗覆/阻斷盤且使用山羊抗兔IgG F(ab)2 -共軛之HRP作為二級抗體偵測。滴定曲線使用4參數擬合曲線進行擬合，使用GraphPad軟體用於EC50估計。
圖 23A 至 23B. 圖 23A 為LILRB4胞外域(ECD)之示意圖。展示顯著降低APOE對LILRB4之活化的兩種殘基(W106及Y121)之突變分別位於第一Ig結構域中及兩個Ig結構域之間的連接子中。圖 23B 說明與人類LILRB4之Ig結構域-1 (D1結構域)結合之例示性LILRB4 mAb之判定。X軸指示抗體濃度及Y軸為OD (450nm)中之結合信號。LILRB4 D1重組蛋白經塗覆於高吸收96孔盤上。將系列稀釋(3倍)之LILRB4 mAb添加至塗覆/阻斷盤且使用山羊抗兔IgG F(ab)2 -共軛之HRP作為二級抗體進行偵測。在此分析中，僅LILRB4之D1結構域足以與七個mAb結合，而僅D1不足以與B4-193結合(藍色空心三角形)。
圖 24A 至 24B. 圖 24A 為LILRB4膜蛋白之示意圖。展示胞外域中之Ig結構域-1 (D1)、Ig結構域-2 (D2)及柄區(SR)，以及識別D1結構域之抗體的圖示。圖 24B 說明B4-193之結合域之判定。將人類LILRB4重組蛋白之LILRB4 D1結構域(D1)、D2結構域(D2)、柄區(SR)、D1+D2、D2+SR及全長ECD (D1+D2+SR)塗覆於高吸收96孔盤上。將系列稀釋(3倍)之B4-193添加至塗覆/阻斷盤且使用山羊抗兔IgG F(ab)2 -共軛之HRP作為二級抗體進行偵測。在此分析中，B4-193僅與人類LILRB4之全長ECD結合。
圖25 說明LILRB4上胺基酸Y121 (位置121之酪胺酸。請注意，此位置121 Y之編號為在D1前另外N端序列中；此位置與SEQ ID No: 238中Y98相同，其開始於D1而無前N端序列)對B4-193結合之貢獻。將野生型及Y121A突變之人類LILRB4 ECD重組蛋白塗覆於高吸收96孔盤上。將系列稀釋(3倍)之mAb B4-193添加至塗覆/阻斷盤且使用山羊抗兔IgG F(ab)2 -共軛之HRP作為二級抗體進行偵測。LILRB4之Y121A突變顯著降低B4-193與LILRB4之結合。
圖 26 說明使用八位元組確定之例示性LILRB4抗體的動力學結合量測值(感測器-公克)。將30 µg/mL之抗體裝載至蛋白質A感測器上4 min。遵循動力學緩衝液中之短基線，將裝載之感測器暴露於一系列重組人類LILRB4濃度(0.1-200 nM)且使用背景減法以校正感測器偏移。所有實驗在1,000 rpm下振盪進行。背景波長變化係自僅裝載有抗體之參考感測器量測。ForteBio之資料分析軟體用於將資料與1:1結合模型進行擬合以提取締合速率及解離速率。KD使用ForteBio之資料分析軟體7.0藉由比率koff/kon來計算。
圖 27 說明例示性LILRB4 mAb之抗原決定基結合。經典夾心抗原決定基分組(epitope binning)實驗在8通道Red96中進行。將第一抗體(40 µg/mL)裝載至蛋白A感測器上4 min且感測器上剩餘之Fc結合位點用不相關兔抗體(20 µg/ml)阻斷4 min，隨後將感測器浸泡於動力學緩衝液中10 sec。隨後將感測器暴露於重組LILRB4 (25 µg/mL)中4 min。最後，將感測器暴露於第二抗體(40 µg/mL)中4 min以檢查結合。原始資料使用ForteBio之資料分析軟體7.0處理且評估抗體對之競爭性結合。第二抗體之額外結合指示未佔用抗原決定基(非競爭者「-」)，而無結合指示抗原決定基阻斷(競爭者「+」)。
圖 28A 至 28C 說明例示性LILRB4抗體之重鏈可變區之胺基酸序列。
圖 29A 至 29C 說明例示性LILRB4抗體之重鏈可變區之核酸序列。
圖 30A 至 30C 說明例示性LILRB4抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列。
圖 31A 至 31C 說明例示性LILRB4抗體之輕鏈可變區之核酸序列。
圖 32 說明不同濃度(0.1 µg/ml、1 µg/ml及10 µg/ml)之例示性抗LILRB4抗體之APOE競爭。與PBS對照相比，APOE活性之有效阻斷展示為GFP陽性(%)減少。
圖 33 說明具有不同濃度(0.1 µg/ml、1 µg/ml及10 µg/ml)之例示性抗LILRB4抗體之LILRB4報導子細胞/K562共培養。由於K562細胞上之Fc受體對抗體之潛在交聯，與此分析中之PBS對照相比，潛在之促效性抗體可引起相對較高之GFP陽性(%)。
圖 34 說明用不同濃度(0.1 µg/ml、1 µg/ml及10 µg/ml)之經塗覆抗LILRB4抗體處理之LILRB4報導子細胞。由於在此分析中抗體固定於塑膠表面上，與PBS對照相比，識別LILRB4胞外域之抗體傾向於記錄陽性GFP (%)信號。
圖 35 說明用不同濃度(0.1 µg/ml、1 µg/ml及10 µg/ml)之可溶性抗LILRB4抗體處理之LILRB4報導子細胞。
圖 36 說明藉由流式細胞量測術確定結合表現食蟹獼猴LILRB4 (cynob4)之CHO細胞的例示性抗LILRB4抗體。
圖 37 說明藉由例示性抗LILRB4抗體與LILRB家族成員、LILRA家族成員以及食蟹獼猴LILRB4 (cynoB4)之交叉反應性。「+」指示抗體與特定重組蛋白之結合。
圖 38 說明例示性抗LILRB4抗體兔#B4-193挽救THP-1細胞對T細胞之抑制。
圖 39A 至 39C 說明例示性抗LILRB4抗體Rab-#128-3及Rab-#193抑制THP-1異種移植小鼠中之白血病發展。
圖 40 說明藉由流式細胞量測術測定之h193抗體與人類LILRB4蛋白之結合。在各直方圖塊下之數字係指表 8 中展示之特異性重組人類化抗體。抗體39為不相關抗體。抗體39及PBS兩者充當陰性對照。
圖 41A 至 41M 說明h193抗體與LILRB4蛋白之特異性結合。圖 41A 至 41L 說明藉由LILR報導子分析測定之h193抗體之特異性，其中將LILR報導子細胞添加至塗覆有h193抗體之盤中。h193抗體在報導子細胞之表面上與LILR成員之ECD的結合誘導GFP信號。圖 41M 說明藉由ELISA測定之例示性h193抗體之特異性。將LILRA及LILRB重組蛋白塗覆於高吸收96孔盤上。將系列稀釋(5倍)之mAb h193添加至塗覆/阻斷盤且使用山羊抗人類IgG F(ab)2共軛之HRP作為二級抗體進行偵測。
圖 42 說明藉由流式細胞量測術測定之h193抗體與食蟹獼猴LILRB4之結合。在各直方圖塊下之數字係指表 8 中展示之特異性重組人類化抗體。抗體39為不相關抗體。抗體39及PBS兩者充當陰性對照。
圖 43A 及43B 說明使用ApoE競爭分析(圖 43A )及K562共培養分析(圖 43B )之h193抗體之效果。在各直方圖塊下之數字係指表 8 中展示之特異性重組人類化抗體。抗體39為不相關抗體。抗體39及PBS兩者充當陰性對照。
圖 44A 至 44D 說明細胞介素陣列分析之結果，該分析量測h193抗體在調節PBMC (外周血液單核細胞)中之細胞介素分泌中的效果。
圖 45A 至 45D 說明細胞介素陣列分析之結果，該分析量測h193抗體在調節與THP-1細胞共培養之PBMC細胞中之細胞介素分泌中的效果。
圖 46A 至 46D 說明細胞介素陣列分析之結果，該分析比較在用人類IgG處理之PBMC及與用人類IgG處理之THP-1細胞共培養的PBMC中之細胞介素分泌。
圖 47 展示圖 44 至 46 之細胞介素陣列分析之例示性影像(一式兩份)。
圖 48 說明例示性h193抗體抑制異種移植小鼠模型中之白血病發展。
圖 49A 至 49D 說明LILRB4及h193之複合物之晶體結構。圖 49A ，LILRB4/h193 scFv複合物之整體結構以草圖展示。h193 (重鏈，橙色；輕鏈，黃色)結合至LILRB4分子(洋紅色)之D2結構域之D1D2鉸鏈環及BC及C'E環。展示h193之重鏈(圖 49B )及輕鏈(圖 49C )與LILRB4部分結合之原子相互作用細節。參與相互作用之殘基展示為棒狀且經標記。氫鍵展示為紅色短劃線。圖 49D ，由h193接觸之LILRB4之結合表面。與h193重鏈或輕鏈接觸之殘基顏色分別為橙色或黃色，且藉由重鏈及輕鏈兩者結合之重疊殘基顏色為綠色。
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Claims (45)

  1. 一種經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其包含： (a) 重鏈(HC)可變區(VH)，其包含： 重鏈互補決定區(HC-CDR) 1，其具有述於SEQ ID NO: 100中之胺基酸序列， HC-CDR2，其具有述於SEQ ID NO: 101中之胺基酸序列，及 HC-CDR3，其具有述於SEQ ID NO: 102、224或227中之胺基酸序列；及 其變體，其中該等HC-CDR中之一或多者具有一個、兩個或三個胺基酸取代、添加、缺失或其組合；及 (b) 輕鏈(LC)可變區(VL)，其包含： 輕鏈互補決定區(LC-CDR)，其具有述於SEQ ID NO: 104中之胺基酸序列， LC-CDR2，其具有KAS或述於SEQ ID NO: 233中之胺基酸序列，及 LC-CDR3，其具有述於SEQ ID NO: 105或234中之胺基酸序列，及 其變體，其中該等LC-CDR中之一或多者具有一個、兩個或三個胺基酸取代、添加、缺失或其組合。
  2. 如請求項1之經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中(a)該HC-CDR1具有述於SEQ ID NO: 100中之胺基酸序列，該HC-CDR2具有述於SEQ ID NO: 101中之胺基酸序列，且該HC-CDR3具有述於SEQ ID NO: 102, 224或227中之胺基酸序列；及(b)該LC-CDR1具有述於SEQ ID NO: 104中之胺基酸序列，該HC-CDR2具有KAS或述於SEQ ID NO: 233中之胺基酸序列，且該HC-CDR3具有述於SEQ ID NO: 105或234中之胺基酸序列。
  3. 如請求項1之經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之單株抗體為鼠類抗體、嚙齒動物抗體、兔抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
  4. 如請求項1之經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為重組ScFv (單鏈可變片段)抗體、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。
  5. 如請求項1之經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之單株抗體為兔抗體或嵌合抗體。
  6. 如請求項5之經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中(a)該VH具有與SEQ ID NO: 99至少約90%一致之胺基酸序列；及(b)該VL具有與SEQ ID NO: 103至少90%一致之胺基酸序列。
  7. 如請求項5之經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中(a)該VH具有述於SEQ ID NO: 99中之胺基酸序列；及(b)該VL具有述於SEQ ID NO: 103中之胺基酸序列。
  8. 如請求項1之經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之單株抗體為人類化抗體。
  9. 如請求項8之經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中(a)該VH具有與SEQ ID NO: 223、225、226、228、229、230或231至少約90%一致之胺基酸序列；及(b)該VL具有與SEQ ID NO: 232、235、236或237至少90%一致之胺基酸序列。
  10. 如請求項8之經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中(a)該VH具有述於SEQ ID NO: 223、225、226、228、229、230或231中之胺基酸序列；及(b)該VL具有述於SEQ ID NO: 232、235、236或237中之胺基酸序列。
  11. 一種經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其與如請求項1至10中任一項之經分離之單株抗體或其抗原結合片段競爭相同的抗原決定基。
  12. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之經分離之單株抗體或其抗原結合片段，及醫藥學上可接受之載劑。
  13. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至11中任一項之經分離之單株抗體。
  14. 一種載體，其包含如請求項13之經分離之核酸。
  15. 一種宿主細胞，其包含如請求項14之載體。
  16. 如請求項15之宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞。
  17. 如請求項15之宿主細胞，其中該宿主細胞為CHO細胞。
  18. 一種融合瘤，其編碼或產生如請求項1至11中任一項之經分離之單株抗體。
  19. 一種產生抗體之方法，其包含如請求項15之宿主細胞在適合於表現該抗體之條件下培養，及回收該抗體。
  20. 一種嵌合抗原受體(CAR)蛋白，其包含如請求項1至11中任一項之抗原結合片段。
  21. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項20之CAR蛋白。
  22. 一種載體，其包含如請求項21之經分離之核酸。
  23. 一種工程改造細胞，其包含如請求項21之經分離之核酸。
  24. 如請求項23之工程改造細胞，其中該細胞為T細胞、NK細胞或巨噬細胞。
  25. 一種治療或改善癌症在個體中影響的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項23或24之工程改造細胞。
  26. 如請求項25之方法，其中該方法降低或根除該個體中之腫瘤負荷。
  27. 如請求項25之方法，其中該方法減少腫瘤細胞之數目。
  28. 如請求項25之方法，其中該方法減小腫瘤大小。
  29. 如請求項25之方法，其中該方法根除該個體中之腫瘤。
  30. 如請求項25之方法，其中該癌症為血液惡性疾病。
  31. 如請求項30之方法，其中該血液惡性疾病係選自由以下組成之群：骨髓發育不良症候群、骨髓增生性贅瘤、慢性骨髓單核細胞性白血病(CMML)、慢性骨髓細胞性白血病，或急性骨髓性白血病(AML)、急性前髓細胞性白血病(APL)或M3 AML、急性骨髓單核細胞性白血病或M4 AML、急性單核球性白血病或M5 AML、急性骨髓母細胞白血病，及真性多紅血球症。
  32. 如請求項25之方法，其中該抗體或其抗原結合片段為經靜脈內、動脈內、腫瘤內或皮下投與。
  33. 如請求項25之方法，其進一步包含向該個體投與一或多種選自由以下組成之群的藥物：拓樸異構酶抑制劑、蒽環黴素拓樸異構酶抑制劑、蒽環黴素、道諾黴素、核苷代謝抑制劑、阿糖胞苷、低甲基化劑、低劑量阿糖胞苷(LDAC)、道諾黴素及阿糖胞苷之組合、用於注射之道諾黴素及阿糖胞苷脂質體、Vyxeos®、氮胞苷、Vidaza®、地西他濱(decitabine)、全反式視黃酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、組胺二鹽酸鹽、Ceplene®、介白素-2、阿地介白素(aldesleukin)、Proleukin®、吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、Mylotarg®、FLT-3抑制劑、米哚妥林(midostaurin)、Rydapt®、氯法拉濱(clofarabine)、法呢基轉移酶抑制劑、IDH1抑制劑、艾伏尼布(ivosidenib)、Tibsovo®、IDH2抑制劑、艾那尼布(enasidenib)、Idhifa®、斯莫森德(smoothened，SMO)抑制劑、格拉吉伯(glasdegib)、精胺酸酶抑制劑、IDO抑制劑、艾帕斯塔(epacadostat)、BCL-2抑制劑、維奈托克(venetoclax)、Venclexta®、鉑複合物衍生物、奧沙利鉑(oxaliplatin)、激酶抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、PI3激酶抑制劑、BTK抑制劑、依魯替尼(ibrutinib)、IMBRUVICA®、阿卡拉布魯替尼(acalabrutinib)、CALQUENCE®、贊魯替尼(zanubrutinib)、PD-1抗體、PD-L1抗體、CTLA-4抗體、LAG3抗體、ICOS抗體、TIGIT抗體、TIM3抗體、CD40抗體、4-1BB抗體、CD47抗體、SIRP1α抗體或融合蛋白、E-選擇蛋白(selectin)之拮抗劑、與腫瘤抗原結合之抗體、與T細胞表面標記結合之抗體、與骨髓細胞或NK細胞表面標記結合之抗體、烷基化劑、亞硝基脲藥劑、抗代謝產物、抗腫瘤抗生素、衍生自植物之生物鹼、激素療法藥品、激素拮抗劑、芳香酶抑制劑及P-糖蛋白抑制劑。
  34. 如請求項25至33中任一項之方法，其中該經分離之單株抗體或其抗原結合片段進一步包含連接至其上之抗腫瘤藥物。
  35. 如請求項34之方法，其中該抗腫瘤藥物經由光不穩定連接子與該抗體連接。
  36. 如請求項34之方法，其中該抗腫瘤藥物經由酶裂解連接子與該抗體連接。
  37. 如請求項34之方法，其中該抗腫瘤藥物為毒素、放射性同位素、細胞介素或酶。
  38. 一種偵測樣品或個體中癌細胞或癌症幹細胞之方法，其包含： (a)    使個體或來自該個體之樣品與如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸；及 (b)    偵測該抗體與該個體或樣品中之癌細胞或癌症幹細胞之結合。
  39. 如請求項38之方法，其中該樣品為體液或生物檢體(biopsy)。
  40. 如請求項38之方法，其中該樣品為血液、骨髓、痰、淚液、唾液、黏液、血清、尿液或糞便。
  41. 如請求項38之方法，其中偵測包含免疫組織化學、流式細胞量測術、FACS、ELISA、RIA或西方墨點法。
  42. 如請求項38之方法，其進一步包含第二次執行步驟(a)及(b)及測定與第一次相比偵測量之變化。
  43. 如請求項38之方法，其中該經分離之單株抗體或其抗原結合片段進一步包含標記。
  44. 如請求項43之方法，其中該標記為肽標記(tag)、酶、磁性粒子、發色團、螢光分子、化學發光分子，或染料。
  45. 如請求項25至44中任一項之方法，其中該經分離之單株抗體或其抗原結合片段與脂質體或奈米粒子共軛。
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