CN115916347A - 针对壳多糖酶3样1的抗体及其使用方法 - Google Patents

针对壳多糖酶3样1的抗体及其使用方法 Download PDF

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CN115916347A CN202180042599.3A CN202180042599A CN115916347A CN 115916347 A CN115916347 A CN 115916347A CN 202180042599 A CN202180042599 A CN 202180042599A CN 115916347 A CN115916347 A CN 115916347A
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辛西娅·鞠
琼明·郑
单昭
李雷科
张宁彦
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Abstract

本文中提供了与CHI3L1结合的抗体以及该抗体在检测和治疗癌症中以及用于治疗肝毒性的用途。

Description

针对壳多糖酶3样1的抗体及其使用方法
优先权要求
本申请要求2020年4月21日提交的美国临时申请序列号63/013,087的优先权权益，其全部内容在此通过引用并入。
关于联邦资助的研究声明
本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助No.DK122708的政府支持下完成的。政府享有本发明中的某些权利。
背景技术
1.技术领域
本公开内容总体上涉及医学、肿瘤学和免疫学领域。更特别的是，本公开内容涉及这样的抗体：其与壳多糖酶3样1(chitinase 3-like-1，CHI3L1)结合，并且能够治疗癌症(包括肝细胞癌和转移性乳腺癌)，并且还能够治疗急性肝损伤。
2.相关技术的描述
急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是可导致多器官衰竭和死亡的大量肝细胞损伤和严重肝功能障碍的威胁生命的病症。1血小板减少是在患有ALF的患者中观察到的常见表现。2据报道，多于60％的患有ALF的患者在循环中的血小板计数低于150,000个细胞/立方毫米。3对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)超剂量代表了在西方国家中ALF的最常见原因，这导致多于三分之一的患者死亡或进行肝移植。1在APAP超剂量的患者中，通常观察到血小板减少。2,4-6在用APAP处理的小鼠中也发现了血小板减少，且其与肝的血小板积聚相关，这很大程度上促使APAP诱导的肝损伤(APAP-induced liver injury，AILI)。7然而，急性损伤期间血小板募集到肝中的潜在机制还知之甚少。解决这个问题可导致新的治疗靶标的发现。目前，治疗AILI的唯一解毒剂是N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)；然而，其效力当在APAP超剂量之后超过数个小时开始时显著降低。8
长期以来已经认识到，受损肝中血小板与窦状内皮细胞(sinusoidalendothelial cell，LSEC)之间的相互作用。9-11然而，新出现的证据表明，在细菌感染和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)期间，库普弗细胞(Kupffercell，KC)在肝血小板募集中发挥着不可或缺的作用。12,13当前研究揭示了KC通过壳多糖酶3样1/CD44轴在急性肝损伤期间促进肝血小板募集方面的关键作用。壳多糖酶3样1(CHI3L1，人中的YKL-40)是没有壳多糖酶活性的壳多糖酶样可溶性蛋白质。14-16其由多种细胞类型(包括巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、滑膜细胞、内皮细胞和肿瘤细胞)产生。15, 17CHI3L1与许多生物过程(包括凋亡、炎症、氧化应激、感染和肿瘤转移)有关。18CD44是在许多哺乳动物细胞(包括内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、角质细胞和白细胞)上表达的I型跨膜糖蛋白。19CD44与许多病理病症(包括癌症、关节炎、糖尿病、血管疾病和感染)有关。20-29
发明内容
因此，在一个方面中，本公开内容提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含来自表A中的克隆配对的重链和轻链CDR。在一些方面中，抗体或其片段由来自图24、25和29的克隆配对的重链和轻链序列编码。在某些方面中，抗体或其片段由与来自图24、25和29的克隆配对序列具有至少70％、80％、90％或95％同一性的重链和轻链可变序列编码。在另一些方面中，抗体或其片段包含来自图26、27和28的克隆配对的重链和轻链序列。在另一些方面中，抗体或其片段包含与来自图26、27和28的克隆配对序列具有至少70％、80％、90％或95％同一性的重链和轻链可变序列。在一些具体方面中，分离的单克隆抗体是鼠、啮齿动物或兔的。在一些特定方面中，分离的单克隆抗体是人源化或人抗体。
在另一些方面中，抗原结合片段是重组ScFv(单链可变片段)抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或Fv片段。在一些方面中，分离的单克隆抗体是双特异性抗体或嵌合抗体。在某些方面中，所述抗体是IgG或重组IgG抗体或抗体片段，其包含Fc部分，所述Fc部分突变成改变(消除或增强)FcR相互作用、提高半衰期和/或提高治疗效力，例如LALA、N297、GASD/ALIE、YTE或LS突变；或者经聚糖修饰成改变(消除或增强)FcR相互作用，例如酶促或化学添加或去除聚糖或在用限定的糖基化模式改造的细胞系中表达。
在另一个实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与根据上述实施方案和方面中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争同一表位。
在另一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含根据上述实施方案和方面中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及可药用载体。
在另一个实施方案中，提供了分离的核酸，其编码根据上述实施方案和方面中任一项所述的分离的单克隆抗体。另一个实施方案提供了包含该实施方案的分离的核酸的载体。另一个实施方案提供了包含所述实施方案的载体的宿主细胞。在一些方面中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在另一些方面中，宿主细胞是CHO细胞。
在另一个实施方案中，提供了杂交瘤，其编码或产生根据上述实施方案和方面中任一项所述的分离的单克隆抗体。另一个实施方案提供了产生抗体的方法，其包括在适用于表达抗体的条件下培养上述宿主细胞，以及回收抗体。在另一个实施方案中，提供了包含根据上述实施方案和方面中任一项所述的抗原结合片段的嵌合抗原受体(chimericantigen receptor，CAR)蛋白。另一个实施方案提供了编码上述CAR蛋白的分离的核酸。在另一个实施方案中，提供了包含该实施方案的分离的核酸的载体。另一个实施方案提供了包含所述实施方案的分离的核酸的经改造的细胞。在某些方面中，细胞是T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
在另一些实施方案中，提供了在对象中治疗癌症或减轻癌症的影响的方法，该方法包括向对象施用治疗有效量的根据本文所述实施方案和方面中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者本文所述的经改造的细胞。在一些方面中，该方法降低或根除了对象中的肿瘤负荷。在某些方面中，该方法降低了肿瘤细胞的数量或降低了肿瘤的尺寸。在一些具体方面中，该方法根除了对象中的肿瘤。在一些特定方面中，癌症是实体瘤癌症，例如肺癌、脑癌、皮肤癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、睾丸癌、宫颈癌、乳腺癌或子宫癌。在另一些方面中，癌症为恶性血液病，例如骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性肿瘤、慢性粒-单核细胞白血病(chronic myelomonocytic leukemia，CMML)、慢性粒细胞白血病、或急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)、急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocytic leukemia，APL)或M3 AML、急性粒-单核细胞白血病或M4 AML、急性单核细胞白血病或M5 AML、急性粒细胞白血病或真性红细胞增多症。在一些方面中，抗体或其抗原结合片段静脉内、动脉内、瘤内或皮下施用。
在另外的一些方面中，该方法还包括向对象施用第二抗癌治疗，例如一种或更多种选自以下的药物：拓扑异构酶抑制剂；蒽环类拓扑异构酶抑制剂；蒽环类；柔红霉素；核苷代谢抑制剂；阿糖胞苷；低甲基化剂(hypomethylating agent)；低剂量阿糖胞苷(LDAC)；柔红霉素与阿糖胞苷的组合；注射用柔红霉素阿糖胞苷脂质体(daunorubicin andcytarabine liposome for injection)，
Figure BDA0003998997950000041
阿扎胞苷(azacytidine)，
Figure BDA0003998997950000042
地西他滨；全反式视黄酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)；砷；三氧化二砷；组胺二盐酸盐，
Figure BDA0003998997950000043
白介素-2；阿地白介素，
Figure BDA0003998997950000044
吉妥单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)，
Figure BDA0003998997950000045
FLT-3抑制剂；米哚妥林(midostaurin)，
Figure BDA0003998997950000046
氯法拉滨；法呢基转移酶抑制剂(farnesyl transferase inhibitor)；地西他滨；IDH1抑制剂；艾伏尼布(ivosidenib)，
Figure BDA0003998997950000047
IDH2抑制剂；恩西地平(enasidenib)，
Figure BDA0003998997950000048
smoothened(SMO)抑制剂；格拉吉布(glasdegib)；精氨酸酶抑制剂；IDO抑制剂；艾卡哚司他(epacadostat)；BCL-2抑制剂；维奈托克(venetoclax)，
Figure BDA0003998997950000049
铂复合物衍生物；奥沙利铂(oxaliplatin)；激酶抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；PI3激酶抑制剂；BTK抑制剂；依鲁替尼(ibrutinib)，
Figure BDA00039989979500000410
阿卡替尼(acalabrutinib)，
Figure BDA00039989979500000411
泽布替尼(zanubrutinib)；PD-1抗体；PD-L1抗体；CTLA-4抗体；LAG3抗体；ICOS抗体；TIGIT抗体；TIM3抗体；CD40抗体；4-1BB抗体；CD47抗体；SIRP1α抗体或融合蛋白；E-选择素的拮抗剂；与肿瘤抗原结合的抗体；与T细胞表面标志物结合的抗体；与骨髓细胞或NK细胞表面标志物结合的抗体；烷基化剂；亚硝基脲剂；抗代谢物；抗肿瘤抗生素；来源于植物的生物碱；激素治疗药物；激素拮抗剂；芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。
在某些方面中，分离的单克隆抗体或其抗原结合片段还包含与其连接的抗肿瘤药物。在另一个方面中，所述抗肿瘤药物通过光不稳定接头与所述抗体连接。在另一个方面中，所述抗肿瘤药物通过酶促切割接头与所述抗体连接。在一些方面中，所述抗肿瘤药物是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
在另一个实施方案中，提供了在样品或对象中检测癌细胞或癌症干细胞的方法，其包括：
(a)使对象或来自对象的样品与根据上述实施方案和方面中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及
(b)在所述对象或样品中检测所述抗体与癌细胞或癌症干细胞的结合。
在一些具体方面中，样品是体液或活检物。在另一些方面中，样品是血液、骨髓、痰、泪、唾液、黏液、血清、尿或粪便。在一些方面中，检测包括免疫组织化学、流式细胞术、FACS、ELISA、RIA或Western印迹。在某些方面中，该方法还包括再次进行步骤(a)和(b)，以及确定与第一次相比检测水平的变化。在另外的一些方面中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段还包含标记。在另一些方面中，所述标记是肽标签、酶、磁粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。在另一个方面中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与脂质体或纳米粒缀合。
在另一个实施方案中，提供了治疗患有肝毒性或处于肝毒性风险之中的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用根据上述实施方案和方面中任一种所述的抗体。在一些方面中，肝毒性是由急性肝衰竭引起的。在另一些方面中，肝毒性是由以下引起的：药剂或药物(例如对乙酰氨基酚)、实验室化学物质、农业化学物质(例如除草剂或杀虫剂)、工业化学物质或天然产物(例如植物毒素)。在某些方面中，药剂或药物以治疗水平给药。在一些特定方面中，药剂或药物以高于治疗水平给药，即为超剂量。在一些具体方面中，抗体施用多于一次，例如每天、每隔一天、每周两次或每周施用。在另外的一些方面中，该方法还包括向所述对象施用第二肝毒性治疗，例如液体、止痛药、抗毒素。在某些方面中，所述对象已被诊断出肝毒性。在另一些方面中，所述对象被怀疑已经诱导了肝毒性或接触了肝毒性药剂或药剂剂量。在另一个方面中，该方法还包括在施用所述抗体之前和/或之后评估肝功能和/或肝酶。
当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词的使用可意指“一个/种”，但是其也符合“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义。“约”一词意指所述数字的正负5％。
预期本文所述的任何方法或组合物可相对于本文所述的任何其他方法或组合物来实施。本公开内容的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。然而，应当理解，详细描述和具体实例虽然指出了本发明的一些具体实施方案，但是仅以举例说明的方式给出，因为通过该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员将变得明显。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或更多个，可以更好地理解本发明。
图1A至E.肝血小板积聚及其对AILI的贡献。(图1A)用以检测在正常肝活检物(正常)和来自患有AILI的患者的肝活检物(患者)中的血小板(CD41+)的IHC染色。对肝内血小板的数量进行定量(n＝10/组)。比例尺，250μm。(图1B)用PBS或APAP处理3小时的雄性WT小鼠中的肝内血小板(CD41+)和LSEC(CD31+)的IF染色。对肝内血小板的数量进行定量(n＝6/组)。比例尺，25μm。(图1C至D)在APAP施用之前3小时或之后3小时，用对照IgG(Ctrl IgG)或抗CD41抗体(α-CD41 Ab)处理小鼠。在APAP处理之后24小时，确定血清ALT水平(图1C)，并用勾勒的坏死区域评价肝组织学(图1D)。比例尺，250μm。(图1E)图1C中处理的小鼠的肝内血小板的CD41染色。(在图1C至E中n＝5只小鼠/组。在图1A至C中进行双尾、未配对的studentt检验)。
图2A至I.CHI3L1介导KC在促进肝血小板积聚中的功能。(图2A)对在正常肝活检物(正常)和来自患有AILI的患者的肝活检物(患者)中的巨噬细胞(CD68+)和血小板(CD41+)的IHC染色(n＝10/组)。比例尺，25μm。(图2B)对用PBS或APAP处理3小时的WT小鼠中的肝内血小板(CD41+)和KC(F4/80+)的IF染色。比例尺，25μm。箭头指示黏附于KC的血小板。(图2C)黏附于KC或LSEC的血小板的定量。(图2D)对用含PBS的空脂质体(PBS)或含氯膦酸盐的脂质体(clodronate-containing liposome，CLDN)处理9小时，随后APAP再处理6小时的WT小鼠中的肝内血小板(CD41+)和KC(F4/80+)的IF染色。比例尺，25μm。(图2E至F)如d中所述处理小鼠，确定血清ALT水平，并用勾勒的坏死区域评价肝组织学。(n＝6只小鼠/组，在图2B至F中)。比例尺，250μm。(图2G)正常肝活检物(正常)和来自患有AILI的患者的肝活检物(患者)的肝内巨噬细胞(CD68+)的IHC检测和定量(n＝10/组)。比例尺，250μm。(图2H)来自用PBS或APAP处理2小时的WT小鼠(n＝4只小鼠/组)的肝匀浆中巨噬细胞活化因子的ELISA分析。(图2I)用以检测肝内血小板(CD41+)和KC(F4/80+)的IF染色。在APAP攻击之前3小时用PBS或rCHI3L1另外处理的经APAP处理的CHI3L1-/-小鼠和未处理CHI3L1-/-小鼠中对血小板数量进行定量(n＝3至4只小鼠/组)。比例尺，25μm。在图2C、2E和2H中进行了双尾、未配对的student t检验。在图2I中进行单因素ANOVA。
图3A至D.Chi31与KC上的CD44相互作用。(图3A)使用从用APAP处理2小时的WT和CD44-/-小鼠中获得的肝匀浆进行抗CD44抗体的免疫沉淀。输入蛋白和免疫沉淀蛋白用指定的抗体进行印迹。(图3B)人His-CHI3L1与人Fc-CD44的结合动力学的干涉术测量。(图3C)His标记的对照和人CHI3L1与重组人CD44一起孵育。与CHI3L1结合的蛋白质用抗His抗体进行免疫沉淀。输入蛋白和免疫沉淀蛋白用指定的抗体进行印迹。(图3D)用以鉴定从用APAP处理2小时的WT小鼠分离的肝非实质细胞中的rCHI3L1结合细胞的流式细胞术分析。从CD45+单活细胞中对CD44+细胞设门。进一步从CD44+细胞中对CHI3L1结合细胞设门。然后通过识别多种细胞类型的特异性标志物(例如F4/80(KC)、CD146(LSEC)、Ly6C(单核细胞))来鉴定CHI3L1+CD44+细胞。
图4A至F.CHI3L1通过CD44促进血小板募集和肝损伤。(图4A)，用APAP处理雄性WT小鼠。用PBS或rCHI3L1加APAP处理雄性CHI3L1-/-和CD44-/-小鼠(n＝3只小鼠/组)。在APAP处理之后3小时处死小鼠，并进行IF染色以检测肝内血小板(CD41+)。通过对LSEC进行CD31染色来勾勒肝窦。比例尺，25μm。(图4B，4C)如图a中所述处理小鼠，并在APAP攻击之后24小时处死。用勾勒的坏死区域评价肝组织学(n＝6只小鼠/组)，并测量血清ALT活性(n＝6至10只小鼠/组)。比例尺，250μm。(图4D)用rCHI3L1重构的CHI3L1-/-小鼠在APAP攻击之前30分钟用Ctrl IgG或α-CD44 Ab处理。在APAP处理之后3小时收获肝切片(n＝3只小鼠/组)。进行IF染色以检测肝内血小板(CD41+)。通过对LSEC进行CD31染色来勾勒肝窦。比例尺，25μm。(图4E，4F)如图4D中所述处理CHI3L1-/-小鼠，并在APAP攻击之后24小时处死。用勾勒的坏死区域评价肝组织学，并测量血清ALT活性(n＝4至5只小鼠/组)。比例尺，250μm。在图4C中进行单因素ANOVA。在图4F中进行双尾、未配对的student t检验。
图5A至H.通过CHI3L1/CD44轴调节的平足蛋白有助于KC介导的血小板募集。(图5A)在从未处理WT小鼠和用APAP处理1小时和3小时的WT小鼠(n＝4只小鼠/组)中分离的KC、LSEC、肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)和肝细胞(hepatocyte，Hep)中通过qPCR分析平足蛋白(podoplanin，PDPN)的mRNA水平。(图5B)用APAP处理WT小鼠。用PBS或rCHI3L1处理CHI3L1-/-和CD44-/-小鼠，然后3小时后进行APAP攻击(n＝3只小鼠/组)。在APAP之后3小时处死小鼠，并分离KC。通过qPCR分析KC中PDPN的mRNA水平。(图5C，5D)如图5B中所述处理WT、CHI3L1-/-和CD44-/-小鼠。图5C示出了PDPN和F4/80的肝切片的IF染色，并且图5D定量了表达PDPN的KC的比例。比例尺，25μm。(图5E)用rCHI3L1重构的CHI3L1-/-小鼠用Ctrl IgG或α-平足蛋白Ab处理16小时，并随后用APAP攻击(n＝3只小鼠/组)。在APAP处理之后3小时处死小鼠，并进行IF染色以鉴定肝内血小板(CD41+)和KC(F4/80+)。比例尺，25μm。(图5F，5G)如图E中所述处理小鼠，并在APAP攻击之后24小时处死。用勾勒的坏死区域评价肝组织学，并测量血清ALT活性(n＝6只小鼠/组)。比例尺，250μm。(图5H)从用APAP处理3小时的WT小鼠中分离KC。在与血小板一起孵育之前，用对照IgG(Ctrl IgG)或α-平足蛋白(PDPN)Ab在体外处理细胞。进行IF染色以检测KC上的PDPN和血小板上的Clec-2。比例尺，25μm。在图5A、5B和5D中进行单因素ANOVA。在图5G中进行双尾、未配对的student t检验。
图6A至H.靶向CHI3L1以治疗AILI的治疗潜力。(图6A)用APAP处理雄性WT小鼠3小时，并随后用对照IgG(Ctrl IgG)或抗小鼠CHI3L1 Ab(α-mCHI3L1 Ab，C59)进行注射(i.p.)。在APAP之后6小时进行对肝内血小板(CD41+)的IF染色(n＝3只小鼠/组)。比例尺，25μm。(图6B，6C)如图6A中所述处理小鼠，并在APAP攻击之后24小时处死。用勾勒的坏死区域评价肝组织学，并测量血清ALT活性(n＝4至6只小鼠/组)。(图6D)对在正常肝活检物(正常)和来自患有AILI的患者的肝活检物(患者)中的CHI3L1的IHC染色(n＝10/组)。比例尺，250μm。(图6E)用APAP处理CHI3L1-/-小鼠3小时，并随后将其分成数个亚组，其用PBS、重组人CHI3L1(recombinant human CHI3L1，rhCHI3L1)、rhCHI3L1加对照IgG(Ctrl IgG)或rCHI3L1加抗人CHI3L1 Ab(α-hCHI3L1 Ab，C7)进行处理。在APAP之后6小时进行IF染色以鉴定肝内血小板(CD41+)。比例尺，25μm。(图6F，6G)如图6E中所述处理CHI3L1-/-小鼠，并在APAP攻击之后24小时处死。(图6H)用勾勒的坏死区域评价肝组织学，并测量血清ALT活性(n＝6只小鼠/组)。比例尺，250μm。(n＝5至10只小鼠/组，在图6E至G中)。在图6C中进行双尾、未配对的student t检验。在图6G中进行单因素ANOVA。
图7.上清液抗体与人CHI3L1(hCHI3L1)和小鼠CHI3L1(mCHI3L1)的ELISA结合。将CHI3L1蛋白包被在maxi-sorp 96孔板上，细胞培养上清液(100ul/孔)用于结合在经抗原包被的板上。Y轴示出了结合信号(A450 nm)，并且X轴示出了CHI3L1 mAb。
图8.在Octet仪器上收集的用于确定每个CHI3L1抗体的kon和koff速率的动力学结合传感图。在蛋白A传感器上捕获单个mAb，并且在每条曲线中使用的CHI3L1浓度(从低到高)分别为3.55、7.1、14.2、28.4、56.8nM。
图9A至D.使用4T1同基因小鼠肿瘤模型进行的体内乳腺癌肿瘤生长的CHI3L1 mAb(C9)处理。(图9A)与对照(Tx PBS)相比的CHI3L1mAb(Tx CHI3L1)处理组的肿瘤生长曲线。误差条表示标准偏差(standard deviation，SD)和n＝5。(图9B)单个小鼠生长曲线，并且红线(小鼠#-CHI3L1)是CHI3L1 mAb处理组的，并且空白线是对照组的。(图9C)与对照组(TxPBS)中相比，经CHI3L1 mAb处理的小鼠(Tx CHI3L1)显示出显著降低的肿瘤重量，n＝5。(图9D)在划破小鼠并从每只小鼠中移出肿瘤之后拍摄肿瘤图像，并且示出了两组来自对照小鼠的肿瘤图像。
图10.使用划痕测定的CHI3L1 mAb(10μg/ml)处理对癌细胞迁移的抑制。空白表示无抗体处理对照，并且划痕空间(scratch gap)被癌细胞填充。用C59、C68、C75和C79 mAb的处理显示出对细胞迁移的抑制，如由红色箭头指示的未填充空间所示。
图11.C#59ab(α-CHI3L1)减弱肝肿瘤发生。
图12.CHI3L1 KO小鼠中的肿瘤发生被改善。
图13.在划痕测定中抗CHI3L1 mAb(C59，10μg/mL)处理对rCHI3L1诱导的HCC细胞(Hepa-16)迁移的抑制。
图14.在小鼠内皮细胞系的管形成测定(TSEC)中抗CHI3L1 mAb(C59，10μg/mL)处理对rCHI3L1诱导的血管生成的抑制。
图15A至B.显示HCC中Chi3l1 mRNA提高及其与存活的相关性的TCGA数据库。(图15A)基于癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库，分析了健康对照和HCC患者的Chi3l1转录物水平(mRNA表达)。(图15B)在具有高和低Chi3l1 mRNA表达水平的两组之间比较了患者的总存活率(％)。
图16A至B.Chi3l1在来自HCC患者的血清和肿瘤中升高。(图16A)从具有不同病因状况(乙型肝炎病毒，HBV；丙型肝炎病毒，HCV；非酒精性脂肪性肝炎，NASH；酒精性脂肪性肝炎，ASH)的HCC患者中收集血清样品。通过ELISA测量血清中Chi3l1的蛋白质水平。(图16B)通过IHC染色检测来自HCC患者的肿瘤和非肿瘤邻近肝组织中的Chi3l1表达。
图17A至B.通过C59mAb中和Chi3l1抑制了体内HCC进展。(图17A)小鼠被用肝肿瘤细胞(Hepa1-6细胞)直接植入到肝中。在1周之后，将小鼠随机分成两组，并用IgG或C59 mAb(200μg/小鼠，两次/周)处理4周。(图17B)通过尾静脉对小鼠流体动力学注射癌基因(b-连环蛋白，c-Met)以及睡美人(sleeping beauty，SB)质粒。在4周之后，用C59 mAb(200μg/小鼠，两次/周)处理小鼠4周。
图18A至D.Chi3l1对肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵入的直接作用。在有或没有C59mAb(10μg/ml)的情况下，将Hepa1-6细胞用rChi3l1蛋白(1μg/ml)处理24小时，然后使用WST-1试剂分析细胞增殖(图18A)，使用8μm插入物(图18B)和胶原涂层基质(图18C)分析迁移和侵入。为了诱导细胞凋亡，在有或没有C59mAb(10μg/ml)的情况下，用高浓度的棕榈酸(palmitic acid，PA，400μM)和rChi3l1蛋白(1μg/ml)处理细胞。在24小时之后，使用流式细胞术对细胞的膜联蛋白V(annexin V，ANX V)表达进行分析(图18D)。
图19.Chi3l1-/-小鼠中的肿瘤生长显著降低。Chi3l1-/-和WT小鼠被用肝肿瘤细胞(Hepa1-6细胞)直接植入到肝中。在5周之后，处死小鼠以测量肿瘤尺寸。
图20.Chi3l1由肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)表达。如图17A至B所述处理小鼠。通过IHC染色检测肝中的Chi3l1和F4/80表达。
图21.C59mAb处理恢复了TAM的促炎和抗肿瘤发生表型。如图17A至B所述处理小鼠。通过梯度依赖性离心来分离总的肝单个核细胞(mononuclear cell，MNC)。通过使用抗CD11b和抗F4/80抗体的磁性相关细胞分选来分离肝巨噬细胞。通过qPCR分析对分离的肝巨噬细胞的mRNA表达水平进行分析。
图22A至B.C59mAb处理降低了TAM的Arg1表达。如图17A至B中所述处理小鼠。通过IHC染色检测肝中F4/80和Arg1的表达(图22A)。从肿瘤中分离肝MNC，并通过流式细胞术进行分析。对CD11b+Ly6G-F4/80+MHC II+细胞设门。示出了Arg1表达(图22B)。
图23A至C.使用生物层干涉术检测的C59Hu和C7Hu的结合亲和力。(图23A)C59Hu与小鼠Chi3L1的结合。(图23B)C59Hu与人Chi3L1的结合。(图23C)C7Hu与人Chi3L1的结合。
图24.抗Chil3抗体的重链(Heavy chain，HC)可变DNA序列。
图25.抗Chil3抗体的轻链(Light chain，LC)可变DNA序列。
图26.抗Chil3抗体的重链(HC)可变氨基酸序列。
图27.抗Chil3抗体的轻链(LC)可变氨基酸序列。
图28.人源化C59和C7氨基酸序列。
图29.人源化C59Hu和C7Hu DNA序列。
扩展数据图1.在CLDN处理之后15小时，KC被耗竭。给雄性WT小鼠注射含PBS的空脂质体(PBS)或含氯膦酸盐的脂质体(CLDN)9小时，随后用APAP再处理6小时。分离NPC并进行流式细胞术分析。在单活CD146-细胞上对指示的细胞设门。
扩展数据图2A至H.KC在Con A诱导的肝损伤(Con A-induced liver injury，CILI)中快速募集血小板以加重肝损伤。(扩展数据图2A)，用PBS或Con A处理6小时的雄性WT小鼠中肝内血小板(CD41+)的IF染色。对肝内血小板的数量进行定量(n＝3/组)。比例尺，25μm。(扩展数据图2B，2C)在施用Con A之前12小时，用对照IgG(Ctrl IgG)或抗CD41抗体(α-CD41 Ab)处理雄性WT小鼠。在Con A处理之后24小时，确定血清ALT水平，并用勾勒的坏死区域评价肝组织学。比例尺，250μm(n＝5只小鼠/组)。(扩展数据图2D)在Con A处理之后24小时，b中处理的小鼠的肝内血小板的CD41染色。(n＝3只小鼠/组)。(扩展数据图2E)用PBS或Con A处理6小时的WT小鼠中肝内血小板(CD41+)和KC(F4/80+)的IF染色。比例尺，25μm。箭头指示黏附于KC的血小板(n＝3只小鼠/组)。(扩展数据图2F)对用含PBS的空脂质体(PBS)或含氯膦酸盐的脂质体(CLDN)处理9小时，随后用Con A再处理6小时的WT小鼠中的肝内血小板(CD41+)和KC(F4/80+)的IF染色。比例尺，25μm(扩展数据图2G，2H)如f中所述处理WT小鼠，并在Con A攻击之后6小时处死。确定血清ALT水平，并用勾勒的坏死区域评价肝组织学。比例尺，250μm(在扩展数据图2G和2H中，n＝4只小鼠/组)。在扩展数据图2A、2B和2G中进行双尾、未配对的student t检验。
扩展数据图3A至C.CHI3L1或CD44缺失不影响APAP生物活化。用APAP处理雄性WT小鼠。(扩展数据图3A)通过HPLC在指定的时间点测量肝中的GSH水平。(扩展数据图3B)在小鼠禁食过夜之后但在APAP处理之前，通过Western印迹测量CYP2E1的肝蛋白质水平。(扩展数据图3C)在APAP处理之后2小时，通过Western印迹测量肝中的NAPQI-蛋白质加合物。(n＝3只小鼠/组)。
扩展数据图4A至E.CHI3L1在CILI中通过CD44促进肝血小板募集和肝损伤。(扩展数据图4A)用Con A处理雄性WT小鼠。用PBS或rCHI3L1加Con A处理雄性CHI3L1-/-和CD44-/-小鼠(n＝3只小鼠/组)。在Con A处理之后6小时处死小鼠，并进行IF染色以检测肝内血小板(CD41+)。比例尺，25μm。(扩展数据图4B、4C)如图a中所述处理雄性WT小鼠，并在Con A攻击之后24小时处死。用勾勒的坏死区域评价肝组织学，并测量血清ALT活性(n＝4至5只小鼠/组)。比例尺，250μm。(扩展数据图4D)将用rCHI3L1重构的CHI3L1-/-小鼠在Con A攻击之前30分钟用Ctrl IgG或α-CD44 Ab进行处理。在Con A处理之后3小时收获肝切片(n＝3只小鼠/组)。进行IF染色以检测肝内血小板(CD41+)。比例尺，25μm。(扩展数据图4E)如扩展数据图4D中所述处理用rCHI3L1重构的CHI3L1-/-小鼠，并在APAP攻击之后24小时处死。用勾勒的坏死区域评价肝组织学，并测量血清ALT活性(n＝6只小鼠/组)。比例尺，250μm。在扩展数据图4D和4E中进行双尾、未配对的student t检验。
扩展数据图5.KC中血小板黏附分子的mRNA水平的测量。用APAP处理雄性WT、CHI3L1-/-、CD44-/-小鼠(n＝4只小鼠/组)。在3小时之后，处死小鼠，并分离KC以测量多种黏附分子的mRNA水平，所述黏附分子包括P-选择素糖蛋白配体1(P-Selectin GlycoproteinLigand 1，PSGL-1)、分化簇40(Cluster of differentiation 40，CD40)、分化簇147(CD147)、细胞间黏附分子1(Intercellular adhesion molecule，ICAM)、淋巴细胞功能相关抗原1(Lymphocyte function-associated antigen 1，LFA1)、冯·维勒布兰德因子(vonWillebrand Factor，VWF)。进行单因素ANOVA。
扩展数据图6.检查一组抗小鼠CHI3L1单克隆抗体(抗mCHI3L1 mAb)在减弱AILI中的有效性。用APAP处理雄性WT小鼠，并在3小时之后用抗mCHI3L1 mAb的多种克隆进行注射(i.p)。在APAP处理之后6小时和24小时确定血清ALT水平(n＝3至6只小鼠/组)。进行单因素ANOVA。
扩展数据图7.与雌性WT小鼠相比，雌性CHI3L1-/-和CD44-/-小鼠发生降低。用APAP处理雌性WT、CHI3L1-/-和CD44-/-小鼠。在6小时和24小时之后，测量血清ALT水平(n＝6至8只小鼠/组)。进行单因素ANOVA。
具体实施方式
本公开内容描述了这样的研究，其旨在使用对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝损伤(AILI)和伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，Con A)诱导的肝炎的鼠模型来阐明急性肝损伤期间肝血小板积聚的潜在细胞和分子机制。此外，抗CHI3L1抗体的成功开发揭示了CHI3L1是用于通过这样的中和抗体来治疗AILI的可行性治疗靶标。另外，基于最近阐明的CHI3L1在癌症中的作用，这些相同的抗体也可用于治疗癌症。
本公开内容的以下描述仅旨在举例说明本公开内容的多个实施方案。因此，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开内容的范围的限制。对本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本公开内容的范围的情况下可进行多种等同方案、改变和修改，并且应理解，这样的等同实施方案将包括在本文中。本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均通过引用整体并入本文。
I.定义
应理解，上述一般性描述和以下详细描述二者仅是示例性和说明性的，并且不对所要求保护的发明具有限制性。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另有说明，否则“或/或者”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式诸如“包含”和“含有”的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，否则术语例如“要素”或“组分”涵盖构成一个单元的要素和组分以及构成多于一个亚单元的要素和组分二者。此外，术语“部分”的使用可以包括部分的一部分或整个部分。
如本文中使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式包括复数指代物。
当提及可测量值例如量、持续时间等时，本文中使用的术语“约”意指涵盖来自指定值的多至±10％的变化。除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、特性例如分子量、反应条件等的所有数字在所有情况下应被理解为由术语“约”修饰。因此，除非相反地指出，否则以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据由所公开的主题试图获得的期望特性而变化。至少，并不试图将等同原则的应用限制在权利要求书的范围内，每个数值参数应当根据报告的有效数字的数值并通过应用一般的舍入技术来解释。虽然陈述本发明宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中陈述的数值是尽可能精确地报导的。然而，任何数值值均固有地包括不可避免地由在其各自的测试测量中发现的标准偏差产生的某些误差。
术语“抗体”是指可与用于与靶抗原特异性结合的完整抗体竞争的任何同种型的完整免疫球蛋白或其片段，并且包括例如嵌合的、人源化的、完全人的以及双特异性的抗体。“抗体”是一种抗原结合蛋白。完整的抗体将通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但是在一些情况下可以包含更少的链，例如天然存在于骆驼科中的抗体，其可以仅包含重链。抗体可以仅来源于单一来源，或者可以是“嵌合的”，即抗体的不同部分可以来源于两种不同的抗体，如下文进一步所述的。抗原结合蛋白、抗体或结合片段可在杂交瘤中、通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。除非另有说明，否则术语“抗体”除了包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体之外，还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白，这些的实例在下面描述。此外，除非明确排除，否则抗体分别包括单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体(本文有时称为“抗体缀合物”)及其片段。在一些实施方案中，该术语还涵盖肽抗体。
天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。每个这样的四聚体通常由两个相同的多肽链对构成，每对具有一条全长“轻”链(在某些实施方案中，约25kDa)和一条全长“重”链(在某些实施方案中，约50至70kDa)。每条链的氨基末端部分通常包含具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区，该可变区通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常限定可以负责效应功能的恒定区。人轻链通常被分为κ和λ轻链。重链通常被分为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别限定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有数个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，其包括但不限于IgM1和IgM2。类似地，将IgA细分为亚类，其包括但不限于IgA1和IgA2。通常来说，在全长轻链和重链中，可变区和恒定区通过具有约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包含具有约10个更多个氨基酸的“D”区。参见，例如，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))(出于所有目的，其通过引用整体并入)。每个轻链/重链对的可变区通常形成了抗原结合位点。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链和/或重链的一部分，其通常包含重链中约120至130个氨基末端氨基酸和轻链中约100至110个氨基末端氨基酸。在某些实施方案中，不同抗体的可变区在氨基酸序列上有很大差异，甚至在同种抗体之间也是如此。抗体的可变区通常确定了特定抗体对其靶标的特异性。
可变区通常显示出由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(framework region，FR)的相同一般结构。来自每对的两条链的CDR通常通过框架区进行排列，这可使得能够与特定的表位结合。从N端到C端，轻链和重链可变区二者通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配通常根据以下的定义：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987and 1991))，Chothia&Lesk,J.Mol Biol.,196:901-917(1987)或Chothia et al.,Nature,342:878-883(1989)。
在某些实施方案中，在缺乏抗体轻链的情况下，抗体重链与抗原结合。在某些实施方案中，在缺乏抗体重链的情况下，抗体轻链与抗原结合。在某些实施方案中，在缺乏抗体轻链的情况下，抗体结合区与抗原结合。在某些实施方案中，在缺乏抗体重链的情况下，抗体结合区与抗原结合。在某些实施方案中，在缺乏其他可变区的情况下，单个可变区与抗原特异性地结合。
在某些实施方案中，CDR的确定性描述和包含抗体之结合位点的残基的鉴定是通过辨析抗体的结构和/或辨析抗体-配体复合物的结构实现的。在某些实施方案中，这可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任一种，例如X射线晶体学来实现。在某些实施方案中，可以采用多种分析方法来鉴定或模拟CDR区。这样的方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和接触定义(contact definition)。
Kabat定义是对抗体中的残基进行编号的标准，并且通常用于鉴定CDR区。参见例如，Johnson&Wu,Nucleic Acids Res.,28:214-8(2000)。Chothia定义类似于Kabat定义，但是Chothia定义考虑了某些结构环区的位置。参见例如，Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196:901-17(1986)；Chothia et al.,Nature,342:877-83(1989)。AbM定义使用由OxfordMolecular Group产生的对抗体结构进行建模的集成计算机程序套件。参见例如，Martinet al.,Proc Natl Acad Sci(USA),86:9268-9272(1989)；“AbMTM,A Computer Programfor Modeling Variable Regions of Antibodies,”Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd。AbM定义使用知识数据库与从头计算方法(ab initio method)(例如由在PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3:194-198(1999)中的Samudrala et al.,“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach,”所述的那些)的组合由一级序列对抗体的三级结构进行建模。接触定义是基于对可用的复杂晶体结构的分析。参见，例如，MacCallum et al.,J.Mol.Biol.,5:732-45(1996)。
按照惯例，重链中的CDR区通常被称为H1、H2和H3，并且在从氨基末端到羧基末端的方向上顺序编号。轻链中的CDR区通常被称为L1、L2和L3，并且在从氨基末端到羧基末端的方向上顺序编号。
术语“轻链”包括全长轻链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长轻链包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端处。轻链包含κ链和λ链。
术语“重链”包括全长重链及其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链包含可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域在多肽的氨基末端处，并且CH结构域在羧基末端处，其中CH3最靠近多肽的羧基末端。重链可以是任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
双特异性或双功能性的抗体通常是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括但不限于杂交瘤的融合或Fab’片段的连接。参见例如，Songsivilai et al.,Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny et al.,J.Immunol.,148:1547-1553(1992)。
术语“抗原”是指能够诱导适应性免疫应答的物质。具体地，抗原是充当用于适应性免疫应答的受体的靶标的物质。通常来说，抗原是与抗原特异性受体结合但其本身不能在体内诱导免疫应答的分子。抗原通常是蛋白质和多糖，较低频率也是脂质。如本文中使用的，抗原还包括免疫原和半抗原。
如本文中使用的“抗原结合蛋白”(antigen binding protein)(“ABP”)意指结合特定靶抗原的任何蛋白质。在本申请中，指定的靶抗原是CHI3L1蛋白或其片段。“抗原结合蛋白”包括但不限于抗体及其抗原结合片段。肽抗体是抗原结合蛋白的另一实例。
如本文中使用的术语“抗原结合片段”是指能够与抗原特异性结合的蛋白质部分。在某些实施方案中，抗原结合片段来源于包含一个或更多个CDR的抗体，或与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的任何其他抗体片段。在某些实施方案中，抗原结合片段不是来源于抗体，而是来源于受体。抗原结合片段的实例包括但不限于以下：双抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、多特异性抗体、单域抗体(single domain antibody，sdAb)、骆驼科抗体或纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。在某些实施方案中，抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合。在某些实施方案中，抗原结合片段可以包含来自特定人抗体的一个或更多个CDR，该CDR被接枝到来自一种或更多种不同人抗体的框架区。在某些实施方案中，抗原结合片段来源于受体，并包含一个或更多个突变。在某些实施方案中，抗原结合片段不与该抗原结合片段所来源于的受体的天然配体结合。
“Fab片段”包含一条轻链，以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
“Fab’片段”包含一条轻链，以及一条重链的一部分，所述一条重链的一部分包含VH结构域和CH1结构域以及还具有在CH1与CH2结构域之间的区域，使得可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”包含两条轻链和两条重链，所述重链包含在CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段构成。
“Fc”区包含两个含有抗体的CH1和CH2结构域的重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“单链抗体”是这样的Fv分子，其中重链和轻链可变区通过柔性接头连接以形成单个多肽链，该多肽链形成抗原结合区。单链抗体在国际专利申请公开No.WO 88/01649和美国专利No.4,946,778和No.5,260,203中进行了详细讨论，其公开内容通过引用并入。
“结构域抗体”是仅包含重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。
“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。二价抗原结合蛋白和二价抗体可以是双特异性的，参见下文。在某些实施方案中，不同于“多特异性”或“多功能性”抗体，二价抗体通常被理解为其结合位点各自相同。
“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向多于一种抗原或表位的蛋白质。
“双特异性的”、“双重特异性的”或“双功能性的”抗原结合蛋白或抗体是各自具有两个不同抗原结合位点的杂交抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗原结合蛋白和抗体是一种多特异性抗原结合蛋白抗体，并可通过多种方法产生，包括但不限于杂交瘤融合或Fab’片段连接。参见例如，Songsivilai and Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79:315-321；Kostelny et al.,1992,J.Immunol.148:1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将与两个不同的表位结合，这两个表位可位于同一或不同的蛋白质靶标上。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则本文中使用的“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(dissociation constant，Kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法(包括本文中所述的那些)测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持结合更长时间。测量结合亲和力的多种方法是本领域中已知的，其中任何方法都可用于本发明的目的。以下描述了用于测量结合亲和力的具体举例说明性和示例性实施方案。
“特异性地结合”特定多肽或特定多肽上的表位或者对其“具有特异性”的抗体是与该特定多肽或特定多肽上的表位结合而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合的抗体。例如，本发明的CHI3L1特异性抗体对CHI3L1具有特异性。在一些实施方案中，与CHI3L1结合的抗体的解离常数(Kd)为≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如，10-8M或更小，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。
当在竞争同一表位的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的背景下使用时，术语“竞争”意指如通过这样的测定所确定的抗原结合蛋白之间的竞争，在该测定中，所测试的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)防止或抑制(例如，降低)参考抗原结合蛋白(例如，配体或参考抗体)与共同抗原(例如，CHI3L1或其片段)的特异性结合。许多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(enzymeimmunoassay，EIA)，夹心竞争测定(参见例如，Stahli et al.,1983,Methods inEnzymology 9:242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如，Kirkland et al.,1986,J.Immunol.137:3614-3619)固相直接标记测定，固相直接标记夹心测定(参见例如，Harlowand Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见例如，Morel et al.,1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung,et al.,1990,Virology 176:546-552)；以及直接标记RIA(Moldenhauer et al.,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常来说，这样的测定涉及以下的使用：与固体表面结合的纯化抗原或携带这些之一的细胞，未经标记的测试抗原结合蛋白和经标记的参考抗原结合蛋白。竞争性抑制是通过在测试抗原结合蛋白存在的情况下确定与固体表面或细胞结合的标记的量来测量的。通常测试抗原结合蛋白是过量存在的。通过竞争测定鉴定的抗原结合蛋白(竞争抗原结合蛋白)包括与参考抗原结合蛋白结合同一表位的抗原结合蛋白，以及与足够接近参考抗原结合蛋白所结合的表位的邻近表位结合以产生空间位阻的抗原结合蛋白。关于用于确定竞争性结合的方法的另外的细节在本文中的实施例中提供。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如，降低)参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合至少40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％或75％或更多。在一些情况下，结合被抑制至少80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至97％、或97％或更多。
本文中使用的术语“表位”是指与抗体结合的抗原上特定氨基酸或原子组。表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由来自抗原的连续氨基酸序列形成，并基于其一级结构与抗体相互作用。在另一方面，构象表位由抗原的氨基酸序列的不连续部分构成，并基于抗原的3D结构与抗体相互作用。一般来说，表位的长度为约5或6个氨基酸。如果两种抗体对抗原显示出竞争性结合，则它们可以与抗原中的同一表位结合。
本文中使用的“细胞”可以是原核或真核的。原核细胞包括例如细菌。真核细胞包括例如真菌、植物细胞和动物细胞。动物细胞(例如，哺乳动物细胞或人细胞)的类型包括例如来自循环/免疫系统或器官的细胞，例如，B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、粒细胞(例如，嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和超节段性中性粒细胞(hypersegmented neutrophil))、单核细胞或巨噬细胞、红细胞(例如，网织红细胞)、肥大细胞、凝血细胞或巨核细胞以及树突细胞；来自内分泌系统或器官的细胞，例如，甲状腺细胞(例如，甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺细胞(例如，甲状旁腺主细胞、嗜氧细胞)、肾上腺细胞(例如，嗜铬细胞)和松果体细胞(例如，松果体细胞)；来自神经系统或器官的细胞，例如，成胶质细胞(例如，星形胶质细胞和少突胶质细胞)、小胶质细胞、巨细胞神经分泌细胞、星状细胞、伯特歇尔细胞(boettcher cell)和垂体细胞(例如，促性腺激素、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、促生长激素和促乳激素)；来自呼吸系统或器官的细胞，例如，肺细胞(I型肺细胞和II型肺细胞)、克拉拉细胞(claracell)、杯状细胞和肺泡巨噬细胞；来自循环系统或器官的细胞(例如，心肌细胞和周细胞)；来自消化系统或器官的细胞，例如，胃主细胞、壁细胞、杯状细胞、帕内特细胞(panethcell)、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞和肝细胞(例如，肝细胞和库普弗细胞(Kupffer cell))；来自皮肤系统或器官的细胞，例如，骨细胞(例如，成骨细胞、骨细胞和破骨细胞)、牙细胞(例如，成牙骨质细胞和成釉细胞)、软骨细胞(例如，成软骨细胞和软骨细胞)、皮肤/毛发细胞(例如，毛细胞、角质细胞和黑素细胞(痣细胞))、肌肉细胞(例如，肌细胞)、脂肪细胞、成纤维细胞和腱细胞；来自泌尿系统或器官的细胞(例如，足细胞、肾小球旁细胞、肾小球内系膜细胞、肾小球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞和致密斑细胞)；以及来自生殖系统或器官的细胞(例如，精子、支持细胞、间质细胞、卵子、卵母细胞)。细胞可以是正常、健康的细胞；或者病变或不健康的细胞(例如，癌细胞)。细胞还包括哺乳动物受精卵或干细胞，其包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、诱导多能干细胞和成体干细胞。干细胞是能够经历细胞分裂周期，同时保持未分化状态并分化成特化细胞类型的细胞。干细胞可以是全能干细胞、多潜能干细胞(pluripotent stemcell)、多能干细胞(multipotent stem cell)、寡能干细胞和单能干细胞，它们中的任一种都可以从体细胞中诱导。干细胞也可以包括癌症干细胞。哺乳动物细胞可以是啮齿动物细胞，例如，小鼠、大鼠、仓鼠细胞。哺乳动物细胞可以是兔类细胞，例如，兔细胞。哺乳动物细胞也可以是灵长类细胞，例如，人细胞。
本文中使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂合蛋白或多肽，其包含与活化免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)的结构域或信号传导例如T细胞信号传导或T细胞活化结构域相连的抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))(参见例如，Kershaw et al.,同上；Eshhar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90(2):720-724(1993)；和Sadelain et al.,Curr.Opin.Immunol.21(2):215-223(2009))。CAR能够利用单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制性方式将免疫细胞特异性和反应性重新导向选定的靶标。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的免疫细胞以独立于抗原加工识别抗原的能力，由此绕过肿瘤逃逸的主要机制。另外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(T-cell receptor，TCR)α和β链二聚化。
如本文中使用的就指定组分而言的“基本上不含”在本文中用于意指没有指定组分被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期的污染导致的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分的量的组合物。
术语“宿主细胞”意指已经用核酸序列转化或能够用核酸序列转化并因此表达目的基因的细胞。该术语包括亲代细胞的子代，只要目的基因存在，无论子代在形态或基因组成上是否与原始亲代细胞相同。
术语“同一性”指两个或更多个多肽分子或者两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列来确定的。“百分比同一性”意指在所比较的分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且基于所比较的分子中最小者的尺寸进行计算。对于这些计算，比对中的空位(如果有的话)优选地通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在以下中描述的那些：Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.,ed.),1988,New York:OxfordUniversity Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.,ed.),1993,New York:Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.),1991,New York:M.Stockton Press；以及Carillo et al.,1988,SIAM J.Applied Math.48:1073。
在计算百分比同一性中，所比较的序列通常以给出序列之间的最大匹配的方式进行比对。可用于确定百分比同一性的计算机程序的一个实例是GCG程序包，其包括GAP(Devereux et al.,1984,Nucl.Acid Res.12:387；Genetics Computer Group,Universityof Wisconsin,Madison,Wis)。计算机算法GAP用于比对待确定序列百分比同一性的两个多肽或多核苷酸。将序列进行比对，以使它们各自的氨基酸或核苷酸最佳匹配(“匹配跨度”，如由算法确定的)。空位开放罚分(其以3×平均对角线计算，其中“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是由特定的比较矩阵指定给每个完美氨基酸匹配的分数或数字)和空位延伸罚分(通常是空位开放罚分的1/10倍)，以及比较矩阵(例如PAM250或BLOSUM 62)与该算法一起使用。在某些实施方案中，该算法也使用标准比较矩阵(参见Dayhoff et al.,1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352，对于PAM 250比较矩阵；Henikoff et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919，对于BLOSUM 62比较矩阵)。
可以在Needleman et al.,1970,J.Mol.Biol.48:443-453中找到可在使用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的百分比同一性中使用的参数的实例。
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可导致两个序列的仅短的区域匹配，并且该小的比对区域可具有非常高的序列同一性，即使两个全长序列之间没有显著的关系。因此，如果需要的话，可以调整所选择的比对方法(GAP程序)，以得到跨越靶多肽的至少50个或其他数目的连续氨基酸的比对。
本文中使用的术语“连接”是指通过分子内相互作用(例如共价键、金属键和/或离子键)或分子间相互作用(例如氢键或非共价键)的缔合。
术语“可操作地连接”指的是元件的排列，其中如此描述的组分被配置以便执行其通常功能。因此，与多肽可操作地连接的给定信号肽指导从细胞中分泌多肽。在启动子的情况下，与编码序列可操作地连接的启动子将指导编码序列的表达。启动子或其他控制元件不必与编码序列连续，只要它们发挥功能以指导其表达即可。例如，在启动子序列和编码序列之间可以存在插入的未翻译但转录的序列，并且启动子序列仍然可以被认为与编码序列“可操作地连接”。
除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义。本文中使用的“另一”可意指至少第二个或更多个。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物二者。构成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的经修饰形式。所述修饰包括碱基修饰(例如溴尿苷和肌苷衍生物)、核糖修饰(例如2’,3’-双脱氧核糖)和核苷酸间键联修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯)。
术语“多肽”或“蛋白质”意指具有天然蛋白质之氨基酸序列的大分子，即由天然存在和非重组的细胞产生的蛋白质；或者其由经遗传改造或重组的细胞产生，并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或者具有天然序列的一个或更多个氨基酸的缺失、添加和/或替换的分子。该术语还包括氨基酸聚合物，其中一个或更多个氨基酸是相应的天然存在氨基酸和聚合物的化学类似物。术语“多肽”和“蛋白质”具体涵盖具有抗原结合蛋白的一个或更多个氨基酸的缺失、添加和/或替换的CHI3L1结合蛋白、抗体或序列。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白质相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。与天然蛋白质相比，这样的片段也可以包含经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段为约5至500个氨基酸长。例如，片段可以为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸长。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能性片段，包括结合结构域。在CHI3L1结合抗体的情况下，有用的片段包括但不限于CDR区、重链和/或轻链的可变区、抗体链的一部分或仅其包含两个CDR的可变区，等等。
可用于本发明中的可药用载体是常规的。E.W.Martin的Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA,15th Edition(1975)描述了适用于本文中公开的融合蛋白的药物递送的组合物和制剂。一般而言，载体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为载剂。针对固体组合物(例如，散剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，待施用的药物组合物可包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。
如本文中使用的，术语“对象”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中，对象是人。对象可以是患者，其指的是为了疾病的诊断或治疗而呈现给医疗提供者的人。本文中使用的术语“对象”可与“个体”或“患者”互换。对象可患有或易患疾病或病症，但可显示或可不显示疾病或病症的症状。
本文中使用的术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指药物有效治疗疾病或病症的剂量或浓度。例如，关于本文中公开的单克隆抗体或其抗原结合片段用于治疗癌症的用途，治疗有效量是能够实现以下的单克隆抗体或其抗原结合片段的剂量或浓度：降低肿瘤体积、根除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长或癌细胞浸润到其他器官中、抑制介导癌性病症的细胞的生长或增殖、抑制或减缓肿瘤细胞转移、改善与肿瘤或癌性病症相关的任何症状或标志、预防肿瘤或癌性病症或延迟其发生，或其一些组合。
如本文中使用的对病症的“治疗”及其变化形式包括预防或减轻病症、减缓病症的发作或病症的发生速度、降低发生病症的风险、预防与病症相关的症状或延缓其发生、减轻或终止与病症相关的症状、引起病症完全或部分消退、治愈病症，或其一些组合。
如本文中使用的，“载体”是指这样的核酸分子，其引入宿主细胞中，从而产生经转化的宿主细胞。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含一种或更多种治疗性基因和/或选择标记基因以及本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达除了细胞原有的核酸和/或蛋白质之外的核酸和/或蛋白质。载体任选地包含有助于实现核酸进入细胞的物质，例如病毒颗粒、脂质体、蛋白质包被等。
II.壳多糖酶3样1与疾病状态
A.壳多糖酶3样1
壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)，也称为YKL-40，是尺寸为约40kDa的分泌型糖蛋白(NP_001267处的人蛋白)，其在人中由CHI3L1基因(NM_001276处的人mRNA)编码。名称YKL-40来源于分泌形式上存在的三个N端氨基酸及其分子量。YKL-40由多种细胞类型(包括巨噬细胞、软骨细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、血管平滑肌细胞和肝星状细胞)表达和分泌。YKL-40的生物学功能尚不清楚。不知道其是否具有特定的受体。YKL-40表达模式与以下相关：与炎症、胞外组织重塑、纤维化和实体癌和哮喘相关的致病过程。
壳多糖酶催化壳多糖的水解，壳多糖是存在于昆虫外骨骼和真菌细胞壁中的丰富的糖聚合物。壳多糖酶的糖苷水解酶18家族包括八个人家族成员。该基因编码糖苷水解酶18家族的糖蛋白成员。该蛋白质缺乏壳多糖酶活性，并由活化的巨噬细胞、软骨细胞、中性粒细胞和滑膜细胞分泌。该蛋白质被认为在炎症和组织重塑过程中发挥作用。由于活性位点内的突变(保守序列：DXXDXDXE(SEQ ID NO:141)；YKL-40序列：DGLDLAWL(SEQ ID NO:142))，YKL-40缺乏壳多糖酶活性。
YKL-40与AKT促存活(抗凋亡)信号传导途径的激活有关。YKL-40通过VEGF依赖性和非依赖性途径促进血管生成。YKL-40是初级星形胶质细胞的迁移因子，且其表达受NFI-X3、STAT3和AP-1的控制。CHI3L1由多种癌症诱导，并且在信号素(semaphorin)7A(蛋白质)存在的情况下，可以抑制多种抗肿瘤免疫系统应答。激活被称为RIG样解旋酶(RIG-likehelicase，RLH)的抗病毒免疫途径具有对抗CHI3L1诱导的能力。癌细胞可以通过刺激NLRX1来抵消RLH。聚(I:C)，一种RNA样分子，可以刺激RLH活化。RLH活化也可以抑制受体IL-13Rα2p的表达。RLH活化储存NK细胞的积聚和活化。RLH活化增加IFN-α/β、趋化素及其受体ChemR23、p-丝切蛋白、LIMK2和PTEN的表达，并以MAVS依赖性方式抑制BRAF和NLRX1。
据认为，YKL-40在癌细胞增殖、存活、侵入和调节细胞-基质相互作用中发挥作用。这表明YKL-40是与不同肿瘤的遗传限定亚群的较差临床结局相关的标志物。YKL-40最近被引入(限制性)临床实践中。一些技术可用于其检测。
YKL-40是在肿瘤微环境和癌症患者血清中以高水平存在的Th2促进细胞因子。YKL-40水平的升高与多种类型癌症的阶段和结局密切相关，这将YKL-40确立为疾病严重程度的生物标志物。用中和抗体靶向YKL-40作为多形性胶质母细胞瘤动物模型的治疗是有效的。YKL-40也增强了肿瘤响应于γ辐照的存活。
B.癌症
尽管过度增殖性疾病可与任何引起细胞开始不受控制地增殖的疾病相关，但是典型实例是癌症。癌症的关键因素之一是细胞的正常凋亡周期被中断，并因此中断细胞生长的药剂作为用于治疗这些疾病的治疗剂是重要的。在本公开内容中，本文所述的微管溶素类似物可用于导致细胞计数降低，并因此可以潜在地用于治疗多种类型的癌症系。在一些方面中，预期本文所述的微管溶素类似物可用于治疗几乎任何恶性肿瘤(malignancy)。在这里，唯一要求是在癌细胞表面上并且尤其是在癌症干细胞表面上存在CHI3L1。
可根据本公开内容处理的癌细胞包括但不限于来自以下的细胞：膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、胃肠、牙龈(gum)、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、胰腺、睾丸、舌、子宫颈或子宫。另外，癌症可具体地具有以下组织学类型，但是其不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌肿瘤；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌(endometroidcarcinoma)；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌(apocrine adenocarcinoma)；皮脂腺癌；耵聍腺癌；黏液表皮样癌；嚢腺癌；乳头状嚢腺癌；乳头状浆液性嚢腺癌；黏液性嚢腺癌；黏液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳房佩吉特病(Paget’s disease)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌w/鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；sertoli细胞癌；恶性莱迪希细胞瘤(leydig celltumor)；恶性脂质细胞瘤；恶性神经节细胞瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤(Mullerian mixed tumor)；肾胚细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤(Brenner tumor)；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病(Hodgkin’s disease)；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥散性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样霉菌病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸细胞性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。在某些方面中，肿瘤可包括骨肉瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤因肉瘤(Ewingsarcoma)、角质母细胞瘤、神经母细胞瘤或白血病。
C.肝损伤
肝损伤，也称为肝毒性，暗指化学物质驱动的肝损害。药物诱导的肝损伤是急性和慢性肝病的原因。肝在转化和清除化学物质中发挥着重要作用，并且容易受到这些药剂毒性的影响。某些药剂在超剂量服用时并且有时甚至在治疗范围内服用时可能会损伤器官。其他化学剂(例如实验室和工业中使用的那些)、天然化学物质(例如，微囊藻毒素)和草药也可诱导肝毒性。导致肝损伤的化学物质被称为肝毒素。
超过900种药物与造成肝损伤有关，并且这是药物从市场中退出的最常见原因。肝毒性和药物诱导的肝损伤也是大量化合物失败的原因，这突出了对于能够在药物开发过程早期检测毒性的毒性预测模型(例如，DTI)和药物筛选测定(例如，干细胞衍生的肝细胞样细胞)的需要。化学物质通常会对肝造成亚临床损伤，该损伤仅表现为肝酶测试异常。药物诱导的肝损伤占所有入院的5％，并占所有急性肝衰竭的50％。
药物不良反应分为A型(固有的或药理性的)或B型(特异质的)。A型药物反应占所有毒性的80％。具有药理性(A型)肝毒性的药物或毒素是具有可预测的剂量-响应曲线(更高的浓度导致更多的肝损害)和良好表征的毒性机制(例如直接损害肝组织或阻断代谢过程)的那些。正如对乙酰氨基酚超剂量的情况一样，该类型的损伤发生在达到某个毒性阈值之后不久。
当药剂在易感个体中引起不可预测的肝毒性时，会在没有警告的情况下发生特异质(B型)损伤，该损伤与剂量无关且具有可变的潜伏期。该类型的损伤没有明确的剂量-响应和时间关系，并且通常来说没有预测模型。即使在作为FDA批准过程的部分的严格临床测试之后，特异质肝毒性也导致数种药物从市场中退出；曲格列酮(Rezulin)和曲伐沙星(Trovan)是从市场中退出的特异质肝毒素的两个最典型实例。经口使用酮康唑与肝毒性(包括一些死亡事故)相关；然而，显示出这样的影响限于服用超过7天时间的剂量。
对乙酰氨基酚(扑热息痛)超剂量是药物诱导的肝病的最常见原因。对乙酰氨基酚(在美国和日本)，扑热息痛(INN)，也以商品名Tylenol和Panadol为人所知，其通常在处方剂量下耐受良好，但超剂量是世界范围内药物诱导的肝病和急性肝衰竭的最常见原因。对肝的损害不是由于药物本身，而是由于肝中细胞色素P-450酶产生的毒性代谢物(N-乙酰基-对苯醌亚胺(N-acetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI))。在正常情况下，该代谢物通过在第2阶段反应中与谷胱甘肽缀合而解毒。在超剂量的情况下，产生大量的NAPQI，其压倒(overwhelm)解毒过程并导致肝细胞损害。一氧化氮也在诱导毒性中发挥作用。肝损伤的风险受数种因素(包括摄入的剂量、同时摄入的酒精或其他药物、摄入与解毒剂之间的间隔等)影响。对肝有毒的剂量完全因人而异并且通常认为在慢性酗酒者中较低。血液水平的测量在评估预后中是重要的，较高的水平预示着较差的预后。乙酰半胱氨酸(谷胱甘肽的前体)的施用可以通过捕获有毒的NAPQI来限制肝损害的严重程度。发生急性肝衰竭的那些仍可自行恢复，但如果出现不良预后迹象(例如脑病或凝血病)，则可能需要移植(参见King’sCollege Criteria)。
非甾体抗炎药。虽然个别镇痛药由于其广泛使用而极少诱导肝损害，但是NSAID已成为表现肝毒性的主要药物群。剂量依赖性和特异质反应二者都被记录。阿司匹林(aspirin)和苯基丁氮酮(phenylbutazone)与固有的肝毒性相关；特异质反应与布洛芬(ibuprofen)、舒林酸(sulindac)、苯基丁氮酮、吡罗昔康(piroxicam)、双氯芬酸(diclofenac)和吲哚美辛(indomethacin)相关。
糖皮质激素。糖皮质激素因其对糖机制的影响而得名。它们促进肝中糖原的储存。肝增大是儿童长期使用类固醇的罕见副作用。成人和儿童群体二者长期使用的典型影响是脂肪变性。
异烟肼。异烟肼(isoniazid，INH)是用于结核病的最常用药物之一；其与高达20％的患者的肝酶轻度升高和1％至2％的患者的严重肝毒性相关。
其他肼衍生药物。还有其他肼衍生药物(例如MAOI抗抑郁药异烟肼)与肝损害相关的情况。苯乙肼与异常肝测试相关。毒性作用可发生于抗生素。
天然产物。实例包括许多蘑菇形鹅膏菌(amanita mushroom)(特别是毁灭天使(destroying angel))和黄曲霉毒素。存在于一些植物中的吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloid)可能有毒。绿茶提取物由于其包含在更多产品中而成为肝衰竭日益增长的原因。
工业毒素。实例包括砷、四氯化碳和氯乙烯。
替代药品。实例包括阿开木果(Ackee fruit)、八角莲、樟脑、Copaltra、苏铁、藤黄、卡瓦叶、吡咯里西啶生物碱、七叶树叶、缬草、聚合草。中草药：金不换、麻黄、首乌片、白鲜皮。
III.单克隆抗体及其产生
本文所述的单克隆抗体可使用标准方法制备，随后进行筛选、表征和功能评估。可对可变区进行测序，并随后将其亚克隆到人表达载体中以产生嵌合抗体基因，然后将该基因表达并纯化。可针对抗原结合、信号传导阻断以及在异种移植实验中对这些嵌合抗体进行测试。
A.一般方法
应理解，与CHI3L1结合的单克隆抗体将具有数种应用。这些包括产生诊断试剂盒，其用于检测和诊断癌症，以及用于癌症治疗。在这些情况下，可将这样的抗体与诊断或治疗剂连接，将其在竞争性测定中用作捕获剂或竞争剂，或者单独使用它们而没有与其连接的另外的试剂。如下文进一步讨论的，抗体可突变或被修饰。用于制备和表征抗体的方法是本领域中公知的(参见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,1988；美国专利4,196,265)。
用于产生单克隆抗体(monoclonal antibody，MAb)的方法通常沿着与用于制备多克隆抗体的方法相同的路线开始。这两种方法的第一步都是对合适的宿主进行免疫接种。如本领域中公知的，用于免疫接种的给定组合物的免疫原性可不同。因此，通常有必要加强宿主的免疫系统，如可通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来实现。一些示例性且优选的载体是钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)和牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)。其他白蛋白例如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作载体。用于使多肽与载体蛋白缀合的方式是本领域中公知的，并且包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺(carbodiimyde)和双-重氮联苯胺(bis-biazotized benzidine)。同样如本领域中公知的，特定免疫原组合物的免疫原性可通过使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强。示例性且优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(包含经杀伤结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的非特异性免疫应答刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫接种的动物而不同。可使用多种途径来施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。可通过在免疫接种之后的不同时间点对经免疫接种的动物采血来监测多克隆抗体的产生。还可给予第二、加强注射。重复加强免疫和滴定过程直至获得合适的效价。当获得期望的免疫原性水平时，可对经免疫接种的动物采血并分离和储存血清，和/或可将动物用于产生MAb。
在免疫接种之后，选择具有产生抗体潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)，用于MAb产生方案。这些细胞可从经活检脾或淋巴结或者从循环血液中获得。然后使来自经免疫接种动物之产生抗体的B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞(其通常为与经免疫接种动物相同物种的细胞，或者人或人/小鼠嵌合细胞)的细胞融合。适用于产生杂交瘤的融合操作的骨髓瘤细胞系优选地不产生抗体、具有高融合效率和酶缺陷，这然后使得其不能在仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择培养基中生长。如本领域技术人员已知的，可使用多种骨髓瘤细胞中的任一种(Goding,第65至66页,1986；Campbell,第75至83页,1984)。
用于产生抗体产生脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括：在存在促进细胞膜融合的一种或更多种试剂(化学的或电学的)的情况下使体细胞与骨髓瘤细胞以2:1的比例混合，但是该比例可分别为约20:1至约1:1而不等。Kohler和Milstein(1975；1976)已描述了使用仙台病毒(Sendai virus)的融合方法，并且Gefter et al.,(1977)已描述了使用聚乙二醇(PEG)例如37％(v/v)PEG的融合方法。使用电诱导融合方法也是合适的(Goding,第71至74页,1986)。融合操作通常以约1×10-6至1×10-8的低频率产生活的杂合体。然而，这并不造成问题，因为通过在选择培养基中培养，活的融合杂合体与亲本未融合细胞(特别是在正常情况下将持续无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)区分开来。选择培养基通常是在组织培养基中包含阻断核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶二者的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，向培养基中补充次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，向培养基中补充次黄嘌呤。如果B细胞来源是EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)转化的人B细胞系，则添加哇巴因(ouabain)以清除未与骨髓瘤融合的EBV转化系。
优选的选择培养基是HAT或具有哇巴因的HAT。只有能够进行核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶(例如，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine phosphoribosyl transferase，HPRT))中有缺陷，因此其不能存活。B细胞可进行该途径，但是其在培养中具有有限的寿命并且通常在约两周内死亡。因此，只有可在选择培养基中存活的细胞才是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂合体。当用于融合的B细胞的来源是EBV转化的B细胞系时，此时还将哇巴因用于杂合体的药物选择，因为EBV转化的B细胞对药物杀伤易感，而选择所使用的骨髓瘤配偶体对哇巴因具有抗性。
培养提供了从中选择特定杂交瘤的杂交瘤群体。通常来说，杂交瘤的选择如下进行：通过在微量滴定板中进行单克隆稀释来培养细胞，随后测试单独的克隆上清液(在约两至三周之后)的期望反应性。测定应灵敏、简单并且迅速，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、斑点免疫结合测定等。然后将选择的杂交瘤连续稀释或通过流式细胞术分选进行单细胞分选，并克隆到单独抗体产生细胞系中，所述克隆然后可无限增殖以提供mAb。细胞系可以以两种基本方式用于MAb产生。可将杂交瘤样品注射(通常注射到腹膜腔中)到动物(例如，小鼠)中。任选地，在注射之前将动物用烃，特别是油(例如姥鲛烷(四甲基十五烷))致敏(prime)。当以这种方式使用人杂交瘤时，注射免疫妥协小鼠(例如SCID小鼠)是最佳的，以防止肿瘤排斥。经注射动物产生分泌由融合细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后，可放出动物的体液例如血清或腹水以提供高浓度MAb。也可在体外培养单个细胞系，其中MAb自然地分泌到培养基中，从中可容易地获得高浓度的MAb。或者，可在体外使用人杂交瘤细胞系以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。可将细胞系调整为在不含血清的培养基中生长，以优化回收高纯度的人单克隆免疫球蛋白的能力。
如果期望的话，可使用过滤、离心和多种色谱方法(例如FPLC或亲和色谱)对通过任一种方式产生的MAb进行进一步纯化。本公开内容的单克隆抗体的片段可通过包括用酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化的方法和/或通过经化学还原切割二硫键由经纯化的单克隆抗体获得。或者，本公开内容所涵盖的单克隆抗体片段可使用自动化肽合成仪合成。
还考虑了可使用分子克隆方法来产生单克隆。为此，可从杂交瘤系分离RNA，并通过RT-PCR获得抗体基因，并将其克隆到免疫球蛋白表达载体中。或者，由从细胞系分离的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌粒文库，并使用病毒抗原通过淘选选择表达合适抗体的噬菌粒。该方法相对于常规杂交瘤技术的优点是可在单轮中产生并筛选约104倍多的抗体，并且通过H链和L链组合产生新特异性，其进一步提高了发现合适抗体的机会。
教导产生可用于本公开内容的抗体的其他美国专利(其各自通过引用并入本文)包括美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法产生嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制备；和美国专利4,867,973，其描述了抗体-治疗剂缀合物。
B.本公开内容的抗体
1.针对CHI3L1的抗体
根据本公开内容的抗体或其抗原结合片段可以首先通过其结合特异性(在本例中，是对于CHI3L1的)来限定。通过使用本领域技术人员公知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力，本领域技术人员可确定这样的抗体是否落入本发明权利要求书的范围内。
在一个方面中，提供了与CHI3L1特异性地结合的抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，当与CHI3L1结合时，这样的抗体调节CHI3L1的活化。
在一些实施方案中，本文中提供的抗体或抗原结合片段具有来自在下表中所示的重链和轻链的克隆配对的CDR。这样的抗体可使用本文所述的方法通过以下在实施例部分中讨论的克隆来产生。在某些实施方案中，每个CDR都是根据CDR的Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义与Chothia定义的组合、AbM定义或接触定义来定义的。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段的特征在于来自下表的克隆配对的重链和轻链序列。
在某些实施方案中，抗体可由其包含另外的“框架”区的可变序列来限定。该抗体的特征在于来自下表的克隆配对的重链和轻链氨基酸序列。此外，抗体序列可不同于这些序列，特别是在CDR之外的区域。例如，氨基酸可以以给定百分比，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性而不同于上述氨基酸，或者氨基酸可通过允许保守替换(以下讨论)而不同于上述那些。上述各项均适用于下表的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本公开内容的抗体衍生物包含VL和VH结构域，其具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个保守或非保守氨基酸替换，同时仍表现出期望的结合和功能特性。
虽然本公开内容的抗体是作为IgG产生，但是修饰恒定区以改变其功能可能是有用的。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。因此，术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及其亚型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ和λ型。在轻链和重链内，可变区和恒定区由具有约12个或更多个氨基酸的35“J”区连接，其中重链还包含具有约10个更多氨基酸的“D”区。通常参见Fundamental ImmunologyCh.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989)。
本公开内容还包括与编码本文中公开的抗体的核酸杂交的核酸。一般而言，核酸在中度或高度严格的条件下与编码本文中公开的抗体以及编码保持与CHI3L1特异性结合的能力的抗体的核酸杂交。当第一核酸分子的单链形式能在适当的温度和溶液离子强度条件下与第二核酸分子退火时，第一核酸分子与第二核酸分子是“可杂交的”(参见Sambrooket al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3rd ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001)。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。典型的中度严格杂交条件是40％甲酰胺，5×或6×SSC和0.1％SDS，42℃。高度严格杂交条件是50％甲酰胺，5×或6×SSC(0.15M NaCl和0.015M枸橼酸钠)，42℃，或者任选地在更高的温度(例如57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下。杂交要求两个核酸包含互补序列，但是根据杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。对核酸进行杂交的适当严格性取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域公知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，核酸可杂交的严格性就越高。对于长度大于100个核苷酸的杂交体，已经推导出了用于计算解链温度的方程(参见Sambrook et al.，同上)。对于与较短的核酸(例如，寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更加重要，并且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook et al.，同上)。
2.示例性表位和竞争性抗原结合蛋白
在另一个方面中，本公开内容提供了与抗CHI3L1抗体结合的表位。
在一些实施方案中，由本文所述的抗体结合的表位是有用的。在某些实施方案中，可以利用本文中提供的表位来分离与CHI3L1结合的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方案中，可以利用本文中提供的表位来产生与CHI3L1结合的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方案中，可以利用本文中提供的表位或包含本文中提供的表位的序列作为免疫原以产生与CHI3L1结合的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施方案中，可以利用本文所述的表位或包含本文所述表位的序列来干扰CHI3L1的生物活性。
在一些实施方案中，与任何表位结合的抗体或其抗原结合片段是特别有用的。在一些实施方案中，当被抗体结合时，本文中提供的表位调节CHI3L1的生物活性。
在一些实施方案中，通过使CHI3L1中的特定残基突变并确定抗体是否能结合突变的CHI3L1蛋白，可以鉴定含有与抗体接触或被抗体覆盖的残基的结构域/区域。通过进行许多单独突变，可以鉴定在结合中发挥直接作用的残基或与抗体足够接近以使得突变可影响抗体与抗原之间的结合的残基。根据对这些氨基酸的了解，可以阐明包含与抗原结合蛋白接触或被抗体覆盖的残基的抗原结构域或区域。这样的结构域可包含抗原结合蛋白的结合表位。
在另一个方面中，本公开内容提供了抗原结合蛋白，其与结合本文所述表位的示例性抗体或抗原结合片段之一竞争与CHI3L1的特异性结合。这样的抗原结合蛋白也可以与本文中例示的抗体或抗原结合片段之一结合同一表位，或与重叠表位结合。预期与例示抗体竞争或结合同一表位的抗原结合蛋白显示出相似的功能特性。例示的抗体包括上述那些抗体，其包括具有图26、27和28以及表A中包括的重链和轻链可变区以及CDR的那些抗体。
C.抗体序列的改造
在多个实施方案中，可出于多种原因，例如改善表达、改善交叉反应性或降低脱靶结合而选择对所鉴定抗体的序列进行改造。以下是用于抗体改造的相关技术的一般讨论。
可培养杂交瘤，然后裂解细胞，并提取总RNA。可使用随机六聚体和RT一起来产生RNA的cDNA拷贝，并随后使用预期扩增所有人可变基因序列的PCR引物的多重混合物进行PCR。可将PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体中，然后使用标准载体引物通过自动化DNA测序进行测序。可使用从杂交瘤上清液收集并使用G蛋白柱通过FPLC纯化的抗体进行结合和中和的测定。可通过以下产生重组全长IgG抗体：将来自克隆载体的重链和轻链Fv DNA亚克隆到IgG质粒载体中，转染到293 Freestyle细胞或CHO细胞中，并从293或CHO细胞上清液中收集和纯化抗体。
与最终cGMP制造过程在相同宿主细胞和细胞培养过程中产生的抗体的迅速可用性有可能降低过程开发计划的持续时间。Lonza已经开发了使用在CDACF培养基中培养的合并转染子用于在CHO细胞中迅速产生少量(多至50g)抗体的一般方法。尽管比真正的瞬时系统稍慢，但是其优点包括更高的产物浓度和与生产细胞系使用相同的宿主和过程。在一次性生物反应器中表达模型抗体之GS-CHO库的生长和生产力的实例为：在以补料分批模式进行的一次性袋状生物反应器培养(5L工作体积)中，在转染后9周内达到了2g/L的收获抗体浓度。
抗体分子将包含例如通过mAb的蛋白水解切割产生的片段(例如F(ab’)、F(ab’)2)或者例如通过重组方式产生的单链免疫球蛋白。这样的抗体衍生物是单价的。在一个实施方案中，这样的片段可彼此组合，或者与其他抗体片段或受体配体组合以形成“嵌合”结合分子。明显地，这样的嵌合分子可包含能够与同一分子的不同表位结合的取代基。
1.抗体结合修饰
在一些相关实施方案中，抗体是所公开抗体的衍生物，例如，包含与所公开抗体中CDR序列相同的CDR序列的抗体(例如，嵌合抗体或CDR接枝抗体)。或者，可希望进行修饰，例如向抗体分子中引入保守变化。在进行这种变化时，可考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。氨基酸亲水指数在赋予蛋白质以相互作用生物学功能中的重要性是本领域中通常了解的(Kyte and Doolittle,1982)。公认的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其转而限定了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
本领域中还应理解的是，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的替换。美国专利4,554,101(通过引用并入本文)声称：蛋白质的最大局部平均亲水性(如受其邻近氨基酸的亲水性控制)与该蛋白质的生物学特性相关。如美国专利4,554,101中所详述的，已向氨基酸残基分配了以下亲水性值：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)；含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水性非芳族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性芳族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。
应理解，氨基酸可被替换为具有类似亲水性的另一氨基酸，并且产生在生物学或免疫学上修饰的蛋白质。在这样的变化中，亲水性值在±2之内的氨基酸的替换是优选的，在±1之内的那些是特别优选的，并且在±0.5之内的那些是甚至更特别优选的。
如以上所概括的，氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。考虑多个前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本公开内容还考虑了同种型修饰。通过修饰Fc区以具有不同同种型，可实现不同功能。例如，改变为IgG1可提高抗体依赖性细胞细胞毒性，转换为A类可改善组织分布，以及转换为M类可改善价位。
经修饰抗体可通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，所述技术包括通过标准分子生物技术表达、或多肽的化学合成。用于重组表达的方法在本文件的其他地方提出。
2.Fc区修饰
本文中公开的抗体也可以被改造成包含Fc区内的修饰，通常是为了改变抗体的一种或更多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或效应子功能(例如，抗原依赖性细胞毒性)。此外，本文中公开的抗体可以经化学修饰(例如，可以将一个或更多个化学部分连接到抗体上)或者经修饰以改变其糖基化，再次改变该抗体的一种或更多种功能特性。下面将进一步详细描述这些实施方案中的每一个。Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引的编号。本文中公开的抗体还包括具有经修饰(或经封闭)Fc区以提供改变的效应子功能的抗体。参见例如，美国专利5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。这样的修饰可用于增强或抑制免疫系统的多种反应，在诊断和治疗中具有可能的有益效果。Fc区的改变包括氨基酸变化(替换、缺失和插入)、糖基化或去糖基化、以及添加多个Fc。Fc的变化也可以改变治疗性抗体中抗体的半衰期，使得给药频率减少，并因此提高了便利性并降低了材料使用。据报道，该突变废除了铰链区中重链间二硫桥的异质性。
在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰，使得铰链区中半胱氨酸残基的数量提高或降低。该方法在美国专利5,677,425中进行了进一步描述。CH1铰链区中半胱氨酸残基的数量被改变，例如，以促进轻链和重链的组装或者以提高或降低抗体的稳定性。在另一个实施方案中，对抗体进行修饰以提高其生物半衰期。多种方法均是可能的。例如，可以引入以下突变中的一个或更多个：如美国专利6,277,375中描述的T252L、T254S、T256F。或者，如美国专利5,869,046和6,121,022中描述的，为了提高生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体以包含取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位。在另一些实施方案中，通过以下来改变Fc区：用不同的氨基酸残基代替至少一个氨基酸残基，以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一种或更多种氨基酸可以用不同的氨基酸残基代替，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其的亲和力被改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法在美国专利5,624,821和5,648,260中有更详细的描述。
在另一个实例中，氨基酸位置231和239内的一个或更多个氨基酸残基被改变，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在PCT公开WO 94/29351中有进一步描述。在另一个实例中，Fc区被修饰以提高或降低抗体介导抗体依赖性细胞毒性(antibody dependentcellular cytotoxicity，ADCC)的能力，和/或通过修饰以下位置处的一个或更多个氨基酸来提高或降低抗体对Fcγ受体的亲和力：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法在PCT公开WO 00/42072中有进一步描述。此外，人IgG1上FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经被定位，并且已描述了具有改善的结合的变体。第256、290、298、333、334和339位的特定突变显示出改善了与FcγRIII的结合。另外，以下组合突变体显示出改善FcγRIII结合：
T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在一个实施方案中，对Fc区进行了修饰以降低抗体介导效应子功能和/或提高抗炎特性(通过修饰残基243和264)的能力。在一个实施方案中，通过将第243和264位残基改变为丙氨酸来对抗体的Fc区进行修饰。在一个实施方案中，对Fc区进行修饰以降低抗体介导效应子功能和/或提高抗炎特性(通过修饰残基243、264、267和328)的能力。在另一个实施方案中，抗体包含特定的糖基化模式。例如，可以制备无糖基化抗体(即抗体缺乏糖基化)。抗体的糖基化模式可以改变成例如提高抗体对抗原的亲和力或亲合力。这样的修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或更多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或更多个氨基酸替换，其导致一个或更多个可变区框架糖基化位点的去除，从而在该位点消除糖基化。这样的糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力或亲合力。参见例如，美国专利5,714,350和6,350,861。
还可以制备这样的抗体：其中糖基化模式包括低岩藻糖基化或无岩藻糖基化聚糖，例如低岩藻糖基化抗体或无岩藻糖基化抗体在聚糖上具有减少量的岩藻糖基残基。该抗体还可以包括具有提高量的二等分的GLcNac结构的聚糖。已经表明了这样改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。这样的修饰可以通过例如在宿主细胞中表达抗体来实现，在所述宿主细胞中，将糖基化途径进行遗传改造以产生具有特定糖基化模式的糖蛋白。这些细胞已在本领域中描述，并且可用作宿主细胞，在其中表达本发明的重组抗体，从而产生糖基化改变的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)-岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系是通过使用两种代替载体在CHO/DG44细胞中靶向破坏FUT8基因而产生的(参见美国专利公开No.20040110704)。作为另一个实例，EP 1 176195描述了具有编码岩藻糖基转移酶的功能性破坏的FUT8基因的细胞系，使得在这样的细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1,6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。EP 1 176 195还描述了对于将岩藻糖添加到与抗体Fc区结合的N-乙酰葡糖胺具有低酶活性或者不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lec13细胞，其降低了岩藻糖附着到Asn(297)连接的糖上的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化。如PCT公开WO 06/089231中所述，还可以在鸡卵中产生具有经修饰的糖基化谱的抗体。或者，可以在植物细胞(例如浮萍属(Lemna)(美国专利7,632,983))中产生具有经修饰的糖基化谱的抗体。美国专利6,998,267和7,388,081中公开了用于在植物系统中产生抗体的方法。PCT公开WO 99/54342描述了这样的细胞系，其被改造成表达糖蛋白-修饰糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)，使得在经改造的细胞系中表达的抗体表现出提高的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性提高。
或者，可以使用岩藻糖苷酶将抗体的岩藻糖残基切除；例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖基残基。本文中公开的抗体还包括在低等真核生物宿主细胞中产生的抗体，特别地，真菌宿主细胞(例如酵母和丝状真菌)已经经遗传改造为产生具有哺乳动物或人样糖基化模式的糖蛋白。相对于当前使用的哺乳动物细胞系，这些经遗传修饰的宿主细胞的一个特别优势是能够控制在细胞中产生的糖蛋白的糖基化谱以使得可以产生其中特定N-聚糖结构占主导地位的糖蛋白组合物(参见，例如，美国专利7,029,872和7,449,308)。这些经遗传修饰的宿主细胞已用于产生主要具有特定N-聚糖结构的抗体。
另外，由于真菌(例如酵母或丝状真菌)缺乏产生岩藻糖基化糖蛋白的能力，因此在这样的细胞中产生的抗体将缺乏岩藻糖，除非进一步修饰细胞以包括用于产生岩藻糖基化糖蛋白的酶促途径(参见，例如，PCT公开WO2008112092)。在一些具体实施方案中，本文中公开的抗体还包括在低等真核宿主细胞中产生以及包含以下的那些抗体：岩藻糖基化和非岩藻糖基化杂合和复合的N-聚糖，包括二等分和多等分种类，包括但不限于N-聚糖，例如
GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。
在一些具体实施方案中，本文中提供的抗体组合物可包含具有选自以下的至少一种杂合N-聚糖的抗体：
GlcNAcMan5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2；和NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。
在一些具体方面中，杂合N-聚糖是组合物中最主要的N-聚糖种类。在另一些方面中，杂合N-聚糖是特定的N-聚糖种类，其占组合物中杂合N-聚糖的约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。
在一些具体实施方案中，本文中提供的抗体组合物包含具有选自以下的至少一种复合N-聚糖的抗体：
GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在一些具体方面中，复合N-聚糖是组合物中最主要的N-聚糖种类。在另一些方面中，复合N-聚糖是特定的N-聚糖种类，其占组合物中复合N-聚糖的约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些具体实施方案中，N-聚糖是岩藻糖基化的。一般而言，岩藻糖在N-聚糖还原端与GlcNAc以α1，3-键联，在N-聚糖还原端与GlcNAc以α1，6-键联，在N-聚糖的非还原端与Gal以α1，2-键联，在N-聚糖的非还原端与GlcNAc以α1，3-键联，或者在N-聚糖的非还原端与GlcNAc以α1，4-键联。
因此，在以上的糖蛋白组合物的一些具体方面中，糖型为α1，3-键联或α1，6-键联岩藻糖以产生选自以下的糖型：
Man5GlcNAc2(Fuc)，GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)，Man3GlcNAc2(Fuc)，GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)，GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)，GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)，Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)，NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)，和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；
为α1，3-键联或α1，4-键联岩藻糖以产生选自以下的糖型：
GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2，GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2，GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2，GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2，Gal2GlcNAc2(Fucl-2)Man3GlcNAc2，NANAGal2GlcNAc2(Fucl-2)Man3GlcNAc2，和NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；
或为α1，2-键联岩藻糖以产生选自以下的糖型：
Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2，Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2，NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2，和NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在另一些方面中，抗体包含高甘露糖N-聚糖，包栝但不限于，Man8GlcNAc2，Man7GlcNAc2，Man6GlcNAc2，Man5GlcNAc2，Man4GlcNAc2，或者由Man3GlcNAc2 N-聚糖结构组成的N-聚糖。在以上的另一些方面中，复合N-聚糖还包括岩藻糖基化和非岩藻糖基化的二等分和多等分种类。如本文中使用的，术语“N-聚糖”和“糖型”可互换使用，并且是指N连接的寡糖，例如，通过天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺键联到多肽的天冬酰胺残基上的寡糖。N连接的糖蛋白包含与蛋白质中天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰葡糖胺残基。
D.单链抗体
单链可变片段(scFv)是用短(通常丝氨酸、甘氨酸)接头连接在一起的免疫球蛋白重链和轻链可变区的融合物。这种嵌合分子虽然去除了恒定区并且引入了接头肽但是保留了原始免疫球蛋白的特异性。这种修饰通常不改变特异性。历史上产生这些分子是为了有利于噬菌体展示，其中将抗原结合结构域表达为单个肽非常方便。或者，可由来源于杂交瘤的亚克隆重链和轻链直接产生scFv。单链可变片段缺少存在于完全抗体分子中的恒定Fc区，并因此缺少用于纯化抗体的常见结合位点(例如，蛋白A/G)。这些片段通常可使用蛋白L纯化/固定，因为蛋白L与κ轻链的可变区相互作用。
柔性接头通常由促进螺旋和转角的氨基酸残基(例如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸)构成。然而，其他残基也可很好地发挥作用。Tang et al.(1996)使用噬菌体展示作为从蛋白质接头文库中快速选择用于单链抗体(scFv)的专用接头的方式。构建随机接头文库，其中用于重链和轻链可变结构域的基因通过编码具有可变组成的18-氨基酸多肽的区段连接。在丝状噬菌体上展示scFv库(约5×106个不同成员)并且用半抗原进行亲和选择。所选择变体的群体表现出结合活性显著提高，但是保留了相当大的序列多样性。随后筛选1054个单独变体产生了以可溶性形式有效产生的催化活性scFv。序列分析揭示，所选择栓链(tether)的仅有的共同特征是：VH C末端之后的两个残基是接头中的保守脯氨酸以及在其他位置处有大量的精氨酸和脯氨酸。
本公开内容的重组抗体还可涉及允许受体二聚化或多聚化的序列或部分。这样的序列包括来源于IgA的那些，其允许与J链联合形成多聚体。另一个多聚化结构域是Gal4二聚化结构域。在另一些实施方案中，可用允许两个抗体组合的试剂(例如生物素/抗生物素蛋白)对链进行修饰。
在一个独立的实施方案中，可通过使用非肽接头或化学单元连接受体轻链和重链来产生单链抗体。通常来说，使轻链和重链在不同细胞中产生，纯化，并且随后以合适的方式连接在一起(即，通过合适的化学桥将重链的N端与轻链的C端连接)。
使用交联试剂形成将两个不同分子的官能团系住的分子桥，例如，稳定和凝结剂。然而，考虑了可产生相同类似物的二聚体或多聚体或者包含不同类似物的异聚复合体。为了以逐步方式连接两个不同化合物，可使用异-双官能交联剂，其消除了不想要的均聚物形成。
一种示例性的异-双官能交联剂包含两个反应性基团：一个与伯胺基(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)反应并且另一个与硫醇基(例如，吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)反应。通过伯胺反应基，交联剂可与一个蛋白质(例如，所选择的抗体或片段)的赖氨酸残基反应，并且通过硫醇反应基，已经系在第一蛋白质上的交联剂与另一蛋白质(例如，选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基)反应。
优选的是将使用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知多种类型含二硫键接头可成功用于使靶向剂和治疗剂/预防剂缀合。包含在空间上受阻之二硫键的接头可证明在体内提供更高稳定性，从而防止靶向肽在到达作用位点之前释放。因此，这些接头是一组连接剂。
另一种交联试剂是SMPT，这是一种包含二硫键的双官能交联剂，该二硫键由于邻近的苯环和甲基而在“空间上受阻”。认为二硫键的空间位阻发挥了保护键不被可存在于组织和血液中的硫醇盐阴离子(例如谷胱甘肽)攻击的功能，并且从而有助于防止缀合物在连接的药剂递送到靶部位之前解偶联。
与许多其他已知的交联试剂一样，SMPT交联试剂也能够使官能团例如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)交联。另一种可能的交联剂类型包括含有可切割二硫键的异-双官能光反应性叠氮基苯，例如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰氨基)乙基-1,3’-二硫代丙酸酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯氨基反应，并且叠氮基苯(光分解之后)非选择性地与任何氨基酸残基反应。
除了受阻交联剂，非受阻交联剂也可据此使用。不考虑包含或产生被保护的二硫化物的话，其他可用的交联剂包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫烷(Wawrzynczak&Thorpe,1987)。这样的交联剂的使用是本领域中非常了解的。另一个实施方案涉及使用柔性接头。
美国专利4,680,338描述了可用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的缀合物，特别是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物的双官能接头。美国专利5,141,648和5,563,250公开了包含在多种温和条件下可切割之不稳定键的可切割缀合物。这种接头特别可用，因为目的药剂可直接与接头键合，并且其切割导致活性剂的释放。特别的用途包括向蛋白质例如抗体或药物添加游离氨基或游离巯基。
美国专利5,856,456提供了用于连接多肽成分以制备融合蛋白(例如，单链抗体)的肽接头。接头的长度为多至约50个氨基酸，包含出现至少一次的带电氨基酸(优选精氨酸或赖氨酸)接着是脯氨酸，并且以更高的稳定性和聚集降低为特征。美国专利5,880,270公开了可用于多种免疫诊断和分离技术的含氨基氧基接头。
E.纯化
在某些实施方案中，本公开内容的抗体可以是经纯化的。如本文中使用的术语“纯化的”旨在指可与其他组分分离的组合物，其中蛋白质被纯化至相对于其可天然获得状态的任何程度。因此，经纯化的蛋白质也指这样的蛋白质，其脱离了其可天然存在的环境。当使用术语“基本上纯化的”时，该指定将指这样的组合物，其中蛋白质或肽形成该组合物的主要组分，例如构成组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知的。这些技术在一个水平上涉及将细胞环境粗分级至多肽级分和非多肽级分。在使多肽与其他蛋白质分离之后，可使用色谱和电泳技术进一步纯化目的多肽以实现部分纯化或完全纯化(或纯化至均质)。特备适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱、排阻色谱；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚集。其他用于蛋白质纯化的方法包括用硫酸铵、PEG、抗体等或通过热变性进行沉淀，然后进行离心；凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱；以及这样的技术与其他技术的组合。
在纯化本公开内容的抗体中，可期望在原核或真核表达系统中表达多肽并使用变性条件提取蛋白质。可使用与多肽的标记部分结合的亲和柱使多肽从其他细胞组分纯化出。如本领域中通常已知的，认为进行各纯化步骤的顺序可改变，或者可省略某些步骤，并且仍然获得适合制备基本上纯化的蛋白质或肽的方法。
通常，使用与抗体的Fc部分结合的试剂(即，蛋白A)对完全抗体进行分级。或者，可使用抗原以同时纯化和选择合适的抗体。这样的方法通常使用结合在支持物(例如柱、过滤器或珠)上的选择剂。使抗体与支持物结合，除去(例如，冲洗掉)污染物，并通过施加条件(盐、热等)释放抗体。
根据本公开内容，本领域技术人员将知道多种用于对蛋白质或肽之纯化程度进行定量的方法。这些包括例如确定活性级分的比活性，或者通过SDS/PAGE分析来评估级分中多肽的量。另一种用于评估级分纯度的方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性比较，并因此计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于根据纯化而选择的特定测定技术，以及所表达蛋白质或肽是否表现出可检测活性。
已知多肽的迁移可随着不同的SDS/PAGE条件而改变，有时候显著地改变(Capaldiet al.,1977)。因此，应理解的是，在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的表达产物的表观分子量可改变。
V.治疗方法
A.制剂和施用
本公开内容提供了包含抗CHI3L1抗体和用于产生该抗CHI3L1抗体的抗原的药物组合物。这样的组合物包含预防或治疗有效量的抗体或其片段、以及可药用载体。在一个具体实施方案中，术语“可药用”意指由联邦或州政府的监管机构批准或者在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物并且更特别地用于人。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、赋形剂或载剂。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物是静脉内施用时，水是特定的载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。另一些合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
如果需要的话，组合物还可包含少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。经口制剂可包含标准载体，例如药用级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药剂的一些实例在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中描述。这样的组合物将包含预防或治疗有效量的抗体或其片段(优选以纯化的形式)以及合适量的载体，以便向患者提供用于适当施用的形式。制剂应适合于施用方式，其可以是经口、静脉内、动脉内、颊内、鼻内、雾化、支气管吸入或通过机械通气递送。
如本文所述，本公开内容的抗体可以配制成用于肠胃外施用，例如，配制成用于通过皮内、静脉内、肌内、皮下、瘤内或甚至腹膜内途径注射。或者，抗体可通过表面途径直接施用于黏膜，例如，通过滴鼻剂、吸入或通过雾化器。可药用盐包括酸盐以及与以下形成的盐：无机酸，例如如盐酸或磷酸，或有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。与游离羧基形成的盐也可来源于无机碱，例如如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
抗体的被动转移，称为人工获得的被动免疫，通常将涉及静脉内注射剂的使用。抗体的形式可以是人或动物血液血浆或血清，作为用于静脉内使用的合并人免疫球蛋白(immunoglobulin for intravenous，IVIG)或肌内使用的合并人免疫球蛋白(immunoglobulin for intramuscular，IG)，作为来自经免疫接种或来自从疾病中恢复的供体的高效价人IVIG或IG，以及作为单克隆抗体(MAb)。这样的免疫通常仅持续短的时间段，并且还存在对于超敏反应和血清病，尤其是来自于非人来源的γ球蛋白的超敏反应和血清病的潜在风险。然而，被动免疫提供即时保护。抗体将被配制在适合于注射(即，无菌且可注射)的载体中。
通常来说，本公开内容的组合物的成分分开提供或以单位剂型混合在一起提供，例如作为在指示活性剂的量的气密密封容器(例如安瓿或药袋(sachette))中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物提供。当组合物通过输注施用时，其可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶进行分配。当组合物通过注射施用时，可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水以便可在施用之前将成分混合。
本公开内容的组合物可被配制为中性或盐形式。可药用盐包括与阴离子形成的那些，所述阴离子例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些；以及与阳离子形成的那些，所述阳离子例如来源于钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
B.癌细胞治疗
在另一个方面中，本公开内容提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞。在一些实施方案中，CAR包含本文中提供的抗原结合片段。在一个实施方案中，CAR蛋白从N端到C端包含：前导肽、抗CHI3L1重链可变结构域、接头结构域、抗CHI3L1轻链可变结构域、人IgG1-CH2-CH3结构域、间隔区、CD28跨膜结构域、4-1BB胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域。
还提供了用于免疫治疗的方法，其包括施用有效量的本公开内容的免疫细胞。在一个实施方案中，通过转移引发免疫应答的免疫细胞群来治疗医学疾病或病症。在本公开内容的某些实施方案中，通过转移引发免疫应答的免疫细胞群来治疗癌症或感染。本文中提供了用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括向个体施用有效量的抗原特异性细胞治疗。
免疫细胞可以是T细胞(例如，调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞或巨噬细胞。本文中还提供了产生和改造免疫细胞的方法，以及使用和施用细胞用于过继细胞治疗的方法，在这种情况下，细胞可以是自体的或同种异体的。因此，免疫细胞可被用作免疫治疗，例如以靶向癌细胞。
免疫细胞可以从对象，特别是人对象中分离出来。免疫细胞可以从健康的人对象、健康的志愿者或健康的供体中获得。免疫细胞可获自目的对象，例如怀疑患有特定疾病或病症的对象、怀疑具有特定疾病或病症倾向的对象，或正在接受针对特定疾病或病症的治疗的对象。免疫细胞可以从其在对象中所存在的任何位置中收集，所述位置包括但不限于血液、脐带血、脾、胸腺、淋巴结和骨髓。分离出来的免疫细胞可以直接使用，或者其可以储存一段时间，例如通过冷冻。
免疫细胞可从其所存在的任何组织中富集/纯化，所述组织包括但不限于血液(包括通过血库或脐带血库收集的血液)、脾、骨髓、外科手术期间去除和/或暴露的组织，以及通过活检操作获得的组织。从中富集、分离和/或纯化免疫细胞的组织/器官可以从活的对象和非活的对象二者中分离，其中非活的对象是器官供体。在一些具体实施方案中，免疫细胞分离自血液，例如外周血或脐带血。在一些方面中，从脐带血中分离的免疫细胞具有增强的免疫调节能力，例如通过CD4-或CD8-阳性T细胞抑制测量的。在一些具体方面中，免疫细胞是从合并的血液，特别是合并的脐带血中分离的，以增强免疫调节能力。合并的血液可以来自2个或更多个来源，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更多个来源(例如，供体对象)。
免疫细胞群可以从需要治疗的对象或患有与免疫细胞活性降低相关的疾病的对象中获得。因此，该细胞对需要治疗的对象来说是自体的。或者，免疫细胞群可以从供体，优选组织相容性匹配的供体中获得。免疫细胞群可以从所述对象或供体的外周血、脐带血、骨髓、脾或免疫细胞存在于其中的任何其他器官/组织收获。免疫细胞可以从对象和/或供体的合并物中分离，例如从合并的脐带血中分离。
当从不同于对象的供体中获得免疫细胞群时，供体优选是同种异体的，条件是获得的细胞是对象相容的，因为它们可以被引入到对象中。同种异体的供体细胞可以是或可以不是人白细胞抗原(human-leukocyte-antigen，HLA)相容的。为了使同种异体细胞与对象相容，可对其进行处理以降低免疫原性。
免疫细胞可以经遗传改造以表达抗原受体，例如经改造的TCR和/或嵌合抗原受体(CAR)。例如，宿主细胞(例如，自体或同种异体T细胞)被修饰以表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。在一些具体实施方案中，NK细胞被改造以表达TCR。NK细胞还可被改造以表达CAR。可以将多种CAR和/或TCR(例如针对不同的抗原的CAR和/或TCR)添加至单一细胞类型(例如T细胞或NK细胞)。
合适的修饰方法是本领域中已知的。参见，例如，Sambrook et al.,同上；和Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene PublishingAssociates and John Wiley&Sons,NY,1994。例如，可以使用Heemskerk et al.(2008)和Johnson et al.(2009)中描述的转导技术转导细胞以表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，细胞包含通过遗传改造引入的编码一种或更多种抗原受体的一种或更多种核酸，以及这样的核酸的经遗传改造的产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从该细胞获得的样品中，例如从另一生物体或细胞获得的核酸，其例如通常不存在于被改造的细胞和/或这样的细胞所来源于的生物体。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，例如未存在于自然界的核酸(例如，嵌合的)。
C.癌症组合治疗
还可期望提供将本公开内容的抗体与另外的抗癌治疗联合使用的组合治疗。这些治疗将以有效实现一种或更多种疾病参数的降低的组合量提供。该过程可涉及使细胞/对象同时与两种药剂/治疗接触，例如使用包含两种药剂的单一组合物或药理学制剂，或使细胞/对象同时与两种不同的组合物或制剂接触，其中一种组合物包含抗体，并且另一种包含其他药剂。
或者，抗体可以以数分钟至数周的间隔在其他治疗之前或之后。通常应保证各递送时间之间不会中断一段显著的时间，使得治疗将仍能够对细胞/对象产生有利组合作用。在这样的情况下，预期可以在彼此约12至24小时内、彼此约6至12小时内或仅约12小时的延迟时间内使细胞与两种形式接触。在一些情况下，可期望显著延长治疗时间段；然而，其中在各个施用之间间隔数10天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
还可以想象，期望多于一次施用抗CH3L1抗体或其他治疗。可使用多种组合，其中抗体为“A”并且其他治疗为“B”，如下所示：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/BA/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
考虑其他组合。为了使用本发明的方法和组合物杀伤细胞、抑制细胞生长、抑制转移、抑制血管生成或以其他方式逆转或降低肿瘤细胞的恶性表型，可以使靶细胞或部位与抗体和至少一种其他治疗接触。这些治疗将以有效杀伤或抑制癌细胞增殖的组合量提供。该方法可涉及使细胞/部位/对象同时与药剂/治疗接触。
预期用于与本公开内容的抗体组合治疗的特定药剂包括化学治疗和造血干细胞移植。化学治疗可包括阿糖胞苷(ara-C)和蒽环类药物(最常见的是柔红霉素)，单独的高剂量阿糖胞苷，全反式视黄酸(ATRA)以及诱导化学治疗，通常是蒽环类药物、组胺二盐酸盐(Ceplene)和白介素2(Proleukin)(在合并治疗完成之后)，用于患有复发性AML、非高剂量化学治疗候选人的超过60岁患者的吉妥单抗奥唑米星(Mylotarg)，氯法拉滨，以及靶向治疗，例如激酶抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨和MDR1(多药耐药蛋白质，multidrug-resistance protein)的抑制剂，或三氧化二砷或复发性急性早幼粒细胞白血病(APL)。
在某些实施方案中，用于组合治疗的药剂是选自以下的一种或更多种药物：拓扑异构酶抑制剂；蒽环类拓扑异构酶抑制剂；蒽环类；柔红霉素；核苷代谢抑制剂；阿糖胞苷；低甲基化剂；低剂量阿糖胞苷(LDAC)；柔红霉素与阿糖胞苷的组合；注射用柔红霉素阿糖胞苷脂质体，
Figure BDA0003998997950000491
阿扎胞苷，
Figure BDA0003998997950000492
地西他滨；全反式视黄酸(ATRA)；砷；三氧化二砷；组胺二盐酸盐，
Figure BDA0003998997950000493
白介素-2；阿地白介素，
Figure BDA0003998997950000494
吉妥单抗奥唑米星，
Figure BDA0003998997950000495
FLT-3抑制剂；米哚妥林，
Figure BDA0003998997950000496
氯法拉滨；法呢基转移酶抑制剂；地西他滨；IDH1抑制剂；艾伏尼布，
Figure BDA0003998997950000497
IDH2抑制剂；恩西地平，
Figure BDA0003998997950000498
smoothened(SMO)抑制剂；格拉吉布；精氨酸酶抑制剂；IDO抑制剂；艾卡哚司他；BCL-2抑制剂；维奈托克，
Figure BDA0003998997950000501
铂复合物衍生物；奥沙利铂；激酶抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；PI3激酶抑制剂；BTK抑制剂；依鲁替尼，
Figure BDA0003998997950000502
阿卡替尼，
Figure BDA0003998997950000503
泽布替尼；PD-1抗体；PD-L1抗体；CTLA-4抗体；LAG3抗体；ICOS抗体；TIGIT抗体；TIM3抗体；CD40抗体；4-1BB抗体；CD47抗体；SIRP1α抗体或融合蛋白；E-选择素的拮抗剂；与肿瘤抗原结合的抗体；与T细胞表面标志物结合的抗体；与骨髓细胞或NK细胞表面标志物结合的抗体；烷基化剂；亚硝基脲剂；抗代谢物；抗肿瘤抗生素；来源于植物的生物碱；激素治疗药物；激素拮抗剂；芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。
D.肝毒性组合治疗
还可期望提供将本公开内容的抗体与另外的肝毒性治疗联合使用的组合治疗。这些治疗将以有效实现一种或更多种疾病参数的降低的组合量提供。该过程可涉及使细胞/对象同时与两种药剂/治疗接触，例如使用包含两种药剂的单一组合物或药理学制剂，或通过使细胞/对象同时与两种不同的组合物或制剂接触，其中一种组合物包含抗体，并且另一种包含其他药剂。
或者，抗体可以以数分钟至数周的间隔在其他治疗之前或之后。通常应保证各递送时间之间不会中断一段显著的时间，使得治疗将仍能够对细胞/对象产生有利组合作用。在这样的情况下，预期可以在彼此约12至24小时内、彼此约6至12小时内或仅约12小时的延迟时间内使细胞与两种形式接触。在一些情况下，可期望显著延长治疗时间段；然而，其中在各个施用之间间隔数10天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
还可以想象，期望多于一次施用抗CH3L1抗体或其他治疗。可使用多种组合，其中抗体为“A”并且其他治疗为“B”，如下所示：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/BA/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
考虑其他组合。该方法可涉及使细胞/部位/对象同时或不同时与药剂/治疗接触。其他治疗可以是支持性护理，包括止痛药物和液体，以及在一些情况下的抗毒素。
VI.抗体缀合物
本公开内容的抗体可与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物。为了提高抗体分子作为诊断剂或治疗剂的效力，常规地与至少一种期望的分子或部分连接或共价结合或复合。这样的分子或部分可以是但不限于至少一种效应分子或报道分子。效应分子包括具有期望活性，例如细胞毒活性的分子。已与抗体连接的效应分子的一些非限制性实例包括毒素、抗肿瘤剂、治疗性酶、放射性核素、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报道分子被定义为可使用测定检测的任何部分。已经与抗体缀合的报道分子的一些非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、光亲和分子、着色颗粒或配体，例如生物素。
已经出现抗体-药物缀合物作为癌症治疗剂开发的突破性方法。抗体-药物缀合物(antibody–drug conjugate，ADC)包含与杀伤细胞的药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。该方法将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物组合，产生将载荷(药物)递送至具有丰富抗原水平的肿瘤细胞的“武装”MAb。药物的靶向递送还使其在正常组织中的暴露最小化，导致毒性降低和治疗指数提高。FDA对两种ADC药物的批准(2011年
Figure BDA0003998997950000511
(维汀-布仑妥昔单抗(brentuximab vedotin))和2013年
Figure BDA0003998997950000512
(曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emtansine)或T-DM1))验证了该方法。目前存在超过30种ADC药物候选物处于癌症治疗临床试验的多个阶段中(Leal et al.,2014)。随着抗体工程和接头-有效载荷优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合于该方法和靶向MAb产生的新靶标的鉴定和验证。ADC靶标的两个标准是在肿瘤细胞中上调的/高水平的表达和稳健的内化。
还优选使用抗体缀合物作为诊断剂。抗体诊断剂通常属于两类：用于体外诊断例如用于多种免疫测定的那些，以及用于通常称为“抗体指导的成像”的体内诊断方案的那些。许多合适的显像剂是本领域中已知的，其与抗体连接的方法也如此(参见，例如，美国专利5,021,236、4,938,948和4,472,509)。所使用的成像部分可以是顺磁性离子、放射性同位素、荧光染料、可NMR检测物质和X-射线显像剂。
在顺磁性离子的情况下，可通过以下示例性离子来提及：例如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，其中特别优选钆。在另一些情况(例如X-射线成像)下可用的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)和特别是铋(III)。
在用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，可提及砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m和/或钇90。在某些实施方案中通常优选使用125I，并且也通常优选锝99m和/或铟111，因为其能量低且适用于长距离检测。本公开内容的放射性标记的单克隆抗体可根据本领域公知的方法产生。例如，可通过与碘化钠和/或碘化钾和化学氧化剂(例如次氯酸钠)或酶促氧化剂(例如乳过氧化物酶)接触来使单克隆抗体碘化。根据本公开内容的单克隆抗体可通过配体交换过程用锝99m标记，例如，通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上，并将抗体施加于该柱。或者，可使用直接标记技术，例如通过孵育高锝酸盐、还原剂(例如SNCl2)、缓冲溶液(例如邻苯二甲酸钠钾溶液)和抗体进行。通常用于使作为金属离子存在的放射性同位素与抗体结合的中间官能团是二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)或乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetracetic acid，EDTA)。
考虑用作缀合物的荧光标记包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Pacific Blue、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红(Texas Red)。
在本公开内容中考虑的另一种类型的抗体缀合物是主要意图用于体外使用的那些，其中抗体与第二结合配体和/或在与显色底物接触后将产生着色产物的酶(酶标签)连接。合适的酶的一些实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的第二结合配体是生物素以及抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白化合物。这样的标记的使用对于本领域技术人员是公知的，并且在例如美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中描述。
分子与抗体的位点特异性连接的另一种已知方法包括使抗体与基于半抗原的亲和标记反应。实质上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的氨基酸反应，从而破坏该位点并阻断特异性抗原反应。然而，这可能是不利的，因为其导致通过抗体缀合物的抗原结合丧失。
包含叠氮基的分子也可用于经由通过低强度紫外光产生的反应性氮宾中间体来与蛋白质形成共价键(Potter和Haley,1983)。特别地，已经使用嘌呤核苷酸的2-叠氮类似物和8-叠氮类似物作为定点光探针以鉴定粗制细胞提取物中的核苷酸结合蛋白(Owens&Haley,1987；Atherton et al.,1985)。2-叠氮核苷酸和8-叠氮核苷酸还已被用于对经纯化蛋白质的核苷酸结合结构域进行图谱绘制(Khatoon et al.,1989；King et al.,1989；Dholakia et al.,1989)并且可用作抗体结合剂。
用于使抗体与其缀合部分连接或缀合的数种方法是本领域中已知的。一些连接方法涉及使用金属螯合物复合物，其使用例如与抗体连接的有机螯合剂，例如二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)；亚乙基三胺四乙酸；N-氯-对-甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(tetrachloro-3α-6α-diphenylglycouril-3)(美国专利4,472,509和4,938,948)。单克隆抗体还可在存在偶联剂例如戊二醛或高碘酸盐的情况下与酶反应。与荧光素标记的缀合物在存在这些偶联剂的情况下或通过与异硫氰酸酯反应来制备。在美国专利4,938,948中，使用单克隆抗体实现了乳腺肿瘤的成像并且使用接头例如甲基-对羟基苯甲亚氨酸酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯使可检测成像部分与抗体结合。
在另一些实施方案中，考虑了通过使用不改变抗体结合位点的反应条件选择性地将巯基引入免疫球蛋白的Fc区中来使免疫球蛋白衍生化。据公开，根据这种方法产生的抗体缀合物表现出改善的寿命、特异性和灵敏度(美国专利5,196,066，其通过引用并入本文)。在文献中也已经公开了效应分子或报道分子的位点特异性连接，其中报道分子或效应分子与Fc区中的糖残基缀合(O’Shannessy et al.,1987)。已经报道该方法产生目前处于临床评价之中的在诊断和治疗方面有希望的抗体。
VII.免疫检测方法
在另一些实施方案中，本公开内容涉及用于结合、纯化、去除、定量和以其他方式一般地检测CHI3L1相关癌症的免疫检测方法。虽然这样的方法可以在传统意义上应用，但另一种用途将是用于疫苗储液的质量控制和监测，其中根据本公开内容的抗体可用于评估抗原的量或完整性(即长期稳定性)。或者，该方法可用于筛选多种抗体的适当/期望反应性谱。
一些免疫检测方法包括酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定和Western印迹等。特别地，还提供了用于检测和定量CHI3L1的竞争性测定。科学文献例如，如Doolittle and Ben-Zeev(1999)、Gulbis and Galand(1993)、De Jager et al.(1993)和Nakamura et al.(1987)中已经描述了多种有用的免疫检测方法的步骤，。通常来说，免疫结合方法包括获得怀疑包含CHI3L1相关癌症的样品并根据本公开内容使样品与第一抗体接触，视情况而定，这在有效允许免疫复合物形成的条件下进行。
这些方法包括用于从样品中检测或纯化CHI3L1或CHI3L1相关癌细胞的方法。抗体将优选地连接至固体支持物，例如柱基质形式的固体支持物，并且将怀疑包含CHI3L1相关癌细胞的样品应用于固定化抗体。不需要的成分将从柱上洗掉，使CHI3L1表达细胞免疫复合至固定化抗体，其然后通过从柱上去除生物体或抗原来收集。
免疫结合方法还包括用于在样品中检测和定量CHI3L1相关癌细胞或相关组分的量以及检测和定量在结合过程期间形成的任何免疫复合物的方法。在此，将获得怀疑包含CHI3L1相关癌细胞的样品，并使该样品与结合CHI3L1或其组分的抗体接触，随后检测并定量在特定条件下形成的免疫复合物的量。就抗原检测而言，所分析的生物样品可以是任何怀疑含有CHI3L1相关癌症的样品，例如组织切片或试样，均质化组织提取物，生物流体包括血液和血清，或者分泌物例如粪便或尿。
使所选生物样品与抗体在有效条件下接触并持续足以允许形成免疫复合物(初级免疫复合物)的时间通常是简单地将抗体组合物添加至样品并将混合物孵育足够长的时间以使抗体与CHI3L1形成免疫复合物(即与之结合)的问题。在该时间之后，通常对样品-抗体组合物，例如组织切片、ELISA板、斑点印迹或Western印迹进行洗涤以去除任何非特异性结合的抗体种类，从而允许只有特异性结合在初级免疫复合物中的那些抗体被检测到。
通常来说，免疫复合物形成的检测是本领域中公知的，并且可通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于标记或标志物(例如那些放射性标签、荧光标签、生物标签和酶标签中的任一种)的检测。有关使用这样的标记的专利包括美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。当然，如本领域中已知的，通过使用第二结合配体例如第二抗体和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合布置，可发现另外的优点。
用于检测的抗体可本身与可检测标记连接，其中然后将简单地检测该标记，从而允许确定组合物中初级免疫复合物的量。或者，可通过对第一抗体具有结合亲和力的第二结合配体来检测结合在初级免疫复合物中的该抗体。在这些情况下，第二结合配体可与可检测标记连接。第二结合配体本身通常是抗体，其因此可称为“第二”抗体。使初级免疫复合物与经标记的第二结合配体或抗体在有效条件下接触并持续足以允许形成次级免疫复合物的时间。然后，通常洗涤次级免疫复合物以去除任何非特异性结合的经标记的第二抗体或配体，并且随后检测次级免疫复合物中的剩余标记。
另一些方法包括通过两步法检测初级免疫复合物。如上所述，将对抗体具有结合亲和力的第二结合配体(例如抗体)用于形成次级免疫复合物。在洗涤之后，再次使次级免疫复合物与对第二抗体具有结合亲和力的第三结合配体或抗体在有效条件下接触并持续足以允许形成免疫复合物(三级免疫复合物)的时间。第三配体或抗体与可检测标记连接，从而允许检测由此形成的三级免疫复合物。如果期望的话，该系统可提供信号放大。
一种免疫检测方法使用两种不同的抗体。将第一生物素化抗体用于检测靶抗原，并且然后将第二抗体用于检测与复合生物素连接的生物素。在该方法中，首先将待测试样品在包含第一步抗体的溶液中孵育。如果存在靶抗原，则一些抗体与抗原结合形成生物素化抗体/抗原复合物。然后通过在链霉抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白)、生物素化DNA和/或互补生物素化DNA的连续溶液中孵育来扩大抗体/抗原复合物，其中每个步骤向抗体/抗原复合物添加另外的生物素位点。重复扩大步骤直至达到合适的扩大水平，此时将样品在包含针对生物素的第二步抗体的溶液中孵育。该第二步抗体是经标记的，如例如经酶标记的，所述酶可用于使用色原底物通过组织酶学来检测抗体/抗原复合物的存在。经过适当扩大，可产生宏观可见的缀合物。
另一种已知的免疫检测方法利用免疫PCR(聚合酶链反应)方法。在与生物素化DNA一起孵育之前，PCR方法类似于Cantor方法，然而，作为使用多轮链霉抗生物素蛋白和生物素化DNA孵育的替代，将DNA/生物素/链霉抗生物素蛋白/抗体复合物用低pH或高盐缓冲液洗掉，这释放抗体。然后将所得洗涤溶液用于用合适的引物与合适的对照进行PCR反应。至少在理论上，PCR的巨大扩增能力和特异性可用于检测单抗原分子。
A.ELISA
免疫测定在其最简单和直接的意义上是结合测定。某些优选的免疫测定是本领域中已知的多种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也特别有用。然而，将容易理解的是，检测不限于此类技术，并且也可使用western印迹、斑点印迹、FACS分析等。
在一种示例性ELISA中，将本公开内容的抗体固定在表现出蛋白质亲和力的所选表面上，例如聚苯乙烯微量滴定板中的孔上。然后，向孔添加怀疑包含CHI3L1相关癌细胞的受试组合物。在结合并洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物之后，可检测结合的抗原。检测可通过添加与可检测标记连接的另一抗CHI3L1抗体来实现。这种类型的ELISA是简单的“夹心ELISA”。检测也可通过添加第二抗CHI3L1抗体，随后添加对该第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来实现，其中该第三抗体与可检测标记连接。
在另一个示例性的ELISA中，将怀疑含有CHI3L1相关癌细胞的样品固定在孔表面上，并随后使其与本公开内容的抗CHI3L1抗体接触。在结合并洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物之后，检测结合的抗CHI3L1抗体。当初始抗CHI3L1抗体与可检测标记连接时，可直接检测免疫复合物。同样，可使用对第一抗CHI3L1抗体具有结合亲和力的第二抗体来检测免疫复合物，其中第二抗体与可检测标记连接。
不论使用何种形式，ELISA都具有某些共同特征，例如包被、孵育和结合、洗涤以去除非特异性结合的物质以及检测结合的免疫复合物。以下对这些进行描述。
在用抗原或抗体包被板中，通常用抗原或抗体的溶液孵育板的孔过夜或持续指定的一段时间。然后对板的孔进行洗涤以去除不完全吸附的物质。然后，将孔的任何剩余可用表面用相对于受试抗血清为抗原性中性的非特异性蛋白质“包被”。这些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或乳粉溶液。包被允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点，并因此降低由抗血清在表面上的非特异性结合引起的背景。
在ELISA中，可能更习惯于使用二级或三级检测方法而不是直接操作。因此，在蛋白质或抗体与孔结合，用非反应性物质包被以降低背景，并洗涤以去除未结合的物质之后，使固定表面与待测试的生物样品在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下接触。然后，免疫复合物的检测需要经标记的第二结合配体或抗体，以及与经标记的第三抗体或第三结合配体联合的第二结合配体或抗体。
“在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下”意指该条件优选包括用溶液(例如BSA、牛丙种球蛋白(bovine gamma globulin，BGG)或磷酸缓冲盐水(PBS)/吐温)来稀释抗原和/或抗体。这些添加的试剂还倾向于有助于降低非特异性背景。
“合适的”条件还意指孵育在足以允许有效结合的温度或时间下进行。孵育步骤通常在优选为约25℃至27℃的温度下进行约1至2至4小时左右，或者可在约4℃左右下过夜进行。
在ELISA中所有孵育步骤之后，洗涤接触的表面以去除未复合的物质。一个优选的洗涤过程包括用溶液例如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液洗涤。在受试样品与最初结合物质之间形成特异性免疫复合物并随后进行洗涤之后，可确定甚至是微量的免疫复合物的出现。
为了提供检测手段，第二或第三抗体具有缔合的标记以允许检测。优选地，这是在与合适的显色底物孵育之后产生显色的酶。因此，例如，期望在有利于发生进一步的免疫复合物形成的时间和条件下使初级和次级免疫复合物与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀合的抗体接触或孵育(例如，在室温下在含有PBS的溶液(例如PBS-吐温)中孵育2小时)。
在与经标记的抗体孵育并随后进行洗涤以去除未结合的物质之后，对标记的量进行定量，例如通过与显色底物(例如尿素或溴甲酚紫或2,2’-联氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)或H2O2(在过氧化物酶作为酶标记的情况下))一起孵育进行。然后通过测量产生的颜色的程度，例如使用可见光谱分光光度计实现定量。
B.Western印迹
Western印迹(或者，蛋白质免疫印迹)是用于在给定的组织匀浆或提取物样品中检测特定蛋白质的分析技术。其使用凝胶电泳通过多肽的长度(变性条件)或通过蛋白质的3-D结构(天然/非变性条件)来分离天然或变性的蛋白质。然后将蛋白质转移到膜(通常是硝酸纤维素或PVDF)上，在膜上使用对靶蛋白具有特异性的抗体对其进行探测(检测)
样品可取自整个组织或来自细胞培养物。在大多数情况下，首先使用搅拌器(用于较大的样品体积)、使用均化器(较小的体积)或通过声处理将实体组织机械破碎。细胞也可通过上述机械方法之一破裂。可使用多种洗涤剂、盐和缓冲液来促进细胞裂解和使蛋白质溶解。通常添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止样品被其自身的酶消化。组织制备通常在低温下进行以避免蛋白质变性。
使用凝胶电泳分离样品的蛋白质。蛋白质的分离可通过等电点(pI)、分子量、电荷或这些因素的组合来进行。分离的本质取决于样品的处理和凝胶的性质。这是确定蛋白质的非常有用的方法。也可使用二维(two-dimensional，2-D)凝胶，其将来自单个样品的蛋白质以两个维度散布。在第一维度中根据等电点(蛋白质具有中性净电荷时的pH)分离蛋白质，而在第二维度中根据其分子量分离蛋白质。
为了使蛋白质易于进行抗体检测，将其从凝胶中移动到由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的膜上。将膜放置在凝胶的顶部，并在其顶部放置一叠滤纸。将整叠放置在缓冲溶液中，该缓冲溶液通过毛细作用移动至纸上，从而使蛋白质随之移动。用于转移蛋白质的另一种方法称为电印迹，并且使用电流将蛋白质从凝胶拉到PVDF或硝酸纤维素膜中。蛋白质在维持其在凝胶中具有的组织的同时从凝胶中移动到膜上。作为该印迹过程的结果，蛋白质被暴露在薄的表面层上用于检测(参见下文)。选择这两种膜是因为其非特异性的蛋白质结合特性(即，同等良好地结合所有蛋白质)。蛋白质结合基于疏水性相互作用以及膜与蛋白质之间的带电相互作用。硝酸纤维素膜比PVDF便宜，但更加易脆而不能良好地经受反复探测。蛋白质从凝胶转移到膜上的均匀性和整体有效性可通过用考马斯亮蓝或丽春红S(Ponceau S)染料对膜进行染色来检查。一旦转移，就使用经标记的第一抗体或未经标记的第一抗体并随后使用经标记蛋白A或与第一抗体的Fc区结合的第二经标记抗体进行间接检测来检测蛋白质。
C.免疫组织化学
本公开内容的抗体还可与新鲜冷冻和/或福尔马林固定石蜡包埋的组织块二者联合使用，所述组织块为了通过免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)进行研究而制备。由这些颗粒状试样制备组织块的方法已成功用于多种预后因子的先前IHC研究中，并且是本领域技术人员公知的(Brown et al.,1990；Abbondanzo et al.,1990；Allred etal.,1990)。
简言之，冷冻切片可通过以下来制备：在室温下在小塑料囊中的磷酸缓冲盐水(PBS)中将50ng冷冻的“粉碎”组织再水合；通过离心使颗粒沉淀；将其重悬在黏性包埋介质(OCT)中；将囊倒置和/或通过离心再次沉淀；在-70℃异戊烷中速冻；切割塑料囊和/或取出冷冻的组织圆柱状物；将组织圆柱状物固定在低温恒温切片机卡盘上；和/或从囊上切下25至50个连续切片。或者，可将整个冷冻的组织样品用于连续切片切割。
可通过类似的方法制备永久切片，其包括在塑料微量离心管中将50mg样品再水合；沉淀；重悬于10％福尔马林中固定4小时；洗涤/沉淀；重悬于温热的2.5％琼脂中；沉淀；在冰水中冷却以使琼脂硬化；从管中取出组织/琼脂块；将块浸入和/或包埋在石蜡中；和/或切割多至50个连续的永久切片。同样，整个组织样品可替换。
D.免疫检测试剂盒
在另一些实施方案中，本公开内容涉及与上述免疫检测方法一起使用的免疫检测试剂盒。由于抗体可用于检测CHI3L1相关癌细胞，因此该抗体可包括在试剂盒中。因此，免疫检测试剂盒在合适的容器装置中包含与CHI3L1结合的第一抗体和任选地免疫检测试剂。
在某些实施方案中，抗体可与固体支持物例如柱基质和/或微量滴定板的孔预先结合。试剂盒的免疫检测试剂可采取多种形式中的任一种，包括与给定抗体缔合或连接的那些可检测标记。也考虑了与第二结合配体缔合或连接的可检测标记。一些示例性的第二配体是对第一抗体具有结合亲和力的那些第二抗体。
用于本发明试剂盒的其他合适的免疫检测试剂包括双组分试剂，其包含对第一抗体具有结合亲和力的第二抗体，以及对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体，所述第三抗体与可检测标记连接。如上所述，许多示例性的标记在本领域中是已知的，并且所有这样的标记均可结合本公开内容使用。
试剂盒还可包含适当等分的CHI3L1组合物，无论是标记的还是未标记的，如可用于制备用于检测测定的标准曲线。试剂盒可包含以完全缀合形式、以中间体形式或作为将由试剂盒使用者进行缀合的独立部分的抗体-标记缀合物。试剂盒的组分可包装在水性介质中或以冻干形式包装。
试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，其中可放置抗体，或者优选将抗体适当地等分。本公开内容的试剂盒通常还包括用于封闭限制式容纳抗体、抗原和任何其他试剂容器以用于商业销售的装置。这样的容器可包含其中保持期望小瓶的注塑或吹塑的塑料容器。
E.流式细胞术和FACS
本公开内容的抗体也可用于流式细胞术或FACS。流式细胞术是用于许多检测测定的基于激光或阻抗的技术，包括细胞计数、细胞分类、生物标志物检测和蛋白质改造。该技术将细胞悬浮在流体流中，并使其通过电子检测装置，该装置允许同时对多达数千个颗粒/秒的物理和化学特征进行多参数分析。流式细胞术常规用于诊断病症，特别是血癌，但是在基础研究、临床实践和临床试验中也有许多其他应用。
荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)是专业型的细胞术。它提供了用于根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物分选到两个或更多个容器(每次一个细胞)中的方法。一般而言，该技术涉及在狭窄、快速流动的液体流的中心夹带细胞悬液。布置流动，使得细胞之间相对于它们的直径存在大的间隔。振动机制使细胞流破碎成单独的液滴。就在流体破裂成液滴之前，流通过荧光测量站，在那里测量每个细胞的荧光。将充电环恰好置于水流破裂成液滴的位置。在紧邻荧光强度测量之前，在环上放置电荷，而相反的电荷则在液滴破裂形成水流时被捕获。然后带电的液滴通过静电偏转系统落下，该系统基于其电荷将液滴转移到容器中。
在某些实施方案中，为了用于流式细胞术或FACS，本公开内容的抗体用荧光团标记，并随后允许其与目的细胞结合，所述细胞在流式细胞仪中进行分析或由FACS设备进行分选。
VIII.实施例
包括以下实施例以说明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术表示本发明人发现的在本发明的实践中运行良好的技术，并因此可认为构成用于其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可在所公开的一些具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相同或类似的结果。
实施例1——材料和方法
动物实验和操作。C57BL/6J和CD44-/-小鼠购自Jackson Laboratory，并将群体供养在德克萨斯大学健康科学中心(University of Texas Health Science Center，UTHealth)的动物核心设施。C57BL/6J(而不是C57BL/6N)被用作WT对照，因为CHI3L1-/-和CD44-/-小鼠二者均处于C57BL/6J背景，通过PCR确定(数据未示出)。CHI3L1-/-小鼠由Dr.Jack AElias(Brown University，Providence，RI，United States)提供。供养所有小鼠。本手稿中描述的动物研究已被批准，并在UTHealth机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的监督下进行。将小鼠(8至12周龄)饥饿过夜(5:00pm至9:00am)并用APAP(Sigma，A7085)进行腹膜内(i.p.)注射，对雄性小鼠以210mg/kg的剂量并且对雌性小鼠以325mg/kg的剂量，因为雌性小鼠对APAP诱导的肝损伤较不易感。55将性别视为生物变量，在文献中报道的绝大多数研究中都选择了雄性小鼠。7,54,56然而，雄性和雌性小鼠对APAP处理的响应相似，尽管它们的剂量响应不同(扩展数据图7)。在一些实验中，接受APAP的小鼠立即进行腹膜内(i.p.)注射PBS(100μl)或重组小鼠CHI3L1(rCHI3L1，100μl中500ng/只小鼠，Sino Biological 50929-M08H)。在图例中指出的时间点处收获肝冷冻切片，并进行免疫荧光染色以分别使用抗F4/80、抗CD31和抗CD41抗体检测KC、LSEC和血小板。在图例中指出的时间点处收集肝石蜡切片和血清，并且进行H&E染色、ALT测量以检查肝损伤。
阻断内源性CD44。在APAP处理或Con A处理之前30分钟，对小鼠i.p注射用rCHI3L1重构的CHI3L1-/-中的抗CD44抗体(BD Pharmingen，553131，50μg/只小鼠)或对照(Ctrl)IgG(BD Pharmingen，559478，50μg/只小鼠)。
阻断内源性平足蛋白。在APAP处理之前16小时，对小鼠i.v.注射用rCHI3L1重构的CHI3L1-/-中的抗平足蛋白抗体(Bioxcell InvivoMab，BE0236，100μg/只小鼠)或Ctrl IgG(Bioxcell InvivoMab，BE0087，100μg/只小鼠)。
血小板耗竭。在APAP处理或Con A处理之前12小时，对WT小鼠i.v.注射Ctrl IgG(BD Pharmingen，553922，2mg/kg)或CD41抗体(BD Pharmingen，553847，2mg/kg)以耗竭血小板。
KC耗竭。在APAP处理或Con A处理之前9小时，对WT小鼠i.v.注射空脂质体(PBS，100μl/只小鼠)或含氯膦酸盐的脂质体(CLDN，100μl/只小鼠)以耗竭KC。氯膦酸盐脂质体如前所述产生54。
抗CHI3L1单克隆抗体的作用的评价。为了检查抗小鼠CHI3L1 mAb的治疗潜力，用APAP处理WT小鼠，并在3小时之后对其注射(i.p.)Ctrl IgG或抗小鼠CHI3L1抗体克隆(C15、C43、C53、C61、C64、C55、C59)。为了检查抗人CHI3L1 mAb的治疗潜力，对用APAP处理的CHI3L1-/-小鼠立即注射(i.p.)PBS(100μl)或重组人CHI3L1(rhCHI3L1，100μl中1μg/只小鼠，Sino Biological 11227-H08H)。在3小时之后，然后将这些小鼠分成两组，用Ctrl IgG或抗人CHI3L1 mAb C7对其进行注射(i.p.)。
丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和细胞因子水平的测量。使用诊断测定试剂盒(Teco Dignostics，Anaheim CA)测量血清ALT水平。血清和肝组织样品中IL-4、IL-13、IL-10、IL-6、IFN-γ和CHI3L1的水平根据制造商的方案通过夹心酶联免疫吸附测定(ELISA，R&D)来确定。
肝细胞的制备和体外细胞培养。如前所述57对肝非实质细胞(nonparenchymalcell，NPC)和肝细胞进行分离。简言之，将小鼠麻醉，并将肝组织用EGTA溶液灌注，然后用0.04％胶原酶消化缓冲液灌注。在消化之后，将胆囊去除，并将消化的肝切成小块以进行管消化(tubing digestion)。通过percoll(Sigma)和Optiprep(Stemcell)梯度离心进一步分离活肝细胞和NPC。为了进一步获得纯化的LSEC和KC，分别用藻红蛋白(phycoerythrin，PE)缀合的抗CD146(对于LSEC，Invitrogen，12-1469-42)和抗F4/80(对于KC，Invitrogen，12-4801-82)抗体对LSEC和KC级分进行染色，并使用EasySepTM小鼠PE阳性选择试剂盒(Stemcell technologies)根据制造商的说明对LSEC和KC进行阳性选择。每个亚组将产生约90％的纯度。
KC和经洗涤血小板的共培养。将分离的KC在含有10％胎牛血清的DMEM中培养，并用平足蛋白抗体(Bioxcell InvivoMab，BE0236，2μg/ml)预处理30分钟，并随后与经洗涤血小板共培养30分钟。洗去未结合的血小板，并对KC上的平足蛋白和Clec-2进行染色。
经洗涤血小板的分离。从下腔静脉中用抗凝剂ACD溶液收集小鼠全血。通过另外洗涤Tyrode缓冲液进一步分离血小板。在与PGI2(Sigma，P6188)一起孵育30分钟之后，对分离的经洗涤血小板进行功能测定。
流式细胞术。分离的NPC进一步与2μg rCHI3L1一起孵育2小时。在洗涤之后，将重悬的细胞沉淀首先与1μl抗小鼠FcγRII/III(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA)一起孵育以使非特异性抗体结合最小化，并随后用以下进行染色：抗小鼠CD45-V655(eBioscience，15520837)、F4/80-APC/Cy7(Biolegend，123118)、Ly6C-APC(BDPharmingen，560595)、Ly6G-V450(BD Pharmingen，560603)、CD146-PerCP-Cy5.5(BDPharmingen，562134)、CD44-PE(BD Pharmingen，553134)、抗6×His标签-FITC(abcam，ab1206)。使用FlowJo软件(Tree Star，Ashland，OR，USA)在CytoFLEX LX流式细胞仪(Beckman coulter，IN，USA)上分析细胞。对于流式细胞术分析，对CD45+细胞设门以排除内皮细胞、肝星状细胞和残余肝细胞。在CD45+细胞中，对结合CHI3L1的CD44+细胞反向设门以确定细胞类型。
肝蛋白质的提取、免疫沉淀和质谱。将快速冷冻的肝组织粉碎以在STE缓冲液中提取肝蛋白质。用BCA试剂盒(Thermo Scientific，23225)根据说明来测量蛋白质浓度。
对于库普弗细胞裂解中的免疫沉淀。从KC裂解中提取蛋白质并将其与5μg小鼠rCHI3L1一起孵育，然后用2μg兔IgG(阴性对照，Peprotech，500-p00)或2μg抗his标签抗体(Abnova，MAB12807)进行免疫沉淀。Dynabeads蛋白G(Invitrogen，1003D)用于牵出(pulldown)抗体结合蛋白。在UTHealth的蛋白质组核心设施中对免疫沉淀的蛋白质进行质谱分析。
对于肝匀浆的免疫沉淀。将从用APAP处理2小时的CD44-/-和WT小鼠中提取的10mg肝蛋白质与5μg rCHI3L1一起孵育，然后用2μg抗CD44抗体(BD Pharmingen，553131)进行免疫沉淀。Dynabeads蛋白G(Invitrogen，1003D)用于牵出抗体结合蛋白。对输入蛋白和免疫沉淀蛋白进行western印迹分析。
对于体外免疫沉淀测定。将2μg rhCH3L1(Sino Biological，His标签，11227-H08H)或2μg人Ctrl蛋白与2μg人CD44(Sino Biological，Fc标签，12211-H02H)一起孵育，并用2μg抗his标签抗体(Abnova，MAB12807)进行免疫沉淀，然后通过Dynabeads蛋白G(Invitrogen，1003D)牵出。对输入蛋白和免疫沉淀蛋白进行western印迹分析。
Western印迹。用上样缓冲液制备样品，并将样品煮沸以加载到SDS-PAGE凝胶上。硝酸纤维素膜(Bio-Rad)用于转移蛋白质。用于检测特定蛋白质的第一抗体包括抗CHI3L1(Proteintech，12036-1-AP，1:1000)、抗CD44(abcam，ab25340，1:500)、抗β-肌动蛋白(CellSignaling，4970，1:1000)、抗his标签(Abnova，MAB12807，1:1000)、抗Cyp2e1(LifeSpanBioSciences，LS-C6332，1:500)、抗APAP加合物54(由Dr.Lance R.Pohl，NIH提供，1:500)。第二抗体包括山羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch，111-035-144，1:1000)、山羊抗大鼠(Jackson ImmunoResearch，112-035-003，1:1000)。
生物层干涉术。CD44-Fc与His-CHI3L1之间的结合亲和力通过使用Octet system8-channel Red96(Menlo Park)来测量。蛋白A生物传感器和动力学缓冲液购自Pall LifeSciences(Menlo Park)。将CD44-Fc蛋白固定在蛋白A生物传感器上，并与溶液中不同浓度(1000nM至1.4nM)的重组His-CHI3L1一起孵育。使用ForteBio数据分析软件7.0的1:1拟合模型来确定结合动力学常数，并使用koff/kon比率计算KD(使用最高的4个浓度来计算KD。)。
免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)染色。使用以下抗体对石蜡切片进行H&E和IHC染色：抗人CD41(Proteintech，24552-2-AP，1:200)、抗人CD68(Thermo Fisher，MA5-13324，1:100)、抗人CHI3L1(Proteintech，12036-1-AP，1:100)、抗小鼠F4/80(Bio Rad，MCA497R，1:200)。使用以下抗体对冷冻切片进行IF染色：抗小鼠CD41(BD Bioscience，Clone MWReg 30)、抗CD31(Biolegend，102516，1:100)、小鼠F4/80(Biolegend，123122，1:100)、抗CD44(abcam，clone KM81，ab112178，1:200)、抗CHI3L1(Proteintech，12036-1-AP，1:100)、抗平足蛋白(Novus，biological，NB600-1015，1:100)、抗Clec-2(Biorbyt，orb312182，1:100)。Alexa 488缀合的驴抗大鼠免疫球蛋白(Invitrogen，A-21208，1:1000)被用作CD41、CD44检测的第二抗体。Alexa 488缀合的山羊抗兔免疫球蛋白(Invitrogen，A-11034，1:1000)被用作Clec-2检测的第二抗体。使用Alexa 594缀合的山羊抗兔免疫球蛋白(Invitrogen，A-11012，1:1000)被用作CHI3L1检测的第二抗体。Alexa 594缀合的山羊抗仓鼠免疫球蛋白(Invitrogen，A-21113，1:1000)被用作平足蛋白检测的第二抗体。用Hoechst(Invitrogen，H3570，1:10000)检测核。
定量实时逆转录酶聚合酶链反应(Quantitative Real-Time ReverseTranscriptase Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从1×106个细胞中分离总RNA。在去除基因组DNA之后，使用Moloney鼠白血病病毒RT(Invitrogen，Carlsbad，CA)和寡聚物(dT)引物(Invitrogen)将RNA逆转录成cDNA。使用SYBR green master mix(applied biosystem)在实时PCR 7500SDS系统和软件上根据制造商的说明(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)一式三份进行定量PCR。RNA含量基于18S核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)(18S)的扩增进行归一化。变化倍数＝实验样品的归一化数据/对照的归一化数据。表1中列出了用于PCR的特异性引物对。
表1——实时PCR引物
Figure BDA0003998997950000651
CHI3L1 mAb的产生。通过对兔进行免疫接种并从单一B细胞中分离抗体来产生针对CHI3L1的单克隆抗体(mAb)。人CHI3L1蛋白被用于抗体产生，并在HEK293细胞中表达。该蛋白质具有6×HIS-标签和avi-标签，并且使用Ni-NTA树脂将重组表达的蛋白质纯化至>95％的纯度。使用标准免疫接种操作，用重组产生的CHI3L1对兔(NZW，Charles River)进行免疫接种，在初次引发免疫之后进行3次加强注射。抗CHI3L1血清的滴度通过在ELISA中对血清进行一系列稀释以结合包被在96孔板(max-sorb plates，Nunc)上的CHI3L1蛋白来确定。当血清滴度达到>106时，从经免疫接种的兔中收集外周血样品，以用于从新鲜制备的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中分离B细胞。使用IACCUSPINTM
Figure BDA0003998997950000652
试剂盒(Sigma)制备PBMC，并使用MiltenyiStreptavidin MicroBeads分离系统富集抗原特异性记忆B细胞。将单一B细胞接种到96孔细胞培养板中，并在具有5％CO2和95％湿度的细胞培养箱中，在37℃下在含有10％FBS的培养基中，用饲养细胞和细胞因子混合物培养7至10天。对培养上清液中的抗体的CHI3L1结合进行测定。裂解来自阳性孔的细胞，分离总RNA，并使用上标逆转录酶II(Invitrogen)根据制造商的建议来合成cDNA。使用一组为抗体序列扩增设计的引物，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增来自重链和轻链二者的抗体可变区的DNA序列。将抗体可变片段克隆到表达载体中，以用于产生每种抗体。图24至29中列出了DNA和氨基酸序列二者的可变序列。使用IMGT程序(万维网IMGT.org)对抗CHI3L1单克隆抗体的CDR进行鉴定，并将其在表A&B中列出。
抗CHI3L1 mAb的表达和纯化。在人胚肾(HEK293)细胞(Invitrogen)中使用哺乳动物表达载体系统，将所选的CHI3L1结合命中(hit)表达为全长IgG。通过快速蛋白质液相色谱(fast protein liquid chromatography，FPLC)使用蛋白A亲和树脂对抗体进行纯化。对纯化的CHI3L1结合抗体的结合亲和力和生物学特性进行表征。
使用ELISA方法的抗CHI3L1单克隆抗体与CHI3L1蛋白的结合亲和力。首先使用从B细胞培养物中收集的上清液通过ELISA筛选CHI3L1与单克隆抗体的结合，并确定与小鼠CHI3L1蛋白的交叉反应性(图7)。
使用生物层干涉术(BLI)(基于传感器的Octet仪器)确定的抗CHI3L1单克隆抗体的结合亲和力。对于抗体亲和力测量，将抗体(30μg/mL)加载到蛋白A生物传感器上4分钟。在动力学缓冲液洗涤至基线后，将经加载的生物传感器暴露于0.1nM至200nM范围的一系列重组CHI3L1蛋白，并使用背景减除来校正来自传感器漂移的任何背景。所有实验都是在1000rpm的摇动下进行的。背景波长漂移是从加载有抗体并随后加载不含抗原的缓冲液的参考生物传感器中进行测量的。对于每种抗体的动力学传感图在图8中示出。使用ForteBio的数据分析软件将数据拟合到1:1结合模型，以得到结合率和解离率。使用koff/kon的比率和表C中CHI3L1 mAb的KD估计值来计算KD。
CHI3L1 mAb的表位分箱(epitope binning)和分组。使用Octet仪器和蛋白A生物传感器，使用抗CHI3L1 mAb之间的成对结合竞争来确定每个mAb的结合表位。表D中总结了表位箱。使用CHI3L1蛋白的片段对CHI3L1抗体进行分组，并且两个组在表E中列出。
用于抑制乳腺癌肿瘤生长的CHI3L1抗体的体内研究。将小鼠乳腺肿瘤细胞(4T1)以100万/只小鼠植入5至7周龄雌性小鼠的乳腺脂肪垫。在肿瘤细胞植入并建立局部肿瘤的4天之后，用CHI3L1抗体C59以10mg/kg每周一次处理小鼠。每周两次监测肿瘤尺寸，直到对照组中的肿瘤尺寸达到接近体重的10％时研究终止。识别小鼠CHI3L1的CHI3L1 mAb C59显示出对肿瘤生长的显著抑制，如在研究结束时的肿瘤生长曲线和肿瘤重量二者所示(图9A至D)。
CHI3L1抗体在体外抑制癌细胞(EMT6)迁移。将癌细胞培养24小时，并使用无菌尖端在黏附细胞上形成划痕空间。以10μg/ml添加Chil3L1 mAb，并将其在细胞培养物中处理48小时，然后成像(图10)。
统计学分析。数据以平均值±SEM表示。使用GraphPad Prism(GraphPad软件)进行统计学分析。使用未配对的Student t检验进行两组之间的比较。使用单因素ANOVA进行多组(n>＝3)间的比较。p值如标记的所示，并且小于0.05视为显著的。通过Image J软件分析血小板计数/mm2、血小板聚集体面积、黏附于KC或LSEC的血小板、KC尺寸。
实施例2——结果与讨论
肝的血小板积聚及其对急性肝损伤的贡献。通常在APAP超剂量的患者中观察到血小板减少。2,4-6本发明人假设血小板可被募集至肝。他们对来自患有APAP诱导的肝损伤(AILI)的患者的肝活检物进行了免疫组织化学(IHC)染色，并检测到血小板数量与正常肝活检物相比显著提高(图1A)。类似地，在用APAP处理的小鼠中观察到肝中血小板的大量积聚(图1B)。奇怪的是，血小板在中央静脉周围的区域积聚，在这里损伤继而发生。据报道，在APAP处理之前血小板的耗竭可以预防小鼠的肝损伤。7这些数据表明，即使在APAP处理之后，血小板的耗竭仍然可以减弱AILI(图1C至E)。这些数据也表明血小板对AILI的重要贡献。重要的问题是血小板是如何在肝中积聚的？
库普弗细胞(KC)促进肝血小板积聚。最近的两项研究表明，在细菌感染和非酒精性脂肪性肝病期间，库普弗细胞介导血小板募集到肝中。12,13为了检查KC在AILI中是否具有类似的作用，本发明人使用抗CD68和抗CD41抗体对来自患有AILI的患者的肝活检物进行染色。数据显示出血小板恰好位于巨噬细胞上或在巨噬细胞附近(图2A)。在经APAP处理的小鼠的肝中，对KC(抗F4/80抗体)和血小板(抗CD41抗体)的IHC染色也显示出血小板附着于KC(图2B)。染色的量化确定了黏附于KC的血小板数量比黏附于LSEC的更多(图2C)。这些观察导致了这样的假设，即KC可能在血小板在损伤期间募集到肝中发挥着重要作用。为了测试这一假设，本发明人在APAP处理之前9小时使用包封在脂质体中的氯膦酸盐(CLDN)耗竭KC，并在APAP攻击之后6小时测量肝中的KC和血小板。他们确定了KC几乎完全耗竭(扩展数据图1)。与用空脂质体处理的对照小鼠相比，在经CLDN处理的小鼠中消除了肝血小板积聚(图2D)，并显著降低了肝损伤(图2E至F)。这些数据表明KC在血小板募集到肝中发挥着关键作用，从而有助于AILI的早期阶段。
为了在另一个急性肝损伤模型中证实上述发现，本发明人在用伴刀豆球蛋白A(Con A)处理的小鼠中进行了类似的实验。Con A诱导的肝损伤(CILI)模拟免疫介导的急性肝炎。30他们观察到，与经PBS处理的对照小鼠相比，在用Con A处理6小时的小鼠中肝内血小板的数量显著提高(扩展数据图2A)。由抗CD41抗体导致的血小板耗竭显著减弱了CILI(扩展数据图2B至D)。F4/80和CD41的IHC共染色显示出血小板黏附于KC(扩展数据图2E)。此外，通过CLDN的KC耗竭消除了Con A处理之后肝中的血小板积聚，并显著降低了CILI(扩展数据图2F至H)。这些数据揭示，KC介导的肝血小板积聚和血小板的病理作用可能是急性肝损伤期间的普遍现象。
作为KC的潜在活化剂的CHI3L1及其受体的鉴定。下一个自然的问题是KC是如何被调节促进血小板募集的。APAP不可能直接调节KC，因为APAP毒性是由活性代谢物N-乙酰基对醌亚胺(NAPQI)引起的。本发明人假设在肝损伤时KC由快速释放的可溶性因子来调节。为了鉴定该因子，本发明人利用了两种无偏的方法。首先，他们比较了来自经APAP和经PBS处理的小鼠的肝组织的全基因表达谱。其次，他们测量了一组已知调节巨噬细胞活化的可溶性因子的蛋白质表达水平。18,31两组数据均显示出在APAP攻击之后Chi3l显著提高(图2H)。为了研究CHI3L1在激活KC以促进血小板募集中的参与情况，本发明人首先检查了CHI3L1对肝血小板积聚的作用。与WT小鼠相比，CHI3L1-/-小鼠在APAP处理之后在肝中的血小板数量显著降低。对CHI3L1-/-小鼠进行小鼠重组CHI3L1蛋白(rCHI3L1)的施用恢复了肝中的血小板积聚(图2I)。这些数据表明，CHI3L1在促进肝中血小板积聚方面至关重要。
CHI3L1与KC上的CD44相互作用。为了进一步了解CHI3L1是如何介导KC募集血小板的功能的，本发明人着手鉴定了其在KC上的受体。他们从用APAP处理3小时的WT小鼠中分离KC并将细胞与His标记的rCHI3L1一起孵育。使用抗His抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。对“牵出”级分进行LC/MS分析。鉴定的蛋白质的部分列表(包括CHI3L1本身)在(扩展数据表1)中示出。因为CD44是细胞膜蛋白，因此本发明人决定研究其是CHI3L1的受体。他们使用从在APAP处理之后的WT和CD44-/-小鼠中获得的肝匀浆进行免疫沉淀实验。如在图3A所示，抗CD44抗体可以从WT但不能从CD44-/-的肝匀浆中“牵出”CHI3L1。使用重组人CHI3L1(rhCHI3L1)的干涉术测量揭示了CHI3L1和CD44之间的高结合亲和力(Kd＝251nM；图3B)。此外，本发明人将rhCH3l1与人CD44一起孵育，并随后用抗CD44抗体进行免疫沉淀。数据确定了CHI3L1和CD44之间的直接结合(图3C)。与许多细胞类型表达CD44的概念一致，他们检测到CD44在除B细胞和DC之外的多种肝非实质细胞(NPC)上表达(在扩展数据表2中总结)。然而，当他们将肝NPC与His-标记的rCHI3L1一起孵育时，本发明人观察到唯一能与CHI3L1结合的表达CD44的细胞是KC(图3D)。总之，这些结果表明CD44是CHI3L1在KC上的受体。
CHI3L1通过CD44促进血小板黏附于KC。为了研究CHI3L1和CD44在肝血小板募集和肝损伤中的参与情况，本发明人用APAP处理了WT、CHI3L1-/-和CD44-/-小鼠。与在WT小鼠的肝中积聚大量血小板相反，可在CHI3L1-/-和CD44-/-小鼠的肝中发现非常少的血小板(图4A)。将rCHI3L1注射至CHI3L1-/-小鼠(而不是CD44-/-小鼠)恢复了肝中的血小板积聚，并且将肝损伤增强至在WT小鼠中观察到的水平(图4A至C)。最重要的是，通过CHI3L1/CD44轴的大多数血小板显示出黏附于KC。此外，在CHI3L1-/-小鼠中通过抗体阻断CD44消除了rCHI3L1在促进KC募集血小板中的作用，并因此大大减少了肝损伤(图4D至F)。总之，这些数据表明了CD44是CHI3L1促进肝血小板积聚和AILI的功能所必需的。
细胞色素P450 2E1(CYP2E1)介导的APAP对NAPQI的生物活化和由谷胱甘肽(GSH)对NAPQI的解毒在确定AILI的程度方面是重要的。32-38因此，尽管出乎意料，但是本发明人检查了CHI3L1或CD44的缺失可影响APAP生物活化的可能性。他们没有观察到WT、CHI3L1-/-和CD44-/-小鼠之间在GSH、肝CYP2E1蛋白表达或NAPQI-蛋白加合物水平方面的任何差异(扩展数据图3A至C)。这些数据表明CHI3L1和CD44缺失不影响APAP生物活化及其对肝细胞的直接毒性。
此外，本发明人在CILI模型中检查了CHI3L1/CD44轴在促进血小板募集和肝损伤中的作用。他们发现，在CHI3L1-/-小鼠中，rCHI3L1可以恢复肝血小板积聚并增强肝损伤，但在CD44-/-小鼠中则不可以(扩展数据图4A至B)。此外，通过使用抗体阻断CD44消除了rCHI3L1对CHI3L1-/-小鼠的作用(扩展数据图4C至E)。这些数据表明，CHI3L1/CD44轴在肝血小板积聚和肝损伤中的作用不限于AILI。
KC中的CHI3L1/CD44信号传导上调了平足蛋白表达和血小板黏附。为了研究KC中的CHI3L1/CD44信号传导如何促进血小板募集，本发明人测量了在血小板募集中重要的一组黏附分子的KC表达。39-44他们发现平足蛋白在来自WT小鼠的KC中比在来自CHI3L1-/-或CD44-/-小鼠的KC中以高得多的水平表达(扩展数据图5)。为了比较平足蛋白的细胞表达，本发明人从未处理和经APAP处理的WT小鼠中分离了KC、LSEC、肝星状细胞(HSC)和肝细胞。如在图5A中所示，平足蛋白的mRNA水平在APAP处理之后上调，但仅在KC中如此，在肝的其他主要细胞类型中并非如此。此外，平足蛋白在来自CHI3L1-/-和CD44-/-小鼠的KC中的表达水平比来自WT小鼠的那些显著更低。有趣的是，对CHI3L1-/-小鼠而不是CD44-/-小鼠的rCHI3L1处理可以显著提高KC中平足蛋白mRNA和蛋白表达的水平(图5B至D)。
为了进一步检查平足蛋白在介导血小板黏附于KC中的作用，本发明人在用rCHI3L1重构的CHI3L1-/-小鼠中使用抗平足蛋白抗体阻断平足蛋白。如在图5E至G中所示，平足蛋白的阻断不仅消除了rCHI3L1介导的血小板募集到肝中，而且显著降低了其对提高CHI3L1-/-小鼠中的AILI的作用。C型凝集素样受体2(C-type lectin-like receptor 2，Clec-2)是血小板上已报道与平足蛋白结合的唯一受体43。为了进一步阐明平足蛋白在介导KC/血小板黏附中的作用，本发明人从用APAP处理的WT小鼠中分离了KC。在用抗平足蛋白抗体或IgG作为对照处理KC之后，他们添加了血小板。平足蛋白和Clec-2的免疫荧光染色显示出表达Clec-2的血小板仅与经IgG处理的KC结合，而不与经抗平足蛋白处理的KC结合(图5H)。总之，这些数据表明KC通过平足蛋白和Clec-2相互作用来募集血小板，并且平足蛋白在KC上的表达由CHI3L1/CD44信号传导进行调节。
在AILI治疗中靶向CHI3L1的治疗潜力的评价。AILI是缺乏有效治疗的严重医学问题。在阐明AILI中CHI3L1的潜在生物学的同时，本发明人还产生了特异性识别小鼠或人CHI3L1的单克隆抗体。首先，他们针对减弱AILI的效力筛选了一组抗小鼠CHI3L1抗体(α-mCHI3L1 Ab)。在APAP攻击3小时之后，本发明人给WT小鼠注射了一组α-mCHI3L1 Ab或IgG作为对照。他们发现克隆55和59(C55和C59)可以显著降低APAP之后6小时和24小时的ALT水平(扩展数据图6)。他们还使用C59进行了另外的实验，并且数据显示C59可以有效地抑制肝血小板积聚(图6A)并减弱APAP诱导的肝细胞坏死(图6B)。
有趣的是，在来自患有AILI的患者的血清样品和肝活检物二者中，CHI3L1的蛋白质表达水平与来自正常个体的那些相比显著提高(图6D至E)。由于人和小鼠CHI3L1之间的氨基酸序列同源性非常高(76％)，因此本发明人用重组人CHI3L1(rhCHI3L1)处理CHI3L1-/-小鼠，以便评价本发明人产生的抗人CHI3L1抗体(α-hCHI3L1 Ab)的作用。数据显示出，与小鼠CHI3L1相似，rhCHI3L1可促进CHI3L1-/-小鼠中的肝血小板募集并提高AILI(图6F至H)。他们筛选了通过对来自患有AILI的患者的肝活检物进行免疫组织化学染色而产生的所有α-hCHI3L1 Ab，并挑选了最适合进行体内研究的克隆。令本发明人兴奋的是，α-hCHI3L1 Ab处理可以消除血小板募集并显著降低肝损伤(图6F至H)。总之，这些数据表明基于单克隆抗体的CHI3L1阻断可以是治疗AILI并且潜在地是治疗其他急性肝损伤的有效治疗策略。
可用于治疗超剂量对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝衰竭和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的靶向壳多糖酶3样1(CHI3L1)的单克隆抗体。对乙酰氨基酚(APAP)超剂量导致多于三分之一的患者死亡或肝移植。截至2018年，美国急性肝衰竭最常见的原因仍然是超剂量APAP诱导的肝损伤(AILI)。据估计，每周有6000万美国人服用含APAP的产品，并且每年有约30,000名患者因AILI而进入重症监护室。AILI的直接成本每年高达8700万美元。唯一的解毒剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)的有效性在摄入APAP之后迅速下降，远早于患者因严重肝损伤的症状而被送入门诊。因此，开发新的挽救生命的治疗以减弱AILI的需求仍未得到满足。
HCC是最常见的癌症之一，全世界每年发生多于50万新病例。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)，预计到2030年将有多于100万患者死于肝癌，使其成为癌症相关的死亡的第六大主要原因。在过去的数十年里，美国的HCC发病率一直在上升。目前，HCC每年影响约33,000名美国人并导致27,000例死亡。HCC的治疗选择非常有限。多激酶抑制剂索拉非尼(sorafenib)是目前唯一的一线化学治疗。然而，大多数患者表现为晚期HCC，其对于化学治疗是难治性的。最近，免疫检查点抑制剂(纳武单抗，nivolumab)已被FDA批准作为二线治疗。鉴于炎症在HCC发生中的关键作用，更多针对肿瘤微环境的免疫治疗将成为成功的治疗方法。
CHI3L1(人中的YKL-40)是不具有壳多糖酶活性的壳多糖酶样可溶性蛋白质。它可以由多种细胞类型(包括巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、滑膜细胞、内皮细胞和肿瘤细胞)产生。CHI3L1与许多生物学过程(包括凋亡、炎症、氧化应激、感染和肿瘤转移)有关。但是它在APAP诱导的肝衰竭中的参与先前没有报道过。虽然有临床报道描述了HCC与CHI3L1表达升高之间的联系，但是CHI3L1在HCC中的作用先前没有报道过。靶向CHI3L1以延缓/治疗HCC进展先前也没有报道过。
抗CHI3L1抗体显著减弱了APAP诱导的肝损伤(AILI)。使用AILI的小鼠模型，本发明人发现通过CHI3L1受体CD44的信号传导，CHI3L1很大程度上有助于AILI。这些数据表明CHI3L1-/-和CD44-/-小鼠对AILI具有抗性。向CHI3L1-/-小鼠而不是CD44-/-小鼠施用重组CHI3L1可以将AILI恢复到在野生型(WT)小鼠中看到的程度。本发明人产生了特异性识别小鼠或人CHI3L1的单克隆抗体。然后他们评价了这些抗体的治疗潜力。对于抗小鼠抗体，本发明人将抗体注射至WT小鼠，然后进行APAP攻击。对于抗人抗体，他们将抗体注射至用重组人CHI3L1重构的CHI3L1-/-小鼠。在筛选了一组抗体之后，本发明人鉴定出了数个可以显著减弱AILI的克隆。描述这些结果的手稿附后。
抗CHI3L1抗体显著降低了HCC发生。本发明人使用了通过将200万个小鼠HCC细胞系(mHepa1-6)注射至WT C57B/6J小鼠的肝的HCC的肝原位小鼠模型。在一周之后，将小鼠分成两组。一组用抗小鼠CHI3L1抗体(C#59，50μg)进行处理，每周2次，持续3周。另一组用兔IgG作为对照进行处理。数据显示出C#59对肿瘤生长有显著的抑制作用。来自三次独立实验的合并结果在图11中示出。此外，本发明人将mHepa1-6细胞注射至WT和CHI3L1-/-小鼠的肝。在4周之后，CHI3L1-/-小鼠中的肿瘤尺寸比WT小鼠显著更小，图12。有可能是肿瘤微环境中的CHI3L1发挥了促进肿瘤生长的作用。
讨论。虽然不希望受到任何特定机理的束缚，但是越来越多的证据表明，血小板被隔绝在受损肝的血窦中。7,9-13除了其在止血和组织再生中的核心作用外，血小板还表现出有助于肝损伤的启动。7,13,45在此，本发明人将KC鉴定为在急性肝损伤早期阶段期间肝内血小板募集的关键角色。这些研究揭示了CHI3L1/CD44信号传导在介导KC的该功能中的关键作用。重要的是，本发明人发现用单克隆抗体中和CHI3L1可以有效地抑制肝血小板积聚并减轻由APAP引起的肝损伤，这支持了靶向CHI3L1作为治疗AILI的治疗策略的潜力和可行性。
最近发表的研究将CD44描述为胃癌中的CHI3L1受体。46还报道了对于CHI3L1的数种其他受体，其包括IL-13Rα2、CRTH2、TMEM219和半乳凝素-3。46-50CHI3L1与多种受体结合的发现表明CHI3L1在不同疾病背景下的不同参与情况。本发明人观察到CHI3L1主要与KC结合，但不与肝中其他表达CD44的细胞结合，这表明了两种可能性。首先，CHI3L1可能与由KC独特表达的CD44特定亚型结合。第二，KC，而不是其他表达CD44的肝细胞，表达促进CHI3L1与KC上的CD44结合的共受体。这些可能性需要进一步研究。
如在实施例中所示，血小板通过血小板上的Clec-2与KC上的平足蛋白之间的相互作用而黏附于KC。与该发现相一致的是，据报道，在全身性鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)感染期间，KC通过平足蛋白/Clec-2相互作用募集血小板。51尽管如此，还描述了其他受体/配体相互作用对以介导血小板/KC黏附。例如，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus-)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)细菌感染通过糖蛋白IIb(glycoprotein IIb，GPIIb)与冯·维勒布兰德因子(vWF)之间的相互作用而触发持续的血小板黏附于KC。12NASH的研究报道了，血小板的肝募集依赖于血小板上的GPIb与KC上的黏膜血管地址素细胞黏附分子1(mucosal vascular addressin celladhesion molecule 1，MAdCAM-1)之间的相互作用，而平足蛋白、Clec-2或vWF不参与。13AILI中KC的参与情况一直是具有争议的话题，因为在小鼠中进行的KC耗竭研究产生了相反的结果。52-54目前的研究表明，CLDN治疗的时机可能是调和这些差异的关键。在大多数先前的研究中，小鼠在CLDN之后48小时用APAP进行处理。虽然KC被耗竭，但是在这个时间点有大量的浸润性巨噬细胞。因此，在这些研究中观察到的表型反映了浸润性巨噬细胞的功能，而不仅仅是KC耗竭的结果。因此，为了避免浸润性巨噬细胞的混杂因素，本发明人在当前研究中选择了KC被耗竭但不存在浸润性巨噬细胞的时间点来检查KC在血小板募集和AILI中的作用。
本文中表明了先前未认识到的CHI3L1/CD44轴参与AILI并且提供了对于CHI3L1/CD44信号传导在APAP攻击之后促进肝血小板积聚和肝损伤的机制的见解。为了将本发明人的发现更进一步推向临床，他们产生了小鼠和人抗CHI3L1单克隆抗体。这些数据表明了通过中和抗体靶向CHI3L1以减弱AILI的可行性。总之，这些研究为靶向CHI3L1作为新的治疗策略以改善AILI和或许其他急性肝损伤病症的临床结局的潜力提供了强有力的证据。
扩展数据表1
Figure BDA0003998997950000741
扩展数据表1.通过MS分析与CHI3L1结合的蛋白质的代表性列表。从用APAP处理2小时的WT小鼠中分离KC，并随后将rCHI3L1与KC裂解物一起孵育过夜。与rCHI3L1结合的蛋白质用抗His抗体进行免疫沉淀，并进行蛋白质ID质谱分析。
扩展数据表2
肝细胞 标志物 CD44表达
肝细胞 <![CDATA[FSC<sup>hi</sup>，SSC<sup>hi</sup>]]> -
LSEC <![CDATA[CD45<sup>-</sup>CD146<sup>+</sup>]]> ++
库普弗细胞 <![CDATA[CD45<sup>+</sup>F4/80<sup>hi</sup>]]> ++
中性粒细胞 <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD11b<sup>hi</sup>Ly6G<sup>+</sup>]]> +
单核细胞 <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD11b<sup>hi</sup>Ly6C<sup>+</sup>]]> +
树突细胞 <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD11c<sup>+</sup>MHCII<sup>+</sup>]]> -
B细胞 <![CDATA[CD19<sup>+</sup>]]> -
T细胞 <![CDATA[CD3<sup>+</sup>]]> ++
NK细胞 <![CDATA[CD3<sup>+</sup>NK1.1<sup>+</sup>]]> ++
嗜酸性粒细胞 <![CDATA[CD45<sup>+</sup>Siglec F<sup>+</sup>]]> ++
HSC <![CDATA[V450<sup>hi</sup>]]> ++
扩展数据表2.小鼠肝中不同细胞的CD44表达的总结。从用APAP处理2小时和24小时的小鼠中分离小鼠肝细胞和NPC。用指定的细胞表面标志物标记分离的肝细胞，以限定每个不同的细胞群。在单活细胞群上对每个细胞群设门。(n＝3只小鼠/组)。
表A-CHI3L1 mAb的CDR的氨基酸序列
Figure BDA0003998997950000761
Figure BDA0003998997950000771
表B—CHI3L1 mAb的CDR的核苷酸序列
Figure BDA0003998997950000772
Figure BDA0003998997950000781
Figure BDA0003998997950000791
表C—CHI3L1 mAb与人CHI3L1和小鼠CHI3L1的动力学结合亲和力
Figure BDA0003998997950000792
n.a.：无可检测的结合
表D—抗CHI3L1抗体的表位箱
Figure BDA0003998997950000801
表E—基于与不同的CHI3L1蛋白片段(AA：22-256)和CHI3L1蛋白片段(AA：257-383)结合的CHI3L1 mAb的分组
Chi3L1蛋白片段 mAb结合组
AA：22-256 C1，C3，C7，C14，C17，C23，C24，C27，C29
AA：257-383 C2，C4，C8，C9，C13，C15，C16，C18，C19，C20，C21，C25，C28，C30
实施例3
引言。肝细胞癌(HCC)是世界范围内第五大常见癌症和第二大常见相关癌症死亡。其是由于转移和手术后复发而预后不良的侵袭性癌症。对HCC的药物治疗选择是有限的。多年来，索拉非尼(一种酪氨酸激酶抑制剂)是晚期HCC唯一可用的治疗。FDA最近批准了数种另外的多激酶抑制剂。免疫检查点抑制剂纳武单抗(抗PD1抗体)也于2017年由FDA批准用于治疗对于索拉非尼有进展的患者的HCC。然而，只有一小部分患者对治疗有响应。
HCC是由炎症驱动的疾病。高达80％的HCC患者存在长期的肝炎症和肝硬化，这表明肿瘤微环境在HCC进展中发挥着关键作用。HCC的TME的特征在于免疫抑制性质，这归因于抑制抗肿瘤T细胞应答的多种细胞(包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM))的存在。基于细胞表面标志物和功能特征，巨噬细胞被分为经典活化的(M1)和选择性活化的(M2)表型。M2细胞在促进伤口愈合、血管生成和免疫抑制中发挥重要作用。这些功能在损伤之后的组织修复期间是有益的，但却促进肿瘤生长和转移。对人HCC样品的分析表明，大多数TAM是选择性活化的M2巨噬细胞。已知这些细胞产生多种促进肿瘤细胞生长和血管生成的介质。更重要的是，TAM发挥重要的免疫抑制功能。它们产生一组细胞因子和趋化因子(包括IL-10，TGF-β，CCL17、18、22和24)以募集和活化调节性T细胞，其继而抑制细胞毒性T细胞的活化。
壳多糖酶3样1(也称为YKL-40)是由壳多糖酶和壳多糖酶样蛋白组成的18-糖苷水解酶家族的成员，并且其缺乏壳多糖酶活性。虽然对Chi3l1的功能研究有限，但是许多临床报告已经描述了在涉及炎症和组织重塑的疾病中Chi3l1的血清水平升高，所述疾病例如类风湿性关节炎、炎性肠病、多发性硬化、糖尿病、慢性阻塞性肺病，以及许多组织包括肺、前列腺、结肠、乳腺、脑、肾和肝的癌症。
关于HCC，蛋白质组学和转录组学分析揭示了肿瘤中Chi3l1的表达水平比肿瘤周围正常组织中的更高。此外，较高的Chi3l1水平与晚期肿瘤淋巴结转移阶段、较差的总存活和无病存活相关。在接受治愈性切除的HCC患者中，在手术之后6个月内Chi3l1水平较高的患者总存活比Chi3l1水平较低的患者显著更短。这些发现表明了Chi3l1作为HCC患者的独立预后标志物的潜力。
然而，尚未研究在HCC发生中Chi3l1病理生理学参与的机制。文献中的一些证据指向Chi3l1与巨噬细胞功能之间的联系。在人和小鼠纤维化的肝中，Chi3l1血清水平的提高与肝巨噬细胞的提高相一致。表明Chi3l1抑制肝和肺中巨噬细胞的凋亡。此外，据报道，Chi3l1促进腹膜、肺泡、真皮和肠巨噬细胞的替代活化。
Chi3l1表达提高与HCC严重程度相关。癌症基因组图谱(TCGA)数据库的分析揭示了HCC患者中Chi3l1的转录物水平比健康对照更高(图15)。此外，与具有低的Chi3l1表达的那些患者相比，具有高的Chi3l1表达的HCC患者与较低的存活率相关(图15)。
本发明人测量了具有不同病因状况(包括HBV、HCV、NASH和ASH)的HCC患者的血浆中的Chi3l1蛋白水平。这些数据显示，无论病因状况如何，与健康对照相比，Chi3l1蛋白的血浆水平更高(图16A至B)。他们还发现了Chi3l1在来自HCC患者的肿瘤中但不在邻近正常肝组织中高度表达(图16A至B)。
用抗Chi3l1单克隆抗体(mAb)进行的治疗抑制HCC进展。本发明人产生了一组抗Chi3l1单克隆抗体(mAb)。使用两种HCC小鼠模型，他们发现克隆59(C59mAb)可以显著降低HCC发生(图17A至B)。在第一个模型中，他们将表达Chi3l1的Hepa 1-6细胞直接植入到小鼠肝中(原位模型)。在1周之后，将小鼠随机分为两组，其用IgG或α-Chi3l1(200μg/只小鼠)处理，每周两次，持续4周。在第二个模型中，本发明人将癌基因(β-连环蛋白和c-met)通过流体动力学注射引入到尾静脉中。在注射之后4周，将小鼠随机分为两组，其用IgG或α-Chi3l1(200μg/只小鼠)处理，每周2次，再持续4周。图17A至B中示出的数据表明，由C59mAb中和Chi3l1有效地降低了肿瘤生长。
确定Chi3l1在体外对肿瘤细胞的直接作用。在体外细胞培养物中，在不存在或存在C59mAb的情况下，本发明人用重组Chi3l1蛋白(rChi3l1)处理hepa1-6细胞。数据显示，rChi3l1显著提高了细胞增殖、迁移和侵入，并且C59mAb降低了rChi3l1的作用(图18A至B)。用棕榈酸(PA)处理细胞以诱导凋亡，并通过膜联蛋白V(ANX V)染色进行分析。数据显示出rChi3l1抑制凋亡，而C59mAb则逆转了这种情况(图18A至B)。
C59mAb抑制肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的促肿瘤发生表型。本发明人将hepa1-6细胞植入到WT和Chi3l1-/-小鼠的肝中。数据显示在肿瘤微环境中缺乏Chi3l1但在植入的肿瘤细胞中不缺乏Chi3l1的Chi3l1-/-小鼠比WT小鼠表现出显著更小的肿瘤(图19)。该发现表明，Chi3l1对肿瘤微环境的作用在其促肿瘤发生功能中发挥着关键作用。此外，免疫组织化学染色(IHC)表明了TAM表达Chi3l1(图20)。来自经IgG和C59mAb处理的小鼠的TAM基因表达谱的比较揭示了C59mAb抑制M2相关基因，其包括Ym-1、Fizz1、Mrc1和精氨酸酶(Arg)1(图21)。Arg1和F4/80(巨噬细胞的标志物)的IHC染色表明Arg1由TAM表达，并且表达水平在来自经C59mAb处理的小鼠的TAM中降低(图22A至B)。
C59mAb增强了抗肿瘤T细胞应答。在HCC的原位小鼠模型中，本发明人从经IgG和C59mAb处理的小鼠中分离出免疫细胞。他们通过使用流式细胞术测量其TNFa和IFNg的产生来研究CD4+和CD8+的活化。如在图23A至C所示，C59mAb处理导致CD4+和CD8+T细胞二者的TNFa和IFNg表达增强。
总结。这些发现表明，Chi3l1通过诱导TAM的促肿瘤发生表型并因此抑制抗肿瘤T细胞应答来促进HCC进展。重要的是，本发明人表明了使用C59mAb中和Chi3l1可以抑制TAM的促肿瘤发生作用，从而增强了抗肿瘤T细胞免疫。这些研究提供了对Chi3l1促肿瘤发生功能的机理方面的见解，并且确定了Chi3l1不仅是治疗HCC的生物标志物，而且也是可行的治疗靶标。
表F.使用Octet BLI方法确定的C59Hu和C7Hu的动力学结合参数
Figure BDA0003998997950000831
根据本公开内容，本文中公开和要求保护的所有方法无需过度实验就可进行和实施。尽管已根据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说明显的是，可对本文中所述方法以及所述方法的步骤或步骤顺序作出改变而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，可用某些在化学和生理学两个方面均相关的试剂替代本文中所述的试剂，同时实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这样的类似替代和改变被视为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献就其提供补充本文中所阐述的那些操作或细节的示例性操作或其他细节而言特别地通过引用并入本文。
1.Bernal，W.，Auzinger，G.，Dhawan，A.&Wendon，J.Acute liver failure.Lancet376，190-201，doi:10.1016/S0140-6736(10)60274-7(2010).
2.Stravitz，R.T.et al.Thrombocytopenia Is Associated With Multi-organSystem Failure in Patients With Acute Liver Failure.Clin GastroenterolHepatol 14，613-620 e614，doi:10.1016/j.cgh.2015.09.029(2016).
3.European Association for the Study of the Liver.Electronic address，e.e.e.et al.EASL Clinical Practical Guidelines on the management of acute(fulminant)liver failure.J Hepatol 66，1047-1081，doi:10.1016/j.jhep.2016.12.003(2017).
4.Stravitz，R.T.et al.Role of procoagulant microparticles in mediatingcomplications and outcome of acute liver injury/acute liverfailure.Hepatology 58，304-313，doi:10.1002/hep.26307(2013).
5.Harrison，P.M.，O′Grady，J.G.，Keays，R.T.，Alexander，G.J.&Williams，R.Serial prothrombin time as prognostic indicator in paracetamol inducedfulminant hepatic failure.BMJ 301，964-966(1990).
6.Kerr，R.et al.Effects of acute liver injury on blood coagulation.JThromb Haemost 1，754-759(2003).
7.Miyakawa，K.et al.Platelets and protease-activated receptor-4contribute to acetaminophen-induced liver injury in mice.Blood 126，1835-1843，doi:10.1182/blood-2014-09-598656(2015).
8.Larson，A.M.et al.Acetaminophen-induced acute liver failure:resultsof a United States multicenter，prospective study.Hepatology 42，1364-1372，doi:10.1002/hep.20948(2005).
9.Lalor，P.F.，Herbert，J.，Bicknell，R.&Adams，D.H.Hepatic sinusoidalendothelium avidly binds platelets in an integrin-dependent manner，leading toplatelet and endothelial activation and leukocyte recruitment.Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol 304，G469-478，doi:10.1152/ajpgi.00407.2012(2013).
10.Lang，P.A.et al.Aggravation of viral hepatitis by platelet-derivedserotonin.Nat Med 14，756-761，doi:10.1038/nm1780(2008).
11.Lesurtel，M.et al.Platelet-derived serotonin mediates liverregeneration.Science 312，104-107，doi:10.1126/science.1123842(2006).
12.Wong，C.H.，Jenne，C.N.，Petri，B.，Chrobok，N.L.&Kubes，P.Nucleation ofplatelets with blood-borne pathogens on Kupffer cells precedes other innateimmunity and contributes to bacterial clearance.Nat Immunol 14，785-792，doi:10.1038/ni.2631(2013).
13.Malehmir，M.et al.Platelet GPIbα is a mediator and potentialinterventional target for NASH and subsequent liver cancer.Nature Medicine25，641-655，doi:10.1038/s41591-019-0379-5(2019).
14.Lee，C.G.et al.Role of chitin and chitinase/chitinase-like proteinsin inflammation，tissue remodeling，and injury.Annu Rev Physiol 73，479-501，doi:10.1146/annurev-physiol-012110-142250(2011).
15.Hakala，B.E.，White，C.&Recklies，A.D.Human cartilage gp-39，a majorsecretory product of articular chondrocytes and synovial cells，is a mammalianmember of a chitinase protein family.J Biol Chem 268，25803-25810(1993).
16.Kirkpatrick，R.B.et al.Induction and expression of human cartilageglycoprotein 39 in rheumatoid inflammatory and peripheral blood monocyte-derived macrophages.Exp Cell Res 237，46-54，doi:10.1006/excr.1997.3764(1997).
17.Kawada，M.，Hachiya，Y.，Arihiro，A.&Mizoguchi，E.Role of mammalianchitinases in inflammatory conditions.Keio J Med 56，21-27(2007).
18.Lee，C.G.et al.Role of breast regression protein 39(BRP-39)/chitinase 3-like-1 in Th2 and IL-13-induced tissue responses and apoptosis.JExp Med 206，1149-1166，doi:10.1084/jem.20081271(2009).
19.Ponta，H.，Sherman，L.&Herrlich，P.A.CD44:from adhesion molecules tosignalling regulators.Nat Rev Mol Cell Biol 4，33-45，doi:10.1038/nrm1004(2003).
20.Ahrens，T.et al.Soluble CD44 inhibits melanoma tumor growth byblocking cell surface CD44 binding to hyaluronic acid.Oncogene 20，3399-3408，doi:10.1038/sj.onc.1204435(2001).
21.Alaniz，L.et al.Interaction of CD44 with different forms ofhyaluronic acid.Its role in adhesion and migration of tumor cells.Cell CommunAdhes 9，117-130(2002).
22.Bartolazzi，A.，Peach，R.，Aruffo，A.&Stamenkovic，I.Interaction betweenCD44 and hyaluronate is directly implicated in the regulation of tumordevelopment.J Exp Med 180，53-66(1994).
23.Blass，S.L.，Pure，E.&Hunter，C.A.A role for CD44 in the production ofIFN-gamma and immunopathology during infection with Toxoplasma gondii.JImmunol 166，5726-5732(2001).
24.Kittl，E.M.et al.Serum levels of soluble CD44 variant isoforms areelevated in rheumatoid arthritis.Rheumatol Int 16，181-186(1997).
25.Naor，D.&Nedvetzki，S.CD44 in rheumatoid arthritis.Arthritis ResTher 5，105-115(2003).
26.Sato，M.I.，Koshino，T.&Takagi，T.CD44 expression on chondrocytes inknees of DBA/1 mice with type II collagen-induced arthritis.Clin ExpRheumatol 17，185-190(1999).
27.Lucarini，G.et al.Involvement of vascular endothelial growthfactor，CD44 and CD133 in periodontal disease and diabetes:animmunohistochemical study.J Clin Periodontol 36，3-10，doi:10.1111/j.1600-051X.2008.01338.x(2009).
28.Slevin，M.et al.Hyaluronan-mediated angiogenesis in vasculardisease:uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.Matrix Biol 26，58-68，doi:10.1016/j.matbio.2006.08.261(2007).
29.Wang，J.&Kubes，P.A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that CanRapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.Cell 165，668-678，doi:10.1016/j.cell.2016.03.009(2016).
30.Rahman，T.M.&Hodgson，H.J.Animal models of acute hepatic failure.IhtJ Exp Pathol 81，145-157，doi:10.1046/j.1365-2613.2000.00144.x(2000).
31.Mosser，D.M.&Edwards，J.P.Exploring the full spectrum of macrophageactivation.Nat Rev Immunol 8，958-969，doi:10.1038/nri2448(2008).
32.Mitchell，J.R.et al.Acetaminophen-induced hepatic necrosis.I.Roleof drug metabolism.J Pharmacol Exp Ther 187，185-194(1973).
33.Jollow，D.J.et al.Acetaminophen-induced hepatic necrosis.II.Role ofcovalent binding in vivo.J Pharmacol Exp Ther 187，195-202(1973).
34.Cover，C.et al.Peroxynitrite-induced mitochondrial andendonuclease-mediated nuclear DNA damage in acetaminophen hepatotoxicity.JPharmacol Exp Ther 315，879-887，doi:10.1124/jpet.105.088898(2005).
35.Chiu，H.et al.Role of p55 tumor necrosis factor receptor 1 inacetaminophen-induced antioxidant defense.Am J Physiol Gastrointest LiverPhysiol 285，G959-966，doi:10.1152/ajpgi.00219.2003(2003).
36.Gardner，C.R.et al.Reduced hepatotoxicity of acetaminophen in micelacking inducible nitric oxide synthase:potential role of tumor necrosisfactor-alpha and interleukin-10.Toxicol Appl Pharmacol 184，27-36(2002).
37.Hinson，J.A.，Reid，A.B.，McCullough，S.S.&James，L.P.Acetaminophen-induced hepatotoxicity:role of metabolic activation，reactive oxygen/nitrogenspecies，and mitochondrial permeability transition.Drug Metab Rev 36，805-822,doi:10.1081/DMR-200033494(2004).
38.Jaeschke，H.，Knight，T.R.&Bajt，M.L.The role of oxidant stress andreactive nitrogen species in acetaminophen hepatotoxicity.Toxicol Lett 144，279-288(2003).
39.Hamburger，S.A.&McEver，R.P.GMP-140 mediates adhesion of stimulatedplatelets to neutrophils.Blood 75,550-554(1990).
40.Larsen，E.et al.PADGEM protein:a receptor that mediates theinteraction of activated platelets with neutrophils and monocytes.Cell 59，305-312(1989).
41.Simon，D.I.et al.Platelet glycoprotein ibalpha is a counterreceptorfor the leukocyte integrin Mac-1(CD11b/CD18).J Exp Med 192,193-204(2000).
42.Weber，C.&Springer，T.A.Neutrophil accumulation on activated，surface-adherent platelets in flow is mediated by interaction of Mac-1 withfibrinogen bound to alphaIIbbeta3 and stimulated by platelet-activatingfactor.J Clin Invest 100，2085-2093，doi:10.1172/JCI119742(1997).
43.Kerrigan，A.M.et al.Podoplanin-expressing inflammatory macrophagesactivate murine platelets via CLEC-2.J Thromb Haemost 10,484-486，doi:10.1111/j.1538-7836.2011.04614.x(2012).
44.Diacovo，T.G.，deFougerolles，A.R.，Bainton，D.F.&Springer，T.A.Afunctional integrin ligand on the surface of platelets:intercellular adhesionmolecule-2.J Clin Invest 94，1243-1251，doi:10.1172/JCI117442(1994).
45.Iannacone，M.et al.Platelets mediate cytotoxic Tlymphocyte-inducedliver damage.Nat Med 11，1167-1169，doi:10.1038/nm1317(2005).
46.Geng，B.et al.Chitinase 3-like 1-CD44 interaction promotesmetastasis and epithelial-to-mesenchymal transition through beta-catenin/Erk/Akt signaling in gastric cancer.J Exp Clin Cancer Res 37,208，doi:10.1186/s13046-018-0876-2(2018).
47.Zhou，Y.et al.Chitinase 3-like-1 and its receptors in Hermansky-Pudlak syndrome-associated lung disease.J Clin Invest 125，3178-3192，doi:10.1172/JCI79792(2015).
48.He，C.H.et al.Chitinase 3-like 1 regulates cellular and tissueresponses via IL-13 receptor alpha2.Cell Rep 4，830-841，doi:10.1016/j.celrep.2013.07.032(2013).
49.Lee，C.M.et al.IL-13Ralpha2 uses TMEM219 in chitinase 3-like-1-induced signalling and effector responses.Nat Commun 7，12752，doi:10.1038/ncomms12752(2016).
50.Zhou，Y.et al.Galectin-3 Interacts with the CHI3L1 Axis andContributes to Hermansky-Pudlak Syndrome Lung Disease.J Immunol 200,2140-2153,doi:10.4049/jimmunol.1701442(2018).
51.Hitchcock，J.R.et al.Inflammation drives thrombosis afterSalmonella infection via CLEC-2 on platelets.J Clin Invest 125，4429-4446，doi:10.1172/JCI79070(2015).
52.Laskin，D.L.，Gardner，C.R.，Price，V.F.&Jollow，D.J.Modulation ofmacrophage functioning abrogates the acute hepatotoxicity ofacetaminophen.Hepatology 21,1045-1050(1995).
53.Michael，S.L.，Pumford，N.R.，Mayeux，P.R.，Niesman，M.R.&Hinson，J.A.Pretreatment of mice with macrophage inactivators decreases acetaminophenhepatotoxicity and the formation of reactive oxygen and nitrogenspecies.Hepatology 30，186-195，doi:10.1002/hep.510300104(1999).
54.Ju，C.et al.Protective role of Kupffer cells in acetaminophen-induced hepatic injury in mice.Chem Res Toxicol 15，1504-1513(2002).
55.Guerrero Munoz，F.&Fearon，Z.Sex related differences inacetaminophen toxicity in the mouse.J Toxicol Clin Toxicol 22，149-156(1984).
56.Holt，M.P.，Cheng，L.&Ju，C.Identification and characterization ofinfiltrating macrophages in acetaminophen-induced liver injury.J Leukoc Biol84，1410-1421，doi:10.1189/jlb.0308173(2008).
57.Shah，Z.et al.Chitinase 3-like-I promotes intrahepatic activationof coagulation through induction of tissue factor in mice.Hepatology 67，2384-2396，doi:10.1002/hep.29733(2018).
58.Deng，M.et al.LILRB4 signalling in leukaemia cells mediates T cellsuppression and tumour infiltration.Nature 562，605-609，doi:10.1038/s41586-018-0615-z(2018).
                         序列表
<110>  THE BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM
<120>  针对壳多糖酶3样1的抗体及其使用方法
<130>  UTFH.P0366WO
<140>  尚未分配
<141>  2021-04-21
<150>  US 63/013,087
<151>  2020-04-21
<160>  488
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  345
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  1
caggagcagc tggtggagga gtccggggga ggcctggtcc agcctggggg atccctgaca      60
ctctcctgca cagcctctgg gtgggactta agtgatacct actggatatg ctgggtccgc     120
caggctccag ggaagggatt ggagtggatc ggatgcattt ataatggtaa tggtgacact     180
tactacgcga cctgggcgaa aggccgattc accatctcca aagcctcgac cacggtggat     240
ctgaaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagaggagtg     300
gctgcggact tgtggggccc aggcaccctg gtcaccgtct cctca                     345
<210>  2
<211>  369
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  2
caggagcagc tgaaggagga gtccggggga ggcctggtcc agcctgaggg atccctgaca      60
ctcacctgca cagcttctgg attctccttc agtagcggct attacatgtg ctgggtccgc     120
caggctccag ggaaggggct ggagtggagc gcgtgcattg gtgctagtag tggactcact     180
tatttcgcga gctgggcgaa aggccgattc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg     240
actctgcgaa tgaccagtct cacggccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagagtc     300
tatcttggtg gtgctgatta tgagcgattt aatttgtggg gtccaggcac cctggtcacc     360
gtctcttca                                                             369
<210>  3
<211>  360
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  3
cagaagcagc tggtggagac cgggggaggc ctggtccagc ctgggggatc cctgacactc      60
tcctgcaaag tctctgaatt cgacttcagt agctactaca tacactgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg gatcggaatc atttatgctg gtaaaggtga cacagactac     180
gcgagctggg tgaatggccg attcaccatc tccagcgaca acgcccagaa cactgtggat     240
cttcaaatga acagtctgac agcggcggac acggccacct atttctgtgc gagagggtgg     300
ctggggtccg attactactt taacttttgg ggcccaggca ccctggtcac cgtctcctca     360
<210>  4
<211>  351
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  4
caggagcagc tggtggagtc cgggggaggc ctggtccagc ctgagggatc cctgacactc      60
acctgcaaag cctctgggtt agacttcagt agcagctact ggatatgctg ggtccgccag     120
gctccaggga aggggctgga gtggatcgga tacattaata ctagtagtgg tagcacatgg     180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact     240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccattt atttctgtgc gaaatatatt     300
aatagttatt tcggcttgtg gggcccaggc accctggtca ccgtctcttc a              351
<210>  5
<211>  348
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  5
cagcagctgg tggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg agggatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattcac cctcactacc tactgggtgt gctgggtccg ccaggctcca     120
gggaaggggc tggagtggat cgcatgcatt gatgctggta gtatcactta ctacacgacc     180
tgggcgagag gccgattcac cgtctccaga acctcgtcga ccacggtgac tctgcaaatg     240
accagtctga cagccgcgga cacggccacc tatttctgtg cgagagatgc tcattatact     300
tatgcccttg tcttgtgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctca                  348
<210>  6
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  6
cagcagctga aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtaat aataactaca tgtgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatgc atttatactg gtgatgctta cacttacttc     180
gcgagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctg     240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag aggttacagt     300
ggttatagtg gttatggtta ttccgacttg tggggcccag gcaccctggt caccgtctct     360
tca                                                                   363
<210>  7
<211>  357
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  7
cagtcggtgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtagc agctactgga tgtgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatactg gtgatggtgc taattactac     180
gcgagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaaagcct cgtcgaccac ggtgactcta     240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag atctgcttat     300
ggtggttatg gttattttaa cttctggggc ccaggcaccc tggtcactgt ctcttca        357
<210>  8
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  8
cagtcagtga aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtggt gcctactgga tatgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggaggt gatcgcatgc atttatgtga ttagtagtag taacacttat     180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc tgctccaaaa cctcgtcgac cacggtggat     240
ctgaagatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagatattct     300
tgtagtagtg ctttttgcct ttttaacttg tggggccctg gcaccctggt caccgtctct     360
tca                                                                   363
<210>  9
<211>  360
<212>  DNA
<213>  人工序列
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<223>  合成抗体
<400>  9
cagaagcagc tggtggagtc cgggggaggc ctggtccagc ctgagggatc cctgacactc      60
acctgcaaag cctctggatt cgacttcagt agcaatgcaa tgtgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtt gctcgcatgc tttgattata ttagtgatag tatatggtac     180
gcgagctggg tgaatggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctg     240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag agacaatgtt     300
ggtgatggtt atactacatt tgacttgtgg ggcccaggca ccctggtcac tgtctcttca     360
<210>  10
<211>  351
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  10
cagtcagtga aggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattcga cttcagtagc aatgcaatgt gctgggtccg ccaggctcca     120
gggaaggggc ctgagtggat cgcatgcatt tataatggtg atgccagtac atactacgcg     180
agctgggcga aaggccgatc taccatctcc aaaacctcgt cgaccacggt gactctgcaa     240
atgaccagtc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgagatg ttttaataga     300
ttttacagag gagacttgtg gggcccaggc accctggtca ccgtctcttc a              351
<210>  11
<211>  347
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  11
cgaagcagct ggtggagtcc gggggagacc tggtcaagcc tgagggatcc ctgacactca      60
cctgcacagc ctctggactc accctcagta gatactggat atgctgggtc cgccaggctc     120
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atgcacttgt cttgtggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcttca                   347
<210>  12
<211>  369
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  12
cagtcagtga aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtagc agctactgga tatgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc attgatgctg gtagtagtga gagcacttac     180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact     240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagagattct     300
agggtagtgg ctggggtggg gatgtacttg aatttgtggg gcccaggcac cctcgtcacc     360
gtctcttca                                                             369
<210>  13
<211>  360
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  13
aagcagctgg tggaggagtc cgggggagac ctggtcaggc ctgagggatc cctgacactc      60
acctgcaaag gctctggatt cgacttcagt agaaatgcaa tgtgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatgttg gtagtggtgg tggcacttac     180
tacgcgacct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact     240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gggatccccc     300
tattctggtt atggctactt taacttgtgg ggcccaggca ccctggtcac tgtctcttca     360
<210>  14
<211>  360
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  14
caggagcagc tggtggagta cgggggagac ctggtccagc ctgagggatc cctgacactc      60
acctgcacag cctctggatt caccatcagt agtactttct acatgggctg ggtccgacag     120
gctccaggga aggggctgga gtggatcgga gacatgcatg ttggtagtgc tactaccact     180
tactacgcga gctgggcgaa aggccgattc accatctcca agccctcgtc gaccacggtg     240
actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagatat     300
gttaatagtg gttattatat ggactcgtgg ggcccaggca ccctggtcac tgtctcttca     360
<210>  15
<211>  366
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  15
cagtcggtgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtagc agccactata tgtggtgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggttggagtg gatcggatgc atccatatta gtagtggtgt cacatggtac     180
gcgagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctc     240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag agacgatcgt     300
tatggtcatg gtggttatcc ttatactgac ttgtggggcc caggcaccct ggtcaccgtc     360
tcttca                                                                366
<210>  16
<211>  357
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  16
cagtcagtga aggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtagc agctactaca tgtgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttataatg gtgatggcag cacatactac     180
gcgagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctg     240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag agatgctgat     300
tatgctggcg tggtgctcaa cttgtggggc ccaggtaccc tggtcactgt ctcttca        357
<210>  17
<211>  375
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  17
cagctggtgg aggagtccgg ggggggcctg gtcaagcctg gggcgcccct gacactcacc      60
tgcacactct ctggattctc cttcagtagc ggctactaca tgtgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatggtg ctgttagtga taggatttac     180
ttcgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atgtccagac cctcgtcgac cacggtgact     240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagagatagt     300
tatagtggta gtacttatta tagatcatac tactttaact tgtggggccc aggcaccctc     360
gtcaccgtct cttca                                                      375
<210>  18
<211>  360
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  18
cagtcagtga aggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg ggggatccct gacactctcc      60
tgcaaagcct ctggattcga cttcagtagt tactacatga gctgggtccg ccaggctcca     120
gggaaggggc tggagtggat cgggatcatt tatggtggta aaggtaccac agactacgcg     180
agctgggtga atggccgatt caccatctcc agcgacaacg cccagaacac tgtggatctt     240
caaatgaaca gtctgacagc ggcggacacg gccacctatt tctgtgcgag agactatgtt     300
agtagtagtg gttattatat ggacttgtgg ggcccaggca ccctggtcac cgtctcttca     360
<210>  19
<211>  348
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  19
cagcagctga aggagtccgg gggaggcctg gtcaagcctg gaggaaccct gacactcacc      60
tgcaaagcct ctggaatcga cttcagtagc aatgtagtgt gctgggtccg ccaggctcca     120
gggaaggggc tggagtggat cggatgcatt gatactgatg attttattgg cacttactac     180
gcgagttggg cgaaaggccg attcaccacc tccaagacct cgtcgaccac ggtgactctt     240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag gggagatgct     300
ggttactatg ccttgtgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctca                  348
<210>  20
<211>  375
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  20
cagtcggtgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc      60
tgcacagctt ctggattctc cttcagtagc agctactaca tgtgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatgctg gtagtagtgg tagcacatgg     180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccatta cctcgtcgac cacggtgact     240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagagaccgt     300
tatggtggtg gttcttatta tataccttac tactttgact tgtggggccc aggcaccctg     360
gtcaccgtct cttca                                                      375
<210>  21
<211>  354
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  21
cagtcggtgg aggagtccgg gggaggcctg gtcaagcctg agggatccct gacactcacc      60
tgcacagctt ctggattctc cttcagttac aggtactaca tgtgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg gatcggatgc attgataatg gtgatggcga cacatactac     180
gcgagctggg tgaatggccg attcaccatc tccaaagcct cgtcgaccac ggtgactctg     240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag agggagtagt     300
ggttataatg gctttaactt ctggggccca ggcaccctgg tcaccgtctc ttca           354
<210>  22
<211>  363
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  22
cagcagctga aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtagc ggctactaca tgtgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg gactggagtg gatcgcatgc attggtgcta gtagtggact cactaactac     180
gcgagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctg     240
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ggtggtgctg attatgagca atttaatttg tggggtccag gcaccctcgt caccgtctct     360
tca                                                                   363
<210>  23
<211>  375
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  23
caggagcagc tggtggagtc cgggggagac ctggtcaagc ctgagggatc cctgacactc      60
acctgcacag cctctggatt ctccttcagt gacaactact ggatgtgctg ggtccgccag     120
gctccaggga aggggctgga gtggatcgga tgcatttata ttggttttag tggtaccact     180
tactacgcga gctgggcgaa aggccgattc accatctcca aggcctcgtc gaccacggtg     240
actctgcaaa tgaccagtct gacaggcgcg gacacggcca cctatttctg tgcgagaggg     300
gttttttatg ttggtagtgg ttattggtac tacttgaact tgtggggccc aggcaccctg     360
gtcaccatct cttca                                                      375
<210>  24
<211>  351
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  24
caggagcagc tggtggagtc tggagggggt ctggtcacgc ctggaggaac cctgacactc      60
acctgcacag cctctggatt cgacttcagt agctactact acatgtgctg ggtccgccag     120
gctccaggga aggggctgga gttgatcgca gcgattgata ctggtagtgg tgagacttac     180
tacgcgagct gggcgaacgg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact     240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagagatccc     300
tattttggca ctaacttatg gggcccaggc accctggtca ccgtctcttc a              351
<210>  25
<211>  364
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  25
caggagcagc tggtggagtc cgggggagac ctggtcaagc ctggggcatc cctgacactc      60
acctgcacag cctctggatt ctccttcagt agcagccact atatgtgctg ggtccgccag     120
gctccaggga aggggctgga gtggatagcg tgtatttatc ttggtgatga cagcacatac     180
tacgcgagct gggtgaatgg ccgattctcc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact     240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagacatgga     300
tataatcttg ctattcataa ttatattata tggggcccag gcaccctggt cactgtctct     360
tcag                                                                  364
<210>  26
<211>  355
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  26
cagtcagtga aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtagc gactacgaca tatactgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgg attgatggtg gtagtagtgg tgagatttat     180
gcgaactggg cgaaaggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctg     240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccgcctatt tctgtgcgag atgtatttgg     300
agtcataatt actatgactt gtggggccca ggcaccctgg tcaccgtctc ttcag          355
<210>  27
<211>  376
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  27
caggagcagc tggtggagtc cgggggagac ctggtcaagc ctggggcatc cctgacactc      60
acctgcacag cctctggatt ctccttcagt agcagctact ggatatgctg ggtccgccag     120
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attccttata atattcatgg ttatactacc ggatttaact tgtggggccc aggcaccctg     360
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<210>  28
<211>  355
<212>  DNA
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<220>
<223>  合成抗体
<400>  28
cagtcggtgg aggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg ggggatccct gacactcacc      60
tgcaaagcct ctggattctc cttcagtagc ggctactgga tgtgttgggt ccgccaggct     120
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gcgagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctt     240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtacgag agatgatggt     300
ggtcttgata atcctaattt gtggggccca ggcaccctgg tcactgtctc ttcag          355
<210>  29
<211>  370
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  29
cagtcggtgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattcac catcagtagt gactactaca tgtgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg gatcggatgt atttatattg gtagtggtac tgatacttat     180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact     240
ctacaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct acttctgtgc gagagataag     300
ggatggtcta atgcctgggg tttctacttt cagttgtggg gcccaggcac cctggtcacc     360
gtctcctcag                                                            370
<210>  30
<211>  367
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  30
caggagcagc tggaggagtc cgggggagac ctggtcaagc ctgagggatc cctgacactc      60
acctgcacag cctctggatt ctccttcagt agcagctact ggatatgctg ggtccgccag     120
gctccaggga aggggctgga gtggatcgca tgcatttatg ctggtggtag tggtagcact     180
tactacgcga gctgggcgaa aggccgattc accatctcca aaacctcgtc gaccacggtg     240
actctgcaaa tgaccagtct gacagccgcg gacgcggcca cctatttctg tgcgagagat     300
ggtgttagtg gtagtggttg gttctttaac ttgtggggcc caggcaccct ggtcaccgtc     360
tcttcag                                                               367
<210>  31
<211>  367
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  31
cagtcggtgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtaac aactactgga tatgctggat ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcatgc atttatgctg gtgatactgg taccgcttac     180
tacgcgaact gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa cctcgtcgac cacggtgact     240
ctacaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacat atttctgtgc gagagatggg     300
gatggtgttg ggaatggtgg tacttttgcc ttgtggggcc caggcaccct ggtcaccgtc     360
tcctcag                                                               367
<210>  32
<211>  367
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  32
cagtcggtgg aggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc      60
tgcacagctt ctggattctc cttcagtagc agctactaca tgtgctgggt ccgccaggct     120
ccagggaagg ggctggagtg gatcgcgtgc atttttactg gtggtgttag cacgtactac     180
gcgagctggg tgaatggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctg     240
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgtgcgag aacctatact     300
gctggtttta ctggtgataa ctactttaac ttgtggggcc caggcaccct ggtcaccgtc     360
tcttcag                                                               367
<210>  33
<211>  379
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  33
cagtcggtgg aggagtccgg gggagacctg gtcaagcctg gggcatccct gacactcacc      60
tgcacagcct ctggattctc cttcagtggc ccctactgga taagttgggt ccgccaggct     120
ccagggaggg ggctggagtg gatcgcaagt attggtgctc gtagtagtgg tagcactcac     180
tacgcgagct gggcgaaagg ccgattcacc atctccaaaa ccgcgtcgac cacggtgact     240
ctgcaaatga ccagtctgac agccgcggac acggccacct atttctgtgc gagatcgtat     300
cctgcttatg ctggtgacgg ttatgcccta tactacttta acttgtgggg cccaggcacc     360
ctggtcaccg tctcttcag                                                  379
<210>  34
<211>  333
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  34
gcccttgtga tgacccagac tccatcttcc gcgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtga gagcattgat aatgatttag cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctaccag gcatccactc tggcatctgg ggtcccatcg     180
cgattcaaag gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagt aattattata gtggtagtag tagtagttat     300
ggtttcggcg gagggaccga ggtggtcgtc aaa                                  333
<210>  35
<211>  333
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  35
gcccttgtga tgacccagac tccatcttcc gcgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtga gagcattagt agtagattag cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatgtttgat gcatccgctc tggcatctgg ggtctcctcg     180
cggttcaaag gcaggggatc tgggacacag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagt tattattata gtggtggggt tcctagttat     300
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<210>  36
<211>  333
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  36
gccatcaaaa tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaattgcc gggccagtga ggacattgaa agctatttag cctggtatca gcagaaacca     120
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cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcgg cgtgcagtgt     240
gacgatggtg ccacttatta ctgtcaaggt gcttggtata gtagtagtgt tgatatgtat     300
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<210>  37
<211>  330
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  37
gccatcaaaa tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaattgcc aggccagtca gaacatttac agcaatttag cctggtatca gcagaaccca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctattct gcatccactc tggcatctgg ggtcccatcg     180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcga cctggactgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaacag gattatagtt ggagtaatgt tgataatgtt     300
ttcggcggag ggaccaagct ggagatcaaa                                      330
<210>  38
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  38
gatgtcgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtga ggacattgaa agttatttag cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcgtc ccagactcct gatctatgat gcatccgatc tggcatctgg ggtcccatcg     180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcgg cgtgcagtgt     240
gccgatgcta ccacttacta ctgtcaaggc tattcttatg gtagtagtta tgttggtttc     300
ggcggaggga ccgaggtggt cgtcaaa                                         327
<210>  39
<211>  330
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  39
gcccaagtgc tgacccagac tccagcctct gtggaggtag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtca gagcatttac agctacttat cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatgtatggt gcatccactc tggcatctgg ggtctcatcg     180
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gccgatgctg ccacttacta ctgtcaacag ggttatacta gttataatat tgacaatgct     300
ttcggcggag ggaccgaggt ggtcgtcaaa                                      330
<210>  40
<211>  339
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  40
gatgtcgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtga ggacatttat agcttattgg cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gctctatctg gcatctactc tggcatctgg ggtcccatcg     180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccatcagtga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaaac tatcattata gtagtactac tagttatgcc     300
cccaatcctt tcggcggagg gaccgagctg gagatccta                            339
<210>  41
<211>  309
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  41
gatgtcgtga tgacccagac tccatcctct gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaattgcc aggccagtca gagtgttagc aacctcttag cctggtatca gcagaaacca     120
gggcgccctc ccgcgctcct gatttatggt gcatccaatc tggaatctgg ggtcccatcg     180
cgtttccgtg gcagtggatc tgggacacag ttcactctca ccatcagtgg catgaaggct     240
gaagatgctg ccacttatta ctgtcaaagt ggttattact ttggagctgg caccaagctg     300
gagatcaaa                                                             309
<210>  42
<211>  336
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  42
gccatcaaaa tgacccagac tccagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtca gagcattagc agttggttat cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagcgcct gatctacaag gcatccactc tggcatctgg ggtcccatcg     180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagc aattatggta gttatagtag tagttatgga     300
tatgctttcg gcggagggac cgaggtggtc gtcaaa                               336
<210>  43
<211>  333
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  43
gaccctatgc tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcagc      60
atcagttgcc agtccagtca gagtgtttat gataacgact ggttatcctg gtatcagcag     120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tatgatgcat ccaaattggc atctggggtc     180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacgtg     240
cagtgtgacg ctgctgccac ttactactgt gcaggcgact atattaatac tattgataat     300
gctttcggcg gagggaccga ggtggtcgtc aaa                                  333
<210>  44
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  44
gatgtcgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtga ggacattgaa agctatttag cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctatgat gcatccgatc tggcatctgg ggtcccatcg     180
cggttcaaag gcagtggatc tgggaaacag ttcactctca ccatcagcgg cgtgcggtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaggc tattattatg gtgctattta tgttgctttc     300
ggcggaggga ccaagctgga gatcaaa                                         327
<210>  45
<211>  330
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  45
gccatcaaaa tgacccagac tccagcctct gtggaggtag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtca gagcattggt atctacttag cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctatgat gcatccgatc tggcatctgg agtcccatcg     180
cggttcagag gcagtggatc tgggacacag ttcactctca ccatcagcgg cgtggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaacag ggtgatacta tttataatgt tgataatact     300
ttcggcggag ggaccaaggt ggtcgtcgaa                                      330
<210>  46
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  46
gaccctatgc tgacccagac tccagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtca gagcattagc actgcattag cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctacagg gcatccattc tggcatctgg ggtcccatcg     180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagc tattatgata gtagtgctgg taatactttc     300
ggcggaggga ccaaggtgga aatcaaa                                         327
<210>  47
<211>  330
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  47
gcccaagtgc tgacccagac tccagcctct gtggaggtag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtca gaccattagc aacctcttag cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaaactcct aatctatgat gcatccactc tggcatatgg ggtctcatcg     180
cgattcagcg gcagtggatc tgggacacag ttcactctca ccatcagcgg cgtgcagtgt     240
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tttggcggag ggaccaagct ggagatcaaa                                      330
<210>  48
<211>  330
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  48
gccatcaaaa tgacccagac tccagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacggtcacc      60
atcaagtgcc aggccaatga gagcattagc agttggtgtg cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctaccag gcatccaaac tggcatctgg ggtcccatcg     180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacacag ttcactctca ctatcagcga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaatct acttattata atgagaatgt tggaaatgcg     300
ttcggcggag ggaccgaggt ggtcgtcaaa                                      330
<210>  49
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  49
gcccaagtgc tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
ataaagtgcc aggccagtga gagcattggc aatgcattag cctggtatca acagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctatgtt gcatcctatc tggcatctgg ggtctcatcg     180
cggttcaaag gcagtagatc tgggacagag tacactctca ccatcagcga cctggagtgt     240
gtcgatgctg ccacttacta ctgtcaatgt acttggtatg gtaatgtcta tcttgctttc     300
ggcggaggga ccgaggtggt cgtcaaa                                         327
<210>  50
<211>  333
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  50
gaccctgtgc tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcagttgcc agtccaatga aaatatttat gtagacaaat acttatcctg gtatcaacag     120
aaaccagggc agcctcccaa aggcctgatc tattctgcat ccactctggc atctggggtc     180
ccatcgcgct tcagaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacgtg     240
cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt gcagggagtt ttagtagtag tgatagttgt     300
gctttcggcg gagggaccga ggtggtcgtc aaa                                  333
<210>  51
<211>  333
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  51
gcccttgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagttacc      60
atcaagtgcc aggccagtga ggacatttat agcttattgg cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctatgat gcatccgatc tggcatctgg ggtcccatcg     180
cggttcagcg gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccatcagcga cctggagtgt     240
gacgatgctg ccacttacta ctgtcaaggc ggttattata gtggtagtcc tactgataat     300
tctttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc gaa                                  333
<210>  52
<211>  333
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  52
gatgtcgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtca gagcattggt agctatttag cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctattat gcctccactc tggcatctgg ggtctcatcg     180
cggttcaaag gcagtagatc tgggacagag tacacgctca ccatcagcga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaatgt tcttattttg gtagtggtgc tgtcgatagt     300
cctttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc gaa                                  333
<210>  53
<211>  333
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  53
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gctttcggcg gagggaccga ggtggtcgtc aaa                                  333
<210>  54
<211>  330
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  54
gcccttgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctgtggcagg cacagtcacc      60
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cggttaaaag gcagtagatc tgggacagag tacactctca ccatcagcga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaatgt ggttattatg atagtaatta tgggggtgct     300
ttcggcggag ggaccgaggt ggtcgtcaaa                                      330
<210>  55
<211>  324
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  55
gcccaagtgc tgacccagac tccatcttcc gcgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc      60
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gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaaac tattatggta ttagtggtgt cgctttcggc     300
ggagggaccg aggtggtcgt caaa                                            324
<210>  56
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  56
gatgtcgtga tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
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gggcagcctc ccaagctcct gatctacagg gcatccactc tggcatctgg ggtcccatcg     180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccattagcga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaact acttatgttg gtggtagtgg caatgctttc     300
ggcggaggga ccaaggtgga aatcaaa                                         327
<210>  57
<211>  333
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  57
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atcacttgcc aggccagtca gagtgtttat aacaacaact acttatcctg gtttcagcag     120
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tacaaggctt ccattctggc atctggggtc     180
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg     240
cagtgtgacg atgctgccac ttactactgt ctaggcggtt atagtagtcc tagtgatgat     300
gctttcggcg gagggaccaa ggtggtcgtc gaa                                  333
<210>  58
<211>  337
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  58
gatgtcgtga tgacccagac tccatcctcc gtggaggcag gtgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtga gagtagtagt cgtcacttat cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcgtc ccaagctcct gatctactgg gcatccactc tggcatctgg ggtcccatcg     180
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gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagc tattatgggc ttagtaataa tggttggaga     300
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<210>  59
<211>  331
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  59
gccatcaaaa tgacccagac tccatcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
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<210>  60
<211>  331
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  60
gcccttgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtca gagcattggt agtaatttag cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctattct gcatccactc tggcatctgg ggtctcatcg     180
cggttcaaag gcagtagatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaattt acttattatg gtagtagtga tgtcgatgtt     300
ttcggcggag ggaccaaggt ggtcgtcgaa g                                    331
<210>  61
<211>  337
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  61
gaccctgtgc tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
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gacgatgctg ccacttacta ctgtcaaagc tattattata gtgttaccac tagttattcg     300
aatagtttcg gcggagggac cgaggtggtc gtcaaag                              337
<210>  62
<211>  331
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  62
gaccctgtgc tgacccagac tccagcctct gtggaggtac ctgtgggagg cacagtcacc      60
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<210>  63
<211>  337
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  63
gatgtcgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgaac ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtca gagcattagt agctacttaa cctggtatca acagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctacaag gcatccactc tggcatctgg ggtctcatcg     180
cggttcaagg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagt agttattatg gtcctagtga tgttgatttt     300
tctcctttcg gcggagggac tgaggtggaa atcaaag                              337
<210>  64
<211>  331
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  64
gcccttgtga tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacggtcacc      60
atcaggtgcc aggccagtga gaggattggc aatgcattag cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctaccag acatccaaac tgacatctgg ggtcccatcg     180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagaa cacactctca ccatcagcga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagc tattattata ctggcagtat tagttatgaa     300
ttcggcggag ggaccaaggt ggtcgtcgaa g                                    331
<210>  65
<211>  337
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  65
gcccaagtgc tgacccagac tccagcctcc gtggaggcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtca gagtattagt agttacttag cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagctcct gatctacagg gcatccactc tggcatctgg ggtcccatcg     180
cggttcaaag gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcga cctggagtgt     240
gccgatgctg ccacttacta ctgtcaaagt gattattata gtagtagtag caataatggt     300
tttgttttcg gcggagggac cgaggtggtc gtcaaag                              337
<210>  66
<211>  334
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  66
gatgtcgtga tgacccagac tccagcctcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc      60
atcaagtgcc aggccagtga agacatttat agtttattgg cctggtatca gcagaaacca     120
gggcagcctc ccaagttcct gatctatgat gcatccgatc tggcatctgg ggtcccatcg     180
cggttcagcg gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccatcaacga cctgaagtgt     240
gacgatgctg ccacttacta ctgtcaaggc ggttattata gtggtgatgg tactgatata     300
cctttcggcg gagggaccga gctggagatc ctag                                 334
<210>  67
<211>  114
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  67
Glu Gln Leu Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Trp Asp Leu Ser Asp Thr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Cys Ile Tyr Asn Gly Asn Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp
    50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Thr Thr Val Asp Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Val Ala Ala Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser
<210>  68
<211>  122
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  68
Glu Gln Leu Lys Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ser Ala Cys Ile Gly Ala Ser Ser Gly Leu Thr Tyr Phe Ala Ser Trp
    50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Arg Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Tyr Leu Gly Gly Ala Asp Tyr Glu Arg Phe Asn Leu Trp
            100                 105                 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  69
<211>  120
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  69
Gln Lys Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Val Ser Glu Phe Asp Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Ala Gly Lys Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val
    50                  55                  60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Trp Leu Gly Ser Asp Tyr Tyr Phe Asn Phe Trp Gly Pro
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  70
<211>  117
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  70
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Leu Asp Phe Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Asn Thr Ser Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp
    50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Tyr Ile Asn Ser Tyr Phe Gly Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  71
<211>  116
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  71
Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Thr Thr Tyr Trp
            20                  25                  30
Val Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala
        35                  40                  45
Cys Ile Asp Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Tyr Thr Thr Trp Ala Arg Gly
    50                  55                  60
Arg Phe Thr Val Ser Arg Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln Met
65                  70                  75                  80
Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp
                85                  90                  95
Ala His Tyr Thr Tyr Ala Leu Val Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210>  72
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  72
Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Asp Ala Tyr Thr Tyr Phe Ala Ser Trp Ala
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Tyr Ser Gly Tyr Ser Gly Tyr Gly Tyr Ser Asp Leu Trp Gly
            100                 105                 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  73
<211>  119
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  73
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Tyr Thr Gly Asp Gly Ala Asn Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ser Ala Tyr Gly Gly Tyr Gly Tyr Phe Asn Phe Trp Gly Pro Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  74
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  74
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Ala Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Val Ile
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Tyr Val Ile Ser Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
    50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Cys Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp
65                  70                  75                  80
Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Tyr Ser Cys Ser Ser Ala Phe Cys Leu Phe Asn Leu Trp Gly
            100                 105                 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  75
<211>  120
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  75
Gln Lys Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Ala Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Leu
        35                  40                  45
Ala Cys Phe Asp Tyr Ile Ser Asp Ser Ile Trp Tyr Ala Ser Trp Val
    50                  55                  60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Asn Val Gly Asp Gly Tyr Thr Thr Phe Asp Leu Trp Gly Pro
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  76
<211>  117
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  76
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Asn Ala
            20                  25                  30
Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile Ala
        35                  40                  45
Cys Ile Tyr Asn Gly Asp Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Ser Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln
65                  70                  75                  80
Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
                85                  90                  95
Cys Phe Asn Arg Phe Tyr Arg Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  77
<400>  77
000
<210>  78
<400>  78
000
<210>  79
<211>  120
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  79
Lys Gln Leu Val Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Arg Pro Glu Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Asn
            20                  25                  30
Ala Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Tyr Val Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp
    50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Gly Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Pro
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  80
<211>  120
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  80
Gln Glu Gln Leu Val Glu Tyr Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Glu Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Thr
            20                  25                  30
Phe Tyr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Asp Met His Val Gly Ser Ala Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser
    50                  55                  60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Pro Ser Ser Thr Thr Val
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Tyr Val Asn Ser Gly Tyr Tyr Met Asp Ser Trp Gly Pro
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  81
<211>  122
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  81
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser His
            20                  25                  30
Tyr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Cys Ile His Ile Ser Ser Gly Val Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Ala
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Asp Arg Tyr Gly His Gly Gly Tyr Pro Tyr Thr Asp Leu Trp
            100                 105                 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  82
<211>  119
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  82
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Tyr Asn Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Ala Asp Tyr Ala Gly Val Val Leu Asn Leu Trp Gly Pro Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  83
<211>  125
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  83
Gln Leu Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Tyr Gly Ala Val Ser Asp Arg Ile Tyr Phe Ala Ser Trp
    50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Pro Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Ser Tyr Tyr Phe
            100                 105                 110
Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>  84
<211>  120
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  84
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr Tyr
            20                  25                  30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
        35                  40                  45
Ile Ile Tyr Gly Gly Lys Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val Asn
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Tyr Val Ser Ser Ser Gly Tyr Tyr Met Asp Leu Trp Gly Pro
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  85
<211>  116
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  85
Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ser Asn Val
            20                  25                  30
Val Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
        35                  40                  45
Cys Ile Asp Thr Asp Asp Phe Ile Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Asp Ala Gly Tyr Tyr Ala Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210>  86
<211>  125
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  86
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp
    50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Arg Tyr Gly Gly Gly Ser Tyr Tyr Ile Pro Tyr Tyr Phe
            100                 105                 110
Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>  87
<211>  118
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  87
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Glu Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Tyr Arg Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Cys Ile Asp Asn Gly Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val
    50                  55                  60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Ser Ser Gly Tyr Asn Gly Phe Asn Phe Trp Gly Pro Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  88
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  88
Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Gly Ala Ser Ser Gly Leu Thr Asn Tyr Ala Ser Trp Ala
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Arg Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Val Tyr Leu Gly Gly Ala Asp Tyr Glu Gln Phe Asn Leu Trp Gly
            100                 105                 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  89
<211>  125
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  89
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asp Asn
            20                  25                  30
Tyr Trp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Cys Ile Tyr Ile Gly Phe Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser
    50                  55                  60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Val
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Gly Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Val Phe Tyr Val Gly Ser Gly Tyr Trp Tyr Tyr Leu
            100                 105                 110
Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
        115                 120                 125
<210>  90
<211>  117
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  90
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu
        35                  40                  45
Ile Ala Ala Ile Asp Thr Gly Ser Gly Glu Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
    50                  55                  60
Ala Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Pro Tyr Phe Gly Thr Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  91
<211>  121
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  91
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
            20                  25                  30
His Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Ala Cys Ile Tyr Leu Gly Asp Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
    50                  55                  60
Val Asn Gly Arg Phe Ser Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Gly Tyr Asn Leu Ala Ile His Asn Tyr Ile Ile Trp Gly
            100                 105                 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  92
<211>  118
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  92
Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Asp Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ala Trp Ile Asp Gly Gly Ser Ser Gly Glu Ile Tyr Ala Asn Trp Ala
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Cys Ile Trp Ser His Asn Tyr Tyr Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  93
<211>  125
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  93
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu
        35                  40                  45
Ile Ala Cys Ile Tyr Pro Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser
    50                  55                  60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asp Ile Pro Tyr Asn Ile His Gly Tyr Thr Thr Gly Phe
            100                 105                 110
Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>  94
<211>  118
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  94
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Gly Ala Ser Tyr Gly Gly Thr Phe Tyr Ala Ser Trp Ala
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr
                85                  90                  95
Arg Asp Asp Gly Gly Leu Asp Asn Pro Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  95
<211>  123
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  95
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Cys Ile Tyr Ile Gly Ser Gly Thr Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
    50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Lys Gly Trp Ser Asn Ala Trp Gly Phe Tyr Phe Gln Leu
            100                 105                 110
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  96
<211>  122
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  96
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Glu Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
    50                  55                  60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Phe
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asp Gly Val Ser Gly Ser Gly Trp Phe Phe Asn Leu Trp
            100                 105                 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  97
<211>  122
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  97
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Asn Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Cys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Asp Thr Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp
    50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Asp Gly Val Gly Asn Gly Gly Thr Phe Ala Leu Trp
            100                 105                 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  98
<211>  122
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  98
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Phe Thr Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val
    50                  55                  60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Thr Tyr Thr Ala Gly Phe Thr Gly Asp Asn Tyr Phe Asn Leu Trp
            100                 105                 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>  99
<211>  126
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  99
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Gly Pro Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Gly Ala Arg Ser Ser Gly Ser Thr His Tyr Ala Ser Trp
    50                  55                  60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ala Ser Thr Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Tyr Pro Ala Tyr Ala Gly Asp Gly Tyr Ala Leu Tyr Tyr
            100                 105                 110
Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>  100
<211>  111
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  100
Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Ala Ser Glu Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Asp Asn Asp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn Tyr Tyr Ser Gly Ser
                85                  90                  95
Ser Ser Ser Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105                 110
<210>  101
<211>  111
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  101
Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Ala Ser Glu Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Arg
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Met
        35                  40                  45
Phe Asp Ala Ser Ala Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ser Gly Gly
                85                  90                  95
Val Pro Ser Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
            100                 105                 110
<210>  102
<211>  111
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  102
Ala Ile Lys Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65                  70                  75                  80
Asp Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ala Trp Tyr Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Val Asp Met Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu
            100                 105                 110
<210>  103
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  103
Ala Ile Lys Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Asp Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Trp Ser Asn
                85                  90                  95
Val Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>  104
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  104
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Thr Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Ser Tyr Gly Ser Ser
                85                  90                  95
Tyr Val Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105
<210>  105
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  105
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Met
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Glu Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn
                85                  90                  95
Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105                 110
<210>  106
<211>  113
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  106
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Leu
        35                  40                  45
Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr His Tyr Ser Ser Thr
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ala Pro Asn Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile
            100                 105                 110
Leu
<210>  107
<211>  103
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  107
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Leu
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Pro Pro Ala Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Met Lys Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Tyr Phe Gly Ala
                85                  90                  95
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100
<210>  108
<211>  112
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  108
Ala Ile Lys Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn Tyr Gly Ser Tyr Ser
                85                  90                  95
Ser Ser Tyr Gly Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105                 110
<210>  109
<211>  111
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  109
Asp Pro Met Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn
            20                  25                  30
Asp Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
65                  70                  75                  80
Gln Cys Asp Ala Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Ile Asn
                85                  90                  95
Thr Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105                 110
<210>  110
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  110
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Lys Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Arg Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ala Ile
                85                  90                  95
Tyr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>  111
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  111
Ala Ile Lys Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ile Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Thr Ile Tyr Asn
                85                  90                  95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
            100                 105                 110
<210>  112
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  112
Asp Pro Met Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ala
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Arg Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Asp Ser Ser Ala
                85                  90                  95
Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>  113
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  113
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asn Leu
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Tyr Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Trp Ser Ser Ser Asn
                85                  90                  95
Val Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>  114
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  114
Ala Ile Lys Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Asn Glu Ser Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Cys Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn
                85                  90                  95
Val Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105                 110
<210>  115
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  115
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Asn Ala
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Val Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Val Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Trp Tyr Gly Asn Val
                85                  90                  95
Tyr Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105
<210>  116
<211>  111
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  116
Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Asn Glu Asn Ile Tyr Val Asp
            20                  25                  30
Lys Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gly
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
65                  70                  75                  80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Ser Phe Ser Ser
                85                  90                  95
Ser Asp Ser Cys Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105                 110
<210>  117
<211>  111
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  117
Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Tyr Ser Gly Ser
                85                  90                  95
Pro Thr Asp Asn Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
            100                 105                 110
<210>  118
<211>  111
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  118
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Ser Tyr Phe Gly Ser Gly
                85                  90                  95
Ala Val Asp Ser Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
            100                 105                 110
<210>  119
<211>  111
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  119
Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Asp
            20                  25                  30
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Pro Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65                  70                  75                  80
Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser Ala
                85                  90                  95
Asp Ser Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105                 110
<210>  120
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  120
Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Leu Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Gly Tyr Tyr Asp Ser Asn
                85                  90                  95
Tyr Gly Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105                 110
<210>  121
<211>  108
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  121
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Ala Ser Glu Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Gly Glu Ser Val Ser Ser Arg
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Phe Asp Ala Ser Ala Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Thr Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Tyr Gly Ile Ser Gly
                85                  90                  95
Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105
<210>  122
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  122
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ala Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Thr Tyr Val Gly Gly Ser
                85                  90                  95
Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>  123
<211>  111
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  123
Asp Pro Met Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn
            20                  25                  30
Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu
65                  70                  75                  80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Ser
                85                  90                  95
Pro Ser Asp Asp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
            100                 105                 110
<210>  124
<211>  112
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  124
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Glu Ala Gly Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ser Ser Arg His
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Gln Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Gly Leu Ser Asn
                85                  90                  95
Asn Gly Trp Arg Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105                 110
<210>  125
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  125
Ala Ile Lys Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Trp Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Gly Ser Asn
                85                  90                  95
Val Asp Asn Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
            100                 105                 110
<210>  126
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  126
Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Phe Thr Tyr Tyr Gly Ser Ser
                85                  90                  95
Asp Val Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
            100                 105                 110
<210>  127
<211>  112
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  127
Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ile
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro His Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ala Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65                  70                  75                  80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ser Val Thr
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Asn Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105                 110
<210>  128
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  128
Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ser Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Phe Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Tyr Val Asp
                85                  90                  95
Leu Glu Asn Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu
            100                 105                 110
<210>  129
<211>  112
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  129
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ser Tyr Tyr Gly Pro Ser
                85                  90                  95
Asp Val Asp Phe Ser Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>  130
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  130
Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Arg Cys Gln Ala Ser Glu Arg Ile Gly Asn Ala
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gln Thr Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu His Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Tyr Thr Gly Ser
                85                  90                  95
Ile Ser Tyr Glu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Val Glu
            100                 105                 110
<210>  131
<211>  112
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  131
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asp Tyr Tyr Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Ser Asn Asn Gly Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
            100                 105                 110
<210>  132
<211>  111
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  132
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Phe Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Asp Leu Lys Cys
65                  70                  75                  80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Tyr Ser Gly Asp
                85                  90                  95
Gly Thr Asp Ile Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu
            100                 105                 110
<210>  133
<211>  125
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  133
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asp
            20                  25                  30
Tyr Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Cys Ile Tyr Ile Gly Ser Gly Thr Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys His Asn Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Asp Lys Gly Trp Ser Asn Ala Trp Gly Phe Tyr Phe
            100                 105                 110
Gln Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>  134
<211>  110
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  134
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ser Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Tyr Val Asp
                85                  90                  95
Leu Glu Asn Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>  135
<211>  118
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  135
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Trp Val Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Asp Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Tyr Thr Thr Trp Ala Arg
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Thr Asn Thr Leu Phe Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Ala His Tyr Thr Tyr Ala Leu Val Leu Trp Gly Arg Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>  136
<211>  109
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  136
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Tyr Ser Tyr Gly Ser Ser
                85                  90                  95
Tyr Val Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>  137
<211>  375
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  137
gaggtgcagc tcgtagaaag tgggggcggc cttgtgcagc cgggtggtag tcttcgcctg      60
tcctgtgcgg cgagcggatt tacaatatca tccgactact atatgtgctg ggtccgccag     120
gcgcccggaa aaggtttgga atggatcggc tgcatttaca taggatctgg cacagacact     180
tactatgcgg acagcgtgaa aggaagattc actattagca agcacaacag caaaaatact     240
ttgtatctgc agatgaccag cctcagggcc gaggataccg cggtctacta ctgcgctagg     300
gataagggtt ggtcaaacgc atgggggttc tacttccagt tgtggggaca gggaactctt     360
gtcaccgtga gttcc                                                      375
<210>  138
<211>  330
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  138
gacatccaga tgacccagtc tccgtcaagt ctcagtgcct ccgtgggaga ccgggtgact      60
ataacatgcc aagcgtcaca aagtatcggg aagtacctca actggtatca acaaaagcct     120
ggcaaggcac caaagctcct catctattcc agtagttctc tcgcaagtgg cgttccgtcc     180
aggttttctg gctctggatt cggtaccgat ttcacgctca ctatttcaag tttgcagcct     240
gaggattttg ccacttacta ctgtcaacag gggtacagtt atgtggactt ggagaacggc     300
tttggaggcg gaacgaaggt tgaaataaag                                      330
<210>  139
<211>  354
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  139
caagttcagt tggtagaatc tggcggaggt gtggtgcagc ctgggaggtc tctgagattg      60
tcctgcgctg cgagcgggtt taccctcacg acgtattggg tttgctgggt ccggcaggca     120
cctggtaaag ggttggagtg ggtcgcttgc atcgacgctg gctccattac atactatacc     180
acgtgggcgc ggggtagatt tactatttca cgagacaact ctaccaacac tttgttcttg     240
cagatgaatt ccttgcgagc agaggacact gcagtatatt attgtgcgag agacgcacat     300
tatacttacg cactggtgct gtggggtaga ggtactctcg tgacggtttc ttct           354
<210>  140
<211>  327
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  140
gatatacaaa tgacacaaag cccctccagc gtatccgcct ctgtagggga tcgggtgaca      60
atcaagtgtc aagcatccga agatattgaa agctacctcg catggtatca acaaaagcct     120
ggaaaggcgc cgaaattgct tatttatgat gcttccgacc tggcttctgg cgttccaagc     180
cgattctctg gaagcgggag tggaacagac tttacgctga ctataagctc tcttcaaccg     240
gaggacgccg cgacatatta ttgccagggg tattcctatg gctctagcta cgttggtttc     300
gggggaggca ctaaagtcga gattaag                                         327
<210>  141
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成肽
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (2)..(3)
<223>  Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>  141
Asp Xaa Xaa Asp Xaa Asp Xaa Glu
1               5
<210>  142
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成肽
<400>  142
Asp Gly Leu Asp Leu Ala Trp Leu
1               5
<210>  143
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  143
accgtgccag tgttgttctg                                                  20
<210>  144
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  144
agcacctgtg gttgttattt tgt                                              23
<210>  145
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  145
agcacctgtg gttgttattt tgt                                              23
<210>  146
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  146
agtagttccg cactgggtac a                                                21
<210>  147
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  147
tgtcatctgt gaaaaggtgg tc                                               22
<210>  148
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  148
actggagcag cggtgttatg                                                  20
<210>  149
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  149
gtggcgttga catcgttgg                                                   19
<210>  150
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  150
ctatgtactt cgtatgcagg tcg                                              23
<210>  151
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  151
gtgatgctca ggtatccatc ca                                               22
<210>  152
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  152
cacagttctc aaagcacagc g                                                21
<210>  153
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  153
agggcctcca tctggactg                                                   19
<210>  154
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  154
gtggttctgg taatcatgct ctg                                              23
<210>  155
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  155
ccagactttt gctactggga c                                                21
<210>  156
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  156
gcttgttcgg cagtgataga g                                                21
<210>  157
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  157
ctctttgggg acgacttcat c                                                21
<210>  158
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成引物
<400>  158
tcccgagaat ggagaaggaa c                                                21
<210>  159
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  159
Gly Trp Asp Leu Ser Asp Thr Tyr
1               5
<210>  160
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  160
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Tyr
1               5
<210>  161
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  161
Glu Phe Asp Phe Ser Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  162
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  162
Gly Leu Asp Phe Ser Ser Ser Tyr Trp
1               5
<210>  163
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  163
Gly Phe Thr Leu Thr Thr Tyr Trp
1               5
<210>  164
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  164
Gly Phe Ser Phe Ser Asn Asn Asn Tyr
1               5
<210>  165
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  165
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp
1               5
<210>  166
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  166
Gly Phe Ser Phe Ser Gly Ala Tyr Trp
1               5
<210>  167
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  167
Gly Phe Asp Phe Ser Ser Asn Ala
1               5
<210>  168
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  168
Gly Phe Asp Phe Ser Ser Asn Ala
1               5
<210>  169
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  169
Gly Leu Thr Leu Ser Arg Tyr Trp
1               5
<210>  170
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  170
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp
1               5
<210>  171
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  171
Gly Phe Asp Phe Ser Arg Asn Ala
1               5
<210>  172
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  172
Gly Phe Thr Ile Ser Ser Thr Phe Tyr
1               5
<210>  173
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  173
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser His Tyr
1               5
<210>  174
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  174
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  175
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  175
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Tyr
1               5
<210>  176
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  176
Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  177
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  177
Gly Ile Asp Phe Ser Ser Asn Val
1               5
<210>  178
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  178
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  179
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  179
Gly Phe Ser Phe Ser Tyr Arg Tyr Tyr
1               5
<210>  180
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  180
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Tyr
1               5
<210>  181
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  181
Gly Phe Ser Phe Ser Asp Asn Tyr Trp
1               5
<210>  182
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  182
Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr Tyr Tyr
1               5
<210>  183
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  183
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser His Tyr
1               5
<210>  184
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  184
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asp Tyr Asp
1               5
<210>  185
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  185
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp
1               5
<210>  186
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  186
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Trp
1               5
<210>  187
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  187
Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asp Tyr Tyr
1               5
<210>  188
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  188
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Trp
1               5
<210>  189
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  189
Gly Phe Ser Phe Ser Asn Asn Tyr Trp
1               5
<210>  190
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  190
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  191
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  191
Gly Phe Ser Phe Ser Gly Pro Tyr Trp
1               5
<210>  192
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  192
Cys Ile Tyr Asn Gly Asn Gly
1               5
<210>  193
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  193
Ile Gly Ala Ser Ser Gly Leu
1               5
<210>  194
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  194
Ile Tyr Ala Gly Lys Gly Asp Thr
1               5
<210>  195
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  195
Ile Asn Thr Ser Ser Gly Ser
1               5
<210>  196
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  196
Ile Asp Ala Gly Ser Ile Thr
1               5
<210>  197
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  197
Ile Tyr Thr Gly Asp Ala Tyr Thr
1               5
<210>  198
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  198
Ile Tyr Thr Gly Asp Gly Ala Asn
1               5
<210>  199
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  199
Ile Tyr Val Ile Ser Ser Ser Asn Thr
1               5
<210>  200
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  200
Phe Asp Tyr Ile Ser Asp Ser Ile
1               5
<210>  201
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  201
Ile Tyr Asn Gly Asp Ala Ser Thr
1               5
<210>  202
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  202
Ile Asp Ala Gly Ser Ile Thr
1               5
<210>  203
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  203
Ile Asp Ala Gly Ser Ser Glu Ser Thr
1               5
<210>  204
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  204
Ile Asp Ala Gly Ser Ser Glu Ser Thr
1               5
<210>  205
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  205
Met His Val Gly Ser Ala Thr Thr Thr
1               5
<210>  206
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  206
Ile His Ile Ser Ser Gly Val Thr
1               5
<210>  207
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  207
Ile Tyr Asn Gly Asp Gly Ser Thr
1               5
<210>  208
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  208
Ile Tyr Gly Ala Val Ser Asp Arg Ile
1               5
<210>  209
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  209
Ile Tyr Gly Gly Lys Gly Thr Thr
1               5
<210>  210
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  210
Ile Asp Thr Asp Asp Phe Ile Gly Thr
1               5
<210>  211
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  211
Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  212
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  212
Ile Asp Asn Gly Asp Gly Asp Thr
1               5
<210>  213
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  213
Ile Gly Ala Ser Ser Gly Leu Thr
1               5
<210>  214
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  214
Ile Tyr Ile Gly Phe Ser Gly Thr Thr
1               5
<210>  215
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  215
Ile Asp Thr Gly Ser Gly Glu Thr
1               5
<210>  216
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  216
Ile Tyr Leu Gly Asp Asp Ser Thr
1               5
<210>  217
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  217
Ile Asp Gly Gly Ser Ser Gly Glu Ile
1               5
<210>  218
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  218
Ile Tyr Pro Ser Ser Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  219
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  219
Ile Gly Ala Ser Tyr Gly Gly Thr
1               5
<210>  220
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  220
Ile Tyr Ile Gly Ser Gly Thr Asp Thr
1               5
<210>  221
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  221
Ile Tyr Ala Gly Gly Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  222
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  222
Ile Tyr Ala Gly Asp Thr Gly Thr Ala
1               5
<210>  223
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  223
Ile Phe Thr Gly Gly Val Ser Thr
1               5
<210>  224
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  224
Ile Gly Ala Arg Ser Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  225
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  225
Ala Arg Gly Val Ala Ala Asp Leu
1               5
<210>  226
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  226
Ala Arg Val Tyr Leu Gly Gly Ala Asp Tyr Glu Arg Phe Asn Leu
1               5                   10                  15
<210>  227
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  227
Ala Arg Gly Trp Leu Gly Ser Asp Tyr Tyr Phe Asn Phe
1               5                   10
<210>  228
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  228
Ala Lys Tyr Ile Asn Ser Tyr Phe Gly Leu
1               5                   10
<210>  229
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  229
Ala Arg Asp Ala His Tyr Thr Tyr Ala Leu Val Leu
1               5                   10
<210>  230
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  230
Ala Arg Gly Tyr Ser Gly Tyr Ser Gly Tyr Gly Tyr Ser Asp Leu
1               5                   10                  15
<210>  231
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  231
Ala Arg Ser Ala Tyr Gly Gly Tyr Gly Tyr Phe Asn Phe
1               5                   10
<210>  232
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  232
Ala Arg Tyr Ser Cys Ser Ser Ala Phe Cys Leu Phe Asn Leu
1               5                   10
<210>  233
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  233
Ala Arg Asp Asn Val Gly Asp Gly Tyr Thr Thr Phe Asp Leu
1               5                   10
<210>  234
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  234
Ala Arg Cys Phe Asn Arg Phe Tyr Arg Gly Asp Leu
1               5                   10
<210>  235
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  235
Ala Arg Asp Ala Asp Tyr Thr Tyr Ala Leu Val Leu
1               5                   10
<210>  236
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  236
Ala Arg Asp Ser Arg Val Val Ala Gly Val Gly Met Tyr Leu Asn Leu
1               5                   10                  15
<210>  237
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  237
Ala Gly Ser Pro Tyr Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Asn Leu
1               5                   10
<210>  238
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  238
Ala Arg Tyr Val Asn Ser Gly Tyr Tyr Met Asp Ser
1               5                   10
<210>  239
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  239
Ala Arg Asp Asp Arg Tyr Gly His Gly Gly Tyr Pro Tyr Thr Asp Leu
1               5                   10                  15
<210>  240
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  240
Ala Arg Asp Ala Asp Tyr Ala Gly Val Val Leu Asn Leu
1               5                   10
<210>  241
<211>  18
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  241
Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Ser Tyr Tyr Phe
1               5                   10                  15
Asn Leu
<210>  242
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  242
Ala Arg Asp Tyr Val Ser Ser Ser Gly Tyr Tyr Met Asp Leu
1               5                   10
<210>  243
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  243
Ala Arg Gly Asp Ala Gly Tyr Tyr Ala Leu
1               5                   10
<210>  244
<211>  18
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  244
Ala Arg Asp Arg Tyr Gly Gly Gly Ser Tyr Tyr Ile Pro Tyr Tyr Phe
1               5                   10                  15
Asp Leu
<210>  245
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  245
Ala Arg Gly Ser Ser Gly Tyr Asn Gly Phe Asn Phe
1               5                   10
<210>  246
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  246
Ala Arg Val Tyr Leu Gly Gly Ala Asp Tyr Glu Gln Phe Asn Leu
1               5                   10                  15
<210>  247
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  247
Ala Arg Gly Val Phe Tyr Val Gly Ser Gly Tyr Trp Tyr Tyr Leu Asn
1               5                   10                  15
Leu
<210>  248
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  248
Ala Arg Asp Pro Tyr Phe Gly Thr Asn Leu
1               5                   10
<210>  249
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  249
Ala Arg His Gly Tyr Asn Leu Ala Ile His Asn Tyr Ile Ile
1               5                   10
<210>  250
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  250
Ala Arg Cys Ile Trp Ser His Asn Tyr Tyr Asp Leu
1               5                   10
<210>  251
<211>  17
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  251
Ala Arg Asp Ile Pro Tyr Asn Ile His Gly Tyr Thr Thr Gly Phe Asn
1               5                   10                  15
Leu
<210>  252
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  252
Thr Arg Asp Asp Gly Gly Leu Asp Asn Pro Asn Leu
1               5                   10
<210>  253
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  253
Ala Arg Asp Lys Gly Trp Ser Asn Ala Trp Gly Phe Tyr Phe Gln Leu
1               5                   10                  15
<210>  254
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  254
Ala Arg Asp Gly Val Ser Gly Ser Gly Trp Phe Phe Asn Leu
1               5                   10
<210>  255
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  255
Ala Arg Asp Gly Asp Gly Val Gly Asn Gly Gly Thr Phe Ala Leu
1               5                   10                  15
<210>  256
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  256
Ala Arg Thr Tyr Thr Ala Gly Phe Thr Gly Asp Asn Tyr Phe Asn Leu
1               5                   10                  15
<210>  257
<211>  19
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  257
Ala Arg Ser Tyr Pro Ala Tyr Ala Gly Asp Gly Tyr Ala Leu Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Phe Asn Leu
<210>  258
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  258
Glu Ser Ile Asp Asn Asp
1               5
<210>  259
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  259
Glu Ser Ile Ser Ser Arg
1               5
<210>  260
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  260
Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
1               5
<210>  261
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  261
Gln Asn Ile Tyr Ser Asn
1               5
<210>  262
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  262
Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
1               5
<210>  263
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  263
Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr
1               5
<210>  264
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  264
Glu Asp Ile Tyr Ser Leu
1               5
<210>  265
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  265
Gln Ser Val Ser Asn Leu
1               5
<210>  266
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  266
Gln Ser Ile Ser Ser Trp
1               5
<210>  267
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  267
Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asp Trp
1               5
<210>  268
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  268
Glu Asp Ile Glu Ser Tyr
1               5
<210>  269
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  269
Gln Ser Ile Gly Ile Tyr
1               5
<210>  270
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  270
Gln Ser Ile Ser Thr Ala
1               5
<210>  271
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  271
Gln Thr Ile Ser Asn Leu
1               5
<210>  272
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  272
Glu Ser Ile Ser Ser Trp
1               5
<210>  273
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  273
Glu Ser Ile Gly Asn Ala
1               5
<210>  274
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  274
Glu Asn Ile Tyr Val Asp Lys Tyr
1               5
<210>  275
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  275
Glu Asp Ile Tyr Ser Leu
1               5
<210>  276
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  276
Gln Ser Ile Gly Ser Tyr
1               5
<210>  277
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  277
Gln Asn Ile Tyr Val Asp Ser Tyr
1               5
<210>  278
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  278
Gln Ser Ile Gly Ser Tyr
1               5
<210>  279
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  279
Glu Ser Val Ser Ser Arg
1               5
<210>  280
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  280
Gln Ser Ile Ala Ser Tyr
1               5
<210>  281
<211>  8
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  281
Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Tyr
1               5
<210>  282
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  282
Glu Ser Ser Ser Arg His
1               5
<210>  283
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  283
Glu Asp Ile Glu Asn Tyr
1               5
<210>  284
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  284
Gln Ser Ile Gly Ser Asn
1               5
<210>  285
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  285
Gln Ser Ile Gly Ser Ile
1               5
<210>  286
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  286
Gln Ser Ile Gly Lys Tyr
1               5
<210>  287
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  287
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210>  288
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  288
Glu Arg Ile Gly Asn Ala
1               5
<210>  289
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  289
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1               5
<210>  290
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  290
Glu Asp Ile Tyr Ser Leu
1               5
<210>  291
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  291
Gln Ser Asn Tyr Tyr Ser Gly Ser Ser Ser Ser Tyr Gly
1               5                   10
<210>  292
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  292
Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ser Gly Gly Val Pro Ser Tyr Gly
1               5                   10
<210>  293
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  293
Gln Gly Ala Trp Tyr Ser Ser Ser Val Asp Met Tyr Ala
1               5                   10
<210>  294
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  294
Gln Gln Asp Tyr Ser Trp Ser Asn Val Asp Asn Val
1               5                   10
<210>  295
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  295
Gln Gly Tyr Ser Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly
1               5                   10
<210>  296
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  296
Gln Gln Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Ile Asp Asn Ala
1               5                   10
<210>  297
<211>  15
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  297
Gln Asn Tyr His Tyr Ser Ser Thr Thr Ser Tyr Ala Pro Asn Pro
1               5                   10                  15
<210>  298
<211>  5
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  298
Gln Ser Gly Tyr Tyr
1               5
<210>  299
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  299
Gln Ser Asn Tyr Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr Gly Tyr Ala
1               5                   10
<210>  300
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  300
Ala Gly Asp Tyr Ile Asn Thr Ile Asp Asn Ala
1               5                   10
<210>  301
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  301
Gln Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ala Ile Tyr Val Ala
1               5                   10
<210>  302
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  302
Gln Gln Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Val Asp Asn Thr
1               5                   10
<210>  303
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  303
Gln Ser Tyr Tyr Asp Ser Ser Ala Gly Asn Thr
1               5                   10
<210>  304
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  304
Gln Gln Gly Trp Ser Ser Ser Asn Val Asp Asn Val
1               5                   10
<210>  305
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  305
Gln Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn Val Gly Asn Ala
1               5                   10
<210>  306
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  306
Gln Cys Thr Trp Tyr Gly Asn Val Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  307
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  307
Ala Gly Ser Phe Ser Ser Ser Asp Ser Cys Ala
1               5                   10
<210>  308
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  308
Gln Gly Gly Tyr Tyr Ser Gly Ser Pro Thr Asp Asn Ser
1               5                   10
<210>  309
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  309
Gln Cys Ser Tyr Phe Gly Ser Gly Ala Val Asp Ser Pro
1               5                   10
<210>  310
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  310
Ala Gly Gly Tyr Ser Ala Asp Ser Asp Asn Ala
1               5                   10
<210>  311
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  311
Gln Cys Gly Tyr Tyr Asp Ser Asn Tyr Gly Gly Ala
1               5                   10
<210>  312
<211>  10
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  312
Gln Asn Tyr Tyr Gly Ile Ser Gly Val Ala
1               5                   10
<210>  313
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  313
Gln Thr Thr Tyr Val Gly Gly Ser Gly Asn Ala
1               5                   10
<210>  314
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  314
Leu Gly Gly Tyr Ser Ser Pro Ser Asp Asp Ala
1               5                   10
<210>  315
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  315
Gln Ser Tyr Tyr Gly Leu Ser Asn Asn Gly Trp Arg Tyr Ala
1               5                   10
<210>  316
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  316
Gln Gln Gly Tyr Ser Gly Ser Asn Val Asp Asn Phe
1               5                   10
<210>  317
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  317
Gln Phe Thr Tyr Tyr Gly Ser Ser Asp Val Asp Val
1               5                   10
<210>  318
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  318
Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ser Val Thr Thr Ser Tyr Ser Asn Ser
1               5                   10
<210>  319
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  319
Gln Gln Gly Tyr Ser Tyr Val Asp Leu Glu Asn Gly
1               5                   10
<210>  320
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  320
Gln Ser Ser Tyr Tyr Gly Pro Ser Asp Val Asp Phe Ser Pro
1               5                   10
<210>  321
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  321
Gln Ser Tyr Tyr Tyr Thr Gly Ser Ile Ser Tyr Glu
1               5                   10
<210>  322
<211>  14
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  322
Gln Ser Asp Tyr Tyr Ser Ser Ser Ser Asn Asn Gly Phe Val
1               5                   10
<210>  323
<211>  13
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  323
Gln Gly Gly Tyr Tyr Ser Gly Asp Gly Thr Asp Ile Pro
1               5                   10
<210>  324
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  324
gggtgggact taagtgatac ctactgg                                          27
<210>  325
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  325
atttataatg gtaatggtga cact                                             24
<210>  326
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  326
gcgagaggag tggctgcgga cttg                                             24
<210>  327
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  327
gagagcattg ataatgat                                                    18
<210>  328
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  328
caaagtaatt attatagtgg tagtagtagt agttatggt                             39
<210>  329
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  329
ggattctcct tcagtagcgg ctattac                                          27
<210>  330
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  330
attggtgcta gtagtggact cact                                             24
<210>  331
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  331
gcgagagtct atcttggtgg tgctgattat gagcgattta atttg                      45
<210>  332
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  332
gagagcatta gtagtaga                                                    18
<210>  333
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  333
caaagttatt attatagtgg tggggttcct agttatggt                             39
<210>  334
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  334
gaattcgact tcagtagcta ctac                                             24
<210>  335
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  335
atttatgctg gtaaaggtga caca                                             24
<210>  336
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  336
gcgagagggt ggctggggtc cgattactac tttaacttt                             39
<210>  337
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  337
gaggacattg aaagctat                                                    18
<210>  338
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  338
ggtgcttggt atagtagtag tgttgatatg tatgct                                36
<210>  339
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  339
gggttagact tcagtagcag ctactgg                                          27
<210>  340
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  340
attaatacta gtagtggtag caca                                             24
<210>  341
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  341
gcgaaatata ttaatagtta tttcggcttg                                       30
<210>  342
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  342
cagaacattt acagcaat                                                    18
<210>  343
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  343
caacaggatt atagttggag taatgttgat aatgtt                                36
<210>  344
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  344
ggattcaccc tcactaccta ctgg                                             24
<210>  345
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  345
attgatgctg gtagtatcac t                                                21
<210>  346
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  346
gcgagagatg ctcattatac ttatgccctt gtcttg                                36
<210>  347
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  347
gaggacattg aaagttat                                                    18
<210>  348
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  348
caaggctatt cttatggtag tagttatgtt ggt                                   33
<210>  349
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  349
ggattctcct tcagtaataa taactac                                          27
<210>  350
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  350
atttatactg gtgatgctta cact                                             24
<210>  351
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  351
gcgagaggtt acagtggtta tagtggttat ggttattccg acttg                      45
<210>  352
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  352
cagagcattt acagctac                                                    18
<210>  353
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  353
caacagggtt atactagtta taatattgac aatgct                                36
<210>  354
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  354
ggattctcct tcagtagcag ctactgg                                          27
<210>  355
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  355
atttatactg gtgatggtgc taat                                             24
<210>  356
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  356
gcgagatctg cttatggtgg ttatggttat tttaacttc                             39
<210>  357
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  357
gaggacattt atagctta                                                    18
<210>  358
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  358
caaaactatc attatagtag tactactagt tatgccccca atcct                      45
<210>  359
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  359
ggattctcct tcagtggtgc ctactgg                                          27
<210>  360
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  360
atttatgtga ttagtagtag taacact                                          27
<210>  361
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  361
gcgagatatt cttgtagtag tgctttttgc ctttttaact tg                         42
<210>  362
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  362
cagagtgtta gcaacctc                                                    18
<210>  363
<211>  15
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  363
caaagtggtt attac                                                       15
<210>  364
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  364
ggattcgact tcagtagcaa tgca                                             24
<210>  365
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  365
tttgattata ttagtgatag tata                                             24
<210>  366
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  366
gcgagagaca atgttggtga tggttatact acatttgact tg                         42
<210>  367
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  367
cagagcatta gcagttgg                                                    18
<210>  368
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  368
caaagcaatt atggtagtta tagtagtagt tatggatatg ct                         42
<210>  369
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  369
ggattcgact tcagtagcaa tgca                                             24
<210>  370
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  370
atttataatg gtgatgccag taca                                             24
<210>  371
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  371
gcgagatgtt ttaatagatt ttacagagga gacttg                                36
<210>  372
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  372
cagagtgttt atgataacga ctgg                                             24
<210>  373
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  373
gcaggcgact atattaatac tattgataat gct                                   33
<210>  374
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  374
ggactcaccc tcagtagata ctgg                                             24
<210>  375
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  375
attgatgctg gtagtatcac t                                                21
<210>  376
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  376
gcgagagatg ctgattatac ttatgcactt gtcttg                                36
<210>  377
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  377
gaggacattg aaagctat                                                    18
<210>  378
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  378
caaggctatt attatggtgc tatttatgtt gct                                   33
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<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  379
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<210>  380
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  380
attgatgctg gtagtagtga gagcact                                          27
<210>  381
<211>  48
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  381
gcgagagatt ctagggtagt ggctggggtg gggatgtact tgaatttg                   48
<210>  382
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  382
cagagcattg gtatctac                                                    18
<210>  383
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  383
caacagggtg atactattta taatgttgat aatact                                36
<210>  384
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  384
ggattcgact tcagtagaaa tgca                                             24
<210>  385
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  385
atttatgttg gtagtggtgg tggcact                                          27
<210>  386
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  386
gcgggatccc cctattctgg ttatggctac tttaacttg                             39
<210>  387
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<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  387
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<210>  388
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  388
caaagctatt atgatagtag tgctggtaat act                                   33
<210>  389
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  389
ggattcacca tcagtagtac tttctac                                          27
<210>  390
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  390
atgcatgttg gtagtgctac taccact                                          27
<210>  391
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<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  391
gcgagatatg ttaatagtgg ttattatatg gactcg                                36
<210>  392
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<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  392
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<210>  393
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  393
caacagggtt ggagtagtag taatgttgat aatgtt                                36
<210>  394
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<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  394
ggattctcct tcagtagcag ccactat                                          27
<210>  395
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  395
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<210>  396
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<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  396
gcgagagacg atcgttatgg tcatggtggt tatccttata ctgacttg                   48
<210>  397
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  397
gagagcatta gcagttgg                                                    18
<210>  398
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  398
caatctactt attataatga gaatgttgga aatgcg                                36
<210>  399
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  399
ggattctcct tcagtagcag ctactac                                          27
<210>  400
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  400
atttataatg gtgatggcag caca                                             24
<210>  401
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  401
gcgagagatg ctgattatgc tggcgtggtg ctcaacttg                             39
<210>  402
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  402
gagagcattg gcaatgca                                                    18
<210>  403
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  403
caatgtactt ggtatggtaa tgtctatctt gct                                   33
<210>  404
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  404
caatgtactt ggtatggtaa tgtctatctt gct                                   33
<210>  405
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  405
atttatggtg ctgttagtga taggatt                                          27
<210>  406
<211>  54
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  406
gcgagagata gttatagtgg tagtacttat tatagatcat actactttaa cttg            54
<210>  407
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  407
gaaaatattt atgtagacaa atac                                             24
<210>  408
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  408
gcagggagtt ttagtagtag tgatagttgt gct                                   33
<210>  409
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  409
ggattcgact tcagtagtta ctac                                             24
<210>  410
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  410
atttatggtg gtaaaggtac caca                                             24
<210>  411
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  411
gcgagagact atgttagtag tagtggttat tatatggact tg                         42
<210>  412
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  412
gaggacattt atagctta                                                    18
<210>  413
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  413
caaggcggtt attatagtgg tagtcctact gataattct                             39
<210>  414
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  414
ggaatcgact tcagtagcaa tgta                                             24
<210>  415
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  415
attgatactg atgattttat tggcact                                          27
<210>  416
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  416
gcgaggggag atgctggtta ctatgccttg                                       30
<210>  417
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  417
cagagcattg gtagctat                                                    18
<210>  418
<211>  39
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  418
caatgttctt attttggtag tggtgctgtc gatagtcct                             39
<210>  419
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  419
ggattctcct tcagtagcag ctactac                                          27
<210>  420
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  420
atttatgctg gtagtagtgg tagcaca                                          27
<210>  421
<211>  54
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  421
gcgagagacc gttatggtgg tggttcttat tatatacctt actactttga cttg            54
<210>  422
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  422
cagaacattt atgtcgacag ctac                                             24
<210>  423
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  423
gcaggcggtt atagtgctga ttcggataat gct                                   33
<210>  424
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  424
ggattctcct tcagttacag gtactac                                          27
<210>  425
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  425
attgataatg gtgatggcga caca                                             24
<210>  426
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  426
gcgagaggga gtagtggtta taatggcttt aacttc                                36
<210>  427
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  427
cagagcattg gtagctac                                                    18
<210>  428
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  428
caatgtggtt attatgatag taattatggg ggtgct                                36
<210>  429
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  429
ggattctcct tcagtagcgg ctactac                                          27
<210>  430
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  430
attggtgcta gtagtggact cact                                             24
<210>  431
<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  431
gcgagagtct atcttggtgg tgctgattat gagcaattta atttg                      45
<210>  432
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  432
gagagcgtta gtagtaga                                                    18
<210>  433
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  433
caaaactatt atggtattag tggtgtcgct                                       30
<210>  434
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  434
ggattctcct tcagtgacaa ctactgg                                          27
<210>  435
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  435
atttatattg gttttagtgg taccact                                          27
<210>  436
<211>  51
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  436
gcgagagggg ttttttatgt tggtagtggt tattggtact acttgaactt g               51
<210>  437
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  437
cagagcattg ctagttac                                                    18
<210>  438
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  438
caaactactt atgttggtgg tagtggcaat gct                                   33
<210>  439
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  439
ggattcgact tcagtagcta ctactac                                          27
<210>  440
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  440
attgatactg gtagtggtga gact                                             24
<210>  441
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  441
gcgagagatc cctattttgg cactaactta                                       30
<210>  442
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  442
cagagtgttt ataacaacaa ctac                                             24
<210>  443
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  443
ctaggcggtt atagtagtcc tagtgatgat gct                                   33
<210>  444
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  444
ggattctcct tcagtagcag ccactat                                          27
<210>  445
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  445
atttatcttg gtgatgacag caca                                             24
<210>  446
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  446
gcgagacatg gatataatct tgctattcat aattatatta ta                         42
<210>  447
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  447
gagagtagta gtcgtcac                                                    18
<210>  448
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  448
caaagctatt atgggcttag taataatggt tggagatatg ct                         42
<210>  449
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  449
ggattctcct tcagtagcga ctacgac                                          27
<210>  450
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
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<223>  合成抗体
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<210>  453
<211>  36
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<223>  合成抗体
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atttatccta gtagtagtgg tagcact                                          27
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<223>  合成抗体
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<223>  合成抗体
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<210>  458
<211>  36
<212>  DNA
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<223>  合成抗体
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caatttactt attatggtag tagtgatgtc gatgtt                                36
<210>  459
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ggattctcct tcagtagcgg ctactgg                                          27
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<223>  合成抗体
<400>  460
attggtgcta gttatggtgg cact                                             24
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<223>  合成抗体
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acgagagatg atggtggtct tgataatcct aatttg                                36
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<223>  合成抗体
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<212>  DNA
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<223>  合成抗体
<400>  463
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<223>  合成抗体
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<210>  465
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<213>  人工序列
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<223>  合成抗体
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atttatattg gtagtggtac tgatact                                          27
<210>  466
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<213>  人工序列
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<223>  合成抗体
<400>  466
gcgagagata agggatggtc taatgcctgg ggtttctact ttcagttg                   48
<210>  467
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<220>
<223>  合成抗体
<400>  467
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<210>  468
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  468
caacagggtt atagttatgt tgatcttgaa aatggt                                36
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<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  469
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<210>  470
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  470
atttatgctg gtggtagtgg tagcact                                          27
<210>  471
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  471
gcgagagatg gtgttagtgg tagtggttgg ttctttaact tg                         42
<210>  472
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<220>
<223>  合成抗体
<400>  472
cagagcatta gtagctac                                                    18
<210>  473
<211>  42
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<223>  合成抗体
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<223>  合成抗体
<400>  474
ggattctcct tcagtaacaa ctactgg                                          27
<210>  475
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<212>  DNA
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<223>  合成抗体
<400>  475
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<400>  476
gcgagagatg gggatggtgt tgggaatggt ggtacttttg ccttg                      45
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<223>  合成抗体
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<223>  合成抗体
<400>  481
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<223>  合成抗体
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<213>  人工序列
<220>
<223>  合成抗体
<400>  484
ggattctcct tcagtggccc ctactgg                                          27
<210>  485
<211>  27
<212>  DNA
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<220>
<223>  合成抗体
<400>  485
attggtgctc gtagtagtgg tagcact                                          27
<210>  486
<211>  57
<212>  DNA
<213>  人工序列
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<223>  合成抗体
<400>  486
gcgagatcgt atcctgctta tgctggtgac ggttatgccc tatactactt taacttg         57
<210>  487
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
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<223>  合成抗体
<400>  487
gaagacattt atagttta                                                    18
<210>  488
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<212>  DNA
<213>  人工序列
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<223>  合成抗体
<400>  488
caaggcggtt attatagtgg tgatggtact gatatacct                             39

Claims (55)

1.分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含来自表A中的克隆配对的重链和轻链CDR。
2.权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其片段由来自图24、25和29的克隆配对的重链和轻链序列编码。
3.权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其片段由与来自图24、25和29的克隆配对序列具有至少70％、80％、90％或95％同一性的重链和轻链可变序列编码。
4.权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其片段包含来自图26、27和28的克隆配对的重链和轻链序列。
5.权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其片段包含与来自图26、27和28的克隆配对序列具有至少70％、80％、90％或95％同一性的重链和轻链可变序列。
6.权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体是鼠、啮齿动物或兔的。
7.权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体是人源化或人抗体。
8.权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是重组ScFv(单链可变片段)抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或Fv片段。
9.权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体是双特异性抗体或嵌合抗体。
10.权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG或重组IgG抗体或抗体片段，其包含Fc部分，所述Fc部分突变成改变(消除或增强)FcR相互作用、提高半衰期和/或提高治疗效力，例如LALA、N297、GASD/ALIE、YTE或LS突变；或者经聚糖修饰成改变(消除或增强)FcR相互作用，例如酶促或化学添加或去除聚糖或在用限定的糖基化模式改造的细胞系中表达。
11.分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与根据权利要求1至10中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争同一表位。
12.药物组合物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及可药用载体。
13.分离的核酸，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的分离的单克隆抗体。
14.载体，其包含权利要求13所述的分离的核酸。
15.宿主细胞，其包含权利要求14所述的载体。
16.权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
17.权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
18.杂交瘤，其编码或产生根据权利要求1至11中任一项所述的分离的单克隆抗体。
19.产生抗体的方法，其包括在适用于表达所述抗体的条件下培养权利要求15所述的宿主细胞，以及回收所述抗体。
20.嵌合抗原受体(CAR)蛋白，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的抗原结合片段。
21.分离的核酸，其编码权利要求20所述的CAR蛋白。
22.载体，其包含权利要求21所述的分离的核酸。
23.经改造的细胞，其包含权利要求21所述的分离的核酸。
24.权利要求23所述的经改造的细胞，其中所述细胞是T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
25.在对象中治疗癌症或减轻癌症的影响的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者权利要求23或24所述的经改造的细胞。
26.权利要求25所述的方法，其中所述方法降低或根除所述对象中的肿瘤负荷。
27.权利要求25所述的方法，其中所述方法降低肿瘤细胞的数量。
28.权利要求25所述的方法，其中所述方法降低肿瘤的尺寸。
29.权利要求25所述的方法，其中所述方法根除所述对象中的肿瘤。
30.权利要求25所述的方法，其中所述癌症是实体瘤癌症，例如肺癌、脑癌、皮肤癌、头颈癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、睾丸癌、宫颈癌、乳腺癌或子宫癌。
31.权利要求30所述的方法，其中所述癌症是恶性血液病，例如骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性肿瘤、慢性粒-单核细胞白血病(CMML)、慢性粒细胞白血病、或急性髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)或M3 AML、急性粒-单核细胞白血病或M4 AML、急性单核细胞白血病或M5 AML、急性粒细胞白血病或真性红细胞增多症。
32.权利要求25所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段静脉内、动脉内、瘤内或皮下施用。
33.权利要求25所述的方法，其还包括向所述对象施用第二抗癌治疗，例如一种或更多种选自以下的药物：拓扑异构酶抑制剂；蒽环类拓扑异构酶抑制剂；蒽环类；柔红霉素；核苷代谢抑制剂；阿糖胞苷；低甲基化剂；低剂量阿糖胞苷(LDAC)；柔红霉素与阿糖胞苷的组合；注射用柔红霉素阿糖胞苷脂质体，
Figure FDA0003998997940000031
阿扎胞苷，
Figure FDA0003998997940000032
地西他滨；全反式视黄酸(ATRA)；砷；三氧化二砷；组胺二盐酸盐，
Figure FDA0003998997940000033
白介素-2；阿地白介素，
Figure FDA0003998997940000034
吉妥单抗奥唑米星，
Figure FDA0003998997940000037
FLT-3抑制剂；米哚妥林，
Figure FDA0003998997940000035
氯法拉滨；法呢基转移酶抑制剂；地西他滨；IDH1抑制剂；艾伏尼布，
Figure FDA0003998997940000036
IDH2抑制剂；恩西地平，
Figure FDA0003998997940000038
smoothened(SMO)抑制剂；格拉吉布；精氨酸酶抑制剂；IDO抑制剂；艾卡哚司他；BCL-2抑制剂；维奈托克，
Figure FDA0003998997940000039
铂复合物衍生物；奥沙利铂；激酶抑制剂；酪氨酸激酶抑制剂；PI3激酶抑制剂；BTK抑制剂；依鲁替尼，
Figure FDA00039989979400000310
阿卡替尼，
Figure FDA00039989979400000311
泽布替尼；PD-1抗体；PD-L1抗体；CTLA-4抗体；LAG3抗体；ICOS抗体；TIGIT抗体；TIM3抗体；CD40抗体；4-1BB抗体；CD47抗体；SIRP1α抗体或融合蛋白；E-选择素的拮抗剂；与肿瘤抗原结合的抗体；与T细胞表面标志物结合的抗体；与骨髓细胞或NK细胞表面标志物结合的抗体；烷基化剂；亚硝基脲剂；抗代谢物；抗肿瘤抗生素；来源于植物的生物碱；激素治疗药物；激素拮抗剂；芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。
34.权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段还包含与其连接的抗肿瘤药物。
35.权利要求34所述的方法，其中所述抗肿瘤药物通过光不稳定接头与所述抗体连接。
36.权利要求34所述的方法，其中所述抗肿瘤药物通过酶促切割接头与所述抗体连接。
37.权利要求34所述的方法，其中所述抗肿瘤药物是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
38.在样品或对象中检测癌细胞或癌症干细胞的方法，其包括：
(a)使对象或来自所述对象的样品与根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及
(b)在所述对象或样品中检测所述抗体与癌细胞或癌症干细胞的结合。
39.权利要求38所述的方法，其中所述样品是体液或活检物。
40.权利要求38所述的方法，其中所述样品是血液、骨髓、痰、泪、唾液、黏液、血清、尿或粪便。
41.权利要求38所述的方法，其中检测包括免疫组织化学、流式细胞术、FACS、ELISA、RIA或Western印迹。
42.权利要求38所述的方法，其还包括再次进行步骤(a)和(b)以及确定与第一次相比检测水平的变化。
43.权利要求38所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段还包含标记。
44.权利要求43所述的方法，其中所述标记是肽标签、酶、磁粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。
45.权利要求25至44中任一项所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与脂质体或纳米粒缀合。
46.治疗患有肝毒性或处于肝毒性风险之中的对象的方法，其包括向所述对象施用根据权利要求1至11所述的抗体。
47.权利要求46所述的方法，其中所述肝毒性是由急性肝衰竭引起的。
48.权利要求46所述的方法，其中所述肝毒性是由以下引起的：药剂或药物，例如对乙酰氨基酚；实验室化学物质；农业化学物质，例如除草剂或杀虫剂；工业化学物质；或天然产物，例如植物毒素。
49.权利要求48所述的方法，其中所述药剂或药物以治疗水平给药。
50.权利要求48所述的方法，其中所述药剂或药物以高于治疗水平给药，即为超剂量。
51.权利要求46所述的方法，其中所述抗体施用多于一次，例如每天、每隔一天、每周两次或每周施用。
52.权利要求46所述的方法，其还包括向所述对象施用第二肝毒性治疗，例如液体、止痛药、抗毒素。
53.权利要求46所述的方法，其中所述对象已被诊断出肝毒性。
54.权利要求46所述的方法，其中所述对象被怀疑已经诱导了肝毒性或者接触了肝毒性药剂或药剂剂量。
55.权利要求46所述的方法，其还包括在施用所述抗体之前和/或之后评估肝功能和/或肝酶。
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