KR20220152316A - 신규한 항-lilrb4 항체 및 유도체 생성물 - Google Patents

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안 송
타오 후앙
라이언 스태포드
마리아 호세 코스타
규 희 홍
캐롤린 보난스
지안후이 죠우
리 죠우
지 리
제이 폴 우드아드
엑스 샤를렌 리아오
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이뮨-온크 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 항-LILRB4 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-LILRB4 키메라 항원 수용체 단백질, 이를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이의 용도를 제공한다.

Description

신규한 항-LILRB4 항체 및 유도체 생성물
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2020년 3월 12일에 출원된 미국 가출원 제62/988,892호에 대한 우선권을 주장하며, 그 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
151 KB(마이크로소프트 윈도우즈에서 측정됨)이며 2021년 3월 12일에 생성된 "066564-8013WO01_ST25"라는 파일에 포함되어 있는 서열 목록은 전자 제출에 의해 본원과 함께 제출되며 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 개시내용은 일반적으로 의학, 종양학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 LILRB4에 결합하는 항체에 관한 것이다.
면역글로불린 유사 전사체 3(ILT3 또는 ILT-3), 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 5(LIR5 또는 LIR-5), 및 CD85k 또는 CD85K로도 알려진 인간 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브패밀리 B 멤버 4(LILRB4)는 세포질 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)를 함유하고 면역 세포 활성화의 음성 조절을 수반하는 유형 I 막 단백질이다. LILRB4는 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포 상에서 발현되며, 세포 자율 방식으로 선천적 면역을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 간접적인 기작을 통해 T 세포 활성화를 억제할 수 있다. LILRB4는 난치성 및 재발성 질환을 포함하는 단핵구성 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 특이적 마커이다. LILRB4는 조직 내로의 종양 세포 침윤을 지원하고 AML 세포에서 APOE, LILRB4, SHP-2, uPAR 및 ARG1을 포함하는 신호전달 경로를 통해 T 세포 활성을 억제하는 것으로 나타났다(Deng M. et al., Nature (2018) 562:605-09). 신규한 항-LILRB4 항체에 대한 상당한 요구가 존재한다.
본 개시내용은 항-LILRB4 항체 및 이의 항원 결합 단편, 이의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열, 항-LILRB4 키메라 항원 수용체, 및 이의 용도를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 단리된 항-LILRB4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, 항-LILRB4 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역(HC-CDR) 1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (b) 아미노산 잔기 NS에 돌연변이를 갖는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역(LC-CDR) 1, 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2 및 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, LC-CDR1은 서열번호: 28의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 1과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 27과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 27의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 면역글로불린 불변 영역, 선택적으로 Ig의 불변 영역, 또는 선택적으로 인간 IgG의 불변 영역을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소타입이다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화된다.
특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 낙타화된 단일 도메인 항체, 디아바디, ds(disulfide-stabilized) 디아바디 또는 ds 디아바디, scFv, scFv 이량체, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F(ab')2, 이중특이적 항체, 나노바디, 도메인 항체, 또는 2가 항체이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항-LILRB4 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 항-LILRB4 이중특이적 항체는 CD3과 같은 T 세포 수용체에 대항한다. 일부 구현예에서, 항-LILRB4 이중특이적 항체는 CD16A와 같은 NK 세포 수용체에 대항한다.
따라서, 또 다른 양태에서 본 개시내용은 LILRB4 및 CD3에 결합할 수 있는 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 이중특이적 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) 제1 경쇄 가변(VL) 도메인 및 제1 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하는 제1 항원 결합 영역; 및 (b) 제2 VL 도메인 및 제2 VH 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 영역을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 영역은 LILRB4에 결합할 수 있고, 제2 항원 결합 영역은 CD3에 결합할 수 있거나, 또는 그 반대의 경우이다.
특정 구현예에서, 제1 VL 도메인 및 제1 중쇄 가변 도메인은 각각 불변 도메인의 제1 쌍에 연결되고, 제2 VL 도메인 및 제2 VH 도메인은 각각 불변 도메인의 제2 쌍에 연결된다.
특정 구현예에서, 제1 VL 도메인은 제1 경쇄 불변(CL) 도메인에 연결되고, 제1 VH 도메인은 제1 중쇄 불변 도메인 1(CH1)에 연결된다. 특정 구현예에서, 제1 VL 도메인은 제1 CH1 도메인에 연결되고, VH 도메인은 제2 CL 도메인에 연결된다.
특정 구현예에서, 제2 VL 도메인은 제2 CL 도메인에 연결되고, 제2 VH 도메인은 제2 CH1 도메인에 연결된다. 특정 구현예에서, 제2 VL 도메인은 제2 CH1 도메인에 연결되고, 제2 VH 도메인은 제2 CL 도메인에 연결된다. 특정 구현예에서, 제2 VL 도메인은 T 세포 수용체(TCR) α 사슬 불변 도메인에 연결되고, 제2 VH 도메인은 TCR β 사슬 불변 도메인에 연결된다. 특정 구현예에서, 제2 VL 도메인은 TCR β 사슬 불변 도메인에 연결되고, 제2 VH 도메인은 TCR α 사슬 불변 도메인에 연결된다.
특정 구현예에서, 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편은 제3 VL 도메인 및 제3 VH 도메인을 포함하는 제3 항원 결합 영역을 추가로 포함하며, 여기서 제3 항원 결합 영역은 LILRB4 또는 CD3에 결합할 수 있다.
특정 구현예에서, 제3 VL 도메인 및 제3 중쇄 가변 도메인은 각각 불변 도메인의 제1 쌍에 연결된다. 특정 구현예에서, 제3 VL 도메인은 제3 CL 도메인에 연결되고, 제3 VH 도메인은 제3 CH1 도메인에 연결된다. 특정 구현예에서, 제3 VL 도메인은 제3 CH1 도메인에 연결되고, 제3 VH 도메인은 제3 CL 도메인에 연결된다. 특정 구현예에서, 제3 VL 도메인은 제2 TCR α 사슬 불변 도메인에 연결되고, 제3 VH 도메인은 제2 TCR β 사슬 불변 도메인에 연결된다. 특정 구현예에서, 제3 VL 도메인은 제2 TCR β 사슬 불변 도메인에 연결되고, 제3 VH 도메인은 제2 TCR α 사슬 불변 도메인에 연결된다.
특정 구현예에서, TCR α 사슬 불변 도메인은 서열번호: 89의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, TCR α 사슬 불변 도메인은 서열번호: 89의 S91A 돌연변이를 갖는다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 접합체 모이어티에 연결된다. 특정 구현예에서, 접합체 모이어티는 클리어런스(clearance) 변형제, 독소, 검출가능한 표지, 화학치료제, 또는 정제 모이어티를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예컨대, CHO 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은 항-LILRB4 항체를 코딩 또는 생산하는 하이브리도마를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 벡터가 발현되는 조건 하에서 본원에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 암의 효과를 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 본원에 기재된 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
방법은 대상체에서 종양 부담을 감소 또는 근절할 수 있고, 종양 세포의 수를 감소시킬 수 있고, 종양 크기를 감소시킬 수 있고, 종양 침윤을 감소시킬 수 있고, 종양 전이를 감소시킬 수 있고, 대상체에서 종양을 근절할 수 있다. 암은 고형 종양 또는 혈액학적 악성 종양일 수 있다.
특정 구현예에서, 암은 부신암, 담관 암종, 골암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 융모막암종, 결장암, 결장직장암, 식도암, 안암, 위암, 위식도암, 교모세포종, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 기관지폐포 세포 폐암, 중피종, 편평 세포 암종, 흑색종, 메르켈 세포암, 비인두 암종, 신경모세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 음경암, 전립선암, 신장 세포 암, 망막모세포종, 육종, 피부암, 고환암, 흉선 암종, 갑상선암, 자궁암 및 질암이다.
일부 구현예에서, 암은 전이성, 재발성 또는 약제 내성 암이다.
일부 구현예에서, 상기 암은 급성 림프구성/림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), B 세포 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(BPDCN), 만성 림프모구성 백혈병(CLL), 만성 골수단구성 백혈병(CMML), 만성 골수구성 백혈병(CML), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 결절외 NK/T 세포 림프종, 모발 세포 백혈병, HHV8 관련 원발성 삼출 림프종, 혈장모구성 림프종, 전-B 급성 림프구성 백혈병(Pre-B ALL), 원발성 CNS 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구가 풍부한 B 세포 림프종, 중쇄 질환, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS), 골수증식성 신생물 및 진성적혈구증가증을 포함하는 혈액학적 악성 종양이다.
특정 구현예에서, 상기 혈액학적 악성 종양은 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 전골수구성 백혈병(APL) 또는 M3 AML, 급성 골수단구성 백혈병 또는 M4 AML, 급성 단핵구성/단핵모구성 백혈병 또는 M5 AML, 및 급성 골수모구성 백혈병의 서브세트 또는 서브타입을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 혈액학적 악성 종양은 베네토클락스(venetoclax), 또는 아자사이티딘(azacytidine)/아자시티딘(azacitidine)과 조합된 베네토클락스에 내성이거나, 아자사이티딘/아자시티딘 및/또는 베네토클락스로 치료 후 재발되거나, 데시타빈과 조합된 베네토클락스에 내성이거나 또는 아자사이티딘/아자시티딘 및 데시타빈으로 치료 후 재발된 급성 골수성 백혈병(AML)을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 정맥내로, 동맥내로, 종양내로, 또는 피하로 투여된다.
특정 구현예에서, 방법은 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린, 다우노루비신, 뉴클레오사이드 대사 억제제, 시타라빈, 하이포메틸화제, 저용량 시타라빈(LDAC), 다우노루비신 및 시타라빈의 조합, 주사를 위한 다우노루비신 및 시타라빈 리포솜, 빅시오스(Vyxeos®), 아자사이티딘, 비다자(Vidaza®), 데시타빈, 올-트랜스-레티노산(all-trans-retinoic acid, ATRA), 비소, 삼산화비소, 히스타민 디하이드로클로라이드, 세플렌(Ceplene®), 인터루킨-2, 알데스루킨, 프로루킨(Proleukin®), 겜투주맙 오조가미신, 밀로타르그(Mylotarg®), FLT-3 억제제, 미도스타우린, 리답트(Rydapt®), 클로파라빈, 파네실 트랜스퍼라제 억제제, 데시타빈, IDH1 억제제, 이보시데닙, 티브소보(Tibsovo®), IDH2 억제제, 에나시데닙, 이디파(Idhifa®), 평활화(SMO) 억제제, 글라스데깁(glasdegib), 아르기나제 억제제, IDO 억제제, 에파카도스타트, BCL-2 억제제, 베네토클락스, 벤클렉스타(Venclexta®), 백금 복합체 유도체, 옥살리플라틴, 키나제 억제제, 티로신 키나제 억제제, PI3 키나제 억제제, BTK 억제제, 이브루티닙, 임브루비카(IMBRUVICA®), 아칼라브루티닙, 칼쿠엔스(CALQUENCE®), 자누브루티닙, PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, LAG3 항체, ICOS 항체, TIGIT 항체, TIM3 항체, CD40 항체, 4-1BB 항체, CD47 항체, SIRP1α 항체 또는 융합 단백질, CD70 항체, 및 CLL1 항체, CD123 항체, E-셀렉틴의 길항제, 종양 항원에 결합하는 항체, T 세포 표면 마커에 결합하는 항체, 골수 세포 또는 NK 세포 표면 마커에 결합하는 항체, 알킬화제, 니트로소우레아제, 항대사물질, 항종양 항생제, 식물로부터 유래된 알칼로이드, 호르몬 치료 약물, 호르몬 길항제, 아로마타제 억제제 및 P-당단백질 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 방법은 초기에 대상체에게 항-LILRB4 항체의 단일요법을 일정 기간 동안 투여한 다음, 아자사이티딘, 비다자®, BCL-2 억제제, 베네토클락스, 및 벤클렉스타®로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 부가하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 샘플 또는 대상체에서 암 세포 또는 암 줄기 세포를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 방법은 (a) 대상체 또는 대상체로부터의 샘플을 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 대상체 또는 샘플 내의 암 세포 또는 암 줄기 세포에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플은 체액 또는 생검이다. 일부 구현예에서, 샘플은 혈액, 객담, 눈물, 타액, 점액, 혈청, 소변 또는 대변이다.
일부 구현예에서, 검출은 면역조직화학, 유세포 분석, 면역분석(ELISA, RIA 등 포함) 또는 웨스턴 블롯을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 단계 (a) 및 (b)를 2회째 또는 추가 횟수 수행하고 1회째와 비교하여 검출 수준의 변화를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
항-LILRB4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 펩타이드 태그, 효소, 자기 입자, 발색단, 형광 분자, 화학발광 분자, 또는 염료와 같은 표지를 추가로 포함할 수 있다. 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 리포좀 또는 나노입자에 접합될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 LILRB4를 검출하는데 유용한 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 항-LILRB4 키메라 항원 수용체(CAR) 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, CAR 단백질은 (a) 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 아미노산 잔기 NS에 돌연변이를 갖는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1, 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2 및 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, LC-CDR1은 서열번호: 28의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, LILRB4 CAR 단백질의 중쇄 가변 영역은 서열번호: 1과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며; CAR 단백질의 경쇄 가변 영역은 서열번호: 27과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 27의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, CAR 단백질은 서열번호: 66 또는 서열번호: 68과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 단백질은 서열번호: 66 또는 서열번호: 68과 동일한 아미노산 서열을 갖는 scFv를 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 CAR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 진핵 세포에서 활성인 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 발현 벡터이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 CAR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 조작된 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포, NK 세포 또는 대식세포이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 CAR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 하나 이상의 세포를 포함하는 세포 요법(치료제)의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 상기 인간 대상체에게 제2 암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 암 요법은 화학요법, 면역요법, 방사선요법, 호르몬 요법 또는 수술이다. 일부 구현예에서, 제2 암 요법은 세포 요법과 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 제2 암 요법은 세포 요법 전 또는 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기재된 CAR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 하나 이상의 세포의 유효량의 제2 투여를 상기 인간 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 세포 요법은 암 부위에 국소적으로, 암 부위에 지역적으로, 또는 전신으로 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 암은 급성 림프구성/림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), B 세포 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(BPDCN), 만성 림프모구성 백혈병(CLL), 만성 골수단구성 백혈병(CMML), 만성 골수구성 백혈병(CML), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 결절외 NK/T 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발 세포 백혈병, HHV8 관련 원발성 삼출 림프종, 혈장모구성 림프종, 전-B 급성 림프구성 백혈병(Pre-B ALL), 원발성 CNS 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구가 풍부한 B 세포 림프종, 중쇄 질환, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS), 골수증식성 신생물 및 진성적혈구증가증을 포함하는 혈액학적 악성 종양이다.
특정 구현예에서, 상기 혈액학적 악성 종양은 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 전골수구성 백혈병(APL) 또는 M3 AML, 급성 골수단구성 백혈병 또는 M4 AML, 급성 단핵구성/단핵모구성 백혈병 또는 M5 AML, 및 급성 골수모구성 백혈병의 서브세트 또는 서브타입을 포함한다.
추가의 양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 자가면역 질환의 효과를 치료 또는 개선하는 방법이 제공된다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 정맥내로, 동맥내로, 복강내로, 또는 피하로 투여될 수 있다. 방법은 스테로이드 또는 NSAID로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 자가면역질환은 길랑바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 장병증성 관절염, 반응성 관절염, 미분화 척추관절병증, 소아 척추관절병증, 베체트병, 골부착부위염, 궤양성 대장염, 크론병, 과민성 대장 증후군, 염증성 장 질환, 섬유근육통, 만성 피로 증후군, 전신성 염증성 질환과 관련된 통증 상태, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 류마티스 관절염, 연소성 류마티스 관절염, 소아 발병 당뇨병(I형 당뇨병으로도 알려짐), 베게너 육아종증, 다발성 근육염, 피부근염, 봉입체 근육염, 다발성 내분비 부전, 슈미트 증후군, 자가면역 포도막염, 애디슨병, 그레이브병, 하시모토 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 악성 빈혈, 위 위축, 만성 간염, 루포이드 간염, 죽상동맥경화증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭경화증, 부갑상선기능저하증, 드레슬러 증후군, 중증 근무력증, 이튼-램버트 증후군, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 용혈성 빈혈, 천포창 외음부, 천포창, 포진상 피부염, 탈모증, 경피증, 진행성 전신 경화증, 크레스트 증후군(석회증, 레이노 현상, 식도 운동장애, 수지경화, 및 모세혈관확장증), 성인 발병 당뇨병(II형 당뇨병으로도 알려짐), 혼합 결합 조직 질환, 결절성 다발동맥염, 전신성 괴사성 혈관염, 사구체신염, 아토피성 피부염, 아토피성 비염, 굿파스처 증후군, 샤가스병, 사르코이드증, 류마티스 열, 천식, 항인지질증후군, 다형 홍반, 쿠싱 증후군, 자가면역 만성 활성 간염, 알레르기성 질환, 알레르기성 뇌척수염, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈만편모충증, 트리파노소마증, 다카야스 동맥염, 류마티스성 다발근통, 측두동맥염, 주혈흡충증, 거대세포동맥염, 습진, 림프종성 육아종증, 가와사키병, 내안구염, 건선, 태아 적아구증, 호산구 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 푹스 모양체염, IgA 신증, 헤노흐-쉔라인 자반증, 이식편 대 숙주 질환, 이식 거부, 야토병(tularemia), 주기성 발열 증후군, 화농성 관절염, 가족성 지중해 열, TNF-수용체 관련 주기적 증후군(TRAPS), 머클-웰스 증후군 또는 하이퍼-IgD 증후군일 수 있다.
도 1은 항-LILRB4 항체 및 유도체 생성물의 작용 기작의 모식도를 보여준다.
도 2는 2W 또는 4W 동안 40℃에서 H7K3(분자 A) 및 H7K3m5(분자 B)의 icIEF 결과의 비교를 보여준다.
도 3은 항-LILRB4 항체 H7K3m5에 의한 THP-1 세포 상의 인간 내인성 LILRB4의 인식을 보여준다.
도 4는 야생형(WT) 또는 아푸코실화된(afu) H7K3m5에 의한 THP-1-GFP 세포의 ADCC를 보여준다.
도 5는 인간 단핵구 및 형질세포양 수지상 세포(pDC) 상의 LILRB4 발현을 보여준다.
도 6은 인간 단핵구에서 IL-10 및 IFNα 처리에 의한 LILRB4 발현의 상향 조절을 보여준다.
도 7은 LPS에 의해 자극된 인간 단핵구 상에서 하향조절된 LILRB4 수준 및 상향조절된 uPAR 수준을 보여준다.
도 8a는 시험관내 인간 단핵구 분화된 대식세포 상의 LILRB4 발현을 보여준다. 도 8b는 시험관내 단핵구 유래 인간 대식세포 상의 LILRB4의 카피 수를 보여준다.
도 9는 시험관내 분화된 MDSC 상의 LILRB4의 카피 수를 보여준다.
도 10a-10b는 인간 단핵구 유래 수지상 세포(DC) 상의 LILRB4의 카피 수를 보여준다. LILRB4 수준은 높은 것부터 낮은 것까지 다음 순서로 관찰된다: 면역관용 DC > 활성화된 DC > 미성숙 DC
도 11은 컴퓨터 생물학 접근법을 통해 생성된 대식세포 유전자 발현 "서명(signature)"에 기초하여, 대식세포 침윤에 대해 높고 낮은 신호를 갖는 TCGA RNA 시퀀싱 데이터베이스로부터의 고형 종양 샘플 사이의 LILRB4 mRNA 발현 수준의 비교를 보여준다. 분석에 포함된 각 종양 유형에 대한 샘플의 총 수가 괄호 안에 표시되어 있다. 여기에 표시된 결과는 부분적으로 TCGA Research Network에 의해 생성된 RNA 시퀀싱 데이터를 기반으로 한다.
도 12a-12b는 H7K3m5가 고형 종양 미세환경(TME) 내로 침윤된 단핵구성 골수 세포뿐만 아니라 고형 종양 환자로부터의 말초 혈액 단핵구성 골수 세포에 특이적으로 결합한다는 것을 보여주는 대표적인 유세포 분석법 데이터를 예시한다. 진회색이 채워진 히스토그램: H7K3m5와 함께 인큐베이션된 샘플; 연회색이 채워진 히스토그램: 인간 IgG1 이소타입 대조군과 함께 인큐베이션된 샘플. 도 12a. TME를 침윤하는 다양한 골수 세포 서브세트 상의 H7K3m5 또는 그의 이소타입 대조군의 결합 신호. 도 12b. 말초 혈액으로부터의 다양한 골수 세포 서브세트 상의 H7K3m5 또는 그의 이소타입 대조군의 결합 신호.
도 13a-13d는 신선한 PBMC를 사용하는 자가 ADCC에서 H7K3m5 매개 단핵구 사멸이 없음을 보여준다. 건강한 공여자로부터 갓 분리된 PBMC를 연속 적정된 H7K3m5, 이소타입 대조군 인간 IgG1, 또는 양성 대조군으로서 리툭시맙의 존재 하에 밤새 인큐베이션하였다. 단핵구 및 B 세포를 유세포 분석법에 의해 CD14+CD19- 및 CD19+CD14-로서 확인하고 계수하였다. 도 13a 및 13c는 2명의 상이한 공여자로부터의 PBMC에 의한 단핵구 사멸의 결핍을 보여주고, 도 13b 및 13d는 양성 대조군으로서 상응하는 B 세포 사멸을 보여준다.
도 14a-14d는 야생형(WT) 또는 아푸코실화된(afu) H7K3m5에 의한 정상 단핵구의 자가 ADCC를 보여준다. 도 14a 및 14c는 2명의 상이한 공여자로부터의 PBMC에 의한 ADCC를 통한 대표적인 단핵구 사멸을 보여준다. 아푸코실화된 H7K3m5에 의한 단핵구 상의 ADCC는 공여자 024에서 관찰되었지만, 활성은 공여자 13에서 최소였다. 야생형 H7K3m5에 의해 어떤 ADCC도 관찰되지 않았다. 도 14b 및 14d는 양성 대조군으로서 상응하는 B 세포 사멸을 보여준다.
도 15a-도 15d는 야생형(WT) 또는 아푸코실화된(afu) H7K3m5 매개 자가 ADCC에 의한 pDC 또는 단핵구의 자가 ADCC를 보여준다. pDC에 대한 ADCC는 2명의 공여자에서 야생형 및 아푸코실화된 H7K3m5 둘 모두에 의해 관찰되었다. 반면, 단핵구는 공여자에 따라 아푸코실화된 H7K3m5로만 사멸될 수 있다. 더욱이, 아푸코실화된 H7K3m5는 pDC 또는 단핵구에 대해 야생형보다 훨씬 더 강한 ADCC 활성을 나타내었다(도 15a-15b).
도 16a-16b는 동일한 용량 수준에서 단핵구에 대한 ADCC 효과가 없는 H7K3m5의 존재 하에 정제된 NK 세포를 사용한 CD33+ MDSC 세포의 용량 의존적 ADCC를 보여준다. H7K3m5는 동일한 실험에서 AML 세포주 THP-1에 대해 ADCC 활성을 나타내었다(도 16b).
도 17a-17b는 항-LILRB4에 의한 THP-1-GFP 세포의 ADCP를 보여준다. THP-1-GFP 세포를 연속 적정된 야생형 H7K3m5 또는 이소타입 대조군 인간 IgG1의 존재 하에 24시간 동안 시험관내 분화된 대식세포와 공동 배양하였다. THP-1-GFP 세포 및 대식세포를 각각 GFP+ 및 CD163+CD206+로서 확인하고 정량화하였다. THP-1 세포 사멸의 퍼센트를 GFP+ 세포의 절대 수 또는 GFP+% 세포로부터 계산하였다. 도 17a 및 17b는 2명의 별도의 건강한 공여자로부터 분화된 대식세포로부터의 야생형 H7K3m5에 의한 THP-1-GFP 세포의 ADCP를 보여준다.
도 18은 항-LILRB4를 사용한 THP-1-GFP 세포에 대한 시험관내 T 세포 세포독성을 보여준다. THP-1-GFP 세포를 정제된 나이브 T 세포와 공동 배양하였다. 항-LILRB4 H7K3m5는 AML 세포에 대해 T 세포 세포독성을 유도할 수 있다. 효과기 pan T 세포는 3명의 상이한 건강한 공여자로부터 유래되었다. 곡선을 평균 ± SD로 플롯팅한다. EC50 값은 나노몰 단위이다.
도 19는 시험관내 T 세포 세포독성 분석 샘플로부터의 상청액에서의 대표적인 사이토카인 생산 프로파일을 보여준다. THP-1 세포에 대한 항-LILRB4 유도 T 세포 세포독성은 공동 배양에서 사이토카인의 상승에 의해 반영된다. 곡선을 평균 ± SD로 플롯팅한다. EC50 값은 나노몰 단위이다. EC50 값은 IL-6에 대해 도출될 수 없다.
도 20은 유세포 분석법에 의한 T 세포 활성화의 평가를 보여준다. A-B: T 세포 활성화 마커 CD69(A) 및 CD25(B)의 표면 염색. C-E: 유세포 분석법에 의해 공동 배양된 T 세포 및 THP-1 세포의 세포내 사이토카인 염색. C: IFNγ 및 TNFα 둘 모두를 생산하는 세포; D: IFNγ를 생산하지만 TNFα는 생산하지 않는 세포; E: TNFα를 생산하지만 IFNγ는 생산하지 않는 세포.
도 21은 H7K3m5 처리시 THP-1 세포 상의 증가된 T 세포 활성화 마커 및 MHC 발현을 보여준다. D428 = 공여자 428. MFI = 기하학적 평균 형광 강도.
도 22는 유세포 분석법에 의한 THP-1 AML 세포 상의 활성화 마커의 표면 발현을 보여준다. MFI = 기하학적 평균 형광 강도.
도 23은 H7K3m5가 AML 이종이식편 모델에서 효능이 있음을 보여준다. 본 실험은 THP-1.luc 세포의 성장 동역학을 평가하였고, 바이오이미징을 사용하여 암컷 NSG 마우스에서 THP-1.luc 인간 AML 이종이식편 모델에서 H7K3m5의 효능을 결정하였다. 1x106 THP-1.luc 세포를 테일 정맥을 통해 JAX 암컷 NSG 마우스에 정맥내 이식하였다. 전신 생체발광 이미징을 동물 무작위화 및 비히클 대조군 또는 H7K3m5(1 mg/kg)의 단일 용량 정맥내 투여 전 1일(세포 주사 후 4-6시간)에 수행하였다. 7일, 14일, 17일 및 21일에, 대조군 및 처리된 동물에 대해 전신 생체발광 이미징 데이터를 수집하였다.
도 24는 H7K3m5가 TLR(Toll-Like Receptor) 신호전달에 대한 응답으로 단핵구 유래 수지상 세포(Mo-DC)의 성숙/활성화를 강화한다는 것을 보여주는 유세포 분석 데이터를 예시한다. H7K3m5는 면역관용 마커 CD209의 발현을 감소시키면서 활성화 마커(CD86, HLA-DR)의 발현을 향상시켰다. 각 행은 상이한 건강한 공여자로부터의 결과를 나타낸다. H7K3m5가 원하는 전염증 효과를 일으킨 공여자의 비율이 괄호 안에 표시되어 있다. *p<0.05(대응표본 t 검정).
도 25는 H7K3m5가 동종이계 T 세포와의 혼합 백혈구 반응시 성숙한 단핵구 유래 DC(Mo-DC)의 표면 상의 활성화 마커(CD86 및 HLA-DR)의 발현을 향상시킨다는 것을 보여주는 유세포 분석법 데이터를 예시한다. 미성숙 및 성숙 Mo-DC에 대한 H7K3m5의 효과를 각각 연구하기 위해, H7K3m5의 효과를 CD40 리간드의 부재(-CD40L) 또는 존재(+CD40L) 하에 평가하였다. 각 행은 상이한 건강한 공여자(n=3 공여자)로부터의 결과를 나타낸다.
도 26은 H7K3m5가 T 세포 및 성숙한 단핵구 유래 DC(Mo-DC)의 동종이계 혼합 백혈구 반응에서 IL-12 생산을 향상시킨다는 것을 보여주는 ELISA 데이터를 예시한다. 미성숙 및 성숙 Mo-DC에 대한 H7K3m5의 효과를 각각 연구하기 위해, H7K3m5의 효과를 CD40 리간드의 부재(-CD40L) 또는 존재(+CD40L) 하에 평가하였다. 데이터는 평균 ± SEM로서 제시되고 각 공여자에 대한 데이터는 또한 개별 데이터 포인트(n=2-3 공여자)로서 표시된다.
도 27은 H7K3m5가 T 세포 및 단핵구 유래 DC(Mo-DC)의 동종이계 혼합 백혈구 반응에서 IFN-γ 생산을 향상시킨다는 것을 보여주는 ELISA 데이터를 예시한다. 미성숙 및 성숙 Mo-DC에 대한 H7K3m5의 효과를 각각 연구하기 위해, H7K3m5의 효과를 CD40 리간드의 부재(-CD40L) 또는 존재(+CD40L) 하에 평가하였다. 데이터는 평균 ± SEM로서 제시되고 각 공여자에 대한 데이터는 또한 개별 데이터 포인트(n=3 공여자)로서 표시된다.
도 28a 및 28b는 LILRB4/CD3 이중특이적 항체의 구성의 개략적인 표시를 보여준다.
도 29a 및 29b는 FACS에 의해 측정된 바와 같은 CD3 및 LILRB4 이중특이적 항체에 의한 정상 단핵구 및 AML 세포주 THP-1에 대한 결합을 보여준다. 단핵구와 THP-1 사이에서 상이한 항-LILRB4 단일특이적 및 이중특이적 항체에 걸쳐 유사한 결합 친화도 추세가 관찰되었다.
도 30a 및 30b는 단핵구(도 22a) 및 THP-1-luc-GFP 세포(도 22b) 상의 이중특이적 CD3/LILRB4 항체의 T 세포 매개 세포독성을 보여준다.
도 31a 및 31b는 LILRB4xCD3 이중특이적 항체에 의한 단핵구의 자가 사멸(도 31a) 및 대조군으로서 리툭산에 의한 B 세포의 자가 사멸(도 31b)을 보여준다.
도 32는 인간 1차 단핵구 및 인간 백혈병 세포주 THP-1에 대한 유세포 분석법 분석에서 H7K3m5 전장 IgG 및 ScFv 단백질을 사용한 결합 친화도 비교를 보여준다.
도 33은 항-LILRB4 CAR 단백질을 발현하기 위한 DNA 작제물의 개략적인 표시를 보여준다. DNA 작제물은 CD3zeta 활성화 도메인과 함께 CD28 또는 4-1BB 공동자극 도메인을 함유하는 2세대 CAR 작제물에 기반하였다. scFv는 항-LILRB4 단일클론 항체 H7K3m5로부터 유래되었다. 5' 및 3' 상동성 팔은 TRAC 유전자 내의 Cas9 DNA 절단 부위의 상류 및 하류에 있는 상동성 서열이다(gRNA 설계에 기초함). 프로모터 및 리더 펩타이드는 유전자 발현 및 세포외 전좌를 위한 요소이다. SV40 폴리-A 테일은 전사체 안정성 및 번역을 개선하기 위해 포함되었다.
도 34는 CRISPR 넉아웃 및 넉인 방법을 사용한 LILRB4 CAR-T 세포의 효율적인 생성을 보여준다. 인간 일차 T 세포를 상동 재조합 기반 넉인을 위한 DNA 주형과 함께 또는 없이, TCR 알파(TRAC) 유전자좌를 불활성화시키도록 설계된 CRISPR-Cas9 RNP 복합체로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 2주 동안 배양물에서 확장시켰다. 항-LILRB4 CAR-T 세포를 LILRB4-Fc 융합 단백질(ACRObiosystems CDK-H5259) 및 항-Fc 항체(Biolegend B278652, 음성 대조군)에 대한 결합에 의해 확인하였다. 성공적인 TCR 알파(TRAC) 불활성화(넉아웃 또는 KO)를 항-CD3 염색(항-CD3 PE, BD 555333)에 의해 측정하였다. ATC, 활성화된 T 세포; KO, TCR 알파(TRAC) 불활성화된 T 세포; RB4_CD28, CD28 공동자극 도메인을 갖는 항-LILRB4 CAR을 발현하는 T 세포; RB4_41BB, 4-1BB 공동자극 도메인을 갖는 항-LILRB4 CAR을 발현하는 T 세포.
도 35는 TCR 알파(TRAC) 불활성화된 T 세포(KO) 및 항-LILRB4 CAR(또는 대조군 CAR) 넉인 T 세포의 증식을 보여준다. TCRalpha를 넉아웃한 후, 세포를 IL-2 300 IU/ml를 갖고 항-CD3/28이 첨가되지 않은 완전한 옵티마이저(Optimizer) 배지에서 성장시켰다. 일자(지시된 바와 같음)에서의 총 T 세포 수를 출발 배양 수로 나누어 배수 확장을 플롯팅하였다. 항-LILRB4 CAR-T 세포는 대조군 CAR-T 세포와 비교하여 유의하게 더 높은 배수의 확장을 가지고 있었다. ATC, 활성화된 T 세포; KO, TCR 알파(TRAC) 불활성화된 T 세포; ctrl_CD28, CD28 공동자극 도메인을 갖는 대조군 CAR을 발현하는 T 세포; ctrl_41BB, 4-1BB 공동자극 도메인을 갖는 대조군 CAR을 발현하는 T 세포; RB4_CD28, CD28 공동자극 도메인을 갖는 항-LILRB4 CAR을 발현하는 T 세포; RB4_41BB, 4-1BB 공동자극 도메인을 갖는 항-LILRB4 CAR을 발현하는 T 세포.
도 36a-36h는 CAR-T 배양물의 항원 의존적 활성화를 보여준다. 1 ug/ml 재조합 대조군 항원 또는 LILRB4 항원을 PBS 완충액에서 밤새 96 웰 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 PBS 버퍼로 2회 세척하였다. 배양 배지(사이토카인이 첨가되지 않음) 중의 1X105 CAR-T 세포를 각 웰에 첨가하고 72시간 동안 인큐베이션하였다. 루미넥스(Luminex) 분석에 의한 사이토카인 방출 측정을 위해 세포 배양 상청액을 수집하였다. ATC, 활성화된 T 세포; KO, TCR 알파(TRAC) 불활성화된 T 세포; antiRB4_CD28CART, CD28 공동자극 도메인을 갖는 항-LILRB4 CAR을 발현하는 T 세포; antiRB4_41BB CART, 4-1BB 공동자극 도메인을 갖는 항-LILRB4 CAR을 발현하는 T 세포; control_CD28CART, CD28 공동자극 도메인을 갖는 대조군 CAR을 발현하는 T 세포; control_41BBCART, 4-1BB 공동자극 도메인을 갖는 대조군 CAR을 발현하는 T-세포.
도 37a-37c는 2주 확장 후 CAR-T 세포의 특성화를 보여준다. 액체 질소 저장소 내의 냉동된 CAR-T 세포를 해동시키고, 유세포 분석법 분석 전 2-3일 동안 계속 배양하였다. 사용된 항체는 항-CD8 APC Cy7(BD561945), 항-PD1 PE(BD560908) 및 항-TIM3 BV421(BD565562)이었다. 항-LILRB4 CAR-T 세포를 LILRB4-Fc 융합 단백질(ACRObiosystems CDK-H5259) 및 항-Fc 항체(Biolegend B278652)에 대한 결합에 의해 확인하였다.
도 38은 항-LILRB4 CAR-T 세포의 세포독성을 나타낸다. CHO K1 RB4 세포를 12시간 동안 상이한 밀도(6X104, 2X104 또는 7X103)로 시딩하고, 1X105 CAR-T 세포를 첨가하고, 상층액을 제거하고 플레이트를 PBS로 2회 세척함으로써 세포독성을 측정하였다. 총 생존 부착성 CHO K1 RB4 세포를 Promega CTG2.0 발광 키트에 의해 측정하였다. 그리고 각 조건의 발광 신호를 동일한 E:T 비 활성화된 T 세포 대조군으로 나누어 % 세포독성을 계산하였다.
도 39a-39b는 1상 인간 최초 임상 시험의 개략도를 보여준다. 도 39a는 용량 상승을 위한 "윈도우" 설계의 개략도이다. 도 39b는 항-LILRB4 단독요법의 개략도이다. 도 39c-39d는 항-LILRB4 항체와 아자사이티딘 및/또는 베네토클락스의 잠재적인 조합 연구의 개략도이다. 항-LILRB4와의 다른 잠재적 조합은 동일하거나 유사한 스키마를 따를 것이다. AZA, 아자사이티딘; VEN, 베네토클락스; C1D1, 1 사이클 1일; 2 사이클 1일; DLT, 용량 제한 독성; MTD1, 항-LILRB4 단독요법의 최대 허용 용량; MTD2, 아자사이티딘과 조합된 항-LILRB4의 최대 허용 용량. 항-LILRB4는 질환의 진행 또는 사망 때까지 14일마다 단독요법으로서 또는 다른 제제와 조합하여 투여된다.
본 개시내용의 하기 설명은 단지 본 개시내용의 다양한 구현예를 예시하기 위한 것이다. 이와 같이, 논의된 특정 변형은 본 개시내용의 범위에 대한 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 균등물, 변경 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이며, 이러한 균등한 구현예가 본원에 포함되어야 하는 것으로 이해된다. 간행물, 특허 및 특허 출원을 포함하는 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
I. 정의
전술한 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명 모두는 단지 예시적이고 설명적이며, 청구된 발명을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 출원에서, 단수의 사용은 명시적으로 달리 언급되지 않는 한 복수형을 포함한다. 본 개시내용에서, 용어 "또는"은 대안만을 지칭하는 것으로 명시적으로 지시되지 않거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "또 다른"은 적어도 제2 이상을 의미할 수 있다. 또한, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함하다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한하는 것이 아니다. 또한, "요소" 또는 "구성요소"와 같은 용어는 명시적으로 달리 언급되지 않는 한 하나의 유닛을 포함하는 요소 또는 구성요소 및 둘 이상의 서브유닛을 포함하는 요소 또는 구성요소 모두를 포괄한다. 또한, 용어 "부분"의 사용은 모이어티의 일부 또는 전체 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 특정 항원에 결합하는 임의의 면역글로불린, 단일클론 항체, 다클론 항체, 다가 항체, 이가 항체, 일가 항체, 다중특이적 항체, 또는 이중특이적 항체를 포함한다. 천연 온전한 항체는 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 포유동물 중쇄는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 분류되며, 각각의 중쇄는 가변 도메인(VH) 및 제1, 2, 및 제3 불변 도메인(각각 CH1, CH2, CH3)을 포함하는 불변 영역으로 구성되고; 포유동물 경쇄는 λ 또는 κ로 분류되는 반면, 각 경쇄는 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)으로 구성된다. 전형적인 IgG 항체는 "Y" 모양을 가지며, Y의 줄기는 전형적으로 디설파이드 결합을 통해 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 도메인으로 구성된다. Y의 각각의 팔은 단일 경쇄의 가변 및 불변 도메인에 결합된 단일 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 항원 결합을 담당한다. 두 쇄에서의 가변 도메인은 일반적으로 상보성 결정 영역(CDR)(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 CDR, HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는 중쇄 CDR)으로 불리는 3개의 매우 가변적인 루프를 함유한다. 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편에 대한 CDR 경계는 Kabat, IMGT, Chothia, 또는 Al-Lazikani의 관례에 의해 정의되거나 확인될 수 있다(Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. (1985) 186(3):651-63; Chothia, C. and Lesk, A.M., J.Mol.Biol. (1987) 196:901; Chothia, C. et al., Nature (1989) 342(6252):877-83; Marie-Paule Lefranc et al., Developmental and Comparative Immunology (2003) 27: 55-77; Marie-Paule Lefranc et al., Immunome Research (2005) 1(3); Marie-Paule Lefranc, Molecular Biology of B cells (second edition), chapter 26, 481-514, (2015)). 3개의 CDR은 CDR보다 더 잘 보존되고 초가변 루프를 지원하는 스캐폴드를 형성하는 프레임워크 영역(FR)으로 알려진 측접 스트레치 사이에 개재된다. 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인은 항원 결합에 관여하지 않지만 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 항체는 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 부류에 할당된다. 항체의 5개의 주요 부류 또는 이소타입은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤 중쇄의 존재를 특징으로 하는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이다. 몇 가지 주요 항체 부류는 하위부류, 예컨대 IgG1(감마1 중쇄), IgG2(감마2 중쇄), IgG3(감마3 중쇄), IgG4(감마4 중쇄), IgA1(알파1 중쇄), 또는 IgA2(알파2 중쇄)로 나뉜다.
용어 "항원"은 적응성 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 지칭한다. 구체적으로, 항원은 항체 또는 T 림프구 항원 수용체에 의해 특이적으로 결합된 물질이다. 항원은 일반적으로 단백질 및 다당류이며, 덜 빈번하게는 또한 지질이다. 적합한 항원은 비제한적으로 박테리아(코트, 캡슐, 세포벽, 편모, 선모 및 독소), 바이러스, 및 다른 미생물의 부분을 포함한다. 항원은 또한 종양 항원, 예컨대, 종양에서의 돌연변이에 의해 생성된 항원을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 항원은 또한 면역원 및 합텐을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 항원에 결합하지만 온전한 천연 항체 구조체를 포함하지 않는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부로부터 형성된 항체 단편, 또는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 항원 결합 단편의 예는, 비제한적으로, 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디설파이드 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv(dsFv-dsFv'), 디설파이드 안정화된 디아바디(ds 디아바디), 단쇄 항체 분자(scFv), scFv 이량체(2가 디아바디), 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 낙타화된 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 및 2가 도메인 항체를 포함한다. 항원 결합 단편은 모 항체가 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 도메인을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 없다.
"Fab' 단편"은 하나의 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인 및 또한 CH1 및 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 하나의 중쇄의 일부를 포함하며, 이로써 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 사슬간 디설파이드 결합이 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 중쇄 및 CH1 및 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 함유하는 2개의 중쇄를 함유하며, 이로써 2개의 중쇄 사이에 사슬간 디설파이드 결합이 형성된다. 따라서 F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 디설파이드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
항체와 관련하여 "Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 지니는 항체의 가장 작은 단편을 지칭한다. Fv 단편은 단일 중쇄의 가변 도메인에 결합된 단일 경쇄의 가변 도메인으로 구성된다.
"단쇄 Fv 항체" 또는 "scFv"는 직접 또는 펩타이드 링커 서열을 통해 서로 연결된 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인으로 구성된 조작된 항체를 지칭한다(Huston JS et al., Proc Natl Acad Sci USA(1988) 85:5879).
"Fc" 영역은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디설파이드 결합에 의해 그리고 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다. 항체의 Fc 영역은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존적 세포독성(CDC)과 같은 다양한 효과기 기능을 담당하지만 항원 결합에서는 기능하지 않는다.
"단쇄 Fv-Fc 항체" 또는 "scFv-Fc"는 항체의 Fc 영역에 연결된 scFv로 구성된 조작된 항체를 지칭한다.
"dsFv"는 단일 경쇄의 가변 도메인과 단일 중쇄의 가변 도메인 사이의 결합이 디설파이드 결합인 디설파이드 안정화된 Fv 단편을 지칭한다. 일부 구현예에서, "(dsFv)2" 또는 "(dsFv-dsFv')"는 3개의 펩타이드 사슬, 즉 펩타이드 링커(예컨대, 긴 가요성 링커)에 의해 연결되고 디설파이드 브릿지를 통해 각각 2개의 VL 도메인에 결합된 2개의 VH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, dsFv-dsFv'는 각각의 디설파이드 쌍이 형성된 중쇄 및 경쇄는 상이한 항원 특이성을 갖는다는 점에서 이중특이적이다.
"낙타화된 단일 도메인 항체", "중쇄 항체" 또는 "HCAb"는 2개의 VH 도메인을 함유하고 경쇄를 함유하지 않는 항체를 지칭한다(Riechmann L. and Muyldermans S., J Immunol Methods. Dec 10;231(1-2):25-38 (1999); Muyldermans S., J Biotechnol. Jun;74(4):277-302 (2001); WO제94/04678호; WO제94/25591호; 미국 특허 제6,005,079호 참조). 중쇄 항체는 원래 낙타과(Camelidae)(낙타, 단봉낙타, 및 라마)로부터 유래되었다. 경쇄는 없지만, 낙타화된 항체는 진정한 항원 결합 레퍼토리를 갖는다(Hamers-Casterman C. et al., Nature (1993) 363:446-8; Nguyen VK. et al., Immunogenetics (2002) 54:39-47; Nguyen VK. et al., Immunology (2003) 109:93-101). 중쇄 항체의 가변 도메인(VHH 도메인)은 적응성 면역 반응에 의해 생성된 가장 작은 공지된 항원 결합 단위를 나타낸다(Koch-Nolte F. et al., FASEB J. (2007) 21:3490-8).
"나노바디"는 중쇄 항체로부터의 VHH 도메인 및 2개의 불변 도메인인 CH2 및 CH3으로 구성되는 항체 단편을 지칭한다.
"디아바디" 또는 "dAb"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 포함하며, 여기서 상기 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬 내의 VL 도메인에 연결된 VH 도메인(VH-VL 또는 VL-VH)을 포함한다(예컨대, Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Jul 15;90(14):6444-8 (1993); EP제404097호; WO제93/1116호 참조). 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 쌍 형성을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인들은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원 결합 부위를 생성한다. 항원 결합 부위는 동일하거나 상이한 항원(또는 에피토프)을 표적으로 할 수 있다. 특정 구현예에서, "이중특이적 ds 디아바디"는 2개의 상이한 항원(또는 에피토프)을 표적화하는 디아바디이다.
특정 구현예에서, "scFv 이량체"는 2개의 scFv를 연결함으로써 조작될 수 있는 2가 단쇄 가변 단편(디-scFv, 바이-scFv)이다. 2가 디아바디 또는 이가 scFv(BsFv, 디-scFv, 바이-scFv)는 또 다른 VH-VL 모이어티와 이량체화되어 하나의 모이어티의 VH가 다른 모이어티의 VL과 배위하고 동일한 항원(또는 에피토프) 또는 상이한 항원(또는 에피토프)을 표적화할 수 있다. 다른 구현예에서, "scFv 이량체"는 VH1 및 VL1이 배위되고 VH2 및 VL2가 배위되며 각각의 배위된 쌍이 상이한 항원 특이성을 갖도록 VL1-VH2(또한 펩타이드 링커에 의해 연결됨)와 결합된 VH1-VL2(펩타이드 링커에 의해 연결됨)를 포함하는 이중특이적 디아바디이다.
"도메인 항체"는 중쇄의 가변 도메인 또는 경쇄의 가변 도메인만을 함유하는 항체 단편을 지칭한다. 특정 경우, 2개 이상의 VH 도메인은 펩타이드 링커와 공유적으로 연결되어 2가 또는 다가 도메인 항체를 생성한다. 2가 도메인 항체의 2개의 VH 도메인은 동일하거나 상이한 항원을 표적화할 수 있다.
"이중특이적" 항체는 2개의 상이한 단일클론 항체로부터 유래된 단편을 가지며 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 인공 항체를 지칭한다. 2개의 에피토프는 동일한 항원 상에 존재할 수 있거나, 또는 이들은 2개의 상이한 항원 상에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 "암"은 악성 세포 성장 또는 신생물, 비정상적 증식, 침윤 또는 전이를 특징으로 하는 임의의 의학적 상태를 지칭하며, 고형 종양 및 비고형암(혈액학적 악성 종양), 예컨대 백혈병 모두를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "고형 종양"은 신생물성 및/또는 악성 세포의 고형 덩어리를 지칭한다. 암 또는 종양의 예는 혈액학적 악성 종양, 구강 암종(예를 들어 입술, 혀 또는 인두), 소화 기관(예를 들어 식도, 위, 소장, 결장, 대장 또는 직장), 복막, 간 및 담관 통로, 췌장, 호흡계, 예컨대 후두 또는 폐(소세포 및 비소세포), 뼈, 결합 조직, 피부(예컨대, 흑색종), 유방, 생식 기관(나팔관, 자궁, 자궁 경부, 고환, 난소 또는 전립선), 요로(예컨대, 방광 또는 신장), 뇌 및 내분비선, 예컨대 갑상선을 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 난소암, 유방암, 두경부암, 신장암, 방광암, 간세포암, 및 결장직장암으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 암은 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종 및 B 세포 림프종으로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "키메라"는 하나의 종으로부터 유래된 중쇄 및/또는 경쇄의 일부, 및 상이한 종으로부터 유래된 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지를 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 의미한다. 예시적인 예에서, 키메라 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역 및 비인간 동물, 예컨대 마우스 또는 토끼로부터 유래된 가변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 기니아 피그, 또는 햄스터이다.
본원에 사용된 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 두 분자 사이, 예를 들어 항체와 항원 사이의 비무작위 결합 반응을 지칭한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편은 ≤10-6 M(예컨대, ≤5x10-7 M, ≤2x10-7 M, ≤10-7 M, ≤5x10-8 M, ≤2x10-8 M, ≤10-8 M, ≤5x10-9 M, ≤4x10-9 M, ≤3x10-9 M, ≤2x10-9 M, 또는 ≤10-9 M)의 결합 친화도(KD)로 인간 LILRB4에 특이적으로 결합한다. 본원에 사용된 KD는 해리 속도 대 결합 속도의 비율(Koff/kon)를 지칭하며, 이는 비제한적으로 표면 플라즈몬 공명 방법, 마이크로스케일 열영동 방법, HPLC-MS 방법 및 유동 세포측정(예컨대, FACS) 방법을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 통상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, KD 값은 유세포 분석법을 사용하여 적절하게 결정될 수 있다.
본원에 사용된 "결합을 차단하는" 또는 "동일한 에피토프에 대해 경쟁하는" 능력은 두 분자(예컨대, 인간 LILRB4 및 항-LILRB4 항체) 사이의 결합 상호작용을 임의의 감지가능한 정도까지 억제하는 항체 또는 항원 결합 단편의 능력을 지칭한다. 특정 구현예에서, 두 분자 사이의 결합을 차단하는 항체 또는 항원 결합 단편은 두 분자 사이의 결합 상호작용을 적어도 85%, 또는 적어도 90% 억제한다. 특정 구현예에서, 이러한 억제는 85% 초과, 또는 90% 초과일 수 있다.
당업자는 과도한 실험 없이, 주어진 항체가 본 개시내용의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 후자가 LILRB4 항원 폴리펩타이드에 결합하는 것을 전자가 방지하는지 확인함으로써 결정할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 주어진 항체가 LILRB4 항원 폴리펩타이드에 대한 본 개시내용의 항체에 의한 결합의 감소에 의해 나타낸 바와 같이 본 개시내용의 항체와 경쟁하면, 두 항체는 동일하거나 밀접하게 관련된 에피토프에 결합한다. 또는 LILRB4 항원 폴리펩타이드에 대한 주어진 항체의 결합이 본 개시내용의 항체에 의해 억제되면, 두 항체는 동일하거나 밀접하게 관련된 에피토프에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 항원에 대한 원하는 특이성을 T 세포, NK 세포 및 대식세포와 같은 면역 효과기 세포 내로 이식할 수 있는 조작된 수용체를 지칭한다. 전형적으로, CAR 단백질은 원하는 특이성을 도입하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 면역 효과기 세포가 항원에 결합할 때 면역 효과기 세포에 신호를 전달하는 세포내 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 도메인은 리더 펩타이드, 항원 인식 영역 및 스페이서 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항원 인식 영역은 항원에 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 항원 인식 영역은 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv)이다. 특정 구현예에서, 단쇄 가변 단편(scFv)은 인간화 항체로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 단쇄 가변 단편은 가요성 링커를 통해 경쇄 가변 영역에 융합된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
아미노산 서열과 관련된 "보존적 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환은 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기(예컨대 Met, Ala, Val, Leu 및 Ile) 사이에서, 중성 친수성 측쇄를 갖는 잔기(예컨대 Cys, Ser, Thr, Asn 및 Gln) 사이에서, 산성 측쇄를 갖는 잔기(예컨대 Asp, Glu) 사이에서, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대 His, Lys, 및 Arg) 사이에서, 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기(예컨대, Trp, Tyr 및 Phe) 사이에서 이뤄질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 보존적 치환은 일반적으로 단백질 입체 구조에 유의한 변화를 야기하지 않으며, 따라서 단백질의 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
본원에 사용된 "효과기 기능"은 C1 복합체 및 Fc 수용체와 같은 그의 효과기에 대한 항체의 Fc 영역의 결합에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 예시적인 효과기 기능은 항체와 C1 복합체 상의 C1q의 상호작용에 의해 유도된 보체 의존성 세포독성(CDC); 효과기 세포 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 Fc 영역의 결합에 의해 유도된 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC); 및 식작용(식균작용)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 원자 또는 아미노산의 특정 그룹을 지칭한다. 두 항체가 항원에 대한 경쟁적 결합을 나타내는 경우 이들은 항원 내에서 동일하거나 밀접하게 관련된 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편이 항원에 대한 참조 항체의 결합을 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 차단하면, 항체 또는 항원 결합 단편은 참조 항체와 동일한/밀접하게 관련된 에피토프에 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상동체" 및 "상동"은 상호교환가능하고, 최적으로 정렬될 때 또 다른 서열에 대해 적어도 80%(예컨대, 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열(또는 그의 상보적 가닥) 또는 아미노산 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 문구 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터가 도입된 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "인간화된"은 항체 또는 항원 결합 단편이 비인간 동물로부터 유래된 CDR, 인간으로부터 유래된 FR 영역, 및 적용가능한 경우, 인간으로부터 유래된 불변 영역을 포함하는 것을 의미한다.
"단리된" 물질은 자연 상태로부터 인간의 손에 의해 변경되었다. "단리된" 조성물 또는 물질이 자연에서 발생하는 경우, 그것은 변화되었거나 원래의 환경으로부터 제거되었거나, 또는 둘 모두이다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 "단리된" 것이 아니지만, 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 실질적으로 순수한 상태로 존재하도록 그의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 충분히 분리되었다면 "단리"된다. "단리된 핵산 서열"은 단리된 핵산 분자의 서열을 지칭한다. 특정 구현예에서, "단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편"은 전기영동 방법(예컨대, SDS-PAGE, 등전 포커싱, 모세관 전기영동), 또는 크로마토그래피 방법(예컨대, 이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 순도를 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭한다.
"리더 펩타이드"는 분비 경로의 일부를 형성하는 새로 합성된 단백질의 N 말단에 존재하는 약 5-30개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드를 지칭한다. 분비 경로의 단백질은 비제한적으로 특정 소기관(소포체, 골지 또는 엔도솜) 내부에 상주하거나, 세포로부터 분비되거나, 또는 세포막 내로 삽입된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 리더 펩타이드는 단백질의 막횡단 도메인의 일부를 형성한다.
본원에 사용된 "LILRB4"는 영장류(예컨대, 인간, 원숭이) 및 설치류(예컨대, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터 유래된 LILRB4를 지칭한다. 인간 LILRB4의 예시적인 서열은 GenBank 서열 참조번호 NP_001265355, AAH26309, ABM83015, ABM86208, AIC55892를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "LILRB4"는 인간 LILRB4의 임의의 형태, 예를 들어, 1) 천연의 처리되지 않은 LILRB4 분자, "전장" LILRB4 사슬 또는 LILRB4의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체; 2) 세포에서의 처리로부터 초래되는 LILRB4의 임의의 형태; 또는 3) 재조합 방법을 통해 생성된 LILRB4 서브유닛의 전장, 단편(예컨대, 절단된 형태, 세포외/막횡단 도메인) 또는 변형된 형태(예컨대, 돌연변이된 형태, 글리코실화/PEG화, His-태그/면역형광 융합 형태)를 포괄하는 것으로 의도된다.
용어 "항-LILRB4 항체"는 LILRB4(예컨대, 인간 또는 원숭이 LILRB4)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 "LILRB4 관련" 질환 또는 병태는 LILRB4의 증가되거나 감소된 발현 또는 활성에 의해 유발되거나, 악화되거나, 또는 관련되는 임의의 질환 또는 병태를 지칭한다. 일부 구현예에서, LILRB4 관련 병태는 면역 관련 장애, 예를 들어, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 감염성 질환이다.
본원에 사용된 용어 "연결"은 분자내 상호작용, 예컨대, 공유 결합, 금속 결합, 및/또는 이온 결합, 또는 분자간 상호작용, 예컨대, 수소 결합 또는 비공유 결합을 통한 회합을 지칭한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 기재된 구성요소들이 그들의 통상적인 기능을 수행하도록 구성되는 요소들의 배열을 지칭한다. 따라서, 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결된 주어진 신호 펩타이드는 세포로부터 폴리펩타이드의 분비를 지시한다. 프로모터의 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 코딩 서열의 발현을 지시할 것이다. 프로모터 또는 다른 제어 요소는 이들이 이의 발현을 지시하는 기능을 하는 한 코딩 서열과 인접할 필요가 없다. 예를 들어, 개재하는 번역되지 않았지만 전사된 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 관한 "퍼센트(%) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 동일한 아미노산(또는 핵산)의 최대 개수를 달성하기 위해 필요한 경우 갭을 도입한 후, 참조 서열 내의 아미노산(또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산(또는 핵산) 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 잔기의 보존적 치환은 동일한 잔기로서 고려되거나 고려되지 않을 수 있다. 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, BLASTN, BLASTp(U.S. NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 웹사이트에서 이용가능함, 또한 Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410; Stephen F. et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402 참조), ClustalW2(European Bioinformatics Institute의 웹사이트에서 이용가능함, 또한, Higgins D.G. et al., Methods in Enzymology (1996) 266:383-402; Larkin M.A. et al., Bioinformatics (2007) 23:2947-8 참조), 및 ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 도구를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 도구에 의해 제공되는 기본 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 예를 들어, 적합한 알고리즘을 선택함으로써 정렬에 대해 적절하게 파라미터를 맞출 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 단일 가닥 및 이중 가닥 뉴클레오타이드 중합체 모두를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 어느 하나의 유형의 뉴클레오타이드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 브로모우리딘 및 이노신 유도체와 같은 염기 변형, 2',3'-디데옥시리보스와 같은 리보스 변형, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오타이드간 결합 변형을 포함한다.
용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 아미노산의 가닥을 의미한다. 폴리펩타이드 및 단백질은 아미노산 외에도 모이어티를 포함할 수 있고(예컨대, 글리코실화될 수 있고)/있거나 가공되거나 변형될 수 있다. 당업자는 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"이 세포에 의해 생산된 바와 같은 완전한 폴리펩타이드 사슬(신호 서열을 갖거나 갖지 않음)일 수 있거나, 또는 이의 기능적 부분일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 폴리펩타이드 또는 단백질이 때때로, 예를 들어 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 연결되거나 다른 수단에 의해 결합된 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다는 것을 더 이해할 것이다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생 아미노산 및 중합체의 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 지정된 담체, 비히클, 희석제, 부형제(들), 및/또는 염이 일반적으로 제형을 포함하는 다른 성분과 화학적 및/또는 물리적으로 양립가능하고, 이의 수용자와 생리학적으로 양립가능하다는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비인간 동물(예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 지칭한다. 인간은 출생 전 및 출생 후 형태를 포함한다. 많은 구현예에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 환자일 수 있으며, 이는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 제시되는 인간을 지칭한다. 용어 "대상체"는 본원에서 "개체" 또는 "환자"와 상호교환가능하게 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애를 앓을 수 있거나 이에 걸리기 쉽지만 질환 또는 장애의 증상을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료적 유효량" 또는 "유효 투여량"은 질환 또는 병태를 치료하는 데 효과적인 약물의 투여량 또는 농도를 지칭한다. 예를 들어, 암을 치료하기 위한 본원에 개시된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도와 관련하여, 치료적 유효량은 종양 용적을 감소시키거나, 종양의 전부 또는 일부를 근절하거나, 종양 성장 또는 다른 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제 또는 늦추거나, 암 병태를 매개하는 세포의 성장 또는 증식을 억제하거나, 종양 세포 전이를 억제 또는 늦추거나, 종양 또는 암 병태와 관련된 임의의 증상 또는 마커를 개선하거나, 종양 또는 암 병태의 발달을 예방 또는 지연시키거나, 또는 이들의 일부 조합이 가능한 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여량 또는 농도이다.
본원에 사용된 바와 같은 병태의 "치료하는 것" 또는 "치료"는 병태를 예방 또는 완화시키는 것, 병태의 발병 또는 발달 속도를 늦추는 것, 병태를 발병시킬 위험을 감소시키는 것, 병태와 관련된 증상의 발달을 예방 또는 지연시키는 것, 병태와 관련된 증상을 감소 또는 종료시키는 것, 병태의 완전한 또는 부분적 퇴행을 발생시키는 것, 병태를 치유하는 것, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 상기 단백질의 발현을 일으키도록 작동가능하게 삽입될 수 있는 비히클을 지칭한다. 벡터는 숙주 세포 내에서 그것이 운반하는 유전 요소의 발현을 일으키도록 숙주 세포를 형질전환, 형질도입 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC), 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC), 박테리오파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스를 포함한다. 벡터로서 사용되는 동물 바이러스의 카테고리는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예컨대, 단순포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 및 파포바바이러스(예컨대, SV40)를 포함한다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택가능한 요소, 및 리포터 유전자를 포함하는 발현을 제어하기 위한 다양한 요소를 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 원점을 함유할 수 있다. 벡터는 또한 비제한적으로 바이러스 입자, 리포솜, 또는 단백질 코팅을 포함하는 세포 내로의 그의 진입을 보조하는 물질을 포함할 수 있다. 벡터는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터일 수 있다. 본 개시내용은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 본원에 제공된 핵산 서열, 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터(예컨대, SV40, CMV, EF-1α), 및 적어도 하나의 선택 마커를 함유하는 벡터(예컨대, 발현 벡터)를 제공한다. 벡터의 예는, 비제한적으로, 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예컨대, 단순포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 파포바바이러스(예컨대, SV40), 람다 파지, 및 M13 파지, 플라스미드 pcDNA3.3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos 등을 포함한다.
II. 항-LILRB4 항체 및 항원 결합 단편
일 양태에서, 본 개시내용은 LILRB4에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 항-LILRB4 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, LILRB4에 결합할 때, 이러한 항체는 LILRB4의 활성화를 조절한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은, LILRB4에 결합할 때, LILRB4의 활성화를 억제한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은, LILRB4에 결합할 때, ApoE 및 LILRB4 사이의 상호작용을 특이적으로 방해, 차단 또는 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편은 LILRB4의 ApoE 매개 활성을 억제할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 LILRB4에 특이적으로 또는 선택적으로 결합한다.
본원에 제공된 항체 및 항원 결합 단편의 결합 친화도는 KD 값으로 나타낼 수 있으며, 이는 항원과 항원 결합 분자 사이의 결합이 평형에 도달할 때의 해리 속도 대 결합 속도의 비율(koff/kon)을 나타낸다. 항원 결합 친화도(예컨대, KD)는 예를 들어, 바이오층 간섭측정법을 포함하는 당업계에 공지된 적합한 방법을 사용하여 적절하게 결정될 수 있다.
인간 LILRB4에 대한 항체의 결합은 또한 "반최대 유효 농도"(EC50) 값으로 나타낼 수 있으며, 이는 그의 최대 효과(예컨대, 결합 또는 억제 등)의 50%가 관찰되는 항체의 농도를 지칭한다. EC50 값은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 샌드위치 분석, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯, 유세포 분석 및 기타 결합 분석에 의해 측정될 수 있다.
특이적 항-LILRB4 항체
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 항-LILRB4 항체의 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 CDR 서열을 포함하는 항-LILRB4 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. CDR은 항원 결합을 담당하는 것으로 알려져 있지만, 6개의 모든 CDR이 필수 불가결하거나 변경할 수 없는 것은 아닌 것으로 밝혀졌다. 즉, 본원에 개시된 항-LILRB4 항체에서 하나 이상의 CDR을 대체 또는 변경 또는 변형시키지만 LILRB4에 대한 특이적 결합 친화도를 실질적으로 보유할 수 있다.
특정 구현예에서, LILRB4 항체는 서열번호: 1의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호: 3의 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체 H7K3로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 항-LILRB4 항체는 H7K3과 비교하여 향상된 안정성을 갖지만, LILRB4에 대한 특이적 결합 친화도를 실질적으로 보유한다.
특정 구현예에서, LILRB4 항체는 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역(HC-CDR) 1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HC CDR2 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HC CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는다. 특정 구현예에서, HC-CDR3은 아미노산 잔기 W에 돌연변이를 갖는 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, LILRB4 항체는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역(LC-CDR) 1, 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2 및 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 아미노산 잔기 NS에 돌연변이를 갖는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1, 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2 및 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3을 포함한다. 특정 구현예에서, LC-CDR1은 서열번호: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다
특정 구현예에서, LILRB4 항체는 하기 표 1에 열거된 바와 같은 CDR 서열을 갖는다.
표 1. 항-LILRB4 항체의 CDR 서열
Figure pct00001
상기 항-LILRB4 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열이 아래에 제공된다.
Figure pct00002
Figure pct00003
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 항체 및 이의 항원 결합 단편이 LILRB4에 특이적으로 결합할 수 있는 한 적합한 프레임워크 영역(FR) 서열을 포함한다. 표 1에 제공된 CDR 서열은 재조합 기술과 같은 당업계에 공지된 적합한 방법을 사용하여 임의의 적합한 종, 예컨대 그 중에서도 마우스, 인간, 래트, 토끼의 임의의 적합한 FR 서열에 이식될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 인간화된다. 인간화 항체 또는 항원 결합 단편은 인간에서 그의 감소된 면역원성에서 바람직하다. 인간화 항체는 비인간 CDR 서열이 인간 또는 실질적으로 인간 FR 서열에 이식되기 때문에 그의 가변 영역에서 키메라성이다. 항체 또는 항원 결합 단편의 인간화는 인간 면역글로불린 유전자 내의 상응하는 인간 CDR 유전자를 비인간(예를 들어 쥣과) CDR 유전자로 치환함으로써 본질적으로 수행될 수 있다(예를 들어, Jones et al., Nature (1986) 321:522-525; Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327; Verhoeyen et al., Science (1988) 239:1534-1536 참조).
적합한 인간 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 이러한 목적을 달성하기 위해 선택될 수 있다. 예시적인 예에서, "최적 적합(best-fit)" 접근법이 사용될 수 있고, 여기서 비인간(예컨대, 설치류) 항체 가변 도메인 서열이 공지된 인간 가변 도메인 서열의 데이터베이스에 대해 스크리닝되거나 BLAST되고, 비인간 질의 서열에 가장 가까운 인간 서열이 확인되고 비인간 CDR 서열을 이식하기 위한 인간 스캐폴드로서 사용된다(예를 들어, Sims et al., J. Immunol. (1993) 151:2296; Chothia et al., J. Mot. Biol. (1987) 196:901 참조). 대안적으로, 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크가 비인간 CDR의 이식에 사용될 수 있다(예를 들어, Carter et at. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:4285; Presta et al., J. Immunol. (1993) 151:2623 참조).
특정 구현예에서, 본원에 제공된 인간화 항체 또는 항원 결합 단편은 비인간 CDR 서열을 제외하고 실질적으로 모든 인간 서열로 구성된다. 일부 구현예에서, 가변 영역 FR 및 불변 영역은 존재하는 경우 전적으로 또는 실질적으로 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 인간 FR 서열 및 인간 불변 영역 서열은 상이한 인간 면역글로불린 유전자, 예를 들어, 하나의 인간 항체로부터 유래된 FR 서열 및 또 다른 인간 항체로부터 유래된 불변 영역일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 인간화 항체 및 이의 항원 결합 단편은 H7의 중쇄 FR 서열 및/또는 K3의 경쇄 FR 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간으로부터 유래된 FR 영역은 그것이 유래되는 인간 면역글로불린과 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 FR의 하나 이상의 아미노산 잔기는 모 비인간 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환된다. 이는 특정 구현예에서 인간화 항체 또는 그의 단편이 비인간 모 항체 구조에 매우 근사하게 하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 인간화 항체 또는 항원 결합 단편은 각각의 인간 FR 서열에서 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기 치환, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 모든 FR에서 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 잔기에서의 이러한 변화는 중쇄 FR 영역에만, 경쇄 FR 영역에만, 또는 양쪽 사슬에 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 1, 11, 13, 15, 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 서열번호: 3, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-LILRB4 항체 및 항원 결합 단편은 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 및/또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 항-LILRB4 항체 및 항원 결합 단편은 본원에 제공된 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 구성되는 단일 도메인 항체이다. 이러한 단일 도메인 항체의 더 많은 정보는 당업계에서 이용가능하다(예컨대 미국 특허 제6,248,516호 참조).
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-LILRB4 항체 및 이의 단편은 면역글로불린 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역은 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, 및/또는 CH2-CH3 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 Fc 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 Cκ 또는 Cλ를 포함한다.
본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편은 단일클론 항체, 다클론 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 이중특이적 항체, 표지된 항체, 2가 항체, 또는 항이디오타입 항체일 수 있다. 재조합 항체는 동물에서가 아닌 재조합 방법을 사용하여 시험관내에서 제조된 항체이다.
항체 변이체
본원에 제공된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 또한 이의 다양한 변이체를 포괄한다. 특정 구현예에서, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 본원에 제공된 예시적인 항체의 다양한 유형의 변이체를 포괄한다.
특정 구현예에서, 항체 변이체는 표 1에 제공된 바와 같은 하나 이상의 CDR 서열, 본원에 제공된 하나 이상의 가변 영역 서열(그러나 임의의 CDR 서열은 아님), 및/또는 불변 영역(예컨대, Fc 영역)에 하나 이상의 변형 또는 치환을 포함한다. 이러한 변이체는 그들의 모 항체의 LILRB4에 대한 특이적 결합 친화도를 보유하지만, 변형(들) 또는 치환(들)에 의해 부여되는 하나 이상의 바람직한 특성을 갖는다. 예를 들어, 항체 변이체는 개선된 항원 결합 친화도, 개선된 글리코실화 패턴, 감소된 글리코실화의 위험, 감소된 탈아미드화 또는 탈아민화, 개선되거나 증가된 효과기 기능(들), 감소되거나 고갈된 효과기 기능(들), 개선된 FcRn 수용체 결합, 증가된 약동학적 반감기, pH 민감성, 및/또는 접합에 대한 양립가능성(예컨대, 하나 이상의 도입된 시스테인 잔기)을 가질 수 있다.
모 항체 서열은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"을 사용하여 변형 또는 치환될 적합하거나 바람직한 잔기를 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다(예를 들어, Cunningham and Wells(1989) Science, 244:1081-1085 참조). 간략하게, 표적 잔기(예컨대, Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu와 같은 하전된 잔기)는 중성 또는 음전하를 띤 아미노산(예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 확인 및 대체될 수 있고, 변형된 항체가 생성되고 관심있는 특성에 대해 스크리닝된다. 특정 아미노산 위치에서의 치환이 관심있는 기능적 변화를 입증한다면, 그 위치는 변형 또는 치환을 위한 잠재적 잔기로서 확인될 수 있다. 잠재적인 잔기는 상이한 유형의 잔기(예컨대, 시스테인 잔기, 양전하를 띤 잔기 등)로 치환함으로써 추가로 평가될 수 있다.
친화도 변이체
친화도 변이체는 본원에 제공된 하나 이상의 CDR 서열, 하나 이상의 FR 서열, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열에 변형 또는 치환을 함유할 수 있다. 친화도 변이체는 모 항체의 LILRB4에 대한 특이적 결합 친화도를 보유하거나, 심지어 모 항체에 비해 개선된 LILRB4 특이적 결합 친화도를 갖는다.
이러한 목적을 달성하기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 변이체(예컨대, Fab 또는 scFv 변이체)의 라이브러리는 파지 디스플레이 기술로 생성 및 발현된 다음, 인간 LILRB4에 대한 결합 친화도에 대해 스크리닝될 수 있다. 또 다른 예를 들어, 컴퓨터 소프트웨어는 인간 LILRB4에 대한 항체의 결합을 가상으로 시뮬레이션하고, 결합 인터페이스를 형성하는 항체 상의 아미노산 잔기를 확인하는 데 사용될 수 있다. 이러한 잔기는 결합 친화도의 감소를 방지하도록 치환에서 회피되거나 더 강한 결합을 제공하는 치환에 대해 표적화될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 인간화 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 CDR 서열, 및/또는 하나 이상의 FR 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 친화도 변이체는 CDR 서열 및/또는 FR 서열에서 전체적으로 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-LILRB4 항체 및 이의 항원 결합 단편은 표 1에 열거된 것(또는 것들)에 대해 적어도 80%(예컨대, 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 동일성을 갖는 1, 2, 또는 3개의 CDR 서열을 포함하는 한편, 그의 모 항체와 유사하거나 심지어 더 높은 수준으로 LILRB4에 대한 결합 친화도를 보유한다.
특정 구현예에서, 항-LILRB4 항체 및 이의 항원 결합 단편은 본원에 제공된 것(또는 것들)에 대해 적어도 80%(예컨대, 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 가변 영역 서열을 포함하는 한편, 그의 모 항체와 유사하거나 심지어 더 높은 수준으로 LILRB4에 대한 결합 친화도를 보유한다. 일부 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부의 영역(예컨대, FR)에서 발생한다.
글리코실화 변이체
또 다른 구현예에서, 항체는 특정 글리코실화 패턴을 포함한다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 글리코실화가 결여되어 있다). 항체의 글리코실화 패턴은 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체 서열 내의 글리코실화 부위 중 하나 이상을 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 초래하여 그 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합도를 증가시킬 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호를 참고한다.
글리코실화 패턴이 저푸코실화되거나 아푸코실화된 글리칸, 예컨대 저푸코실화된 항체 또는 아푸코실화된 항체가 글리칸 상의 푸코실 잔기의 감소된 양을 갖는 항체가 또한 제조될 수 있다. 항체는 또한 증가된 양의 이등분하는 GlcNac 구조를 갖는 글리칸을 포함할 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 변형은, 예를 들어, 특정 글리코실화 패턴을 갖는 당단백질을 생산하도록 글리코실화 경로가 유전적으로 조작된 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 이들 세포는 당업계에 기술되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현하여 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8(α(1,6)-푸코실프랜스퍼라제)이 결여되어 있어서, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현되는 항체는 이들의 탄수화물 상에 푸코스가 결여되어 있다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적화된 파괴에 의해 생성되었다(미국 특허공개 제20040110704호 참고). 또 다른 예로서, EP 제1 176 195호는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기술하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 α-1,6 결합 관련 효소를 감소 또는 제거함으로써 저푸코실화를 나타낸다. EP 제1 176 195호는 또한 항체의 Fc 영역에 결합하거나 효소 활성을 갖지 않는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 첨가하기 위한 낮은 효소 활성을 갖는 세포주, 예를 들어 래트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)를 기술한다. PCT 공개 WO 제2003/035835호는 Asn(297) 연결된 탄수화물에 푸코스를 부착하는 능력이 감소되어, 또한 그 숙주 세포에서 발현된 항체의 고푸코실화를 초래하는, 변이체 CHO 세포주인 Lec13 세포를 기술한다. 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는 또한 PCT 공개 WO 제06/089231호에 기재된 바와 같이 달걀에서 생산될 수 있다. 대안적으로, 변형된 글리코실화 프로파일을 갖는 항체는 식물 세포, 예컨대 렘나(Lemna)에서 생산될 수 있다(미국 특허 제7,632,983호). 식물 시스템에서 항체를 생산하는 방법은 미국 특허 제6,998,267호 및 제7,388,081호에 개시되어 있다. PCT 공개 WO제1999/054342호는 조작된 세포주에서 발현된 항체가 증가된 이등분성 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 증가된 ADCC 활성을 초래하도록 당단백질 변형 글리코실 트랜스퍼라제(예컨대, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기술한다. 저푸코실화는 푸코실화가 항체 상에서 최소일 때 아푸코실화로도 불린다.
대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단될 수 있으며, 예컨대, 푸코시다제 α-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다. 본원에 개시된 항체는 하등 진핵생물 숙주 세포에서 생산된 것을 추가로 포함하며, 특히 진균 숙주 세포, 예컨대 효모 및 사상 진균은 포유동물 유사 또는 인간 유사 글리코실화 패턴을 갖는 당단백질을 생산하도록 유전적으로 조작되었다. 현재 사용되는 포유동물 세포주에 비해 이러한 유전적으로 변형된 숙주 세포의 특별한 이점은 특정 N-글리칸 구조가 우세한 당단백질의 조성물이 생산될 수 있도록 세포에서 생산되는 당단백질의 당화 프로파일을 제어하는 능력이다(예컨대, 미국 특허 제7,029,872호 및 제7,449,308호 참조). 이러한 유전적으로 변형된 숙주 세포는 우세하게 특정한 N-글리칸 구조를 갖는 항체를 생산하는데 사용되어 왔다.
또한, 효모 또는 사상 진균과 같은 진균은 푸코실화된 당단백질을 생산하는 능력이 부족하기 때문에, 이러한 세포에서 생산된 항체는 푸코실화된 당단백질을 생산하기 위한 효소 경로를 포함하도록 세포가 추가로 변형되지 않는 한 푸코스가 부족할 것이다(예를 들어, PCT 공개 WO제2008112092호 참조). 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 하등 진핵 숙주 세포에서 생산된 것들을 추가로 포함하고, 이는 비제한적으로 GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2와 같은 N-글리칸을 포함하는 이등분 및 다중안테나 종을 포함을 포함하는 푸코실화된 및 비푸코실화된 하이브리드 및 복합 N-글리칸을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 조성물은 GlcNAcMan5GlcNAc2; GalGlcNAcMan5GlcNAc2; 및 NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 하이브리드 N-글리칸을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 하이브리드 N-글리칸은 조성물 내에서 우세한 N-글리칸 종이다. 추가의 양태에서, 하이브리드 N-글리칸은 조성물 내의 하이브리드 N-글리칸의 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 차지하는 특정 N-글리칸 종이다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 조성물은 GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan3GlcNAc2; NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2; GlcNAc2Man3GlcNAc2; GalGlcNAc2Man3GlcNAc2; Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 복합 N-글리칸을 갖는 항체를 포함한다. 특정 양태에서, 복합 N-글리칸은 조성물 내에서 우세한 N-글리칸 종이다. 추가의 양태에서, 복합 N-글리칸은 조성물 내의 복합 N-글리칸의 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 포함하는 특정 N-글리칸 종이다. 특정 구현예에서, N-글리칸은 푸코실화된다. 일반적으로, 푸코스는 N-글리칸의 환원 말단에 있는 GlcNAc와의 α1,3 연결, N-글리칸의 환원 말단에 있는 GlcNAc와의 α1,6 연결, N-글리칸의 비환원 말단에 있는 Gal과의 α1,2 연결, N-글리칸의 비환원 말단에 있는 GlcNac와의 α1,3 연결, 또는 N-글리칸의 비환원 말단에 있는 GlcNac와의 α1,4 연결 내에 있다.
따라서, 상기 당단백질 조성물의 특정 양태에서, 당형(glycoform)은 Man5GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc), Man3GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc), GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)로 이루어진 군으로부터 선택된 당형을 생산하기 위한 α1,3 연결 또는 α1,4 연결 푸코스 내에 있거나; GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2, GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2, GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 당형을 생산하기 위한 α1,3 연결 또는 α1,4 연결 푸코스 내에 있거나; 또는 Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 당형을 생산하기 위한 α1,2 연결 푸코스 내에 있다.
추가의 양태에서, 항체는 비제한적으로 Man8GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man5GlcNAc2, Man4GlcNAc2, 또는 Man3GlcNAc2 N-글리칸 구조로 구성되는 N-글리칸을 포함하는 높은 만노스 N-글리칸을 포함한다. 상기의 추가의 양태에서, 복합 N-글리칸은 푸코실화된 및 비푸코실화된(또는 아푸코실화된) 이등분된 및 다중 안테나리 종을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "N-글리칸" 및 "당형"은 상호교환가능하게 사용되며, N-연결된 올리고당, 예를 들어 폴리펩타이드의 아스파라긴 잔기에 대한 아스파라긴-N-아세틸글루코사민 결합에 의해 부착된 것을 지칭한다. N-연결된 당단백질은 단백질 내의 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 연결된 N-아세틸글루코사민 잔기를 함유한다.
본원에 제공된 항-LILRB4 항체 및 항원 결합 단편은 또한 항체 또는 항원 결합 단편의 글리코실화 정도를 증가 또는 감소시키기 위해 수득될 수 있는 글리코실화 변이체를 포괄한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 탄수화물 모이어티(예컨대, 올리고당 구조)가 부착될 수 있는 측쇄를 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결이다. N-연결은 아스파라긴 잔기, 예를 들어, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌과 같은 트리펩타이드 서열에서의 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭하며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. O-연결된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세일갈락토사민, 갈락토스, 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭한다. 천연 글리코실화 부위의 제거는, 예를 들어, 서열 내에 존재하는 상기 기재된 트리펩타이드 서열 중 하나(N-연결된 글리코실화 부위의 경우) 또는 세린 또는 트레오닌 잔기(O-연결된 글리코실화 부위의 경우)가 치환되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 새로운 글리코실화 부위는 이러한 트리펩타이드 서열 또는 세린 또는 트레오닌 잔기를 도입함으로써 유사한 방식으로 생성될 수 있다.
글리코실화 변형의 한 가지 유형은 푸코실화를 포함한 부위 특이적 글리코실화를 담당하는 특정 효소 경로가 결핍된 항체 생산 세포로 이루어진다. 예를 들어, 푸코실화가 결여된 항체(아푸코실화된 항체로 지칭됨)는 일반적으로 향상된 ADCC 활성을 갖는다. 아푸코실화된 H7K3m5를 이용하여, 시험된 PBMC 공여자의 25-50%에서 ADCC를 통한 정상 단핵구의 사멸이 관찰되었다(도 14a-14d, 및 도 15c-15d). 또한, 도 15a-15b에 나타낸 바와 같이, 아푸코실화된 H7K3m5 및 야생형 H7K3m5 모두는 자가 ADCC를 통해 pDC의 사멸을 초래하였다. 한편, 단핵구는 공여자에 따라 아푸코실화된 H7K3m5로만 사멸될 수 있으며, 야생형 H7K3m5로는 사멸되지 않을 수 있다(도 15c-15d).
시스테인 조작된 변이체
본원에 제공된 항-LILRB4 항체 및 항원 결합 단편은 또한 하나 이상의 도입된 유리 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 시스테인 조작된 변이체를 포괄한다.
유리 시스테인 잔기는 디설파이드 브릿지의 일부가 아닌 잔기이다. 시스테인 조작된 변이체는, 예를 들어 말레이미드 또는 할로아세틸을 통해, 조작된 시스테인 부위에서, 예를 들어 그 중에서도 세포독성 및/또는 이미징 화합물, 표지, 또는 방사성이소타입과의 접합에 유용하다. 유리 시스테인 잔기를 도입하기 위해 항체 또는 항원 결합 단편을 조작하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 WO제2006/034488호를 참고한다.
Fc 변이체
본원에 개시된 항체는 또한 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 효과기 기능(예컨대, 항원 의존적 세포 세포독성)을 변경하기 위해, Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 더욱이, 본원에 개시된 항체는 화학적으로 변형되거나(예컨대, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 그의 글리코실화를 변경하고, 다시 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하도록 변형될 수 있다. 이들 구현예 각각은 아래에서 더욱 상세히 설명된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 Kabat의 EU 지수의 넘버링이다. 본원에 개시된 항체는 또한 변경된 효과기 기능을 제공하기 위해 변형된(또는 차단된) Fc 영역을 갖는 항체를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; WO제2003/086310호; US제2004/0002587호; US제2005/0152894호; US제2005/0249723호; WO제2006/019447호를 참고한다. 이러한 변형은 면역 체계의 다양한 반응을 향상시키거나 억제하는데 사용될 수 있으며, 진단 및 치료에 가능한 유익한 효과를 갖는다. Fc 영역의 변경은 아미노산 변화(치환, 결실 및 삽입), 글리코실화 또는 탈글리코실화, 및 다중 Fc 첨가를 포함한다. Fc에 대한 변화는 또한 치료 항체에서 항체의 반감기를 변경하여, 덜 빈번한 투약 및 이에 따른 증가된 편리성 및 감소된 물질의 사용을 가능하게 할 수 있다. 이러한 돌연변이는 힌지 영역에서 중쇄간 디설파이드 브릿지의 이질성을 폐지하는 것으로 보고되었다.
일 구현예에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 증가되거나 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,677,425호에 추가로 설명되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 촉진하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다. 또 다른 구현예에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 하기 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: 미국 특허 제6,277,375호에 기재된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 제5,869,046호 및 제6,121,022호에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 구제 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다. 또 다른 구현예에서, Fc 영역은 항체의 효과기 기능(들)을 변경시키기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 항체가 효과기 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원 결합 능력을 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경되는 효과기 리간드는 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 구성요소일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에서 더 상세히 설명된다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO제1994/029351호에 추가로 기재되어 있다. 또 다른 예에서, Fc 영역은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가 또는 감소시키고/시키거나 다음 위치 238, 239, 243, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439에서 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가 또는 감소시키도록 변형된다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 제2000/042072호에 추가로 기재되어 있다. 더욱이, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되었고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되었다. 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특정 돌연변이는 FcγRIII에 대한 결합을 개선하는 것으로 나타났다. 추가적으로, 다음의 조합 돌연변이체 T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A는 FcγRIII 결합을 개선하는 것으로 나타났다.
일 구현예에서, Fc 영역은 잔기 243 및 264를 변형시킴으로써 효과기 기능을 매개하고/하거나 항염증 특성을 증가시키는 항체의 능력을 감소시키도록 변형된다. 일 구현예에서, 항체의 Fc 영역은 위치 243 및 264에서의 잔기를 알라닌으로 변경함으로써 변형된다. 일 구현예에서, Fc 영역은 잔기 243, 264, 267 및 328을 변형시킴으로써 효과기 기능을 매개하고/하거나 항염증 특성을 증가시키는 항체의 능력을 감소시키도록 변형된다.
일 구현예에서, Fc 영역은 잔기 234, 235 및 329를 알라닌 또는 글리신(L234A-L235A-P329G)으로 변형시킴으로써 효과기 기능을 매개하는 항체의 능력을 폐지하도록 변형된다.
본원에 제공된 항-LILRB4 항체 및 항원 결합 단편은 또한 Fc 변이체를 포괄하며, 이는 그의 Fc 영역 및/또는 힌지 영역에 하나 이상의 아미노산 잔기 변형 또는 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-LILRB4 항체 또는 항원 결합 단편은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 pH 의존적 결합을 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 이러한 변이체는 산성 pH에서 FcRn에 결합하여 리소좀에서의 분해로부터 탈출하게 한 다음 전좌되어 세포 밖으로 방출되게 하기 때문에, 연장된 약동학적 반감기를 가질 수 있다. FcRn과의 결합 친화도를 개선하기 위해 항체 및 이의 항원 결합 단편을 조작하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Vaughn, D. et al., Structure, 6(1): 63-73, 1998; Kontermann, R. et al., Antibody Engineering, Volume 1, Chapter 27: Engineering of the Fc region for improved PK, published by Springer, 2010; Yeung, Y. et al., Cancer Research (2010) 70: 3269-3277; 및 Hinton, P. et al., J. Immunology (2006) 176:346-356]을 참고한다.
특정 구현예에서, 항-LILRB4 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 변경시키는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. Fc 영역의 CH2 도메인에서의 특정 아미노산 잔기는 향상된 ADCC 활성을 제공하기 위해 치환될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항체 상의 탄수화물 구조는 ADCC 활성을 향상시키기 위해 변경될 수 있다. 항체 조작에 의해 ADCC 활성을 변경시키는 방법은 당업계에 기술되었고, 예를 들어, 문헌[Shields RL. et al., J Biol Chem. (2001) 276(9): 6591-604; Idusogie EE. et al., J Immunol. (2000) 164(8):4178-84; Steurer W. et al., J Immunol. (1995) 155(3): 1165- 74; Idusogie EE. et al., J Immunol. (2001) 166(4): 2571-5; Lazar GA. et al., PNAS (2006) 103(11): 4005-4010; Ryan MC. et al., Mol. Cancer Ther. (2007) 6: 3009-3018; Richards JO. et al., Mol Cancer Ther. (2008) 7(8): 2517-27; Shields R. L. et al., J. Biol. Chem, 2002, 277: 26733-26740; Shinkawa T. et al., J. Biol. Chem (2003) 278: 3466-3473]을 참고한다.
특정 구현예에서, 항-LILRB4 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, C1q 결합 및/또는 CDC를 개선 또는 감소시킴으로써 보체 의존적 세포독성(CDC)을 변경하는 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다(예를 들어, WO 제99/51642호; Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 Fe 영역 변이체의 다른 예에 관한 WO제1994/029351호 참고).
특정 구현예에서, 항-LILRB4 항체 또는 항원 결합 단편은 이종이량체화를 용이하게 하고/하거나 촉진하기 위해 Fc 영역의 계면 내에 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 이들 변형은 제1 Fc 폴리펩타이드 내로 돌출(protuberance)의 도입 및 제2 Fc 폴리펩타이드 내로 공동(cavity)의 도입을 포함하며, 여기서 돌출은 제1 및 제2 Fc 폴리펩타이드의 상호작용을 촉진하여 이종이량체 또는 복합체를 형성하기 위해 공동 내에 위치될 수 있다. 이러한 변형을 갖는 항체를 생성하는 방법은, 예컨대, 미국 특허 제5,731,168호에 기재된 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다.
항원 결합 단편
또한 항-LILRB4 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 다양한 유형의 항원 결합 단편은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, CDR 및 가변 서열이 본원에 제공된 예시적인 항체, 및 이들의 상이한 변이체(예컨대, 친화도 변이체, 글리코실화 변이체, Fc 변이체, 시스테인 조작된 변이체 등)를 포함하는 본원에 제공된 항-LILRB4 항체에 기초하여 개발될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-LILRB4 항원 결합 단편은 낙타화 단일 도메인 항체, 디아바디, 단쇄 Fv 단편(scFv), scFv 이량체, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F(ab')2, 이중특이적 항체, ds 디아바디, 나노바디, 도메인 항체, 단일 도메인 항체, 또는 2가 도메인 항체이다.
단일 사슬 가변 단편(scFv)은 짧은(보통 세린, 글리신) 링커와 함께 연결된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합체이다. 이러한 키메라 분자는 불변 영역의 제거 및 링커 펩타이드의 도입에도 불구하고 원래의 면역글로불린의 특이성을 보유한다. 이러한 변형은 일반적으로 특이성이 변경되지 않은 상태로 둔다. 이들 분자는 단일 펩타이드로서 항원 결합 도메인을 발현하는 것이 매우 편리한 파지 디스플레이를 용이하게 하기 위해 역사적으로 생성되었다. 대안적으로, scFv는 하이브리도마로부터 유래된 서브클로닝된 중쇄 및 경쇄로부터 직접 생성될 수 있다. 단일 사슬 가변 단편은 완전한 항체 분자에서 발견되는 불변 Fc 영역, 및 따라서 항체를 정제하는 데 사용된 공통 결합 부위(예컨대, 단백질 A/G)가 결여되어 있다. 이러한 단편은 단백질 L이 카파 경쇄의 가변 영역과 상호작용하기 때문에 단백질 L을 사용하여 종종 정제/고정화될 수 있다.
가요성 링커는 일반적으로 나선 및 회전 촉진 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌, 세린 및 글리신으로 구성된다. 그러나, 다른 잔기도 마찬가지로 기능할 수 있다. Tang 등(1996)은 단백질 링커 라이브러리로부터 단쇄 항체(scFv)에 대한 맞춤형 링커를 신속하게 선택하는 수단으로서 파지 디스플레이를 사용하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 유전자가 가변 조성물의 18-아미노산 폴리펩타이드를 코딩하는 분절에 의해 연결된 무작위 링커 라이브러리가 구축되었다. scFv 레퍼토리(약 5 × 106개의 상이한 구성원)를 사상 파지 상에 디스플레이하고 합텐으로 친화도 선택하였다. 선택된 변이체의 집단은 결합 활성에서 유의한 증가를 나타내었지만 상당한 서열 다양성을 보유하였다. 1054개의 개별 변이체를 스크리닝하는 것은 가용성 형태로 효율적으로 생산되는 촉매 활성 scFv를 후속적으로 산출하였다. 서열 분석은 VH C 말단의 2개의 잔기 이후에 링커에서의 보존된 프롤린과 선택된 테더(tether)의 유일한 공통적인 특징으로서 다른 위치에서의 아르기닌 및 프롤린의 풍부함을 밝혀냈다.
본 개시내용의 재조합 항체는 또한 수용체의 이량체화 또는 다량체화를 허용하는 서열 또는 모이어티를 수반할 수 있다. 이러한 서열은 J-사슬과 함께 다량체의 형성을 허용하는 IgA로부터 유래된 것들을 포함한다. 또 다른 다량체화 도메인은 Gal4 이량체화 도메인이다. 다른 구현예에서, 사슬은 두 항체의 조합을 허용하는 비오틴/아비딘과 같은 제제로 변형될 수 있다.
별도의 구현예에서, 단쇄 항체는 비펩타이드 링커 또는 화학적 단위를 사용하여 수용체 경쇄 및 중쇄를 연결함으로써 생성될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 별개의 세포에서 생성되고, 정제되고, 후속적으로 적절한 방식으로 함께 연결될 것이다(즉, 중쇄의 N-말단은 적절한 화학적 브릿지를 통해 경쇄의 C-말단에 부착됨).
가교 시약, 예컨대, 안정화제 및 응고제는 2개의 상이한 분자의 작용기를 묶는 분자 브릿지를 형성하는 데 사용된다. 그러나, 동일한 유사체의 이량체 또는 다량체 또는 상이한 유사체로 구성된 이종량체(heteromeric) 복합체가 생성될 수 있음이 고려된다. 2개의 상이한 화합물을 단계적 방식으로 연결하기 위해, 원치 않는 동종중합체 형성을 제거하는 이종이작용성 가교제가 사용될 수 있다.
예시적인 이종이작용성 가교제는 2개의 반응성 기, 즉 일차 아민기와 반응하는 하나(예컨대, N하이드록시 석신이미드) 및 티올기와 반응하는 다른 하나(예컨대, 피리딜 디설파이드, 말레이미드, 할로겐 등)를 함유한다. 일차 아민 반응성 기를 통해, 가교제는 하나의 단백질(예컨대, 선택된 항체 또는 단편)의 리신 잔기(들)와 반응할 수 있고, 티올 반응성 기를 통해, 이미 제1 단백질에 묶인 가교제가 다른 단백질(예컨대, 선택제)의 시스테인 잔기(유리 설프히드릴 기)와 반응한다.
혈액에서 적정한 안정성을 갖는 가교제가 이용될 것임이 바람직하다. 표적화 및 치료/예방 제제를 접합하는 데 성공적으로 사용될 수 있는 수많은 유형의 디설파이드 결합 함유 링커가 공지되어 있다. 입체적으로 방해되는 디설파이드 결합을 함유하는 링커는 생체내에서 더 큰 안정성을 제공하여 작용 부위에 도달하기 전에 표적화 펩타이드의 방출을 방지하는 것으로 입증될 수 있다. 따라서, 이들 링커는 연결제의 하나의 그룹이다.
또 다른 가교 시약은 SMPT이며, 이는 인접한 벤젠 고리 및 메틸기에 의해 "입체적으로 방해되는" 디설파이드 결합을 함유하는 이작용성 가교제이다. 디설파이드 결합의 입체 장애는 조직 및 혈액에 존재할 수 있는 글루타티온과 같은 티올레이트 음이온에 의한 공격으로부터 결합을 보호하는 기능을 하여 부착된 제제를 표적 부위로 전달하기 전에 접합체의 탈결합을 방지하는 데 도움이 된다고 여겨진다.
SMPT 가교 시약은, 많은 다른 공지된 가교 시약과 마찬가지로, 시스테인 또는 일차 아민의 SH와 같은 작용기(예컨대, 리신의 엡실론 아미노기)를 가교시키는 능력을 준다. 또 다른 가능한 가교제의 유형은 설포석신이미딜-2-(p-아지도 살리실아미도) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트와 같은 절단가능한 디설파이드 결합을 함유하는 이종이작용성 광반응성 페닐아지드를 포함한다. N-하이드록시-석신이미딜기는 일차 아미노기와 반응하고, 페닐아지드(광분해시)는 임의의 아미노산 잔기와 비선택적으로 반응한다.
방해된 가교제 외에도, 방해받지 않은 링커도 이에 따라 사용될 수 있다. 보호된 디설파이드를 함유하거나 생성하는 것으로 간주되지 않는 다른 유용한 가교제는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란을 포함한다(Wawrzynczak & Thorpe, 1987). 이러한 가교제의 사용은 당업계에서 잘 이해된다. 또 다른 구현예는 가요성 링커의 사용을 포함한다.
미국 특허 제4,680,338호는 아민 함유 중합체 및/또는 단백질과 리간드의 접합체를 생산하는 데, 특히 킬레이터, 약물, 효소, 검출가능한 표지 등과의 항체 접합체를 형성하는 데 유용한 이작용성 링커를 기술한다. 미국 특허 제5,141,648호 및 제5,563,250호는 다양한 온화한 조건 하에서 절단가능한 불안정한 결합을 함유하는 절단가능한 접합체를 개시한다. 이러한 링커는 관심있는 제제가 링커에 직접 결합될 수 있고, 절단이 활성제의 방출을 초래한다는 점에서 특히 유용하다. 특정 용도는 항체, 또는 약물과 같은 단백질에 유리 아미노 또는 유리 설프하이드릴기를 첨가하는 것을 포함한다.
미국 특허 제5,856,456호는 융합 단백질, 예컨대, 단쇄 항체를 만들기 위해 폴리펩타이드 구성성분을 연결하는 데 사용하기 위한 펩타이드 링커를 제공한다. 링커는 최대 약 50개 아미노산 길이이고, 하전된 아미노산(바람직하게는 아르기닌 또는 리신) 다음에 프롤린의 적어도 하나의 발생을 함유하고, 더 큰 안정성 및 감소된 응집을 특징으로 한다. 미국 특허 제5,880,270호는 다양한 면역진단 및 분리 기술에 유용한 아미노옥시 함유 링커를 개시하고 있다.
이러한 항원 결합 단편의 생산을 위해 다양한 기술이 사용될 수 있다. 예시적인 방법은, 온전한 항체의 효소적 소화(예컨대, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods (1992) 24:107-117; 및 Brennan et al., Science (1985) 229:81 참조), E. Coli와 같은 숙주 세포에 의한 재조합 발현(예컨대, Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편에 대해), 상기 논의된 바와 같은 상 디스플레이 라이브러리로부터의 스크리닝(예컨대, ScFv에 대해), 및 F(ab')2 단편을 형성하기 위한 2개의 Fab'-SH 단편의 화학적 결합(Carter et al., Bio/Technology(1992) 10:163-167)을 포함한다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다.
특정 구현예에서, 항원 결합 단편은 scFv이다. scFv의 생성은, 예를 들어, WO 제93/16185호; 미국 특허 제5,571,894호; 및 제5,587,458호에 기재되어 있다. scFv는 융합 단백질을 제공하기 위해 아미노 또는 카르복실 말단 중 어느 하나에서 효과기 단백질에 융합될 수 있다(예를 들어, Antibody Engineering, ed. Borrebaeck 참조).
이중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에 개시된 LILRB4 항체는 이중특이적 항체이다. 특정 구현예에서, LILRB4 이중특이적 항체는 T 세포 또는 NK 세포 상의 항원 및 암 세포 상의 LILRB4 상의 항원 모두를 결합시킴으로써 세포독성 T 세포 또는 NK 세포를 암 세포쪽으로 다시 보내는 것을 통해 혈액학적 및 고형 악성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-LILRB4 이중특이적 항체는 CD3과 같은 T 세포 수용체에 대항한다. 일부 구현예에서, 항-LILRB4 이중특이적 항체는 CD16A와 같은 NK 세포 수용체에 대항한다.
본 개시내용의 항-LILRB4 이중특이적 항체는 다양한 형태 및 구조를 가질 수 있는 것으로 이해되며, 이는 도 28a 및 28b에 예시된 바와 같이 LILRB4 및 CD3(LILRB4/CD3 이중특이적)에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체의 예시적인 구현예에 의해 이해될 수 있다.
도 28a에 예시된 바와 같이, 본 발명의 예시적인 구현예에서, LILRB4/CD3 이중특이적 항체는 Y 모양이고 2개의 팔을 포함한다. 제1 중쇄 폴리펩타이드 및 제1 경쇄 폴리펩타이드의 일부에 의해 형성된 항체의 하나의 팔은 중쇄 가변 도메인(VH1) 및 경쇄 가변 도메인(VL1)의 쌍을 포함하고, 이는 LILRB4에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 형성한다. 제2 중쇄 폴리펩타이드 및 제2 경쇄 폴리펩타이드의 일부에 의해 형성된 항체의 다른 팔은 중쇄 가변 도메인(VH2) 및 경쇄 가변 도메인(VL2)의 제2 쌍을 포함한다. VH2 및 VL2는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항원 결합 부위를 형성한다. 이러한 구성에서, 각각의 이중특이적 항체는 LILRB4에 대한 항원 결합 부위의 단일 카피 및 CD3에 대한 항원 결합 부위의 단일 카피를 포함하며, 이는 1+1로 지칭된다.
도 28a의 실시예 4-3ab를 참조하면, 제1 중쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VH1-CH1-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 CH1, CH2 및 CH3은 중쇄 불변 도메인 1, 2 및 3을 지칭하고; 제1 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL1-CL을 포함하며, 여기서 CL은 경쇄 불변 도메인을 지칭하고; 제2 중쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VH2-TCRβ-CH2-CH3을 포함하며; 제2 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL2-TCRα를 포함한다. 이중특이적 항체에서 TCRα 및 TCRβ 불변 도메인의 사용은 경쇄 및 이들의 동족 중쇄의 정확한 결합을 가능하게 하여, LILRB4 및 CD3에 대한 원하는 이중특이적 항체의 더 높은 수율을 야기한다(예컨대, WO제2019057122호A1 참조). 특정 구현예에서, TCRα 도메인은 서열번호: 89의 아미노산 서열을 갖고, TCRβ 도메인은 서열번호: 90의 아미노산 서열을 갖는다.
대안적으로, 도 28a의 4ab-3 구현예에 예시된 바와 같이, 제1 중쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VH1-TCRβ-CH2-CH3을 포함하고; 제1 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL1-TCRα를 포함하며; 제2 중쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VH2-CH1-CH2-CH3을 포함하고; 제2 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL2-CL을 포함한다.
도 28a에 예시된 바와 같이, Y 모양 항체의 줄기는 디설파이드 결합을 통해 함께 결합된 제1 및 제2 중쇄 폴리펩타이드의 제2 및 제3 불변 도메인(CH2 및 CH3)으로 구성된 Fc 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 영역은 노브 인 홀(knobs in holes, KiH) 기술로 조작되며(Ridgway JB et al, Protein Eng (1996) 9:617-21; Atwell S et al, J Mol Biol (1997) 270:26-35; Merchant et al, Nature Biotech (1998) 16, 677-681), 이는 중쇄 폴리펩타이드의 동종이량체화를 방지한다. 요컨대, 2개의 중쇄 폴리펩타이드의 각각의 불변 영역은 이종이량체화를 촉진하기 위해 쌍을 형성하는 노브 또는 홀 중 어느 하나를 생성하도록 돌연변이된다. KiH 기술을 사용한 LILRB4/CD3 이중특이적 항체의 설계는 중쇄의 이종이량체화 및 경쇄 및 이들의 동족 중쇄의 정확한 결합을 가능하게 하여, LILRB4 및 CD3에 대한 원하는 이중특이적 항체의 더 높은 수율로 이어진다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체의 구성은 LILRB4에 대한 항원 결합 부위의 2개의 카피 및 CD3에 대한 항원 결합 부위의 단일 카피를 포함한다. 이러한 구성은 2+1로 지칭되고 도 28a에 예시되어 있다. 이러한 구성에서, LILRB4/CD3 이중특이적 항체는 중쇄/경쇄 폴리펩타이드의 2개의 쌍을 포함하며, 이는 각각 LILRB4 및 CD3에 결합하는 제1 항원 결합 영역과 제2 항원 결합 영역을 형성한다. 1+1 구성과 구별되는, 2+1 구성에서, 하나의 중쇄 폴리펩타이드는 제3 경쇄 폴리펩타이드에서 제3 경쇄 가변 도메인에 동족인 제3 중쇄 가변 도메인(VH3)을 포함하여, LILRB4에 결합하는 제3 항원 결합 영역을 형성한다.
도 28a의 구현예 44-3ab를 참조하면, 본 발명의 예시적인 구현예에서, Y 모양이고 2개의 팔을 포함하는 LILRB4/CD3 이중특이적 항체는 제1 중쇄 폴리펩타이드, 제1 경쇄 폴리펩타이드, 제2 중쇄 폴리펩타이드, 제2 경쇄 폴리펩타이드 및 제3 경쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 제1 중쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VH3- CH1-L-VH1-CH1-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 L은 링커(예컨대, (G4S)2)이고; 제1 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL1-CL을 포함하며; 제2 중쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VH2-TCRβ-CH2-CH3을 포함하고; 제2 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL2-TCRα를 포함하며; 제3 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL3-CL을 포함한다. 항체의 하나의 팔 상에서, VH1 및 VL1은 LILRB4에 대한 제1 항원 결합 부위를 형성하는 반면, VH3 및 VL3은 LILRB4에 대한 제2 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 다른 팔 상에서, VH2 및 VL2는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 형성한다. 특정 구현예에서, 제3 경쇄 폴리펩타이드 VL3-CL은 제1 경쇄 폴리펩타이드 VL1-CL과 동일할 수 있다.
도 28a의 구현예 4ab4ab-3을 참조하면, 본 발명의 예시적인 구현예에서, LILRB4/CD3 이중특이적 항체는 제1 중쇄 폴리펩타이드, 제1 경쇄 폴리펩타이드, 제2 중쇄 폴리펩타이드, 제2 경쇄 폴리펩타이드 및 제3 경쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 제1 중쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VH3-TCRβ-L-VH1-TCRβ-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 L은 링커(예컨대, (G4S)2)이고; 제1 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL1-TCRα를 포함하며; 제2 중쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VH2-CH1-CH2-CH3을 포함하고; 제2 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL2-CL을 포함하며; 제3 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL3-TCRα를 포함한다. 항체의 하나의 팔 상에서, VH1 및 VL1은 LILRB4에 대한 제1 항원 결합 부위를 형성하는 반면, VH3 및 VL3은 LILRB4에 대한 제2 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 다른 팔 상에서, VH2 및 VL2는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 형성한다. 특정 구현예에서, 제3 경쇄 폴리펩타이드 VL3-TCRα는 제1 경쇄 폴리펩타이드 VL1-TCRα와 동일할 수 있다.
도 28a의 구현예 43ab-4를 참조하면, 본 발명의 예시적인 구현예에서, LILRB4/CD3 이중특이적 항체는 제1 중쇄 폴리펩타이드, 제1 경쇄 폴리펩타이드, 제2 중쇄 폴리펩타이드, 제2 경쇄 폴리펩타이드 및 제3 경쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 제1 중쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VH3-CH1-L-VH2-TCRβ-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 L은 링커(예컨대, (G4S)2)이고; 제1 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL2-TCRα를 포함하며; 제2 중쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VH1-CH1-CH2-CH3을 포함하고; 제2 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL1-CL을 포함하며; 제3 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL3-CL을 포함한다. 항체의 하나의 팔 상에, VH1 및 VL1은 LILRB4에 대한 제1 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 다른 팔 상에, VH3 및 VL3은 LILRB4에 대한 제2 항원 결합 부위를 형성하는 반면, VH2 및 VL2는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 형성한다. 특정 구현예에서, 제3 경쇄 폴리펩타이드 VL3-CL은 제1 경쇄 폴리펩타이드 VL1-CL과 동일할 수 있다.
도 28a의 구현예 4ab3-4ab를 참조하면, 본 발명의 예시적인 구현예에서, LILRB4/CD3 이중특이적 항체는 제1 중쇄 폴리펩타이드, 제1 경쇄 폴리펩타이드, 제2 중쇄 폴리펩타이드, 제2 경쇄 폴리펩타이드 및 제3 경쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 제1 중쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VH3-TCRβ-L-VH2-CH1-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 L은 링커(예컨대, (G4S)2)이고; 제1 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL2-CL을 포함하며; 제2 중쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VH1-TCRβ-CH2-CH3을 포함하고; 제2 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL1-TCRα를 포함하며; 제3 경쇄 폴리펩타이드는 N부터 C 말단까지 VL3-TCRα를 포함한다. 항체의 하나의 팔 상에, VH1 및 VL1은 LILRB4에 대한 제1 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 다른 팔 상에, VH3 및 VL3은 LILRB4에 대한 제2 항원 결합 부위를 형성하는 반면, VH2 및 VL2는 CD3에 대한 항원 결합 부위를 형성한다. 특정 구현예에서, 제3 경쇄 폴리펩타이드 VL3-TCRα는 제1 경쇄 폴리펩타이드 VL1-TCRα와 동일할 수 있다.
특정 구현예에서, CD3에 대한 항원 결합 부위는 당업계에 공지된 항-CD3 항체, 예컨대 WO제2019057099호에 기재된 항-CD3 항체, SP34(Pessano et al EMBO J (1985) 4, 337-334), OKT3(Ortho, Raritan, NJ; Van Wauwe et al, J Immunol (1984) 133, 129-32), M291(Protein Design Laboratories, Fremont, CA), BC3(Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA), TR66 (Novus Biologicals, Centennial, CO) 및 BMA030(Walker C et al., Eur J Immunol. (1907) 17:1611-8)에 기초하여 생성된다.
특정 구현예에서, LILRB4/CD3 이중특이적 항체는 균질성 및 제조성을 개선하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 도 28b에 예시된 바와 같이, TCRα는 O-글리칸 변형 부위를 제거하기 위해 서열번호: 89의 S91A에서 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, Q1E 돌연변이는 N-말단 피로-Q 형성을 방지하기 위해 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드의 N 말단에서 이루어질 수 있다.
특정 구현예에서, 항-LILRB4 이중특이적 항체는 문헌[Konterman et al. 2017, 9 182-212]에 의해 검토된 바와 같이 많은 다른 방식으로 제작될 수 있다. 특히 항-LILRB4 이중특이적 항체는 공유 항체 접합체, 비대칭 F(ab')2, CovX-바디, 마우스/래트 키메라 IgG, 공통 중쇄를 갖는 κλ-바디, 탠덤 단쇄 가변 도메인(scFv), BiTE, 삼중바디, 디아바디, 탠덤 도메인 항체, CH1/CL 도메인과의 scFv 융합체, Fab-scFv 바이바디 또는 트리바디, Fab-Fv 융합체, Fab-단일 도메인 항체(sdAb)/VHH 융합체, 직교 Fab-Fab, scFv2-알부민/독소 융합체, 단쇄 디아바디-알부민/독소 융합체, 탠덤 scFv 알부민/독소 융합체, 독앤락(dock-and-lock, DNL) Fab3, DNL-Fab2-scFv, DNL-Fab-IgG 융합체, ImmTAC TCR-scFv 융합체, 상이한 중쇄 및 상이하거나 공통적인 경쇄를 갖는 IgG, 중쇄 또는 경쇄 N 또는 C 말단으로의 IgG-scFv 융합체, 중쇄 또는 경쇄 N- 또는 C-말단으로의 IgG 단쇄 Fab(scFab) 융합체, scFv 융합체를 갖는 단쇄 IgG(scIgG), 이중 가변 도메인(DVD) 이중특이적 항체, 비대칭 scFv-Fc, 탠덤-scFv-Fc 융합체, Fc 융합이 있거나 없는 이중 친화도 재표적화 항체(DART), 비대칭 Fab-scFv-Fc 융합체, scFv-CH3 융합체, TriFab, IgG 탠덤 scFv 융합체, IgG-crossFab 융합체, 직교 Fab와의 탠덤 Fab-IgG 융합체, 디디아바디-Fc 융합체, 단쇄 디아바디 Fc-융합체, Fab-scFv-Fc 융합체, scFv4-Fc 융합체, scFv2-Fcab, 디디아바디, 단쇄 디아바디 CH3 융합체, IgE/M CH2 융합체, F(ab')2 융합체, CH1/CK 융합체, 투인원 이중 작용 Fab(DAF) 또는 DutaMab, DNL-Fab2-IgG 융합체로서 제작될 수 있다.
Fc 도메인을 함유하는 이중특이적 항체에 대한 중쇄의 이종이량화는 비제한적으로 노브-인-홀(Ridgway et al. PEDS 1996; Atwell et al. J Mol Biol 1997; Merchant et al. Nat Biotechnol 1998), HA-TF 돌연변이(Moore et al Mabs 2011), ZW1(Von Kreudenstein et al MAbs 2013), CH3 전하 쌍(Gunasekaran et al J Biol Chem 2010), IgG1 힌지/CH3 전하 쌍(Strop et al J Mol Biol 2012), IgG2 힌지/CH3 전하 쌍(Strop et al J Mol Biol 2012), 조작된 디설파이드를 갖거나 갖지 않는 EW-RVT 돌연변이(Choi et al. Mol Cancer Ther 2013; Choi et al Mol Immunol 2015), 바이클로닉(Geuijen et al J Clinical Onc 2014), 두오바디(DuoBody)(Labrijn et al Proc Natl Acad Sci USA 2013), SEEDbody IgG/A 키메라(David et al Protein Eng Des Sel 2010), BEAT(Moretti et al BMC Proceedings 2013), 7.8.60 또는 29.8.34(Leaver-Fey et al Structure 2016)를 포함하는 다수의 수단에 의해 달성될 수 있다. 상이한 경쇄의 정확한 쌍 형성은 비제한적으로 CrossMab(Schaefer et al Cancer Cell 2011), 직교 Fab(Lewis et al Nat Biotechnol 2014), T 세포 수용체 융합체(Wu et al MAbs 2015), CR3(Golay et al J Immunol 2016), MUT4(Golay et al. J Immunol 2016), MUT4(Golay et al. J Immunol 2016), DuetMab(Mazor et al MAbs 2015,7, 377-89; Mazor et al MAbs 2015, 7, 461-669)를 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 LILRB4 및 또 다른 표적, 예컨대 비제한적으로 CD3, CD2, CD16a, NKp46, CD137, OX40, PD-1, PD-L1, CD40, CTLA4, LAG3, TIM3, CD47에 표적화될 수 있다.
접합체
일부 구현예에서, 항-LILRB4 항체 및 이의 항원 결합 단편은 접합체 모이어티를 추가로 포함한다. 접합체 모이어티는 항체 및 이의 항원 결합 단편에 연결될 수 있다. 접합체 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 부착될 수 있는 단백질성 또는 비단백질성 모이어티이다. 다양한 접합체 모이어티가 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편에 연결될 수 있음이 고려된다(예를 들어, “Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York, (1989) 참고). 이들 접합체 모이어티는 다른 방법들 중에서 공유 결합, 친화도 결합, 인터컬레이션, 배위 결합, 복합체화, 회합, 블렌딩, 또는 첨가에 의해 항체 또는 항원 결합 단편에 연결될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 하나 이상의 접합체 모이어티에 결합하기 위해 이용될 수 있는 에피토프 결합 부분의 외부에 특정 부위를 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이러한 부위는 접합체 모이어티에 대한 공유 결합을 촉진하기 위해, 하나 이상의 반응성 아미노산 잔기, 예를 들어 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 항체는 접합체 모이어티에 간접적으로, 또는 또 다른 접합체 모이어티를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 비오틴에 접합된 다음, 아비딘에 접합된 제2 접합체에 간접적으로 접합될 수 있다. 접합체는 클리어런스 변형제, 독소(예컨대, 화학치료제), 검출가능한 표지(예컨대, 방사성 동위원소, 란타나이드, 발광 표지, 형광 표지, 또는 효소-기질 표지), 또는 정제 모이어티일 수 있다.
"독소"는 세포에 해롭거나 세포를 손상시키거나 사멸시킬 수 있는 임의의 제제일 수 있다. 독소의 예는, 비제한적으로, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF), 메르탄신, 엠탄신, DM1, 메이탄시노이드 DM1, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신 및 이의 유사체, 항대사산물(예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예컨대, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신(이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예컨대, 닥티노마이신(이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 항유사분열제(예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴), 토포이소머라제 억제제, 및 튜불린 결합제를 포함한다.
검출가능한 표지의 예는 형광 표지(예컨대, 플루오레세인, 로다민, 단실, 피코에리트린, 또는 텍사스 레드), 효소-기질 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 루시퍼라제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 또는 β-D-갈락토시다제), 방사성 동위원소(예컨대, 123I, 124I, 125I, 131I, 35S, 3H, 111In, 112In, 14C, 64Cu, 67Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 177Lu, 211At, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 및 32P, 다른 란타나이드), 발광 표지, 발색단 모이어티, 디곡시게닌, 비오틴/아비딘, 검출을 위한 DNA 분자 또는 금을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 접합체 모이어티는 항체의 반감기를 증가시키는 것을 돕는 클리어런스 변형제일 수 있다. 예시적인 예에는 수용성 중합체, 예컨대 PEG, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체 등을 포함한다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 2개 이상의 중합체가 부착된 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다.
특정 구현예에서, 접합체 모이어티는 자성 비드와 같은 정제 모이어티일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 접합체를 위한 기재를 위해 사용된다.
폴리뉴클레오타이드 및 재조합 방법
본 개시내용은 항-LILRB4 항체 및 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 특정 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 2, 4, 및 35에 나타낸 바와 같은 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 이는 본원에 제공된 예시적인 항체의 가변 영역을 코딩한다. 단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리되고 시퀀싱된다. 코딩 DNA는 또한 합성 방법에 의해 수득될 수 있다.
항-LILRB4 항체 및 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여 추가의 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 구성요소는 일반적으로 비제한적으로 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터(예컨대, SV40, CMV, EF-1α), 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시내용은 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 본원에 제공된 핵산 서열, 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터(예컨대, SV40, CMV, EF-1α), 및 적어도 하나의 선택 마커를 함유하는 벡터(예컨대, 발현 벡터)를 제공한다. 벡터의 예는, 비제한적으로, 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예컨대, 단순포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 파포바바이러스(예컨대, SV40), 람다 파지, 및 M13 파지, 플라스미드 pcDNA3.3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos 등을 포함한다.
항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터는 클로닝 또는 유전자 발현을 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본원의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 진정세균, 예컨대 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리치아, 예컨대, E. coli, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예컨대, 살모넬라 티피무리움, 세라티아, 예컨대, 세라티아 마르세스칸스, 및 쉬겔라, 뿐만 아니라 바실리, 예컨대 B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스, 슈도모나스, 예컨대 P. 애루지노사, 및 스트렙토마이세스를 포함한다.
원핵생물 외에도, 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모는 항-LILRB4 항체 코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애, 또는 일반적인 빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 유전자, 종, 및 균주, 예컨대 쉬조사카로마이세스 폼베; 클루이베로마이세스 숙주, 예컨대, K. 락티스, K. 프라질리스(ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(ATCC 16,045), K. 위커라미이(ATCC 24,178), K. 왈티이(ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(ATCC 36,906), K. 써모톨레란스, 및 K. 막시아누스; 야로위아(EP 402,226); 피키아 파스토리스(EP 183,070); 칸디다; 트리코더마 레시아(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사; 쉬반니오마이세스, 예컨대 쉬반니오마이세스 오시덴탈리스; 및 사상 진균, 예컨대, 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라듐, 및 아스퍼질러스 숙주, 예컨대 A. 니둘란스 및 A. 나이거가 일반적으로 이용가능하고 본원에 유용하다.
본원에 제공된 글리코실화 항체 또는 항원 단편의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 스포돕테라 프루지페르다(캐터필러), 아에데스 아에집티(모기), 아에데스 알보픽투스(모기), 드로소필라 멜라노가스터(초파리) 및 봄빅스 모리와 같은 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예컨대, 오토그라파 칼리포르니카 NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포돕테라 프루지페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따른 본원의 바이러스로서 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 활용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포에서 관심이 가장 컸고, 배양(조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인(293 또는 현탁 배양물에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. (1977) 36:59); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 활성이 결핍된 CHO 세포, CHO-DHFR(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77:4216); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. (1980) 23:243-251); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. (1982) 383:44-68)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 라인(Hep G2)이다. 일부 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 293F 세포이다.
숙주 세포는 항-LILRB4 항체 생산을 위한 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적합한 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 또 다른 구현예에서, 항체는 당업계에 공지된 상동 재조합에 의해 생산될 수 있다.
본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지(MEM)(Sigma), RPMI-1640(Sigma) 및 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)(Sigma)와 같은 상업적으로 이용가능한 배지가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 또한, 문헌[Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. (1980) 102:255, 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또한 제5,122,469호; WO 제90/03430호; WO 제87/00195호; 또는 미국 특허 Re. 제30,985호]에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이러한 임의의 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제(예컨대, HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, 젠타마이신TM 약물), 미량 원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제가 또한 당업자에게 공지될 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 당업자에게 명백할 것이다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포내에서, 주변세포질 공간에서, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편 중 하나인 미립자 파편이, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌[Carter et al., Bio/Technology(1992) 10:163-167]은 E. coli의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체를 단리하는 절차를 기술한다. 간략하게, 세포 페이스트는 약 30분에 걸쳐 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 해동된다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 먼저 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 유닛을 사용하여 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 억제하기 위해 전술한 단계 중 어느 하나에 포함될 수 있으며, 항생제는 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항-LILRB4 항체 및 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, DEAE-셀룰로오스 이온 교환 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 염석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다.
특정 구현예에서, 고체상에 고정화된 단백질 A는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 면역친화도 정제에 사용된다. 친화도 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 의존한다. 단백질 A는 인간 감마1, 감마2, 또는 감마4 중쇄에 기초한 항체를 정제하는데 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. (1983) 62:1-13). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입과 인간 감마3에 권장된다(Guss et al., EMBO J. (1986)5:1567-75). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게 아가로스이지만, 다른 매트릭스가 이용가능하다. 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속과 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABXTM 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 이온 교환 컬럼 상의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 헤파린 세파로스TM 크로마토그래피 상의 크로마토그래피(예컨대, 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술이 또한 회수될 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심있는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 약 2.5-4.5 사이의 pH에서 용출 완충액을 사용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있고, 바람직하게는 낮은 염 농도(예컨대, 약 0-0.25 M 염)에서 수행될 수 있다.
정제
특정 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 정제될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "정제된"은 다른 성분으로부터 단리가능한 조성물을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기서 단백질은 그의 자연적으로 수득가능한 상태에 대하여 임의의 정도로 정제된다. 따라서, 정제된 단백질은 또한 자연적으로 발생할 수 있는 환경으로부터 자유로운 단백질을 지칭한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이러한 명칭은 단백질 또는 펩타이드가 조성물의 주요 구성요소를 형성하는 조성물, 예컨대 조성물 내의 단백질 중 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상을 차지하는 조성물을 지칭할 것이다.
단백질 정제 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 기술은, 한 수준에서, 폴리펩타이드 및 비폴리펩타이드 분획에 대한 세포 환경의 조잡한 분획화를 포함한다. 폴리펩타이드를 다른 단백질로부터 분리한 후, 관심있는 폴리펩타이드는 부분적 또는 완전한 정제(또는 균질성까지의 정제)를 달성하기 위해 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 순수한 펩타이드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 등전 포커싱이다. 단백질 정제를 위한 다른 방법은, 황산암모늄, PEG, 항체 등을 이용한 침전 또는 열 변성 후 원심분리에 의한 침전; 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 및 그러한 및 다른 기술의 조합을 포함한다.
본 개시내용의 항체의 정제에서, 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 폴리펩타이드를 발현하고 변성 조건을 사용하여 단백질을 추출하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 태그된 부분에 결합하는 친화도 컬럼을 사용하여 다른 세포 구성요소로부터 정제될 수 있다. 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서가 변경될 수 있거나, 특정 단계가 생략될 수 있고, 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩타이드의 제조에 적합한 방법을 초래하는 것으로 여겨진다.
일반적으로, 완전한 항체는 항체의 Fc 부분에 결합하는 제제(즉, 단백질 A)를 이용하여 분획화된다. 대안적으로, 항원은 적절한 항체를 동시에 정제하고 선택하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 종종 컬럼, 필터 또는 비드와 같은 지지체에 결합된 선택제를 이용한다. 항체는 지지체에 결합되고, 오염물이 제거(예컨대, 세척)되며, 항체는 조건(염, 열 등)을 적용함으로써 방출된다.
단백질 또는 펩타이드의 정제 정도를 정량화하기 위한 다양한 방법은 본 개시내용에 비추어 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 이들은 예를 들어, 활성 분획의 특정 활성을 결정하는 것, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩타이드의 수를 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하기 위한 또 다른 방법은 분획의 비 활성(specific activity)을 계산하고, 이를 초기 추출물의 비 활성과 비교하고, 이에 따라 순도의 정도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 단위는 물론, 정제를 수행하기 위해 선택된 특정 분석 기술 및 발현된 단백질 또는 펩타이드가 검출가능한 활성을 나타내는지 여부에 좌우될 것이다.
폴리펩타이드의 이동은 상이한 조건의 SDS/PAGE로 때때로 유의하게 달라질 수 있는 것으로 알려져 있다(Capaldi et al., 1977). 따라서, 상이한 전기영동 조건 하에서, 정제되거나 부분적으로 정제된 발현 생성물의 겉보기 분자량은 달라질 수 있는 것으로 이해될 것이다.
III. 약제학적 조성물
본 개시내용은 항-LILRB4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다.
본원에 개시된 약제학적 조성물에 사용하기 위한 약제학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 액체, 겔, 또는 고체 담체, 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충제, 항산화제, 마취제, 현탁/분산제, 금속이온봉쇄제 또는 킬레이트화제, 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비독성 보조 물질, 당업계에 공지된 다른 성분, 또는 이들의 다양한 조합을 포함할 수 있다.
적합한 구성요소는, 예를 들어, 항산화제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 윤활제, 방향제, 증점제, 착색제, 유화제 또는 안정화제, 예컨대 당 및 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다. 적합한 항산화제는 예를 들어, 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 나트륨 티오설페이트, 백금, 카탈라제, 시트르산, 시스테인, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 및/또는 프로필 갈레이트를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편 및 접합체를 포함하는 조성물에 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함시키는 것은 항체 또는 항원 결합 단편의 산화를 감소시킨다. 이러한 산화의 감소는 결합 친화도의 손실을 방지하거나 감소시켜, 항체 안정성을 개선하고 저장 수명을 극대화시킨다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 개시된 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편 및 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함하는 조성물이 제공된다. 항체 또는 항원 결합 단편을 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제와 혼합함으로써 본원에 제공된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편의 산화를 방지하고, 저장 수명을 연장하고/하거나 효능을 개선하는 방법이 추가로 제공된다.
추가로 예시하기 위해, 약제학적 허용가능한 담체는 예를 들어, 수성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사, 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사, 또는 덱스트로스 및 락테이티드 링거 주사, 비수성 비히클, 예컨대 식물성 기원의 고정유, 면실유, 옥수수유, 참깨유, 또는 땅콩유, 정균 또는 정진균 농도의 항미생물제, 등장화제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스, 완충제, 예컨대 포스페이트 또는 시트레이트 완충제, 항산화제, 예컨대 나트륨 바이설페이트, 국소 마취제, 예컨대 프로카인 하이드로클로라이드, 현탁 및 분산제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀루오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 또는 폴리비닐피롤리돈, 유화제, 예컨대 폴리소르베이트 80(TWEEN-80), 금속이온봉쇄제 또는 킬레이트화제, 예컨대 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산), 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함할 수 있다. 담체로서 이용되는 항미생물제는 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤잘코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함하는 다중 용량 용기 내에 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 또는 에탄올을 포함할 수 있다. 적합한 비독성 보조 물질은 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 증진제, 또는 제제, 예컨대 아세트산 나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 또는 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 액체 용액, 현탁액, 유화액, 환제, 캡슐, 정제, 서방형 제제, 또는 분말일 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예컨대 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐 피롤리돈, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사용 조성물로 제제화된다. 주사용 약제학적 조성물은 임의의 통상적인 형태, 예를 들어 액체 용액, 현탁액, 유화액, 또는 액체 용액, 현탁액, 또는 유화액을 생성하기에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다. 주사용 제제는 주사를 위해 준비된 멸균 및/또는 비발열 용액, 멸균 건조 용해성 제품, 예컨대 피하 정제를 포함하여 사용 직전에 용매와 조합될 준비가 된 동결건조된 분말, 주사를 위해 준비된 멸균 현탁액, 사용 직전에 비히클과 조합될 준비가 된 멸균 건조 불용성 제품, 및 멸균 및/또는 비발열 유화액을 포함할 수 있다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.
특정 구현예에서, 단위 용량 비경구 제제는 앰플, 바이알 또는 바늘이 있는 주사기에 포장된다. 비경구 투여를 위한 모든 제제는 당업계에 공지되고 실시되는 바와 같이 멸균이고 비발열이어야 한다.
특정 구현예에서, 멸균, 동결건조된 분말은 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편을 적합한 용매에 용해시킴으로써 제조된다. 용매는 안정성을 개선하는 부형제 또는 분말 또는 분말로부터 제조된 재구성된 용액의 다른 약리학적 구성요소를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 비제한적으로, 물, 덱스트로스, 소르비톨, 프럭토스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스 또는 다른 적합한 제제를 포함한다. 용매는 완충제, 예컨대 시트레이트, 나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 일 구현예에서, 약 중성 pH의 당업자에게 공지된 다른 이러한 완충제를 함유할 수 있다. 용액의 후속 멸균 여과 후 당업자에게 공지된 표준 조건 하에서의 동결건조는 바람직한 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 생성된 용액은 동결건조를 위해 바이알에 분배될 것이다. 각각의 바이알은 항-LILRB4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 조성물의 단일 투여량 또는 다중 투여량을 함유할 수 있다. 용량 또는 용량 세트(예컨대, 약 10%)에 필요한 것을 초과하는 소량을 갖는 과충전 바이알은 정확한 샘플 인출 및 정확한 투약을 용이하게 하기 위해 허용가능하다. 동결건조된 분말은 약 4℃ 내지 실온과 같은 적절한 조건 하에서 저장될 수 있다.
동결건조된 분말을 주사용수로 재구성하는 것은 비경구 투여에 사용하기 위한 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 재구성을 위해 멸균 및/또는 비발열 수 또는 다른 액체 적합한 담체가 동결건조된 분말에 첨가된다. 정확한 양은 주어지는 선택된 요법에 의존하며, 경험적으로 결정될 수 있다.
IV. 항-LILRB4 항체의 사용 방법
본 개시내용은 또한 본원에 제공된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, LILRB4 관련 병태 또는 장애를 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는, 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, LILRB4 관련 병태 또는 장애는 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 감염성 질환이다.
암의 예는 일반적으로 고형 종양 및 혈액학적 악성 종양으로 분류될 수 있다. 고형 종양은 비제한적으로 비소세포 폐암(편평/비편평), 소세포 폐암, 신장 세포암, 결장직장암, 결장암, 난소암, 유방암(기저 유방 암종, 관상 암종 및 소엽 유방 암종 포함), 췌장암, 위 암종, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선 암종, 흑색종, 다발성 골수종, 균상 식육종, 메르켈 세포암, 간세포 암종(HCC), 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골형성 육종, 및 다른 육종, 활막종/활막 육종, 중피종, 유잉 육종, 평활근육종, 횡문근육종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 수질 갑상선 암종, 유두상 갑상선 암종, 갈색세포종, 피지선 암종, 유두암종, 유두 선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 간종양, 담관 암종, 융모막암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 반종, 비만세포 유래 종양, EBV 양성 및 음성 PTLD, 비인두 암종, 척수축 종양, 뇌 줄기 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종을 포함한다.
고형 종양은 증식 신호전달 유지, 성장 억제제 회피, 세포 사멸 저항, 복제 불멸 가능화, 혈관 신생 유도, 침윤 및 전이 활성화, 종양 촉진, 면역 파괴 방지, 게놈 불안정 및 돌연변이, 및 세포 에너지 조절 해제를 포함하는 다수의 생물학적 특징에 의해 특성화된다. 치료 노력은 빠르게 분열하는 세포를 표적화하는 세포독성 화학요법으로부터 선별된 신호전달 경로를 억제하는 소분자, 표면 단백질을 표적화하는 단일클론항체로 발전해 왔다. 최근에는 내인성 면역을 활성화시키는 암 면역요법 또는 합성 면역을 활용하는 세포 요법의 개념이 유망하였다. 이러한 발전에도 불구하고, 진행된 고형 종양을 가진 대부분의 환자들은 여전히 장기간 생존하지 못한다. 항-CTLA-4 또는 항-PD-1/PD-L1과 같은 면역 체크포인트 억제제의 사용은 소수의 환자에서 장기간 무진행 및 전반적인 생존으로 이어졌다.
면역 생물학의 다양한 측면 및 상이한 종양 침윤 세포를 표적화하는 더 새로운 면역요법 접근법은 골수 유래 억제 세포(MDSC)를 포함하는 골수 세포의 서브세트 상에서 발현되는 억제 수용체로서 LILRB4를 표적화하는 것과 같이, 결과를 개선하기 위해 필요하다. 이러한 골수 세포는 그들의 면역 억제/항염증 표현형이 종양 항원 특이적 T 세포의 활성화, 증식 및 세포독성 활성을 억제할 수 있기 때문에 골수 유래 억제 세포로서 기능적으로 기술된다.
일부 구현예에서, MDSC를 고갈시키는 것은 고형 종양 치료를 위한 종양 항원 특이적 T 세포에 대한 억제 효과를 되돌릴 수 있다.
일부 구현예에서, 골수 세포 상의 LILRB4를 차단하는 것은 또한 LILRB4를 발현하는 수지상 세포 또는 골수성 백혈병 세포를 포함하는 항원 제시 세포(APC)에 대한 그의 억제 효과를 잠금 해제할 수 있다. 증가된 항원 제시 활성은 특정 사이토카인 생산된 APC에 의해 관찰될 수 있고, T 세포 활성화, 세포독성 및 T 세포 사이토카인 생산으로 이어질 수 있다.
혈액학적 악성 종양은 비제한적으로 급성 림프구성/림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), B-세포 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(BPDCN), 만성 림프모구성 백혈병(CLL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수구성 백혈병(CML), 만성 골수단구성 백혈병(CMML), 고전적 호지킨 림프종(CHL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 결절외 NK/T 세포 림프종, 모발 세포 백혈병, 중쇄 질환, HHV8 관련 원발성 삼출 림프종, 림프성 악성 종양, 다발성 골수종(MM), 골수이형성증, 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종, 혈장모구성 림프종, 전-B 급성 림프구성 백혈병(Pre-B ALL), 원발성 CNS 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구가 풍부한 B 세포 림프종, 골수증식성 신생물 및 발덴스트롬의 거대글로불린혈증을 포함한다.
자가면역 또는 염증성 질환은 비제한적으로 후천성 면역결핍 증후군(AIDS, 자가면역 성분을 갖는 바이러스 질환), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판 감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진상 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭 응집소병, 크레스트 증후군, 크론병, 데고스병, 연소성 피부근염, 원반형 루푸스, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근육염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소증 자반병(ITP), IgA 신증, 인슐린 의존성 당뇨병, 연소성 만성 관절염(스틸병), 연소성 류마티스 관절염, 메니에르병, 혼합 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 경피증, 전신성 경피증, 진행성 전신 경화증(PSS), 전신 경화증(SS), 쇼그렌 증후군, 강직 인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 다카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 염증성 장 질환(IBD), 궤양성 대장염, 크론병, 장 점막 염증, 대장염과 관련된 소모성 질환, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증, 알츠하이머병, 천식, 아토피 알레르기, 알레르기, 죽상동맥경화증, 기관지 천식, 습진, 사구체신염, 이식편 대 숙주 질환, 용혈성 빈혈, 골관절염, 패혈증, 뇌졸중, 조직 및 장기의 이식, 혈관염, 당뇨병성 망막병증, 인공호흡기 유발 폐 손상, 바이러스 감염, 자가면역 당뇨병 등을 포함한다. 염증성 장애는 예를 들어, 만성 및 급성 염증성 장애를 포함한다.
감염성 질환은 비제한적으로 진균 감염, 기생충/원생동물 감염 또는 만성 바이러스 감염, 예를 들어, 말라리아, 콕시디오이도마이코시스 이미티스(coccidioidomycosis immitis), 히스토플라스마증(histoplasmosis), 손발톱진균증(onychomycosis), 아스퍼질루스증(aspergillosis), 분아균증(blastomycosis), 칸디디아시스 알비칸스(candidiasis albicans), 파라콕시디오도마이코시스(paracoccidiodomycosis), 마이크로스포리디오시스(microsporidiosis), 아칸타모에바 각막염(Acanthamoeba keratitis), 아메바증(Amoebiasis), 회충증(Ascariasis), 바베스열원충증(Babesiosis), 대장섬모충(Balantidiasis), 아프리카너구리회충증(Baylisascariasis), 샤가스병(Chagas disease), 간흡충증(Clonorchiasis), 코클리오미아(Cochliomyia), 크립토스포리디오시스(Cryptosporidiosis), 디필로보트리아시스(Diphyllobothriasis), 드라쿤쿨리아시스(Dracunculiasis), 포충증(Echinococcosis), 엘레판티아시스(Elephantiasis), 요충증(Enterobiasis), 간질증(Fascioliasis), 장흡충증(Fasciolopsis), 사상충증(Filariasis), 람블편모충증(Giardiasis), 악구층증(Gnathostomiasis), 왜소조충증(Hymenolepiasis), 등포자충증(Isosporiasis), 카타야마 열(Katayama fever), 리슈만편모충증(Leishmaniasis), 라임병(Lyme disease), 요코가와흡충증(Metagonimiasis), 구더기증(Myiasis), 회선사상충증(Onchocerciasis), 이감염증(Pediculosis), 옴(Scabies), 주혈흡충증(Schistosomiasis), 수면병(Sleeping sickness), 분선충증(Strongyloidiasis), 조충증(Taeniasis), 개회충증(Toxocariasis), 톡소플라즈마증(Toxoplasmosis), 선모충증(Trichinosis), 편충증(Trichuriasis), 트리파노소마증(Trypanosomiasis), 기생충 감염, B형 간염(HBV), C형 간염(HCV), 헤르페스 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, HIV, 사이토메갈로바이러스, 단순포진 바이러스 유형 I, 단순 포진 바이러스 유형 II, 인간 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 I, 인간 면역결핍 바이러스 II, 카포시 웨스트 육종 관련 헤르페스 바이러스 유행성, 박환 바이러스(Torquetenovirus), 인간 T 림프영양성 바이러스 I, 인간 T 림프영양성 바이러스 II, 수두 대상 포진, JC 바이러스 또는 BK 바이러스의 감염을 포함한다.
본원에 제공된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편의 치료적 유효량은 당업계에 공지된 다양한 인자, 예를 들어 대상체의 체중, 연령, 과거 병력, 현재 약물, 건강 상태 및 교차 반응, 알레르기, 민감성 및 부작용 가능성뿐만 아니라 투여 경로 및 질환 발달 정도에 의존할 것이다. 투여량은 이들 및 다른 상황 또는 요건에 의해 지시된 바와 같이 당업자(예컨대, 의사 또는 수의사)에 의해 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편은 약 0.0001 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 치료적 유효 투여량으로 투여될 수 있다. 이들 특정 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 약 50 mg/kg 이하의 투여량으로 투여되고, 이들 특정 구현예에서, 투여량은 10 mg/kg 이하, 5 mg/kg 이하, 3 mg/kg 이하, 1 mg/kg 이하, 0.5 mg/kg 이하, 또는 0.1 mg/kg 이하이다. 특정 구현예에서, 투여량은 치료 과정에 걸쳐 변할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 초기 투여량은 후속 투여량보다 높을 수 있다. 특정 구현예에서, 투여량은 대상체의 반응에 따라 치료 과정에 걸쳐 달라질 수 있다.
투여 요법은 최적의 원하는 반응(예컨대, 치료 반응)을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일 용량이 투여될 수 있거나, 또는 몇 개의 분할 용량이 시간이 경과함에 따라 투여될 수 있다.
본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편은 당업계에 공지된 임의의 경로, 예를 들어 비경구(예컨대, 피하, 복강내, 정맥내 주입을 포함하는 정맥내, 근육내, 또는 피내 주사) 또는 비경구(예컨대, 경구, 비강내, 안구내, 설하, 직장 또는 국소) 경로에 의해 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편은 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 치료 수단 또는 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편은 또 다른 치료제, 예를 들어, 화학치료제 또는 항암 약물과 조합하여 투여될 수 있다.
이들 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 투여되는 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 추가 치료제와 동시에 투여될 수 있고, 이들 특정 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편 및 추가 치료제(들)는 동일한 약제학적 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 그러나, 또 다른 치료제와 "조합하여" 투여된 항체 또는 항원 결합 단편은 제제와 동시에 또는 동일한 조성물로 투여될 필요가 없다. 또 다른 제제 이전 또는 이후에 투여된 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 또는 항원 결합 단편 및 제2 제제가 상이한 경로를 통해 투여되더라도, 상기 어구가 본원에 사용된 바와 같이 그 작용제와 "조합하여" 투여되는 것으로 간주된다. 가능한 경우, 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편과 조합하여 투여된 추가적인 치료제는 추가 치료제의 제품 정보 시트에 열거된 일정에 따라, 또는 처방자의 디지털 레퍼런스(pdr.net에서만 온라인으로 이용가능함) 또는 당업계에 잘 알려진 프로토콜에 따라 투여된다.
본 개시내용의 항체와의 조합 요법을 위해 고려되는 특정 제제는 화학요법을 포함한다. 화학요법은 시타라빈(ara-C) 및 안트라사이클린(가장 흔히 다우노루비신), 고용량 시타라빈 단독, 유도 화학요법에 더하여 올-트랜스-레티노산(ATRA), 일반적으로 통합 요법의 완료 후 안트라사이클린, 히스타민 디하이드로클로라이드(Ceplene) 및 인터루킨 2(Proleukin), 고용량 화학요법을 위한 후보가 아닌 재발성 AML을 가진 60세 이상의 환자를 위한 겜투주맙 오조가미신(Mylotarg), 클로파라빈뿐만 아니라 표적화된 요법, 예컨대 키나제 억제제, 파네실 트랜스퍼라제 억제제, 데시타빈 및 MDR1의 억제제(다약제 내성 단백질), 또는 삼산화비소 또는 재발성 급성 전골수구성 백혈병(APL)을 포함한다.
특정 구현예에서, 조합 요법을 위한 제제는 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린, 다우노루비신, 뉴클레오사이드 대사 억제제, 시타라빈, 하이포메틸화제, 저용량 시타라빈(LDAC), 다우노루비신 및 시타라빈의 조합, 주사용 다우노루비신 및 시타라빈 리포솜, 빅시오스(Vyxeos®), 아자사이티딘/아자시티딘, 비다자(Vidaza®), 데시타빈, 올-트랜스-레티노산(all-trans-retinoic acid, ATRA), 비소, 삼산화비소, 히스타민 디하이드로클로라이드, 세플렌(Ceplene®), 인터루킨-2, 알데스루킨, 프로루킨(Proleukin®), 겜투주맙 오조가미신, 밀로타르그(Mylotarg®), FLT-3 억제제, 미도스타우린, 리답트(Rydapt®), 클로파라빈, 파네실 트랜스퍼라제 억제제, 데시타빈, IDH1 억제제, 이보시데닙, 티브소보(Tibsovo®), IDH2 억제제, 에나시데닙, 이디파(Idhifa®), 평활화(SMO) 억제제, 글라스데깁(glasdegib), 아르기나제 억제제, IDO 억제제, 에파카도스타트, BCL-2 억제제, 베네토클락스, 벤클렉스타(Venclexta®), 백금 복합체 유도체, 옥살리플라틴, 키나제 억제제, 티로신 키나제 억제제, PI3 키나제 억제제, BTK 억제제, 이브루티닙, 임브루비카(IMBRUVICA®), 아칼라브루티닙, 칼쿠엔스(CALQUENCE®), 자누브루티닙, PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, LAG3 항체, ICOS 항체, TIGIT 항체, TIM3 항체, CD40 항체, 4-1BB 항체, CD47 항체, SIRP1α 항체 또는 융합 단백질, E-셀렉틴의 길항제, 종양 항원에 결합하는 항체, T 세포 표면 마커에 결합하는 항체, 골수 세포 또는 NK 세포 표면 마커에 결합하는 항체, 알킬화제, 니트로소우레아제, 항대사물질, 항종양 항생제, 식물로부터 유래된 알칼로이드, 호르몬 치료 약물, 호르몬 길항제, 아로마타제 억제제 및 P-당단백질 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 약물이다.
특정 구현예에서, LILRB4 관련 병태 또는 장애는 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 골수단구성 백혈병(FAB M4) 서브타입 및 급성 단핵모구성/단핵구성 백혈병(FAB M5) 서브타입이다.
특정 구현예에서, AML은 표준 치료, 예컨대 베네토클락스 및 아자사이티딘/아자시티딘에 내성이거나 난치성이다.
AML은 예후가 좋지 않은 공격적인 악성 종양이다. 세계 보건기구(WHO) 분류에서, 급성 골수단구성 백혈병(프랑스-미국-영국[FAB] 분류에서 M4) 및 급성 단핵모구성/단핵구성 백혈병(FAB 분류에서 M5)은 달리 명시되지 않은 AML(AML, NOS)의 서브타입이다.
WHO 시스템에서의 급성 골수단구성 백혈병(FAB M4)은 골수모세포, 단핵모세포 및 전단핵구(총 ≥20 %)와 ≥20% 내지 79%의 단핵구 계통으로 구성된 모세포를 갖는다. 급성 단핵모구성/단핵구성 백혈병(FAB M5)은 단핵모세포/전단핵구≥20%, 및 단핵구 특징을 가진 골수세포의 ≥80%를 갖는다. 급성 골수단구성 백혈병(M4) 및 급성 단핵구성 백혈병(M5)은 AML의 모든 사례의 각각 약 20% 및 10%를 차지한다(Ganzel et al., 2016). 상당한 단핵구 성분을 가진 AML 환자는 골수외 질환(Ganzel et al., 2016) 및 과다백혈구증가증(말초 혈액에서 ≥100 x 103/μL 백혈구로서 정의됨)의 증거를 가질 가능성이 더 높다(Rollig and Ehninger, 2015).
LILRB4는 단핵구 분화를 갖는 AML 세포(Deng et al., 2018; Dobrowolska et al., 2013) 및 CMML(Chien et al., 2019) 상에서 발현된다. LILRB4의 발현 수준은 정상 단핵구와 동등하거나 단핵구 분화를 갖는 AML 모세포에서 최대 10배 더 높을 수 있다(Deng et al., 2018). 더욱이, 기능적 및 면역표현형 연구는 LILRB4가 단핵구성 AML로부터 백혈병 줄기 세포에 의해 발현된다는 것을 시사한다(Deng et al., 2018).
2008년에, AZA는 64세 초과이고 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)을 받을 자격이 없는 20% 내지 30% 골수(BM) 모세포를 갖는 AML 환자의 치료를 위해 유럽 의약품청(EMA)의 승인을 받았다. 전문 센터의 혈액학자들은 2007년 초에 AZA로 >30%의 BM 모세포를 갖는 AML 환자를 치료하기 시작했으며, 이는 의사들이 환자들을 위해 최선을 다하고 있다고 확신했음을 나타낸다. 이러한 추정은 AZA-MDS-001 시험 및 암 및 백혈병 그룹 B 프로토콜에서 얻은 전체 생존(OS)의 현저한 개선에 기초하였고, 여기서 시험 집단의 32%와 38%가 각각 20% 내지 30%의 BM 모세포를 갖는 AML을 가지고 있었다.
2010년에, 새로 진단된 AML, >30% BM 모세포 및 ≤15 x 109/L 백혈구(WBC) 수를 가진 65세 초과의 AML 환자에서 AZA 대 기존 치료 요법(CCR)(집중 화학요법, 저용량 시타라빈 또는 치료 의사가 미리 선택한 최상의 지원 치료)을 시험하는 국3상 무작위 AZA-AML-001 임상 시험이 시작되었다. 이 시험에서, CCR에 비해 AZA에 대한 OS의 임상적으로 의미있는 개선(10.4 대 6.5개월; p=0.1009)이 보고되었다. 또한, 전체 반응(완전 관해[CR] + 불완전한 혈액 수 회복을 갖는 완전 관해[CRi]) 비율은 AZA(27.8%)와 CCR(25.1%) 부문(P = 0.5384)에서 비슷하였고, AZA의 EMA 승인은 2015년 10월 30일에 >30% BM 모세포를 갖는 AML 환자를 포함하도록 확대되었다.
특정 구현예에서, LILRB4 관련 병태 또는 장애는 만성 골수단구성 백혈병(CMML)이다.
CMML 진단 분류는 임상 검사, 형태학, 세포 유전학을 기반으로 하며, 가능할 때마다 유세포 분석법 및 분자 생물학을 통합하여 WHO 2016 범주에 따라 환자를 분류해야 한다. WHO 분류(Arber et al., 2016)는 말초 혈액에서 <2% 모세포 및 BM에서 <5% 모세포를 갖는 사례에 대한 CMML-0, 말초 혈액에서 2% 내지 4% 모세포 및/또는 BM에서 5% 내지 9% 모세포를 갖는 사례에 대한 CMML-1, 및 말초 혈액에서 5% 내지 19% 모세포, BM에서 10% 내지 19%를 갖는 사례에 대한 및/또는 아우어 막대(Auer rod)가 존재할 때의 CMML-2를 포함한다.
13 x 109/L의 WBC 컷오프에 기초한 FAB 분류에 의해 처음 제안된 "이형성" CMML과 "증식성" CMML의 구별은 여전히 유용한데, 이들의 임상 특징이 상이하고(세포감소증 대 장기비대증, 높은 WBC 및 전신 증상), 결과적으로 그들의 임상 관리가 상이하기 때문이다.
비장비대증과 간비대증과는 별도로 골수외 백혈병은 주로 모두 더 나쁜 예후와 관련된 특정 장액 삼출액(흉막 및 덜 자주 심낭 또는 복막)과 특정 피부 침윤을 포함한다.
VIDAZA®(azacitidine)는 다음 FAB 골수이형성 증후군(MDS) 서브타입인 난치성 빈혈 또는 고리모양의 철적혈모구(ringed sideroblast)를 갖는 난치성 빈혈(호중구 감소증 또는 혈소판 감소증을 동반하거나 수혈이 필요한 경우), 과도한 모세포를 갖는 난치성 빈혈, 형질전환 중인 과도한 모세포를 갖는 난치성 빈혈, 및 만성 골수단구성 백혈병(CMML)을 가진 환자의 치료를 위해 지시된 뉴클레오사이드 대사 억제제이다.
본 개시내용은 샘플을 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계, 및 샘플 내의 LILRB4의 존재 또는 양을 결정하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 LILRB4의 존재 또는 양을 검출하기 위해 항-LILRB4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 항-LILRB4 항체를 사용하여 LILRB4를 검출하는 방법은 비제한적으로 ELISA, 웨스턴 블롯, 유세포 분석법 및 FACS를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 a) 대상체로부터 수득된 샘플을 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; b) 샘플 내의 LILRB4의 존재 또는 양을 결정하는 단계; 및 c) LILRB4의 존재를 대상체에서의 LILRB4 관련 질환 또는 병태와 상관시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 LILRB4 관련 질환 또는 병태를 진단하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 검출가능한 모이어티와 선택적으로 접합된, 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 LILRB4의 검출 또는 LILRB4 관련 질환의 진단에 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 또한 대상체에서 LILRB4 관련 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, LILRB4 관련 질환 또는 병태를 진단하기 위한 진단 시약의 제조에 있어서 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
V. 키메라 항원 수용체
다른 양태에서, 본 개시내용은 LILRB4(LILRB4 CAR 단백질)에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR) 단백질을 제공한다. 특정 구현예에서, CAR 단백질은 항원 인식 영역, 즉, 본원에 기재된 바와 같은 LILRB4를 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편, 및 다른 막 및 세포내 구성요소를 포함한다. 일부 구현예에서, LILRB4 CAR 단백질은 LILRB4 항원 인식 영역, 막횡단 도메인 및 세포내 공동자극 신호 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 단일 사슬 LILRB4 CAR 단백질은 또한 리더 펩타이드, 스페이서 영역 및 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 인식 영역은 다중 폴리펩타이드 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 단백질은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 제1 또는 제2 폴리펩타이드는 막횡단 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 항체 중쇄 가변 도메인과 항체 경쇄 가변 도메인은 함께 항원 인식 영역을 형성한다.
일부 구현예에서, CAR 단백질은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩타이드는 막횡단 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 불변 도메인은 함께 항원 인식 영역을 형성한다. 일부 구현예에서, 제1 부분은 세포내 공동자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 단백질은 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩타이드는 막횡단 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 중쇄 불변 도메인, 및 항체 경쇄 가변 도메인은 함께 항원 인식 영역을 형성한다. 일부 구현예에서, 제1 부분은 세포내 공동자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 단백질은 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 제2 폴리펩타이드는 막횡단 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 불변 도메인은 함께 항원 인식 영역을 형성한다. 일부 구현예에서, 제2 부분은 세포내 공동자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 단백질은 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 제2 폴리펩타이드는 막횡단 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 항체 중쇄 가변 도메인, 항체 중쇄 불변 도메인, 및 항체 경쇄 가변 도메인은 함께 항원 인식 영역을 형성한다. 일부 구현예에서, 제2 부분은 세포내 공동자극 신호전달 도메인 및 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, CAR 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 항-LILRB4 scFv, 즉 링커 도메인에 의해 연결된 항-LILRB4 중쇄 가변 도메인 및 항-LILRB4 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드이다. 일 구현예에서, CAR 단백질은 N 말단부터 C-말단까지 리더 펩타이드, 항-LILRB4 중쇄 가변 도메인, 링커 도메인, 항-LILRB4 경쇄 가변 도메인, 힌지 영역, 막횡단 도메인, 세포내 공동자극 신호 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, CAR 단백질은 N 말단부터 C-말단까지 리더 펩타이드, 항-LILRB4 경쇄 가변 도메인, 링커 도메인, 항-LILRB4 중쇄 가변 도메인, 힌지 영역, 막횡단 도메인, 세포내 공동자극 신호 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 단백질은 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 링커 도메인은 일반적으로 나선 및 회전 촉진 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌, 세린 및 글리신으로 구성된다. 그러나, 다른 잔기도 마찬가지로 기능할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 도메인은 scFv의 VH 및 VL 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 링커 도메인은 막횡단 도메인과 세포내 공동자극 신호전달 도메인 사이에 있다. 일부 구현예에서, 링커 도메인은 세포내 T 세포 신호전달 도메인과 세포내 공동자극 신호전달 도메인 사이에 있다. 일부 구현예에서, 링커 도메인은 서열 GGGGSGGGGGGS(서열번호: 70)를 포함한다.
일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 자연 발생 CD8α 막횡단 도메인 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 CD8α 막횡단 도메인이다(서열번호: 71). 일부 구현예에서, CD8α 막횡단 도메인은 서열번호: 72의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 자연 발생 CD28 막횡단 도메인 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 CD28 막횡단 도메인이다(서열번호: 73). 일부 구현예에서, CD28 막횡단 도메인은 서열번호: 74의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
세포내 공동자극 신호전달 도메인은 CAR에 대한 항원의 결합에 응답하여 공동자극 신호전달을 제공할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 도메인의 신호전달은 사이토카인의 생산 및 이를 발현하는 T 세포 또는 NK 세포의 증식을 초래한다. 일부 구현예에서, 세포내 공동자극 신호전달 도메인은 CD28 세포내 공동자극 신호전달 도메인, 4-1BB 세포내 공동자극 신호전달 도메인, ICOS 세포내 공동자극 신호전달 도메인, OX-40 세포내 공동자극 신호전달 도메인 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, CD28 공동자극 도메인은 서열번호: 75의 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, CD28 세포내 공동자극 신호전달 도메인은 서열번호: 76의 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 4-1BB 세포내 공동자극 신호전달 도메인은 서열번호: 77의 폴리펩타이드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 4-1BB 세포내 공동자극 신호전달 도메인은 서열번호: 78의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본원에 제공된 "힌지 영역"은 항원 결합 영역을 막횡단 도메인과 연결하는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 중쇄 가변 영역을 막횡단 도메인과 연결한다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 중쇄 불변 영역을 막횡단 도메인과 연결한다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 경쇄 가변 영역을 막횡단 도메인과 연결한다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 경쇄 불변 영역을 막횡단 도메인과 연결한다. 일부 구현예에서, 항원에 대한 항원 결합 영역의 결합 친화도는 힌지 영역의 부재와 비교하여 증가된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 영역과 항원 사이의 입체 장애는 힌지 영역의 존재 하에 감소된다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 CD8α 힌지 영역이다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 CD28 힌지 영역이다.
일부 구현예에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 인간 CD3 복합체의 제타(ζ) 사슬의 신호전달 도메인, 즉 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 서열번호: 79의 아미노산 서열을 갖는 단백질 CD3zIso1이다. 일부 구현예에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 서열번호: 81의 핵산 서열에 의해 코딩된 서열번호: 80의 아미노산 서열을 갖는 단백질 CD3zIso3이다.
일 예에서, CAR 단백질은 N 말단부터 C 말단까지 CD8α 리더 펩타이드, 항-LILRB4 scFv, CD8α 힌지 영역, CD8α 막횡단 도메인(또는 CD28 막횡단 도메인), 4-1BB 세포내 공동자극 신호전달 도메인(또는 CD28 세포내 공동자극 신호전달 도메인, 또는 CD28 세포내 공동자극 신호전달 도메인 다음에 4-1BB 세포내 공동자극 신호전달 도메인) 및 2개의 이소형 중 하나에서의 CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인(CD3zIso1 또는 CD3zIso3)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드이다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 LILRB4 CAR 단백질은 LILRB4에 대한 높은 친화도를 입증한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 CAR 단백질은 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.09 nM, 0.08 nM, 0.07 nM, 0.06 nM 또는 0.05 nM 미만의 LILRB4에 대한 결합 친화도(ELISA에 의해 측정된 바와 같은 EC50)를 갖는다. 본 출원의 목적을 위해, ELISA EC50 값은 다음과 같이 결정될 수 있다. LILRB-4 세포외 도메인 단백질(C-말단에 6개의 HIS 태그를 가짐)을 HEK293 세포에서 재조합으로 생산하고, 4℃에서 14 내지 16시간 동안 1 μg/ml 농도(100 μl/웰)로 높은 결합 96-웰 투명 플레이트(Corning-Costar, Fisher Scientific) 상에 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 PBS, pH 7.4로 간략히 세척하고, PBS 중의 5% 무지방 우유의 200 μl/웰로 37℃에서 2시간 동안 차단하였다. 10 μg/ml부터 시작하고 12단계 동안 3배 적정하는 시험 단일클론 항체(IgG 또는 scFv 단편)의 연속 희석물을 플레이트 상에 커버를 이용하여 37℃에서 45분 인큐베이션함으로써 결합을 위해 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 그 다음 플레이트를 트윈 20(0.05% 농도)을 함유하는 PBS로 3회 및 PBS로 1회 세척하였다. 항-인간 또는 항-토끼의 2차 항체, 또는 HRP 접합체를 갖는 다른 종 IgG 특이적 항체(Jackson ImmunoResearch)를 제조자의 제안된 희석물당 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하기 위해 첨가하였다. HRP 기질인 TMB(ThermoFisher)를 10분 동안 첨가하여 검출을 실시하였고, 2N H2SO4의 50 μl/웰을 첨가하여 중단하였다. 플레이트를 플레이트 리더(SpectraMax M4, Molecular Devices)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도에 대해 판독하였다. 데이터를 수집하고 EC50 계산을 위해 GrapPad Prism 7 소프트웨어를 이용하여 4-파라미터 피팅 곡선을 사용하여 그래프화하였다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 CAR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 진핵 세포에서 활성인 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 JeT 프로모터이다. JeT 프로모터는 다수의 강력한 포유동물 프로모터와 비슷한 전사 활성을 갖는 재조합 프로모터이다. JeT 프로모터는 5개의 핵심 요소인 (1) TATA 박스; (2) 전사 개시 부위(Inr); (3) (4) CArG 요소와 함께 CArG 요소 및 마지막으로, (5) 2개의 탠덤으로 배열된 4개의 Spl 전사 결합 부위(GGGCGG)로 구성된다(US 제2002/0098547호 A1). 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 Clontech의 pLVX-EF1alpha-IRES-ZsGreen, 또는 pSIN-EF1alpha-IRES-Puromycin 또는 pSIN-EF1alpha에 기초하여 생성된다. 일 예에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 분자는 순차적으로 다음의 요소 (1) JeT 프로모터; (2) CD8-알파 리더를 코딩하는 서열; (3) 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열; (4) 링커를 코딩하는 서열; (5) 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열; (6) CD8 힌지 및 TM 도메인을 코딩하는 서열; (7) 4-1BB 공동자극 도메인을 코딩하는 서열; (8) CD3-제타 활성화 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일 예에서, 상기 기재된 요소는 폴리뉴클레오타이드 분자를 표적 유전자좌, 예컨대, T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자좌에 삽입하는 것을 용이하게 하는 5' 및 3' 상동성 팔에 의해 측접된다.
VI. 항-LILRB4 CAR 단백질을 발현하는 조작된 세포
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 CAR 단백질을 발현하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 면역 세포는 T 세포(예컨대, 조절 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 감마-델타 T 세포), 자연 살해(NK) 세포, 불변 NK 세포, NKT 세포, 또는 대식세포일 수 있다. 또한 면역 세포를 생산 및 조작하는 방법뿐만 아니라 입양 세포 요법을 위한 세포를 사용하고 투여하는 방법이 본원에 제공되며, 이 경우 세포는 자가 또는 동종이계일 수 있다. 따라서, 조작된 면역 세포는 면역요법으로서, 예컨대 암 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있다.
CAR 단백질을 발현하는 것은 조작된 면역 세포가 표적 세포에 존재하는 항원을 인식함으로써 암 세포와 같은 표적 세포에 결합할 수 있게 한다. 표적 세포에 결합시, 조작된 면역 세포는 활성화된 다음, 증식을 진행하고 세포독성이 되며, 결국 표적 세포를 파괴한다. CAR-T 세포 면역요법은 임상 시험에서 성공을 입증했으며 난치성 B 세포 급성 림프모구성 백혈병 및 B 세포 비호지킨 림프종을 치료하기 위해 미국 FDA에 의해 승인되었다(Hartmann J et al., EMBO Mol Med (2017) 9:1183-97). CAR NK 세포 및 CAR 대식세포는 최근에 CAR-T 세포 이외에 면역요법 옵션으로서 개발되어 왔다(Kloess S et al., Transfusion Medicine and Hemotherapy (2019) 46:4-13; Klichinsky M et al., AACR Annual Meeting 2017, Abstract 4575). 따라서, 본 개시내용의 특정 구현예에서, 본원에 기재된 CAR 단백질을 발현하는 면역 세포는 T 세포, NK 세포 또는 대식세포이다.
면역 세포는 대상체, 특히 인간 대상체로부터 단리될 수 있다. 면역 세포는 관심있는 대상체, 예컨대 특정 질병 또는 병태를 갖는 것으로 의심되는 대상체, 특정 질병 또는 병태에 대한 소인을 갖는 것으로 의심되는 대상체, 특정 질병 또는 병태에 대한 치료를 겪고 있는 대상체, 건강한 지원자 또는 건강한 공여자인 대상체, 또는 혈액 은행으로부터 수득될 수 있다. 면역 세포는 비제한적으로 혈액, 제대혈, 비장, 흉선, 림프절 및 골수를 포함하는 대상체에 거주하는 임의의 위치로부터 수집될 수 있다. 단리된 면역 세포는 직접 사용될 수 있거나, 또는 이들은, 예컨대 동결에 의해 일정 시간 동안 저장될 수 있다.
면역 세포는 비제한적으로 혈액(혈액 은행 또는 제대혈 은행에 의해 수집된 혈액 포함), 비장, 골수, 수술 과정 중에 제거 및/또는 노출된 조직, 및 생검 절차를 통해 수득된 조직을 포함하는 그들이 거주하는 임의의 조직으로부터 농축/정제 될 수 있다. 면역 세포가 풍부하고, 단리되고/되거나 정제되는 조직/기관은 살아있는 대상체와 살아있지 않은 대상체 모두로부터 단리될 수 있으며, 여기서 살아있지 않은 대상체는 장기 공여자이다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 혈액, 예컨대 말초 혈액 또는 제대혈로부터 단리된다. 일부 양태에서, 제대혈로부터 단리된 면역 세포는 CD4- 또는 CD8-양성 T 세포 억제에 의해 측정된 바와 같은 향상된 면역조절 능력을 갖는다. 특정 양태에서, 면역 세포는 강화된 면역조절 능력을 위해 풀링된 혈액, 특히 풀링된 제대혈로부터 단리된다. 풀링된 혈액은 2개 이상의 공급원, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 공급원(예컨대, 공여자 대상체)으로부터 유래될 수 있다.
면역 세포의 집단은 요법을 필요로 하거나 감소된 면역 세포 활성과 관련된 질환을 앓고 있는 대상체로부터 수득될 수 있다. 따라서, 세포는 요법을 필요로 하는 대상체에게 자가일 것이다. 대안적으로, 면역 세포의 집단은 공여자, 바람직하게는 조직적합성 일치된 공여자로부터 수득될 수 있다. 면역 세포 집단은 말초 혈액, 제대혈, 골수, 비장 또는 면역 세포가 상기 대상체 또는 공여자에 상주하는 임의의 다른 기관/조직으로부터 채취될 수 있다. 면역 세포는 풀링된 제대혈과 같은 대상체 및/또는 공여자의 풀로부터 단리될 수 있다.
면역 세포의 집단이 대상체와 구별되는 공여자로부터 수득되는 경우, 수득된 세포가 대상체 내로 도입될 수 있다는 점에서 대상체 양립가능하다면 공여자는 바람직하게는 동종이계이다. 동종이계 공여자 세포는 인간-백혈구-항원(HLA) 양립가능하거나 양립가능하지 않을 수 있다. 대상체 양립가능하기 위해, 동종이계 세포는 면역원성을 감소시키도록 처리될 수 있다.
면역 세포는 당업계에 공지된 적합한 변형 방법을 사용하여 CAR을 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook and Ausubel, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994]을 참고한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 하나 이상의 CAR 단백질을 코딩하는 유전 공학을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR 단백질을 코딩하는 핵산은 유전자 편집 방법, 예컨대 CRISPR/Cas 기술을 사용하여 면역 세포의 게놈에 삽입된다. 일 예에서, CAR 단백질을 코딩하는 핵산은 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC) 유전자좌에 삽입된다(예컨대, Eyquem J et al., Nature (2017) 543:113-117 참조).
또한 본 개시내용의 면역 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 면역요법을 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 의학적 질환 또는 장애는 면역 반응을 유도하는 본원에 기재된 면역 세포 집단의 전달에 의해 치료된다. 특정 구현예에서, 의학적 질환 또는 장애는 암이다. 특정 구현예에서, 의학적 질환 또는 장애는 자가면역 또는 염증성 질환이다.
하기 실시예는 청구된 발명을 더 잘 예시하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 하기 기재된 모든 특정 조성물, 물질, 및 방법은 전체적으로 또는 부분적으로 본 발명의 범위에 속한다. 이러한 특정 조성물, 물질, 및 방법은 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니라, 단지 본 발명의 범위에 속하는 특정 구현예를 예시하기 위한 것이다. 당업자는 창의력을 행사하지 않고 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 동등한 조성물, 물질 및 방법을 개발할 수 있다. 본 발명의 범위에 여전히 남아있으면서 본원에 기재된 절차에서 많은 변화가 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이러한 변화는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
실시예 1
물질 및 방법
SEC: 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 절차는 다음과 같다. 샘플 농도가 10.0 mg/mL 이상인 경우 SEC 분석 전에 샘플을 이동상으로 10.0 mg/mL로 희석한다. 100 μg의 샘플을 컬럼에 주입하였다. 사용된 장비는 TSKgel G3000SWXL 컬럼(7.8×300 mm, 5 μm 입자 크기) 및 UV 검출기(검출 파장: 280 nm)를 갖는 Agilent 1260 HPLC 시스템이었다. 이동상은 300 mM 염화나트륨을 갖는 50 mM 포스페이트 완충액(pH 6.8 ± 0.1)이었다. 등용매 구배를 1.0 mL/분의 유속으로 20분 동안 적용하였다.
이미지 모세관 등전 포커싱(icIEF): 20 μL의 참조 표준 또는 샘플(1.0 mg/mL로 희석됨)을 0.5 μL의 pI 7.40 마커, 0.5 μL의 pI 9.77 마커, 1.0 μL의 Pharmalyte 3-10, 3.0 μL의 Pharmalyte 8-10.5, 35 μL의 1% 메틸 셀룰로스(MC), 35 μL의 8 M 우레아 용액, 0.07 μL의 아세트산 및 2.5 μL의 초순수로 구성된 ~80 μL의 마스터 믹스와 개별적으로 혼합하였다. 이어서, 로딩 혼합물을 FC 코팅된 전체 컬럼 검출 모세관이 장착된 iCE3 모세관 등전 포커싱 분석기로 분석하였다. 포커싱을 두 단계, 즉 (1) 1분 동안 1.5 kV; (2) 8분 동안 3 kV에 의해 수행하였고, 자동 샘플러 트레이를 15℃로 유지하였다. 흡광도 검출은 280 nm에서 일어났다. 분석 후, 원시 데이터를 Empower 3으로 처리하였다.
EC50 FACS: 인간 LILRB4 또는 플래그 태깅된 사이노몰거스 원숭이 LILRB4 중 하나를 발현하는 안정한 CHO-K1 세포를 사용하여 H7K3 항체의 안정성 샘플의 결합 능력을 결정하였다. CHO-K1 세포(1x105)를 연속 적정된 안정성 샘플로 염색한 다음, 형광 접합된 항-인간 IgG(Biolegend)로 이차 염색하였다. 기하학적 평균 형광(MFI)을 측정하고 EC50을 Prism에 의해 계산하였다.
EC50 ELISA: 인간 LILRB4 ECD-his 재조합 단백질(Sino Biological) 또는 사이노몰거스 원숭이 LILRB4 ECD-his 재조합 단백질(ACRObiosystems)을 4℃에서 밤새 EIA/RIA 플레이트(Corning) 상에 코팅하였다. 5% 무지방 우유로 37℃에서 2시간 동안 차단한 후, 연속 희석된 항-LILRB4 항체 100 μL를 웰에 첨가하고, 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 PBS-트윈 20(0.05%)로 3회 세척하고, PBS로 1회 세척한 다음, 실온에서 HRP 접합된 항-hFc 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories)와 함께 35분 동안 인큐베이션하였다. 신호를 TMB 기질(Sigma)을 사용하여 발생시키고, 2 M 황산의 첨가에 의해 중단시킨 다음, 플레이트 리더(Molecular Devices)로 450 nm에서 판독하였다. EC50을 Prism(GraphPad)을 사용한 OD450 측정에 기초하여 계산하였다.
ApoE 억제(IC50): 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT)-GFP 리포터 시스템과 세포외적으로 연결된 LILRB4를 발현하는 마우스 T 하이브리도마 세포주를 사용하여 H7K3 변이체의 리간드 차단 능력을 스크리닝하였다. LILRB4-리포터 세포(웰당 2 x 104)를 10 ug/mL의 고정화된 재조합 APOE3 단백질(Novoprotein Cat#CI02)과 공동 배양했을 때, GFP 발현은 수용체 LILRB4에 대한 APOE의 결합에 의해 유도되었고, GFP 신호는 유세포 분석법을 사용하여 정량화되었다. 연속 적정된 LILRB4 차단 항체 H7K3의 존재 하에서, GFP 발현은 용량 의존적 방식으로 감소되었고, IC50은 유세포 분석법 신호에 의해 계산되었다.
자가 ADCC: PBMC를 건강한 공여자로부터 신선하게 단리하고, 50 ng/mL의 rhIL-2 및 연속 적정된 항체의 존재 하에 밤새 배양하였다. 세포를 형광 접합된 항-CD14, 항-CD19, 항-CD303, 및 항-CD123 항체로 염색하고, 살아있는 단핵구, pDC 및 B 세포를 계수하기 위해 FACS Celesta에 의해 획득하였다. 7-AAD를 첨가하여 죽은 세포를 배제시켰다. 사멸의 퍼센트를 100 - [(항체 처리된 세포의 #)/(항체 처리되지 않은 세포의 #)]로 계산하였다.
THP-1-GFP 세포의 ADCC: THP-1-GFP 세포 및 갓 단리된 PBMC를 50 ng/mL의 rhIL-2 및 연속 희석된 항체의 존재 하에 밤새 공동 배양하였다(E:T 비율 = 50:1). 살아있는 THP-1-GFP 세포 수를 GFP+ 및 7-AAD-세포 상에서 게이팅함으로써 수득하였다. 사멸의 퍼센트를 자가 ADCC의 동일한 제제를 사용하여 계산하였다.
MDSC의 ADCC: 2명의 상이한 건강한 공여자로부터의 MDSC 및 NK 세포를 준비하였다. PBMC를 8일 동안 40 ng/mL의 GM-CSF의 존재 하에 SKMEL5 세포와 공동 배양하고 CD33+ 마이크로비드를 사용하여 정제함으로써 MDSC를 생성하였다. NK 세포 활성화를 위해 IL-2(100 ng/mL)를 첨가하였다. 50,000개의 MDSC와 125,000개의 NK 세포를 갖는 MDSC:NK = 1:2.5(중복)를 21시간 동안 공동 배양하였다. 21시간 인큐베이션 후, 세포를 CD14-FITC로 염색하였다. THP-1-luc-GFP 세포를 동일한 환경에서 양성 대조군으로 사용하였다. 사멸의 퍼센트를 자가 ADCC의 동일한 제제를 사용하여 계산하였다.
ADCP: 인간 단핵구를 음성 선택(Miltenyi Biotec)을 사용하여 건강한 공여자로부터 PBMC로부터 단리하고, 50 ng/mL M-CSF(R&D system)의 존재 하에 7일 동안 X-vivo 10 + 10% FBS 배지에서 배양하였다. 마지막 24시간에, 50 ng/mL의 인터페론 감마를 첨가하여 대식세포를 프라이밍하였다. THP-1-GFP 세포(2.5 x 104)를 RPE 접합된 항-CD163 및 항-CD206으로 염색된 연속 적정된 항-LILRB4 항체의 존재 하에 24시간 동안 대식세포와 공동 배양하였다(E:T=5:1). 살아있는 THP-1 세포를 GFP+ 세포 상에 게이팅함으로써 유세포 분석법에 획득하였다. 사멸의 퍼센트를 THP-1 세포의 절대 수와 GFP+% 모두에 기초하여 계산하였다.
T 세포 매개 세포독성: FACS 기반 접근법을 사용하여 나이브 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 매개하는 항-LILRB4의 능력을 결정하였다. 인간 버피 코트를 건강한 공여자로부터 수득하였고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll Paque Plus(GE Healthcare 카탈로그 번호 17-1440-03) 밀도 구배 세포 분리에 의해 버피 코트로부터 단리하였다. Pan T 세포를 인간 Pan T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec 카탈로그 번호 130-096-535)를 사용하여 PBMC로부터 추가로 단리하였다. 4x105개의 신선하게 단리된 인간 pan T 세포를 효과기 세포로 사용하였고, 1x105 THP-1-GFP를 4:1 비율로 표적 세포로 사용하였다. 인간 pan T 세포, THP-1-GFP 세포, 및 증가하는 농도의 항-LILRB4 항체 또는 이소타입 대조군 인간 IgG1(BioXcell 카탈로그 번호 BE0297)을 U자형 96-웰 플레이트에서 RPMI 1640(Gibco 카탈로그 번호 61870-036) + 10% 열 불활성화 FBS(Gibco 카탈로그 번호 10082-147)에서 총 200 μL로 혼합하고 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 말기에, 40 uL의 상청액을 사이토카인 루미넥스 분석을 위해 수집하였다. 7-AAD(BD Pharmingen 카탈로그 번호 559925)를 세포에 첨가하고 100 uL의 세포를 FACS Celesta에 의해 획득하고 GFP 양성 세포의 백분율을 측정하였다. 유세포 분석 데이터를 Flowjo 소프트웨어(Flowjo LLC)를 사용하여 분석하고, 세포 세포독성을 세포독성의 퍼센트 = 100 -([T/NT] x100)로 계산하였으며, 여기서 T 및 NT는 각각 시험 항체로 처리되거나 시험 항체 없이 처리된 GFP+ 세포의 백분율이다.
Luminex에 의한 사이토카인 분석: 세포 상청액을 맞춤형 15 플렉스 패널 키트(R&D Systems)를 사용하여 시험하였다. 벽이 없는 플레이트 및 15 플렉스 키트의 시약을 사용하여 DA 비드 분석을 수행하기 위해, R&D Systems 키트의 프로토콜을 약간 변형하였다. 먼저, DA 비드 벽이 없는 플레이트를 PBS 중의 10 μL 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 실온에서 30분 동안 차단하였다. 이후, DA 비드 플레이트를 PBS(세척 완충액) 중의 0.1% BSA 0.05% 트윈 20을 갖는 자동 세척 스테이션 LT MX(Curiox Biosystems)를 사용하여 1회 세척하였다. 각 웰은 7.5 μL의 사전 혼합된 자기 비드를 받았다. 그 다음, 적절한 웰은 7.5 μL의 희석된 샘플, 표준 또는 블랭크를 받았다. 그 다음, DA 비드 플레이트를 4의 강도 스케일로 아날로그 마이크로플레이트 지니(Genie) 쉐이커(Scientific Industries Inc., Bohemia, NY) 상에서 약 10초 동안 볼텍싱하였다. DA 비드 플레이트를 3 mm 스팬 오비탈 쉐이커(Orbit 300, Labnet, Edison, NJ) 상에 놓고, 실온에서 분당 350 회전(rpm)(0.2×g)으로 120분 동안 진탕시켰다. 그 다음, DA 비드 플레이트를 LT MX 세척 스테이션으로 3회 세척하였다. 각각의 사용된 웰은 10 μL의 검출 항체 희석제를 받았다. 이후, DA 비드를 전술한 바와 같이 아날로그 마이크로플레이트 지니 쉐이커 상에서 약 10초 동안 두고, 실온에서 350 rpm으로 60분 동안 오비탈 쉐이커 상에서 인큐베이션하였다. 그 다음, DA 비드 플레이트를 LT MX 스테이션을 사용하여 3회 세척하였다. 각 웰은 10 μL의 스트렙타비딘 피코에리트린 희석제를 받았다. DA 비드 플레이트를 전술한 바와 같이 지니 쉐이커 상에 약 10초 동안 두고, 실온에서 350 rpm으로 오비탈 쉐이커 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. DA 비드 플레이트를 LT MX 스테이션에서 3회 세척하였다. 비드를 총 부피 65 μL의 세척 완충액으로 재현탁시키고, 스커티드(skirted) PCR 플레이트로 옮기고, 데이터 수집을 위해 Luminex 리더(MAGPIX, 이중 레이저 유동 기반 검출 기기, Luminex)에서 판독하였다.
공동 배양된 T-세포 및 THP-1 세포의 FACS 분석: 인간 버피 코트를 건강한 공여자로부터 수득하였고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll Paque Plus(GE Healthcare 카탈로그 번호 17-1440-03) 밀도 구배 세포 분리에 의해 버피 코트로부터 단리하였다. Pan T 세포를 인간 Pan T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec 카탈로그 번호 130-096-535)를 사용한 음성 고갈에 의해 동결된 PBMC로부터 추가로 단리하였다. 8x105개의 정제된 인간 pan T 세포를 효과기 세포로 사용하였고, 1x105개의 THP-1-GFP를 8:1 비율로 표적 세포로 사용하였다. 인간 pan T 세포, THP-1-GFP 세포, 및 항-LILRB4 항체 또는 이소타입 대조군 인간 IgG1(BioXcell 카탈로그 번호 BE0297)을 U자형 96-웰 플레이트에에서 X-vivo 10(Lonza 카탈로그 번호 04-380Q) + 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청(FBS; Gibco 카탈로그 번호 10082-147)에서 총 200 μL로 혼합하고, 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 항-LILRB4 항체 또는 인간 IgG1의 최종 농도는 3 μg/mL(20 nM)이었다. 세포내 TNFα 및 IFNγ 생산을 측정하기 위해, 인큐베이션의 마지막 11시간에 단백질 수송 억제제(BD Biosciences 카탈로그 번호 555029)를 첨가하였다. 인큐베이션의 말기에, 세포를 단백질 수송 억제제를 함유하는 배지 밖으로 스핀 다운하고, 실온에서 10분 동안 인간 IgG(Sigma Aldrich 카탈로그 번호 I4506)와 인큐베이션하여 Fc 수용체를 차단하였다. 그 다음, 세포를 직접 접합된 항-CD4(카탈로그 번호 564975) 및 항-CD8(카탈로그 번호 563256)으로 표면 항원에 대해 염색하고, 고정/투과화 키트(카탈로그 번호 555028)를 사용하여 고정 및 투과화하고, 항-IFNγ(카탈로그 번호 554552) 및 항-TNFα(카탈로그 번호 554514) 또는 이소타입 대조군 항체(카탈로그 번호 554681, 555749)로 염색하였다. 표면 및 세포내 항원에 대한 항체는 Becton, Dickinson and Company로부터이다.
T-세포 및 THP-1 세포 활성화의 FACS 분석: T 세포 활성화 마커의 표면 발현을 BD Biosciences로부터의 직접 접합된 항-CD4(카탈로그 번호 564975), 항-CD8(카탈로그 번호 563256), 항-CD69(카탈로그 번호 555533), 및 항-CD25(카탈로그 번호 555432) 항체로 평가하였다. THP-1 세포 마커의 표면 발현을 BD Biosciences로부터의 직접 접합된 항-HLA-DR(카탈로그 번호 559866), 항-CD80(카탈로그 번호 563084), 항-CD83(카탈로그 번호 565336), 항-CD86(카탈로그 번호 562432), 항-CD205(카탈로그 번호 558156), 항-CD87(카탈로그 번호 743096), 및 Biolegend로부터의 항-CD40(카탈로그 번호 334310), 항-HLA-A, B, C(카탈로그 번호 311406), 항-LILRB4(카탈로그 번호 333008)로 평가하였다. 7-아미노악티노마이신 D(7AAD; BD Pharmingen 카탈로그 번호 559925)를 세포에 첨가한 후 세포를 FACS Celesta에 의해 획득하였다. 유세포 분석 데이터를 Flowjo 소프트웨어(Flowjo LLC)를 사용하여 분석하고 Prism GraphPad 소프트웨어에 의해 그래프화하였다.
CAR 코딩 단편에 대한 PCR 단편: PCR을 다음 조건, 즉 98℃_30초, (98℃_10초, 64℃_5초 72℃_30초) x 35 사이클, 72℃_7분을 사용하여 Venti 열순환기를 사용하여 PRIMESTAR DNA 중합효소(Takara Bio R010B)로 수행하였다. PCR 산물을 PCR 클린업 키트(Macherey-Nagel 740609.250)를 사용하여 더 정제하고, 용출된 DNA를 에탄올 침전에 의해 추가로 세척/농축하였다.
유전자 표적화: 본 발명자들은 TransAct를 사용하여 T 세포를 먼저 활성화시킨 다음, 전기천공 전에 TransAct를 세척하여 제거하였다. PMBC의 TransAct 활성화 72시간 후, CD3/CD28 비드를 자기적으로 제거하고, T 세포를 네온 형질감염 시스템(thermo fisher, 10 ul 팁)을 사용하여 5 ug 및 100 pmol/l RNA 듀플렉스에 의해 형질감염시켰다. 4× 105개 세포를 RNP 복합체 및 CAR을 코딩하는 2.5 ug PCR 단편과 혼합하였다. 전기천공 후, 세포를 배지 내로 희석하고 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 이후, 편집된 세포를 표준 조건을 사용하여 배양하였다(37℃ 및 T-세포 성장 배지에서 확장시키고, 2 내지 3일마다 ml당 1× 106개의 세포의 밀도를 유지하기 위해 필요에 따라 보충함).
TCRalpha KO T 세포: 인간 일차 T 세포를 TRAC의 제1 엑손의 5' 말단을 표적화하는 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 RNP 복합체로 형질감염시키고, 상동성 재조합 기반 넉인을 위한 DNA 주형을 공급하였다. TCRalpha를 넉아웃한 후, 세포를 IL-2 300 IU/ml를 갖고 항-CD3/28이 첨가되지 않은 완전한 옵티마이저(Optimizer) 배지에서 성장시켰다. 형질감염 후, 세포를 2주 동안 배양물에서 확장시켰다.
CAR-T 형질도입의 유세포 분석: LILRB4 CAR-T를 LILRB4-Fc 융합 단백질(ACRObiosystems CDK-H5259) 및 항-Fc 항체(Biolegend B278652)에 대한 결합에 의해 확인하였다. 내인성 TCR 알파(TRAC) 유전자좌(KO)의 넉아웃 성공을 항-CD3 염색(항-CD3 PE, BD 555333)에 의해 측정하였다.
항원 자극 분석: 1 ug/ml 재조합 대조군 항원 또는 LILRB4 항원을 PBS 완충액에서 밤새 96 웰 플레이트에 코팅하였다. 플레이트를 PBS 완충액으로 2회 세척하였다. 배양 배지(사이토카인 첨가 없음) 중의 1X105개의 CAR-T 세포를 각 웰에 첨가하고 72시간 동안 배양하였다. 세포 배양 상청액을 Luminex 분석(R&D Systems FCSTM-18)에 의한 사이토카인 방출 측정을 위해 수집하였다.
CAR-T 세포 매개 세포독성 분석: CHO K1 RB4 세포를 12시간 동안 상이한 밀도(6X104, 2X104 또는 7X103)로 시딩하였다. 1X105개의 CAR-T 세포를 첨가하고, 상층액 CAR-T 세포를 제거하고 플레이트를 PBS로 2회 세척함으로써 세포독성을 측정하였다. 총 생존 부착성 CHO K1 RB4 세포를 Promega CTG2.0 발광 키트에 의해 측정하고, 각 조건의 발광 신호를 동일한 E:T 비율 활성화 T 세포 대조군으로 나누어 % 세포독성을 계산하였다.
1단계 설계: 파트 1A 단독요법 상승 단계(1일에 단일 용량) 동안, 환자들은 증가하는 용량의 항-LILRB4 단독요법의 순차적인 코호트에 등록될 것이다. 파트 1A의 목표는 항-LILRB4 단독 요법(MTD1)의 최대 허용 용량(MTD)을 결정하는 것이다. MTD1에 대한 DLT는 치료의 처음 14일 동안(아자사이티딘/아자시티딘과 조합된 항-LILRB4의 제1 투여량 이전), 즉 항-LILRB4에 대한 제1 용량 간격 동안 평가될 것이다. 초기 용량 상승은 가속화된 적정 설계로 시작한 후, 3+3 설계를 사용할 표준 상승 단계로 이어진다. 파트 1은 상기 기재된 바와 같이 재발성 및/또는 난치성 골수단구성(M4) 및 단핵구성/단핵모구성(M5) AML 환자 및 만성 골수단구성 백혈병(CMML) 환자 모두를 포함할 것이다. 항-LILRB4의 이러한 2주 단독요법 도입("윈도우")은 단독요법으로서 LILRB4를 특이적으로 표적화하는 단일클론 항체의 효과에 대한 연구를 가능하게 한다. 파트 1B(15일째부터 시작) 동안, 파트 1A 중에 DLT가 없는 환자는 표준 용량의 아자사이티딘/아자시티딘(28일마다 7일 동안 피하 75 mg/m2)과 조합된 파트 1A에서 투여된 항-LILRB4의 동일한 용량을 받을 것이다. 아자사이티딘/아자시티딘과 조합된 MTD(MTD2)는 14일의 단독요법 및 14일의 조합 치료로 구성된 28일 DLT 윈도우에서 결정될 것이다. 파트 1(조합된 파트 1A 및 파트 1B)의 전체 DLT 기간은 28일이다. 후속 사이클은 아자사이티딘/아자시티딘과 조합된 항-LILRB4일 것이다.
실시예 2
본 발명자들은 이전에 인간 LILRB4에 대한 높은 결합 친화도를 가지며 이종이식편 AML 마우스 모델에서 암 발생을 억제할 수 있는 B4-193으로 명명된 토끼 항-LILRB4 항체를 확인하였다(미국 가출원 제62/730,715호 참조, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 포함됨).
본 발명자들은 B4-193과 동일한 CDR을 함유하는 인간화 항-LILRB4 항체를 생성하였다. H7K3으로 명명된 인간화 항-LILRB4 항체는 서열번호: 1의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호: 3의 경쇄 가변 영역 서열을 갖는다.
H7K3의 인실리코 분석은 그것이 중쇄 CDR3 내의 아미노산 잔기 W에 잠재적인 산화 부위와 경쇄 CDR1 내의 아미노산 잔기 NS에 잠재적인 탈아미드화 부위를 가지며, 이는 잠재적으로 항체의 안정성을 감소시킬 수 있음을 나타내었다.
그 다음, 본 발명자들은 PBS 또는 제제 완충액에서 40℃에서 항체 H7K3의 안정성을 평가하였고, 그 결과가 표 2 및 3에 요약되어 있다. 결과는 항체 H7K3이 불안정하다는 것을 나타낸다.
표 2. PBS에서의 H7K3의 안정성
Figure pct00004
표 3. 제제 완충액에서의 H7K3의 안정성
Figure pct00005
실시예 3
탈아민화 및 산화 책임을 수정하도록 H7K3를 재조작하기 위해, 본 발명자들은 잠재적인 산화 부위 및 탈아민화 부위에 돌연변이를 갖는 일련의 변이체를 생성하였다. H7K3 변이체의 서열이 표 4에 요약되어 있다.
표 4. H7K3 변이체
Figure pct00006
본 발명자들은 인간 및 사이노 LILRB4를 발현하는 CHO 안정한 세포를 사용한 FACS를 통해 H7K3 변이체의 결합 친화도를 시험하였다. 그 결과가 하기 표 5에 요약되어 있다.
표 5. H7K3 변이체의 결합 친화도
Figure pct00007
본 발명자들은 H7K3 변이체의 안정성을 추가로 시험하였다. 하기 표 6에 요약된 바와 같이 40℃에서 인큐베이션하지 않은 대조군 샘플과 비교하여 4W 동안 40℃에서 인큐베이션 후 H7K3에서 산화종이 관찰되었다(매핑 결과에 의해 확인됨). 40℃에서 4주 동안 인큐베이션 후 H7K3m5에서 명백한 산화가 관찰되지 않았다. H7K3m5가 H7K3보다 안정한 것으로 결론내릴 수 있다.
표 6. H7K3 및 H7K3m5의 탈당화된 감소된 질량(DRM) 결과의 비교
Figure pct00008
본 발명자들은 H7K3 변이체의 안정성을 추가로 시험하였다. 40℃에서 인큐베이션하지 않은 대조군 샘플과 비교하여 4주 동안 40℃에서 인큐베이션 후 H7K3에서 주요 피크의 약 ∼50% 감소가 관찰되었다. 대조군과 비교하여 4주 동안 40℃에서 인큐베이션 후 H7K3m5에서 주요 피크 %의 약 16% 감소가 관찰되었다. H7K3m5가 H7K3보다 안정한 것으로 결론내릴 수 있다.
표 7. H7K3 및 H7K3m5의 icIEF 결과 비교
Figure pct00009
광 노출 하에 H7K3m5에서 유의한 산화가 검출되지 않았다. 광 노출된 H7K3m5에 대해 DRM과 펩타이드 매핑 결과 사이의 일관성이 수득되었다. 결과는 H7K3m5가 산화 환경(빛) 하에서 허용가능한 안정성을 보였음을 나타내었다.
4주 동안 40℃에서 인큐베이션한 후 H7K3m5의 경우, DRM 결과는 유의한 산화가 없음을 나타내었다. H7K3m5는 DRM 및 icIEF 결과와 관련하여 H7K3보다 더 안정적인 것으로 보인다. icIEF는 낮은 비율에도 산화 및 탈아미드화를 모니터링할 수 있다.
실시예 4
본 실시예는 H7K3m5의 생물학적 기능을 예시한다.
본 발명자들은 먼저 H7K3m5가 세포 표면 상에서 발현된 LILRB4에 결합하는지 여부를 평가하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, H7K3m5는 THP-1-GFP 세포 상에서 발현된 LILRB4를 인식하였다. H7K3m5는 도 4에 나타낸 바와 같이, 시험관내에서 PBMC의 존재 하에 THP-1 세포에 대해 ADCC 활성을 유도할 수 있다. 특히, 아푸코실화된 H7K3m5는 야생형 H7K3m5에 비해 향상된 세포 사멸을 보였으며, EC50은 100배 넘게 향상되었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, H7K3m5는 또한 인간 단핵구 및 형질세포양 수지상 세포(pDC) 상에서 발현된 LILRB4에 결합한다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 인간 단핵구에서의 LILRB4 발현은 IL-10 및 IFNα 처리에 의해 상향조절될 수 있다. 인간 단핵구를 음성 선택에 의해 인간 PBMC로부터 단리하고, 24시간 동안 10% FBS 및 1xL-글루타민을 갖는 RPMI 배지에서 50 ng/ml IL-10 및 1500 U IFNα에 의해 자극하였다. 세포를 2 ug/ml에서 CD14-PE 및 항-LILRB4-APC에 의해 염색하였다.
한편, LPS에 의해 처리된 인간 단핵구는 LILRB4 발현을 하향조절하고 uPAR 발현 수준을 증가시켰다(도 7).
도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, LILRB4는 시험관내 분화된 인간 대식세포 상에서 발현된다. 시험관내 단핵구 유래 인간 대식세포 상의 LILRB4의 카피 수는 매우 높으며, 150,000 카피/세포에 가깝다.
도 9에 나타난 바와 같이, LILRB4 발현은 골수 유래 억제 세포(MDSC)에서 크게 증가한다. 시험관내 분화된 MDSC 상의 LILRB4의 카피 수는 200,000 카피/세포만큼 높을 수 있다.
도 10a-10b에 나타낸 바와 같이, LILRB4는 또한 인간 단핵구 유래 수지상 세포(DC) 상에서 고도로 발현된다. LILRB4 수준은 높은 것부터 낮은 것까지 다음 순서로 관찰된다. 면역관용 DC > 활성화된 DC > 미성숙 DC.
표 8. 상이한 유형의 인간 일차 세포 및 AML 세포주 상의 LILRB4의 카피 수의 비교
Figure pct00010
그 다음, 본 발명자들은 대식세포 침윤에 대해 높은 신호와 낮은 신호를 갖는 고형 종양 샘플 사이의 LILRB4 mRNA 발현 수준을 비교하였다. TCGA 데이터베이스로부터의 RNA 시퀀싱 데이터를 전산 생물학 및 통계적 접근법을 사용하여 분석하여, 각 종양 유형 내에서 종양 관련 대식세포에 의해 주로 발현된 다수의 전사체(집합적으로 대식세포 유전자 발현 "서명(signature)"로 정의됨)의 협동된 상향조절된 발현을 제시하는 샘플을 확인하였다. 대식세포 유전자 발현 "서명"에 대해 높은 신호를 제시하는 샘플을 종양 관련 대식세포에 의해 고도로 침윤된 것으로 분류하였다. 그 다음, LILRB4 전사체의 발현 수준을 이들 종양 샘플과 대식세포 유전자 발현 "서명"이 명백하지 않은 나머지 샘플(낮은 대식세포 침윤된 샘플로서 그룹화됨) 사이에서 비교하였다. 도 11에 나타난 바와 같이, 더 높은 LILRB4 mRNA 발현 수준은 대식세포 침윤과 상관관계가 있다.
그 다음, 본 발명자들은 고형 종양에서 LILRB4 항체(H7K3m5)에 의해 결합된 세포의 유형을 결정하였다. 고형 종양으로부터의 조직 샘플을 기계적 방법 및 PBS-10 mM EDTA를 사용하여 단일 세포로 해리시켰다. 일부 경우에, 말초 혈액 샘플을 또한 종양 조직 샘플과 동일한 공여자로부터 수득하고, 표준 방법을 사용하여 유세포 분석을 위해 처리하였다. 생성된 세포를 표준 방법을 사용하여 4℃에서 H7K3m5 및 골수 세포의 마커에 대한 항체 칵테일과 함께 인큐베이션하고, 염색된 샘플을 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 종양 샘플에서의 게이팅은 다음과 같았다. 골수성 수지상 세포(DC, CD11b+CD15-CD14-HLA-DR+CD11c+), HLA-DRHi 종양 관련 대식세포(TAM)/단핵구(CD11b+CD15-CD14+HLA-DR+), HLA-DRLo TAM/단핵구성 골수 유래 억제 세포(M-MDSC, CD11b+CD15-CD14+HLA-DR-), PMN-MDSC(CD11b+CD15+CD14-). 말초 혈액에서의 게이팅은 다음과 같았다: 골수성 DC(CD11b+CD14-CD11c+), 단핵구(CD11b+CD14+HLA-DRHi), M-MDSC(CD11b+CD14+HLA-DRLo), PMN-MDSC(CD11b+CD15+CD14-HLA-DR-Lox-1+). 도 12a-12b에 나타낸 바와 같이, 이들 실험의 결과는 H7K3m5가 종양 미세환경 및 주변부에서 단핵구성(과립구성은 아님) 골수 세포에 결합한다는 것을 입증한다. 이러한 발견은 단핵구 혈통의 골수 세포로 제한되는 LILRB4의 발현 패턴과 일치한다.
LILRB4는 일차 정상 단핵구에서 발현되지만, H7K3m5의 결합은 ADCC를 통한 단핵구 사멸을 초래하지 않았다(도 13a-13d). 아푸코실화된 H7K3m5에서, ADCC를 통한 정상 단핵구의 사멸은 시험된 PBMC 공여자의 25-50%에서 관찰되었다(도 14a-14d 및 도 15c-15d). 또한, 도 15a-15b에 나타낸 바와 같이, 아푸코실화된 및 야생형 H7K3m5 모두는 자가 ADCC를 통해 pDC의 사멸을 초래하였다. 한편, 단핵구는 공여자에 따라 아푸코실화된 H7K3m5로만 사멸될 수 있다(도 15c-도 15d).
도 16a 및 16b에 나타낸 바와 같이, H7K3m5와 같은 항-LILRB4 항체는 ADCC를 통해 시험관내 유래(종양 세포 조건화된) 골수 유래 억제자 세포(MDSC)에서 고갈되었다. 이것은 고형 종양의 치료에서 항-LILRB4에 대한 잠재적인 작용 메카니즘이다.
ADCC 외에도, 야생형 H7K3m5는 THP-1 세포에 대해 ADCP를 통한 세포 사멸을 입증하였다(도 17a-17b).
항-LILRB4 항체는 또한 종양 세포에 대한 T 세포 매개 세포독성을 향상시킨다. 도 18에 나타난 바와 같이, 항-LILRB4는 AML 세포주 THP-1-GFP에 대해 T 세포 세포독성을 유도할 수 있는 반면, 이소타입 대조군 항체에 대해 T 세포 세포독성이 관찰되지 않았다. H7K3m5 처리는 나이브 T 세포를 유도하여 THP-1 AML 세포를 용량 의존적으로 사멸시켰다. 평균 EC50은 0.208 ± 0.125 nM(31.2 ± 18.8 ng/mL)(n = 3)이었다.
세포독성 분석 샘플의 상청액으로부터의 멀티플렉싱 Luminex 분석에 의한 사이토카인 측정은 대조군 샘플과 비교하여 H7K3m5 처리된 샘플에서 IFNγ 및 TNFα의 용량 의존적 증가를 입증하였다(도 19). 사이토카인 프로파일 변화는 THP-1 세포 정량화에 의해 측정된 증가된 세포 사멸 활성과 일치하였다(도 18). 활성화된 세포독성 T 세포에 의해 생산될 가능성이 있는 증가된 TNFα 및 IFNγ 수준 외에도, 단핵구 및 대식세포에 의해 생산된 것으로 알려진 MCP-1 및 IL-1Rα의 용량 의존적 증가가 또한 관찰되었으며, 이는 활성화된 THP-1 세포로부터 유래될 가능성이 있다. IL-6, IL-8, IL-10 수준은 또한 대조군에 비해 H7K3m5 처리에 반응하여 증가하였다. 이들 사이토카인은 활성화된 T 세포 및 THP-1 세포 모두로부터 유래될 가능성이 있다.
T 세포 활성화 마커를 유세포 분석법에 의해 평가하였다(도 20 참조). CD69 발현 T 세포의 2배 더 높은 백분율이 H7K3m5 처리로 관찰되었다(도 20a). 여기서, H7K3m5로 처리된 CD4+ T 세포의 4.7% 및 CD8+ T 세포의 23.6%가 CD69를 발현한 반면, CD4+ T 세포의 2.6%와 이소타입 대조군으로 처리된 CD8+ T 세포의 12.2%만이 CD69를 발현하였다. T 세포가 단독 배양되었을 때, H7K3m5 처리에 의한 CD69+ T 세포의 증가는 없었다. H7K3m5는 CD25+ T 세포 증가에 대해 단지 경미한 효과가 있었다(도 20b).
공동 배양된 T 세포 및 THP-1 AML 세포에서의 사이토카인 생산을 또한 유세포 분석법에 대한 세포내 염색에 의해 평가하였다. 이소타입 대조군과 비교하여, H7K3m5 처리는 IFNγ 및 TNFα 생산 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 각각 2.7배 및 34배 증가시켰다(도 20c). IFNγ 생산 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 H7K3m5 처리로 2배 및 4배 증가하였고, IFNγ는 THP-1 세포에 의해 생산되지 않았다(도 20d). 반대로, TNFα 생산 THP-1 세포는 T 세포와 공동 배양하였을 때 H7K3m5 처리로 3배 증가하였다(도 18e). T 세포 없이, THP-1 세포 단독에 H7K3m5를 처리하는 것은 TNFα 생산 THP-1 세포의 증가를 초래하지 않았다. 이들 데이터는 IFNγ가 활성화된 T 세포에 의해서만 생성되었고, TNFα가 활성화된 T 세포 및 THP-1 AML 세포 모두에 의해 생산되었음을 나타내었다.
종합하면, H7K3m5는 THP-1 세포 및 활성화된 T 세포의 항원 제시를 향상시켜 IFNγ 및 TNFα를 생산하였다.
T 세포 매개 세포독성의 제안된 향상 메커니즘은 항-LILRB4 차단 항체를 사용한 LILRB4 억제 수용체 신호전달의 차단, THP-1 세포에 의한 아르기나제 생산의 감소, THP-1 세포에 의한 사이토카인의 생산(도 19 및 20) 및 THP-1의 향상된 항원 제시 능력(도 21)으로 구성된다. 도 21에 나타낸 바와 같이, THP-1 AML 세포 및 나이브 T 세포를 1.5 ug/mL(10 nM)의 H7K3m5 또는 인간 IgG1의 존재 하에 4:1의 E:T 비율로 48시간 동안 37℃에서 공동 배양하였다. T 세포 및 THP-1 세포 활성화 마커를 유세포 분석법에 의해 평가하였다(도 21). THP-1 AML 세포 상에서, 공동자극 분자 CD83의 경미한 상향조절이 모든 실험에서 검출되었다. 각 실험은 다른 공여자(n=4)로부터의 pan T 세포를 사용하였다. MHC 클래스 II 분자 HLADR(n = 3), MHC 클래스 I 분자(n = 1) 및 또 다른 공동 자극 분자 CD86(n = 2)의 경미한 상향조절이 또한 THP-1 세포 상에서 검출되었다. 이들 데이터는 H7K3m5 처리가 THP-1의 항원 제시 활성을 향상시킨다는 것을 나타낸다. T-세포 활성화 마커 CD69는 H7K3m5 처리에 의해 적당히 유도되었고(n=1), 이는 증가된 세포독성 활성과 일치하였다. 종합하면, THP-1의 향상된 항원 제시는 T 세포 활성화를 촉발시키고 향상된 세포독성 활성을 유도할 수 있다.
THP-1 세포가 H7K3m5의 존재 하에 나이브 T 세포와 공동 배양될 때, H7K3m5는 THP-1에 대한 T 세포 세포독성을 활성화시킨다(도 20). 이 활성에서 두 세포 유형의 변화를 더 이해하기 위해, 나이브 T 세포와 THP-1 AML 세포를 3 ug/mL(20 nM)의 H7K3m5 또는 인간 IgG1의 존재 하에 8:1의 E:T 비율로 48시간 동안 37℃에서 공동 배양하였다. THP-1 활성화를 유세포 분석법에 의해 평가하였다(도 22). HLA 클래스 I(A, B, C) 및 클래스 II(HLA-DR), 공동자극 분자 CD40, CD86, CD80, 및 CD83의 발현은 H7K3m5 처리에 의해 유도되었으며, 이는 H7K3m5가 THP-1 세포의 항원 제시 기능을 향상시켰음을 나타낸다. 반대로, 억제 분자 CD205 및 LILRB4의 발현은 H7K3m5에 의해 감소되지 않았다. 흥미롭게도 그리고 예기치 못하게도, H7K3m5 처리는 또한 LILRB4의 하류에 있는 NF-kB 표적인 uPAR의 발현을 증가시켰고, 이는 단핵구 AML 세포에서 고도로 발현되고 암 침윤, 전이, 생존 및 혈관신생을 촉진하는 것으로 잘 알려져 있는 LILRB4의 하류에 있는 NF-kB 표적인 uPAR의 발현을 증가시켰다(Deng et al. 2018) .
THP-1 AML 세포를 나이브 T 세포와 공동 배양할 때, T 세포 활성화 및 세포독성이 관찰되지 않았다. 이것은 높은 LILRB4 발현을 갖는 THP-1 AML 세포의 손상된 항원 제시 기능 때문일 가능성이 높다. H7K3m5가 공동 배양된 THP-1 및 나이브 T 세포에 첨가되었을 때, THP-1 세포의 향상된 항원 제시 기능은 증가된 HLA-DR 및 CD83 발현에 의해 예시된 바와 같이 관찰되었다. 나이브 T 세포의 활성화는 상응하게 관찰되었고, 특히 THP-1 세포에 대한 세포독성 활성화가 관찰되었다. 이것은 조직 배양 배지에서 사이토카인(즉, TNFα 및 IFNγ)의 증가된 분비에 의해 확증된다. 이들 데이터는 H7K3m5가 THP-1 AML 세포에 대한 T 세포 세포독성을 활성화시킬 수 있음을 입증한다.
H7K3m5에 의해 매개된 나이브 T 세포에 의한 정상 단핵구의 세포독성은 또한 이 시험관내 시스템에서 평가되었으나 정상 단핵구의 사멸은 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 정상 단핵구 상의 LILRB4 밀도는 THP-1 AML 세포 상에서의 밀도보다 10배 더 낮으며, 더 중요하게는, 정상 단핵구의 항원 제시 능력은 종양 관련 항원의 부족으로 인해 종양 AML 세포의 항원 제시 능력보다 유의하게 낮을 것으로 예상된다. 본 발명자들은 환자 AML 세포가 정상 단핵구와 유사하거나 높은 수준으로 LILRB4를 발현할 수 있음을 확인하였지만, AML 모세포가 THP-1 세포와 표현형적으로 더 유사할 수 있고 H7K3m5로 처리될 때 활성화된 T 세포에 의해 사멸될 수 있을 가능성이 있다.
그 다음, 본 발명자들은 단핵구로부터 분화된 수지상 세포(Mo-DC)에 대한 H7K3m5의 효과를 시험하였다. 고전적 단핵구를 건강한 공여자 PBMC로부터 단리하고, 6일 동안 DC 배지(StemXVivo, 50 μg/mL 겐타마이신, 50 ng/mL GM-CSF 및 35 ng/mL IL-4)를 사용하여 미성숙 수지상 세포로 분화시켰다. 그 다음, 미성숙 단핵구 유래 수지상 세포(Mo-DC)를 100 ng/mL LPS(TLR4 작용제)의 존재 하에 항체(100 nM)와 함께 인큐베이션하여 수지상 세포 성숙 및 활성화를 유도하였다. 2일 후, 세포를 세포 표면 마커의 발현에 대해 유세포 분석법에 분석하였다. 도 24에 나타낸 바와 같이, HLA-DR 및 공동자극 분자 CD86의 발현 증가와 면역관용 마커 CD209의 감소된 발현은 H7K3m5가 TLR 신호전달에 반응하여 Mo-DC의 항원 제시 및 전염증성 능력을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
미성숙 수지상 세포를 DC 배지(StemXVivo, 50 μg/mL 겐타마이신, 100 ng/mL GM-CSF 및 35 ng/mL IL-4)를 사용하여 건강한 공여자의 PBMC로부터 단리된 단핵구(Mo-DC)로부터 5일 동안 분화시켰다. 5일째에, Mo-DC를 신선한 DC 배지로 보충하고, 추가로 2일 동안 5 μg/mL CD40 리간드의 부재 또는 존재 하에 30 μg/mL H7K3m5 또는 이의 이소타입 대조군으로 처리하였다. 7일째에, T 세포를 건강하고 관련없는 공여자의 PBMC로부터 단리하고, 사이토카인 칵테일 및 30 μg/mL H7K3m5를 함유하는 신선한 배지에 현탁시켰다. T 세포 단독 및 Mo-DC 단독의 배양물을 대조군으로 포함시켰다. 4일 말기에, 배지 상청액 내의 IFN-γ 및 IL-12 수준을 ELISA에 의해 측정한 반면, Mo-DC의 세포 표면 표현형을 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 도 24-27에 예시된 실험 결과는 Mo-DC에 대한 H7K3m5의 전염증 효과가 후자가 CD40 리간드로 성숙된 경우 더욱 확연하다는 것을 보여준다.
실시예 5
본 실시예는 H7K3m5 및 WO 제2019057099호에 개시된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열에 기초한 LILRB4/CD3 이중특이적 항체의 생성을 예시한다. 중쇄 이종이량체화는 조작된 디설파이드 결합에 의해 안정화된 노브 및 홀 돌연변이(Merchant et al. Nature Biotech 1998, 16, 677-681)에 의해 제어되었다(Carter J Immunol Methods 2001, 248, 7-15). 정확한 경쇄 쌍 형성은 경쇄 Ckappa 또는 중쇄 CH1을 이전(WO2019057122A1)에 기재된 바와 같이 인간 T 세포 수용체 알파(TRAC) 및 베타(TRBC) 불변 도메인으로 대체함으로써 제어되었다. 또한 CHO에서 효과기 기능을 감소시키고, 안정성을 개선하고, 생산성을 증가시키기 위해 돌연변이를 인간 IgG1 불변 도메인에 도입하였다(Alegre et al. Transplantation 1994, 57 1537-43 및 Hu et al Biotechnol Prog 2017, 33, 786-794).
LILRB4/CD3 이중특이적 항체의 발현 및 정제
도 28a는 1+1 또는 2+1 구성의 6개의 1세대 LILRB4/CD3 이중특이적 항체의 개략적인 표현을 보여준다. 1+1 구성의 이중특이적 항체(4-3ab 및 4ab-3)를 CD3 엡실론 및 LILRB4의 단일 카피에 결합하도록 조작하였다. 2+1(44-4ab, 4ab4ab-3, 43ab-4, 및 4ab3-4ab) 구성의 이중특이적 항체를 CD3 엡실론의 단일 카피 및 LILRB4의 2개의 카피에 결합하도록 조작하였다. 44-3ab 및 4ab4ab-3 구성은 이중특이적 항체의 하나의 팔 상에 나란히 두 LILRB4 결합 모이어티를 갖는다. 43ab-4 및 4ab3-4ab 구성은 이중특이적 항체의 양쪽 팔 상에 LILRB4 결합 모이어티를 갖는다. 각각의 1세대 이중특이적 항체에 대한 폴리펩타이드 사슬 및 이의 아미노산 서열이 표 9에 열거되어 있다.
표 9. 1세대 LILRB4/CD3 이중특이적 항체에 대한 서열
Figure pct00011
1세대 이중특이적 항체를 생성하기 위해, 1세대 이중특이적 항체를 코딩하는 DNA를 유전자 합성 후 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 그 다음, 벡터의 적절한 혼합물을 Expi293 세포 내로 일시적으로 형질감염시키고 100 mL 규모로 발현시킴으로써 이중특이적 항체를 발현시켰다. 모든 샘플을 먼저 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 상청액으로부터 정제하였다. 이중특이적 항체 번호 1-3을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 추가로 정제한 반면, 이중특이적 항체 4-6을 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에 의해 정제하였다. 모든 샘플을 순도에 대해 SDS-PAGE 및 분석적 SEC에 의해 분석하였다. 결과가 표 10에 나타나 있다. 분취량을 PNGase F(MEDNA Bio M3103)로 탈당화시키고, Acquity UPLC 단백질 BEH SEC 컬럼을 사용하여 Xevo G2-XS QTOF에 결합된 Water Acquity UPLC를 사용한 질량 분광법에 의해 특성화하였다. 결과가 표 11에 나타나 있다.
표 10. 1세대 이중특이적 항체의 수율과 순도
Figure pct00012
표 11. 1세대 이중특이적 항체에 대한 질량 분광분석법 데이터
Figure pct00013
2세대 이중특이적 항체를 균질성 및 제조성을 개선하도록 설계하였다. 구체적으로, 이것은 TCRa 도메인에서 S91A를 돌연변이시켜 O-글리칸 변형을 제거하거나 Q1E 돌연변이를 만들어 N 말단 피로-Q 형성을 방지함으로써 이루어졌다. 각각의 1세대 이중특이적 항체에 대한 폴리펩타이드 사슬 및 이의 아미노산 서열이 표 12에 열거되어 있다. 1세대 이중특이적 항체로부터 시작하는 유전자 합성 또는 표준 분자 생물학 프로토콜 후에 2세대 이중특이적 항체를 코딩하는 DNA 및 대조군을 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 그 다음, 이중특이적 항체를 CHO-K1 세포 내로 일시적으로 형질감염된 적절한 벡터를 사용하여 발현시키고 유가식 프로토콜을 사용하여 14일 동안 1 L 규모로 발현시켰다. 이중특이적 항체를 단백질 A 컬럼에 의해 사용하여 모든 샘플의 상청액으로부터 정제하고, SEC에 의해 연마하였다. 모든 샘플을 순도에 대해 SDS-PAGE 및 분석적 SEC에 의해 분석하였다. 결과가 표 13에 나타나 있다. 샘플의 분취량을 탈당화하고, 질량 분광법에 의해 특성화하였으며, 이는 샘플이 1세대 이중특이적 항체의 불순물이 결여되었음을 보여주었다(표 14 참조).
표 12. 2세대 LILRB4/CD3 이중특이적 항체에 대한 서열
Figure pct00014
표 13. 2세대 이중특이적 항체의 수율 및 순도
Figure pct00015
표 14. 2세대 이중특이적 항체에 대한 질량 분광분석법 데이터
Figure pct00016
시험관내 세포독성 분석
FACS 기반 접근법을 사용하여 T 세포에 의한 표적 세포 사멸을 매개하는 LILRB4/CD3 이중특이적 항체의 능력을 결정하였다. THP-1 및 MV4-11 세포: 인간 AML 세포주 THP-1 및 MV-4-11 세포의 시험관내 세포독성을 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하도록 조작하였다. 인간 버피 코트를 스탠포드 혈액 센터(Stanford Blood Center)에 의해 수집된 건강한 공여자로부터 수득하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll Paque Plus(GE Healthcare 카탈로그 번호 17-1440-03) 밀도 구배 세포 분리에 의해 버피 코트로부터 단리하였다. Pan T 세포를 인간 Pan T 세포 단리 키트(Miltenyi Biotec 카탈로그 번호 130-096-535)를 사용하여 PBMC로부터 추가로 단리하였다. 5x105개의 신선하게 분리된 인간 pan T 세포를 효과기 세포로 사용하였고, 1x105개의 THP-1-GFP를 5:1 비율로 표적 세포로 사용하였다. MV4-11 세포 사멸 분석에서, 9x105개의 신선하게 단리된 인간 pan T 세포를 효과기 세포로 사용하였고, 1x105개의 MV4-11-GFP를 9:1 비율로 표적 세포로 사용하였다. 인간 pan T 세포, THP-1-GFP 또는 MV4-11-GFP 세포, 및 증가하는 농도의 IO-202 또는 이소타입 대조군 인간 IgG1(BioXcell 카탈로그 번호 BE0297)을 U자형 96-웰 플레이트에서 RPMI 1640(Gibco 카탈로그 번호 61870-036) + 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청(FBS; Gibco 카탈로그 번호 10082-147)을 총 200 μL로 혼합하고 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 말기에, 7-아미노악티노마이신 D(7 AAD; BD Pharmingen 카탈로그 번호 559925)를 세포에 첨가하고 100 uL의 세포를 FACS Celesta에 의해 획득하고 GFP 양성 세포의 백분율을 측정하였다. 유세포 분석 데이터를 Flowjo 소프트웨어(Flowjo LLC)를 사용하여 분석하였고, 세포 세포독성을 세포독성의 퍼센트 = 100 -([T/NT] x100)로서 계산하였고, 여기서 T 및 NT는 각각 시험 항체로 처리되거나 시험 항체 없이 처리된 GFP+ 세포의 백분율이다.
인간 정상 단핵구의 자가 살해: 1 × 106의 PBMC 및 증가된 농도의 LILRB4/CD3 이중특이적 항체 또는 대조군을 U자형 96-웰 플레이트에서 RPMI+10% 열 불활성화 FBS 및 50 ng/ml의 IL-2(R&D systems 카탈로그 번호 202-IL/CF)에서 총 200 μL로 혼합하고 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 증가하는 농도의 리툭시맙(Biogen/Genentech)과 함께 배양된 PBMC를 분석 대조군으로 사용하였다. 인큐베이션 말기에, 세포를 세척하고, 5 μL의 Fc 수용체 차단제(10 mg/mL의 인간 면역글로불린 G[IgG], Sigma Aldrich 카탈로그 번호 I4506)와 함께 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, BD Biosciences로부터의 100 μL의 형광 접합된 CD14(Clone M5E2, 카탈로그 번호 555397) 및 CD19(Clone HIB19, 카탈로그 번호 555415)와 함께 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 단핵구는 CD14 양성 세포로 확인된 반면, B 세포는 CD19 양성 세포로 확인되었다.
도 29a-29b에 나타낸 바와 같이, 단핵구와 THP-1 사이에서 상이한 항-LILRB4 단일특이적 및 이중특이적 항체에 걸쳐 유사한 결합 친화도 추세가 관찰되었다. 도 30a-30b에 나타낸 바와 같이, 단핵구 및 THP-1-luc-GFP 세포 상에서 이중특이적 LILRB4/CD3 항체의 T 세포 매개 세포독성이 관찰된다. 도 31a-31b에 나타난 바와 같이, LILRB4/CD3 이중특이적 항체에 의한 단핵구의 자가 사멸(도 31a) 및 대조군으로서 리툭산에 의한 B 세포의 자가 사멸(도 31b)이 관찰되었다.
세포 사멸 곡선 생성 및 EC50 계산을 비선형 시그모이드 용량-반응 곡선 적합을 사용한 Prism GraphPad 소프트웨어에 의해 수행하였다. 평균 ± SD를 엑셀에 의해 계산하였다. 결과가 표 15 및 16에 보고되어 있다.
표 15. 1세대 이중특이성의 T 세포 세포독성
Figure pct00017
표 16. 2세대 이중특이적 항체의 T-세포 세포독성
Figure pct00018
표면 플라즈몬 공명(Biacore)
재조합 CD3e-CD3d 이종이량체 단백질(Acro Biosystems) 또는 LILRB4 재조합 단백질(Sino Biological)에 대한 1세대 이중특이적 항체의 결합 친화도를 Biacore 8K 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하였다. 간략하게, CD3e-CD3d 또는 LILRB4 단백질을 표준 프로토콜에 따라 EDC 및 NHS를 갖는 CM5 칩 상에 고정화하였다. 그 다음, 이중특이적 항체 분석물을 각각 LILRB4 및 CD3e-CD3d에 대해 1x HBX-EP+(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 트윈 20, pH 7.4)에서 6개의 농도(1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 및 80 nM) 또는 7개의 농도(20, 2.5, 5, 10, 20, 및 40 nM)로 주사하였다. 칩을 재생 완충제로서 10 mM 글리신 pH 1.5를 사용하여 재생하였다. 참조 채널 Fc1 및 버퍼 채널에 대한 센서그램을 시험 센서그램으로부터 차감하고 실험 데이터를 1:1 결합 모델에 의해 피팅하였다. 친화도의 경우 표 17을 참조한다.
표 17. 재조합 단백질 및 세포에 대한 1세대 이중특이성의 친화도
Figure pct00019
바이오층 간섭측정법(Gator Bio)
2세대 이중특이적 항체의 결합 친화도를 Gator Bio의 기기를 사용하여 바이오층 간섭측정법(BLI)에 의해 재조합 인간 CD3e(Acro, cat # CDE-H5223), 사이노 CD3e(Acro, cat #CDE-C5226), 인간 LILRB4(Sino Biological, cat# 16742-H08H), 및 사이노 LILRB4(Acro, cat# CDK-C5227)에 대해 측정하였다. 이중특이적 항체를 5 ug/mL 부하로 고정화된 항-인간 Fc 항체(HFC) 프로브(Gator Bio, cat# PL168-160003)를 사용하여 포획하였다. 결합 친화도를 각각 인간 CD3e, 사이노 CD3e, 인간 LILRB4, 및 사이노 LILRB4에 대해 6개의 농도(0.6 내지 159 nM, 0.7 내지 164 nM, 0.8 내지 200 nM 및 2.5 내지 595 nM)를 사용하여 측정하였다. 결합 친화도 상수를 Gator의 데이터 분석 소프트웨어 1.6.1.1203을 사용한 1:1 피팅 모델(Global Fit)을 사용하여 결정하였고, KD를 Kdis/Kon의 비율을 사용하여 계산하였다. 친화도의 경우 표 18을 참조한다.
표 18. 재조합 단백질 및 세포에 대한 2세대 이중특이적 항체의 친화도
Figure pct00020
유세포 분석법
CD3 또는 LILRB4에 대한 1세대 및 2세대 이중특이적 항체의 결합을 Jurkat 세포 또는 THP-1 세포 상의 FACS에 의해 측정하였다. THP-1 세포에 대한 이중특이적 항체의 결합을 측정하기 위해, THP-1 세포를 먼저 실온에서 10분 동안 1백만 세포당 10 ug에서 인간 Fc 차단제(BD Pharmingen 카탈로그 번호 564220)와 함께 인큐베이션한 후, 얼음 상에서 30분 동안 연속적으로 희석된 이중특이적 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 BSA 염색 완충액(BD Pharmingen 카탈로그 번호 554657)로 2회 세척하고, 얼음 상에서 30분 동안 5 ug/mL에서 이차 알렉사 647 접합된 항-인간 IgG Fc 단일클론 항체(Biolegend 카탈로그 번호 409306)와 함께 인큐베이션하였다. 마지막 세척 후, 사멸한 세포를 배제하기 위해 7-AAD를 적용하였다. Jurkat 세포에 대한 1세대 이중특이적 항체의 결합을 측정하기 위해, 각각의 이중특이적 항체를 1% BSA(5배 희석 시리즈, 400 nM 최고 농도)를 포함하는 완충액에서 희석하고, 4℃에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 그 다음, 이중특이적 항체를 분석 전에 0.5시간 동안 4℃에서 5 ug/mL에서 Alexa 647 항-인간 IgG Fc로 염색하였다. CD3에 대한 결합이 이소타입 대조군과 비교하여 세포 상에서 명확하게 관찰되었지만, 결합 곡선이 정체기에 도달하지 않았기 때문에 EC50을 계산하거나 추정할 수 없었다. EC50 값에 대해 표 17 및 18을 참조한다.
실시예 6
본 실시예는 H7K3m5의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열에 기초한 CAR 단백질을 발현하는 CAR-T 세포의 생성을 예시한다.
항-LILRB4 단일클론 항체 H7K3m5로부터 유래된 단쇄 Fv(scFv)의 2개의 상이한 구성을 유세포 분석법을 사용하여 인간 일차 단핵구 및 인간 백혈병 세포 THP-1에 대한 결합에 대해 시험하였다. 도 32에 나타낸 바와 같이, VlVh 구성은 H7K3m5와 같은 결합 친화도를 유지하는 반면, VhVl 구성은 일부 결합 친화도를 상실하였다. 따라서, VlVh는 CAR 작제물에 대해 선택된다.
도 33에 예시된 바와 같이, 항-LILRB4 CAR 단백질을 발현시키기 위한 DNA 작제물은 CD3zeta 활성화 도메인과 함께 CD28 또는 4-1BB 공동자극 도메인을 함유하는 2세대 CAR 작제물이다. scFv는 항-LILRB4 단일클론 항체 H7K3m5로부터 유래된다. 5' 및 3' 상동성 팔은 TRAC 유전자 내의 Cas9 DNA 절단 부위의 상류 및 하류에 있는 상동성 서열이다(gRNA 설계에 기초함). 프로모터 및 리더 펩타이드는 유전자 발현 및 세포외 전좌에 필요한 요소이다. 여기에서, 본 발명자들은 scFv의 발현을 제어하기 위해 JeT 프로모터를 사용하였다(Eyquem J et al. Nature (2017) 543 : 113-117). SV40 폴리-A 테일은 전사체 안정성 및 번역을 개선시키기 위해 포함된다.
인간 일차 T 세포를 TRAC의 제1 엑손의 5' 말단을 표적화하는 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR-Cas9 RNP 복합체로 형질감염시키고, 상동성 재조합 기반 넉인을 위한 DNA 작제물과 함께 제공하였다. TCRalpha를 넉아웃한 후, 세포를 IL-2 300 IU/ml를 갖고 항-CD3/28이 첨가되지 않은 완전한 옵티마이저 배지에서 성장시켰다. 형질감염 후, 세포를 2주 동안 배양물에서 확장시켰다. 항-LILRB4 CAR-T 세포를 LILRB4-Fc 융합 단백질(ACRObiosystems CDK-H5259) 및 항-Fc 항체(Biolegend B278652)에 대한 결합에 의해 확인하였다. 내인성 TCR 알파(TRAC) 유전자좌(KO)의 넉아웃 성공을 항-CD3 염색(항-CD3 PE, BD 555333)에 의해 측정하였다. 도 34에 나타난 바와 같이, 항-LILRB4 CAR-T 세포의 효율적인 생성이 확인되었다.
도 35에 나타낸 바와 같이, TCR 알파(TRAC) 불활성화된 T 세포(KO) 및 항-LILRB4 CAR(또는 대조군 CAR) 넉인된 T 세포는 시험관내 세포 증식 및 확장을 겪는다. 항-LILRB4 CAR-T 세포는 대조군 CAR-T 세포와 비교하여 유의하게 더 높은 배수의 확장을 가지고 있었다.
CAR-T 배양물의 항원 의존적 활성화를 시험하기 위해, 1 ug/ml 재조합 대조군 항원 또는 LILRB4 항원을 PBS 완충액에서 밤새 96 웰 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 PBS 완충액으로 2회 세척하였다. 배양 배지(사이토카인이 첨가되지 않음) 중의 1X105개의 CAR-T 세포를 각 웰에 첨가하고 72시간 동안 인큐베이션하였다. Luminex 분석에 의한 사이토카인 방출 측정을 위해 세포 배양 상청액을 수집하였다. 도 36a-36h에 나타낸 바와 같이, 항-LILRB4 CAR-T 세포에 의한 사이토카인 IL-8, IFNγ, IL-10, IL-1ra, IL-2, IL-6, TNFα 및 IL1alpha의 방출은 LILRB4의 존재에 의존한다.
도 37a-37c는 2주 확장 후의 CAR-T 세포의 특성화를 보여준다. 액체 질소 저장소에서 동결된 CAR-T 세포를 해동시키고, 유세포 분석 전에 2-3일 동안 배양물에 보관하였다. 사용된 항체는 항-CD8 APC Cy7(BD561945), 항-PD1 PE(BD560908), 항-TIM3 BV421(BD565562)이었다. LILRB4 CAR-T 세포를 LILRB4-Fc 융합 단백질(ACRObiosystems CDK-H5259) 및 항-Fc 항체(Biolegend B278652)에 대한 결합에 의해 확인하였다. 도 37a에 나타낸 바와 같이, 항-LILRB4_CD28 발현은 CD8+ T 세포의 백분율을 약간 감소시켰고(61.8%에서 41.8%로), 세포 상에서 PD-1 및 TIM3의 발현을 실질적으로 변화시키지 않았다. 도 37b에 나타난 바와 같이, 항-LILRB4_4-1BB 발현은 CD8+ T 세포의 백분율을 48.7%에서 3.61%로 감소시키고 PD-1의 발현을 증가시켰다. 도 37c에 나타낸 바와 같이, CAR 작제물이 삽입된 TRAC 유전자좌에서의 넉아웃(KO) TCR 알파 발현은 CD8+ T 세포의 백분율 또는 PD-1 또는 TIM3의 발현을 실질적으로 변화시키지 않았다.
항-LILRB4 CAR-T 세포의 세포독성을 시험하기 위해, CHO K1 RB4 세포를 12시간 동안 상이한 밀도(6X104, 2X104 또는 7X103)로 시딩하였고, 1X105개의 CAR-T 세포를 첨가하고, 상청액 CAR-T 세포를 제거하고 플레이트를 PBS로 2회 세척함으로써 세포독성을 측정하였다. 총 생존 부착성 CHO K1 RB4 세포를 Promega CTG2.0 발광 키트에 의해 측정하고, 각 조건의 발광 신호를 동일한 E:T 비율 활성화된 T 세포 대조군으로 나누어 % 세포독성을 계산하였다. 도 38에 나타낸 바와 같이, 항-CD19 CAR-T 세포(94)가 아닌 항-LILRB4 CAR-T 세포(44)는 CHO K1 RB4 세포를 사멸시켰다.
실시예 7
본 실시예는 1상 인간 최초 시험의 설계를 예시한다.
도 39a에 나타낸 바와 같이, 항-LILRB4의 2주 단독요법 도입을 포함하는 "윈도우" 설계("윈도우")는 단일요법으로서 LILRB4를 특이적으로 표적화하는 단일클론 항체의 효과에 대한 연구를 가능하게 한다.
파트 1A 단독요법 상승 단계(1일째에 단일 용량) 동안, 환자들은 증가하는 용량의 항-LILRB4 단독요법의 순차적인 코호트에 등록될 것이다. 파트 1A의 목표는 항-LILRB4 단독 요법의 MTD(MTD1)를 결정하는 것이다. MTD1에 대한 DLT는 처리의 처음 14일 동안(아자사이티딘/아자시티딘과 조합된 항-LILRB4의 첫 번째 투여량 이전), 즉 항-LILRB4에 대한 첫 번째 용량 간격 동안 평가될 것이다. 초기 용량 상승은 가속화된 적정 설계로 시작한 후, 3+3 설계를 사용할 표준 상승 단계로 이어진다. 파트 1은 재발성 및/또는 난치성 골수단구성(M4) 및 단핵구성/단모구성(M5) AML 환자와 만성 골수단구성 백혈병(CMML) 환자 모두를 포함할 것이다.
파트 1B(15일째에 시작) 동안, 파트 1A 중의 DLT가 없는 환자는 아자사이티딘/아자시티딘의 표준 용량(28일마다 7일 동안 피하 75 mg/m2)과 조합된 파트 1A에서 투여된 항-LILRB4의 동일한 용량을 받을 것이다. 아자사이티딘/아자시티딘과 조합된 항-LILRB4의 MTD(MTD2)는 14일의 단독요법과 14일의 조합 치료로 구성된 28일 DLT 윈도우에서 결정될 것이다.
파트 1(조합된 파트 1A 및 파트 1B)의 전체 DLT 기간은 28일이다. 이것은 또한 42일로 쉽게 변경될 수 있고, 단일요법 DLT의 경우 처음 14일 및 조합요법 DLT의 경우 마지막 28일(아자사이티딘/아자시티딘 첨가로)이다.
후속 사이클은 아자사이티딘/아자시티딘과 조합된 항-LILRB4일 것이다.
도 39b 및 도 39c에 나타낸 바와 같이, 항-LILRB4 + 아자사이티딘/아자시티딘 조합에 대한 MTD 및/또는 RP2D가 확인되고 안전 검토 위원회(SRC)에 의해 승인되면, 2개의 확장 팔 중 하나에서의 등록(도 39b 및 도 39c)이 재발성 및/또는 난치성 단핵모구성/단핵구성 백혈병 환자에서 시작될 것이다.
도 39b에 나타낸 바와 같이, 본 연구는 단핵구성 분화를 갖는 재발성/난치성 AML 환자에서 단일요법 코호트 항-LILRB4를 등록할 것이다. 도 39b는 또한 설계된 "윈도우"가 수용되지 않는 경우 인간 최초 1상 시험을 위한 설계일 수 있다.
도 39c에 나타낸 바와 같이, 본 연구는 단핵구성 분화를 갖는 재발성/난치성 AML 환자에서 항-LILRB4 + 아자사이티딘/아자시티딘의 조합 코호트를 등록할 것이다.
도 39d에 나타낸 바와 같이, 본 연구는 단핵구 분화를 갖는 재발성/난치성 AML 환자 및 단핵구성 분화를 갖는 새로 진단된 AML 환자에서 항-LILRB4 + 아자시티딘/아자시티딘 + 베네토클락스의 조합 코호트를 등록할 것이다.
본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예의 관점에서 설명되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 방법 및 단계에 또는 본원에 기재된 방법의 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 관련되는 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본원에 기재된 제제를 대체할 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> Immune-Onc Therapeutics, Inc. <120> NOVEL ANTI-LILRB4 ANTIBODIES AND DERIVATIVE PRODUCTS <130> 066564-8013WO01 <160> 124 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr 50 55 60 Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 gaggtgcagc tggtcgagtc cggaggcgga ctggtgcagc ctggaggatc cctgaggctg 60 tcctgcgccg cttccggctt ctccctgtcc 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ctgggcctcc 240 acccggcagt ctggggtgcc cgatcggttt agtggatctg ggagcgggac agacttcaca 300 ttgacaatta gctcactgca ggccgaggac gtggccgtct actactgtac tcagagccac 360 actctccgca cattcggcgg agggactaaa gtggagatta agcccgacat ccagaacccc 420 gaccccgccg tgtaccagct gagagacagc aagagcagcg acaagagcgt gtgcctgttc 480 accgacttcg acagccagac ccaggtgagc cagagcaagg actccgacgt gtatatcacc 540 gacaagtgcg tgctggacat gaggagcatg gacttcaaga gcaacagcgc cgtggcctgg 600 agccagaaga gcgacttcgc ctgcgccaac gccttccaga acagcatcat ccccgaggac 660 accttcttcc ccgcccccga gagcagctaa tag 693 <210> 120 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 120 atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggtt ccccggatcc 60 cgatgcgaca tccagatgac ccagtcccct agcacactgt ccgccagcgt gggcgatcgt 120 gtgaccatca cttgtcgggc ttcccagagc atcagcagct ggctggcttg gtatcagcag 180 aagcccggca aggcccccaa gctgctgatc tacaaggctt ccactttagc tagcggcgtg 240 ccttctcgtt tctccggatc cggatccggc accgagttca ctttaaccat cagctcttta 300 cagcccgacg acttcgccac atactactgc cagcacggct acatccgggg cgatttagac 360 aatgtgttcg gcggcggcac caaggtcgag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttaa 720 tag 723 <210> 121 <211> 615 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 121 gacatccaga tgacccagtc ccctagcaca ctgtccgcca gcgtgggcga tcgtgtgacc 60 atcacttgtc gggcttccca gagcatcagc agctggctgg cttggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaag gcttccactt tagctagcgg cgtgccttct 180 cgtttctccg gatccggatc cggcaccgag ttcactttaa ccatcagctc tttacagccc 240 gacgacttcg ccacatacta ctgccagcac ggctacatcc ggggcgattt agacaatgtg 300 ttcggcggcg gcaccaaggt cgagatcaag cccgacatcc agaaccccga ccccgccgtg 360 taccagctga gagacagcaa gagcagcgac aagagcgtgt gcctgttcac cgacttcgac 420 agccagaccc aggtgagcca gagcaaggac tccgacgtgt atatcaccga caagtgcgtg 480 ctggacatga ggagcatgga cttcaagagc aacagcgccg tggcctggag ccagaagagc 540 gacttcgcct gcgccaacgc cttccagaac agcatcatcc ccgaggacac cttcttcccc 600 agccccgaga gcagc 615 <210> 122 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 122 atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggtt ccccggatcc 60 cgatgcgaca tccagatgac ccagtcccct agcacactgt ccgccagcgt gggcgatcgt 120 gtgaccatca cttgtcgggc ttcccagagc atcagcagct ggctggcttg gtatcagcag 180 aagcccggca aggcccccaa gctgctgatc tacaaggctt ccactttagc tagcggcgtg 240 ccttctcgtt tctccggatc cggatccggc accgagttca ctttaaccat cagctcttta 300 cagcccgacg acttcgccac atactactgc cagcacggct acatccgggg cgatttagac 360 aatgtgttcg gcggcggcac caaggtcgag atcaagcccg acatccagaa ccccgacccc 420 gccgtgtacc agctgagaga cagcaagagc agcgacaaga gcgtgtgcct gttcaccgac 480 ttcgacagcc agacccaggt gagccagagc aaggactccg acgtgtatat caccgacaag 540 tgcgtgctgg acatgaggag catggacttc aagagcaaca gcgccgtggc ctggagccag 600 aagagcgact tcgcctgcgc caacgccttc cagaacagca tcatccccga ggacaccttc 660 ttccccgccc ccgagagcag ctaatag 687 <210> 123 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 123 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt acagtgtgag 60 gtgcagctcg tcgagtccgg aggaggttta gtccaacccg gtggatcttt aaggctgtct 120 tgtgctgctt ccggcttttc tttatcctcc agctactgga tctcttgggt gcggcaagct 180 cccggaaagg gactcgagtg gatcggctcc atcgattccg gatccgtggg cattacctac 240 tacgccacat gggtgaaagg tcgtttcaca atctcccggg acaactccaa gaacaccctc 300 tatttacaga tgaactcttt aagggccgag gataccgctg tgtactactg tgcccggcac 360 ggcgacaatt gggctttaga tctgtggggc caaggtacac tggtgacagt gagcagcgct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ccgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagcgggt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc agggggaccg 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggttgatga 1410 <210> 124 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 124 atggtgctcg ccgcccctct cctgctcgga tttctcctgc tggctctcga actgagaccc 60 aggggagagg ccgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgccggg 120 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 180 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 240 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 300 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 360 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 420 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtctgca ccctgccccc atcccgggag 480 gagatgacca agaaccaggt cagcctgagc tgcgcggtca aaggcttcta tcccagcgac 540 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 600 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gttagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 660 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 720 acgcagaaga gcttaagcct gtctccgggt taatag 756

Claims (79)

  1. a) 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역(HC-CDR) 1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    b) 아미노산 잔기 NS에 돌연변이를 갖는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역(LC-CDR) 1, 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2 및 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 단리된 항-LILRB4 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, LC-CDR1은 서열번호: 28의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 1과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 27과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 27의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 불변 영역, 선택적으로 Ig의 불변 영역, 또는 선택적으로 인간 IgG의 불변 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 낙타화된 단일 도메인 항체, 디아바디, scFv, scFv 이량체, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F(ab')2, 이중특이적 항체, ds 디아바디, 나노바디, 도메인 항체, 또는 2가 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, LILRB4 및 CD3에 대항하는 이중특이적 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 접합체 모이어티에 연결된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 접합체 모이어티는 클리어런스(clearance) 변형제, 독소, 검출가능한 표지, 화학치료제, 사이토카인, 또는 정제 모이어티를 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제12항의 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  14. 제13항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  15. 제13항의 벡터가 발현되는 조건 하에서 제14항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 방법.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제11항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암의 효과를 치료 또는 개선하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 암은 부신암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 안암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 기관지폐포 세포 폐암, 중피종, 두경부암, 편평 세포 암종, 흑색종, 구강암, 난소암, 자궁경부암, 음경암, 전립선암, 췌장암, 피부암, 육종, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 질암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 암은 면역억제 미세환경을 갖고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 골수 유래 억제 세포(MDSC)를 사멸시키는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 암은 림프종, 림프구성 백혈병, 호지킨병, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프구성/림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병(CML), 골수이형성 증후군(MDS), 골수증식성 신생물, 및 만성 골수단구성 백혈병(CMML)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
  21. 제16 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 정맥내로, 동맥내로, 종양내로, 또는 피하로 투여되는 것인 방법.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린, 다우노루비신, 뉴클레오사이드 대사 억제제, 시타라빈, 하이포메틸화제, 저용량 시타라빈(LDAC), 다우노루비신 및 시타라빈의 조합, 주사를 위한 다우노루비신 및 시타라빈 리포솜, 빅시오스(Vyxeos®), 아자사이티딘, 비다자(Vidaza®), 데시타빈, 올-트랜스-레티노산(all-trans-retinoic acid, ATRA), 비소, 삼산화비소, 히스타민 디하이드로클로라이드, 세플렌(Ceplene®), 인터루킨-2, 알데스루킨, 프로루킨(Proleukin®), 겜투주맙 오조가미신, 밀로타르그(Mylotarg®), FLT-3 억제제, 미도스타우린, 리답트(Rydapt®), 클로파라빈, 파네실 트랜스퍼라제 억제제, 데시타빈, IDH1 억제제, 이보시데닙, 티브소보(Tibsovo®), IDH2 억제제, 에나시데닙, 이디파(Idhifa®), 평활화(SMO) 억제제, 글라스데깁(glasdegib), 아르기나제 억제제, IDO 억제제, 에파카도스타트, BCL-2 억제제, 베네토클락스, 벤클렉스타(Venclexta®), 백금 복합체 유도체, 옥살리플라틴, 키나제 억제제, 티로신 키나제 억제제, PI3 키나제 억제제, BTK 억제제, 이브루티닙, 임브루비카(IMBRUVICA®), 아칼라브루티닙, 칼쿠엔스(CALQUENCE®), 자누브루티닙, PD-1 항체, PD-L1 항체, CTLA-4 항체, LAG3 항체, ICOS 항체, TIGIT 항체, TIM3 항체, CD40 항체, 4-1BB 항체, CD47 항체, SIRP1α 항체 또는 융합 단백질, E-셀렉틴의 길항제, 종양 항원에 결합하는 항체, T 세포 표면 마커에 결합하는 항체, 골수 세포 또는 NK 세포 표면 마커에 결합하는 항체, 알킬화제, 니트로소우레아제, 항대사물질, 항종양 항생제, 식물로부터 유래된 알칼로이드, 호르몬 치료 약물, 호르몬 길항제, 아로마타제 억제제 및 P-당단백질 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 약물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제11항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 자가면역 또는 염증성 질환을 치료 또는 개선하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 자가면역 또는 염증성 질환은 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판 감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진상 피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭 응집소병, 크레스트 증후군, 크론병, 데고스병, 연소성 피부근염, 원반형 루푸스, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근육염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소증 자반병(ITP), IgA 신증, 인슐린 의존성 당뇨병, 연소성 만성 관절염(스틸병), 연소성 류마티스 관절염, 메니에르병, 혼합 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 경피증, 전신성 경피증, 진행성 전신 경화증(PSS), 전신 경화증(SS), 쇼그렌 증후군, 강직 인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 다카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 염증성 장 질환(IBD), 궤양성 대장염, 크론병, 장 점막 염증, 대장염과 관련된 소모성 질환, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증, 알츠하이머병, 천식, 아토피 알레르기, 알레르기, 죽상동맥경화증, 기관지 천식, 습진, 사구체신염, 이식편 대 숙주 질환, 용혈성 빈혈, 골관절염, 패혈증, 뇌졸중, 조직 및 장기의 이식, 혈관염, 당뇨병성 망막병증, 인공호흡기 유발 폐 손상, 바이러스 감염 및 자가면역 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 세포를 사멸시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 세포는 단핵구, 형질세포양 수지상 세포(pDC), 대식세포, 골수 유래 억제 세포(MDSC), 단핵구 유래 대식세포, 단핵구 유래 수지상 세포, 또는 암 세포인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 세포는 항원 제시 기능을 갖는 것인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 세포는 세포의 표면 상에서 발현된 LILRB4 단백질의 적어도 2,000, 적어도 50,000, 적어도 100,000 또는 적어도 150,000 카피를 갖는 것인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 세포는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 또는 항체 의존적 세포 식작용(ADCP)을 통해 사멸되는 것인 방법.
  30. 제25항에 있어서, 세포는 T 세포 세포독성을 통해 사멸되는 것인 방법.
  31. T 세포를 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포를 활성화시키는 방법.
  32. T 세포를 암 세포의 존재 하에 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포를 활성화시키는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 암 세포는 항원 제시 활성을 증가시키는 것인 방법.
  34. 제31항 또는 제32항에 있어서, T 세포는 시험관내에서 배양되는 것인 방법.
  35. (a) 대상체 또는 대상체로부터의 샘플을 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 대상체 또는 샘플 내의 암 세포 또는 암 줄기 세포에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하는, 샘플 또는 대상체에서 암 세포 또는 암 줄기 세포를 검출하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 샘플은 체액 또는 생검인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 샘플은 혈액, 객담, 눈물, 타액, 점액, 혈청, 소변 또는 대변인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 검출은 면역조직화학, 유세포 분석 또는 FACS, 면역분석(ELISA, RIA 등을 포함함) 또는 웨스턴 블롯을 포함하는 것인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)를 2회째 또는 추가 횟수 수행하고 1회째와 비교하여 검출 수준의 변화를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  40. 대상체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도
  41. LILRB4를 검출하는데 유용한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트.
  42. a) 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    b) 아미노산 잔기 NS에 돌연변이를 갖는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1, 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2 및 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR) 단백질.
  43. 제42항에 있어서, LC-CDR1은 서열번호: 28의 아미노산 서열을 갖는 것인 CAR 단백질.
  44. 제42항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 1과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 27과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 CAR 단백질.
  45. 제42항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 가지며; 경쇄 가변 영역은 서열번호: 27의 아미노산 서열을 갖는 것인 CAR 단백질.
  46. 제42항에 있어서, 서열번호: 66 또는 서열번호: 68과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 CAR 단백질.
  47. 제42항에 있어서, 서열번호: 66 또는 68과 동일한 아미노산 서열을 갖는 scFv를 포함하는 CAR 단백질.
  48. 제42항에 있어서, CD8α 막횡단 도메인 또는 CD28 막횡단 도메인을 추가로 포함하는 CAR 단백질.
  49. 제42항에 있어서, 4-1BB 세포내 공동자극 신호전달 도메인 또는 CD28 세포내 공동자극 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 CAR 단백질.
  50. 제42항에 있어서, CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 CAR 단백질.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 CAR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  52. 제51항에 있어서, 진핵 세포에서 활성인 프로모터를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  53. 제51항에 있어서, 발현 벡터로서 추가로 정의되는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  54. 제51항의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 조작된 세포.
  55. 제54항에 있어서, 세포는 T 세포, NK 세포 또는 대식세포인 세포.
  56. 제54항 또는 제55항에 따른 세포의 치료적 유효량을 포함하는 세포 요법을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 또는 개선하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 세포 요법은 암 부위에 국소적으로, 암 부위에 지역적으로, 또는 전신으로 투여되는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 인간 대상체에게 제2 암 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 제2 암 요법은 화학요법, 면역요법, 방사선요법, 호르몬 요법 또는 수술인 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 제2 암 요법은 세포 요법과 동시에 투여되는 것인 방법.
  61. 제58항에 있어서, 상기 제2 암 요법은 세포 요법 전 또는 후에 투여되는 것인 방법.
  62. 제57항에 있어서, 제54항 또는 제55항에 따른 하나 이상의 세포의 유효량의 제2 투여를 상기 인간 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  63. 제56항에 있어서, 상기 암은 전이성, 재발성 또는 약제 내성 암인 방법.
  64. 제56항에 있어서, 상기 암은 AML인 방법.
  65. 제56항에 있어서, 상기 암은 전-B 급성 림프구성 백혈병(Pre-B ALL), B 세포 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병(CLL), 다발성 골수종(MM), 만성 골수단구성 백혈병(CMML), 골수이형성 증후군(MDS), 골수증식성 신생물, 및 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물(BPDCN)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  66. 제56항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 췌장암, 또는 전립선암인 방법.
  67. 제54항 또는 제55항에 따른 세포의 치료적 유효량을 포함하는 세포 요법을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 자가면역 또는 염증성 질환을 치료 또는 개선하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 자가면역 또는 염증성 질환은 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판 감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진상 피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭 응집소병, 크레스트 증후군, 크론병, 데고스병, 연소성 피부근염, 원반형 루푸스, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근육염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소증 자반병(ITP), IgA 신증, 인슐린 의존성 당뇨병, 연소성 만성 관절염(스틸병), 연소성 류마티스 관절염, 메니에르병, 혼합 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 경피증, 전신성 경피증, 진행성 전신 경화증(PSS), 전신 경화증(SS), 쇼그렌 증후군, 강직 인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 다카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 염증성 장 질환(IBD), 궤양성 대장염, 크론병, 장 점막 염증, 대장염과 관련된 소모성 질환, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증, 알츠하이머병, 천식, 아토피 알레르기, 알레르기, 죽상동맥경화증, 기관지 천식, 습진, 사구체신염, 이식편 대 숙주 질환, 용혈성 빈혈, 골관절염, 패혈증, 뇌졸중, 조직 및 장기의 이식, 혈관염, 당뇨병성 망막병증, 인공호흡기 유발 폐 손상, 바이러스 감염 및 자가면역 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  69. LILRB4 및 CD3에 결합할 수 있는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  70. 제69항에 있어서,
    (a) 제1 경쇄 가변(VL) 도메인 및 제1 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하는 제1 항원 결합 영역; 및
    (b) 제2 VL 도메인 및 제2 VH 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 영역
    을 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 영역은 LILRB4에 결합할 수 있고, 제2 항원 결합 영역은 CD3에 결합할 수 있거나, 또는 그 반대의 경우인, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  71. 제70항에 있어서, 제1 VL 도메인 및 제1 중쇄 가변 도메인은 각각 불변 도메인의 제1 쌍에 연결되고, 제2 VL 도메인 및 제2 VH 도메인은 각각 불변 도메인의 제2 쌍에 연결된 것인 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  72. 제71항에 있어서,
    (a) 제1 VL 도메인은 제1 경쇄 불변(CL) 도메인에 연결되고, 제1 VH 도메인은 제1 중쇄 불변 도메인 1(CH1)에 연결되거나, 또는
    (b) 제1 VL 도메인은 제1 CH1 도메인에 연결되고, VH 도메인은 제2 CL 도메인에 연결된 것인 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  73. 제72항에 있어서,
    (a) 제2 VL 도메인은 제2 CL 도메인에 연결되고, 제2 VH 도메인은 제2 CH1 도메인에 연결되거나, 또는
    (b) 제2 VL 도메인은 제2 CH1 도메인에 연결되고, 제2 VH 도메인은 제2 CL 도메인에 연결되거나, 또는
    (c) 제2 VL 도메인은 T 세포 수용체(TCR) α 사슬 불변 도메인에 연결되고, 제2 VH 도메인은 TCR β 사슬 불변 도메인에 연결되거나, 또는
    (d) 제2 VL 도메인은 TCR β 사슬 불변 도메인에 연결되고, 제2 VH 도메인은 TCR α 사슬 불변 도메인에 연결된 것인 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  74. 제73항에 있어서, TCR α 사슬 불변 도메인은 S91A 돌연변이를 갖는 것인 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  75. 제70항에 있어서, 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 단일 사슬 가변 단편(scFv)인 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  76. 제70항에 있어서, 제3 VL 도메인 및 제3 VH 도메인을 포함하는 제3 항원 결합 영역을 추가로 포함하며, 제3 항원 결합 영역은 LILRB4 또는 CD3에 결합할 수 있는 것인 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  77. 제76항에 있어서, 제3 VL 도메인 및 제3 중쇄 가변 도메인은 각각 불변 도메인의 제1 쌍에 연결된 것인 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  78. 제77항에 있어서,
    (a) 제3 VL 도메인은 제3 CL 도메인에 연결되고, 제3 VH 도메인은 제3 CH1 도메인에 연결되거나, 또는
    (b) 제3 VL 도메인은 제3 CH1 도메인에 연결되고, 제3 VH 도메인은 제3 CL 도메인에 연결되거나, 또는
    (c) 제3 VL 도메인은 제2 TCR α 사슬 불변 도메인에 연결되고, 제3 VH 도메인은 제2 TCR β 사슬 불변 도메인에 연결되거나, 또는
    (d) 제3 VL 도메인은 제2 TCR β 사슬 불변 도메인에 연결되고, 제3 VH 도메인은 제2 TCR α 사슬 불변 도메인에 연결된 것인 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  79. 제70항에 있어서,
    (a) 제1 VH 도메인은 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 제1 HC-CDR1, 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 제1 HC-CDR2 및 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 제1 HC-CDR3을 포함하고;
    (b) 제1 VL 도메인은 아미노산 잔기 NS에 돌연변이를 갖는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 제1 LC-CDR1, 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 제1 LC-CDR2 및 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 제1 LC-CDR3을 포함하는 것인 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
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