JP2023517252A - 新規抗ｌｉｌｒｂ４抗体および派生産物 - Google Patents

Abstract

本開示は、抗ＬＩＬＲＢ４抗体またはその抗原結合断片、抗ＬＩＬＲＢ４キメラ抗原受容体タンパク質、これらをコードする単離ポリヌクレオチド、これらを含む薬学的組成物、およびにその使用を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願に対するクロスリファレンス
［００１］本出願は、２０２０年３月１２日に提出された米国仮特許出願第６２／９８８，８９２号に優先権を主張し、該文献の開示は本明細書に援用される。
配列表
［００２］１５１ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓによって測定されるとおり）であり、そして２０２１年３月１２日に作成された、「０６６５６４－８０１３ＷＯ０１＿ＳＴ２５」と称されるファイルに含まれる配列表は、電子投稿によって本明細書と共に提出され、そして本明細書に援用される。
発明の分野
［００３］本開示は、一般的に、医学、腫瘍学、および免疫学の分野に関する。より具体的には、本開示は、ＬＩＬＲＢ４に結合する抗体に関する。

［００４］ヒト白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー４（ＬＩＬＲＢ４）はまた、免疫グロブリン様転写物３（ＩＬＴ３またはＩＬＴ－３）、白血球免疫グロブリン様受容体５（ＬＩＲ５またはＬＩＲ－５）、およびＣＤ８５ｋまたはＣＤ８５Ｋとしても知られ、細胞質免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有し、そして免疫細胞活性化の負の制御に関与する、１型膜タンパク質である。ＬＩＬＲＢ４は、単球、マクロファージおよび樹状細胞上で発現され、そして細胞自律方式で自然免疫を阻害可能であるとともに、間接的機構を通じてＴ細胞活性化を抑制可能である。ＬＩＬＲＢ４は、難治性および再発性疾患を含む、単球性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に関する特異的マーカーである。ＬＩＬＲＢ４が、組織内への腫瘍細胞浸潤を補助し、そしてＡＭＬ細胞において、ＡＰＯＥ、ＬＩＬＲＢ４、ＳＨＰ－２、ｕＰＡＲおよびＡＲＧ１を伴うシグナル伝達経路を通じて、Ｔ細胞活性を抑制することが示されてきている（Ｄｅｎｇ Ｍ．ら， Ｎａｔｕｒｅ （２０１８） ５６２：６０５－０９）。新規抗ＬＩＬＲＢ４抗体に関する重大な必要性がある。

［００５］本開示は、抗ＬＩＬＲＢ４抗体およびその抗原結合断片、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列、抗ＬＩＬＲＢ４キメラ抗原受容体、ならびにその使用を提供する。
［００６］１つの側面において、本開示は、単離抗ＬＩＬＲＢ４抗体またはその抗原結合断片を提供する。いくつかの態様において、抗ＬＩＬＲＢ４抗体またはその抗原結合断片は：（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（ＨＣ－ＣＤＲ）１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；ならびに（ｂ）アミノ酸残基ＮＳで突然変異を含む配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域（ＬＣ－ＣＤＲ）１、配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む。

［００７］特定の態様において、ＬＣ－ＣＤＲ１は、配列番号２８のアミノ酸配列を有する。
［００８］特定の態様において、重鎖可変領域は、配列番号１に少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有し；そして軽鎖可変領域は、配列番号２７に少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有する。

［００９］特定の態様において、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、そして軽鎖可変領域は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する。
［００１０］特定の態様において、抗体または抗原結合断片は、免疫グロブリン定常領域、任意選択でＩｇＧの定常領域、または任意選択でヒトＩｇＧの定常領域をさらに含む。

［００１１］特定の態様において、本明細書記載の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。
［００１２］特定の態様において、抗体または抗原結合断片はヒト化されている。

［００１３］特定の態様において、抗原結合断片は、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）単一ドメイン抗体、ディアボディ、ｄｓ（ジスルフィド安定化）ディアボディまたはｄｓディアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）₂、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、二重特異性抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、または二価抗体である。

［００１４］特定の態様において、本明細書記載の抗ＬＩＬＲＢ４抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗ＬＩＬＲＢ４二重特異性抗体は、Ｔ細胞受容体、例えばＣＤ３に対するものである。いくつかの態様において、抗ＬＩＬＲＢ４二重特異性抗体は、ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６Ａに対するものである。

［００１５］したがって、本開示は、別の側面において、ＬＩＬＲＢ４およびＣＤ３に結合可能な二重特異性抗体または抗原結合断片を提供する。
［００１６］特定の態様において、本明細書に提供される二重特異性抗体または抗原結合断片は：（ａ）第一の軽鎖可変（Ｖ_L）ドメインおよび第一の重鎖可変（Ｖ_H）ドメインを含む、第一の抗原結合領域；ならびに（ｂ）第二のＶ_Lドメインおよび第二のＶ_Hドメインを含む、第二の抗原結合領域を含み、第一の抗原結合領域がＬＩＬＲＢ４に結合可能であり、そして第二の抗原結合領域がＣＤ３に結合可能であるか、またはその反対のものである。

［００１７］特定の態様において、第一のＶ_Lドメインおよび第一の重鎖可変ドメインは、それぞれ、定常ドメインの第一の対に連結され、そして第二のＶ_Lドメインおよび第二のＶ_Hドメインは、それぞれ、定常ドメインの第二の対に連結される。

［００１８］特定の態様において、第一のＶ_Lドメインは第一の軽鎖定常（Ｃ_L）ドメインに連結され、そして第一のＶ_Hドメインは第一の重鎖定常ドメイン１（Ｃ_H１）に連結される。特定の態様において、第一のＶ_Lドメインは第一のＣ_H１ドメインに連結され、そしてＶ_Hドメインは第二のＣ_Lドメインに連結される。

［００１９］特定の態様において、第二のＶ_Lドメインは第二のＣ_Lドメインに連結され、そして第二のＶ_Hドメインは第二のＣ_H１ドメインに連結される。特定の態様において、第二のＶ_Lドメインは第二のＣ_H１ドメインに連結され、そして第二のＶ_Hドメインは第二のＣ_Lドメインに連結される。特定の態様において、第二のＶ_Lドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖定常ドメインに連結され、そして第二のＶ_Hドメインは、ＴＣＲβ鎖定常ドメインに連結される。特定の態様において、第二のＶ_Lドメインは、ＴＣＲβ鎖定常ドメインに連結され、そして第二のＶ_Hドメインは、ＴＣＲα鎖定常ドメインに連結される。

［００２０］特定の態様において、第一の抗原結合領域および／または第二の抗原結合領域は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
［００２１］特定の態様において、本明細書に提供される抗体または抗原結合断片は、第三のＶ_Lドメインおよび第三のＶ_Hドメインを含む第三の抗原結合領域をさらに含み、第三の抗原結合領域はＬＩＬＲＢ４またはＣＤ３に結合可能である。

［００２２］特定の態様において、第三のＶ_Lドメインおよび第三の重鎖可変ドメインは、それぞれ、定常ドメインの第一の対に連結される。特定の態様において、第三のＶ_Lドメインは第三のＣ_Lドメインに連結され、そして第三のＶ_Hドメインは第三のＣ_H１ドメインに連結される。特定の態様において、第三のＶ_Lドメインは第三のＣ_H１ドメインに連結され、そして第三のＶ_Hドメインは第三のＣ_Lドメインに連結される。特定の態様において、第三のＶ_Lドメインは、第二のＴＣＲα鎖定常ドメインに連結され、そして第三のＶ_Hドメインは、第二のＴＣＲβ鎖定常ドメインに連結される。特定の態様において、第三のＶ_Lドメインは、第二のＴＣＲβ鎖定常ドメインに連結され、そして第三のＶ_Hドメインは、第二のＴＣＲα鎖定常ドメインに連結される。

［００２３］特定の態様において、ＴＣＲα鎖定常ドメインは、配列番号８９のアミノ酸配列を有する。特定の態様において、ＴＣＲα鎖定常ドメインは、配列番号８９のＳ９１Ａ突然変異を有する。

［００２４］特定の態様において、抗体または抗原結合断片は、１つまたはそれより多いコンジュゲート部分に連結される。特定の態様において、コンジュゲート部分は、クリアランス修飾剤、毒素、検出可能標識、化学療法剤、または精製部分を含む。

［００２５］別の側面において、本開示は、本明細書記載の抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的組成物を提供する。
［００２６］別の側面において、本開示は、本明細書記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離ポリヌクレオチドを提供する。

［００２７］別の側面において、本開示は、本明細書記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
［００２８］別の側面において、本開示は、本明細書記載のベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞である。

［００２９］別の側面において、本開示は、本明細書に提供するような抗ＬＩＬＲＢ４抗体をコードするかまたは産生するハイブリドーマを提供する。
［００３０］別の側面において、本開示は、本明細書記載の抗体またはその抗原結合断片を発現する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、本明細書記載のベクターが発現される条件下で、本明細書記載の宿主細胞を培養する工程を含む。

［００３１］別の側面において、本開示は、被験体において、癌を治療するかまたはその影響を改善する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、被験体に、療法的有効量の本明細書記載の抗体またはその抗原結合断片あるいは本明細書記載の薬学的組成物を投与する工程を含む。

［００３２］方法は、被験体における腫瘍負荷を減少させるかまたは根絶させてもよく、腫瘍細胞数を減少させてもよく、腫瘍サイズを減少させてもよく、腫瘍浸潤を減少させてもよく、腫瘍転移を減少させてもよく、被験体において腫瘍を根絶させてもよい。癌は、固形腫瘍または血液学的悪性腫瘍でもよい。

［００３３］特定の態様において、癌は、副腎癌、胆管癌、骨癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、目の癌、胃癌、胃食道癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、細気管支肺胞細胞肺癌、中皮腫、扁平上皮癌、黒色腫、メルケル細胞癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、肉腫、皮膚癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌、および膣癌である。

［００３４］いくつかの態様において、癌は、転移性、再発性または薬剤耐性癌である。
［００３５］いくつかの態様において、前記癌は、急性リンパ球性／リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、慢性骨髄細胞性白血病（ＣＭＬ）、びまん性巨細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、毛様細胞白血病、ＨＨＶ８関連原発性浸出リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、プレＢ急性リンパ球性白血病（プレＢ ＡＬＬ）、原発性ＣＮＳリンパ腫、原発性縦隔巨細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球リッチＢ細胞リンパ腫、重鎖病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性新生物、および真性多血症を含む血液学的悪性腫瘍である。

［００３６］特定の態様において、前記血液学的悪性腫瘍には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）またはＭ３ ＡＭＬ、急性骨髄単球性白血病またはＭ４ ＡＭＬ、急性単球性／単芽球性白血病またはＭ５ ＡＭＬ、および急性骨髄芽球性白血病のサブセットまたはサブタイプが含まれる。

［００３７］特定の態様において、前記血液学的悪性腫瘍には、ベネトクラックス、またはアザシチジン（ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ／ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）と組み合わされたベネトクラックスに耐性であるか、アザシチジンおよび／またはベネトクラックスでの治療後に再発したか、デシタビンと組み合わせたベネトクラックスに耐性であるか、またはアザシチジンおよびデシタビンでの治療後に再発した、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が含まれる。

［００３８］特定の態様において、抗体またはその抗原結合断片は、静脈内、動脈内、腫瘍内、または皮下投与される。
［００３９］特定の態様において、方法は、被験体に、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリン・トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリン、ダウノルビシン、ヌクレオシド代謝阻害剤、シタラビン、低メチル化剤、低用量シタラビン（ＬＤＡＣ）、ダウノルビシンおよびシタラビンの組み合わせ、注射用ダウノルビシンおよびシタラビン・リポソーム、Ｖｙｘｅｏｓ（登録商標）、アザシチジン、Ｖｉｄａｚａ（登録商標）、デシタビン、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ヒ素、亜ヒ酸、ヒスタミン二塩酸塩、Ｃｅｐｌｅｎｅ（登録商標）、インターロイキン－２、アルデスロイキン、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、ＦＬＴ－３阻害剤、ミドスタウリン、Ｒｙｄａｐｔ（登録商標）、クロファラビン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、ＩＤＨ１阻害剤、イボシデニブ、Ｔｉｂｓｏｖｏ（登録商標）、ＩＤＨ２阻害剤、エナシデニブ、Ｉｄｈｉｆａ（登録商標）、スムーズンド（ＳＭＯ）阻害剤、グラスデギブ、アルギナーゼ阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、エパカドスタット、ＢＣＬ－２阻害剤、ベネトクラックス、Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（登録商標）、白金複合体誘導体、オキサリプラチン、キナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、イブルチニブ、ＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（登録商標）、アカラブルチニブ、ＣＡＬＱＵＥＮＣＥ（登録商標）、ザヌブルチニブ、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＬＡＧ３抗体、ＩＣＯＳ抗体、ＴＩＧＩＴ抗体、ＴＩＭ３抗体、ＣＤ４０抗体、４－１ＢＢ抗体、ＣＤ４７抗体、ＳＩＲＰ１α抗体または融合タンパク質、ＣＤ７０抗体、ＣＬＬ１抗体、ＣＤ１２３抗体、Ｅ－セレクチンのアンタゴニスト、腫瘍抗原に結合する抗体、Ｔ細胞表面マーカーに結合する抗体、骨髄細胞またはＮＫ細胞表面マーカーに結合する抗体、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物由来のアルカロイド、ホルモン療法薬剤、ホルモンアンタゴニスト、アロマターゼ阻害剤、およびＰ－糖タンパク質阻害剤からなる群より選択される１つまたはそれより多い薬剤を投与する工程をさらに含む。

［００４０］特定の態様において、方法は、被験体に、まず一定期間、抗ＬＩＬＲＢ４抗体の単独療法を投与し、その後、アザシチジン、Ｖｉｄａｚａ（登録商標）、ＢＣＬ－２阻害剤、ベネトクラックス、およびＶｅｎｃｌｅｘｔａ（登録商標）からなる群より選択される１つまたはそれより多い薬剤を添加する工程をさらに含む。

［００４１］さらに別の側面において、本開示は、試料または被験体において、癌細胞または癌幹細胞を検出するための方法を提供する。特定の態様において、方法は：（ａ）被験体または被験体由来の試料を、本明細書記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させ；そして（ｂ）前記被験体または試料における癌細胞または癌幹細胞への前記抗体の結合を検出する工程を含む。

［００４２］いくつかの態様において、試料は体液または生検である。いくつかの態様において、試料は、血液、痰、涙、唾液、粘液、血清、尿または糞便である。
［００４３］いくつかの態様において、検出は、免疫組織化学、フローサイトメトリー、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等を含む）またはウェスタンブロットを含む。

［００４４］いくつかの態様において、方法は、工程（ａ）および（ｂ）を二回目にまたはさらに行って、そして一回目に比較した際の検出レベルの変化を決定する工程をさらに含む。

［００４５］抗ＬＩＬＲＢ４抗体またはその抗原結合断片は、標識、例えばペプチドタグ、酵素、磁気粒子、発色団、蛍光分子、化学発光分子、または色素をさらに含んでもよい。単離モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を、リポソームまたはナノ粒子にコンジュゲート化してもよい。

［００４６］別の側面において、本開示は、被験体において癌を治療するための薬剤製造における、本明細書記載の抗体またはその抗原結合断片の使用を提供する。
［００４７］別の側面において、本開示は、ＬＩＬＲＢ４を検出する際に有用な、本明細書記載の抗体またはその抗原結合断片を含むキットを提供する。

［００４８］別の側面において、本開示は、抗ＬＩＬＲＢ４キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）タンパク質を提供する。いくつかの態様において、ＣＡＲタンパク質は：（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；ならびに（ｂ）アミノ酸残基ＮＳで突然変異を含む配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、ＬＣ－ＣＤＲ１は、配列番号２８のアミノ酸配列を有する。

［００４９］いくつかの態様において、ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲタンパク質の重鎖可変領域は、配列番号１に少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有し；そしてＣＡＲタンパク質の軽鎖可変領域は、配列番号２７に少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を有し；そして軽鎖可変領域は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、ＣＡＲタンパク質は、配列番号６６または配列番号６８に、少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの態様において、ＣＡＲタンパク質は、配列番号６６または配列番号６８に同一であるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを有する。

［００５０］別の側面において、本開示は、本明細書記載のＣＡＲタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド分子は、真核細胞において活性であるプロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド分子は発現ベクターである。

［００５１］別の側面において、本開示は、本明細書記載のＣＡＲタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含む、操作細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージである。

［００５２］別の側面において、本開示は、治療の必要がある被験体において、癌を治療するかまたは改善する方法であって、被験体に、本明細書記載のＣＡＲタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含む１つまたはそれより多い細胞を含む細胞療法の有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、前記ヒト被験体に第二の癌療法を投与する工程をさらに含む。いくつかの態様において、第二の癌療法は、化学療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法または手術である。いくつかの態様において、第二の癌療法は、細胞療法と同時に投与される。いくつかの態様において、前記の第二の癌療法は、細胞療法の前または後に投与される。いくつかの態様において、方法は、前記ヒト被験体に、本明細書記載のＣＡＲタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含む１つまたはそれより多い細胞の有効量の第二の投与を投与する工程をさらに含む。

［００５３］いくつかの態様において、前記細胞療法は、癌部位に局在性に（ｌｏｃａｌ）、癌部位に局所に（ｒｅｇｉｏｎａｌ）、または全身性に投与される。
［００５４］いくつかの態様において、前記癌は、急性リンパ球性／リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、慢性骨髄細胞性白血病（ＣＭＬ）、びまん性巨細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、ＨＨＶ８関連原発性浸出リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、プレＢ急性リンパ球性白血病（プレＢ ＡＬＬ）、原発性ＣＮＳリンパ腫、原発性縦隔巨細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球リッチＢ細胞リンパ腫、重鎖病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性新生物、および真性多血症を含む血液学的悪性腫瘍である。

［００５５］特定の態様において、前記血液学的悪性腫瘍には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）またはＭ３ ＡＭＬ、急性骨髄単球性白血病またはＭ４ ＡＭＬ、急性単球性／単芽球性白血病またはＭ５ ＡＭＬ、および急性骨髄芽球性白血病のサブセットまたはサブタイプが含まれる。

［００５６］さらにさらなる側面において、被験体において、自己免疫疾患を治療するかまたはその影響を改善する方法であって、被験体に、本明細書に定義するような抗体またはその抗原結合断片の療法的有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。抗体またはその抗原結合断片は、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与されてもよい。方法は、被験体に、ステロイドまたはＮＳＡＩＤからなる群より選択される１つまたはそれより多い薬剤を投与する工程をさらに含んでもよい。自己免疫疾患は、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、未分化脊椎関節症、若年性脊椎関節症、ベーチェット病、腱付着部炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性大腸症候群、炎症性腸疾患、線維筋痛症、慢性疲労症候群、全身性炎症性疾患に関連する疼痛状態、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、早発性糖尿病（Ｉ型糖尿病としても知られる）、ウェゲナー肉芽腫症、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、多発性内分泌不全、シュミット症候群、自己免疫ブドウ膜炎、アジソン病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫甲状腺病、悪性貧血、胃委縮症、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、筋委縮性側索硬化症、副甲状腺機能低下症、ドレッサー症候群、重症筋無力症、イートン・ランバート症候群、自己免疫血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、疱疹状皮膚炎、脱毛症、強皮症、進行性全身性硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象、食道蠕動低下、強指症、および毛細血管拡張症（ｔｅｌａｎｇｔａｓｉａ））、成人発症糖尿病（ＩＩ型糖尿病としても知られる）、混合結合組織病、結節性多発動脈炎、全身性壊死性血管炎、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、抗リン脂質症候群、多形性紅斑、クッシング症候群、自己免疫慢性活性肝炎、アレルギー疾患、アレルギー性脳脊髄炎、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、高安動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞動脈炎、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、川崎病、眼内炎、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フック毛様体炎、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、移植片対宿主病、移植拒絶、野兎病、周期熱症候群、化膿性関節炎、家族性地中海熱、ＴＮＦ受容体関連周期症候群（ＴＲＡＰＳ）、マックル・ウェルス症候群、または高ＩｇＤ症候群であってもよい。

［００５７］図１は、抗ＬＩＬＲＢ４抗体および派生産物の作用機構の模式図を示す。 ［００５８］図２は、４０℃で２週間または４週間でのＨ７Ｋ３（分子Ａ）およびＨ７Ｋ３ｍ５（分子Ｂ）のｉｃＩＥＦ結果の比較を示す。 ［００５９］図３は、抗ＬＩＬＲＢ４抗体Ｈ７Ｋ３ｍ５による、ＴＨＰ－１細胞上のヒト内因性ＬＩＬＲＢ４の認識を示す。 ［００６０］図４は、野生型（ＷＴ）または無フコシル化（ａｆｕ）Ｈ７Ｋ３ｍ５によるＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞のＡＤＣＣを示す。 ［００６１］図５は、ヒト単球および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）上のＬＩＬＲＢ４発現を示す。 ［００６２］図６は、ヒト単球におけるＩＬ－１０およびＩＦＮα処理によるＬＩＬＲＢ４発現の上方制御を示す。 ［００６３］図７は、ＬＰＳによって刺激されたヒト単球上で下方制御されたＬＩＬＲＢ４レベルおよび上方制御されたｕＰＡＲレベルを示す。 ［００６４］図８Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト単球分化マクロファージ上のＬＩＲＢ４発現を示す。 図８Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ単球由来ヒトマクロファージ上のＬＩＬＲＢ４のコピー数を示す。 ［００６５］図９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化ＭＤＳＣ上のＬＩＬＲＢ４のコピー数を示す。 ［００６６］図１０Ａはヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ）上のＬＩＬＲＢ４のコピー数を示す。ＬＩＬＲＢ４レベルは、高い方から低い方に、以下の順で見られる：免疫寛容原性ＤＣ＞活性化ＤＣ＞未成熟ＤＣ。 図１０Ｂはヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ）上のＬＩＬＲＢ４のコピー数を示す。ＬＩＬＲＢ４レベルは、高い方から低い方に、以下の順で見られる：免疫寛容原性ＤＣ＞活性化ＤＣ＞未成熟ＤＣ。 ［００６７］図１１は、コンピュータ生物学アプローチを通じて生成されたマクロファージ遺伝子発現「シグネチャー」に基づく、マクロファージ浸潤に関する高シグナルおよび低シグナルを含む、ＴＣＧＡ ＲＮＡ配列決定データベース由来の固形腫瘍試料間のＬＩＬＲＢ４ ｍＲＮＡ発現レベルの比較を示す。分析中に含められた各腫瘍タイプに関する試料総数を括弧内に示す。ここに示す結果は、部分的に、ＴＣＧＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋによって生成されたＲＮＡ配列決定データに基づく。 ［００６８］図１２Ａ～１２Ｂは、Ｈ７Ｋ３ｍ５が、固形腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内に浸潤した単球性骨髄細胞、ならびに固形腫瘍患者由来の末梢血単球性骨髄細胞に特異的に結合することを示す代表的なフローサイトメトリーデータを例示する。濃い灰色で塗りつぶしたヒストグラム：Ｈ７Ｋ３ｍ５とインキュベーションした試料；薄い灰色で塗りつぶしたヒストグラム：ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照とインキュベーションした試料。図１２Ａ。ＴＭＥに浸潤した多様な骨髄細胞サブセット上のＨ７Ｋ３ｍ５またはそのアイソタイプ対照の結合シグナル。図１２Ｂ。末梢血由来の多様な骨髄細胞サブセット上のＨ７Ｋ３ｍ５またはそのアイソタイプ対照の結合シグナル。 ［００６９］図１３Ａ～１３Ｄは、新鮮ＰＢＭＣを用い、自己ＡＤＣＣにおいて、Ｈ７Ｋ３ｍ５が仲介する殺単球がないことを示す。健康なドナーから新鮮に単離したＰＢＭＣを、連続滴定Ｈ７Ｋ３ｍ５、アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１、または陽性対照としてのリツキシマブの存在下で、一晩インキュベーションした。フローサイトメトリーによって、ＣＤ１４⁺ＣＤ１９^-およびＣＤ１９⁺ＣＤ１４^-として単球およびＢ細胞を同定し、そして計数した。図１３Ａおよび１３Ｃは、２人の異なるドナー由来のＰＢＭＣによる殺単球の欠如を示し、そして図１３Ｂおよび１３Ｄは、陽性対照としての対応する殺Ｂ細胞を示す。 図１３Ａ～１３Ｄは、新鮮ＰＢＭＣを用い、自己ＡＤＣＣにおいて、Ｈ７Ｋ３ｍ５が仲介する殺単球がないことを示す。健康なドナーから新鮮に単離したＰＢＭＣを、連続滴定Ｈ７Ｋ３ｍ５、アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１、または陽性対照としてのリツキシマブの存在下で、一晩インキュベーションした。フローサイトメトリーによって、ＣＤ１４⁺ＣＤ１９^-およびＣＤ１９⁺ＣＤ１４^-として単球およびＢ細胞を同定し、そして計数した。図１３Ａおよび１３Ｃは、２人の異なるドナー由来のＰＢＭＣによる殺単球の欠如を示し、そして図１３Ｂおよび１３Ｄは、陽性対照としての対応する殺Ｂ細胞を示す。 ［００７０］図１４Ａ～１４Ｄは、野生型（ＷＴ）または無フコシル化（ａｆｕ）Ｈ７Ｋ３ｍ５による正常単球の自己ＡＤＣＣを示す。図１４Ａおよび１４Ｃは、２人の異なるドナー由来のＰＢＭＣによるＡＤＣＣを通じた代表的な殺単球を示す。無フコシル化Ｈ７Ｋ３ｍ５による単球に対するＡＤＣＣがドナー０２４で観察されたが、活性はドナー１３で最少であった。野生型Ｈ７Ｋ３ｍ５では、ＡＤＣＣはまったく観察されなかった。図１４Ｂおよび１４Ｄは、陽性対照として、対応する殺Ｂ細胞を示す。 図１４Ａ～１４Ｄは、野生型（ＷＴ）または無フコシル化（ａｆｕ）Ｈ７Ｋ３ｍ５による正常単球の自己ＡＤＣＣを示す。図１４Ａおよび１４Ｃは、２人の異なるドナー由来のＰＢＭＣによるＡＤＣＣを通じた代表的な殺単球を示す。無フコシル化Ｈ７Ｋ３ｍ５による単球に対するＡＤＣＣがドナー０２４で観察されたが、活性はドナー１３で最少であった。野生型Ｈ７Ｋ３ｍ５では、ＡＤＣＣはまったく観察されなかった。図１４Ｂおよび１４Ｄは、陽性対照として、対応する殺Ｂ細胞を示す。 ［００７１］図１５Ａ～１５Ｄは、野生型（ＷＴ）または無フコシル化（ａｆｕ）Ｈ７Ｋ３ｍ５仲介性自己ＡＤＣＣによるｐＤＣまたは単球の自己ＡＤＣＣを示す。ｐＤＣに対するＡＤＣＣは、２人のドナーにおいて、野生型および無フコシル化Ｈ７Ｋ３ｍ５の両方によって観察された。一方、単球は、ドナーに応じて、無フコシル化Ｈ７Ｋ３ｍ５でのみ殺されうる。さらに、無フコシル化Ｈ７Ｋ３ｍ５は、ｐＤＣまたは単球に対して、野生型よりもはるかにより強いＡＤＣＣ活性を示した（図１５Ａ～１５Ｂ）。 図１５Ａ～１５Ｄは、野生型（ＷＴ）または無フコシル化（ａｆｕ）Ｈ７Ｋ３ｍ５仲介性自己ＡＤＣＣによるｐＤＣまたは単球の自己ＡＤＣＣを示す。ｐＤＣに対するＡＤＣＣは、２人のドナーにおいて、野生型および無フコシル化Ｈ７Ｋ３ｍ５の両方によって観察された。一方、単球は、ドナーに応じて、無フコシル化Ｈ７Ｋ３ｍ５でのみ殺されうる。 ［００７２］図１６Ａ～１６Ｂは、同じ用量レベルで単球に対してＡＤＣＣ効果をまったく持たない、Ｈ７Ｋ３ｍ５の存在下での、精製ＮＫ細胞を伴うＣＤ３３＋ ＭＤＳＣ細胞の用量依存性ＡＤＣＣを示す。Ｈ７Ｋ３ｍ５は、同じ実験において、ＡＭＬ細胞株ＴＨＰ－１に対してＡＤＣＣ活性を示した（図１６Ｂ）。 ［００７３］図１７Ａは、抗ＬＩＬＲＢ４によるＴＨＰ－１－ＧＦＰのＡＤＣＰを示す。ＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞を、連続滴定野生型Ｈ７Ｋ３ｍ５またはアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１の存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化マクロファージと２４時間、共培養した。それぞれ、ＧＦＰ⁺およびＣＤ１６３⁺ＣＤ２０６⁺としてＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞およびマクロファージを同定し、そして定量化した。殺ＴＨＰ－１細胞のパーセントを、ＧＦＰ＋細胞の絶対数から、またはＧＦＰ＋％細胞から計算した。図１７Ａおよび１７Ｂは、２人の別個の健康なドナーから分化したマクロファージ由来の野生型Ｈ７Ｋ３ｍ５によるＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞のＡＤＣＰを示す。 図１７Ｂは、抗ＬＩＬＲＢ４によるＴＨＰ－１－ＧＦＰのＡＤＣＰを示す。ＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞を、連続滴定野生型Ｈ７Ｋ３ｍ５またはアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１の存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化マクロファージと２４時間、共培養した。それぞれ、ＧＦＰ⁺およびＣＤ１６３⁺ＣＤ２０６⁺としてＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞およびマクロファージを同定し、そして定量化した。殺ＴＨＰ－１細胞のパーセントを、ＧＦＰ＋細胞の絶対数から、またはＧＦＰ＋％細胞から計算した。図１７Ａおよび１７Ｂは、２人の別個の健康なドナーから分化したマクロファージ由来の野生型Ｈ７Ｋ３ｍ５によるＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞のＡＤＣＰを示す。 ［００７４］図１８は、抗ＬＩＬＲＢ４でのＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞細胞傷害性を示す。ＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞を、精製ナイーブＴ細胞と共培養した。抗ＬＩＬＲＢ４ Ｈ７Ｋ３ｍ５は、ＡＭＬ細胞に対してＴ細胞細胞傷害性を誘導可能である。エフェクター汎Ｔ細胞は、３人の異なる健康なドナーに由来した。平均±ＳＤとして曲線をプロットする。ＥＣ５０値は、ナノモル単位である。 ［００７５］図１９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞細胞傷害性アッセイ試料由来の上清における代表的なサイトカイン産生プロファイルを示す。ＴＨＰ－１細胞に対する抗ＬＩＬＲＢ４誘導性Ｔ細胞細胞傷害性は、共培養中のサイトカイン上昇によって反映される。平均±ＳＤとして曲線をプロットする。ＥＣ₅₀値はナノモル単位である。ＥＣ５０値はＩＬ－６に関しては得られない。 ［００７６］図２０は、フローサイトメトリーによるＴ細胞活性化の評価を示す。Ａ～Ｂ：Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９（Ａ）およびＣＤ２５（Ｂ）の表面染色。Ｃ～Ｅ：フローサイトメトリーによる共培養Ｔ細胞およびＴＨＰ－１細胞の細胞内サイトカイン染色。Ｃ：ＩＦＮγおよびＴＮＦαの両方を産生する細胞；Ｄ：ＩＦＮγを産生するがＴＮＦαを産生しない細胞；Ｅ：ＴＮＦαを産生するがＩＦＮγを産生しない細胞。 ［００７７］図２１は、Ｈ７Ｋ３ｍ５処理に際する、ＴＨＰ－１細胞上のＴ細胞活性化マーカーおよびＭＨＣ発現の増加を示す。Ｄ４２８＝ドナー４２８。ＭＦＩ＝幾何平均蛍光強度。 ［００７８］図２２は、フローサイトメトリーによる、ＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞上の活性化マーカーの表面発現を示す。ＭＦＩ＝幾何平均蛍光強度。 ［００７９］図２３は、ＡＭＬ異種移植モデルにおいてＨ７Ｋ３ｍ５が有効であることを示す。この実験は、ＴＨＰ－１．ｌｕｃ細胞の増殖動力学を評価し、そしてバイオイメージングを用いて、雌ＮＳＧマウスにおけるＴＨＰ－１．ｌｕｃヒトＡＭＬ異種移植モデル中のＨ７Ｋ３ｍ５の有効性を決定した。１ｘ１０⁶ ＴＨＰ－１．ｌｕｃ細胞を、尾静脈を通じて、ＪＡＸ雌ＮＳＧマウスに静脈内移植した。第１日（細胞注射の４～６時間後）に全身生物発光イメージングを行った後、動物をランダム化し、そしてビヒクル対照またはＨ７Ｋ３ｍ５（１ｍｇ／ｋｇ）の単回用量静脈内投与を行った。第７日、第１４日、第１７日および第２１日、対照および処置動物に関して、全身生物発光イメージングデータを収集した。 ［００８０］図２４は、Ｈ７Ｋ３ｍ５が、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達に反応した、単球由来樹状細胞（Ｍｏ－ＤＣ）の成熟／活性化を増強することを示す、フローサイトメトリーデータを例示する。Ｈ７Ｋ３ｍ５は、活性化マーカー（ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ）の発現を増進させる一方、免疫寛容原性マーカーＣＤ２０９の発現を減少させた。各線は、異なる健康なドナー由来の結果を示す。Ｈ７Ｋ３ｍ５が望ましい炎症促進性効果を生じたドナーの割合を括弧内に示す。^*ｐ＜０．０５（対応ｔ検定）。 ［００８１］図２５は、Ｈ７Ｋ３ｍ５が、同種Ｔ細胞での混合白血球反応に際して、成熟単球由来ＤＣ（Ｍｏ－ＤＣ）表面上の活性化マーカー（ＣＤ８６およびＨＬＡ－ＤＲ）の発現を増進させることを示す、フローサイトメトリーデータを例示する。それぞれ、未成熟および成熟Ｍｏ－ＤＣに対するＨ７Ｋ３ｍ５の効果を研究するため、ＣＤ４０リガンドの非存在下（－ＣＤ４０Ｌ）または存在下（＋ＣＤ４０Ｌ）で、Ｈ７Ｋ３ｍ５の効果を評価した。各線は、異なる健康なドナー由来の結果を示す（ｎ＝３人のドナー）。 ［００８２］図２６は、Ｈ７Ｋ３ｍ５が、Ｔ細胞および成熟単球由来ＤＣ（Ｍｏ－ＤＣ）の同種混合白血球反応において、ＩＬ－１２産生を増進することを示す、ＥＬＩＳＡデータを例示する。それぞれ、未成熟および成熟Ｍｏ－ＤＣに対するＨ７Ｋ３ｍ５の効果を研究するため、ＣＤ４０リガンドの非存在下（－ＣＤ４０Ｌ）または存在下（＋ＣＤ４０Ｌ）で、Ｈ７Ｋ３ｍ５の効果を評価した。データを平均±ＳＥＭとして提示し、そして各ドナーに関するデータもまた、個々のデータ点として示す（ｎ＝２～３人のドナー）。 ［００８３］図２７は、Ｈ７Ｋ３ｍ５が、Ｔ細胞および単球由来ＤＣ（Ｍｏ－ＤＣ）の同種混合白血球反応において、ＩＦＮ－γ産生を増進させることを示す、ＥＬＩＳＡデータを例示する。それぞれ、未成熟および成熟Ｍｏ－ＤＣに対するＨ７Ｋ３ｍ５の効果を研究するため、ＣＤ４０リガンドの非存在下（－ＣＤ４０Ｌ）または存在下（＋ＣＤ４０Ｌ）で、Ｈ７Ｋ３ｍ５の効果を評価した。データを平均±ＳＥＭとして提示し、そして各ドナーに関するデータもまた、個々のデータ点として示す（ｎ＝３人のドナー）。 ［００８４］図２８Ａおよび２８Ｂは、ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体の立体配置の模式図を示す。 ［００８５］図２９Ａおよび２９Ｂは、ＦＡＣＳによって測定した際のＣＤ３およびＬＩＬＲＢ４二重特異性抗体による、正常単球およびＡＭＬ細胞株ＴＨＰ－１への結合を示す。単球およびＴＨＰ－１間で、異なる抗ＬＩＬＲＢ４単一特異性および二重特異性抗体に渡って、類似の結合アフィニティ傾向が観察された。 ［００８６］図３０Ａおよび３０Ｂは、単球（図２２Ａ）およびＴＨＰ－１－ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞（図２２Ｂ）に対する二重特異性ＣＤ３／ＬＩＬＲＢ４抗体のＴ細胞仲介性細胞傷害性を示す。 ［００８７］図３１Ａおよび３１Ｂは、ＬＩＬＲＢ４ｘＣＤ３二重特異性抗体による単球の自己殺細胞（図３１Ａ）および対照としてのリツキサンによるＢ細胞の自己殺細胞（図３１Ｂ）を示す。 図３１Ａおよび３１Ｂは、ＬＩＬＲＢ４ｘＣＤ３二重特異性抗体による単球の自己殺細胞（図３１Ａ）および対照としてのリツキサンによるＢ細胞の自己殺細胞（図３１Ｂ）を示す。 ［００８８］図３２は、フローサイトメトリーアッセイにおける、ヒト初代単球およびヒト白血病細胞株ＴＨＰ－１に対する、Ｈ７Ｋ３ｍ５全長ＩｇＧおよびＳｃＦｖタンパク質を用いた結合アフィニティ比較を示す。 ［００８９］図３３は、抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲタンパク質を発現するためのＤＮＡ構築物の模式図を示す。ＤＮＡ構築物は、ＣＤ３ゼータ活性化ドメインとＣＤ２８または４－１ＢＢ共刺激ドメインを含有する第二世代ＣＡＲ構築物に基づいた。ｓｃＦｖは、抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体Ｈ７Ｋ３ｍ５に由来した。５’および３’相同アームは、ＴＲＡＣ遺伝子中のＣａｓ９ ＤＮＡ切断部位の上流および下流の相同配列である（ｇＲＮＡ設計に基づく）。プロモーターおよびリーダーペプチドは、遺伝子発現および細胞外転位置のための要素である。転写物安定性および翻訳を改善するため、ＳＶ４０ポリＡテールが含まれた。 ［００９０］図３４は、ＣＲＩＳＰＲノックアウトおよびノックイン法を用いたＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞の効率的な生成を示す。ヒト初代Ｔ細胞を、相同組換えに基づくノックインのためのＤＮＡテンプレートを伴いまたは伴わず、ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子座を不活性化するように設計されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体でトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を２週間培養中で増殖させた。ＬＩＬＲＢ４－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＤＫ－Ｈ５２５９）および抗Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｂ２７８６５２、陰性対照）への結合によって、抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞を同定した。ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）不活性化の成功（ノックアウトまたはＫＯ）を、抗ＣＤ３染色（抗ＣＤ３ ＰＥ、ＢＤ５５５３３３）によって測定した。ＡＴＣ、活性化Ｔ細胞；ＫＯ、ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）不活性化Ｔ細胞；ＲＢ４＿ＣＤ２８、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲを発現するＴ細胞；ＲＢ４＿４１ＢＢ、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲを発現するＴ細胞。 ［００９１］図３５は、ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）不活性化Ｔ細胞（ＫＯ）および抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ（または対照ＣＡＲ）ノックインＴ細胞の増殖を示す。ＴＣＲアルファのノックアウト後、細胞を、ＩＬ－２ ３００ＩＵ／ｍｌを含みそして抗ＣＤ３／２８が添加されていない完全Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ培地中で増殖させた。その日（示す通り）の総Ｔ細胞数を開始培養数で割ることによって、倍増殖をプロットした。抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞に比較して、有意により高い増殖倍を示した。ＡＴＣ、活性化Ｔ細胞；ＫＯ、ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）不活性化Ｔ細胞；ｃｔｒｌ＿ＣＤ２８、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む対照ＣＡＲを発現するＴ細胞；ｃｔｒｌ＿４１ＢＢ、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む対照ＣＡＲを発現するＴ細胞；ＲＢ４＿ＣＤ２８、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲを発現するＴ細胞；ＲＢ４＿４１ＢＢ、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲを発現するＴ細胞。 ［００９２］図３６Ａ～３６Ｈは、ＣＡＲ－Ｔ培養の抗原依存性活性化を示す。１μｇ／ｍｌの組換え対照抗原またはＬＩＬＲＢ４抗原を、ＰＢＳ緩衝液中、９６ウェルプレート上に一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。培地（いかなるサイトカインの添加も含まない）中の１Ｘ１０⁵ ＣＡＲ－Ｔ細胞を各ウェルに添加し、そして７２時間インキュベーションした。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによるサイトカイン放出測定のため、細胞培養上清を収集した。ＡＴＣ、活性化Ｔ細胞；ＫＯ、ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）不活性化Ｔ細胞；抗ＲＢ４＿ＣＤ２８ＣＡＲＴ、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲを発現するＴ細胞；抗ＲＢ４－４１ＢＢＣＡＲＴ、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲを発現するＴ細胞；対照＿ＣＤ２８ＣＡＲＴ、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む対照ＣＡＲを発現するＴ細胞；対照＿４１ＢＢＣＡＲＴ、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む対照ＣＡＲを発現するＴ細胞。 図３６Ａ～３６Ｈは、ＣＡＲ－Ｔ培養の抗原依存性活性化を示す。１μｇ／ｍｌの組換え対照抗原またはＬＩＬＲＢ４抗原を、ＰＢＳ緩衝液中、９６ウェルプレート上に一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。培地（いかなるサイトカインの添加も含まない）中の１Ｘ１０⁵ ＣＡＲ－Ｔ細胞を各ウェルに添加し、そして７２時間インキュベーションした。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによるサイトカイン放出測定のため、細胞培養上清を収集した。ＡＴＣ、活性化Ｔ細胞；ＫＯ、ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）不活性化Ｔ細胞；抗ＲＢ４＿ＣＤ２８ＣＡＲＴ、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲを発現するＴ細胞；抗ＲＢ４－４１ＢＢ ＣＡＲＴ、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲを発現するＴ細胞；対照＿ＣＤ２８ＣＡＲＴ、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む対照ＣＡＲを発現するＴ細胞；対照＿４１ＢＢＣＡＲＴ、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む対照ＣＡＲを発現するＴ細胞。 図３６Ａ～３６Ｈは、ＣＡＲ－Ｔ培養の抗原依存性活性化を示す。１μｇ／ｍｌの組換え対照抗原またはＬＩＬＲＢ４抗原を、ＰＢＳ緩衝液中、９６ウェルプレート上に一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。培地（いかなるサイトカインの添加も含まない）中の１Ｘ１０⁵ ＣＡＲ－Ｔ細胞を各ウェルに添加し、そして７２時間インキュベーションした。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによるサイトカイン放出測定のため、細胞培養上清を収集した。ＡＴＣ、活性化Ｔ細胞；ＫＯ、ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）不活性化Ｔ細胞；抗ＲＢ４＿ＣＤ２８ＣＡＲＴ、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲを発現するＴ細胞；抗ＲＢ４－４１ＢＢ ＣＡＲＴ、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲを発現するＴ細胞；対照＿ＣＤ２８ＣＡＲＴ、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む対照ＣＡＲを発現するＴ細胞；対照＿４１ＢＢＣＡＲＴ、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む対照ＣＡＲを発現するＴ細胞。 ［００９３］図３７Ａ～３７Ｃは、２週間の増殖後のＣＡＲ－Ｔ細胞の特徴付けを示す。液体窒素保存中の凍結ＣＡＲ－Ｔ細胞を融解し、そしてフローサイトメトリー分析前に２～３日間培養中に維持した。用いた抗体は、抗ＣＤ８ ＡＰＣ Ｃｙ７（ＢＤ５６１９４５）、抗ＰＤ１ ＰＥ（ＢＤ５６０９０８）および抗ＴＩＭ３ ＢＶ４２１（ＢＤ５６５５６２）であった。ＬＩＬＲＢ４－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＤＫ－Ｈ５２５９）および抗Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｂ２７８６５２）への結合によって、抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞を同定した。 図３７Ａ～３７Ｃは、２週間の増殖後のＣＡＲ－Ｔ細胞の特徴付けを示す。液体窒素保存中の凍結ＣＡＲ－Ｔ細胞を融解し、そしてフローサイトメトリー分析前に２～３日間培養中に維持した。用いた抗体は、抗ＣＤ８ ＡＰＣ Ｃｙ７（ＢＤ５６１９４５）、抗ＰＤ１ ＰＥ（ＢＤ５６０９０８）および抗ＴＩＭ３ ＢＶ４２１（ＢＤ５６５５６２）であった。ＬＩＬＲＢ４－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＤＫ－Ｈ５２５９）および抗Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｂ２７８６５２）への結合によって、抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞を同定した。 図３７Ａ～３７Ｃは、２週間の増殖後のＣＡＲ－Ｔ細胞の特徴付けを示す。液体窒素保存中の凍結ＣＡＲ－Ｔ細胞を融解し、そしてフローサイトメトリー分析前に２～３日間培養中に維持した。用いた抗体は、抗ＣＤ８ ＡＰＣ Ｃｙ７（ＢＤ５６１９４５）、抗ＰＤ１ ＰＥ（ＢＤ５６０９０８）および抗ＴＩＭ３ ＢＶ４２１（ＢＤ５６５５６２）であった。ＬＩＬＲＢ４－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＤＫ－Ｈ５２５９）および抗Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｂ２７８６５２）への結合によって、抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞を同定した。 ［００９４］図３８は、抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。ＣＨＯ Ｋ１ ＲＢ４細胞を、異なる密度で（６Ｘ１０⁴、２Ｘ１０⁴または７Ｘ１０⁴）で１２時間植え付け、１Ｘ１０⁵ ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加し、そして上清ＣＡＲ－Ｔ細胞を除去することによって細胞傷害性を測定し、そしてプレートをＰＢＳで２回洗浄した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＴＧ２．０発光キットによって、総生存接着ＣＨＯ Ｋ１ ＲＢ４細胞を測定した。そして各条件の発光シグナルを同じＥ：Ｔ比で活性化されたＴ細胞対照で割ることによって、％細胞傷害性を計算した。 ［００９５］図３９Ａ～３９Ｂは、第１相、ヒトでの最初の臨床試験の模式図を示す。図３９Ａは、用量上昇のための「ウィンドウ」設計の模式図である。図３９Ｂは、抗ＬＩＬＲＢ４単独療法の模式図である。図３９Ｃ～３９Ｄは、アザシチジンおよび／またはベネトクラックスと抗ＬＩＬＲＢ４抗体の潜在的な組み合わせ研究の模式図である。抗ＬＩＬＲＢ４との他の潜在的な組み合わせは、同じまたは類似のスキーマにしたがう。ＡＺＡ、アザシチジン；ＶＥＮ、ベネトクラックス；Ｃ１Ｄ１、サイクル１第１日；サイクル２第１日；ＤＬＴ、用量限定毒性；ＭＴＤ１、抗ＬＩＬＲＢ４単独療法の最大寛容用量；ＭＴＤ２、アザシチジンと組み合わせた抗ＬＩＬＲＢ４の最大寛容用量。疾患の進行または死亡まで、１４日ごとに、抗ＬＩＬＲＢ４を、単独療法として、または他の剤との組み合わせで投与する。 図３９Ｃ～３９Ｄは、アザシチジンおよび／またはベネトクラックスと抗ＬＩＬＲＢ４抗体の潜在的な組み合わせ研究の模式図である。抗ＬＩＬＲＢ４との他の潜在的な組み合わせは、同じまたは類似のスキーマにしたがう。ＡＺＡ、アザシチジン；ＶＥＮ、ベネトクラックス；Ｃ１Ｄ１、サイクル１第１日；サイクル２第１日；ＤＬＴ、用量限定毒性；ＭＴＤ１、抗ＬＩＬＲＢ４単独療法の最大寛容用量；ＭＴＤ２、アザシチジンと組み合わせた抗ＬＩＬＲＢ４の最大寛容用量。疾患の進行または死亡まで、１４日ごとに、抗ＬＩＬＲＢ４を、単独療法として、または他の剤との組み合わせで投与する。

［００９６］本開示の以下の説明は、単に、開示の多様な態様を例示するよう意図される。こうしたものとして、論じられる特定の修飾は、本開示の範囲に対する限定とは見なされないものとする。当業者には、本開示の範囲から逸脱することなく、多様な同等物、変化、および修飾が作製されうることが明らかであろうし、そしてこうした同等の態様が、本明細書に含まれるものであることが理解される。刊行物、特許および特許出願を含む、本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全体が本明細書に援用される。

［００９７］Ｉ． 定義
［００９８］前述の一般的な説明および以下の詳細な説明のどちらも、例示でありそして説明のためのみであり、そして請求されるような発明を制限しないことが理解されるものとする。本出願において、別に明らかに記載されない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。本開示において、用語「または」は、代替物のみを明確に指すよう示されるか、または代替物が互いに排除性である場合を除き、「および／または」を意味するよう用いられる。本明細書において、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも第二のまたはそれより多くを意味しうる。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに他の形、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は限定性ではない。また、用語、例えば「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」は、別に記載されない限り、１つの単位（ｕｎｉｔ）または要素を含む要素または構成要素、および１つより多いサブユニットを含む要素または構成要素の両方を含む。また、用語「一部（ｐｏｒｔｉｏｎ）」の使用には、部分（ｍｏｉｅｔｙ）の一部（ｐａｒｔ）または部分全体が含まれうる。

［００９９］本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、背景が明らかに別に示さない限り、複数の参照物が含まれる。
［００１００］用語「抗体」には、本明細書において、特定の抗原に結合する、任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、二価抗体、一価抗体、多重特異性抗体、または二重特異性抗体が含まれる。天然の損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体は、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。哺乳動物重鎖は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと分類され、各重鎖は可変ドメイン（Ｖ_H）、ならびに第一、第二、および第三の定常ドメイン（それぞれ、Ｃ_H1、Ｃ_H2、Ｃ_H3）を含む定常領域からなり；哺乳動物軽鎖は、λまたはκと分類される一方、各軽鎖は可変ドメイン（Ｖ_L）および定常ドメイン（Ｃ_L）からなる。典型的なＩｇＧ抗体は、「Ｙ」の形状を有し、Ｙのステムは、典型的には、ジスルフィド結合を通じて共に結合されている２つの重鎖の第二および第三の定常ドメインからなる。Ｙの各アームには、単一の軽鎖の可変および定常ドメインに結合された、単一の重鎖の可変ドメインおよび第一の定常ドメインが含まれる。軽鎖および重鎖の可変ドメインは、抗原結合に関与する。両鎖中の可変ドメインは、一般的に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３つの非常に可変性のループを含有する（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲ）。本明細書に開示される抗体および抗原結合断片のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの慣習によって定義されるかまたは同定されうる（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ， Ｂ．， Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ．， Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２７３（４）， ９２７ （１９９７）； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ．ら， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． （１９８５） １８６（３）：６５１－６３； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ．およびＬｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． （１９８７） １９６：９０１； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ．ら， Ｎａｔｕｒｅ （１９８９） ３４２（６２５２）：８７７－８３； Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃら， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２００３） ２７： ５５－７７； Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃら， Ｉｍｍｕｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２００５） １（３）； Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ （第２版）， ｃｈａｐｔｅｒ ２６， ４８１－５１４， （２０１５））。３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる隣接ストレッチ間に介在し、ＦＲは、ＣＤＲよりもより高く保存され、そして超可変ループを支持する足場を形成する。重鎖および軽鎖の定常ドメインは、抗原結合には関与しないが、多様なエフェクター機能を示す。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、クラスに割り当てられる。抗体の５つの主要なクラスまたはアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミュー重鎖の存在によって特徴付けられる。主要な抗体クラスのいくつかは、サブクラス、例えばＩｇＧ１（ガンマ１重鎖）、ＩｇＧ２（ガンマ２重鎖）、ＩｇＧ３（ガンマ３重鎖）、ＩｇＧ４（ガンマ４重鎖）、ＩｇＡ１（アルファ１重鎖）、またはＩｇＡ２（アルファ２重鎖）に分けられる。

［００１０１］用語「抗原」は、適応免疫反応を誘導可能な物質を指す。特に、抗原は、抗体またはＴリンパ球抗原受容体によって特異的に結合される物質である。抗原は、通常、タンパク質および多糖であり、より頻繁でないが脂質でもある。適切な抗原には、限定なしに、細菌（コート、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛（ｆｉｍｂｒａｉ）、および毒素）、ウイルス、および他の微生物の部分が含まれる。抗原にはまた、腫瘍抗原、例えば腫瘍における突然変異によって生成される抗原も含まれる。本明細書において、抗原にはまた、免疫原およびハプテンも含まれる。

［００１０２］用語「抗原結合断片」は、本明細書において、１つまたはそれより多くのＣＤＲを含む抗体の部分から形成される抗体断片、または抗原に結合するが、損なわれていない天然抗体構造を含まない任意の他の抗体断片を指す。抗原結合断片の例には、限定なしに、ディアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）₂、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ディアボディ（ｄｓディアボディ）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ディアボディ）、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、および二価ドメイン抗体が含まれる。抗原結合断片は、親抗体が結合するものと同じ抗原に結合可能である。

［００１０３］「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣ_H１および可変ドメインを含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成不能である。

［００１０４］「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖、ならびにＶ_HドメインおよびＣ_H１ドメインを含有する１つの重鎖の部分、ならびにまたＣ_H１およびＣ_H２ドメインの間の領域を含み、鎖間ジスルフィド結合が、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間で形成されて、Ｆ（ａｂ’）₂分子を形成可能であるようなものである。

［００１０５］「Ｆ（ａｂ’）₂断片」は、２つの軽鎖、ならびにＣ_H１およびＣ_H２ドメインの間の定常領域の部分を含有する２つの重鎖を含有し、２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されるようなものである。Ｆ（ａｂ’）₂断片は、したがって、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって共に保持される２つのＦａｂ’断片で構成される。

［００１０６］抗体に関する「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を所持する抗体の最小の断片を指す。Ｆｖ断片は、単一重鎖の可変ドメインに結合された単一軽鎖の可変ドメインからなる。

［００１０７］「一本鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、互いに直接、またはペプチドリンカー配列を通じて連結された、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインからなる、操作抗体を指す（Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ （１９８８） ８５：５８７９）。

［００１０８］「Ｆｃ」領域は、抗体のＣ_H２およびＣ_H３ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つまたはそれより多いジスルフィド結合によって、そしてＣ_H３ドメインの疎水性相互作用によって、共に保持される。抗体のＦｃ領域は、多様なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与するが、抗原結合においては機能しない。

［００１０９］「一本鎖Ｆｖ－Ｆｃ抗体」または「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」は、抗体のＦｃ領域に連結されたｓｃＦｖからなる操作抗体を指す。
［００１１０］「ｄｓＦｖ」は、単一軽鎖の可変ドメインおよび単一重鎖の可変ドメイン間の連結がジスルフィド結合である、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片を指す。いくつかの態様において、「（ｄｓＦｖ）₂」または「（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）」は３つのペプチド鎖：ペプチドリンカー（例えば長く柔軟なリンカー）によって連結され、そしてそれぞれジスルフィド架橋によって２つのＶ_Lドメインに結合された２つのＶ_Hドメインを含む。いくつかの態様において、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’は二重特異性であり、各ジスルフィド対形成重鎖および軽鎖は、異なる抗原特異性を有する。

［００１１１］「ラクダ化単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」、または「ＨＣＡｂ」は、２つのＶ_Hドメインを含有し、そして軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｄｅｃ １０；２３１（１－２）：２５－３８ （１９９９）； Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．， Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｊｕｎ；７４（４）：２７７－３０２ （２００１）； ＷＯ９４／０４６７８； ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。重鎖抗体は、元来、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）（ラクダ（ｃａｍｅｌ）、ヒトコブラクダ（ｄｒｏｍｅｄａｒｉｅ）、およびラマ（ｌｌａｍａ））に由来した。軽鎖を持たないが、ラクダ化抗体は真正の抗原結合レパートリーを有する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ら， Ｎａｔｕｒｅ （１９９３） ３６３：４４６－８； Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ （２００２） ５４：３９－４７； Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２００３） １０９：９３－１０１）。重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）は、適応免疫反応によって生成される、最小の既知の抗原結合ユニットを示す（Ｋｏｃｈ－Ｎｏｌｔｅ Ｆ．ら， ＦＡＳＥＢ Ｊ． （２００７） ２１：３４９０－８）。

［００１１２］「ナノボディ」は、重鎖抗体由来のＶＨＨドメイン、ならびに２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３からなる抗体断片を指す。
［００１１３］「ディアボディ」または「ｄＡｂ」には、断片が同じポリペプチド鎖中でＶ_Lドメインに連結されたＶ_Hドメインを含む（Ｖ_H－Ｖ_LまたはＶ_L－Ｖ_H）、２つの抗原結合部位を持つ小分子抗体断片が含まれる（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． Ｊｕｌ １５；９０（１４）：６４４４－８ （１９９３）； ＥＰ４０４０９７； ＷＯ９３／１１１６１を参照されたい）。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするためには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは、別の鎖の相補ドメインと対形成するよう強いられ、それによって、２つの抗原結合部位が生成される。抗原結合部位は、同じまたは異なる抗原（またはエピトープ）をターゲティングしうる。特定の態様において、「二重特異性ｄｓディアボディ」は、２つの異なる抗原（またはエピトープ）をターゲティングするディアボディである。

［００１１４］特定の態様において、「ｓｃＦｖ二量体」は、２つのｓｃＦｖを連結することによって操作されうる、二価（ｄｉｖａｌｅｎｔまたはｂｉｖａｌｅｎｔ）一本鎖可変断片（ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｂｉ－ｓｃＦｖ）である。別のＶ_H－Ｖ_L部分と二量体化したＶ_H－Ｖ_L（ペプチドリンカーによって連結）を含む、二価ディアボディまたは二価ｓｃＦｖ（ＢｓＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｂｉ－ｓｃＦｖ）は、一方の部分のＶ_Hが他方の部分のＶ_Lと協調して、そして同じ抗原（またはエピトープ）または異なる抗原（またはエピトープ）をターゲティング可能な２つの結合部位を形成するようになっている。他の態様において、「ｓｃＦｖ二量体」は、Ｖ_H1とＶ_L1が協調し、そしてＶ_H2とＶ_L2が協調して、そして協調した各対が異なる抗原特性を有するように、Ｖ_H1－Ｖ_L2（ペプチドリンカーによって連結）とＶ_L1－Ｖ_H2（やはりペプチドリンカーによって連結）が会合したものを含む二重特異性ディアボディである。

［００１１５］「ドメイン抗体」は、重鎖の可変ドメインまたは軽鎖の可変ドメインのみを含有する抗体断片を指す。特定の例では、２つまたはそれより多いＶ_Hドメインがペプチドリンカーで連結されて、二価または多価ドメイン抗体を生成する。二価ドメイン抗体の２つのＶ_Hドメインは、同じまたは異なる抗原をターゲティングしてもよい。

［００１１６］「二重特異性」抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体に由来する断片を有し、そして２つの異なるエピトープに結合可能である、人工抗体を指す。２つのエピトープは同じ抗原上に存在してもよいし、またはこれらは２つの異なる抗原上に存在してもよい。

［００１１７］「癌」は、本明細書において、悪性細胞増殖または新生物、異常な増殖、浸潤または転移によって特徴付けられる任意の医学的状態を指し、そして固形腫瘍および非固形腫瘍（血液学的悪性腫瘍）、例えば白血病の両方を含む。本明細書において、「固形腫瘍」は、新生物および／または悪性細胞の固形塊を指す。癌または腫瘍の例には、血液学的悪性腫瘍、口腔癌（例えば唇、舌または咽頭の癌）、消化器官（例えば食道、胃、小腸、結腸、大腸、または直腸）、腹膜、肝臓および胆汁道、膵臓、呼吸系、例えば喉頭または肺（小細胞および非小細胞）、骨、結合組織、皮膚（例えば黒色腫）、乳房、生殖器（輸卵管、子宮、子宮頸部、精巣、卵巣、または前立腺）、尿管（例えば膀胱または腎臓）、脳および内分泌腺、例えば甲状腺の癌が含まれる。特定の態様において、癌は、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、腎癌、膀胱癌、肝細胞癌、および結腸直腸癌より選択される。特定の態様において、癌は、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫およびＢ細胞リンパ腫より選択される。

［００１１８］用語「キメラ」は、本明細書において、１つの種由来の重鎖および／または軽鎖の部分、ならびに異なる種由来の重鎖および／または軽鎖の残りの部分を有する、抗体または抗原結合断片を意味する。例示的な例において、キメラ抗体は、ヒト由来の定常領域、および非ヒト動物、例えばマウスまたはウサギ由来の可変領域を含んでもよい。いくつかの態様において、非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、またはハムスターである。

［００１１９］用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、本明細書において、２つの分子間、例えば抗体および抗原間の非ランダム結合反応を指す。特定の態様において、本明細書に提供される抗体または抗原結合断片は、≦１０^-6Ｍ（例えば≦５ｘ１０^-7Ｍ、≦２ｘ１０^-7Ｍ、≦１０^-7Ｍ、≦５ｘ１０^-8Ｍ、≦２ｘ１０^-8Ｍ、≦１０^-8Ｍ、≦５ｘ１０^-9Ｍ、≦４ｘ１０^-9Ｍ、≦３ｘ１０^-9Ｍ、≦２ｘ１０^-9Ｍ、または≦１０^-9Ｍ）の結合アフィニティ（Ｋ_D）で、ヒトＬＩＬＲＢ４に特異的に結合する。本明細書において、Ｋ_Dは、解離速度対会合速度の比（ｋ_off／ｋ_on）を指し、これは、限定されるわけではないが、表面プラズモン共鳴法、マイクロスケール熱泳動（ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＨＰＬＣ－ＭＳ法およびフローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）法を含む、当該技術分野に知られる任意の慣用法を用いることによって決定されうる。特定の態様において、Ｋ_D値は、フローサイトメトリーを用いることによって、適切に決定されうる。

［００１２０］「結合をブロッキングする」または「同じエピトープに関して競合する」能力は、本明細書において、抗体または抗原結合断片が、２つの分子（例えばヒトＬＩＬＲＢ４および抗ＬＩＬＲＢ４抗体）の間の結合相互作用を任意の検出可能な度合いまで阻害する能力を指す。特定の態様において、２つの分子間の結合をブロッキングする抗体または抗原結合断片は、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、２つの分子間の結合相互作用を阻害する。特定の態様において、この阻害は８５％より大きいか、または９０％より大きくてもよい。

［００１２１］当業者は、過度の実験を伴わずに、所定の抗体が本開示の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを、前者が、ＬＩＬＲＢ４抗原ポリペプチドへの後者の結合を防止するかどうかを確認することによって、決定可能であることを認識するであろう。本開示の抗体によるＬＩＬＲＢ４抗原ポリペプチドへの結合の減少によって示されるように、所定の抗体が、本開示の抗体と競合するならば、２つの抗体は、同じ、または緊密に関連するエピトープに結合する。または、所定の抗体のＬＩＬＲＢ４抗原ポリペプチドへの結合が、本開示の抗体によって阻害されるならば、２つの抗体は、同じ、または緊密に関連するエピトープに結合する。

［００１２２］用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、本明細書において、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージ内に、抗原に対する所望の特異性を移植可能な操作受容体を指す。典型的には、ＣＡＲタンパク質は、所望の特異性を導入する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫エフェクター細胞が抗原に結合した際に、免疫エフェクター細胞にシグナルを伝達する細胞内ドメインを含む。特定の態様において、細胞外ドメインは、リーダーペプチド、抗原認識領域およびスペーサー領域を含む。特定の態様において、抗原認識領域は、抗原に特異的に結合する抗体に由来する。特定の態様において、抗原認識領域は、抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。特定の態様において、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）はヒト化抗体に由来する。特定の態様において、一本鎖可変断片は、柔軟なリンカーを通じて、軽鎖可変領域に融合された重鎖可変領域を含む。

［００１２３］アミノ酸配列に関する「保存的置換」は、アミノ酸残基を、類似の物理化学特性を持つ側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換することを指す。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を持つアミノ酸残基（例えばＭｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）間で、中性親水性側鎖を持つ残基（例えばＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）間で、酸性側鎖を持つ残基（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ）間で、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばＨｉｓ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇ）間で、または芳香族側鎖を持つ残基（例えばＴｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅ）間で行われてもよい。当該技術分野に知られるように、保存的置換は、通常、タンパク質コンホメーション構造に重大な変化は引き起こさず、そしてしたがって、タンパク質の生物学的活性を保持しうる。

［００１２４］「エフェクター機能」は、本明細書において、Ｃ１複合体およびＦｃ受容体などのエフェクターに、抗体のＦｃ領域を結合させることに寄与しうる生物学的活性を指す。例示的なエフェクター機能には：抗体およびＣ１複合体上のＣ１ｑの相互作用によって誘導される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；抗体のＦｃ領域の、エフェクター細胞上のＦｃ受容体への結合によって誘導される抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；および食作用が含まれる。

［００１２５］用語「エピトープ」は、本明細書において、抗体が結合する抗原上の原子またはアミノ酸の特定のグループを指す。２つの抗体が抗原に関して競合的結合を示すならば、これらは抗原内の同じまたは緊密に関連するエピトープに結合しうる。例えば、抗体または抗原結合断片が、参照抗体の抗原への結合を、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％ブロッキングするならば、抗体または抗原結合断片は、参照抗体と同じ／緊密に関連したエピトープに結合すると見なされうる。

［００１２６］用語「相同体」および「相同」は、本明細書において、交換可能であり、そして最適に整列させた際に、別の配列に対して少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する核酸配列（またはその相補鎖）またはアミノ酸配列を指す。

［００１２７］句「宿主細胞」は、本明細書において、外因性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入されている細胞を指す。
［００１２８］用語「ヒト化」は、本明細書において、抗体または抗原結合断片が、非ヒト動物由来のＣＤＲ、ヒト由来のＦＲ領域、および適用可能な場合、ヒト由来の定常領域を含むことを意味する。

［００１２９］「単離」物質は、天然状態から人の手によって改変されている。「単離」組成物または物質が天然に存在する場合、該物質は、改変されているか、または元来の環境から取り除かれているか、またはその両方である。例えば、生存動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、実質的に純粋な状態で存在するように、天然状態で共に存在する物質から十分に分離されている場合、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されている。「単離核酸配列」は、単離核酸分子の配列を指す。特定の態様において、「単離抗体またはその抗原結合断片」は、電気泳動法（例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィ法（例えばイオン交換クロマトグラフィまたは逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるように、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の純度を有する抗体または抗原結合断片を指す。

［００１３０］「リーダーペプチド」は、分泌経路の一部を形成する新規合成されたタンパク質のＮ末端に存在する約５～３０アミノ酸の長さを有するペプチドを指す。分泌経路のタンパク質には、限定されるわけではないが、特定の細胞内小器官（小胞体、ゴルジまたはエンドソーム）内に存在するか、細胞から分泌されるか、または細胞膜内に挿入されるかいずれのタンパク質も含まれる。いくつかの態様において、リーダーペプチドは、タンパク質の膜貫通ドメインの一部を形成する。

［００１３１］「ＬＩＬＲＢ４」は、本明細書において、霊長類（例えばヒト、サル）および齧歯類（例えばマウスおよびラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来のＬＩＬＲＢ４を指す。ヒトＬＩＬＲＢ４の例示的な配列には、ＧｅｎＢａｎｋ配列参照番号第ＮＰ＿００１２６５３５５号、第ＡＡＨ２６３０９号、第ＡＢＭ８３０１５号、第ＡＢＭ８６２０８号、第ＡＩＣ５５８９２号が含まれる。用語「ＬＩＬＲＢ４」は、本明細書において、ヒトＬＩＬＲＢ４の任意の型、例えば１）天然非プロセシングＬＩＬＲＢ４分子、「全長」ＬＩＬＲＢ４鎖、あるいはスプライス変異体またはアレル変異体を含む、ＬＩＬＲＢ４の天然存在変異体；２）細胞中のプロセシングから生じる任意の型のＬＩＬＲＢ４；あるいは３）組換え法を通じて生成される、ＬＩＬＲＢ４サブユニットの全長、断片（例えば一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型、細胞外／膜貫通ドメイン）または修飾型（例えば突然変異型、グリコシル化／ＰＥＧ化、Ｈｉｓ－タグ／免疫蛍光融合型）を含むよう意図される。

［００１３２］用語「抗ＬＩＬＲＢ４抗体」は、ＬＩＬＲＢ４（例えばヒトまたはサルＬＩＬＲＢ４）に特異的に結合可能な抗体を指す。
［００１３３］「ＬＩＬＲＢ４関連」疾患または状態は、本明細書において、ＬＩＬＲＢ４の増加したまたは減少した発現または活性によって引き起こされるか、悪化するか、または別の方式でこれと関連する、任意の疾患または状態を指す。いくつかの態様において、ＬＩＬＲＢ４関連状態は、免疫関連障害、例えば癌、自己免疫疾患、炎症性疾患または感染性疾患である。

［００１３４］用語「連結」は、本明細書において、分子内相互作用、例えば共有結合、金属結合、および／またはイオン性結合、あるいは分子間相互作用、例えば水素結合または非共有結合を通じた会合を指す。

［００１３５］用語「機能可能であるように連結された」は、通常の機能を行うように、記載された構成要素が立体配置されている、要素の配置を指す。したがって、ポリペプチドに機能可能であるように連結されている所定のシグナルペプチドは、細胞からのポリペプチドの分泌を導く。プロモーターの場合、コード配列に機能可能であるように連結されているプロモーターは、コード配列の発現を導くであろう。プロモーターまたは他の制御要素は、これらがその発現を導くように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。例えば、介在する翻訳されないがなお転写される配列が、プロモーター配列およびコード配列の間に存在していてもよいし、そしてプロモーター配列はなお、コード配列に「機能可能に連結された」と見なされうる。

［００１３６］「パーセント（％）配列同一性」は、アミノ酸配列（または核酸配列）に関して、配列を整列させ、そして必要な場合、同一アミノ酸（または核酸）の最大数を達成するためにギャップを導入した後、参照配列中のアミノ酸（または核酸）残基に同一である、候補配列中のアミノ酸（または核酸）残基の割合と定義される。アミノ酸残基の保存的置換は、同一残基と見なされてもまたは見なされなくてもよい。パーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性を決定する目的のための整列は、例えば公的に入手可能なツール、例えばＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイト上で入手可能、また、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９９０） ２１５：４０３－４１０； Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９７） ２５：３３８９－３４０２も参照されたい）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト上で入手可能、また、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （１９９６） ２６６：３８３－４０２； Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ら， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （２００７） ２３：２９４７－８も参照されたい）、およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて、達成可能である。当業者は、ツールによって提供されるデフォルトパラメータを用いてもよいし、または例えば適切なアルゴリズムを選択することによって、整列に適しているようにパラメータをカスタマイズしてもよい。

［００１３７］用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」には、一本鎖および二本鎖ヌクレオチドポリマーの両方が含まれる。ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型であってもよい。前記修飾には、塩基修飾、例えばブロモウリジンおよびイノシン誘導体、リボース修飾、例えば２’，３’－ジデオキシリボース、ならびにヌクレオチド間連結修飾、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオネート、ホスホラニラデートおよびホスホロアミデートが含まれる。

［００１３８］用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、ペプチド結合によって互いに連結された、少なくとも２つのアミノ酸のストリングを意味する。ポリペプチドおよびタンパク質には、アミノ酸に加えた部分が含まれてもよく（例えばグリコシル化されていてもよく）、そして／または別の方式でプロセシングされるかまたは修飾されてもよい。一般の当業者は、「ポリペプチド」または「タンパク質」が、細胞によって産生されるような（シグナル配列を含むまたは含まない）完全ポリペプチド鎖であってもよいし、またはその機能性部分であってもよいことを認識するであろう。一般の当業者は、ポリペプチドまたはタンパク質が、ときに、１つより多いポリペプチド鎖を含んでもよく、例えば１つまたはそれより多いジスルフィド結合によって連結されるか、あるいは他の手段によって会合していてもよいことをさらに認識するであろう。該用語にはまた、１つまたはそれより多いアミノ酸が、対応する天然存在アミノ酸およびポリマーの化学的類似体であるアミノ酸ポリマーも含まれる。

［００１３９］用語「薬学的に許容されうる」は、指定されるキャリアー、ビヒクル、希釈剤、賦形剤（単数または複数）、および／または塩が、一般的に化学的および／または物理的に、配合物が含む他の成分と適合し、そして生理的にそのレシピエントと適合することを示す。

［００１４０］本明細書において、用語「被験体」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）を指す。ヒトには、出生前および出生後が含まれる。多くの態様において、被験体はヒトである。被験体は患者であってもよく、患者は、疾患の診断または治療のため、医療提供者を受診するヒトを指す。用語「被験体」は、本明細書において、「個体」または「患者」と交換可能に用いられる。被験体は、疾患または傷害に罹患しうるかまたは感受性であるが、疾患または障害の症状を示していてもまたはいなくてもよい。

［００１４１］用語「療法的有効量」または「有効投薬量」は、本明細書において、疾患または状態を治療するために有効である薬剤の投薬量または濃度を指す。例えば、本明細書に開示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用に関して、療法的有効量は、腫瘍体積を減少させるか、腫瘍のすべてまたは一部を根絶させるか、腫瘍増殖または他の臓器への癌細胞浸潤を阻害するかまたは遅延させるか、癌性状態を仲介する細胞の成長または増殖を阻害するか、腫瘍細胞転移を阻害するかまたは遅延させるか、腫瘍または癌性状態と関連する任意の症状またはマーカーを改善するか、腫瘍または癌性状態の発展を防止するかまたは遅延させるか、あるいはこれらのいくつかの組み合わせを行うことが可能な、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の投薬量または濃度である。

［００１４２］状態を「治療すること」またはその「治療」には、本明細書において、状態を防止するかまたは軽減するか、状態の開始または状態を発展させる速度を遅延させるか、状態を発展させるリスクを減少させるか、状態と関連する症状の発展を防止するかまたは遅延させるか、状態と関連する症状を減少させるかまたは終わらせるか、状態の完全なまたは部分的な退行を生じるか、状態を治癒させるか、あるいはそのいくつかの組み合わせを行うことが含まれる。

［００１４３］用語「ベクター」は、本明細書において、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、そのタンパク質の発現をもたらすように、機能可能であるように挿入されうるビヒクルを指す。ベクターは、宿主細胞内で該ベクターが所持する遺伝要素の発現をもたらすように、宿主細胞に形質転換、形質導入、またはトランスフェクションするために用いられうる。ベクターの例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、バクテリオファージ、例えばラムダファージまたはＭ１３ファージ、および動物ウイルスが含まれる。ベクターとして用いられる動物ウイルスのカテゴリーには、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えばＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、発現を制御するための多様な要素を含有してもよく、これには、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能要素、およびレポーター遺伝子が含まれる。さらに、ベクターは、複製起点を含有してもよい。ベクターにはまた、細胞への進入を補助する物質が含まれてもよく、これには限定されるわけではないが、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質コーティングが含まれる。ベクターは、発現ベクターまたはクローニングベクターであってもよい。本開示は、抗体またはその抗原結合断片をコードする、本明細書に提供される核酸配列、該核酸配列に機能可能であるように連結された少なくとも１つのプロモーター（例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、および少なくとも１つの選択マーカーを含有するベクター（例えば発現ベクター）を提供する。ベクターの例には、限定されるわけではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）、ラムダファージ、およびＭ１３ファージ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．３、ｐＭＤ１８－Ｔ、ｐＯｐｔｉｖｅｃ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ、ｐＱＤ－Ｈｙｇ－ＧＳｅｕ、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ１０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＭＶ－ＳＣＲＩＰＴ．ＲＴＭ．、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ＰＣＲ ２．１、ｐＥＦ－１、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＦ－Ｂｏｓ等が含まれる。

［００１４４］ＩＩ． 抗ＬＩＬＲＢ４抗体および抗原結合断片
［００１４５］本開示は、１つの側面において、ＬＩＬＲＢ４への高い結合アフィニティを有する抗ＬＩＬＲＢ４抗体およびその抗原結合断片を提供する。いくつかの態様において、ＬＩＬＲＢ４に結合した際、こうした抗体は、ＬＩＬＲＢ４の活性化を調節する。特定の態様において、抗体または抗原結合断片は、ＬＩＬＲＢ４に結合した際、ＬＩＬＲＢ４の活性化を抑制する。特定の態様において、抗体または抗原結合断片は、ＬＩＬＲＢ４に結合した際、ＡｐｏＥおよびＬＩＬＲＢ４の間の相互作用に特異的に干渉するか、これをブロッキングするかまたは減少させることも可能である。特定の態様において、本明細書に提供される抗体または抗原結合断片は、ＬＩＬＲＢ４のＡｐｏＥ仲介活性を阻害可能である。特定の態様において、本明細書に提供される抗体または抗原結合断片は、ヒトＬＩＬＲＢ４に特異的にまたは選択的に結合する。

［００１４６］本明細書に提供される抗体または抗原結合断片の結合アフィニティは、Ｋ_D値によって示されてもよく、該値は、抗原および抗原結合分子の間の結合が平衡に達した際の解離速度対会合速度の比（ｋ_off／ｋ_on）を示す。抗原結合アフィニティ（例えばＫ_D）は、例えばバイオレイヤー・インターフェロメトリーを含む、当該技術分野に知られる適切な方法を用いて、適切に決定されうる。

［００１４７］ヒトＬＩＬＲＢ４への抗体の結合はまた、「最大半量有効濃度」（ＥＣ₅₀）値によって示されてもよく、この値は、その最大効果（例えば結合または阻害等）の５０％が観察される、抗体濃度を指す。ＥＣ₅₀値は、当該技術分野に知られる方法、例えばサンドイッチアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーアッセイ、および他の結合アッセイによって測定可能である。

［００１４８］特異的抗ＬＩＬＲＢ４抗体
［００１４９］本開示は、１つの側面において、本明細書に開示される抗ＬＩＬＲＢ４抗体の１つまたはそれより多い（例えば１、２、３、４、５、または６つの）ＣＤＲ配列を含む、抗ＬＩＬＲＢ４抗体およびその抗原結合断片を提供する。ＣＤＲは、抗原結合に関与することが知られているが、６つのＣＤＲすべてが不可欠であるかまたは変更不能であるわけではないことが見出されてきている。言い換えると、本明細書開示の抗ＬＩＬＲＢ４抗体中の１つまたはそれより多いＣＤＲを置換させるかまたは変化させるかまたは修飾して、なお、実質的にＬＩＬＲＢ４への特異的結合アフィニティを保持することが可能である。

［００１５０］特定の態様において、ＬＩＬＲＢ４抗体は、配列番号１の重鎖可変領域配列および配列番号３の軽鎖可変領域配列を有する抗体Ｈ７Ｋ３に由来する。特定の態様において、抗ＬＩＬＲＢ４抗体は、Ｈ７Ｋ３に比較して増進した安定性を有するが、なお、実質的にＬＩＬＲＢ４への特異的結合アフィニティを保持することが可能である。

［００１５１］特定の態様において、ＬＩＬＲＢ４抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（ＨＣ－ＣＤＲ）１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣ ＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣ ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を有する。特定の態様において、ＨＣ－ＣＤＲ３は、アミノ酸残基Ｗでの突然変異を含む、配列番号７のアミノ酸配列を有する。

［００１５２］特定の態様において、ＬＩＬＲＢ４抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域（ＬＣ－ＣＤＲ）１、配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を有する。特定の態様において、軽鎖可変領域は、アミノ酸残基ＮＳで突然変異を含む、配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３を含む。特定の態様において、ＬＣ－ＣＤＲ１は、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４より選択されるアミノ酸配列を有する。

［００１５３］特定の態様において、ＬＩＬＲＢ４抗体は、以下の表１に列挙するようなＣＤＲ配列を有する。
［００１５４］表１． 抗ＬＩＬＲＢ４抗体のＣＤＲ配列

［００１５５］上記抗ＬＩＬＲＢ４抗体の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を以下に提供する。

［００１５６］特定の態様において、本明細書に提供される抗体およびその抗原結合断片は、抗体およびその抗原結合断片がＬＩＬＲＢ４に特異的に結合可能である限り、適切なフレームワーク領域（ＦＲ）配列を含む。表１に提供されるＣＤＲ配列は、組換え技術などの当該技術分野に知られる適切な方法を用いて、とりわけマウス、ヒト、ラット、ウサギなどの任意の適切な種の任意の適切なＦＲ配列に移植されうる。

［００１５７］特定の態様において、本明細書に提供される抗体およびその抗原結合断片はヒト化される。ヒト化抗体または抗原結合断片は、ヒトにおいて免疫原性が減少している点で望ましい。ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲ配列がヒトに移植されるか、または実質的にヒトＦＲ配列であるように、可変領域においてキメラである。抗体または抗原結合断片のヒト化は、ヒト免疫グロブリン遺伝子中の対応するヒトＣＤＲ遺伝子に関して、非ヒト（例えばネズミ）ＣＤＲ遺伝子を置換することによって、本質的に実行されうる（例えば、Ｊｏｎｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ （１９８６） ３２１：５２２－５２５； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， Ｎａｔｕｒｅ （１９８８） ３３２：３２３－３２７； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８８） ２３９：１５３４－１５３６を参照されたい）。

［００１５８］適切なヒト重鎖および軽鎖可変ドメインは、当該技術分野に知られる方法を用いて、この目的を達成するために選択されうる。例示的な例において、「ベストフィット」アプローチを用いてもよく、この場合、非ヒト（例えば齧歯類）抗体可変ドメイン配列を既知のヒト可変ドメイン配列のデータベースに対してスクリーニングするか、またはＢＬＡＳＴ処理し、そして非ヒト・クエリー配列に最も近いヒト配列を同定し、そして非ヒトＣＤＲ配列を移植するためのヒト足場として用いる（例えばＳｉｍｓら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９３） １５１：２２９６； Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｔ． Ｂｉｏｌ． （１９８７） １９６：９０１を参照されたい）。あるいは、すべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワークを、非ヒトＣＤＲの移植のために用いてもよい（例えば、Ｃａｒｔｅｒら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９２） ８９：４２８５； Ｐｒｅｓｔａら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９３） １５１：２６２３を参照されたい）。

［００１５９］特定の態様において、本明細書に提供されるようなヒト化抗体または抗原結合断片は、非ヒトであるＣＤＲ配列を除いて、実質的にすべてヒト配列で構成される。いくつかの態様において、可変領域ＦＲ、および存在するならば定常領域は、全体にまたは実質的に、ヒト免疫グロブリン配列由来である。ヒトＦＲ配列およびヒト定常領域配列は、異なるヒト免疫グロブリン遺伝子に由来してもよく、例えばＦＲ配列は１つのヒト抗体に由来し、そして定常領域は別のヒト抗体に由来してもよい。

［００１６０］特定の態様において、本明細書に提供されるヒト化抗体およびその抗原結合断片は、Ｈ７の重鎖ＦＲ配列および／またはＫ３の軽鎖ＦＲ配列を含む。いくつかの態様において、ヒト由来のＦＲ領域は、それが由来するヒト免疫グロブリンと同じアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ヒトＦＲの１つまたはそれより多いアミノ酸残基は、親非ヒト抗体由来の対応する残基で置換される。これは、特定の態様において、ヒト化抗体またはその断片を、非ヒト親抗体構造に緊密に近づけるために望ましい可能性もある。特定の態様において、本明細書に提供されるヒト化抗体または抗原結合断片は、ヒトＦＲ配列各々において、１０、９、８、７、６、５，４、３、２、または１を超えないアミノ酸残基置換、あるいは重鎖または軽鎖可変ドメインのＦＲすべてにおいて、１０、９、８、７、６、５，４、３、２、または１を超えないアミノ酸残基置換を含む。いくつかの態様において、アミノ酸残基のこうした変化は、重鎖ＦＲ領域にのみ、軽鎖ＦＲ領域にのみ、または両方の鎖に存在してもよい。

［００１６１］特定の態様において、本明細書に提供される抗体およびその抗原結合断片は、配列番号１、１１、１３、１５、および１７からなる群より選択される重鎖可変ドメイン配列を含む。特定の態様において、本明細書に提供される抗体およびその抗原結合断片は、配列番号３、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３からなる群より選択される軽鎖可変ドメインを含む。

［００１６２］いくつかの態様において、本明細書に提供される抗ＬＩＬＲＢ４抗体および抗原結合断片は、重鎖可変ドメインのすべてまたは一部および／または軽鎖可変ドメインのすべてまたは一部を含む。１つの態様において、本明細書に提供される抗ＬＩＬＲＢ４抗体および抗原結合断片は、本明細書に提供される重鎖可変ドメインのすべてまたは一部からなる単一ドメイン抗体である。こうした単一ドメイン抗体のさらなる情報は、当該技術分野で入手可能である（例えば米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい）。

［００１６３］特定の態様において、本明細書に提供される抗ＬＩＬＲＢ４抗体およびその断片は、免疫グロブリン定常領域をさらに含む。いくつかの態様において、免疫グロブリン定常領域は、重鎖および／または軽鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、および／またはＣＨ２－ＣＨ３領域を含む。特定の態様において、重鎖定常領域はＦｃ領域を含む。特定の態様において、軽鎖定常領域はＣκまたはＣλを含む。

［００１６４］本明細書に提供される抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、標識抗体、二価抗体、また抗イディオタイプ抗体であってもよい。組換え抗体は、動物においてではなく、組換え法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製された抗体である。

［００１６５］抗体変異体
［００１６６］本明細書に提供される抗体およびその抗原結合断片はまた、その多様な変異体も含む。特定の態様において、抗体およびその抗原結合断片は、本明細書に提供される例示的な抗体の変異体の多様なタイプを含む。

［００１６７］特定の態様において、抗体変異体は、表１に提供されるような１つまたはそれより多いＣＤＲ配列、本明細書に提供されるような１つまたはそれより多い可変領域配列（しかし、ＣＤＲ配列いずれかではない）、および／または定常領域（例えばＦｃ領域）中に１つまたはそれより多い修飾または置換を含む。こうした変異体は、親抗体のＬＩＬＲＢ４への特異的結合アフィニティを保持するが、修飾（単数または複数）または置換（単数または複数）によって与えられる１つまたはそれより多い望ましい特性を有する。例えば、抗体変異体は、抗原結合アフィニティの改善、グリコシル化パターンの改善、グリコシル化リスクの減少、脱アミド化または脱アミノ化の減少、エフェクター機能（単数または複数）の改善または増加、エフェクター機能（単数または複数）の減少または枯渇、ＦｃＲｎ受容体結合の改善、薬物動態学的半減期の増加、ｐＨ感受性、および／またはコンジュゲート化に対する適合性（例えば１つまたはそれより多い導入されたシステイン残基）を有してもよい。

［００１６８］親抗体配列をスクリーニングして、当該技術分野に知られる方法、例えば「アラニンスキャンニング突然変異誘発」（例えば、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１０８１－１０８５を参照されたい）を用いて、修飾または置換すべき、適切なまたは好ましい残基を同定してもよい。簡潔には、ターゲット残基（例えば、荷電残基、例えばＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕ）を同定し、そして中性または負荷電アミノ酸（例えばアラニンまたはポリアラニン）によって置換してもよく、そして修飾抗体を産生し、そして関心対象の特性に関してスクリーニングする。特定のアミノ酸位置での置換が関心対象の機能的変化を示す場合、その位は、修飾または置換のための潜在的な残基として同定されうる。異なるタイプの残基（例えばシステイン残基、正荷電残基等）で置換することによって、潜在的な残基をさらに評価してもよい。

［００１６９］アフィニティ変異体
［００１７０］アフィニティ変異体は、本明細書に提供される１つまたはそれより多いＣＤＲ配列、１つまたはそれより多いＦＲ配列、あるいは重鎖または軽鎖可変領域における修飾または置換を含有してもよい。アフィニティ変異体は、親抗体のＬＩＬＲＢ４に対する特異的結合アフィニティを保持するか、またはさらに親抗体を超える、改善されたＬＩＬＲＢ４特異的結合アフィニティを有する。

［００１７１］当該技術分野に知られる多様な方法を用いて、この目的を達成してもよい。例えば、抗体変異体（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ変異体）のライブラリーを生成して、そしてファージディスプレイ技術を用いて発現させ、そして次いで、ヒトＬＩＬＲＢ４に対する結合アフィニティに関してスクリーニングしてもよい。別の例に関して、コンピュータソフトウェアを用いて、ヒトＬＩＬＲＢ４に対する抗体の結合をバーチャルにシミュレーションし、そして結合界面を形成する抗体上のアミノ酸残基を同定してもよい。こうした残基は、結合アフィニティの減少を防ぐために置換において回避されても、またはより強い結合を提供するため、置換のためにターゲティングされても、いずれでもよい。

［００１７２］特定の態様において、本明細書に提供されるヒト化抗体または抗原結合断片は、１つまたはそれより多いＣＤＲ配列、および／または１つまたはそれより多いＦＲ配列中に１つまたはそれより多いアミノ酸残基置換を含む。特定の態様において、アフィニティ変異体は、ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列中、全部で、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つを超える置換を含まない。

［００１７３］特定の態様において、抗ＬＩＬＲＢ４抗体およびその抗原結合断片は、表１に列挙されるもの（単数または複数）に対して少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する１つ、２つまたは３つのＣＤＲ配列を含み、そしてその一方、その親抗体と類似の、またはさらにそれより高いレベルのＬＩＬＲＢ４への結合アフィニティを保持する。

［００１７４］特定の態様において、抗ＬＩＬＲＢ４抗体およびその抗原結合断片は、本明細書に提供されるもの（単数または複数）に対して少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する１つまたはそれより多い可変領域を含み、そしてその一方、その親抗体と類似の、またはさらにそれより高いレベルのＬＩＬＲＢ４への結合アフィニティを保持する。いくつかの態様において、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲの外の領域で（例えばＦＲ中で）起こる。

［００１７５］グリコシル化変異体
［００１７６］さらに別の態様において、抗体は、特定のグリコシル化パターンを含む。例えば、無グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体を作製してもよい（すなわち抗体はグリコシル化を欠く）。抗体のグリコシル化パターンを改変して、例えば抗原に対する抗体のアフィニティまたはアビディティを増加させてもよい。こうした修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化部位の１つまたはそれより多くを改変することによって達成されうる。例えば、可変領域フレームワークグリコシル化部位の１つまたはそれより多くの除去を生じ、それによってその部位でのグリコシル化を排除する、１つまたはそれより多いアミノ酸置換を行ってもよい。こうした無グリコシル化は、抗原に対する抗体のアフィニティまたはアビディティを増加させうる。例えば米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号を参照されたい。

［００１７７］グリコシル化パターンが、低フコシル化または無フコシル化グリカンを含む抗体もまた作製してもよく、例えば低フコシル化抗体または無フコシル化抗体は、グリカン上の減少した量のフコシル残基を有する。抗体はまた、増加した量の二分岐ＧｌｃＮａｃ構造を有するグリカンも含んでもよい。こうしたグリコシル化パターン改変は、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが立証されてきている。こうした修飾は、例えば、グリコシル化経路が遺伝子操作されていて、特定のグリコシル化パターンを持つ糖タンパク質を産生する宿主細胞において、抗体を発現することによって達成されうる。これらの細胞は当該技術分野に記載されてきており、そして本発明の組換え抗体を発現する宿主細胞として用いて、それによって改変されたグリコシル化を持つ抗体を産生してもよい。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ）を欠き、このため、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９細胞株中で発現された抗体は、その炭水化物上にフコースを欠く。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、およびＭｓ７０９ ＦＵＴ８－／－細胞株は、２つの置換ベクターを用い、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子のターゲティング破壊によって生成された（米国特許公報第２００４０１１０７０４号を参照されたい）。別の例として、ＥＰ １ １７６ １９５は、フコシルトランスフェラーゼをコードする、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を持つ細胞株を記載し、このため、こうした細胞株で発現された抗体は、α－１，６結合関連酵素を減少させるかまたは排除することによって、低フコシル化を示す。ＥＰ １ １７６ １９５はまた、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－アセチルグルコサミンにフコースを添加するための酵素活性が低いか、またはこうした酵素活性を持たない細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）も記載する。ＰＣＴ公報ＷＯ２００３／０３５８３５は、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に付着させる能力が減少し、やはりその宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化を生じる、変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞を記載する。修飾グリコシル化プロファイルを持つ抗体はまた、ＰＣＴ公報ＷＯ ０６／０８９２３１に記載されるように、鶏卵でも産生されうる。あるいは、修飾グリコシル化プロファイルを持つ抗体は、植物細胞、例えばアオウキクサ属（Ｌｅｍｎａ）（米国特許第７，６３２，９８３号）で産生されてもよい。植物系において抗体を産生するための方法は、米国特許第６，９９８，２６７号および第７，３８８，０８１号に開示される。ＰＣＴ公報ＷＯ１９９９／０５４３４２は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するよう操作された細胞株を記載し、操作された細胞株で発現される抗体は二分岐ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示し、抗体のＡＤＣＣ活性増加を生じる。低フコシル化はまた、フコシル化が抗体上で最小限である場合、無フコシル化とも称される。

［００１７８］あるいは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断されてもよく；例えばフコシダーゼ、α－Ｌ－フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する。本明細書に開示される抗体には、より低次の真核宿主細胞で産生されるものがさらに含まれ、特に真菌宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は、哺乳動物またはヒト様グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するために、遺伝子操作されてきている。現在使用されている哺乳動物細胞株に勝る、これらの遺伝子修飾された宿主細胞の特定の利点は、特定のＮ－グリカン構造が優位を占める糖タンパク組成を産生可能であるように、細胞中で産生される糖タンパク質のグリコシル化プロファイルを調節する能力である（例えば米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８号を参照されたい）。これらの遺伝子修飾された宿主細胞は、主に特定のＮ－グリカン構造を有する抗体を産生するために用いられてきている。

［００１７９］さらに、真菌、例えば酵母または糸状菌は、フコシル化糖タンパク質を産生する能力を欠くため、こうした細胞中で産生される抗体は、細胞がフコシル化糖タンパク質を産生するための酵素経路を含むようにさらに修飾されていない限り、フコースを欠くであろう（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２００８１１２０９２を参照されたい）。特定の態様において、本明細書に開示される抗体には、より低次の真核宿主細胞で産生され、そして二分岐および多数アンテナ（ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）種を含む、限定されるわけではないが、ＧｌｃＮＡｃ（１－４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ（１－４）ＧｌｃＮＡｃ（１－４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡ（１－４）Ｇａｌ（１－４）ＧｌｃＮＡｃ（１－４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２などのＮ－グリカンを含む、フコシル化および非フコシル化ハイブリッドおよび複合体Ｎ－グリカンを含むものがさらに含まれる。特定の態様において、本明細書に提供される抗体組成物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される少なくとも１つのハイブリッドＮ－グリカンを有する抗体を含んでもよい。特定の側面において、ハイブリッドＮ－グリカンは、組成物中の主なＮ－グリカン種である。さらなる側面において、ハイブリッドＮ－グリカンは、組成物中のハイブリッドＮ－グリカンの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％を構成する、特定のＮ－グリカン種である。

［００１８０］特定の態様において、本明細書に提供される抗体組成物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２； ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２； ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２； ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２； ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２； Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２； ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される少なくとも１つの複合体Ｎ－グリカンを有する抗体を含む。特定の側面において、複合体Ｎ－グリカンは、組成物中の主なＮ－グリカン種である。さらなる側面において、複合体Ｎ－グリカンは、組成物中の複合体Ｎ－グリカンの約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％を構成する、特定のＮ－グリカン種である。特定の態様において、Ｎ－グリカンはフコシル化されている。一般的に、フコースは、Ｎ－グリカンの還元端のＧｌｃＮａｃとα１，３－連結にあるか、Ｎ－グリカンの還元端のＧｌｃＮａｃとα１，６－連結にあるか、Ｎ－グリカンの非還元端のＧａｌとα１，２－連結にあるか、Ｎ－グリカンの非還元端のＧｌｃＮａｃとα１，３－連結にあるか、またはＮ－グリカンの非還元端のＧｌｃＮＡｃとα１，４－連結にある。

［００１８１］したがって、上記糖タンパク質組成物の特定の側面において、グリコフォームは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）からなる群より選択されるグリコフォームを産生するα１，３－連結またはα１，６－連結フコースにあるか；ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１－２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１－２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１－２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１－２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１－２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択されるグリコフォームを産生するα１，３－連結またはα１，４－連結フコースにあるか；あるいはＧａｌ（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１－２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２（Ｆｕｃ１－２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１－２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択されるグリコフォームを産生するα１，２－連結フコースにある。

［００１８２］さらなる側面において、抗体は、限定されるわけではないが、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ－グリカン構造からなるＮ－グリカンを含む、高マンノースＮ－グリカンを含む。上記のさらなる側面において、複合体Ｎ－グリカンには、フコシル化および非フコシル化（または無フコシル化）二分岐および多数アンテナ種がさらに含まれる。本明細書において、用語「Ｎ－グリカン」および「グリコフォーム」は、交換可能に用いられ、そしてＮ－連結オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基へのアスパラギン－Ｎ－アセチルグルコサミン連結によって付着されるものを指す。Ｎ－連結糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に連結されたＮ－アセチルグルコサミン残基を含有する。

［００１８３］本明細書に提供される抗ＬＩＬＲＢ４抗体および抗原結合断片はまた、抗体または抗原結合断片のグリコシル化の度合いを増加させるかまたは減少させるかいずれかのために得られうる、グリコシル化変異体も含む。

［００１８４］抗体またはその抗原結合断片は、炭水化物部分（例えばオリゴ糖構造）が付着されうる側鎖を持つ１つまたはそれより多いアミノ酸残基を含んでもよい。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ－連結またはＯ－連結のいずれかである。Ｎ－連結は、アスパラギン残基、例えばアスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－スレオニンなどの３ペプチド配列であって、Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である、前記３ペプチド配列中のアスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の付着を指す。Ｏ－連結グリコシル化は、糖、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンに対する付着を指す。天然グリコシル化部位の除去は、好適には、例えば、配列中に存在する上記の３ペプチド配列（Ｎ－連結グリコシル化部位に関して）あるいはセリンまたはスレオニン残基（Ｏ－連結グリコシル化部位に関して）の１つが置換されるように、アミノ酸配列を改変することによって達成されうる。新規グリコシル化部位は、こうした３ペプチド配列あるいはセリンまたはスレオニン残基を導入することによって、同様の方式で生成されうる。

［００１８５］１つのタイプのグリコシル化修飾は、フコシル化を含む部位特異的グリコシル化に関与する特定の酵素経路が不全である抗体産生細胞を用いて行われる。例えば、フコシル化を欠く抗体（無フコシル化抗体と称される）は、一般的に増進されたＡＤＣＣ活性を有する。無フコシル化Ｈ７Ｋ３ｍ５を用いると、ＡＤＣＣを通じた正常単球の殺細胞は、試験されたＰＢＭＣドナーの２５～５０％で観察された（図１４Ａ～１４Ｄ、および図１５Ｃ～１５Ｄ）。さらに、図１５Ａ～１５Ｂに示されるように、無フコシル化および野生型Ｈ７Ｋ３ｍ５はどちらも、自己ＡＤＣＣを通じたｐＤＣの殺細胞を生じた。その一方で、単球は、ドナーに応じて、無フコシル化Ｈ７Ｋ３ｍ５でのみ殺され、そして野生型Ｈ７Ｋ３ｍ５では殺されない可能性もある（図１５Ｃ～１５Ｄ）。

［００１８６］システイン操作変異体
［００１８７］本明細書に提供される抗ＬＩＬＲＢ４抗体および抗原結合断片はまた、１つまたはそれより多い導入された未結合（ｆｒｅｅ）システインアミノ酸残基を含む、システイン操作変異体も含む。

［００１８８］未結合システイン残基は、ジスルフィド架橋の一部ではないものである。システイン操作変異体は、例えば、とりわけ、細胞傷害性および／または画像化化合物、標識、または放射性同位体の、例えばマレイミドまたはハロアセチルを通じた、操作システイン部位でのコンジュゲート化に有用である。未結合システイン残基を導入するために抗体または抗原結合断片を操作するための方法は当該技術分野に知られ、例えばＷＯ２００６／０３４４８８を参照されたい。

［００１８９］Ｆｃ変異体
［００１９０］本明細書に開示される抗体はまた、典型的には抗体の１つまたはそれより多い機能特性、例えば血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／またはエフェクター機能（例えば抗原依存性細胞性細胞傷害）を改変するため、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作されてもよい。さらに、本明細書に開示される抗体は、やはり抗体の１つまたはそれより多い機能特性を改変するために化学的に修飾されてもよい（例えば、１つまたはそれより多い化学部分を抗体に付着させてもよい）し、またはそのグリコシル化を改変するために修飾されてもよい。これらの態様は各々、さらに詳細に以下に記載される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。本明細書に開示される抗体にはまた、改変されたエフェクター機能を提供するため、修飾（またはブロッキング）されたＦｃ領域を含む抗体も含まれる。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号； ＷＯ２００３／０８６３１０； ＵＳ２００４／０００２５８７； ＵＳ２００５／０１５２８９４； ＵＳ２００５／０２４９７２３； ＷＯ２００６／０１９４４７を参照されたい。こうした修飾を用いて、診断および療法において、ありうる有益な効果を伴い、免疫系の多様な反応を増進させるかまたは抑制してもよい。Ｆｃ領域の改変には、アミノ酸変化（置換、欠失および挿入）、グリコシル化または脱グリコシル化、および多数のＦｃの付加が含まれる。Ｆｃへの変化はまた、療法抗体中の抗体の半減期を改変して、より頻繁でない投薬を可能にし、そしてこうして利便性を増加させ、そして物質の使用を減少させることも可能である。この突然変異は、ヒンジ領域中の重鎖間ジスルフィド架橋の不均一性を消失させると報告されてきている。

［００１９１］１つの態様において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が増加するかまたは減少するように修飾される。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載される。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合を促進するため、あるいは抗体の安定性を増加させるかまたは減少させるために改変される。別の態様において、抗体は、生物学的半減期を増加させるために修飾される。多様なアプローチが可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号に記載されるように、１つまたはそれより多い、以下の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆを導入してもよい。あるいは、生物学的半減期を増加させるため、米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採用されたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で改変してもよい。さらに他の態様において、抗体のエフェクター機能（単数または複数）を改変するため、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによって、Ｆｃ領域を改変する。抗体が、エフェクターリガンドに対して改変されたアフィニティを有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２より選択される１つまたはそれより多いアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置換してもよい。それに対するアフィニティが改変されるエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１成分であってもよい。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載される。

［００１９２］別の例において、アミノ酸２３１位および２３９位内の１つまたはそれより多いアミノ酸残基を改変して、それによって抗体が補体に結合する能力を改変する。このアプローチは、ＰＣＴ公報ＷＯ１９９４／０２９３５１にさらに記載される。さらに別の例において、以下の位：２３８、２３９、２４３、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９の１つまたはそれより多いアミノ酸を修飾することによって、Ｆｃ領域を修飾して、抗体が抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を仲介する能力を増加させるかまたは減少させ、および／またはＦｃγ受容体に対する抗体のアフィニティを増加させるかまたは減少させる。このアプローチは、ＰＣＴ公報ＷＯ２０００／０４２０７２にさらに記載される。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに関するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされ、そして結合が改善された変異体が記載されてきている。２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９位での特定の突然変異は、ＦｃγＲＩＩＩへの結合を改善することが示された。さらに、以下の組み合わせの突然変異が、ＦｃγＲＩＩＩ結合を改善することが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ。

［００１９３］１つの態様において、残基２４３および２６４を修飾することによって、抗体がエフェクター機能を仲介する能力を減少させ、そして／または抗炎症特性を増加させるように、Ｆｃ領域を修飾する。１つの態様において、抗体のＦｃ領域は、２４３位および２６４位の残基をアラニンに変化させることによって、抗体のＦｃ領域を修飾する。１つの態様において、残基２４３、２６４、２６７および３２８を修飾することによって、抗体がエフェクター機能を仲介する能力を減少させ、そして／または抗炎症特性を増加させるためにＦｃ領域を修飾する。

［００１９４］１つの態様において、残基２３４、２３５および３２９をアラニンまたはグリシンに修飾する（Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ－Ｐ３２９Ｇ）ことによって、抗体がエフェクター機能を仲介する能力を消失させるためにＦｃ領域を修飾する。

［００１９５］本明細書に提供される抗ＬＩＬＲＢ４抗体および抗原結合断片はまた、Ｆｃ領域および／またはヒンジ領域で１つまたはそれより多いアミノ酸残基修飾または置換を含む、Ｆｃ変異体も含む。

［００１９６］特定の態様において、抗ＬＩＬＲＢ４抗体および抗原結合断片は、新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのｐＨ依存性結合を改善する、１つまたはそれより多いアミノ酸置換（単数または複数）を含む。こうした変異体は、酸性ｐＨでＦｃＲｎに結合し、これによりリソソーム中の分解を逃れることが可能になり、そして次いで、転位置されて、そして細胞の外に放出されることが可能になるため、延長された薬物動態学的半減期を有しうる。ＦｃＲｎとの結合アフィニティを改善するため、抗体およびその抗原結合断片を操作する方法は、当該技術分野に周知であり、例えば、Ｖａｕｇｈｎ， Ｄ．ら， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ６（１）： ６３－７３， １９９８； Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ， Ｒ．ら， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌｕｍｅ １， Ｃｈａｐｔｅｒ ２７： Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＫ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ２０１０； Ｙｅｕｎｇ， Ｙ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２０１０） ７０： ３２６９－３２７７；およびＨｉｎｔｏｎ， Ｐ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２００６） １７６：３４６－３５６を参照されたい。

［００１９７］特定の態様において、抗ＬＩＬＲＢ４抗体または抗原結合断片は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を改変する１つまたはそれより多いアミノ酸置換を含む。Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインの特定のアミノ酸残基を置換して、増進されたＡＤＣＣ活性を提供してもよい。あるいは、またはさらに、抗体上の炭水化物構造を変化させて、ＡＤＣＣ活性を増進させてもよい。抗体操作によってＡＤＣＣ活性を改変する方法は、当該技術分野に記載されてきており、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． （２００１） ２７６（９）： ６５９１－６０４； Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ら， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０００） １６４（８）：４１７８－８４； Ｓｔｅｕｒｅｒ Ｗ．ら， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９５） １５５（３）： １１６５－ ７４； Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ら， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００１） １６６（４）： ２５７１－５； Ｌａｚａｒ ＧＡ．ら， ＰＮＡＳ （２００６） １０３（１１）： ４００５－４０１０； Ｒｙａｎ ＭＣ．ら， Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． （２００７） ６： ３００９－３０１８； Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＯ．ら， Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． （２００８） ７（８）： ２５１７－２７； Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ． Ｌ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２００２， ２７７： ２６７３３－２６７４０； Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ （２００３） ２７８： ３４６６－３４７３を参照されたい。

［００１９８］特定の態様において、抗ＬＩＬＲＢ４抗体または抗原結合断片は、例えばＣ１ｑ結合および／またはＣＤＣを改善するかまたは減少させることによって、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変する１つまたはそれより多いアミノ酸置換を含む（例えば、ＷＯ９９／５１６４２； Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０ （１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＦc領域変異体の他の例に関しては、ＷＯ１９９４／０２９３５１を参照されたい）。

［００１９９］特定の態様において、抗ＬＩＬＲＢ４抗体または抗原結合断片は、ヘテロ二量体化を容易にするおよび／または促進するため、Ｆｃ領域の界面に１つまたはそれより多いアミノ酸置換を含む。これらの修飾は、第一のＦｃポリペプチド内への結節および第二のポリペプチド内への空洞の導入を含み、ここで、第一および第二のＦｃポリペプチドの相互作用を促進して、ヘテロ二量体または複合体を形成するように、結節が空洞内に配置されうる。これらの修飾を含む抗体を生成する方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号に記載されるように、当該技術分野に知られる。

［００２００］抗原結合断片
［００２０１］抗ＬＩＬＲＢ４抗原結合断片もまた、本明細書に提供される。多様なタイプの抗原結合断片が当該技術分野に知られ、そして例えば、そのＣＤＲおよび可変配列が本明細書に提供される例示的な抗体、およびその異なる変異体（例えばアフィニティ変異体、グリコシル化変異体、Ｆｃ変異体、システイン操作変異体など）を含む、本明細書に提供される抗ＬＩＬＲＢ４抗体に基づいて、開発されてもよい。

［００２０２］特定の態様において、本明細書に提供される抗ＬＩＬＲＢ４抗原結合断片は、ラクダ化単一ドメイン抗体、ディアボディ、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）₂、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、二重特異性抗体、ｄｓディアボディ、ナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、または二価ドメイン抗体である。

［００２０３］一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、短い（通常、セリン、グリシン）リンカーで共に連結された、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合体である。このキメラ分子は、定常領域の除去およびリンカーペプチドの導入にも関わらず、元来の免疫グロブリンの特異性を保持する。この修飾は、通常、特異性が改変されないままにする。これらの分子は、歴史的には、単一ペプチドとして抗原結合ドメインを発現するために非常に好適であるファージディスプレイを容易にするために生成された。あるいは、ハイブリドーマ由来のサブクローニングされた重鎖および軽鎖からｓｃＦｖを直接生成してもよい。一本鎖可変断片は、完全抗体分子に見られる定常Ｆｃ領域を欠き、そしてしたがって、抗体を精製するために用いられる、共通の結合部位（例えばプロテインＡ／Ｇ）を欠く。プロテインＬがカッパ軽鎖の可変領域と相互作用するため、これらの断片はしばしば、プロテインＬを用いて精製／固定されうる。

［００２０４］柔軟なリンカーは、一般的に、アラニン、セリンおよびグリシンなどのらせんおよび回転促進アミノ酸残基で構成される。しかし、他の残基もまた機能しうる。Ｔａｎｇら（１９９６）は、タンパク質リンカーライブラリーから一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のための仕立てられた（ｔａｉｌｏｒｅｄ）リンカーを迅速に選択する手段として、ファージディスプレイを用いた。重鎖および軽鎖可変ドメインの遺伝子が、可変組成物の１８アミノ酸ポリペプチドをコードするセグメントによって連結されるランダムリンカーライブラリーを構築した。ｓｃＦｖレパートリー（およそ５ｘ１０⁶の異なるメンバー）が繊維状ファージ上にディスプレイされ、そしてハプテンとのアフィニティ選択に供された。選択された変異体集団は、結合活性の有意な増加を示したが、かなりの配列多様性を保持した。続いて、１０５４の個々の変異体をスクリーニングして、可溶性型で効率的に産生される、触媒的に活性であるｓｃＦｖを得た。配列分析によって、選択されるテザーの共通の特徴として、ＶＨ Ｃ末端の２残基後のリンカー中のプロリンが保存され、そして他の位でアルギニンおよびプロリンが豊富であることのみが明らかになった。

［００２０５］本開示の組換え抗体はまた、受容体の二量体化または多量体化を可能にする配列または部分を含んでもよい。こうした配列には、Ｊ鎖と併せて多量体の形成を可能にする、ＩｇＡ由来のものが含まれる。別の多量体化ドメインは、Ｇａｌ４二量体化ドメインである。他の態様において、２つの抗体の組み合わせを可能にする剤、例えばビオチン／アビジンで鎖を修飾してもよい。

［００２０６］別個の態様において、非ペプチドリンカーまたは化学ユニットを用いて、受容体軽鎖および重鎖を連結することによって、一本鎖抗体を生成してもよい。一般的に、軽鎖および重鎖は、別個の細胞において産生され、精製され、そして続いて適切な様式で共に連結される（すなわち重鎖のＮ末端が、適切な化学架橋を通じて、軽鎖のＣ末端に付着される）であろう。

［００２０７］架橋試薬を用いて、２つの異なる分子、例えば安定化剤および凝血剤の官能基を結ぶ分子架橋を形成する。しかし、同じ類似体の二量体または多量体、あるいは異なる類似体で構成されるヘテロマー複合体が生成されてもよいことが意図される。２つの異なる化合物を段階的な方式で連結するため、望ましくないホモポリマー形成を排除する、ヘテロ二官能性架橋剤を用いてもよい。

［００２０８］例示的なヘテロ二官能性架橋剤は、２つの反応基：一級アミン基（例えばＮヒドロキシスクシンイミド）と反応する一方の反応基、およびチオール基（例えばピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲン等）と反応するもう一方の反応基を含有する。一級アミン反応基を通じて、架橋剤は、一方のタンパク質（例えば選択される抗体または断片）と反応し、そしてチオール反応基を通じ、すでに第一のタンパク質に結び付けられた架橋剤は、もう一方のタンパク質（例えば選択剤）のシステイン残基（未結合スルフィドリル基）と反応する。

［００２０９］血液中で妥当な安定性を有する架橋剤が使用されることが好ましい。ターゲティング剤および療法剤／予防剤をコンジュゲート化するために成功裡に使用されうるジスルフィド結合含有リンカーの多くのタイプが知られる。立体障害型ジスルフィド結合を含有するリンカーは、ｉｎ ｖｉｖｏでより大きい安定性を生じ、ターゲティングペプチドが作用部位に到達する前に放出されることを防止することが証明されうる。これらのリンカーは、したがって、連結剤の１つの群である。

［００２１０］別の架橋試薬はＳＭＰＴであり、これは、隣接するベンゼン環およびメチル基によって「立体障害型」ジスルフィド結合を含有する二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織および血液中に存在しうるグルタチオンなどのチオーラートアニオンによる攻撃から結合を保護する機能を提供し、そしてそれによって、付着した剤がターゲット部位に送達される前のコンジュゲートの脱共役の防止を補助する。

［００２１１］ＳＭＰＴ架橋試薬は、多くの他の既知の架橋試薬同様、システインのＳＨまたは一級アミン（例えばリジンのイプシロンアミノ基）などの官能基を架橋する能力を与える。別のありうるタイプの架橋剤には、切断可能なジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性光反応性フェニルアジド、例えばスルホスクシンイミジル－２－（ｐ－アジドサリチルアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネートが含まれる。Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル基は、一級アミノ基と反応し、そしてフェニルアジドは（光分解に際して）非選択的に任意のアミノ酸残基と反応する。

［００２１２］障害型架橋剤に加えて、非障害型リンカーもまた、本明細書にしたがって使用されてもよい。保護ジスルフィドを含有するかまたは生成するとは見なされない他の有用な架橋剤には、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰおよび２－イミノチオレーンが含まれる（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ ＆ Ｔｈｏｒｐｅ、１９８７）。こうした架橋剤の使用は、当該技術分野によく理解される。別の態様は、柔軟なリンカーの使用を伴う。

［００２１３］米国特許第４，６８０，３３８号は、特に、キレート剤、薬剤、酵素、検出可能標識等を含む抗体コンジュゲートを形成するため、アミン含有ポリマーおよび／またはタンパク質とリガンドのコンジュゲートを産生するために有用な二官能性リンカーを記載する。米国特許第５，１４１，６４８号および第５，５６３，２５０号は、多様な穏やかな条件下で切断可能である、不安定性結合を含有する、切断可能コンジュゲートを開示する。このリンカーは、関心対象の剤を、リンカーに直接結合させることが可能であり、切断すると活性剤の放出を生じる場合に特に有用である。特定の使用には、タンパク質、例えば抗体または薬剤への、未結合アミノまたは未結合スルフィドリル基の付加が含まれる。

［００２１４］米国特許第５，８５６，４５６号は、融合タンパク質、例えば一本鎖抗体を作製するため、ポリペプチド構成要素を連結する際に使用するためのペプチドリンカーを提供する。リンカーは、長さ最大約５０アミノ酸であり、荷電アミノ酸（好ましくはアルギニンまたはリジン）の少なくとも１つの存在、その後、プロリンを含み、そしてより大きい安定性および減少した凝集によって特徴付けられる。米国特許第５，８８０，２７０号は、多様な免疫診断および分離技術において有用な、アミノオキシ含有リンカーを開示する。

［００２１５］こうした抗原結合断片の産生には、多様な技術を用いてもよい。例示的な方法には、損なわれていない抗体の酵素消化（例えばＭｏｒｉｍｏｔｏら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ （１９９２） ２４：１０７－１１７；およびＢｒｅｎｎａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８５） ２２９：８１を参照されたい）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）等の宿主細胞による組換え発現（例えばＦａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片）、上に論じられるようなファージディスプレイライブラリーからのスクリーニング（例えばＳｃＦｖに関する）、およびＦ（ａｂ’）₂断片を形成する、２つのＦａｂ’－ＳＨ断片の化学カップリング（Ｃａｒｔｅｒら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９２） １０：１６３－１６７）が含まれる。抗体断片を産生するための他の技術は、当業者には明らかであろう。

［００２１６］特定の態様において、抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。ｓｃＦｖの生成は、例えば、ＷＯ ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および第５，５８７，４５８号に記載される。ｓｃＦｖを、アミノまたはカルボキシル末端のいずれかでエフェクタータンパク質に融合させて、融合タンパク質を提供してもよい（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ監修を参照されたい）。

［００２１７］二重特異性抗体
［００２１８］特定の態様において、本明細書開示のＬＩＬＲＢ４抗体は、二重特異性抗体である。特定の態様において、ＬＩＬＲＢ４二重特異性抗体は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞上の抗原および癌細胞上のＬＩＬＲＢ４の両方と結合することによって、細胞傷害性Ｔ細胞またはＮＫ細胞を癌細胞に向けなおすことを通じて、血液学的および固形悪性腫瘍を治療するために用いられうる。いくつかの態様において、抗ＬＩＬＲＢ４二重特異性抗体は、Ｔ細胞受容体、例えばＣＤ３に対する。いくつかの態様において、抗ＬＩＬＲＢ４二重特異性抗体は、ＮＫ細胞受容体、例えばＣＤ１６Ａに対する。

［００２１９］本開示の抗ＬＩＬＲＢ４二重特異性抗体は、多様な型および構造を有してもよく、これは、図２８Ａおよび２８Ｂに例示されるようなＬＩＬＲＢ４およびＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体（ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性）の例示的態様によって理解されうる。

［００２２０］図２８Ａに例示されるように、本発明の例示的な態様において、ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｙの形状であり、そして２つのアームを含む。第一の重鎖ポリペプチドおよび第一の軽鎖ポリペプチドの部分によって形成される抗体の一方のアームは、重鎖可変ドメイン（Ｖ_H１）および軽鎖可変ドメイン（Ｖ_L１）の対を含み、これがＬＩＬＲＢ４に特異的に結合可能な抗原結合部位を形成する。第二の重鎖ポリペプチドおよび第二の軽鎖ポリペプチドの部分によって形成される抗体のもう一方のアームは、第二の対の重鎖可変ドメイン（Ｖ_H２）および軽鎖可変ドメイン（Ｖ_L２）を含む。Ｖ_H２およびＶ_L２は、ＣＤ３に特異的に結合可能な第二の抗原結合部位を形成する。この立体配置において、各二重特異性抗体は、ＬＩＬＲＢ４に対する抗原結合部位の単一コピーおよびＣＤ３に対する抗原結合部位の単一コピーを含み、これは１＋１と称される。

［００２２１］図２８Ａ中の態様４－３ａｂを参照すると、第一の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_H１－Ｃ_H１－Ｃ_H２－Ｃ_H３を含み、式中、Ｃ_H１、Ｃ_H２、およびＣ_H３は、重鎖定常ドメイン１、２および３を指し；第一の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L１－Ｃ_Lを含み、式中、Ｃ_Lは軽鎖定常ドメインを指し；第二の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_H２－ＴＣＲβ－Ｃ_H２－Ｃ_H３を含み；そして第二の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L２－ＴＣＲαを含む。二重特異性抗体中で、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ定常ドメインを使用すると、軽鎖およびその同族重鎖の正しい会合が可能になり、ＬＩＬＲＢ４およびＣＤ３に対する望ましい二重特異性抗体がより高収量で生じる（例えば、ＷＯ２０１９０５７１２２Ａ１を参照されたい）。特定の態様において、ＴＣＲαドメインは配列番号８９のアミノ酸配列を有し、ＴＣＲβドメインは配列番号９０のアミノ酸配列を有する。

［００２２２］あるいは、図２８Ａ中の４ａｂ－３態様に例示されるように、第一の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_H１－ＴＣＲβ－Ｃ_H２－Ｃ_H３を含み；第一の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L１－ＴＣＲαを含み；第二の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_H２－Ｃ_H１－Ｃ_H２－Ｃ_H３を含み；そして第二の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L２－Ｃ_Lを含む。

［００２２３］図２８Ａに例示されるように、Ｙ形状抗体のステムは、ジスルフィド結合を通じて共に結合した、第一および第二の重鎖ポリペプチドの第二および第三の定常ドメイン（Ｃ_H２およびＣ_H３）からなるＦｃ領域を含む。特定の態様において、Ｆｃ領域は、ノブズ・イン・ホールズ（ｋｎｏｂｓ ｉｎ ｈｏｌｅｓ）（ＫｉＨ）技術で操作され（Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ （１９９６） ９：６１７－２１； Ａｔｗｅｌｌ Ｓら， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （１９９７） ２７０：２６－３５； Ｍｅｒｃｈａｎｔら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ （１９９８） １６， ６７７－６８１）、これは、重鎖ポリペプチドのホモ二量体化を防止する。簡単にいうと、２つの重鎖ポリペプチドの定常領域は各々、ノブかホールのいずれかを生成するように突然変異され、これが対形成してヘテロ二量体化を促進する。ＫｉＨ技術を用いたＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体の設計は、重鎖のヘテロ二量体化、ならびに軽鎖およびその同族重鎖の正しい会合を可能にし、ＬＩＬＲＢ４およびＣＤ３に対する望ましい二重特異性抗体のより高い収量を生じる。

［００２２４］特定の態様において、二重特異性抗体の立体配置は、ＬＩＬＲＢ４に対する抗原結合部位の２つのコピー、およびＣＤ３に対する抗原結合部位の１つのコピーを含む。この立体配置は２＋１と称され、そして図２８Ａに例示される。こうした立体配置において、ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体は、２つの対の重鎖／軽鎖ポリペプチドを含み、これがそれぞれ、ＬＩＬＲＢ４およびＣＤ３に結合する、第一の抗原結合領域および第二の抗原結合領域を形成する。１＋１立体配置とは異なり、２＋１立体配置では、１つの重鎖ポリペプチドが、第三の軽鎖ポリペプチド中の第三の軽鎖可変ドメインに対する第三の重鎖可変ドメイン（Ｖ_H３）同族体を含み、ＬＩＬＲＢ４に結合する第三の抗原結合領域を形成する。

［００２２５］図２８Ａ中の態様４４－３ａｂを参照すると、本発明の例示的な態様において、Ｙの形状で、そして２つのアームを含む、ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体は、第一の重鎖ポリペプチド、第一の軽鎖ポリペプチド、第二の重鎖ポリペプチド、第二の軽鎖ポリペプチドおよび第三の軽鎖ポリペプチドを含む。第一の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_H３－Ｃ_H１－Ｌ－Ｖ_H１－Ｃ_H１－Ｃ_H２－Ｃ_H３を含み、式中、Ｌはリンカー（例えば（Ｇ₄Ｓ）₂）であり；第一の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L１－Ｃ_Lを含み；第二の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_H２－ＴＣＲβ－Ｃ_H２－Ｃ_H３を含み；そして第二の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L２－ＴＣＲαを含み；第三の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L３－Ｃ_Lを含む。抗体の一方のアーム上で、Ｖ_H１およびＶ_L１は、ＬＩＬＲＢ４に対する第一の抗原結合部位を形成する一方、Ｖ_H３およびＶ_L３は、ＬＩＬＲＢ４に対する第二の抗原結合部位を形成する。抗体のもう一方のアーム上で、Ｖ_H２およびＶ_L２は、ＣＤ３に特異的に結合可能な抗原結合部位を形成する。特定の態様において、第三の軽鎖ポリペプチドＶ_L３－Ｃ_Lは、第一の軽鎖ポリペプチドＶ_L１－Ｃ_Lと同一であってもよい。

［００２２６］図２８Ａ中の態様４ａｂ４ａｂ－３を参照すると、本発明の例示的な態様において、ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体は、第一の重鎖ポリペプチド、第一の軽鎖ポリペプチド、第二の重鎖ポリペプチド、第二の軽鎖ポリペプチドおよび第三の軽鎖ポリペプチドを含む。第一の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_H３－ＴＣＲβ－Ｌ－Ｖ_H１－ＴＣＲβ－Ｃ_H２－Ｃ_H３を含み、式中、Ｌはリンカー（例えば（Ｇ₄Ｓ）₂）であり；第一の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L１－ＴＣＲαを含み；第二の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_H２－Ｃ_H１－Ｃ_H２－Ｃ_H３を含み；そして第二の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L２－Ｃ_Lを含み；第三の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L３－ＴＣＲαを含む。抗体の一方のアーム上で、Ｖ_H１およびＶ_L１はＬＩＬＲＢ４に対する第一の抗原結合部位を形成する一方、Ｖ_H３およびＶ_L３はＬＩＬＲＢ４に対する第二の抗原結合部位を形成する。抗体のもう一方のアーム上で、Ｖ_H２およびＶ_L２は、ＣＤ３に特異的に結合可能な抗原結合部位を形成する。特定の態様において、第三の軽鎖ポリペプチドＶ_L３－ＴＣＲαは、第一の軽鎖ポリペプチドＶ_L１－ＴＣＲαと同一であってもよい。

［００２２７］図２８中の態様４３ａｂ－４を参照すると、本発明の例示的な態様において、ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体は、第一の重鎖ポリペプチド、第一の軽鎖ポリペプチド、第二の重鎖ポリペプチド、第二の軽鎖ポリペプチドおよび第三の軽鎖ポリペプチドを含む。第一の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_H３－Ｃ_H１－Ｌ－Ｖ_H２－ＴＣＲβ－Ｃ_H２－Ｃ_H３を含み、式中、Ｌはリンカー（例えば（Ｇ₄Ｓ）₂）であり；第一の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L２－ＴＣＲαを含み；第二の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_H１－Ｃ_H１－Ｃ_H２－Ｃ_H３を含み；そして第二の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L１－Ｃ_Lを含み；第三の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L３－Ｃ_Lを含む。抗体の一方のアーム上で、Ｖ_H１およびＶ_L１は、ＬＩＬＲＢ４に対する第一の抗原結合部位を形成する。抗体のもう一方のアーム上で、Ｖ_H３およびＶ_L３は、ＬＩＬＲＢ４に対する第二の抗原結合部位を形成する一方、Ｖ_H２およびＶ_L２は、ＣＤ３に特異的に結合可能な抗原結合部位を形成する。特定の態様において、第三の軽鎖ポリペプチドＶ_L３－Ｃ_Lは、第一の軽鎖ポリペプチドＶ_L１－Ｃ_Lと同一であってもよい。

［００２２８］図２８Ａ中の態様４ａｂ３－４ａｂを参照すると、本発明の例示的な態様において、ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体は、第一の重鎖ポリペプチド、第一の軽鎖ポリペプチド、第二の重鎖ポリペプチド、第二の軽鎖ポリペプチドおよび第三の軽鎖ポリペプチドを含む。第一の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_H３－ＴＣＲβ－Ｌ－Ｖ_H２－Ｃ_H１－Ｃ_H２－Ｃ_H３を含み、式中、Ｌはリンカー（例えば、（Ｇ₄Ｓ）₂）であり；第一の軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L２－Ｃ_Lを含み；第二の重鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_H１－ＴＣＲβ－Ｃ_H２－Ｃ_H３を含み；そして第二の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L１－ＴＣＲαを含み；第三の軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｖ_L３－ＴＣＲαを含む。抗体の一方のアーム上で、Ｖ_H１およびＶ_L１は、ＬＩＬＲＢ４に対する第一の抗原結合部位を形成する。抗体のもう一方のアーム上で、Ｖ_H３およびＶ_L３はＬＩＬＲＢ４に対する第二の抗原結合部位を形成する一方、Ｖ_H２およびＶ_L２は、ＣＤ３に対する抗原結合部位を形成する。特定の態様において、第三の軽鎖ポリペプチドＶ_L３－ＴＣＲαは、第一の軽鎖ポリペプチドＶ_L１－ＴＣＲαと同一であってもよい。

［００２２９］特定の態様において、ＣＤ３に対して向けられる抗原結合部位は、当該技術分野に知られる抗ＣＤ３抗体、例えばＷＯ２０１９０５７０９９に記載される抗ＣＤ３抗体、ＳＰ３４（Ｐｅｓｓａｎｏら ＥＭＢＯ Ｊ （１９８５） ４， ３３７－３３４）、ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ， Ｒａｒｉｔａｎ， ＮＪ； Ｖａｎ Ｗａｕｗｅら， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ （１９８４） １３３， １２９－３２）、Ｍ２９１（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州フレモント）、ＢＣ３（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、ワシントン州シアトル）、ＴＲ６６（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、コロラド州センテニアル）およびＢＭＡ０３０（Ｗａｌｋｅｒ Ｃ ら， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９０７） １７：１６１１－８）に基づいて生成される。

［００２３０］特定の態様において、ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体は、均一性および製造可能性を改善するように操作されてもよい。いくつかの態様において、図２８Ｂに例示されるように、ＴＣＲαを、配列番号８９のＳ９１Ａで突然変異して、Ｏ－グリカン修飾部位を除去してもよい。いくつかの態様において、重鎖または軽鎖ポリペプチドのＮ末端で、Ｑ１Ｅ突然変異を作製して、Ｎ末端ピロ－Ｑ形成を防止してもよい。

［００２３１］特定の態様において、抗ＬＩＬＲＢ４二重特異性抗体は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎら ２０１７， ９ １８２－２１２に概説されるように、多くの他の方式で構築されてもよい。特に、抗ＬＩＬＲＢ４二重特異性抗体は、共有結合抗体コンジュゲート、非対称Ｆ（ａｂ’）２、ＣｏｖＸ体、マウス／ラットキメラＩｇＧ、共通の重鎖を含むκλ体、タンデム一本鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）、ＢｉＴＥ、トリプルボディ、ディアボディ、タンデムドメイン抗体、ＣＨ１／ＣＬドメインとのｓｃＦｖ融合体、Ｆａｂ－ｓｃＦｖバイボディまたはトリボディ、Ｆａｂ－Ｆｖ融合体、Ｆａｂ－単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）／ＶＨＨ融合体、直交性Ｆａｂ－Ｆａｂ、ｓｃＦｖ２－アルブミン／毒素融合体、一本鎖ディアボディ－アルブミン／毒素融合体、タンデムｓｃＦｖアルブミン／毒素融合体、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）Ｆａｂ₃、ＤＮＬ－Ｆａｂ₂－ｓｃＦｖ、ＤＮＬ－Ｆａｂ－ＩｇＧ融合体、ＩｍｍＴＡＣ ＴＣＲ－ｓｃＦｖ融合体、異なる重鎖および異なるまたは共通の軽鎖を含むＩｇＧ、重鎖または軽鎖ＮまたはＣ末端へのＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、重鎖または軽鎖ＮまたはＣ末端へのＩｇＧ一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）融合体、ｓｃＦｖ融合体を含む一本鎖ＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）二重特異性抗体、非対称ｓｃＦｖ－Ｆｃ、タンデム－ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、Ｆｃ融合体を含むまたは含まない二重アフィニティ再ターゲティング（ｒｅ－ｔａｒｔｉｎｇ）抗体（ＤＡＲＴ）、非対称Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－ＣＨ３融合体、ＴｒｉＦａｂ、ＩｇＧタンデムｓｃＦｖ融合体、ＩｇＧ－クロスＦａｂ融合体、直交性Ｆａｂを含むタンデムＦａｂ－ＩｇＧ融合体、ディディアボディ（ｄｉｄｉａｂｏｄｙ）－Ｆｃ融合体、一本鎖ディアボディＦｃ－融合体、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ₄－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ２－Ｆｃａｂ、ディ－ディアボディ、一本鎖ディアボディＣＨ３融合体、ＩｇＥ／Ｍ ＣＨ２融合体、Ｆ（ａｂ’）₂融合体、ＣＨ１／ＣＫ融合体、２イン１デュアル作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）、またはＤｕｔａＭａｂ、ＤＮＬ－Ｆａｂ₂－ＩｇＧ融合体として構築されてもよい。

［００２３２］限定されるわけではないが、ノブズ－イン－ホールズ（Ｒｉｄｇｗａｙら ＰＥＤＳ １９９６； Ａｔｗｅｌｌら Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９７； Ｍｅｒｃｈａｎｔら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８）、ＨＡ－ＴＦ突然変異（Ｍｏｏｒｅら Ｍａｂｓ ２０１１）、ＺＷ１（Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎら ＭＡｂｓ ２０１３）、ＣＨ３電荷対（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１０）、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３電荷対（Ｓｔｒｏｐら Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１２）、ＩｇＧ２ヒンジ／ＣＨ３電荷対（Ｓｔｒｏｐら Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１２）、操作されたジスルフィドを含むまたは含まないＥＷ－ＲＶＴ突然変異（Ｃｈｏｉら Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０１３； Ｃｈｏｉら Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５）、ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｇｅｕｉｊｅｎら Ｊ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃ ２０１４）、ＤｕｏＢｏｄｙ（Ｌａｂｒｉｊｎら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１３）、ＳＥＥＤｂｏｄｙ ＩｇＧ／Ａキメラ（Ｄａｖｉｄら Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２０１０）、ＢＥＡＴ（Ｍｏｒｅｔｔｉら ＢＭＣ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ２０１３）、７．８．６０または２９．８．３４（Ｌｅａｖｅｒ－Ｆｅｙら Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０１６）を含むいくつかの手段によって、Ｆｃドメインを含有する二重特異性抗体のための重鎖のヘテロ二量体化を達成してもよい。異なる軽鎖の正しい対形成は、限定されるわけではないが、ＣｒｏｓｓＭａｂ（Ｓｃｈａｅｆｅｒら Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１１）、直交性Ｆａｂ（Ｌｅｗｉｓら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１４）、Ｔ細胞受容体融合体（Ｗｕら ＭＡｂｓ ２０１５）、ＣＲ３（Ｇｏｌａｙら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１６）、ＭＵＴ４（Ｇｏｌａｙら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１６）、ＤｕｅｔＭａｂ（Ｍａｚｏｒら ＭＡｂｓ ２０１５， ７， ３７７－８９； Ｍａｚｏｒら ＭＡｂｓ ２０１５， ７， ４６１－６６９）を含む多様な方法によって達成されてもよい。

［００２３３］特定の態様において、二重特異性抗体は、ＬＩＬＲＢ４、および限定されるわけではないが、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ１６ａ、ＮＫｐ４６、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ４７を含む別のターゲットをターゲティングしてもよい。

［００２３４］コンジュゲート
［００２３５］いくつかの態様において、抗ＬＩＬＲＢ４抗体およびその抗原結合断片は、コンジュゲート部分をさらに含む。コンジュゲート部分を抗体およびその抗原結合断片に連結させてもよい。コンジュゲート部分は、抗体またはその抗原結合断片に付着させうるタンパク質性または非タンパク質性部分である。多様なコンジュゲート部分を本明細書に提供される抗体または抗原結合断片に連結させてもよい（例えば、“Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”， Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊ． Ｍ． ＣｒｕｓｅおよびＲ． Ｅ． Ｌｅｗｉｓ， Ｊｒ．（監修）， Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８９）を参照されたい）。これらのコンジュゲート部分を、他の方法の中でも、共有結合、アフィニティ結合、挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）、配位結合、複合体形成、会合、ブレンド、または添加によって、抗体または抗原結合断片に連結してもよい。

［００２３６］特定の態様において、本明細書に開示される抗体および抗原結合断片を操作して、１つまたはそれより多いコンジュゲート部分への結合に利用されうる、エピトープ結合部分の外側に特定の部位を含有させてもよい。例えば、こうした部位には、コンジュゲート部分への共有連結を促進する、１つまたはそれより多い反応性アミノ酸残基、例えばシステインまたはヒスチジン残基が含まれてもよい。

［００２３７］特定の態様において、抗体を、間接的に、または別のコンジュゲート部分を通じて、コンジュゲート部分に連結してもよい。例えば、抗体または抗原結合断片をビオチンにコンジュゲート化して、次いで、アビジンにコンジュゲート化されている第二のコンジュゲートに間接的にコンジュゲート化してもよい。コンジュゲートは、クリアランス修飾剤、毒素（例えば化学療法剤）、検出可能標識（例えば放射性同位体、ランタニド、発光標識、蛍光標識、または酵素－基質標識）、または精製部分であってもよい。

［００２３８］「毒素」は、細胞に対して有害であるか、あるいは細胞を損傷するかまたは殺すことが可能な任意の剤であってもよい。毒素の例には、限定なしに、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メルタンシン、エムタンシン、ＤＭ１、メイタンシノイドＤＭ１、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体、代謝拮抗剤（例えばメトトレキセート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオテパ・クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス―ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、トポイソメラーゼ阻害剤、およびチューブリン結合剤が含まれる。

［００２３９］検出可能標識の例には、蛍光標識（例えばフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、またはＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）、酵素－基質標識（例えばセイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼまたはβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ）、放射性同位体（例えば、¹²³Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓ、³Ｈ、¹¹¹Ｉｎ、¹¹²Ｉｎ、¹⁴Ｃ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、⁸⁶Ｙ、⁸⁸Ｙ、⁹⁰Ｙ、¹⁷⁷Ｌｕ、²¹¹Ａｔ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、¹⁵³Ｓｍ、²¹²Ｂｉ、および³²Ｐ、他のランタニド）、発光標識、発色団部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子または検出用の金が含まれてもよい。

［００２４０］特定の態様において、コンジュゲート部分は、抗体の半減期の増加を補助する、クリアランス修飾剤であってもよい。例示的な例には、水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー等が含まれる。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、そして分岐していてもまたは未分岐であってもよい。抗体に付着したポリマーの数は多様であってもよく、そして１より多いポリマーが付着する場合、これらは同じであってもまたは異なる分子であってもよい。

［００２４１］特定の態様において、コンジュゲート部分は、磁気ビーズなどの精製部分であってもよい。
［００２４２］特定の態様において、本明細書に提供される抗体およびその抗原結合断片は、コンジュゲートの基部のために用いられる。

［００２４３］ポリヌクレオチドおよび組換え法
［００２４４］本開示は、抗ＬＩＬＲＢ４抗体およびその抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。特定の態様において、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に提供される例示的抗体の可変領域をコードする、配列番号２、４、および３５に示されるような、１つまたはそれより多いヌクレオチド配列を含む。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用法を用いて（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離され、そして配列決定される。コードＤＮＡはまた、合成法によっても得られうる。

［００２４５］抗ＬＩＬＲＢ４抗体および抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチドを、当該技術分野に知られる組換え技術を用いて、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のため、ベクター内に挿入してもよい。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素には、一般的に、限定されるわけではないが、以下：シグナル配列、複製起点、１つまたはそれより多いマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター（例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、および転写終結配列の１つまたはそれより多くが含まれる。

［００２４６］本開示は、抗体または抗原結合断片をコードする、本明細書に提供される核酸配列、該核酸配列に機能可能であるように連結された少なくとも１つのプロモーター（例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、および少なくとも１つの選択マーカーを含有する、ベクター（例えば発現ベクター）を提供する。ベクターの例には、限定されるわけではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）、ラムダファージ、およびＭ１３ファージ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．３、ｐＭＤ１８－Ｔ、ｐＯｐｔｉｖｅｃ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ、ｐＱＤ－Ｈｙｇ－ＧＳｅｕ、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ１０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＭＶ－ＳＣＲＩＰＴ．ＲＴＭ．、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ＰＣＲ ２．１、ｐＥＦ－１、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＦ－Ｂｏｓ等が含まれる。

［００２４７］抗体または抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを、クローニングまたは遺伝子発現のために、宿主細胞に導入してもよい。本明細書のベクター中のＤＮＡのクローニングまたは発現のために適した宿主細胞は、原核生物、酵母、または上述のより高次の真核細胞である。この目的に適した原核生物には、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えばエンテロバクテリア科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。

［００２４８］原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌または酵母が、抗ＬＩＬＲＢ４抗体コードベクターの適切なクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母は、より低次の真核宿主微生物の中で、最も一般的に用いられる。しかし、いくつかの他の属、種、および株が一般的に入手可能であり、そして本明細書において有用であり、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えばＫ．ラクティス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ウィケラミー（Ｋ． ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ワルティー（Ｋ． ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ． ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ． ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびＫ．マルキシアヌス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３，０７０）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉ）；ならびに糸状菌、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニジュランス（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）がある。

［００２４９］本明細書に提供されるグリコシル化抗体または抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｆｒａｇｍｅｎｔ）の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株および変異体、ならびにスポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、およびカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されてきている。例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１変異体およびカイコガＮＰＶのＢｍ－５株などのトランスフェクションのための多様なウイルス株が公的に入手可能であり、そしてこうしたウイルスを、特にスポドプテラ・フルジペルダ細胞のトランスフェクションのため、本発明にしたがって、本明細書のウイルスとして用いてもよい。ワタ（ｃｏｔｔｏｎ）、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、ジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）、ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）、ペチュニア（ｐｅｔｕｎｉａ）、トマト（ｔｏｍａｔｏ）、およびタバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）の植物細胞培養もまた、宿主として利用されうる。

［００２５０］しかし、関心が最も高いのは脊椎動物細胞であり、そして培養（組織培養）中の脊椎動物細胞の増殖は、ルーチンの方法になってきている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎細胞（懸濁培養中で増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． （１９７７） ３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）活性不全ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－ＤＨＦＲ（Ｕｒｌａｕｂら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８０） ７７：４２１６）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． （１９８０） ２３：２４３－２５１）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９８２） ３８３：４４－６８）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝腫瘍細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）である。いくつかの好ましい態様において、宿主細胞は２９３Ｆ細胞である。

［００２５１］宿主細胞を、抗ＬＩＬＲＢ４抗体産生のため、上述の発現またはクローニングベクターで形質転換し、そしてプロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または望ましい配列をコードする遺伝子を増幅するため、適切であるように修飾された慣用的栄養培地中で培養する。別の態様において、抗体は、当該技術分野に知られる相同組換えによって産生されうる。

［００２５２］本明細書に提供される抗体または抗原結合断片を産生するために用いられる宿主細胞は、多様な培地中で培養されてもよい。商業的に入手可能な培地、例えばＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）は、宿主細胞を培養するために適切である。さらに、Ｈａｍら， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：４４ （１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８０） １０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；または第５，１２２，４６９号； ＷＯ ９０／０３４３０； ＷＯ ８７／００１９５；または米国特許第Ｒｅ． ３０，９８５号に記載される培地いずれかを、宿主細胞のための培地として用いてもよい。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ^TM薬剤）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー供給源を補充してもよい。任意の他の必要な補充剤もまた、当業者に知られる適切な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞で以前、用いられてきており、そして一般の当業者に明らかであろう。

［００２５３］組換え技術を用いる際、抗体を細胞内で、細胞膜周辺腔で産生させるか、または培地内に直接分泌させてもよい。抗体を細胞内で産生する場合、第一の工程として、粒子破片、宿主細胞または溶解した断片のいずれも、例えば遠心分離または限外ろ過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９２） １０：１６３－１６７は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための方法を記載する。簡潔には、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間に渡って融解する。細胞破片を遠心分離によって除去してもよい。抗体が培地内に分泌される場合、こうした発現系からの上清は、一般的に、まず、商業的に入手可能なタンパク質ろ過フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過装置を用いて濃縮される。プロテアーゼ阻害剤、例えばＰＭＳＦを、前述の工程のいずれかに含んで、タンパク質分解を阻害してもよく、そして抗生物質を含んで、外来性の混入物質の増殖を防止してもよい。

［００２５４］細胞から調製された抗ＬＩＬＲＢ４抗体およびその抗原結合断片を、例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ－セルロースイオン交換クロマトグラフィ、硫酸アンモニウム沈殿、塩析、およびアフィニティクロマトグラフィを用いて精製してもよく、アフィニティクロマトグラフィが好ましい精製技術である。

［００２５５］特定の態様において、固相上に固定されたプロテインＡを、抗体およびその抗原結合断片の免疫アフィニティ精製のために用いる。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適切さは、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。ヒトガンマ１、ガンマ２、またはガンマ４重鎖に基づく抗体を精製するためには、プロテインＡを用いてもよい（Ｌｉｎｄｍａｒｋら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． （１９８３） ６２：１－１３）。マウスの全てのアイソタイプおよびヒトガンマ３には、プロテインＧが推奨される（Ｇｕｓｓら， ＥＭＢＯ Ｊ． （１９８６）５：１５６７－７５）。アフィニティリガンドを付着させるマトリックスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば制御孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースで達成されうるよりも、より迅速な流速およびより短いプロセシング時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ^TM樹脂（Ｊ． Ｔ． Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州フィリップスバーグ）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィ、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^TMクロマトグラフィ上のクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収しようとする抗体に応じて、利用可能である。

［００２５６］任意の予備精製工程（単数または複数）後、関心対象の抗体および混入物質を含む混合物を、約２．５～４．５の間のｐＨの溶出緩衝液を用いて、好ましくは低塩濃度（例えば約０～０．２５Ｍ塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィに供してもよい。

［００２５７］精製
［００２５８］特定の態様において、本開示の抗体を精製してもよい。用語「精製」は、本明細書において、タンパク質が、その天然に得られうる状態に比較して、任意の度合いまで精製されている、他の構成要素から単離可能な組成物を指すよう意図される。したがって、精製タンパク質はまた、該タンパク質が天然に存在しうる環境から遊離したタンパク質を指す。用語「実質的に精製された」を用いた際、この指定は、タンパク質またはペプチドが、組成物の主要構成要素を形成する、例えば組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれより多くを構成する、組成物を指すであろう。

［００２５９］タンパク質精製技術は、当業者に周知である。これらの技術は、１つのレベルで、ポリペプチドおよび非ポリペプチド分画への、細胞環境の粗分画（ｃｒｕｄｅ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）を伴う。ポリペプチドを他のタンパク質から分離したら、クロマトグラフィおよび電気泳動技術を用いて、関心対象のポリペプチドをさらに精製して、部分的または完全精製（または均質になるまでの精製）を達成してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィ、排除クロマトグラフィ；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。タンパク質精製のための他の方法には、硫酸アンモニウムでの沈殿、ＰＥＧ、抗体等または熱変性、その後、遠心分離によるもの；ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイトおよびアフィニティクロマトグラフィ；ならびにこうしたものおよび他の技術の組み合わせである。

［００２６０］本開示の抗体を精製する際、ポリペプチドを原核または真核発現系で発現させ、そして変性条件を用いてタンパク質を抽出することが望ましい可能性もある。ポリペプチドは、ポリペプチドのタグ付け部分に結合するアフィニティカラムを用いて、他の細胞構成要素から精製されてもよい。当該技術分野に一般的に知られるように、多様な精製工程を行う順序を変化させてもよく、または特定の工程を省いてもよく、そしてなお、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製のための適切な方法を生じうると考えられる。

［００２６１］一般的に、完全抗体は、抗体のＦｃ部分に結合する剤（すなわちプロテインＡ）を利用して分画される。あるいは、抗原を用いて、適切な抗体を精製すると同時に選択してもよい。こうした方法はしばしば、支持体、例えばカラム、フィルターまたはビーズに結合した選択剤を利用する。抗体を支持体に結合させ、混入物質を除去し（例えば洗い流し）、そして条件（塩、熱等）を適用することによって抗体を放出させる。

［００２６２］本開示を考慮して、タンパク質またはペプチドの精製の度合いを定量化するための多様な方法が、当業者には知られるであろう。これらには、例えば、活性分画の比活性の決定、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による分画内のポリペプチド数の評価が含まれる。分画の純度を評価するための別の方法は、分画の比活性を計算し、それを最初の抽出物の比活性と比較し、そしてこうして純度を計算することである。活性の量を示すために用いられる実際の単位は、もちろん、精製を追跡するために選択された特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに応じるであろう。

［００２６３］ポリペプチドの移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件で、時に有意に変化しうることが知られる（Ｃａｐａｌｄｉら、１９７７）。したがって、異なる電気泳動条件下で、精製されたまたは部分的に精製された発現産物の見かけの分子量は多様でありうることが認識されるであろう。

［００２６４］ＩＩＩ．薬学的組成物
［００２６５］本開示は、抗ＬＩＬＲＢ４抗体またはその抗原結合断片および１つまたはそれより多い薬学的に許容されうるキャリアーを含む薬学的組成物をさらに提供する。

［００２６６］本明細書に開示される薬学的組成物中で使用されるための薬学的に許容されうるキャリアーには、例えば、薬学的に許容されうる液体、ゲル、または固形キャリアー、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗微生物剤、等張剤、緩衝剤、酸化防止剤、麻酔剤、懸濁剤／分散剤、隔離剤またはキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性補助物質、当該技術分野に知られる他の構成要素、またはその多様な組み合わせが含まれてもよい。

［００２６７］適切な構成要素には、例えば、酸化防止剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、潤滑剤、フレーバー剤、増粘剤、着色剤、乳化剤、または安定化剤、例えば糖およびシクロデキストリンが含まれてもよい。適切な酸化防止剤には、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール（ｈｙｄｒｏｘａｎｉｓｏｌ）、ブチル化ヒドロキシトルエン、および／または没食子酸プロピルが含まれてもよい。本明細書に開示されるように、抗体または抗原結合断片および本明細書に提供されるようなコンジュゲートを含む組成物中に、メチオニンなどの１つまたはそれより多い酸化防止剤を含めると、抗体または抗原結合断片の酸化が減少する。酸化のこの減少は、結合アフィニティの損失を防止するかまたは減少させ、それによって、抗体安定性を改善し、そして有効期間を最大化する。したがって、特定の態様において、本明細書に開示されるような１つまたはそれより多い抗体または抗原結合断片および１つまたはそれより多い酸化防止剤、例えばメチオニンを含む、組成物を提供する。さらに提供されるのは、抗体または抗原結合断片を、１つまたはそれより多い酸化防止剤、例えばメチオニンと混合することによって、本明細書に提供されるような抗体または抗原結合断片の酸化を防止し、その有効期間を延長し、そして／またはその有効性を改善するための方法である。

［００２６８］さらに例示するため、薬学的に許容されうるキャリアーには、例えば、水性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性デキストロース注射液、無菌水注射液、またはデキストロースおよび乳酸化リンゲル注射液、非水性ビヒクル、例えば植物起源の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油、またはピーナツ油、殺細菌性または殺真菌性濃度の抗微生物剤、等張剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース、緩衝剤、例えばリン酸またはクエン酸緩衝剤、酸化防止剤、例えば重硫酸ナトリウム、局所麻酔剤、例えばプロカイン塩酸塩、懸濁剤および分散剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン、乳化剤、例えばポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ－８０）、隔離剤またはキレート剤、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸が含まれてもよい。キャリアーとして利用される抗微生物剤を、多用量容器中の薬学的組成物に添加してもよく、これには、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが含まれる。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールが含まれてもよい。適切な非毒性補助物質には、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、可溶性増進剤、あるいは酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、またはシクロデキストリンなどの剤が含まれてもよい。

［００２６９］薬学的組成物は、液体溶液、懸濁物、エマルジョン、丸剤、カプセル、錠剤、持続放出配合物、または粉末であってもよい。経口配合物には、標準的キャリアー、例えば薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等が含まれてもよい。

［００２７０］特定の態様において、薬学的組成物を注射可能組成物内に配合する。注射可能薬学的組成物を、任意の慣用的な型で、例えば液体溶液、懸濁物、エマルジョン、あるいは液体溶液、懸濁物、またはエマルジョンを生成するために適した固体型で調製してもよい。注射のための調製物には、注射の準備ができている無菌および／または非発熱性溶液、使用直前に溶媒と組み合わせる準備ができている無菌乾燥可溶性産物、例えば凍結乾燥粉末が含まれてもよく、皮下錠剤、注射の準備ができている無菌懸濁物、使用直前にビヒクルと組み合わされる準備ができている無菌乾燥不溶性産物、および無菌および／または非発熱性エマルジョンが含まれる。溶液は、水性または非水性のいずれであってもよい。

［００２７１］特定の態様において、単位用量非経口調製物を、アンプル、バイアルまたは針を含むシリンジ中にパッケージングする。非経口投与のためのすべての調製物は、当該技術分野に知られ、そして実施されるように、無菌でなければならず、そして発熱性であってはならない。

［００２７２］特定の態様において、無菌凍結乾燥粉末は、本明細書に開示されるような抗体または抗原結合断片を、適切な溶媒中に溶解することによって調製される。溶媒は、安定性を改善させる賦形剤、あるいは粉末または粉末から調製される再構成溶液の他の薬理学的構成要素を含有してもよい。使用可能な賦形剤には、限定されるわけではないが、水、デキストロース、ソルビタール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたは他の適切な剤が含まれる。溶媒は、１つの態様において、ほぼ中性ｐＨの、緩衝剤、例えばクエン酸、リン酸ナトリウムまたはカリウム、あるいは当業者に知られる他のこうした緩衝剤を含有してもよい。溶液の続く無菌ろ過、その後、当業者に知られる標準条件下での凍結乾燥は、望ましい配合物を提供する。１つの態様において、生じる溶液を、凍結乾燥のため、バイアル内に分配する。各バイアルは、抗ＬＩＬＲＢ４抗体またはその抗原結合断片またはその組成物の単一投薬量または多数投薬量を含有してもよい。正確な試料除去および正確な投薬を容易にするため、用量または用量セットに必要なものを少量超える量（例えば約１０％）を含む過剰充填バイアルは許容されうる。凍結乾燥粉末を、適切な条件下、例えば約４℃～室温で保存してもよい。

［００２７３］凍結乾燥粉末の注射用水での再構成は、非経口投与で使用するための配合物を提供する。１つの態様において、再構成のため、無菌および／または非発熱性水または他のキャリアーに適した液体を凍結乾燥粉末に添加する。正確な量は、与えられる選択された療法に依存し、そして実験的に決定されうる。

［００２７４］ＩＶ． 抗ＬＩＬＲＢ４抗体の使用法
［００２７５］本開示はまた、本明細書に提供されるような抗体または抗原結合断片の療法的有効量を、治療の必要がある被験体に投与し、それによって、ＬＩＬＲＢ４関連状態または障害を治療するかまたは防止する工程を含む療法も提供する。いくつかの態様において、ＬＩＬＲＢ４関連状態または障害は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患である。

［００２７６］癌の例は、一般的に、固形腫瘍および血液学的悪性腫瘍に分類されうる。固形腫瘍には、限定されるわけではないが、非小細胞肺癌（扁平／非扁平）、小細胞肺癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、卵巣癌、乳癌（基底乳癌、腺管癌および小葉乳癌を含む）、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、中皮腫、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、肉腫、前立腺癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、胸腺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、菌状息肉症（ｍｙｃｏｓｅｓ ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ）、メルケル細胞癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜種／滑膜肉腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、髄様甲状腺癌、乳頭状甲状腺癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、マスト細胞由来腫瘍、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤ、鼻咽頭癌、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫が含まれる。

［００２７７］固形腫瘍は、増殖性シグナル伝達の維持、増殖抑制因子の回避、細胞死への抵抗、複製性不死の実現、血管新生誘導、浸潤および転移の活性化、腫瘍促進性炎症、免疫破壊の回避、ゲノム不安定性および突然変異、ならびに細胞エネルギー論制御不全を含む、多数の生物学的特徴によって特徴付けられる。迅速に分裂する細胞をターゲティングする細胞傷害性化学療法から、選択されたシグナル伝達経路を阻害する小分子、表面タンパク質をターゲティングするモノクローナル抗体まで、治療努力が開発されてきている。より最近、内因性免疫を再活性化する癌免疫療法または合成免疫を利用する細胞療法の概念が有望であることが示されてきている。これらの進歩にもかかわらず、進行した固形腫瘍を有する患者の大部分はなお、長期に生存しない。免疫チェックポイント阻害剤、例えば抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の使用は、少数の患者において、長期無増悪および全生存を導いてきている。

［００２７８］転帰を改善するには、免疫生物学の異なる側面および異なる腫瘍浸潤細胞をターゲティングする、より新しい免疫療法アプローチ、例えば骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む、骨髄細胞サブセット上で発現される阻害性受容体としてのＬＩＬＲＢ４をターゲティングするものが必要である。これらの骨髄細胞は、その免疫抑制性／抗炎症表現型が、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化、増殖および細胞傷害活性を阻害しうるため、機能的に骨髄由来抑制性細胞と記載される。

［００２７９］いくつかの態様において、ＭＤＳＣの枯渇は、固形腫瘍治療のため、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞に対する抑制性の影響を逆転させうる。
［００２８０］いくつかの態様において、骨髄細胞上のＬＩＬＲＢ４のブロッキングはまた、ＬＩＬＲＢ４を発現する樹状細胞または骨髄性白血病細胞を含む、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対するその阻害性効果を解除しうる。特定のサイトカイン産生ＡＰＣによる抗原提示活性の増加が観察される可能性があり、そしてこれはＴ細胞活性化、細胞傷害性およびＴ細胞サイトカイン産生を導きうる。

［００２８１］血液学的悪性腫瘍には、限定されるわけではないが、急性リンパ球性／リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、びまん性巨細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、毛様細胞白血病、重鎖病、ＨＨＶ８関連原発性浸出リンパ腫、リンパ性悪性腫瘍、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ），非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、プレＢ急性リンパ球性白血病（プレＢ ＡＬＬ）、原発性ＣＮＳリンパ腫、原発性縦隔巨細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球リッチＢ細胞リンパ腫、骨髄増殖性新生物、およびワルデンストレームマクログロブリン血症が含まれる。

［００２８２］自己免疫または炎症性疾患には、限定されるわけではないが、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、自己免疫構成要素を伴うウイルス性疾患）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳病（ＡＩＥＤ）、自己免疫リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病－疱疹状皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素病、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、デゴス病、若年性皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、全身性強皮症、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、全身性硬化症（ＳＳ）、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸粘膜炎症、大腸炎関連消耗性疾患、ブドウ膜炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症、アルツハイマー病、喘息、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、変形性関節症、敗血症、脳卒中、組織および臓器移植、血管炎、糖尿病性網膜症、人工呼吸器誘発肺傷害、ウイルス感染、自己免疫糖尿病等が含まれる。炎症性障害には、例えば慢性および急性炎症性障害が含まれる。

［００２８３］感染性疾患には、限定されるわけではないが、真菌感染、寄生虫／原生動物感染または慢性ウイルス感染、例えばマラリア、コクシジオイディス・イミティス症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｏｄｍｙｃｏｓｉｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ヒストプラズマ症、爪真菌症、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ・アルビカンス症（ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ ａｌｂｉｃａｎｓ）、パラコクシジオイデス症（ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）、微胞子虫症（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓ）、アカントアメーバ角膜症、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、バイリサスカリス症（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉａｓｉｓ）、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ症（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ）、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮症、腸蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、眠り病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、鞭虫症、トリパノソーマ症、蠕虫感染、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス、ＩＩ型単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ、カポジ西肉腫関連ヘルペスウイルス伝染病、シンリングウイルス（トルケテノウイルス）、ヒトＴリンパ球増殖性ウイルスＩ、ヒトＴリンパ球増殖性ウイルスＩＩ、水痘帯状疱疹、ＪＣウイルスまたはＢＫウイルスの感染が含まれる。

［００２８４］本明細書に提供されるような抗体または抗原結合断片の療法的有効量は、当該技術分野に知られる多様な要因、例えば体重、年齢、過去の病歴、現在の投薬、被験体の健康状態および交差反応の潜在的可能性、アレルギー、感受性および有害副作用、ならびに投与経路および疾患進行の度合いに応じるであろう。投薬量は、これらのおよび他の状況または要件によって示されるように、一般の当業者（例えば医師または獣医師）によって比例して減少させるかまたは増加させることも可能である。

［００２８５］特定の態様において、本明細書に提供されるような抗体または抗原結合断片は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの療法的有効投薬量で投与されてもよい。これらの態様の特定のものにおいて、抗体または抗原結合断片は、約５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の投薬量で投与され、そしてこれらの態様の特定のものにおいて、投薬量は、１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、５ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、３ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、１ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、０．５ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満あるいは０．１ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満である。特定の態様において、投与投薬量は、治療経過に渡って変化してもよい。例えば、特定の態様において、最初の投与投薬量は、続く投与投薬量より高くてもよい。特定の態様において、投与投薬量は、被験体の反応に応じて、治療経過に渡って変化してもよい。

［００２８６］投薬措置を調節して、最適の望ましい反応（例えば療法反応）を提供してもよい。例えば、単回用量を投与してもよいし、またはいくつかの分割された用量を長期に渡って投与してもよい。

［００２８７］本明細書に開示される抗体および抗原結合断片を、当該技術分野に知られる任意の経路によって、例えば非経口（例えば皮下、腹腔内、静脈内注入を含む静脈内、筋内、または皮内注射）または非・非経口（例えば経口、鼻内、眼内、舌下、直腸、または局所）経路によって投与してもよい。

［００２８８］いくつかの態様において、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片を、単独で、あるいは１つまたはそれより多いさらなる療法手段または剤と組み合わせて投与してもよい。例えば、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片は、別の療法剤、例えば化学療法剤または抗癌薬剤と組み合わせて投与されてもよい。

［００２８９］これらの態様の特定のものにおいて、１つまたはそれより多いさらなる療法剤と組み合わせて投与される、本明細書に開示されるような抗体または抗原結合断片は、１つまたはそれより多いさらなる療法剤と同時に投与されてもよく、そしてこれらの態様の特定のものにおいて、抗体または抗原結合断片、およびさらなる療法剤（単数または複数）は、同じ薬学的組成物の部分として投与されてもよい。しかし、別の療法剤と「組み合わせて」投与される抗体または抗原結合断片は、こうした剤と同時にまたは同じ組成中で投与される必要はない。別の剤の前にまたは後に投与される抗体または抗原結合断片は、「組み合わせて」という句を本明細書に用いる際、抗体または抗原結合断片および第二の剤が異なる経路を通じて投与されている場合であっても、こうした剤と「組み合わせて」投与されていると見なされる。可能な場合、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片と組み合わせて投与されるさらなる療法剤は、さらなる療法剤の製品情報シートに列挙されるスケジュールにしたがって、あるいはＰｒｅｓｃｒｉｂｅｒ’ｓ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ｐｄｒ．ｎｅｔでのみオンラインで利用可能）または当該技術分野に周知のプロトコルにしたがって、投与される。

［００２９０］本開示の抗体との組み合わせ療法のために意図される特定の剤には、化学療法が含まれる。化学療法には、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）およびアントラサイクリン（最も頻繁にはダウノルビシン）、高用量シタラビン単独、導入化学療法、通常はアントラサイクリンに添加されるオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、地固め療法完了後のヒスタミン二塩酸塩（Ｃｅｐｌｅｎｅ）およびインターロイキン２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、高用量化学療法の候補ではない再発性ＡＭＬの６０歳を超える患者のためのゲムツズマブ・オゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）、クロファラビン、ならびにターゲティング療法、例えばキナーゼ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、およびＭＤＲ１（多剤耐性タンパク質）の阻害剤、あるいは亜ヒ酸または再発性急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）が含まれてもよい。

［００２９１］特定の態様において、組み合わせ療法のための剤は、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリン・トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリン、ダウノルビシン、ヌクレオシド代謝阻害剤、シタラビン、低メチル化剤、低用量シタラビン（ＬＤＡＣ）、ダウノルビシンおよびシタラビンの組み合わせ、注射用のダウノルビシンおよびシタラビン・リポソーム、Ｖｙｘｅｏｓ（登録商標）、アザシチジン、Ｖｅｄａｚａ（登録商標）、デシタビン、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ヒ素、亜ヒ酸、ヒスタミン二塩酸塩、Ｃｅｐｌｅｎｅ（登録商標）、インターロイキン－２、アルデスロイキン、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、ＦＬＴ－３阻害剤、ミドスタウリン、Ｒｙｄａｐｔ（登録商標）、クロファラビン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、ＩＤＨ１阻害剤、イボシデニブ、Ｔｉｂｓｏｖｏ（登録商標）、ＩＤＨ２阻害剤、エナシデニブ、Ｉｄｈｉｆａ（登録商標）、スムーズンド（ＳＭＯ）阻害剤、グラスデギブ、アルギナーゼ阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、エパカドスタット、ＢＣＬ－２阻害剤、ベネトクラックス、Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（登録商標）、白金複合体誘導体、オキサリプラチン、キナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、イブルチニブ、ＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（登録商標）、アカラブルチニブ、ＣＡＬＱＵＥＮＣＥ（登録商標）、ザヌブルチニブ、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＬＡＧ３抗体、ＩＣＯＳ抗体、ＴＩＧＩＴ抗体、ＴＩＭ３抗体、ＣＤ４０抗体、４－１ＢＢ抗体、ＣＤ４７抗体、ＳＩＲＰ１α抗体または融合体タンパク質、Ｅ－セレクチンのアンタゴニスト、腫瘍抗原に結合する抗体、Ｔ細胞表面マーカーに結合する抗体、骨髄細胞またはＮＫ細胞表面マーカーに結合する抗体、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、植物由来アルカロイド、ホルモン療法薬剤、ホルモンアンタゴニスト、アロマターゼ阻害剤、およびＰ－糖タンパク質阻害剤からなる群より選択される１つまたはそれより多い薬剤である。

［００２９２］特定の態様において、ＬＩＬＲＢ４関連状態または障害は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性骨髄単球性白血病（ＦＡＢ Ｍ４）サブタイプおよび急性単芽球性／単球性白血病（ＦＡＢ Ｍ５）サブタイプである。

［００２９３］特定の態様において、標準治療、例えばベネトクラックスおよびアザシチジンに耐性であるかまたは難治性であるＡＭＬ。
［００２９４］ＡＭＬは、予後が劣った侵襲性悪性腫瘍である。世界保健機構（ＷＨＯ分類では、急性骨髄単球性白血病（フランス・アメリカ・イギリス［ＦＡＢ］分類ではＭ４）および急性単芽球／単球性白血病（ＦＡＢ分類ではＭ５）は、ＡＭＬ、特定不能（Ｎｏｔ Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）（ＡＭＬ、ＮＯＳ）のサブタイプである。

［００２９５］ＷＨＯ系の急性骨髄単球性白血病（ＦＡＢ Ｍ４）は、骨髄芽球、単芽球、および前単球からなる芽球（全部で≧２０％）、ならびに≧２０％～７９％の単球細胞系譜を有する。急性単芽球性／単球性白血病（ＦＡＢ Ｍ５）は、単芽球／前単球≧２０％、および単球性特徴を持つ骨髄細胞の≧８０％を有する。急性骨髄単球性白血病（Ｍ４）および急性単球性白血病（Ｍ５）は、ＡＭＬの全症例の、それぞれおよそ２０％および１０％を占める（Ｇａｎｚｅｌら、２０１６）。有意な単球性構成要素を有するＡＭＬ患者は、髄外疾患（Ｇａｎｚｅｌら、２０１６）および超白血球増多（ｈｙｐｅｒｌｅｕｋｏｃｙｔｏｓｉｓ）（末梢血中≧１００ｘ１０³／μＬ白血球と定義される）（ＲｏｌｌｉｇおよびＥｈｎｉｎｇｅｒ、２０１５）の証拠を有する。

［００２９６］ＬＩＬＲＢ４は、単球性分化を伴うＡＭＬ細胞（Ｄｅｎｇら、２０１８； Ｄｏｂｒｏｗｏｌｓｋａら、２０１３）およびＣＭＭＬ（Ｃｈｉｅｎら、２０１９）上に発現される。ＬＩＬＲＢ４の発現レベルは、単球性分化を伴うＡＭＬ芽球上では、正常単球と同等であるか、または最大１０倍、より高い可能性もある（Ｄｅｎｇら、２０１８）。さらに、機能的および免疫表現型的研究はどちらも、ＬＩＬＲＢ４が、単球性ＡＭＬ由来の白血病幹細胞によって発現されることを示唆する（Ｄｅｎｇら、２０１８）。

［００２９７］２００８年、ＡＺＡは、２０％～３０％骨髄（ＢＭ）芽球を有し、６４歳より高齢で、そして造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に不適格であるＡＭＬ患者の治療のため、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって認可された。専門センターの血液学者は、２００７年には早くも＞３０％ ＢＭ芽球を有するＡＭＬ患者をＡＺＡで治療し始めており、医師らが患者に最適なことを行っていると確信を持っていたことを示す。この仮定は、ＡＺＡ－ＭＤＳ－００１試験、ならびに癌および白血病Ｂ群プロトコルで得られた全生存（ＯＳ）の有意な改善に基づいており、この際、試験集団のそれぞれ３２％および３８％が、２０％～３０％ＢＭ芽球を伴うＡＭＬを有した。

［００２９８］２０１０年、新規に診断されたＡＭＬを有し、＞３０％ＢＭ芽球および≦１５ｘ１０⁹／Ｌ白血球（ＷＢＣ）数である６５歳より高齢のＡＭＬ患者において、慣用治療措置（ＣＣＲ）（治療する医師によってあらかじめ選択された、集中化学療法、低用量シタラビンまたは最適支持療法）に対してＡＺＡを試験する、国際第３相ランダム化ＡＺＡ－ＡＭＬ－００１臨床試験が開始された。この試験において、ＡＺＡ対ＣＣＲに関して、ＯＳの臨床的に意味のある改善（１０．４対６．５ヶ月；ｐ＝０．１００９）が報告された。さらに、全反応（完全寛解［ＣＲ］＋不完全血球回復を伴う完全寛解［ＣＲｉ］）率は、ＡＺＡ（２７．８％）およびＣＣＲ（２５．１％）アームで匹敵し（Ｐ＝０．５３８４）、そしてＡＺＡのＥＭＡ認可は、２０１５年１０月３０日、＞３０％ＢＭ芽球のＡＭＬ患者も含めるように拡大された。

［００２９９］特定の態様において、ＬＩＬＲＢ４関連状態または障害は、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である。
［００３００］ＣＭＭＬ診断分類は、臨床検査、形態学、細胞遺伝学、および可能な場合はいつでも、フローサイトメトリーに基づき、そして分子生物学を組み込んで、ＷＨＯ ２０１６カテゴリーにしたがって患者を分類すべきである。ＷＨＯ分類（Ａｒｂｅｒら、２０１６）には、末梢血中の＜２％芽球およびＢＭ中の＜５％芽球を伴う症例に関するＣＭＭＬ－０；末梢血中の２％～４％芽球およびＢＭ中の５％～９％芽球を伴う症例に関するＣＭＭＬ－１；ならびに末梢血中の５％～１９％芽球、ＢＭ中の１０％～１９％芽球を伴う、および／またはアウエル小体が存在する場合の症例に関するＣＭＭＬ－２が含まれる。

［００３０１］１３ｘ１０⁹／ＬのＷＢＣカットオフに基づき、ＦＡＢ分類によって最初に提唱された、「異形成」ＣＭＭＬおよび「増殖性」ＣＭＭＬの間の区別は、その臨床的特徴が異なり（血球減少対臓器肥大、高ＷＢＣ、および体質性症状）、そしてその結果、臨床管理が異なるため、依然、有用である。

［００３０２］髄外白血病には、脾腫および肝腫とは別に、主に特異的漿液浸出（胸水およびより頻繁でなく心膜液または腹水）および特異的皮膚浸潤が含まれ、これらはすべてより劣った予後と関連する。

［００３０３］ＶＩＤＡＺＡ（登録商標）（アザシチジン）は、以下のＦＡＢ骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）サブタイプ：難治性貧血または環状鉄芽球を伴う難治性貧血（好中球減少症または血小板減少症を伴うか、または輸血を必要とする場合）、過剰な芽球を伴う難治性貧血、形質転換した過剰な芽球を伴う難治性貧血、および慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）の患者の治療に示されるヌクレオシド代謝阻害剤である。

［００３０４］本開示は、試料中のＬＩＬＲＢ４の存在または量を検出するために、抗ＬＩＬＲＢ４抗体またはその抗原結合断片を用いる方法であって、試料を抗体またはその抗原結合断片と接触させ、そして試料中のＬＩＬＲＢ４の存在または量を決定する工程を含む、前記方法をさらに提供する。抗ＬＩＬＲＢ４抗体を用いてＬＩＬＲＢ４を検出する方法には、限定なしに、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳが含まれる。

［００３０５］いくつかの態様において、本開示は、被験体において、ＬＩＬＲＢ４関連疾患または状態を診断する方法であって：ａ）被験体から得られた試料を、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合断片と接触させ；ｂ）試料中のＬＩＬＲＢ４の存在または量を決定し；そしてｃ）ＬＩＬＲＢ４の存在を、被験体におけるＬＩＬＲＢ４関連疾患または状態と相関させる工程を含む、前記方法を提供する。

［００３０６］いくつかの態様において、本開示は、任意選択で検出可能部分とコンジュゲート化された、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合断片を含むキットを提供する。キットは、ＬＩＬＲＢ４の検出またはＬＩＬＲＢ４関連疾患の診断に有用でありうる。

［００３０７］いくつかの態様において、本開示はまた、被験体におけるＬＩＬＲＢ４関連疾患または状態を治療するための薬剤の製造における、ＬＩＬＲＢ４関連疾患または状態を診断するための診断試薬の製造における、本明細書に提供される抗体またはその抗原結合断片の使用も提供する。

［００３０８］Ｖ．キメラ抗原受容体
［００３０９］本開示は、別の側面において、ＬＩＬＲＢ４に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）タンパク質（ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲタンパク質）を提供する。特定の態様において、ＣＡＲタンパク質は、抗原認識領域、すなわち本明細書に記載されるようなＬＩＬＲＢ４を認識する抗体または抗原結合断片、ならびに他の膜および細胞内構成要素を含む。いくつかの態様において、ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲタンパク質は、ＬＩＬＲＢ４抗原認識領域、膜貫通ドメインおよび細胞内共刺激性シグナルドメインを含む。特定の態様において、一本鎖ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲタンパク質はまた、リーダーペプチド、スペーサー領域および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインも含む。

［００３１０］特定の態様において、抗原認識領域は多数のポリペプチド鎖を含む。
［００３１１］いくつかの態様において、ＣＡＲタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインを含む第一のポリペプチド、および抗体軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドを含み、ここで第一または第二のポリペプチドには膜貫通ドメインがさらに含まれ、そして抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインが共に、抗原認識領域を形成する。

［００３１２］いくつかの態様において、ＣＡＲタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインを含む第一のポリペプチド、ならびに抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む第二のポリペプチドを含み、ここで第一のポリペプチドには膜貫通ドメインがさらに含まれ、そして抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが共に、抗原認識領域を形成する。いくつかの態様において、第一の部分には、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインがさらに含まれる。

［００３１３］いくつかの態様において、ＣＡＲタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体重鎖定常ドメインを含む第一のポリペプチド、ならびに抗体軽鎖可変ドメインを含む第二のポリペプチドを含み、ここで第一のポリペプチドには膜貫通ドメインがさらに含まれ、そして抗体重鎖可変ドメイン、抗体重鎖定常ドメイン、および抗体軽鎖可変ドメインが共に、抗原認識領域を形成する。いくつかの態様において、第一の部分には、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインがさらに含まれる。

［００３１４］いくつかの態様において、ＣＡＲタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインを含む第一のポリペプチド、および抗体軽鎖可変ドメインを含む第二のポリペプチドを含み、ここで第二のポリペプチドには膜貫通ドメインがさらに含まれ、そして抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが共に、抗原認識領域を形成する。いくつかの態様において、第二の部分には、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインがさらに含まれる。

［００３１５］いくつかの態様において、ＣＡＲタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体重鎖定常ドメインを含む第一のポリペプチド、ならびに抗体軽鎖可変ドメインを含む第二のポリペプチドを含み、ここで第二のポリペプチドには膜貫通ドメインがさらに含まれ、そして抗体重鎖可変ドメイン、抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインが共に、抗原認識領域を形成する。いくつかの態様において、第二の部分には、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインがさらに含まれる。

［００３１６］特定の態様において、ＣＡＲタンパク質は、本明細書に記載されるような抗ＬＩＬＲＢ４ ｓｃＦｖ、すなわち、リンカードメインによって連結されている抗ＬＩＬＲＢ４重鎖可変ドメインおよび抗ＬＩＬＲＢ４軽鎖可変ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである。１つの態様において、ＣＡＲタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端に：リーダーペプチド、抗ＬＩＬＲＢ４重鎖可変ドメイン、リンカードメイン、抗ＬＩＬＲＢ４軽鎖可変ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激シグナルドメインが含まれる。１つの態様において、ＣＡＲタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端に：リーダーペプチド、抗ＬＩＬＲＢ４軽鎖可変ドメイン、リンカードメイン、抗ＬＩＬＲＢ４重鎖可変ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激シグナルドメインが含まれる。いくつかの態様において、ＣＡＲタンパク質には、ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインがさらに含まれる。

［００３１７］特定の態様において、リンカードメインは、一般的に、らせんおよび回転促進アミノ酸残基、例えばアラニン、セリンおよびグリシンで構成される。しかし、他の残基もまた機能しうる。いくつかの態様において、リンカードメインがｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの間に挿入される。いくつかの態様において、リンカードメインは、膜貫通ドメインおよび細胞内共刺激シグナル伝達ドメインの間にある。いくつかの態様において、リンカードメインは、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインおよび細胞内共刺激シグナル伝達ドメインの間にある。いくつかの態様において、リンカードメインは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７０）を含む。

［００３１８］いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、天然存在ＣＤ８α膜貫通ドメインポリペプチド（配列番号７１）に比較して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、ＣＤ８α膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、ＣＤ８α膜貫通ドメインは、配列番号７２の核酸配列によってコードされる。

［００３１９］いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、天然存在ＣＤ２８膜貫通ドメインポリペプチド（配列番号７３）に比較して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号７４の核酸配列によってコードされる。

［００３２０］細胞内共刺激シグナル伝達ドメインには、ＣＡＲへの抗原の結合に反応して、共刺激シグナル伝達を提供可能なアミノ酸配列が含まれる。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインのシグナル伝達は、サイトカインの産生、およびこうしたサイトカインを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞の増殖を生じる。いくつかの態様において、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢ細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳ細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ＯＸ－４０細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその任意の組み合わせである。いくつかの態様において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号７５のポリペプチド配列を有する。いくつかの態様において、ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７６の核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、４－１ＢＢ細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７７のポリペプチド配列を有する。いくつかの態様において、４－１ＢＢ細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７８の核酸配列によってコードされる。

［００３２１］「ヒンジ領域」は、本明細書に提供された際、抗原結合領域と膜貫通ドメインを連結するポリペプチドである。いくつかの態様において、ヒンジ領域は、重鎖可変領域と膜貫通ドメインを連結する。いくつかの態様において、ヒンジ領域は、重鎖定常領域と膜貫通ドメインを連結する。いくつかの態様において、ヒンジ領域は、軽鎖可変領域と膜貫通ドメインを連結する。いくつかの態様において、ヒンジ領域は、軽鎖定常領域と膜貫通ドメインを連結する。いくつかの態様において、抗原への抗原結合領域の結合アフィニティは、ヒンジ領域の非存在下と比較して、増加する。いくつかの態様において、抗原結合領域および抗原の間の立体障害は、ヒンジ領域の存在下で減少する。いくつかの態様において、ヒンジ領域はＣＤ８αヒンジ領域である。いくつかの態様において、ヒンジ領域はＣＤ２８ヒンジ領域である。

［００３２２］いくつかの態様において、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインには、ヒトＣＤ３複合体のゼータ（ζ）鎖のシグナル伝達ドメイン、すなわちＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが含まれる。いくつかの態様において、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を含むタンパク質ＣＤ３ｚＩｓｏ１である。いくつかの態様において、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号８１の核酸配列によってコードされる配列番号８０のアミノ酸配列を含むタンパク質ＣＤ３ｚＩｓｏ３である。

［００３２３］１つの例において、ＣＡＲタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に：ＣＤ８αリーダーペプチド、抗ＬＩＬＲＢ４ ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（またはＣＤ２８膜貫通ドメイン）、４－１ＢＢ細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（またはＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、またはＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、その後、４－１ＢＢ細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン）および２つのアイソフォーム（ＣＤ３ｚＩｓｏ１またはＣＤ３ｚＩｓｏ３）の１つのＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む、一本鎖ポリペプチドである。

［００３２４］特定の態様において、本明細書に提供されるＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲタンパク質は、ＬＩＬＲＢ４に対する高いアフィニティを示す。特定の態様において、本明細書に提供されるＣＡＲタンパク質は、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭまたは０．０５ｎＭ未満のＬＩＬＲＢ４に対する結合アフィニティ（ＥＬＩＳＡによって測定されるようなＥＣ₅₀）を有する。本出願の目的のため、ＥＬＩＳＡ ＥＣ₅₀値は、以下のように決定されうる。ＬＩＬＲＢ－４細胞外ドメインタンパク質（Ｃ末端に６ＨＩＳタグを含む）を、ＨＥＫ２９３細胞において組換え的に産生し、そして１μｇ／ｍｌ濃度（１００μｌ／ウェル）で、高結合９６ウェル透明プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｃｏｓｔａｒ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に４℃で１４～１６時間コーティングした。コーティングされたプレートを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で簡単に洗浄し、そしてＰＢＳ中の５％無脂肪ミルク２００μｌ／ウェルで、３７℃で２時間ブロッキングした。１０μｇ／ｍｌから始まり、そして１２段階で下方向に３倍滴定する、試験モノクローナル抗体（ＩｇＧまたはｓｃＦｖ断片）の連続希釈を、アッセイプレート上に蓋をして３７℃で４５分間インキュベーションすることによって、結合のため、９６ウェルプレートに添加した。次いで、プレートを、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％濃度）を含有するＰＢＳで３回、そしてＰＢＳで１回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲートを含む抗ヒトまたは抗ウサギ、または他の種のＩｇＧ特異的抗体の二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、製造者が示唆する希釈にしたがって、インキュベーションのため、室温で１時間添加した。ＨＲＰ基質、ＴＭＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を１０分間添加することによって、検出を行い、そして５０μｌ／ウェルの２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を添加することによって停止した。プレート読み取り装置（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４５０ｎｍの吸光度に関してプレートを読み取った。データを収集し、そしてＥＣ₅₀計算のため、ＧｒａｐＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアで４パラメータ適合曲線を用いてグラフを作成した。

［００３２５］別の側面において、本開示は、本明細書記載のＣＡＲタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド分子は、真核細胞において活性であるプロモーターをさらに含む。いくつかの態様において、プロモーターはＪｅＴプロモーターである。ＪｅＴプロモーターは、多くの強力な哺乳動物プロモーターに匹敵する転写活性を持つ組換えプロモーターである。ＪｅＴプロモーターは、５つの主要要素：（１）ＴＡＴＡボックス；（２）転写開始部位（Ｉｎｒ）；（４）ＣＡｒＧ要素と組み合わせられる（３）ＣＡＴコンセンサス配列；そして最後に（５）２つのタンデムに配置された４つのＳｐｌ転写結合部位（ＧＧＧＣＧＧ）からなる（ＵＳ２００２／００９８５４７ Ａ１）。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド分子は発現ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、ＣｌｏｎｔｅｃｈのｐＬＶＸ－ＥＦ１アルファ－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ、あるいはｐＳＩＮ－ＥＦ１アルファ－ＩＲＥＳ－ピューロマイシンまたはｐＳＩＮ－ＥＦ１アルファに基づく。１つの例において、本開示のポリヌクレオチド分子は、以下の要素を連続して含む：（１）ＪｅＴプロモーター；（２）ＣＤ８－アルファリーダーをコードする配列；（３）重鎖可変領域をコードする配列；（４）リンカーをコードする配列；（５）軽鎖可変領域をコードする配列；（６）ＣＤ８ヒンジおよびＴＭドメインをコードする配列；（７）４－１ＢＢ共刺激ドメインをコードする配列；（８）ＣＤ３－ゼータ活性化ドメインをコードする配列。１つの例において、上述の要素には、ポリヌクレオチド分子の、ターゲット遺伝子座、例えばＴ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座への挿入を促進する５’および３’相同アームが隣接する。

［００３２６］ＶＩ．抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲタンパク質を発現する操作細胞
［００３２７］別の側面において、本開示は、本明細書記載のＣＡＲタンパク質を発現する操作免疫細胞を提供する。免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはガンマ－デルタＴ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはマクロファージであってもよい。本明細書にやはり提供するのは、免疫細胞を産生しそして操作する方法、ならびに養子細胞療法のために細胞を使用しそして投与する方法であり、この場合、細胞は自己または同種であってもよい。したがって、操作免疫細胞は、免疫療法として、例えば癌細胞をターゲティングするために用いられてもよい。

［００３２８］ＣＡＲタンパク質の発現は、ターゲット細胞上に存在する抗原を認識することによって、ターゲット細胞、例えば癌細胞に操作免疫細胞が結合することを可能にする。ターゲット細胞への結合に際して、操作免疫細胞は活性化され、次いで増殖に進み、そして細胞傷害性となり、最終的にターゲット細胞を破壊する。ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法は、臨床試験において成功が示されてきており、そして米国ＦＤＡによって、難治性Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫を治療するために認可されている（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｊら， ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ （２０１７） ９：１１８３－９７）。ＣＡＲ－Ｔ細胞に加えて、免疫療法オプションとして、近年、ＣＡＲ ＮＫ細胞およびＣＡＲマクロファージが開発されてきている（Ｋｌｏｅｓｓ Ｓら， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ （２０１９） ４６：４－１３； Ｋｌｉｃｈｉｎｓｋｙ Ｍら， ＡＡＣＲ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１７， Ａｂｓｔｒａｃｔ ４５７５）。したがって、本開示の特定の態様において、本明細書記載のＣＡＲタンパク質を発現する免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージである。

［００３２９］免疫細胞は、被験体、特にヒト被験体から単離されてもよい。免疫細胞は、関心対象の被験体、例えば特定の疾患または状態を有すると推測される被験体、特定の疾患または状態に対する素因を有すると推測される被験体、特定の疾患または状態のために療法を経ている被験体、健康なボランティアまたは健康なドナーである被験体、あるいは血液バンクから得られてもよい。免疫細胞は、被験体中に存在するいかなる位置から収集されてもよく、こうした位置には、限定されるわけではないが、血液、臍帯血、脾臓、胸腺、リンパ節、および骨髄が含まれる。単離免疫細胞を直接用いてもよいし、またはある期間、例えば凍結によって保存してもよい。

［００３３０］限定されるわけではないが、血液（血液バンクまたは臍帯血バンクによって収集された血液を含む）、脾臓、骨髄、手術処置中に取り除かれたおよび／または曝露された組織、および生検法によって得られた組織を含む、免疫細胞が存在する任意の組織から、免疫細胞を濃縮／精製してもよい。免疫細胞を濃縮、単離、および／または精製する組織／臓器は、生存および非生存被験体のどちらから単離されてもよく、非生存被験体は臓器ドナーである。特定の態様において、免疫細胞は血液、例えば末梢血または臍帯血から単離される。いくつかの側面において、臍帯血から単離された免疫細胞は、例えばＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔ細胞抑制によって測定されるように、増進された免疫調節能を有する。特定の側面において、免疫細胞は、免疫調節能増進のため、プールされた血液、特に、プールされた臍帯血から単離される。プールされた血液は、２つまたはそれより多い供給源、例えば３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれより多い供給源（例えばドナー被験体）に由来してもよい。

［００３３１］免疫細胞集団は、療法を必要とするか、または免疫細胞活性減少に関連する疾患を患う被験体から得られてもよい。したがって、細胞は、療法が必要な被験体に対して自己であろう。あるいは免疫細胞集団は、ドナー、好ましくは組織適合性がマッチしたドナーから得られてもよい。免疫細胞集団は、末梢血、臍帯血、骨髄、脾臓、あるいは前記被験体またはドナーにおいて免疫細胞が存在する任意の他の臓器／組織から採取されてもよい。免疫細胞は、被験体および／またはドナーのプール、例えばプールされた臍帯血から単離されてもよい。

［００３３２］得られた細胞が被験体に導入可能である点で被験体適合性であることを条件に、免疫細胞集団が、被験体とは異なるドナーから得られる場合、ドナーは好ましくは同種である。同種ドナー細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性であってもまたはなくてもよい。被験体適合性となるため、同種細胞を処理して、免疫原性を減少させてもよい。

［００３３３］当該技術分野に知られる適切な修飾法を用いて、免疫細胞を遺伝子操作して、ＣＡＲを発現させてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ， １９９４を参照されたい。いくつかの態様において、免疫細胞は、遺伝子操作を通じて導入された、１つまたはそれより多いＣＡＲタンパク質がコードされた１つまたはそれより多い核酸を含む。特定の態様において、ＣＡＲタンパク質をコードする核酸は、遺伝子編集法、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を用いて、免疫細胞ゲノム中に挿入される。１つの例において、ＣＡＲタンパク質をコードする核酸は、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座で挿入される（例えば、Ｅｙｑｕｅｍ Ｊら， Ｎａｔｕｒｅ （２０１７） ５４３：１１３－１１７を参照されたい）。

［００３３４］やはり提供されるのは、本開示の免疫細胞の有効量を投与する工程を含む免疫療法のための方法である。いくつかの態様において、医学的疾患または障害を、免疫反応を誘発する本明細書記載の免疫細胞集団のトランスファーによって治療する。特定の態様において、医学的疾患または障害は癌である。特定の態様において、医学的疾患または障害は自己免疫または炎症性疾患である。

［００３３５］以下の実施例は、請求される本発明をよりよく例示するために提供され、そして本発明の範囲を限定すると解釈されてはならない。以下に記載するすべての特定の組成物、材料、および方法は、全体に、または部分的に、本発明の範囲内に属する。これらの特定の組成物、材料、および方法は、本発明を限定するとは意図されず、単に本発明の範囲内に属する特定の態様を例示することを意図される。当業者は、発明的能力の行使を伴わずに、そして本発明の範囲から逸脱することなく、同等の組成物、材料および方法を発展させうる。本明細書に記載される方法において、多くの変形を作製しうる一方で、なお本発明の範囲内に留まることが理解されるであろう。こうした変形が本発明の範囲内に含まれることを本発明者らは意図する。

実施例１
［００３３６］材料および方法
［００３３７］ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の方法は以下の通りである。試料濃度が１０．０ｍｇ／ｍＬを超える場合、ＳＥＣ分析前に可動相で試料を１０．０ｍｇ／ｍＬに希釈する。１００μｇの試料をカラム内に注入した。用いた装置は、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（７．８ｘ３００ｍｍ、５μｍ粒子サイズ）およびＵＶ検出装置（検出波長：２８０ｎｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣ系であった。可動相は、３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液であった（ｐＨ６．８±０．１）。１．０ｍＬ／分の流速で２０分間、均一濃度勾配を適用した。

［００３３８］画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）：２０μＬの参照標準または試料（１．０ｍｇ／ｍＬに希釈）を個々に、０．５μＬのｐＩ７．４０マーカー、０．５μＬのｐＩ９．７７マーカー、１．０μＬのＰｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０、３．０μＬのＰｈａｒｍａｌｙｔｅ ８－１０．５、３５μＬの１％メチルセルロース（ＭＣ）、３７．５μＬの８Ｍ尿素溶液、０．０７μＬの酢酸および２．５μＬの超純水で構成されるマスター混合物、～８０μＬと混合した。次いで、装填混合物を、ＦＣ－ＣＯＡＴＥＤ全カラム検出キャピラリーを装備したｉＣＥ３キャピラリー等電点電気泳動分析装置で分析した。電気泳動を２つの工程：（１）１．５ｋＶ、１分間；（２）３ｋＶ、８分間で行い、そしてオートサンプラートレイを１５℃で維持した。吸光度検出を２８０ｎｍで行った。分析後、生データをＥｍｐｏｗｅｒ ３でプロセシングした。

［００３３９］ＥＣ５０ ＦＡＣＳ：ヒトＬＩＬＲＢ４またはｆｌａｇタグ付けカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）ＬＩＬＲＢ４のいずれかを発現する安定ＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いて、Ｈ７Ｋ３抗体の安定性試料の結合能を決定した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞（１ｘ１０⁵）を連続滴定安定性試料で染色した後、蛍光コンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で二次染色した。幾何平均蛍光（ＭＦＩ）を測定し、そしてＰｒｉｓｍによってＥＣ₅₀を計算した。

［００３４０］ＥＣ５０ ＥＬＩＳＡ：ヒトＬＩＬＲＢ４ ＥＣＤ－ｈｉｓ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）またはカニクイザルＬＩＬＲＢ４ ＥＣＤ－ｈｉｓ組換えタンパク質（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に４℃で一晩コーティングした。５％無脂肪ミルクで、３７℃で２時間ブロッキングした後、１００μＬの連続希釈抗ＬＩＬＲＢ４抗体をウェル内に添加し、そして３７℃で４５分間インキュベーションした。続いて、プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄し、そしてＰＢＳで１回洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲート化抗ｈＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と室温で３５分間インキュベーションした。ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）でシグナルを発色させ、２Ｍ硫酸の添加によって停止した後、プレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍで読み取った。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用い、ＯＤ₄₅₀測定値に基づいて、ＥＣ₅₀を計算した。

［００３４１］ＡｐｏＥ阻害（ＩＣ５０）：活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）－ＧＦＰレポーター系と細胞外で連結された、ＬＩＬＲＢ４を発現するマウスＴハイブリドーマ細胞株を用いて、Ｈ７Ｋ３変異体のリガンドブロッキング能をスクリーニングした。ＬＩＬＲＢ４レポーター細胞（ウェルあたり２ｘ１０⁴）を、固定組換えＡＰＯＥ３タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎカタログ番号Ｃ１０２）１０μｇ／ｍＬと共培養し、ＡＰＯＥの受容体ＬＩＬＲＢ４への結合によってＧＦＰ発現を誘導し、そしてフローサイトメトリーを用いて、ＧＦＰシグナルを定量化した。連続滴定ＬＩＬＲＢ４ブロッキング抗体Ｈ７Ｋ３の存在下では、ＧＦＰ発現は用量依存方式で減少し、そしてフローサイトメトリーシグナルによって、ＩＣ₅₀を計算した。

［００３４２］自己ＡＤＣＣ：ＰＢＭＣを健康なドナーから新鮮に単離し、そして５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－２および連続滴定抗体の存在下で一晩培養した。蛍光コンジュゲート化抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３０３、および抗ＣＤ１２３抗体で細胞を染色し、そしてＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａによって獲得して、生存単球、ｐＤＣおよびＢ細胞を計数した。７－ＡＡＤを添加することによって、死細胞を排除した。殺細胞パーセントを、１００－［（抗体処理した細胞数）／（抗体処理していない細胞数）］として計算した。

［００３４３］ＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞のＡＤＣＣ：ＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞および新鮮に単離したＰＢＭＣを、５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－２および連続滴定抗体の存在下で一晩、共培養した（Ｅ：Ｔ比＝５０：１）。ＧＦＰ⁺および７－ＡＡＤ^-細胞に対してゲート処理することによって、生存ＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞数を得た。自己ＡＤＣＣと同じ式を用いて、殺細胞パーセントを計算した。

［００３４４］ＭＤＳＣのＡＤＣＣ：２人の異なる健康なドナー由来のＭＤＳＣおよびＮＫ細胞を調製した。ＰＢＭＣを、４０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦの存在下で、ＳＫＭＥＬ５細胞と８日間共培養することによってＭＤＳＣを生成し、そしてＣＤ３３＋マイクロビーズを用いて精製した。ＩＬ－２（１００ｎｇ／ｍＬ）をＮＫ細胞活性化のために添加した。５０，０００のＭＤＳＣおよび１２５，０００のＮＫ細胞を含むＭＤＳＣ：ＮＫ＝１：２．５（２つ組）を、２１時間共培養した。２１時間インキュベーションした後、細胞をＣＤ１４－ＦＩＴＣで染色した。ＴＨＰ－１－ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を、同じセッティングで陽性対照として用いた。自己ＡＤＣＣと同じ式を用いて、殺細胞パーセントを計算した。

［００３４５］ＡＤＣＰ：負の選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、健康なドナー由来のＰＢＭＣからヒト単球を単離し、そして５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、Ｘ－ｖｉｖｏ １０＋１０％ＦＢＳ培地中で７日間培養した。最後の２４時間、５０ｎｇ／ｍＬのインターフェロン・ガンマを添加して、マクロファージをプライミングした。ＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞（２．５ｘ１０⁴）を、連続滴定抗ＬＩＬＲＢ４抗体の存在下で、２４時間、マクロファージと共培養し（Ｅ：Ｔ＝５：１）、ＲＰＥコンジュゲート化抗ＣＤ１６３および抗ＣＤ２０６で染色した。ＧＦＰ⁺細胞に対してゲート処理することによって、フローサイトメトリーによって生存ＴＨＰ－１細胞を得た。ＴＨＰ－１細胞の絶対数およびＧＦＰ⁺％の両方に基づいて、殺細胞パーセントを計算した。

［００３４６］Ｔ細胞仲介性細胞傷害：ＦＡＣＳに基づくアプローチを用いて、抗ＬＩＬＲＢ４が、ナイーブＴ細胞による腫瘍細胞殺細胞を仲介する能力を決定した。ヒト・バフィーコートを健康なドナーから得て、そしてＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７－１４４０－０３）密度勾配細胞分離によって、バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ヒト汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０９６－５３５）を用いて、汎Ｔ細胞をＰＢＭＣからさらに単離した。４：１の比で、４ｘ１０⁵新鮮単離ヒト汎Ｔ細胞をエフェクター細胞として用い、そして１ｘ１０⁵ ＴＨＰ－１－ＧＦＰをターゲット細胞として用いた。ヒト汎Ｔ細胞、ＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞、および増加する濃度の抗ＬＩＬＲＢ４抗体またはアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌカタログ番号ＢＥ０２９７）を、総量２００μＬ中、ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏカタログ番号６１８７０－０３６）＋１０％熱不活化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１００８２－１４７）中、Ｕ型９６ウェルプレート中で混合し、そして３７℃で４８時間インキュベーションした。インキュベーション終了時、４０μＬの上清をサイトカインＬｕｍｉｎｅｘアッセイのために収集した。７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５９９２５）を細胞に添加し、そしてＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａによって１００μＬの細胞を獲得し、そしてＧＦＰ陽性細胞の割合を測定した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｆｌｏｗｊｏ ＬＬＣ）を用いて、フローサイトメトリーデータを分析し、そして細胞傷害性を：細胞傷害性パーセント＝１００－（［Ｔ／ＮＴ］ｘ１００）、式中、ＴおよびＮＴはそれぞれ、試験抗体を含みまたは含まずに処理したＧＦＰ⁺細胞の割合である、として計算した。

［００３４７］Ｌｕｍｉｎｅｘによるサイトカインアッセイ：カスタム１５重パネルキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、細胞上清を試験した。無壁プレートおよび１５重キットの試薬を用いたＤＡ Ｂｅａｄアッセイを実行するため、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓキットのプロトコルをわずかに修飾した。まず、ＤＡ Ｂｅａｄ無壁プレートを、１０μＬのＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、室温で３０分間ブロッキングした。続いて、自動洗浄ステーションＬＴ ＭＸ（Ｃｕｒｉｏｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＤＡ ＢｅａｄプレートをＰＢＳ中の０．１％ ＢＳＡ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（洗浄緩衝液）で１回洗浄した。各ウェルに、７．５μＬのプレミックス磁気ビーズを添加した。次いで、適切なウェルに７．５μＬの希釈試料、標準またはブランクを添加した。次いで、ＤＡ Ｂｅａｄプレートを、４の強度レベルで、アナログマイクロプレートＧｅｎｉｅ Ｓｈａｋｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ボヘミア）上で、およそ１０秒間ボルテックスした。ＤＡ Ｂｅａｄプレートを３ｍｍスパンの軌道振盪装置（Ｏｒｂｉｔ ３００、Ｌａｂｎｅｔ、ニュージャージー州エジソン）上に置き、そして１分あたり３５０回転（ｒｐｍ）（０．２ｘｇ）で１２０分間、室温で振盪した。次いで、ＤＡ ＢｅａｄプレートをＬＴ ＭＸ洗浄ステーションで３回洗浄した。用いたウェル各々に、１０μＬの検出抗体希釈液を添加した。続いて、ＤＡ Ｂｅａｄを、上述のように、アナログマイクロプレートｇｅｎｉｅ振盪装置上におよそ１０秒間置き、そして軌道振盪装置上、室温、３５０ｒｐｍで６０分間インキュベーションした。次いで、ＬＴ ＭＸステーションを用いて、ＤＡ Ｂｅａｄプレートを３回洗浄した。各ウェルに１０μＬのストレプトアビジン・フィコエリトリン希釈液を添加した。ＤＡ Ｂｅａｄプレートを、上述のように、Ｇｅｎｉｅ振盪装置上におよそ１０秒間置き、そして軌道振盪装置上、室温、３５０ｒｐｍで３０分間インキュベーションした。ＬＴ ＭＸステーション中で、ＤＡ Ｂｅａｄプレートを３回洗浄した。ビーズを総体積６５μＬの洗浄緩衝液に再懸濁し、そしてスカート型ＰＣＲプレートに移し、そしてデータ獲得のため、Ｌｕｍｉｎｅｘ読み取り装置中で読み取った（ＭＡＧＰＩＸ、二重レーザーフローに基づく検出装置、Ｌｕｍｉｎｅｘ）。

［００３４８］共培養Ｔ細胞およびＴＨＰ－１細胞のＦＡＣＳ分析：ヒト・バフィーコートを健康なドナーから得て、そしてＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７－１４４０－０３）密度勾配細胞分離によって、バフィーコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ヒト汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０９６－５３５）を用いた負の枯渇によって、汎Ｔ細胞を凍結ＰＢＭＣからさらに単離した。８：１の比で、８ｘ１０⁵精製ヒト汎Ｔ細胞をエフェクター細胞として用い、そして１ｘ１０⁵ ＴＨＰ－１－ＧＦＰをターゲット細胞として用いた。ヒト汎Ｔ細胞、ＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞、および抗ＬＩＬＲＢ４抗体またはアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌカタログ番号ＢＥ０２９７）を、総量２００μＬ中、Ｘ－ｖｉｖｏ １０（Ｌｏｎｚａカタログ番号０４－３８０Ｑ）＋１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏカタログ番号１００８２－１４７）中、Ｕ型９６ウェルプレート中で混合し、そして３７℃で４８時間インキュベーションした。抗ＬＩＬＲＢ４抗体またはヒトＩｇＧ１の最終濃度は３μｇ／ｍＬ（２０ｎＭ）であった。細胞内ＴＮＦαおよびＩＦＮγ産生を測定するため、タンパク質輸送阻害剤（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５５０２９）を、インキュベーションの最後の１１時間に添加した。インキュベーション終了時、タンパク質輸送阻害剤を含有する培地から細胞を回転して落とし、そしてヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｉ４５０６）と室温で１０分間インキュベーションして、Ｆｃ受容体をブロッキングした。次いで、細胞を、直接コンジュゲート化された抗ＣＤ４（カタログ番号５６４９７５）および抗ＣＤ８（カタログ番号５６３２５６）で表面抗原に関して染色し、固定／透過処理キット（カタログ番号５５５０２８）を用いて、固定し、そして透過処理し、そして抗ＩＦＮγ（カタログ番号５５４５５２）および抗ＴＮＦα（カタログ番号５５４５１４）またはアイソタイプ対照抗体（カタログ番号５５４６８１、５５５７４９）で染色した。表面および細胞内抗原に対する抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙのものである。

［００３４９］Ｔ細胞およびＴＨＰ－１細胞活性化のＦＡＣＳ分析：Ｔ細胞活性化マーカーの表面発現を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの直接コンジュゲート化された抗ＣＤ４（カタログ番号５６４９７５）、抗ＣＤ８（カタログ番号５６３２５６）、抗ＣＤ６９（カタログ番号５５５５３３）、および抗ＣＤ２５（カタログ番号５５５４３２）抗体で評価した。ＴＨＰ－１細胞マーカーの表面発現を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの直接コンジュゲート化された抗ＨＬＡ－ＤＲ（カタログ番号５５９８６６）、抗ＣＤ８０（カタログ番号５６３０８４）、抗ＣＤ８３（カタログ番号５６５３３６）、抗ＣＤ８６（カタログ番号５６２４３２）、抗ＣＤ２０５（カタログ番号５５８１５６）、抗ＣＤ８７（カタログ番号７４３０９６）、およびＢｉｏｌｅｇｅｎｄの抗ＣＤ４０（カタログ番号３３４３１０）、抗ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ（カタログ番号３１１４０６）、抗ＬＩＬＲＢ４（カタログ番号３３３００８）で評価した。７－アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５９９２５）を細胞に添加した後、ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａによって細胞を獲得した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｆｌｏｗｊｏ ＬＬＣ）を用いてフローサイトメトリーデータを分析し、そしてＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによってグラフ化した。

［００３５０］ＣＡＲコード断片のためのＰＣＲ断片：Ｖｅｎｔｉサーモサイクラーを用い、以下の条件：９８℃で３０秒、（９８℃で１０秒、６４℃で５秒、７２℃で３０秒）ｘ３５周期、７２℃で７分を用いて、ＰＲＩＭＥＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｒ０１０Ｂ）でＰＣＲを行った。ＰＣＲクリーンナップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ７４０６０９．２５０）を用いて、ＰＣＲ産物をさらに精製し、そして溶出されたＤＮＡを、エタノール沈殿によって、さらに洗浄／濃縮した。

［００３５１］遺伝子ターゲティング：本発明者らはＴｒａｎｓＡｃｔを用いて、まずＴ細胞を活性化し、次いで、エレクトロポレーション前に、ＴｒａｎｓＡｃｔを洗い流した。ＰＢＭＣをＴｒａｎｓＡｃｔ活性化した７２時間後、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを磁気的に取り除き、そしてネオントランスフェクション系（ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ、１０μｌチップ）を用いて、５μｇおよび１００ｐｍоｌ／ｌ ＲＮＡ二重鎖でＴ細胞をトランスフェクションした。４×１０⁵細胞を、ＲＮＰ複合体、およびＣＡＲをコードする２．５μｇ ＰＣＲ断片と混合した。エレクトロポレーション後、細胞を培地内に希釈し、そして３７℃、７％ＣＯ２でインキュベーションした。続いて、編集された細胞を、標準条件（３７℃、および１ｍｌあたり～１×１０⁶細胞の密度を維持するために必要であるように２～３日ごとに培地を補充しながら、Ｔ細胞増殖培地中で増殖）を用いて培養した。

［００３５２］ＴＣＲアルファＫＯ Ｔ細胞：ヒト初代Ｔ細胞を、ＴＲＡＣの第一エクソンの５’端をターゲティングするガイドＲＮＡを含み、そして相同組換えに基づくノックインのためのＤＮＡテンプレートを供給されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体でトランスフェクションした。ＴＣＲアルファをノックアウトした後、ＩＬ－２ ３００ＩＵ／ｍｌを含み、そして抗ＣＤ３／２８が添加されていない完全Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ培地中で細胞を増殖させた。トランスフェクション後、細胞を培養中で２週間増殖させた。

［００３５３］ＣＡＲ－Ｔ形質導入のフローサイトメトリーアッセイ：ＬＩＬＲＢ４－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＤＫ－Ｈ５２５９）および抗Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｂ２７８６５２）に結合することによって、ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔを同定した。内因性ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子座のノックアウトの成功（ＫＯ）を、抗ＣＤ３染色（抗ＣＤ３ ＰＥ、ＢＤ ５５５３３３）によって測定した。

［００３５４］抗原刺激アッセイ：ＰＢＳ緩衝液中、１μｇ／ｍｌ組換え対照抗原またはＬＩＬＲＢ４抗原を９６ウェルプレート上に一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。培地（いかなるサイトカインも添加されていない）中、１Ｘ１０⁵ ＣＡＲ－Ｔ細胞を各ウェルに添加し、そして７２時間インキュベーションした。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＦＣＳＴＭ－１８）によるサイトカイン放出測定のため、細胞培養上清を収集した。

［００３５５］ＣＡＲ－Ｔ細胞仲介性細胞傷害アッセイ：ＣＨＯ Ｋ１ ＲＢ４細胞を異なる密度で（６Ｘ１０⁴、２Ｘ１０⁴または７Ｘ１０³）１２時間植え付けた。１Ｘ１０⁵ ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加し、そして上清ＣＡＲ－Ｔ細胞を除去し、そしてプレートをＰＢＳで２回洗浄することによって、細胞傷害性を測定した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＴＧ２．０発光キットによって、総生存接着ＣＨＯ Ｋ１ ＲＢ４細胞を測定し、そして各条件の発光シグナルを、同じＥ：Ｔ比で活性化されたＴ細胞対照で割ることによって、％細胞傷害性を計算した。

［００３５６］第１相設計：パート１Ａ単独療法増大期（第１日に単一用量）中、患者を抗ＬＩＬＲＢ４単独療法の増加する用量の連続コホートに登録する。パート１Ａの目的は、抗ＬＩＬＲＢ４単独療法（ＭＴＤ１）の最大許容用量（ＭＴＤ）を決定することである。処置の最初の１４日間（アザシチジンと組み合わせた抗ＬＩＬＲＢ４の最初の用量の前）、すなわち抗ＬＩＬＲＢ４の最初の用量間隔に、ＭＴＤ１のＤＬＴを評価する。最初の用量増大は、加速滴定設定で始まり、その後、３＋３設計を用いる標準増大期が続く。パート１には、上述のような、再発性および／または難治性骨髄単球性（Ｍ４）および単球性／単芽球性（Ｍ５）ＡＭＬ患者ならびに慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）患者の両方が含まれるであろう。抗ＬＩＬＲＢ４のこの２週間の単独療法導入（ｌｅａｄ－ｉｎ）（「ウィンドウ」）は、単独療法として、ＬＩＬＲＢ４を特異的にターゲティングするモノクローナル抗体の影響の研究を可能にする。パート１Ｂ中（第１５日に開始）、パート１Ａ中でＤＬＴを伴わない患者には、標準用量のアザシチジン（７５ｍｇ／ｍ2皮下、２８日ごとに７日間）と組み合わせた、パート１Ａ中で投与されたものと同じ用量の抗ＬＩＬＲＢ４が投与される。アザシチジンと組み合わせた抗ＬＩＬＲＢ４のＭＴＤ（ＭＴＤ２）は、２８日間のＤＬＴウィンドウで決定され、このウィンドウは１４日間の単独療法および１４日間の組み合わせ治療からなる。パート１の全体のＤＬＴ期間（パート１Ａおよびパート１Ｂを合わせたもの）は、２８日間である。続くサイクルは、アザシチジンと組み合わせた抗ＬＩＬＲＢ４であろう。

実施例２
［００３５７］本発明者らは以前、ヒトＬＩＬＲＢ４に対する高い結合アフィニティを有し、そして異種移植ＡＭＬマウスモデルにおいて癌の発展を阻害可能である、Ｂ４－１９３と称されるウサギ抗ＬＩＬＲＢ４抗体を同定した（米国仮出願第６２／７３０，７１５号を参照されたい。該文献の開示はその全体が本明細書に援用される）。

［００３５８］本発明者らは、Ｂ４－１９３と同じＣＤＲを含有するヒト化抗ＬＩＬＲＢ４抗体を生成した。Ｈ７Ｋ３と称されるヒト化抗ＬＩＬＲＢ４抗体は、配列番号１の重鎖可変領域配列および配列番号３の軽鎖可変領域配列を有する。

［００３５９］Ｈ７Ｋ３のコンピュータ分析によって、該抗体が重鎖ＣＤＲ３中のアミノ酸残基Ｗで潜在的な酸化部位を、そして軽鎖ＣＤＲ１中のアミノ酸残基ＮＳで潜在的な脱アミド化部位を有し、これは潜在的に抗体の安定性を減少させうることが示された。

［００３６０］本発明者らは次いで、ＰＢＳまたは配合緩衝液中、４０℃で、抗Ｈ７Ｋ３の安定性を評価したが、この結果を表２および３に要約する。結果によって、抗Ｈ７Ｋ３は不安定であることが示される。

［００３６１］表２． ＰＢＳ中のＨ７Ｋ３安定性

［００３６２］表３． 配合緩衝液中のＨ７Ｋ３の安定性

実施例３
［００３６３］Ｈ７Ｋ３を再操作して、脱アミノ化および酸化傾向を修正するため、本発明者らは、潜在的な酸化部位および脱アミノ化部位で突然変異を有する一連の変異体を生成した。Ｈ７Ｋ３変異体の配列を表４に要約する。

［００３６４］表４． Ｈ７Ｋ３変異体

［００３６５］本発明者らは、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＬＩＬＲＢ４を発現するＣＨＯ安定細胞を用いて、ＦＡＣＳを通じて、Ｈ７Ｋ３変異体の結合アフィニティを試験した。結果を以下の表５に要約する。

［００３６６］表５． Ｈ７Ｋ３変異体の結合アフィニティ

［００３６７］本発明者らは、Ｈ７Ｋ３変異体の安定性をさらに試験した。以下の表６に要約するように、４０℃でのインキュベーションを伴わない対照試料に比較して、４０℃で４週間インキュベーションした後、Ｈ７Ｋ３において酸化種が観察された（マッピング結果によって確認）。Ｈ７Ｋ３ｍ５では、４０℃で４週間インキュベーションした後、明らかな酸化は観察されなかった。Ｈ７Ｋ３ｍ５はＨ７Ｋ３よりもより安定であると結論付けることが可能である。

［００３６８］表６． Ｈ７Ｋ３およびＨ７Ｋ３ｍ５の脱グリコシル化還元質量（ＤＲＭ）結果の比較

［００３６９］本発明者らは、Ｈ７Ｋ３変異体の安定性をさらに試験した。４０℃でインキュベーションしなかった対照試料に比較して、４０℃で４週間インキュベーションした後、Ｈ７Ｋ３の主ピークで約～５０％の減少が観察された。対照に比較して、４０℃で４週間インキュベーションした後、Ｈ７Ｋ３ｍ５では、主ピークで約１６％の減少が観察された。Ｈ７Ｋ３ｍ５はＨ７Ｋ３よりもより安定であると結論付けることが可能である。

［００３７０］表７． Ｈ７Ｋ３およびＨ７Ｋ３ｍ５のｉｃＩＥＦ結果の比較

［００３７１］光曝露下でＨ７Ｋ３ｍ５の有意な酸化は検出されなかった。光曝露したＨ７Ｋ３ｍ５に関して、ＤＲＭおよびペプチドマッピング結果の間の一貫性が得られた。結果は、Ｈ７Ｋ３ｍ５が、酸化環境（光）下で、許容されうる安定性を示すことを示した。

［００３７２］４０℃で４週間インキュベーションした後のＨ７Ｋ３ｍ５に関しては、ＤＲＭ結果は、有意な酸化がないことを示した。Ｈ７Ｋ３ｍ５は、ＤＲＭおよびｉｃＩＥＦ結果に関して、Ｈ７Ｋ３より、より安定であるようである。ｉｃＩＥＦは、低い比であっても、酸化および脱アミド化を監視可能である。

実施例４
［００３７３］本実施例は、Ｈ７Ｋ３ｍ５の生物学的機能を例示する。
［００３７４］本発明者らはまず、Ｈ７Ｋ３ｍ５が、細胞表面上に発現されたＬＩＬＲＢ４に結合するかどうかを評価した。図３に示すように、Ｈ７Ｋ３ｍ５は、ＴＨＰ－１－ＧＦＰ細胞上に発現されたＬＩＬＲＢ４を認識した。Ｈ７Ｋ３ｍ５は、図４に示すように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＢＭＣの存在下、ＴＨＰ－１細胞に対するＡＤＣＣ活性を誘導可能である。特に、無フコシル化Ｈ７Ｋ３ｍ５は、野生型Ｈ７Ｋ３ｍ５に比較して、増進された殺細胞を示し、ＥＣ５０は１００倍以上増進された。図５に示すように、Ｈ７Ｋ３ｍ５はまた、ヒト単球および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）上に発現されたＬＩＬＲＢ４にも結合する。

［００３７５］図６に示すように、ヒト単球におけるＬＩＬＲＢ４発現は、ＩＬ－１０およびＩＦＮα処理によって上方制御されうる。負の選択によって、ヒト単球をヒトＰＢＭＣから単離し、そして１０％ＦＢＳおよび１ｘＬ－グルタミンを含むＲＰＭＩ培地中、５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１０に加えて１５００Ｕ ＩＦＮαによって２４時間刺激した。ＣＤ１４－ＰＥおよび２μｇ／ｍｌの抗ＬＩＬＲＢ４－ＡＰＣによって細胞を染色した。

［００３７６］一方で、ＬＰＳによって処理されたヒト単球は、ＬＩＬＲＢ４発現を下方制御し、そしてｕＰＡＲ発現レベルを増加させた（図７）。
［００３７７］図８Ａおよび８Ｂに示すように、ＬＩＬＲＢ４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化ヒトマクロファージ上で発現される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ単球由来ヒトマクロファージ上のＬＩＬＲＢ４のコピー数は非常に高く、１５０，０００コピー／細胞に近い。

［００３７８］図９に示すように、ＬＩＬＲＢ４発現は、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）において非常に増加する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化ＭＤＳＣ上のＬＩＬＲＢ４のコピー数は、２００，０００コピー／細胞もの高さになりうる。

［００３７９］図１０Ａ～１０Ｂに示すように、ＬＩＬＲＢ４はまた、ヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ）上でも高発現される。ＬＩＬＲＢ４レベルは、高い方から低い方に、以下の順で見られる：免疫寛容原性ＤＣ＞活性化ＤＣ＞未成熟ＤＣ。

［００３８０］表８． ヒト初代細胞およびＡＭＬ細胞株の異なるタイプ上でのＬＩＬＲＢ４のコピー数の比較

［００３８１］本発明者らは次いで、マクロファージ浸潤に関して高いシグナルおよび低いシグナルを持つ固形腫瘍試料間で、ＬＩＬＲＢ４ ｍＲＮＡ発現レベルを比較した。コンピュータ生物学および統計学アプローチを用いて、ＴＣＧＡデータベース由来のＲＮＡ配列決定を分析して、各腫瘍タイプ内で、腫瘍関連マクロファージによって主に発現される多数の転写物の協調上方制御発現（集合的に、マクロファージ遺伝子発現「シグネチャー」を定義する）を示す試料を同定した。マクロファージ遺伝子発現「シグネチャー」に関して高シグナルを示す試料を、腫瘍関連マクロファージによって非常に浸潤されていると分類した。次いで、ＬＩＬＲＢ４転写物の発現レベルを、これらの腫瘍試料、およびマクロファージ遺伝子発現「シグネチャー」が見られない残りの試料（低マクロファージ浸潤試料とグループ分けされる）の間で比較した。図１１に示すように、より高いＬＩＬＲＢ４ ｍＲＮＡ発現レベルは、マクロファージ浸潤と相関する。

［００３８２］本発明者らは次いで、固形腫瘍において、ＬＩＬＲＢ４抗体（Ｈ７Ｋ３ｍ５）によって結合される細胞タイプを決定した。機械的方法およびＰＢＳ－１０ｍＭ ＥＤＴＡを用いて、固形腫瘍由来の組織試料を単細胞に分離した。いくつかの場合、末梢血試料もまた腫瘍組織試料と同じドナーから得て、そして標準法を用いて、フローサイトメトリー分析のためにプロセシングした。標準法を用いて、生じた細胞をＨ７Ｋ３ｍ５および骨髄細胞マーカーの抗体カクテルと４℃でインキュベーションし、そして染色された試料をフローサイトメトリーによって分析した。腫瘍試料におけるゲート処理は以下の通りであった。骨髄樹状細胞（ＤＣ、ＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ１５^-ＣＤ１４^-ＨＬＡ－ＤＲ⁺ＣＤ１１ｃ⁺）、ＨＬＡ－ＤＲ高腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）／単球（ＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ１５^-ＣＤ１４⁺ＨＬＡ－ＤＲ⁺）、ＨＬＡ－ＤＲ低 ＴＡＭ／単球性骨髄由来サプレッサー細胞（Ｍ－ＭＤＳＣ、ＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ１５^-ＣＤ１４⁺ＨＬＡ－ＤＲ^-）、ＰＭＮ－ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ１５⁺ＣＤ１４^-）。末梢血におけるゲート処理は以下の通りであった：骨髄ＤＣ（ＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ１４^-ＣＤ１１ｃ⁺）、単球（ＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ１４⁺ＨＬＡ－ＤＲ高）、Ｍ－ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ１４⁺ＨＬＡ－ＤＲ低）、ＰＭＮ－ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ⁺ＣＤ１５⁺ＣＤ１４^-ＨＬＡ－ＤＲ^-Ｌｏｘ－１⁺）。図１２Ａ～１２Ｂに示すように、これらの実験の結果は、Ｈ７Ｋ３ｍ５が、腫瘍微小環境および末梢において、単球性骨髄細胞に結合する（が顆粒球性骨髄細胞には結合しない）ことを示す。この知見は、単球細胞系譜の骨髄細胞に制限される、ＬＩＬＲＢ４の発現パターンと一致する。

［００３８３］ＬＩＬＲＢ４は、初代正常単球細胞上に発現されるが、Ｈ７Ｋ３ｍ５の結合は、ＡＤＣＣを通じた単球殺細胞は生じなかった（図１３Ａ～１３Ｄ）。無フコシル化Ｈ７Ｋ３ｍ５では、ＡＤＣＣによる正常単球殺細胞は、試験したＰＢＭＣドナーの２５～５０％で観察された（図１４Ａ～１４Ｄ、および図１５Ｃ～１５Ｄ）。さらに、図１５Ａ～１５Ｂに示すように、無フコシル化および野生型両方のＨ７Ｋ３ｍ５は、自己ＡＤＣＣを通じてｐＤＣの殺細胞を生じた。一方で、単球は、ドナーに応じて、無フコシル化Ｈ７Ｋ３ｍ５でのみ殺されることが可能である（図１５Ｃ～１５Ｄ）。

［００３８４］図１６Ａおよび１６Ｂに示すように、抗ＬＩＬＲＢ４抗体、例えばＨ７Ｋ３ｍ５は、ＡＤＣＣを通じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来（腫瘍細胞条件化）骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を枯渇させた。これは、固形腫瘍の治療において、抗ＬＩＬＲＢ４が作用する潜在的な機構である。

［００３８５］ＡＤＣＣに加えて、野生型Ｈ７Ｋ３ｍ５はまた、ＴＨＰ－１細胞に対するＡＤＣＰを通じても殺細胞を示した（図１７Ａ～１７Ｂ）。
［００３８６］抗ＬＩＬＲＢ４抗体はまた、腫瘍細胞に対するＴ細胞仲介性細胞傷害もまた増進させる。図１８に示すように、抗ＬＩＬＲＢ４は、ＡＭＬ細胞株ＴＨＰ－１－ＧＦＰに対するＴ細胞細胞傷害性を誘導しうる一方、アイソタイプ対照抗体では、いかなるＴ細胞細胞傷害性も観察されなかった。Ｈ７Ｋ３ｍ５処理は、用量依存方式で、ナイーブＴ細胞がＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞を殺すよう誘導した。平均ＥＣ５０は、０．２０８±０．１２５ｎＭ（３１．２±１８．８ｎｇ／ｍＬ）（ｎ＝３）であった。

［００３８７］細胞傷害アッセイ試料の上清からの、多重Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによるサイトカイン測定は、対照試料に比較して、Ｈ７Ｋ３ｍ５処理試料において、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの用量依存性増加を示した（図１９）。サイトカインプロファイル変化は、ＴＨＰ－１細胞定量化によって測定される殺細胞活性増加と一致した（図１８）。活性化細胞傷害性Ｔ細胞によって産生される可能性が高いＴＮＦαおよびＩＦＮγレベルの増加に加えて、単球およびマクロファージによって産生されることが知られるＭＣＰ－１およびＩＬ－１Ｒαの用量依存性増加もまた観察され、これは活性化されたＴＨＰ－１細胞からである可能性が高い。ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０レベルもまた、対照に比較して、Ｈ７Ｋ３ｍ５処理に反応して増加した。これらのサイトカインは活性化Ｔ細胞およびＴＨＰ－１細胞の両方に由来する可能性が高い。

［００３８８］フローサイトメトリーによってＴ細胞活性化マーカーを評価した（図２０を参照されたい）。ＣＤ６９発現Ｔ細胞の２倍より高い割合が、Ｈ７Ｋ３ｍ５処理で観察された（図２０Ａ）。ここでは、Ｈ７Ｋ３ｍ５で処理されたＣＤ４＋ Ｔ細胞の４．７％およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の２３．６％がＣＤ６９を発現する一方、アイソタイプ対照で処理されたＣＤ４＋Ｔ細胞の２．６％およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の１２．２％のみが、ＣＤ６９を発現した。Ｔ細胞を単独で培養した場合、Ｈ７Ｋ３ｍ５処理によるＣＤ６９＋ Ｔ細胞の増加はなかった。Ｈ７Ｋ３ｍ５は、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞増加には、穏やかな影響しか持たなかった（図２０Ｂ）。

［００３８９］共培養Ｔ細胞およびＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞におけるサイトカイン産生もまた、フローサイトメトリー用の細胞内染色によって評価した。アイソタイプ対照に比較して、Ｈ７Ｋ３ｍ５処理は、ＩＦＮγおよびＴＮＦα産生ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を、それぞれ、２．７倍および３４倍増加させた（図２０Ｃ）。ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞は、Ｈ７Ｋ３ｍ５処理で２倍および４倍増加し、そしてＩＦＮγはＴＨＰ－１細胞によっては産生されなかった（図２０Ｄ）。対照的に、ＴＮＦα産生ＴＨＰ－１細胞は、Ｔ細胞と共培養された場合、Ｈ７Ｋ３ｍ５処理で３倍増加した（図１８Ｅ）。Ｔ細胞を伴わないと、ＴＨＰ－１細胞のみに対するＨ７Ｋ３ｍ５処理は、ＴＮＦα産生ＴＨＰ－１細胞の増加を生じなかった。これらのデータは、ＩＦＮγが活性化Ｔ細胞によってのみ産生され、そしてＴＮＦαは活性化Ｔ細胞およびＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞の両方によって産生されることを示した。

［００３９０］総合すると、Ｈ７Ｋ３ｍ５は、ＴＨＰ－１細胞および活性化Ｔ細胞の抗原提示を増進し、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを産生した。
［００３９１］Ｔ細胞仲介性細胞傷害増進の提唱される機構は、抗ＬＩＬＲＢ４ブロッキング抗体でのＬＩＬＲＢ４阻害性受容体シグナル伝達の遮断、ＴＨＰ－１細胞によるアルギナーゼ産生の減少、ＴＨＰ－１細胞によるサイトカインの産生（図１９および２０）、およびＴＨＰ－１の抗原提示能の増進（図２１）からなる。図２１に示すように、ＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞およびナイーブＴ細胞を、１．５μｇ／ｍＬ（１０ｎＭ）のＨ７Ｋ３ｍ５またはヒトＩｇＧ１の存在下で、４：１のＥ：Ｔ比で、３７℃で４８時間共培養した。フローサイトメトリーによって、Ｔ細胞およびＴＨＰ－１細胞活性化マーカーを評価した（図２１）。ＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞上で、すべての実験において、共刺激分子ＣＤ８３の穏やかな上方制御が検出された。各実験は、異なるドナー（ｎ＝４）由来の汎Ｔ細胞を用いた。ＭＨＣクラスＩＩ分子ＨＬＡＤＲ（ｎ＝３）、ＭＨＣクラスＩ分子（ｎ＝１）、および別の共刺激分子ＣＤ８６（ｎ＝２）の穏やかな上方制御もまた、ＴＨＰ－１細胞上で検出された。これらのデータは、Ｈ７Ｋ３ｍ５処理が、ＴＨＰ－１の抗原提示活性を増進させることを示す。Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９は、Ｈ７Ｋ３ｍ５処理によって中程度に誘導され（ｎ＝１）、これは細胞傷害活性の増加と一致する。総合すると、ＴＨＰ－１の抗原提示の増進は、Ｔ細胞活性化を誘発し、そして細胞傷害活性の増進を導きうる。

［００３９２］ＴＨＰ－１細胞を、Ｈ７Ｋ３ｍ５の存在下でナイーブＴ細胞と同時培養すると、Ｈ７Ｋ３ｍ５は、ＴＨＰ－１に対するＴ細胞傷害性を活性化する（図２０）。この活性における両細胞タイプに対する変化をさらに理解するため、ナイーブＴ細胞およびＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞を、３μｇ／ｍｌ（２０ｎＭ）のＨ７Ｋ３ｍ５またはヒトＩｇＧ１の存在下、８：１のＥ：Ｔ比で、３７℃で４８時間共培養した。ＴＨＰ－１活性化をフローサイトメトリーによって評価した（図２２）。ＨＬＡクラスＩ（Ａ、Ｂ、Ｃ）およびクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ）、共刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ８０、およびＣＤ８３の発現は、Ｈ７Ｋ３ｍ５処理によって誘導され、Ｈ７Ｋ３ｍ５がＴＨＰ－１細胞の抗原提示機能を増進することが示された。対照的に、阻害性分子ＣＤ２０５およびＬＩＬＲＢ４の発現は、Ｈ７Ｋ３ｍ５によって減少しなかった。興味深く、そして予期せぬことに、Ｈ７Ｋ３ｍ５処理はまた、ＬＩＬＲＢ４の下流のＮＦ－κＢターゲットであり、単球性ＡＭＬ細胞で高発現され、そして癌浸潤、転移、生存および血管形成を促進することが周知である（Ｄｅｎｇら、２０１８）ｕＰＡＲの発現も増加させた。

［００３９３］ＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞をナイーブＴ細胞と共培養した際、Ｔ細胞活性化および細胞傷害性は観察されなかった。これはおそらく、ＬＩＬＲＢ４高発現を有するＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞の抗原提示機能が損なわれたためである。Ｈ７Ｋ３ｍ５を共培養ＴＨＰ－１およびナイーブＴ細胞に添加すると、ＴＨＰ－１細胞の増進された抗原提示機能は、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ３８発現増加によって実験的に観察された。ナイーブＴ細胞の活性化が対応して観察され、特にＴＨＰ－１細胞に対する細胞傷害性活性化が見られた。これは、組織培地中のサイトカイン（すなわちＴＮＦαおよびＩＦＮγ）の分泌増加によって実証される。これらのデータは、Ｈ７Ｋ３ｍ５がＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞に対するＴ細胞細胞傷害を活性化させうることを示す。

［００３９４］Ｈ７Ｋ３ｍ５によって仲介されるナイーブＴ細胞による正常単球の細胞傷害性をまた、このｉｎ ｖｉｔｒｏ系でも評価したが、正常単球の殺細胞は観察されなかった（データ未提示）。正常単球上のＬＩＬＲＢ４密度は、ＴＨＰ－１ ＡＭＬ細胞上のものより１０倍低く、より重要なことに、正常単球の抗原提示能は、腫瘍関連抗原を欠くため、腫瘍ＡＭＬ細胞のものより有意により低いと予期される。本発明者らは患者ＡＭＬ細胞が正常単球上のものと類似かまたは高レベルのＬＩＬＲＢ４を発現可能であることを見出したが、ＡＭＬ芽球が表現型的によりＴＨＰ－１細胞様であり、そしてＨ７Ｋ３ｍ５で処理された際、活性化Ｔ細胞によって殺されうることは妥当と考えられる。

［００３９５］次いで、本発明者らは、単球から分化した樹状細胞（Ｍｏ－ＤＣ）に対するＨ７Ｋ３ｍ５の影響を試験した。古典的単球を健康なドナーＰＢＭＣから単離し、そしてＤＣ培地（ＳｔｅｍＸＶｉｖｏ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦおよび３５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４）で６日間、未成熟樹状細胞に分化させた。次いで、未成熟単球由来樹状細胞（Ｍｏ－ＤＣ）を、１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ（ＴＬＲ４アゴニスト）の存在下で、抗体（１００ｎＭ）とインキュベーションして、樹状細胞成熟および活性化を誘導した。２日後、細胞表面マーカーの発現に関して、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。図２４に示すように、ＨＬＡ－ＤＲおよび共刺激分子ＣＤ８６の発現増加、ならびに免疫寛容原性マーカーＣＤ２０９の発現減少は、Ｈ７Ｋ３ｍ５が、ＴＬＲシグナル伝達に反応して、Ｍｏ－ＤＣの抗原提示および炎症促進能を増進することを示す。

［００３９６］健康なドナーのＰＢＭＣから単離した単球（Ｍｏ－ＤＣ）から、未成熟樹状細胞をＤＣ培地（ＳｔｅｍＸＶｉｖｏ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦおよび３５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４）で５日間分化させた。第５日、Ｍｏ－ＤＣに新鮮なＤＣ培地を補充し、そして５μｇ／ｍＬ ＣＤ４０リガンドの非存在下または存在下、３０μｇ／ｍＬ Ｈ７Ｋ３ｍ５またはそのアイソタイプ対照でさらに２日間処理した。第７日、健康な関連しないドナーのＰＢＭＣからＴ細胞を単離し、そしてサイトカインカクテルおよび３０μｇ／ｍＬ Ｈ７Ｋ３ｍ５を含有する新鮮培地中に懸濁した。Ｔ細胞のみおよびＭｏ－ＤＣのみの培養を対照として含めた。４日間の終了時、培地上清中のＩＦＮ－γおよびＩＬ－１２レベルをＥＬＩＳＡによって測定する一方、Ｍｏ－ＤＣの細胞表面表現型をフローサイトメトリーによって分析した。図２４～２７に例示する実験結果は、Ｍｏ－ＤＣがＣＤ４０リガンドで成熟されていたならば、Ｍｏ－ＤＣに対するＨ７Ｋ３ｍ５の炎症促進効果がより顕著であることを示す。

実施例５
［００３９７］本実施例は、Ｈ７Ｋ３ｍ５の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列に基づくＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体、ならびにＷＯ２０１９０５７０９９に開示される抗体の生成を例示する。重鎖ヘテロ二量体化を、操作ジスルフィド結合（Ｃａｒｔｅｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１， ２４８， ７－１５）によって安定化されるノブおよびホール突然変異（Ｍｅｒｃｈａｎｔら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １９９８， １６， ６７７－６８１）によって制御した。軽鎖Ｃカッパまたは重鎖ＣＨ１を、以前記載されるような（ＷＯ２０１９０５７１２２Ａ１）ヒトＴ細胞レポーターアルファ（ＴＲＡＣ）およびベータ（ＴＲＢＣ）定常ドメインで置換することによって、正しい軽鎖対形成を制御した。また、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン内に突然変異を導入して、エフェクター機能を減少させ、安定性を改善し、そしてＣＨＯにおける生産性を増加させた（Ａｌｅｇｒｅら Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９４， ５７ １５３７－４３およびＨｕら Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２０１７， ３３， ７８６－７９４）。

［００３９８］ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体の発現および精製
［００３９９］図２８Ａは、１＋１または２＋１立体配置の６つの第一世代のＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体の模式図を示す。１＋１立体配置の二重特異性抗体（４－３ａｂおよび４ａｂ－３）は、ＣＤ３イプシロンおよびＬＩＬＲＢ４の単一コピーに結合するよう操作された。２＋１の二重特異性抗体（４４－４ａｂ、４ａｂ４ａｂ－３、４３ａｂ－４、および４ａｂ３－４ａｂ）立体配置は、ＣＤ３イプシロンの単一コピーおよびＬＩＬＲＢ４の２コピーに結合するよう操作された。４４－３ａｂおよび４ａｂ４ａｂ－３立体配置は、二重特異性の１つのアーム上にタンデムに、両方のＬＩＬＲＢ４結合部分を有する。４３ａｂ－４および４ａｂ３－４ａｂ立体配置は、二重特異性の両方のアーム上にＬＩＬＲＢ４結合部分を有する。各第一世代二重特異性抗体のポリペプチド鎖およびそのアミノ酸配列を表９に列挙する。

［００４００］表９． 第一世代ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体の配列

［００４０１］第一世代二重特異性抗体を生成するため、第一世代二重特異性抗体をコードするＤＮＡを、遺伝子合成後に哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。次いで、Ｅｘｐｉ２９３細胞内にベクターの適切な混合物を一過性にトランスフェクションし、そして１００ｍＬスケールで発現することによって、二重特異性抗体を発現させた。すべての試料をまず、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって、上清から精製した。二重特異性抗体１～３をサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によってさらに精製する一方、二重特異性抗体４～６を陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＸ）によって精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび分析ＳＥＣによってすべての試料を純度に関して分析した。結果を表１０に示す。アリコットをＰＮＧアーゼＦ（ＭＥＤＮＡ Ｂｉｏ Ｍ３１０３）で脱グリコシル化し、そしてＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣタンパク質ＢＥＨ ＳＥＣカラムを用い、Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴＯＦにカップリングさせたＷａｔｅｒ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣを用いた質量分析によって特徴付けた。結果を表１１に示す。

［００４０２］表１０． 第一世代二重特異性抗体の収量および純度

［００４０３］表１１． 第一世代二重特異性抗体の質量分析データ

［００４０４］均一性および製造可能性を改善するため、第二世代二重特異性抗体を設計した。特に、これは、ＴＣＲａドメイン中のＳ９１Ａを突然変異させて、Ｏ－グリカン修飾を除去するか、またはＱ１Ｅ突然変異を作製して、Ｎ末端ピロＱ形成を防止することによって行われた。各第一世代二重特異性抗体のポリペプチド鎖およびそのアミノ酸配列を表１２に列挙する。第二世代二重特異性抗体および対照をコードするＤＮＡを、遺伝子合成または第一世代二重特異性抗体から出発する標準的分子生物学プロトコル後に哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。次いで、ＣＨＯ－Ｋ１細胞内に一過性にトランスフェクションされる適切なベクターを用いて、二重特異性抗体を発現させ、そして流加培養プロトコルを用いて、１４日間、１Ｌスケールで発現させた。プロテインＡカラムを用いてすべての試料由来の上清から二重特異性抗体を精製し、そしてＳＥＣによってポリッシュした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび分析ＳＥＣによってすべての試料を純度に関して分析した。結果を表１３に示す。試料のアリコットを脱グリコシル化し、そして質量分析によって特徴付け、これは試料が第一世代二重特異性抗体の不純物を欠くことを示した（表１４を参照されたい）。

［００４０５］表１２． 第二世代ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体の配列

［００４０６］表１３． 第二世代二重特異性抗体の収量および純度

［００４０７］表１４． 第二世代二重特異性抗体の質量分析データ

［００４０８］ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
［００４０９］ＦＡＣＳに基づくアプローチを用いて、ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体がＴ細胞によるターゲット細胞殺細胞を仲介する能力を決定した。ＴＨＰ－１およびＭＶ４－１１細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性：ヒトＡＭＰ細胞株ＴＨＰ－１およびＭＶ－４－１１細胞を操作して緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現させた。Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒによって収集された健康なドナーからヒト・バフィーコートを得た。Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７－１４４０－０３）密度勾配細胞分離によって、バフィーコートからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ヒト汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０９６－５３５）を用いて、汎Ｔ細胞をＰＢＭＣからさらに単離した。５：１の比で、５ｘ１０⁵新鮮単離ヒト汎Ｔ細胞をエフェクター細胞として用い、そして１ｘ１０⁵ ＴＨＰ－１－ＧＦＰをターゲット細胞として用いた。ＭＶ４－１１細胞殺細胞アッセイでは、９：１の比で、９ｘ１０⁵新鮮単離ヒト汎Ｔ細胞をエフェクター細胞として用い、そして１ｘ１０⁵ ＭＶ４－１１－ＧＦＰをターゲット細胞として用いた。ヒト汎Ｔ細胞、ＴＨＰ－１－ＧＦＰまたはＭＶ４－１１－ＧＦＰ細胞、および増加する濃度のＩＯ－２０２またはアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌカタログ番号ＢＥ０２９７）を、総量２００μＬ中、ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏカタログ番号６１８７０－０３６）＋１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏカタログ番号１００８２－１４７）中、Ｕ型９６ウェルプレート中で混合し、そして３７℃で４８時間インキュベーションした。インキュベーション終了時、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５９９２５）を細胞に添加し、そしてＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａによって１００μＬの細胞を獲得し、そしてＧＦＰ陽性細胞の割合を測定した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｆｌｏｗｊｏ ＬＬＣ）を用いて、フローサイトメトリーデータを分析し、そして細胞傷害性を：細胞傷害性パーセント＝１００－（［Ｔ／ＮＴ］ｘ１００）、式中、ＴおよびＮＴはそれぞれ、試験抗体を含みまたは含まずに処理したＧＦＰ⁺細胞の割合である、として計算した。

［００４１０］ヒト正常単球の自己殺細胞：１ｘ１０⁶のＰＢＭＣおよび増加する濃度のＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体または対照を、Ｕ型９６ウェルプレート中、２００μＬ総量で、ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化ＦＢＳおよび５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２０２－ＩＬ／ＣＦ）中で混合し、そして３７℃で４８時間インキュベーションした。増加する濃度のリツキシマブ（Ｂｉｏｇｅｎ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）とインキュベーションしたＰＢＭＣをアッセイ対照として用いた。インキュベーション終了後、細胞を洗浄し、そして５μＬのＦｃ受容体ブロッカー（１０ｍｇ／ｍＬのヒト免疫グロブリンＧ［ＩｇＧ］、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｉ４５０６）と室温で１０分間インキュベーションした後、１００μＬのＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの蛍光コンジュゲート化ＣＤ１４（クローンＭ５Ｅ２、カタログ番号５５５３９７）およびＣＤ１９（クローンＨＩＢ１９、カタログ番号５５５４１５）と氷上で３０分間インキュベーションした。単球はＣＤ１４陽性細胞として同定される一方、Ｂ細胞はＣＤ１９陽性細胞として同定された。

［００４１１］図２９Ａ～２９Ｂに示すように、異なる抗ＬＩＬＲＢ４単一特異性および二重特異性抗体に渡って、単球およびＴＨＰ－１間で、同様の結合アフィニティ傾向が観察された。図３０Ａ～３０Ｂに示すように、単球およびＴＨＰ－１－ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞に対する二重特異性ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３抗体のＴ細胞仲介性細胞傷害性が観察される。図３１Ａ～３１Ｂに示すように、ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ３二重特異性抗体による単球の自己殺細胞（図３１Ａ）および対照としてのリツキサンによるＢ細胞の自己殺細胞（図３１Ｂ）を観察した。

［００４１２］非線形シグモイド用量反応曲線適合を用い、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアによって、殺細胞曲線作成およびＥＣ₅₀計算を行った。平均±ＳＤをＥｘｃｅｌによって計算した。結果を表１５および１６に報告する。

［００４１３］表１５． 第一世代二重特異性抗体のＴ細胞細胞傷害性

^*概算ＥＣ₅₀
^**ＥＣ５０は正確には測定不能である；４－３ａｂ、４ａｂ－３、および４４－３ａｂは、４ａｂ４ａｂ－３、４３ａｂ－４、および４ａｂ３－４ａｂよりもより弱い強度を有する。

［００４１４］表１６． 第二世代二重特異性抗体のＴ細胞細胞傷害性

［００４１５］表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）
［００４１６］組換えＣＤ３ｅ－ＣＤ３ｄヘテロ二量体タンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＬＩＬＲＢ４組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に対する第一世代二重特異性抗体の結合アフィニティを、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置を用いた表面プラズモン共鳴によって測定した。簡潔には、標準プロトコルにしたがって、ＥＤＣおよびＮＨＳで、ＣＤ３ｅ－ＣＤ３ｄまたはＬＩＬＲＢ４タンパク質をＣＭ５チップ上に固定した。次いで、二重特異性抗体分析物を、それぞれ、ＬＩＬＲＢ４およびＣＤ３ｅ－ＣＤ３ｄに関して、１ｘＨＢＸ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）中、６つの濃度（１．２５、２．５、５、１０、２０、および４０ｎＭ）または７つの濃度（２０、２．５、５、１０、２０、４０、および８０ｎＭ）で注入した。再生緩衝液として、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を用いてチップを再生した。参照チャネルＦｃ１および緩衝液チャネルのセンソグラムを試験センソグラムから減じ、そして１：１結合モデルによって実験データを適合させた。アフィニティに関しては、表１７を参照されたい。

［００４１７］表１７． 組換えタンパク質および細胞に対する第一世代二重特異性抗体のアフィニティ

［００４１８］Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒインターフェロメトリー（Ｇａｔｏｒ Ｂｉｏ）
［００４１９］Ｇａｔｏｒ Ｂｉｏの機器を用いて、Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒインターフェロメトリー（ＢＬＩ）によって、組換えヒトＣＤ３ｅ（Ａｃｒｏ、カタログ番号ＣＤＥ－Ｈ５２２３）、ｃｙｎｏ ＣＤ３ｅ（Ａｃｒｏ、カタログ番号ＣＤＥ－Ｃ５２２６）、ヒトＬＩＬＲＢ４（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１６７４２－Ｈ０８Ｈ）、およびｃｙｎｏ ＬＩＬＲＢ４（Ａｃｒｏ、カタログ番号ＣＤＫ－Ｃ５２２７）に対して、第二世代二重特異性抗体の結合アフィニティを測定した。５μｇ／ｍＬ装填の固定抗ヒトＦｃ抗体（ＨＦＣ）プローブ（Ｇａｔｏｒ Ｂｉｏ、カタログ番号ＰＬ１６８－１６０００３）を用いて、二重特異性抗体を捕捉した。それぞれ、ヒトＣＤ３ｅ、ｃｙｎｏ ＣＤ３ｅ、ヒトＬＩＬＲＢ４、およびｃｙｎｏ ＬＩＬＲＢ４に関して、６つの濃度（０．６～１５９ｎＭ、０．７～１６４ｎＭ、０．８～２００ｎＭ、および２．５～５９５ｎＭ）を用いて、結合アフィニティを測定した。Ｇａｔｏｒのデータ分析ソフトウェア１．６．１．１２０３で、１：１適合モデル（Ｇｌｏｂａｌ Ｆｉｔ）を用いて結合アフィニティ定数を決定し、そして比、Ｋｄｉｓ／Ｋｏｎを用いて、ＫＤを計算した。アフィニティに関しては表１８を参照されたい。

［００４２０］表１８． 組換えタンパク質および細胞に対する第二世代二重特異性抗体のアフィニティ

［００４２１］フローサイトメトリー
［００４２２］ＣＤ３またはＬＩＬＲＢ４に対する第一世代および第二世代二重特異性抗体の結合を、Ｊｕｒｋａｔ細胞またはＴＨＰ－１細胞上で、ＦＡＣＳによって測定した。ＴＨＰ－１細胞への二重特異性抗体の結合を測定するため、ＴＨＰ－１細胞をまず、１００万細胞あたり１０μｇのヒトＦｃブロッカー（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５６４２２０）と室温で１０分間インキュベーションし、その後、連続希釈二重特異性抗体と氷上で３０分間インキュベーションした。ＢＳＡ染色緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５４６５７）で細胞を２回洗浄し、そして５μｇ／ｍＬの二次Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ Ｆｃモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４０９３０６）と氷上で３０分間インキュベーションした。最後の洗浄後、７－ＡＡＤを適用して死んだ細胞を排除した。Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する第一世代二重特異性抗体の結合を測定するため、各二重特異性抗体を、１％ＢＳＡを含む緩衝液中で希釈し（５倍希釈シリーズ、４００ｎＭが最高濃度）、そして細胞と４℃で３０分間インキュベーションした。次いで、二重特異性抗体を、５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７抗ヒトＩｇＧ Ｆｃで、４℃で０．５時間染色した後、分析した。ＣＤ３に関する結合は、アイソタイプ対照に比較して該細胞上で明らかに観察されたが、結合曲線がプラトーに到達しなかったため、ＥＣ５０は計算できないか、または概算のみ可能であった。ＥＣ５０値に関しては、表１７および１８を参照されたい。

実施例６
［００４２３］本実施例は、Ｈ７Ｋ３ｍ５の重鎖および軽鎖可変領域配列に基づくＣＡＲタンパク質を発現する、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成を例示する。

［００４２４］フローサイトメトリーを用いて、ヒト初代単球およびヒト白血病細胞ＴＨＰ－１に対する結合に関して、抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体Ｈ７Ｋ３ｍ５由来の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の２つの異なる立体配置を試験した。図３２に示すように、ＶｌＶｈ立体配置はＨ７Ｋ３ｍ５としての結合アフィニティを維持する一方、ＶｈＶｌ立体配置は、ある程度の結合アフィニティを失った。したがって、ＶｌＶｈをＣＡＲ構築物のために選択する。

［００４２５］図３３に例示するように、抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲタンパク質を発現するためのＤＮＡ構築物は、ＣＤ３ゼータ活性化ドメインを含む、ＣＤ２８または４－１ＢＢ共刺激ドメインを含有する第二世代ＣＡＲ構築物である。ｓｃＦｖは、抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体Ｈ７Ｋ３ｍ５由来である。５’および３’相同アームは、ＴＲＡＣ遺伝子（ｇＲＮＡ設計に基づく）中のＣａｓ９ ＤＮＡ切断部位の上流および下流の相同配列である。プロモーターおよびリーダーペプチドは、遺伝子発現および細胞外転位置に必要な要素である。ここで、本発明者らは、ｓｃＦｖの発現を制御するためにＪｅＴプロモーターを用いた（Ｅｙｑｕｅｍ Ｊら Ｎａｔｕｒｅ （２０１７） ５４３：１１３－１１７）。転写物安定性および翻訳を改善するために、ＳＶ４０ポリＡテールを含めた。

［００４２６］ＴＲＡＣの第一エクソンの５’端をターゲティングするガイドＲＮＡを含み、そして相同組換えに基づくノックインのためのＤＮＡ構築物と共に供給される、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体で、ヒト初代Ｔ細胞をトランスフェクションした。ＴＣＲアルファをノックアウトした後、ＩＬ－２ ３００ＩＵ／ｍｌを含み、そして抗ＣＤ３／２８が添加されていない完全Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ培地中で細胞を増殖させた。トランスフェクション後、細胞を培養中で２週間増殖させた。ＬＩＬＲＢ４－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＤＫ－Ｈ５２５９）および抗Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｂ２７８６５２）に結合することによって、抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞を同定した。内因性ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子座のノックアウトの成功（ＫＯ）を、抗ＣＤ３染色（抗ＣＤ３ ＰＥ、ＢＤ ５５５３３３）によって測定した。図３４に示すように、抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞の効率的な生成が確認された。

［００４２７］図３５に示すように、ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ）不活性化Ｔ細胞（ＫＯ）および抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ（または対照ＣＡＲ）ノックインＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞増殖および拡大を経る。抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞に比較して、有意により高い倍増殖を有した。

［００４２８］ＣＡＲ－Ｔ培養の抗原依存性活性化を試験するため、１μｇ／ｍｌ組換え対照抗原またはＬＩＬＲＢ４抗原を、ＰＢＳ緩衝液中、９６ウェルプレート上に一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。培地（いかなるサイトカインの添加も含まない）中の１Ｘ１０⁵ ＣＡＲ－Ｔ細胞を各ウェルに添加し、そして７２時間インキュベーションした。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによるサイトカイン放出測定のため、細胞培養上清を収集した。図３６Ａ～３６Ｈに示すように、抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカインＩＬ－８、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦαおよびＩＬ１アルファの放出は、ＬＩＬＲＢ４の存在に依存する。

［００４２９］図３７Ａ～３７Ｃは、２週間の増殖後のＣＡＲ－Ｔ細胞の特徴付けを示す。液体窒素保存中の凍結ＣＡＲ－Ｔ細胞を融解し、そしてフローサイトメトリー分析前に２～３日間培養中に維持した。用いた抗体は、抗ＣＤ８ ＡＰＣ Ｃｙ７（ＢＤ５６１９４５）、抗ＰＤ１ ＰＥ（ＢＤ５６０９０８）、抗ＴＩＭ３ ＢＶ４２１（ＢＤ５６５５６２）であった。ＬＩＬＲＢ４－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＤＫ－Ｈ５２５９）および抗Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｂ２７８６５２）への結合によって、ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞を同定した。図３７Ａに示すように、抗ＬＩＬＲＢ４＿ＣＤ２８の発現は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合をわずかに減少させ（６１．８％から４１．８％）、そして細胞上のＰＤ－１およびＴＩＭ３の発現を実質的に変化させなかった。図３７Ｂに示すように、抗ＬＩＬＲＢ４＿４－１ＢＢの発現は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合を４８．７％から３．６１％に減少させ、そしてＰＤ－１の発現を増加させた。図３７Ｃに示すように、ＣＡＲ構築物が挿入されるＴＲＡＣ遺伝子座でのノックアウト（ＫＯ）ＴＣＲアルファ発現は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合、あるいはＰＤ－１またはＴＩＭ３の発現を実質的に変化させなかった。

［００４３０］抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を試験するため、ＣＨＯ Ｋ１ ＲＢ４細胞を異なる密度で（６Ｘ１０⁴、２Ｘ１０⁴または７Ｘ１０³）１２時間植え付け、１Ｘ１０⁵ ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加し、そして上清ＣＡＲ－Ｔ細胞を除去し、そしてプレートをＰＢＳで２回洗浄することによって、細胞傷害性を測定した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＴＧ２．０発光キットによって、総生存接着ＣＨＯ Ｋ１ ＲＢ４細胞を測定し、そして各条件の発光シグナルを、同じＥ：Ｔ比で活性化されたＴ細胞対照で割ることによって、％細胞傷害性を計算した。図３８に示すように、抗ＬＩＬＲＢ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞（４４）はＣＨＯ Ｋ１ ＲＢ４細胞を殺したが、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞（９４）は殺さなかった。

実施例７
［００４３１］本実施例は、第１相、ヒトでの最初の臨床試験の設計を示す。
［００４３２］図３９Ａに示すように、抗ＬＩＬＲＢ４の２週間の単独療法導入（「ウィンドウ」）を含む「ウィンドウ」設計は、単独療法として、ＬＩＬＲＢ４を特異的にターゲティングするモノクローナル抗体の影響の研究を可能にする。

［００４３３］パート１Ａ単独療法増大期（第１日に単一用量）中、患者を抗ＬＩＬＲＢ４単独療法の増加する用量の連続コホートに登録する。パート１Ａの目的は、抗ＬＩＬＲＢ４単独療法（ＭＴＤ１）のＭＴＤを決定することである。処置の最初の１４日間（アザシチジンと組み合わせた抗ＬＩＬＲＢ４の最初の用量の前）、すなわち抗ＬＩＬＲＢ４の最初の用量間隔に、ＭＴＤ１のＤＬＴを評価する。最初の用量増大は、加速滴定設定で始まり、その後、３＋３設計を用いる標準増大期が続く。パート１には、再発性および／または難治性骨髄単球性（Ｍ４）および単球性／単芽球性（Ｍ５）ＡＭＬ患者および慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）患者の両方が含まれるであろう。

［００４３４］パート１Ｂ中（第１５日に開始）、パート１Ａ中でＤＬＴを伴わない患者には、標準用量のアザシチジン（７５ｍｇ／ｍ2皮下、２８日ごとに７日間）と組み合わせた、パート１Ａで投与されたものと同じ用量の抗ＬＩＬＲＢ４が投与される。アザシチジンと組み合わせた抗ＬＩＬＲＢ４のＭＴＤ（ＭＴＤ２）は、２８日間のＤＬＴウィンドウで決定され、このウィンドウは１４日間の単独療法および１４日間の組み合わせ治療からなる。

［００４３５］パート１の全体のＤＬＴ期間（パート１Ａおよびパート１Ｂを合わせたもの）は、２８日間である。これは、単独療法ＤＬＴに関する最初の１４日間、および組み合わせ療法ＤＬＴに関する最後の２８日間（アザシチジンの添加を伴う）を含む、４２日間に容易に変化可能であった。

［００４３６］続くサイクルは、アザシチジンと組み合わせた抗ＬＩＬＲＢ４であろう。
［００４３７］図３９Ｂおよび図３９Ｃに示すように、抗ＬＩＬＲＢ４＋アザシチジンの組み合わせに関するＭＴＤおよび／またはＲＰ２Ｄが同定され、そして安全審査委員会（ＳＲＣ）によって認可が与えられたならば、２つの拡大アーム（図３９Ｂおよび図３９Ｃ）の一方への登録が、再発性および／または難治性単芽球性／単球性白血病患者において開始されるであろう。

［００４３８］図３９Ｂに示すように、この研究は、単球性分化を伴う再発性／難治性ＡＭＬ患者における単独療法コホート抗ＬＩＬＲＢ４を登録するであろう。図３９Ｂはまた、設計された「ウィンドウ」が認可されなかった場合のヒトでの最初の第１相臨床試験の設計でもありうる。

［００４３９］図３９Ｃに示すように、この研究は、単球性分化を伴う再発性／難治性ＡＭＬ患者における抗ＬＩＬＲＢ４＋アザシチジンの組み合わせコホートを登録するであろう。

［００４４０］図３９Ｄに示すように、この研究は、単球性分化を伴う再発性／難治性ＡＭＬ患者における、および単球性分化を伴う新規診断ＡＭＬ患者における、抗ＬＩＬＲＢ４＋アザシチジン＋ベネトクラックスの組み合わせコホートを登録するであろう。

［００４４１］本明細書に開示し、そして請求する組成物および方法はすべて、本開示を踏まえて、過度の実験を伴わずに作製し、そして実行することが可能である。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して記載されてきているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書記載の方法および方法の工程または工程の順序に、変動を適用してもよいことが当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の剤は、本明細書記載の剤に関して置換可能である一方、同じまたは類似の結果が達成されることが明らかであろう。当業者に明らかであるこうした類似の置換および修飾は、付随する請求項によって定義されるような本発明の精神、範囲および概念内にあると見なされる。

Claims (79)

1. ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（ＨＣ－ＣＤＲ）１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；ならびに
   ｂ）アミノ酸残基ＮＳで突然変異を含む配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域（ＬＣ－ＣＤＲ）１、配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域
   を含む、単離抗ＬＩＬＲＢ４抗体またはその抗原結合断片。
2. ＬＣ－ＣＤＲ１が配列番号２８のアミノ酸配列を有する、請求項１の抗体またはその抗原結合断片。
3. 重鎖可変領域が、配列番号１に少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有し；そして軽鎖可変領域が、配列番号２７に少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１の抗体またはその抗原結合断片。
4. 重鎖可変領域が、配列番号１のアミノ酸配列を有し、そして軽鎖可変領域が、配列番号２７のアミノ酸配列を有する、請求項１の抗体またはその抗原結合断片。
5. 免疫グロブリン定常領域、任意選択でＩｇＧの定常領域、または任意選択でヒトＩｇＧの定常領域をさらに含む、先行する請求項いずれかの抗体またはその抗原結合断片。
6. ヒト化されている、先行する請求項いずれかの抗体またはその抗原結合断片。
7. ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）単一ドメイン抗体、ディアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）₂、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、二重特異性抗体、ｄｓディアボディ、ナノボディ、ドメイン抗体、または二価抗体である、先行する請求項いずれかの抗体またはその抗原結合断片。
8. ＬＩＬＲＢ４およびＣＤ３に対する二重特異性抗体である、請求項７の抗体またはその抗原結合断片。
9. １つまたはそれより多いコンジュゲート部分に連結されている、先行する請求項いずれかの抗体またはその抗原結合断片。
10. コンジュゲート部分が、クリアランス修飾剤、毒素、検出可能標識、化学療法剤、サイトカイン、または精製部分を含む、請求項９の抗体またはその抗原結合断片。
11. 先行する請求項いずれかの抗体またはその抗原結合断片、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的組成物。
12. 請求項１～１０の抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離ポリヌクレオチド。
13. 請求項１２の単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
14. 請求項１３のベクターを含む、宿主細胞。
15. 請求項１～１０のいずれかの抗体またはその抗原結合断片を発現させる方法であって、請求項１４の宿主細胞を、請求項１３のベクターが発現される条件下で培養する工程を含む、前記方法。
16. 被験体において、癌を治療するかまたはその影響を改善する方法であって、被験体に、療法的有効量の請求項１～１０のいずれかの抗体またはその抗原結合断片あるいは請求項１１の薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
17. 癌が、副腎癌、骨癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、目の癌、胃癌、頭頸部癌、腎癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、細気管支肺胞細胞肺癌、中皮腫、頭頸部癌、扁平上皮癌、黒色腫、口腔癌、卵巣癌、子宮頸癌、陰茎癌、前立腺癌、膵臓癌、皮膚癌、肉腫、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膣癌からなる群より選択される、請求項１６の方法。
18. 癌が免疫抑制微小環境を有し、そして抗体またはその抗原結合断片が少なくとも１つの骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を殺す、請求項１６の方法。
19. 癌が、リンパ腫、リンパ球性白血病、ホジキン病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性／リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性新生物、および慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）からなる群より選択される、請求項１６の方法。
20. 被験体がヒトである、請求項１６～１９のいずれかの方法。
21. 抗体またはその抗原結合断片が、静脈内、動脈内、腫瘍内、または皮下投与される、請求項１６～２０のいずれかの方法。
22. トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリン・トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリン、ダウノルビシン、ヌクレオシド代謝阻害剤、シタラビン、低メチル化剤、低用量シタラビン（ＬＤＡＣ）、ダウノルビシンおよびシタラビンの組み合わせ、注射用ダウノルビシンおよびシタラビン・リポソーム、Ｖｙｘｅｏｓ（登録商標）、アザシチジン、Ｖｉｄａｚａ（登録商標）、デシタビン、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ヒ素、亜ヒ酸、ヒスタミン二塩酸塩、Ｃｅｐｌｅｎｅ（登録商標）、インターロイキン－２、アルデスロイキン、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、ＦＬＴ－３阻害剤、ミドスタウリン、Ｒｙｄａｐｔ（登録商標）、クロファラビン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、ＩＤＨ１阻害剤、イボシデニブ、Ｔｉｂｓｏｖｏ（登録商標）、ＩＤＨ２阻害剤、エナシデニブ、Ｉｄｈｉｆａ（登録商標）、スムーズンド（ＳＭＯ）阻害剤、グラスデギブ、アルギナーゼ阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、エパカドスタット、ＢＣＬ－２阻害剤、ベネトクラックス、Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（登録商標）、白金複合体誘導体、オキサリプラチン、キナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、イブルチニブ、ＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（登録商標）、アカラブルチニブ、ＣＡＬＱＵＥＮＣＥ（登録商標）、ザヌブルチニブ、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＬＡＧ３抗体、ＩＣＯＳ抗体、ＴＩＧＩＴ抗体、ＴＩＭ３抗体、ＣＤ４０抗体、４－１ＢＢ抗体、ＣＤ４７抗体、ＳＩＲＰ１α抗体または融合タンパク質、Ｅ－セレクチンのアンタゴニスト、腫瘍抗原に結合する抗体、Ｔ細胞表面マーカーに結合する抗体、骨髄細胞またはＮＫ細胞表面マーカーに結合する抗体、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物由来のアルカロイド、ホルモン療法薬剤、ホルモンアンタゴニスト、アロマターゼ阻害剤、およびＰ－糖タンパク質阻害剤からなる群より選択される１つまたはそれより多い薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項１６～２１のいずれかの方法。
23. 被験体における自己免疫または炎症性疾患を治療するかまたは改善するための方法であって、被験体に、療法的有効量の請求項１～１０のいずれかの抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項１１の薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
24. 自己免疫または炎症性疾患が、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳病（ＡＩＥＤ）、自己免疫リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病－疱疹状皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素病、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、デゴス病、若年性皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、全身性強皮症、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、全身性硬化症（ＳＳ）、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸粘膜炎症、大腸炎関連消耗性疾患、ブドウ膜炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症、アルツハイマー病、喘息、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、変形性関節症、敗血症、脳卒中、組織および臓器移植、血管炎、糖尿病性網膜症、人工呼吸器誘発肺傷害、ウイルス感染および自己免疫糖尿病からなる群より選択される、請求項２３の方法。
25. 被験体において細胞を殺す方法であって、請求項１～１０のいずれかの抗体またはその抗原結合断片を被験体に投与する工程を含む、前記方法。
26. 細胞が、単球、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、マクロファージ、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、単球由来マクロファージ、単球由来樹状細胞、または癌性細胞である、請求項２５の方法。
27. 細胞が抗原提示機能を有する、請求項２５の方法。
28. 細胞が、細胞表面上に発現されたＬＩＬＲＢ４タンパク質を少なくとも２，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００または少なくとも１５０，０００コピー有する、請求項２５の方法。
29. 細胞が、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）を通じて殺される、請求項２５の方法。
30. 細胞がＴ細胞細胞傷害性を通じて殺される、請求項２５の方法。
31. Ｔ細胞を、請求項１～１０のいずれかの抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、Ｔ細胞を活性化する方法。
32. Ｔ細胞を、癌性細胞の存在下で、請求項１～１０のいずれかの抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、Ｔ細胞を活性化する方法。
33. 癌性細胞が抗原提示活性を増加させる、請求項３２の方法。
34. Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される、請求項３１～３２の方法。
35. 試料または被験体において、癌細胞または癌幹細胞を検出する方法であって：
    （ａ）被験体または被験体由来の試料を、請求項１～１０のいずれかの抗体またはその抗原結合断片と接触させ；そして
    （ｂ）前記被験体または試料における癌細胞または癌幹細胞への前記抗体の結合を検出する
    工程を含む、前記方法。
36. 試料が体液または生検である、請求項３５の方法。
37. 試料が、血液、痰、涙、唾液、粘液、血清、尿または糞便である、請求項３５の方法。
38. 検出が、免疫組織化学、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳ、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等を含む）またはウェスタンブロットを含む、請求項３５の方法。
39. 工程（ａ）および（ｂ）を二回目にまたはさらに行って、そして一回目に比較した際の検出レベルの変化を決定する工程をさらに含む、請求項３５の方法。
40. 被験体において癌を治療するための薬剤の製造における、請求項１～１０のいずれかの抗体またはその抗原結合断片の使用。
41. ＬＩＬＲＢ４を検出する際に有用な、請求項１～１０のいずれかの抗体またはその抗原結合断片を含む、キット。
42. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）タンパク質であって：
    ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣ－ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；ならびに
    ｂ）アミノ酸残基ＮＳで突然変異を含む配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣ－ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域
    を含む、前記ＣＡＲタンパク質。
43. ＬＣ－ＣＤＲ１が配列番号２８のアミノ酸配列を有する、請求項４２のＣＡＲタンパク質。
44. 重鎖可変領域が、配列番号１に少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有し；そして軽鎖可変領域が、配列番号２７に少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項４２のＣＡＲタンパク質。
45. 重鎖可変領域が、配列番号１のアミノ酸配列を有し；そして軽鎖可変領域が、配列番号２７のアミノ酸配列を有する、請求項４２のＣＡＲタンパク質。
46. 配列番号６６または６８に、少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項４２のＣＡＲタンパク質。
47. 配列番号６６または６８に同一であるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む、請求項４２のＣＡＲタンパク質。
48. ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインをさらに含む、請求項４２のＣＡＲタンパク質。
49. ４－１ＢＢ細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項４２のＣＡＲタンパク質。
50. ＣＤ３ζ細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項４２のＣＡＲタンパク質。
51. 請求項４２～５０のいずれか一項記載のＣＡＲタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド分子。
52. 真核細胞において活性であるプロモーターをさらに含む、請求項５１のポリヌクレオチド分子。
53. 発現ベクターとしてさらに定義される、請求項５１のポリヌクレオチド分子。
54. 請求項５１のポリヌクレオチド分子を含む、操作細胞。
55. 細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージである、請求項５４の細胞。
56. 治療の必要がある被験体において、癌を治療するかまたは改善する方法であって、被験体に、請求項５４または５５にしたがった細胞の療法的有効量を含む細胞療法を投与する工程を含む、前記方法。
57. 前記細胞療法が、癌部位に局在性に（ｌｏｃａｌ）、癌部位に局所に（ｒｅｇｉｏｎａｌ）、または全身性に投与される、請求項５６の方法。
58. 前記ヒト被験体に、第二の癌療法を投与する工程をさらに含む、請求項５７の方法。
59. 前記の第二の癌療法が、化学療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法または手術である、請求項５８の方法。
60. 前記の第二の癌療法が、細胞療法と同時に投与される、請求項５８の方法。
61. 前記の第二の癌療法が、細胞療法の前または後に投与される、請求項５８の方法。
62. 前記ヒト被験体に、請求項５４または５５に記載の１つまたはそれより多い細胞の有効量の第二の投与を投与する工程をさらに含む、請求項５７の方法。
63. 前記癌が転移性、再発性または薬剤耐性癌である、請求項５６の方法。
64. 前記癌がＡＭＬである、請求項５６の方法。
65. 前記癌が、プレＢ急性リンパ球性白血病（プレＢ ＡＬＬ）、Ｂ細胞白血病、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性新生物、および芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）からなる群より選択される、請求項５６の方法。
66. 前記癌が乳癌、肺癌、膵臓癌、または前立腺癌である、請求項５６の方法。
67. 被験体において自己免疫または炎症性疾患を治療するかまたは改善するための方法であって、請求項５４または５５記載の細胞の療法的有効量を含む細胞療法を被験体に投与する工程を含む、前記方法。
68. 自己免疫または炎症性疾患が、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳病（ＡＩＥＤ）、自己免疫リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病－疱疹状皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素病、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、デゴス病、若年性皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、全身性強皮症、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、全身性硬化症（ＳＳ）、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸粘膜炎症、大腸炎関連消耗性疾患、ブドウ膜炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症、アルツハイマー病、喘息、アトピー性アレルギー、アレルギー、アテローム性動脈硬化症、気管支喘息、湿疹、糸球体腎炎、移植片対宿主病、溶血性貧血、変形性関節症、敗血症、脳卒中、組織および臓器移植、血管炎、糖尿病性網膜症、人工呼吸器誘発肺傷害、ウイルス感染および自己免疫糖尿病からなる群より選択される、請求項６７の方法。
69. ＬＩＬＲＢ４およびＣＤ３に結合可能な、二重特異性抗体または抗原結合断片。
70. （ａ）第一の軽鎖可変（Ｖ_L）ドメインおよび第一の重鎖可変（Ｖ_H）ドメインを含む、第一の抗原結合領域；ならびに
    （ｂ）第二のＶ_Lドメインおよび第二のＶ_Hドメインを含む、第二の抗原結合領域を含み、第一の抗原結合領域がＬＩＬＲＢ４に結合可能であり、そして第二の抗原結合領域がＣＤ３に結合可能であるか、またはその反対のものである
    請求項６９の二重特異性抗体または抗原結合断片。
71. 第一のＶ_Lドメインおよび第一の重鎖可変ドメインが、それぞれ、定常ドメインの第一の対に連結され、そして第二のＶ_Lドメインおよび第二のＶ_Hドメインが、それぞれ、定常ドメインの第二の対に連結される、請求項７０の二重特異性抗体または抗原結合断片。
72. （ａ）第一のＶ_Lドメインが第一の軽鎖定常（Ｃ_L）ドメインに連結され、そして第一のＶ_Hドメインが第一の重鎖定常ドメイン１（Ｃ_H１）に連結される、または
    （ｂ）第一のＶ_Lドメインが第一のＣ_H１ドメインに連結され、そしてＶ_Hドメインが第二のＣ_Lドメインに連結される
    請求項７１の二重特異性抗体またはその抗原結合断片。
73. （ａ）第二のＶ_Lドメインが第二のＣ_Lドメインに連結され、そして第二のＶ_Hドメインが第二のＣ_H１ドメインに連結される、または
    （ｂ）第二のＶ_Lドメインが第二のＣ_H１ドメインに連結され、そして第二のＶ_Hドメインが第二のＣ_Lドメインに連結される、または
    （ｃ）第二のＶ_LドメインがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖定常ドメインに連結され、そして第二のＶ_HドメインがＴＣＲβ鎖定常ドメインに連結される、または
    （ｄ）第二のＶ_LドメインがＴＣＲβ鎖定常ドメインに連結され、そして第二のＶ_HドメインがＴＣＲα鎖定常ドメインに連結される
    請求項７２の二重特異性抗体または抗原結合断片。
74. ＴＣＲα鎖定常ドメインがＳ９１Ａ突然変異を有する、請求項７３の二重特異性抗体または抗原結合断片。
75. 第一の抗原結合領域および／または第二の抗原結合領域が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項７０の二重特異性抗体または抗原結合断片。
76. 第三のＶ_Lドメインおよび第三のＶ_Hドメインを含む第三の抗原結合領域をさらに含み、第三の抗原結合領域がＬＩＬＲＢ４またはＣＤ３に結合可能である、請求項７０の二重特異性抗体または抗原結合断片。
77. 第三のＶ_Lドメインおよび第三の重鎖可変ドメインが、それぞれ、定常ドメインの第一の対に連結される、請求項７６の二重特異性抗体または抗原結合断片。
78. （ａ）第三のＶ_Lドメインが第三のＣ_Lドメインに連結され、そして第三のＶ_Hドメインが第三のＣ_H１ドメインに連結される、または
    （ｂ）第三のＶ_Lドメインが第三のＣ_H１ドメインに連結され、そして第三のＶ_Hドメインが第三のＣ_Lドメインに連結される、または
    （ｃ）第三のＶ_Lドメインが第二のＴＣＲα鎖定常ドメインに連結され、そして第三のＶ_Hドメインが第二のＴＣＲβ鎖定常ドメインに連結される、または
    （ｄ）第三のＶ_Lドメインが第二のＴＣＲβ鎖定常ドメインに連結され、そして第三のＶ_Hドメインが第二のＴＣＲα鎖定常ドメインに連結される
    請求項７７の二重特異性抗体または抗原結合断片。
79. （ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有する第一のＨＣ－ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有する第一のＨＣ－ＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を有する第一のＨＣ－ＣＤＲ３を含む、第一のＶ_Hドメイン；ならびに
    （ｂ）アミノ酸残基ＮＳで突然変異を含む配列番号８のアミノ酸配列を有する第一のＬＣ－ＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を有する第一のＬＣ－ＣＤＲ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を有する第一のＬＣ－ＣＤＲ３を含む、第一のＶ_Lドメイン
    を含む、請求項７０の二重特異性抗体または抗原結合断片。

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