TWI734879B

TWI734879B - 抗ox40抗體及其用途

Info

Publication number: TWI734879B
Application number: TW106144235A
Authority: TW
Inventors: 費歐那 A 哈汀
Original assignee: 美商艾伯維生物醫療股份有限公司
Priority date: 2016-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2021-08-01
Also published as: EP3725809A1; KR20190092552A; CR20190330A; DK3504242T3; RU2753493C2; US20200048363A1; US20200181282A1; US20180346593A1; PL3504242T3; EP3504242A1; IL267070A; MX2019007121A; LT3504242T; AU2017377036A1; CY1123274T1; US20180171023A1; AR110526A1; HUE050399T2; KR102341926B1; MA53184A

Abstract

本發明提供新穎抗OX40抗體、包括該等抗體之組合物、編碼該等抗體之核酸，及製造及使用其之方法。

Description

抗OX40抗體及其用途

本申請案尤其係關於新穎抗OX40抗體、包括該等抗體之組合物、編碼該等抗體之核酸及製造與使用其之方法。

癌症治療包含廣泛之治療方法，其等包括外科手術、放射治療及化學治療。儘管各種方法允許醫師可獲得廣泛之治療選擇以治療癌症，但現存治療具有許多缺點，諸如缺乏靶向癌細胞而非正常健康細胞之選擇性，及癌症對治療之抗性之發展。基於靶向治療之最新方法(其等優先干擾癌細胞而非正常細胞之細胞過程)已導致相較於非靶向治療(諸如放射治療)具有更少副作用之化學治療方案。癌症免疫治療已成為補充現存護理標準之頗具前景之治療方法。參見，例如，Miller等人，Cancer Cell, 27, 439-449 (2015)。此等免疫治療方法包括開發用以調節免疫系統以殺死癌細胞之抗體。患有實體腫瘤之病患中之抗腫瘤免疫反應已藉由使用生物製劑之治療增強。例如，存在兩種已批准及銷售之抗PD-1單株抗體：尼魯單抗(nivolumab) (OPDIVO®)及派姆單抗(pembrolizumab) (KEYTRUDA®)，且在美國及歐盟已被批准用以治療諸如無法切除或轉移性黑色素瘤及轉移性非小細胞肺癌之疾病。使用此等藥劑治療病患已導致如藉由無進展存活期及/或總體存活期之改善所衡量之抗腫瘤反應。在比較OPDIVO®與習知化學治療之臨床試驗中，OPDIVO®近期在初次治療病患群體中減慢晚期肺癌之進展之失敗突出對替代方法及額外之癌症治療之需求以補充現存之治療護理標準。

本發明提供特異性結合並活化OX40之抗OX40抗體。下文實施方式中提供示例性抗OX40抗體之示例性互補決定區(CDR)、重鏈可變域(V_H )及輕鏈可變域(V_L )區(即，分別V_H 及V_L 鏈)及重鏈及輕鏈之胺基酸序列。本文提供之抗OX40抗體導致適應性免疫反應之活化。如此項技術中已知，抗OX40抗體可包括改變抗體性質(諸如增加半衰期、增加或減小抗原依賴性細胞毒性(ADCC))之修飾及/或突變。本文提供包含編碼本發明之抗OX40抗體之核苷酸序列之核酸，亦提供包含核酸之載體。另外，本文提供經包含編碼本文揭示之抗OX40抗體之核苷酸序列之載體轉化之原核及真核宿主細胞，及經改造以表現該等核苷酸序列之真核(諸如哺乳動物)宿主細胞。下文實施方式中亦提供並進一步討論藉由培養宿主細胞及回收抗體產生抗體之方法。在另一態樣中，本發明提供包括本文描述之抗OX40抗體之組合物。該等組合物大體上包含一或多種如本文描述之抗OX40抗體及一或多種賦形劑、載劑或稀釋劑。本發明提供使用抗OX40抗體治療經診斷患有實體腫瘤之個體(諸如人類個體)之方法。該方法大體上涉及向該個體投與有效提供治療效益之量之本文描述之抗OX40抗體。該個體可經診斷患有許多可經最新診斷、復發或復發且難治性實體腫瘤中之任何一者。抗OX40抗體可每兩週一次以靜脈內輸注投與。抗OX40抗體可作為單一治療劑(單一治療)或輔助或與其他治療劑(通常但不一定為彼等用於治療實體腫瘤者)一起投與。治療劑通常將以其等批准量、投與途徑及投與頻率使用。如此項技術中已知，抗OX40抗體可經由各種投與途徑或模式(其等包括(但不限於)靜脈內輸注及/或注射及瘤內注射)投與。投與量將取決於投與途徑、投藥程序表、治療中之癌症之類型、治療中之癌症之階段及此項技術中熟知的其他參數(諸如病患之年齡及體重)。

相關參考案之交叉參考本申請案依據35 U.S.C. § 119(e)主張於2016年12月15日申請之美國臨時申請案第62/434,761號之權利，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。序列表本申請案含有序列表，其已以ASCII格式之電子檔提交且以全文引用之方式併入本文中。2017年10月30日建立之該ASCII拷貝命名為381493-368generic_SL.txt及大小為96,794個字組。本發明係關於特異性結合OX40之抗體及其片段、包含該等抗體之組合物、編碼抗OX40抗體之多核苷酸、可產生該等抗體之宿主細胞、適用於製造該等抗體之方法及組合物及使用其之各種方法。如熟習技工將知曉，抗體及其片段本質上為「模塊化」。在整個揭示內容中，描述組成抗OX40抗體或其結合片段之各種「模塊」之各種特定實施例。作為特異性非限制性實例，描述重鏈可變域(V_H )互補決定區(CDR)、V_H 鏈、輕鏈可變域(V_L ) CDR及V_L 鏈之各種特定實施例。希望特定實施例中之所有皆可彼此組合，如同各特定組合被個別地明確描述一般。 7.1. 縮寫在許多實施例中，本文描述之抗體、結合片段及多核苷酸係藉助於其等各自多肽或多核苷酸序列描述。除非另有指示，否則多肽序列係以N→C方向提供；多核苷酸序列以5’→3’方向提供。就多肽序列而言，可使用針對基因編碼胺基酸之習知三字母或單字母縮寫，如下表1中顯示。

某些序列係由規定胺基酸殘基屬於某些類別(例如，脂族、疏水性等)之結構式定義。如本文使用之基因編碼胺基酸所屬之各種類別係顯示於下表2中。一些胺基酸可屬於不止一種類別。含有巰基之半胱胺酸及經構象限制之脯胺酸未指定分類別。

7.2. 定義除非本文另有定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有一般技術者通常瞭解之含義。 7.3. 抗OX40抗體及結合片段 OX40係共刺激分子，其在增強初生免疫反應中具有關鍵作用且同時發揮作用以抑制調節T細胞活性。亦稱為CD134或腫瘤壞死因子受體超家族4 (TNFRSF4)之OX40係瞬態表現於經近期活化之T細胞上及構成表現於經活化之T調節細胞上之腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族之I型跨膜細胞表面成員。OX40之細胞外配體結合域係由三個半胱胺酸富集域(CRD)及第四部分CRD (分別CRDI、CRDII、CRDIII及CRDIV)組成。儘管主要由經活化之CD4+ T細胞表現，但OX40可表現於活化後的B細胞、CD8+ T細胞及天然殺手(NK)及天然殺手T (NKT)細胞上。嗜中性白血球亦已經報道表現OX40及通過人類嗜中性白血球上之OX40之傳訊抑制細胞凋亡。OX40之配體(OX40L)(亦稱為腫瘤壞死因子配體超家族4 (TNFSF4)、CD252或醣蛋白34 (gp34))係由經活化之抗原呈現細胞及B細胞上調。配體與經抗原活化之T細胞上之OX40之結合導致下游NF-κB異位及AKT途徑活化。NF-κB異位導致促存活分子(諸如Bcl-2、Bcl-XL)之上調及細胞存活。活化針對OX40之抗體旨在藉由延長T效應細胞之活化及分化來至少部分增強抗原特異性免疫反應。除對經抗原活化之T效應細胞之影響外，靶向由T調節細胞表現之OX40亦可有助於假定之作用機制。T調節細胞於腫瘤微環境內表現高濃度之OX40。OX40活化已顯示影響T調節細胞之抑制能力及導致來自腫瘤微環境之OX40陽性T調節細胞之活性消耗。在一個態樣中，本發明係關於特異性結合OX40之抗體。如本文使用，術語「抗體」 (Ab)係指特異性結合至特定抗原(本文中為OX40)之免疫球蛋白分子。在一些實施例中，該等本發明之抗OX40抗體結合至人類OX40 (SEQ ID NO: 1) (NCBI參考序列NP003318)並藉此調節免疫系統。所得之免疫系統反應對腫瘤細胞具有細胞毒性。抗OX40抗體之輕鏈可變域及重鏈可變域均包含互補決定區(CDR)，亦稱為高度可變區。可變域之更高度保守部分稱為框架(FR)。如此項技術中已知，描繪抗體之高度可變區之胺基酸位置/邊界可取決於上下文及此項技術中已知的各種定義變化。可變域內之一些位置可視為雜合高度可變位置，因為此等位置在一組標準下可視為於高度可變區內而在不同組之標準下視為於高度可變區外部。此等位置中之一或多者亦於經延伸之高度可變區中可見。本發明提供在此等雜合高度可變位置中包含修飾之抗體。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含由三個CDR連接(其等形成環連接，及在一些情況下形成β-折疊結構之一部分)之四個FR區(主要採用β-折疊構型)。各鏈中之CDR係藉由FR區緊密相鄰地固定在一起，且與來自其他鏈之CDR有助於形成抗體之靶結合位點。參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987)。如本文使用，除非另有指示，否則免疫球蛋白胺基酸殘基之編號係根據Kabat等人之免疫球蛋白胺基酸殘基編號系統完成。本發明之抗體本質上可為多株、單株、基因改造型及/或以其他方式經修飾，其等包括(但不限於)嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體。在一些實施例中，恆定區係選自以下之同型：：IgA (例如，IgA₁ 或IgA₂ )、IgD、IgE、IgG (例如，IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 或IgG₄ )及IgM。在特定實施例中，本文描述之抗OX40抗體包含IgG₁ 。在其他實施例中，該等抗OX40抗體包含IgG₂ 或IgG₄ 。如本文使用，抗體之「恆定區」包括天然恆定區、同種異型或天然變體(諸如D356E及L358M)或於人類IgG₁ 中之A431G。參見，例如，Jefferis及Lefranc, MAbs, 1(4): 332-338 (Jul-Aug 2009)。抗OX40抗體之輕恆定區可為kappa (κ)輕區或lambda (λ)區。λ輕區可為已知亞型中之任何一者，例如，λ₁ 、λ₂ 、λ₃ 或λ₄ 。在一些實施例中，該抗OX40抗體包含kappa (κ)輕區。如本文使用之術語「單株抗體」不限於通過融合瘤技術產生之抗體。單株抗體係藉由此項技術中可獲得或已知的任何方法衍生自單一純系(包括任何真核、原核或噬菌體純系)。適用於本發明之單株抗體可使用此項技術中已知的各種技術製備，該等技術包括使用融合瘤、重組及噬菌體顯示技術或其組合。在本發明之許多用途中，可使用包括抗OX40抗體於人類、嵌合、人類化或人類抗體中之活體內用途。如本文使用之術語「嵌合」抗體係指具有衍生自非人類免疫球蛋白(諸如大鼠或小鼠抗體)之可變序列及通常選自人類免疫球蛋白模板之人類免疫球蛋白恆定區之抗體。用於產生嵌合抗體之方法已為此項技術中已知。參見，例如，Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7；Oi等人，1986, BioTechniques 4:214-221；Gillies等人，1985, J. Immunol. Methods 125:191-202；美國專利案第5,807,715、4,816,567及4,816,397號。非人類(例如，鼠科)抗體之「人類化」形式係含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合免疫球蛋白。一般而言，人類化抗體將包含大體上所有至少一個及通常兩個可變域，其中所有或大體上所有CDR區對應於彼等非人類免疫球蛋白之CDR區及所有或大體上所有FR區係彼等人類免疫球蛋白序列之FR區。該人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白共同序列之一部分。抗體人類化之方法為此項技術中已知。參見，例如，Riechmann等人，1988, Nature 332:323-7；Queen等人之美國專利案第5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,762及6,180,370號；EP239400；PCT公開案WO 91/09967；美國專利案第5,225,539、EP592106、EP519596號；Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498；Studnicka等人，1994, Prot. Eng. 7:805-814；Roguska等人，1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973；及美國專利案第5,565,332號。「人類抗體」包括具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列之抗體及包括分離自人類免疫球蛋白庫或分離自針對一或多種人類免疫球蛋白轉基因之動物且不顯示內源性免疫球蛋白之抗體。人類抗體可藉由此項技術中已知的各種方法製得，該等方法包括使用衍生自人類免疫球蛋白序列之抗體庫之噬菌體顯示方法。參見美國專利案第4,444,887及4,716,111號；及PCT公開案WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735及WO 91/10741。人類抗體亦可使用無法表現功能內源性免疫球蛋白但可表現人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠產生。參見，例如，PCT公開案WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美國專利案第5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771及5,939,598號。另外，諸如LakePharma, Inc. (Belmont, CA)或Creative BioLabs (Shirley, NY)之公司可致力於使用與上文描述之技術相似之技術提供針對所選抗原之人類抗體。識別所選抗原決定基之完全人類抗體可使用被稱為「引導選擇」之技術產生。在此方法中，使用所選非人類單株抗體(例如，小鼠抗體)以引導對識別相同抗原決定基之完全人類抗體之選擇(參見，Jespers等人，1988, Biotechnology 12:899-903)。亦預期抗OX40抗體結合片段。本發明之結合片段包括彼等可特異性結合OX40者。抗體結合片段之實例藉助於實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fv片段、單鏈Fv (scFv)片段及單域片段。 Fab片段含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於Fab'片段之重鏈CH1域之羧基端添加一些殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'片段係藉由裂解F(ab')₂ 胃蛋白酶消化產物之鉸鏈半胱胺酸處之二硫鍵產生。抗體片段之額外化學偶合為一般技術者已知。相較於完整抗體，Fab及F(ab')₂ 片段缺乏完整抗體之片段可結晶(Fc)區，自動物之循環更快速清除及可具有更少之非特異性組織結合(參見，例如，Wahl等人，1983, J. Nucl. Med. 24:316)。如此項技術中通常瞭解，「Fc」區係抗體之不包含抗原特異性結合區之片段可結晶恆定區。在IgG、IgA及IgD抗體同型中，該Fc區係由兩個衍生自抗體之兩個重鏈之第二及第三恆定域(分別CH2及CH3域)之相同蛋白質片段組成。IgM及IgE Fc區於各多肽鏈中含有三個重鏈恆定域(CH2、CH3及CH4域)。「Fv」片段係抗體之含有完全靶識別及結合位點之最小片段。此區由以緊密、非共價結合(V_H -V_L 二聚體)之一個重鏈及一個輕鏈可變域之二聚體組成。在此構型中，各可變域之三個CDR相互作用以於V_H -V_L 二聚體之表面上界定靶結合位點。通常，六個CDR向抗體賦予靶結合特異性。然而，在一些實例中，甚至單一可變域(或半個Fv，其包含僅三個對靶具有特異性之CDR)仍可具有識別並結合靶之能力，但親和力低於整個結合位點。「單鏈Fv」或「scFv」抗體結合片段包含抗體之V_H 及V_L 域，其中此等域存在於單一多肽鏈中。通常，該Fv多肽在V_H 與V_L 域之間進一步包含多肽連接子，該連接子可使scFv形成有利於靶結合之結構。「單域片段」係由對OX40顯示足夠親和力之單一V_H 或V_L 域組成。在特定實施例中，單域片段係經駱駝化(參見，例如，Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25–38)。本發明之抗OX40抗體包括衍生型抗體。例如，衍生型抗體係通常藉由以下修飾：醣化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/阻斷基團之衍生化、蛋白水解裂解、結合至細胞配體或其他蛋白質。許多化學修飾中之任何一者可藉由已知技術進行，該等技術包括(但不限於)衣黴素之特異性化學裂解、乙醯化、甲醯化、代謝合成等。另外，衍生物可含有一或多種非天然胺基酸，例如，使用ambrx技術(參見，例如，Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011-2)。抗OX40抗體可為序列已經修飾以改變至少一種恆定區介導之生物效應功能之抗體。例如，在一些實施例中，相對於未經修飾之抗體，抗OX40抗體可經修飾以減少至少一種恆定區介導之生物效應功能，例如，減少結合至Fc受體(FcγR)諸如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA及/或FcγRIIIB中之一或多者。FcγR結合可藉由使抗體之免疫球蛋白恆定區片段之FcγR相互作用所需之特定區突變來減少(參見，例如，Canfield及Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491；及Lund等人，1991, J. Immunol. 147:2657-2662)。抗體之FcγR結合能力之減小亦可減小其他依賴於FcγR相互作用之效應功能，諸如調理作用、吞噬作用及抗原依賴性細胞毒性(「ADCC」)。在一說明性實例中，相較於相應之野生型恆定區，於Fc區之CH2域中具有V263L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S或V273Y取代之變體CH2域可顯示減小之對FcγRIIB之親和力。本文描述之抗OX40抗體包括相對於未經修飾之抗體，已經修飾以獲得或改善至少一種恆定區介導之生物效應功能，例如，以增強FcγR相互作用之抗體(參見，例如，US專利申請案第2006/0134709號)。例如，本發明之抗OX40抗體可具有以比相應之野生型恆定區更大之親和力結合FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA及/或FcγRIIIB之恆定區。在一說明性實例中，相較於相應之野生型恆定區，於Fc區之CH2域中具有V263L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S或V273Y取代之變體CH2域可顯示更大之對FcγRIIIA之親和力。因此，本發明之抗OX40抗體可具有導致增加或減少之調理作用、吞噬作用或ADCC之生物活性改變。此等改變為此項技術中已知。例如，減小ADCC活性之抗體之修飾係描述於美國專利案第5,834,597號中。示例性降低ADCC之變體對應於「突變體3」 (亦稱為「M3」，其顯示於美國專利案第5,834,597號之圖4中)，其中殘基234及237 (使用EU編號)係經丙胺酸取代。突變體3 (亦稱為「M3」)變化可用於許多抗體同型(例如，人類IgG₂ M3)中。可修飾抗OX40抗體之FcγR結合及/或ADCC效應功能之額外之取代包括Fc區中之K322A取代或L234A及L235A雙取代，例如，具有L234A/L235A雙取代之人類IgG₁ 。參見，例如，Hezareh等人， J. Virol., 75 (24): 12161-12168 (2001)。在一些實施例中，抗OX40抗體具有低濃度巖藻糖或缺乏巖藻糖。缺乏巖藻糖之抗體已與增強之ADCC活性相關，在低劑量之抗體下尤其如此。參見Shields等人，2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Shinkawa等人，2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73。製備缺乏巖藻糖之抗體之方法包括於大鼠骨髓瘤YB2/0細胞(ATCC CRL 1662)中之生長。YB2/0細胞表現低程度之FUT8 mRNA，其編碼α-1,6-巖藻糖轉移酶(多肽之巖藻醣化必需之酶)。抗OX40抗體可包含經修飾之(或變體)CH2域或整個Fc域，其等包括相較於相應之野生型CH2或Fc區之結合，增加對FcγRIIB之結合及/或減小對FcγRIIIA之結合之胺基酸取代。變體CH2或變體Fc域已描述於美國專利申請案第2014/0377253號中。變體CH2或變體Fc域通常包括一或多個於位置263、位置266、位置273及位置305處之取代，其中殘基於Fc域中之編號係如Kabat中之EU索引之編號。在一些實施例中，相對於野生型CH2域，抗OX40抗體包含一或多個選自以下之取代：263L、V266L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S、V273Y、V305K及V305W。在特定實施例中，相對於人類IgG₁ 之CH2域，CH2域之一或多個取代係選自V263L、V273E、V273F、V273M、V273S及V273Y。例如，IgG₁ CH2域之一或多個取代可為V273E。在另一特定實施例中，本發明之抗OX40抗體包含包含胺基酸取代V263L之變體IgG₁ CH2域。相較於相應之野生型CH2或Fc區之結合，可提供增加之對FcγRIIB之結合及/或提供減小之對FcγRIIIA之結合之變體CH2或變體Fc域之其他實例包括彼等於Vonderheide等人，Clin. Cancer Res., 19(5)，1035-1043 (2013)中發現者，諸如人類IgG₁ 中之S267E或S267E/L328F。在一些實施例中，抗OX40抗體包括增加或減小其對胎兒Fc受體(FcRn)之結合親和力之修飾，例如藉由使免疫球蛋白恆定區片段之涉及FcRn相互作用之特定區突變(參見例如WO 2005/123780)。在特定實施例中，IgG類別之抗OX40抗體係經突變使得重鏈恆定區之胺基酸殘基250、314及428中之至少一者係單獨經取代或其任何組合經取代，諸如於位置250及428，或於位置250及314，或於位置314及428，或於位置250、314及428，以位置250及428為一個特定組合。就位置250而言，取代胺基酸殘基可為除蘇胺酸外之任何胺基酸殘基，其包括(但不限於)丙胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、離胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、絲胺酸、纈胺酸、色胺酸或酪胺酸。就位置314而言，取代胺基酸殘基可為除白胺酸外之任何胺基酸殘基，其包括(但不限於)丙胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、色胺酸或酪胺酸。就位置428而言，取代胺基酸殘基可為除甲硫胺酸外之任何胺基酸殘基，其包括(但不限於)丙胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、離胺酸、白胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、色胺酸或酪胺酸。已知修飾Fc效應功能之示例性取代係Fc取代M428L，其可與Fc取代T250Q組合發生。合適之胺基酸取代之另外特定組合係識別於美國專利案第7,217,797號之表1中。此等突變增強對FcRn之結合，其保護抗體免於降解並增加其半衰期。抗OX40抗體可具有一或多種嵌入其CDR之一或多者內之胺基酸，例如描述於Jung及Plückthun, 1997, Protein Engineering 10:8, 959-966；Yazaki等人，2004, Protein Eng. Des Sel. 17(5):481-9. Epub 2004 Aug 17；及美國專利申請案第2007/0280931號中。對人類OX40 (SEQ ID NO: 1)具有高親和力之抗OX40抗體可為治療及診斷用途所需。因此，本發明設想對人類OX40具有高結合親和力之抗體。在特定實施例中，該等抗OX40抗體以至少約100 nM之親和力結合人類OX40，但可顯示更高之親和力，例如至少約90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或甚至更高。在一些實施例中，該等抗體以在約1 pM至約100 nM範圍內之親和力，或以在前述值之任一者之間之親和力，諸如(但不限於)自約0.001至10 nM、0.001至5 nM、0.01至100 nM、0.01至50 nM、0.01至10 nM、0.01至5 nM或0.01至1 nM結合人類OX40。抗OX40抗體對人類OX40之親和力可使用此項技術中熟知或本文描述之技術測定，諸如，例如(但不限於)ELISA、等溫滴定量熱法(ITC)、表面電漿子共振或螢光極化分析。抗OX40抗體通常包含包含具有三個本文中稱為(以N→C順序) V_H CDR#1、V_H CDR#2及V_H CDR#3之互補決定區(「CDR」)之可變區(V_H )之重鏈，及包含具有三個本文稱為(以N→C順序) V_L CDR#1、V_L CDR#2及V_L CDR#3之互補決定區之可變區(V_L )之輕鏈。本文提供示例性CDR之胺基酸序列以及示例性抗OX40之重鏈及輕鏈之V_H 及V_L 區之胺基酸序列。抗OX40抗體之特定實施例包括此等示例性CDR及/或V_H 及/或V_L 序列及與此等抗體競爭結合人類OX40之抗體。在一些實施例中，抗OX40抗體之CDR之胺基酸序列具有選自選自下表3中其各自V_H 及V_L CDR序列之序列：

本文描述具有上文CDR之抗OX40抗體之特定示例性實施例。在一些實施例中，抗OX40抗體具有根據SEQ ID NO: 101、102、103、104、105及106之CDR。在一些實施例中，抗OX40抗體具有根據SEQ ID NO: 111、112、113、114、115及116之CDR。在一些實施例中，抗OX40抗體具有根據SEQ ID NO: 121、122、123、114、125及126之CDR。在一些實施例中，抗OX40抗體具有根據SEQ ID NO: 131、132、133、114、115及136之CDR。本文描述之CDR於本發明之抗OX40抗體之V_H 及V_L 鏈內形成結合元件。下表4及5描述對應於含有上文描述之CDR之示例性抗OX40抗體之V_H 及V_L 鏈。表4及5中給CDR加下劃線。在一些實施例中，抗OX40抗體包含具有如表4中描述之胺基酸序列之V_H 鏈：

及具有如表5中描述之胺基酸序列之V_L 鏈：

在一些實施例中，抗OX40抗體包含具有根據SEQ ID NO: 21之胺基酸序列之V_H 鏈，及具有根據SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之V_L 鏈。在一些實施例中，抗OX40抗體包含具有根據SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之V_H 鏈，及具有根據SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之V_L 鏈。在一些實施例中，抗OX40抗體包含具有根據SEQ ID NO: 25之胺基酸序列之V_H 鏈，及具有根據SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之V_L 鏈。在一些實施例中，抗OX40抗體包含具有根據SEQ ID NO: 27之胺基酸序列之V_H 鏈，及具有根據SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之V_L 鏈。在一些實施例中，抗OX40抗體適用於向人類投與。在特定實施例中，該抗OX40抗體係經人類化。在一些實施例中，抗OX40抗體包含具有根據SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之V_H 鏈，及具有根據SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之V_L 鏈。在一些實施例中，抗OX40抗體包含具有根據SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之V_H 鏈，及具有根據SEQ ID NO: 34之胺基酸序列之V_L 鏈。在一些實施例中，抗OX40抗體包含具有根據SEQ ID NO: 26之胺基酸序列之V_H 鏈，及具有根據SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之V_L 鏈。在一些實施例中，抗OX40抗體包含具有根據SEQ ID NO: 28之胺基酸序列之V_H 鏈，及具有根據SEQ ID NO: 38之胺基酸序列之V_L 鏈。熟習此項技術者應瞭解本文描述之抗OX40抗體中之V_H 或V_L 序列之某些突變提供位於本發明之範圍內之抗OX40抗體。突變可包括來自如本文揭示之V_H 或V_L 序列之胺基酸取代、添加或刪除，同時保留顯著之抗OX40活性。因此，在一些實施例中，抗OX40抗體包含與表4中顯示之V_H 序列中之任何一者具有至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性之V_H 序列。相較於表4中顯示之V_H 序列中之任何一者，抗OX40抗體可包含具有多達8、多達7、多達6、多達5、多達4、多達3或多達2個突變之V_H 序列。在一些實施例中，相較於表4中顯示之V_H 序列中之任何一者，抗OX40抗體可包含具有5或更少、4或更少、3或更少或2或更少之突變之V_H 序列。在一些實施例中，抗OX40抗體包含與表5中顯示之V_L 序列中之任何一者具有至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性之V_L 序列。相較於表5中顯示之V_L 序列中之任何一者，抗OX40抗體可包含具有多達8、多達7、多達6、多達5、多達4、多達3或多達2個突變之V_L 序列。在一些實施例中，相較於表5中顯示之V_L 序列中之任何一者，抗OX40抗體可包含具有5或更少、4或更少、3或更少或2或更少之突變之V_L 序列。全長重鏈及輕鏈胺基酸序列大體上包含連接至適當免疫球蛋白恆定區(例如，人類IgG₁ 或κ輕恆定區)之上文描述之V_H 或V_L 鏈，。可發生抗OX40抗體之全長序列之轉譯後修飾，諸如抗體重鏈之C端末端上之一或多個(例如，1、2、3或多個)胺基酸殘基之裂解。此等裂解產物可包含如表現之抗OX40抗體中之一些或所有。因此，在一些實施例中，抗OX40抗體包含如表6中描述之重鏈胺基酸序列：

及如表7中描述之輕鏈胺基酸序列：

其中加下劃線之胺基酸表示CDR及斜體胺基酸表示恆定區。在一些實施例中，抗OX40抗體包含根據SEQ ID NO: 41或42之重鏈胺基酸序列，及根據SEQ ID NO: 51之輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗OX40抗體包含根據SEQ ID NO: 43或44之重鏈胺基酸序列，及根據SEQ ID NO: 52之輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗OX40抗體包含根據SEQ ID NO: 45或46之重鏈胺基酸序列，及根據SEQ ID NO: 53之輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗OX40抗體包含根據SEQ ID NO: 47或48之重鏈胺基酸序列，及根據SEQ ID NO: 54之輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗OX40抗體包含與根據SEQ ID NO: 41至48中之任何一者之重鏈序列具有至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性之重鏈序列。相較於根據SEQ ID NO: 41至48中之任何一者之重鏈序列，抗OX40抗體可包含具有多達8、多達7、多達6、多達5、多達4、多達3或多達2個突變之重鏈序列。在一些實施例中，相較於根據SEQ ID NO: 41至48中之任何一者之重鏈序列，抗OX40抗體可包含具有5或更少、4或更少、3或更少或2或更少之突變之重鏈序列。在一些實施例中，抗OX40抗體包含與根據SEQ ID NO: 51至54中之任何一者之輕鏈序列具有至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性之輕鏈序列。相較於根據SEQ ID NO: 51至54中之任何一者之輕鏈序列，抗OX40抗體可包含具有多達8、多達7、多達6、多達5、多達4、多達3或多達2個突變之輕鏈序列。在一些實施例中，相較於根據SEQ ID NO: 51至54中之任何一者之輕鏈序列，抗OX40抗體可包含具有5或更少、4或更少、3或更少或2或更少之突變之輕鏈序列。抗OX40抗體之額外轉譯後修飾可包括醣化。常見雙觸複合體可由具有兩個N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)、三個甘露糖及兩個β-1,2連接至α-6甘露糖及α-3甘露糖以形成兩個觸角之GlcNAc殘基之核結構組成。一或多個巖藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)、高甘露糖聚糖Man-5或Man-9、平分型GlcNAc及包括N-乙醯基神經胺糖酸(NANA)或N-乙醇醯神經胺糖酸(NGNA)殘基之唾液酸可連接至該核。N-連接型糖形式可包括G0 (具有核雙觸醣化結構之蛋白質)、G0F (巖藻糖化G0)、G0F GlcNAc、G1 (具有含一個半乳糖殘基之核醣化結構之蛋白質)、G1F (巖藻糖化G1)、G2 (具有含兩個半乳糖殘基之核醣化結構之蛋白質)及/或G2F (巖藻糖化G2)。在一些實施例中，抗OX40抗體於活體外分析中與參考抗體競爭結合人類OX40 (SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，該等抗OX40抗體競爭結合表現人類OX40之細胞上之人類OX40。該參考抗體可為本文描述之抗OX40抗體中之任何一者。在一些實施例中，該參考抗體為具有根據表4中描述之一者之V_H 及根據表5中描述之一者之V_L 之抗體。在特定實施例中，該參考抗體為包含Mu3726 V_H 及Mu3726 V_L 之小鼠抗體(「Mu3726」)、包含Mu3738 V_H 及Mu3738 V_L 之小鼠抗體(「Mu3738」)、包含Mu3739 V_H 及Mu3739 V_L 之小鼠抗體(「Mu3739」)或包含Mu3741 V_H 及Mu3741 V_L 之小鼠抗體(「Mu3741」)。在一些實施例中，該參考抗體係Mu3726、Mu3738、Mu3739或Mu3741之人類化形式。在某些實施例中，該參考抗體係包含根據SEQ ID NO: 41或42之重鏈及根據SEQ ID NO: 51之輕鏈之人類化抗體(「Hu3738」)、包含根據SEQ ID NO: 43或44之重鏈及根據SEQ ID NO: 52之輕鏈之人類化抗體(「Hu3726」)、包含根據SEQ ID NO: 45或46之重鏈及根據SEQ ID NO: 53之輕鏈之人類化抗體(「Hu3739」)或包含根據SEQ ID NO: 47或48之重鏈及根據SEQ ID NO: 54之輕鏈之人類化抗體(「Hu3741」)。本文描述之抗OX40抗體大體上特異性結合至人類OX40。用於結合至來自其他物種(例如，來自猴，例如，食蟹猴)之OX40之抗體之交叉反應性可提供優勢，諸如於猴動物模型中測試生物活性之能力。此動物模型測試可用以篩選抗OX40抗體選擇與效用相關之性質(例如，有利之藥物動力學)或彼等與安全性相關之性質(例如，增加之肝毒性)。在一些實施例中，抗OX40抗體結合至食蟹猴OX40 (SEQ ID NO: 2) (NCBI參考序列XP005545179)及人類OX40。在一些實施例中，抗OX40抗體不結合至小鼠OX40 (SEQ ID NO: 3) (NCBI參考序列NP037181)。用於競爭之分析包括(但不限於)放射性材料標記免疫分析(RIA)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、夾心ELISA、螢光活化細胞分選(FACS)分析及表面電漿子共振分析。表面電漿子共振(SPR)分析容許直接量測兩種蛋白質(例如，受體與抗體，諸如人類OX40受體與抗OX40抗體)之間的結合動力學而無需報導子信號或標誌。平衡解離常數K_D (結合親和力之量度)及其兩個分量(結合動力學速率常數k_a (M^-1 -sec^-1 ) (結合常數，k_on 或「結合速率」)及k_d (sec^-1 ) (解離常數，k_off 或「解離速率」))皆可使用SPR測定。該等常數係由下列等式相關： K_D = k_d / k_a 。在一些實施例中，抗OX40抗體具有至少約100 nM之K_D ，但可顯示更高之親和力，例如，至少約90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或甚至更高。在一些實施例中，該抗OX40抗體具有在約1 pM至約100 nM之範圍內之K_D ，或在前述值中之任何一者之間之親和力，諸如(但不限於)自約0.001至10 nM、0.001至5 nM、0.01至100 nM、0.01至50 nM、0.01至10 nM、0.01至5 nM或約0.01至1 nM。在一些實施例中，抗OX40抗體具有不大於約10 sec^-1 之解離常數k_d ，例如，不大於約1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001 sec^-1 或甚至更低。在一些實施例中，該抗OX40抗體具有在約0.001 sec^-1 至約10 sec^-1 之範圍內之k_d 或在前述值中之任何一者之間之k_d ，諸如(但不限於)自約0.01至10 sec^-1 、0.001至0.5 sec^-1 、0.001至0.2 sec^-1 、0.001至0.1 sec^-1 、0.01至1 sec^-1 、0.001至0.05 sec^-1 或約0.001至1 sec^-1 。在一些實施例中，抗OX40抗體具有至少約10⁴ M^-1 -sec^-1 之結合常數k_a ，例如，至少約1 × 10⁴ 、5 × 10⁴ 、1 × 10⁵ 、5 × 10⁵ 、1 × 10⁶ 、5 × 10⁶ 、1 × 10⁷ M^-1 -sec^-1 或甚至更大。在一些實施例中，該抗OX40抗體具有在約10⁴ M^-1 -sec^-1 至約10⁷ M^-1 -sec^-1 之範圍內之k_d 或在前述值中之任何一者之間之k_a ，諸如(但不限於)自約5 × 10⁴ 至1 × 10⁷ M^-1 -sec^-1 、5 × 10⁴ 至5 × 10⁶ M^-1 -sec^-1 或約1 × 10⁴ 至5 × 10⁶ M^-1 -sec^-1 。本發明之抗OX40抗體可顯示在約針對本文描述之示例性抗OX40抗體中之任何一者所量測之結合動力學常數之範圍內之K_D 、k_d 或k_a 。例如，在一些實施例中，抗OX40抗體具有介於Hu3738、Hu3726、Hu3739及Hu3741中之任何一者之k_d 之約0.01至約100倍例如約0.1至約10倍或約0.5至約5倍之範圍內之解離常數k_d 。在一些實施例中，抗OX40抗體具有介於Hu3738、Hu3726、Hu3739及Hu3741中之任何一者之k_a 之約0.01至約100倍例如約0.1至約10倍或約0.5至約5倍之範圍內之結合常數k_a 。在參考抗體與測試抗體(不考慮物種或同型)之間進行抗體競爭分析時，吾人可用可偵測標記(諸如螢光團、生物素或酶(或甚至放射性)標記)首先標記參考抗體以可進行後續識別。在此情況下，表現人類OX40之細胞係用未經標記之測試抗體培養，添加經標記之參考抗體，並量測已結合之標記之強度。若測試抗體藉由結合至重疊抗原決定基與經標記之參考抗體競爭，則相對於在無測試抗體之情況下進行之對照反應，強度將減小。在此分析之一特定實施例中，首先測定在分析條件下產生80%之最大結合(「conc_80% 」)之經標記之參考抗體之濃度(例如，細胞之指定密度)，並用10X conc_80% 未經標記之測試抗體及conc_80% 經標記之參考抗體進行競爭分析。抑制可以根據下式計算之抑制常數或K_i 表示： K_i = IC₅₀ / (1 + [參考Ab濃度]/K_d )，其中IC₅₀ 係產生參考抗體結合之50%減小之測試抗體之濃度，及K_d 係參考抗體之解離常數，一種其對人類OX40之親和力之量度。與本文揭示之抗OX40抗體競爭之抗體在本文描述之分析條件下可具有自10 pM至100 nM之K_i 。在各種實施例中，若在所使用之特定分析條件下參考抗體濃度為最大結合之80%且測試抗體濃度比參考抗體濃度高10倍，測試抗體使參考抗體之結合減小至少約20%或更大，例如至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至更大，或在前述值中任一者之間範圍內之百分率，則認為測試抗體與參考抗體競爭。適用於評估抗體是否與如本文描述之參考抗體競爭結合人類OX40之特異性分析及分析條件係提供於章節8.1.4中。在一些實施例中，本發明之抗OX40抗體活化人類OX40 (SEQ ID NO: 1)。OX40受體活化可藉由許多機制發生，例如藉由提供針對OX40受體之配體樣活性。在此等情況下，抗OX40抗體與人類OX40配體(OX40L，CD252；UniProtKB/Swiss-Prot Code P23510.1) (SEQ ID NO: 4)競爭結合至OX40受體。本發明之抗OX40抗體可大體上在交聯存在下活化OX40受體。適用於評估抗OX40抗體在交聯存在下是否可活化OX40受體(例如人類OX40受體(SEQ ID NO: 1))之特異性分析及分析條件係提供於章節8.1.8中。在一些實施例中，抗OX40抗體在交聯存在下以自約1 pM至約500 nM，諸如(但不限於)自約0.01至約300 nM、自約0.01至約100 nM、自約0.01至約10 nM、自約0.01至約1 nM、自約0.1至約300 nM、自約0.1 nM至約100 nM、自約1 nM至約100 nM或自約0.1 nM至約100 nM之EC₅₀ 活化人類OX40受體。在一些實施例中，100 μg/mL之抗OX40抗體可在交聯存在下將人類OX40受體活化至相較於人類OX40受體在缺乏抗OX40抗體之情況下之活性高至少約3倍，諸如自約3至約1000，例如約5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、200、400、500、700、800或約1000倍之活性。交聯可藉由許多方法提供，包括添加外源性交聯劑，例如，藉由對人類或人類化抗體之重、輕或可變區具特異性之抗體或抗體F(ab')₂ 片段；藉由可溶性或經固定之蛋白A；藉由經Fc受體轉染之細胞系；藉由表現內源性Fc受體之細胞系；藉由將個體抗體直接塗覆至塑膠表面；藉由經外源性交聯抗體或Fc受體塗覆之塑膠表面；或藉由結合至上文中之任何一者之珠。在一說明性實例中，個體抗體可結合至蛋白質(諸如生物素)，及可溶性或經固定之抗生物素蛋白或鏈黴親和素係用作交聯劑。在另一實例中，在活體內人類淋巴結中，OX40在結合至抗OX40抗體後之活化預期在由內源性FcγR+抗原呈現細胞提供之受體交聯後發生。在一些實施例中，抗OX40抗體在缺乏交聯之情況下結合並活化人類OX40受體。在一些實施例中，抗OX40抗體在缺乏OX40L(例如，人類OX40L (SEQ ID NO: 4))之情況下活化OX40受體(例如，人類OX40受體(SEQ ID NO: 1))。適用於評估抗OX40抗體是否可在無交聯之情況下活化OX40受體之特異性分析及分析條件係提供於章節8.1.8中。在一些實施例中，抗OX40抗體在無交聯之情況下以自約1 pM至約500 nM，諸如(但不限於)自約0.01至約300 nM、自約0.01至約100 nM、自約0.1至約300 nM、自約0.1 nM至約100 nM、自約1 nM至約100 nM、自約0.1 nM至約100 nM、自約1至約300 nM、自約1至約100 nM、自約1至約50 nM或自約10至約100 nM之EC₅₀ 活化人類OX40受體。在一些實施例中，100 μg/mL之抗OX40抗體可在無交聯之情況下將人類OX40受體活化至相較於用當量之同型抗體投藥之人類OX40受體之活性高至少約5倍，諸如自約5至約1000，例如，約5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、200、300、400、500、700、800或約1000倍之活性。在一些實施例中，10 μg/mL之抗OX40抗體可在無交聯之情況下將人類OX40受體活化至相較於用當量之同型抗體投藥之人類OX40受體之活性高至少約3倍，諸如自約3至約300，例如，約3、5、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、60、80、100、200或約300倍之活性。在一些實施例中，1 μg/mL之抗OX40抗體可在無交聯之情況下將人類OX40受體活化至相較於用當量之同型抗體投藥之人類OX40受體之活性高至少約3倍，諸如自約3至約150，例如，約3、4、5、6、7、8、10、12、15、20、25、30、40、50、60、80、100或約150倍之活性。在一些實施例中，相較於無交聯，抗OX40抗體在交聯之存在下以更高程度活化OX40受體(例如，人類OX40受體(SEQ ID NO: 1))。適用於測定其中抗OX40抗體可在無交聯之情況下活化OX40受體之程度之特異性分析及分析條件係提供於章節8.1.8中。活化程度可(例如)以EC₅₀ 及/或觀測最大活化來衡量。在一些實施例中，相較於在根據章節8.1.8之分析中無交聯之NF-κB活性，100 μg/mL之抗OX40抗體在無交聯之情況下以自約20%至約95%之NF-κB活性，諸如約25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或約90%活化OX40受體(例如，人類OX40受體(SEQ ID NO: 1))。在一些實施例中，在根據章節8.1.8之分析中，抗OX40抗體在無交聯之情況下以自約0.1 nM至約500 nM，諸如(但不限於)自約1 nM至約100 nM、自約0.1 nM至約100 nM、自約1至約300 nM、自約1至約100 nM、自約1至約50 nM或自約10至約100 nM之EC₅₀ 活化人類OX40受體。在一些此等實施例中，10 μg/mL之抗OX40抗體可在無交聯之情況下將人類OX40受體活化至相較於用當量之同型抗體投藥之人類OX40受體之活性高至少約3倍，諸如自約3至約300，例如，約3、5、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、60、80、100、200或約300倍之活性。在一些此等實施例中，在根據章節8.1.8之分析中，抗OX40抗體在交聯之存在下以自約1 pM至約300 nM，諸如(但不限於)自約0.01至約300 nM、自約0.01至約100 nM、自約0.01至約10 nM、自約0.01至約1 nM、自約0.1至約300 nM、自約0.1 nM至約100 nM、自約1 nM至約100 nM或自約0.1 nM至約100 nM之EC₅₀ 活化人類OX40受體。在一些此等實施例中，在根據章節8.1.8之分析中，抗OX40抗體可在交聯之存在下以相較於美國公開案第2015/0307617號中描述之抗體1A7之EC₅₀ 更低諸如低約1.5至約100倍，諸如自約1.5至約10倍，例如，約2、3、4、5、6、7、8、9或約10倍之EC₅₀ 活化人類OX40受體。在根據章節8.1.8之分析中，本發明之抗OX40抗體可在無交聯之情況下以自約1 nM至約100 nM之EC₅₀ 活化人類OX40受體及在根據章節8.1.8之分析中在交聯之存在下可以相較於美國公開案第2015/0307617號中描述之抗體1A7之EC₅₀ 更低之EC₅₀ ，諸如低約1.5至約10倍之EC₅₀ 活化人類OX40受體。具有上文列舉之性質之示例性抗OX40抗體包括如本文中實例2至8中描述之Mu3738及Hu3738。通常，用抗OX40抗體治療後之OX40活化導致信號轉導，諸如細胞介素(例如，干擾素-γ (IFN-γ))產生之增加及/或細胞增殖(例如，CD4+ T細胞增殖)之增加。在一些實施例中，在用1 μg/mL抗OX40抗體治療後之IFN-γ產生之增加係在用當量之同型抗體治療後之IFN-γ產生之濃度之約1.5至約50倍，諸如約1.5、2、3、4、5、6、8、10、15、20、25、30、40或約50倍。在一些實施例中，在用1 μg/mL抗OX40抗體治療後之CD4+ T細胞增殖之增加係在用當量之同型抗體治療後之CD4+ T細胞增殖之程度之約1.5至約20倍，諸如約1.5、2、3、4、5、6、8、10、15或約20倍。用於測定細胞介素濃度或用於測定細胞增殖程度之分析為此項技術中已知。用於測定IFN-γ產生及/或CD4+ T細胞增殖之特異性分析及分析條件係提供於本文章節8.1.12中。 7.4. 編碼抗OX40抗體之多核苷酸、表現系統及製造其之方法本發明包含編碼抗OX40抗體之免疫球蛋白輕鏈及重鏈基因之核酸分子、包含此等核酸之載體及可產生本發明之抗OX40抗體之宿主細胞。本發明之抗OX40抗體可藉由免疫球蛋白輕鏈及重鏈基因於宿主細胞中之重組表現來製備。為重組表現抗體，宿主細胞係經一或多種攜載編碼抗體之免疫球蛋白輕鏈及重鏈之DNA片段之重組表現載體轉染使得該等輕鏈及重鏈於宿主細胞中表現及視需要分泌至培養宿主細胞之培養基內，可自該培養基回收抗體。使用標準重組DNA方法論以獲得抗體重鏈及輕鏈基因，將此等基因併入重組表現載體內並將該等載體引入宿主細胞內，諸如彼等描述於Molecular Cloning; A Laboratory Manual，第二版，(Sambrook、Fritsch及Maniatis編，Cold Spring Harbor, N. Y., 1989)、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M.等人編，Greene Publishing Associates, 1989)及於美國專利案第4,816,397號中者。為產生編碼此等抗OX40抗體之核酸，首先獲得編碼輕鏈及重鏈可變區之DNA片段。此等DNA可藉由編碼輕鏈及重鏈可變序列之生殖系DNA或cDNA之擴增及修飾獲得，例如使用聚合酶鏈式反應(PCR)。用於人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列為此項技術中已知(參見，例如，「VBASE」人類生殖系序列資料庫；亦參見Kabat, E. A.等人，1991, Sequences s of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson等人，1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198；及Cox等人，1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836)。一經獲得編碼抗OX40抗體相關之V_H 及V_L 片段之DNA片段，此等DNA片段可藉由標準重組DNA技術進一步操作，例如將可變區基因轉化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操作中，編碼V_L 或V_H 之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白質之另一DNA片段，諸如抗體恆定區或可撓性連接子。如此內文使用之術語「可操作地連接」旨在意指兩個DNA片段經相連使得由該等兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保留於框內。編碼V_H 區之經分離DNA可藉由將編碼V_H 之DNA可操作地連接至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2、CH3及視需要CH4)之另一DNA分子轉化為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知(參見，例如，Kabat, E.A.等人，1991, Sequences s of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號)及包含此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 、IgG₄ 、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但在某些實施例中係IgG₁ 或IgG₄ 。就Fab片段重鏈基因而言，編碼V_H 之DNA可操作地連接至編碼僅重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。編碼V_L 之經分離DNA可藉由將編碼V_L 之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子轉化為全長輕鏈基因(及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知(參見，例如，Kabat等人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)及包含此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但在某些實施例中係κ恆定區。為產生scFv基因，將編碼V_H 及V_L 之DNA片段可操作地連接至編碼可撓性連接子(例如，編碼胺基酸序列(Gly₄ ~Ser)₃ (SEQ ID NO: 60))之另一片段，使得V_H 及V_L 序列可表現為連續單鏈蛋白質，及V_L 與V_H 區由可撓性連接子連接(參見，例如，Bird等人，1988, Science 242:423-426；Huston等人，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等人，1990, Nature 348:552-554)。為表現本發明之抗OX40抗體，將如上文描述獲得之編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA嵌入表現載體內使得基因可操作地連接至轉錄及轉譯控制序列。在此內文中，術語「可操作地連接」旨在意指將抗體基因拼接至載體內使得載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其等調節抗體基因之轉錄及轉譯之預期功能。表現載體及表現控制序列係經選擇以與所用之表現宿主細胞可相容。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可嵌入各別載體內，或更通常兩種基因係嵌入相同表現載體內。抗體基因係藉由標準方法(例如，拼接抗體基因片段及載體上之互補限制位點，或若不存在限制位點則進行平端連接)嵌入表現載體內。在嵌入抗OX40抗體相關之輕鏈或重鏈序列之前，表現載體可已攜載抗體恆定區序列。例如，將抗OX40單株抗體相關之V_H 及V_L 序列轉化為全長抗體基因之一種方法係將其等嵌入已分別編碼重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體內，使得該V_H 片段可操作地連接至載體內之該(等)CH片段及該V_L 片段可操作地連接至載體內之CL片段。另外或或者，重組表現載體可編碼促進自宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。抗體鏈基因可選殖至載體內使得信號肽框內連接至抗體鏈基因之胺基端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源性信號肽(即，來自非免疫球蛋白蛋白質之信號肽)。除抗體鏈基因外，本發明之重組表現載體攜載控制抗體鏈基因於宿主細胞中之表現之調節序列。術語「調節序列」旨在包括控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯之啟動子、強化子及其他表現控制元件(例如，多腺核苷酸化信號)。此等調節序列係描述(例如)於Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990中。熟習此項技術者將知曉表現載體之設計(包括調節序列之選擇)可取決於諸如對待轉化之宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現程度等因素。適用於哺乳動物宿主細胞表現之調節序列包括於哺乳動物細胞中引起高蛋白質表現程度之病毒元件，諸如衍生自以下之啟動子及/或強化子：巨細胞病毒(CMV) (諸如CMV啟動子/強化子)、猿猴病毒40 (SV40) (諸如SV40啟動子/強化子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒。為進一步描述病毒調節元件及其序列，參見，例如，Stinski之美國專利案第5,168,062號、Bell等人美之國專利案第4,510,245號及Schaffner等人之美國專利案第4,968,615號。除抗體鏈基因及調節序列外，本發明之重組表現載體亦可攜載額外序列，諸如於宿主細胞中調節載體之複製之序列(例如，複製之起源)及可選擇標誌基因。可選擇標誌基因促進已引入載體之宿主細胞之選擇(參見，例如，皆為Axel等人之美國專利案第4,399,216、4,634,665及5,179,017號)。例如，通常，可選擇標誌基因向已引入載體之宿主細胞賦予對藥物(諸如G418、潮黴素或甲氨蝶呤)之抗性。合適之可選擇標誌基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(適用於具有甲氨蝶呤選擇/擴增之DHFR^- 宿主細胞中)及新黴素抗性基因(neo gene)(用於G418選擇)。就輕鏈及重鏈之表現而言，編碼重鏈及輕鏈之該(等)表現載體係藉由標準技術轉染至宿主細胞內。術語「轉染」之各種形式旨在包含通常用於將外源性DNA引入原核或真核宿主細胞內之各種技術，例如，電穿孔、脂質轉染、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及類似技術。可於原核或真核宿主細胞中表現本發明之抗OX40抗體。在某些實施例中，抗體之表現係於最佳化分泌適當折疊之免疫活性抗體之真核細胞(例如，哺乳動物宿主細胞)中進行。用於表現本發明之重組抗體之示例性哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞) (包括DHFR^- CHO細胞，描述於Urlaub及Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中，與DHFR可選擇標誌一起使用，例如，如描述於Kaufman及Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621中)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞內時，抗體係藉由將宿主細胞培養足以容許抗體於宿主細胞中表現或抗體分泌至生長宿主細胞之培養基內之時間週期產生。抗體可使用標準蛋白純化方法回收自培養基。宿主細胞亦可用以產生抗體之抗OX40結合片段，諸如Fab片段或scFv分子。應瞭解對上文過程之變更係在本發明之範圍內。例如，可希望用編碼本發明之抗OX40抗體之輕鏈或重鏈(但非兩者)之DNA轉染宿主細胞。重組DNA技術亦可用以移除編碼輕鏈及重鏈中之一者或兩者之DNA中之一些或所有，其等對結合至人類OX40而言不必要。自此等截短DNA分子表現之分子亦由本發明之抗體包含。就本發明之抗OX40抗體之重組表現而言，宿主細胞可經兩種本發明之表現載體(編碼重鏈衍生之多肽之第一載體及編碼輕鏈衍生之多肽之第二載體)共轉染。該等兩種載體可含有相同可選擇標誌，或其等可各含有各別可選擇標誌。或者，可使用編碼重鏈及輕鏈多肽兩者之單一載體。一經獲得編碼抗OX40抗體中之一或多個部分之核酸，可將其他改變或突變引入編碼序列內以(例如)產生編碼具有不同CDR序列之抗體、對Fc受體具有減小之親和力之抗體或不同子類之抗體之核酸。本發明之抗OX40抗體亦可藉由化學合成(例如，藉由Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.中描述之方法)產生。變體抗體亦可使用無細胞平臺產生(參見，例如，Chu等人，Biochemia No. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals)及Murray等人，2013, Current Opinion in Chemical Biology, 17:420–426)。倘若本發明之抗OX40抗體已由重組表現產生，則其可藉由此項技術中已知用於純化免疫球蛋白分子之任何方法(例如，藉由層析術(例如，離子交換層析術、親和層析術及篩分管柱層析術)、離心、差別溶解度，或藉由用於純化蛋白質之任何其他標準技術)純化。此外，本發明之抗OX40抗體可融合至本文描述的異源性多肽序列或此項技術中已知的其他異源性多肽序列以促進純化。一經分離，則抗OX40抗體可(視需要)例如藉由高效液相層析術(參見，例如，Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work and Burdon編，Elsevier, 1980)或藉由凝膠過濾層析術於Superdex^TM 75管柱(Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)上進一步純化。 7.5. 醫藥組合物本文描述之抗OX40抗體可呈包含抗體及一或多種載劑、賦形劑及/或稀釋劑(其等本文中均稱為「載劑」)，即，緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等滲劑、非離子型洗滌劑、抗氧化劑及其他雜項添加劑之組合物之形式。參見，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版(Osol編，1980)。該等組合物可針對特定用途調配，諸如針對獸醫用途或人類中之醫藥用途。組合物之形式(例如，乾燥粉末、液體調配物等)及使用之載劑將取決於抗體之預期用途及(針對治療用途)投與模式。就治療用途而言，組合物可作為包括醫藥上可接受之載劑之無菌醫藥組合物之一部分提供。此組合物可呈任何合適之形式(取決於向病患投與該組合物所需之方法)。醫藥組合物可藉由各種途徑向病患投與，諸如靜脈內、瘤內或鞘內。在任何給定情況下最合適之投與途徑將取決於特定抗體、個體及疾病之性質與嚴重性及該個體之身體狀況。通常，該醫藥組合物將靜脈內投與。醫藥組合物可便利地以每劑量含有既定量之本文描述之抗OX40抗體之單位劑型存在。單位劑量中包括之抗OX40抗體之量將取決於治療中之疾病及此項技術中熟知的其他因素。此等單位劑量可呈含有適用於單一投與之量之抗體之凍乾粉末之形式或呈液體之形式。乾燥粉末單位劑型可與注射器、合適量之載劑及/或適用於投與之其他組分一起包裝於套組中。液體形式之單位劑量可便利地以經適用於單一投與之量之抗OX40抗體預填充之注射器之形式提供。醫藥組合物亦可以含有適用於多次投與之量之抗OX40抗體之散裝形式提供。醫藥組合物可藉由將具有所需純度之抗體與此項技術中通常採用之可選醫藥上可接受之載劑混合來製備成凍乾調配物或水溶液以供儲存。此等添加劑在採用之劑量及濃度下應對接受者無毒。例如，就靜脈內投與而言，組合物可呈凍乾粉末之形式，該形式一經與適用於注射或輸注之無菌水或其他溶液(例如，0.9%生理鹽水，林格氏溶液、乳酸林格氏溶液等)復水即可提供水性組合物。 7.6. 使用方法 7.6.1 治療利益本文提供之資料證實本文揭示之抗OX40抗體在癌細胞之存在下活化OX40受體及活體內發揮針對癌症之強效抗癌活性。因此，抗OX40抗體及/或包含該等抗OX40抗體之醫藥組合物可在治療上用於治療癌症。在一些實施例中，該癌症係實體腫瘤。可用抗OX40抗體治療之實體腫瘤包括膀胱癌、乳癌(例如，三陰性乳癌)、頭頸癌、腎癌(例如，腎細胞癌)、肝癌(例如，肝細胞癌、膽管癌)、肺癌(例如，非小細胞肺癌、間皮瘤、小細胞肺癌)、黑色素瘤(例如，無法切除或轉移性黑色素瘤、晚期惡性黑色素瘤)、皮膚癌(例如，默克爾氏細胞癌)、卵巢癌、胃癌及具有DNA錯配修復缺陷證據之腫瘤。該癌症可包含含有表現OX40之細胞之腫瘤；包含其中一些含有表現OX40之細胞及其中一些不含表現OX40之細胞之腫瘤；或包含缺乏表現OX40之細胞之腫瘤。該癌症可為最新診斷及初次治療，或可復發、難治或復發且難治，或實體腫瘤之轉移性形式。在一些實施例中，該實體腫瘤係初次接受PD-1或PD-L1靶向劑之治療。在其他實施例中，該實體腫瘤係在用PD-1或PD-L1靶向劑治療後係復發或難治。在一些實施例中，該實體腫瘤係選自膀胱癌、乳癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、黑色素瘤及胃癌。在一些實施例中，該實體腫瘤係選自：黑色素瘤(例如，無法切除或轉移性黑色素瘤)、肺癌(例如，非小細胞肺癌)及腎細胞癌 (例如，晚期腎細胞癌)。在一些實施例中，該實體腫瘤係選自三陰性乳癌、卵巢癌、肝細胞癌、胃癌、小細胞肺癌、間皮瘤、膽管癌、默克爾氏細胞癌及具有DNA錯配修復缺陷證據之腫瘤。在某些實施例中，該肺癌係在鉑基化學治療時或之後進展之轉移性非小細胞肺癌。在某些實施例中，該肺癌係鉑基治療及使用PD-1或PD-L1靶向劑之治療失敗之局部晚期或轉移性非小細胞肺癌。在某些實施例中，該頭頸癌係不適合用局部或全身治療進行治癒性治療之復發性鱗狀細胞頭頸癌，或認為無法藉由局部治療治癒之口腔、口咽、咽喉及喉頭之轉移性(彌散性)頭頸鱗狀細胞癌。如上文討論，本發明揭示之抗OX40抗體調節免疫反應。因此，免疫系統受損之病患可排除自治療外。在一些實施例中，排除滿足下列標準中之一或多者後之病患：(1)在過去2年內主動或事先記錄自身免疫疾病(包括(但不限於)炎性腸病、乳糜瀉、韋氏症候群)。(不排除患有兒童異位性皮膚炎或哮喘、白癜風、禿頭症、橋本症候群、格雷夫斯病或無需全身治療之牛皮癬(在過去2年內)之個體)；(2)有原發性免疫缺陷、骨髓移植、慢性淋巴細胞白血病、實體器官移植或肺結核之先前臨床診斷之病史；(3)有凝血障礙或血小板失調症之病史；(4)對人類免疫缺陷病毒(HIV)證實陽性測試結果或患有慢性或活性B型或C型肝炎之個體。(可招募有B型或C型肝炎之病史且經記錄在抗病毒治療後已治癒之個體)；(5)先前等級≥3之免疫介導之神經毒性或肺炎同時接受免疫治療(包括(但不限於)針對CTLA-4、PD-L1或PD-1之藥劑)。另外，在3個月內患有未解決或變得無症狀之任何其他先前等級≥3之免疫介導之不良事件同時接受免疫治療；(6)在抗OX40抗體之首次劑量前之28天內接受活減毒疫苗。本發明之抗OX40抗體可單獨投與(單一治療)或輔助或與其他抗癌治療及/或靶向或非靶向抗癌劑一起投與。當作為抗OX40單一治療投與時，可使用一或多種抗體。無論作為單一治療抑投與或輔助或與其他治療或藥劑一起投與，投與一定量之抗OX40抗體使得整體治療方案提供治療利益。治療利益係指相較於無治療(當適當時)或已知護理標準，使用OX40抗體以治療病患之癌症導致任何經證實之臨床利益。臨床利益可藉由一般技術者已知的任何方法評估。在一項實施例中，臨床利益係基於客觀反應率(ORR) (使用RECIST 1.1版測定)、反應持續時間(DOR)、無進展存活期(PFS)及/或總體存活期(OS)評估。在一些實施例中，完全反應指示治療利益。在一些實施例中，部分反應指示治療利益。在一些實施例中，穩定疾病指示治療利益。在一些實施例中，總體存活期之增加指示治療利益。在一些實施例中，治療利益構成疾病進展時間之改善及/或症狀或生活品質之改善。在其他實施例中，治療利益不應視為疾病控制之增加之週期，而係導致經改善之生活品質之顯著減小之症狀負荷。如熟習此項技術者顯而易見，治療利益可單獨使用抗OX40抗體(單一治療)或輔助或與其他抗癌治療及/或靶向或非靶向抗癌劑一起使用觀測。通常，治療利益係使用經設計用以量測對癌症之新穎治療之反應之標準臨床測試評估。為評估本文描述之抗OX40抗體之治療利益，可使用下列測試中之一者或組合：(1)實體腫瘤中之反應評估標準(RECIST) 1.1版、(2)免疫相關之RECIST (irRECIST)、(3)東部腫瘤協作組(ECOG)性能狀態、(4)免疫相關之反應標準(irRC)、(5)可由腫瘤抗原評估之疾病、(6)經確認之病患報導之結果量表及/或(7)針對總體存活期及無進展存活期之卡普蘭-邁耶估計。對腫瘤負荷之變化之評估係癌症治療劑之臨床評估之重要特徵。腫瘤收縮(客觀反應)及疾病進展之發展時間係癌症臨床試驗中之重要終點。標準化反應標準(被稱為RECIST (實體腫瘤中之反應評估標準))係於2000年公開。更新版(RECIST 1.1)係於2009年發佈。RECIST標準通常用於其中客觀反應係主要研究終點之臨床試驗中及用於其中開始對穩定疾病、腫瘤進展或進展分析之時間之評估因為此等結果量測基於對解剖學腫瘤負荷及其隨試驗過程變化之評估之實驗中。表8提供用以測定對研究藥物(諸如本文描述之抗OX40抗體)之客觀腫瘤反應之反應標準之定義。

可用以測定本文描述之抗OX40抗體之治療利益之次要結果量測包括客觀反應率(ORR)、無進展存活期(PFS)、總體存活期(OS)、整體反應之持續時間(DOR)及反應深度(DpR)。ORR定義為達成完全反應(CR)或部分反應(PR)之參與者之比例。PFS定義為自抗OX40抗體之首次投藥日期至疾病進展或死亡(以先發生者為準)之時間。OS定義為自疾病之診斷日期或治療開始之時間長度，即經診斷患有該疾病之該等病患仍存活之時間長度。DOR定義為參與者之初始CR或PR至疾病進展之時間之時間。DpR定義為相較於基線腫瘤負荷，在最大反應點下觀測到之腫瘤收縮之百分率。用於ORR及PFS兩者之臨床終點可基於上文描述之RECIST 1.1標準測定。可用於對經歷免疫療法治療之癌症病患具特異性之臨床評估之額外標準包括標準化免疫相關之RECIST (irRECIST)標準。參見，例如，Nishino, M.等人，Eur. J. Radiol., 84(7)，第1259至1268頁(2015年7月)。此等指導方針修飾上文之RECIST 1.1標準並考慮潛在免疫調節效應。表9提供用以測定對免疫調節藥物(諸如本文描述之抗OX40抗體)之客觀腫瘤反應之反應標準之定義。

表10中顯示之ECOG性能狀態量表係用以描述病患在其等護理自身、日常活動及身體能力方面所發揮之水平。該量表係由東部腫瘤協作組(ECOG)(現為ECOG-ACRIN癌症研究組之一部分)研發，並於1982年公開。

可用以完全表徵及測定對免疫治療劑(諸如基於抗體之癌症治療)之反應之另一組標準係免疫相關之反應標準(irRC)，其係於2009年經開發以用於量測實體腫瘤，並於2013年更新(Wolchok等人， Clin. Cancer Res. 2009; 15(23): 7412-7420及Nishino等人， Clin. Cancer Res. 2013; 19(14): 3936-3943)。經更新之irRC標準係通常用以評估免疫治療劑(諸如本文描述之抗OX40抗體)對腫瘤負荷之效應並根據表11定義反應。

無論作為單一治療投與或輔助或與其他治療或藥劑一起投與，由使用本文描述之抗OX40抗體治療實體腫瘤產生之一個示例性治療利益係完全反應。無論作為單一治療投與或輔助或與其他治療或藥劑一起投與，由使用抗OX40抗體治療實體腫瘤產生之另一示例性治療利益係部分反應。經確認之病患報導之結果量表亦可用以表示由各病患通過特定報導系統提供之反應。此等結果量表與正聚焦之疾病無關而與在應對慢性病症時保留之功能相關。經確認之病患報導之結果量表之一個非限制性實例係來自美國國立衛生研究院之PROMIS® (病患報導之結果量測資訊系統)。例如，用於成年癌症病患之PROMIS®物理功能儀器可評估自我報導之上肢(例如，靈活性)、下肢(例如，步行或行動能力)及中心區(例如，頸、背部行動能力)之功能，且包括例行日常活動(諸如跑動差事)。相較於護理標準，卡普蘭-邁耶曲線(Kaplan及 Meier, J. Am. Stat. Assoc. 1958; 53(282): 457-481)亦可用以評估經歷抗OX40抗體治療之癌症病患之總體存活期及無進展存活期。 7.6.2 輔助治療抗OX40抗體可輔助或與具有抗癌性質之其他藥劑或治療(包括護理治療標準，諸如抗PD-1抗體治療)一起使用。當輔助使用時，在單一協調投藥程序表或不同投藥程序表中，抗OX40抗體及其他藥劑可一起調配成單一、組合藥物調配物或可分別調配及投與。輔助或與抗OX40抗體一起投與之藥劑將通常對抗OX40抗體具有補充活性使得該等抗體及其他藥劑不會對彼此造成不利影響。 7.7 劑量及投與方案所投與之抗OX40抗體之量將取決於各種因素，包括(但不限於)治療之癌症之特定類型、治療中之癌症之階段、投與模式、投與頻率、所需治療利益及其他參數(諸如病患之年齡、體重及其他特徵等)。對為特定模式及投與頻率有效提供治療利益之劑量之判定係在熟習此項技術者之能力範圍內。有效提供治療利益之劑量可初始自活體內動物模型評估。適用於各種疾病之動物模型為此項技術中已知。本文揭示之抗OX40抗體可由對欲治療之病症而言適當之任何途徑投與。在一些實施例中，該抗OX40抗體係含有具有根據SEQ ID NO: 41至48中之任何一者之胺基酸序列之重鏈及具有根據SEQ ID NO: 51至54中之任何一者之胺基酸序列之輕鏈之人類化抗體中之任何一者。在某些實施例中，該抗OX40抗體含有具有根據SEQ ID NO: 41或42之胺基酸序列之重鏈及具有根據SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之輕鏈。抗OX40抗體將通常非經腸投與，即，輸注、靜脈內(IV)、鞘內、推注、瘤內注射或硬膜外(Shire等人，2004, J. Pharm. Sciences 93(6):1390-1402)。在一個實施例中，抗OX40抗體係作為於小瓶中之凍乾粉末提供。在投與之前，該凍乾粉末係以注射用無菌水(SWFI)或其他合適之介質復水以提供含有抗OX40抗體之溶液。在一些實施例中，所得之復水溶液係用生理鹽水或其他合適之輸注用介質進一步稀釋及經由IV輸注每兩週一次，即，每13、14或15天投與。在一些實施例中，抗OX40抗體係經由IV輸注每兩週一次以0.01 mg/kg、0.1 mg/kg、1.0 mg/kg或3.0 mg/kg投與。當輔助或與其他藥劑(諸如其他化學治療劑)一起投與時，抗OX40抗體可按與其他藥劑相同之程序表投與或按不同之程序表投與。當按相同程序表投與時，該抗OX40抗體可在其他藥劑之前、之後或同時投與。如熟習此項技術者應知曉，針對上文描述之各種藥劑之推薦劑量可能需要經調整以最佳化病患反應及最大化治療利益。 8. 實例強調本文描述之抗OX40抗體之示例性實施例之某些特徵及性質之下列實例係出於闡述之目的提供而非限制本發明。實例1：材料及方法 8.1.1. 藉由ELISA量測抗OX40抗體與人類OX40之結合在4℃下用1 μg/mL人類OX40-FC (R&D Systems)塗覆Immunolon 4xHB 96孔盤(Thermo Scientific)整夜。盤係在室溫下用含有1%牛血清白蛋白(BSA)之磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)阻斷30分鐘及然後使用盤清洗機以PBST (具有0.1%吐溫20之PBS)清洗三次。經OX40塗覆之盤係然後用指定濃度之測試抗體在室溫下培養一小時。盤係用PBST清洗四次及然後在室溫下用100 μL於含有1% BSA之PBS中以1:5000稀釋度製備之山羊抗人類Fab片段特異性生物素(Jackson ImmunoResearch)培養1小時。盤然後於PBST中清洗五次並向各孔添加100 μL 1:1000稀釋度之鏈黴親和素-辣根過氧化物酶(HRP) (Thermo Scientific)且在室溫下培養30分鐘。盤接著於PBST中清洗五次及向各孔添加100 μL TMB One組分(Surmodics)並在室溫下(RT)培養直至顯色(約5至10分鐘)。光學密度(OD)係於650 nm下讀取(Molecular Devices Spectromax190)。 8.1.2. 藉由ELISA量測抗OX40抗體與食蟹猴OX40之結合在4℃下用1 μg/mL食蟹猴OX40-Fc融合物塗覆Immunolon 4xHB 96孔盤(Thermo Scientific)整夜。盤係在RT下用含有1%牛血清白蛋白(BSA)之PBS阻斷30分鐘及然後用PBST (具有0.1%吐溫20之PBS)清洗三次。經OX40塗覆之盤然後用指定濃度之抗OX40抗體在室溫下培養一小時。盤用PBST清洗四次及然後在室溫下用100 μL於含有1% BSA之PBS中以1:5000稀釋度製備之山羊抗人類Fab片段特異性生物素(Jackson ImmunoResearch)培養1小時。盤然後於PBST中清洗五次及向各孔添加100 μL 1:1000稀釋度之鏈黴親和素-HRP (Thermo Scientific)並在室溫下培養30分鐘。盤然後於PBST中清洗五次及向各孔添加100 μL TMB One組分(Surmodics)並在室溫下培養直至顯色(約5至10分鐘)。光學密度(OD)係於650 nm下讀取(Molecular Devices Spectromax190)。 8.1.3. 藉由流動式細胞測量術量測抗OX40抗體與恆河猴OX40之結合恆河猴(普通獼猴(Macaca mulatta )) OX40在胺基酸層面係與食蟹猴(食蟹獼猴(Macaca fascicularis )) OX40 (SEQ ID NO: 2)相同。將表現恆河猴OX40之293 NF-κB報導子細胞系於含有10%胎牛血清(FBS)及盤尼西林/鏈黴素之達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)中培養。就結合分析而言，細胞係以5百萬個細胞每mL重懸浮。將50 μL (250,000個細胞)/孔轉移至500 μL聚丙烯96孔盤(Nunc)之各孔。測試抗OX40抗體或同型對照單株抗體之2X儲備液係以於培養基中之666、333、111、37.03、12.34、4.11、0.457、0.152、0.0508、0.0169、0.00564 nM製備於各別稀釋盤中。將單株抗體(50 μL/孔)轉移至分析盤之各自孔內。細胞係用一級抗體在4℃下培養30分鐘及藉由在800 rpm下離心3分鐘用250 μL/孔之PBS清洗兩次。經結合之抗體係用於PBS中稀釋至2 μg/mL (50 μL/孔)之Cy5-驢抗人類IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch)在4℃下偵測30分鐘。細胞係用250 μL/孔之PBS清洗一次，重懸浮於含有1%甲醛之PBS中並於雙雷射FACSCalibur (Becton Dickinson)上分析。 8.1.4. 藉由表面電漿子共振量測抗OX40抗體與人類及恆河猴OX40之結合親和力抗OX40抗體與重組可溶性OX40 ECD (細胞外域)之結合動力學係藉由於Biacore T200儀器(GE Healthcare)上在25℃下使用抗Fc捕獲分析方法作出之基於表面電漿子共振之量測測定。人類OX40 (殘基1至216)及恆河猴OX40 (殘基28至214)之重組細胞外域(ECD)係購得(Creative Biomart)並使用Superdex200 (GE Healthcare)於10 mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)(pH 7.4)、150 mM NaCl、3 mM乙二胺四乙酸(EDTA)中藉由凝膠過濾進一步純化。恆河猴(普通獼猴) OX40在胺基酸層面係與食蟹猴(食蟹獼猴) OX40 (SEQ ID NO: 2)相同。晶片製備及結合動力學量測係於分析緩衝劑HBS-EP+ (10 mM HEPES (pH 7.4)、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%吐溫20)中進行。就抗Fc捕獲晶片製備而言，將於10 mM乙酸鈉(pH 4.5)中稀釋至25 μg/mL之約2000共振單位(RU)之山羊抗人類IgG Fc多株抗體(Thermo Fisher Scientific Inc.)使用標準胺偶合套組根據製造商之說明及程序直接固定在CM5感測器晶片上。感測器表面上未反應之部分係用乙醇胺阻斷。就結合動力學量測而言，各分析週期由下列步驟組成：1)僅捕獲測試表面上的測試抗OX40抗體；2) 將分析物(OX40 ECD或僅緩衝劑)注射在參考表面及測試表面兩者上，以80 μL/min注射240 μL，注射後以80 μL/min監測解離900秒；3)藉由將10 mM甘胺酸-HCl (pH 1.5)注射在參考表面及測試表面兩者上再生捕獲表面。在分析期間，所有量測皆單獨參考捕獲表面(即，無未經捕獲之測試抗體)且僅緩衝劑注射係用於雙重參考。OX40注射之濃度係分別以隨機9倍或3倍稀釋系列介於900 nM或300 nM至11.11 nM之範圍內。資料係使用Biacore T200評估軟體處理並全域擬合至1:1結合模型以測定結合動力學速率常數k_a (M^-1 s^-1 )及k_d (s^-1 )及平衡解離常數K_D (M)。 8.1.5. 用抗OX40抗體阻斷OX40配體將以2 x 10⁵ 個細胞/孔培養之經人類OX40穩定轉染之JurkaT細胞同時用0.2 µg/mL測試抗OX40抗體及滴定之可溶性人類OX40L (R&D系統)於含有1% BSA之PBS中在圓底96孔盤中在室溫下培養30分鐘。將細胞清洗兩次及每孔用100 μL 1:500稀釋度之山羊抗人類Fc PE (Jackson ImmunoResearch)再培養30分鐘。然後將細胞清洗兩次及使用FACSCanto (BD Biosciences)獲得並使用FACSDiva分析。 8.1.6. 抗OX40抗體與細胞表面表現之人類OX40之結合將表現人類OX40蛋白之Jurkat NF-κB報導子細胞系於含有10% FBS及盤尼西林/鏈黴素(pen/strep)之DMEM中培養。就結合分析而言，各細胞系係以5百萬個細胞每mL重懸浮。將50 μL (250,000個細胞)/孔轉移至500 μL聚丙烯96孔盤(Nunc)之各孔。測試抗OX40抗體或同型對照mAb之2X儲備液係以於培養基中之666、333、111、37.03、12.34、4.11、0.457、0.152、0.0508、0.0169、0.00564 nM製備於各別稀釋盤中。將各抗體(50 μL/孔)轉移至分析盤之各自孔內。細胞係用測試抗OX40抗體或同型對照抗體在4℃下培養30分鐘及藉由在800 rpm下離心3分鐘用250 μL/孔之PBS清洗兩次。經結合之抗體係用於PBS中稀釋至2 μg/mL (50 μL/孔)之Cy5-驢抗人類IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch)在4℃下偵測30分鐘。細胞係用250 μL/孔之PBS清洗一次，重懸浮於含有1%甲醛之PBS中並於雙雷射FACSCalibur (Becton Dickinson)上分析。 8.1.7. 抗OX40抗體與嵌合OX40受體之結合產生基於293s之轉染子以表現小鼠OX40半胱胺酸富集域(CRD)個別換出相應人類CRD之人類OX40分子之嵌合形式。在G418選擇後，存活細胞係於MoFlo流式細胞儀(Beckman)上針對表現加以分選：293s-huOX40、293s-huOX40-muCRD1、293s-huOX40-muCRDII、293s-huOX40-muCRDIII、293s-huOX40-muCRDIV、293s-huOX40-muCRDII+III及293s-muOX40。將每孔總計2 x 10⁵ 個各293s OX40嵌合轉染子細胞添加至500 µL聚丙烯96孔盤(Nunc)內。在接種細胞後，以2 μg/mL將50 μL之Hu3738或同型對照抗體針對各細胞系一式兩份添加至相應孔且容許於冰上培養30分鐘。在培養後，將200 μL達爾伯克磷酸鹽緩衝生理鹽水(DPBS)添加至各孔內及盤係以1000 rpm離心三分鐘。自各孔移除上清液並以1:250稀釋度添加50 μL之Cy5-驢抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch)二級抗體，其然後於冰上在黑暗中培養30分鐘。在培養週期後，添加200 μL的DPBS，接著以1000 rpm將盤離心沉降三分鐘。移除上清液及各孔係用100 μL之DPBS + 1%甲醛重懸浮。樣本係於雙雷射FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson)上分析。 8.1.8. 針對人類及恆河猴OX40之NF-κB螢光報導子活性將Jurkat-NF-κB-huOX40及293-NF-κB-RhOX40 (分別表現人類及恆河猴OX40蛋白之NF-κB報導子細胞系)維持於包含含有10% FBS及盤尼西林/鏈黴素(100 U/mL)之DMEM之培養基中。就NF-κB報導子分析而言，Jurkat-NF-κB-huOX40細胞系係以1百萬個/mL (最終50,000個細胞/孔)重懸浮於生長培養基(與培養基相同)中及293-NF-κB-RhOX40細胞系係以0.5百萬個/mL (最終25,000個細胞/孔)重懸浮於生長培養基中。將50 µL/孔轉移至白色/透明底96孔分析盤(Costar 3903)之60個內孔。於各別U底96孔稀釋盤(Becton Dickinson)中製備下列抗體之3X儲備液：用作陰性對照抗體之抗PD-1抗體，及抗OX40抗體。在無外源性交聯劑之情況下測試抗體之活性之稀釋系列包括於培養基中之2000、500、125、31.25、7.812、1.953、0.488、0.122、0.0305、0.00762 nM。測試交聯劑對抗OX40抗體之活性之影響之稀釋系列包括200、50、12.5、3.125、0.7812、0.1953、0.0488、0.0122、0.00305、0.000762 nM抗體。在一式兩份中，將50 µL/孔之抗體轉移至分析盤之各自孔內。向單獨抗體盤，將50 µL/孔之培養基添加至60個內孔。就交聯劑稀釋系列而言，將山羊抗人類IgG Fc特異性(Jackson ImmunoResearch)稀釋至800、200、50、12.5、3.125、0.7812、0.1953、0.0488、0.0122、0.00305 nM及將50 µL/孔轉移至60個內孔以維持抗OX40抗體及交聯劑之4:1比率。將生長培養基(150 µL)添加至外孔以防止60個內孔中之蒸發。盤係在37℃下培養約18小時。螢光素酶活性係用BriteLite Plus (Perkin Elmer)定量。簡而言之，受質係用10 mL供應商提供之緩衝劑溶解及向各盤之60個內孔添加75 μL受質/孔。該等盤係於Victor5 (Molecular Devices)上使用發光設定分析。 8.1.9. ADCC報導子分析表現人類FcγRIII之ADCC效應細胞(Promega)係按照方案建議解凍及生長。使用前讓細胞分裂兩次。經人類或恆河猴OX40穩定轉染之HEK293細胞係用作靶細胞。此等細胞係於HyClone^TM DMEM中用10%熱滅活之FBS (Sigma)及5 μg/mL殺稻瘟菌素(Gibco Life Technologies)增殖。在分析前一天，表現OX40之HEK293靶細胞係用0.25%胰蛋白酶(Gibco Life Technologies)收穫。細胞係經清洗、計數及以10,000個細胞/孔接種於96孔Costar盤(Corning)中。盤係在37℃下於DMEM 10% FBS中培養整夜。在該分析後，接著進行ADCC生物分析效應細胞，增殖模型方案G7102。效應物與靶細胞之比率為7.5:1。發光係使用EnSpireManager軟體以EnSpire Alpha讀數器(Perkin Elmer)量測。此分析中測試之抗體包括同型對照抗體及抗OX40抗體。 8.1.10. 抗OX40抗體與經活化之人類CD4+ T細胞之結合人類PBMC係分離自購買自Stanford Blood Center (Palo Alto, CA)之白細胞層。簡而言之，白細胞層係以1:1比率用無鎂及鈣之PBS (GE Healthcare)稀釋。經稀釋之血液(30 mL)係於在SepMate管(Stemcell Technologies)中含有之無鎂及鈣之PBS (GE Healthcare)中製備之15 mL 90% Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)上分層。該等管係在1200 g下離心10分鐘。收集界相並用於1X PBS中沖洗兩次。CD4+ T細胞係使用Stemcell Technologies CD4富集套組(Stem Cell Technologies)分離。使細胞於RPMI/10%FBS中重懸浮至2x10⁶ 個細胞/mL。以1:1之比率添加Dynal CD3/28珠(Life Technologies)。細胞係於翻滾旋轉儀(end over end rotator)上在室溫下培養20分鐘。在37℃下將細胞於6孔盤中培養24小時。在24小時後，用磁鐵移除珠。細胞係經計數及重懸浮至1.5x10⁶ /mL。每次染色使用等分細胞懸浮液(100 μL)。測試抗體係起始自1 μg/mL以4倍稀釋系列滴定。將細胞染色30分鐘並清洗兩次。將1:250稀釋度之山羊抗人類Fc特異性-PE/孔(Jackson ImmunoResearch) (4 μg/mL)添加至含有1% BSA之100 μL/孔PBS中。將細胞再染色30分鐘並清洗兩次，將其轉移至管及使用BD LSR Fortessa流式細胞儀獲得，並使用FACSDiva分析軟體8.0.1版分析。 8.1.11 抗OX40抗體與經活化之食蟹猴T細胞之結合食蟹猴全血係購買自Worldwide Primates。就PBMC之分離而言，全血係以1:1之比率用無鎂及鈣之PBS (GE Healthcare)稀釋。經稀釋之血液(30 mL)係於在50 mL圓錐管中含有之無鎂及鈣之PBS (GE Healthcare)中製備之13 mL 95% Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)上分層。該等管係在1000 g下離心25分鐘。收集界相並於1X PBS中清洗兩次。使細胞於RPMI/10% FBS中重懸至2 x 10⁶ 個細胞/mL。細胞係用10 mg/mL植物凝集素(PHA) (Sigma)及100 U/mL重組人類介白素-2 (IL-2) (Proleukin®, Prometheus)於6孔盤中培養72小時。在24小時後，細胞係經清洗、計數及重懸浮至2x10⁶ /mL。每次染色使用100 μL之細胞。測試抗OX40抗體係起始自1 μg/mL以4倍稀釋系列滴定。將細胞染色30分鐘並清洗兩次。向每孔添加於含有1% BSA之100 μL PBS中之1:250稀釋度之山羊抗人類IgG Fc特異性-PE (Jackson ImmunoResearch) (4 μg/mL)。將細胞再染色30分鐘並清洗兩次，將其轉移至管並使用BD LSR Fortessa流式細胞儀獲得，且使用FACSDiva分析軟體8.0.1版分析。 8.1.12. 經活化之人類T細胞增殖及IFN-γ誘導人類白細胞層係購買自Stanford Blood Center (Palo Alto, CA)。就人類PBMC之分離而言，白細胞層係以1:1之比率用無鎂及鈣之PBS (GE Healthcare)稀釋。經稀釋之血液(30 mL)係於SepMate管(Stemcell Technologies)中含有之無鎂及鈣之PBS (GE Healthcare)中製備之15 mL 90% Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)上分層。該等管係在1200 g下離心10分鐘。收集界相並於1X PBS中清洗兩次。CD4+ T細胞係使用EasySep CD4+ T細胞富集套組(Stemcell Technologies)分離自PBMC。CD4+ T細胞係以2 x 10⁶ 個細胞/mL於RPMI+10% FCS加2 µg/mL PHA (Sigma)及20 IU/mL重組人類IL-2 (Proleukin®, Prometheus)中在6孔盤中培養72小時。 Biocoat T細胞活化對照盤-96孔盤(Corning)係經於100 µL/孔PBS中之2 μg/mL山羊抗小鼠IgG Fc-特異性(Jackson ImmunoResearch)及2 µg/mL山羊抗人類IgG-Fc特異性(Jackson ImmunoResearch)在4℃下塗覆整夜。盤係用200 μL/孔含於PBS中之1% BSA (Rockland)在室溫下阻斷30分鐘。盤係用200 μL/孔PBS清洗兩次。將4 ng/mL抗人類CD3 OKT3 (eBioscience)添加至100 μL/孔PBS中及在37℃下培養90分鐘。盤係用200 μL/孔PBS清洗兩次。將起始自5 μg/mL之抗OX40抗體及同型對照單株抗體之3倍稀釋系列添加至盤之100 μL PBS中。該等盤係在37℃下培養90分鐘。盤係用200 μL/孔PBS清洗兩次。將經清洗之經PHA及IL-2活化之CD4+ T細胞(2 x 10⁵ )添加至各孔。在37℃下培養48小時後，匯集來自各重複之30 μL上清液以用Luminex (Millipore)進行IFN-γ分析並於Bioplex Manager 6.0 (BioRad)上分析。盤係用0.25 μCi³ H-胸苷(Perkin Elmer)脈衝整夜並在第二天早上以5 mL Ultima Gold閃爍液(Perkin Elmer) 於Filtermats (Perkin Elmer)上獲得。Filtermat係於1450 Microbeta Wallac Trilux計數器(PerkinElmer)上計數。 8.1.13. 人類調節T細胞抑制分析新鮮外周血單核細胞(PBMC)係獲得自AllCells或Stemcell Technologies。將細胞離心，細胞集結粒係用1X PBS重懸浮並在1200 rpm下在室溫下再次離心沉降10分鐘。移除上清液及然後用RoboSep緩衝劑(Stemcell Technologies)重懸浮細胞。細胞存活率及細胞計數係使用Vi-Cell XR細胞計數器Beckman計數器測定。置留100至150百萬個細胞以供使用Stemcell EasySep人類CD4+ T細胞富集套組進行CD4+ T細胞富集。然後使用Stemcell EasySep人類CD25+選擇套組將經富集之CD4+ T細胞之CD25+細胞耗盡。此過程導致經純化之CD4+/CD25-反應者T細胞(Tresp)。殘留之PBMC係用於遵循指令自Stemcell EasySep人類CD4+/CD127低/CD49d-調節T細胞富集套組分離調節T細胞(Treg)。在分離CD4+/CD25- Tresp及Treg之後，細胞係用具有10%熱滅活之FBS及0.01 mM 2-巰基乙醇之RPMI 1640分別以1 x 10⁶ 個細胞/mL及5 x 10⁵ 個細胞/mL重懸浮。 Treg抑制分析係使用2:1及4:1之兩種不同比率之Tresp與Treg建立。就2:1比率而言，將5 x 10⁴ 個Tresp細胞及2.5 x 10⁴ 個Treg細胞添加至 96孔U底盤。就4:1比率而言，將5 x 10⁴ 個Tresp細胞及1.25 x 10⁴ 個Treg細胞添加至96孔盤。亦以1:1珠與細胞比率向孔添加Treg抑制檢查珠試劑(Miltenyi Biotec)用於刺激。抗OX40抗體及同型對照人類IgG₁ 係以10 μg/mL最終濃度在缺乏或存在F(ab')₂ 山羊抗人類(GxHu) IgG, Fc特異性(Jackson ImmunoResearch)之情況下以1:4比率一式三份進行測試。盤係在37℃下於5% CO₂ 中培養四天。盤係用1 μCi/孔³ H-胸苷處理及在37℃下於5% CO₂ 中進一步再培養16小時。在培養後，獲得盤並使用Ultima Gold閃爍液(Perkin Elmer)及1450 Microbeta Wallac Trilux閃爍計數器(PerkinElmer)量測增殖。 8.1.14. 人類免疫細胞嫁接之PC-3小鼠腫瘤模型在接種當天，人類T細胞、自體人類moDC (單核細胞衍生之樹突細胞)及PC-3細胞係藉由Vi-Cell XR (Beckman Coulter)計數且經組合以對每隻NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl /SzJ小鼠)皮下注射遞送含於100 µL達爾伯克磷酸鹽緩衝生理鹽水(DPBS) (GE Lifesciences)中之1 x 10⁷ 個PC-3、1 x 10⁶ 個T細胞及5 x 10⁵ 個moDC。10 mg/kg同型對照單株抗體及10 mg/kg Hu3738之治療組(n = 8隻小鼠/組)係製備於200 µL DPBS中用於腹腔內注射。單一抗體劑量係在細胞混合物接種時注射。腫瘤生長之量測係藉由標準卡尺量測評估並計算腫瘤生長體積(長度x寬度x高度/2)。 8.1.15. NSG小鼠中之人類PBMC GVHD模型人類外周血單核細胞(PBMC)係購買自AllCells (Oakland, CA)。在第1天，對免疫缺陷NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl /SzJ)腹腔內接種2 x 10⁷ 個人類PBMC。抗OX40抗體Hu3738或同型對照係自第1天開始每週一次腹腔內投與。倘若小鼠顯示移植物抗宿主疾病(GVHD)之行為標誌(例如，駝背之姿勢、皺起之皮毛)，則獲得血清樣本，並使用Luminex珠陣列分析(Millipore)測定細胞介素於該血清中之濃度。實例2：小鼠抗OX40抗體之產生及人類化小鼠係根據此項技術中已知的方法進行免疫(E. Harlow, D. Lane. Antibody: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998))。各單株抗體之同型係使用小鼠分型套組(Roche)測定。產生受關注之抗體之融合瘤純系係經純化及針對親和力藉由表面電漿子共振及針對配體競爭藉由FACS進一步表徵。表現載體之選殖及構築係藉由此項技術中已知用於表現重組單株抗體之方法完成。抗體V區之人類化係遵循Queen, C.等人，(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86:10029-10033)進行。CDR之規範結構係根據Huang等人，(Methods, 2005; 36:35-42)判定。識別具有相同或最相似CDR規範結構之人類可變生殖系序列，且選擇適當之人類V_H 、V_L 及J片段序列以提供用於抗OX40可變區之框架。在其中電腦模型表明與CDR明顯接觸之框架位置處，來自鼠科抗OX40 V區之胺基酸取代原始人類框架胺基酸(回復突變)。抗OX40小鼠抗體Mu3726、Mu3738、Mu3739及Mu3741係根據上文描述之方法人類化。Mu3726 V_H 之人類化形式係具有人類V_H 4-28框架區及I48M、V67I、M69I、V71R、F78V、A93V及R94K之七種回復突變之Hu3726 V_H .1a。Hu3726 V_H .1a係與具有人類VK1-39框架區及Y48F及F71Y之兩種回復突變之其各自人類化輕鏈Hu3726 V_L .1b組合。Mu3738 V_H 之人類化形式係具有人類V_H 3-7框架區及W47L之一種回復突變之Hu3738 V_H .1b。Hu3738 V_H .1b係與具有人類VK4-1框架區且無回復突變之其各自人類化輕鏈Hu3738 V_L .1組合。Mu3739 V_H 之人類化形式係具有人類V_H 1-69框架區及M48I、V67A、E73T及S76N之四種回復突變之Hu3739 V_H .1b。Hu3739 V_H .1b係與具有人類VK1-39框架區及V58L及F71Y之兩種回復突變之其各自人類化輕鏈Hu3739 V_L .1b組合。Mu3741 V_H 之人類化形式係具有人類V_H 3-66框架區及A24V、V48L、S49G、F67L、R71K、N76S及L78V之七種回復突變之Hu3741 V_H .2b。Hu3741 V_H .2b係與具有人類VK1-39框架區及Y36F及F71Y之兩種回復突變之其各自人類化輕鏈Hu3741 V_L .1c組合。實例3：抗OX40抗體之結合親和力下表3-1顯示示例性抗OX40抗體Hu3738或美國專利案第7,960,515號中描述之參考文獻抗OX40抗體11D4或18D8之活體外結合親和力資料。11D4及18D8中之各者係具有輕κ區之人類IgG₁ 。如本文使用，11D4具有具有根據以下之胺基酸序列之V_H ： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARESGWYLFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 61)及具有根據以下之胺基酸序列之V_L ： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 62)。 18D8具有具有根據以下之胺基酸序列之V_H ： EVQLVESGGGLVQPGRLSRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDQSTADYYFYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 63)及具有根據以下之胺基酸序列之V_L ： EIVVTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 64)。藉由表面電漿子共振，或在如實例1之分析中量測之表現人類OX40之經轉染之Jurkat NF-κB報導子細胞中，Hu3738顯示對人類OX40之強效結合性質，及相較於Hu3739或Hu3741，藉由SPR測得之更高結合親和力。

*如根據實例1藉由表面電漿子共振測定；所示指數符號(例如，3.0E-09 = 3.0 × 10^-9 )；N/A =不可用。示例性抗OX40抗體Hu3738顯示針對食蟹猴或恆河猴OX40之交叉反應性，但未顯示針對小鼠或大鼠OX40之顯著結合。如藉由實例1中描述之分析測定之Hu3738對重組人類或食蟹猴(cyno) OX40或對細胞表面人類或恆河猴OX40之結合活性係總結於表3-2中。

實例4：抗OX40抗體Hu3738之活體外生物活性為評估Hu3738對經內源性表現之人類OX40之結合，經活化之CD4+ T細胞及未經刺激之外周血單核細胞(PBMC)皆藉由流動式細胞測量術檢查。根據實例1中描述之分析，表4-1總結Hu3738對經CD3/CD28珠活化之人類CD4+ T細胞上或經受植物凝集素(PHA)及介白素-2 (IL-2)活化之食蟹猴CD4+ T細胞上之細胞表面OX40之結合之資料。如表4-1中顯示，於人類及食蟹猴T細胞培養中，Hu3738強效結合至經活化之CD4+ T細胞上之OX40。

如根據章節8.1.12中描述之分析(圖1A、1B)，如在用Hu3738活體外處理後，人類外周血CD4+ T細胞之增加之增殖及人類CD4+ T細胞之增強之干擾素-γ產生所證實，Hu3738與人類OX40之亞奈米莫耳結合提供功能活化。如圖1A描述之典型實驗中顯示，相較於同型對照huIgG₁ ，Hu3738實現人類外周血CD4+ T細胞增殖增加約1.5倍至約6倍，其堪比或大於當T細胞用當量之參考文獻抗OX40抗體11D4或18D8投藥時可見之增殖之增加。Hu3738顯示來自八個供體之運行之平均EC₅₀ = 0.11 nM (16 ng/mL)。圖1C顯示當各根據章節8.1.12中描述之T細胞增殖分析測試時，人類外周血CD4+ T細胞在用Hu3738活體外治療後之增殖係與參考文獻抗OX40抗體1A7相似，在自約0.001至約1 μg/mL之抗體濃度之廣泛範圍內。美國公開案第2015/0307617號中描述之抗體1A7係具有κ輕鏈之人類IgG₁ ，其具有根據以下之V_H 胺基酸序列： EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDSYMSWVKQSHGKTLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFREKVTLTVDKSSTTAYMEFRSLTSEDSAVYYCVLAPRWYFSVWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 69)，及根據以下之V_L 胺基酸序列： DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGKDYFLTISNLEQEDVAAYFCQQGHTLPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 70)。如圖1B描述之典型實驗中顯示，當在測試之濃度範圍內用Hu3738處理時，人類CD4+ T細胞中IFN-γ產生增加自約2倍至約10倍。關於IFN-γ產生，Hu3738顯示來自九個供體之運行之平均EC₅₀ = 0.16 nM (24 ng/mL)。參考文獻抗OX40抗體11D4及18D8在此等分析條件下亦證實對IFN-γ產生之相似影響。圖1D顯示當各根據章節8.1.12中描述之T細胞 IFN-γ產生分析時，相較於參考文獻抗OX40抗體1A7，Hu3738影響人類CD4+ T細胞之更高IFN-γ產生增加。除增加CD4+ T細胞之增殖並增強IFN-γ之產生之下游傳訊活化效應外，示例性抗OX40抗體Hu3738亦顯示活體外人類T調節細胞活性，此表明可藉由身體攻擊腫瘤抑制免疫學反應之實體腫瘤內T調節細胞可用Hu3738之投與進行抑制。 Hu3738對T調節活性之影響係根據章節8.1.13中描述之分析活體外評估。自體CD4+/CD25- T反應者(Tresp)細胞係與CD4+/CD25+/CD127低T調節(Treg)細胞及活化劑珠(Insp)以2:1或4:1 Tresp : Treg比率(圖2A、2B)共培養。在缺乏Treg之情況下，Tresp細胞增殖以回應於活化劑珠。在Treg之存在下，增殖係經抑制。培養基中包含10 µg/mL Hu3738對Treg介導之抑制無影響。適用於此等T調節抑制分析之同型對照係具有恆定區變體L234A及L235A之huIgG₁ 。使用huIgG₁ 同型對照與交聯劑進行之各別實驗顯示對分析無影響。相反，在外源性交聯劑之存在下，Hu3738導致Tresp增殖之完全恢復(圖2A及2B)。Hu3738在交聯劑之存在下在此分析中增強增殖，其高於針對單獨活化劑珠之Tresp反應之程度。此結果表明OX40信號可克服T調節細胞介導之抑制且可增強與上文報導之結果一致之抗原特異性反應。 Hu3738介導之ADCC活性係使用如章節8.1.9中描述之市售ADCC報導子分析評估。此分析採用表現人類FcγRIIIa之經改造Jurkat細胞及經活化細胞(NFAT)報導子之核因子作為效應細胞。表現人類OX40之HEK 293細胞係用作靶細胞，且預期抗OX40抗體結合至表現於靶細胞上之OX40。另外，預期Hu3738之Fc區結合至報導子細胞之細胞表面上之FcγRIIIa受體。此等結合事件將引起兩種細胞類型之多重交聯，其導致ADCC報導子活性活化，其係因NFAT途徑活化所致之通過發光讀數器量測之效應。相較於同型對照，Hu3738以EC₅₀ = 0.51 nM (77 ng/mL)增加ADCC報導子活性。實例5：示例性抗OX40抗體之抗原決定基分類 8.5.1. Hu3738與人類/小鼠嵌合OX40之結合在章節8.1.5 (圖3)中描述之表現人類OX40之Jurkat細胞分析中，可溶性OX40L以IC₅₀ = 67 pM (10 ng/mL)阻斷Hu3738結合至OX40，此表明Hu3738結合至人類OX40分子之配體結合區。就Hu3738抗體結合之更詳細之抗原決定基繪圖(epitope mapping)而言，建立一系列表現人類/小鼠半胱胺酸富集域(CRD)交換之OX40分子之細胞系。此方法係基於Hu3738不結合至小鼠OX40之觀測結果(圖4B)。人類OX40 (SEQ ID NO: 1)與小鼠OX40 (SEQ ID NO: 3)之序列比對係顯示於圖4A中。自序列之分析，一系列表現293s轉染子之具有換入(swapped-in)小鼠CRD序列之人類OX40受體之嵌合形式係經產生並用Hu3738染色。人類-小鼠OX40受體嵌合體(其中鼠科換入區如下劃線指示)之胺基酸序列(包括信號序列)如下。用鼠科CRDI置換人類CRDI之人類OX40嵌合體具有根據以下之胺基酸序列： MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLNCVKHTYPSGHKCCRECQPGHGMVSRCDHTRDTLCH PCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO: 5)，用鼠科CRDII置換人類CRDII之人類OX40嵌合體具有根據以下之胺基酸序列：MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVC RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO: 6)，用鼠科CRDIII置換人類CRDIII之人類OX40嵌合體具有根據以下之胺基酸序列： MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRPGTQPRQDSGYKLGVDCV PCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO: 7)，用鼠科CRDIV置換人類CRDIV之人類OX40嵌合體具有根據以下之胺基酸序列： MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGNNQACKPWTNCTLSGKQTRHPASDSLDAVCE DRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO: 8)，及用鼠科CRDII及CRDIII置換人類CRDII及CRDIII之人類OX40嵌合體具有根據以下之胺基酸序列： MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRCRPGTQPRQDSGYKLGVDCV PCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO: 9)。 Hu3738對此系列之嵌合體之結合測定係根據章節8.1.7中描述之分析進行以將結合位點定位至特定CRD區。結合之減少表明哪些CRD對於特定抗體對OX40之識別而言係關鍵的。在此實例中，小鼠中對特異性CRD交換區之可偵測結合之缺乏表明人類OX40受體之區由Hu3738識別。當人類CRDII經相應之小鼠CRDII置換時，抗OX40抗體Hu3738顯示結合減少，此與Hu3738對人類OX40之CRDII之結合一致(圖4B)。 8.5.2. 結合至人類OX40之示例性抗OX40抗體Hu3738之競爭分析產生額外之參考文獻人類化抗OX40抗體以與示例性本發明之抗OX40抗體比較。描述於美國公開案第號2013/0280275中之抗體106至222及119至122係具有κ輕鏈人之類IgG₁ 。抗體106-222具有根據以下之V_H 胺基酸序列： QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCANPYYDYVSYYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 65)，及根據以下之V_L 胺基酸序列： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 66)。抗體119-122具有根據以下之V_H 胺基酸序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEYEFPSHDMSWVRQAPGKGLELVAAINSDGGSTYYPDTMERRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYDDYYAWFAYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 67)，及根據以下之V_L 胺基酸序列： EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRELPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 68)。藉由直接競爭研究，Hu3738對細胞表面表現之OX40之結合顯示與一些但非所有參考文獻抗OX40抗體競爭。如圖5中顯示，然後經劑量滴定之參考文獻抗體處理之Jurkat-NF-κB-huOX40細胞接著經歷2 μg/mL經螢光ALEXA FLUOR® 647標記之Hu3738以測定結合競爭。分析係藉由流動式細胞測量術進行。參考文獻抗OX40抗體106至222或1A7係與Hu3738競爭。然而，抗體11D4、18D8或119-122不與Hu3738競爭，直到100 μg/mL。實例6：藉由示例性抗OX40抗體Hu3738之OX40活化即使在缺乏交聯劑之情況下，Jurkat NF-κB細胞資料亦強調示例性抗OX40抗體Hu3738之活化能力(圖6A、6B)。如圖6A顯示，在自約0.001至約100 μg/mL抗體之濃度範圍內證實顯著NF-κB傳訊活性之唯一抗OX40抗體係Hu3738及相應之鼠科Mu3738。參考文獻抗OX40抗體11D4、18D8、106-222及119-122各缺乏顯著NF-κB傳訊效應，直到約100 μg/mL抗體。在相同分析條件下，Hu3738在缺乏外源性交聯之情況下之活性與其他參考文獻抗OX40抗體之活性之缺乏相反。NF-κB細胞傳訊資料之總結係顯示於表6-1及6-2中。尤其，儘管Hu3738與參考文獻抗OX40抗體106至222及1A7競爭結合人類OX40，但相較於在缺乏交聯劑之情況下之各抗體，Hu3738顯示不同功能活性。

* NS = 無顯著NF-κB傳訊，直到100 μg/mL抗體；N/A =不可用。除在缺乏外源性交聯劑之情況下Hu3738影響Jurkat-NF-κB-huOX40細胞中之NF-κB傳訊之能力外，相較於參考文獻抗OX40抗體11D4、18D8、106-222及19-122，Hu3738亦證實如藉由具有交聯劑之EC₅₀ 量測之更大效力(表6-1)。 Hu3738與1A7之並排比較係顯示於圖6B中並總結於下表6-2中。除在缺乏外源性交聯劑之情況下Jurkat-NF-κB-huOX40細胞中之NF-κB傳訊之缺乏外，上文描述之各參考文獻抗OX40抗體亦顯示相較於Hu3738更低之EC₅₀ 。

* NS =無顯著NF-κB傳訊，直到100 μg/mL抗體。實例7：Hu3738在人類細胞過繼性轉移模型中在小鼠中之抗腫瘤活性根據章節8.1.14中描述之方案，在用人類PC3細胞、T細胞及自體單核細胞衍生之樹突細胞(moDC)單一劑量接種後，Hu3738於活體內NSG小鼠模型中證實抗腫瘤活性(圖7)。在接種當天，人類T細胞、moDC及PC3細胞係藉由向各NSG小鼠皮下注射遞送。對各治療組(n = 8)中之每隻動物各腹腔內投藥同型對照單株抗體或Hu3738 (10 mg/kg)，及在接種同時注射抗體劑量。腫瘤生長之量測係藉由標準卡尺量測評估並計算腫瘤生長體積(長度x寬度x高度/2)。如圖7中顯示，相較於相等劑量之同型對照抗體，Hu3738在接種後17天顯著抑制PC3腫瘤於NSG小鼠中之生長。實例8：人類PBMC GVHD模型中之活體內免疫活化對NSG小鼠腹腔內接種人類PBMC。該等小鼠然後係用1 mg/kg Hu3738或HuIgG₁ 同型對照q7d x 4 (即，每7天一次，總計4次劑量)處理，及在接種人類細胞後之第1天立即首次投藥。在第22天，將小鼠處死及細胞介素於血清中之濃度係使用Luminex珠陣列分析(Millipore)測定。圖8中之結果顯示相較於同型，在投藥抗OX40抗體Hu3738後觀測到介白素-8 (IL-8)、顆粒球巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)及干擾素-γ (IFN-γ)之增強，此表明小鼠中之免疫反應因Hu3738增加。本申請案中引用之所有公開案、專利案、專利申請案及其他文獻係出於所有目的以全文引用之方式併入本文中，其併入之程度就如同出於所有目的將各個別公開案、專利案、專利申請案或其他文獻個別地指示併入本文中一般。儘管已闡述及描述各種特定實施例，但應知曉在不背離本發明之精神及範圍之情況下可作出各種變化。

圖1A至1D繪示在用示例性抗OX40抗體Hu3738治療後，人類T細胞活體外之功能活化。圖1A繪示在用抗OX40抗體Hu3738或參考文獻抗體11D4或18D8治療後，人類外周血CD4+ T細胞之增殖。圖1B繪示在用抗OX40抗體Hu3738或參考文獻抗體11D4或18D8治療後，人類CD4+ T細胞之干擾素-γ (IFN-γ)產生之增加。圖1C繪示在用Hu3738或參考文獻抗體1A7治療後，人類外周血CD4+ T細胞之增殖。圖1D繪示在用Hu3738或參考文獻抗體1A7治療後，人類CD4+ T細胞之IFN-γ產生之增加。圖2A至2B顯示活體外示例性抗OX40抗體Hu3738對人類T調節(Treg)細胞介導之抑制之效應。Treg抑制分析係使用兩種不同比率之CD4+/CD25-反應者T細胞(Tresp)與CD4+/CD25+/CD127低T調節細胞(Treg)來建立。將Treg抑制檢查試劑珠(Insp)以1:1的珠與細胞比率添加至培養孔以用於刺激。清晰槓表示Tresp細胞在Insp之存在下之增殖。抗OX40及同型對照人類IgG₁ 抗體係以10 μg/mL最終濃度在缺乏或存在交聯試劑(F(ab')₂ 山羊抗人類IgG，Fc特異性)之情況下以1:4比率一式三份進行測試。將盤在37℃下於5% CO₂ 中培養四天。添加1 μCi/孔³ H-胸苷及將該等盤進一步再培養16小時。圖式表示以每分鐘計數(cpm)顯示之增殖。圖2A繪示使用2:1比率之Tresp與Treg之結果；圖2B繪示使用4:1比率之Tresp與Treg之結果。圖3繪示示例性抗OX40抗體Hu3738在可溶性人類OX40配體(OX40L)之存在下之結合之抑制。該圖式顯示平均螢光強度(MFI)與OX40L之濃度(µg/mL)。表現人類OX40之JurkaT細胞係用滴定之未標記之可溶性OX40L及0.2 µg/mL Hu3738或同型對照抗體共染色。圖4A顯示人類OX40 (SEQ ID NO: 1)與小鼠OX40 (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列比對。圖4B繪示示例性抗OX40抗體Hu3738對含有小鼠半胱胺酸富集域(CRD)換出相應人類區之細胞表面表現之人類、鼠科或嵌合人類-小鼠OX40分子之結合活性。人類OX40係顯示為「293s-huOX40」，具有鼠科CRDI之嵌合人類OX40係顯示為「293s-huOX40-muCRDI」，具有鼠科CRDII之嵌合人類OX40係顯示為「293s-huOX40-muCRDII」，具有鼠科CRDIII之嵌合人類OX40係顯示為「293s-huOX40-muCRDIII」，具有鼠科CRDIV之嵌合人類OX40係顯示為「293s-huOX40-muCRDIV」，具有鼠科CRDII及鼠科CRDIII之嵌合人類OX40係顯示為「293s-huOX40-muCRDII+III」及鼠科OX40係顯示為「293s-muOX40」。圖5繪示示例性抗OX40抗體Hu3738或參考文獻抗體(11D4、18D8、106-222、119-122或1A7)對細胞表面人類OX40結合之競爭。圖6A繪示一經用示例性抗OX40抗體Mu3738或Hu3738或參考文獻抗體11D4、18D8、106-222或119-122或同型對照在缺乏添加之交聯劑之情況下治療後，NF-κB於經人類OX40轉染之Jurkat報導細胞系中之活化。圖6B繪示一經用示例性抗OX40抗體Hu3738、參考文獻抗體1A7或同型對照在存在或缺乏添加之交聯劑之情況下治療後，NF-κB於經人類OX40轉染之Jurkat報導細胞系中之活化。圖7繪示示例性抗OX40抗體Hu3738在人類PC3過繼性細胞腫瘤模型中於NSG小鼠中之抗腫瘤活性。圖8繪示在用1 mg/kg Hu3738或人類IgG₁ 同型對照每7天一次總計投藥4次治療小鼠後，介白素-8 (IL-8)、顆粒球巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)及干擾素-γ (IFN-γ)在人類外周血單核細胞(PBMC)介導之移植物抗宿主疾病(GVHD)模型中於NSG小鼠中之濃度。

<110> 美商艾伯維生物醫療股份有限公司(ABBVIE BIOTHERAPEUTICS INC.)

<120> 抗OX40抗體及其用途

<130> 381493-368generic

<140>

<141>

<150> 62/434,761

<151> 2016-12-15

<160> 136

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 277

<212> PRT

<213> 智人

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<213> 食蟹猴

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<213> 人造序列

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<213> 人造序列

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<223> 人造序列之描述：合成多肽

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<213> 人造序列

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<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 38

<210> 39

<400> 39

000

<210> 40

<400> 40

000

<210> 41

<211> 450

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 41

<210> 42

<211> 449

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 42

<210> 43

<211> 447

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 43

<210> 44

<211> 446

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 44

<210> 45

<211> 447

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 45

<210> 46

<211> 446

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 46

<210> 47

<211> 443

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 47

<210> 48

<211> 442

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 48

<210> 49

<400> 49

000

<210> 50

<400> 50

000

<210> 51

<211> 218

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 51

<210> 52

<211> 214

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 52

<210> 53

<211> 214

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 53

<210> 54

<211> 214

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成多肽

<400> 54

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<400> 55

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

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<211> 120

<212> PRT

<213> 智人

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<211> 111

<212> PRT

<213> 智人

<400> 68

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 69

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<212> PRT

<213> 智人

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000

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000

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000

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000

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000

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<400> 85

000

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000

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000

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000

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000

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<210> 100

<400> 100

000

<210> 101

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 101

<210> 102

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 102

<210> 103

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 103

<210> 104

<211> 15

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 104

<210> 105

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 105

<210> 106

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<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

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<400> 107

000

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000

<210> 110

<400> 110

000

<210> 111

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 111

<210> 112

<211> 15

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 112

<210> 113

<211> 8

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 113

<210> 114

<211> 11

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 114

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 115

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<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 116

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000

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000

<210> 120

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000

<210> 121

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 121

<210> 122

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 122

<210> 123

<211> 8

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 123

<210> 124

<400> 124

000

<210> 125

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 125

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 126

<210> 127

<400> 127

000

<210> 128

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<210> 130

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000

<210> 131

<211> 10

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 131

<210> 132

<211> 16

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 132

<210> 133

<211> 5

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 133

<210> 134

<400> 134

000

<210> 135

<400> 135

000

<210> 136

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 人造序列之描述：合成肽

<400> 136

Claims

一種抗OX40抗體，其包含(i)包含3個CDR之V_H鏈及(ii)包含3個CDR之V_L鏈，其中：VH CDR#1具有GFTFSRYGMS(SEQ ID NO：101)之胺基酸序列；VH CDR#2具有TINSNGGRTYYPDSVKG(SEQ ID NO：102)之胺基酸序列；VH CDR#3具有EGITTAYAMDY(SEQ ID NO：103)之胺基酸序列；VL CDR#1具有KASQSVDYDGDSYMH(SEQ ID NO：104)之胺基酸序列；VL CDR#2具有AASILES(SEQ ID NO：105)之胺基酸序列；以及VL CDR#3具有QQSNEDPRT(SEQ ID NO：106)之胺基酸序列。
如請求項1之抗OX40抗體，其為單株抗體。
如請求項1之抗OX40抗體，其為人類化抗體。
如請求項3之抗OX40抗體，其包含具有如下胺基酸序列之V_H鏈：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLELVATINSNGGRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGITTAYAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：22)；以及包含具有如下胺基酸之V_L鏈：DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：32)。
如請求項1至4中任一項之抗OX40抗體，其為IgG。
如請求項5之抗OX40抗體，其為IgG₁。
如請求項4之抗OX40抗體，其包含具有如SEQ ID NO：41或42之胺基酸序列；以及具有如SEQ ID NO：51之胺基酸序列。
一種一或多個核酸，其包含編碼如請求項1至7中任一項之抗OX40抗體的核苷酸序列。
一種一或多個載體，其包含如請求項8之一或多個核酸。
一種真核宿主細胞，其係經如請求項9之一或多個載體轉形。
一種真核宿主細胞，其係經工程改造以表現如請求項8之一或多個核酸。
如請求項10或11之真核宿主細胞，其為哺乳動物宿主係胞。
一種生產抗OX40抗體之方法，其包含：(a)培養如請求項10或11之宿主細胞，以及(b)回收該抗OX40抗體。