JP2020504101A - 抗ox40抗体及びそれらの使用 - Google Patents

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Abstract

本開示は、新規の抗OX40抗体、抗体を含む組成物、抗体をコードする核酸並びにこれらを作製及び使用する方法を提供する。

Description

1.関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、2016年12月15日に出願された米国特許仮出願第62/434,761号の利益を主張する。
2.配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2017年10月30日に作成された前記ASCIIコピーは、381493−368WO_SL.txtと名付けられ、97,999バイトのサイズである。
3.技術分野
本出願は、とりわけ、新規の抗OX40抗体、抗体を含む組成物、抗体をコードする核酸並びにこれらを作製及び使用する方法に関する。
4.背景
がん治療は、手術、放射線及び化学療法を含む、広範にわたる治療法を含む。多様な手法は、がんを処置する医療従事者に利用可能な、広範な処置の選択を可能とするが、既存の治療剤は、正常な健常細胞ではなく、がん細胞をターゲティングする選択性の欠如及びがんによる処置に対する耐性の発生のような、多数の欠点を抱えている。
正常細胞より優先的に、がん細胞の細胞過程に干渉する、ターゲティング型治療剤に基づく近年の手法は、放射線処置のような非ターゲティング療法と比較して、副作用の少ない化学療法レジメンをもたらしている。
がん免疫療法は、既存の標準治療を補完する、有望な治療法として出現した。例えば、Millerら、Cancer Cell、27、439〜449(2015)を参照されたい。このような免疫療法は、がん細胞を死滅させるように、免疫系をモジュレートするのに使用される抗体の開発を含む。
固形腫瘍を有する患者における抗腫瘍免疫応答は、生物学的薬剤を用いた処置により増強される。例えば、2つの抗PD−1モノクローナル抗体:ニボルマブ(OPDIVO(登録商標))及びペムブロリズマブ(KEYTRUDA(登録商標))が承認され、市販されており、米国及び欧州において、切除不能性黒色腫又は転移性黒色腫及び転移性非小細胞肺がんのような疾患の処置に対する承認がなされている。これらの薬剤による患者の処置は、無進行生存及び/又は全生存の改善により測定される、抗腫瘍応答を結果としてもたらした。
Millerら、Cancer Cell、27、439〜449(2015)
近年において、OPDIVO(登録商標)を従来の化学療法と比較する臨床試験の、未処置患者集団においてOPDIVO(登録商標)により進行性肺がんの進行を遅らせることの失敗は、既存の標準治療を補完する代替法及びさらなるがん処置に対する必要を強調する。
(発明の要旨)
5.概要
本開示は、OX40に特異的に結合し、これを活性化する抗OX40抗体を提供する。下記の「発明を実施するための形態」において、例示的な相補性決定領域(CDR)、重鎖可変ドメイン(V)領域及び軽鎖可変ドメイン(V)領域(すなわち、それぞれ、V鎖及びV鎖)、並びに例示的な抗OX40抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列が提供される。本明細書において提供された抗OX40抗体は、獲得免疫応答の活性化を結果としてもたらす。
抗OX40抗体は、当技術分野において公知の通り、半減期を延長し、抗原依存性細胞介在性細胞傷害作用(ADCC)を増大又は減少させるように、抗体の特性を変更する修飾及び/又は突然変異を含みうる。
本明細書において、本開示の抗OX40抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供され、核酸を含むベクターも同様に提供される。加えて、本明細書において、開示された抗OX40抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された原核及び真核宿主細胞のほか、ヌクレオチド配列を発現するように操作された(哺乳動物などの)真核宿主細胞も提供される。下記の「発明を実施するための形態」において、宿主細胞を培養し、抗体を回収することにより、抗体を産生する方法もまた提供され、論じられる。
別の態様では、本開示は、本明細書において記載された抗OX40抗体を含む組成物を提供する。組成物は、一般に、本明細書において記載された、1つ以上の抗OX40抗体及び1つ以上の賦形剤、担体又は希釈剤を含む。
本開示は、固形腫瘍を有すると診断されたヒト対象のような対象を、抗OX40抗体により処置する方法を提供する。方法は、一般に、対象へと、治療的利益をもたらすのに有効な量の、本明細書において記載された抗OX40抗体を投与するステップを伴う。対象は、新たに診断される場合もあり、再発する場合もあり、再発し、かつ、不応性の場合もある、多数の固形腫瘍のいずれか1つを有すると診断されうる。抗OX40抗体は、2週間ごとに1回の静脈内注入として投与されうる。
抗OX40抗体は、単一の治療剤(単剤療法)として投与される場合もあり、固形腫瘍の処置のために使用される治療剤が典型的であるが、必ずしもこれらではない、他の治療剤に加えて、又はこれらと共に投与される場合もある。治療剤は、それらの承認された用量、投与経路及び投与頻度において使用されることが典型的である。
抗OX40抗体は、静脈内注入及び/又は静脈内注射並びに腫瘍内注射を含むがこれらに限定されない、様々な投与経路又は投与方式を介して投与されうる。投与される量は、投与経路、投与スケジュール、処置されるがんの種類、処置されるがんのステージ並びに患者年齢及び体重のような、当技術分野において周知の他のパラメータに依存する。
6.図面の簡単な説明
例示的な抗OX40抗体であるHu3738による処置の後のインビトロにおける、ヒトT細胞の機能的な活性化を描示する図である。抗OX40抗体であるHu3738又は文献による抗体である11D4若しくは18D8による処置の後における、ヒト末梢血CD4+ T細胞の増殖を描示する図である。 例示的な抗OX40抗体であるHu3738による処置の後のインビトロにおける、ヒトT細胞の機能的な活性化を描示する図である。抗OX40抗体であるHu3738又は文献による抗体である11D4若しくは18D8による処置の後における、ヒトCD4+ T細胞による、インターフェロン−ガンマ(IFN−γ)の産生の増大を描示する図である。 例示的な抗OX40抗体であるHu3738による処置の後のインビトロにおける、ヒトT細胞の機能的な活性化を描示する図である。Hu3738又は文献による抗体である1A7による処置の後における、ヒト末梢血CD4+ T細胞の増殖を描示する図である。 例示的な抗OX40抗体であるHu3738による処置の後のインビトロにおける、ヒトT細胞の機能的な活性化を描示する図である。Hu3738又は文献による抗体である1A7による処置の後における、ヒトCD4+ T細胞による、IFN−γの産生の増大を描示する図である。 インビトロにおける、例示的な抗OX40抗体であるHu3738の、ヒト調節性T細胞(Treg)媒介性抑制に対する効果を示す図である。Treg抑制アッセイは、CD4+/CD25−レスポンダーT細胞(Tresp)の、CD4+/CD25+/CD127low調節性T細胞(Treg)に対する、2つの異なる比を使用して準備した。Treg Supression Inspector試薬ビーズ(Insp)を、刺激のために、培養物ウェルへと、1:1のビーズ対細胞比において添加した。白色バーは、Inspの存在下における、Tresp細胞の増殖を表す。抗OX40抗体及びアイソタイプ対照ヒトIgG抗体を、1:4の比の、架橋試薬(F(ab’)ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的抗体)の非存在下又は存在下、10μg/mLの最終濃度、三連において調べた。プレートを、5%のCO中、37℃において、4日間にわたりインキュベートした。ウェル1つ当たり1μCiのH−チミジンを添加し、プレートを、さらに16時間にわたり、さらにインキュベートした。グラフは、1分間当たりのカウント(cpm)において示される増殖を表す。Tresp対Tregの比を2:1としたときの結果を描示する図である。 インビトロにおける、例示的な抗OX40抗体であるHu3738の、ヒト調節性T細胞(Treg)媒介性抑制に対する効果を示す図である。Treg抑制アッセイは、CD4+/CD25−レスポンダーT細胞(Tresp)の、CD4+/CD25+/CD127low調節性T細胞(Treg)に対する、2つの異なる比を使用して準備した。Treg Supression Inspector試薬ビーズ(Insp)を、刺激のために、培養物ウェルへと、1:1のビーズ対細胞比において添加した。白色バーは、Inspの存在下における、Tresp細胞の増殖を表す。抗OX40抗体及びアイソタイプ対照ヒトIgG抗体を、1:4の比の、架橋試薬(F(ab’)ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的抗体)の非存在下又は存在下、10μg/mLの最終濃度、三連において調べた。プレートを、5%のCO中、37℃において、4日間にわたりインキュベートした。ウェル1つ当たり1μCiのH−チミジンを添加し、プレートを、さらに16時間にわたり、さらにインキュベートした。グラフは、1分間当たりのカウント(cpm)において示される増殖を表す。Tresp対Tregの比を4:1としたときの結果を描示する図である。 可溶性ヒトOX40リガンド(OX40L)の存在下における、例示的な抗OX40抗体であるHu3738の結合の阻害を描示する図である。グラフは、OX40L(μg/mL)の濃度と対比した、平均値蛍光強度(MFI)を示す。ヒトOX40を発現するJurkat細胞を、滴定量の標識化されていない可溶性OX40L及び0.2μg/mLのHu3738又はアイソタイプ対照抗体と共に共染色した。 ヒトOX40(配列番号1)の、マウスOX40(配列番号3)との、アミノ酸配列のアライメントを示す図である。 例示的な抗OX40抗体であるHu3738の、細胞表面において発現したヒトOX40分子、マウスOX40分子又は対応するヒト領域によりスワップアウトされたマウスシステインリッチドメイン(CRD)を含有する、キメラヒト−マウスOX40分子の結合活性を描示する図である。ヒトOX40は、「293s−huOX40」として示され、マウスCRD IとのキメラヒトOX40は、「293s−huOX40−muCRD I」として示され、マウスCRD IIとのキメラヒトOX40は、「293s−huOX40−muCRD II」として示され、マウスCRD IIIとのキメラヒトOX40は、「293s−huOX40−muCRD III」として示され、マウスCRD IVとのキメラヒトOX40は、「293s−huOX40−muCRD IV」として示され、マウスCRD II及びマウスCRD IIIとのキメラヒトOX40は、「293s−huOX40−muCRD II+III」として示され、マウスOX40は、「293s−muOX40」として示される。 例示的な抗OX40抗体であるHu3738又は文献による抗体(11D4、18D8、106−222、119−122又は1A7)による、細胞表面ヒトOX40への結合についての競合を描示する図である。 添加された架橋剤の非存在下において、例示的な抗OX40抗体であるMu3738若しくはHu3738又は文献抗体11D4、18D8、106−222若しくは119−122又はアイソタイプ対照により処置したときの、ヒトOX40をトランスフェクトされたJurkatレポーター細胞系における、NF−κBの活性化を描示する図である。 添加された架橋剤の存在下又は非存在下において、例示的な抗OX40抗体であるHu3738、文献抗体である1A7又はアイソタイプ対照により処置したときの、ヒトOX40をトランスフェクトされたJurkatレポーター細胞系における、NF−κBの活性化を描示する図である。 NSGマウスによる、ヒトPC3養子細胞腫瘍モデルにおける、例示的な抗OX40抗体であるHu3738の抗腫瘍活性を描示する図である。 マウスを、7日ごとに1回ずつ、のべ4回の投与にわたり、1mg/kgのHu3738又はヒトIgGアイソタイプ対照により処置した後のNSGマウスによるヒト末梢血単核球(PBMC)媒介性移植片対宿主病(GVHD)モデルにおける、インターロイキン8(IL−8)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)及びインターフェロンガンマ(IFN−γ)のレベルを描示する図である。
7.詳細な記載
本開示は、OX40に特異的に結合する抗体及びこの断片、抗体を含む組成物、抗OX40抗体をコードするポリヌクレオチド、抗体を産生することが可能な宿主細胞、抗体を作るために有用な方法及び組成物並びにこれらを使用する多様な方法に関する。
当業者により理解される通り、抗体及びこの断片は、天然において、「モジュール的」である。本開示を通して、抗OX40抗体又はこの結合性断片を構成する多様な「モジュール」についての、多様な具体的実施形態が記載される。具体的な非限定例として述べると、重鎖可変ドメイン(V)相補性決定領域(CDR)、V鎖、軽鎖可変ドメイン(V)CDR鎖及びV鎖についての、多様な具体的実施形態が記載される。具体的な実施形態はいずれも、各具体的な組合せが、個別に、明示的に記載された場合と同様に、互いと組み合わされうることが意図される。
7.1.略号
多くの実施形態において、本明細書において記載された抗体、結合性断片及びポリヌクレオチドは、それらのそれぞれのポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列により記載される。そうでないことが指し示されない限りにおいて、ポリペプチド配列は、N→Cの方向で示され、ポリヌクレオチド配列は、5’→3’の方向で示される。ポリペプチド配列について、下記の表1において言及される通り、遺伝子によりコードされたアミノ酸のための、従来の3文字又は1文字による略号が使用されうる。
Figure 2020504101
Figure 2020504101
ある特定の配列は、ある特定のクラス(例えば、脂肪族、疎水性など)に属するアミノ酸残基を指定する構造式により規定される。本明細書において使用された、遺伝子によりコードされたアミノ酸が属する多様なクラスは、下記の表2において言及される。一部のアミノ酸は、1つを超えるクラスに属しうる。スルフヒドリル基を含有するシステイン及びコンフォメーション的に拘束されたプロリンは、クラスを割り当てられない。
Figure 2020504101
7.2.定義
そうでないことが規定されない限りにおいて、本開示との関連において使用された科学技術用語は、当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有するものとする。
7.3.抗OX40抗体及び結合性断片
OX40は、発生する免疫応答の増強において重要な役割を果たし、調節性T細胞活性を抑制するように同時的に作用する共刺激分子である。CD134又は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー4(TNFRSF4)としてもまた公知のOX40は、活性化したばかりのT細胞上において、一過性に発現し、活性化した調節性T細胞上において、構成的に発現する、腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリーのI型膜貫通型細胞表面メンバーである。OX40の細胞外リガンド結合ドメインは、3つのシステインリッチドメイン(CRD)及び第4の部分的CRD(それぞれ、CRD I、CRD II、CRD III及びCRD IV)から構成される。主に、活性化CD4+ T細胞により発現するが、OX40は、活性化の後の、B細胞、CD8+ T細胞並びにナチュラルキラー(NK)細胞及びナチュラルキラーT(NKT)細胞においても発現されうる。好中球もまた、OX40を発現することが報告されており、ヒト好中球上におけるOX40シグナル伝達は、アポトーシス性細胞死を阻害する。OX40のリガンド(OX40L)であって、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー4(TNFRSF4)、CD252又は糖タンパク質34(gp34)としてもまた公知のOX40Lは、活性化抗原提示細胞及びB細胞により上方調節される。抗原により活性化したT細胞上のOX40へのリガンドの結合は、下流のNF−κBの転位及びAKT経路の活性化を結果としてもたらす。NF−κBの転位は、Bcl−2、Bcl−XLのような生存促進分子の上方調節及び細胞の生存をもたらす。OX40に方向付けられた抗体の活性化は、エフェクターT細胞の活性化及び分化を遷延させることにより、少なくとも部分的に、抗原特異的免疫応答を増強することが意図される。
抗原により活性化したエフェクターT細胞に対する影響に加えて、調節性T細胞により発現したOX40のターゲティングはまた、推定される作用機構にも寄与しうる。調節性T細胞は、腫瘍微小環境内において、高レベルのOX40を発現する。OX40の活性化は、調節性T細胞の抑制能に影響し、腫瘍微小環境からの、OX40陽性調節性T細胞の能動的枯渇をもたらすことが示されている。
一態様では、本開示は、OX40に特異的に結合する抗体に関する。
本明細書において使用された「抗体」(Ab)という用語は、特定の抗原(本明細書において、OX40)に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。一部の実施形態において、本開示の抗OX40抗体は、ヒトOX40(配列番号1)(NCBI基準配列:NP003318)に結合し、これにより、免疫系をモジュレートする。結果として得られる免疫系の応答は、腫瘍細胞に対して、細胞傷害性である。抗OX40抗体は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方における、超可変領域としてもまた公知の相補性決定領域(CDR)を含む。可変ドメインのうちの、より高度に保存的な部分は、フレームワーク(FR)と呼ばれる。当技術分野において公知の通り、抗体の超可変領域を画定するアミノ酸位置/境界部は、文脈及び当技術分野において公知の多様な定義に応じて変動しうる。可変ドメイン内の一部の位置は、これらの位置が、1つの基準セット下において超可変領域内にあると解釈される一方、異なる基準セット下において超可変領域外にあると解釈されるという点で、ハイブリッドの超可変性位置として考えられうる。これらの位置のうちの1又は複数はまた、拡張型の超可変領域内にも見出されうる。本開示は、これらのハイブリッドの超可変位置内に修飾を含む抗体を提供する。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシートの立体構成をとる4つずつのFR領域を含み、このβシート構造は、βシート構造をつなぎそして場合によってβシート構造の一部をも形成するループを形成する、3つのCDRによりつなぎ合わされている。各鎖内のCDRは、FR領域により、近接して一体に保持され、他の鎖に由来するCDRと共に、抗体の標的結合性部位の形成に寄与する。Kabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(National Institute of Health、Bethesda、Md.、1987)を参照されたい。本明細書で使用された、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、そうでないことが指し示されない限り、Kabatらによる免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けシステムに従いなされている。
本開示の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を含むがこれらに限定されない、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子操作抗体及び/又は天然において、他の形において修飾された抗体でありうる。一部の実施形態において、定常領域は、IgA(例えば、IgA又はIgA)、IgD、IgE、IgG(例えば、IgG、IgG、IgG又はIgG)及びIgMから選択されたアイソタイプである。具体的な実施形態において、本明細書において記載された抗OX40抗体は、IgGを含む。他の実施形態において、抗OX40抗体は、IgG又はIgGを含む。本明細書において使用された、抗体の「定常領域」は、ヒトIgGにおける、D356E及びL358M又はA431Gのような、天然の定常領域、アロタイプ又は天然の変異体を含む。例えば、Jefferis及びLefranc、MAbs、1(4):332〜338(2009年7月〜8月)を参照されたい。
抗OX40抗体の軽鎖定常領域は、カッパ(κ)軽鎖領域の場合もあり、ラムダ(λ)領域の場合もある。λ軽鎖領域は、公知のサブタイプ、例えば、λ、λ、λ又はλのいずれか1つでありうる。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、カッパ(κ)軽鎖領域を含む。
本明細書において使用された「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において利用可能である、又は公知である任意の手段により、任意の真核細胞クローン、原核細胞クローン又はファージクローンを含む、単一のクローンに由来する。本開示と共に有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術及びファージディスプレイ技術又はこれらの組合せの使用を含む、当技術分野において公知である、多種多様な技法を使用して調製されうる。抗OX40抗体の、インビボのヒトにおける使用を含む、本開示の多くの使用において、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が使用されうる。
本明細書において使用された「キメラ」抗体という用語は、ラット抗体又はマウス抗体のような、非ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列、及び、典型的に、ヒト免疫グロブリン鋳型から選択された、ヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を指す。キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Morrison、1985、Science、229(4719):1202〜7;Oiら、1986、BioTechniques、4:214〜221;Gilliesら、1985、J.Immunol.Methods、125:191〜202;米国特許第5,807,715号;同第4,816,567号及び同第4,816,397号を参照されたい。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する、最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリンである。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、CDR領域の全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、FR領域の全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンのFR領域である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的に、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の少なくとも一部も含みうる。抗体のヒト化法は、当技術分野において公知である。例えば、Riechmannら、1988、Nature、332:323〜7;Queenらによる、米国特許第5,530,101号;同第5,585,089号;同第5,693,761号;同第5,693,762号及び同第6,180,370号;EP239400;PCT公開第WO91/09967号;米国特許第5,225,539号;EP592106;EP519596;Padlan、1991、Mol.Immunol.、28:489〜498;Studnickaら、1994、Prot.Eng.、7:805〜814;Roguskaら、1994、Proc.Natl.Acad.Sci.、91:969〜973及び米国特許第5,565,332号を参照されたい。
「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリー又は1つ以上のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックである動物から単離され、内因性免疫グロブリンを発現しない抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法を含む、当技術分野において公知の様々な方法により作ることができる。米国特許第4,444,887号及び同第4,716,111号並びにPCT公開第WO98/46645号;同第WO98/50433号;同第WO98/24893号;同第WO98/16654号;同第WO96/34096号;同第WO96/33735号及び同第WO91/10741号を参照されたい。ヒト抗体はまた、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することが不可能であるが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現しうるトランスジェニックマウスを使用しても作ることができる。例えば、PCT公開第WO98/24893号;同第WO92/01047号;同第WO96/34096号;同第WO96/33735号;米国特許第5,413,923号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,569,825号;同第5,661,016号;同第5,545,806号;同第5,814,318号;同第5,885,793号;同第5,916,771号及び同第5,939,598号を参照されたい。加えて、LakePharma,Inc.(Belmont、CA)又はCreative BioLabs(Shirley、NY)のような企業は、上記において記載した技術と同様の技術を使用して、選択された抗原に対して方向付けられたヒト抗体を提供することに取り組むことができる。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導型選択」と称される技法を使用して生成されうる。この手法において、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体は、同じエピトープを認識する、完全なヒト抗体の選択を誘導するのに使用される(Jespersら、1988、Biotechnology、12:899〜903を参照されたい)。
また、抗OX40抗体の結合性断片も想定される。本開示の結合性断片は、OX40に特異的に結合することが可能な結合性断片を含む。抗体の結合性断片の例は、限定ではなく、例を目的として述べると、Fab、Fab’、F(ab’)、Fv断片、単鎖Fv(scFv)断片及び単一ドメイン断片を含む。
Fab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)を含有する。Fab’断片は、重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端における少数の残基であって、抗体のヒンジ領域に由来する、1つ以上のシステインを含む残基の付加により、Fab断片と異なる。Fab’断片は、F(ab’)の、ペプシンによる消化産物であるヒンジシステインにおける、ジスルフィド結合の切断によりもたらされる。抗体断片のさらなる化学的カップリングは、当業者に公知である。Fab及びF(ab’)断片は、無傷抗体の結晶性断片(Fc)領域を欠き、動物の循環からより急速にクリアランスされ、無傷抗体より小さな非特異的組織結合をもたらしうる(例えば、Wahlら、1983、J.Nucl.Med.、24:316を参照されたい)。
当技術分野において一般に理解された「Fc」領域とは、抗原特異的結合性領域を含まない、抗体の結晶性断片定常領域である。抗体のアイソタイプである、IgG、IgA及びIgDにおいて、Fc領域は、抗体の2つの重鎖の、第2の定常ドメイン及び第3の定常ドメイン(それぞれ、CH2ドメイン及びCH3ドメイン)に由来する、2つの同一なタンパク質断片から構成される。IgM Fc領域及びIgE Fc領域は、各ポリペプチド鎖内に、3つずつの重鎖定常ドメイン(CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメイン)を含有する。
「Fv」断片とは、完全な標的認識部位及び標的結合性部位を含有する、最小の抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合的会合下にある、1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインの二量体(V−V二量体)からなる。各可変ドメインの3つずつのCDRが相互作用して、V−V二量体の表面上において、標的結合性部位を規定するのは、この立体構成においてである。6つのCDRは、標的結合特異性を、抗体に付与することが多い。しかし、場合によって、単一の可変ドメイン(又は標的に特異的な3つのCDRだけを含むFvの半分)でもなお、全結合性部位より小さなアフィニティーにおいてではあるが、標的を認識し、標的に結合する能力を有しうる。
抗体の結合性断片である、「単鎖Fv」又は「scFv」は、抗体のVドメイン及びVドメインを含むが、この場合、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、Fvポリペプチドは、Vドメインと、Vドメインとの間のポリペプチドリンカーであって、scFvが、標的への結合に好適な構造を形成することを可能とするポリペプチドリンカーをさらに含む。
「単一ドメイン断片」は、OX40に対する十分なアフィニティーを示す、単一のVドメイン又はVドメインから構成される。具体的な実施形態において、単一ドメイン断片は、ラクダ科動物化断片である(例えば、Riechmann、1999、Journal of Immunological Methods、231:25〜38を参照されたい)。
本開示の抗OX40抗体は、誘導体化抗体を含む。例えば、誘導体化抗体は、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンド又は他のタンパク質への連結により修飾されることが典型的である。特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むがこれらに限定されない、多数の化学的修飾のいずれかが、公知の技法により実行されうる。加えて、誘導体は、例えば、ambrx技術(例えば、Wolfson、2006、Chem.Biol.13(10):1011〜2を参照されたい)を使用する、1つ以上の非天然のアミノ酸を含有しうる。
抗OX40抗体は、配列が、少なくとも1つの、定常領域に媒介される生物学的エフェクター機能を変更するように修飾された抗体でありうる。例えば、一部の実施形態において、抗OX40抗体は、少なくとも1つの、定常領域に媒介される生物学的エフェクター機能を、非修飾抗体と比べて低減する、例えば、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA及び/又はFcγRIIIBのようなFc受容体(FcγR)のうちの1又は複数への結合を低減するように、修飾されうる。FcγRへの結合は、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを、FcγR相互作用に必要な特定の領域において、突然変異させることにより低減されうる(例えば、Canfield及びMorrison、1991、J.Exp.Med.、173:1483〜1491並びにLundら、1991、J.Immunol.147:2657〜2662を参照されたい)。抗体の、FcγRへの結合能の低減はまた、FcγRとの相互作用に依拠する、他のエフェクター機能であって、オプソニン化、食作用及び抗原依存性細胞介在性細胞傷害作用(「ADCC」)のようなエフェクター機能も低減しうる。例示的な例において、Fc領域のCH2ドメイン内にV263L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S又はV273Yの置換を有する変異体CH2ドメインは、FcγRIIBに対し、対応する野生型定常領域と比較して低減されたアフィニティーを示しうる。
本明細書において記載された抗OX40抗体は、非修飾抗体と比べて、少なくとも1つの、定常領域に媒介される生物学的エフェクター機能を獲得又は改善する、例えば、FcγRとの相互作用を増強するように修飾された抗体(例えば、米国特許出願第2006/0134709号を参照されたい)を含む。例えば、本開示の抗OX40抗体は、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA及び/又はFcγRIIIBに、対応する野生型定常領域より大きなアフィニティーにより結合する定常領域を有しうる。例示的な例において、Fc領域のCH2ドメイン内にV263L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S又はV273Yの置換を有する変異体CH2ドメインは、FcγRIIIAに対し、対応する野生型定常領域と比較して大きなアフィニティーを示しうる。
したがって、本開示の抗OX40抗体は、オプソニン化、食作用又はADCCの増大又は減少を結果としてもたらす、生物学的活性の変更を有しうる。このような変更は、当技術分野において公知である。例えば、ADCC活性を低減する、抗体内の修飾は、米国特許第5,834,597号において記載されている。例示的なADCC低下変異体は、残基234及び237(EU番号付けを使用する)が、アラニンにより置換された、「突然変異体3」(「M3」としてもまた公知であり、米国特許第5,834,597号の図4に示されている)に対応する。突然変異体3(「M3」としてもまた公知である)の変異は、多数の抗体アイソタイプ、例えば、ヒトIgG M3において使用されうる。
抗OX40抗体の、FcγRへの結合及び/又はADCCエフェクター機能を修飾しうる、さらなる置換は、Fc領域内のK322A置換又はL234A及びL235Aの二重置換、例えば、L234A/L235A二重置換を有するヒトIgGを含む。例えば、Hezarehら、J.Virol.、75(24):12161〜12168(2001)を参照されたい。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、低レベルのフコースを有する、又はフコースを欠く。フコースを欠く抗体は、とりわけ、低用量の抗体において、ADCC活性の増強と相関する。Shieldsら、2002、J.Biol.Chem.、277:26733〜26740;Shinkawaら、2003、J.Biol.Chem.、278:3466〜73を参照されたい。フコース非含有抗体を調製する方法は、ラット骨髄腫YB2/0細胞(ATCC CRL 1662)内の増殖を含む。YB2/0細胞は、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素である、α−1,6−フコシルトランスフェラーゼをコードする、低レベルのFUT8 mRNAを発現する。
抗OX40抗体は、対応する野生型CH2領域又はFc領域の結合と比較して、FcγRIIBへの結合を増大させ、かつ/又はFcγRIIIAへの結合を低減するアミノ酸置換を含む修飾(又は変異体)CH2ドメイン又は全Fcドメインを含みうる。変異体CH2ドメイン又は変異体Fcドメインは、米国特許出願第2014/0377253号において記載されている。変異体CH2ドメイン又は変異体Fcドメインは、典型的に、263位、266位、273位及び305位において、1つ以上の置換を含み、この場合、Fcドメイン内の残基の番号付けは、Kabatにおける通り、EUインデックスによる番号付けである。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、野生型CH2ドメインと比べて、V263L、V266L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S、V273Y、V305K及びV305Wから選択される、1つ以上の置換を含む。具体的な実施形態において、CH2ドメインの、1つ以上の置換は、ヒトIgGのCH2ドメインと比べて、V263L、V273E、V273F、V273M、V273S及びV273Yから選択される。例えば、IgG CH2ドメインの、1つ以上の置換は、V273Eでありうる。別の具体的な実施形態において、本開示の抗OX40抗体は、アミノ酸置換であるV263Lを含む、変異体のIgG CH2ドメインを含む。
対応する野生型CH2領域又は野生型Fc領域の結合と比較して、FcγRIIBへの結合の増大及び/又はFcγRIIIAへの結合の低減をもたらしうる、変異体CH2ドメイン又は変異体Fcドメインの他の例は、Vonderheideら、Clin.Cancer Res.、19(5)、1035〜1043(2013)において見出される例であって、ヒトIgGにおける、S267E又はS267E/L328Fのような例を含む。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、FcRnとの相互作用に関与する特定の領域において、例えば、免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させること(例えば、WO2005/123780を参照されたい)により、胎児性Fc受容体であるFcRnへの、それらの結合アフィニティーを、増大又は減少させる修飾を含む。特定の実施形態において、IgGクラスの抗OX40抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸残基250、314及び428のうちの少なくとも1つが、単独において、又は250位及び428位において、若しくは250位及び314位において、若しくは314位及び428位において、若しくは250位、314位及び428位においてなど、これらの任意の組合せにおいて置換されるように突然変異させられるが、250位及び428位が具体的な組合せである。250位について、アミノ酸残基の置換は、トレオニン以外の任意のアミノ酸残基であって、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含むがこれらに限定されないアミノ酸残基でありうる。314位について、アミノ酸残基の置換は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であって、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含むがこれらに限定されないアミノ酸残基でありうる。428位について、アミノ酸残基の置換は、メチオニン以外の任意のアミノ酸残基であって、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含むがこれらに限定されないアミノ酸残基でありうる。Fcエフェクター機能を修飾することが公知の、例示的な置換は、Fc置換であるT250Qと組み合わせて生じうるFc置換である、M428Lである。適するアミノ酸置換の、さらなる具体的な組合せは、米国特許第7,217,797号の表1において同定されている。このような突然変異は、FcRnへの結合を増大させ、これは、抗体を、分解から保護し、その半減期を延長する。
抗OX40抗体は、例えば、Jung及びPluckthun、1997、Protein Engineering、10:8、959〜966; Yazakiら、2004、Protein Eng.Des Sel.17(5):481〜9、Epub、2004年8月17日及び米国特許出願第2007/0280931号において記載されている通り、そのCDRのうちの1又は複数へと、1つ以上のアミノ酸を挿入されている場合がある。
ヒトOX40(配列番号1)に対するアフィニティーが大きな抗OX40抗体は、治療的使用及び診断的使用に所望でありうる。したがって、本開示は、ヒトOX40に対する結合アフィニティーが大きな抗体を想定する。具体的な実施形態において、抗OX40抗体は、ヒトOX40に、少なくとも約100nMのアフィニティーにより結合する一方、高値のアフィニティー、例えば、少なくとも約90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM又はなお高値のアフィニティーを示しうる。一部の実施形態において、抗体は、ヒトOX40に、約1pM〜約100nMの範囲のアフィニティー又は約0.001〜10nM、0.001〜5nM、0.01〜100nM、0.01〜50nM、0.01〜10nM、0.01〜5nM又は0.01〜1nMのような範囲であるがこれらに限定されない、前出の値のいずれかの間の範囲のアフィニティーにより結合する。
抗OX40抗体の、ヒトOX40に対するアフィニティーは、例えば、限定を目的とするわけではないが、ELISA、等温滴定熱量測定(ITC)、表面プラズモン共鳴又は蛍光偏光アッセイのような、当技術分野において周知の技法又は本明細書において記載された技法を使用して決定されうる。
抗OX40抗体は、一般に、本明細書において(N→Cの順序で)V CDR1、V CDR2及びV CDR3として言及される、3つの相補性決定領域(「CDR」)を有する可変領域(V)を含む重鎖、並びに本明細書において(N→Cの順序で)V CDR1、V CDR2及びV CDR3として言及される、3つの相補性決定領域を有する可変領域(V)を含む軽鎖を、含む。本明細書において、例示的なCDRのアミノ酸配列のほか、例示的な抗OX40の重鎖及び軽鎖のV領域及びV領域のアミノ酸配列が提供される。抗OX40抗体の具体的な実施形態は、これらの例示的なCDR並びに/又はV配列及び/若しくはV配列のほか、ヒトOX40への結合について、このような抗体と競合する抗体を含む。
一部の実施形態において、抗OX40抗体のCDRのアミノ酸配列は、下記の表3:
Figure 2020504101
Figure 2020504101
における、それらのそれぞれのV CDR配列及びV CDR配列から選択された配列を有する。
本明細書において、上記のCDRを有する抗OX40抗体の具体的で例示的な実施形態が記載される。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号101、102、103、104、105及び106で表されるCDRを有する。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号111、112、113、114、115及び116で表されるCDRを有する。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号121、122、123、114、125及び126で表されるCDRを有する。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号131、132、133、114、115及び136で表されるCDRを有する。
本明細書において記載されたCDRは、本開示の抗OX40抗体のV鎖及びV鎖の中のエレメントへの結合を形成する。下記の表4及び5は、上記において記載されたCDRを含有する、例示的な抗OX40抗体に対応するV鎖及びV鎖について記載する。下記の表4及び5において、CDRに下線が付される。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、表4:
Figure 2020504101
に記載されたアミノ酸配列を有するV鎖及び表5:
Figure 2020504101
に記載されたアミノ酸配列を有するV鎖を含む。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号21で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び配列番号31で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号23で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び配列番号33で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号25で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び配列番号35で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号27で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び配列番号37で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、ヒトへの投与に適する。具体的な実施形態において、抗OX40抗体は、ヒト化されている。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号22で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び配列番号32で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号24で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び配列番号34で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号26で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び配列番号36で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号28で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び配列番号38で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む。
当業者により、本明細書において記載された抗OX40抗体内のV配列又はV配列の、ある特定の突然変異は、本開示の範囲内の抗OX40抗体をもたらすことが理解される。突然変異は、著明な抗OX40活性を保持しながら、本明細書で開示されたV配列又はV配列の、アミノ酸の置換、付加又は欠失を含みうる。したがって、一部の実施形態において、抗OX40抗体は、表4に示されたV配列のいずれか1つに対する、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有するV配列を含む。抗OX40抗体は、表4に示されたV配列のいずれか1つと比較して、最大で8カ所、最大で7カ所、最大で6カ所、最大で5カ所、最大で4カ所、最大で3カ所又は最大で2カ所の突然変異を有するV配列を含みうる。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、表4に示されたV配列のいずれか1つと比較して、5カ所以下、4カ所以下、3カ所以下又は2カ所以下の突然変異を有するV配列を含みうる。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、表5に示されたV配列のいずれか1つに対する、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有するV配列を含む。抗OX40抗体は、表5に示されたV配列のいずれか1つと比較して、最大で8カ所、最大で7カ所、最大で6カ所、最大で5カ所、最大で4カ所、最大で3カ所又は最大で2カ所の突然変異を有するV配列を含みうる。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、表5に示されたV配列のいずれか1つと比較して、5カ所以下、4カ所以下、3カ所以下又は2カ所以下の突然変異を有するV配列を含みうる。
全長重鎖アミノ酸配列及び全長軽鎖アミノ酸配列は、一般に、適切な免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒトIgG又はヒトカッパ軽鎖の定常領域へと連結された、上記において記載されたV鎖又はV鎖を含む。抗体重鎖のC末端における、1つ以上の(例えば、1つ、2つ、3つ以上)アミノ酸残基の切断のような、抗OX40抗体の全長配列に対する翻訳後修飾が生じうる。このような切断産物は、表された抗OX40抗体の一部又は全部を含みうる。
したがって、一部の実施形態において、抗OX40抗体は、表6に記載された重鎖アミノ酸配列:
Figure 2020504101
Figure 2020504101
Figure 2020504101
Figure 2020504101
及び表7に記載された軽鎖アミノ酸配列:
Figure 2020504101
Figure 2020504101
を含み、ここで下線を付されたアミノ酸はCDRを表し、イタリック体のアミノ酸は定常領域を表す。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号41又は42で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号51で表される軽鎖アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号43又は44で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号52で表される軽鎖アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号45又は46で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号53で表される軽鎖アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号47又は48で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号54で表される軽鎖アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号41〜48のいずれか1つで表される重鎖配列に対する、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する重鎖配列を含む。抗OX40抗体は、配列番号41〜48のいずれか1つで表される重鎖配列と比較して、最大で8カ所、最大で7カ所、最大で6カ所、最大で5カ所、最大で4カ所、最大で3カ所又は最大で2カ所の突然変異を有する重鎖配列を含みうる。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号41〜48のいずれか1つで表される重鎖配列と比較して、5カ所以下、4カ所以下、3カ所以下又は2カ所以下の突然変異を有する重鎖配列を含みうる。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号51〜54のいずれか1つで表される軽鎖配列に対する、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する軽鎖配列を含む。抗OX40抗体は、配列番号51〜54のいずれか1つで表される軽鎖配列と比較して、最大で8カ所、最大で7カ所、最大で6カ所、最大で5カ所、最大で4カ所、最大で3カ所又は最大で2カ所の突然変異を有する軽鎖配列を含みうる。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号51〜54のいずれか1つで表される軽鎖配列と比較して、5カ所以下、4カ所以下、3カ所以下又は2カ所以下の突然変異を有する軽鎖配列を含みうる。
抗OX40抗体のさらなる翻訳後修飾は、グリコシル化を含みうる。一般的な二分岐状複合体は、2つのN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、3つのマンノース並びに2つの分岐を形成するように、α−6マンノース及びα−3マンノースへと、β−1,2連結された、2つのGlcNAc残基を有するコア構造から構成されうる。1つ以上のフコース(Fuc)、ガラクトース(Gal)、高マンノースグリカンである、Man−5又はMan−9、バイセクティングGlcNAc、及びN−アセチルノイラミン酸(NANA)残基又はN−グリコリルノイラミン酸(NGNA)残基を含むシアル酸が、コアへと接合しうる。N連結型糖形態は、G0(コア二分岐状グリコシル化構造を有するタンパク質)、G0F(フコシル化G0)、G0F GlcNAc、G1(1つのガラクトース残基を有するコアグリコシル化構造を有するタンパク質)、G1F(フコシル化G1)、G2(2つのガラクトース残基を有するコアグリコシル化構造を有するタンパク質)及び/又はG2F(フコシル化G2)を含みうる。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、インビトロアッセイにおいて、ヒトOX40(配列番号1)への結合について、基準抗体と競合する。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、ヒトOX40を発現する細胞において、ヒトOX40rへの結合について競合する。基準抗体は、本明細書において記載された抗OX40抗体のいずれかでありうる。一部の実施形態において、基準抗体は、表4に記載されたVで表されるV及び表5に記載されたVで表されるVを有する抗体である。具体的な実施形態において、基準抗体は、Mu3726 V及びMu3726 V(「Mu3726」)を含むマウス抗体、Mu3738 V及びMu3738 V(「Mu3738」)を含むマウス抗体、Mu3739 V及びMu3739 V(「Mu3739」)を含むマウス抗体又はMu3741 V及びMu3741 V(「MU3741」)を含むマウス抗体である。一部の実施形態において、基準抗体は、Mu3726、Mu3738、Mu3739又はMu3741のヒト化形である。ある特定の実施形態において、基準抗体は、配列番号41又は42で表される重鎖及び配列番号51(「Hu3738」)で表される軽鎖を含むヒト化抗体、配列番号43又は44で表される重鎖及び配列番号52(「Hu3726」)で表される軽鎖を含むヒト化抗体、配列番号45又は46で表される重鎖及び配列番号53(「Hu3739」)で表される軽鎖を含むヒト化抗体又は配列番号47又は48で表される重鎖及び配列番号54(「Hu3741」)で表される軽鎖を含むヒト化抗体である。
本明細書において記載された抗OX40抗体は、一般に、ヒトOX40に特異的に結合する。他の種、例えば、サル、例えば、カニクイザルに由来するOX40への結合についての抗体の交差反応性は、サルによる動物モデルにおいて、生物学的活性について調べる能力のような利点をもたらしうる。このような動物モデルによる試験は、有効性と関連する特性、例えば、好適な薬物動態又は安全性と関連する特性、例えば、肝毒性の低下を選択するように、抗OX40抗体をスクリーニングするのに使用されうる。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、カニクイザルOX40(配列番号2)(NCBI基準配列:XP005545179)のほか、ヒトOX40に結合する。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、マウスOX40(配列番号3)(NCBI基準配列:NP037181)に結合しない。
競合についてのアッセイは、放射性材料により標識化されたイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫測定アッセイ(ELISA)、サンドイッチELISA、蛍光活性化細胞分取(FACS)アッセイ及び表面プラズモン共鳴アッセイを含むがこれらに限定されない。
表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイは、2つのタンパク質、例えば、レポーターシグナル又はレポータータグに対する必要をとせずに、ヒトOX40受容体及び抗OX40抗体のような受容体及び抗体の間の結合反応速度の直接的な測定を可能とする。結合アフィニティーの尺度である、平衡解離定数のK並びにその2つの成分(結合反応速度定数であるk(M−1×秒−1)(会合定数であるkon又は「オン速度」)及びk(秒−1)(解離定数であるkoff又は「オフ速度」)のいずれも、SPRを使用して決定されうる。定数は、以下の式:
=k/k
により関連づけられる。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、少なくとも約100nMのKを有するが、高値のアフィニティー、例えば、少なくとも約90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nMなお又は高値のアフィニティーを示しうる。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、約1pM〜約100nMの範囲のK又は約0.001〜10nM、0.001〜5nM、0.01〜100nM、0.01〜50nM、0.01〜10nM、0.01〜5nM又は約0.01〜1nMのような範囲であるがこれらに限定されない、前出の値のいずれかの間の範囲のアフィニティーを有する。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、約10秒−1を超えない、例えば、約1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001秒−1なお又はこれより低値を超えない解離定数kを有する。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、約0.001秒−1〜約10秒−1の範囲のk又は約0.01〜10秒−1、0.001〜0.5秒−1、0.001〜0.2秒−1、0.001〜0.1秒−1、0.01〜1秒−1、0.001〜0.05秒−1若しくは約0.001〜1秒−1のような範囲であるがこれらに限定されない、前出の値のいずれかの間の範囲のkを有する。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、少なくとも約10−1×秒−1、例えば、少なくとも約1×10、5×10、1×10、5×10、1×10、5×10、1×10−1×秒−1なお又はこれを超える会合定数kを有する。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、約10−1×秒−1〜約10−1×秒−1の範囲のk又は約5×10〜1×10−1×秒−1、5×10〜5×10−1×秒−1若しくは約1×10〜5×10−1×秒−1のような範囲であるがこれらに限定されない、前出の値のいずれかの間の範囲のkを有する。
本開示の抗OX40抗体は、本明細書において記載された例示的OX抗体のいずれか1つで測定された結合反応速度定数に近似する範囲のK、k又はkを示しうる。例えば、一部の実施形態において、抗OX40抗体は、Hu3738、Hu3726、Hu3739及びHu3741のいずれか1つのkの、約0.01〜約100倍、例えば、約0.1〜約10倍又は約0.5〜約5倍の範囲のkである解離定数を有する。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、Hu3738、Hu3726、Hu3739及びHu3741のいずれか1つのkの、約0.01〜約100倍、例えば、約0.1〜約10倍又は約0.5〜約5倍の範囲のkである会合定数を有する。
基準抗体と被験抗体との抗体競合アッセイ(種又はアイソタイプに関わらない)の実行において、まず、その後における同定を可能とするように、基準抗体を、フルオロフォア、ビオチン又は酵素(なお又は放射性)標識のような検出用標識により標識化することができる。この場合、ヒトOX40を発現する細胞を、標識化されていない被験抗体と共にインキュベートし、標識化された基準抗体を添加し、結合した標識の強度を測定する。被験抗体が、重複するエピトープへの結合により、標識化された基準抗体と競合する場合、強度は、被験抗体がない状態で実行された対照反応と比べて低下する。
このアッセイの具体的な実施形態において、アッセイ条件(例えば、特定の細胞密度)下において最大結合の80%をもたらす標識化基準抗体の濃度(「conc80%」)を、まず決定し、conc80%の10倍濃度の非標識化被験抗体及びconc80%の標識化基準抗体により、競合アッセイを実行する。
阻害は、以下の式:
=IC50/(1+[基準Ab濃度]/K
に従い計算される阻害定数又はKとして表すことができ、ここでIC50は、基準抗体の結合の50%の低減をもたらす被験抗体の濃度であり、Kは、ヒトOX40に対するそのアフィニティーの尺度である、基準抗体の解離定数である。本明細書で開示された抗OX40抗体と競合する抗体は、本明細書において記載されたアッセイ条件下において、10pM〜100nMのKを有しうる。
多様な実施形態において、被験抗体は、基準抗体濃度が、使用された具体的なアッセイ条件下における最大結合の80%であり、被験抗体濃度が、基準抗体濃度の10倍であるときに、基準抗体の結合を、少なくとも約20%以上、例えば、少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%なお若しくはこれを超えて、又は前出の値のいずれかの間の範囲の百分率だけ減少する場合に、基準抗体と競合すると考えられる。
抗体が、ヒトOX40への結合について、本明細書において記載された基準抗体と競合するのかどうかを評価するために有用な、具体的なアッセイ及びアッセイ条件については、8.1.4節において示されている。
一部の実施形態において、本開示の抗OX40抗体は、ヒトOX40(配列番号1)を活性化する。OX40受容体の活性化は、多数の機構、例えば、OX40受容体に対するリガンド様活性をもたらすことにより生じうる。このような場合、抗OX40抗体は、OX40受容体への結合について、ヒトOX40リガンド(OX40L、CD252;UniProtKB/Swiss−Prot Code P23510.1)(配列番号4)と競合する。
本開示の抗OX40抗体は、一般に、架橋の存在下において、OX40受容体を活性化しうる。抗OX40抗体が、架橋の存在下において、OX40受容体、例えば、ヒトOX40受容体(配列番号1)を活性化しうるのかどうかを評価するために有用な、具体的なアッセイ及びアッセイ条件については、8.1.8節において示されている。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、架橋の存在下において、約0.01〜約300nM、約0.01〜約100nM、約0.01〜約10nM、約0.01〜約1nM、約0.1〜約300nM、約0.1nM〜約100nM、約1nM〜約100nM又は約0.1nM〜約100nMのような範囲であるがこれらに限定されない、約1pM〜約500nMのEC50により、ヒトOX40受容体を活性化する。一部の実施形態において、100μg/mLにおける抗OX40抗体は、ヒトOX40受容体を、架橋の存在下において、抗OX40抗体の非存在下における、ヒトOX40受容体の活性と比較して、約3〜約1000、例えば、約5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、200、400、500、700、800又は約1000倍のような、少なくとも約3倍の活性へと活性化しうる。
架橋は、外因性架橋剤の添加を含む多数の方法により、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体の重鎖、軽鎖若しくは可変領域に特異的な、抗体若しくは抗体F(ab’)断片により;可溶性プロテインA若しくは固定化させたプロテインAにより;Fc受容体をトランスフェクトされた細胞系により;内因性Fc受容体を発現する細胞系により;プラスチック表面を、対象の抗体により直接コーティングすることにより;外因性の架橋抗体若しくはFc受容体によりコーティングされたプラスチック表面により;又は上記のいずれかへとコンジュゲートさせたビーズにより施されうる。例示的な例において、対象の抗体は、ビオチンのようなタンパク質へとコンジュゲートさせることができ、可溶性アビジン若しくは固定化させたアビジン又は可溶性ストレプトアビジン若しくは固定化させたストレプトアビジンは、架橋剤として使用される。別の例において、インビボのヒトリンパ節において、抗OX40抗体への結合の後におけるOX40の活性化は、内因性FcγR+抗原提示細胞により施される受容体の架橋の後において生じることが予測される。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、架橋の非存在下において、ヒトOX40受容体に結合し、これを活性化する。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、OX40L、例えば、ヒトOX40L(配列番号4)の非存在下において、OX40受容体、例えば、ヒトOX40受容体(配列番号1)を活性化する。抗OX40抗体が、架橋がない状態で、OX40受容体を活性化しうるのかどうかを評価するために有用な、具体的なアッセイ及びアッセイ条件については、8.1.8節において示されている。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、架橋がない状態で、約0.01〜約300nM、約0.01〜約100nM、約0.1〜約300nM、約0.1nM〜約100nM、約1nM〜約100nM、約0.1nM〜約100nM、約1〜約300nM、約1〜約100nM、約1〜約50nM又は約10〜約100nMのような範囲であるがこれらに限定されない、約1pM〜約500nMのEC50により、ヒトOX40受容体を活性化する。一部の実施形態において、100μg/mLにおける抗OX40抗体は、ヒトOX40受容体を、架橋がない状態で、等量のアイソタイプ抗体を投与された場合のヒトOX40受容体の活性と比較して、約5〜約1000、例えば、約5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、200、300、400、500、700、800又は約1000倍のような、少なくとも約5倍の活性へと活性化しうる。一部の実施形態において、10μg/mLにおける抗OX40抗体は、ヒトOX40受容体を、架橋がない状態で、等量のアイソタイプ抗体を投与された場合のヒトOX40受容体の活性と比較して、約3〜約300、例えば、約3、5、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、60、80、100、200又は約300倍のような、少なくとも約3倍の活性へと活性化しうる。一部の実施形態において、1μg/mLにおける抗OX40抗体は、ヒトOX40受容体を、架橋がない状態で、等量のアイソタイプ抗体を投与された場合のヒトOX40受容体の活性と比較して、約3〜約150、例えば、約3、4、5、6、7、8、10、12、15、20、25、30、40、50、60、80、100又は約150倍のような、少なくとも約3倍の活性へと活性化しうる。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、架橋の存在下において、架橋がない状態と比較して、高レベルにおいて、OX40受容体、例えば、ヒトOX40受容体(配列番号1)を活性化する。抗OX40抗体が、架橋がない状態で、OX40受容体を活性化しうるレベルを決定するために有用な、具体的なアッセイ及びアッセイ条件については、8.1.8節において示されている。活性のレベルは、例えば、EC50及び/又は観察された最大の活性化との関係において測定しうる。一部の実施形態において、100μg/mLにおける抗OX40抗体は、架橋がない状態で、8.1.8節に従うアッセイにおいて、架橋がある状態のNF−κB活性と比較して、約25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%又は約90%のような、約20%〜約95%のNF−κB活性において、OX40受容体、例えば、ヒトOX40受容体(配列番号1)を活性化する。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、架橋がない状態で、8.1.8節に従うアッセイにおいて、約1nM〜約100nM、約0.1nM〜約100nM、約1〜約300nM、約1〜約100nM、約1〜約50nM又は約10〜約100nMのような範囲であるがこれらに限定されない、約0.1nM〜約500nMのEC50により、ヒトOX40受容体を活性化する。一部のこのような実施形態において、10μg/mLにおける抗OX40抗体は、ヒトOX40受容体を、架橋がない状態で、等量のアイソタイプ抗体を投与された場合のヒトOX40受容体の活性と比較して、約3〜約300、例えば、約3、5、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、60、80、100、200又は約300倍のような、少なくとも約3倍の活性へと活性化しうる。一部のこのような実施形態において、抗OX40抗体は、架橋の存在下において、8.1.8節に従うアッセイにおいて、約0.01〜約300nM、約0.01〜約100nM、約0.01〜約10nM、約0.01〜約1nM、約0.1〜約300nM、約0.1nM〜約100nM、約1nM〜約100nM又は約0.1nM〜約100nMのような範囲であるがこれらに限定されない、約1pM〜約300nMのEC50により、ヒトOX40受容体を活性化する。一部のこのような実施形態において、抗OX40抗体は、架橋の存在下において、8.1.8節に従うアッセイにおいて、米国公開第2015/0307617号に記載された抗体1A7のEC50と比較して、約1.5〜約10倍、例えば、約2、3、4、5、6、7、8、9又は約10分の1のような、約1.5〜約100分の1のような、低値のEC50において、ヒトOX40受容体を活性化しうる。
本発明の抗OX40抗体は、架橋がない状態で、8.1.8節に従うアッセイにおいて、約1nM〜約100nMのEC50により、ヒトOX40受容体を活性化し、架橋の存在下にて、8.1.8節に従うアッセイにおいて、米国公開第2015/0307617号に記載された抗体1A7のEC50と比較して、約1.5〜約10分の1のような低値のEC50において、ヒトOX40受容体を活性化しうる。上記において列挙された特性を有する、例示的な抗OX40抗体は、本明細書の実施例2〜8において記載されている、Mu3738及びHu3738を含む。
一般に、抗OX40抗体により処置されたときのOX40の活性化は、サイトカイン産生(例えば、インターフェロン−ガンマ(IFN−γ))の増大及び/又は細胞増殖、例えば、CD4+ T細胞増殖の増大のようなシグナル伝達を結果としてもたらす。一部の実施形態において、1μg/mLの抗OX40抗体による処置の後における、IFN−γの産生の増大は、等量のアイソタイプ抗体による処置の後におけるIFN−γの産生レベルの約1.5、2、3、4、5、6、8、10、15、20、25、30、40又は約50倍のような、約1.5〜約50倍である。一部の実施形態において、1μg/mLの抗OX40抗体による処置の後における、CD4+ T細胞の増殖の増大は、等量のアイソタイプ抗体による処置の後におけるCD4+ T細胞の増殖レベルの約1.5、2、3、4、5、6、8、10、15又は約20倍のような、約1.5〜約20倍である。サイトカインレベルを決定するためのアッセイ又は細胞増殖レベルを決定するためのアッセイは、当技術分野において公知である。IFN−γの産生及び/又はCD4+ T細胞増殖を決定するための、具体的なアッセイ及びアッセイ条件は、本明細書の8.1.12節において示されている。
7.4.抗OX40抗体をコードするポリヌクレオチド、これらを作る発現系及び方法
本開示は、抗OX40抗体のための免疫グロブリンの軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子をコードする核酸分子、このような核酸を含むベクター及び本開示の抗OX40抗体を産生することが可能な宿主細胞を包摂する。
本開示の抗OX40抗体は、宿主細胞内の免疫グロブリンの軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子の組換え発現により調製されうる。抗体を、組換えにより発現させるために、軽鎖及び重鎖が、宿主細胞内において発現し、任意選択的に、宿主細胞が培養され、抗体が回収される培地へと分泌されるように、宿主細胞に、抗体の免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖をコードするDNA断片を保有する、1つ以上の組換え発現ベクターをトランスフェクトする。抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を、組換え発現ベクターへと組み込み、ベクターを、宿主細胞へと導入するのに、「Molecular Cloning;A Laboratory Manual」、2版(Sambrook、Fritsch及びManiatis(編)、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989)、「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel,F.M.ら編、Greene Publishing Associates、1989)並びに米国特許第4,816,397号において記載されている組換えDNA法のような、標準的組換えDNA法が使用される。
このような抗OX40抗体をコードする核酸を生成するために、まず、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするDNA断片を得る。これらのDNAは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用する、軽鎖及び重鎖の可変配列をコードする、生殖細胞系列のDNA又はcDNAの増幅及び修飾により得られうる。ヒト重鎖可変領域遺伝子及びヒト軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列のDNA配列は、当技術分野において公知である(例えば、ヒト生殖細胞系列配列のデータベースである「VBASE」を参照されたい;また、Kabat,E.A.ら、1991、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、5版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH刊行物第91−3242号;Tomlinsonら、1992、J.Mol.Biol.、22:116〜198;及びCoxら、1994、Eur.J.Immunol.、24:827〜836も参照されたい)。
抗OX40抗体関連のVセグメント及びVセグメントをコードするDNA断片が得られたら、これらのDNA断片は、標準的な組換えDNA法により、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Fab断片遺伝子又はscFv遺伝子へと転換するように、さらに操作されうる。これらの操作において、VをコードするDNA断片又はVをコードするDNA断片は、抗体の定常領域又は可撓性のリンカーのような、別のタンパク質をコードする、別のDNA断片へと作動的に連結される。この文脈において使用された、「作動的に連結された」という用語は、2つのDNA断片によりコードされたアミノ酸配列が、なおもインフレームにあるように、2つのDNA断片が接続されることを意味するように意図される。
領域をコードする単離DNAは、VをコードするDNAを、重鎖定常領域(CH1、CH2、CH3及び、任意選択的に、CH4)をコードする、別のDNA分子へと作動的に連結することにより、全長重鎖遺伝子へと転換されうる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において公知であり(例えば、Kabat,E.A.ら、1991、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、5版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH刊行物第91−3242号を参照されたい)、これらの領域を包摂するDNA断片は、標準的なPCR増幅により得られうる。重鎖定常領域は、IgG、IgG、IgG、IgG、IgA、IgE、IgM又はIgDの定常領域でありうるが、ある特定の実施形態において、IgG又はIgGである。Fab断片の重鎖遺伝子のために、VをコードするDNAは、重鎖CH1定常領域だけをコードする、別のDNA分子へと作動的に連結されうる。
領域をコードする単離DNAは、VをコードするDNAを、軽鎖定常領域であるCLをコードする、別のDNA分子へと作動的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子(並びにFab軽鎖遺伝子)へと転換されうる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において公知であり(例えば、Kabat,E.A.ら、1991、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、5版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH刊行物第91−3242号を参照されたい)、これらの領域を包摂するDNA断片は、標準的なPCR増幅により得られうる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域でありうるが、ある特定の実施形態において、カッパ定常領域である。scFv遺伝子を創出するために、VをコードするDNA断片及びVをコードするDNA断片は、V領域及びV領域が、可撓性のリンカーにより接続された、連続的な単鎖タンパク質として、V配列及びV配列が表されうるように、可撓性のリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列(Gly−Ser)(配列番号60)をコードする別の断片へと作動的に連結される(例えば、Birdら、1988、Science、242:423〜426;Hustonら、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:5879〜5883;McCaffertyら、1990、Nature、348:552〜554を参照されたい)。
本開示の抗OX40抗体を発現させるために、上記において記載した通りに得られた、部分的軽鎖及び部分的重鎖又は全長軽鎖及び全長重鎖をコードするDNAは、遺伝子が、転写制御配列及び翻訳制御配列へと作動的に連結されるように、発現ベクターへと挿入される。この文脈において、「作動的に連結された」という用語は、ベクター内の転写制御配列及び翻訳制御配列が、それらの意図された機能であって、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する機能を果たすように、抗体遺伝子が、ベクターへとライゲーションされることを意味するように意図される。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現用宿主細胞と適合性となるように選択される。抗体の軽鎖遺伝子と、抗体の重鎖遺伝子とは、別個のベクターへと挿入される場合もありうるが、より典型的に、いずれの遺伝子も、同じ発現ベクターへと挿入される。
抗体遺伝子は、標準的な方法(例えば、抗体遺伝子断片上の相補的な制限部位とベクターとのライゲーション又は制限部位が存在しない場合の、平滑末端によるライゲーション)により、発現ベクターへと挿入される。抗OX40抗体関連の軽鎖配列又は重鎖配列を挿入する前に、発現ベクターは、既に、抗体の定常領域配列を保有しうる。例えば、抗OX40モノクローナル抗体関連のV配列及びV配列を、全長抗体遺伝子へと転換する1つの手法は、Vセグメントが、ベクター内のCHセグメントへと作動的に連結され、Vセグメントが、ベクター内のCLセグメントへと作動的に連結されるように、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のそれぞれをあらかじめコードする発現ベクターへと、それらを挿入することである。加えて、又は代替的に、組換え発現ベクターは、抗体鎖の、宿主細胞からの分泌を容易とするシグナルペプチドをコードしうる。シグナルペプチドが、インフレームにおいて、抗体鎖遺伝子のアミノ末端へと連結されるように、抗体鎖遺伝子は、ベクターへとクローニングされうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドの場合もあり、異種シグナルペプチド(すなわち、免疫グロブリン以外のタンパク質に由来するシグナルペプチド)の場合もある。
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内の抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Goeddel、「Gene Expression Technology:Methods in Enzymology」、185、Academic Press、San Diego、CA、1990において記載されている。当業者により、調節配列の選択を含む発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存しうることが理解される。哺乳動物宿主細胞の発現に適する調節配列は、サイトメガロウイルス(CMV)(CMVのプロモーター/エンハンサーのような)、サルウイルス40(SV40)(SV40プロモーター/エンハンサーのような)、アデノウィルス(例えば、アデノウィルス主要後期プロモーター(AdMLP))及びポリオーマウイルスに由来するプロモーター及び/又はエンハンサーのような、哺乳動物細胞内の、高レベルのタンパク質発現を方向付けるウイルス性エレメントを含む。ウイルス性調節エレメント及びこれらの配列のさらなる記載について、例えば、Stinskiによる米国特許第5,168,062号、Bellらによる米国特許第4,510,245号及びSchaffnerらによる米国特許第4,968,615号を参照されたい。
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内のベクターの複製を調節する配列(例えば、複製起点)及び選択用マーカー遺伝子のような、さらなる配列を保有しうる。選択用マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易とする(例えば、全てAxelらによる、米国特許第4,399,216号、同第4,634,665号及び同第5,179,017号を参照されたい)。例えば、選択用マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対して、G418、ハイグロマイシン又はメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与することが典型的である。適切な選択用マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子(メトトレキサートによる選択/増幅を伴う、DHFR宿主細胞における使用のための)及びneo遺伝子(G418による選択のための)を含む。軽鎖及び重鎖を発現させるために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技法により、宿主細胞へとトランスフェクトされる。多様な形態にわたる「トランスフェクション」という用語は、外因性DNAを、原核宿主細胞又は真核宿主細胞へと導入するために一般に使用される多種多様な技法であって、例えば、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE−デキストラントランスフェクションなどの技法を包摂することが意図される。
本開示の抗OX40抗体は、原核宿主細胞又は真核宿主細胞において発現させることが可能である。ある特定の実施形態において、抗体の発現は、真核細胞、例えば、フォールディングが適正であり、免疫学的に活性である抗体の分泌を最適とする、哺乳動物宿主細胞において実施される。本開示の組換え抗体を発現させるための、例示的な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えば、Kaufman及びSharp、1982、Mol.Biol.、159:601〜621において記載されている、DHFR選択用マーカーと共に使用される、Urlaub及びChasin、1980、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:4216〜4220において記載されている、DHFRCHO細胞を含む)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞及びSP2細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞へと導入される場合、抗体は、宿主細胞内の抗体の発現又は宿主細胞が増殖する培養培地への抗体の分泌を可能とするのに十分な時間にわたり、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して、培養培地から回収されうる。宿主細胞はまた、Fab断片又はscFv分子のような、抗体の抗OX40結合性断片を産生するのにも使用されうる。上記の手順に対する変動は、本開示の範囲内にあることが理解される。例えば、宿主細胞に、本開示の抗OX40抗体の軽鎖又は重鎖(両方ではない)をコードするDNAをトランスフェクトすることが所望されうる。
組換えDNA技術はまた、ヒトOX40への結合に必要でない軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするDNAの一部又は全部を除去するのにも使用されうる。また、このような切断型DNA分子から発現する分子も、本開示の抗体に包摂される。
本開示の抗OX40抗体を組換え発現させるために、宿主細胞に、本開示の2つの発現ベクターが共トランスフェクトされ得、ここで、第1のベクターが、重鎖に由来するポリペプチドをコードし、第2のベクターが、軽鎖に由来するポリペプチドをコードする。2つのベクターは、同一の選択用マーカーを含有する場合もあり、各々、個別の選択用マーカーを含有する場合もある。代替的に、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードする、単一のベクターも使用されうる。
抗OX40抗体の1つ以上の部分をコードする核酸が得られたら、例えば、異なるCDR配列を有する抗体、Fc受容体に対するアフィニティーが低減された抗体又は異なるサブクラスの抗体をコードする核酸を生成するように、さらなる変更又は突然変異が、コード配列へと導入されうる。
本開示の抗OX40抗体はまた、化学合成によっても産生されうる(例えば、「Solid Phase Peptide Synthesis」、2版、1984、The Pierce Chemical Co.、Rockford、Ill.において記載されている方法により)。変異体抗体はまた、無細胞プラットフォームを使用しても生成されうる(例えば、Chuら、Biochemia、2号、2001(Roche Molecular Biologicals)及びMurrayら、2013、Current Opinion in Chemical Biology、17:420〜426を参照されたい)。
本開示の抗OX40抗体が、組換え発現により産生されたら、免疫グロブリン分子を精製するための、当技術分野において公知である、任意の方法、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ除外カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差的可溶性又はタンパク質を精製するための他の任意の標準的な技法により精製されうる。さらに、本開示の抗OX40抗体は、精製を容易とするように、本明細書において記載された異種ポリペプチド配列又は当技術分野において、他の形において公知の異種ポリペプチド配列へと融合されうる。
単離されたら、抗OX40抗体は、所望の場合、例えば、高速液体クロマトグラフィー(例えば、Fisher、「Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology」、Work及びBurdon編、Elsevier、1980を参照されたい)によりさらに精製される場合もあり、Superdex(商標)75カラム(Pharmacia Biotech AB、Uppsala、Sweden)上のゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに精製される場合もある。
7.5.医薬組成物
本明細書において記載された抗OX40抗体は、抗体並びに1つ以上の担体、賦形剤及び/又は希釈剤(これらの全ては、本明細書において、「担体」と称される)、すなわち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤及びその他の添加剤を含む組成物の形態でありうる。「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、16版(Osol編、1980)を参照されたい。組成物は、獣医学的使用又はヒトにおける医薬としての使用のような、具体的使用のために製剤化されうる。使用される組成物(例えば、乾燥粉末、液体製剤など)及び担体の形態は、抗体の意図される使用及び、治療的使用について、投与方式に依存する。
治療的使用のために、組成物は、薬学的に許容される担体を含む、滅菌の医薬組成物の一部として供給されうる。この組成物は、任意の適切な形態でありうる(それを患者へと投与する所望の方法に応じて)。医薬組成物は、患者へと、静脈内、腫瘍内又は髄腔内のような、様々な経路により投与されうる。所与の任意の場合において、投与に最も適する経路は、特定の抗体、対象、並びに疾患の性格及び重症度並びに対象の全身状態に依存する。医薬組成物は、静脈内投与されることが典型的である。
医薬組成物は、投与1回当たり所定量の、本明細書において記載された抗OX40抗体を含有する単位剤形において提示されると好都合でありうる。単位用量中に含まれる抗OX40抗体の数量は、処置される疾患のほか、当技術分野において周知である、他の因子に依存する。このような単位投与量は、単回の投与に適する量の抗体を含有する、凍結乾燥させた乾燥粉末の形態の場合もあり、液体の形態の場合もある。乾燥粉末による単位剤形は、シリンジ、適切な数量の担体及び/又は投与に有用な他の成分を有するキットにパッケージングされうる。液体形態の単位投与量は、単回の投与に適する数量の抗OX40抗体により事前に充填されたシリンジの形態において供給されると好都合でありうる。
医薬組成物はまた、複数回投与に適する数量の抗OX40抗体を含有するバルク形態においても供給されうる。
医薬組成物は、所望の純度を有する抗体を、当技術分野において、典型的に援用される、任意選択の、薬学的に許容される担体と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液としての保存のために調製されうる。このような添加剤は、援用される投与量及び濃度において、レシピエントに対して非毒性でなければならない。
例えば、静脈内投与のために、組成物は、滅菌水又は注射若しくは注入に適する他の溶液(例えば、0.9%の生理食塩液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液など)により再構成すると、水性組成物をもたらす、凍結乾燥粉末の形態でありうる。
7.6.使用法
7.6.1.治療的利益
本明細書において提供されたデータは、開示された抗OX40抗体が、がん細胞の存在下において、OX40受容体を活性化し、インビボにおいて、がんに対する、強力な抗がん活性を及ぼすことを裏付ける。したがって、抗OX40抗体及び/又は抗OX40抗体を含む医薬組成物は、がんを処置するために、治療的に使用されうる。
一部の実施形態において、がんは、固形腫瘍である。抗OX40抗体により処置されうる固形腫瘍は、膀胱がん、乳がん(例えば、トリプルネガティブ乳がん)、頭頸部がん、腎臓がん(例えば、腎細胞癌)、肝臓がん(例えば、肝細胞癌、胆管癌)、肺がん(例えば、非小細胞肺がん、中皮腫、小細胞肺がん)、黒色腫(例えば、切除不能性黒色腫又は転移性黒色腫、進行性悪性黒色腫)、皮膚がん(例えば、メルケル細胞癌)、卵巣がん、胃がん及びDNAミスマッチ修復欠損の証拠を有する腫瘍を含む。がんは、OX40を発現する細胞を含有する腫瘍を含む場合もあり;一部が、OX40を発現する細胞を含有し、一部が、これらを含有しない腫瘍を含む場合もあり;OX40を発現する細胞を欠く腫瘍を含む場合もある。がんは、新たに診断され、未処置の場合もあり、再発性、不応性又は再発性かつ不応性の場合もあり、固形腫瘍の転移性形態の場合もある。一部の実施形態において、固形腫瘍は、PD−1ターゲティング剤又はPD−L1ターゲティング剤が未投薬である。他の実施形態において、固形腫瘍は、PD−1ターゲティング剤又はPD−L1ターゲティング剤による処置の後において、再発性又は不応性である。一部の実施形態において、固形腫瘍は、膀胱がん、乳がん、頭頸部がん、腎臓がん、肺がん、黒色腫及び胃がんから選択される。一部の実施形態において、固形腫瘍は、黒色腫(例えば、切除不能性黒色腫又は転移性黒色腫)、肺がん(例えば、非小細胞肺がん)及び腎細胞癌(例えば、進行性腎細胞癌)から選択される。一部の実施形態において、固形腫瘍は、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、肝細胞癌、胃がん、小細胞肺がん、中皮腫、胆管癌、メルケル細胞癌及びDNAミスマッチ修復欠損の証拠を有する腫瘍から選択される。ある特定の実施形態において、肺がんは、白金ベースの化学療法時又はこの後における進行を伴う、転移性非小細胞肺がんである。ある特定の実施形態において、肺がんは、白金ベースの治療及びPD−1ターゲティング剤又はPD−L1ターゲティング剤による治療が失敗した、局所進行性非小細胞肺がん又は転移性非小細胞肺がんである。ある特定の実施形態において、頭頸部がんは、局所治療若しくは全身治療による、治癒のための処置候補ではない、扁平上皮頭頸部癌又は局所治療により難治性であると考えられた、口腔、口腔咽頭、下咽頭及び喉頭の、転移性(播種性)頭頸部扁平上皮癌である。
上記において論じられた通り、本開示の抗OX40抗体は、免疫応答をモジュレートする。したがって、免疫系が損なわれた患者は、処置から除外されうる。一部の実施形態において、患者は、以下の基準のうちの1又は複数を満たした後に除外される:(1)活動性の自己免疫疾患若しくは過去2年以内に既往の記録がある自己免疫疾患(炎症性腸疾患、セリアック病、ウェゲナー症候群を含むがこれらに限定されない)(小児性アトピー性皮膚炎若しくは喘息、白斑、禿頭、橋本症候群、グレーブス病若しくは全身処置を要請しない乾癬(過去2年以内)を有する対象は、除外されない);(2)原発性免疫不全症、骨髄移植、慢性リンパ球性白血病、固形臓器移植若しくは過去における結核の臨床診断の既往歴;(3)凝固障害若しくは血小板障害の既往歴;(4)ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)についての陽性検査結果の確認又は慢性若しくは活動性のB型肝炎若しくはC型肝炎を有する対象(B型肝炎又はC型肝炎の既往歴を有する対象であって、抗ウイルス療法の後における治癒の記録がある対象は、登録されうる);(5)過去に、免疫療法(CTLA−4、PD−L1又はPD−1に対して方向付けられた薬剤を含むがこれらに限定されない)を施されたときの、グレード>3の免疫媒介性神経毒性又は肺炎、加えて、他の任意の、過去に、免疫療法を施されたときの、グレード>3の免疫媒介性有害事象であって、3カ月以内に消失しなかった、又は無症状性とならなかった有害事象;(6)抗OX40抗体の初回投与の28日間以内前における、弱毒化生ワクチンの施与。
本開示の抗OX40抗体は、単独(単剤療法)において投与される場合もあり、他の抗がん療法及び/又はターゲティング型抗がん剤若しくは非ターゲティング型抗がん剤に加えて、又はこれらと共に投与される場合もある。抗OX40単剤療法として投与される場合、1つ以上の抗体が使用されうる。単剤療法として投与されるのであれ、他の治療又は薬剤に加えて、又はこれらと共に投与されるのであれ、抗OX40抗体の量は、全体的な処置レジメンが、治療的利益をもたらすように投与される。
治療的利益とは、患者におけるがんを処置する抗OX40抗体の使用が、非治療(該当する場合)又は公知の標準治療と比較して、任意の、裏付けられた臨床利益を結果としてもたらすことを意味する。臨床利益は、当業者に公知である、任意の方法により評価されうる。一実施形態において、臨床利益は、客観的奏効率(ORR)(RECIST version 1.1を使用して決定される)、奏効期間(DOR)、無進行生存(PFS)及び/又は全生存(OS)に基づき評価される。一部の実施形態において、完全奏効は、治療的利益を指し示す。一部の実施形態において、部分奏効は、治療的利益を指し示す。一部の実施形態において、安定は、治療的利益を指し示す。一部の実施形態において、全生存の増大は、治療的利益を指し示す。一部の実施形態において、治療的利益は、進行までの時間の改善及び/又は症状若しくは生活の質の改善を構成する。他の実施形態において、治療的利益は、疾患コントロール期間の延長ではなく、生活の質の改善を結果としてもたらす、症状負荷の顕著な低減へと置きかえられる。当業者に明らかな通り、治療的利益は、抗OX40抗体を、単独(単剤療法)において使用して観察される場合もあり、他の抗がん療法及び/又はターゲティング型抗がん剤若しくは非ターゲティング型抗がん剤に加えて、又はこれらと共に使用して観察される場合もある。
治療的利益は、がんのための新たな処置に対する応答を測定するようにデザインされた、標準的な臨床試験を使用して評価されることが典型的である。本明細書において記載された抗OX40抗体の治療的利益を評価するために、以下の試験:(1)固形がん治療効果判定基準(RECIST)version 1.1、(2)免疫関連RECIST(irRECIST)、(3)米国東海岸癌臨床試験グループ(ECOG)パフォーマンスステータス、(4)免疫関連効果判定基準(irRC)、(5)腫瘍抗原の評価により査定可能な疾患、(6)検証された患者報告型転帰スケール及び/又は(7)全生存及び無進行生存についてのカプラン−マイヤー推定値のうちの1つの又は組合せが使用されうる。
腫瘍負荷の変化についての評価は、がん治療剤についての臨床査定の重要な特色である。腫瘍退縮(客観的奏効)及び進行の発生までの時間のいずれも、がん臨床試験における、重要な評価項目である。固形がん治療効果判定基準(RECIST)として公知の、標準化された奏効基準は、2000年に公表された。改訂版(RECIST1.1)は、2009年に発刊された。RECIST基準は、これらの転帰尺度が、解剖学的腫瘍負荷及び試験の経過にわたるその変化についての評価に基づくため、客観的奏効が主要研究評価項目である臨床試験のほか、安定、腫瘍進行についての評価又は進行までの時間についての解析が企図される試験においても使用されることが典型的である。表8は、本明細書において記載された抗OX40抗体のような研究薬に対する、腫瘍の客観的応答を決定するのに使用された奏効基準の定義を提供する。
Figure 2020504101
本明細書において記載された抗OX40抗体の治療的利益を決定するのに使用されうる副次的転帰尺度は、客観的奏効率(ORR)、無進行生存(PFS)、全生存(OS)、奏効期間(DOR)及び奏効の深さ(DpR)を含む。ORRは、完全奏効(CR)又は部分奏効(PR)を達成する参加者の比率として規定される。PFSは、抗OX40抗体の、初回の投与日から、進行又は死亡のいずれかが先に生じるまでの時間として規定される。OSは、疾患についての診断日又は処置の開始日からの時間であって、疾患を有すると診断された患者が依然として生存している時間として規定される。DORは、参加者の最初のCR又はPRから、進行までの時間として規定される。DpRは、最大の応答時点において観察された腫瘍退縮の、ベースラインの腫瘍負荷と比較した百分率として規定される。ORR及びPFSのいずれについての臨床評価項目も、上記において記載されたRECIST 1.1基準に基づき決定されうる。
免疫療法による処置を受けるがん患者に特異的な臨床査定に使用されうる、さらなる基準は、標準化された免疫関連RECIST(irRECIST)基準を含む。例えば、Nishino,M.ら、Eur.J.Radiol、84(7)、1259〜1268頁(2015年7月)を参照されたい。これらのガイドラインは、潜在的な免疫調節効果を考慮して、上記のRECIST 1.1基準を改訂した。表9は、本明細書において記載された抗OX40抗体のような免疫調節薬に対する客観的応答を決定するのに使用された奏効基準の定義を提供する。
Figure 2020504101
表10に示されたECOGパフォーマンスステータススケールは、自分自身をケアする能力、毎日の活動及び全身能力との関係における、患者の機能レベルについて記載するのに使用される。スケールは、現在、ECOG−ACRINがん研究グループの一部である、米国東海岸癌臨床試験グループ(ECOG)により開発され、1982年に公表された。
Figure 2020504101
抗体ベースのがん療法のような、免疫療法剤に対する応答を完全に特徴付け、決定するのに使用されうる基準の別のセットは、固形腫瘍を測定するために、2009年に開発され、2013年に改訂された、免疫関連効果判定基準(irRC)(Wolchokら、Clin.Cancer Res.、2009;15(23):7412〜7420及びNishinoら、Clin.Cancer Res.2013;19(14):3936〜3943)である。改訂irRC基準は、表11に従い、本明細書において記載された抗OX40抗体のような免疫療法剤の、腫瘍負荷に対する効果を評価し、応答を規定するのに使用されることが典型的である。
Figure 2020504101
単剤療法として投与されるのであれ、他の治療又は薬剤に加えて、又はこれらと共に投与されるのであれ、固形腫瘍を処置するための、本明細書において記載された抗OX40抗体の使用から生じる、1つの例示的な治療的利益は、完全奏効である。単剤療法として投与されるのであれ、他の治療又は薬剤に加えて、又はこれらと共に投与されるのであれ、固形腫瘍を処置するための、抗OX40抗体の使用から生じる、別の例示的な治療的利益は、部分奏効である。
検証された患者報告型転帰スケールもまた、各患者により、具体的な報告システムを介して提供される応答を描示するのに使用されうる。このような転帰スケールは、焦点を当てられた疾患ではなく、慢性状態を管理しながら、保持される機能に関する。検証された患者報告型転帰スケールの、1つの非限定例は、米国国立保健研究所による、PROMIS(登録商標)(Patinet Reported Outcomes Measurement Information System)である。例えば、成人がん患者のためのPROMIS(登録商標)Physical Function Instrumentは、上肢(例えば、器用さ)、下肢(例えば、歩行又は運動)及び中心領域(例えば、頸部、背部の運動)の機能のための、自己報告された能力について査定することが可能であり、雑用のような、日常的な毎日の活動を含む。
カプラン−マイヤー曲線(Kaplan及びMeier、J.Am.Stat.Assoc.、1958;53(282):457〜481)もまた、抗OX40抗体療法を受けるがん患者について、全生存及び無進行生存を、標準治療と比較して推定するのに使用されうる。
7.6.2.併用療法
抗OX40抗体は、抗がん特性を有する、他の薬剤又は処置であって、抗PD−1抗体療法のような標準治療を含む薬剤又は処置に加えて、又はこれらと共に使用されうる。併用される場合、抗OX40抗体及び他の薬剤は、単一の組合せ医薬製剤中に、併せて製剤化される場合もあり、単一の協同的投与レジメン又は異なる投与レジメンにより、個別に製剤化され、投与される場合もある。抗OX40抗体に加えて、又はこれと共に投与される薬剤は、抗体と他の薬剤とが、互いに対して有害な影響を及ぼし合わないように、抗OX40抗体と相補的な活性を有することが典型的である。
7.7.投与量及び投与レジメン
投与される抗OX40抗体の量は、処置される特定の種類のがん、処置されるがんのステージ、投与方式、投与頻度、所望される治療的利益、並びに患者の年齢、体重及び他の特徴などのような他のパラメータを含むがこれらに限定されない、様々な因子に依存する。具体的な投与方式及び投与頻度について、治療的利益をもたらすのに有効な投与量の決定は、当業者の能力の範囲内にある。
治療的利益をもたらすのに有効な投与量は、まず、インビボの動物モデルから推定されうる。多種多様な疾患に適する動物モデルは、当技術分野において公知である。
本明細書で開示された抗OX40抗体は、処置される状態に適切な、任意の経路により投与されうる。一部の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号41〜48のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号51〜54のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を有するヒト化抗体のいずれか1つである。ある特定の実施形態において、抗OX40抗体は、配列番号41又は42で表されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号51で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を有する。抗OX40抗体は、非経口投与、すなわち、非経口注入、静脈内(IV)注入、髄腔内注入、ボーラス注入、腫瘍内注射又は硬膜外注射されることが典型的である(Shireら、2004、J.Pharm.Sciences、93(6):1390〜1402)。一実施形態において、抗OX40抗体は、バイアル内の凍結乾燥粉末として提供される。投与の前に、凍結乾燥粉末は、抗OX40抗体を含有する溶液をもたらすように、注射用滅菌水(SWFI)又は他の適切な媒体により再構成される。一部の実施形態において、結果として得られる、再構成された溶液は、生理食塩液又は注入に適する他の媒体によりさらに希釈され、2週間ごと、すなわち、13、14又は15日ごとに1回のIV注入を介して投与される。
一部の実施形態において、抗OX40抗体は、0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg又は3.0mg/kgにおける、2週間ごとに1回のIV注入として投与される。
他の化学療法剤のような、他の薬剤に加えて、又はこれと共に投与される場合、抗OX40抗体は、他の薬剤と同じスケジュールにより投与される場合もあり、異なるスケジュールにより投与される場合もある。同じスケジュールにより投与される場合、抗OX40抗体は、他の薬剤の前に投与される場合もあり、他の薬剤の後で投与される場合もあり、他の薬剤と同時的に投与される場合もある。
当業者により理解される通り、上記において記載された多様な薬剤について推奨された投与量は、患者の応答を最適化し、治療的利益を最大化するように、調整される必要がある。
8.実施例
本明細書において記載された抗OX40抗体についての例示的な実施形態の、ある特定の特色及び特性を強調する、以下の実施例は、例示を目的として提供されるものであり、限定を目的として提供されるものではない。
[実施例1] 材料及び方法
8.1.1.ELISAによる、抗OX40抗体の、ヒトOX40への結合
Immunolon 4xHB 96ウェルプレート(Thermo Scientific)を、1μg/mLのヒトOX40−FC(R&D 系)により、4℃において、一晩にわたりコーティングした。プレートを、1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含有するリン酸緩衝生理食塩液(PBS)により、室温において、30分間にわたりブロッキングし、次いで、プレート洗浄機を使用して、PBST(0.1%のTween 20の入ったPBS)により、3回にわたり洗浄した。次いで、OX40によりコーティングされたプレートを、表示濃度の被験抗体と共に、室温において、1時間にわたりインキュベートした。プレートを、PBSTと共に、4回にわたり洗浄し、次いで、1%のBSAを含有するPBS中に、1:5000の希釈率となるように調製された、ヤギ抗ヒトFab断片特異的ビオチン(Jackson ImmunoResearch)100μLと共に、室温において、1時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、PBST中において、5回にわたり洗浄し、希釈率を1:1000とする、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Thermo Scientific)100μLを、各ウェルへと添加し、室温において、30分間にわたりインキュベートした。その後、プレートを、PBST中において、5回にわたり洗浄し、TMB One component(Surmodics)100μLを、各ウェルへと添加し、発色するまで(約5〜10分間)、室温(RT)においてインキュベートした。光学濃度(OD)を、650nm(Molecular Devices Spectromax190)において読み取った。
8.1.2.ELISAによる、抗OX40抗体の、カニクイザルOX40への結合
Immunolon 4xHB 96ウェルプレート(Thermo Scientific)を、1μg/mLのCyno OX40−Fc融合体により、4℃において、一晩にわたりコーティングした。プレートを、1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBSにより、RTにおいて、30分間にわたりブロッキングし、次いで、PBST(0.1%のTween 20の入ったPBS)により、3回にわたり洗浄した。次いで、OX40によりコーティングされたプレートを、表示濃度の抗OX40抗体と共に、室温において、1時間にわたりインキュベートした。プレートを、PBSTと共に、4回にわたり洗浄し、次いで、1%のBSAを含有するPBS中に、1:5000の希釈率となるように調製された、ヤギ抗ヒトFAB断片特異的ビオチン(Jackson ImmunoResearch)100μLと共に、室温において、1時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、PBST中において、5回にわたり洗浄し、希釈率を1:1000とする、ストレプトアビジン−HRP(Thermo Scientific)100μLを、各ウェルへと添加し、室温において、30分間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、PBST中において、5回にわたり洗浄し、TMB One component(Surmodics)100μLを、各ウェルへと添加し、発色するまで(約5〜10分間)、室温においてインキュベートした。光学濃度(OD)を、650nm(Molecular Devices Spectromax190)において読み取った。
8.1.3.フローサイトメトリーによる、抗OX40抗体の、アカゲザルOX40への結合
アカゲザル(マカカ・ムラッタ(Macaca mulatta))OX40は、アミノ酸レベルにおいて、カニクイザル(マカカ・ファシクラリス(Macaca fascicularis))OX40(配列番号2)と同一である。アカゲザルOX40を発現する293NF−κBレポーター細胞系を、10%のウシ胎児血清(FBS)及びペニシリン/ストレプトマイシンを含有する、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中において培養した。結合アッセイのために、細胞を、1mL当たりの細胞500万個において再懸濁させた。ウェル1つ当たり50μL(細胞250,000個)を、500μLのポリプロピレン製96ウェルプレート(Nunc)の各ウェルへと移した。被験抗OX40抗体又はアイソタイプ対照モノクローナル抗体の、2倍濃度の原液を、別個の希釈プレート内の培養培地中、666、333、111、37.03、12.34、4.11、0.457、0.152、0.0508、0.0169、0.00564nMにおいて調製した。モノクローナル抗体(ウェル1つ当たり50μL)を、アッセイプレートの、それぞれのウェルへと移した。細胞を、一次抗体と共に、4℃において、30分間にわたりインキュベートし、800rpmにおいて、3分間にわたり遠心分離することにより、ウェル1つ当たり250μLのPBSにより、2回にわたり洗浄した。結合した抗体を、PBS中に2μg/mL(ウェル1つ当たり50μL)へと希釈されたCy5−Donkey anti−human IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch)により、4℃において、30分間にわたり検出した。細胞を、ウェル1つ当たり250μLのPBSにより、1回洗浄し、1%のホルムアルデヒドを含有するPBS中に再懸濁させ、デュアルレーザーFACSCalibur(Becton Dickinson)上において解析した。
8.1.4.表面プラズモン共鳴による、ヒトOX40及びアカゲザルOX40への、抗OX40抗体の結合アフィニティー
抗OX40抗体の、組換え可溶性OX40 ECD(細胞外ドメイン)への結合反応速度を、抗Fc捕捉アッセイ法を使用して、25℃において、Biacore T200測定器(GE Healthcare)上においてなされた、表面プラズモン共鳴ベースの測定により決定した。ヒトOX40(残基1〜216)及びアカゲザルOX40(残基28〜214)の組換え細胞外ドメイン(ECD)を購入し(Creative Biomart)、10mMの4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、pH 7.4、150mMのNaCl、3mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)中において、Superdex200(GE Healthcare)を使用するゲル濾過によりさらに精製した。アカゲザル(マカカ・ムラッタ)OX40は、アミノ酸レベルにおいて、カニクイザル(マカカ・ファシクラリス)OX40(配列番号2)と同一である。チップの調製及び結合反応速度の測定は、アッセイ緩衝液であるHBS−EP+(10mMのHEPES、pH 7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%Tween 20)中において行った。抗Fc捕捉チップを調製するために、10mMの酢酸ナトリウム(pH4.5)中において、25μg/mLへと希釈された、約2000共鳴単位(RU)のヤギ抗ヒトIgG Fcポリクローナル抗体(Thermo Fisher Scientific Inc.)を、製造元の指示書及び手順に従い、標準的なアミンカップリングキットを使用して、CM5バイオセンサーチップにわたり、直接固定化させた。バイオセンサー表面において反応させない部分を、エタノールアミンによりブロッキングした。結合反応速度を測定するために、各アッセイサイクルは、以下のステップ:1)被験抗OX40抗体の、被験表面上だけの捕捉;2)基準表面及び被験表面の両方における、80μL/分において、240μLにわたる、解析物の注入(OX40ECD又は緩衝液だけ)を行い、この後、80μL/分において、900秒間にわたり、解離をモニタリングした;3)10mMのグリシン−HCl、pH 1.5の、基準表面及び被験表面の両方における注入による、捕捉表面の再生からなった。アッセイにおいて、全ての測定値は、捕捉表面単独(すなわち、被験抗体の捕捉を伴わない)を参照基準とし、緩衝液だけの注入を、二重基準化のために使用した。OX40の注入は、それぞれ、ランダム化された9倍又は3倍の希釈系列において、900nM又は300nM〜11.11nMの濃度範囲にわたった。データを加工し、結合反応速度定数である、k(M−1−1)及びk(秒−1)並びに平衡解離定数K(M)を決定するように、Biacore T200 Evaluationソフトウェアを使用して、1:1結合モデルへと、全体的に当てはめた。
8.1.5.抗OX40抗体による、OX40リガンドの遮断
ヒトOX40を安定的にトランスフェクトされたJurkat細胞であって、ウェル1つ当たりの細胞2×10個において培養されたJurkat細胞を、丸底96ウェルプレート内、RTにおいて、30分間にわたり、1%のBSAを含有するPBS中、0.2μg/mLの被験抗OX40抗体及び滴定量の可溶性ヒトOX40L(R&D 系)と同時にインキュベートした。細胞を、2回にわたり洗浄し、ウェル1つ当たり、希釈率を1:500とする、ヤギ抗ヒトFc PE(Jackson ImmunoResearch)100μLと共に、さらに30分間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、2回にわたり洗浄し、FACSCanto(BD Biosciences)を使用して収集し、FACSDivaを使用して解析した。
8.1.6.細胞表面に発現したヒトOX40への、抗OX40抗体の結合
ヒトOX40タンパク質を発現するJurkat NF−κBレポーター細胞系を、10%のFBS及びペニシリン/ストレプトマイシン(pen/strep)を含有するDMEM中において培養した。結合アッセイのために、各細胞系を、1mL当たりの細胞500万個において再懸濁させた。ウェル1つ当たり50μL(細胞250,000個)を、500μLのポリプロピレン製96ウェルプレート(Nunc)の各ウェルへと移した。被験抗OX40抗体又はアイソタイプ対照mAbの、2倍濃度の原液を、別個の希釈プレート内の培養培地中、666、333、111、37.03、12.34、4.11、0.457、0.152、0.0508、0.0169、0.00564nMにおいて調製した。各抗体(ウェル1つ当たり50μL)を、アッセイプレートの、それぞれのウェルへと移した。細胞を、被験抗OX40抗体又はアイソタイプ対照抗体と共に、4℃において、30分間にわたりインキュベートし、800rpmにおいて、3分間にわたり遠心分離することにより、ウェル1つ当たり250μLのPBSにより、2回にわたり洗浄した。結合した抗体を、PBS中に2μg/mL(ウェル1つ当たり50μL)へと希釈されたCy5−Donkey anti−human IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch)により、4℃において、30分間にわたり検出した。細胞を、ウェル1つ当たり250μLのPBSにより、1回洗浄し、1%のホルムアルデヒドを含有するPBS中に再懸濁させ、デュアルレーザーFACSCalibur(Becton Dickinson)上において解析した。
8.1.7.抗OX40抗体の、キメラOX40受容体への結合
マウスOX40システインリッチドメイン(CRD)を、対応するヒトCRDへと、個別にスワップした、ヒトOX40分子のキメラ形を発現する、293ベースのトランスフェクタントを生成した。G418による選択の後において、生存細胞を、MoFloフローサイトメーター(Beckman)上における発現:293s−huOX40、293s−huOX40−muCRD I、293s−huOX40−muCRD II、293s−huOX40−muCRD III、293s−huOX40−muCRD IV、293s−huOX40−muCRD II+III及び293s−muOX40について分取した。各293 OX40キメラトランスフェクタント細胞合計2×10個ずつを、ウェルごとに、500μLのポリプロピレン製96ウェルプレート(Nunc)へと添加した。細胞を播種した後において、2μg/mLのHu3738又はアイソタイプ対照抗体50μLを、各細胞系について、二連において、対応するウェルへと添加し、氷上において、30分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、200μLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩液(DPBS)を、各ウェルへと添加し、プレートを、1000rpmにおいて、3分間にわたりスピンダウンした。各ウェルから上清を除去し、50μLのCy5−Donkey anti−Human IgG(Jackson ImmunoResearch)二次抗体を、1:250の希釈率において添加し、次いで、これを、暗所内、氷上において、30分間にわたりインキュベートした。インキュベーション時間の後、200μLのDPBSを、添加してから、プレートを、1000rpmにおいて、3分間にわたりスピンダウンした。上清を除去し、各ウェルを、100μLのDPBS+1%ホルムアルデヒドと共に再懸濁させた。試料を、デュアルレーザーFACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson)上において解析した。
8.1.8.ヒトOX40及びアカゲザルOX40についての、NF−κB蛍光レポーター活性
それぞれ、ヒトOX40タンパク質及びアカゲザルOX40タンパク質を発現するNF−κBレポーター細胞系である、Jurkat−NF−κB−huOX40及び293−NF−κB−RhOX40を、10%のFBS及びペニシリン/ストレプトマイシン(100U/mL)を含有するDMEMを含む培養培地中において維持した。NF−κBレポーターアッセイのために、Jurkat−NF−κB−huOX40細胞系を、増殖培地(培養培地と同一である)中に、1mL当たり100万個(ウェル1つ当たりの最終的な細胞50,000個)において再懸濁させ、293−NF−κB−RhOX40細胞系を、増殖培地中に、1mL当たり50万個(ウェル1つ当たりの最終的な細胞25,000個)において再懸濁させた。ウェル1つ当たり50μLを、白色底/透明底96ウェルアッセイプレート(Costar 3903)の、内側の60のウェルへと移した。以下の抗体:陰性対照抗体として使用された抗PD−1抗体及び抗OX40抗体の、3倍濃度の原液を、別個のU字底96ウェル希釈プレート(Becton Dickinson)内において作った。外因性架橋剤がない状態で抗体の活性を調べる希釈系列は、培養培地中に、2000、500、125、31.25、7.812、1.953、0.488、0.122、0.0305、0.00762nMを含んだ。架橋剤の、抗OX40抗体の活性に対する効果を調べる希釈系列は、200、50、12.5、3.125、0.7812、0.1953、0.0488、0.0122、0.00305、0.000762nMの抗体を含んだ。二連において、ウェル1つ当たり50μLの抗体を、アッセイプレートの、それぞれのウェルへと移した。抗体単独のプレートへ、ウェル1つ当たり50μLの培地を、内側の60のウェルへと添加した。架橋剤希釈系列のために、ヤギ抗ヒトIgGFc特異的抗体(Jackson ImmunoResearch)を、希釈された800、200、50、12.5、3.125、0.7812、0.1953、0.0488、0.0122、0.00305nMへと希釈し、ウェル1つ当たり50μLを、内側の60のウェルへと移して、抗OX40抗体及び架橋剤の、4:1の比を維持した。増殖培地(150μL)を、外側のウェルへと添加して、内側の60のウェルにおける蒸発を防止した。プレートを、37℃において、約18時間にわたりインキュベートした。ルシフェラーゼ活性は、BriteLite Plus(Perkin Elmer)により定量化した。略述すると、基質を、販売元により提供された緩衝液10mLにより溶解させ、ウェル1つ当たり75μLの基質を、各プレートの、内側の60のウェルへと添加した。プレートを、発光設定を使用して、Victor5(Molecular Devices)上において解析した。
8.1.9.ADCCレポーターアッセイ
ヒトFcγRIII(Promega)を発現するADCCエフェクター細胞を融解させ、プロトコールの推奨に従い増殖させた。細胞を、使用の前に、2回にわたり分割した。ヒトOX40又はアカゲザルOX40を安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞を、標的細胞として使用した。これらの細胞を、10%の熱不活化FBS(Sigma)及び5μg/mLのブラストサイジン(Gibco Life Technologies)の入ったHyClone(商標)DMEM中において繁殖させた。
アッセイの前日に、OX40を発現するHEK293標的細胞を、0.25%のトリプシン(Gibco Life Technologies)により採取した。細胞を、洗浄し、カウントし、96−well Costar Plate(Corning)内に、ウェル1つ当たりの細胞10,000個において播種した。プレートを、10%のFBSの入ったDMEM中、37℃において、一晩にわたりインキュベートした。アッセイのために、ADCC Bioassay Effector Cells,Propagationモデルprotocol G7102に従った。エフェクター細胞対標的細胞比は、7.5:1であった。発光は、EnSpireManagerソフトウェアを使用して、EnSpire Alpahaリーダー(Perkin Elmer)により測定した。このアッセイにおける被験抗体は、アイソタイプ対照抗体及び抗OX40抗体を含んだ。
8.1.10.抗OX40抗体の、活性化ヒトCD4+ T細胞への結合
ヒトPBMCを、Stanford Blood Center(Palo Alto、CA)から購入されたバフィーコートから単離した。略述すると、バフィーコートを、マグネシウム及びカルシウムの入っていないPBS(GE Healthcare)により、1:1の比に希釈した。希釈された血液(30mL)を、SepMateチューブ(Stem Cell Technologies)内に含有された、マグネシウム及びカルシウムの入ってないPBS(GE Healthcare)中において調製された、90%のFicoll−Paque Plus(GE Healthcare)15mL上において層状化させた。チューブを、1200gにおいて、10分間にわたりスピンした。界面相を回収し、1倍濃度のPBS中において、2回にわたり洗浄した。Stem Cell Technologies CD4 enrichment kit(Stem Cell Technologies)を使用して、CD4+ T細胞を単離した。細胞を、RPMI/10%FBS中、1mL当たりの細胞2×10個へと再懸濁させた。Dynal CD3/28ビーズ(Life Technologies)を、1:1の比において添加した。細胞を、回転式ローテータ−上、室温において、20分間にわたりインキュベートした。細胞を、6ウェルプレート内、37℃において、24時間にわたり培養した。
24時間後、ビーズを、磁石により除去した。細胞をカウントし、1mL当たりの細胞1.5×10個へと再懸濁させた。細胞懸濁液のアリコート(100μL)を、染色のために使用した。被験抗体を、1μg/mLに始まる4倍の希釈系列において滴定した。細胞を、30分間にわたり染色し、2回にわたり洗浄した。ウェル1つ当たりの希釈率を1:250(4μg/mL)とする、ヤギ抗ヒトFc特異的PE(Jackson ImmunoResearch)を、1%BSAを含有する、ウェル1つ当たり100μLのPBS中に添加した。細胞を、さらに30分間にわたり染色し、2回にわたり洗浄し、チューブへと移し、BD LSR Fortessaフローサイトメーターを使用して収集し、FACSDiva analysis software version 8.0.1を使用して解析した。
8.1.11 抗OX40抗体の、活性化カニクイザルT細胞への結合
カニクイザル全血液を、Worldwide Primatesから購入した。PBMCを単離するために、全血液を、マグネシウム及びカルシウムの入っていないPBS(GE Healthcare)により、1:1の比に希釈した。希釈された血液(30mL)を、50mLの円錐型チューブ内の、マグネシウム及びカルシウムの入っていないPBS(GE Healthcare)中において調製された、95%のFicoll−Paque Plus(GE Healthcare)13mL下において層状化させた。チューブを、1000gにおいて、25分間にわたりスピンした。界面相を回収し、1倍濃度のPBS中において、2回にわたり洗浄した。細胞を、RPMI/10%FBS中、1mL当たりの細胞2×10個へと再懸濁させた。細胞を、6ウェルプレート内、10mg/mLのフィトヘマグルチニン(PHA)(Sigma)及び100U/mLの組換えヒトインターロイキン2(IL−2)(Proleukin(登録商標);Prometheus)と共に、72時間にわたりインキュベートした。24時間後に、細胞を、洗浄し、カウントし、1mL当たりの細胞2×10個へと再懸濁させた。100μLの細胞を、染色のために使用した。被験抗OX40抗体を、1μg/mLに始まる4倍の希釈系列において滴定した。細胞を、30分間にわたり染色し、2回にわたり洗浄した。1%のBSAを含有するPBS 100μL中の希釈率を1:250(4μg/mL)とする、ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的PE(Jackson ImmunoResearch)を、ウェルごとに添加した。細胞を、さらに30分間にわたり染色し、2回にわたり洗浄し、チューブへと移し、BD LSR Fortessaフローサイトメーターを使用して収集し、FACSDiva analysis software version 8.0.1を使用して解析した。
8.1.12.活性化ヒトT細胞の増殖及びIFN−γの誘導
ヒトバフィーコートを、Stanford Blood Center(Palo Alto、CA)から購入した。ヒトPBMCを単離するために、バフィーコートを、マグネシウム及びカルシウムの入っていないPBS(GE Healthcare)により、1:1の比に希釈した。希釈された血液(30mL)を、SepMateチューブ(Stem Cell Technologies)内に含有された、マグネシウム及びカルシウムの入っていないPBS(GE Healthcare)中において調製された、90%のFicoll−Paque Plus(GE Healthcare)15mL上において層状化させた。チューブを、1200gにおいて、10分間にわたりスピンした。界面相を回収し、1倍濃度のPBS中において、2回にわたり洗浄した。Easy Sep CD4+ T cell enrichment kit(Stemcell Technologies)を使用して、CD4+ T細胞を、PBMCから単離した。CD4+ T細胞を、6ウェルプレート内、RPMI+10%のFCS+2μg/mLのPHA(Sigma)及び20IU/mLの組換えヒトIL−2(Proleukin(登録商標);Prometheus)中、1mL当たりの細胞2×10個において、72時間にわたり培養した。
Biocoat T cell activation control plate96ウェルプレート(Corning)を、ウェル1つ当たり100μLのPBS中に、2μg/mLのヤギ抗マウスIgG Fc特異的抗体(Jackson ImmunoResearch)及び2μg/mLのヤギ抗ヒトIgG−Fc特異的抗体(Jackson ImmunoResearch)により、4℃において、一晩にわたりコーティングした。プレートを、PBS中、ウェル1つ当たりの1% BSA 200μL(Rockland)により、室温において、30分間にわたりブロッキングした。プレートを、ウェル1つ当たり200μLのPBSにより、2回にわたり洗浄した。4ng/mLの抗ヒトCD3 OKT3(eBioscience)を、ウェル1つ当たり100μLのPBS中に添加し、37℃において、90分間にわたりインキュベートした。プレートを、ウェル1つ当たり200μLのPBSにより、2回にわたり洗浄した。5μg/mLにおいて始まる、3倍希釈系列の、抗OX40抗体及びアイソタイプ対照であるモノクローナル抗体を、プレートへと、100μLのPBS中に添加した。プレートを、37℃において、90分間にわたりインキュベートした。プレートを、ウェル1つ当たり200μLのPBSにより、2回にわたり洗浄した。洗浄されたPHA及びIL−2活性化CD4+ T細胞(2×10)を、各ウェルへと添加した。
37℃における培養の48時間後において、二連の各々から、30μLずつの上清を、Luminex(Millipore)によるIFN−γ解析のためにプールし、Bioplex Manager 6.0(BioRad)上において解析した。プレートを、0.25μCiのH−チミジン(Perkin Elmer)により、一晩にわたり、パルス刺激し、翌朝、5mL Ultima Gold Scintillation fluid(Perkin Elmer)の入ったFiltermats(Perkin Elmer)上において採取した。Filtermatsは、1450 Microbeta Wallac Trilux counter(Perkin Elmer)上においてカウントした。
8.1.13.ヒト調節性T細胞抑制アッセイ
採取したての末梢血単核球(PBMC)は、AllCells又はStem Cell Technologiesから得た。細胞をスピンダウンし、細胞ペレットを、1倍濃度のPBSにより再懸濁させ、室温、1200rpmにおいて、10分間にわたり、今一度スピンダウンした。上清を除去し、次いで、細胞を、RoboSep緩衝液(Stem Cell Technologies)により再懸濁させた。Vi−Cell XR cell Counter(Beckman Coulter)を使用して、細胞生存率及び細胞カウントを決定した。Stemcell EasySep Human CD4+ T cell Enrichment Kitを使用するCD4+ T細胞エンリッチメントのために、細胞1億〜1億5000万個を取り置いた。次いで、Stemcell EasySep Human CD25+ Selection kitを使用して、エンリッチされたCD4+ T細胞から、CD25+細胞を枯渇させた。この工程は、精製されたCD4+/CD25−レスポンダーT細胞(Tresp)を結果としてもたらした。残留PBMCを、Stemcell EasySep Human CD4+/CD127low/CD49d− Regulatory T cell Enrichment Kitによる指示書に従い、調節性T細胞(Treg)を単離するために使用した。CD4+/CD25− Tresp及びTregを単離した後で、細胞を、10%熱不活化させたFBS及び0.01mMの2−メルカプトエタノールの入ったRPMI1640により、それぞれ、1mL当たりの細胞1×10個及び1mL当たりの細胞5×10個において再懸濁させた。
Treg抑制アッセイは、Tresp対Tregの、2つの異なる比である、2:1及び4:1を使用して準備した。比を2:1とする場合、Tresp細胞5×10個及びTreg細胞2.5×10を、96ウェルU字底プレートへと添加した。比を4:1とする場合、Tresp細胞5×10個及びTreg細胞1.25×10を、96ウェルプレートへと添加した。刺激のために、Treg Suppression Inspector bead reagent(Miltenyi Biotec)もまた、ビーズ対細胞比を1:1として、ウェルへと添加した。抗OX40抗体及びアイソタイプ対照ヒトIgGを、比を1:4とする、F(ab’)抗ヒト(GxHu)IgG Fc特異的抗体(Jackson ImmunoResearch)の非存在下又は存在下、三連、10μg/mLの最終濃度において調べた。プレートを、5%のCO2中、37℃において、4日間にわたりインキュベートした。プレートを、ウェル1つ当たり1μCiのH−チミジンにより処理し、37℃、5%のCO中、さらに16時間にわたり、さらにインキュベートした。インキュベーションの後、プレートを採取し、Ultima Gold Scintillation fluid(Perkin Elmer)及び1450 Microbeta Wallac Trilux scintillation counter(Perkin Elmer)を使用して、増殖を測定した。
8.1.14.ヒト免疫細胞生着PC−3マウス腫瘍モデル
接種日に、ヒトT細胞、自家ヒトmoDC(単球由来樹状細胞)及びPC−3細胞を、Vi−Cell XR(Beckman Coulter)によりカウントし、100μLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩液(DPBS)(GE Lifesciences)中に、NSGマウス(NOD.Cg−Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJマウス)1匹当たりのPC−3 1×10個、T細胞1×10個及びmoDC 5×10個の皮下注射を送達するように組み合わせた。処置群(群1つ当たりのマウスのn=8)の、10mg/kgのアイソタイプ対照モノクローナル抗体及び10mg/kgのHu3738は、腹腔内注射のための、200μLのDPBS中において調製した。単回の抗体投与は、細胞混合物の接種時に注射した。腫瘍増殖の測定は、標準的なキャリパー測定により評価し、腫瘍増殖体積を計算した(長さ×幅×高さ/2)。
8.1.15.NSGマウスにおける、ヒトPBMC GVHDモデル
ヒト末梢血単核球(PBMC)を、AllCells(Oakland、CA)から購入した。1日目に、免疫欠損NSGマウス(NOD.Cg−Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJマウス)に、ヒトPBMC 2×10を、腹腔内接種した。抗OX40抗体であるHu3738又はアイソタイプ対照を、1日目から、毎週1回、腹腔内投与した。マウスが、移植片対宿主病(GVHD)の行動学的徴候(例えば、猫背の姿勢、逆毛)を示したら、血清試料を採取し、Luminex bead array assay(Millipore)を使用して、血清中のサイトカインレベルを決定した。
[実施例2] マウス抗OX40抗体の生成及びヒト化
当技術分野において公知の方法(E.Harlow、D.Lane、「Antibodies:A Laboratory Manual」(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1998))に従い、マウスを免疫化した。Mouse Isotyping kit(Roche)を使用して、各モノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。目的の抗体を産生するハイブリドーマクローンを精製し、アフィニティーについて、表面プラズモン共鳴により、リガンド競合について、FACSにより、さらに特徴付けた。
発現ベクターのクローニング及び構築は、組換えモノクローナル抗体を発現させるための、当技術分野において公知の方法により達成した。
抗体V領域のヒト化は、Queen,C.ら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1989;86:10029〜10033)により概括されている通りに実行した。カノニカルのCDR構造は、Huangら(Methods、2005;36:35〜42)に従い決定した。同じCDRカノニカル構造又は極めて類似するCDRカノニカル構造を有するヒト可変生殖細胞系列配列を同定し、適切なヒトVセグメント配列、ヒトVセグメント配列及びヒトJセグメント配列を選択して、抗OX40可変領域のためのフレームワークをもたらした。コンピュータモデルが、CDRとの著明な接触を示唆したフレームワーク位置において、マウス抗OX40V領域に由来するアミノ酸を、元のヒトフレームワークアミノ酸により置換した(復帰突然変異)。
上記において記載した方法に従い、抗OX40マウス抗体である、Mu3726、Mu3738、Mu3739及びMu3741をヒト化した。Mu3726 Vのヒト化形は、I48M、V67I、M69I、V71R、F78V、A93V及びR94Kからなる、7つの復帰突然変異を有する、ヒトV4−28フレームワーク領域を有するHu3726 V.1aであった。Hu3726 V.1aを、Y48F及びF71Yからなる、2つの復帰突然変異を有する、ヒトVK1−39フレームワーク領域を有する、その対応するヒト化軽鎖であるHu3726 V.1bと組み合わせた。Mu3738 Vのヒト化形は、W47Lからなる、1つの復帰突然変異を有する、ヒトV3−7フレームワーク領域を有するHu3738 V.1bであった。Hu3738 V.1bを、ヒトVK4−1フレームワーク領域を有し、復帰突然変異を有さない、その対応するヒト化軽鎖であるHu3738 V.1と組み合わせた。Mu3739 Vのヒト化形は、M48I、V67A、E73T及びS76Nからなる、4つの復帰突然変異を有する、ヒトV1−69フレームワーク領域を有するHu3739 V.1bであった。Hu3739 V.1bを、V58L及びF71Yからなる、2つの復帰突然変異を有する、ヒトVK1−39フレームワーク領域を有する、その対応するヒト化軽鎖であるHu3739 V.1bと組み合わせた。Mu3741 Vのヒト化形は、A24V、V48L、S49G、F67L、R71K、N76S及びL78Vからなる、7つの復帰突然変異を有する、ヒトV3−66フレームワーク領域を有するHu3741 V.2bであった。Hu3741 V.2bを、Y36F及びF71Yからなる、2つの復帰突然変異を有する、ヒトVK1−39フレームワーク領域を有する、その対応するヒト化軽鎖であるHu3741 V.1cと組み合わせた。
[実施例3] 抗OX40抗体の結合アフィニティー
下記の表3−1は、例示的な抗OX40抗体であるHu3738又は米国特許第7,960,515号において記載された、文献による抗OX40抗体11D4若しくは18D8についての、インビトロにおける結合アフィニティーデータを示す。11D4及び18D8の各々は、軽鎖カッパ領域を有するヒトIgGである。
本明細書において使用された11D4は、
Figure 2020504101
で表されるアミノ酸配列を有するV及び
Figure 2020504101
で表されるアミノ酸配列を有するVを有する。
18D8は、
Figure 2020504101
で表されるアミノ酸配列を有するV及び
Figure 2020504101
で表されるアミノ酸配列を有するVを有する。
Hu3738は、実施例1のアッセイにおいて測定された通り、表面プラズモン共鳴により、又はヒトOX40を発現する、トランスフェクトされたJurkat NF−κBレポーター細胞において、ヒトOX40への、強力な結合特性を示し、SPRにより、Hu3739又はHu3741と比較して、高度な結合アフィニティーを示した。
Figure 2020504101
例示的な抗OX40抗体であるHu3738は、カニクイザルOX40又はアカゲザル
OX40に対する交差反応性を示したが、マウスOX40又はラットOX40に対する著明な結合を裏付けなかった。実施例1に記載されたアッセイにより決定された、Hu3738の、組換えヒトOX40若しくは組換えカニクイザル(cyno)OX40又は細胞表面ヒトOX40若しくは細胞表面アカゲザルOX40への結合活性は、表3−2にまとめられる。
Figure 2020504101
[実施例4] 抗OX40抗体であるHu3738の、インビトロにおける生物学的活性
Hu3738の、内因的に発現したヒトOX40への結合を評価するために、活性化CD4+ T細胞及び非刺激末梢血単核球(PBMC)の両方を、フローサイトメトリーにより検討した。表4−1は、実施例1に記載されたアッセイに従い、CD3/CD28ビーズにより活性化させたヒトCD4+ T細胞又はフィトヘマグルチニン(PHA)及びインターロイキン2(IL−2)により活性化させたカニクイザルCD4+ T細胞上の、細胞表面OX40へのHu3738の結合についてのデータをまとめる。表4−1において示される通り、Hu3738は、ヒトT細胞培養物中及びカニクイザルT細胞培養物中の、活性化CD4+ T細胞上のOX40に、強力に結合した。
Figure 2020504101
ナノモル未満のHu3738による、ヒトOX40への結合は、8.1.12節において記載されたアッセイに従い、Hu3738によるインビトロ処置の後における、ヒトCD4+ T細胞による、ヒト末梢血CD4+ T細胞増殖の増大及びインターフェロンγ産生の増強により裏付けられる、機能的活性化をもたらした(図1A、1B)。図1Aにおいて描示された、典型的な実験において示される通り、Hu3738は、ヒト末梢血CD4+ T細胞の増殖の、アイソタイプ対照huIgGと比較して、約1.5〜約6倍の増大をもたらしたが、T細胞に、等量の、文献による抗OX40抗体である、11D4又は18D8を投与した場合に観察された増殖の増大と同等であった、又はこれを超えた。Hu3738は、8例のドナーによる試行の平均において、EC50=0.11nM(16ng/mL)を示した。
図1Cは、各々を、8.1.12節において記載された、T細胞増殖アッセイに従い調べたところ、Hu3738によるインビトロ処置の後における、ヒト末梢血CD4+ T細胞の増殖が、約0.001〜約1μg/mLという広範囲の抗体濃度にわたり、文献による抗OX40抗体である1A7と同様であったことを示す。
米国公開第2015/0307617号において記載された抗体である1A7は、カッパ軽鎖を有するヒトIgGであって、
Figure 2020504101
で表されるVアミノ酸配列及び
Figure 2020504101
で表されるVアミノ酸配列を有するIgGである。
図1Bにおいて描示された、典型的な実験において示される通り、Hu3738により処置された場合、ヒトCD4+ T細胞におけるIFN−γの産生は、被験濃度範囲にわたり、約2〜約10倍に増大した。IFN−γの産生に関して、Hu3738は、9例のドナーによる試行の平均において、EC50=0.16nM(24ng/mL)を示した。文献による抗OX40抗体である、11D4及び18D8もまた、これらのアッセイ条件下において、IFN−γの産生に対する同様の効果を裏付けた。
図1Dは、各々を、8.1.12節において記載された、T細胞IFN−γ産生アッセイに従い調べたところ、Hu3738が、ヒトCD4+ T細胞における、文献による抗OX40抗体である1A7と比較して、高度なIFN−γの産生の増大をもたらすことを示す。
CD4+ T細胞の増殖の増大及びIFN−γの産生の増強における、下流シグナル伝達の活性化効果に加えて、例示的な抗OX40抗体であるHu3738はまた、インビトロにおいて、ヒト調節性T細胞の活性も阻害したことから、身体による、腫瘍を攻撃する免疫応答を阻害しうる、固形腫瘍内の調節性T細胞を、Hu3738の投与により抑制しうることが示唆される。
Hu3738の、調節性T細胞活性に対する効果は、8.1.13節に記載されたアッセイに従い、インビトロにおいて評価した。自家CD4+/CD25−レスポンダーT細胞(Tresp)を、CD4+/CD25+/CD127low調節性T細胞(Treg)及び活性化ビーズ(Insp)と共に、2:1又は4:1のTresp:Treg比において共培養した(図2A、2B)。Tregの非存在下において、Tresp細胞は、活性化ビーズに応答して増殖した。Tregの存在下において、増殖は、阻害された。10μg/mLのHu3738の、培養培地への組入れは、Treg媒介性の抑制に対して、影響を及ぼさなかった。これらの調節性T細胞抑制アッセイのために使用されたアイソタイプ対照は、定常領域変異体である、L234A及びL235Aを有するhuIgGであった。架橋剤を有するhuIgGアイソタイプ対照を使用して実施された別個の実験は、アッセイに対する影響を示さなかった。
これに対して、外因性架橋剤の存在下において、Hu3738は、Tresp増殖の完全な回復を結果としてもたらした(図2A及び2B)。架橋剤の存在下におけるHu3738は、このアッセイにおける増殖を、活性化ビーズ単独に対するTresp応答のレベルを上回って増強した。この結果は、OX40シグナルが、調節性T細胞媒介性の抑制を克服することが可能であり、上記において報告された結果と符合する、抗原特異的応答を増強しうることを示唆した。
8.1.9節において記載された、市販のADCCレポーターアッセイを使用して、Hu3738により媒介されたADCC活性を査定した。このアッセイは、ヒトFcγRIIIa及び活性化T細胞(NFAT)レポーターの核因子を発現する操作Jurkat細胞を、エフェクター細胞として活用した。ヒトOX40を発現するHEK293細胞を、標的細胞として使用したが、抗OX40抗体は、標的細胞上において発現するOX40に結合することが予測された。加えて、Hu3738のFc領域は、レポーター細胞の細胞表面上のFcγRIIIa受容体に結合することが予測された。これらの結合イベントの結果として、2つの細胞型に対して、複数の架橋がもたらされることから、NFAT経路の活性化の結果として、発光リードアウトにより測定される効果である、ADCCレポーター活性の活性化がもたらされる。アイソタイプ対照と比較して、Hu3738は、ADCCレポーター活性を、EC50=0.51nM(77ng/mL)により増大させた。
[実施例5] 例示的な抗OX40抗体のエピトープ分類
8.5.1.Hu3738の、ヒト/マウスキメラOX40との結合
8.1.5節において記載された、ヒトOX40発現Jurkat細胞アッセイにおいて、可溶性OX40Lが、Hu3738の、OX40への結合を、IC50=67pM(10ng/mL)により遮断した(図3)ことから、Hu3738が、分子のリガンド結合性領域内において、ヒトOX40に結合したことが示唆される。
Hu3738抗体の結合についてのより詳細なエピトープマッピングのために、ヒト/マウスシステインリッチドメイン(CRD)スワップOX40分子を発現する、一連の細胞系を創出した。この方法は、Hu3738が、マウスOX40に結合しないという観察(図4B)に基づく。ヒトOX40(配列番号1)の、マウスOX40(配列番号3)との配列アライメントを、図4Aに示す。配列についての解析から、スワップインマウスのCRD配列を有するヒトOX40受容体のキメラ形を発現する、一連の293トランスフェクタントを生成し、Hu3738により染色した。
下線部として表示されたマウススワップイン領域を有する、ヒト−マウスOX40受容体キメラのアミノ酸配列(シグナル配列を含む)は、以下の通りである。マウスCRD Iにより、ヒトCRD Iを置きかえるヒトOX40キメラは、
Figure 2020504101
で表されるアミノ酸配列を有し、マウスCRD IIにより、ヒトCRD IIを置きかえるヒトOX40キメラは、
Figure 2020504101
で表されるアミノ酸配列を有し、マウスCRD IIIにより、ヒトCRD IIIを置きかえるヒトOX40キメラは、
Figure 2020504101
で表されるアミノ酸配列を有し、マウスCRD IVにより、ヒトCRD IVを置きかえるヒトOX40キメラは、
Figure 2020504101
で表されるアミノ酸配列を有し、マウスCRD II及びマウスCRD IIIにより、ヒトCRD II及びヒトCRD IIIを置きかえるヒトOX40キメラは、
Figure 2020504101
で表されるアミノ酸配列を有する。
Hu3738の、この一連のキメラへの結合の決定を、8.1.7節において記載されたアッセイに従い実施して、結合部位を、具体的なCRD領域へと位置特定した。結合の喪失は、どのCRDが、特定の抗体によるOX40の認識に重要であるのかを示唆した。この場合、マウスにおける特異的なCRDスワップ領域への、検出可能な結合の非存在は、Hu3738により認識される、ヒトOX40受容体の領域を示唆した。ヒトCRD IIを、対応するマウスCRD IIにより置きかえた場合に、抗OX40抗体であるHu3738が、結合を喪失することが示されたことは、Hu3738の、ヒトOX40のCRD IIへの結合と符合する(図4B)。
8.5.2.例示的な抗OX40抗体Hu3738をヒトOX40に結合させた競合アッセイ
さらなる、文献によるヒト化抗OX40抗体を生成して、本開示の、例示的な抗OX40抗体と比較した。米国公開第2013/0280275号において記載された抗体である、106−222及び119−122は、カッパ軽鎖を有するヒトIgGである。
抗体である106−222は、
Figure 2020504101
で表されるVアミノ酸配列及び
Figure 2020504101
で表されるVアミノ酸配列を有する。
抗体である119−122は、
Figure 2020504101
で表されるVアミノ酸配列及び
Figure 2020504101
で表されるVアミノ酸配列を有する。
直接的な競合研究により、Hu3738の、細胞表面において発現したOX40への結合は、全てではないが、一部の、文献による抗OX40抗体と競合的であることが示された。次いで、その後、図5において示される通り、滴定用量の、文献による抗体により処置された、Jurkat−NF−κB−huOX40細胞を、2μg/mLの蛍光ALEXA FLUOR(登録商標)647標識化Hu3738下に置いて、結合の競合を決定した。解析は、フローサイトメトリーにより実施した。文献による、抗OX40抗体である106−222又は1A7は、Hu3738と競合的であった。しかし、抗体である11D4、18D8又は119−122は、100μg/mLまでにおいて、Hu3738と競合しなかった。
[実施例6] 例示的な抗OX40抗体であるHu3738による、OX40の活性化
Jurkat NF−κB細胞データは、架橋剤の非存在下においてもなお、例示的な抗OX40抗体であるHu3738の活性化能力を強調する(図6A、6B)。図6Aにおいて示される通り、約0.001〜約100μg/mLの抗体濃度範囲にわたり、著明なNF−κBシグナル伝達活性を裏付けた、唯一の抗OX40抗体は、Hu3738及び対応するマウスMu3738であった。文献による抗OX40抗体である、11D4、18D8、106−222及び119−122は各々、抗体を約100μg/mLまでとするとき、著明なNF−κBシグナル伝達効果を欠いた。
外因性架橋の非存在下における、Hu3738の活性は、同じアッセイ条件下における、文献による他の抗OX40抗体の活性の欠如と対照的であった。NF−κB細胞によるシグナル伝達データについての概要を、表6−1及び6−2に示す。注目すべきことは、Hu3738が、ヒトOX40に結合するのに、文献による抗OX40抗体である106−222及び1A7と競合したが、架橋剤の非存在下において、抗体の各々と比較して、異なる機能的活性を示したことである。
Figure 2020504101
外因性架橋剤の非存在下において、Jurkat−NF−κB−huOX40細胞内のNF−κBシグナル伝達をもたらすその能力に加えて、Hu3738はまた、架橋剤がある状態での、EC50により測定される効力であって、文献による抗OX40抗体である、11D4、18D8、106−222及び119−122と比較して大きな効力(表6−1)も裏付けた。
Hu3738を、1A7と対比した比較を、図6Bに示し、下記の表6−2にまとめる。外因性架橋剤の非存在下における、Jurkat−NF−κB−huOX40細胞内のNF−κBシグナル伝達の欠如に加えて、上記において記載された、文献による抗OX40抗体の各々はまた、Hu3738と比較して低値のEC50も示した。
Figure 2020504101
[実施例7] マウスのヒト細胞養子移植モデルにおける、Hu3738の抗腫瘍活性
Hu3738は、8.1.14節において記載されたプロトコールに従い、単回投与による、ヒトPC3細胞、ヒトT細胞及びヒト自家単球由来樹状細胞(moDC)の接種後の、インビボNSGマウスモデルにおける抗腫瘍活性を裏付けた(図7)。接種日において、ヒトT細胞、ヒトmoDC及びヒトPC3細胞を、皮下注射により、各NSGマウスへと送達した。アイソタイプ対照モノクローナル抗体又はHu3738(10mg/kg)を、各々、各処置群内の動物ごとに(n=8)、接種時において注射された抗体用量により、腹腔内投与した。腫瘍増殖の測定は、標準的なキャリパー測定により評価し、腫瘍増殖体積を計算した(長さ×幅×高さ/2)。
図7において示される通り、Hu3738は、接種の17日後において、NSGマウスにおけるPC3腫瘍の増殖を、等用量のアイソタイプ対照抗体と比較して、有意に阻害した。
[実施例8] インビボのヒトPBMC GVHDモデルにおける免疫活性化
NSGマウスに、ヒトPBMCを、腹腔内接種した。次いで、マウスを、1mg/kgのHu3738又はhuIgGアイソタイプ対照により、1日目における初回投与を、ヒト細胞の接種の直後とする、q7dX4(すなわち、7日間ごとに1回ずつ、合計4回の投与)にわたり処置した。22日目に、マウスを屠殺し、Luminex bead array assay(Millipore)を使用して、血清中のサイトカインレベルを決定した。
図8における結果は、抗OX40抗体であるHu3738を投与した後において、アイソタイプと比較した、インターロイキン8(IL−8)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)及びインターフェロンガンマ(IFN−γ)の増強が観察されることを裏付けたことから、Hu3738に起因する、マウスにおける免疫応答の増大が示唆される。
本出願において引用された、全ての刊行物、特許、特許出願及び他の文書は、各個別の刊行物、特許、特許出願又は他の文書が、全ての目的のために、参照により組み込まれることが個別に指し示された場合と同程度に、全ての目的のために、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
多様な具体的実施形態が例示及び記載されているが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱しない限りにおいて、多様な変化が施されうることが理解される。

Claims (33)

  1. (i)3つのCDRを含むV鎖及び(ii)3つのCDRを含むV鎖を含む抗OX40抗体であって、
    Figure 2020504101
    抗OX40抗体。
  2. 配列番号101、102及び103の3つのCDRを含むV鎖並びに配列番号104、105及び106の3つのCDRを含むV鎖を有する、請求項1に記載の抗OX40抗体。
  3. Figure 2020504101
    で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び
    Figure 2020504101
    で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む、請求項1に記載の抗OX40抗体。
  4. モノクローナルである、請求項1、2又は3に記載の抗OX40抗体。
  5. ヒト化されている、請求項1に記載の抗OX40抗体。
  6. Figure 2020504101
    で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び
    Figure 2020504101
    で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む、請求項5に記載の抗OX40抗体。
  7. 配列番号22で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び配列番号32で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む、請求項5に記載の抗OX40抗体。
  8. 配列番号24で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び配列番号34で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む、請求項5に記載の抗OX40抗体。
  9. 配列番号26で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び配列番号36で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む、請求項5に記載の抗OX40抗体。
  10. 配列番号28で表されるアミノ酸配列を有するV鎖及び配列番号38で表されるアミノ酸配列を有するV鎖を含む、請求項5に記載の抗OX40抗体。
  11. IgGである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗OX40抗体。
  12. IgG1である、請求項11に記載の抗OX40抗体。
  13. 配列番号41〜48のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号51〜54のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項11に記載の抗OX40抗体。
  14. 配列番号41又は42で表されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号51で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項13に記載の抗OX40抗体。
  15. 配列番号43又は44で表されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号52で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項13に記載の抗OX40抗体。
  16. 配列番号45又は46で表されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号53で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項13に記載の抗OX40抗体。
  17. 配列番号47又は48で表されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号54で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項13に記載の抗OX40抗体。
  18. ヒトOX40(配列番号1)に対して約100nM未満のKを有する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の抗OX40抗体。
  19. 請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗OX40抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  20. 請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗OX40抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  21. 請求項20に記載の核酸を含むベクター。
  22. 請求項21に記載のベクターで形質転換された原核宿主細胞。
  23. 請求項21に記載のベクターで形質転換された真核宿主細胞。
  24. 請求項20に記載の核酸を発現するように操作された真核宿主細胞。
  25. 哺乳動物宿主細胞である、請求項23又は24に記載の真核宿主細胞。
  26. 抗OX40抗体を産生する方法であって、(a)請求項23又は請求項24に記載の宿主細胞を培養するステップ及び(b)抗OX40抗体を回収するステップを含む方法。
  27. 免疫系を活性化する方法であって、それを必要とする患者へと、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗OX40抗体又は請求項18に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
  28. がんを治療する方法であって、それを必要とする患者へと、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗OX40抗体又は請求項19に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
  29. がんが、膀胱がん、乳がん、頭頸部がん、胃がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、皮膚がん及びDNAミスマッチ修復欠損の証拠を有する腫瘍から選択される、請求項28に記載の方法。
  30. 肺がんが、小細胞肺がん、非小細胞肺がん又は中皮腫である、請求項29に記載の方法。
  31. 抗OX40抗体が、単剤療法として投与される、請求項28に記載の方法。
  32. 抗OX40抗体が、がんを治療するのに一般に使用される別の薬剤に加えて、又はこれと共に投与される、請求項28に記載の方法。
  33. 抗OX40抗体が、抗PD−1抗体に加えて、又はこれと共に投与される、請求項32に記載の方法。
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