CN110172090B

CN110172090B - Cd134单克隆抗体及其制备方法和癌症治疗中的应用

Info

Publication number: CN110172090B
Application number: CN201910476814.5A
Authority: CN
Inventors: 彭菲; 顾超
Original assignee: Zhongshan Bgh Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhongshan Biaohong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-06-03
Filing date: 2019-06-03
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2039-06-03
Also published as: CN110172090A

Abstract

本发明提供一种能特异识别人OX40的单克隆抗体，该抗体与人OX40结合的亲和力强于现有抗人OX40单克隆抗体，同时具有较好的耐热性和耐酸碱性。

Description

CD134单克隆抗体及其制备方法和癌症治疗中的应用

技术领域

本申请属于生物制药领域，具体的涉及CD134抗体及其制备方法以及相应的癌症治疗的用途。

背景技术

OX40(CD134)是TNF超家族成员之一,为I型跨膜糖蛋白。人OX40基因于1994年克隆,长约1.4kb,编码277个氨基酸,位于1号染色体lp36。OX40的表达谱局限于活化的CD+4和CD+8T细胞表面,且以CD+4T细胞为主。人OX40配体(OX40L/CD134L)1991年由Miura等克隆,含183个氨基酸(胞外139个氨基酸,跨膜21个氨基酸,胞内23个氨基酸),属TNF家庭成员,为Ⅱ型跨膜糖蛋白。OX40L基因长约lkb,位于1q25。

OX40/0X40L是一对重要的协同刺激分子,在机体的免疫应答和多种疾病中起重要作用,通过干预其相互作用所进行的免疫治疗已在许多动物模型上取得非常好的疗效,这为今后的临床治疗提供了理论和实验基础。机体的免疫应答过程中,OX40/OX40L是重要的共刺激分子,其相互作用能促进CD₄ ⁺T细胞的活化、增殖、迁移,延长其寿命,并促进生发中心的形成和DC的分化成熟,OX40L能协同刺激T细胞的活化,促进B细胞产生高效价抗体和类别转换,介导OX40⁺T细胞向炎性反应部位浸润。OX40/OX40L的生物学功能通过3个阶段参与免疫应答:①在淋巴结,OX40/OX40L相互作用而活化的CD₄ ⁺T细胞移行到B滤泡区,促进生发中心形成和抗体分泌；②OX40/OX40L信号促使CD₄ ⁺T细胞等炎症细胞进入血流中,再移行到炎性反应部位；③组织来源的OX40L⁺APC在局部组织结导CD4⁺T细胞性的炎性反应。

乳腺癌是我国女性最常见的恶性肿瘤之一。施勤等实验发现OX40、OX40L在乳腺癌中的阳性表达与病理分级、瘤块大小有关(P<0.05),且OX40表达随着瘤块的增大阳性率增高,随病理分级的升高而降低；OX40L阳性表达率随着瘤块的增大而递减,随病理分级的升高而增高。OX40/OX40L在乳腺癌中的阳性表达均与肿瘤瘤块大小有关(P<0.05),二者表现相反的趋势。异常表达于肿瘤细胞上的OX40分子可能不仅与淋巴细胞上OX40L分子结合,还与邻近的肿瘤细胞,甚至是自身的OX40L分子结合,一方面形成环路,通过类似OX40⁺T细胞生存期延长机制,拮抗肿瘤细胞凋亡；另一方面封闭肿瘤细胞上的OX40L,干扰或阻断肿瘤细胞为细胞毒T细胞(CTL)或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)提供的协同刺激信号,逃避CTL或TIL对它的细胞毒杀伤作用,最终造成肿瘤的增殖和瘤块的扩大。正常的乳腺组织不表达OX40L,可能是由于多种机制和免疫网络调节的结果。当细胞发生非典型增生时,细胞启动自我免疫保护机制,上调表达OX40L,可与T细胞上的OX40结合,从而为T细胞参与抗肿瘤免疫提供活化信号。因此在乳腺肿瘤中表现为OX40L分子的阳性表达率与瘤块的大小有关,瘤块大的OX40L的阳性率反而降低,不利于激发T细胞对肿瘤细胞的杀灭。

细胞上OX40L分子结合,还与邻近的肿瘤细胞,甚至是自身的OX40L分子结合,一方面形成环路,通过类似OX40+T细胞生存期延长机制,拮抗肿瘤细胞凋亡；另一方面封闭肿瘤细胞上的OX40L,干扰或阻断肿瘤细胞为细胞毒T细胞(CTL)或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)提供的协同刺激信号,逃避CTL或TIL对它的细胞毒杀伤作用,最终造成肿瘤的增殖和瘤块的扩大。正常的乳腺组织不表达OX40L,可能是由于多种机制和免疫网络调节的结果。当细胞发生非典型增生时,细胞启动自我免疫保护机制,上调表达OX40L,可与T细胞上的OX40结合,从而为T细胞参与抗肿瘤免疫提供活化信号。因此在乳腺肿瘤中表现为OX40L分子的阳性表达率与瘤块的大小有关,瘤块大的OX40L的阳性率反而降低,不利于激发T细胞对肿瘤细胞的杀灭。

Anti-OX40激动型抗体是最早在小鼠中被测试的免疫检查点靶点之一(2000年)。肿瘤浸润性T细胞表达OX40，注射Anti-OX40抗体或OX40L.Fc融合蛋白能有效抑制荷瘤小鼠模型的肿瘤生长。目前，多种Anti-OX40抗体或OX40L-Fc融合蛋白正在用于针对转移性癌症的临床试验。

近日，丽珠医药公告称，其控股附属公司珠海市丽珠单抗生物技术有限公司申报的“重组全人源抗OX40单克隆抗体注射液”临床试验申请获国家药监局受理。据悉“重组全人源抗OX40单克隆抗体注射液”历经2年研发，临床试验申请已于2019年3月12日获得受理。截至目前，包括丽珠单抗在内，国内以“OX40”为靶点的单抗药物仅有2家提出临床申请，其中1家已获批临床。

基于OX40抗体强大的应用空间和市场前景，开发更好的OX40单克隆抗体变得尤其有市场价值和应用前景。

发明内容

本发明基于市场的需求，提供了一种全新的OX40单克隆抗体及其制备方法。具体的包含如下内容：

一方面，本发明提供一种OX40抗原片段，其序列如SEQ ID NO：1所示，该片段为申请人筛选得到的具有较好免原性的区段，克服了传统的OX40全长抗原作为免疫原具有筛选不准确不稳定效率低下的问题。

另外一方面，本发明还提供一种优化的OX40抗原片段，其序列如SEQ ID NO：2所示，其特异性的在大肠杆菌中高表达。

具体的，本发明还提供一种表达OX40片段的方法，全基因合成SEQ ID NO：2基因，在其上、下游分别引入BglⅡ和SalⅠ酶切位点，pET30a质粒用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切，然后用T4DNA连接酶pET30a转化至大肠杆菌E.coli DH5α鉴定阳性后转化BL21菌株进行表达和纯化后获得目的蛋白。

另外一方面，本发明提供一种单克隆抗体，其轻链可变区和重链可变区序列分别为：重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示，抗体的轻链可变区如SEQ ID NO：4所示。

本发明另外一方面，提供一种单克隆抗体的制备方法，为采用杂交瘤技术获得。

本发明还涉及包括前述的抗人OX40单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。

本发明还涉及抗人OX40单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的抗体还包含恒定区，该恒定区为人IgG的恒定区，优选地为IgG1的恒定区。

本发明还提供了上述的单克隆抗体在制备治疗、预防肿瘤或者转移的药物中的用途。

进一步的，所述的肿瘤包括但并不局限于胃鳞状细胞癌、胃腺癌、小细胞癌、腺鳞癌、类癌、食管癌、胃癌、十二指肠癌、胰腺癌、胆管癌、胆囊癌、肝癌、结肠癌、结直肠癌。

本发明还提供了一种检测试剂盒，含有上述的单克隆抗体。

进一步的，上述的检测试剂盒还含有与上述的单克隆抗体结合的标记物，所述的标记物为突光标记物、或者放射性标记物、或者酶标标记物。

本发明还提供了一种药物组合物，含有上述的单克隆抗体。

进一步的，上述的药物组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂或混合剂。

本发明还提供了上述的单克隆抗体在肿瘤的血清学、病理学诊断、X线断层显像、或者正电子发射断层扫描-X线断层显像中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明的能特异识别人OX40的单克隆抗体，该抗体与人OX40结合的亲和力强于现有抗人OX40单克隆抗体，序列新颖。

附图说明

图1蛋白纯化图

图2间接免疫荧光检测抗体效果图，A为对照，B为高表达OX40细胞结果图

图3生化稳定性检测温度检测结果

具体实施方式

实施例1OX40片段蛋白的表达

全基因合成SEQ ID NO：2基因，在其上、下游分别引入BglⅡ和SalⅠ酶切位点，将其用BglⅡ和SalⅠ进行双酶切，pET30a质粒用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离，然后用T4DNA连接酶将胶回收后的OX40基因片段和pET30a酶切DNA产物于22℃连接2h，转化至大肠杆菌E.coli DH5α，挑取单菌落培养后提取质粒进行EcoRⅤ和SalⅠ双酶切鉴定，并将双酶切鉴定正确的阳性克隆送至上海生工有限公司测序。质粒图谱经鉴定，与SEQ ID NO：2完全相同。将pET30a-OX40载体中，转化至大肠杆菌：加人pET30a-OX40胞外段重组质粒DNA10微升到大肠杆菌BL21感受态细胞中,轻轻摇匀,冰上放置30min,42℃水浴中热击90s后迅速置冰上冷却3-5min。向管中加人l ml LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养lh，将上述菌液摇匀后取10μl闪涂布于含抗生素的筛选平板上，待菌液完全被培养基吸收后置培养皿，37℃培养16-24h。转化时同时设置2组对照:以同体积无菌水代替DNA溶液,转化后取10微升菌液涂布于含抗生素的平板上；以同体积无菌水代替DNA溶液,取5微升转化菌液涂布于无抗生素平板上。单菌落接种于5ml含氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养液中,37℃,160r/min振荡培养过夜。次日取50微升(1：100的比例)接种于5ml新鲜的LB(Amp+)液体培养基中,于恒温摇床中,37℃220r/min,培养3h至OD600约为0.6后,取出1.5ml未经诱导的培养物放在一个1.5ml的无菌Eppendorf管中,在剩余培养物中加人IPTG至终浓度lmM,37℃继续诱导培养,在诱导的6h后取1.5ml培养物放人无菌Eppendorf管中，进行SDS-PAGE检测，筛选得到表达量最高的阳性菌株一株，命名为BL-OX40。按照常规的蛋白诱导表达方法，扩大表达，并采用Ni柱纯化，得到纯化后的OX40片段，如图1所示，纯度较好，将其配置成为浓度为100mg/mL，用于后续的抗体的制备。

实施例2单克隆抗体的制备

2.1动物免疫

根据本领域通用的方法免疫小鼠。免疫原为实施例1制备得到的抗原。简要地，取出适量的福氏佐剂到1.5ml EP管中，振荡器混匀。用PBS配制抗原蛋白溶液。按照需要量混匀佐剂和蛋白抗原溶液，通过注射器互推充分乳化抗原形成稳定油包水的溶液，而后进行动物注射。根据血清效价测定结果，首次免疫后通常需要进行2到3次加强免疫后才能达到良好的免疫效果。选择血清效价高的免疫小鼠行腹腔注射终免后进行细胞融合。

2.2杂交瘤融合和筛选

细胞融合前，培养小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14,ATCC#CRL-1581)处于对数生长期。处死免疫后小鼠无菌环境取脾，根据文献中方法使用PEG化学融合脾B淋巴细胞和SP2/0骨髓瘤细胞。融合后的细胞铺板96孔细胞培养板，通常7到10天后显微镜下可观察到存活的杂交瘤细胞生长出来。细胞铺板两周后，收集各孔培养上清，以ELISA方法用人OX40-his蛋白抗原进行杂交瘤筛选。简述如下：用60ul 4ug/ml的人OX40-his抗原的PBS溶液包被酶标板，4℃过夜。而后PBST洗板5次后，加入200μl/孔的5％脱脂奶粉的PBST溶液置于37度封闭2小时。再次洗板，加入60μl/孔的杂交瘤上清,37℃孵育40分钟，而后洗板4次。以100μl/孔加入稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗,37℃孵育40分钟，而后洗板4次,拍干。添加100μl/孔的TMB显色底物,室温显色5到15分钟，而后用1M的硫酸溶液终止,测定450纳米处各孔的吸光值。挑出ELISA显色阳性的杂交瘤孔细胞，转移到24孔板中，继续培养。并通过ELISA方法进行第二轮复筛，筛选出特异识别OX40抗原且能阻断OX40/OX40L结合的杂交瘤OX401M是本发明得到的杂交瘤，该杂交瘤表达本发明所制得的抗人OX40单克隆抗体，通过有限稀释法亚克隆，获得目标单克隆细胞株。而后通过无血清培养小量表达生产这些单克隆抗体，纯化抗体进行测序，获得了抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示，抗体的轻链可变区如SEQ ID NO：4所示。

实施例3流式细胞术测评抗体结合细胞膜表面OX40抗原的结合能力

收集处于对数生长期的膜表面过表达人OX40的293T细胞系，用PBS洗细胞2次后用FACS缓冲液(含2％胎牛血清的PBS溶液)重悬细胞。调节密度，以2x105个细胞/孔铺板于96孔U底板中，300g离心5分钟，倾去上清，添加已梯度稀释的CSF1R抗体溶液而后置于冰上孵育40分钟。洗细胞2次，添加100μL/孔藻红蛋白荧光标记的羊抗小鼠二抗，4度避光孵育40分钟后，洗细胞3次，而后每孔加100μL的FACS缓冲液重悬，吹匀细胞后上机检测。使用BD公司Canto II型号流式细胞仪测定每孔细胞的荧光强度。使用Graphpad prism软件进行数据处理，得出抗体结合细胞的EC50浓度值为12.5pM。另外，使用常用Kd检测方法(ELASA法)检测得到抗体的Kd为27.3pM,具有较好的结合特性，而本领域常用的对照抗体(CD40Monoclonal Antibody(HB14),PE，Catalog#CD4004，Invitrogen)其EC50浓度值为2.5nM，其Kd为9.8nM。

实施例4间接免疫荧光(IFA)检测抗体的反应性

将CHO细胞接入24孔板中，待细胞生长至80％时，将高表达OX40蛋白的载体接种24孔细胞板，设置BHK21细胞对照，37℃细胞培养箱中孵育4h后，收集上清灭活处理。然后加入-20℃预冷的甲醇∶丙酮(1∶1)固定液固定细胞，室温作用20min。PBS洗细胞3次，按5μg/mL浓度加入纯化的OX40抗体，37℃孵育1h。PBS洗3次，加入工作浓度的荧光素标记的家兔抗牛IgG，37℃孵育30min。PBS洗细胞5次，荧光显微镜观察荧光信号并拍照记录。IFA检测结果(图2)显示，本发明的抗体图2B可特异性结合细胞中的抗原，出现特异性绿色荧光，而对照图2A不识别抗原，未见绿色荧光。

实施例5抗体的生化稳定性测定

将本发明的抗体和对照抗体(CD40 Monoclonal Antibody(HB14),PE，Catalog#CD4004，Invitrogen)与偶联荧光标签，而后分别置于4℃、16℃、37℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴锅中水浴30min，取出，恢复至室温。各取100μL上清于聚苯乙烯板中，检测其荧光强度，分析类抗体的热稳定性。通过图3可以看出，其中A本发明的抗体，B为对照抗体，温度对本发明的抗体稳定性均有很大影响。在40℃–65℃内其稳定性较好，在90℃时几乎完全丧失稳定性。而对照抗体的40℃–45℃内其稳定性较好，在80℃时几乎完全丧失稳定性，说明本发明的抗体具有较好的热稳定性。

另外，针对pH稳定性试验，在1-11的pH范围内，检测抗体的稳定性，结果发现，稳定性在pH<7的范围内随pH的降低而降低，在pH＝3时几乎丧失稳定性，在pH>8的范围内稳定性开始下降，在pH＝11时丧失稳定性。而对照抗体在pH小于4以及大于10时即丧失稳定性。

实施例6单克隆抗体对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制效应

在单向混合淋巴细胞反应中，将T细胞(1X10⁵/孔)和体外诱导成熟的DC以20:1比例加入96孔板，加入浓度为5μg/ml的单抗，每组设3个复孔，同时设小鼠IgG同型对照，阳性对照为(CD40 Monoclonal Antibody(HB14),PE，Catalog#CD4004，Invitrogen)。于培养第6d加入³H-TdR 1.85X 10⁴Bq/孔，继续培养16-18h。收集细胞于49^#玻璃纤维纸上，烘干后测定放射性核素每分钟闪烁记数值(cpm)。结果如表1所示，本发明的抗体能够有效的抑制成熟DC对T细胞的促增殖作用，而对照阳性抗体的抑制能力就相对较差。

表1单克隆抗体对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制效应图

类型	cpm值
		T	527±21
DC+T	5825±66
		鼠IgG	6240±102
本发明OX40单克隆抗体	728±48
		对照OX40单克隆抗体	1944±112

综上所述，本发明的能特异识别人OX40的单克隆抗体，该抗体与人OX40结合的亲和力强，序列新颖。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 北京岳昊科技发展有限公司

<120> CD134单克隆抗体及其制备方法和癌症治疗中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 146

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr

1 5 10 15

Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro

20 25 30

Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly

35 40 45

Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu

50 55 60

Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro

65 70 75 80

Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser

85 90 95

Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val

100 105 110

Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu

115 120 125

Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro

130 135 140

Pro Asp

145

<210> 2

<211> 438

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gatactgttt gtcgttgccg cgctggtacc caacctttag actcttataa acccggcgtc 60

gattgtgccc catgcccgcc tggacatttt tcccccgggg acaatcaggc atgtaagcca 120

tggacaaact gcacgttggc gggtaaacac actcttcaac cggcttcaaa ttcgagtgat 180

gccatttgtg aagaccgaga tcctcccgca acccagccac aagagacaca gggcccgcct 240

gcgcggccca tcacggtaca accaactgaa gcttggccga gaaccagcca gggaccttct 300

acaaggcccg tggaggttcc agggggtcgt gccgtcgcag cgatactcgg cctaggactg 360

gtattagggt tgcttggtcc gctcgctatt ctactggcct tatacttgct tcgccgagac 420

caacggctcc ctcccgat 438

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Gln Val Gln Leu Ala Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Gln Tyr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Trp Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Ser Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Ser Thr Leu

115

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Gln Ile Val Thr Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Arg Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ala Thr Cys Arg Ala Ser Ala Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Arg Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Asn Pro Ser

50 55 60

Gly Ala Tyr Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Arg Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Gln Phe Phe Arg Ser Asn Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Ser Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ala Lys Arg

100 105

Claims

1.一种特异性结合抗原片段的单克隆抗体或其片段，其特征在于：所述抗原片段其序列如SEQ ID NO:1所示，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.权利要求1中所述的抗体或其片段，其特征在于：所述抗体是人抗体、人源化的抗体或嵌合的抗体。

3.权利要求1-2中任一项所述的抗体或其片段用于制备治疗乳腺癌的药物的应用。

4.一种检测OX40的试剂盒，其特征在于：含有权利要求1-2任一所述的抗体或其片段。