CN111763258B - 抗ox40抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗OX40抗体及其用途。本申请还提供了包含所述抗OX40抗体或其抗原结合片段的多特异性抗体例如双特异性抗体、缀合物和组合物，及其在治疗疾病例如肿瘤中的用途。

Description

抗OX40抗体及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗OX40（TNF受体超家族成员4（TNFReceptor Superfamily Member 4）或TNFRSF4，也称为CD134）抗体及其制备方法和用途。
背景技术
免疫系统可以区分体内的正常细胞与其视为“外来”的那些细胞，这使免疫系统能够攻击外来细胞，而正常细胞不受影响。这种机制有时涉及被称为免疫检查点的蛋白质。免疫检查点是免疫系统中调高信号（共刺激分子）或调低信号的分子。
检查点抑制剂可防止免疫系统攻击正常组织，从而防止自身免疫病。许多肿瘤细胞也表达检查点抑制剂。这些肿瘤细胞通过选择某些免疫检查点途径来逃避免疫监视，特别是在对肿瘤抗原具有特异性的T细胞中（Creelan, Benjamin C. “Update on immunecheckpoint inhibitors in lung cancer.” Cancer Control 21.1 (2014): 80-89）。由于许多免疫检查点是由配体-受体相互作用引发的，因此它们容易可被针对配体和/或其受体的抗体所阻断。
肿瘤坏死因子受体超家族成员4（tumor necrosis factor receptorsuperfamily, member 4，TNFRSF4），也称为CD134和OX40，是受体的TNFR超家族的成员，其不是在静息的初始T细胞上组成型表达的。OX40是在激活之后24至72小时之后表达的次级共刺激免疫检查点分子；其配体OX40L也不是在静息的抗原呈递细胞上表达的，而是在其激活之后表达。
小鼠T细胞表面上OX40的表达通常发生在同源抗原识别之后24小时至96小时。使用抗OX40激动剂抗体（在体外）结合T细胞上的OX40受体直接促进了不同效应T细胞亚群的生存率提高。此外，CD4+ T细胞的被称为调节性T细胞（Treg）的免疫抑制亚群也表达高水平的OX40。值得注意的是，鼠Treg显示组成型表达OX40，而人Treg在激活之后上调OX40。Treg可通过分泌免疫抑制细胞因子（例如转化生长因子β（transforming growth factor-beta，TGFb）和白介素-10（IL-10））来抑制效应T细胞。这些负调节因子可通过效应T细胞上OX40和其他TNFRSF共刺激受体例如41BB（CD137）和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GITR）（CD357）的刺激来抵消。
OX40信号传导影响Treg功能并且削弱其抑制能力，这可能是通过直接抑制FoxP3表达来进行。OX40信号传导也作用于Treg的产生：其强烈拮抗TGFb和抗原介导的初始T细胞转化为FoxP3þ Treg。
由于OX40信号传导强烈促进CD4+和CD8+ T细胞的生物活性并且抵消Treg功能，因此OX40是用于癌症免疫治疗的免疫调节靶标，例如，OX40信号传导可以被OX40特异性激动剂抗体诱导。
OX40与OX40L相互作用还与炎症性以及自身免疫性疾病和障碍中的免疫应答有关，这些疾病包括哮喘、特应性皮炎、脑脊髓炎、类风湿关节炎、结肠炎/炎性肠病、移植物抗宿主疾病（例如，移植排斥）、非肥胖性糖尿病小鼠中的糖尿病、以及动脉硬化的小鼠模型（Croft M et al., (2009) Immunol Rev 229(1): 173-191，以及其中引用的参考文献）。
迄今为止，OX40是唯一能够建立外周耐受的共刺激分子。其可破坏肿瘤的免疫耐受并且恢复免疫监视。使用OX40作为用于肿瘤免疫治疗的新靶标已经显示出某些积极作用。但是，由于活化抗体需要其结合表位和其状态与相应的配体完全对齐以激活下游信号传导途径，这类似于与锁特异性相匹配的钥匙，因此这种类型的抗体的开发具有挑战性。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的第一方面，提供一种抗OX40抗体或其抗原结合片段。
具体地，上述抗体包含重链可变区的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及轻链可变区的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中，VHCDR1的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1或7所示，VHCDR2的氨基酸序列包含SEQ ID NO：2或8所示，VHCDR3的氨基酸序列包含SEQ ID NO：3所示，VLCDR1的氨基酸序列包含SEQ ID NO：4所示，VLCDR2的氨基酸序列包含SEQ ID NO：5所示，VLCDR3的氨基酸序列包含SEQ ID NO：6所示。
具体地，上述重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:17或与SEQ ID NO:17具有80%以上同源性且保留与OX40结合的能力。
具体地，上述轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:18或与SEQ ID NO:18具有80%以上同源性且保留与OX40结合的能力。
具体地，上述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
具体地，上述抗体或其抗原结合片段可以是单链抗体（scFv）、Fv抗体、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性单链抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体，以及任何包含抗体结合域或同源的抗体结合域的多肽。其中，抗体结合域可以包括完整的重链和/或轻链CDR、完整的抗体的重链和/或轻链可变区、完整的全长重链和/或轻链、或者来自所述抗体的单个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。单链抗体包含一个重链可变区和一个轻链可变区。
具体地，上述抗体或其抗原结合片段中还包含来自人IgG4抗体的恒定结构域，特别是包含CL、CH1、CH2和/或CH3结构域。
具体地，上述抗体或其抗原结合片段特异性结合人、嵌合或非人动物OX40。
在本发明的一个实施方式中，上述抗体或其抗原结合片段特异性结合人OX40（例如SEQ ID NO:13）、猴OX40（例如SEQ ID NO:15）或嵌合OX40（例如SEQ ID NO:16）。
本发明的第二方面，提供了一种编码上述抗OX40抗体或其抗原结合片段的核酸。
本发明的第三方面，提供了一种核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，该多肽包含：
（1）包含重链可变区的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区包含SEQ IDNO:1、2和3的VHCDR1、2和3，并且其中所述重链可变区在与包含SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列的轻链可变区配对时结合OX40；和/或，
（2）包含轻链可变区的免疫球蛋白轻链或其片段，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:4、5和6的VLCDR1、2和3，并且其中所述轻链可变区在与包含SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列的重链可变区配对时结合OX40。
本发明的第四方面，提供了一种包含本发明上述核酸的载体。
具体地，上述载体能够在体内或体外或离体条件下表达。进一步具体地，上述表达载体在体内细胞中持续高水平表达。具体地，该表达载体为原核表达载体或慢病毒表达载体。进一步具体地，该原核表达载体为大肠杆菌系列。
本发明的第五方面，提供了一种包含上述核酸或载体的细胞。
具体地，上述细胞可以是真核的或者原核的。更具体地，上述细胞可以为酵母细胞、293细胞、CHO细胞、大肠杆菌等。
本发明的第六方面，提供了一种产生上述的抗OX40抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞。
本发明的第七方面，提供了一种杂交瘤细胞的制备方法，其包括用人OX40免疫非人动物获得，收集人OX40免疫后非人动物的脾细胞，将收集的脾细胞与SP2/0细胞融合获得杂交瘤细胞。
本发明的第八方面，提供了一种抗OX40抗体或其抗原结合片段的制备方法，培养包含上述核酸的细胞，获得抗OX40抗体或其抗原结合片段。
本发明的第九方面，提供了一种制备抗OX40抗体或其抗原结合片段的方法，其包括蛋白免疫法或者DNA免疫法。
具体地，上述方法包括用人OX40免疫非人动物获得。
具体地，上述方法还包含收集人OX40免疫后非人动物的脾细胞。
具体地，上述方法还包含将收集的脾细胞与SP2/0细胞融合获得杂交瘤细胞。
具体地，上述方法还包含将杂交瘤细胞导入非人动物，以及收集非人动物腹水的步骤。
具体地，上述人OX40可以为人OX40蛋白（例如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列）或编码人OX40蛋白的核苷酸序列（例如cDNA序列，例如编码SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的核苷酸序列）。
具体地，上述人OX40蛋白经His标记。
具体地，上述非人动物为非人哺乳动物，例如啮齿类动物。
在本发明的一个实施方式中，上述非人动物为大鼠或小鼠。
本发明的第十方面，提供了一种抗体药物偶联物（antibody-drug conjugate,ADC），其包含与药物共价结合的上述抗体或其抗原结合片段。
具体地，上述ADC中的药物可以为化学合成药、抗生素或者各种生物药。
本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明上述抗体或其抗原结合片段，或上述抗体药物偶联物，以及药用载体。
具体地，上述药用载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂或崩解剂等等。
更具体地，上述药物组合物可包含在纳米载体、病毒载体、微胶囊、脂质体等中给予。
本发明的第十二方面，提供了一种制剂、试剂盒、芯片，其包含如下任一组：
1）本发明上述抗OX40抗体或其抗原结合片段；
2）本发明上述核酸；
3）本发明上述载体；
4）本发明上述细胞；
5）本发明上述杂交瘤细胞。
具体地，还包含其他辅助或与上述1）-5）任一产品协同的试剂。
具体地，上述试剂可以是药用载体，所述药用载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂、崩解剂等等。
本发明的第十三方面，提供了上述的抗OX40抗体或其抗原结合片段、上述核酸、上述载体、上述细胞、上述抗体药物偶联物、上述药物组合物、试剂盒、芯片的用途，所述的用途包括：
A）在制备治疗OX40/OX40L相关的疾病的产品中的用途；或，
B）在OX40检测中的用途。
具体地，上述OX40/OX40L相关的疾病为肿瘤、自身免疫性疾病、超敏反应性疾病、移植排斥反应等。
在本发明的一个实施方式中，上述疾病为肿瘤，例如，但不限于，乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、肺癌、肝癌、胃癌、头颈癌、结肠癌、前列腺癌、白血病等。
在本发明的一个实施方式中，上述疾病为自身免疫性疾病，例如，但不限于，系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病、葡萄膜炎、糖尿病等。
在本发明的一个实施方式中，上述疾病为超敏反应性疾病，例如，但不限于，哮喘、特应性皮炎等。
在本发明的一个实施方式中，上述疾病为移植排斥反应，其可以为移植物抗宿主病（Graft-Versus-Host Disease, GVHD）或宿主抗移植物并（Host-Versus-GraftDisease, HVGD）。
本发明的第十四方面，提供了一种T细胞抗原受体或CAR分子，其包含上述抗OX40抗体或其抗原结合片段。
本发明的第十五方面，提供了一种治疗OX40/OX40L相关的疾病的方法，其包括向个体施加有效量的本发明上述抗OX40抗体或其抗原结合片段、上述抗体药物偶联物、上述药物组合物的步骤。
具体地，上述方法还包括将上述组合物联合其他药物或者治疗方法进行疾病治疗。
具体地，上述OX40/OX40L相关的疾病为肿瘤、自身免疫性疾病、超敏反应性疾病、移植排斥反应等。
在本发明的一个实施方式中，上述疾病为肿瘤，例如，但不限于，乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、B细胞淋巴瘤、肺癌、肝癌、胃癌、头颈癌、结肠癌、前列腺癌、白血病等。
在本发明的一个实施方式中，上述疾病为自身免疫性疾病，例如，但不限于，系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病、葡萄膜炎、糖尿病等。
在本发明的一个实施方式中，上述疾病为超敏反应性疾病，例如，但不限于，哮喘、特应性皮炎等。
在本发明的一个实施方式中，上述疾病为移植排斥反应，其可以为移植物抗宿主病（Graft-Versus-Host Disease, GVHD）或宿主抗移植物并（Host-Versus-GraftDisease, HVGD）。
本发明的第十六方面，提供了一种诱导免疫应答的方法，其包括向个体施加本发明上述抗OX40抗体或其抗原结合片段、抗体药物偶联物、药物组合物的步骤。
本发明的第十七方面，提供了一种OX40的检测方法，其包括将待检测样品与本发明所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段接触，然后检测OX40与抗OX40抗体或其抗原结合片段形成的复合物的步骤。
具体地，上述检测方法为检测OX40的存在或含量。其中，所述的存在表示有无，所述的含量可以为表达量或蛋白浓度等。
本发明的第十八方面，提供了一种诊断OX40/OX40L相关的疾病的方法，其包括取样，将样品与本发明所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段接触，然后检测OX40与抗OX40抗体或其抗原结合片段形成的复合物。
本发明的第十九方面，提供了一种降低肿瘤生长速率或杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括：使肿瘤细胞与有效量的产品接触，该产品包含本发明上述抗体或其抗原结合片段，或者抗体药物偶联物，或者药物组合物。
本发明提供一种抗OX40抗体，其可阻断人OX40与OX40L之间的结合，对人类OX40的特异性佳，通过人源化动物实验验证，其体内肿瘤抑制率可达79.6%，可有效抑制肿瘤生长，有望用于治疗人类中与OX40/OX40L相关的疾病，特别是肿瘤，具有非常好的应用前景和商业价值。
附图说明
图1所示为制备抗OX40抗体的流程图，具体包括免疫接种至血清收集的步骤，以及对收集的血清进行抗体效价的检测。
图2所示为制备抗OX40抗体的流程图，具体包括加强免疫接种、收集脾细胞、制备杂交瘤细胞，并筛选杂交瘤细胞，以及采用杂交瘤细胞生产抗体和纯化抗体的步骤。
图3所示为一组流式细胞术图，其显示了抗OX40抗体阻断OX40与OX40L之间的结合。
图4所示为一组图，其显示了抗OX40抗体针对猴OX40（rmOX40）、小鼠OX40（mOX40）和人-小鼠嵌合OX40（chiOX40）的交叉反应性的流式细胞术结果。
图5所示为用小鼠抗hOX40抗体08-6A11、08-9D1和17-2E9处理的具有MC-38肿瘤细胞的OX40人源化小鼠（B-hOX40）随时间的体重的图。
图6所示为用小鼠抗hOX40抗体08-6A11、08-9D1和17-2E9处理的具有MC-38肿瘤细胞的OX40人源化小鼠（B-hOX40）随时间的体重百分比变化的图。
图7所示为用小鼠抗hOX40抗体08-6A11、08-9D1和17-2E9处理的具有MC-38肿瘤细胞的OX40人源化小鼠（B-hOX40）中随时间的肿瘤体积的图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
在本发明中，术语“抗原结合片段”是保留完整抗体的特定结合活性的抗体的一部分，即抗体的任何部分能够与完整抗体的靶分子上的表位特异结合。它包括例如Fab，Fab'，F（ab'）2和这些片段的变体。例如，完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链，或来自完整抗体的重链或轻链的单个CDR。
在本发明中，术语“施加”包括但不限于口服、肠给药、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、动脉内注射、静脉注射、鼻腔给药、透皮给药、结膜下给药、腹腔内注射、眼球内给药、眼眶给药、眼球后给药、视网膜给药、脉络膜给药、鞘内注射等。
在本发明中，术语“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至患者或器官或个体之后提供所希望的治疗的本发明所述的产品（优选抗OX40抗体或其抗原结合片段）的量或剂量。
在本发明中，术语“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展，或者是评估患者对治疗的反应。
在本发明中，术语“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
在本发明中，术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响技术效果的其他指定成分或步骤。其在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
在本发明中，术语“个体”可以为人或非人动物。其中，所述的非人动物可以为非人哺乳动物，例如猴子、小鼠、兔子等等。
在一个方面，上述非人动物是哺乳动物。在一个方面，上述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科（例如小鼠样仓鼠）、仓鼠科（例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠总科（真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科（登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠）、刺睡鼠科（例如多刺睡鼠）和鼹形鼠科（例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠）家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠（鼠总科）、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、 C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1. 产生小鼠抗hOX40抗体
为了产生针对人OX40（hOX40；SEQ ID NO: 13）的小鼠抗体，用人OX40免疫接种6-8周大的雌性BALB/c小鼠。通过如下所述的方法收集抗hOX40抗体（如图1和图2所示）。
小鼠的免疫接种
以100 μg/ml的浓度以20 μg/小鼠用经His标记的人OX40蛋白免疫接种6-8周大的雌性BALB/c小鼠。将经His标记的人OX40蛋白用佐剂乳化，并注射在小鼠背部的四个位置。对于第一次皮下（s.c.）注射，将稀释的抗原用等体积的完全弗氏佐剂（CFA）乳化。在随后的皮下注射中，将蛋白质用等体积的不完全弗氏佐剂（IFA）乳化。在第三次注射或加强免疫接种之后三天，收集血液（血清）并使用ELISA分析抗体效价。
在另一个实验中，通过将编码人OX40的表达质粒注射到小鼠中来免疫接种6-8周大的雌性BALB/c小鼠。通过使用基因枪以1000 μg/μl的浓度以每只小鼠60 μg将编码抗原的质粒注射到小鼠的胫骨前肌中（肌内注射；i.m.注射）。进行至少四次注射，每次注射之间间隔至少14天。在最后一次免疫接种之后7天收集血液（血清），并通过ELISA测试血清的抗体效价。
在前一次免疫接种之后至少十四天还进行了增强免疫接种的程序（通过注射质粒或通过注射蛋白质）。将在表面表达OX40抗原的CHO细胞通过尾静脉静脉内注射到小鼠体内。然后在注射之后四天收集脾。
SP2/0细胞与脾细胞的融合
研磨脾组织。首先通过CD3ε微珠和抗小鼠IgM微珠选择脾细胞，然后使其与SP2/0细胞融合。然后将细胞平板接种在具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷（HAT）培养基的96孔板中。
杂交瘤的初步筛选
根据标准程序，使用荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated CellSorting，FACS）对96孔板中的杂交瘤上清液进行初步筛选。在筛选之前，将中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞添加到96孔板中（每孔2 × 104个细胞）。使用50 μl上清液。实验中使用的抗体是：
（1）荧光素（FITC）缀合的AffiniPure F(ab)2片段山羊抗小鼠IgG，Fcγ片段特异性的；和
（2）Alexa Fluor® 647缀合的AffiniPure F(ab)2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性的。
亚克隆
使用ClonePix2进行亚克隆。简单地说，将在初步筛选中鉴定出的阳性孔转移到半固体培养基中，并鉴定和测试IgG阳性克隆。使用FITC抗小鼠IgG Fc抗体。
腹水抗体
将1 × 106个阳性杂交瘤细胞腹腔内注射至B-NDG®小鼠（北京百奥赛图，中国北京（Beijing Biocytogen, Beijing, China））。通过使杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长来产生单克隆抗体。杂交瘤细胞在小鼠腹部扩增并且产生腹水。腹水含有高浓度的抗体，可将其收获以备后用。
抗体纯化
使用GE AKTA蛋白色谱（GE Healthcare, Chicago, Illinois, United States）纯化腹水中的抗体。07-7A10（“7A10”）、08-6A11（“6A11”）、08-9D1（“9D1”）和17-2E9（“2E9”）在通过上述方法产生的小鼠抗体之中。
确定了一些抗体的VH、VL和CDR区。9D1的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列示出在SEQ ID NO: 1-6（Kabat编号）或SEQ ID NO: 7-12（Chothia编号）中。除非在本公开内容中特别指出，否则在本公开内容中默认使用Kabat编号。
实施例2. 小鼠抗hOX40抗体的体外测试：阻断人OX40（hOX40）与人OX40L（hOX40L）的结合
进行阻断测定以确定抗hOX40抗体是否可阻断hOX40与hOX40L之间的结合。
从小鼠腹水中收集抗hOX40抗体，并通过色谱纯化。将25 μl 用人OX40瞬时转染的CHO细胞加入板中的每个孔中。将纯化的抗体滴定至终浓度为50、5、0.5、0.05、0.005 μg/ml。将滴定的抗体在4℃下以每孔25 μl添加到每个孔中，并孵育30分钟。
将hOX40L-Fc以1:400稀释。将50 μl的配体溶液添加至每个孔。将细胞与hOX40L-Fc和抗体在4℃下孵育15分钟。
在用磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤两次之后，将50 μl抗小鼠IgG Fc抗体藻红蛋白缀合物（抗mIgG Fc-PE）以1:500的稀释度以及抗人IgG Fc抗体异硫氰酸荧光素缀合物（抗hIgGFc-FITC）以1:100的稀释度添加到每个孔中，在4℃下孵育30分钟，然后用PBS洗涤。通过流式细胞术确定FITC和PE的信号。
如图3所示，当小鼠抗hOX40抗体7A10（“07-7A10”）和9D1（“08-9D1”）的浓度提高时，FITC的信号降低，表明抗hOX40抗体阻断了人OX40与OX40L之间的结合。
实施例3. 抗hOX40抗体针对猴、小鼠和人-小鼠嵌合OX40（chiOX40）的交叉反应性
用恒河猴OX40（rmOX40，SEQ ID NO: 15）、小鼠OX40（mOX40，SEQ ID NO: 14）和嵌合（小鼠和人）OX40（chiOX40，SEQ ID NO: 16）转染CHO细胞。
将25 μl CHO细胞添加至每个孔。将25 μl纯化的抗hOX40抗体（1 μg/ml）（07-7A10或08-9D1）添加至每个孔，并在4℃下孵育30分钟。
在用PBS（1200 rmp，5分钟）洗涤两次之后，将50 μl抗小鼠IgG Fc抗体异硫氰酸荧光素缀合物（抗mIgG Fc-FITC）以1:500的稀释度添加到每个孔中，并在4℃下孵育30分钟，然后用PBS洗涤（1200 rmp，5分钟）。通过流式细胞术确定FITC的信号。
如图4所示，7A10和9D1与小鼠OX40没有交叉反应，但是与rmOX40和嵌合OX40具有较强的交叉反应性。在图4中，NC代表阴性对照。
实施例4. 抗hOX40抗体的结合亲和力
测试了抗体与hOX40的结合。抗体的亲和力通过装备有预先固定的蛋白A传感器芯片的表面等离子体共振（Biacore T200生物传感器, Biacore, INC, Piscataway N.J.）确定。
9D1和2E9是实施例1中所述的小鼠抗hOX40抗体。基于9D1和2E9，产生了9D1-mHvKv-IgG1和2E9-mHvKv-IgG1嵌合抗hOX40抗体。该嵌合抗体具有来自相应的小鼠抗hOX40抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域，以及来自人IgG1抗体的恒定结构域（包括，例如CL、CH1、CH2和CH3结构域）。
将抗hOX40抗体9D1-mHvKv-IgG1、2E9-mHvKv-IgG1（1 μg/mL）以10 μL/分钟进样到Biacore T200生物传感器中持续25秒，以达到期望的蛋白质密度（约112个响应单位（RU））。然后将浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 nM的人OX40蛋白（hOX40-His）以30 μL/分钟进样120秒。监测解离300秒。在每种滴定度的最后进样之后用甘氨酸（pH 2.0，30 μL/分钟持续12秒）将芯片再生。
通过使用Biacore T200评价软件3.0将数据全局拟合于1:1 Langmuir结合模型来同时获得动力学缔合速率（kon）和解离速率（koff）（Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam,L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110）。由动力学速率常数的商（KD=koff/kon）推导亲和力。
对于所有其他受试抗体，进行相同的方法并对其参数（例如，抗体的浓度）进行必要的适当调整。下表总结了受试抗hOX40抗体的结果。
表1 受试抗hOX40抗体的结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例5. 小鼠抗hOX40抗体的体内测试
为了在体内测试抗hOX40抗体并预测这些抗体在人体中的作用，产生了OX40人源化小鼠模型。设计OX40人源化小鼠模型以表达嵌合OX40蛋白（SEQ ID NO: 16），其中小鼠OX40蛋白的细胞外区域的一部分被人OX40细胞外区域替代。小鼠OX40（SEQ ID NO: 14）的第31-195位氨基酸残基被人OX40（SEQ ID NO: 13）的第35-197位氨基酸残基替代。人源化小鼠模型（B-hOX40人源化小鼠）通过显著降低人与表达小鼠OX40的普通小鼠中临床结局之间的差异来为在临床环境中测试新的治疗性治疗提供新的工具。关于OX40人源化小鼠模型的详细描述可以在PCT/CN2017/099575中找到，其通过引用整体并入本文。
在结肠癌模型中测试了抗hOX40抗体以显示其对体内肿瘤生长的作用。在B-hOX40人源化小鼠中皮下注射MC-38癌肿瘤细胞（结肠腺癌细胞）。当小鼠中的肿瘤达到150±50mm3的体积时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分为不同的组。
然后通过腹腔内施用向小鼠注射生理盐水（PS）和抗hOX40抗体。在每周的第一天和第四天给予抗体，持续3周（共注射6次）。
根据小鼠的体重以3 mg/kg计算注射体积。测量肿瘤的长轴和短轴的长度，并且将肿瘤的体积作为0.5×(长轴)×(短轴)2计算。还在注射之前、在将小鼠分为不同组时（第一次抗体注射之前）、在抗体注射期期间每周两次、以及在实施安乐死之前测量小鼠的体重。
使用下式计算肿瘤生长抑制百分比（TGI%）：
Figure 17574DEST_PATH_IMAGE002
。Ti是第i天处理组的平均肿瘤体积。T0是第0天处理组的平均肿瘤体积。Vi是第i天对照组的平均肿瘤体积。V0是第0天对照组的平均肿瘤体积。
进行t检验以进行统计学分析。TGI%高于60%表明肿瘤生长的显著抑制。p <0.05是指示显著差异的阈值。
将小鼠抗-hOX40抗体08-6A11、08-9D1和17-2E9施用给B-hOX40人源化小鼠（OX40人源化小鼠）。在整个处理期期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的体重全部增加（如图5和图6所示）。在对照组和抗hOX40处理组之间未观察到体重的显著差异。结果表明，抗hOX40抗体被良好耐受，并且对小鼠无毒。
然而，在用抗体08-9D1处理的组中肿瘤体积显示出显著差异（如图7所示）。
如下表所示，还计算了每个处理组在第24天的TGI%。
表2 各处理组在第24天的TGI%
Figure 872398DEST_PATH_IMAGE003
结果表明，08-9D1具有最佳的TGI%。08-6A11在抑制肿瘤生长方面几乎无效。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。
序列表
<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> 抗OX40抗体及其用途
<130> 1
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Asn Tyr Ile Ser
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Trp Ile Ser Ala Gly Thr Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
His Asp Gly Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asn Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
His Gln Tyr Leu Ser Ser Trp Thr
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn Tyr Ile Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ser Ala Gly Thr Ser Asp
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
His Asp Gly Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asn Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
His Gln Tyr Leu Ser Ser Trp Thr
1 5
<210> 13
<211> 277
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 13
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 14
<211> 272
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 14
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu
165 170 175
Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val
180 185 190
Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro
195 200 205
Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp
225 230 235 240
Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr
245 250 255
Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 15
<211> 277
<212> PRT
<213> 恒河猴(Macaca mulatta)
<400> 15
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Lys Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys Gln Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Asn Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ala Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Ala Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Pro Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Pro Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Thr Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Arg Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Arg Gly Pro Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Ala
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Met Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala Pro Lys Ala Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Ala Leu Ala Lys Ile
275
<210> 16
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys
65 70 75 80
Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr
85 90 95
Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu
100 105 110
Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His
115 120 125
Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr
130 135 140
Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala
145 150 155 160
Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln
165 170 175
Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro
180 185 190
Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro Glu Gly
195 200 205
Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu Ala Pro
210 215 220
Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp Arg Leu
225 230 235 240
Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr Pro Ile
245 250 255
Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Gly Arg Met Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Leu Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Ala Gly Thr Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Lys Ala Gln Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Asn Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Asp Gly Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Ser Met Thr Cys Asn Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Leu Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (12)

1.一种抗OX40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及轻链可变区的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中，VHCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，VHCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，VHCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，VLCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，VLCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2.根据权利要求1所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
3.根据权利要求1所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段为单链抗体、Fv抗体、Fd、dAb、线性抗体或多特异性抗体。
4.根据权利要求1所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段为双特异性抗体。
5.根据权利要求1所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段为双特异性单链抗体。
6.根据权利要求1-5任一所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段特异性结合人OX40。
7.一种核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：
（1）包含重链可变区的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1、2和3所示的VHCDR1、2和3，并且其中所述重链可变区在与如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区配对时结合OX40；和，
（2）包含轻链可变区的免疫球蛋白轻链或其片段，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4、5和6所示的VLCDR1、2和3，并且其中所述轻链可变区在与如SEQ ID NO:17所示的重链可变区配对时结合OX40。
8.一种细胞，其包含权利要求7所述的核酸。
9.一种抗OX40抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，培养权利要求8所述的细胞，获得抗OX40抗体或其抗原结合片段。
10.一种抗体药物偶联物，其包含与药物共价结合的权利要求1-6任一所述的抗体或其抗原结合片段。
11.一种药物组合物，其包含权利要求1-6任一所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求10所述的抗体药物偶联物，以及可药用载体。
12.权利要求1-6任一所述的抗体或其抗原结合片段，或者权利要求10所述的抗体药物偶联物，或者权利要求11所述的药物组合物在制备治疗OX40/OX40L相关的疾病的产品或在OX40检测中的用途；其中，所述OX40/OX40L相关的疾病为结肠癌；所述OX40检测用途不包括疾病的诊断和治疗方法。
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