TW202241957A - 抗ｐｄ－１抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申請提供了一種分離的抗原結合蛋白，其能夠結合PD-1蛋白，能夠阻斷PD-1蛋白與PD-L1和/或PD-L2蛋白之間的結合，和/或，能夠刺激免疫細胞分泌細胞因子。本申請還提供了該分離的抗原結合蛋白在製備藥物中的用途。
Description
本申請關於生物醫藥領域，具體的關於一種抗PD-1抗體及其在製備藥物中的用途。
惡性腫瘤是目前全球範圍內嚴重威脅人類健康的疾病，是疾病導致人類死亡的主要類型。隨著國內人口老齡化的日漸加劇，腫瘤發生率不斷提高，有效的治療藥物亟待開發，其中免疫檢查點藥物的開發為近年來研究熱點。
程序性死亡受體1(programmed death 1)簡稱PD-1廣泛表達於免疫細胞，是一種重要的免疫抑制分子。PD-1的主要配體為PD-L1，PD-L1主要表達於腫瘤細胞表面。配體PD-L1和受體PD-1結合後，在腫瘤微環境中抑制T細胞活化，導致T細胞等免疫系統無法正常殺傷腫瘤細胞，進而實現免疫逃逸。
PD-1或PD-L1免疫療法的作用機制是針對PD-1或PD-L1設計特定的單株抗體，阻止PD-1和PD-L1的識別，恢復T細胞正常功能，從而使T細胞有效殺傷腫瘤細胞。目前已開發出多款針對這一信號通路的治療性抗體，如帕博利珠單抗(Pembrolizumab)和納武利尤單抗(Nivolumab)，但在治療過程中普遍存在響應率低，易產生耐藥性等現象。因此，亟需結構穩定、療效好且適合大規模工業化生產的抗腫瘤PD-1抗體。
本申請提供了一種分離的抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：(1)能夠以1×108M或更低的KD值結合源自靈長類動物的PD-1蛋白；(2)能夠阻斷PD-1蛋白與PD-L1蛋白之間的結合；(3)能夠阻斷PD-1蛋白與PD-L2蛋白之間的結合；和(4)能夠刺激免疫細胞分泌細胞因子，例如，刺激淋巴細胞分泌IL-2。
在某些實施方式中，該靈長類動物包括人和/或猴。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方式中，該抗原結合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
在某些實施方式中，該抗體選自下組：單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白能夠與參比抗體競爭結合該PD-1蛋白，其中該參比抗體包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該參比抗體的VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該參比抗體的VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該參比抗體包含選自下述的任意一組胺基酸序列：(1)HCDR1：SEQ ID NO：1，HCDR2：SEQ ID NO：2，HCDR3：SEQ ID NO：3，LCDR1：SEQ ID NO：8，LCDR2：SEQ ID NO：9，和LCDR3：SEQ ID NO：10；(2)HCDR1：SEQ ID NO：27，HCDR2：SEQ ID NO：28，HCDR3：SEQ ID NO：29，LCDR1：SEQ ID NO：34，LCDR2：SEQ ID NO：35，和LCDR3：SEQ ID NO：
36(3)HCDR1：SEQ ID NO：1，HCDR2：SEQ ID NO：85，HCDR3：SEQ ID NO：3，LCDR1：SEQ ID NO：8，LCDR2：SEQ ID NO：9，和LCDR3：SEQ ID NO：10。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含HCDR3，且該HCDR3包含SEQ ID NO：3或29所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含HCDR2，且該HCDR2包含SEQ ID NO：2、28或85所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含HCDR1，且該HCDR1包含SEQ ID NO：1或27所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自以下任一組胺基酸序列：(1)
HCDR1：SEQ ID NO：1，HCDR2：SEQ ID NO：2和HCDR3：SEQ ID NO：3：(2)HCDR1：SEQ ID NO：27，HCDR2：SEQ ID NO：28和HCDR3：SEQ ID NO：29；和(3)HCDR1：SEQ ID NO：1，HCDR2：SEQ ID NO：85和HCDR3：SEQ ID NO：3。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含重鏈可變區VH，其中該VH包括框架區H-FR1，該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端直接
或間接相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR1包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：43中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包括框架區H-FR2，該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：59或60所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR2包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：44中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包括框架區H-FR3，該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：61或62所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR3包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：45中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包括框架區H-FR4，該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：63或64所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該H-FR4包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：46中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，其中該H-FR1包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：43中任一項所示的胺基酸序列，該H-FR2包含SEQ ID
NO：5、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：44中任一項所示的胺基酸序列，該H-FR3包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：45中任一項所示的胺基酸序列且該H-FR4包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：46中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，且該H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4選自以下任一組胺基酸序列：
(1)H-FR1：SEQ ID NO：4，H-FR2：SEQ ID NO：5，H-FR3：SEQ ID NO：6和H-FR4：SEQ ID NO：7；
(2)H-FR1：SEQ ID NO：17，H-FR2：SEQ ID NO：18，H-FR3：SEQ ID NO：19和H-FR4：SEQ ID NO：20；
(3)H-FR1：SEQ ID NO：30，H-FR2：SEQ ID NO：31，H-FR3：SEQ ID NO：32和H-FR4：SEQ ID NO：33；和
(4)H-FR1：SEQ ID NO：43，H-FR2：SEQ ID NO：44，H-FR3：SEQ ID NO：45和H-FR4：SEQ ID NO：46。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含重鏈可變區VH，且該VH包含SEQ ID NO：65或66所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：86中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括重鏈恆定區，且該重鏈恆定區源自人IgG恆定區。
在某些實施方式中，該重鏈恆定區源自人IgG4恆定區，且該人IgG4恆定區包含SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體重鏈HC，且該HC包含SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含LCDR3，且該LCDR3包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含LCDR2，且該LCDR2包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含LCDR1，且該LCDR1包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該LCDR1包含SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：34中任一項所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：35中任一項所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：36中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該LCDR1、LCDR2和LCDR3選自以下任一組胺基酸序列：(1)
LCDR1：SEQ ID NO：34，LCDR2：SEQ ID NO：35和LCDR3：SEQ ID NO：36；和(2)LCDR1：SEQ ID NO：8，LCDR2：SEQ ID NO：9和LCDR3：SEQ ID NO：10。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含輕鏈可變區VL，其中該VL包括框架區L-FR1，該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端直接或間接相連，且該L-FR1包含SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR1包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：47中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包括框架區L-FR2，該L-FR2位於該LCDR1與該LCDR2之間，且該L-FR2包含SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR2包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：48中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包括框架區L-FR3，該L-FR3位於該LCDR2與該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：74所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR3包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：49中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR4的N末端與該LCDR3的C末端相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該L-FR4包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：50中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，其中該L-FR1包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：21、SEQ ID
NO：37和SEQ ID NO：47中任一項所示的胺基酸序列，該L-FR2包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：48中任一項所示的胺基酸序列，該L-FR3包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：49中任一項所示的胺基酸序列且該L-FR4包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：50中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，且該L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4選自以下任一組胺基酸序列：
(1)L-FR1：SEQ ID NO：11，L-FR2：SEQ ID NO：12，L-FR3：SEQ ID NO：13和L-FR4：SEQ ID NO：14；
(2)L-FR1：SEQ ID NO：21，L-FR2：SEQ ID NO：22，L-FR3：SEQ ID NO：23和L-FR4：SEQ ID NO：24；
(3)L-FR1：SEQ ID NO：37，L-FR2：SEQ ID NO：38，L-FR3：SEQ ID NO：39和L-FR4：SEQ ID NO：40；和
(4)L-FR1：SEQ ID NO：47，L-FR2：SEQ ID NO：48，L-FR3：SEQ ID NO：49和L-FR4：SEQ ID NO：50。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含輕鏈可變區VL，且該VL包含SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：52中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包括抗體輕鏈恆定區，且該抗體輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該分離的抗原結合蛋白包含抗體輕鏈LC，且該LC包含SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列。
另一方面，本申請提供了一種多肽，其包含該分離的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請提供了一種免疫綴合物，其包含該分離的抗原結合蛋白或該多肽。
另一方面，本申請提供了分離的一種或多種核酸分子，其編碼該分離的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請提供了一種載體，其包含該核酸分子。
另一方面，本申請提供了一種細胞，其包含該核酸分子或該載體。
另一方面，本申請提供了製備該分離的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得該分離的抗原結合蛋白表達的條件下，培養該細胞。
另一方面，本申請提供了醫藥組成物，其包含該分離的抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體和/或該細胞，以及視需要地藥學上可接受的載體。
另一方面，本申請提供了該分離的抗原結合蛋白、多肽、免疫綴合物、核酸分子載體、細胞和/或醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療腫瘤。
另一方面，本申請提供了預防、緩解或治療腫瘤的方法，該方法包括向有需要的受試者施用該分離的抗原結合蛋白、多肽、免疫綴合物、核酸分子載體、細胞和/或醫藥組成物。
另一方面，本申請提供了該分離的抗原結合蛋白，用於預防、緩解或治療腫瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤包括PD-1或PD-L1高表達的腫瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤包括黑色素瘤、肺癌、腎癌、食管癌、頭頸癌、淋巴瘤、肝癌和/或胃癌。
另一方面，本申請提供了抑制PD-1蛋白與PD-L1蛋白結合的方法，該方法包括施用述的分離的抗原結合蛋白、多肽、免疫綴合物、核酸分子、載體、細胞和/或醫藥組成物。
另一方面，本申請提供了抑制PD-1蛋白與PD-L2蛋白結合的方法，其包括施用該述的分離的抗原結合蛋白、多肽、免疫綴合物、核酸分子、載體、細胞和/或醫藥組成物。
另一方面，本申請提供了刺激免疫細胞分泌細胞因子的方法，其包括施用該分離的抗原結合蛋白、多肽、免疫綴合物、核酸分子、載體、細胞和/或醫藥組成物。
另一方面，本申請提供了用於檢測PD-1蛋白的存在和/或含量的方法，其包括施用述的分離的抗原結合蛋白、多肽、免疫綴合物、核酸分子、載體、細胞和/或醫藥組成物。
另一方面，本申請提供了試劑盒，其包含該分離的抗原結合蛋白、該多肽、該免疫綴合物、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。
所屬技術領域具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本申請的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明書如下：
圖1顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3結合CHOK1細胞表面的人PD-1蛋白。
圖2顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3結合CHOK1細胞表面的食蟹猴PD-1蛋白。
圖3顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3阻斷人PD-L1與CHOK1表面的人PD-1蛋白結合。
圖4顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3阻斷人PD-L2與CHOK1細胞表面的人PD-1蛋白。
圖5顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3在混合淋巴細胞反應中刺激細胞因子IL-2分泌。
圖6顯示的是候選抗體與細胞表面人PD-1的結合結果圖。
圖7顯示的是候選抗體與細胞表面猴PD-1的結合結果圖。
圖8顯示的是候選抗體激活混合淋巴細胞釋放IL-2的結果圖。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
術語定義
在本申請中，術語“PD-1”通常是指程序性死亡1受體，也可稱為“程序性死亡1”、“CD279”、“分化簇279”、“PD1”、“PDCD1”或“CD297”。PD-1蛋白通常包括胞外IgV域、跨膜區和胞內尾。PD-1通常在T細胞、B細胞、自然殺傷T細胞、活化的單核細胞和樹突細胞(DC)上表達。PD-1可以結合其配體PD-L1和PD-L2。術語“PD-1”涵蓋任何脊椎動物來源的任何天然PD-1或經修飾的PD-1，該任何脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類(例如，人或猴)和齧齒類(例如，小鼠或大鼠)。該術語涵蓋“全長”、未加工的PD-1以及由細胞中的加工所產生的任何形式的PD-1。PD-1可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。“PD-1”包括完整的PD-1及其片段，還包括PD-1的功能性變體、同工型、物種同源物、衍生物、類似物，以及具有至少一個與PD-1共同表位的類似物。PD-1序列是本領域已知的。例如，示例性的全長人PD-1蛋白序列可在NCBI登錄號
NP_005009.2下找到，示例性的全長食蟹猴的PD-1蛋白序列可在NCBI登錄號NP_001271065或Uniprot登錄號B0LAJ3下找到。
在本申請中，術語“PD-L1”通常是指程序性死亡配體1蛋白。PD-L1也稱為分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，並且是由(人類中)CD274基因編碼的蛋白。PD-L1可以結合其受體，例如程序性死亡1(PD-1)。PD-L1和PD-1的絡合藉由抑制T細胞增殖和產生細胞因子IL-2和IFN-γ發揮免疫抑制作用。術語“PD-L1”涵蓋任何脊椎動物來源的任何天然PD-L1或經修飾的PD-1，該任何脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類(例如，人或猴)和齧齒類(例如，小鼠或大鼠)。該術語涵蓋“全長”、未加工的PD-L1以及由細胞中的加工所產生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。該術語還涵蓋天然存在的PD-L1的變體，例如剪接變體或等位基因變體。PD-L1的基本結構包括4個結構域：胞外Ig樣V型結構域和Ig樣C2型結構域、跨膜結構域以及細胞質結構域。PD-L1序列是本領域已知的。例如可在NCBI Gene ID No.29126下找到關於人PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的信息。示例性的全長人PD-L1蛋白的胺基酸序列可在NCBI登錄號NP_054862或UniProt登錄號Q9NZQ7下找到。
在本申請中，術語“PD-L2”通常是指程序性死亡配體2蛋白，也可稱為“程序性死亡2”、“CD273”、“分化簇273”、“B7-DC”或“PDCD1LG2”。術語“PD-L2”涵蓋任何脊椎動物來源的任何天然PD-L2或經修飾的PD-L2，該任何脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類(例如，人或猴)和齧齒類(例如，小鼠或大鼠)。該術語涵蓋“全長”、未加工的PD-1以及由細胞中的加工所產生的任何形式的PD-L2。PD-L2可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。“PD-L2”包
括完整的PD-L2及其片段，還包括PD-L2的功能性變體、同工型、物種同源物、衍生物、類似物，以及具有至少一個與PD-L2共同表位的類似物。PD-L2序列是本領域已知的。例如，示例性的全長人PD-L2蛋白序列可在NCBI登錄號NP_079515.2下找到。
在本申請中，術語“抗原結合蛋白”通常是指包含結合抗原部分的蛋白質，以及視需要地允許結合抗原的部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構象的支架或骨架部分。抗原結合蛋白可典型地包含抗體輕鏈可變區(VL)、抗體重鏈可變區(VH)或上述兩者，及其功能性片段。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗原結合蛋白的實例包括但不限於抗體、抗原結合片段、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。
在本申請中，術語“抗體”通常是指對指定蛋白質或肽或其片段有反應性的免疫球蛋白。抗體可以是來自任何類的抗體，包括但不限於IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，及來自任何亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)的抗體。抗體可具有選自例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的重鏈恆定區。抗體還可具有選自例如kappa(κ)或lambda(λ)的輕鏈。本申請的抗體可衍生自任何物種。
在本申請中，術語“抗原結合片段”通常是指抗體分子的某部分，該部分包含胺基酸殘基，該胺基酸殘基與抗原相互作用並賦予抗體對於抗原的特異性和親和力。抗原結合片段的實例可包括但不限於Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv和/或dAb。在本申請中，術語“Fab”通常是指含有重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的片段，並且還含有輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CH1)；術語“Fab'''通常是指在重鏈CH1結構域的羧基端添加
少量殘基(包括一個或多個來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸)而不同於Fab的片段；術語“F(ab')2”通常是指Fab’的二聚體，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段。術語“Fv”通常是指含有完整抗原識別與結合位點的最小抗體片段。在某些情形中，該片段可以由一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區以緊密非共價結合的二聚體組成；術語“dsFv”通常是指二硫鍵穩定的Fv片段，其單個輕鏈可變區與單個重鏈可變區之間的鍵是二硫鍵。術語“dAb片段”通常是指由VH結構域組成的抗體片段。在本申請中，術語“scFv”通常是指抗體的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域藉由柔性肽連接子共價連接配對形成的單價分子；此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。
在本申請中，術語“可變區”或“可變結構域”通常是指參與抗體與抗原的結合的抗體重鏈或輕鏈的結構域。在本申請中，術語“可變”通常是指，抗體的可變結構域的序列的某些部分變化強烈，形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變區中。它集中在輕鏈可變區和重鏈可變區中的三個區段，被稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)，分別為LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。可變域中更高度保守的部分被稱為框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區(H-FR1、H-FR2、H-FR3、H-FR4、L-FR1、L-FR2、L-FR3、L-FR4)，大部分採用β-折疊構型，藉由三個CDR結構環區連接。每條鏈中的CDR藉由FR區緊密靠近在一起，並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點。
在本領域中，可以藉由多種方法來編碼抗體的可變區或劃分抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat編號方案和定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬裡蘭州(1991))，基於結構環區域位置的Chothia編號方案和定義規則(參見，A1-Lazikani等人，JMol Biol 273：927-48,1997)，efranc等人的基於種系V基因的胺基酸序列比對的IMGT編號方案和定義規則，還有Honneger’s編號方案(AHo’s)，Martin編號方案，Gelfand編號方案等，可參見Mathieu Dondelinger等人，Understanding the Significance and Implications of Antibody Numbering and Antigen-Binding Surface/Residue Definition,Front.Immunol.,16 October 2018.
在本申請中，術語“單株抗體”通常是指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變和/或翻譯後修飾(例如異構化、醯胺化)外。單株抗體是高度特異性的，針對單一抗原性位點。
在本申請中，術語“嵌合抗體”通常是指其中可變區源自一個物種，而恆定區源自另一個物種的抗體。通常，可變區源自實驗動物諸如齧齒動物的抗體(“親本抗體”)，且恆定區源自人類抗體，使得所得嵌合抗體與親本(例如小鼠來源)抗體相比，在人類個體中引發不良免疫反應的可能性降低。
在本申請中，術語“人源化抗體”通常是指非人抗體(例如小鼠抗體)的CDR區以外的部分或全部有的胺基酸被源自人免疫球蛋白的相應的胺基酸置換的抗體。在CDR區中，胺基酸的添加、缺失、插入、置換或修飾也可以是允許的，只要它們仍保留抗體結合特定抗原的能力。人源化抗體可視需要地包含人類免疫球蛋白恆定區的至少一部分。“人源化抗體”保留類似於原始抗體的抗
原特異性。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白(受體抗體)中的CDR區殘基用具有所期望性質、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠，大鼠，家兔或非人靈長類動物)的CDR區殘基替換。在某些情形中，可以將人免疫球蛋白的FR區殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有的胺基酸修飾。
在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指所有部分(包括抗體的可變區和恆定區)均由人類來源的基因所編碼的抗體。本領域獲得全人源抗體的方法可以有噬菌體展示技術、轉基因小鼠技術、核糖體展示技術和RNA-多肽技術等。
在本申請中，術語“結合”、“特異性結合”或“對...特異性的”通常是指可測量且可再現的相互作用，諸如抗原和抗體之間的結合，其可以確定在存在分子(包括生物學分子)的異質群體的情況中靶物的存在。例如，抗體藉由其抗原結合域與表位結合，並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。例如，特異性結合靶物(其可以是表位)的抗體是以比其結合其它靶物更大的親和力、親合力、更容易和/或以更大的持續時間結合此靶物的抗體。當抗體相比於其將結合隨機的、不相關的表位而言更容易藉由其抗原結合域與表位結合時，抗體被稱為“特異性結合”該抗原。
在本申請中，術語“KD”、“K D ”可互換地使用，通常是指平衡解離常數，“KD”是解離速率常數(kdis，也稱為“解離率(off-rate)(koff)”或“kd”)與結合速率常數(kon，也稱為“結合率(kon)”或“ka”)的比值。可使用結合速率常數(kon)、解離速率常數(kdis)和平衡解離常數(KD)表示抗原結合蛋
白(例如抗體)對抗原的結合親和力。確定結合和解離速率常數的方法為本領域熟知，包括但不限於生物膜干涉技術(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面電漿共振(SPR)、螢光共振能量遷移(FRET)、免疫共沉澱(Co-IP)以及蛋白質芯片技術。如果在不同的條件(例如鹽濃度、pH)下測量，則所測得的某種特定蛋白-蛋白相互作用的親和力可不同。
在本申請中，術語“靈長類動物”通常是指猴和猿物種，並包括猴物種，諸如來自彌猴屬(例如，食蟹猴(Macaca fascicularis)和或恆河猴(Macaca mulatta))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))的猴，以及狨猴(來自狨(Callithrix)屬的物種)，松鼠猴(來自松鼠猴(Saimiri)屬的物種)和絹毛猴(來自檉柳猴(Saguinus)屬的物種)，以及猿物種，諸如黑猩猩(Pan troglodytes)，並且還包括智人(Homo sapiens)。
在本申請中，術語“多肽”或“蛋白質”可互換地使用，通常是指胺基酸殘基的聚合物。該術語也適用於其中一個或多個胺基酸殘基是相應的天然存在的胺基酸的類似物或模擬物的胺基酸聚合物、以及天然存在的胺基酸聚合物。該術語也可包括修飾的胺基酸聚合物，例如，藉由添加糖殘基以形成糖蛋白或被磷酸化修飾。多肽和蛋白質可由天然存在的和非重組的細胞或由遺傳工程改造的或重組的細胞產生，並且可包含具有天然蛋白質的胺基酸序列的分子、或具有天然序列的一個或多個胺基酸的缺失、添加和/或取代的分子。術語“多肽”和“蛋白質”特別包括本申請所述的抗原結合蛋白的一個或多個胺基酸的缺失、添加和/或取代的序列。
在本申請中，術語“分離的”通常是指大體上不含其天然存在的環境中通常伴隨或與之相互作用的組分的生物材料(例如病毒、核酸或蛋白質)。該
分離的生物材料視需要地包含在其天然環境(例如，核酸或蛋白質)中該生物材料未發現具有的另外的材料。在本申請中，當涉及蛋白質時，“分離”通常是指該分子從發現該分子天然存在的整個生物體中分離和分開，或基本不存在其它相同類型的生物大分子。當涉及核酸分子時，它與天然與其結合的序列完全或部分分離，或該核酸具有與其結合的異源序列，或該核算從染色體分離。
在本申請中，術語“免疫綴合物”通常是指抗原結合蛋白與其它活性劑連接形成的物質，其他活性劑可以是小分子活性劑，例如化療劑、毒素、免疫治療劑、成像探針或光譜探針。
在本申請中，術語“核酸”分子通常是指從其天然環境中分離的或人工合成的任何長度的分離形式的核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。
在本申請中，術語“載體”通常是指能夠在合適的宿主中自我複製的核酸分子，其將插入的核酸分子轉移到宿主細胞中和/或宿主細胞之間。該載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於複製DNA或RNA的載體，以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達的載體。該載體還包括具有多種上述功能的載體。該載體可以是當引入合適的宿主細胞時能夠轉錄並翻譯成多肽的多核苷酸。通常，藉由培養包含該載體的合適的宿主細胞，該載體可以產生期望的表達產物。
在本申請中，術語“細胞”通常是指可以包含或已經含有包括本申請所述的核酸分子的質粒或載體，或者能夠表達本申請所述的抗原結合蛋白的個體細胞、細胞系或細胞培養物。該細胞可以包括單個宿主細胞的子代。由於天然的、意外的或故意的突變，子代細胞與原始親本細胞在形態上或在基因組上可
能不一定完全相同，但能夠表達本申請所述的抗體或其抗原結合片段即可。該細胞可以藉由使用本申請所述的載體體外轉染細胞而得到。該細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌)，也可以是真核細胞(例如酵母細胞，例如COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞或骨髓瘤細胞)。在某些情形中，該細胞可以是哺乳動物細胞。例如，該哺乳動物細胞可以是CHO-K1細胞。
在本申請中，術語“醫藥組成物”通常是指這樣的製劑，其以允許活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對將施用該組成物的對象具有不可接受的毒性的另外的成分。
在本申請中，術語“治療”通常是指期望改變所治療個體的天然病程，且可為實現防治或在臨床病變過程中進行的臨床介入。合乎需要的治療效果包括但不限於防止疾病發生或復發性、減輕症狀、減弱疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低疾病進展速率、改善或緩解疾病狀態以及緩和或改善預後。在一些情形中，抗體(例如，抗PD-1抗體)可用來延遲疾病發展或減緩疾病進展。
在本申請中，術語“施用”通常是指向受試者(例如，患者)給予一定劑量的化合物(例如，抗癌治療劑)或醫藥組成物(例如，包含抗癌治療劑的醫藥組成物)的方法。施用可藉由任何合適的方式進行，包括腸胃外、肺內和鼻內，以及(如果局部治療需要)損傷內施用。胃腸外輸注包括例如肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。
在本申請中，術語“腫瘤”通常是指所有贅生性細胞生長和增殖(無論惡性還是良性)以及所有癌前和癌性細胞和組織。在本申請中，該腫瘤可以為
細胞和組織的PD-1或PD-L1高表達的腫瘤。腫瘤可包括實體瘤和/或非實體瘤(例如，血液瘤、淋巴瘤)。
在本申請中，術語“同源物”通常是指與野生型胺基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的胺基酸序列或核苷酸序列。術語“同源性”可以等同於序列“同一性”。同源序列可以包括可以與主題序列是至少80%、85%、90%、99.11%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%相同的胺基酸序列。通常，同源物將包含與主題胺基酸序列相同的活性位點等。同源性可以根據相似性(即具有相似化學性質/功能的胺基酸殘基)來考慮，也可以在序列同一性方面表達同源性。在本申請中，提及的胺基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一項具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整個長度上具有所述百分比同一性的序列。
在本申請中，術語“在......之間”通常是指某種胺基酸片段的C端與第一胺基酸片段的N端直接或間接連接，並且其N端與第二胺基酸片段的C端直接或間接連接。在輕鏈中，例如，該L-FR2的N末端與該LCDR1的C末端直接或間接相連，且該L-FR2的C末端與該LCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該L-FR3的N末端與該LCDR2的C末端直接或間接相連，且該L-FR3的C末端與該LCDR3的N末端直接或間接相連。在重鏈中，例如，該H-FR2的N末端與該HCDR1的C末端直接或間接相連，且該H-FR2的C末端與該HCDR2的N末端直接或間接相連。又例如，該H-FR3的N末端與該HCDR2的C末端直接或間接相連，且該H-FR3的C末端與該HCDR3的N末端直接或間接相連。在本申請中，“第一胺基酸片段”和“第二胺基酸片段”可以為相同或不同的任意一段胺基酸片段。
在本申請中，術語“包括”通常是指包含、總括、含有或包涵的含義。在某些情況下，也表示“為”、“由......組成”的含義。
在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
[發明詳述]
抗原結合蛋白
一方面，本申請提供一種分離的抗原結合蛋白，本申請中，該分離的抗原結合蛋白能夠以1×10-8M或更低的KD值結合源自靈長類動物的PD-1。該靈長類動物PD-1抗原結合蛋白對PD-1的結合親和力可藉由本領域已知的任何方法測定。在某些情形中，結合親和力可藉由表面電漿共振法(SPR)、酶聯免疫法(ELISA)、結合抗原沉澱法、平衡透析法、生物膜干涉(BLI)測定。在某些情形中，PD-1抗原結合蛋白對PD-1的結合親和力和KD值可藉由生物膜干涉(BLI)測定。例如，可使用ForteBio Octet分子相互作用分析儀，來進行抗原抗體之間的結合動力學分析。
本申請中，該分離的抗原結合蛋白能夠以1×10-8M或更低的KD值結合源自靈長類動物的PD-1。例如，該KD的值可以以約1×10-8M或以下、約9×10-9M或以下、約8×10-9M或以下、約7×10-9M或以下、約6×10-9M或以下、約5×10-9M或以下、約4×10-9M或以下、約3×10-9M或以下、約2×10-9M或以下、約1×10-9M或以下的值結合源自人的PD-L1，例如，使用FortieRio Octet分子相互作用分析儀所檢測的。
在另一情形中，本申請所述PD-1抗原結合蛋白與PD-1的結合活性可使用流式細胞術或酶聯免疫法測定進行檢測。
例如，在FACS檢測中，使用穩定表達人PD-1的宿主細胞(如CHOK1細胞)，該PD-1抗原結合蛋白結合PD-1的EC50值在約0.0001nM至約100nM之間，例如，約0.001nM至約10nM之間，約0.001nM至約5nM之間，約0.001nM至約1nM之間，約0.01nM至約1nM之間，約0.01nM至約1.2nM之間，或，約0.1nM至約1.5nM之間。
例如，在FACS檢測中，使用穩定表達猴PD-L1的宿主細胞(如CHOK1細胞)，該PD-L1抗原結合蛋白結合PD-L1的EC50值在約0.0001nM至約100nM之間，例如，約0.001nM至約10nM之間，約0.001nM至約5nM之間，約0.01nM至約1nM之間，約0.02nM至約1.0nM之間，約0.1nM至約1.0nM之間。
在另一個方面，本申請所述的抗原結合蛋白能夠阻斷PD-1與PD-L1的結合。在某些情形中，該抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L1的結合可藉由流式細胞技術FACS、酶聯免疫法ELISA測定。
例如，首先將穩定表達人PD-1的宿主細胞(如HEK293細胞)與遞減量的未標記的該抗原結合蛋白孵育，隨後用生物素標記的PD-L1蛋白孵育。然後，使用FACS分析細胞，以證實該抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L1結合。例如，IC50值約0.001nM至約10nM之間，約0.001nM至約5nM之間，約0.01nM至約5nM之間，約0.1nM至約1.0nM之間，約0.5nM至約1.5nM之間。
例如，首先將穩定表達人PD-1的宿主細胞(如CHOK1細胞)與遞減量的未標記的該抗原結合蛋白孵育，隨後用生物素標記的PD-L2蛋白孵育。
然後，使用FACS分析細胞，以證實該抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L2結合。例如，約0.001nM至約10nM之間，約0.001nM至約5nM之間，約0.1nM至約2.5nM之間，約0.1nM至約3nM之間。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR3，該HCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示的VH的CDR3。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR3，該HCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：15或25所示的VH的CDR3。例如，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR3，該HCDR3可包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR2，該HCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示的VH的CDR2。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR2，該HCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：15或25所示的VH的CDR2。例如，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR2，該HCDR2可包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR2，該HCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：86所示的VH的CDR2。例如，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR2，該HCDR2可包含如SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1，該HCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示的VH的CDR1。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1，該HCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：15或25所示的VH的CDR1。例如，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1，該HCDR1可包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示的VH的CDR1，該HCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示的VH的CDR2，該HCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示的VH的CDR3。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：15或25所示的VH的CDR1，該HCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：15或25所示的VH的CDR2，該HCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：15或25所示的VH的CDR3。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：86所示的VH的CDR1，該HCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：86所示的VH的CDR2，該HCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：86所示的VH的CDR3。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示的VH的CDR1，可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示的VH的CDR2，且包含胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示的VH的CDR3。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：25所示的VH的CDR1，可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：25所示的VH的CDR2，且包含胺基酸序列如SEQ ID NO：25所示的VH的CDR3。
例如，本申請所述分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
例如，本申請所述分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含如SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含H-FR1，該H-FR1可包含如SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列：EVX3LVESGGGLVKPGGSLX19LX21CAAS(SEQ ID NO：57)，其中，X3為K或Q，X19為K或R，且X21為A或S。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列相比，該H-FR1可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X3、X19和/或X21處的胺基酸取代。例如，該H-FR1可包含如SEQ ID NO：4或17所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含H-FR2，該H-FR2可包含如SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列：DMSWVRQX8PX10KX12LEWVX17TI(SEQ ID NO：59)，其中，X8為A或T，X10為E或G，X12為G或R，且X17為A或S。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列相比，該H-FR2可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X8、X10、X12和/或X17處的胺基酸取代。例如，該H-FR2可包含如SEQ ID NO：5或18所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含H-FR3，該H-FR3可包含如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列：TYYX4DSVKGRFTISRDNAKNX21LYLQMX27SLRX31EDTAX36YYCVS(SEQ ID NO：61)，其中，X4為A或P，X21為S或N，X27為N或S，X31為A或S，且X36為L或V。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列相比，該H-FR3可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X4、X21、X27、X31和/或X36處的胺基酸取代。
例如，該H-FR3可包含如SEQ ID NO：6或19所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含H-FR4，該H-FR4可包含如SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列：WGQGTX6VTVSS(SEQ ID NO：63)，其中，X6為L或S。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列相比，該H-FR3可至少包含在X6處的胺基酸取代。例如，該H-FR4可包含如SEQ ID NO：7或20所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH，該VH可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列：
(SEQ ID NO：65)，其中，X3為K或Q，X19為K或R，X21為A或S，X40為A或T，X42為E或G，X44為G或R，X49為A或S，X61為A或P，X78為N或S，X84為S或N，X88為A或S，X93為L或V，且X111為L或S。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列相比，該VH可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X3、X19、X21、X40、X42、X44、X49、X61、X78、X84、X88、X93和/或X111處的胺基酸取代。
例如，該VH可包含SEQ ID NO：15或25所示的胺基酸序列。例如，該VH可包含SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列。
本申請的分離的抗原結合蛋白可包含LCDR3，該LCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示的VL的CDR3。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR3，該LCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：16或26所示的VL的CDR3。例如，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR3，該LCDR3可包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR2，該LCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示的VL的CDR2。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR2，該LCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：16或26所示的VL的CDR2。例如，該分離
的抗原結合蛋白可包含LCDR2，該LCDR2可包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR1，該LCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示的VL的CDR1。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR1，該LCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：16或26所示的VL的CDR1。例如，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR1，該LCDR1可包含如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示的VL的CDR1，該LCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示的VL的CDR2，該LCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示的VL的CDR3。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：16或26所示的VL的CDR1，該LCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：16或26所示的VL的CDR2，該LCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：16或26所示的VL的CDR3。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：16所示的VL的CDR1，可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：16所示的VL的CDR2，且包含胺基酸序列如SEQ ID NO：16所示的VL的CDR3。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：26所示的VL的CDR1，可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：26所示的VL的CDR2，且包含胺基酸序列如SEQ ID NO：26所示的VL的CDR3。
例如，本申請所述分離的抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含L-FR1，該L-FR1可包含如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列：DIX3X4TQSX8X9FX11SX13SVGDRVX20TC(SEQ ID NO：69)，其中，X3為Q或V，X4為L或M，X8為P或H，X9為K或S，X11為L或M，X13為A或T，且X20為S或T。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列相比，該L-FR1可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X3、X4、X8、X9、X11、X13和/或X20處的胺基酸取代。
例如，該L-FR1可包含如SEQ ID NO：11或21所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含L-FR2，該L-FR2可包含如SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列：WYQQKPGX8X9PKLLIY(SEQ ID NO：71)，其中，X8為K或Q，且X9為A或S。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列相比，該L-FR2可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X8和/或X9處的胺基酸取代。
例如，該L-FR2可包含如SEQ ID NO：12或22所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含L-FR3，該L-FR3可包含如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列：
GVPX4RFX7GSGSGTX14FTLTISX21X22QX24EDX27AX29YFC(SEQ ID NO：73)，其中，X4為D或S，X7為S或T，X14為D或E，X21為N或S，X22為L或V，X24為P或S，X27為F或L，且X29為D或T。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列相比，該L-FR3可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X4、X7、X14、X21、X22、X24、X27和/或X29處的胺基酸取代。
例如，該L-FR3可包含如SEQ ID NO：13或23所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含L-FR4，該L-FR4可包含如SEQ ID NO：75所示的胺基酸序列：FGGGTKX7EX9K(SEQ ID NO：75)，其中，X7為L或V，且X9為I或V。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列相比，該L-FR4可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X7和/或X9處的胺基酸取代。
例如，該L-FR4可包含如SEQ ID NO：14或24所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL，該VL可包含SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列：
(SEQ ID NO：67)，其中，X3為Q或V，X4為L或M，X8為P或H，X9為K或S，X11為L或M，X13為A或T，且X20為S或T，X42為K或Q，X43為A或S，X60為D或S，X63為S或T，X70為D或E，X77為N或S，X78為L或V，X80為P或S，X83為F或L，且X85為D或T，X104為L或V，且X106為I或V。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列相比，該VL可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X3、X4、X8、X9、X11、X13、X20、X42、X43、X60、X63、X70、X77、X78、X80、X83、X85、X104和/或X106處的胺基酸取代。
例如，該VL可包含SEQ ID NO：16或26所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該HCDR1可包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，該HCDR3可包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該HCDR1可包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含如SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列，該HCDR3可包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含如SEQ ID
NO：8所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含VH和VL，且該VH可包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，該VL可包含SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含VH和VL，且該VH可包含SEQ ID NO：15或25所示的胺基酸序列，該VL可包含SEQ ID NO：16或26所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含VH和VL，且該VH可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，該VL可包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含VH和VL，且該VH可包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，該VL可包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含VH和VL，且該VH可包含SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，該VL可包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區可以來自IgG。例如，該重鏈恆定區可以來自人IgG。該重鏈恆定區可以來自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。例如，該重鏈恆定區可以來自人IgG4。與天然的人IgG4相比，該重鏈恆定區可以是胺基酸突變的。例如，該重鏈恆定區可
以是IgG4進行S228P胺基酸點突變後的序列。例如，該重鏈恆定區可以包含SEQ ID NO：77或81所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈，該重鏈可包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈，該重鏈可包含SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區可以來自輕鏈λ和輕鏈κ。例如，該輕鏈恆定區可以包含SEQ ID NO：78或82所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈，該輕鏈可包含SEQ ID NO：80或84所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈和輕鏈，該重鏈可包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列，該輕鏈可包含SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈和輕鏈，該重鏈可包含SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列，該輕鏈可包含SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈和輕鏈，該重鏈可包含SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列，該輕鏈可包含SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列。
本申請的分離的抗原結合蛋白可包含HCDR3，該HCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示的VH的CDR3。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR3，該HCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：41或51所示的VH的CDR3。例如，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR3，該HCDR3可包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR2，該HCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示的VH的CDR2。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR2，該HCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：41或51所示的VH的CDR2。例如，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR2，該HCDR2可包含如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1，該HCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示的VH的CDR1。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1，該HCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：41或51所示的VH的CDR1。例如，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1，該HCDR1可包含如SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示的VH的CDR1，該HCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示的VH的CDR2，該HCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示的VH的CDR3。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：41或51所示的VH的
CDR1，該HCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：41或51所示的VH的CDR2，該HCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：41或51所示的VH的CDR3。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：41所示的VH的CDR1，可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：41所示的VH的CDR2，且包含胺基酸序列如SEQ ID NO：41所示的VH的CDR3。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：51所示的VH的CDR1，可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：51所示的VH的CDR2，且包含胺基酸序列如SEQ ID NO：51所示的VH的CDR3。
例如，本申請所述分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含如SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含H-FR1，該H-FR1可包含如SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列：QVQLX5QSGAEX11X12X13PGASVKX20SCKAX25GFTFI(SEQ ID NO：58)，其中，X5為V或Q，X11為L或V，X12為K或V，X13為K或R，X20為L或V，且X25為L或S。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列相比，該H-FR1可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X5、X11、X12、X13、X20和/或X25處的胺基酸取代。
例如，該H-FR1可包含如SEQ ID NO：30或43所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含H-FR2，該H-FR2可包含如SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列：WVRQX5PX7X8GLEWIG(SEQ ID NO：60)，其中，X5為A或T，X7為V或G，且X8為H或Q。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列相比，該H-FR2可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X5和/或X8處的胺基酸取代。
例如，該H-FR2可包含如SEQ ID NO：31或44所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含H-FR3，該H-FR3可包含如SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列：X1ATLX5ADISX10X11TAX14MEX17SX19LX21SX23DX25AVYYCTR(SEQ ID NO：62)，其中，X1為K或R，X5為I或T，X10為T或I，X11為N或S，X14為S或Y，X17為L或V，X19為R或S，X21為R或T，X23為D或E，且X25為S或T。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列相比，該H-FR3可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X1、X5、X10、X11、X14、X17、X19、X21、X23和/或X25處的胺基酸取代。
例如，該H-FR3可包含如SEQ ID NO：32或45所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含H-FR4，該H-FR4可包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列：WGX3GTTVTVSS(SEQ ID NO：64)，其中，X3為A或Q。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列相比，該H-FR4可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X3處的胺基酸取代。
例如，該H-FR4可包含如SEQ ID NO：33或46所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區VH，該VH可包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列：
(SEQ ID NO：66)，其中，X5為V或Q，X11為L或V，X12為K或V，X13為K或R，X20為L或V，X25為L或S，X40為A或T，X42為V或G，X43為H或Q，X67為K或R，X71為I或T，X76為T或I，X77為N或S，X80為S或Y，X83為L或V，X85為R或S，X87為R或T，X89為D或E，X91為S或T，且X112為A或Q。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列相比，該VH可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X5、X11、X12、X13、X20、X25、X40、X42、X43、X67、X71、X76、X77、X80、X83、X85、X87、X89、X91和/或X112處的胺基酸取代。
例如，該VH可包含SEQ ID NO：41或51所示的胺基酸序列。
本申請的分離的抗原結合蛋白可包含LCDR3，該LCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示的VL的CDR3。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR3，該LCDR3可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：52或42所示的VL的CDR3。例如，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR3，該LCDR3可包含如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR2，該LCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示的VL的CDR2。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR2，該LCDR2可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：52或42所示的VL的CDR2。例如，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR2，該LCDR2可包含如SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR1，該LCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示的VL的CDR1。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR1，該LCDR1可包含胺基酸序列如SEQ ID NO：52或42所示的VL的CDR1。例如，該分離的抗原結合蛋白可包含LCDR1，該LCDR1可包含如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
例如，本申請所述分離的抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含如SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含L-FR1，該L-FR1可包含如SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列：DVX3MTQX7PLSLPVX14LGX17X18ASISC(SEQ ID NO：70)，其中，X3為L或V，X7為S或T，X14為S或T，X17為D或Q，且X18為Q或P。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列相比，該L-FR1可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X3、X7、X14、X17和/或X18處的胺基酸取代。
例如，該L-FR1可包含如SEQ ID NO：37或47所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含L-FR2，該L-FR2可包含如SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列：WYX3QX5PGQSPX11LLIY(SEQ ID NO：72)，其中，X3為L或Q，X5為K或R，且X11為K或R。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列相比，該L-FR2可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X3、X5和/或X11處的胺基酸取代。
例如，該L-FR2可包含如SEQ ID NO：38或48所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含L-FR3，該L-FR3可包含如SEQ ID NO：74所示的胺基酸序列：
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEX24EDX27GVYYC(SEQ ID NO：74)，其中，X24為A或Q，且X27為L或V。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列相比，該L-FR3可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X24和/或X27處的胺基酸取代。
例如，該L-FR3可包含如SEQ ID NO：39或49所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白包可含L-FR4，該L-FR4可包含如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列：FGX3GTKLEIK(SEQ ID NO：76)，其中，X3為G或Q。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列相比，該L-FR4可至少包含在X3處的胺基酸取代。
例如，該L-FR4可包含如SEQ ID NO：40或50所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈可變區VL，該VL可包含SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列：
(SEQ ID NO：68)，其中X3為L或V，X7為S或T，X14為S或T，X17為D或Q，X18為Q或P，X42為L或Q，X44為K或R，且X50為K或R，X85為A或Q，X88為L或V，且X105為G或Q。例如，可根據Chothia規則劃分。
在某些情形中，與SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列相比，該VL可至少包含在選自下組位置處的胺基酸取代：在X3、X7、X14、X17、X18、X42、X44、X50、X85、X88和/或X105處的胺基酸取代。
例如，該VL可包含SEQ ID NO：42或52所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該HCDR1可包含如SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，該HCDR3可包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含如SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含VH和VL，且該VH可包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，該VL可包含SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含VH和VL，且該VH可包含SEQ ID NO：41或51所示的胺基酸序列，該VL可包含SEQ ID NO：42或52所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含VH和VL，且該VH可包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，該VL可包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含VH和VL，且該VH可包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列，該VL可包含SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區可以來自IgG。例如，該重鏈恆定區可以來自人IgG。該重鏈恆定區可以來自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。例如，該重鏈恆定區可以來自人IgG4。與天然的人IgG4相比，該重鏈恆定區可以是胺基酸突變的。例如，該重鏈恆定區可以是IgG4進行S228P胺基酸點突變後的序列。例如，該重鏈恆定區可以包含SEQ ID NO：77或81所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈，該重鏈可包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈，該重鏈可包含SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區可以來自輕鏈λ和輕鏈κ。例如，該輕鏈恆定區可以包含SEQ ID NO：78或82所示的胺基酸序列。
在本申請中，該分離的抗原結合蛋白可包含輕鏈，該輕鏈可包含SEQ ID NO：80或84所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈和輕鏈，該重鏈可包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列，該輕鏈可包含SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈和輕鏈，該重鏈可包含SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列，該輕鏈可包含SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列。
例如，該分離的抗原結合蛋白可包含重鏈和輕鏈，該重鏈可包含SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列，該輕鏈可包含SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗原結合蛋白每個重鏈或輕鏈胺基酸序列的一部分與來自特定物種的抗體中相應胺基酸序列同源，或者屬於特定的類別。例如，輕鏈和重鏈的可變區及恆定部分均來自一個動物物種(如人)的抗體的可變區及恆定區。在本申請中，該同源物可以為，與該蛋白質和/或該多肽(例如，特異性結合PD-L1蛋白的抗體或其片段)的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。
在本申請中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域具有通常知識者可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。該同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA算法的描述可以參見W．R．Pearson和D．J．Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．)，85：2444-2448，1988；和D．J．Lipman和W．R．Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。對BLAST算法的描述可參見S．Altschul、W．Gish、W．Miller、E．W．Myers和D．Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410，1990。
檢測方法
可藉由本領域已知的各種測定鑑別、篩選或表徵本申請所述的PD-1抗原結合蛋白的物理/化學特性和/或生物活性。
在一個方面，例如可藉由已知方法諸如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫印跡(例如，蛋白質印跡)、流式細胞術(例如，FACS)、免疫組織化學、免疫螢光等來測試本申請抗原結合蛋白的抗原結合活性。
核酸、載體、宿主細胞和製備方法
在另一個方面，本申請還提供了分離的一種或多種核酸分子。該一種或多種核酸分子可編碼本申請所述的抗原結合蛋白。例如，該一種或多種核酸分子中的每一個核酸分子可以編碼完整的該抗原結合蛋白，也可以編碼其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、輕鏈或重鏈中的一種或多種)。
本申請所述的核酸分子可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的，(ii)藉由選殖重組產生的，(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。
在本申請中，可以藉由本領域已知的多種方法來製備編碼該抗體、其抗原結合片段的核酸，這些方法包括但不限於，採用限制性片段操作或採用合成性寡核苷酸的重疊延伸PCR。
在另一個方面，本申請提供了一種或多種載體，其包含本申請所述的一種或多種核酸分子。每種載體中可包含一種或多種該核酸分子。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選
擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。例如，該載體為表達載體。
在另一個方面，本申請提供了宿主細胞，該宿主細胞可包含本申請所述的一種或多種核酸分子和/或本申請所述的一種或多種載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含一個或一種本申請所述的核酸分子或載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含多個(例如，2個或以上)或多種(例如，2種或以上)本申請所述的核酸分子或載體
在另一個方面，本申請提供了製備該抗體或其抗原結合片段的方法。該方法可包括，在使得該抗體或其抗原結合片段表達的條件下，培養該本申請所述的宿主細胞。例如，可藉由使用適當的培養基、適當的溫度和培養時間等，這些方法是所屬技術領域具有通常知識者所瞭解的。
醫藥組成物、方法、用途
在另一個方面，本申請提供了一種醫藥組成物，其可包含本申請所述的抗原結合蛋白，該多肽，該核酸分子，該載體，該宿主細胞，以及視需要地藥學上可接受的載體。該藥學上可接受的佐劑在所採用的劑量和濃度下對接受者無毒性，本申請中的醫藥組成物還可含有多於一種活性化合物，通常為不會不利地影響彼此的具有互補活性的那些活性化合物。此類藥物的類型和有效量取決於例如製劑中存在的拮抗劑的量和類型，以及受試者的臨床參數。
該醫藥組成物可以用於抑制腫瘤生長。例如，本申請的醫藥組成物可以抑制或延緩疾病的發展或進展，可以減小腫瘤大小(甚至基本消除腫瘤)，和/或可以減輕和/或穩定疾病狀態。
本申請所述的醫藥組成物可以包含預防和/或治療有效量的該抗體、其抗原結合片段。該預防和/或治療有效量是能夠預防和/或治療(至少部分治療)患有或具有發展風險的受試者中的疾病或病症和/或其任何併發症而所需的劑量。
另一方面，本申請提供了該抗原結合蛋白和/或該融合蛋白在製備藥物中的用途。該藥物用於治療癌症，抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。在某些實施方式中，該腫瘤或癌症為PD-L1表達異常和/或PD-1表達異常的腫瘤或癌症。在某些實施方式中，該腫瘤包括PD-1或PD-L1高表達的腫瘤。在某些實施方式中，該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。在某些實施方式中，該腫瘤包括黑色素瘤、肺癌、腎癌、食管癌、頭頸癌、淋巴瘤、肝癌和/或胃癌。
另一方面，本申請提供了抑制PD-L1與PD-1結合的方法，包括施用本申請所述的抗原結合蛋白和/或該多肽。例如，該方法可以是離體或體外方法。例如，該方法可以是非治療目的的方法。在某些情形中，該方法可包括使生物樣品與本申請所述的抗原結合蛋白和/或PD-1在容許該抗原結合蛋白和/或PD-1結合PD-L1的條件下接觸，檢測在該抗原結合蛋白與PD-L1之間是否形成複合物，和檢測PD-1與PD-L1之間是否形成複合物。
另一方面，本申請提供了抑制PD-L2與PD-1結合的方法，包括施用本申請所述的抗原結合蛋白和/或該多肽。例如，該方法可以是離體或體外方法。例如，該方法可以是非治療目的的方法。在某些情形中，該方法可包括使生物樣品與本申請所述的抗原結合蛋白和/或PD-1在容許該抗原結合蛋白和/或PD-1結合PD-L2的條件下接觸，檢測在該抗原結合蛋白與PD-L2之間是否形成複合物，和檢測PD-1與PD-L2之間是否形成複合物。
另一方面，本申請提供了刺激免疫細胞分泌細胞因子的方法，其包括施用該分離的抗原結合蛋白和/或該多肽。該細胞因子可以是IL-2。該免疫細胞可以是淋巴細胞。例如，T淋巴細胞。例如，該方法可以是離體或體外方法。例如，該方法可以是非治療目的的方法。
另一方面，本申請提供了一種用於檢測PD-1蛋白的存在和/或含量的方法，其包括施用該分離的抗原結合蛋白和/或該多肽。例如，該方法可以是離體或體外方法。例如，該方法可以是非治療目的的方法。
本申請還提供了抗原結合蛋白在診斷患有腫瘤或癌症的受試者的方法中的用途，該方法包括：藉由使樣品與本申請的抗原結合蛋白接觸並檢測結合的抗體的存在來確定獲自受試者的樣品中PD-1的存在或表達水平。
另一方面，本申請提供了一種嵌合抗原受體(CAR)，其可以包含本申請所述的核酸分子或本申請所述的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請提供了一種抗體藥物偶聯物，其可以包含細胞毒性劑，以及本申請所述的抗原結合片段。抗體藥物偶聯物通常是指採用特定的連接子將抗體和小分子細胞毒藥物連接起來，其主要組成成分可以包括抗體、連接子和小分子細胞毒藥物。
另一方面，本申請提供了一種試劑盒，其可以包含本申請所述的抗原結合蛋白，嵌合抗原受體，基因修飾的細胞，抗體藥物偶聯物，和/或本申請所述的醫藥組成物。其可在單一常用容器中包括本申請所述的抗原結合蛋白，嵌合抗原受體，基因修飾的細胞，和/或抗體藥物偶聯物，也可視需要地與一種或多種治療劑組合，視需要地一起配製於醫藥組成物中。
另一方面，本申請提供了一種給藥裝置，它可以用來施用本申請所述的抗原結合蛋白或其醫藥組成物。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的融合蛋白、製備方法和用途等，而不用於限制本申請發明的範圍。
[實施例]
實施例1 抗PD-1的人源化抗體製備與檢測
1.1 融合瘤抗體發現
用Human PD-1,Mouse IgG2a Fc Tag融合蛋白(Acrobiosystem，PD1-H5255a)與pcDNA3.4-hPD-1質粒DNA免疫Balb/c和SJL小鼠各5隻，每次間隔2~3週，3次後用Human PD-1,Mouse IgG2a Fc Tag融合蛋白或CHOK1-hPD-1穩轉細胞株(金斯瑞，M00529)做加強免疫1-3次，採血測效價。效價檢測採用流式細胞儀測定血清與過表達人PD-1蛋白的CHOK1或293T細胞結合，取結合效價高的小鼠脾細胞與骨髓瘤(Sp2/0)細胞進行融合。
利用流式細胞儀從融合板中篩選出與CHOK1-hPD-1細胞特異性結合並能同時阻斷配體PD-L1、PD-L2與細胞CHOK1-hPD1結合的純株，利用有限稀釋法進行亞選殖，最終篩選到可分泌特異性抗體的單純株。採用無血清培養基進行小規模生產純化得到單株抗體做後續鑑定，包含檢測抗體與CHOK1-hPD1的結合能力、對PD-L1、PD-L2與CHOK1-hPD-1結合的阻斷功能以及混合淋巴細胞實驗最終得到候選抗人PD-1單株抗體41D2-2C3D7與46H3A8。經單株抗體測序獲得鼠源融合瘤純株41D2-2C3D7與46H3A8的可變區序列如下：
>41D2-2C3D7重鏈可變區序列
>41D2-2C3D7輕鏈可變區序列
>46H3A8重鏈可變區序列
>46H3A8輕鏈可變區序列
表1 鼠源融合瘤純株41D2-2C3D7重鏈及輕鏈CDR區序列
表2 鼠源融合瘤純株46H3A8重鏈及輕鏈CDR區序列
實施例2 單株抗體人源化
2.1 鼠源融合瘤抗體人源化
藉由序列比對挑選最同源的人Germline抗體(數據來源：IMGT)做為人源化設計框架(輕鏈以IGKV1-9*01，IGKJ4*01為框架，重鏈以IGHV3-21*01，IGHJ5*01，為框架)，對抗體輕重鏈可變區進行Chothia編號[Chothia & Lesk,1987]，定義抗體CDR區：LCDR1(L24-L34)、LCDR2(L50-L56)、LCDR3(L89-L97)、HCDR1(H26-H32)、HCDR2(H52-H56)、HCDR3(H95-H97)，根據序列比對和可變區結構信息對抗體輕重鏈可變區胺基酸進行人源化突變；設計表達載體，基因合成，哺乳細胞表達純化重組抗體，比較人源化抗體和嵌合抗體活性，理化性質的差異，進行1-2輪人源化優化。
Gerrnline抗體序列信息：
IGKV1-9*01
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYP(SEQ ID NO：53)
IGKJ4*01
LTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：54)
IGHV3-21*01
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：55)
IGHJ5*01
NWFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：56)
以下輕重鏈的優化設計都是以上面Germline抗體為框架CDR移植的人源化序列(41D2HzL0和41D2HzH0為嵌合抗體的輕重鏈，41D2HzL4和41D2HzH3為人源化抗體的輕重鏈)。
41D2HzL0輕鏈可變區序列：
41D2HzL4輕鏈可變區序列
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQYSSYPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：26)
41D2HzH0重鏈可變區序列
41D2HzH3重鏈可變區序列
2.2 鼠源融合瘤抗體46H3A8人源化
46H3A8人源化方案同1.2.1，以下輕重鏈的優化設計都是以Germline抗體為框架CDR移植的人源化序列(1910h3hzL0和1910h3hzH0為嵌合抗體的輕重鏈，1910h3hzL3和1910h3hzH4為人源化抗體的輕重鏈)。
1910h3hzL0輕鏈可變區序列
1910h3hzH0重鏈可變區序列
1910h3hzL3輕鏈可變區序列
1910h3hzH4重鏈可變區序列
實施例3 人源化抗體動力學參數測定
(1)採用Octet RED96e(Fortebio)測定人源化抗體1910h3hzL3H4及41D2HzL4H3與人PD-1(Sino Biological，貨號：10377-H08H)的親和力，抗原及抗體均用1xPBST(1xPBS：生工，B548117-0500；0.02%吐溫20：sigma-alorich，P1379)稀釋，抗原使用濃度為100nM，抗體使用濃度為50nM。
(2)樣品上機檢測(Octet Data Acquisition 11.1.0.11)：首先，將樣品加入96孔板(Greiner bio-one，655209)，體系為200μL/well。然後設置軟體參數，板溫設定為30℃，收集標準動力學信號的頻率為5.0HZ。接著，用1xPBST預濕AHC傳感器(Fortébio，貨號：18-0015)10分鐘，然後上機檢測。每個循環包含以下步驟：1)浸入緩衝液60秒；2)檢測抗原是否與傳感器有非特異性結合；3)10mM pH1.7的甘胺酸溶液再生；4)浸入緩衝液60秒；5)抗體固化在傳感器上，時間為20秒；6)傳感器浸入緩衝液180秒；7)抗原與抗體結合，時間180秒；8)抗原抗體的解離，時間10分鐘；9)傳感器再生。
(3)數據分析
採用Fortebio的Data Analysis 11.0軟體，對抗原-抗體以1：1的結合方式，測定結合速率(Ka)和解離速率(Kd)，以此計算抗體的平衡解離常數(KD)。結果如下表：
表3 人源化抗體與人PD-1的親和力
從表3得出，1910h3hzL3H4與Pembrolizumab比較，抗體與人PD-1的親和力相當；41D2HzL4H3與人PD-1的親和力較Pembrolizumab提高約4.2倍。說明本申請抗原結合蛋白與PD-1具有較高的結合親和力。
實施例4 本申請抗原結合蛋白與細胞表面人或食蟹猴PD-1的結合活性
收集CHOK-hPD-1(金斯瑞，M00529)細胞或CHOK1-cynoPD-1(金斯瑞，M00572)，用FACS緩衝液(含有2% FBS的PBS)洗一遍後重新懸浮，按1E5/50ul/孔，分液到96孔板(Corning 3799)中。抗體加到上述96孔U型板中，50ul/孔，混勻後4℃孵育1小時。2000rpm離心5分鐘去掉上清，每孔加200ul FACS緩衝液洗一遍。每孔加入1：1000的Alexa Fluor 488二抗(Invitrogen)，100ul/孔，混勻4℃孵育1小時。2000rpm離心5分鐘去掉上清，每孔加200ul FACS buffer洗一遍，30ul FACS buffer重新懸浮上機檢測。實驗結果如下圖1和圖2所示。圖1顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3結合CHOK1細胞表面的人PD-1蛋白。圖2顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3結合CHOK1細胞表面的食蟹猴PD-1蛋白。結果表明1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3與細胞表面人或食蟹猴PD-1的結合活性同Pembrolizumab相當。
實施例5 本申請抗原結合蛋白阻斷細胞表面人PD-1與PD-L1或PD-L2的結合活性
收集CHOK1-hPD-1細胞，用FACS buffer洗一遍後重新懸浮，按1E5/50ul/孔，分液到96孔U型板中。抗體稀釋後加到上述96孔板中，25ul/孔，生物素
化的PD-L1(Sinobiological，貨號10084-H02H-B)(或PD-L2，Acrobiosystem，貨號PD2-H82F6)稀釋後加到上述96孔板中，25ul/孔，混勻後4℃孵育1小時。2000rpm離心5分鐘去掉上清，每孔加200ul FACS buffer洗一遍。每孔加入1：1000的SA-Alexa Fluor 488(Invitrogen cat：S32354)，100ul/孔，混勻4℃孵育30分鐘。2000rpm離心5分鐘去掉上清，每孔加200ul FACS buffer洗一遍，30ul FACS buffer重新懸浮上機檢測。圖3顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3阻斷人PD-L1與CHOK1表面的人PD-1蛋白結合。圖4顯示的是本申請所述抗原結合蛋白1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3阻斷人PD-L2與CHOK1細胞表面的人PD-1蛋白。結果表明1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3阻斷細胞表面人PD-1與PD-L1或PD-L2的結合活性與對照抗體Pembrolizumab相當。說明本申請抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L1或PD-L2結合的活性良好。
實施例6 混合淋巴細胞反應：細胞因子IL2的分泌
使用細胞培養基(1640+2% FBS)復蘇人樹突狀DC細胞，調整DC細胞密度至1*105-1*107細胞/mL，然後加入終濃度為50μg/ml絲裂黴素C，37度避光處理30分鐘後加入10ml培養基終止，400g離心10分鐘，隨後用10mL培養基清洗一遍。梯度稀釋anti-PD1抗體：抗體最高終濃度為2.5μg/mL(配製濃度為10μg/mL)，10倍梯度稀釋(5個濃度點+1個0濃度)，然後相應即包培養板(康寧，貨號：3599)中加入50μL配製好的anti-PD1抗體。收集人外周血淋巴細胞PBMC和絲裂黴素C處理好的DC細胞，調整DC細胞密度至2*105細胞/mL，隨後將細胞加入培養板中，每孔50μL，即每孔DC細胞數為1*104細胞/孔；調整PBMC細胞密度至2*106細胞/mL，隨後將細胞加入培養板中，每孔100μL，即每孔PBMC細胞數為2*105細胞/孔。將細胞培養板置於37℃、5%二
氧化碳細胞培養箱孵育5天，5天後，300g離心5分鐘，收集上清用Human IL-2 ELISA試劑盒(BD，貨號：550611)檢測IL-2含量，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行，數據用GraphPad Prism軟體進行處理。結果如圖5所示，結果表明，人源化抗體1910h3hzL3H4和41D2HzL4H3都能刺激淋巴細胞分泌IL2，活性與Pembrolizumab相似。說明本申請抗原結合蛋白刺激免疫細胞分泌細胞因子的能力較高。
實施例7 抗原結合蛋白的親和力成熟
7.1 酵母展示突變文庫的構建、篩選與單株鑑定
酵母展示突變文庫的構建與篩選
基於41D2HzL4H3，對其抗原結合決定簇(CDR)位點的胺基酸進行隨機突變，構建各CDR區的突變文庫，利用酵母展示技術高通量篩選與抗原特異性結合力強的序列。將41D2HzL4H3的重鏈可變區胺基酸序列按Chothia編碼規則進行編碼，CDR區按Chothia定義。對各分子重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3，設計NNK突變引子進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增各CDR突變文庫基因片段。將各CDR突變文庫基因片段與酵母展示質粒分別轉入釀酒酵母菌株EBY100(購自ATCC)，使各CDR突變文庫以Fab形式展示於酵母表面。同時將41D2HzL4H3的親本序列以Fab形式展示於酵母表面，作為對照使用。
文庫經過培養、誘導後，按1 OD為1.0×107細胞數計算，各取1.5×109細胞，用磁珠分選系統進行第一輪富集。各文庫細胞重新懸浮於含5nM生物素標記的人PD-1(Acro，貨號：PD1-H82E4，簡稱Bitoin hPD-1)的1×PBSA(1×PBS+1%BSA)中孵育30分鐘，洗滌後加入Anti biotin beads(miltenyi，貨號：130-090-485)混勻孵育10分鐘，過磁力柱(Quadro MACS Starting Kit)收集陽
性細胞。陽性細胞經過再次培養、誘導後，各取3.0×107細胞，用1nM Bitoin hPD-1進行第二輪流式分選，收集展示水平高且與抗原結合力強的細胞群；陽性細胞經過再次培養、誘導後，各取2.0×107細胞，用10nM生物素標記的猴PD-1(Acro，貨號：PD1-C82E6，簡稱Bitoin cyno PD-1)進行第三輪流式分選，分選後取細胞測序分析，獲得重鏈各個CDR區突變的單一序列。
突變單株的鑑定
經測序分析，共計獲得42個新的突變序列，對相應單株進行流式染色鑑定，分別與1nM Bitoin hPD-1以及1nM Bitoin cyno PD-1孵育染色，比較不同純株與抗原結合的平均螢光信號強度(MFI)，MFI越高說明與抗原的親和力越強。根據螢光信號的強度，篩選出YC208B3、YC208E2、YC208G3、YC210H2、YC215D1、YC215F3、YC215H3、YC215H5、YC216D5、YC216F1、YC216F2、YC208E1、YC209C5、YC209D4、YC209D6、YC209E6、YC214E2等17個純株進一步測定與人、猴PD-1的結合曲線Ag50。
按列分佈各純株，1.0×105細胞/孔平鋪96孔板，1×PBSA洗滌離心後加入梯度稀釋的人、猴PD-1抗原室溫孵育30分鐘；離心棄上清，加入100μL二抗螢光抗體，避光孵育30分鐘；洗滌後重新懸浮於30μL 1×PBSA，上流式細胞儀讀取相應螢光信號，數據用GraphPad Prism 8軟體進行擬合，計算各純株與人、猴PD-1的結合曲線Ag50，結果見表4。
表4 突變純株與人、猴PD-1的結合測定
根據各純株的序列及與人、猴PD-1的Ag50值等綜合考慮，選取YC208B3、YC208E2、YC208G3、YC209C5、YC209D6、YC215D1、YC215F3、YC215H3、YC216D5、YC216F2等10個純株的突變序列，選用IgG1 LALA D265S亞型構建表達質粒，抗體編號命名為Ab2005Am01-10。
7.2 候選抗體表達
將各純株的重鏈可變區序列與IgG1 LALAD265S融合，輕鏈可變區與Kappa鏈恆定區融合；基因合成後裝入表達載體pcDNA3.4(Life Technologies)。輕、重表達質粒轉入ExpiCHO細胞(ThermoFisher Scientific，A29133)，根據供應商ExpiCHO表達系統方法進行抗體瞬轉表達，過程如下：在培養總體積25mL培養基中，36.5℃，8%二氧化碳濃度下培養Expi CHO細胞到密度6×106/mL，使用ExpiFectamine轉染試劑化轉各10μg抗體輕重鏈表達質粒到細胞；轉染一天後，各取150μL和4mL ExpiCHO增強劑和ExpiCHO輔料添加到培養細胞中，繼續培養至9天，4度，3500轉離心取上清。混合AmMagTM Protein A磁珠(Genscript，L00695)和抗體表達上清，室溫孵育2小時，PBS洗滌兩次棄上清，加入適量沖提緩衝液Protein G or A Sefinose TM Elution buffer(Sangon,C600481)，充分混勻後置於試管架上靜止孵育5分鐘，孵育期間重新懸浮磁珠2-3次，重複沖提2次，沖提後，立即加入適量中和液1M Tris-HCl，pH7.5)Sangon,B548124_中和備用，得到純化的抗體見表5。
表5 候選抗體表達、純化數據
7.3 候選抗體理化性質評估
將抗體Ab2005Am01-10作為候選分子繼續進行理化成藥性評估，具體如下：
SEC-HPLC純度分析
(1)將樣品濃度調整至1mg/mL，混勻，12000rpm離心5min，取上清轉至樣品瓶，放入HPLC樣品盤。設置色譜條件如下：
(2)色譜管柱採用流動相(200mM磷酸鹽緩衝液，pH6.8)平衡後，進樣分析，用色譜軟體進行數據分析，峰面積歸一化法計算各個峰的峰面積百分比，百分比越高說明抗體純度越高。
HIC-HPLC分析
(1)將樣品濃度調整至1mg/ml，離心取上清待測。設置色譜條件如下：
(2)用流動相A(50mM磷酸鹽緩衝液/1M硫酸銨，pH 7.0)和流動相B(50mM磷酸鹽緩衝液，pH 7.0)進行梯度沖提，記錄主峰保留時間，出峰時間短則抗體親水性強。
熔解溫度(Tm)值分析
將樣品濃度調整至1mg/mL，然後按照Protein Thermal ShiftTM Starter Kit說明書，取供試品溶液13μL加入至PCR管內，加入5μL Protein Thermal shiftTM
Buffer，加入2μL 10×染色液，使反應體積為20μL，混勻後，12000rpm離心5min以去除氣泡。將檢測樣品置於PCR儀內，進行樣品分析，記錄樣品的Tm值，Tm值越高表示抗體的熱穩定性越好。
iCIEF分析
取樣品溶液加入到已經充分混勻的以下體系中：1%的甲基纖維素(MC)70μL，尿素5M 80μL，兩性電解質Pharmalyte pH 3-10 8μL，pI marker 5.5和9.5各2μL。補加適當體積超純水至200μL，混勻。離心取上清進樣分析。分析結束後，將結果文件導入ChromPerfect軟體進行圖譜積分處理並計算各峰的等電點以及各峰百分比。
將候選抗體Ab2005Am01-10的理化性質匯總如表6，結果顯示，候選抗體的純度、熱穩定性、親水性等理化指標較為理想，繼續評估候選抗體的體外活性。
表6 候選抗體理化性質分析結果
7.4 候選抗體親和力測定
為了測定候選抗體Ab2005Am01-10與人、猴PD-1的親和力，採用Octet RED96e(Fortebio)測定候選抗體與人PD-1(Acro，貨號：PD-1-H5221)、猴PD-1(Acro，貨號：PD-1-C5223)的親和力，抗原及抗體均用1×PBST(1×PBS：生工，B548117-0500；0.02%吐溫20：sigma，P1379)稀釋，抗原使用濃度為100nM，抗體使用濃度為50nM。將候選抗體樣品按200μL/孔加入96孔板(Greiner bio-one，655209)，設置軟體參數，溫度30℃、收集標準動力學信號的頻率為5.0Hz；用1×PBST預濕AHC傳感器(Fortébio，貨號：18-0015)10分鐘，然後上機檢測。每個循環包含以下步驟：1)浸入緩衝液60s；2)檢測抗原是否與傳感器有
非特異性結合；3)10mM pH1.7的甘胺酸溶液再生；4)浸入緩衝液60s；5)抗體固化在傳感器上，時間為13s；6)傳感器浸入緩衝液180s；7)抗原與抗體結合，時間180s；8)抗原抗體的解離，時間10分鐘；9)傳感器再生。採用Fortebio的Data Analysis 12.0軟體，對抗原-抗體以1：1的結合方式，測定結合速率(Kon)和解離速率(Koff)，以此計算抗體的平衡解離常數(K D )，結果如表7、8。
表7 候選抗體與人PD-1的親和力測定
表8 候選抗體與猴PD-1的親和力測定
由結果可知，候選抗體Ab2005Am06、08、09與人、猴PD-1的親和力比親和力成熟之前的親本抗體強2倍左右，繼續進行體外結合與功能實驗評估。
7.5 候選抗體與細胞表面人、猴PD-1的結合
為測定候選抗體Ab2005Am06、08、09與細胞表面人、猴PD-1的結合，收集CHOK-hPD-1(金斯瑞，M00529)細胞或CHOK-cynoPD-1(金斯瑞，M00572)，用FACS緩衝液(含有2% FBS的PBS)洗一遍後重新懸浮，按1E5/50μL/孔，分液到96孔板中；候選抗體Ab2005Am06、08、09從10μg/mL的起始濃度，4倍梯度稀釋；將稀釋後的抗體溶液加到上述96孔U型板中，50μL/孔，混勻後4℃孵育1小時；2000rpm離心5分鐘去除上清；每孔加入200μL FACS緩
衝液洗一遍，加入1：1000稀釋的Alexa Fluor 488二抗(Invitrogen，A-11013)，100μL/孔，混勻4℃孵育1小時；2000rpm離心5分鐘去除上清；每孔加200μL FACS buffer洗一遍，30μL FACS buffer重新懸浮上機檢測。數據用GraphPad Prism軟體進行處理，實驗結果顯示候選抗體可以與細胞表面人、猴PD-1的結合。圖6顯示的是候選抗體與細胞表面人PD-1的結合結果圖。圖7顯示的是候選抗體與細胞表面猴PD-1的結合結果圖。
7.6 候選抗體激活混合淋巴細胞釋放IL-2功能實驗
為比較候選抗體Ab2005Am06、08、09與親本抗體41D2HzL4H3及對標抗體Pembrolizumab的體外活性，在同一次激活混合淋巴細胞釋放IL-2的實驗中進行，具體如下：使用細胞培養基(1640+2%FBS)復蘇人樹突狀DC細胞，調整DC細胞密度至1×105-1×107cells/mL，然後加入終濃度為50μg/mL絲裂黴素C，37度避光處理30分鐘後加入10mL培養基終止，400g離心10分鐘，隨後用10mL培養基清洗一遍。梯度稀釋抗PD1抗體：抗體最高終濃度為2.5μg/mL(配製濃度為10μg/mL)，10倍梯度稀釋(5個濃度點+1個0濃度點)，然後相應細胞培養板(康寧，貨號：3599)中加入50μL配製好的抗PD1抗體。收集人外周血淋巴細胞PBMC和絲裂黴素C處理好的DC細胞，調整DC細胞密度至2×105cells/mL，隨後將細胞加入培養板中，每孔50μL，即DC細胞數為1×104cells/孔；調整PBMC細胞密度至2×106cells/mL，隨後將細胞加入培養板中，每孔100μL，即PBMC細胞數為2×105cells/孔。將細胞培養板置於37℃、5%二氧化碳細胞培養箱孵育3天，3天後，300g離心5分鐘，收集上清用Human IL-2 ELISA試劑盒(Novus，貨號：VAL110)檢測IL-2含量，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行，數據用GraphPad Prism軟體進行處理，結果顯示候選抗
體可以激活混合淋巴細胞釋放IL-2。圖8顯示的是候選抗體激活混合淋巴細胞釋放IL-2的結果圖。
綜上可知，候選抗體Ab2005Am08(HCDR2為SGGGRY，如SEQ ID NO：85所示；VH為
，如SEQ ID NO：86所示)經過親和力成熟後，相比親本抗體41D2HzL4H3具有更強的人、猴PD-1結合能力，在體外激活混合淋巴細胞釋放IL-2的實驗中優於親本抗體及對標抗體Pembrolizumab；同時，候選抗體Ab2005Am08在表達量、理化性質等方面均符合成藥性標準，具有繼續開發的潛力。
<110> 大陸商上海濟煜醫藥科技有限公司(SHANGHAI JEMINCARE PHARMACEUTICAL CO.,LTD)
大陸商江西濟民可信集團有限公司(JIANGXI JEMINCARE GROUP CO.,LTD.)
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<160> 87
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
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<222> (3)..(3)
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<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> Xaa=Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(93)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<221> misc_feature
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 46H3A8 VL；1910h3hzL3 VL
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
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<222> (11)..(11)
<223> Xaa=Lys或Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<221> mise_feature
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 46H3A8 L-FR3；1910h3hzL3 L-FR3
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<221> misc_feature
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<222> (27)..(27)
<223> Xaa=Leu或Val
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Ile或Val
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 46H3A8 L-FR4；1910h3hzL3 L-FR4
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Gly或Gln
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1910h3hzH4重鏈恆定區
<400> 77
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1910h3hzL3輕鏈恆定區
<400> 78
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1910h3hzH4重鏈
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1910h3hzL3輕鏈
<400> 80
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<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1910D2HzH3重鏈恆定區
<400> 81
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1910D2HzL4輕鏈恆定區
<400> 82
<210> 83
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1910D2HzH3重鏈
<400> 83
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1910D2HzL4輕鏈
<400> 84
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ab2005Am08 HCDR2
<400> 85
<210> 86
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ab2005Am08 VH
<400> 86
<210> 87
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ab2005Am08重鏈
<400> 87
Claims (24)
- 一種分離的抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：(1)能夠以1×108M或更低的K D 值結合源自靈長類動物的PD-1蛋白；(2)能夠阻斷PD-1蛋白與PD-L1蛋白之間的結合；(3)能夠阻斷PD-1蛋白與PD-L2蛋白之間的結合；和(4)能夠刺激免疫細胞分泌細胞因子。
- 如請求項1所述的分離的抗原結合蛋白，其包括抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項1或2所述的分離的抗原結合蛋白，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：27中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：85中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：29中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至3中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且該HCDR1、HCDR2和HCDR3選自以下任一組胺基酸序列：(1)HCDR1：SEQ ID NO：1，HCDR2：SEQ ID NO：2和HCDR3：SEQ ID NO：3；(2)HCDR1：SEQ ID NO：27，HCDR2：SEQ ID NO：28和HCDR3：SEQ ID NO：29；和(3)HCDR1：SEQ ID NO：1，HCDR2：SEQ ID NO：85和HCDR3：SEQ ID NO：3。
- 如請求項1至4中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH，且該VH包含SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至5中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH，且該VH包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：86中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至6中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體重鏈HC，且該HC包含SEQ ID NO：79、83或87所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至7中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該LCDR1包含SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：34中任一項所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：35中任一項所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：36中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至8中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，且該LCDR1、LCDR2和LCDR3選自以下任一組胺基酸序列：(1)LCDR1：SEQ ID NO：34，LCDR2：SEQ ID NO：35和LCDR3：SEQ ID NO：36；和(2)LCDR1：SEQ ID NO：8，LCDR2：SEQ ID NO：9和LCDR3：SEQ ID NO：10。
- 如請求項1至9中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含輕鏈可變區VL，且該VL包含SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68所示的胺基酸 序列。
- 如請求項1至10中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含輕鏈可變區VL，且該VL包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：52中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至11中任一項所述的分離的抗原結合蛋白，其包含抗體輕鏈LC，且該LC包含SEQ ID NO：80或84所示的胺基酸序列。
- 一種多肽，其包含如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
- 一種免疫綴合物，其包含如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白或如請求項13所述的多肽。
- 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白。
- 一種載體，其包含如請求項15所述的核酸分子。
- 一種細胞，其包含如請求項15所述的核酸分子或如請求項16所述的載體。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項13所述的多肽、如請求項14所述的免疫綴合物、如請求項15所述的核酸分子、如請求項16所述的載體和/或如請求項17所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的載體。
- 一種如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項13所述的多肽、如請求項14所述的免疫綴合物、如請求項15所述的核酸分子、如請求項16所述的載體、如請求項17所述的細胞和/或如請求項18 所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療腫瘤。
- 如請求項19所述的用途，其中該腫瘤包括PD-1或PD-L1高表達的腫瘤。
- 如請求項19或20所述的用途，其中該腫瘤包括實體瘤和/或非實體瘤。
- 如請求項19至21中任一項所述的用途，其中該腫瘤包括黑色素瘤、肺癌、腎癌、食管癌、頭頸癌、淋巴瘤、肝癌和/或胃癌。
- 一種抑制PD-1蛋白與PD-L1蛋白和/或PD-L2蛋白結合的方法、刺激免疫細胞分泌細胞因子的方法和/或檢測PD-1蛋白的存在和/或含量的方法，該方法包括施用如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項13所述的多肽、如請求項14所述的免疫綴合物、如請求項15所述的核酸分子、如請求項16所述的載體、如請求項17所述的細胞和/或如請求項18所述的醫藥組成物。
- 一種試劑盒，其包含如請求項1至12中任一項所述的分離的抗原結合蛋白、如請求項13所述的多肽、如請求項14所述的免疫綴合物、如請求項15所述的核酸分子、如請求項16所述的載體、如請求項17所述的細胞和/或如請求項18所述的醫藥組成物。
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