WO2024032664A1

WO2024032664A1 - 一种靶向pd-l1和vegf的抗体及其应用

Info

Publication number: WO2024032664A1
Application number: PCT/CN2023/112026
Authority: WO
Inventors: 王宗达; 顾春银; 邓俗俊
Original assignee: 上海济煜医药科技有限公司
Priority date: 2022-08-09
Filing date: 2023-08-09
Publication date: 2024-02-15

Abstract

提供了一种靶向PD-L1和VEGF的抗体及其应用。也提供了一种抗原结合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，所述第一靶向部分具有特异性结合PD-L1的功能，所述第二靶向部分具有特异性结合VEGF的功能。

Description

一种靶向PD-L1和VEGF的抗体及其应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向PD-L1和VEGF的抗体及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是目前全球范围内严重威胁人类健康的疾病，是疾病导致人类死亡的主要类型。随着国内人口老龄化的日渐加剧，肿瘤发生率不断提高，有效的治疗药物亟待开发。

免疫检查点药物的开发为近年来研究热点。程序性死亡受体1(programmed death 1)简称PD-1广泛表达于免疫细胞，是一种重要的免疫抑制分子。PD-1的主要配体为PD-L1，PD-L1主要表达于肿瘤细胞表面。配体PD-L1和受体PD-1结合后，在肿瘤微环境中抑制T细胞活化，导致T细胞等免疫系统无法正常杀伤肿瘤细胞，进而实现免疫逃逸。PD-1或PD-L1免疫疗法的作用机制是针对PD-1或PD-L1设计特定的单克隆抗体，阻止PD-1和PD-L1的识别，恢复T细胞正常功能，从而使T细胞有效杀伤肿瘤细胞。目前已开发出多款针对这一信号通路的治疗性抗体，如帕博利珠单抗(Pembrolizumab)和纳武利尤单抗(Nivolumab)，但在治疗过程中普遍存在响应率低，易产生耐药性等现象。

另外，在肿瘤的生长过程中表皮生长因子VEGF能特异性刺激内皮细胞的增殖，在多种类型的肿瘤血管生成中起关键作用。VEGF与表皮生长因子受体VEGFR结合后能够通过下游信号通路介导胞内相关蛋白基因转录表达，促进血管内皮细胞增殖。目前已开发出诸如贝伐单抗(Bevacizumab)等多款靶向人VEGF人源化单克隆抗体，但在治疗过程中仍存在响应率低，易产生耐药性等现象。

同时，目前在售的治疗性抗体药绝大多数为单克隆抗体，抗体特异性针对单一靶点，治疗过程中更倾向于出现响应率低，易产生耐药性等现象。因此，本领域亟需一种结构稳定、疗效好且适合大规模工业化生产的靶向PD-L1和VEGF多特异性抗体。

发明内容

本申请所述的抗原结合蛋白具有至少一种选自下组的特点：易表达纯化、与VEGF结合亲和活性高、能够有效调控PD-1和PD-L1的信号，和抑制肿瘤生长。

一方面，本申请提供了一种抗原结合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，所述第一靶向部分包含特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段，所述第二靶向部分包含特异性结合VEGF的抗体或其抗原结合片段；

其中，所述第一靶向部分包含抗体或其抗原结合片段的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；

其中，所述第一靶向部分包含抗体或其抗原结合片段的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述LCDR1包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；

其中，所述第二靶向部分包含纳米抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列。

一方面，本申请提供了一种特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链可变区CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；所述LCDR1包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区VH，所述VH包含选自SEQ ID NO：2、16、17、18、19和20中任一项所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段包含抗体轻链可变区VL，所述VL包含选自SEQ ID NO：1、13、14和15中任一项所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区VH和抗体轻链可变区VL，其中所述VH包含选自SEQ ID NO：2、16、17、18、19和20中任一项所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；所述VL包含选自SEQ ID NO：1、13、14和15中任一项所示的氨基酸序列或与该序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链恒定区，例如所述抗体重链恒定区源自IgG恒定区，例如包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段还包含轻链恒定区，例如所述抗体轻链恒定区源自IgG恒定区，例如包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：30所示的重链，SEQ ID NO：31所示的轻链。

一方面，本申请提供了特异性结合VEGF的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是纳米抗体。

在一个实施方案中，所述纳米抗体包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述纳米抗体包含抗体重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，或与所述序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述特异性结合VEGF的抗体或其抗原结合片段包含抗体重链恒定区，所述抗体重链恒定区源自IgG恒定区，例如包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述特异性结合VEGF的抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。

一方面，本申请提供了一种核酸，其编码本申请的抗原结合蛋白。

一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请的核酸。

一方面，本申请提供了一种免疫缀合物，其包含本申请的抗原结合蛋白。

一方面，本申请提供了一种细胞，其包含本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、和/或本申请的免疫缀合物。

一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、和/或本申请的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。

一方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、和/或本申请的药物组合物。

一方面，本申请提供了一种制备如本申请的抗原结合蛋白的方法，其包括在使得所述抗原结合蛋白能够表达的条件下培养如本申请的细胞。

一方面，本申请提供了一种本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物、和/或本申请的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。

一方面，本申请提供了一种本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物、和/或本申请的试剂盒用于治疗。

一方面，本申请提供了一种本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物、和/或本申请的试剂盒用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。

一方面，本申请提供了一种用于预防、缓解和/或治疗肿瘤的方法，包括向受试者施用有效量的本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物、和/或本申请的试剂盒。

一方面，本申请提供了一种抑制PD-1蛋白与PD-L1蛋白和/或PD-L2蛋白结合，和/或抑制VEGF蛋白与VEGFR蛋白结合的方法，所述方法包含施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物、和/或本申请的试剂盒。

一种调控免疫反应的方法，所述方法包含施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物、和/或本申请的试剂盒。

本申请双特异性抗体分子结构可以为IgG-VHH，使用该形式的针对PD-1或PD-L1与VEGF靶点的双特异性抗体可以有效的避免抗体轻重链的错配，分子稳定性更高，更适合于工业化生产。同时本申请的抗原结合分子可以阻断两个信号通路，以及具有肿瘤微环境的靶向性，可以有更好的安全性及治疗效果。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：

图1A-1B分别显示的是候选抗体与细胞表面人(图1A)或食蟹猴(图1B)PD-L1的结合活性。

图2A-2B分别显示的是候选抗体阻断HEK293-hPD-L1细胞(图2A)或CHOK1-cynoPD-L1细胞(图2B)表面抗原PD-L1与PD-1的结合活性。

图3显示的是候选抗体诱导的混合淋巴细胞反应，以及细胞因子IL2的分泌结果。

图4显示的是酵母细胞壁表面展示单域抗体的构建方案。

图5显示的是单域抗体阻断VEGF165和人VEGFR2的结合结果。

图6显示的是Ab1910VE18和Ab1910VE21抗体的阻断结果。

图7A-7B分别显示的是双特异性抗体Tab1，Tab2与HEK293-hPD-L1细胞(图7A)或CHOK1-cynoPD-L1细胞(图7B)表面抗原PD-L1的结合结果。

图8A-8B分别显示的是双特异性抗体Tab1，Tab2阻断HEK293-hPD-L1细胞(图8A)或CHOK1-cynoPD-L1细胞(图8B)表面抗原PD-L1与PD-1的结合结果。

图9显示的是双特异性抗体与VEGFR竞争结合抗原VEGF165的活性结果。

图10显示的是双功能抗体与VEGFR2竞争结合抗原VEGF165的活性结果。

图11显示的是本申请抗体刺激混合淋巴细胞反应，促进细胞因子IL2的分泌的结果。

图12显示本申请双特异性抗体抑制肿瘤的作用的结果。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

在本申请中，术语“第一靶向部分”和“第二靶向部分”通常是指本申请抗原结合蛋白中能够靶向特定分子的部分。例如，所述靶向部分可以包括但不限于抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子和任何其它天然的或非天然的配体。

在本申请中，术语“连接子”通常是指接合或连接2个或更多个离散的分开的单体域的部分。连接子可以是肽连接子，其包含通过肽键连接的2个或更多氨基酸残基的多肽，且用于连接一个或多个抗原结合部分。例如，所述连接子可以是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，x＝3且n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，或x＝4且n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，所述连接子可以是ADIEGRMD。

在本申请中，术语“VEGF”通常是指血管内皮细胞生长因子，包括其天然存在的等位基因形式和加工形式。所述VEGF可包括VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F和/或PlGF。在本申请中，所述VEGF可以为VEGF-A，也可称为VEGF165。VEGF-A可结合受体酪氨酸激酶，即VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)、VEGFR3和Neuropilin-1(NRP-1)。VEGF165与VEGFR2结合后通过下游PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK信号通路介导胞内相关蛋白基因转录表达，促进血管内皮细胞增殖。术语“VEGF”还可以指来自非人物种诸如小鼠，大鼠或灵长类动物的VEGF。在本申请中，来自特定物种的VEGF可以表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF。通常，VEGF可以指人VEGF。术语“VEGF”还用于指完整VEGF的截短形式或片段，还包括VEGF的功能性变体、同工型、物种同源物、衍生物、类似物，以及具有至少一个与VEGF共同表位的类似物。VEGF序列是本领域已知的。例如，示例性的全长人VEGFA蛋白序列可在NCBI登录号NP_001020537、NP_001020538、NP_001020539、NP_001020540或NP_001020541下找到。

在本申请中，术语“PD-L1”通常是指程序性死亡配体1蛋白。PD-L1也称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，并且是由(人类中)CD274基因编码的蛋白。PD-L1可以结合其受体，例如程序性死亡1(PD-1)。PD-L1和PD-1的络合通过抑制T细胞增殖和产生细胞因子IL-2和IFN-γ发挥免疫抑制作用。术语“PD-L1”涵盖任何脊椎动物来源的任何天然PD-L1或经修饰的PD-1，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类(例如，人或猴)和啮齿类(例如，小鼠或大鼠)。所述术语涵盖“全长”、未加工的PD-L1以及由细胞中的加工所产生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作为跨膜蛋白或作为可溶性蛋白存在。所述术语还涵盖天然存在的PD-L1的变体，例如剪接变体或等位基因变体。PD-L1的基本结构包括4个结构域：胞外Ig样V型结构域和Ig样C2型结构域、跨膜结构域以及细胞质结构域。PD-L1序列是本领域已知的。例如可在NCBI Gene ID No.29126下找到关于人PD-L1基因(包括基因组DNA序列)的信息。示例性的全长人PD-L1蛋白的氨基酸序列可在NCBI登录号NP_054862或UniProt登录号Q9NZQ7下找到。

在本申请中，术语“PD-1”通常是指程序性死亡1受体，也可称为“程序性死亡1”、“CD279”、“分化簇279”、“PD1”、“PDCD1”或“CD297”。PD-1蛋白通常包括胞外IgV域、跨膜区和胞内尾。PD-1通常在T细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、活化的单核细胞和树突细胞(DC)上表达。PD-1可以结合其配体PD-L1和PD-L2。术语“PD-1”涵盖任何脊椎动物来源的任何天然PD-1或经修饰的PD-1，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类(例如，人或猴)和啮齿类(例如，小鼠或大鼠)。所述术语涵盖“全长”、未加工的PD-1以及由细胞中的加工所产生的任何形式的PD-1。PD-1可作为跨膜蛋白或作为可溶性蛋白存在。“PD-1”包括完整的PD-1及其片段，还包括PD-1的功能性变体、同工型、物种同源物、衍生物、类似物，以及具有至少一个与PD-1共同表位的类似物。PD-1序列是本领域已知的。例如，示例性的全长人PD-1蛋白序列可在NCBI登录号NP_005009.2下找到，示例性的全长食蟹猴的PD-1蛋白序列可在NCBI登录号NP_001271065或Uniprot登录号B0LAJ3下找到。

在本申请中，术语“PD-L2”通常是指程序性死亡配体2蛋白，也可称为“程序性死亡2”、“CD273”、“分化簇273”、“B7-DC”或“PDCD1LG2”。术语“PD-L2”涵盖任何脊椎动物来源的任何天然PD-L2或经修饰的PD-L2，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类(例如，人或猴)和啮齿类(例如，小鼠或大鼠)。所述术语涵盖“全长”、未加工的PD-1以及由细胞中的加工所产生的任何形式的PD-L2。PD-L2可作为跨膜蛋白或作为可溶性蛋白存在。“PD-L2”包括完整的PD-L2及其片段，还包括PD-L2的功能性变体、同工型、物种同源物、衍生物、类似物，以及具有至少一个与PD-L2共同表位的类似物。PD-L2序列是本领域已知的。例如，示例性的全长人PD-L2蛋白序列可在NCBI登录号NP_079515.2下找到。

在本申请中，术语“VEGFR”通常是指血管内皮细胞生长因子受体，包括其天然存在的等位基因形式和加工形式。VEGFR可包括VEGFR1、CEGFR2和VEGFR3，以及其他选择性剪接变体。VEGFR可以是膜结合的或可溶的。术语“VEGFR”还可以指来自非人物种诸如小鼠，大鼠或灵长类动物的VEGFR。在本申请中，来自特定物种的VEGFR可以表示如下，hVEGFR表示人VEGFR，mVEGFR表示鼠VEGFR。通常，VEGFR可以指人VEGFR。术语“VEGFR”还用于指完整VEGFR的截短形式或片段，还包括VEGFR的功能性变体、同工型、物种同源物、衍生物、类似物，以及具有至少一个与VEGFR共同表位的类似物。VEGFR序列是本领域已知的。例如，示例性的全长人VEGFR2蛋白序列可在NCBI登录号NP_002244下找到。

在本申请中，当说到蛋白质、多肽和/或核酸分子时，还包括该蛋白质、多肽和/或核酸分子的同源物。在本申请中，术语“同源物”通常是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“同源性”可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。

在本申请中，术语“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。抗原结合蛋白可典型地包含抗体轻链可变区(VL)、抗体重链可变区(VH)或上述两者，及其功能性片段。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。

在本申请中，术语“抗体”通常是指对指定蛋白质或肽或其片段有反应性的免疫球蛋白。抗体可以是来自任何类的抗体，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，及来自任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)的抗体。抗体可具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的重链恒定区。抗体还可具有选自例如kappa(κ)或lambda(λ)的轻链。本申请的抗体可衍生自任何物种。

在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体分子的某部分，该部分包含氨基酸残基，该氨基酸残基与抗原相互作用并赋予抗体对于抗原的特异性和亲和力。抗原结合片段的实例可包括但不限于Fab，Fab’，F(ab)₂，Fv片段，F(ab’)₂，scFv，di-scFv和/或dAb。在本申请中，术语“Fab”通常是指含有重链可变结构域和轻链可变结构域的片段，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)；术语“Fab’”通常是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab的片段；术语“F(ab')₂”通常是指Fab’的二聚体，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fv”通常是指含有完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段。在某些情形中，该片段可以由一个重链可变区和一个轻链可变区以紧密非共价结合的二聚体组成；术语“dsFv”通常是指二硫键稳定的Fv片段，其单个轻链可变区与单个重链可变区之间的键是二硫键。术语“dAb片段”通常是指由VH结构域组成的抗体片段。在本申请中，术语“scFv”通常是指抗体的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域通过柔性肽连接子共价连接配对形成的单价分子；此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-连接子-VH-COOH或NH₂-VH-连接子-VL-COOH。在本申请中，术语“VHH”通常是指包含重链抗体的可变抗原结合结构域的抗体。VHH也可称为纳米抗体。

在本申请中，术语“可变区”或“可变结构域”通常是指参与抗体与抗原的结合的抗体重链或轻链的结构域。在本申请中，术语“可变”通常是指，抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈，形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链可变区和重链可变区中的三个区段，被称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)，分别为LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。可变域中更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(H-FR1，H-FR2，H-FR3，H-FR4，L-FR1，L-FR2，L-FR3，L-FR4)，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDR结构环区连接。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点。

在本领域中，可以通过多种方法来编码抗体的可变区或划分抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat编号方案和定义规则，基于结构环区域位置的Chothia编号方案和定义规则，efranc等人的基于种系V基因的氨基酸序列比对的IMGT编号方案和定义规则，还有Honneger’s编号方案(AHo’s)，Martin编号方案，Gelfand编号方案等。

在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。

在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本(例如小鼠来源)抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。

在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。

在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指将人类编码抗体的基因转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达的抗体。抗体所有部分(包括抗体的可变区和恒定区)均由人类来源的基因所编码。本领域获得全人源抗体的方法可以有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术和RNA-多肽技术等。

在本申请中，术语“结合”、“特异性结合”或“对…特异性的”通常是指可测量且可再现的相互作用，诸如抗原和抗体之间的结合，其可以确定在存在分子(包括生物学分子)的异质群体的情况中靶物的存在。例如，抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。例如，特异性结合靶物(其可以是表位)的抗体是以比其结合其它靶物更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更大的持续时间结合此靶物的抗体。当抗体相比于其将结合随机的、不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该抗原。

在本申请中，术语“KD”、“K_D”可互换地使用，通常是指平衡解离常数，“KD”是解离速率常数(kdis，也称为“解离率(off-rate)(koff)”或“kd”)与结合速率常数(kon，也称为“结合率(kon)”或“ka”)的比值。可使用结合速率常数(kon)、解离速率常数(kdis)和平衡解离常数(KD)表示抗原结合蛋白(例如抗体)对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知，包括但不限于生物膜干涉技术(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面等离子共振(SPR)、荧光共振能量迁移(FRET)、免疫共沉淀(Co-IP)以及蛋白质芯片技术。如果在不同的条件(例如盐浓度、pH)下测量，则所测得的某种特定蛋白-蛋白相互作用的亲和力可不同。

在本申请中，术语“灵长类动物”通常是指猴和猿物种，并包括猴物种，诸如来自弥猴属(例如，食蟹猴(Macaca fascicularis)和或恒河猴(Macaca mulatta))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))的猴，以及狨猴(来自狨(Callithrix)属的物种)，松鼠猴(来自松鼠猴(Saimiri) 属的物种)和绢毛猴(来自柽柳猴(Saguinus)属的物种)，以及猿物种，诸如黑猩猩(Pan troglodytes)，并且还包括智人(Homo sapiens)。

在本申请中，术语“多肽”或“蛋白质”可互换地使用，通常是指氨基酸残基的聚合物。该术语也适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物、以及天然存在的氨基酸聚合物。该术语也可包括修饰的氨基酸聚合物，例如，通过添加糖残基以形成糖蛋白或被磷酸化修饰。多肽和蛋白质可由天然存在的和非重组的细胞或由遗传工程改造的或重组的细胞产生，并且可包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子、或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”特别包括本申请所述的抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。

在本申请中，术语“分离的”通常是指大体上不含其天然存在的环境中通常伴随或与之相互作用的组分的生物材料(例如病毒、核酸或蛋白质)。所述分离的生物材料任选地包含在其天然环境(例如，核酸或蛋白质)中所述生物材料未发现具有的另外的材料。在本申请中，当涉及蛋白质时，“分离”通常是指所述的分子从发现该分子天然存在的整个生物体中分离和分开，或基本不存在其它相同类型的生物大分子。当涉及核酸分子时，它与天然与其结合的序列完全或部分分离，或该核酸具有与其结合的异源序列，或该核算从染色体分离。

在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指抗原结合蛋白与其它活性剂连接形成的物质，其他活性剂可以是小分子活性剂，例如化疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针或光谱探针。

在本申请中，术语“核酸”分子通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。

在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。

在本申请中，术语“细胞”通常是指可以包含或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗原结合蛋白的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在某些情形中，所述细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。

在本申请中，术语“药物组合物”通常是指这样的制剂，其以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。

在本申请中，术语“治疗”通常是指期望改变所治疗个体的天然病程，且可为实现防治或在临床病变过程中进行的临床介入。合乎需要的治疗效果包括但不限于防止疾病发生或复发性、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态以及缓和或改善预后。在一些情形中，抗原结合蛋白(例如，抗VEGF抗体)可用来延迟疾病发展或减缓疾病进展。

在本申请中，术语“施用”通常是指向受试者(例如，患者)给予一定剂量的化合物(例如，抗癌治疗剂)或药物组合物(例如，包含抗癌治疗剂的药物组合物)的方法。施用可通过任何合适的方式进行，包括肠胃外、肺内和鼻内，以及(如果局部治疗需要)损伤内施用。胃肠外输注包括例如肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。

在本申请中，术语“肿瘤”通常是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性还是良性)以及所有癌前和癌性细胞和组织。在本申请中，所述肿瘤可以为细胞和组织的VEGF或VEGFR高表达的肿瘤。肿瘤可包括实体瘤和/或非实体瘤(例如，血液瘤、淋巴瘤)。

在本申请中，术语“在……之间”通常是指某种氨基酸片段的C端与第一氨基酸片段的N端直接或间接连接，并且其N端与第二氨基酸片段的C端直接或间接连接。在轻链中，例如，所述L-FR2的N末端与所述LCDR1的C末端直接或间接相连，且所述L-FR2的C末端与所述LCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述L-FR3的N末端与所述LCDR2的C末端直接或间接相连，且所述L-FR3的C末端与所述LCDR3的N末端直接或间接相连。在重链中，例如，所述H-FR2的N末端与所述HCDR1的C末端直接或间接相连，且所述H-FR2的C末端与所述HCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述H-FR3的N末端与所述HCDR2的C末端直接或间接相连，且所述H-FR3的C末端与所述HCDR3的N末端直接或间接相连。在本申请中，“第一氨基酸片段”和“第二氨基酸片段”可以为相同或不同的任意一段氨基酸片段。

在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。

发明详述

其中，所述第二靶向部分包含抗体或其抗原结合片段的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列。

例如，本申请第一靶向部分可包含HCDR3，所述HCDR3可包含氨基酸序列如SEQ ID NO：2、16、17、18、19和20中任一项所示的VH的HCDR3。例如，本申请第一靶向部分可包含HCDR2，所述HCDR2可包含氨基酸序列如SEQ ID NO：2、16、17、18、19和20中任一项所示的VH的HCDR2。例如，本申请第一靶向部分可包含HCDR1，所述HCDR1可包含氨基酸序列如SEQ ID NO：2、16、17、18、19和20中任一项所示的VH的HCDR1。例如，本申请第一靶向部分可包含HCDR3、HCDR2和HCDR1，所述HCDR3、HCDR2和HCDR1可包含氨基酸序列如SEQ ID NO：2、16、17、18、19和20中任一项所示的VH的HCDR3、HCDR2和HCDR1。例如，本申请第一靶向部分可包含HFR1、HFR2、HFR3、和/或HFR4，所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4可分别包含氨基酸序列如SEQ ID NO：2、16、17、18、19和20中任一项所示的VH的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4。例如，可根据Chothia规则划分。

例如，本申请第一靶向部分可包含LCDR3，所述LCDR3可包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1、13、14和15中任一项所示的VL的LCDR3。例如，本申请第一靶向部分可包含LCDR2，所述LCDR2可包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1、13、14和15中任一项所示的VL的LCDR2。例如，本申请第一靶向部分可包含LCDR1，所述LCDR1可包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1、13、14和15中任一项所示的VL的LCDR1。例如，本申请第一靶向部分可包含LCDR3、LCDR2和LCDR1，所述LCDR3、LCDR2和LCDR1可包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1、13、14和15中任一项所示的VL的LCDR3、LCDR2和LCDR1。例如，本申请第一靶向部分可包含LFR1、LFR2、LFR3、和/或LFR4，所述LFR1、LFR2、LFR3、LFR4可分别包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1、13、14和15中任一项所示的VL的LFR1、LFR2、LFR3、LFR4。例如，可根据Chothia规则划分。

例如，其中所述第一靶向部分包含抗体重链可变区VH，且所述VH包含选自SEQ ID NO：2、16、17、18、19和20中任一项所示的氨基酸序列。例如，其中所述第一靶向部分包含抗体轻链可变区VL，且所述VL包含选自SEQ ID NO：1、13、14和15中任一项所示的氨基酸序列。

例如，其中所述第一靶向部分包含抗体重链可变区VH和抗体轻链可变区VL，所述VH包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。例如，所述VH包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。例如，所述VH包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。例如，所述VH包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。例如，所述VH包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。例如，所述VH包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。

例如，其中所述第一靶向部分还包含抗体重链恒定区，所述抗体重链恒定区源自IgG恒定区。例如，源自IgG1恒定区。例如，第一靶向部分可以包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。例如，其中所述第一靶向部分还包含抗体轻链恒定区。例如，第一靶向部分可以包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。

根据本申请的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含抗体重链可变区VH，且所述 VH包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。根据本申请的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含抗体重链恒定区。例如，源自IgG1恒定区。例如，第二靶向部分可以包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。例如，其中所述第二靶向部分为纳米抗体。

在一个实施方案中，本申请提供了一种抗原结合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，所述第一靶向部分包含特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段，所述第二靶向部分包含特异性结合VEGF的抗体或其抗原结合片段；其中所述抗原结合蛋白是双功能抗体Tab1或Tab1。

一个实施方案中，双功能抗体Tab1包含重链或轻链，其中所述重链从N端至C端依次包含氨基酸序列SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：21；所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO：31。

一个实施方案中，双功能抗体Tab2包含重链或轻链，其中所述重链从N端至C端依次包含氨基酸序列SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：21；所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO：31。

在本申请中，所述抗原结合蛋白每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别。例如，轻链和重链的可变区及恒定部分均来自一个动物物种(如人)的抗体的可变区及恒定区。在本申请中，所述同源物可以为，与所述蛋白质和/或所述多肽的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。

在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。

根据本申请的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。例如，其中抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)₂、Fv片段、F(ab’)₂、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。例如，所述抗原结合蛋白包含双特异性抗体。例如，所述抗原结合蛋白包含IgG-VHH类型双特异性抗体。

例如，所述第二靶向部分位于所述第一靶向部分的C端和/或N端。例如，所述第一靶向部分包含抗体重链和抗体轻链，所述第二靶向部分位于所述第一靶向部分的抗体重链、和/或抗体轻链的C端。

例如，所述第二靶向部分与所述第一靶向部分直接或间接连接。例如，所述第二靶向部分与所述第一靶向部分通过连接子连接。例如，所述连接子包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列。例如，本领域可以用于连接两端多肽的连接子可以用于连接述第二靶向部分与所述第一靶向部分。

根据本申请的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含所述第一多肽链包含所述第一靶向部分的抗体重链或其抗原结合片段、任选存在或不存在的连接子以及所述第二靶向部分的抗体或其抗原结合片段，且所述第二多肽链包含所述第一靶向部分的抗体轻链或其抗原结合片段。例如，本申请中的第一多肽链中的所述第一靶向部分与所述第二靶向部分可以直接连接，例如连接子不存在或者，通过化学键连接。例如，本申请中的第一多肽链中的所述第一靶向部分与所述第二靶向部分可以间接连接，例如通过连接子连接。例如连接子结构可以为本申请已知的连接肽。例如，所述第一多肽链可以包含：所述第一靶向部分的重链可变区-第一靶向部分的重链恒定区-X-所述第二靶向部分的可变区-所述第二靶向部分的恒定区，以及所述第二多肽链可以包含：所述第一靶向部分的轻链可变区-第一靶向部分的轻链恒定区，其中所述X为不存在或者包含所述连接子。例如，所述第一多肽链自N端至C端依次包含第一靶向部分的抗体重链或其抗原结合片段和所述第二靶向部分的抗体或其抗原结合片段。例如，所述第一多肽链自N端至C端依次包含第一靶向部分的抗体重链或其抗原结合片段，连接子和所述第二靶向部分的抗体或其抗原结合片段。

本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够以1×10^-9M或更低的K_D值结合源自灵长类动物的PD-L1。例如，所述K_D的值可以以约1×10^-9M或以下、约9×10^-10M或以下、约8×10^-10M或以下、约7×10^-10M或以下、约6×10^-10M或以下、约5×10^-10M或以下、约4×10^-10M或以下、约3×10^-10M或以下、约2×10^-10M或以下、约1×10^-10M或以下的值结合源自人的PD-L1，例如，使用FortieBio Octet分子相互作用分析仪所检测的。

在另一情形中，本申请所述PD-L1抗原结合蛋白与PD-L1的结合活性可使用流式细胞术或酶联免疫法测定进行检测。例如，在FACS检测中，使用稳定表达人PD-L1的宿主细胞(如HEK293细胞)，所述PD-L1抗原结合蛋白结合PD-L1的EC50值在约0.0001μg/mL至约100μg/mL之间，例如，约0.001μg/mL至约10μg/mL之间，约0.001μg/mL至约5μg/mL之间，约0.001μg/mL至约1μg/mL之间，约0.01μg/mL至约0.5μg/mL之间，约0.01μg/mL至约0.1μg/mL之间，或，约0.01μg/mL至约0.05μg/mL之间。

例如，在FACS检测中，使用稳定表达猴PD-L1的宿主细胞(如CHOK1细胞)，所述PD-L1抗原结合蛋白结合PD-L1的EC50值在约0.0001μg/mL至约100μg/mL之间，例如，约0.001μg/mL至约10μg/mL之间，约0.001μg/mL至约5μg/mL之间，约0.01μg/mL至约1μg/mL之间，约0.02μg/mL至约0.5μg/mL之间，约0.03μg/mL至约0.1μg/mL之间。

在另一个方面，本申请所述的抗原结合蛋白能够阻断PD-1与PD-L1的结合。在某些情形中，所述的抗原结合蛋白阻断PD-1与PD-L1的结合可通过流式细胞技术FACS、酶联免疫法ELISA测定。

例如，首先将稳定表达人PD-L1的宿主细胞(如HEK293细胞)与递减量的未标记的所述抗原结合蛋白孵育，随后用生物素标记的PD-1蛋白孵育。然后，使用FACS分析细胞，以证实所述抗原结合蛋白阻断PD-1与PD-L1结合。例如，约0.001μg/mL至约10μg/mL之间，约0.001μg/mL至约5μg/mL之间，约0.01μg/mL至约1μg/mL之间，约0.02μg/mL至约0.5μg/mL之间，约0.02μg/mL至约0.1μg/mL之间。

例如，首先将稳定表达猴PD-L1的宿主细胞(如CHOK1细胞)与递减量的未标记的所述抗原结合蛋白孵育，随后用生物素标记的PD-1蛋白孵育。然后，使用FACS分析细胞，以证实所述抗原结合蛋白阻断PD-1与PD-L1结合。例如，约0.001μg/mL至约10μg/mL之间，约0.001μg/mL至约5μg/mL之间，约0.01μg/mL至约1μg/mL之间，约0.1μg/mL至约0.7μg/mL之间。

本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够以1×10^-7M或更低的K_D值结合VEGF(例如，VEGF165)。例如，所述K_D的值可以以约5×10^-8M或以下、约4×10^-8M或以下、约3×10^-8M或以下、约2×10^-8M或以下、约1×10^-8M或以下、约9×10^-9M或以下、约8×10^-9M或以下、约7×10^-9M或以下、约6×10^-9M或以下、约5×10^-9M或以下、约4×10^-9M或以下、约3×10^-9M或以下、约2×10^-9M或以下、约1×10^-9M或以下、约9×10^-10M或以下、约8×10^-10M或以下、约7×10^-10M或以下的值结合源自人的VEGF，例如，使用FortieBio Octet分子相互作用分析仪所检测的。

本申请所述的抗原结合蛋白能够阻断VEGF(例如，VEGF165)与VEGFR(例如VEGFR2)的结合。在某些情形中，所述的抗原结合蛋白阻断VEGF与VEGFR的结合可通过流式细胞技术FACS、酶联免疫法ELISA测定。

例如，首先将人VEGFR(例如VEGFR2)与递减量的未标记的所述抗原结合蛋白孵育，随后用被标记的VEGF蛋白孵育。然后，检测OD450，以证实所述抗原结合蛋白阻断VEGF(例如，VEGF165)与VEGFR(例如VEGFR2)结合。例如，阻断活性的IC50在约0.001μg/mL至约10μg/mL之间，约0.001μg/mL至约5μg/mL之间，约0.01μg/mL至约1μg/mL之间，约0.02μg/mL至约0.5μg/mL之间，约0.2μg/mL至约15μg/mL之间，约0.2μg/mL至约12μg/mL之间，约0.2μg/mL至约10μg/mL之间，约0.3μg/mL至约8μg/mL之间，约0.3μg/mL至约6μg/mL之间，约0.5μg/mL至约5μg/mL之间，约0.1μg/mL至约2μg/mL之间，或约0.5μg/mL至约1.5μg/mL之间。

一方面，本申请提供了一种核酸，其编码本申请的抗原结合蛋白。所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的抗原结合蛋白。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗原结合蛋白的各个多肽链。本申请所述的核酸分子可以为分离的。

一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请的核酸。本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。

一方面，本申请提供了一种免疫缀合物，其包含本申请的抗原结合蛋白。例如，本申请的免疫缀合物还可以包含具有细胞杀伤能力的化合物。例如，本申请的免疫缀合物还可以包含跨膜域、胞内刺激域、和/或胞内信号域。

一方面，本申请提供了一种细胞，其包含本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、和/或本申请的免疫缀合物。例如，本申请提供了宿主细胞，所述宿主细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。例如，本申请的细胞不具有发育成为完整生物体的潜能。

一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、和/或本申请的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。所述药学上可接受的佐剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性，本申请中的药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。

一方面，本申请提供了一种本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物、和/或本申请的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。例如，其中所述肿瘤包括PD-1、PD-L1和/或VEGF高表达的肿瘤。根据本申请的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。根据本申请的用途，其中所述肿瘤包括结直肠癌、乳腺癌、母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、肾癌、食管癌、头颈癌、淋巴瘤、肝癌和/或胃癌。

一方面，本申请提供了一种本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物、和/或本申请的试剂盒，其用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。例如，其中所述肿瘤包括PD-1、PD-L1和/或VEGF高表达的肿瘤。根据本申请的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。根据本申请的用途，其中所述肿瘤包括结直肠癌、乳腺癌、母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、肾癌、食管癌、头颈癌、淋巴瘤、肝癌和/或胃癌。

一方面，本申请提供了一种预防、缓解和/或治疗肿瘤的方法，包含施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物、和/或本申请的试剂盒。例如，其中所述肿瘤包括PD-1、PD-L1和/或VEGF高表达的肿瘤。根据本申请的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。根据本申请的用途，其中所述肿瘤包括结直肠癌、乳腺癌、母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、肾癌、食管癌、头颈癌、淋巴瘤、肝癌和/或胃癌。

一方面，本申请提供了一种抑制PD-1蛋白与PD-L1蛋白和/或PD-L2蛋白结合，和/或抑制VEGF蛋白与VEGFR蛋白结合的方法，所述方法包含施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物、和/或本申请的试剂盒。例如，所述方法可以是离体或体外方法。例如，所述方法可以是非治疗目的的方法。在某些情形中，所述方法可包括使生物样品与本申请所述的抗原结合蛋白和/或PD-1 在容许所述抗原结合蛋白和/或PD-1结合PD-L1的条件下接触，检测PD-1与PD-L1之间是否形成复合物。在某些情形中，所述方法可包括使生物样品与本申请所述的抗原结合蛋白和/或VEGF在容许所述抗原结合蛋白和/或VEGF结合VEGFR的条件下接触，检测VEGFR与VEGFR之间是否形成复合物。

一种调控免疫反应的方法，所述方法包含施用本申请的抗原结合蛋白、本申请的核酸、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物、和/或本申请的试剂盒。例如，所述调控免疫反应包含刺激免疫细胞分泌细胞因子。例如，所述调控免疫反应包含刺激免疫细胞分泌IL-2。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。下面实施例中述及的实验方法，如无特殊说明，均为本领域采用默认参数、步骤等的常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售产品。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照相应产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

实施例

实施例1抗PD-L1抗体的制备

1.1杂交瘤抗体筛选和制备

使用Human PD-L1/B7-H1 Protein,Fc Tag(Acro Biosystem PD1-H5258)以及PADRE进行乳化，然后通过腹腔注射至6～8周龄雌性SD大鼠，50μg Human PD-L1/B7-H1 Protein,Fc Tag/只，25μg PADRE/只；之后间隔两周到三周进行加强免疫。共计免疫3次，最后一次免疫两周后取大鼠尾血，测定血清抗人PD-L1抗体滴度。经大鼠腹腔注射不加弗氏佐剂的50μg蛋白冲击免疫后，第三天取大鼠脾脏细胞与骨髓瘤(Sp2/0)细胞进行融合。

利用流式细胞仪从融合板中筛选出与HEK293-PD-L1细胞特异性结合并能同时阻断受体PD-1、与细胞HEK293-hPD-L1结合的克隆，利用有限稀释法进行亚克隆，最终筛选到可分泌特异性抗体的单克隆。采用无血清培养基进行小规模生产纯化得到单克隆抗体做后续鉴定，包含检测抗体与HEK293-PD-L1的结合能力、对PD-1与细胞HEK293-hPD-L1结合的阻断功能以及混合淋巴细胞实验最终得到候选抗人PD-L1单克隆抗体50G2-3。经单克隆抗体测序获得鼠源杂交瘤克隆50G2-3的可变区序列如下：

>50G2-3轻链可变区序列(SEQ ID NO：1)

>50G2-3重链可变区序列(SEQ ID NO：2)

表1鼠源杂交瘤克隆50G2-3重链及轻链CDR区序列

1.2单克隆抗体人源化

通过序列比对挑选最同源的人Germline抗体(数据来源：IMGT)做为人源化设计框架(轻链以IGKV1-33*01(SEQ ID NO：9)，IGKJ2*01(SEQ ID NO：10)为框架，重链以IGHV3-7*01(SEQ ID NO：11)，IGHJ4*01(SEQ ID NO：12)，为框架)，对抗体轻重链可变区进行Chothia编号[Chothia&Lesk,1987],定义抗体CDR区：CDRL1(L24-L34)，CDRL2(L50-L56)，CDRL3(L89-L97)，CDRH1(H26-H32)，CDRH2(H52-H56),CDRH3(H95-H97)，根据序列比对和可变区结构信息对抗体轻重链可变区氨基酸进行人源化突变；设计表达载体，基因合成，哺乳细胞表达纯化重组抗体，比较人源化抗体和嵌合抗体活性，理化性质的差异，进行1-2轮人源化优化；

以下轻重链的优化设计是以上面Germline抗体序列为框架CDR移植的人源化序列(1910G2HzL0和1910G2HzH0为嵌合抗体的轻重链，1910G2HzL2，1910G2HzH2，1910G2HzL3，1910G2HzH3，1910G2HzL4，1910G2HzH4，1910G2HzL7，1910G2HzH7，1910G2HzL9，1910G2HzH9为人源化抗体的轻重链)

>1910G2HzL2轻链可变区序列(SEQ ID NO：13)

>1910G2HzL3轻链可变区序列(SEQ ID NO：14)

>1910G2HzL4轻链可变区序列，同1910G2HzL2

>1910G2HzL7轻链可变区序列，同1910G2HzL2

>1910G2HzL9轻链可变区序列(SEQ ID NO：15)

>1910G2HzH2重链可变区序列(SEQ ID NO：16)

>1910G2HzH3重链可变区序列(SEQ ID NO：17)

>1910G2HzH4重链可变区序列(SEQ ID NO：18)

>1910G2HzH7重链可变区序列(SEQ ID NO：19)

>1910G2HzH9重链可变区序列(SEQ ID NO：20)

将人源化后抗体轻链可变区1910G2HzL2，1910G2HzL3，1910G2HzL4，1910G2HzL7和1910G2HzL9序列与人Kappa链恒定区CL(氨基酸序列SEQ ID NO:27)组合成抗体轻链，将人源化后抗体重链可变区1910G2HzH2，1910G2HzH3，1910G2HzH4，1910G2HzH7和1910G2HzH9与人IgG1IgG4恒定区CH(氨基酸序列SEQ ID NO:26)组合成抗体重链，组合后配对组成人源化抗体1910G2HzL2H2、1910G2HzL3H3、1910G2HzL4H4、1910G2HzL7H7和1910G2HzL9H9。

1.3人源化抗体动力学参数测定

(1)采用Octet RED96e(Fortebio)测定人源化抗体与人PD-L1的亲和力，抗原及抗体均用1xPBST(1xPBS：生工，B548117-0500；0.02％吐温20：sigma-alorich，P1379)稀释，抗原使用浓度为100nM，抗体使用浓度为50nM。

(2)样品上机检测(Octet Data Acquisition 11.1.0.11)：首先，将样品加入96孔板(Greiner bio-one，655209)，体系为200μL/well。然后设置软件参数，板温设定为30℃，收集标准动力学信号的频率为5.0HZ。接着，用1xPBST预湿AHC传感器(Fortébio,货号：18-0015)10分钟，然后上机检测。每个循环包含以下步骤：1)浸入缓冲液60秒；2)检测抗原是否与传感器有非特异性结合；3)10mM pH1.7的甘氨酸溶液再生；4)浸入缓冲液60秒；5)抗体固化在传感器上，时间为20秒；6)传感器浸入缓冲液180秒；7)抗原与抗体结合，时间180秒；8)抗原抗体的解离，时间10分钟；9)传感器再生。

(3)数据分析

采用Fortebio的Data Analysis 11.0软件，对抗原-抗体以1:1的结合方式，测定结合速率(Ka)和解离速率(Kd)，以此计算抗体的平衡解离常数(K_D)。人源化抗体与人PD-L1的亲和力结果如下表2所示。

表2人源化抗体与人PD-L1的亲和力

结果表明，人源化抗体与人PD-L1的亲和力与Atezolimumab相似，

1.4人源化抗体与细胞表面抗原PD-L1的结合活性

按照每块96孔板5E6个细胞收集CHOK1-cynoPD-L1,HEK293-hPD-L1：300g离心5分钟，用预冷的FACS Buffer重悬，按照100μL/well均匀铺于3799U型板中，室温封闭15分钟，取人源化抗体，3.33μg/mL初始浓度，后依次3倍稀释，共设置12个梯度。封闭结束后，2000rpm离心5分钟，甩掉上清。加入稀释好的抗体100μL/well，吹打均匀，4℃孵育1小时(3)2000rpm 离心5分钟，弃上清，用FACS Buffer洗1-2次。加入二抗：goat-anti-human488,1:1000。100μL/well，4℃孵育1小时，2000rpm离心5分钟，弃上清，用FACS Buffer洗1-2次，加入FACS Buffer：30μL/well重悬细胞，上机检测。

图1A-1B分别显示的是，候选抗体与细胞表面人(图1A)或食蟹猴(图1B)PD-L1的结合活性。结果表明，人源化抗体与细胞表面抗原PD-L1的结合活性同Atezolimumab相似。

1.5人源化抗体阻断细胞表面抗原PD-L1与PD-1的结合活性

按照每块96孔板5E6个细胞收集HEK293-hPD-L1,CHOK1-cynoPD-L1：300g离心5分钟，用预冷的FACS Buffer重悬，按照100μL/well均匀铺于3799U型板中，室温封闭15分钟，取人源化抗体稀释至10μg/mL作为初始浓度，后依次3倍稀释，共设置12个梯度。取Biotin-PD-1-mFc，0.224mg/mL，配制成2μg/mL。封闭结束后，2000rpm离心5分钟，甩掉上清。先加入稀释好的人源化抗体50μL/well，吹打均匀，再加入2μg/mL的Biotin-PD-1-mFc，50μL/well，混匀，4℃孵育1小时,2000rpm离心5分钟，弃上清，用FACS Buffer洗1-2次。加入二抗：SA488,1:1000。100μL/well，4℃孵育1小时,2000rpm离心5分钟，弃上清，用FACS Buffer洗1-2次，加入FACS Buffer：30μL/well重悬细胞，上机检测。

图2A-2B分别显示的是，候选抗体阻断HEK293-hPD-L1细胞(图2A)或CHOK1-cynoPD-L1细胞(图2B)表面抗原PD-L1与PD-1的结合活性。结果表明，人源化抗体阻断细胞表面抗原PD-L1与PD-1的结合活性同Atezolimumab相似。

1.6候选抗体诱导的混合淋巴细胞反应

使用细胞培养基(1640+2％FBS)复苏人树突状DC细胞，调整DC细胞密度至1*10^5-1*10^7cells/mL，然后加入终浓度为50μg/ml丝裂霉素C，37度避光处理30分钟后加入10ml培养基终止，400g离心10分钟，随后用10mL培养基清洗一遍。梯度稀释anti-PD-L1抗体：抗体最高终浓度为2.5μg/mL(配制浓度为10μg/mL)，10倍梯度稀释(5个浓度点+1个0浓度)，然后相应细胞培养板(康宁，货号：3599)中加入50μL配制好的anti-PD-L 1抗体。收集人外周血淋巴细胞PBMC和丝裂霉素C处理好的DC细胞，调整DC细胞密度至2*10^5cells/mL，随后将细胞加入培养板中，每孔50μL，即每孔DC细胞数为1*10^4cells/孔；调整PBMC细胞密度至2*10^6cells/mL，随后将细胞加入培养板中，每孔100μL，即每孔PBMC细胞数为2*10^5cells/孔。将细胞培养板置于37℃、5％二氧化碳细胞培养箱孵育5天，5天后，300g离心5分钟，收集上清用Human IL-2 ELISA试剂盒(BD，货号：550611)检测IL-2 含量，检测方法严格按照试剂盒说明书进行，数据用GraphPad Prism软件进行处理。

图3显示的是，候选抗体诱导的混合淋巴细胞反应，以及细胞因子IL2的分泌结果。结果表明，anti-PD-L1人源化抗体都有免疫反应诱导功能，且比Atezolimumab效果更好。

实施例2抗VEGF单域抗体制备与检测

2.1噬菌体单域抗体库构建及淘选

采取三只未免疫目的抗原的羊驼的血样，每只取150ml。从血样中分离淋巴细胞提取总RNA，构建噬菌体展示纳米抗体文库，库容大小为3*10⁹cfu。取6ml转化的抗体文库菌制备噬菌体用于特异性淘选，菌体总量大于库容50倍。

将50ml Streptavidin Magnetic Beads(Thermo fisher,货号：88817)预结合1ml噬菌体室温孵育30min，去除非特异性结合。去除背景后的纳米抗体文库噬菌体加入10ug Biotinylated Human VEGF165(百普赛斯，货号：VE5-H82Q0),150ul Streptavidin Magnetic Beads，室温孵育15min,PBST(PBS中含有0.05％Tween-20)洗14遍，洗去不结合的噬菌体。用450ul 100mM盐酸洗脱抗原特异性结合的噬菌体，加入50ul pH11的1M Tris-HCl中和并感染处于对数生长期的大肠杆菌SS320，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。筛选方法与第一轮相同，仅将抗原用量减为4ug。取两轮筛选后富集的噬菌体用酶联免疫(ELISA)鉴定富集情况，结果表3所示，结果表明，经过两轮淘选后噬菌体富集明显。

表3第二轮富集后的酶联免疫(ELISA)鉴定

2.2酵母展示文库构建与筛选

如图4所示酵母细胞壁表面展示单域抗体的构建方案，以噬菌体抗体库库两轮淘选后质粒为模板，设计引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增纳米抗体基因(V_HH)；PCR扩增的V_HH基因片段回收后与酵母展示质粒共转入酿酒酵母菌株EBY100(购自ATCC)，通过酿酒酵母的同源重组使VHH基因插入至酵母展示质粒中，进而实现在酵母细胞壁表面展示单域抗体。

使用流式分选仪对酵母展示文库进行两轮分选，将分选获得的酵母菌涂布营养缺陷型平板培养基，挑46个单克隆进行测序，最终获得5个独一序列的单域重链抗体。对相应的酵母单克隆菌落进行流式染色分析，取1×10⁶个细胞按表4显示的各个方案进行染色。

表4单克隆酵母菌落流式染色鉴定方案

方案1与human VEGF165-Bio结合细胞群的强弱由PE平均荧光信号强度(MFI)反映，同理方案2和方案3可以评估Mouse VEGF-Bio以及非特异性的结合水平，方案4竞争信号由APC平均荧光信号强度(MFI)反映。结果表5所示，排除与人VEGF、鼠VEGF不结合的克隆，最终获得抗人VEGF165单域重链抗体的单克隆Y20A6。克隆Y20A6结合及竞争的能力均理想。

表5酵母展示文库二轮筛选后酵母单克隆菌落流式染色分析结果

2.3单域抗体人源化设计与表达

对单克隆抗体Y20A6的序列进行IMGT/Domain Gap Align，查找与其同源性最高的人源的germline为IGHV3-23*04。抗体序列按Chothia规则编号，对单克隆Y20A6进行如下表6所示的突变，得到Hz20A6.2和Hz20A6.3。

表6单域抗体序列人源化设计

将Y20A6与人源化后克隆Hz20A6.1、Hz20A6.3的重链可变区与IgG1Fc N297A(SEQ ID NO:26)融合，组成抗体重链，形成重链单域抗体Ab1910VE6(对应Y20A6)、Ab1910VE8(对应Hz20A6.2)和Ab1910VE9(对应Hz20A6.3)。进行密码子优化，基因合成后装入表达载体pcDNA3.4(Life Technologies)。表达质粒扩增和质粒抽提后质粒转入ExpiCHO细胞(ThermoFisher Scientific，A29133)，根据供应商ExpiCHO表达系统方法进行抗体瞬转表达，得到纯化的抗体表达、纯化数据如表7所示。

表7单域抗体表达、纯化数据

2.4单域抗体与人VEGF165的结合活性测定

参考实施例1.3中的方法，测定人源化前后单域抗体与人VEGF165的亲和力，结果如下表8所示，AB1910VE8、AB1910VE9与人VEGF亲和力较好，选取AB1910VE8和AB1910VE9抗体做阻断功能实验。

表8单域抗体与人VEGF165的亲和力

2.5单域抗体阻断人VEGF165与人VEGFR2结合的活性测定

采用竞争ELISA方法测定单域抗体阻断VEGF165和人VEGFR2的结合活性，具体为将人VEGFR2(Acro,货号：KDR-H5227)用PBS(Gibco,货号：10010-023)稀释到1μg/mL，加入到96孔板中，每孔100μL，贴封板膜，置于4度孵育过夜。第二天用洗涤液PBST(0.05％TWEEN-20:sigma-alorich，P1379)洗板3次，继而用洗涤液配制封闭液PBST+2％BSA(BSA：VWR,0332-1KG)，每孔加入300μL封闭液，37℃封闭1小时。用封闭液配制Anti-VEGF 和Biotin-hVEGF(Acro,货号：VE5-H82Q0)，Anti-VEGF的配制起始浓度为200μg/mL，5倍梯度稀释(7个浓度点+1个0浓度点)，Biotin-hVEGF的配制浓度为90ng/mL。继而取出封闭好的酶标板，用洗涤液洗板3次，取50μL稀释后的Anti-VEGF加入到96孔板中，再取50μL的Biotin-hVEGF加入到96孔板中，37℃共孵育1小时。用洗涤液洗板3次，封闭液1：5000稀释二抗SA-HRP(sigma，S2438)，以100μL/孔加至酶标板内，37℃孵育1小时。用洗涤液洗板3次，每孔加入100μL TMB显色液(Biopanda，货号：TMB-S-003)，室温避光显色，然后每孔加入50μL终止液(Solarbio，货号：C1058)终止反应，在450nm波长处测定吸光值。

单域抗体阻断VEGF165和人VEGFR2的结合结果如图5所示，结果显示，Ab1910VE8、Ab1910VE9和Ab1910VE6均具有阻断功能，从中选取AB1910VE9做亲和力成熟。

2.6单域抗体亲和力成熟文库构建

对Ab1910VE9序列进行亲和力成熟，提高其与人VEGF的亲和力。将Ab1910VE9的CDR区按Chothia定义，对其HCDR1-3、LCDR1-3位点氨基酸进行随机突变，构建突变文库。设计NNK突变引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增各CDR突变文库基因片段。将各CDR突变文库基因片段与酵母展示质粒分别转入酿酒酵母菌株EBY100(购自ATCC)，使各CDR突变文库展示于酵母表面。同时将Ab1910VE9的亲本序列展示于酵母表面，作为对照使用。

文库经过培养、诱导后，使用Biotin-Human VEGF165进行三轮分选，起始浓度3nM，10倍梯度稀释。收集展示水平高且与抗原结合能力强的细胞群；分选后细胞涂布于SD-Trp固体培养基，30℃静置培养3天。

挑取单克隆进行测序，对获得的独一序列的单克隆进行流式染色鉴定，与1nM Biotin-Human VEGF165孵育染色，比较不同克隆的展示平均荧光信号强度与抗原结合平均荧光信号强度的比值，反映了单个分子与抗原的结合能力。根据结合力数值，最终挑取了表达抗体Ab1910VE21(重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：21)，抗体表达编号与单克隆鉴定结果如下表9所示。Ab1910VE21的Chothia编号的CDR区氨基酸序列如下表10。

表9单克隆鉴定结果与抗体表达编号

>1910VE21单域抗体重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：21)

表10 1910VE21单域抗体CDR区序列

2.7亲和力成熟单域抗体表达及SEC-HPLC纯度分析

将表10中单域抗体进行表达、纯化。对表达抗体进行SEC-HPLC纯度分析，方法如下：

(1)将样品稀释至1mg/mL，混匀，12000rpm离心5min，取上清转至样品瓶，放入HPLC样品盘。设置色谱条件如下：

(2)色谱柱采用流动相(200mM磷酸盐缓冲液，pH6.8)平衡后，进样分析，用色谱软件进行数据分析，峰面积归一化法计算各个峰的峰面积百分比。

亲和力成熟单域抗体表达、纯化数据如下表11所示。

表11亲和力成熟单域抗体表达、纯化数据

2.8亲和力成熟单域抗体动力学参数测定

参照实施例1.3中的方法，测定人源化抗体与人VEGF165的亲和力，结果如表12所示，亲和力成熟后的抗体分子AB1910VE21亲和力提高数倍。

表12亲和力成熟抗体与人VEGF165的亲和力

2.9亲和力成熟VEGF抗体阻断人VEGF165和人VEGFR2的结合功能实验

参照实施例2.5的方法，测定亲和力成熟VEGF抗体阻断人VEGF165和人VEGFR2的结合功能实验。

实验结果如图6所示，结果显示Ab1910VE18，Ab1910VE21抗体的阻断效果和Bevacizumab相当。

实施例3抗PD-L1/VEGF双特异性抗体Tab1,Tab2评估

3.1双功能抗体设计与制备

按下表方式设计双特异性抗体Tab1,Tab2。即在一个IgG抗体的两条重链的C端连接一个纳米抗体片段。

表13双特异性抗体Tab1,Tab2的设计

连接子Linker氨基酸序列为(SEQ ID NO：25)：ADIEGRMD

将Tab1,Tab2基因合成后装入表达载体pcDNA3.4(Life Technologies)。表达质粒扩增和质粒抽提后质粒转入ExpiCHO细胞(ThermoFisher Scientific，A29133)，根据供应商ExpiCHO表达系统方法进行抗体瞬转表达，纯化抗体用于后续性质测定。

双特异性抗体动力学参数测定

3.2双特异性抗体Tab1,Tab2与PD-L1的亲和力测定

参照实施例1.3中的方法，测定双特异性抗体Tab1,Tab2分别与人VEGF165、人PD-L1(Acro,货号：PDL-H82F2)和食蟹猴PD-L1(Acro,货号：PD1-C5253)的亲和力。与人VEGF165的亲和力结果如下表14所示，与食蟹猴PD-L1的亲和力结果如下表15所示：

表14双特异性抗体Tab1,Tab2与人VEGF165的亲和力

表15双特异性抗体Tab1,Tab2分别与食蟹猴PD-L1的亲和力

结果显示，1)Tab1与Tab2两个分子分别与human或cyno PD-L1的亲和力相当；2)与hPD-L1的结合，Tab1和Tab2与Atezolimumab比较亲和力相当；3)与cynoPD-L1的结合,Tab1和Tab2均优于Atezolimumab 20倍之多。

3.3双特异性抗体Tab1,Tab2与人VEGF165的亲和力测定

参照实施例1.3中的方法，测定双功能抗体Tab1,Tab2与biotinylated human VEGF165(Acro,货号：VE5-H82Q0)的亲和力。下表16显示的是双特异性抗体Tab1,Tab2与人VEGF165的亲和力。

表16双特异性抗体Tab1,Tab2与人PD-1的亲和力

结果显示，Tab1和Tab2两个分子与biotin hVEGF165的avidity相当，且两个分子与Bevacizumab比较，Kon高2-3倍，Koff低3倍左右，最终亲和力与Bevacizumab相当。

3.4双特异性抗体Tab1，Tab2与细胞表面抗原PD-L1的结合活性

参照实施例1.4中的方法，测定双特异性抗体Tab1，Tab2与细胞表面抗原PD-L1的结合活性。

图7A-7B分别显示的是，双特异性抗体Tab1，Tab2与HEK293-hPD-L1细胞(图7A)或CHOK1-cynoPD-L1细胞(图7B)表面抗原PD-L1的结合结果。结果表明，双特异性抗体Tab1，Tab2与细胞表面抗原PD-L1的结合活性与Atezolimumab相似。

3.5双特异性抗体Tab1，Tab2阻断细胞表面抗原PD-L1与PD-1的结合活性

参照实施例1.5中的方法，测定双特异性抗体阻断细胞表面抗原PD-L1与PD-1的结合活性。

图8A-8B分别显示的是，双特异性抗体Tab1，Tab2阻断HEK293-hPD-L1细胞(图8A)或CHOK1-cynoPD-L1细胞(图8B)表面抗原PD-L1与PD-1的结合结果。结果表明，双特异性抗体Tab1，Tab2阻断细胞表面抗原PD-L1与PD-1的结合活性与Atezolimumab相似。

3.6竞争ELISA方法测定双特异性抗体与VEGFR竞争结合抗原VEGF165的活性

竞争ELISA方法测定双功能抗体与hVEGFR1竞争结合抗原VEGF165的活性，参照实施例2.5的测定方法。

图9显示的是，双特异性抗体与VEGFR竞争结合抗原VEGF165的活性结果。结果显示，Tab1和Tab2阻断效果相当，且都优于Bevacizumab,约两倍左右。

3.7竞争ELISA方法测定双功能抗体与VEGFR2竞争结合抗原VEGF165的活性

竞争ELISA方法测定双功能抗体与hVEGFR2竞争结合抗原VEGF165的活性，参照实施例2.5的测定方法。

图10显示的是，双功能抗体与VEGFR2竞争结合抗原VEGF165的活性结果。结果显示的是，Tab1和Tab2阻断效果相当，且都优于Bevacizumab，约两倍左右。

3.8双特异性抗体诱导混合淋巴细胞反应

参照实施例1.6的实验方法，测定双特异性抗体的诱导混合淋巴细胞分泌细胞因子IL2的反应，其中双特异性抗体最高终浓度为10μg/mL(配制浓度为40μg/mL)，10倍梯度稀释(5个浓度点+1个0浓度)，数据用GraphPad Prism软件进行处理。

图11显示的是，本申请抗体刺激混合淋巴细胞反应，促进细胞因子IL2的分泌的结果。结果显示，双特异性抗体Tab1、Tab2抗体都有刺激混合淋巴细胞反应，促进细胞因子IL2的分泌的功能，其功能和Atezolimumab相当。

实施例4.抗PD-L1/VEGF双特异性抗体抑制肿瘤的作用

本实施例采用双特异性人源化抗体Tab1检测了其中荷A375黑色素瘤的小鼠中的抑瘤作用。

NOG小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，6-7周龄，雌性，共48只。冻存PBMC细胞购自上海赛笠生物科技有限公司，A375黑色素瘤细胞购自ATCC(Lot：70019044)。在小鼠适应期结束后，复苏PBMC细胞，并以5E6的量向每只小鼠腹腔注射PBMC细胞。一周后收集按照常规方法扩增培养的A375细胞，将其与基质胶混匀后按照2E6的数量接种于NOG小鼠右侧背部皮下。按照常规方法定期检测肿瘤体积，待肿瘤体积生长至100mm³时将小鼠随机分为4组，每组8只小鼠，分别为同种型抗体对照组(百英生物，货号：B109801，10mg/kg)组、PL3H3(PDL1抗体1910G2HzL3H3，如实施例1所述，10mg/kg)组、FcVE21(VEGF抗体，SEQ ID NO：29，5.3mg/kg)组、JMB2003Tab1(PDL1×VEGF双抗Tab1，如实施例3所述，11.6mg/kg)组。给药方式为腹腔给药，每周两次，共给药7次。具体分组及给药情况见表17：

表17.动物分组及给药情况

在分组后第25天实验终点时检测各组小鼠的肿瘤大小。其中同种型对照组组、PL3H3组、FcVE21组、Tab1组的肿瘤体积分别为1786±118mm ³、1218±104mm ³、796±142mm ³、504±99mm ³。与同种型对照组相比，PL3H3组、FcVE21组、JMB2003Tab1组的肿瘤生长抑制率分别为34％、59％、77％。各治疗组肿瘤体积均显著小于对照组(p<0.05)，JMB2003组肿瘤体积显著小于PL3H3组(p<0.01)。测试抗体FcVE21、PL3H3、JMB2003对免疫系统人源化异种移植A375皮下瘤模型均产生显著的抗肿瘤作用，有效地抑制了肿瘤生长，双特异性抗体JMB2003Tab1抗肿瘤作用显著优于PL3H3组，优于FcVE21组，显示JMB2003Tab1有联合增效的抗肿瘤作用。结果如图12所示。

序列：

>FcVE21(SEQ ID NO：29)

>PL3H3-重链(SEQ ID NO：30)

>PL3H3-轻链(SEQ ID NO：31)

前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。

Claims

一种抗原结合蛋白，其包含第一靶向部分和第二靶向部分，所述第一靶向部分包含特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段，所述第二靶向部分包含特异性结合VEGF的抗体或其抗原结合片段；

其中，所述第一靶向部分包含抗体或其抗原结合片段的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；

其中，所述第一靶向部分包含抗体或其抗原结合片段的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述LCDR1包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；

其中，所述第二靶向部分包含抗体或其抗原结合片段的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列。
根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分包含抗体重链可变区VH和抗体轻链可变区VL，其中：

(i)所述VH包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

(ii)所述VH包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列

(iii)所述VH包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；

(iv)所述VH包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；

(v)所述VH包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；或者

(vi)所述VH包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-2中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分还包含抗体重链恒定区，所述抗体重链恒定区源自IgG恒定区，例如包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-3中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第一靶向部分还包含抗体轻链恒定区，例如包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-4中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含抗体重链可变区VH，且所述VH包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-5中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述第二靶向部分包含抗体重链恒定区，所述抗体重链恒定区源自IgG恒定区，例如包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-6中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
根据权利要求1-7中任一项所述的抗原结合蛋白，其中抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)₂、Fv片段、F(ab’)₂、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
根据权利要求1-8中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含双特异性抗体，例如包含IgG-VHH类型双特异性抗体，例如是Tab1、Tab2。
根据权利要求1-9中任一项所述的抗原结合蛋白，所述第一靶向部分包含抗体重链和抗体轻链，所述第二靶向部分位于所述第一靶向部分的抗体重链的C端，其中，所述第二靶向部分与所述第一靶向部分直接或通过连接子间接连接。
根据权利要求10所述的抗原结合蛋白，所述连接子包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-11中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含所述第一靶向部分的抗体重链或其抗原结合片段、任选存在或不存在的连接子以及所述第二靶向部分的抗体或其抗原结合片段，且所述第二多肽链包含所述第一靶向部分的抗体轻链或其抗原结合片段。
根据权利要求12所述的抗原结合蛋白，所述第一多肽链包含：所述第一靶向部分的重链可变区-第一靶向部分的重链恒定区-X-所述第二靶向部分的可变区-所述第二靶向部分的恒定区，以及所述第二多肽链包含：所述第一靶向部分的轻链可变区-第一靶向部分的轻链恒定区，其中所述X为不存在或者包含所述连接子。
根据权利要求12-13中任一项所述的抗原结合蛋白，所述第一多肽链自N端至C端依次包含第一靶向部分的抗体重链或其抗原结合片段和所述第二靶向部分的抗体或其抗原结合片段；或者，所述第一多肽链自N端至C端依次包含第一靶向部分的抗体重链或其抗原结合片段，连接子和所述第二靶向部分的抗体或其抗原结合片段。
一种核酸，其编码权利要求1-14中任一项所述的抗原结合蛋白。
一种载体，其包含权利要求15所述的核酸。
一种免疫缀合物，其包含权利要求1-14中任一项所述的抗原结合蛋白。
一种细胞，其包含权利要求1-14中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求15所述的核酸、权利要求16所述的载体、和/或权利要求17所述的免疫缀合物。
一种药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求15所述的核酸、权利要求16所述的载体、权利要求17所述的免疫缀合物、和/或权利要求18所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
一种试剂盒，其包含权利要求1-14中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求15所述的核酸、权利要求16所述的载体、权利要求17所述的免疫缀合物、权利要求18所述的细胞、和/或权利要求19所述的药物组合物。
一种制备权利要求1-14中任一项所述的抗原结合蛋白的方法，其包括在使得所述抗原结合蛋白能够表达的条件下培养权利要求18所述的细胞。
一种权利要求1-14中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求15所述的核酸、权利要求16所述的载体、权利要求17所述的免疫缀合物、权利要求18所述的细胞、权利要求19所述的药物组合物、和/或权利要求30所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
根据权利要求22所述的用途，其中所述肿瘤包括PD-1、PD-L1和/或VEGF高表达的肿瘤。
根据权利要求22-23中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
根据权利要求22-24中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括结直肠癌、乳腺癌、母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、肾癌、食管癌、头颈癌、淋巴瘤、肝癌和/或胃癌。
一种抑制PD-1蛋白与PD-L1蛋白和/或PD-L2蛋白结合，和/或抑制VEGF蛋白与VEGFR蛋白结合的方法，所述方法包含施用权利要求1-14中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求15所述的核酸、权利要求16所述的载体、权利要求17所述的免疫缀合物、权利要求18所述的细胞、权利要求19所述的药物组合物、和/或权利要求20所述的试剂盒。
一种调控免疫反应的方法，所述方法包含施用权利要求1-14中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求15所述的核酸、权利要求16所述的载体、权利要求17所述的免疫缀合物、权利要求18所述的细胞、权利要求19所述的药物组合物、和/或权利要求20所述的试剂盒。
根据权利要求27所述的方法，所述调控免疫反应包含刺激免疫细胞分泌细胞因子。