CN109476762A - 多特异性抗原结合蛋白及其使用方法 - Google Patents

多特异性抗原结合蛋白及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，该多特异性抗原结合蛋白包含含有重链可变结构域和轻链可变结构域的第一抗原结合结构域，和含有单域抗体的第二抗原结合结构域。本发明还提供了药物组合物，该药物组合物包含多特异性抗原结合蛋白、试剂盒及其使用方法。

Description

多特异性抗原结合蛋白及其使用方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2016年7月20日提交的国际专利申请PCT/CN2016/090703的优先权权益，该申请的内容全部以引用方式并入本文。
提交序列表的ASCII文本文件
将以下以ASCII文本文件提交的内容全文以引用方式并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：761422000241SEQLIST.txt，记录日期：2017年7月10日，大小：14KB)。
技术领域
本发明涉及包含至少一种单域抗体的多特异性抗原结合蛋白(MABP)及其使用方法。
背景技术
单克隆抗体(mAb)已被广泛用作治疗剂以治疗各种人类疾病，诸如癌症和自身免疫性疾病。目前，存在超过30种已被FDA批准用于治疗用途的单克隆抗体，包括鼠抗体、完全人源化抗体和嵌合抗体。利妥昔单抗和曲妥珠单抗是其中最畅销的针对癌症的蛋白质治疗剂。最近，靶向免疫检查点分子的单克隆抗体，诸如伊匹单抗(例如，)和纳武单抗(例如)通过诱导针对肿瘤的T细胞免疫而示出令人鼓舞的临床结果。因为许多患者对单一治疗方法反应不佳，所述单克隆抗体通常与其它免疫调节方法(诸如针对其它靶的单克隆抗体)联合，以增强其功效。例如，临床研究已经展示出纳武单抗和伊匹单抗的组合导致黑色素瘤患者中改善的客观反应率。
随着分子克隆技术的发展和不断增长的抗体工程化知识，已经演变出许多形式来增加治疗性抗体的靶向能力。多特异性(例如双特异性)抗体被设计成用于同时调节两种或更多种治疗靶，以便提供增强的治疗功效和扩大的潜在效用。据报道双特异性抗体可比两种单克隆抗体的简单组合更有效。已经开发了多种多特异性抗体形式。例如，已经通过将抗原结合(Fab)片段或单链可变片段(scFv)与单克隆抗体融合来制备双特异性抗体(参见，例如Weidle等人，Cancer Genomics&Proteomics 2013；10:1-18)。已经使用scFv开发了双特异性T细胞衔接体(BiTE)以将肿瘤细胞与免疫细胞桥接并通过利用它们相对小的尺寸形成免疫突触。呈IgG形式的双特异性抗体包括不对称双特异性抗体和同源化双特异性抗体，其全部均具有延长的血液半衰期和其自身结晶片段(Fc)介导的功能。不同形式的多特异性抗体的尺寸不同，通常由不同的技术产生，并且具有不同的体内分布、组织渗透和药代动力学特性。
尽管它们具有概念上的优势，但当前双特异性抗体作为生物药物进行制造和开发具有挑战性。作为人工构建体，双特异性抗体不能由正常的B细胞产生。产生双特异性抗体的最初尝试涉及单特异性抗体的化学缀合和mAb-表达细胞的融合，但是这些方法遭受低效率，并且需要从大量副产物中纯化。蛋白质工程和分子生物学中的先进方法使得多种新双特异性抗体形式能够重组构建。然而，一旦采用这些已知的工程化双特异性抗体形式，单一组分，诸如scFv和mAb就丧失其有利的生物化学和/或生物物理学特性、血清半衰期和/或稳定性，从而导致较差功效、不稳定性和高免疫原性。参见，例如Fan G.等人，J.Hematol&Oncol，2015；8:130。此外，许多已知的双特异性抗体形式与对于工业生产而言不切实际的低表达水平相关联。因此，仍然需要用于实际生产并开发成生物药物的双特异性抗体平台。
单域抗体(sdAb)是各自具有单一单体抗体可变结构域的抗体片段。尽管它们的尺寸比具有两个重链和两个轻链的常见单克隆抗体小得多，但sdAb可以与mAb相似的亲和力和特异性结合抗原。用作构建块，sdAb可与IgG Fc结构域融合以产生IgG样抗体，包括二价和双特异性抗体(参见，例如，Hmila I.等人，Mol.Immunol.2008；45：3847-3856)。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请的公开内容据此全文以引用方式并入本文。
发明内容
本申请提供了多特异性抗原结合蛋白(MABP)，该多特异性抗原结合蛋白包含与全长四链抗体融合的一种或多种单域抗体(sdAb)或由其衍生的抗原结合片段。
因此，本申请的一个方面提供了MABP，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的单域抗体(sdAb)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，第一表位和第二表位来自相同抗原。在一些实施方案中，第一表位和第二表位来自不同抗原。在一些实施方案中，MABP为双特异性的。
在根据上述MABP中任一项所述的一些实施方案中，第一抗原结合部分为全长抗体，所述全长抗体由两个重链和两个轻链组成。在一些实施方案中，第一抗原结合部分为包含含有VH的重链和含有VL的轻链的抗体片段。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含单一多肽链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的C末端与第一抗原结合部分的至少一个重链的N-末端融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的C末端与第一抗原结合部分的至少一个轻链的N-末端融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的N末端与第一抗原结合部分的至少一个重链的C-末端融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的N末端与第一抗原结合部分的至少一个轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分为Fab样结构域，所述Fab样结构域包含含有与CH1结构域融合的第一sdAb的第一多肽链，和含有与CL结构域融合的第二sdAb的第二多肽链。
在根据上述MABP中任一项所述的一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。
在根据上述MABP中任一项所述的一些实施方案中，第一抗原结合部分包含Fc区。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与Fc区的N-末端融合。在一些实施方案中，Fc区为IgG1 Fc。在一些实施方案中，Fc区为具有S228P突变的IgG4 Fc，诸如IgG4 Fc。
在根据上述MABP中任一个的一些实施方案中，所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分经由肽键或肽接头彼此融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25、20或15中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分在化学上彼此融合。
在根据上述MABP中任一个的一些实施方案中，sdAb为骆驼sdAb、人源化sdAb或人sdAb。
在根据上述MABP中任一个的一些实施方案中，所述第一表位来自免疫检查点分子。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7-H3、TIM-3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分为抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体选自派姆单抗(例如，)和纳武单抗(例如，)。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分为抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体为度伐鲁单抗或阿特朱单抗。在一些实施方案中，sdAb特异性结合免疫检查点分子，诸如选自下列的免疫检查点分子：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7-H3、TIM-3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗-CTLA-4 sdAb。
在根据上述MABP中任一个的一些实施方案中，第一表位来自肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原选自：HER2、BRAF、EGFR、VEGFR2、CD20、RANKL、CD38和CD52。在一些实施方案中，第一抗原结合部分为抗-HER2抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-HER2抗体为曲妥珠单抗。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗-CD3 sdAb。
在根据上述MABP中任一个的一些实施方案中，第一表位来自血管生成因子。在一些实施方案中，第一抗原结合部分为抗-Ang2抗体或其抗原结合片段，诸如LC10。在一些实施方案中，第二表位来自第二血管生成因子。在一些实施方案中，第二抗原结合部分为抗-VEGF sdAb。
在根据上述MABP中任一个的一些实施方案中，第一表位来自促炎分子。在一些实施方案中，所述促炎分子选自IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-6、IL-6R和嗜酸细胞活化趋化因子-1。在一些实施方案中，第一抗原结合部分为抗-TNF-α抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-TNF-α抗体为阿达木单抗。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗-IL-1βsdAb。在一些实施方案中，第一抗原结合部分为抗-IL-5抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-IL-5抗体为美泊利单抗。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗-嗜酸细胞活化趋化因子-1 sdAb。
在根据上述MABP中任一个的一些实施方案中，MABP可以至少约10mg/L，诸如至少约10mg/L、15mg/L、50mg/mL或更高的表达水平，诸如在哺乳动物细胞(例如CHO细胞)中重组产生。在一些实施方案中，MABP具有至少约100mg/mL，诸如至少约150mg/mL、200mg/mL或更高的溶解度。在一些实施方案中，MABP具有至少约65℃，诸如约65℃至约75℃的聚集起始温度(Tagg)。在一些实施方案中，MABP具有至少约65℃，诸如约65℃至约75℃的展开中点温度(Tm)。在一些实施方案中，在至少约50mg/mL的浓度下，MABP在25℃下稳定至少约一周。在一些实施方案中，在至少约50mg/mL的浓度下，MABP在37℃下稳定至少约一周。在一些实施方案中，在至少50mg/mL的浓度下，MABP在至少约5个冻-融循环后是稳定的。
本申请的另一个方面提供了药物组合物，所述药物组合物包含上述MABP中的任一种和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，MABP的浓度为至少约100mg/mL，诸如至少约150mg/mL、200mg/mL或更高。
本申请的一个方面还提供了治疗个体的疾病的方法，所述方法包括向个体施用有效量的上述药物组合物中的任一种。在一些实施方案中，所述疾病为癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，所述疾病为炎性或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病选自关节炎(诸如类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、牛皮鲜性关节炎、强直性脊柱炎和关节炎性溃疡性结肠炎)、结肠炎、牛皮鲜、重度哮喘和中度至重度克罗恩病。
附图说明
图1描绘了示例性双特异性抗原结合蛋白(在本文中也称为“BABP”)的示意性结构，其包含单特异性全长抗体，所述单特异性全长抗体具有两个相同的重链和两个相同的轻链以及sdAb，其中sdAb的N-末端经由任选的肽接头与一个重链的C-末端融合。所述全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。sdAb特异性结合所述第二表位。例如，BABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；(3)VH-CH1-CH2-CH3；以及(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且VHH特异性结合第二表位。
图2描绘了示例性BABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体，以及两个相同的sdAb，其中两个sdAb彼此融合，并且一个sdAb的N-末端经由任选的肽接头与重链的C-末端融合。所述全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。两个sdAb特异性结合第二表位。例如，BABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-VHH-VHH；(3)VH-CH1-CH2-CH3；以及(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。
图3描绘了示例性三特异性抗原结合蛋白(本文也被称为“TABP”)的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体，第一sdAb和第二sdAb，其中所述第一sdAb和第二sdAb经由任选的肽接头彼此融合，并且第一sdAb的N-末端经由任选的肽接头与重链的C-末端融合。所述全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。第一sdAb特异性结合第二表位。第二sdAb特异性结合第三表位。例如，TABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-VHH1-VHH2；(3)VH-CH1-CH2-CH3；以及(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，VHH1特异性结合第二表位，并且VHH2特异性结合第三表位。
图4描绘了示例性BABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体，以及两个相同的sdAb，其中每个sdAb的N-末端经由任选的肽接头与一个重链的C末端融合。全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。两个sdAb特异性结合第二表位。例如，BABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；(3)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；以及(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在另选的形式中，每个sdAb均可被彼此融合的sdAb的两个拷贝替代。
图5描述了示例性BABP的示意性结构，其包含具有重链和轻链的单特异性Fab，以及两个相同的sdAb，其中sdAb的N-末端经由任选的肽接头与重链的C-末端融合，并且其它sdAb经由任选的肽接头与Fab的轻链的C-末端融合。Fab特异性结合第一表位。两个sdAb特异性结合第二表位。例如，BABP可由两个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL-VHH；和(2)VH-CH1-VHH，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。
图6描绘了示例性TABP的示意性结构，其包含具有两个重链和两个轻链的双特异性全长抗体，以及两个相同的sdAb，其中每个sdAb的N-末端经由任选的肽接头与一个重链融合。所述全长抗体具有特异性结合第一表位的第一抗原结合位点，和特异性结合第三表位的第二抗原结合位点。两个sdAb特异性结合第二表位。例如，TABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL1-CL；(2)VH1-CH1-CH2-CH3-VHH；(3)VH2-CH1-CH2-CH3-VHH；以及(4)VL2-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH1和VL1形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH2和VL2形成特异性结合第三表位的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。
图7描绘了示例性TABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体、第一sdAb、和第二sdAb，其中每个sdAb的N-末端经由任选的肽接头与一个重链融合。所述全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。第一sdAb特异性结合第二表位。第二sdAb特异性结合第三表位。例如，TABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-VHH1；(3)VH-CH1-CH2-CH3-VHH2；以及(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，VHH1特异性结合第二表位，并且VHH2特异性结合第三表位。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。所述单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体替代以进一步扩展结合特异性。
图8描绘了示例性四特异性抗原结合蛋白的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的双特异性全长抗体、第一sdAb和第二sdAb，其中每个sdAb的N-末端经由任选的肽接头与一个重链融合。所述全长抗体具有特异性结合第一表位的第一抗原结合位点，和特异性结合第三表位的第二抗原结合位点。第一sdAb特异性结合第二表位。第二sdAb特异性结合第四表位。例如，四特异性抗原结合蛋白可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL1-CL；(2)VH1-CH1-CH2-CH3-VHH1；(3)VH2-CH1-CH2-CH3-VHH2；以及(4)VL2-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH1和VL1形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH2和VL2形成特异性结合第三表位的抗原结合位点，VHH1特异性结合第二表位，并且VHH2特异性结合第四表位。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。
图9描绘了示例性BABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体，以及两个相同的sdAb，其中每个sdAb的C-末端与一个重链的N-末端融合。全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。两个sdAb特异性结合第二表位。例如，BABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL；(2)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；以及(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。所述单特异性全长抗体可用双特异性全长抗体替代以进一步扩展结合特异性。
图10描绘了示例性TABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体、第一sdAb、和第二sdAb，其中每个sdAb的C-末端与一个重链的N-末端融合。所述全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。第一sdAb特异性结合第二表位。第二sdAb特异性结合第三表位。例如，TABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL；(2)VHH1-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH2-VH-CH1-CH2-CH3；以及(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，VHH1特异性结合第二表位，并且VHH2特异性结合第三表位。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。所述单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体替代以进一步扩展结合特异性。
图11描绘了示例性BABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体，以及两个相同的sdAb，其中每个sdAb的N-末端经由任选的肽接头与一个轻链的C-末端融合。全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。两个sdAb特异性结合第二表位。例如，BABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL-VHH；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；以及(4)VL-CL-VHH，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。所述单特异性全长抗体可用双特异性全长抗体替代以进一步扩展结合特异性。
图12描绘了示例性TABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体、第一sdAb、和第二sdAb，其中每个sdAb的N-末端经由任选的肽接头与一个轻链的C-末端融合。全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。第一sdAb特异性结合第二表位。第二sdAb特异性结合第三表位。例如，TABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL-VHH1；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；以及(4)VL-CL-VHH2，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，VHH1特异性结合第二表位，并且VHH2特异性结合第三表位。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。所述单特异性全长抗体可用双特异性全长抗体替代以进一步扩展结合特异性。
图13描绘了示例性BABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体，以及两个相同的sdAb，其中每个sdAb的C-末端经由任选的肽接头与一个轻链的N-末端融合。全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。两个sdAb特异性结合第二表位。例如，BABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VHH-VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；以及(4)VHH-VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。所述单特异性全长抗体可用双特异性全长抗体替代以进一步扩展结合特异性。
图14描绘了示例性TABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体、第一sdAb、和第二sdAb，其中每个sdAb的C-末端经由任选的肽接头与一个轻链的N-末端融合。全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。第一sdAb特异性结合第二表位。第二sdAb特异性结合第三表位。例如，TABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VHH1-VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；以及(4)VHH2-VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，VHH1特异性结合第二表位，并且VHH2特异性结合第三表位。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。所述单特异性全长抗体可用双特异性全长抗体替代以进一步扩展结合特异性。
图15描绘了示例性TABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体、两个相同的第一sdAb、和两个相同的第二sdAb，其中每个第一sdAb的C-末端经由任选的肽接头与一个重链的N-末端融合，并且每个第二sdAb的N-末端经由任选的肽接头与一个重链的C-末端融合。全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。第一sdAb特异性结合第二表位。第二sdAb特异性结合第三表位。例如，TABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL；(2)VHH1-VH-CH1-CH2-CH3-VHH2；(3)VHH1-VH-CH1-CH2-CH3-VHH2；以及(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，每个VHH1特异性结合第二表位的拷贝，并且每个VHH2特异性结合第三表位的拷贝。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。所述单特异性全长抗体可用双特异性全长抗体替代以进一步扩展结合特异性。
图16描绘了示例性TABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体、两个相同的第一sdAb、和两个相同的第二sdAb，其中每个第一sdAb的C-末端经由任选的肽接头与一个轻链的N-末端融合，并且每个第二sdAb的N-末端经由任选的肽接头与一个重链的C-末端融合。全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。第一sdAb特异性结合第二表位。第二sdAb特异性结合第三表位。例如，TABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VHH1-VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-VHH2；(3)VH-CH1-CH2-CH3-VHH2；以及(4)VHH1-VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，每个VHH1特异性结合第二表位的拷贝，并且每个VHH2特异性结合第三表位的拷贝。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。所述单特异性全长抗体可用双特异性全长抗体替代以进一步扩展结合特异性。
图17描绘了示例性BABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体，以及四个相同的sdAb，其中每个sdAb的C-末端经由任选的肽接头与单特异性全长抗体的重链或轻链的N-末端融合。全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。每个sdAb特异性结合第二表位。例如，BABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VHH-VL-CL；(2)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；以及(4)VHH-VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。所述单特异性全长抗体可用双特异性全长抗体替代以进一步扩展结合特异性。
图18描绘了示例性BABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体，以及四个相同的sdAb，其中融合到每个重链的N-末端的是两个相同的sdAb，并且两个sdAb经由任选的肽接头彼此融合。全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。每个sdAb特异性结合第二表位。例如，BABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL；(2)VHH-VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VHH-VH-CH1-CH2-CH3；以及(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。所述单特异性全长抗体可用双特异性全长抗体替代以进一步扩展结合特异性。
图19描绘了示例性BABP的示意性结构，其包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体和两个相同的sdAb，其中每个sdAb的N-末端经由任选的肽接头与CH1区的C-末端融合，并且每个sdAb的C-末端与单特异性全长抗体的CH2区的N-末端融合。全长抗体具有特异性结合第一表位的两个抗原结合位点。每个sdAb特异性结合第二表位。例如，BABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-VHH-CH2-CH3；(3)VH-CH1-VHH-CH2-CH3；以及(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在另选的形式中，每个sdAb可省略，或被彼此融合的两个相同或不同的sdAb替代。所述单特异性全长抗体可用双特异性全长抗体替代以进一步扩展结合特异性。在另选的形式中，为了扩展特异性，两个Fab片段可特异性结合不同的表位，和/或VHH片段可特异性结合不同的表位。
图20描绘了示例性BABP的示意性结构，其包含两个相同的单链可变片段(scFv)、两个相同的sdAb和片段可结晶(Fc)区，其中每个sdAb的N-末端经由任选的肽接头与scFv的C-末端融合，并且每个sdAb的C-末端与Fc区的N-末端融合。每个scFv特异性结合第一表位。每个sdAb特异性结合第二表位。例如，BABP可由两个多肽链组成，其各自从N-末端到C-末端的结构如下VL-VH-VHH-CH2-CH3，其中每个多肽链的VH和VL形成特异性结合第一表位的拷贝的scFv结构域，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在另选的形式中，scFv结构域从N-末端到C-末端可包含：VH-VL。另选地，为了扩展特异性，两个scFv可特异性结合不同的表位，和/或VHH片段可特异性结合不同的表位。
图21描绘了示例性BABP的示意性结构，其包含两个相同的抗原结合(Fab)片段，两个相同的Fab样片段各自包含两个VHH片段和Fc区。在每个Fab样结构域中，VH和VL区各自由sdAb替代。每个Fab片段特异性结合第一表位，并且每个Fab样片段特异性结合第二表位。例如，BABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VL-CL-VHH-CL；(2)VH-CH1-VHH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-VHH-CH1-CH2-CH3；以及(4)VL-CL-VHH-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第一拷贝的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第一表位的第二拷贝的抗原结合位点，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在另选的形式中，为了扩展特异性，两个Fab片段可特异性结合不同的表位，和/或Fab-样片段可特异性结合不同的表位。
图22描绘了示例性BABP的示意性结构，其包含两个相同的scFv，两个相同的Fab样片段各自包含两个VHH片段和Fc区。在每个Fab样结构域中，VH和VL区各自由sdAb替代。例如，BABP可由四个多肽链组成，其中从N-末端到C-末端的结构如下：(1)VHH-CL；(2)VL-VH-VHH-CH1-CH2-CH3；(3)VL-VH-VHH-CH1-CH2-CH3；和(4)VHH-CL，其中多肽链(2)和(3)的VH和VL各自形成特异性结合第一表位的拷贝的scFv，并且每个VHH特异性结合第二表位的拷贝。在另选的形式中，scFv的C-末端可与包含VHH-CL的Fab样片段中的链的N-末端融合；和/或scFv结构域从N-末端到C-末端可包含：VH-VL。另选地，为了扩展特异性，两个scFv可特异性结合不同的表位，和/或VHH片段可特异性结合不同的表位。
图23示出得自BABP BCP-75和BCP-79在C56BL/6 PD-1 KI小鼠的MC38同系模型中的体内功效实验的结果。将BABP的结果与两种主链4-链抗体(内部表达的生物相似抗体，派姆单抗和纳武单抗)那些结果进行比较
图24示出得自BABP BCP-75和BCP-79在C56BL/6 CTLA-4 KI小鼠的MC38同系模型中的体内功效实验的结果。将BABP的结果与包含sdAb-2或sdAb-3的Fc融合蛋白的那些结果进行比较，其中Fc片段与内部表达的生物相似抗体，派姆单抗和纳武单抗相同。IgG1同种型的内部表达的伊匹单抗用作该实验的阳性对照。
图25示出相比于联合疗法，得自BABP BCP-84和BCP-85在C56BL/6CTLA-4 KI小鼠的人PD-L1 KI MC38同系模型中的体内功效实验的结果。
图26A和图26B示出相比于联合疗法，得自BABP BCP-49在BALB/c裸鼠的A431异种移植模型中的体内功效实验的结果。
具体实施方式
本申请提供了MABP，其包含单域抗体(sdAb)，所述单域抗体与包含重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)的全长抗体或抗原结合片段融合。sdAb特异性结合与由全长抗体或抗原结合片段识别的靶不同的靶(诸如表位或抗原)，从而赋予扩展的靶向能力。作为MABP中的构造块，sdAb具有优于其它抗原结合片段(诸如用于目前已知的多特异性抗体形式中的Fab和scFv)的多个优点，包括但不限于小尺寸、高溶解度和稳定性、人体中的弱免疫原性、和靶向各种表位的能力。因此，与全长抗体或抗原结合片段组分的那些相比，本文所述的MABP可具有相似的分子量和药代动力学特性。例如，MABP可通过使一种或多种sdAb与具有已证实的临床功效和安全性的单克隆抗体融合来设计，以提供增加的临床有益效果和期望的药代动力学特性，但不妨碍多特异性构建体的可表达性。在一些实施方案中，MABP包含通过多肽接头彼此融合的两种天然产生的组分或其衍生物，例如天然产生的或人源化的骆驼VHH片段，和天然产生的单克隆抗体。与大多数已知的双特异性抗体形式不同，本申请的MABP具有优异的生产率、稳定性和溶解度。体外功效数据还指示MABP保留了亲本抗体的抗-肿瘤活性。在体内肿瘤动物模型中也发现或预期了协同活性。本申请的MABP形式可用于靶向多种疾病相关的表位或抗原组合，诸如免疫检查点分子的组合、细胞表面抗原(诸如肿瘤抗原)的组合、或促炎分子的组合，从而提供可用于治疗各种疾病和病症，诸如癌症、炎症和自身免疫性疾病的试剂。
因此，本申请的一个方面提供了MABP，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。
本申请的一个方面提供了MABP，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一免疫检查点分子的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二免疫检查点分子的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。
本申请的一个方面提供了MABP，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一促炎分子的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二促炎分子的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。
本申请的一个方面提供了MABP，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一肿瘤抗原的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合细胞表面抗原(诸如肿瘤抗原、或免疫效应细胞上的表面抗原)sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。
本文还提供了包含MABP的药物组合物、试剂盒和制品，以及使用本文所述的MABP治疗疾病的方法。
I.定义
除非相反地特别说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，其中许多出于说明性目的在下文进行描述。此类技术在文献中作出了充分地说明。参见例如Current Protocols inMolecular Biology or Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,NewYork,N.Y.(2009)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley&Sons,1995；Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版，2001)；Maniatis等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning:APractical Approach,vol.I&II(D.Glover编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编辑，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins编辑，1985)；Transcriptionand Translation(B.Hames&S.Higgins编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney编辑，1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)以及其它类似的文献。
如本文所用，术语“治疗”是指被设计用于改变临床病理学过程中治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预。期望的治疗效果包括减小疾病进展速度、改善或缓解疾病状态、以及缓解或改善预后。例如，如果减轻或消除与治疗的疾病或病症(诸如癌症、炎症或自身免疫疾病)相关联的一种或多种症状，则个体被本申请的MABP成功“治疗”。
如本文所用，“有效量”是指有效治疗受试者的疾病或病症的药剂或药物的量。在癌症的情况下，本申请的MABP的有效量可降低癌细胞的数量；降低肿瘤尺寸；抑制(即，缓慢至一定程度并优选阻止)癌细胞浸润到周边器官中；抑制(即，缓慢至一定程度并优选阻止)肿瘤癌细胞转移；在一定程度上，抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关联的一种或多种症状。如临床环境中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效量可以或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物结合实现。因此，可在施用一种或多种治疗剂的情况下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其它药剂结合，则可认为以有效量给出单一药剂，可实现或实现期望的结果。
如本文所用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物、或灵长类。在一些实施方案中，所述个体为人。
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长4-链抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子、以及抗体片段(例如，Fab、F(ab′)2和Fv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”互换使用。本文设想的抗体仅包括重链抗体和sdAb。
基础的4-链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基础异源四聚体单元连同被称为J链的附加多肽组成，并且包含10个抗原结合位点，然而IgA抗体包含2-5个基础4-链单元，其可聚合以与J链组合形成多价组合体。在IgG的情况下，4-链单元一般为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，然而两个H链通过一个或多个二硫键彼此连接，这取决于H链同种型。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每个H链在N-末端处具有可变结构域(VH)，之后是α和γ链中每一个的三个恒定结构域(CH)和μ和ε同种型的四个CH结构域。每个L链在N-末端处具有可变结构域(VL)，之后是其另一端处的恒定结构域。VL与VH对齐，并且CL与重链(CH1)的第一恒定结构域对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对一起形成单一抗原结合位点。对于不同种类的抗体的结构和特性，参见例如，Basic andClinical Immunology，第8版，Daniel P.Sties，Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw(编辑)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994，第71页和第6章。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将来自任何脊椎动物物种的L链分配给两种明显不同类型(被称为κ和λ)中的一种。取决于其重链(CH)的恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分配到不同的类别或同种型。存在五种类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能的相对微小的差异，γ和α类进一步分成亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
“分离的”抗体是已从其生产环境的组分(例如，天然的或重组的)中鉴定、分离和/或回收的抗体。优选，分离的多肽不与来自其生产环境的所有其它组分缔合。其生产环境的污染组分，诸如得自重组转染细胞的，是通常可干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，所述多肽将纯化：(1)至大于95重量％抗体，如例如通过Lowry法所确定的，并且在一些实施方案中，至大于99％重量；(1)至足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，其通过使用旋转杯测序仪确定，或(3)至均质性，如通过在非还原或还原条件下使用考马斯蓝，或优选银染色的SDS-PAGE确定的。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境中的至少一个组分将不存在。然而，通常，分离的多肽或抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域一般是抗体的最可变部分(相对于同一类的其它抗体)并且包含抗原结合位点。来自骆驼科物种的仅重链抗体具有单一重链可变区，其被称为“VHH”。因此VHH为特定类型的VH。
术语“可变的”指抗体之间可变结构域的某些区段在序列方面区别很大的事实。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性不均匀分布在可变结构域的整个跨度内。相反，它集中在轻链和重链可变结构域两者中被称为高变区(HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，其主要采用β-片构型，通过三个HVR连接，其形成连接环连接，并且在一些情况下形成β-片结构的一部分。每个链中的HVR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且与来自其它链的HVR一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见，Kabat等人，Sequences of Immunological Interest，第五版，National Institute of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自基本上同质抗体的抗体，即除了可以微量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体相同。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单一抗原位点。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点还在于其通过杂交瘤培养合成，不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示抗体的特征在于得自基本上同质的抗体群，并且不应被理解为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本申请的待使用的单克隆抗体可通过多种技术来制备，包括，例如杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein，Nature，256:495-97(1975)；Hongo等人，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)，Harlow等人，Antibodies:ALaboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人，于：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981))中，重组DNA法(参见，例如，美国专利4,816,567)，噬菌体展示技术(参见，例如，Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222，581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)，以及用于在动物中产生人抗体或人样抗体的技术，所述动物具有编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部(参见，例如，WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等人，Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368:856-859(1994)；Morrison，Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger，NatureBiotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
术语“裸抗体”是指不与细胞毒性部分或放射性标记物缀合的抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换使用，以指呈其基本上完整形式的抗体，如与抗体片段相对。具体地讲，全长4-链抗体包括具有包括Fc区的重链和轻链的抗体。恒定结构域可以为天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一个或多个效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段的示例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利5,641,870，实施例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生被称为“Fab”片段的两个相同抗原结合片段，和残余的“Fc”片段，命名反映了易于结晶的能力。Fab片段由整个L链连同H链的可变区结构域(VH)和一个重链(CH1)的第一恒定结构域组成。每个Fab片段相对于抗原结合是单价的，即其具有单一抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单一大F(ab′)2片段，其大致对应于两个二硫键连接的具有不同抗原结合活性的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端处具有一些附加残基，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中Fab'的名称，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离的硫醇基团。F(ab′)2抗体片段最初以Fab'片段对形式产生，在所述片段对之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两个H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列确定，所述区域也被存在于特定类型细胞中的Fc受体(FcR)识别。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。由这两个结构域的折叠散发六个高变环(来自H链和L链各3个环)，其有助于氨基酸残基的抗原结合并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单一可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，亲和力也低于整个结合位点。
也缩写为“sFv”或“scFv”的“单链Fv”是包含连接到单一多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选，sFv多肽还包含介于VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得sFv能够形成抗原结合的所需结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
本文所述的抗体的“功能性片段”包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合区或可变区或保留或具有修饰的FcR结合能力的抗体Fc区。抗体片段的示例包括线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“双抗体”是指通过在VH和VL结构域之间构建sFv片段(参见前段，利用短接头(约5-10个)残基)，使得V结构域的链间配对而不是链内配对被实现，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段来制备的小抗体片段。双特异性抗体是两个“交叉”sFv片段的异源二聚体，其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更详细地描述于下列文献中：例如，EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。
本文的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，然而链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性即可(美国专利4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括抗体，其中抗体的抗原结合区来源于通过例如用感兴趣的抗原免疫猕猴产生的抗体。如本文所用，“人源化抗体”使用“嵌合抗体”的子集。
“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的HVR(下文所定义)的残基被来自具有期望的特异性、亲和力、和/或能力的非人物种(供体抗体)，诸如小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类动物的HVR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架(“FR”)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含不存于受体抗体或供体抗体中的残基。可进行这些修改以进一步改善抗体性能，诸如结合亲和力。一般来讲，人源化抗体将包含至少一个，并且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白序列的那些，并且全部或基本上全部的FR区域是人免疫球蛋白序列的那些，但FR区域可包括一个或多个单独的FR残基取代基，所述取代基改善抗体性能，诸如结合亲和力、异构化、免疫原性等。FR中的这些氨基酸取代基的数量通常在H链中不超过6，并且在L链中不超过3。人源化抗体任选地还将包含通常为人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。对于其它细节，参见，例如，Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见，例如，Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；和美国专利6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或使用如本文公开的用于制备人抗体的技术中的任一种所制备的抗体。人抗体的该定义明确地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的多种技术，包括噬菌体展示文库来制备人抗体。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581(1991)。还可用于制备人单克隆抗体的是描述于下列文献中的方法：Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，J.Immunol.，147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人抗体可通过将抗原施用于转基因动物来制备，所述转基因动物已被修饰以产生响应于抗原攻击的此类抗体，但其内源性基因座已被禁用，例如免疫异源小鼠(参见，例如，关于XENOMOUSETM技术的美国专利6,075,181和6,150,584)。还可参见，例如，Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)，其关于经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的区域，其序列是高变的和/或形成在结构上限定的环。一般来讲，4-链抗体包含六个HVR；三个在VH(H1、H2、H3)中，并且三个在VL(L1、L2、L3)中。单域抗体包含三个HVR，诸如在VHH(H1、H2、H3)中的三个。在天然的4-链抗体中，H3和L3展示出六个HVR的最大多样性，具体地讲，据信H3在赋予抗体良好特异性方面起到独特的作用。参见，例如，Xu等人，Immunity 13:37-45(2000)；Johnson和Wu，Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo编辑，Human Press，Totowa，N.J.，2003)。实际上，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在不存在轻链的情况下是功能性且稳定的。参见，例如，Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人，Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
术语“互补性决定区”或“CDR”用于指高变区，如由Kabat系统所定义的。参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)
多个HVR描述处于使用中并且被本文所涵盖。Kabat互补决定区域(CDR)基于序列可变性，并且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，并且通过OxfordMolecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR基于可用的复合晶体结构的分析。这些HVR中的每一个的残基在下表I中示出。
表I：HVR描述。
HVR可包含如下所示的“扩展的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)以及89-97或89-96(L3)，和VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)以及93-102、94-102或95-102(H3)。就这些定义中的每一个而言，可变结构域残基根据Kabat等人(同上)编号。
表述“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变型形式，是指Kabat等人(同上)中用于抗体编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或附加氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或插入可变结构域的FR或HVR中。例如，重链可变结构域可包括H2的残基52后的单一氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82后的插入的残基(例如，根据Kabat，残基82a、82b和82c等)。给定抗体的残基的Kabat编号可通过在抗体序列的同源性区域与“标准”Kabat编号序列的比对来确定。
“框架”或“FR”残基是除了本文所定义的HVR残基之外的那些可变结构域残基。
“人共有框架”或“受体人框架”是代表选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列时最常出现的氨基酸残基的框架。一般来讲，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。一般来讲，序列的亚组是Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)中的亚组。示例包括对于VL而言，所述亚组可以为亚组κI、κII、κIII或κIV，如Kabat等人，同上。另外，对于VH而言，亚组可以为亚组I、亚组II、或亚组III，如Kabat等人中所述。另选地，人共有框架可来源于上述亚组，其中特定残基(诸如人框架残基)通过将供体框架序列与各种人框架序列的集合进行比对，基于其与供体框架的同源性来选择。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或者其可包含预先存在的氨基酸序列变化。在一些实施方案中，预先存在的氨基酸变化数是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。
在特定位置处(例如Fc区)的“氨基酸修饰”是指特定残基的取代或缺失，或邻近指定残基的至少一个氨基酸残基的插入。“邻近”指定残基的插入是指在其一个至两个残基内的插入。插入可为指定残基的N-末端或C-末端。本文优选的氨基酸修饰为取代。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个HVR中具有一种或多种改变的抗体，与不具有那些改变的亲本抗体相比，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体具有对靶抗原的纳米摩尔或甚至皮摩尔亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域中已知的程序来制备。例如Marks等人，Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH-结构域和VL-结构域混编的亲和力成熟。HVR和/或框架残基的随机诱变例如由以下文献描述：Barbas等人Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人Gene 169:147-155(1995)；Yelton等人J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；以及Hawkins等人，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
如本文所使用的，术语“特异性地结合”或“对……具有特异性”是指可测量且可再现的相互作用，诸如靶和抗体之间的结合，其在分子诸如生物分子的异质群的存在下对于靶的存在具有决定性。例如，特异性结合靶的抗体(其可以为表位)是以比其结合其它靶更大亲和力、亲合力、更容易和/或更长持续时间来结合该靶的抗体。在一个实施方案中，抗体与无关靶的结合程度少于抗体对靶的结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定(RIA)所测量的。在某些实施方案中，特异性结合靶的抗体具有≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM或≦0.1nM的离解常数(Kd)。在某些实施方案中，抗体特异性地结合蛋白质上的表位，所述蛋白质在来自不同物种的蛋白质中是保守的。在另一个实施方案中，特异性结合可包括，但不需要排他性结合。
术语“特异性”是指选择性识别针对抗原特定表位的抗原结合蛋白或抗体。例如，天然抗体是单特异性的。如本文所用，术语“多特异性”表示抗原结合蛋白或抗体具有两个或更多个抗原结合位点，其中至少两个结合不同抗原或相同抗原的不同表位。如本文所用，“双特异性”表示抗原结合蛋白或抗体具有两种不同的抗原结合特异性。如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，所述结合位点各自结合相同抗原的相同表位。
如本文所用，术语“化合价”表示在抗原结合蛋白或抗体分子中存在的结合位点的指定数量。例如，天然抗体或全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”表示在抗原结合蛋白或抗体分子中分别存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。本申请的MABP为至少“二价”，例如，MABP可以为“三价”或“四价”。
“阻断”抗体或“拮抗”抗体是抑制或降低其所结合的抗原的生物活性的抗体。在一些实施方案中，阻断抗体或拮抗抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
“激动剂”或活化抗体是通过其所结合的抗原增强或引发信号传导的抗体。在一些实施方案中，激动剂抗体在不存在天然配体的情况下导致或激活信号传导。
“抗体效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的示例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。“降低或最小化”抗体效应子功能是指其从野生型或未修饰抗体降低至少50％(或者60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)。抗体效应子功能的确定可由本领域普通技术人员容易地确定和测量。在一个优选的实施方案中，互补结合、互补依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性的抗体效应子功能受到影响。在一些实施方案中，通过消除糖基化的恒定区中的突变来消除效应子功能，例如“无效应子突变”。在一个方面，无效应突变是CH2区中的N297A或DANA突变(D265A+N297A)。Shields等人，J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001)。另选地，导致效应子功能降低或消除的附加突变包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。另选地，可通过生产技术，诸如在宿主细胞中表达来降低或消除效应子功能，所述细胞不糖基化(例如，大肠杆菌)或其中导致改变的糖基化模式，所述模式在促进效应子功能方面无效或不太有效(参见，Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278(5):3466-3473(2003)。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC是指细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合到某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上，使得这些细胞毒性效应子细胞能够特异性结合到携带抗原的靶细胞，并且随后利用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且是通过该机制杀死靶细胞所必需的。用于介导ADCC、NK细胞的原代细胞仅表达FcγRIII，然而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达概述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页上的表3中。为评估感兴趣的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所述的。用于此类测定的可用效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。作为另外一种选择或除此之外，感兴趣的分子的ADCC活性可以体内评估，例如在动物模型中，诸如在Clynes等人，PNAS USA 95:652-656(1998)中所公开的。
除非另外指明，否则免疫球蛋白重链中的残基的编号是如Kabat等人(同上)中的EU索引编号。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
本文术语“Fc区”用于限定免疫球蛋白重链的C-末端区，其包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能有所不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226或Pro230的氨基酸残基延伸至其羧基末端。Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统，残基447)可例如在抗体的制备或纯化期间移除，或通过将编码抗体重链的核酸重组工程化来移除。因此，完整抗体的组成可包括其中移除所有K447残基的抗体群，其中不移除K447残基的抗体群，和具有带或不带K447残基的抗体的混合物的抗体群。适用于本文所述抗体的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”描述了结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR为结合IgG抗体(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体的FcR，其包括这些受体的等位变体和另选地剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有主要在其细胞质结构域方面不同的相似氨基酸序列。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见M.Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)。FcR综述于以下文献中：Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文术语“FcR”涵盖其它FcR，包括将来鉴定的那些。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿。Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994)。测量与FcRn结合的方法是已知的(参见，例如，Ghetie和Ward，immunol.Today 18:(12):592-8(1997)；Ghetie等人，Nature Biotechnology 15(7):637-40(1997)；Hinton等人，J.Biol.Chem.279(8):6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。可例如，在表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中，或在对其施用具有变体Fc区的多肽的灵长类中，测定人FcRn高亲和力结合多肽的与FcRn的体内结合和血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)描述了抗体变体，其改善或减弱对FcR的结合。还可参见，例如Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“效应子细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。在一个方面，效应子细胞表达至少FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的示例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞效应子细胞可从天然源，例如血液中分离。效应子细胞一般为与效应期相关联的淋巴细胞，并且用于产生细胞因子(辅助性T细胞)，从而杀死被病原体感染的细胞(细胞毒性T细胞)或分泌抗体(分化的B细胞)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在的情况下裂解靶细胞。经典补体途径的激活通过补体体系的第一组分(C1q)与结合到其同源抗原的抗体(合适的亚类)结合而引发。为了评估补体激活，可进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述的。具有改变的Fc区氨基酸序列以及增加或减小的C1q结合能力的抗体变体描述于美国专利6,194,551B1和WO99/51642中。那些专利公布的内容具体地以引用方式并入本文。还可参见，Idusogie等人，J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
术语“仅重链抗体”或“HCAb”是指功能性抗体，其包含重链，但缺少通常存在于抗体中的轻链。已知骆驼科动物(例如骆驼、美洲驼或羊驼)产生HCAb。
术语“单域抗体”或“sdAb”是指具有三个互补决定区(CDR)的单一抗原结合多肽。单独的sdAb能够与抗原结合，但不与相应的含CDR多肽配对。在一些情况下，sdAb从骆驼HCAb工程化，并且其重链可变结构域在本文中称为“VHH”。骆驼sdAb是最小的已知抗原结合抗体片段之一(参见，例如，Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-8(1993)；Greenberg等人，Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人，Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。
“结合亲和力”一般是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由离解常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域已知的常见方法来测量，包括本文所述的那些。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并且趋于容易地离解，然而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并且趋于保持更长时间的结合。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任一种均可用于本申请的目的。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案描述如下。
如本文所用，“Kd”或“Kd值”在一个实施方案中通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量，所述测定利用抗体和抗原分子的Fab型式进行，如通过以下测定来描述，所述测定通过在未标记抗原的滴定系列的存在下，利用最小浓度的(125I)标记的抗原来平衡Fab，然后利用抗-Fab抗体涂覆的板来捕集结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen等人，(1999)J.Mol.Biol 293:865-881)。为了建立用于测定的条件，将微量滴定板(Dynex)用5μg/ml的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)的50mM碳酸钠溶液(pH 9.6)涂覆过夜，并且随后用2(重量/体积)％牛血清白蛋白的PBS溶液在室温(大约23℃)下封闭两小时至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与感兴趣的Fab的连续稀释液混合(与Presta等人，(1997)Cancer Res.57:4593-4599中的抗-VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续较长时间段(例如，65小时)以确保实现平衡。此后，将混合物转移到捕集板以在室温下温育一小时。然后移除溶液，并且将板用0.1％Tween-20的PBS溶液洗涤八次。当板已经干燥时，添加150μl/孔的闪烁剂(MicroScint-20；Packard)，并且在Topcountγ计数器(Packard)上对板进行计数十分钟。选择产生最大结合的小于或等于20％的每种Fab的浓度以用于竞争结合测定。
根据另一个实施方案，Kd通过在25℃，在约10个响应单元(RU)下，利用固定抗原CM5芯片，使用-2000或-3000仪(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)使用表面等离子体共振测定来测量。简而言之，根据供应商的说明，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠，pH 4.8，将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μL/分钟的流量注射以获得偶联蛋白的约10个响应单元(RU)。在注射抗原后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。为进行动力学测量，在25℃下，以约25μL/min的流量，将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)注射到具有0.05％TWEEN 20TM表面活性剂的PBS(PBST)中。通过同时拟合缔合和离解感测图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(评估软件版本3.2)计算缔合速率(kon)和离解速率(koff)。平衡离解常数(Kd)计算为比率koff/kon。参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振确定，结合率超过106M-1s-1，则可通过使用荧光猝灭技术来测定结合率，所述荧光猝灭技术在浓度逐渐增加的抗原的存在下，测量20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的PBS溶液(pH 7.2)的荧光发射强度的增加或减小(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在光谱仪中测量的，诸如配备有停流装置的分光光度计(Aviv Instruments)，或带有搅拌比色杯的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)。
如本文所用，“缔合率”还可如上所述，使用-2000或-3000系统(BIAcore,Inc.，Piscataway，N.J.)，在25℃下，利用固定抗原CM5芯片，以约10个响应单元(RU)来确定。简而言之，根据供应商的说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(ECD)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠，pH 4.8，将抗原稀释至5mg/ml(0.2mM)，然后以5ml/min的流量注射以获得偶联蛋白的约10个响应单元(RU)。在注射抗原后，添加1M乙醇胺以阻断未反应的基团。为进行动力学测量，在25℃下，以约25μl/min的流量，将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)注射到具有0.05％TWEEN 20的PBS(PBST)中。通过同时拟合缔合和离解感测图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore评估软件版本3.2)计算缔合速率(kon)和离解速率(koff)。计算平衡离解常数(Kd)为koff/kon。参见，例如，Chen等人，(1999)J.Mol.Biol 293:865-881。然而，如果通过上述表面等离子体共振确定，结合率超过106M-1S-1，则优选通过使用荧光猝灭技术来测定结合率，所述荧光猝灭技术在浓度逐渐增加的抗原的存在下，测量20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的PBS溶液(pH 7.2)的荧光发射强度的增加或减小(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在光谱仪中测量的，诸如配备有停流装置的分光光度计(Aviv Instruments)，或带有搅拌比色杯的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在比对序列和引入缺口(如果需要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与特定肽或多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，但不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
编码本文MABP或sdAb的“分离的”核酸分子是核酸分子，所述核酸分子从通常与其产生的环境相关联的至少一种污染物核酸分子中鉴定和分离。优选，分离的核酸不与和生产环境相关联的所有组分缔合。编码本文多肽和抗体的分离的核酸分子呈不是其存在于自然中的形式或设置的形式。因此，分离的核酸分子与天然存在于细胞中的编码本文多肽和抗体的核酸区分开来。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列处于功能相关时，其“可操作地连接”。例如，如果其被表达为参与分泌多肽的原前蛋白前，则前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作连接；如果其影响序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或者如果其被定位以便有利于翻译，则核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。一般来讲，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且在阅读阶段。但是，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制位点处连接来完成。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，“载体”包括对以采用的剂量和浓度暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。生理上可接受的载体通常为含水pH缓冲溶液。生理上可接受的载体的示例包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙烯二醇(PEG)、和PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文感兴趣的“稀释剂”是药学上可接受的(对于施用于人而言是安全且无毒的)并且可用于制备液体制剂，诸如冻干后重构的制剂。示例性稀释剂包括无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。在可供选择的实施方案中，稀释剂可包括盐和/或缓冲剂的水溶液。
“防腐剂”是可添加到本文制剂中以降低细菌活性的化合物。添加防腐剂可例如有助于制备多用途(多剂量)制剂。潜在防腐剂的示例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯己双铵、苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化物的混合物，其中烷基基团为长链化合物)和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳族醇诸如苯酚、丁醇和苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇，3-戊醇和间甲酚。本文最优选的防腐剂为苄醇。
术语“药物制剂”是指呈允许活性成分的生物活性有效这样的形式，并且不含对制剂将施用的受试者具有不可接受的毒性的附加组分的制剂。此类制剂是无菌的。“无菌”制剂是无菌的或不含所有活的微生物及其孢子。
“稳定的”制剂是其中的蛋白质在储存时基本上保持其物理和化学稳定性和完整性的制剂。可用于测量蛋白稳定性的多种分析技术在本领域中可得，并且综述于Peptideand Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee编辑，Marcel Dekker,Inc.，NewYork,N.Y.，Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中。稳定性可在选定温度下测量并持续选定的时间段。为了快速筛选，可将制剂在40℃下保持2周至1个月，在此时测量稳定性。当制剂待储存于2-8℃下时，一般来讲，制剂应在30℃或40℃下稳定至少1个月和/或在2-8℃下稳定至少2年。当制剂待在30℃下储存时，一般来讲，制剂应在30℃下稳定至少2年和/或在40℃下稳定至少6个月。例如，储存期间的聚集程度可用作蛋白质稳定性的指标。因此，“稳定”制剂可以为其中少于约10％，并且优选少于约50％的蛋白质以聚集体的形式存在于制剂中的制剂。在其它实施方案中，可确定制剂储存期间聚集体形成的任何增加。
“重构”制剂是通过将冻干蛋白质或抗体制剂溶于稀释剂中使得蛋白质分散于其中而制备的制剂。重构制剂适用于对待利用感兴趣的蛋白质治疗的患者施用(例如，皮下施用)，并且在某些实施方案中，可以为适用于肠胃外施用或静脉内施用的制剂。
“等渗”制剂是与人血液具有基本相同的渗透压的制剂。等渗制剂一般将具有约250至350mOsm的渗透压。术语“低渗”描述了渗透压低于人血液的制剂。相应地，术语“高渗”用于描述渗透压高于人血液的制剂。例如，等渗性可使用蒸气压或冰冻型渗透压计来测量。由于添加盐和/或缓冲液，本申请的制剂可以为高渗的。
“免疫检查点分子”是指免疫系统中发出或关闭信号的分子。“刺激性免疫检查点分子”或“共刺激分子”是在免疫系统中发出信号的免疫检查点分子。“抑制免疫检查点分子”是在免疫系统中关闭信号的免疫检查点分子。
应当理解，本文所述的实施方案包括“由…组成”和/或“基本由…组成”实施方案。
本文提及“约”的值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的变化。例如，关于“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文所使用，提及“非”某个值或参数通常表示并描述“除该值或参数之外”的值或参数。例如，该方法不用于治疗X类型的癌症，意指该方法用于治疗除X类型之外的类型的癌症。
本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另外明确规定。
II.多特异性抗原结合蛋白(MABP)
本申请的一个方面提供了多特异性抗原结合蛋白(MABP)，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，第一表位来自第一免疫检查点分子，并且第二表位来自第二免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一肿瘤抗原，并且第二表位来自第二肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一表位来自肿瘤抗原，并且第二表位来自细胞表面分子，诸如CD3。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一表位来自第一促炎分子，并且第二表位来自第二促炎分子。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长4-链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
本申请的MABP具有至少两个抗原结合部分，其可特异性结合至少两个不同的表位。至少两个抗原结合部分中的一些可以是相同的，只要MABP具有两个不同表位的结合位点即可。MABP可以是对称的或非对称的。例如，MABP可包含第一抗原结合部分的一个或两个拷贝，和第二抗原结合部分的一至八个拷贝。在一些实施方案中，MABP包含两种不同的抗原结合部分，其各自包含一起形成不同的抗原结合位点的VH结构域和VL结构域。例如，第一抗原结合部分可以为双特异性抗体。在一些实施方案中，第一抗原结合部分是单特异性全长抗体或其抗原结合片段，诸如Fab。
在一些实施方案中，MABP包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多个不同抗原结合部分中的任一个，所述抗原结合部分各自包含sdAb。在一些实施方案中，两个相同的sdAbs彼此融合，其进一步与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，两个不同的sdAbs彼此融合，其进一步与第一抗原结合部分融合。
对于每个表位，MABP可具有任何合适的价数，以及任何合适的特异性数。在一些实施方案中，对于第一表位，MABP为二价、三价、四价、五价、六价或更高价的。在一些实施方案中，对于第二表位，MABP为二价、三价、四价、五价、六价或更高价的。在一些实施方案中，MABP为双特异性的。在一些实施方案中，MABP为三特异性的。在一些实施方案中，MABP为四特异性的。在一些实施方案中，MABP具有超过四个特异性。示例性MABP示于在图1-22中。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白(“BABP”)，其包含：(a)第一抗原结合部分的单一拷贝，其包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分的一个或多个拷贝(诸如2个)，其包含特异性结合第二表位的sdAb，其中所述第二抗原结合部分的每个拷贝和所述第一抗原结合部分彼此融合。示例示于图5中。在一些实施方案中，sdAb中的一个或多个各自与另一个相同或不同的sdAb进一步融合。
在一些实施方案中，本发明提供了MABP，其包含：(a)多个(诸如2、3、4、5、6或更多个)第一抗原结合部分，其包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)多个(诸如2、3、4、5、6、7、8或更多个)相同或不同的sdAb，其各自特异性结合不同于第一表位的表位，其中sdAb彼此融合，和/或与第一抗原结合部分融合。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分的两个拷贝，其各自包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)包含特异性结合第二表位的sdAb的第二抗原结合部分的单一拷贝，其中第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的两个拷贝中的一者融合。示例示于图1中。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分的两个拷贝，其包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)多个(诸如2、3、或4个)相同或不同的sdAb，其各自特异性结合不同于第一表位的表位，其中sdAb彼此融合，和/或与第一抗原结合部分融合。示例示于图2、3、17、18、21和22中。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分的两个拷贝，其各自包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)各自包含特异性结合第二表位的sdAb的第二抗原结合部分的两个拷贝，其中第二抗原结合部分的一个拷贝与第一抗原结合部分的每个拷贝融合。示例示于图4、9、11、13、19和20中。在一些实施方案中，sdAb中的一个或多个各自与另一个相同或不同的sdAb进一步融合。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如三特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分的第一拷贝和第二拷贝，其各自包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，(b)包含特异性结合第二表位的sdAb的第二抗原结合部分，和(c)包含特异性结合第三表位的第二sdAb的第三抗原结合部分，其中第二抗原结合部分与第一抗原结合部分的第一拷贝融合，并且其中所述第三抗原结合部分与第一抗原结合部分的第二拷贝融合。示例示于图7、10、12和14中。在一些实施方案中，sdAb中的一个或多个各自与另一个相同或不同的sdAb进一步融合。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如三特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，其包含第一重链可变结构域(VH)和第一轻链可变结构域(VL)，其中第一VH和第一VL一起形成特异性结合第一表位的第一抗原结合位点；(b)包含特异性结合第二表位的sdAb的第二抗原结合部分的一至四个拷贝；以及(c)第三抗原结合部分，其包含第三重链可变结构域(VH)和第三轻链可变结构域(VL)，其中第三VH和第三VL一起形成特异性结合第三表位的第三抗原结合位点；并且其中所述第二抗原结合部分与所述第一抗原结合部分和/或所述第三抗原结合部分融合。示例示于图6中。在一些实施方案中，sdAb中的一个或多个各自与另一个相同或不同的sdAb进一步融合。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如四特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，其包含第一重链可变结构域(VH)和第一轻链可变结构域(VL)，其中第一VH和第一VL一起形成特异性结合第一表位的第一抗原结合位点；(b)第二抗原结合部分，其包含特异性结合第二表位的sdAb；(c)第三抗原结合部分，其包含第三重链可变结构域(VH)和第三轻链可变结构域(VL)，其中第三VH和第三VL一起形成特异性结合第三表位的第三抗原结合位点；以及(d)第四抗原结合部分，其包含特异性结合第四表位的第二sdAb；其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合，并且其中所述第三抗原结合部分和所述第四抗原结合部分彼此融合。示例示于图8中。在一些实施方案中，sdAb中的一个或多个各自与另一个相同或不同的sdAb进一步融合。
表位和抗原
本文所述的MABP中的任一个可在至少两个不同的表位处特异性结合。识别的至少两个不同表位可位于相同抗原上，或位于不同抗原上。在一些实施方案中，抗原为细胞表面分子。在一些实施方案中，抗原为细胞外分子。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，其包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一抗原的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，其包含特异性结合第二抗原的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长4-链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，第一表位和/或第二表位为免疫检查点分子。在一些实施方案中，免疫检查点分子是刺激免疫检查点分子。示例性刺激免疫检查点分子包括但不限于，CD28、OX40、ICOS、GITR、4-1BB、CD27、CD40、CD3、HVEM和TCR(例如，MHC I类或II类分子)。在一些实施方案中，免疫检查点分子是抑制免疫检查点分子。示例性抑制免疫检查点分子包括但不限于CTLA-4、TIM-3、A2a受体、LAG-3、BTLA、KIR、PD-1、IDO、CD47、及其配体，诸如B7.1、B7.2、PD-L1、PD-L2、HVEM、B7-H4、NKTR-218、以及SIRP-α受体。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，其包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一免疫检查点分子的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，其包含特异性结合第二免疫检查点分子的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一免疫检查点分子和/或第二免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7-H3、TIM-3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长4-链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，第一表位和/或第二表位为细胞表面抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原是免疫效应子细胞上的抗原，诸如T细胞(例如，辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞等)、B细胞、巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞表面抗原是T细胞表面抗原，诸如CD3。
在一些实施方案中，细胞表面抗原为肿瘤抗原。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，其可以引发免疫应答，具体地讲T细胞介导的免疫应答。本文所述的靶向抗原的选择将取决于待治疗的癌症的具体类型。示例性肿瘤抗原包括，例如，神经胶质瘤相关联抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、HER2/neu、生存素和端粒酶、前列腺-癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一些实施方案中，肿瘤抗原包含与恶性肿瘤相关联的一个或多个抗原癌表位。恶性肿瘤表达多个蛋白质，所述蛋白质可用作免疫攻击的靶抗原。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，诸如黑素瘤中MART-1、酪氨酸酶和gp100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它靶分子属于转化相关分子的组，例如癌基因HER2/Neu/ErbB-2。然而，另一组靶抗原是癌胚抗原，例如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原，其对于个体肿瘤是独特的。B细胞分化抗原诸如CD19、CD20和CD37是B-细胞淋巴瘤中靶抗原的其它候选者。
在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关联的抗原(TAA)。TSA对于肿瘤细胞是独特的，并且不在身体中的其它细胞上出现。TAA相关联抗原对于肿瘤细胞不是独特的，反而在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下在正常细胞上表达。肿瘤上抗原的表达可在使免疫系统能够对抗原反应的条件下发生。TAA可以是在胎儿发育期间，当免疫系统不成熟，并且不能应答时，在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以为通常在正常细胞上以极低水平存在，但在肿瘤上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性示例包括以下：分化抗原诸如MART-1/MelanA(MART-1)、gp 100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多向抗原，诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达的胚胎抗原，诸如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制子基因诸如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位引起的独特肿瘤抗原；诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，诸如EB病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。基于其它大的蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关联的蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一肿瘤抗原的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二肿瘤抗原的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原和/或第二肿瘤抗原选自：HER2、BRAF、EGFR、VEGFR2、CD20、RANKL、CD38和CD52。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长4-链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合肿瘤抗原的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合免疫效应子细胞(诸如T细胞)上的细胞表面抗原的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原选自：HER2、BRAF、EGFR、VEGFR2、CD20、RANKL、CD38和CD52。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长4-链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，第一表位和/或第二表位为促炎分子。“促炎分子”是指由上调炎症反应的免疫细胞(诸如单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和白细胞)产生或表达的任何分子。在一些实施方案中，所述促炎分子为促炎细胞因子，诸如淋巴细胞、单核因子、趋化因子或白介素。示例性促炎分子包括但不限于IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-6R、IL-5、IL-17、IL-23、IL-22、IL-21、IL-12、和嗜酸性粒细胞趋化因子-1(即，CCL11)。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，多特异性抗原结合蛋白包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一促炎分子的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二促炎分子的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述第一促炎分子和/或第二促炎分子选自IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-6、IL-6R和嗜酸细胞活化趋化因子-1。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长4-链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
在一些实施方案中，第一表位和/或第二表位为血管生成因子，诸如Ang2和VEGF。因此，在一些实施方案中，提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一血管生成因子的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合血管生成因子的sdAb的第二抗原结合部分，其中第一抗原结合部位和第二抗原结合部分彼此融合。
融合多肽
MABP的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分彼此融合(即，共价连接)。因此，本专利申请的MABP包含一种或多种融合多肽。每个融合多肽可包含第二抗原结合部分和来自第一抗原结合部分的多肽。
第一抗原结合部分和第二抗原结合部分可通过单一化学键(诸如肽键)或经由肽接头直接连接。第二抗原结合部分可在第一抗原结合部分的任一个(包括每个)多肽的N-末端或C-末端处融合，或可以在第一抗原结合部分的任一个(包括每个)多肽的内部位置处，诸如在第一抗原结合部分的重链中的Fc区的N-末端处融合。融合多肽可重组获得或化学获得。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的C-末端经由化学键(诸如肽键)或肽接头与第一抗原结合部分的任何(包括每个)多肽的N-末端融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的N-末端经由化学键(诸如肽键)或肽接头与第一抗原结合部分的任何(包括每个)多肽的C-末端融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由不是涉及氨基酸的主链化学基团的肽的化学键与第一抗原结合部分融合。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含单链抗体片段，其包含VH和VL。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含scFv。在一些实施方案中，MABP包含融合多肽，所述融合多肽在N-末端至C-末端方向上包含：包含sdAb的第二抗原结合部分、任选的肽接头、VH结构域和VL结构域；在一些实施方案中，MABP包含融合多肽，所述融合多肽在N-末端至C-末端方向上包含：包含sdAb的第二抗原结合部分、任选的肽接头、VL结构域和VH结构域。在一些实施方案中，MABP包含融合多肽，所述融合多肽在N-末端至C-末端方向上包含：VH结构域、VL结构域、任选的肽接头和包含sdAb的第二抗原结合部分。在一些实施方案中，MABP包含融合多肽，所述融合多肽在N-末端至C-末端方向上包含：VL结构域、VH结构域、任选的肽接头和包含sdAb的第二抗原结合部分。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH结构域的重链和含有VL结构域的轻链。在一些实施方案中，重链还包含一个或多个重链恒定结构域，例如CH1、CH2、CH4和CH3、和/或抗体铰链区(HR)。在一些实施方案中，轻链还包含轻链恒定结构域(CL)，诸如λìCL结构域或κCL结构域。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的N-末端与重链的C-末端融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的C-末端与重链的N-末端融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的N-末端与轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的C-末端与轻链的N-末端融合。在一些实施方案中，MABP包含第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：重链、任选的肽接头、以及包含sdAb的第二抗原结合部分；和第二多肽，所述第二多肽包含轻链。在一些实施方案中，MABP包含第一多肽，所述第一多肽从N-末端至C-末端包含：包含sdAb的第二抗原结合部分、任选的肽接头和重链；以及第二多肽，所述第二多肽包含轻链。在一些实施方案中，MABP包含第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：轻链、任选的肽接头、以及包含sdAb的第二抗原结合部分；以及第二多肽，所述第二多肽包含重链。在一些实施方案中，MABP包含第一多肽，所述第一多肽从N-末端至C-末端包含：包含sdAb的第二抗原结合部分、任选的肽接头和轻链；以及第二多肽，所述第二多肽包含重链。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长抗体，所述全长抗体由两个重链和两个轻链组成。在一些实施方案中，全长抗体为全长单克隆抗体，其由两个相同的重链和两个相同的轻链组成。在一些实施方案中，MABP包含两种相同的第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端各自包含：重链、任选的肽接头、以及包含sdAb的第二抗原结合部分；和两个第二多肽，所述第二多肽各自包含轻链(参见，例如，图4)。在一些实施方案中，MABP包含两种相同的第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端各自包含：包含sdAb的第二抗原结合部分、任选的肽接头和重链；和两种相同的第二多肽，所述第二多肽各自包含轻链(参见，例如，图9)。在一些实施方案中，MABP包含两种相同的第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端各自包含：轻链、任选的肽接头、以及包含sdAb的第二抗原结合部分；和两种相同的第二多肽，所述第二多肽各自包含重链(参见，例如，图11)。在一些实施方案中，MABP包含两种相同的第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端各自包含：包含sdAb的第二抗原结合部分、任选的肽接头和轻链；和两种相同的第二多肽，所述第二多肽包含重链(参见，例如，图13)。
在一些实施方案中，MABP包含：(a)全长抗体，其由两个重链和两个轻链组成，其中所述全长抗体特异性识别第一表位；(b)特异性识别第二表位的第一sdAb；和(C)特异性识别第三表位的第二sdAb，其中所述第一sdAb的C-末端与每个重链的N-末端融合，并且其中所述第二sdAb的N-末端与每个重链的C-末端融合。在一些实施方案中，MABP包含两种相同的第一多肽，其从N-末端至C-末端各自包含：第一sdAb、任选的肽接头、重链、任选的肽接头和第二sdAb；和两种相同的第二多肽，其各自包含轻链。参见，例如，图15。
在一些实施方案中，MABP包含：(a)全长抗体，其由两个重链和两个轻链组成，其中所述全长抗体特异性识别第一表位；(b)特异性识别第二表位的第一sdAb；和(C)特异性识别第三表位的第二sdAb，其中所述第一sdAb的C-末端与每个轻链的N-末端融合，并且其中所述第二sdAb的N-末端与每个重链的C-末端融合。在一些实施方案中，MABP包含两种相同的第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端各自包含：重链、任选的肽接头、以及第二sdAb；和两种相同的第二多肽，其各自包含第一sdAb、任选的肽接头和轻链。参见，例如，图16。
在一些实施方案中，MABP包含：(a)全长抗体，其由第一重链和第二重链以及第一轻链和第二轻链组成，其中所述全长抗体特异性识别第一表位；(b)特异性识别第二表位的第一sdAb；(c)特异性识别第三表位的第二sdAb；(d)特异性识别第四表位的第三sdAb；以及(e)特异性识别第五表位的第四sdAb；其中第一sdAb的C-末端与第一轻链的N-末端融合，其中第二sdAb的C-末端与第二轻链的N-末端融合，其中第三sdAb的C-末端与第一重链的N-末端融合，并且其中第四sdAb的C-末端与第二重链的N-末端融合。在一些实施方案中，MABP包含两种相同的第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端各自包含：第三或第四sdAb、任选的肽接头和重链；和两种相同的第二多肽，其各自包含第一sdAb或第二sdAb、任选的肽接头和轻链。参见，例如，图17。
在一些实施方案中，MABP包含：(a)全长抗体，其由两个重链和两个轻链组成，其中所述全长抗体特异性识别第一表位；(b)特异性识别第二表位的第一sdAb；(c)特异性识别第三表位的第二sdAb；(d)特异性识别第四表位的第三sdAb；以及(e)特异性识别第五表位的第四sdAb；其中第一sdAb的C-末端与第二sdAb的N-末端融合，并且第二sdAb的C-末端与一个重链的N-末端融合，并且其中第三sdAb的C-末端与第四sdAb的N-末端融合，并且第四sdAb的C-末端与另一重链的N-末端融合。在一些实施方案中，MABP包含两种相同的第一多肽，其从N-末端至C-末端各自包含：第一sdAb或第三sdAb、任选的肽接头、第二或第四sdAb、任选的肽接头和重链；和两种相同的第二多肽，其各自包含轻链。参见，例如，图18。
在一些实施方案中，MABP包含：(a)全长抗体，其由两个重链和两个轻链组成，其中所述全长抗体特异性识别第一表位；(b)特异性识别第二表位的第一sdAb；和(C)特异性识别第三表位的第二sdAb，其中所述第一sdAb或第二sdAb的N-末端与重链的CH1区的C-末端融合，并且所述第一sdAb或第二sdAb的C-末端与重链的CH2区的N-末端融合。在一些实施方案中，MABP包含两种相同的第一多肽，其从N-末端到C-末端各自包含：VH-CH1-任选肽接头-sdAb-CH2-CH3；和两种相同的第二多肽，其各自包含轻链。参见，例如，图19。
在一些实施方案中，MABP包含：(a)特异性识别第一表位的第一scFv；(b)特异性识别第二表位的第二scFv；(c)Fc区；(d)特异性识别第三表位的第一sdAb；和(d)特异性识别第四表位的第二sdAb，其中每个sdAb的N-末端与scFv的C-末端融合，并且sdAb的C-末端与Fc区的N-末端融合。在一些实施方案中，MABP包含两种相同的多肽，其从N-末端至C-末端各自包含：scFv-任选的肽接头-sdAb-CH2-CH3。参见，例如，图20。
在一些实施方案中，MABP包含：(a)特异性识别第一表位的第一Fab；(b)特异性识别第二表位的第二Fab；(c)Fc区；(d)第一Fab样结构域，其包含特异性识别第三表位的第一sdAb和特异性识别第四表位的第二sdAb；(e)第二Fab样结构域，其包含特异性识别第五表位的第三sdAb和特异性识别第六表位的第四sdAb，其中每个Fab样结构域的N-末端与Fab的C-末端融合，并且Fab样结构域的两个C-末端中的一个与Fc区的N-末端融合。在一些实施方案中，MABP包含两种相同的第一多肽，其从N-末端到C-末端各自包含：VH-CH1-任选的肽接头-sdAb-CH1-CH2-CH3；以及两种相同的第二多肽，其从N-末端到C-末端各自包含：VL-CL-任选的肽接头-sdAb-CL。参见，例如，图21。
在一些实施方案中，MABP包含：(a)特异性识别第一表位的第一scFv；(b)特异性识别第二表位的第二scFv；(c)Fc区；(d)第一Fab样结构域，其包含特异性识别第三表位的第一sdAb和特异性识别第四表位的第二sdAb；(e)第二Fab样结构域，其包含特异性识别第五表位的第三sdAb和特异性识别第六表位的第四sdAb，其中每个Fab样结构域的两个N-末端中的一个与scFv的C-末端融合，并且sdAb的两个C-末端中的一个与Fc区的N-末端融合。在一些实施方案中，MABP包含两种相同的第一多肽，其从N-末端到C-末端各自包含：scFv-任选的肽接头-sdAb-CH1-CH2-CH3；以及两种相同的第二多肽，其从N-末端到C-末端各自包含：sdAb-CL。参见，例如，图22。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含含有重链可变结构域(VH)的重链和含有轻链可变结构域(VL)的轻链，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中第二抗原结合部分的N-末端经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分的重链的C-末端融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一表位来自第一免疫检查点分子，并且第二表位来自第二免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一肿瘤抗原，并且第二表位来自第二肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一表位来自肿瘤抗原，并且第二表位来自细胞表面分子，诸如CD3。在一些实施方案中，第一表位来自第一促炎分子，并且第二表位来自第二促炎分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一血管生成因子，并且第二表位来自第二血管生成因子。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含含有重链可变结构域(VH)的重链和含有轻链可变结构域(VL)的轻链，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中第二抗原结合部分的C-末端经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分的重链的N-末端融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一表位来自第一免疫检查点分子，并且第二表位来自第二免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一肿瘤抗原，并且第二表位来自第二肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一表位来自肿瘤抗原，并且第二表位来自细胞表面分子，诸如CD3。在一些实施方案中，第一表位来自第一促炎分子，并且第二表位来自第二促炎分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一血管生成因子，并且第二表位来自第二血管生成因子。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含含有重链可变结构域(VH)的重链和含有轻链可变结构域(VL)的轻链，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中第二抗原结合部分的N-末端经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分的轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一表位来自第一免疫检查点分子，并且第二表位来自第二免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一肿瘤抗原，并且第二表位来自第二肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一表位来自肿瘤抗原，并且第二表位来自细胞表面分子，诸如CD3。在一些实施方案中，第一表位来自第一促炎分子，并且第二表位来自第二促炎分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一血管生成因子，并且第二表位来自第二血管生成因子。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含含有重链可变结构域(VH)的重链和含有轻链可变结构域(VL)的轻链，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中第二抗原结合部分的C-末端经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分的轻链的N-末端融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一表位来自第一免疫检查点分子，并且第二表位来自第二免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一肿瘤抗原，并且第二表位来自第二肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一表位来自肿瘤抗原，并且第二表位来自细胞表面分子，诸如CD3。在一些实施方案中，第一表位来自第一促炎分子，并且第二表位来自第二促炎分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一血管生成因子，并且第二表位来自第二血管生成因子。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含含有两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述全长抗体特异性结合第一表位，和(b)第二抗原结合部分，gai第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中第二抗原结合部分的N-末端经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分的两个重链中的一个或每个的C-末端融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一表位来自第一免疫检查点分子，并且第二表位来自第二免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一肿瘤抗原，并且第二表位来自第二肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一表位来自肿瘤抗原，并且第二表位来自细胞表面分子，诸如CD3。在一些实施方案中，第一表位来自第一促炎分子，并且第二表位来自第二促炎分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一血管生成因子，并且第二表位来自第二血管生成因子。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含含有两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述全长抗体特异性结合第一表位，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中第二抗原结合部分的C-末端经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分的两个重链中的一个或每个的N-末端融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一表位来自第一免疫检查点分子，并且第二表位来自第二免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一肿瘤抗原，并且第二表位来自第二肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一表位来自肿瘤抗原，并且第二表位来自细胞表面分子，诸如CD3。在一些实施方案中，第一表位来自第一促炎分子，并且第二表位来自第二促炎分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一血管生成因子，并且第二表位来自第二血管生成因子。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含含有两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述全长抗体特异性结合第一表位，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中第二抗原结合部分的N-末端经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分的两个轻链中的一个或每个的C-末端融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一表位来自第一免疫检查点分子，并且第二表位来自第二免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一肿瘤抗原，并且第二表位来自第二肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一表位来自肿瘤抗原，并且第二表位来自细胞表面分子，诸如CD3。在一些实施方案中，第一表位来自第一促炎分子，并且第二表位来自第二促炎分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一血管生成因子，并且第二表位来自第二血管生成因子。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含含有两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述全长抗体特异性结合第一表位，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中第二抗原结合部分的C-末端经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分的两个轻链中的一个或每个的N-末端融合。在一些实施方案中，第一表位来自第一免疫检查点分子，并且第二表位来自第二免疫检查点分子。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一表位来自第一肿瘤抗原，并且第二表位来自第二肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一表位来自肿瘤抗原，并且第二表位来自细胞表面分子，诸如CD3。在一些实施方案中，第一表位来自第一促炎分子，并且第二表位来自第二促炎分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一血管生成因子，并且第二表位来自第二血管生成因子。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
本文所述的MABP可包含位于第一抗原结合部分与第二抗原结合部分之间的一个或多个肽接头。在一些实施方案中，第一抗原结合部分与第二抗原结合部分的重链多肽之间的肽接头与第一抗原结合部分与第二抗原结合部分的轻链多肽之间的肽接头相同。在一些实施方案中，第一抗原结合部分与第二抗原结合部分的重链多肽之间的肽接头与第一抗原结合部分与第二抗原结合部分的轻链多肽之间的肽接头不同。在一些实施方案中，第一抗原结合部位和第二抗原结合部分彼此直接融合但其间不设置肽接头。
MABP的各种抗原结合部分可经由肽接头彼此融合。连接不同抗原结合部分的肽接头可以相同或不同。每个肽接头可以单独优化。肽接头可具有任何适合的长度。在一些实施方案中，肽接头为至少约下列中的任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50个或更多个氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头不超过约下列中的任一者：50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少个氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头的长度为下列中的任一者：约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、约30个氨基酸至约50个氨基酸、或约1个氨基酸至约50个氨基酸。
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，仅来源于抗体重链铰链区的序列可用作接头。参见，例如，WO1996/34103。在一些实施方案中，肽接头为柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n(SEQ IDNO:9)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:10)和(GGGS)n(SEQ ID NO:11)，其中n为至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域已知的其它柔性接头。在一些实施方案中，肽接头包含GGGGSGGGS(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含IgG的铰链区，诸如人IgG1的铰链区。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，肽接头包含来源于IgG的铰链区的修饰序列，诸如人IgG1的铰链区。例如，IgG的铰链区中的一个或多个半胱氨酸可被丝氨酸取代。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列EPKSSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分彼此在化学上融合。例如，第二抗原结合部分和第一抗原结合部分的一个或多个多肽可经由连接基团使用一个或多个反应性位点缀合。多肽中可用于化学缀合的反应性位点是本领域熟知的，其包括但不限于存在于氨基酸残基上的伯氨基基团(诸如，赖氨酸的ε氨基基团，和N-末端氨基酸的α氨基基团、半胱氨酸残基中的硫醇基团、C-末端氨基酸的羧基基团、以及糖基化抗体中的碳水化合物基团。在一些实施方案中，通过定点诱变、掺入硒代半胱氨酸或非天然氨基酸、掺入双功能接头(诸如双烷基化试剂)和/或糖基化工程，将反应性位点引入第二抗原结合部分或第一抗原结合部分中。在一些实施方案中，多肽的一个或多个伯氨基基团可转化成含巯基基团(例如，来自半胱氨酸或同型半胱氨酸残基)、亲电子不饱和基团诸如马来酰亚胺基团、或卤代基团诸如溴乙酰基基团，以用于与硫醇反应性多肽缀合。本领域已知的任何连接基团和缀合方法可用于将第二抗原结合部分与第一抗原结合部分化学融合。在一些实施方案中，缀合可例如通过使用琥珀酰亚胺酯(诸如琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC)或N-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS))、戊二醛、碳二亚胺(诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI))、联苯胺(BDB)、高碘酸酯或异硫氰酸酯(诸如N-乙酰基同型半胱氨酸硫代内酯(NAHT))来实现。
包含单域抗体的抗原结合部分
本申请的MABP包含至少一个包含sdAb的抗原结合部分。示例性sdAb的包括，但不限于，仅来自重链抗体的重链可变结构域(例如，VHH或VNAR)、天然缺乏轻链的结合分子、来源于常规4-链抗体的单结构域(诸如，VH或VL)、仅人源化重链抗体、由表达人重链段的转基因小鼠或大鼠产生的人sdAb、和不是来源于抗体那些的工程化结构域和单域支架。本领域已知或由发明人开发的任何sdAb均可用于构建本申请的MABP。sdAb可来源于任何物种，其包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼，美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。本文设想的单域抗体还包括来自不是骆驼和鲨鱼的物种的天然存在的sdAb分子。
在一些实施方案中，sdAb来源于天然存在的单域抗原结合分子，其被称为缺乏轻链的重链抗体(本文中也称为“仅重链抗体”)。此类单域分子例如公开于WO 94/04678和Hamers-Casterman,C.等人(1993)Nature 363:446-448中。为清楚起见，来源于天然缺乏轻链的重链分子的可变结构域在本文中被称为VHH，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开来。此类VHH分子可以来源于骆驼科物种中产生的抗体，例如，骆驼、美洲驼、骆马、单峰驼、羊驼和原驼。除了骆驼科之外的其它物种可产生天然缺乏轻链的重链分子，并且此类VHH在本申请的范围内。
来自羊驼的VHH分子比IgG分子小约10倍。其是单一多肽并且可以是非常稳定的、耐极端pH和温度条件。此外，其可抵抗蛋白酶的作用，常规抗体则不是这种情况此外，VHH的体外表达产生高收率，正确折叠的功能性VHH。此外，在羊驼中产生的抗体可识别除了由抗体识别的那些表位之外的表位，所述抗体通过使用抗体文库或经由对不是羊驼的哺乳动物进行免疫而在体外产生(参见，例如，WO9749805)。因此，包含一个或更多个的VHH结构域的MABP可比常规抗体更有效地与靶相互作用。因为已知VHH结合到“异常”表位诸如空腔或凹槽中，因此包含此类VHH的MABP的亲和力可能比常规多特异性多肽更适用于治疗性治疗。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的VHH结构域，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，第一表位来自第一免疫检查点分子，并且第二表位来自第二免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一表位来自第一肿瘤抗原，并且第二表位来自第二肿瘤抗原。在一些实施方案中，第一表位来自肿瘤抗原，并且第二表位来自细胞表面分子，诸如CD3。在一些实施方案中，第一表位来自第一促炎分子，并且第二表位来自第二促炎分子。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，VHH结构域是人源化的。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长4-链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，sdAb来源于存在于软骨鱼类中的免疫球蛋白的可变区。例如，sdAb可来源于存在于鲨鱼血清中的被称为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。制备来源于NAR的可变区的单域分子(“IgNARs”)的方法描述于WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909中。
在一些实施方案中，sdAb是重组的，CDR接枝的，人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外生成的(例如，通过噬菌体展示选择)。在一些实施方案中，sdAb是由表达人类重链片段的转基因小鼠或大鼠产生的人sdAb。参见，例如，US20090307787A1、美国专利8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1、和WO2004049794。在一些实施方案中，sdAb为亲和力成熟的。
包含VHH结构域的SdAb可被人化以具有人样序列。在一些实施方案中，本文所用的VHH结构域的FR区包含与人VH框架区至少约下列中任一者的氨基酸序列同一性：50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多种。一类示例性人源化VHH结构域的特征在于VHH在根据Kabat编号的位置45，如L45处，携带选自下列的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，并且在位置103处携带色氨酸。因此，属于这种类型的多肽示出与人VH框架区的高氨基酸序列同源性，并且所述多肽可直接施用于人，但不由此预期到不希望的免疫应答，并且没有进一步人源化的负担。
另一类示例性人源化骆驼科sdAb已在WO 03/035694中有所描述，并且含有通常存在于人来源或其它物种的常规抗体中的疏水性FR2残基，但其通过103位上的带电精氨酸残基来补偿这种亲水性损失，所述带电精氨酸残基取代存在于来自双链抗体的VH中的保守色氨酸残基。因此，属于这种两类型的肽示出与人VH框架区的高氨基酸序列同源性，并且所述肽可直接施用于人，但不由此预期到不希望的免疫应答，并且没有进一步人性化的负担。
在一些实施方案中，MABP包含自然产生的sdAb或其衍生物，诸如骆驼sdAb，或来源于骆驼sdAb的人源化sdAb。在一些实施方案中，sdAb得自美洲驼。在一些实施方案中，进一步工程化sdAb以移除不通常存在于人抗体中的序列(诸如CDR区或CDR-FR接合点)。
在一些实施方案中，MABP包含Fab样结构域，所述Fab样结构域包含含有与CH1结构域融合的第一sdAb(诸如VHH)的第一多肽链，和含有与CL结构域融合的第二sdAb(诸如VHH)的第二多肽链。在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb特异性结合到相同表位。在一些实施方案中，第一sdAb和第二sdAb特异性结合不同表位。在一些实施方案中，Fab样结构域的每个多肽链与第一抗原结合部分的多肽链的N-末端、C-末端或内部位置融合。在一些实施方案中，Fab样结构域的两个多肽链中的一者与第一抗原结合部分的多肽链的N-末端、C-末端或内部位置融合。在一些实施方案中，MABP包含两个或更多个Fab样结构域。
在一些实施方案中，MABP包含抗原结合部分，其包含对其表位具有适当亲和力的sdAb。例如，sdAb的亲和力可影响MABP对靶细胞或组织的总体亲和力和亲合力，这可能进一步影响MABP的功效。在一些实施方案中，sdAb以高亲和力结合其表位。高亲和力sdAb以低纳米摩尔(10-9M)范围内的离解常数(Kd)结合其表位，诸如不超过约下列中的任一者：5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM、0.02nM、0.01nM、5pM、2pM、1pM或更少。在一些实施方案中，sdAb以低亲和力结合其表位。低亲和力sdAb以低微摩尔(10-6M)范围内的Kd结合其表位，诸如超过约下列中的任一者：1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM或更多。在一些实施方案中，sdAb以中等亲和力结合其表位。中等亲和力的sdAb以低于低亲和力sdAb但高于高亲和力sdAb的Kd结合其表位。在一些实施方案中，中等亲和力sdAb以下列中的任一者的Kd结合其表位，约1nM至约10nM、约10nM至约100nM、约100nM至约500nM、约500nM至约1μM、约1nM至约100nM、约10nM至约500nM、或约1nM至约1μM。
在一些实施方案中，sdAb具有的对其表位的亲和力强于包含VH和VL的抗原结合部分。在一些实施方案中，sdAb具有的对其表位的亲和力弱于包含VH和VL的抗原结合部分。在一些实施方案中，sdAb与其表位之间的亲和力和包含VH和VL的抗原结合部分与其表位之间的亲和力之间的差值约至少为下列中的任一者：2倍、5倍、10倍、100倍、1000倍或更多。在一些实施方案中，sdAb与其表位之间的亲和力相当于包含VH和VL的抗原结合部分与其表位之间的亲和力。
在一些实施方案中，sdAb特异性地结合免疫检查点分子。在一些实施方案中，sdAb特异性地结合刺激免疫检查点分子。在一些实施方案中，sdAb特异性地结合抑制免疫检查点分子。在一些实施方案中，sdAb特异性结合选自下列的免疫检查点分子：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7-H3、TIM-3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。在一些实施方案中，sdAb是免疫检查点分子的激动剂。在一些实施方案中，sdAb是免疫检查点分子的拮抗剂。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二免疫检查点分子的第二表位的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7-H3、TIM-3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。在一些实施方案中，第一表位来自第二免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一表位来自促炎分子，诸如促炎细胞因子。在一些实施方案中，所述促炎分子选自IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-6、IL-6R和嗜酸细胞活化趋化因子-1。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，sdAb特异性地结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以高亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以中等亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以低亲和力结合CTLA-4。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合免疫检查点分子的表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合CTLA-4的sdAb(例如，VHH)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，免疫检查点分子是CTLA-4的表位，其与由sdAb特异性识别的表位不同。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、TIM-3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-PD-1单克隆抗体(诸如派姆单抗或纳武单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-PD-1单克隆抗体(诸如度伐鲁单抗或阿特朱单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，sdAb以高亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以中等亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以低亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，sdAb特异性地结合TIM-3。在一些实施方案中，sdAb以高亲和力结合TIM-3。在一些实施方案中，sdAb以中等亲和力结合TIM-3。在一些实施方案中，sdAb以低亲和力结合TIM-3。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合免疫检查点分子的表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合TIM-3的sdAb(例如，VHH)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-PD-1单克隆抗体(诸如派姆单抗或纳武单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-PD-1单克隆抗体(诸如度伐鲁单抗或阿特朱单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，sdAb特异性地结合LAG-3。在一些实施方案中，sdAb以高亲和力结合LAG-3。在一些实施方案中，sdAb以中等亲和力结合LAG-3。在一些实施方案中，sdAb以低亲和力结合LAG-3。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合免疫检查点分子的表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合LAG-3的sdAb(例如，VHH)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、TIM-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-PD-1单克隆抗体(诸如派姆单抗或纳武单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-PD-1单克隆抗体(诸如度伐鲁单抗或阿特朱单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，sdAb特异性地结合VISTA。在一些实施方案中，sdAb以高亲和力结合VISTA。在一些实施方案中，sdAb以中等亲和力结合VISTA。在一些实施方案中，sdAb以低亲和力结合VISTA。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合免疫检查点分子的表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合VISTA的sdAb(例如，VHH)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、TIM-3、LAG-3、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-PD-1单克隆抗体(诸如派姆单抗或纳武单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-PD-1单克隆抗体(诸如度伐鲁单抗或阿特朱单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，sdAb特异性结合细胞表面抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原为肿瘤抗原。在一些实施方案中，sdAb特异性结合免疫效应子细胞(诸如T细胞或自然杀伤细胞)上的细胞表面抗原。
在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一肿瘤抗原的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二肿瘤抗原的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原和/或第二肿瘤抗原选自：HER2、BRAF、EGFR、VEGFR2、CD20、RANKL、CD38和CD52。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-HER-2单克隆抗体(诸如曲妥珠单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
在一些实施方案中，sdAb特异性地结合CD3。在一些实施方案中，sdAb以高亲和力结合CD3。在一些实施方案中，sdAb以中等亲和力结合CD3。在一些实施方案中，sdAb以低亲和力结合CD3。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合肿瘤抗原的表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合CD3的sdAb(例如，VHH)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原选自：HER2、BRAF、EGFR、VEGFR2、CD20、RANKL、CD38和CD52。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-HER-2单克隆抗体(诸如曲妥珠单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，sdAb特异性结合细胞外蛋白质，诸如分泌蛋白。在一些实施方案中，sdAb特异性地促炎分子。在一些实施方案中，sdAb特异性结合血管生成因子，诸如VEGF。
在一些实施方案中，sdAb特异性地结合IL-1β。在一些实施方案中，sdAb以高亲和力结合IL-1β。在一些实施方案中，sdAb以中等亲和力结合IL-1β。在一些实施方案中，sdAb以低亲和力结合IL-1β。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合促炎分子的表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合IL-1β的sdAb(例如，VHH)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述促炎分子选自TNF-α、IL-5、IL-6、IL-6R和嗜酸细胞活化趋化因子-1。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-TNF-α单克隆抗体(诸如阿达木单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
在一些实施方案中，sdAb特异性地结合嗜酸性粒细胞趋化因子-1，即CCL11。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合促炎分子的表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合嗜酸性粒细胞趋化因子-1的sdAb(例如，VHH)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述促炎分子选自IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-6和IL-6R。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-IL-5单克隆抗体(诸如美泊利单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
包含VH和VL的抗原结合部分
本申请的MABP包含至少一种抗原结合部分，其包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。此类抗原结合部分可以为由两个重链和两个轻链组成的全长常规抗体，或由其衍生的抗原结合片段。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分为包含含有VH结构域的重链和含有VL结构域的轻链的抗体结合片段。本文设想的示例性抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(诸如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如人Fc区。在一些实施方案中，Fc区衍生自IgG分子，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类中的任一者。在一些实施方案中，Fc区能够介导抗体效应子功能，诸如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和/或CDC(补体依赖性细胞毒性。例如，具有野生型Fc序列的亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常示出包括C1q和C3结合的补体激活，然而IgG4不激活补体系统并且不结合C1q和/或C3。在一些实施方案中，所述Fc区包含修饰，其降低Fc区对Fc受体的结合亲和力。在一些实施方案中，Fc区为IgG1 Fc。在一些实施方案中，IgG1 Fc包含位置233-236中的一个或多个突变，诸如，L234A和/或L235A。在一些实施方案中，Fc区为IgG4 Fc。在一些实施方案中，IgG4 Fc包含位置327、330和/或331中的突变。参见，例如，Armour KL等人，Eur J.Immunol.1999；29:2613；和Shields RL等人，J.Biol.Chem.2001；276:6591。在一些实施方案中，Fc区包含P329G突变。
在一些实施方案中，Fc区包含促进两个不相同重链的异源二聚化的修饰。此类修饰的Fc区对于本文所述具有不对称设计的MABP可能是特别感兴趣的。在一些实施方案中，所述修饰为杵臼结构修饰，其包括在重链或重链融合多肽中的一者中的杵修饰以及两个重链或重链融合多肽的另一个中的臼修饰。在一个实施方案中，Fc区包含CH3结构域中两个重链之间界面内的修饰，其中i)在一个重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基置换，从而产生在一个重链的CH3结构域中的界面内的隆起(“杵”)，其可定位在另一重链的CH3结构域中的界面内的腔体(“臼”)中，并且在另一重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基置换，从而产生在第二CH3结构域中界面内的腔体(“臼”)，在所述腔体内可定位第一CH3结构域中界面内的隆起(“杵”)。杵臼结构修饰的示例描述于例如US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431，和Zhu等人，1997，Protein Science 6：781-788中。本文还设想了促进异源二聚化的Fc区的其它修饰。例如，可将静电转向效应工程化到Fc区中以提供Fc-异源二聚体分子(参见，例如，US4676980，和Brennan等人，Science，229：81(1985))。
在一些实施方案中，所述Fc区包含抑制Fab臂交换的修饰。例如，IgG4 Fc中的S228P突变抑制Fab臂交换。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含κ轻链恒定区。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含λ轻链恒定区。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的轻链恒定区。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链恒定区。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分为全长抗体，所述全长抗体由两个重链和两个轻链组成。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含单克隆抗体，所述单克隆抗体由两个重链和两个轻链组成(本文中也被称为“4-链抗体”)。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含多特异性(诸如双特异性)全长抗体，所述全长抗体由两个重链和两个轻链组成。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含人IgG1亚类或具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的全长抗体。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包括人IgG2亚类的全长抗体。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包括人IgG3亚类的全长抗体。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含人IgG4亚类或具有附加突变S228P的人IgG4亚类的全长抗体。
本领域已知的任何全长4-链抗体或由其衍生的抗原结合片段可用作本申请的MABP中的第一抗原结合部分。具有经验证的临床功效、安全性和药代动力学特征的抗体或抗体片段是特别感兴趣的。在一些实施方案中，在与第二抗原结合部分融合以提供MABP之前，将本领域中已知的抗体或抗体片段进一步工程化，例如人源化或诱变以选择具有合适亲和力的变体。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含本领域已知的单克隆抗体或抗体片段的VH和VL结构域，以及经修饰的重链恒定区和/或轻链恒定区。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含本领域已知的单克隆抗体和修饰的Fc区，诸如具有S228P突变的IgG4Fc。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含人、人源化或嵌合的全长抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分来源于经批准的(诸如被FDA和/或EMA)或研究性单克隆抗体或抗体片段(诸如Fab)。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分为经批准的(诸如被FDA和/或EMA)或研究性单克隆抗体或抗体片段(诸如Fab)。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分特异性结合免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长抗体(诸如拮抗剂抗体)或由其衍生的抗原结合片段，其特异性结合抑制性免疫检查点蛋白。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长抗体(诸如激动剂抗体)或由其衍生的抗原结合片段，其特异性结合刺激检查点分子。在一些实施方案中，所述免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7-H3、TIM-3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分为抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体选自派姆单抗和纳武单抗。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分为抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体为度伐鲁单抗或阿特朱单抗。在一些实施方案中，第一抗原结合部分为抗-CTLA-4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-CTLA-4抗体为伊匹单抗。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含派姆单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含VH结构域所述VH结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，和VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含IgG4 Fc。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含IgG4 Fc。
派姆单抗(例如)为用于癌症免疫疗法中的人源化抗体。其靶向程序性细胞死亡1(PD-1)受体。所述药物最初用于治疗转移性黑素瘤。2014年9月4日，美国食品和药品监督管理局(FDA)根据FDA快速通道发展项目批准了其已被批准用于晚期黑色素瘤。2015年10月2日，美国FDA批准用于治疗患者的转移性非小细胞肺癌，所述患者的肿瘤表达PD-L1且用其它化疗药物治疗失败。
伊匹单抗(例如，)是完全人抗-CTLA-4免疫球蛋白G1(IgG1)单克隆抗体(mAb)，其阻断T细胞活化的下调。伊匹单抗是CTLA-4免疫检查点抑制剂，其阻断由CTLA-4通路诱导的T细胞抑制信号，并增加肿瘤反应性T效应细胞的数量。伊匹单抗与纳武单抗(例如，)联合使用，以研究PD-1和CTLA-4受体在非人灵长类中同时抑制的影响。在单一疗法或与伊匹单抗联合治疗多种肿瘤类型(包括肾细胞癌、黑色素瘤、NSCLC和某些淋巴瘤)时展示出临床疗效。BMS最近公布了免疫联合疗法和伊匹单抗用于治疗黑素瘤的治疗结果。伊匹单抗单一疗法相比，联合疗法实现了非常高的受试者响应率(61％相对于11％)和22％完全缓解率，同时疾病进展或死亡风险减小了60％。这种疗法展示出免疫治疗剂的不同组合在癌症临床治疗中的巨大潜力。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分特异性结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原选自：HER2、BRAF、EGFR、VEGFR2、CD20、RANKL、CD38和CD52。在一些实施方案中，第一抗原结合部分为抗-HER2抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-HER2抗体为曲妥珠单抗。
曲妥珠单抗是五种最畅销的治疗性抗体之一，是人源化抗-HER2受体单克隆抗体，其可显著增加患有HER2-阳性乳腺癌患者的生存率。HER受体是嵌入细胞膜中的蛋白质，并且将来自细胞外部的分子信号(称为EGF的分子)传递到细胞内部，并打开和关闭基因。HER蛋白(人表皮生长因子受体)结合人表皮生长因子，并刺激细胞增殖。在一些癌症中，特别是在某些类型的乳腺癌中，HER2过表达，并导致癌细胞不受控制地繁殖。然而，在乳腺癌患者中，仅其中15％-20％表现出人表皮生长因子受体2(HER2)的扩增和过表达，大多数HER2患者不对曲妥珠单抗反应。此外，一些HER2+患者在初始治疗后已对曲妥珠单抗产生耐药性。因为表皮生长因子RTK家族由四个成员组成：EGFR、HER2、HER3和HER4，所以已经开发了一些双特异性抗体以靶向这些抗原中的两种，这示出优于常规单特异性抗体的优势。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分特异性结合血管生成因子。在一些实施方案中，第一抗原结合部分为抗-Ang2抗体或其抗原结合片段，诸如LC10。
在一些实施方案中，第一抗原结合部分特异性结合促炎分子。在一些实施方案中，所述促炎分子选自IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-6、IL-6R和嗜酸细胞活化趋化因子-1。在一些实施方案中，第一抗原结合部分为抗-TNF-α抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-TNF-α抗体为阿达木单抗。
示例性多特异性抗原结合蛋白
在一些实施方案中，提供多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合CTLA-4的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，sdAb以高亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以中等亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以低亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VH-CH1-CH2-CH3-VHH；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合CTLA-4。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于派姆单抗或纳武单抗。在一些实施方案中，CH3和VHH结构域经由肽接头，诸如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图4所示的结构。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VHH-VH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合CTLA-4。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于派姆单抗或纳武单抗。在一些实施方案中，VH和VHH结构域经由肽接头，诸如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图9所示的结构。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-VHH，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合CTLA-4。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于派姆单抗或纳武单抗。在一些实施方案中，CL和VHH结构域经由肽接头，诸如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图11所示的结构。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VHH-VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合CTLA-4。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于派姆单抗或纳武单抗。在一些实施方案中，VL和VHH结构域经由肽接头，诸如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图13所示的结构。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VHH-VH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VHH-VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合CTLA-4。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于派姆单抗或纳武单抗。在一些实施方案中，VL和VHH结构域和/或VL和VHH结构域经由肽接头，诸如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG4Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图17所示的结构。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VHH1-VHH2-VH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合CTLA-4。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于派姆单抗或纳武单抗。在一些实施方案中，VHH1和VHH2结构域和/或VH和VHH2结构域经由肽接头，诸如包含SEQID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图18所示的结构。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VH-CH1-VHH-CH2-CH3；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合CTLA-4。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于派姆单抗或纳武单抗。在一些实施方案中，CH1和VHH结构域经由肽接头，诸如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图19所示的结构。
在一些实施方案中，提供了双特异性抗原结合蛋白包含多肽，所述多肽从N-末端到C-末端包含：scFv-VHH-CH2-CH3，其中所述scFv特异性结合PD-1，并且其中VHH特异性结合CTLA-4。在一些实施方案中，scFv来源于派姆单抗或纳武单抗。在一些实施方案中，scFv和VHH结构域经由肽接头，例如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图20所示的结构。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VH-CH1-VHH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-VHH-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合CTLA-4。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于派姆单抗或纳武单抗。在一些实施方案中，CH1和VHH结构域和/或CL和VHH结构域经由肽接头，诸如包含SEQID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图21所示的结构。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：scFv-VHH-CH2-CH3；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VHH-CL，其中scFv特异性结合PD-1，并且其中VHH特异性结合CTLA-4。在一些实施方案中，scFv来源于派姆单抗或纳武单抗。在一些实施方案中，scFv和VHH结构域经由肽接头，例如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图22所示的结构。
在一些实施方案中，提供多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合TIM-3的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，提供多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合LAG-3的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，提供多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合VISTA的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链，所述重链包含含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH结构域，和轻链，所述轻链包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VL结构域。和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含抗-CTLA-4 sdAb，并且其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一抗原结合部分为全长派姆单抗。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的N-末端经由任选的肽接头与第一抗原结合部分的重链的C-末端融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分的C-末端经由任选的肽接头与第一抗原结合部分的重链的N-末端融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，提供多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(诸如，度伐鲁单抗或阿特朱单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-L1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合CTLA-4的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，sdAb以高亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以中等亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以低亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VHH-VH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合CTLA-4。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于阿特朱单抗。在一些实施方案中，VH和VHH结构域经由肽接头，诸如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图9所示的结构。
在一些实施方案中，提供多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(诸如，度伐鲁单抗或阿特朱单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-L1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合TIM-3的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，提供多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(诸如，度伐鲁单抗或阿特朱单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-L1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合LAG-3的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，提供多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(诸如，度伐鲁单抗或阿特朱单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-L1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合VISTA的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(诸如曲妥珠单抗)，其中所述全长抗体特异性结合HER2受体；和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合CD3的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(诸如LC10)，其中所述全长抗体特异性结合Ang2；和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合VEGF的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VH-CH1-CH2-CH3-VHH；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合Ang2的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合VEGF。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于LC10。在一些实施方案中，CH3和VHH结构域经由肽接头，诸如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图4所示的结构。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VHH-VH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合Ang2的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合VEGF。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于LC10。在一些实施方案中，VH和VHH结构域经由肽接头，诸如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图9所示的结构。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-VHH，其中VH和VL形成特异性结合Ang2的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合VEGF。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于LC10。在一些实施方案中，CL和VHH结构域经由肽接头，诸如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图11所示的结构。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽从N-末端到C-末端包含：VH-CH1-CH2-CH3；和(b)第二多肽，所述第二多肽从N-末端至C-末端包含：VHH-VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合Ang2的抗原结合位点，并且其中VHH特异性结合VEGF。在一些实施方案中，VH和VL结构域来源于LC10。在一些实施方案中，VL和VHH结构域经由肽接头，诸如包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列的肽接头彼此融合。在一些实施方案中，CH2和CH3结构域来源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，BABP具有如图13所示的结构。
在一些实施方案中，提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(诸如阿达木单抗)，其中所述全长抗体特异性结合TNF-α；和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合IL-1β的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
在一些实施方案中，提供了多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(诸如美泊利单抗)，其中所述全长抗体特异性结合IL-5；和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合嗜酸性粒细胞趋化因子-1的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
MABP的特性
本文所述的MABP适合用于作为生物药物的制造和开发。在一些实施方案中，MABP可以高表达水平重组产生。在一些实施方案中，MABP可以足以工业生产的水平重组产生。在一些实施方案中，MABP可在哺乳动物细胞中瞬时表达。在一些实施方案中，哺乳动物细胞培养物中的MABP的表达水平与亲本4-链抗体的表达水平相当，诸如不小于约亲本4-链抗体的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％溶解度中的任一种。如本文所用，所述“亲本4-链抗体”是指抗体，诸如全长4-链抗体，其包含第一抗原结合部分的VH和VL。在一些实施方案中，哺乳动物细胞培养物中的MABP的表达水平高于亲本4-链抗体的表达水平。在一些实施方案中，哺乳动物细胞培养物(例如，CHO细胞)中的MABP的表达水平为至少约下列中的任一种：10mg/L、15mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L、70mg/L、80mg/L、90mg/L、100mg/L、110mg/L、120mg/L、150mg/L或更高。细胞培养物中MABP的表达水平可使用本领域中已知的方法，诸如通过SDS-PAGE分析，或使用高效液相色谱法(HPLC)或快速蛋白质液相色谱法(FPLC)分析来确定。
在一些实施方案中，通过重组表达产生的MABP可通过尺寸排阻色谱法纯化至同质性或基本均质性。在一些实施方案中，纯化的MABP中的单分散分子例如，作为单体MABP分子，诸如由4个多肽链组成的二聚体蛋白)的百分比，例如如通过色谱法确定的，为至少约下列中的任一者：90％、91％、92％、93％、94％、95％，96％、97％、98％、99％、99.5％或更高。可使用本领域已知的方法，诸如通过SDS-PAGE分析、动态光散射(DLS)或使用HPLC或FPLC分析来确定组合物中MABP的均匀性。在一些实施方案中，来自纯化的MABP的收率为至少约下列中的任一者：50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些实施方案中，来自纯化的MABP的收率为约70％至约95％。
本文所述的MABP还具有适合用作生物药物的各种生物物理特性，包括例如高溶解度、高长期稳定性和热稳定性。MABP的稳定性使用本领域中已知的方法，包括动态光散射(DSL)来确定，其基于其粒度来分析不同群体的可溶性分子。在一些实施方案中，组合物中至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％或更高的MABP是非聚集构象，即单一的单体MABP分子，例如由4个多肽链组成的二聚体蛋白。在一些实施方案中，组合物中的聚集度(即多种MABP分子以络合物形式缔合)不超过约下列中的任一者：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更高。在一些实施方案中，在约4℃下，形成组合物中MABP的至少约5％聚集的时间为至少约下列中的任一者：1天、3天、7天、2周、3周、4周或更长。在一些实施方案中，在约室温，即25℃下，形成组合物中MABP的至少约5％聚集的时间为至少约下列中的任一者：1天、3天、7天、2周、3周、4周或更长。在一些实施方案中，在生理温度，例如约37℃下，在组合物中形成至少约10％的MABP的时间为至少约下列中的任一者：1天、2天、3天、4天、6天、7天、10天、2周或更长。
在一些实施方案中，MABP具有与亲本4-连抗体或sdAb相当的溶解度，诸如不小于约下列中的任一种：50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％溶解度。在一些实施方案中，MABP具有比亲本4-链抗体或sdAb更高的溶解度。在一些实施方案中，MABP可以至少约下列中任一者的浓度溶于例如pH 7.2的PBS缓冲液中：50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、225mg/mL、250mg/mL、300mg/mL或更高。可使用本领域已知的任何方法测量MABP的溶解度，包括使用离心过滤器浓缩，然后进行蛋白质定量，或使MABP通过IgG偶联的交叉相互作用色谱(CIC)柱。在一些实施方案中，交叉相互作用色谱(CIC)柱上MABP的保留因子k'不超过约下列中的任一者：0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01或更少。
在一些实施方案中，MABP具有与亲本4-链抗体或其抗原结合片段相当的热稳定性。在一些实施方案中，MABP具有比亲本4-链抗体或其抗原结合片段更高的热稳定性。可使用本领域已知的方法测量热稳定性，包括毛细管差示扫描量热法(DSC)和与逐渐加热偶联的DLS。在一些实施方案中，MABP具有至少约65℃的聚集起始温度(Tagg)，诸如至少约下列中的任一者：66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃或更高。在一些实施方案中，MABP具有约65℃至约75℃的聚集起始温度(Tagg)。在一些实施方案中，MABP具有至少约65℃，诸如至少约66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃或更高的展开中点温度(Tm)。在一些实施方案中，MABP具有约65℃至约75℃的展开中点温度(Tm)。
在一些实施方案中，MABP具有高长期稳定性。在一些实施方案中，在约4℃下，MABP可稳定至少约下列中的任一者：1天、3天、7天、2周、3周、4周或更长。在一些实施方案中，MABP具有在升高的温度下的高长期稳定性。在一些实施方案中，在室温下，诸如约25℃或更高，MABP可稳定至少约下列中的任一者：1天、3天、7天、2周、3周、4周或更长。在一些实施方案中，在生理温度下，诸如约37℃或更高，MABP可稳定至少约下列中的任一者：1天、2天、3天、4天、6天、7天、10天、2周或更长。在一些实施方案中，例如，在约40℃、50℃、60℃、70℃或更高中任一者的温度下，在加速稳定性评估程序中测试MABP的稳定性，以在较低温度下获得MABP的稳定性。在一些实施方案中，在高浓度下，诸如至少约下列中任一者：50mg/mL、100mg/mL、150mg/mL、200mg/mL或更高，MABP具有高长期稳定性。如本文所用，“稳定的”组合物基本上不含(诸如少于约下列中任一者：10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少)的沉淀和/或聚集。可通过光谱检测沉淀。可通过例如DLS检测聚集。
在一些实施方案中，MABP在冻融循环中具有高稳定性。在一些实施方案中，可将包含MABP的组合物冻融并持续至少约下列次数中的任一者：3、4、5、6、7、8、9、10次或更多，但不丧失结构完整性(例如，形成聚集体)和/或MABP的活性。在一些实施方案中，包含MABP的组合物可在高浓度下冻融，诸如至少约下列中任一者：50mg/mL、100mg/mL、150mg/mL、200mg/mL或更高。
本发明还提供了来源于本文所述的多特异性抗原结合蛋白中任一种的片段，例如Fab样结构域。
III.药物组合物
本申请还提供了药物组合物，所述药物组合物包含MABP和药学上可接受的载体中的任一种。药物组合物可通过将具有期望纯度的MABP与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16半，Osol,A.编辑(1980))，其呈冻干制剂或水溶液形式。
在一些实施方案中，药物组合物具有高浓度的MABP。在一些实施方案中，药物组合物中的MABP的浓度为至少约下列中任一者：50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、225mg/mL、250mg/mL、300mg/mL或更高。在一些实施方案中，药物组合物具有高热稳定性和长期稳定性。在一些实施方案中，药物组合物可在约室温(例如，约25℃)下储存至少约下列中的任一者：1天、3天、7天、2周、3周、4周或更长。在一些实施方案中，药物组合物可在生理温度(例如，约37℃)下储存至少约下列中的任一者：1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、2周或更长。在一些实施方案中，可将药物组合物冻融并持续至少约下列次数中的任一者：3、4、5、6、7、8、9、10次或更多，但不丧失结构完整性(例如，形成聚集体)和/或MABP的活性。在一些实施方案中，药物组合物的架藏寿命为至少约下列中的一者：1周、2周、3周、4周、2个月、3个月或更长。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对受体无毒，并且包括缓冲剂，抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、偏亚硫酸氢钠；防腐剂、等渗剂、稳定剂、金属络合物(例如，锌-蛋白质复合物)；螯合剂诸如EDTA和/或非离子表面活性剂。
缓冲剂用于将pH控制在优化治疗效果的范围内，尤其是在稳定性是pH依赖性的时。缓冲剂优选以在约50mM至约250mM范围内的浓度存在。适用于本申请的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲液可包含组氨酸和三甲基胺盐，诸如Tris。
添加防腐剂以延缓微生物生长，并且其通常以0.2重量/体积％至1.0重量/体积％的范围存在。适用于本申请的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎卤铵(例如苯扎氯铵、苯扎溴铵，苯扎碘铵)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
存在张度剂，有时被称为“稳定剂”，以调节或维持组合物中液体的张度。当与大的带电生物分子如蛋白质和抗体一起使用时，其通常被称为“稳定剂”，因为其可与氨基酸侧链的带电基团相互作用，从而减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其它成分的相对量，张度剂可以介于0.1重量％至25重量％之间，优选1重量％至5重量％之间的任何量存在。优选的张度剂包括多元糖醇，优选三元或更高级糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
附加赋形剂包括可用作下列中一种或多种的试剂：(1)填充剂、(2)溶解度増强剂、(3)稳定剂和(4)和防止变性或附着于容器壁的试剂。此类赋形剂包括：多元糖醇(上面列举的)；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(诸如肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖诸如棉子糖；以及多糖诸如糊精或葡聚糖。
存在非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以有助于增溶治疗剂以及保护治疗性蛋白免受搅拌诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力但不导致活性治疗蛋白质或抗体的变性。非离子表面活性剂以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(-20、-80等)-、聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子洗涤剂包括十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子洗涤剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了药物组合物用于体内施用，其必须是无菌的。可通过经由无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。本文的药物组合物通常置于具有无菌入口的容器中，例如，具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
施用途径根据已知和可接受的方法，例如通过单次或多次推注或以合适的方式长时间输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病灶内或关节内途径注射或输注，局部施用、吸入，或通过持续释放或延长释放方式。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的示例包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型制品的形式，例如，膜或微胶囊。持续释放基质的示例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
本文的药物组合物还可包含超过一种所治疗的具体适应症所必需的活性化合物，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些。作为另外一种选择或除此之外，所述组合物可包含细胞毒性试剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。这些分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分也可包埋在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如，分别在胶体药物递送体系(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版中。
MABP的示例性药物制剂是pH6.0的液体制剂，其包含柠檬酸钠、氯化钠、甘露醇、二乙烯三胺五乙酸(戊烯酸)和聚山梨醇酯80(吐温80)。在一些实施方案中，MABP以pH 6.0的液体制剂形式配制，所述液体制剂包含4％蔗糖、50mM组氨酸、50mM精氨酸。
IV.使用方法
本文所述的多特异性抗原结合蛋白及其组合物(诸如药物组合物)可用于多种应用，诸如诊断、分子测定和治疗。
在一些实施方案中，存在治疗对其有需要的个体的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长4-链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
治疗癌症的方法
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，改第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长4-链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一免疫检查点分子的表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二免疫检查点分子的sdAb(例如，VHH)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一免疫检查点分子和/或第二免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7-H3、TIM-3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在重链的N-末端、轻链的N-末端、Fc区的N-末端、重链的C-末端或轻链的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含全长4-链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合CTLA-4的sdAb(例如，VHH)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，sdAb以高亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以中等亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以低亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合TIM-3的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合LAG-3的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合VISTA的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的派姆单抗；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含抗-CTLA-4 sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:1、8或13的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，度伐鲁单抗或阿特朱单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-L1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合CTLA-4的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，sdAb以高亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以中等亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，sdAb以低亲和力结合CTLA-4。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，度伐鲁单抗或阿特朱单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-L1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合TIM-3的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，度伐鲁单抗或阿特朱单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-L1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合LAG-3的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，度伐鲁单抗或阿特朱单抗)，其中所述全长抗体特异性结合PD-L1；和(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合VISTA的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一肿瘤抗原的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二肿瘤抗原的sdAb(例如，VHH)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第一肿瘤抗原和/或第二肿瘤抗原选自：HER2、BRAF、EGFR、VEGFR2、CD20、RANKL、CD38和CD52。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-HER-2单克隆抗体(诸如曲妥珠单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合肿瘤抗原的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合免疫效应子细胞(诸如T细胞)上的细胞表面抗原的sdAb(例如，VHH)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原选自：HER2、BRAF、EGFR、VEGFR2、CD20、RANKL、CD38和CD52。在一些实施方案中，所述第一抗原结合部分包含全长抗-HER-2单克隆抗体(诸如曲妥珠单抗)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一血管生成因子(诸如Ang-2)的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二血管生成因子(诸如VEGF)的sdAb(例如，VHH)，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的癌症(诸如乳腺癌)的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，曲妥珠单抗)，其中所述全长抗体特异性结合HER2受体；和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合CD3的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。
本文所述的方法适用于治疗多种癌症，包括固体癌症和液体癌症两者。所述方法适用于所有阶段的癌症，包括早期癌症、晚期癌症和转移性癌症。本文所述的方法可在辅助设置或新辅助设置中，作为第一疗法、第二疗法、第三疗法、或与本领域已知的其它类型的癌症疗法(诸如化疗、手术、放射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等)的联合疗法。
治疗炎性或自身免疫性疾病的方法
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的炎性或自身免疫疾病的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病选自关节炎(诸如类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、牛皮鲜性关节炎、强直性脊柱炎和关节炎性溃疡性结肠炎)、结肠炎、牛皮鲜、重度哮喘和中度至重度克罗恩病。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的炎性或自身免疫疾病的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一促炎分子的抗原结合位点，和(b)第二抗原结合部分，该二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病选自关节炎(诸如类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、牛皮鲜性关节炎、强直性脊柱炎和关节炎性溃疡性结肠炎)、结肠炎、牛皮鲜、重度哮喘和中度至重度克罗恩病。在一些实施方案中，所述第一促炎分子和/或第二促炎分子选自IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-6、IL-6R和嗜酸细胞活化趋化因子-1。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的炎性或自身免疫性疾病的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，阿达木单抗)，其中所述全长抗体特异性结合TNF-α；和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合IL-1β的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病选自关节炎(诸如类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、牛皮鲜性关节炎、强直性脊柱炎和关节炎性溃疡性结肠炎)、结肠炎、牛皮鲜、重度哮喘和中度至重度克罗恩病。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗对其有需要的个体的炎性或自身免疫性疾病的方法，该方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白和药学上可接受的载体，其中MABP包含：(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如，美泊利单抗)，其中所述全长抗体特异性结合IL-5；和(b)第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含特异性结合嗜酸性粒细胞趋化因子-1的sdAb，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，sdAb是骆驼sdAb、人源化sdAb、或人sdAb。在一些实施方案中，所述炎性或自身免疫性疾病选自关节炎(诸如类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、牛皮鲜性关节炎、强直性脊柱炎和关节炎性溃疡性结肠炎)、结肠炎、牛皮鲜、重度哮喘和中度至重度克罗恩病。在一些实施方案中，第二抗原结合部分在两个重链中的一个或每个的N-末端、两个轻链中的一个或每个的N-末端、Fc区的N-末端、两个重链中的一个或每个的C-末端或两个轻链中的一个或每个的C-末端处与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分与第一抗原结合部分在化学上融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分经由肽键或肽接头与第一抗原结合部分融合。在一些实施方案中，肽接头不超过约30个(诸如不超过约25个、20个、或15个中任一个)氨基酸长。在一些实施方案中，第一抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc。
施用剂量和路径
本申请的药物组合物的剂量和期望的药物浓度可根据预想的具体用途而变化。合适剂量或施用途径的确定完全在普通技术人员的技能范围内。动物实验为确定人类治疗的有效剂量提供了可靠的指导。有效剂量的种间类推可根据由Mordenti,J.和Chappell,W.，“The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics”，In Toxicokinetics and NewDrug Development，Yacobi等人编辑，Pergamon Press，New York 1989，第42-46页制定的原理来进行。
当使用本文所述的MABP的体内施用时，正常剂量可以从约10ng/kg哺乳动物体重/每天直至约100mg/kg哺乳动物体重/每天或更多变化，优选约1mg/kg/天至10mg/kg/天，这取决于施用途径。在本申请的范围内，不同的制剂对于不同的治疗和不同的病症是有效的，并且旨在治疗特定器官或组织的施用可需要以不同于另一种器官或组织的方式来递送。此外，剂量可通过一次或多个独立的施用或通过连续输注来施用。对于数天或更长时间的重复施用，根据病症，持续治疗直至发生疾病症状的期望的抑制。然而，其它剂量方案可以是有用的。通过常规技术和测定可容易地监测所述治疗的进展。
在一些实施方案中，药物组合物施用单次。在一些实施方案中，将药物组合物施用多次(诸如下列中的任一者：2、3、4、5、6或更多次)。在一些实施方案中，药物组合物每周一次、2周一次、3周一次、4周一次、每月一次、每2月一次、每3月一次、每4月一次、每5月一次、每6月一次、每7月一次、每8月一次、每9月一次、或每年一次进行施用。在一些实施方案中，施用之间的间隔为约下列中的任一种：1周至2周、2周至1个月、2周至2个月、1个月至2个月、1个月至3个月、3个月至6个月、或6个月至一年。通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
根据已知的方法，诸如以推注形式静脉内施用，或通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径连续输液一段时间，将本申请的药物组合物(包括但不限于重构制剂和液体制剂)施用于需要利用MABP治疗的个体，优选人。
在一些实施方案中，药物组合物通过皮下(即，在皮肤下面)施用施用于个体。出于此目的，可使用注射器注射药物组合物。然而，可用其它设备进行药物组合物的施用，诸如注射装置；注射笔；自动注射器装置、无针装置；和皮下贴片递送体系。
在一些实施方案中，药物组合物静脉内施用于个体。在一些实施方案中，药物组合物通过输注，诸如静脉注射施用于个体。用于免疫疗法的输注技术是本领域已知的(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676(1988))。
V.制备方法
本申请还提供了编码MABP的分离的核酸，和包含此类分离的核酸的载体和宿主细胞，以及用于制备MABP的重组方法。
对于MABP的重组制备，将编码第一抗原结合部分的全长抗体或抗原结合片段的核酸与sdAb分离，并插入可复制载体中，用于进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。在一些实施方案中，编码第一抗原结合部分的全长抗体或抗原结合片段的核酸与编码第二抗原结合部分的sdAb的核酸重组融合，并且任选地经由编码肽接头的核酸，全部框内重组融合以用于相对于彼此翻译来提供编码MABP的核酸。编码MABP的DNA、其组分或sdAb容易使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行分离和测序。许多载体是可用的。载体的选择部分取决于待使用的宿主细胞。一般来讲，优选的宿主细胞具有原核或真核(一般来讲为哺乳动物)来源。另选地，第一抗原结合片段和第二抗原结合片段各自分别使用包含编码第一抗原结合片段和第二抗原结合片段的核酸的原核或真核宿主细胞重组制备。然后将表达的第一抗原结合片段和第二抗原结合片段化学缀合并纯化以便提供MABP。
1.原核细胞中的蛋白质产生
a)载体构建
可使用标准重组技术获得编码本申请的MABP的多肽组分的多核苷酸序列。期望的多核苷酸序列可与抗体产生细胞(诸如杂交瘤细胞)分离和测序。另选地，可使用核苷酸合成器或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，就将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域可用且已知的多种载体可用于本申请的目的。合适载体的选择将主要取决于待插入载体中的核酸大小以及待被该载体转化的特定宿主细胞。每种载体包含多种组分，这取决于其功能(异源多核苷酸的扩增或表达，或这两者)及其与其所存在的特定宿主细胞的相容性。载体组分一般包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入序列和转录终止序列。
一般来讲，包含来源于与宿主细胞相容的物种的复制和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，使用通常使用pBR322(来源于大肠杆菌物种的质粒)转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，并且因此提供了鉴定转化细胞的简便方式。pBR322、其衍生物或其它微生物质粒或噬菌体也可包含或经修饰以包含可被微生物用于表达内源蛋白质的启动子。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的示例详细地描述于Carter等人，美国专利5,648,237中。
另外，包含与宿主微生物相容的复制和控制序列的噬菌体载体可与这些宿主结合用作转化载体。例如，噬菌体诸如GEMTM-11可用于制备重组载体，所述载体可用于转化易感宿主细胞，诸如大肠杆菌LE392。
本文所述的表达载体可包含两个或更多个启动子-顺反子对，其编码多肽组分中每一种。启动子是位于调节其表达的顺反子上游(5')的非翻译调节序列。原核启动子通常分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件的变化，例如存在或不存在营养素或温度变化，在其控制下引发顺反子的转录水平的增加。
由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子为人们所熟知。通过限制酶消化从源DNA中除去启动子并将分离的启动子序列插入载体中，可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作地连接。天然启动子序列和许多异源启动子两者均可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们一般允许经表达的靶基因的更多的转录和更高收率。
适合与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、-半乳糖酶和乳糖启动子体系、色氨酸(trp)启动子体系和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中是功能性的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的其核苷酸序列已被公开，从而使技术人员能够使用用于提供任何所需限制位点的接头或衔接子可操作地将它们连接到编码靶轻链和重链的顺反子(Siebenlist等人，(1980)Cell 20:269)。
在一个方面，重组载体内的每个顺反子包含分泌信号序列组分，其指导表达的多肽跨膜转运。一般来讲，信号序列可以是载体的组分，或者其可以是插入载体中的靶多肽DNA的一部分。被选择用于本申请的信号序列应当是被宿主细胞识别和处理的(即，由信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别和处理来源于异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，信号序列被原核信号序列取代，所述原核信号序列选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热-稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在一些实施方案中，用于表达体系的两个顺反子的信号序列是STII信号序列或其变体。
在一些实施方案中，MABP的产生可在宿主细胞的细胞质中发生，并且因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在一些实施方案中，多肽组分，诸如编码任选与第二抗原结合部分融合的第一抗原结合部分的VH结构域的多肽，和编码任选地与第二抗原结合融合的第一抗原结合部分的VL结构域的多肽，表达、折叠并组装以在细胞质内形成功能性MABP。某些宿主菌株(例如，大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而允许表达的蛋白质亚基的正确折叠和组装。Proba and Pluckthun Gene,159:203(1995)。
本专利申请提供了表达系统，其中可调节表达的多肽组分的定量比率，以便最大化本申请的分泌和正确组装的MABP的收率。此类调节至少部分地通过同时调节多肽组分的翻译强度来实现。用于调节翻译强度的一种技术公开于Simmons等人，美国专利5,840,523中。其利用顺反子内的翻译起始区(TIR)的变体。对于给定的TIR，一系列氨基酸或核酸序列变体可以系列翻译强度产生，从而提供由此调节该因素以获得特定链的期望表达水平的便利方式。TIR变体可通过常规诱变技术产生，所述技术导致密码子改变，所述密码子改变可改变氨基酸序列，但也优选核苷酸序列中的沉默改变。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数量或间距的改变，连同信号序列的改变。产生突变信号序列的一种方法是在编码序列开始时产生“密码子库”，其不改变信号序列的氨基酸序列(即，改变是沉默的)。这可通过改变每个密码子的第三核苷酸位置来实现。此外，一些氨基酸诸如亮氨酸、丝氨酸和精氨酸，具有多个第一和第二位置，这可增加制造库的复杂性。该诱变方法详细描述于Yansura等人，(1992)METHODS:A Companion to Methods in Enzymol.4:151-158中。
优选，产生对于其中每个顺反子具有系列TIR强度的一组载体。该有限的组提供了在各种TIR强度组合下，每个链的表达水平以及期望的MABP产物的收率的比较。TIR强度可通过对报道基因的表达水平进行量化来确定，如Simmons等人，美国专利5,840,523中所述的。基于翻译强度比较，选择期望的单独TIR以在本申请的表达载体构建体中组合。
b)原核宿主细胞。
适用于表达本申请的MABP的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物。可用的细菌示例包括埃希杆菌属(例如，大肠杆菌)、芽孢杆菌(例如枯草芽孢杆菌)、肠杆菌、假单胞菌属物种(例如铜绿假单胞菌)、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、志贺氏菌、根瘤菌、透明颤菌或副球菌。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，将大肠杆菌细胞用作宿主。大肠杆菌菌株的示例包括菌株W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第2卷，(Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987)，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)，及其衍生物，包括菌株33D3，其具有基因型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE)degP41 kanR(美国专利5,639,635)。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些示例是说明性的而不是限制性的。构建具有限定基因型的上述细菌中任一种的衍生物的方法是本领域已知的，并描述于例如Bass等人，Proteins，8：309-314(1990)中。考虑到复制子在细菌细胞中的可复制性，通常需要选择合适的细菌。例如，当人们所熟知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410用于提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌属物种可适合用作宿主。
通常，宿主细胞应当分泌最少量的蛋白水解酶，并且可以理想地将附加蛋白酶抑制剂掺入细胞培养物中。
c)蛋白质生产
用上述表达载体转化宿主细胞，并在适当修改的常规营养培养基中培养，以用于诱导启动子、选择转化株或扩增编码期望序列的基因。转化是指将DNA引入原核宿主中以使DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合子复制。根据所用的宿主细胞，使用适合于此类细胞的标准技术进行转化。使用氯化钙的钙处理一般用于包含大量细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。所用的另一种技术是电穿孔。
用于产生本申请的MABP的原核细胞在本领域已知并适用于培养所选宿主细胞的培养基中生长。合适培养基的示例包括luria肉汤(LB)加上必需的营养补充剂。在一些实施方案中，培养基还包含选择剂，其基于构件表达载体选择，以选择性地允许包含表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素添加到培养基中用于表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的生长。
除了碳、氮和无机磷酸盐源之外的任何必要的补充剂也可以单独引入，或作为与另一种补充剂或培养基(例如复合氮源)的混合物形式以适当的浓度被包括。任选地，培养基可包含一种或多种还原剂，所述还原剂选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸酯、二硫赤藓醇和二硫苏糖醇。
原核宿主细胞在合适的温度下培养。例如，对于大肠杆菌生长而言，优选的温度范围为约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。培养基的pH可以为约5至约9范围内的任何pH，这主要取决于宿主生物。对于大肠杆菌，pH优选为约6.8至约7.4，更优选为约7.0。
如果诱导型启动子用于表达载体中，则在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在一些实施方案中，PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，在磷酸盐限制性培养基中培养转化的宿主细胞用于诱导。优选，磷酸盐限制性培养基是C.R.A.P培养基(参见，例如，Simmons等人，J.Immunol.Methods(2002)，263:133-147)。根据所用的载体构建体，可以使用多种其它诱导物，如本领域已知的。
本申请的表达的MABP分泌到宿主细胞的周质中并从宿主细胞的周质中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，其一般通过诸如渗透压休克、超声处理或裂解的方式来进行。一旦细胞被破坏，细胞碎片或整个细胞就可通过离心或过滤移除。蛋白质可例如通过亲和树脂色谱法进一步纯化。另选地，可将蛋白质转移到培养基中并在其中分离。可从培养物中移除细胞，并且将培养上清液过滤并浓缩，以进一步纯化所产生的蛋白质。表达的多肽可使用通常已知的方法，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析，来进一步分离和鉴定。
另选地，蛋白质生产通过发酵过程大量进行。各种大规模补料分批发酵程序可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升容量，优选约1,000至100,000升容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧气和养分，尤其是葡萄糖(优选的碳/能源)。小规模发酵一般是指发酵罐中的发酵，所述发酵罐的体积容量不超过约100升，并且可在约1升至约100升的范围内。
在发酵过程中，蛋白质表达的诱导通常在细胞已经在合适条件下生长至期望密度(例如OD550为约180-220)之后引发，在该阶段细胞处于早期稳定期。根据所用的载体构建体，可以使用多种诱导物，如本领域已知的和如上所述的。细胞可在诱导之前生长较短的时间段。通常将诱导细胞约12-50小时，但可使用较长或更短的诱导时间。
为改善本申请的MABP的产量和质量，可改变各种发酵条件。例如，为了改善分泌的多肽的适当组装和折叠，过表达伴侣蛋白，诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣蛋白活性的肽基脯氨酰顺式，反式异构酶)的附加载体可用于共转化宿主原核细胞。伴侣蛋白已经展示出有利于在细菌宿主细胞中产生异源蛋白质的适当折叠和溶解度。Chen等人，(1999)J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等人，美国专利6,083,715；Georgiou等人，美国专利6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17106-17113；Arie等人，(2001)Mol.Microbiol.39:199-210。
为了使表达的异源蛋白质(尤其是蛋白质水解敏感性的那些蛋白质)的蛋白质水解最小化，可将某些缺乏蛋白质水解酶的宿主菌株用于本申请。例如，可修饰宿主细胞株以在编码已知的细菌蛋白酶(诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI以及它们的组合)的基因中实现基因突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株可获得并且描述于以下文献中：例如，Joly等人(1998)，同上；Georgiou等人，美国专利5,264,365；Georgiou等人，美国专利5,508,192；Hara等人，Microbial Drug Resistance，2:63-72(1996)。
缺乏蛋白质水解酶并用过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株可用作编码本申请MABP的表达体系中的宿主细胞。
d)蛋白质纯化
将本文所制备的MABP进一步纯化以获得基本上均匀的制剂以用于进一步测定和使用。可采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适的纯化程序的示例：免疫亲和或离子交换柱上分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上或阳离子交换树脂如DEAE上的色谱，SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一些实施方案中，固定在固相上的蛋白质A用于包含本文所述Fc区的MABP的免疫亲和纯化。蛋白质A为411(D细胞壁蛋白，其来自金黄色葡萄球菌的(其以与抗体Fc区的高亲和力结合)。Lindmark等人(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。蛋白质A固定于其上的固相优选为包含玻璃或二氧化硅表面的柱，更优选为可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，所述柱已用试剂(例如甘油)涂覆，以试图防止污染物的非特异性粘附。然后洗涤固相，以除去非特异性结合到固相的污染物。最后，通过洗脱从固相中回收感兴趣的MABP。
2.真核细胞中的蛋白质产生
对于真核表达，载体组分一般包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、和增强子元件、启动子和转录终止序列。
a)信号序列组分
用于真核宿主的载体还可以是插入物，其编码在成熟蛋白质或多肽的N-末端处具有特异性切割位点的信号序列或其它多肽。选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶切割)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
将此类前体区的DNA在阅读框架中与编码本申请的MABP的DNA连接。
b)复制起点
一般来讲，复制组分的来源不需要哺乳动物表达载体(通常可仅使用SV40来源，因为其包含早期启动子)。
c)选择基因组分
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择性标记。典型的选择基因编码的蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型缺陷，或(c)提供从复杂培养基不可获得的关键营养素，例如，编码芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个示例利用药物来阻止宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质，因此在选择方案中得以存活。这种显性选择的示例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的合适选择性标记的另一示例是能够鉴定用于摄取编码本申请MABP的核酸的细胞组分的那些，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过在包含甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化体来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
另选地用编码多肽的DNA序列、野生型DHFR蛋白和另一种选择性标记，诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)转化或共转化的宿主细胞(具体地讲包含内源DHFR的野生型宿主)可通过培养基中的细胞生长来选择，所述培养基包含选择标记的选择剂，诸如氨基糖苷类抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418。参见，美国专利4,965,199。
d)启动子组分
表达和克隆载体通常包含由宿主生物识别并与编码期望多肽序列的核酸可操作连接的启动子。事实上，所有真核基因均具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基的富AT区。在许多基因转录起始上游70至80个碱基处发现的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以为任何核苷酸。大多数真核生物的3′端为AATAAA序列，其可为向编码序列的3′端添加polyA尾巴的信号。可将所有这些序列插入真核表达载体中。
适合与原核宿主一起使用的其它启动子包括phoA启动子、-乳糖酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统、以及杂合启动子，诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含可操作地连接于编码MABP的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录多肽例如受到启动子的控制，所述启动子获自诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、细胞巨化病毒、逆转录酶病毒、乙型肝炎病毒并最优选猿猴病毒40(SV40)的病毒的基因组，获自异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，获自热休克启动子，条件是此类启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子可以SV40限制性片段形式便利地获得，所述限制性片段还包含SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以HindIII E限制性片段便利地获得。使用牛乳头状瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的体系公开于美国专利4,419,446中。对该体系的改性描述于美国专利4,601,978中。关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下人干扰素cDNA在小鼠细胞中的表达，还可参见Reyes等人，Nature 297：598-601(1982)。另选地，劳氏肉瘤病毒长末端重复序列可用作启动子。
e)增强子元件组分
通常通过将增强子序列插入载体中，增加通过高等真核生物对编码本申请MABP的DNA的转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。然而，通常，将使用来自真核细胞病毒的增强子。示例包括复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子、以及腺病毒增强子。关于用于激活真核启动子的增强元件，还可参见，Yaniv，nature 297：17-18(1982)。增强子可以被剪接到载体中多肽编码序列的5′或3′位置，但优选位于启动子的5′位点。
f)转录终止组分
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含转录终止和稳定mRNA所需的序列。此类序列通常得自真核或病毒DNA或cDNA的5′(并偶尔为3′)非翻译区。这些区域在编码多肽的mRNA的非翻译部分中含有转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一种可用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
g)宿主细胞的选择和转化
用于在本文载体中克隆或表达DNA的合适的宿主细胞包括本文所述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的示例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7、ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(亚克隆用于悬浮培养基中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977))；小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
宿主细胞利用用于MABP生产的上述表达或克隆载体转化，并在适当修改的常规营养培养基中培养，以诱导启动子，选择转化体，或扩增编码期望序列的基因。
h)培养宿主细胞
用于制备本申请MABP的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购获得的培养基，诸如Ham's F10(Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)(Sigma)适用于培养宿主细胞。此外，描述于Ham等人，Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利注册号30,985中的培养基中的任一种可用作宿主细胞的培养介质。这些培养基中任一种均可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、磷酸钙、磷酸镁和磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等效能源。还可以适当的浓度包含任何其它必要的补充物，所述浓度将是技术人员已知的。培养条件(诸如温度、pH等)是先前与所选用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于普通技术人员将是显而易见的。
i)蛋白质纯化
当使用重组技术时，MABP可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果MABP或sdAb在细胞内产生，作为第一步，则例如通过离心或超滤移除宿主细胞或裂解片段的颗粒状碎片。Carter等人，Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的方法。简而言之，在约30分钟内在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯基甲基磺酰氟(PMSF)的存在下将细胞浆解冻。细胞碎片可通过离心除去。在MABP或sdAb分泌到培养基中的情况下，一般首先使用可商购获得的蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元将来自此类表达体系的上清液浓缩。可在前述步骤中的任一个中包含蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止外源污染物的生长。
由细胞制备的蛋白质组合物可使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化，其中亲和色谱是优选的纯化技术。蛋白质A作为亲和配体的适用性取决于存在于MABP中的任何免疫球蛋白Fc结构域的物种和同种型。蛋白质A可用于纯化基于包含1、2或4个重链的人免疫球蛋白的MABP(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人3，推荐蛋白质G(Guss等人，EMBO J.5:1567-1575(1986))。亲和配体所附接的基质通常是琼脂糖，但也可使用其它基质。机械稳定的基质，诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯允许比由琼脂糖可实现的更快的流量和更短的加工时间。在MABP包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J。)可用于纯化。根据待回收的MABP或sdAb，其它蛋白质纯化技术也是可用的，诸如离子交换柱上分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱、阴离子或阳离子交换树脂上的肝素SEPHAROSETM色谱(诸如聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，包含可使用pH在约2.5-4.5之间，优选低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)的洗脱缓冲液对包含感兴趣的MABP或sdAb和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱。
3.抗体产生
MABP的组分，诸如常规4-链抗体、抗原结合片段、和sdAb可使用本领域中任何已知的方法来制备，包括下文所述的方法。
sdAb(诸如VHH)可使用本领域已知的方法获得，诸如通过将骆驼科物种(诸如骆驼或美洲驼)免疫并由此获得杂交瘤，或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆sdAb文库，并且随后通过ELISA利用未选择文库的单独克隆体进行选择，或通过使用噬菌体展示来获得。
1)单克隆抗体
单克隆抗体指得自基本上同质的抗体的群体，即除了可以微量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体相同。因此，修饰语“单克隆”指示抗体的特征不是离散抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可使用首次由Kohler等人，Nature，256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备(美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤方法中，将如上所述将小鼠或其它合适的宿主动物(诸如仓鼠)免疫以诱发淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体。另选地，淋巴细胞可在体外免疫。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice，第59-103页(Academic Press，1986))。
免疫试剂将通常包括抗原蛋白或其融合变体。一般来讲，如果需要人源细胞，则使用周围血液淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与无限增殖化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，AcademicPress(1986)，第59-103页。
无限增殖化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，具体地讲啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将如此制备的杂交瘤细胞接种并在合适的培养基中生长，所述培养基优选包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，这是方式HGPRT缺陷型细胞生长的物质。
优选的无限增殖化骨髓瘤细胞是有效融合，通过所选抗体生成细胞支持抗体的稳定、高水平产生，并且对培养基(诸如HAT培养基)敏感的那些细胞。其中，优选的是鼠骨髓瘤系，诸如来源于购自Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego，Calif.USA)的MOPC-21和MPC-11小鼠中路的那些，和购自American Type Culture Collection(Manassas，Va.USA.)的SP-2细胞(及其衍生物，例如X63-Ag8-653)。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
对于针对抗原的单克隆抗体的产生，测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基。优选，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合确定，诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。
可对于针对期望抗原的单克隆抗体的存在来测定培养杂交瘤细胞的培养基。优选，单克隆抗体的结合亲和力和特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定来确定，诸如放射免疫测定(RIA)或酶联测定(ELISA)来确定。此类技术和测定法是本领域已知的。例如，可通过Munson等人，Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来确定。
在鉴定产生具有期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆体可通过限制性稀释程序亚克隆并通过标准方法生长(Goding，同上)。用于该目的的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可作为哺乳动物的肿瘤在体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如琼脂糖蛋白质A、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，将由亚克隆体分泌的单克隆抗体适当地与培养基、腹水或血清分离。
单克隆抗体还可通过重组DNA法，诸如描述于美国专利4,816,567中并如上所述的那些来制备。编码单克隆抗体的DNA容易使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行分离和测序。杂交瘤细胞用作此类DNA的优选来源。一旦分离，就可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到不产生免疫球蛋白的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以便在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.，5:256-262(1993)和Pliickthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可使用McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)中所述技术从产生的抗体噬菌体文库中分离抗体。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等人，Bio/Technology，10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.，21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
DNA还可例如通过人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81:6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价连接来修饰。通常，此类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或者其取代抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以形成嵌合二价抗体，所述嵌合二价抗体包含对抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
本文所述的单克隆抗体可以是一价的，其制备是本领域所熟知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和改性重链的重组表达。重链一般在Fc区的任何点处截短，以防止重链交联。另选地，相关的半胱氨酸残基可被另一个氨基酸残基取代或被删除以防止交联。体外方法也适用于制备一价抗体。消化抗体以产生其片段，具体地讲Fab片段，可使用本领域已知的常规技术来完成。
嵌合或杂合抗体也可以使用合成蛋白质化学中的已知方法在体外制备，包括涉及交联剂的那些。例如，可使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的示例包括亚氨基硫醇酯和甲基-4-巯基丁酰亚胺。
2)人源化抗体
抗体还可包含人源抗体或人抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)，其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基置换。人源化抗体还可包含既不存在于受体抗体中也不存在于输入的CDR或框架序列中的残基。一般来讲，人源化抗体将包含至少一个、通常为两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部FR区为人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)和Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
人源化非人抗体的方法是本领域中所熟知的。一般来讲，人源化抗体具有一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基从非人的来源引入其中。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可基本上按照以下方法来进行：Winter和同事，Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239:1534-1536(1988)，或通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的对应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中显著少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链两者)的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受最接近啮齿动物的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)。Sims等人，J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196:901(1987)。另一种方法使用来源于特定亚组轻链或重链的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于多种不同的人源化抗体。Carter等人，proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993)。
更重要的是，抗体在保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性的情况下被人源化。为了实现该目标，根据优选的方法，通过使用亲本序列和人源序列的三维模型分析亲本序列和各种概念人源化产品的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可用的并且是本领域技术人员熟悉的。计算机程序是可用的，其说明并展示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可从受体和输入序列选择和组合FR残基，从而实现期望的抗体特征，诸如对靶抗原的增加的亲和力。一般来讲，CDR残基直接且最显著地参与影响抗原结合。
设想出各种形式的人源化抗体。例如，人源化抗体可以为抗体片段，诸如Fab，其任选地与一种或多种细胞毒性试剂缀合以便生成免疫缀合物。另选地，人源化抗体可以为完整的抗体，诸如完整的IgG1抗体。
在一些实施方案中，sdAb被修饰，诸如人源化，但不减弱结构域对抗原的天然亲和力，同时降低其关于异源物种的免疫原性。例如，可确定美洲驼抗体的抗体可变结构域(VHH)的氨基酸残基，并且例如框架区中的骆驼科氨基酸中的一个或多个被其人配对物替换，如存在于人共有序列中的，但多肽不丧失其典型特性，即人源化不显著影响所得多肽的抗原结合能力。骆驼科sdAb的人源化需要在单一多肽链中引入并诱变有限量的氨基酸。这与scFv、Fab'、(Fab')2和IgG的人源化形成对比，其需要在两条链(轻链和重链)中引入氨基酸变化，并且保留两条链的组装。
3)人抗体
作为人源化的替代方案，可生成人抗体。例如，现在可产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫后能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完整的人抗体库。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。此类种系突变小鼠中的人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致在抗原攻击后产生人抗体。参见例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362:255-258(1993)；Bruggermann等人，Year inImmuno.，7:33(1993)；美国专利5,591,669和WO 97/17852。能够产生完全人sdAb的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见，例如，US20090307787A1、美国专利8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1、和WO2004049794。
或者，噬菌体展示技术可用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库体外产生人抗体和抗体片段。McCafferty等人，Nature 348:552-553(1990)；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227:381(1991)。根据该技术，将抗体V结构域基因同框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，诸如M13或fd，并在噬菌体颗粒的表面上显示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能特性的选择也导致选择编码表现出那些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行，其综述于例如，Johnson,Kevin S，和Chiswell,David J.,Curr.Opin Struct.Biol.3:564-571(1993)中。可将V基因片段的多种来源用于噬菌体展示。Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)将多种抗-噁唑酮抗体从来源于免疫小鼠脾脏的V基因的小随机组合文库中分离。可构建来自未免疫人供体的V基因库，并且可基本上按照由如下所述的技术来分离各种抗原(包括自身抗原)的抗体：Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)，或Griffith等人，EMBO J.12:725-734(1993)。还可参见，美国专利5,565,332和5,573,905。
Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等人，onoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77页(1985)和Boerner等人，J.Immunol.147(1):86-95(1991)。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠)中来制备人抗体。在攻击后，观察到人抗体产生，其在所有方面上与人中所观察到的高度相似，包括基因重排、组装和抗体库。该方法例如描述于以下文献中：美国专利5,545,807；5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和以下科学出版物：Marks等人，Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368:856-859(1994)；Morrison，Nature 368:812-13(1994)，Fishwild等人，Nature Biotechnology 14:845-51(1996)，Neuberger，NatureBiotechnology 14:826(1996)以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
最后，人抗体也可通过活化的B细胞在体外产生(参见，美国专利5,567,610和5,229,275)。
4)抗体片段
在某些情况下，使用抗体片段，诸如抗原结合片段而不是完整抗体是有利的。较小的片段尺寸允许快速清除，并且可导致对实体肿瘤的改善的访问。
已开发各种技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段来源于完整抗体的蛋白水解消化(参见，例如，Morimoto等人，J Biochem Biophys.Method.24:107-117(1992)；和Brennan等人，science 229：81(1985))。然而，这些片段现在可直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和scFv抗体片段可全部在大肠杆菌中表达并分泌，从而允许容易地产生大量这些片段。抗体片段可从上文所讨论的抗体噬菌体库分离出来。另选地，Fab′-SH可从大肠杆菌中直接回收并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，F(ab′)2片段可从重组宿主细胞培养物直接分离。体内半衰期增加的Fab和F(ab′)2描述于美国专利5,869,046中。在其它实施方案中，选择的抗体为单链Fv片段(scFv)。参见，WO 93/16185；美国专利5,571,894和美国专利5,587,458。抗体片段也可以为“线性抗体”，例如，如美国专利5,641,870中所述的。此类线性抗体片段可以为单特异性或双特异性的。
5)双特异性抗体和多特异性抗体
双特异性抗体(BsAb)是对至少两种不同表位，包括在相同或另一种蛋白质上的那些表位具有结合特异性的抗体。另选地，一个臂可结合靶抗原，并且另一个臂可与结合白细胞上的触发分子(诸如，T细胞受体分子(例如，CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγR1(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)结合的臂组合，以便将细胞防御机制融合并定位到靶抗原表达细胞上。此类抗体可来源于全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。
双特异性抗体也可用于将细胞毒性试剂定位到表达靶抗原的细胞。此类抗体具有结合期望的抗原的一个臂和结合细胞毒性剂(例如，皂草素、抗-干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的另一个臂。已知双特异性抗体的示例包括抗-ErbB2/抗-FcgRIII(WO96/16673)、抗-ErbB2/抗-FcgRI(美国专利5,837,234)、抗-ErbB2/抗-CD3(美国专利5,821,337)。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两个链具有不同的特异性。Millstein等人，Nature，305:537-539(1983)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，并且产物收率低。类似的程序公开于WO93/08829和Traunecker等人，EMBO J.，10:3655-3659(1991)中。
根据不同的方法，将具有期望的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。所述融合优选具有免疫球蛋白重链恒定结构域，其包含铰链的至少一部分、CH2和CH3区。优选具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)，其存在于至少一种融合体中。将编码免疫球蛋白重链融合体和如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物中。当用于构建体中的三种多肽链的不等比率提供最佳产率时，这在调节实施方案中三种多肽片段的相互比例方面提供了极大灵活性。然而，当以相等比率表达至少两条多肽链导致高收率或当所述比率不特别重要时，可将两条或所有三条多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现该不对称结构有利于将期望双特异性化合物与不希望的免疫球蛋白链组合的分离，因为仅一半双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供了简单的分离方式。所述方法公开于WO 94/04690中。用于产生双特异性抗体的其它细节，参见，例如，Suresh等人，Methods in Enzymology 121:210(1986)中。
根据描述于WO 96/27011或美国专利5,731,168中的另一种方法，抗体分子对之间的界面可工程化以最大化从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比。优选的界面包含抗体恒定结构域的CH3区的至少一部分。在该方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)取代。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似尺寸的补偿“腔体”。这提供了比其它不希望的最终产物诸如同源二聚体增加的异源二聚体收率的机制。
用于从抗体片段生成双特异性抗体的技术已描述于文献中。例如，双特异性抗体可使用化学键制备。Brennan等人，Science 229:81(1985)描述了其中将完整抗体蛋白水解裂解以产生F(ab′)2片段的程序。在二硫醇络合剂亚砷酸钠存在下还原这些片段以稳定邻位二硫醇并防止分子间二硫键形成。然后将产生的Fab'片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一再转化为Fab'-TNB衍生物以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定的试剂。
Fab'片段可从大肠杆菌直接回收并且化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等人，J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子的产生。每个Fab'片段分别从大肠杆菌分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶的裂解活性。
还描述了用于由重组细胞培养物直接制备和分离二价抗体片段的各种技术。例如，使用亮氨酸拉链产生二价异二聚体。Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同源二聚体在铰链区处还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异源二聚体。由Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)描述的“二抗”提供了用于制备双特异性和二价抗体片段的另选的机制。所述片段包括通过接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，所述接头太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(scFv)二聚体制备双特异性/二价抗体片段的另一种策略。参见Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994)。
设想了具有超过两种化合价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)。
示例性双特异性抗体可结合给定分子上的两个不同表位。另选地，抗-蛋白质臂可与结合白细胞上的触发分子(诸如，T细胞受体分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)结合的臂组合，以便将细胞防御机制融合到表达特定蛋白的细胞上。双特异性抗体也可用于将细胞毒性试剂定位到表达特定蛋白的细胞。此类抗体具有蛋白结合臂结合细胞毒性剂或放射性核素螯合剂(诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。感兴趣的另一双特异性抗体结合感兴趣的蛋白质并进一步结合组织因子(TF)。
6)多价抗体
通过表达抗体对其结合的抗原的细胞，多价抗体可以比二价抗体更快地内化(和/或分解代谢)。用作本申请的MABP中的第一抗原结合部分的抗体可以为具有三个或更多个抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(其不是IgM类)，其可通过重组表达编码抗体多肽链的核酸容易地产生。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含Fc区或铰链区(或由Fc区或铰链区组成)。在这种情况下，抗体将包含Fc区和Fc区的氨基末端的三个或更多个抗原结合位点。本文优选的多价抗体包含三至约八个，但优选四个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一个多肽链(并且优选两个多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，所述多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中所述VD1为第一可变结构域，VD2为第二可变结构域，Fc为Fc区的一个多肽链，X1和X2表示氨基酸或多肽，并且n为0或1。例如，一个或多个多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选还包含至少两个(并且优选四个)轻链可变结构域多肽。例如，本文的多价抗体可包含约二个至约八个轻链可变结构域多肽。本文设想的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并且任选地还包含CL结构域。
7)杂合抗体
杂合抗体也可用作本申请的MABP的第一抗原结合部分。杂合抗体由两个共价结合的抗体构成。例如，杂合物中的一个抗体可与亲和素偶联，另一特与生物素偶联。例如，已提出此类抗体将免疫系统细胞靶向到不希望的细胞，美国专利4,676,980，并且用于治疗HIV感染。WO 91/00360、WO 92/200373和EP 0308936。预期抗体可使用合成蛋白质化学中的已知方法在体外制备，包括涉及交联剂的那些。例如，可使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适用于该目的的试剂的示例包括亚氨基硫醇酯和甲基-4-巯基丁酰亚胺，以及例如公开于美国专利4,676,980中的那些。杂合抗体可使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联试剂在本领域中是熟知的，并且连同多种交联技术一起公开于美国专利4,676,980中。
8)效应子功能工程
期望本申请的MABP关于Fc效应子功能进行修饰，例如，以便修改(例如，增强或消除)抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一个优选的实施方案中，MABP的Fc效应子功能降低或消除。这可通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。作为另外一种选择或除此之外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而允许该区域中的链间二硫键形成。由此产生的同源二聚MABP可具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)参见Caron等人，J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。具有增强的抗-肿瘤活性的同源二聚抗体也可使用异双功能交联剂来制备，如Wolff等人，CancerResearch 53：2560-2565(1993)中所述。另选地，可工程化抗体，其具有双Fc区并且因此可具有增强的互补裂解和ADCC能力。参见Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。
为增加抗体的血清半衰期，可将挽救受体结合表位掺入MABP中，例如，如美国专利5,739,277中所述。如本文所用，术语“挽救受体结合表位”是指负责增加IgG分子的体内血清半衰期的IgG分子的Fc区的表位(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
9)其它氨基酸序列修饰
设想了抗体的氨基酸序列修饰，诸如本文所述的MABP的单链抗体或抗体组分。例如，期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。通过将合适的核苷酸变化引入抗体核酸中或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。如果最终构建体具有期望的特征，则进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数量或位置。
用于鉴定作为诱变的优选位置的抗体特定残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells in Science,244:1081-1085(1989)所述的。在此，鉴定靶残基的残基或组(例如带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)代替，以影响氨基酸抗原的相互作用。然后，通过在取代位点处或对取代位点引入另外的或其它变体来改善展示出对取代的功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，尽管预先确定了引入氨基酸序列变异的位点，但不需要预先确定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点处突变的性能，在靶密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并针对期望的活性筛选表达的抗体变体。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合，其长度范围从一个残基到包含一百个或更多个残基的多肽，以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N-末端或C-末端与酶(例如ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽的融合。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中具有至少一个被不同残基取代的氨基酸残基。对于取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也设想了FR改变。保守取代在下表2中以“优选的取代”标题示出。如果此类取代导致生物活性的变化，则可引入表II中称为“示例性取代”的更实质性变化，或如下文关于氨基酸类别进一步描述的，并筛选产物。
表II：氨基酸取代
表II：氨基酸取代
抗体的生物学特性的显著改变通过选择取代基来实现，所述取代基在其对维持以下方面的效果方面显著不同：(a)取代区域中的多肽主链结构，例如，作为片状构形或螺旋构形，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，(c)大部分侧链。天然存在的残基基于共同侧链特性被分为以下组：
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水性：cys、ser、thr；
(3)酸性：asp、glu；
(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；以及
(6)芳族：trp、tyr、phe。
非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
任何不参与维持抗体的正确构象的半胱氨酸残基也可以一般利用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可将半胱氨酸键添加到抗体中以改善其稳定性(具体地讲，在抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
特别优选的取代变体类型涉及取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般来讲，针对进一步开发所选择的所得变体将相对于其由此产生的清本抗体具有改善的生物学特性。用于产生此类取代变体的便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，使多个高变区位点(例如，6-7个位点)突变以在每个位点处产生所有可能的氨基取代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示，作为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合物。然后针对其生物活性(例如，结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体，如本文所公开的。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。作为另外一种选择或除此之外，可能有利的是分子抗原-抗体络合物的晶体结构以鉴定抗体及其靶之间的接触点(例如，PD-L1、B7.1)。根据本文详述的技术，此类接触残基和相邻残基是取代的候选。一旦产生此类变体，就如本文所述对变体组进行筛选，并且可选择在一种或多种相关测定中具有优异特性的抗体用于进一步开发。
抗体的另一种氨基酸变体改变抗体的原始糖基化模式。所谓改变是指删除存在于抗体中的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分对天冬酰胺残基的侧链的附接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是用于碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促附接的识别序列。因此，在多肽中存在这些三肽序列产生潜在糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖中的一种(N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖)与羟基氨基酸，最常见为丝氨酸或苏氨酸的附接，但也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
糖基化位点添加到抗体便利地通过改变氨基酸序列，使得其包含上述三肽序列中的一个或多个(N-连接的糖基化位点)来完成。改变也可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加或取代到原始抗体的序列(对于O-连接的糖基化位点)来进行。
编码本申请的MABP的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源中分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或通过寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和早期制备的变体或非变体型式的盒诱变。
10)其它修饰
可将本申请的MABP进一步修饰以包含本领域已知并且容易获得的附加非蛋白质部分。优选，施用于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可具有在制造方面的优点。聚合物可具有任何分子量，并且可以是支化或非支化的。附接到抗体的聚合物数可有差别，并且如果附接了超过一种聚合物，则其可以为相同或不同的分子。一般来讲，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑来确定，包括但不限于，待改善的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于在限定条件下的治疗中等。此类技术和其它适宜制剂公开于Remington:TheScience and Practice of Pharmacy，第20版，Alfonso Gennaro编辑，PhiladelphiaCollege of Pharmacy and Science(2000)。
VI.试剂盒和制品
本发明还提供了包含本文所述的任何MABP中任一种的试剂盒、单位剂量和制品。在一些实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包含本文所述的药物组合物中的任一种，并且优选提供其使用说明。
在本申请的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、柔性包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒可任选地提供附加组分，诸如缓冲剂和解释性信息。因此，本申请还提供了制品，其包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶、广口瓶、柔性包装等。
所述制品还可包括容器以及容器上或与容器相关联的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由各种材料(诸如玻璃或塑料)形成。一般来讲，容器保存有效治疗本文所述的疾病或病症的组合物，并且可具有无菌入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装说明书指出所述组合物用于治疗个体的具体病症。标签或包装说明书还包含用于将组合物施用于个体的说明。标签可示出关于重构和/或使用的指示。保存药物组合物的容器可以为多功能小瓶，其允许重构制剂的重复施用(例如，2-6次施用)。包装说明书是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用此类治疗产品的指示、用途、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另选地，所述制品还可包括第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲剂，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述容器还可包含商业和用户角度所需的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
试剂盒或制品可包括药物组合物的多个单位剂量和使用说明书，其以足以在药房(医院药房和配混药房)中储存和使用的量包装。
实施例
以下实施例旨在仅对本发明进行举例说明并且因此不应被视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细描述作为说明且不作为限制来提供。
实施例1：PD-1/CTLA-4双特异性抗原结合蛋白的构建、表达和生物物理表征。
本实施例描述了示例性PD-1/CTLA-4双特异性抗原结合蛋白(BABP)的构建和表达。设计并表达15种构建体，其各自包含如下的两条多肽链。
构建体1-3(BCP-73、BCP-74、BCP-75)：第一多肽从N-末端到C末端包含：抗-CTLA-4sdAb的VHH结构域(BCP-73的sdAb-1、BCP-74的sdAb-2、和BCP-75的sdAb-3)，肽接头(来自人IgG1铰链区的经修饰序列，例如，SEQ ID NO：13)，派姆单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N-末端至C-末端包含：派姆单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。三个BABP具有图9的形式。
构建体4-6(BCP-78、BCP-79、BCP-80)：第一多肽从N-末端到C末端包含：抗-CTLA-4sdAb的VHH结构域(BCP-78的sdAb-1、BCP-79的sdAb-2、和BCP-80的sdAb-3)，肽接头(SEQ IDNO：13)，纳武单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N-末端至C-末端包含：纳武单抗的轻链可变结构域vl和抗体κ轻链CL结构域。三个BABP具有图9的形式。
构建体7(BCP-2)：第一多肽从N-末端至C末端包含：派姆单抗的重链可变结构域VH，IgG4的重链恒定结构域，肽接头(GGGGSGGGS，SEQ ID NO：1)和抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)。第二多肽从N-末端至C-末端包含：派姆单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。BCP-2具有图4的形式。
构建体8(BCP-16)：第一多肽从N-末端至C末端包含：派姆单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N-末端到C-末端包含：抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)，肽接头(人IgG1铰链区，例如SEQ ID NO:8)，派姆单抗的轻链可变结构域VL，以及抗体κ轻链CL结构域。BCP-16具有图13的形式。
构建体9(BCP-17)：第一多肽从N-末端至C末端包含：派姆单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N-末端至C-末端包含：派姆单抗的轻链可变结构域VL，抗体κ轻链CL结构域，肽接头(SEQ ID NO:8)，抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)。BCP-17具有图11的形式。
构建体10(BCP-31)：第一多肽从N-末端到C末端包含：抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)，肽接头(SEQ ID NO：1)，派姆单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N-末端到C-末端包含：抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)，肽接头(SEQID NO:1)，派姆单抗的轻链可变结构域VL，以及抗体κ轻链CL结构域。BCP-31具有图17的形式。
构建体11(BCP-32)：第一多肽从N-末端到C末端包含：抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)，肽接头(SEQ ID NO：1)，抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)，派姆单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N-末端至C-末端包含：派姆单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。BCP-32具有图18的形式。
构建体12(BCP-33)：第一多肽从N-末端至C末端包含：派姆单抗的重链可变区，IgG4的恒定CH1区，肽接头(SEQ ID NO：8)，和抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)和IgG1的Fc区。第二多肽从N-末端至C-末端包含：派姆单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。BCP-33具有图19的形式。
构建体13(BCP-34)：多肽从N-末端至C末端包含：派姆单抗的轻链可变结构域VL，肽接头(GGGGSGGGGSGGGGS，SEQ ID NO:12)，派姆单抗的重链可变结构域VH，肽接头(SEQ IDNO：8)，抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)和IgG1的Fc区。BCP-34具有图20的形式。
构建体14(BCP-35)：第一多肽从N-末端至C末端包含：派姆单抗的重链可变区，IgG4的恒定CH1区，肽接头(SEQ ID NO：8)，抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)，IgG4的恒定CH1区和IgG4的Fc区。第二多肽从N-末端至C-末端包含：派姆单抗的轻链可变结构域，抗体κ轻链CL结构域，肽接头(SEQ ID NO:8)，抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)和抗体κ轻链CL结构域。BCP-35具有图21的形式。
构建体15(BCP-36)：第一多肽从N-末端至C末端包含：派姆单抗的轻链可变结构域VL，肽接头(SEQ ID NO:12)，派姆单抗的重链可变结构域VH，肽接头(SEQ ID NO：8)，抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)和IgG1的Fc区。第二多肽从N-末端至C-末端包含：抗-CTLA-4 sdAb的VHH结构域(sdAb-1)，和抗体κ轻链CL结构域。BCP-36具有图22的形式。
每个BABP由第一多肽的两个拷贝和第二多肽的两个拷贝组成。可将S228P突变引入IgG4 Fc区中以抑制Fab臂交换。此外，BABP的Fc区可与不同同种型的IgG Fc(例如IgG1同种型)交换。IgG4同型的Fc区对FcγR具有低结合亲和力，因此在一些实施方案中，比IgG1同种型优选，以避免PD-1或CTLA-4阳性细胞的ADCC介导的耗尽。
生产
制备上述15种BABP构建体的质粒并在CHO-3E7细胞中瞬时表达。通过一步蛋白质A色谱纯化BABP，并储存在pH7.4的PBS缓冲液中。在还原和非还原条件下，通过SDS-PAGE分析纯化的BABP的组成和纯度。多肽链的尺寸以及全长BABP分子与其基于氨基酸序列计算的分子量一致。为了进一步研究BABP在溶液中的物理特性，使用尺寸排阻色谱法分析每种蛋白质。所有BABP都表现出单一主峰，从而展示出作为单体分子的物理同质性，即非聚集的BABP分子，其各自为由4条多肽链组成的二聚体蛋白质，其包括第一多肽链的2个拷贝和第二多肽链的2个拷贝。该数据的总结示于表1中。表1中的数据示出，大多数BABP的生产水平与常规单克隆抗体的那些相当，从而指示BABP可在哺乳动物细胞中有效表达。
纯化的BABPs也可配制在包含柠檬酸钠、氯化钠、甘露糖醇、二亚乙基三胺五乙酸(戊糖)和聚山梨酸酯80(Tween 80)的pH 6.0的溶液中。
表1：示例性PD-1/CTLA-4 BABP的制备。
稳定性分析
使用MICROCALTMVP-毛细管差示扫描量热法(DSC，Microcal，Northampton，MA，USA，Malvern Instruments)研究各种BABP的热稳定性。根据MICROCALTMVP-毛细管DSC用户手册，将约370μl的每种BABP(1mg/ml)及其相应的缓冲液添加到96孔板中。每次样品运行之间均包括洗涤剂清洁程序，以保持参照池和样品池清洁。所有样品以被动模式以90℃/h(1.5℃/min)的扫描速率在20℃至100℃下扫描。使用基于ORGINTM7.0(Northampton，MA，USA)的VP-毛细管DSC软件分析收集的数据。将所有热谱曲线进行对照并减去基线以获得蛋白质展开的表观中点(Tm)和表观焓(ΔH)。各种BABP的展开中点温度(Tm)示于表2(DSC)中。
使用动态光散射(DLS)跟踪在加热期间较大蛋白质聚集体的形成。使用读板器(Wyatt，Santa Barbara，California)以1.5mg/ml对样品进行从25℃至75℃的升温，其中温度间隔为约0.75℃。将20μl的每种BABP样品添加到一次性比色杯中，然后用10μl矿物油(Sigma 8410)覆盖样品以防止蒸发。对每个BABP样品平均进行三次测量(5次采集/每次测量)。在具有所选温度间隔的实验期间，热扫描速率计算为1.5℃/min。测量每个样品，同时持续加热温度，直至目标温度达到75℃(约40min)。在DYNAMICSTM7.6.0.48软件(Wyatt，Santa Barbara，California)中利用起始分析方法分析聚集温度(Tagg)。各种BABP的测量的聚集起始温度(Tagg)示于表2中。
表2：示例性PD-1/CTLA-4 BABP的DSC和DLS分析。
构建体 T<sub>m</sub>(℃) T<sub>agg</sub>(℃)
BCP-73 69.5 69.2
BCP-74 68.9 70.8
BCP-75 67.6 70.2
生物相似的派姆单抗 67.6 69.6
BCP-78 68.9 70.8
BCP-79 67.9 70.6
BCP-80 67.8 69.2
生物相似的纳武单抗 65.2 67.6
将浓度>50mg/ml的BABP样品在组氨酸缓冲液(pH6.0)中的溶液在4℃、25℃和37℃的恒定温度下温育7天。将一组相似的样品也冻融五次。通过SEC-HPLC评价所有样品的完整全单体分子的级分，并使用由制造商提供的CHROMELEONTM软件记录和分析数据。表3示出在热激发条件下，BABP保持大于90％完整性。
表3：示例性PD-1/CTLA-4 BABP的稳定性分析。
溶解度分析
为了表征纯化的BABP的溶解度，将10mg的1mg/ml的每种BABP以约2.5ml的体积添加到-30kDa离心浓缩器(EMD Millipore)中，并在4000×g(4℃)下离心。定期检查体积并将蛋白质添加到浓缩器中直至剩余的蛋白质溶液被消耗。浓缩进行2小时，直至体积达到～20μl或停止减小。通过对样品进行UV测量来确定浓度，所述样品通过将1μl浓缩的BABP稀释到199μl的各自缓冲液中来获得。在其各自缓冲液中将BABP稀释至1mg/ml后，使用分析型SEC-HPLC评价样品的聚集。表4示出在这些胁迫条件下，BABP保持全完整性。
还使用交叉相互作用色谱(CIC)柱测量纯化的BABP的溶解度。由合并的小鼠血清纯化的鼠多克隆抗体购自Sigma-Aldrich(I5381)。将鼠多克隆抗体以约30mg/mL偶联到树脂基质。将纯化BABP的PBS缓冲液溶液分别注射到鼠IgG-偶联柱和对照柱中，其中浓度范围从0.05到0.20mg/mL。保留时间用于计算保留因子k'值，其记录于表4中：k'＝(Vr-Vo)/Vo＝(Tr-Tm)/Tm。Vr表示蛋白质偶联柱上的样品的洗脱体积，Vo表示来自对照柱的洗脱体积，Tr表示蛋白质偶联柱上的保留时间，并且Tm表示对照柱上的保留时间。多种样品在同一柱上运行两次。k'值>0.6的抗体一般明显不易溶解。根据表4，所有BABPs均表现出优异的溶解度。
表4：示例性PD-1/CTLA-4 BABP的溶解度分析。
构建体 浓度(mg/mL) 单体分子 K'
BCP-73 194.4 94.1％ 0.07
BCP-74 189.2 92.7％ 0.04
BCP-75 290.9 92.6％ 0.03
BCP-78 248.0 93.4％ 0.06
BCP-79 337.5 93.5％ 0.04
BCP-80 206.1 92.8％ 0.03
实施例2：PD-1/CTLA-4双特异性抗原结合蛋白的体外功能测定。
在下文体外测定中测试实施例1中所述的15种示例性PD-1/CTLA-4双特异性抗原结合蛋白(BABP)，以评估BABP对PD-1和CTLA-4的功能性阻断。
靶结合测定
BABP结合PD-1和CTLA-4的能力可使用表面等离子体共振法(例如，)、酶联免疫吸附测定、荧光辅助细胞分选方法(FACS)或它们的组合来确定。分析可对活化T细胞进行。
使用基于荧光激活细胞分选(FACS)的测定法来确定各种BABP对在CHO细胞上表达的PD-1的结合亲和力。制备BABP样品(从1μM开始，以10种浓度3倍连续稀释)作为用于FACS分析的主要抗体。将表达人PD-1的CHO细胞从贴壁培养瓶中离解，并与不同浓度的BABP样品混合(均在96孔板中)。将派姆单抗(例如，)或纳武单抗(例如，)用作抗-PD-1抗体阳性对照。将混合物在室温下平衡30分钟，用FACS缓冲液(包含1％BSA的PBS)洗涤三次。然后添加用作二抗的异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的抗-人κ抗体(JacksonImmunoResearch)，并在室温下温育15分钟。用FACS缓冲液再次洗涤细胞，并通过流式细胞术分析。使用非线性回归，利用PRISMTM(GraphPad Software，San Diego，CA)分析数据，并且计算EC50值。如表5中所示，FACS结合测定展示出BABP分别保持与派姆单抗(例如，)或纳武单抗(例如，)相当的PD-1结合亲和力。
使用基于荧光激活细胞分选(FACS)的测定法来确定15种BABP对在CHO细胞上表达的CTLA-4的结合亲和力。制备BABP样品(从1μM开始，以10种浓度3倍连续稀释)作为用于FACS分析的主要抗体。将表达人CTLA-4的CHO细胞从贴壁培养瓶中离解，并与不同浓度的抗体混合(均在96孔板中)。将sdAb-1-Fc、sdAb-2-Fc、sdAb-3-Fc和伊匹单抗(例如)用作抗-CTLA-4抗体阳性对照。将混合物在室温下平衡30分钟，用FACS缓冲液(包含1％BSA的PBS)洗涤三次。然后添加用作二抗的异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的抗-人κ抗体(Jackson ImmunoResearch)，并在室温下温育15分钟。用FACS缓冲液再次洗涤细胞，并通过流式细胞术分析。使用非线性回归，利用PRISMTM(GraphPad Software，San Diego，CA)分析数据，并且计算EC50值。如表5中所示，FACS结合测定展示出BABP表现出与其融合到Fc的相应sdAb相当的对CTLA-4的结合亲和力。此外，BABP示出与伊匹单抗(例如)相当的对CTLA-4的结合亲和力。
使用表面等离子体共振(SPR)生物传感器，T200(GE Healthcare)来确定各种BABP对PD-1的结合动力学。从50nM开始，以3倍连续稀释来制备不同浓度的BABP样品。通过Fc捕获法将每个BABP样品固定在传感器芯片上。将抗原PD-1用作分析物。使用T200评估软件获得离解(kd)和缔合(ka)速率常数。表观平衡离解常数(KD)由kd对ka的比率计算。如表5中所示，BABP保持与派姆单抗(例如，)和纳武单抗(例如，)相当的对PD-1的结合动力学。
使用表面等离子体共振(SPR)生物传感器，T200(GE Healthcare)来确定各种BABP对CTLA-4的结合动力学。从200nM开始，以3倍连续稀释来制备不同浓度的BABP样品。通过Fc捕获法将每个BABP样品固定在传感器芯片上。将抗原CTLA-4用作分析物。使用T200评估软件获得离解(kd)和缔合(ka)速率常数。表观平衡离解常数(KD)由kd对ka的比率计算。如表5中所示，结合动力学展示出BABP表现出与其融合到Fc的相应sdAb相当的对CTLA-4的结合动力学。另外，BABP具有与生物相似的伊匹单抗相当的对CTLA-4的结合动力学。
表5：示例性PD-1/CTLA-4 BABP的结合数据。
通过FACS分析的配体结合抑制
使用FACS测定评估BABP对配体结合的抑制。
为了评估BABP对PD-L1的抑制，制备BABP样品(从1μM开始，3倍连续稀释，具有10种浓度)。将表达人PD-1的CHO细胞从贴壁培养瓶中离解，并与不同浓度的每种BABP和0.5μM具有生物素标记的hPD-L1-Fc融合蛋白混合。将生物相似的派姆单抗或生物相似的纳武单抗用作抗-PD-1抗体阳性对照。将混合物在室温下平衡30分钟，并用FACS缓冲液(包含1％BSA的PBS)洗涤三次。然后将PE/Cy5链霉抗生物素蛋白第二抗体添加到所述混合物中，并且在室温下温育15分钟。随后，用FACS缓冲液洗涤细胞，并通过流式细胞术分析。使用非线性回归，利用PRISMTM(GraphPad Software，San Diego，CA)分析数据，并且计算IC50值(表5)。竞争测定展示出BABP在低浓度(1-10μg/ml)下有效抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。表5中的结合数据指示示例性PD1/CTLA-4BABP的功能活性与派姆单抗(例如)和纳武单抗(例如)非常相似。
为了评估BABP对B7-1(CTLA-4配体)的抑制，制备BABP样品(从1μM开始，3倍连续稀释，具有10种浓度)。将表达人B7-1的CHO细胞从贴壁培养瓶中离解，并与不同浓度的每种BABP和0.5μM具有生物素标记的hCTLA-4-Fc融合蛋白混合。将sdAb-1-Fc、sdAb-2-Fc、sdAb-3-Fc和伊匹单抗(例如)用作抗-CTLA-4抗体阳性对照。将混合物在室温下平衡30分钟，并用FACS缓冲液(包含1％BSA的PBS)洗涤三次。然后将PE/Cy5链霉抗生物素蛋白第二抗体添加到所述混合物中，并且在室温下温育15分钟。随后，用FACS缓冲液再次洗涤细胞，并通过流式细胞术分析。使用非线性回归，利用PRISMTM(GraphPad Software，SanDiego，CA)分析数据，并且计算IC50值(表5)。竞争测定展示出BABP在低浓度(1-10μg/ml)下有效抑制CTLA4-B7-1相互作用的能力。表5中的结合数据指示示例性PD1/CTLA-4 BABP的功能活性与其融合到Fc的相应sdAb和生物相似的伊匹单抗相似。
BABP的表达谱和双结合特性清楚地展示出BABP的双特异性，其具有由通过4-链抗体的VH和VL正确配对形成的抗原结合位点提供的第一特异性，和由VHH提供的第二特异性。
体外功能测定
可使用多种生物测定来研究BABP对PD-1和CTLA-4途径的阻断，所述生物测定监测由PD-1或CTLA-4途径中的信号传导驱动的T细胞增殖、IFN-′Y释放、IL-2分泌或报道基因的表达。
选择BCP-73、BCP-74、BCP-75、BCP-78、BCP-79和BCP-80 6 BABP用于体外生物活性评估。使用PD-1/NFAT Reporter-Jurkat细胞，在基于PD-1/PD-L1细胞的测定中对抗-PD-1中和抗体的生物活性的表征如表6所示。在这种情况下，利用人PD-L1和工程化T细胞受体(TCR)活化剂稳定地表达CHO-K1细胞。将受影响的细胞-PD-1/NFAT Reporter-Jurkat细胞与连续稀释的BABP预温育30分钟，然后与工程化CHO-K1细胞共培养。在刺激约6小时后，将ONE-STEPTM荧光素酶试剂添加到细胞中以测量NFAT活性。使用非线性回归，利用PRISMTM(GraphPad Software，San Diego，CA)分析数据，并且计算EC50值。报告基因测定展示出，所有BABP有效激活NFAT信号的能力与派姆单抗(例如，)和纳武单抗(例如，)类似。
表6：抗体生物活性
使用基于CTLA-4细胞的阻断测定，发现双特异性抗体有效抑制CTLA-4和B7-1之间的结合，如表6所示。简而言之，通过分离试剂盒(Miltenyl Biotec)从PBMC中纯化人CD4+ T细胞。每个孔包含105个CD4+细胞和104CHO-K1/人CD80(稳定表达人CD80的CHO-K1)，其中最终工作体积为200μl。将双特异性抗体以不同浓度添加到每个孔中。无抗体用作背景对照。将人IgG4用作阴性对照，并将伊匹单抗(例如，)用作阳性抗-CTLA4抗体对照。将CTLA-4-Fc(GenScript，Z03373-50)添加到体系中以引发反应。在37℃/5％CO2培养箱中孵育24小时后，从每个测试孔中取出100μl培养基用于IL-2测量(Cisbio)。将CTLA-4阻断生物测定中通过T细胞的IL-2抗体浓度依赖性分泌用于提取每种测试抗体以及阳性对照全长抗-CTLA-4抗体伊匹单抗(例如，)的EC50值。
通过确定包含表达PD-L1的靶细胞(诸如树突细胞)、活化的T细胞和BABP中每一种的混合淋巴细胞反应(MLR)中的IL-2和IFN-′Y分泌水平来研究BCP-74、BCP-75、BCP-79和BCP-80 BABP对PD-1途径的抑制。使用分离试剂盒(Miltenyl Biotec)从PBMC中纯化人CD4+T细胞和同种异体单核细胞。将单核细胞诱导成树突细胞。每个孔包含105个CD4+细胞和104个同种异体树突细胞，最终工作体积为200μl。将BABP中的每一种以不同浓度加入添加到孔中。无抗体孔用作背景对照。将人IgG4用作阴性对照，并将派姆单抗(例如，)用作阳性抗-PD-1抗体对照。在37℃，5％CO2培养箱中温育72小时后，从每个测试孔中取出100μl培养基用于IL-2和IFN-′Y测量(Cisbio)。MLR中IL-2和IFN-γ的浓度依赖性分泌用于提取针对PD-1的BABP的EC50值，其与对照PD-1抗体派姆单抗(例如，)的EC50值进行比较。如表7所示，各种BABP表现出与派姆单抗(例如，)相当的抑制潜力。
表7：PD-1/CTLA-4 BABP的混合的淋巴细胞反应
实施例3：PD-1/CTLA-4双特异性抗原结合蛋白的体内抗-肿瘤功效。
该实施例描述了评估BCP-75和BCP-79 BABP对PD-1和CTLA-4的功能阻断的体内实验。在用人CTLA-4和PD-1敲入小鼠开发的肿瘤模型中评估抗-肿瘤功效小鼠中CTLA-4和PD-1两者的人源化使得能够在小鼠肿瘤异种移植模型中直接体内评估PD-1/CTLA-4 BABP的功效。
小鼠异种移植模型可通过将肿瘤细胞植入NSG小鼠来制备。肿瘤细胞系，诸如MC38(鼠结肠腺癌细胞系)和CT26(鼠结肠癌细胞系)，可用于制备结肠癌的小鼠模型。B16，鼠黑素瘤细胞系可用于制备黑素瘤的小鼠模型。Renca，鼠肾皮质腺癌细胞系，可用于制备肾脏癌的小鼠模型。
将6-8周龄的人PD-1 KI雌性C57/BL6小鼠在其下背部剃毛，并且皮下注射1×106结肠癌细胞系MC38在75(体积/体积)％RPMI(Life Technologies)和25(体积/体积)％中等密度(Corning)中的50μL悬浮液。通过视觉检查在7天内肿瘤不能移植的小鼠被排除在进一步研究之外。在MC38移植后第7天开始每天测量肿瘤。将小鼠单独分类到治疗组中，并且仅在肿瘤达到150mm3的阈值时开始接受治疗，在所有情况下移植后约10天。在治疗期间每三天进行数字卡尺测量和体重测量。在实验中，用10mg/kg生物相似的派姆单抗、10mg/kg生物相似的纳武单抗或12.3mg/kg BABP(BCP-75或BCP-79)给予小鼠静脉内治疗并持续16天。每4天施用治疗。如图23所示，BCP-75和BCP-79两者均有效地控制MC38同系小鼠模型中的肿瘤生长，从而表现出与生物相似的派姆单抗和生物相似的纳武单抗相当的功能活性。与模拟对照相比(数据未示出)，三个治疗方案均不影响MC38移植小鼠的体重。
将6-8周龄的CTLA-4 KI雌性C57/BL6小鼠在其下背部剃毛，并且皮下注射1×106结肠癌细胞系MC38在75(体积/体积)％RPMI(Life Technologies)和25(体积/体积)％中等密度(Corning)中的50μl悬浮液。通过视觉检查在7天内肿瘤不能移植的小鼠被排除在进一步研究之外。在MC38移植后第7天开始每天测量肿瘤。将小鼠单独分类到治疗组中，并且仅在肿瘤达到150mm3的阈值时开始接受治疗，在所有情况下移植后约10天。在治疗期间每三天进行数字卡尺测量和体重测量。在实验中，用10mg/kg生物相似的伊匹单抗、12.3mg/kg BABP(BCP-75或BCP-79)或6.7mg/kg sdAb-2-Fc或sdAb-3-Fc给予小鼠静脉内治疗并持续16天。每4天施用治疗。如图24所示，BCP-75和BCP-79两者均有效地控制MC38同系小鼠模型中的肿瘤生长，从而表现出与sdAb-2-Fc或sdAb-3-Fc相当的功能活性。与模拟对照相比(数据未示出)，三个治疗方案均不影响MC38移植小鼠的体重。
实施例4：PD-L1/CTLA-4双特异性抗原结合蛋白的构建、表达和生物物理表征。
本实施例描述了示例性PD-L1/CTLA-4 BABP的构建和表达。设计并表达两种构建体，其各自包含如下的两条多肽链。
BCP-84：第一多肽从N-末端到C末端包含：抗-CTLA-4 sdAb-2的VHH结构域，肽接头(SEQ ID NO：13)，阿特朱单抗的重链可变结构域VH和IgG1的重链恒定结构域。第二多肽从N-末端至C-末端包含：阿特朱单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。BCP-84具有图9的形式。
BCP-85：第一多肽从N-末端到C末端包含：抗-CTLA-4 sdAb-3的VHH结构域，肽接头(SEQ ID NO：13)，阿特朱单抗的重链可变结构域VH和IgG1的重链恒定结构域。第二多肽从N-末端至C-末端包含：阿特朱单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。BCP-85具有图9的形式。
BCP-84和BCP-85由第一多肽的两个拷贝和第二多肽的两个拷贝组成。用于构建体的IgG1 Fc区为非糖基化IgG1。此外，双特异性抗原结合蛋白的Fc区可与不同同型的IgG Fc交换，例如野生型IgG1同种型与具有S228P突变的IgG4同种型交换。非糖基化IgG同型的Fc区对FcγR不具有结合亲和力，因此在一些实施方案中，比野生型IgG1同种型优选，以避免PD-1或CTLA-4阳性细胞的ADCC介导的耗尽。
制备
制备BCP-84和BCP-85的质粒并在CHO细胞中瞬时表达。通过一步蛋白质A色谱纯化BABP，并储存在pH7.4的PBS缓冲液中。在还原和非还原条件下，通过SDS-PAGE分析纯化的BABP的组成和纯度。多肽链的尺寸以及BABP分子的全长蛋白与其基于氨基酸序列计算的分子量一致。为了进一步研究2种BABP在溶液中的物理特性，使用尺寸排阻色谱法分析每种蛋白质。两个BABP均表现出单一主峰，从而展示出作为单体BABP分子的物理同质性。该数据的总结示于表8中。
表8：示例性PD-L1/CTLA-4 BABP的制备。
BABP 宿主细胞 瞬时表达(mg/ml) 单体分子(HPLC) 存储缓冲液
BCP-84 CHO-3E7 74.4 95.34％ PBS，pH7.2
BCP-85 CHO-3E7 77.4 96.94％ PBS，pH7.2
稳定性分析
为确定BABP的热稳定性和聚集，如实施例1中所述进行DSC(差示扫描量热法)和DLS(动态光散射)实验。如表9所示，BCP-84和BCP-85的Tm和Tagg与生物相似的阿特朱单抗的那些(例如，相比于)相当。
表9：示例性PD-L1/CTLA-4 BABP的DSC和DLS分析。
实施例5：PD-L1/CTLA-4双特异性抗原结合蛋白的体外功能测定。
在下文所述的体外测定中测试BCP-84和BCP-85，以评估BABP对PD-L1和CTLA-4的功能阻断。
靶结合测定
BABP结合PD-L1和CTLA-4的能力可使用表面等离子体共振法(例如，)、酶联免疫吸附测定、荧光辅助细胞分选方法(FACS)或它们的组合来确定。分析可对活化T细胞进行。
使用基于荧光激活细胞分选(FACS)的测定来确定每个BABP对PD-L1和CTLA-4表达稳定细胞系上表达的PD-L1和CTLA-4的结合。制备BABP样品(从1μM开始，以10种浓度3倍连续稀释)并与PD-L1和CTLA-4细胞一起温育。通过Alexa Fluor 488-缀合的抗-人抗体(Jackson ImmunoResearch)检测与BCP-84和BCP-85 BABP结合的细胞。EC50由GraphPadPRISMTM版本6.0计算。
BCP-84和BCP-85与PD-L1的结合动力学使用在CM5传感器芯片(Biacore)上捕集的带His标记的人PD-L1来确定。以50nM开始，以3倍连续稀释来制备每个BABP的6中不同样品。使每个BABP样品流过抗原涂覆的芯片，并且使用表面等离子体共振确定亲和力。
BCP-84和BCP-85与CTLA-4的结合动力学使用在CM5传感器芯片(Biacore)上涂覆的带His标记的人CTLA-4来确定。以200nM开始，以2倍连续稀释来制备每个BABP的6中不同样品。使每个BABP样品流过抗原涂覆的芯片，并且使用表面等离子体共振确定亲和力。
BCP-84和BCP-85与PD-L1和CTLA-4的亲和力数据示于表10中。
通过FACS分析的配体结合抑制
通过FACS测定评估BCP-84和BCP-85对配体结合的抑制。
为了评估BABP对PD-L1的抑制，将表达人PD-L1的CHO细胞从贴壁培养瓶中离解，并与不同浓度的每种BABP(以1μM开始，对于10种浓度3倍连续稀释)和0.1μM具有生物素标记的hPD-1-Fc融合蛋白混合。将混合物在室温下平衡30分钟，并用FACS缓冲液(包含1％BSA的PBS)洗涤三次。然后将PE/Cy5链霉抗生物素蛋白第二抗体添加到所述混合物中，并且在室温下温育15分钟。随后，用FACS缓冲液洗涤细胞，并通过流式细胞术分析。使用非线性回归，利用PRISMTM(GraphPad Software，San Diego，CA)分析数据，并且计算IC50值并示于表10中。竞争测定法展示出BCP-84和BCP-85有效抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力与生物相似的阿特朱单抗相似。
为了评估BCP-84和BCP-85对B7-1的抑制，将表达人B7-1细胞的CHO细胞从贴壁培养瓶中离解，并与不同浓度的每种BABP(以1μM开始，对于10种浓度3倍连续稀释)和0.1μM具有生物素标记的hCTLA-4-Fc融合蛋白混合。将混合物在室温下平衡30分钟，并用FACS缓冲液(包含1％BSA的PBS)洗涤三次。然后将PE/Cy5链霉抗生物素蛋白第二抗体添加到所述混合物中，并且在室温下温育15分钟。随后，用FACS缓冲液再次洗涤细胞，并通过流式细胞术分析。使用非线性回归，利用PRISMTM(GraphPad Software，San Diego，CA)分析数据，并且计算IC50值并示于表10中。竞争测定法展示出BCP-84和BCP-85有效抑制CTLA-4/B7-1相互作用的能力与相应的sdAb-Fc和伊匹单抗(例如，)相似。
表10：示例性PD-L1/CTLA-4 BABP的结合数据。
体外功能测定
可使用多种生物测定来研究BCP-84和BCP-85对PD-L1和CTLA-4途径的阻断，所述生物测定监测由PD-1或CTLA-4途径中的信号传导驱动的T细胞增殖、IFN-γ释放、IL-2分泌或报道基因的表达。
图11示出了关于使用PD-1/NFAT Reporter-Jurkat细胞，在基于PD-1/PD-L1细胞的测定中抗-PD-1中和抗体的生物活性的数据。简而言之，利用人PD-L1和工程化T细胞受体(TCR)活化剂稳定地表达CHO-K1细胞。将受影响的细胞-PD-1/NFAT Reporter-Jurkat细胞与连续稀释的BCP-84和BCP-85预温育30分钟，然后与工程化CHO-K1细胞共培养。在刺激约6小时后，将ONE-STEPTM荧光素酶试剂添加到细胞中以测量NFAT活性。使用非线性回归，利用PRISMTM(GraphPad Software，San Diego，CA)分析数据，并且计算EC50值并示于表11中。报告基因测定法展示出BCP-84和BCP-85有效激活NFAT信号的能力与生物相似的阿特朱单抗相似。
通过确定包含表达PD-L1的靶细胞(诸如树突细胞)、活化的T细胞和BABP的混合淋巴细胞反应(MLR)中的IL-2分泌水平来研究BCP-84和BCP-85对PD-L1途径的抑制。简而言之，使用分离试剂盒(Miltenyl Biotec)从PBMC中纯化人CD4+T细胞和同种异体单核细胞。将单核细胞诱导成树突细胞。每个孔包含105个CD4+细胞和104个同种异体树突细胞，最终工作体积为200μl。每种BABP以不同浓度添加到每个孔中。无抗体孔用作背景对照。将人IgG1用作阴性对照，并将生物相似的阿特朱单抗(用作阳性抗-PD-L1抗体对照。在37℃，5％CO2培养箱中温育72小时后，从每个测试孔中取出100μl培养基用于IL-2测量(Cisbio)。MLR中IL-2的浓度依赖性分泌用于提取针对PD-L1的BCP-84和BCP-85的EC50值，其与主链抗体阿特朱单抗的EC50值进行比较(参见，表12)。
通过确定包含表达CD80、活化的T细胞和每种BABP的混合淋巴细胞反应(MLR)中的IL-2分泌水平来研究BABP对CTLA-4途径的抑制。使用分离试剂盒(Miltenyl Biotec)从PBMC中纯化人CD4+ T细胞。每个孔包含105个CD4+细胞和104CHO-K1/人CD80(稳定表达人CD80的CHO-K1)，其中最终工作体积为200μl。每种BABP以不同浓度添加到每个孔中。无抗体孔用作背景对照。将人IgG4用作阴性对照，并将伊匹单抗(例如，)用作阳性抗-CTLA4抗体对照。将CTLA4-Fc(GenScript，Z03373-50)添加到体系中以引发反应。在37℃，5％CO2培养箱中温育24小时后，从每个测试孔中取出100μl培养基用于IL-2测量(Cisbio)。CTLA-4阻断生物测定中IL-2的浓度依赖性分泌用于提取针对CTLA-4的BABP的EC50值，其与对照CTLA-4抗体伊匹单抗(例如，)的EC50值进行比较(参见，表11)。
表11：示例性PD-L1/CTLA-4BABP的体外生物测定。
表12示例性PD-L1/CTLA-4 BABP的混合淋巴细胞反应。
构建体 IFN-γEC<sub>50</sub>(nM) IL-2 EC<sub>50</sub>(nM)
BCP-79 1.45 0.56
BCP-80 1.16 0.58
生物相似的阿特朱单抗 0.44 0.67
实施例6：PD-L1/CTLA-4双特异性抗原结合蛋白的体内抗-肿瘤功效。
该实施例描述了评估BCP-84和BCP-85对PD-L1和CTLA-4的功能阻断的体内实验。在用人CTLA-4敲入小鼠开发的肿瘤模型中评估抗-肿瘤功效因为生物相似的阿特朱单抗也与小鼠PD-L1结合，因此小鼠中CTLA-4的人源化使得能够直接体内评估BCP-84和BCP-85BABP在小鼠肿瘤异种移植模型中的功效。
小鼠异种移植模型通过将肿瘤细胞植入C57BL/6 CTLA-4 KI小鼠来制备。在该测定中使用稳定表达人PD-L1的鼠结肠腺癌细胞系MC38。将MC38-h PD-L1 KI细胞(107)皮下注射到8周龄C57BL/6 CTLA-4 KI小鼠中。用卡尺测量肿瘤尺寸，并通过经修改的椭圆体公式来计算肿瘤体积：长度×(宽度)2/2。当肿瘤达到约90-130mm3的体积时，将小鼠随机分配到不同的治疗组，将其维持2或6周。通过腹膜内注射向小鼠施用载体对照、抗-PD-L1抗体(生物相似的阿特朱单抗)、抗-CTLA-4抗体(sdAb-2-Fc或sdAb-3-Fc)、生物相似的阿特朱单抗和抗-CTLA-4抗体(sdAb-2-Fc或sdAb-3-Fc)的组合、或BABP(BCP-84或BCP-85)。通过评估肿瘤尺寸和肿瘤重量的抑制来评估BABP的功效。
如图25所示，生物相似的阿特朱单抗和抗-CTLA-4抗体(sdAb-2-Fc或sdAb-3-Fc)的组合在小鼠肿瘤模型中展示出比单一疗法更高的肿瘤抑制功效。值得注意的是，BCP-84和BCP-85的抗-肿瘤功效与组合疗法相当。
实施例7：Ang2/VEGF双特异性抗原结合蛋白的构建、表达和生物物理表征。
本实施例描述了示例性Ang2/VEGF BABP的构建和表达。设计并表达量四种构建体，其各自包含如下的两个多肽链：
构建体1(BCP-49)：第一多肽从N-末端到C末端包含：抗-VEGF sdAb的VHH结构域，肽接头(SEQ ID NO：13)，LC10的重链可变结构域VH(抗-Ang2抗体)和IgG1的重链恒定结构域。第二多肽从N-末端至C-末端包含：LC10的轻链可变结构域VL(抗-Ang2抗体)和抗体λ轻链CL结构域。BCP-49具有图9的形式。
构建体2(BCP-50)：第一多肽从N-末端至C末端包含：LC10的重链可变结构域VH(抗-Ang2抗体)，IgG1的重链恒定结构域，肽接头(SEQ ID NO：13)和抗-VEGF sdAb的VHH结构域。第二多肽从N-末端至C-末端包含：LC10的轻链可变结构域VL(抗-Ang2抗体)和抗体λ轻链CL结构域。BCP-50具有图4的格式。
构建体3(BCP-51)：第一多肽从N-末端至C末端包含：LC10的重链可变结构域VH(抗-Ang2抗体)和IgG1的重链恒定结构域。第二多肽从N-末端到C-末端包含：抗-VEGF sdAb的VHH结构域，肽接头(SEQ ID NO:13)，LC10的轻链可变结构域VL(抗-Ang2抗体)，以及抗体λ轻链CL结构域。BCP-51具有图13的形式。
构建体4(BCP-52)：第一多肽从N-末端至C末端包含：LC10的重链可变结构域VH(抗-Ang2抗体)和IgG1的重链恒定结构域。第二多肽从N-末端至C-末端包含：LC10的轻链可变结构域VL(抗-Ang2抗体)，抗体λ轻链CL结构域，肽接头(SEQ ID NO:13)，抗-VEGF sdAb的VHH结构域(sdAb-1)。BCP-52具有图11的形式。
制备四种BABP的质粒并在CHO细胞中瞬时表达。通过一步蛋白质A色谱纯化BABP，并且在4％蔗糖、50mM组氨酸、50mM精氨酸、pH 6.0缓冲液中储存。在还原和非还原条件下，通过SDS-PAGE分析纯化的BABP的组成和纯度。链的尺寸以及BABP分子的全长蛋白与其基于氨基酸序列计算的分子量一致。为了进一步研究四种BABP在溶液中的物理特性，使用尺寸排阻色谱法分析每种蛋白质。所有四种蛋白质均表现出单一主峰，从而展示出作为单体BABP分子的物理同质性。该数据的总结示于
表13中。
表13：示例性Ang2/VEGF BABP的制备。
实施例8：Ang2/VEGF双特异性抗原结合蛋白的体外功能测定。
BABP与rhAng2和rhVEGF的结合动力学使用HBS-EP(10mM HEPES，pH 7.4，150mMNaCl，3mM EDTA和0.05％Tween-20)，用T200仪通过表面等离子体共振来确定。简而言之，根据制造商的说明书，使用标准胺偶联试剂盒将山羊抗人IgG多克隆抗体直接固定在CM5生物传感器芯片上。将纯化的FIT-Ig样品在HEPES缓冲盐水中稀释以捕获山羊抗人IgG Fc特异性反应表面，并以5μl/min的流量注射到反应基质上。在30μl/min的连续流量，确定缔合和离解速率常数kon和koff。动力学数据示于表14中。Ang2/VEGF BABP的抗体亲和力类似于相应的4-链抗体LC10或与Fc片段融合的抗-VEGF sdAb。
表14：示例性Ang2/VEGF BABP的结合数据。
为了评估靶向VEGF的Ang2/VEGF BABP的生物活性，将HUVEC细胞用于促有丝分裂测定。将HUVEC细胞以6×103个细胞/孔的密度接种于6孔板中，并在低葡萄糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(GIBCO)中，所述培养补充有10％小牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素(生长培养基)。然后以在1和5000ng/ml之间范围内的浓度添加与Fc片段融合的抗-VEGF sdAb(“sdAbVEGF-Fc”)。在2-3小时后，以3ng/ml的最终浓度添加纯化的rhVEGF165。在五或六天后，通过暴露于胰蛋白酶使细胞离解，并在Coulter计数器中计数。从平均细胞数的变化不超过10％。通过四参数曲线拟合程序分析数据。如表14中所示，四种Ang2/VEGF BABP全部均具有与sdAbVEGF-Fc相当的靶向VEGF的生物活性。
为了评估BABP对Ang-2的抑制，如下测量通过抑制Ang-2诱导的Tie2磷酸化。在存在或不存在LC10抗体或每种BABP的情况下，用Ang-2刺激HEK293-Tie2细胞5分钟。然后，根据制造商的说明，使用夹心ELISA对细胞裂解物中的磷酸化Tie2(“P-Tie2”)含量进行定量。使用GraphPad PRISMTM版本6确定IC50值。如表14中所示，四种Ang2/VEGF BABP全部均具有与LC10相当的靶向Ang2的生物活性。
实施例9：Ang2/VEGF双特异性抗原结合蛋白的体内功效。
与抗Ang2 sdAb和抗VEGF抗体单一疗法或组合疗法相比，使用A375异种移植物来评估实施例7-8中描述的Ang2/VEGF BABP的抗-肿瘤功效。
将107A375细胞皮下注射到6周龄Balb/c裸鼠中。用卡尺测量肿瘤尺寸，并通过经修改的椭圆体公式来计算肿瘤体积：长度×(宽度)2/2。当肿瘤达到约90-130mm3的体积时，将小鼠随机分配到不同的治疗组，将其维持2或6周。每周两次对小鼠静脉内施用载体对照、LC10、sdAbVEGF-Fc、LC10+sdAbVEGF-Fc组合或BCP-49。
在每周两次测量肿瘤体积，并且数据示于图26A中。与载体对照相比，在sdAbVEGF-Fc、LC10+sdAbVEGF-Fc组合疗法和BCP-49治疗组中观察到肿瘤生长的显著抑制。值得注意的是，与组合治疗组相比，在经BCP49治疗组中观察到协同活性。
在研究完成后也测量肿瘤重量。与肿瘤体积结果一致，BCP49在降低肿瘤重量方面比LC10+sdAbVEGF-Fc组合疗法更有效，如图26B所示。
本公开中的所有引用均明确地以引用方式并入本文。
序列表
<110> 南京传奇生物科技有限公司
<120> 多特异性抗原结合蛋白及其使用方法
<130> 761422000241
<140> 待转让
<141> 同此
<150> PCT/CN2016/090703
<151> 2016-07-20
<160> 13
<170> 用于Windows 4.0版的FastSEQ
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
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Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
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195 200 205
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Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
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Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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<221> 变体
<222> (1)...(2)
<223> 可存在于一个或多个重复序列中
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1 5 10 15

Claims (57)

1.多特异性抗原结合蛋白，所述多特异性抗原结合蛋白包含：
(a)第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中VH和VL一起形成特异性结合第一表位的抗原结合位点，和
(b)第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含特异性结合第二表位的单域抗体，
其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一表位和所述第二表位来自相同抗原。
3.根据权利要求1所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一表位和所述第二表位来自不同抗原。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白为双特异性的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分为全长抗体，所述全长抗体由两个重链和两个轻链组成。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分为包含含有VH的重链和含有VL的轻链的抗体片段。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分包含单一多肽链。
8.根据权利要求7所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分的C末端与所述第一抗原结合部分的至少一个重链的N-末端融合。
9.根据权利要求7所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分的C末端与所述第一抗原结合部分的至少一个轻链的N-末端融合。
10.根据权利要求7所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分的N末端与所述第一抗原结合部分的至少一个重链的C-末端融合。
11.根据权利要求7所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分的N末端与所述第一抗原结合部分的至少一个轻链的C-末端融合。
12.根据权利要求1至6中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分为Fab样结构域，所述Fab样结构域包含含有与CH1结构域融合的第一单域抗体的第一多肽链，和含有与CL结构域融合的第二单域抗体的第二多肽链。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分包含人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分包含Fc区。
15.根据权利要求14所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分与所述Fc区的N-末端融合。
16.根据权利要求14或15所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述Fc区为IgG1 Fc。
17.根据权利要求16所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述Fc区为具有S228P突变的IgG4 Fc。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分经由肽键或肽接头彼此融合。
19.根据权利要求18所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述肽接头不超过约30个氨基酸长。
20.根据权利要求19所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述肽接头包含SEQ ID NO：1、8或13的氨基酸序列。
21.根据权利要求1至17中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分在化学上彼此融合。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述单域抗体为骆驼单域抗体、人源化单域抗体、或人单域抗体。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一表位来自免疫检查点分子。
24.根据权利要求23所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7-H3、TIM-3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。
25.根据权利要求24所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分为抗-PD-1抗体或其抗原结合片段。
26.根据权利要求25所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述抗-PD-1抗体选自派姆单抗和纳武单抗。
27.根据权利要求24所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分为抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段。
28.根据权利要求27所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述抗-PD-L1抗体为度伐鲁单抗或阿特朱单抗。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述单域抗体特异性结合免疫检查点分子。
30.根据权利要求29所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、B7-H3、TIM-3、LAG-3、VISTA、ICOS、4-1BB、OX40、GITR和CD40。
31.根据权利要求30所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分包含抗-CTLA-4单域抗体。
32.根据权利要求1至22中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一表位来自肿瘤抗原。
33.根据权利要求32所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述肿瘤抗原选自HER2、BRAF、EGFR、VEGFR2、CD20、RANKL、CD38和CD52。
34.根据权利要求33所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分为抗-HER2抗体或其抗原结合片段。
35.根据权利要求34所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述抗-HER2抗体为曲妥珠单抗。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分包含抗-CD3单域抗体。
37.根据权利要求1至22中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分为抗-Ang2抗体或其抗原结合片段。
38.根据权利要求37所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分为抗-VEGF单域抗体。
39.根据权利要求1至22中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一表位来自促炎分子。
40.根据权利要求39所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述促炎分子选自IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-6、IL-6R和嗜酸细胞活化趋化因子-1。
41.根据权利要求40所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分为抗-TNF-α抗体或其抗原结合片段。
42.根据权利要求41所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述抗-TNF-α抗体为阿达木单抗。
43.根据权利要求42所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分包含抗-IL-1β单域抗体。
44.根据权利要求40所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第一抗原结合部分为抗-IL-5抗体或其抗原结合片段。
45.根据权利要求44所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述抗-IL-5抗体为美泊利单抗。
46.根据权利要求45所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述第二抗原结合部分包含抗-嗜酸细胞活化趋化因子-1单域抗体。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白可以至少约10mg/L的表达水平重组产生。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白具有至少约65℃的聚集起始温度。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白具有至少约100mg/mL的溶解度。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白在至少约50mg/mL的浓度下在25℃下稳定至少约一周。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述多特异性抗原结合蛋白在至少50mg/mL的浓度下在至少约5次冻-融循环之后是稳定的。
52.药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至51中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。
53.治疗个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求52所述的药物组合物。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述疾病是癌症。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肾癌、黑素瘤、肺癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌和淋巴瘤。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述疾病是炎性或自身免疫疾病。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述炎性或自身免疫疾病选自关节炎、结肠炎、牛皮癣、重度哮喘和中度至重度克罗恩病。
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