CN105754990A - 一种pd-1/ctla-4双特异性抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

一种pd-1/ctla-4双特异性抗体的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PD?1/CTLA?4双特异性抗体的制备方法及其应用。本发明通过基因工程技术以单链抗体基因为模板，以特定的高效扩增引物，通过PCR和Overlap PCR，并向抗体的可变区引入二硫键制备PD?1/CTLA?4双特异性抗体片段，并将该基因片段克隆到慢病毒表达载体，通过转染293T细胞进行病毒包装；然后进行CIK细胞的转导，从健康人外周血分离PBMC，用CD3/CD28磁珠刺激T细胞生长，慢病毒与T细胞共培养，得到能够阻断肿瘤及肿瘤微环境来源的免疫抑制信号，同时增强杀伤癌细胞的功能的新型抗肿瘤T细胞。

Description

一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生命科学领域，尤其涉及一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体的制备方法及其相关的应用
背景技术
肿瘤免疫治疗(主要指CTL细胞、DC细胞、CIK细胞、NK细胞、TIL细胞等)是通过激发或调动机体的免疫功能，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞的目的。具有疗效好、毒副作用低或无、无耐药性的显著优势，成为继传统疗法(手术、化疗和放疗)、靶向疗法(小分子靶向药物和单克隆抗体)后肿瘤治疗领域最具前景的研究方向之一。
肿瘤免疫治疗是目前治疗肿瘤最具前景的研究方向之一。通过激发或调动机体的免疫功能，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞的目的。肿瘤免疫治疗主要包括三大类：免疫检验点单抗疗法、过继细胞免疫疗法(ACT)和肿瘤疫苗。目前国际上主要的肿瘤免疫治疗在研药物集中在免疫检验点单抗领域中，特别是负向共刺激因子的抑制剂—CTLA4、PD1等单抗，是全球研发竞赛的焦点。
细胞免疫治疗是世界上肿瘤治疗研究的一个热点，与传统的小分子和单抗药物等生物治疗是一种全新的肿瘤治疗模式，是一种活的药物。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)因其具有靶向杀伤肿瘤细胞的特点而在肿瘤的个体化治疗中占有重要地位。目前常用的肿瘤特异性CTL包括TIL、DC诱导的CTL及基因修饰的T细胞(TCR-T和CAR-T)，能特异性的杀伤表达该抗原的肿瘤细胞，因其出色的疗效，CTL免疫疗法已成为肿瘤个体化治疗的理想方案，但其疗效也受一些限制，如免疫检查点分子PD-1、CTLA-4等。由于肿瘤细胞具有逃避免疫应答的神奇能力，免疫学家也在想方设法激活T细胞的抗肿瘤活性，并保持其发现和攻击癌细胞的能力。肿瘤免疫应答的产生需要机体免疫系统有效识别和提呈肿瘤抗原、进而活化特异性T细胞；共刺激分子及其调节网络在该过程中发挥了极其重要的作用。近几年来，随着对肿瘤免疫抑制机制研究的深入，特别是免疫检查点PD-1、CTLA-4等的发现为提高CTL的疗效提供了新方法。如果通过基因修饰使T细胞直接表达针对PD-1、CTLA-4的特异性抗体则可以阻断肿瘤及肿瘤微环境来源的免疫抑制信号，从而挽救耗竭的T细胞，同时增强CTL杀伤癌细胞的功能；但目前尚无PD-1/CTLA-4双特异性抗体的高效制备方法。
发明内容
本发明针对现有技术之缺陷，提供了一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，以抗PD-1dsFv基因为模板，扩增基因片段PD-1VH-GGGGS，上下游扩增引物序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示；
步骤二，以抗CTLA-4dsFv基因为模板，扩增基因片段GGGGS-CTLA-4VL，上下游扩增引物序列如SEQ NO.3和SEQ NO.4所示；
步骤三，Overlap PCR拼接步骤一和步骤二所得基因片段PD-1VH-GGGGS和GGGGS-CTLA-4VL，构建基因片段PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL，扩增引物序列如SEQ NO.1和SEQ NO.5所示；
步骤四，以抗CTLA-4dsFv基因为模板，扩增基因片段CTLA-4VH-GGGGS，上下游扩增引物序列如SEQ NO.6和SEQ NO.2所示；
步骤五，以抗PD-1dsFv基因为模板，扩增基因片段GGGGS-PD-1VL，上下游扩增引物序列如SEQ NO.3和SEQ NO.8所示；
步骤六，Overlap PCR拼接步骤四和步骤五所得基因片段CTLA-4VH-GGGGS和GGGGS-PD-1VL，构建基因片段CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL，扩增引物序列如SEQ NO.7和SEQNO.8所示；
步骤七，Overlap PCR拼接步骤三和步骤六所得基因片段PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL和CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL，构建基因片段PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL-furin-GSGS-2A-CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL，即为PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段。其中，2A肽可以为F2A(foot-and-mouth disease virus),E2A(equine Rhinitis A virus),P2A(porcineteschovirus-1),T2A(Thosea asigna virus)等具有自剪切功能的2A。
优选地，
furin间隔序列：
CGTGCCAAGCGATCCGGAAGCGGA
2A序列优选：
GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
相应地，本发明还提供上述制备方法所制备的PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段。
进一步地，本发明还提供上述PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段修饰的T细胞。
进一步地，本发明提供PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段所表达的特异性抗体。
进一步地，本发明还提供PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段在制备抗肿瘤药物或试剂盒中的应用。
另一方面，本发明提供了一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体慢病毒表达载体的构建包装方法，包括以下步骤：
步骤一，用EcoR I和Not I分别对权利要求2所述的PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段以及慢病毒表达载体进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后进行胶回收；
步骤二，将回收得到的基因片段同酶切后的慢病毒载体进行连接，取连接产物转化大肠杆菌DH5α，铺板，挑取单菌落并提取质粒，最后用EcoR I和Not I对质粒进行双酶切，得到PD-1/CTLA-4双特异性抗体慢病毒表达载体；
步骤三，将步骤二得到的PD-1/CTLA-4双特异性抗体慢病毒表达载质粒和包装质粒共转染293T细胞并进行培养，收集培养上清，分离病毒并测定病毒滴度，备用。
有了优化上述构建和包装方法，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，上述步骤一中对PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段以及慢病毒表达载体进行双酶切条件为37℃酶切8h。
优选地，上述步骤二具体操作为：将步骤一中回收得到的基因片段同酶切后的载体16℃连接8h，取连接产物5μl转化50μL大肠杆菌DH5α，铺板，挑取单菌落并提取质粒，最后用EcoR I和Not I对质粒37℃双酶切8h，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到PD-1/CTLA-4双特异性抗体表达载体。
优选地，上述步骤三具体操作为：转染前一天传代293T细胞，使得转染当天的融合度达60％-80％，转染前4h换液培养基，将细胞培养皿从5％CO237℃培养箱中取出，将其中的含双抗的培养基换成已预热的无双抗的DMEM+10％FBS培养基，将重组慢病毒质粒及包装质粒用Lipofectamine 2000共转293T细胞；转染第二天换液成正常体积的DMEM+10％FBS+1％双抗的培养基继续培养，收集随后30-48h的培养上清，3000rpm离心10min后用0.45um针头滤器过滤至高速无菌离心管中，4℃于25000rpm离心2h，轻轻弃离心后的上清，并将离心管倒扣于干净的纸巾上，直至无明显上清残余，后加入预冷的1ml PBS每离心管，吹散病毒团后以每管100ul的病毒液分装入干净的无菌1.5ml离心管中，检测病毒滴度后，-80℃保存，备用。
最后一方面，本发明还提供了一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段修饰的T细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，从健康人外周血分离PBMC，用CD3/CD28磁珠刺激T细胞生长3天；
步骤二，将如权利要求7-9任意一项构建包装方法所制备的慢病毒与步骤一中T细胞培养共培养，获得PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段修饰的T细胞。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明通过基因工程技术以单链抗体基因为模板，以特定的高效扩增引物，通过PCR和Overlap PCR，并向抗体的可变区引入二硫键制备PD-1/CTLA-4双特异性抗体片段，并将该基因片段克隆到慢病毒表达载体，通过转染293T细胞进行病毒包装；然后进行CIK细胞的转导，从健康人外周血分离PBMC，用CD3/CD28磁珠刺激T细胞生长，慢病毒与T细胞共培养，得到能够阻断肿瘤及肿瘤微环境来源的免疫抑制信号，同时增强杀伤癌细胞的功能的新型抗肿瘤T细胞。
附图说明
图1为本发明方法所制备的PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL-furin-GSGS-2A-CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL VH-GGGGS-PD-1VL表达载体结构示意图。
图2为实施例一中PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL、CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL拼接后1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。其中的附图标记为M:marker；1:PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL；2:CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL。
图3为实施例一中PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL-furin-GSGS-2A-CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL拼接后1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。其中的附图标记为M:marker；1:PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL-furin-GSGS-2A-CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL。
图4为实施例三中胞内染色法检测胞内PD-1/CTLA-4双特异抗体的表达的检测结果。
图5为实施例三中PD-1/CTLA-4双特异性抗体的ELISA检测结果(包被PD-1蛋白)。
图6为实施例三中PD-1/CTLA-4双特异性抗体的ELISA检测结果(包被CTLA-4蛋白)。
图7为实施例四中IFN-γ释放的检测结果。
图8为实施例四中PD-1/CTLA-4双特异性抗体修饰的基因工程T细胞针对靶细胞杀伤活性检测结果
具体实施方式
本发明提供了一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，以抗PD-1dsFv基因为模板，扩增基因片段PD-1VH-GGGGS，上下游扩增引物序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示；
步骤二，以抗CTLA-4dsFv基因为模板，扩增基因片段GGGGS-CTLA-4VL，上下游扩增引物序列如SEQ NO.3和SEQ NO.4所示；
步骤三，Overlap PCR拼接步骤一和步骤二所得基因片段PD-1VH-GGGGS和GGGGS-CTLA-4VL，构建基因片段PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL，扩增引物序列如SEQ NO.1和SEQ NO.5所示；
步骤四，以抗CTLA-4dsFv基因为模板，扩增基因片段CTLA-4VH-GGGGS，上下游扩增引物序列如SEQ NO.6和SEQ NO.2所示；
步骤五，以抗PD-1dsFv基因为模板，扩增基因片段GGGGS-PD-1VL，上下游扩增引物序列如SEQ NO.3和SEQ NO.8所示；
步骤六，Overlap PCR拼接步骤四和步骤五所得基因片段CTLA-4VH-GGGGS和PD-1VL-GGGGS，构建基因片段CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL，扩增引物序列如SEQ NO.7和SEQ NO.8所示；
步骤七，Overlap PCR拼接步骤三和步骤六所得基因片段PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL和CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL，构建基因片段PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL-furin-GSGS-2A-CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL，即为PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段。
同时本发明还提供PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段修饰的T细胞和相应表达出的特异性抗体，以及上述方面在肿瘤免疫治疗中的应用。下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例一PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段的制备
以抗PD-1、CTLA-4DsFv基因为模板，通过PCR和Overlap PCR，分别构建成为PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL，CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL基因片段，之后再通过furin-GSGS-2A连接肽构建PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL-furin-GSGS-2A-CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL(如附图1)。
表1 PCR引物序列
Tab.1 Primer sequences
步骤一，基因片段PD-1VH-GGGGS的扩增
以DsFv基因为模板，使用引物1和引物2扩增基因片段PD-1VH-GGGGS，扩增体系如下：
表2 PCR反应体系
Table.2 PCR reaction system
PCR扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性5s，72℃延伸30s，30个循环后,72℃延伸5min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确后，胶回收PCR产物。
步骤二，基因片段GGGGS-CTLA-4VL的扩增
以DsFv基因为模板，使用引物3和引物4扩增基因片段GGGGS-CTLA-4VL，扩增体系如下：
表3 PCR反应体系
Table.3 PCR reaction system
PCR扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性5s，72℃延伸30s，30个循环后,72℃延伸5min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确后，胶回收PCR产物。
步骤三，基因片段PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL的扩增
Overlap PCR拼接基因片段PD-1VH-GGGGS和GGGGS-CTLA-4VL，构建基因片段PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL，反应体系如下：
表4 Overlap PCR反应体系
Table.4 Overlap PCR reaction system
PCR扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性5s，72℃延伸30s，7个循环后,72℃延伸5min。然后向上述拼接产物中加入等体积的扩增反应溶液，扩增PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL，扩增体系如下：
表5 Overlap PCR反应体系
Table.5 Overlap PCR reaction system
PCR扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性5s，72℃延伸30s，30个循环后,72℃延伸5min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图2)，鉴定正确后，胶回收PCR产物。
步骤四，基因片段CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL的扩增
基因片段CTLA-4VH-GGGGS的扩增
以DsFv基因为模板，使用引物6和引物2扩增基因片段CTLA-4VH-GGGGS，扩增体系如下：
表6 PCR反应体系
Table.6 PCR reaction system
PCR扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性5s，72℃延伸30s，30个循环后,72℃延伸5min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确后，胶回收PCR产物。
步骤五，基因片段GGGGS-PD-1VL的扩增
以DsFv基因为模板，使用引物7和引物8扩增基因片段GGGGS-PD-1VL，扩增体系如下：
表7 PCR反应体系
Table.7 PCR reaction system
PCR扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性5s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸5min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确后，胶回收PCR产物。
步骤六，基因片段CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL的扩增
Overlap PCR拼接基因片段CTLA-4VH-GGGGS和GGGGS-PD-1VL，构建基因片段CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL，反应体系如下：
表8 Overlap PCR反应体系
Table.8 Overlap PCR reaction system
PCR扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性5s，72℃延伸30s，7个循环后,72℃延伸5min。然后向上述拼接产物中加入等体积的扩增反应溶液，扩增CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL，扩增体系如下：
表9 Overlap PCR反应体系
Table.9 Overlap PCR reaction system
PCR扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性5s，72℃延伸30s，30个循环后,72℃延伸5min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(附图2)，鉴定正确后，胶回收PCR产物。
步骤七，基因片段PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL-furin-GSGS-2A-CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL的扩增
Overlap PCR拼接基因片段PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL和CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL，构建基因片段PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL-furin-GSGS-2A-CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL，反应体系如下：
表10 Overlap PCR反应体系
Table.10 Overlap PCR reaction system
PCR扩增程序为：98℃预变性30s，98℃变性5s，72℃延伸30s，30个循环后,72℃延伸10min。反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确后，胶回收PCR产物(附图3)。
实施案例二PD-1/CTLA-4双特异性抗体慢病毒表达载体的构建以及重组慢病毒的包装
用EcoR I和Not I分别对实施例一中得到PD-1VH-GGGGS-CTLA-4VL-furin-GSGS-2A-CTLA-4VH-GGGGS-PD-1VL以及慢病毒表达载体进行双酶切(表11，12)，37℃酶切8h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后进行胶回收。
表11 酶切体系
Table.11 digestion system
表12酶切体系
Table.12 digestion system
将回收得到的基因片段同酶切后的载体进行连接(表13)，16℃连接8h，取连接产物5μl转化50μL大肠杆菌DH5α，铺板，挑取单菌落并提取质粒，最后用EcoR I和Not I对质粒进行双酶切(表14)，37℃酶切8h，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
表13连接体系
Table.13 Ligase reaction system
表14酶切体系
Table.14 digestion system
转染前一天传代293T细胞，使得转染当天的融合度达60％-80％，转染前4h换液培养基，将细胞培养皿从5％CO237℃培养箱中取出，将其中的含双抗的培养基换成已预热的无双抗的DMEM+10％FBS培养基，将重组慢病毒质粒及包装质粒用Lipofectamine2000共转293T细胞。转染第二天换液成正常体积的DMEM+10％FBS+1％双抗的培养基继续培养，收集随后30-48h的培养上清，3000rpm离心10min后用0.45um针头滤器过滤至高速无菌离心管中，4℃于25000rpm离心2h，轻轻弃离心后的上清，并将离心管倒扣于干净的纸巾上，直至无明显上清残余，后加入预冷的1ml PBS每离心管，吹散病毒团后以每管100ul的病毒液分装入干净的无菌1.5ml离心管中，-80℃保存，用于感染T细胞。利用Lenti-X p24Rapid TiterKit检测所得病毒滴度为5×107-5×108IFU。
实施例三PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因修饰T细胞的制备及抗体表达检测
从健康人外周血分离PBMC，用CD3/CD28磁珠刺激T细胞生长3天，检测CD8+/CD4+比例，CD8+细胞可以达到80％以上；使用实施例二所包装的慢病毒与T细胞培养3天，得到PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因修饰T细胞。
收集细胞，按照1:1000加入Brefeldin A，混匀后于37℃5％CO2孵箱孵育4-6小时；收获细胞，加入100μL MEDIUM A,室温孵育15min；用PBS(3％FBS)洗3次；加入100μL MEDIUMB和1μL protein-L-biotein；4℃孵育30min；用PBS(3％FBS)洗3次；加入5μL SA-PE，4℃孵育30min；流式检测(检测结果如附图4所示)。
利用ELISA检测PD-1/CTLA-4双特异性抗体在T细胞的表达，包被PD-1蛋白100ng/孔，加入100μl PD-1/CTLA-4双特异性抗体表达上清，ELISA检测其与PD-1蛋白的结合活性(检测结果如附图5所示)；包被CTLA-4蛋白100ng/孔，加入100μl PD-1/CTLA-4双特异性抗体表达上清，ELISA检测其与CTLA-4蛋白的结合活性(检测结果如附图6所示)。
实施例四PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因修饰T细胞针对靶细胞杀伤活性检测
体外检测对黑色素瘤细胞的杀伤实验：铬同位素标记肿瘤细胞，4小时候gamma技术器测定铬同位素释放，同时测定IFN-γ释放，结果如附图7、8所示。
效应细胞分组：PBMC对照组；CIK对照组；PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因转染组；
效靶比分组：效靶比分别为3:1；6:1；12:1；25:1；50:1；
将效应细胞与靶细胞按预先实验设计的比例进行混合后于37℃共培养4h；
弃上清，加入适量10％SDS，收集细胞，利用同位素测定仪检测同位素活性，并计算各组T细胞的肿瘤杀伤活性。
PD-1/CTLA-4双特异性抗体修饰的基因工程T细胞与51Cr标记的肿瘤细胞共培养四个小时，效应细胞和靶细胞的比例如图所示。按照以下公式计算各组T细胞肿瘤杀伤活性：肿瘤细胞杀伤百分比＝(实验组—淋巴细胞)/(最大裂解组—靶细胞对照组)×100％。
本发明通过基因工程技术以单链抗体基因为模板，以特定的高效扩增引物，通过PCR和Overlap PCR，并向抗体的可变区引入二硫键制备PD-1/CTLA-4双特异性抗体片段，并将该基因片段克隆到慢病毒表达载体，通过转染293T细胞进行病毒包装；然后进行CIK细胞的转导，从健康人外周血分离PBMC，用CD3/CD28磁珠刺激T细胞生长，慢病毒与T细胞共培养，得到能够阻断肿瘤及肿瘤微环境来源的免疫抑制信号，同时增强杀伤癌细胞的功能的新型抗肿瘤T细胞。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，以抗PD-1 dsFv基因为模板，扩增基因片段PD-1 VH-GGGGS，上下游扩增引物序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示；
步骤二，以抗CTLA-4 dsFv基因为模板，扩增基因片段GGGGS-CTLA-4 VL，上下游扩增引物序列如SEQ NO.3和SEQ NO.4所示；
步骤三，Overlap PCR拼接步骤一和步骤二所得基因片段PD-1 VH-GGGGS和GGGGS-CTLA-4 VL，构建基因片段PD-1 VH-GGGGS-CTLA-4 VL，扩增引物序列如SEQ NO.1和SEQ NO.5所示；
步骤四，以抗CTLA-4 dsFv基因为模板，扩增基因片段CTLA-4 VH-GGGGS，上下游扩增引物序列如SEQ NO.6和SEQ NO.2所示；
步骤五，以抗PD-1 dsFv基因为模板，扩增基因片段GGGGS-PD-1 VL，上下游扩增引物序列如SEQ NO.3和SEQ NO.8所示；
步骤六，Overlap PCR拼接步骤四和步骤五所得基因片段CTLA-4 VH-GGGGS和PD-1 VL-GGGGS，构建基因片段CTLA-4 VH-GGGGS-PD-1 VL，扩增引物序列如SEQ NO.7和SEQ NO.8所示；
步骤七，Overlap PCR拼接步骤三和步骤六所得基因片段PD-1 VH-GGGGS-CTLA-4 VL和CTLA-4 VH-GGGGS-PD-1 VL，构建基因片段PD-1 VH-GGGGS-CTLA-4 VL-furin-GSGS-2A-CTLA-4 VH-GGGGS-PD-1 VL，即得到PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段，其中，2A选自具有自剪切功能的F2A、E2A或T2A。
2.如权利要求1所述的制备方法所制备的PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段。
3.如权利要求2所述的PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段修饰的T细胞。
4.如权利要求2所述的PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段所表达的特异性抗体。
5.如权利要求2所述的PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段在制备抗肿瘤药物或试剂盒中的应用。
6.一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体慢病毒表达载体的构建包装方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，用EcoR I和Not I分别对权利要求2所述的PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段以及慢病毒表达载体进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后进行胶回收；
步骤二，将回收得到的基因片段同酶切后的慢病毒载体进行连接，取连接产物转化大肠杆菌DH5α，铺板，挑取单菌落并提取质粒，最后用EcoR I和Not I对质粒进行双酶切，得到PD-1/CTLA-4双特异性抗体慢病毒表达载体；
步骤三，将步骤二得到的PD-1/CTLA-4双特异性抗体慢病毒表达载质粒和包装质粒共转染293T细胞并进行培养，收集培养上清，分离病毒并测定病毒滴度，备用。
7.根据权利要求6所述的构建包装方法，其特征在于，步骤一中对PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段以及慢病毒表达载体进行双酶切条件为37℃酶切8h。
8.根据权利要求6所述的构建包装方法，其特征在于，步骤二具体操作为：将步骤一中回收得到的基因片段同酶切后的载体16℃连接8h，取连接产物5μl转化50μL大肠杆菌DH5α，铺板，挑取单菌落并提取质粒，最后用EcoR I和Not I对质粒37℃双酶切8h，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到PD-1/CTLA-4双特异性抗体表达载体。
9.根据权利要求6所述的构建包装方法，其特征在于，步骤三具体操作为：转染前一天传代293T细胞，使得转染当天的融合度达60％-80％，转染前4h换液培养基，将细胞培养皿从5％CO2 37℃培养箱中取出，将其中的含双抗的培养基换成已预热的无双抗的DMEM+10％FBS培养基，将重组慢病毒质粒及包装质粒用Lipofectamine 2000共转293T细胞；转染第二天换液成正常体积的DMEM+10％FBS+1％双抗的培养基继续培养，收集随后30-48h的培养上清，3000rpm离心10min后用0.45um针头滤器过滤至高速无菌离心管中，4℃于25000rpm离心2h，轻轻弃离心后的上清，并将离心管倒扣于干净的纸巾上，直至无明显上清残余，后加入预冷的1ml PBS每离心管，吹散病毒团后以每管100ul的病毒液分装入干净的无菌1.5ml离心管中，检测病毒滴度后，-80℃保存，备用。
10.一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段修饰的T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，从健康人外周血分离PBMC，用CD3/CD28磁珠刺激T细胞生长3天；
步骤二，将如权利要求7-9任意一项构建包装方法所制备的慢病毒与步骤一中T细胞培养共培养，获得PD-1/CTLA-4双特异性抗体基因片段修饰的T细胞。
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