CN104694575A - 启动子优化的慢病毒基因修饰t细胞在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明的启动子优化的慢病毒表达体系其特征在于采用了MSCV启动子，该启动子优化的慢病毒表达体系基因修饰T细胞使之表达抗肿瘤T细胞受体(TCR)，其特征在于：在多克隆位点顺序插入TCRα、furin间隔序列、2A肽、TCRβ序列；启动子优化的慢病毒载体构建的嵌合型抗原受体(CAR)表达载体其特征在于：在多克隆位点插入CAR序列。本发明重组慢病毒载体的应用，如使重组TCR表达在T细胞，及通过CAR表达在T或NK细胞以达到特异性杀伤肿瘤的目的，并可以应用到临床的肿瘤治疗中。

Description

启动子优化的慢病毒基因修饰T细胞在肿瘤治疗中的应用

技术领域

本发明属于利用慢病毒技术基因修饰T及NK细胞并使之获得稳定的特异性抗肿瘤能力的一种基因修饰技术，属于第四代特异性抗肿瘤免疫治疗技术，是近年来肿瘤免疫治疗技术的一个热点，在肿瘤治疗(包括白血病)上取得了突破性进展(Lee,Kochenderfer et al.2014,Maude,Frey et al.2014)。

背景技术

恶性肿瘤是最为严重危害人类健康的疾病,每年中国大约三百万人被诊断为新发肿瘤患者，二百万人死于癌症。尽管可以通过手术、放疗、化疗进行治疗,但大多数病人不能承受治疗毒副作用和治疗效率，仍死于肿瘤的复发和转移。所以,如何清除残留的微小肿瘤组织或肿瘤细胞则是现代肿瘤免疫学有待解决的问题之一。由于癌症发生的根本原因是肿瘤细胞逃逸免疫细胞的监控而进行无节制的生长，所以提高免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞将从可以根本上去除肿瘤。目前，免疫疗法是国际公认的最有希望完全消灭肿瘤细胞的第四大新的治疗方法。“癌症免疫疗法”被美国《科学》杂志评为2013年最大的科学突破。免疫疗法逐渐成为治疗癌症最有效的方法之一。

同西方发达国家正在澎湃发展的第四代肿瘤特异性免疫治疗技术相比，我国目前的免疫治疗还停留在第二代和第三代非特异性免疫治疗阶段。第四代免疫技术的主要技术依托是基因修饰技术，目前，我国基因修饰技术同西方发达国家相比严重滞后，缺乏可以提供基因工程病毒载体制备的服务机构及技术支持，更缺乏相关法规来指导临床的应用。令人欣喜的是，我国对肿瘤免疫治疗非常重视，也有越来越多的科研院所，企业投入人力，资金加入该邻域的研发及临床应用；但是，缺乏基因修饰手段成了制约免疫细胞治疗升级换代的首要因素。

目前国际上最流行的可以稳定整合免疫细胞的病毒载体是LENTIVIRALVECTOR(慢病毒载体体系)，已在欧美发达国家进行了大量的临床试验，是公认安全，高效基因转导系统。如前所述，以抗肿瘤TCR及CAR T技术为代表的基因修饰技术给肿瘤的治疗带来了崭新的方法学，并引发了肿瘤治疗史上的重大突破，2013年更被多家权威杂志列为年度科技突破。其所需要的基因修饰既由该基因修饰载体来完成，已经进行了大量的人体实验，其中有的实验治疗者已经平安的度过了20余年，没有发现任何毒副作用。

本发明所应用的慢病毒属于最新一代载体系统，由四个功能组分构成，最大程度地降低了其重组的可能性。在改造的慢病毒体系中，为了有效地表达目的基因，需要加入一个有效的启动子，其功能是启动目的基因在宿主细胞内表达。目前，比较流行的启动子是CMV(Human cytomegalovirus)UBC(Ubiquitin)、PGK(phosphoglycerate kinase-1)、EF1(elongation factor-1alpha)等，但它们在T及NK细胞内的表达不够持久、效率低、容易被甲基化从而失去功能。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题而提出的。本发明系统地比较了不同的启动子，并进行了优化性构建，筛选出了最适合在人类T及NK细胞内表达的MSCV启动子(鼠干细胞病毒启动子)，该启动子比较其它启动子具有高效，稳定长期表达的优越性，是一种非常有临床应用前景的基因修饰体系。另外，为了达到高效均衡地表达抗肿瘤受体(TCR)的两条链(α和β),该发明亦优化了病毒来源的2A结构，既优化地构建了Furin+SGSG+2A链接体，最大化地并均衡地表达抗肿瘤TCR的两条链，经基因修饰的T细胞可以特异性识别表达特异性抗原的肿瘤细胞，并高效率、特异性地杀伤肿瘤，实现了抗肿瘤效果的最大化。

鉴于基因修饰的T细胞表达的抗肿瘤TCR存在主要组织相容性复合体限制性(MHC)的问题，既一种抗肿瘤TCR只能应用到一类特定的人群(Morgan,Dudley et al.2006)，发明人进一步应用该启动子优化的慢病毒表达载体基因修饰T、NK细胞，使之表达CAR的结构，并证实经基因修饰的T、NK细胞可以特异性地识别表达相应肿瘤抗原的靶细胞，包括肿瘤细胞。

本发明主要包括：

1.优化慢病毒启动子，比较了MSCV，PGK，UBC等启动子在原代T细胞及NK细胞上的表达效率，实验证实MSCV启动子优化的慢病毒体系是基因修饰T、NK细胞的最佳方案(见图1-2)；

2.优化构建表达TCR两条链的2A链接体，并在T细胞表面高效表达，同时可以特异性识别并有效杀伤表达相应抗原的肿瘤细胞(见图3-6)；

3.MSCV启动子优化的慢病毒体系可以在T细胞高效表达抗肿瘤嵌合性抗原受体(CAR)，并可以特异性识别表达相应靶点的肿瘤细胞(见图7-9)；

4.MSCV启动子优化的慢病毒体系可以高效基因修饰NK细胞(见图10)。

本发明提供了一种抗肿瘤T细胞及其制备方法。

本发明还提供了一种以上述抗肿瘤T细胞为活性成分的抗肿瘤药物。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述抗肿瘤T细胞是以启动子优化的慢病毒表达载体基因修饰T及NK细胞表达抗肿瘤TCR和抗肿瘤CAR来实现的。

在上述抗肿瘤T细胞中，所述T及NK细胞来自人类的外周血单个核淋巴细胞。

本发明的第二个方面是提供如上述抗肿瘤T细胞的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、包涵抗肿瘤TCR和抗肿瘤CAR的启动子优化的慢病毒载体的制备：通过基因克隆，把TCR和CAR克隆到以MSCV为启动子的慢病毒的多克隆位点，应用第四代慢病毒的四个包装质粒，通过转染293FT细胞包装成具有一次转导能力的基因工程载体来实现的；

步骤2、T及NK细胞的转导：将步骤1得到的包涵TCR和CAR的基因工程载体转导体外培养的T及NK细胞。T细胞的转导：T细胞经抗－CD3/CD28磁珠激活并过夜培养，然后滴加包涵TCR的载体，连续培养14天，期间按细胞生长情况分瓶及补充新鲜液体；包涵CAR的载体转导T细胞与上述方法相同，但T细胞的激活采取可溶性抗－CD3抗体，其目的是达到最大的感染效率。NK细胞通过抗CD56磁珠分选后，应用包含CAR的基因工程载体转导NK细胞，并加入KT64(K562基因修饰的细胞株)进行扩增。

步骤3、将步骤2所得到的T及NK细胞经过14天的体外培养，得到如权利要求1所述的抗肿瘤T细胞。

本发明的第三个方面是提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物以权利要求1所述的抗肿瘤T细胞为活性成分。

在上述抗肿瘤药物中，优选地，所述抗肿瘤药物为药剂。

在上述抗肿瘤药物中，优选地，所述肿瘤包括例如黑色素瘤、乳腺癌、肺癌。

附图说明

图1改造后的慢病毒表达载体系统结构示意图。第四代慢病毒载体的结构如图所示，该载体两末端的LTR经过基因工程改造，既改造成失活LTR，大大地增加了其安全性。启动子标识包括了MSCV，PGK及UBC，启动子之后的序列为绿色荧光蛋白(GFP)。

图2如图1所示的装有GFP的慢病毒转导T细胞。两例来自PBMC的T细胞体外经抗CD3抗体活化后，应用上述病毒基因修饰T细胞，3天后，利用流式细胞仪检测GFP在T细胞的荧光强度，流式检测结果显示启动子的表达活性MSCV>PGK>UBC。

图3利用MSCV慢病毒载体构建含自我剪切2A肽、弗林蛋白酶切点(furin)及间隔序列(SGSG)的TCR表达载体结构示意图。如图所示，慢病毒载体经过MSCV启动子的优化改造，顺式连接TCR的a链、furin酶的切点、间隔序列(SGSG)、F2A的2A肽和TCR的链，信号终止由Woodchuck Hepatitis VirusPosttranscriptional Regulatory Element(WPRE)来实现。

图4流式细胞仪检测TCRα和β链基因在CD4、CD8T淋巴细胞中的表达。CD4和CD8T细胞通过磁珠技术分离，然后利用抗-CD3/CD28的磁珠激活分离的T细胞，1天后，用图3所示的慢病毒载体分别转导CD8、CD4T细胞；转导7天后，应用流式细胞仪通过TCR对应多肽的四聚体(Tetramer)检测TCR的表达水平。

图5TCR修饰的CD4、CD8T与靶细胞共培养后，利用ELISA方法检测上清中IFN-γ水平。TCR基因修饰后CD4、CD8T细胞与表达相关抗原的肿瘤细胞共培养，16小时后，收集上清，并用ELISA试剂盒检测IFN-γ的水平。数据来源于三个复孔的平均值。其中，624、526为表达MHC I A2分子的相关抗原，为阳性靶点细胞；888、938肿瘤细胞不表达MHC A2分子，为阴性对照细胞。

图6经TCR修饰的CD4、CD8T淋巴细胞针对靶细胞杀伤活性的检测。TCR基因修饰的CD4、CD8T细胞与51Cr-标记的肿瘤细胞共培养四小时，效应细胞与靶细胞的比例如图所示，收集细胞，应用同位素检测仪测定细胞中51Cr的含量，按照以下公式计算各组T细胞肿瘤杀伤活性：肿瘤细胞杀伤百分比＝(实验组-淋巴细胞对照组)/(最大裂解组-靶细胞对照组)X100％。实际杀伤百分率如图Y轴所示。其中，624、526为表达MHC I A2分子的相关抗原，为阳性靶点细胞；888、938肿瘤细胞不表达MHC A2分子，为阴性对照细胞。

图7利用MSCV慢病毒载体构建的CAR表达载体结构示意图。嵌合抗原受体(CAR)顺式连接到MSCV优化的慢病毒载体的多克隆位点。该CAR可以识别表达Her2/neu的肿瘤细胞。

图8启动子优化后的慢病毒载体在T细胞上高效表达CAR。PBMC经30ng/ml的可容性抗-CD3抗体激活，第二天，应用表达CAR的慢病毒载体转导T细胞，培养七天后，应用流式细胞仪检测CAR的表达水平。Mock代表对照组，4D5-CD8为表达针对Her2/neu CAR，4D5-CD16a为没有活化信号的对照，GFP为转导对照。

图9CAR修饰后的T细胞特异性识别表达Her2/neu的肿瘤细胞。转导的细胞与肿瘤细胞共培养，16小时后收集上清，应用ELISA检测IFN的水平。CEM、MDA468为Her2/neu表达阴性肿瘤；MDA231、HBT-77为Her2/neu表达阳性肿瘤。

图10重组慢病毒转导NK细胞后，利用流式细胞仪检测GFP在NK细胞的荧光强度，流式检测结果显示启动子的表达活性MSCV>PGK>UBC。

具体实施方式

下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,DavidW.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3^rd edition,2001,NY,ColdSpring Harbor)。所用引物及DNA序列均由Invitrogen公司合成。

本发明实施例所使用的质粒LVV的图谱如图1所示；所使用的质粒pLenti6/V5-D-TOPO、pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP、293FT细胞为市售商品，所使用的试剂均为市售商品。

本发明实施例提供了一种启动子优化的慢病毒表达体系，具体实施方式：

实施例1：慢病毒表达体系启动子的优化

1)重组慢病毒的包装及滴度测定

培养293FT细胞，转染前一天，以含10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度后，按照每15cm细胞培养皿接种25×10⁶个293FT细胞到细胞培养皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，16h～24h后待细胞密度生长到80％～90％时即可用于转染。转染当天更换培养基为不含抗生素(P/S)的完全培养基(DMEM+10％FBS)。分别将LVV-MSCV-GFP，LVV-CMV-GFP，LVV-EF1a-GFP，LVV-PGK-GFP，LVV-UBC-GFP慢病毒骨架与另外三种包装质粒一起共转染293FT细胞，以Lipofectamine 2000(Invitrogen)为媒介。培养6h后弃去培养基，用PBS洗3次后更换为20ml新鲜的完全培养基换液(DMEM+10％FBS+P/S)。收集随后30-48h的培养上清，6000rpm离心10min，弃去细胞碎片，上清液以0.45μm PVDF滤器过滤至50ml圆底离心管中，4℃，50000g高速离心2h，小心弃去上清，DMEM(不含血清、双抗)重悬病毒沉淀，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5mlEP管中，-80℃冰箱保存，用于感染T及NK细胞。Lentivirus-Associated p24ELISA Kit检测病毒的滴度为5×10⁷-1.5×10⁸IFU，具体步骤参见Lentivirus-Associated p24ELISA Kit的说明书。

2)5种启动子在PBMC中启动活性的比较

从健康人外周血分离PBL，用CD3/CD28磁珠刺激T细胞生长3天，检测CD8+/CD4+比例，使CD8+细胞达80％以上，将所制备的5种慢病毒及阴性对照与T细胞共培养3天，并在IL-2(100IU/ml)的培养基中维持培养。重组慢病毒转导T细胞后利用流式细胞仪检测GFP在T细胞的荧光强度。流式检测结果显示启动子的表达活性MSCV>PGK>UBC(图2)。

实施例2：采用分子生物学的技术方法将携带特异性识别人黑色素瘤相关抗原gp100(154-162)的鼠源TCRα和β链基因的重组慢病毒载体转染外周血自体淋巴细胞，使重组TCR表达在T淋巴细胞中以达到高效杀伤肿瘤的目的。利用已优化启动子的慢病毒载体构建含自我剪切2A肽、弗林蛋白酶(Furin)及间隔序列(序列见附表)的TCR表达载体。

1)优化构建表达TCR两条链的2A肽、弗林蛋白酶及间隔序列

为了在同一表达载体中实现TCRα和β链基因的共表达，本发明采用在TCRα和β链之间添加具有自剪切功能的2A肽，所采用的2A肽可以为F2A(foot-and-mouth disease virus)，E2A(equine Rhinitis A virus)，P2A(porcine teschovirus-1)，T2A(Thosea asigna virus)等。由2A肽连接表达TCRα和β链基因已有报道，但是其氨基酸残基对于TCR功能的影响还未得到充分的研究。为了获得更多的接近天然TCR的两条链，本发明在2A肽的前段设计了弗林蛋白酶识别位(R-A-K-R)。在慢病毒表达载体中，间隔序列(GSG或SGSG等)可以促进Furin酶的剪切及2A肽在蛋白合成中的转换，最大化地实现TCR两条链的合成。因此本发明最终开发了一种新型的双顺反子慢病毒载体，可以高效表达两种蛋白组分，并充分结合了弗林蛋白酶切割位点，以及一个氨基酸间隔后2A转换肽等(图3)。

2)TCRα和β链基因在T淋巴细胞中的表达及抗肿瘤活性的研究

为了检测所优化的载体，本发明用抗gp100的TCR载体转导从肿瘤瘤患者体内所分离的PBL,并分析这些工程细胞的抗肿瘤活性。

a)肿瘤患者PBL的分离，按常规密度梯度离心方法实现。

b)T细胞培养及刺激活化，用CD3/CD28磁珠刺激T细胞生长3天，检测CD8+/CD4+比例，并在IL-2的培养基中维持培养。

c)重组慢病毒转导T细胞，用CD3/CD28磁珠刺激T细胞24小时后，把一定量的病毒加到T细胞中，每个T细胞按3个慢病毒的转导比例，32度离心2小时，离心后的细胞放回37度CO2培养箱；3天后，利用流式细胞仪检测TCR在T细胞表面的表达。

d)体外检测基因修饰细胞对肿瘤细胞的杀伤实验：铬同位素标记肿瘤细胞，4小时后，利用gamma技术器测定铬同位素释放，同时测定细胞因子(IL-2和IFN-γ)释放。

3)TCRα和β链基因在CD4、CD8T淋巴细胞中的表达及抗肿瘤活性的研究。

a)利用Myltenyi的磁珠技术从肿瘤患者的PBL中分离CD4及CD8T淋巴细胞。

b)MSCV启动子优化的慢病毒分别转导CD4及CD8T淋巴细胞，转导方法同上。利用流式细胞仪检测TCR在CD4及CD8T淋巴细胞中的表达(图4)。

c)体外检测对肿瘤细胞的杀伤实验：铬同位素标记肿瘤细胞，把标记的肿瘤细胞与TCR基因修饰的T细胞共培养，4小时后，利用gamma技术器测定铬同位素释放，同时测定细胞因子(IL-2和IFN-γ)的水平(图5)。

d)铬法检测重组慢病毒TCR感染的PBL对黑色素瘤细胞存活率的影响(图6)。

(1)将各组肿瘤细胞(624,526,888,938)浓度调节至l×10⁵，接种于96孔培养板，100μL/孔。

(2)效应细胞分组：a.PBMC对照组；b.经刺激PBMC对照组；c.TCR基因转染组。

(3)效靶比分组：效靶比分别为3:1；6:1；12:1；25:1；50:1。并设淋巴细胞对照组(只加入淋巴细胞)、靶细胞对照组(只加入靶细胞)、最大裂解组各组设5复孔。

(4)效应细胞与靶细胞共培养，既37℃孵育4小时。

(5)弃去上清，加入适量10％SDS，利用细胞收集器收集细胞，应用同位素测定仪检测同位素的活性。

(6)按照以下公式计算各组T细胞肿瘤杀伤活性：肿瘤细胞杀伤百分比＝(实验组-淋巴细胞对照组)/(最大裂解组-靶细胞对照组)X100％。

实施例3：利用包装嵌合型抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的MSCV慢病毒载体，可以基因修饰T及NK细胞表达单链抗体，通过其对肿瘤细胞表面抗原的特异性识别，并通过细胞内CD3zeta和41-BB双激活T及NK细胞，既能延长细胞存活时间，又能增强其清除肿瘤的能力，在体内外对多种肿瘤进行有效杀伤。本发明通过anti-Her2/neu单链抗体构建CAR载体，通过MSCV优化的慢病毒体系基因修饰人T及NK细胞，并使它们获得特异性杀伤肿瘤的能力(图7、8、9)。在体外的细胞杀伤试验中，CAR工程化的淋巴细胞可以明显地提高T细胞对HLA-A2+相对应的肿瘤细胞的识别，并释放T细胞活化的标志因子IFN-γ。

1)利用MSCV启动子构建新的慢病毒嵌合型抗原受体(CAR)载体

a)创建抗体的CAR载体及制备慢病毒，详细方法如上所述。

2)研究基因工程T细胞及其体外抑瘤作用

a)获取人T细胞：从健康人外周血分离PBMC，用可溶性抗-CD3抗体刺激T细胞，第2天转导T细胞,方法同上。

b)CAR基因修饰T细胞：CAR慢病毒与T细胞培养3天，利用流式细胞仪检测TCR抗体在T细胞上的表达，并在IL-2的培养基中维持培养。

c)CAR基因修饰的T细胞对表达相对应抗原的肿瘤细胞的特异性识别。CEM、MDA468为Her2/neu表达阴性肿瘤；MDA231、HBT-77为Her2/neu表达阳性肿瘤细胞。经基因修饰的T细胞可以特异性识别表达Her2/neu的肿瘤细胞--MDA231及HBT-77,特异性释放T细胞活化的标志因子IFN-γ。

d)MSCV优化的慢病毒体系可以有效地基因修饰NK细胞，并较其它启动子具有高效表达的特性。PBMC经NK细胞的扩增方法扩增2周后，NK细胞的比例可达95％以上。利用上述方法制备的包涵GFP的MSCV慢病毒载体基因修饰NK细胞，3天后，利用流式细胞仪检测CAR在NK细胞的表达水平，MSCV优化的启动子较其它的启动子具有高效表达的特性，详见图10。

Claims (9)

1.一种启动子优化的慢病毒载体，其特征在于：采用MSCV启动子。

2.根据权利要求书1所述的在重组慢病毒载体的多克隆位点顺序插入TCRα、furin、间隔序列(SGSG)、2A肽、TCRβ序列。

3.根据权利要求书1所述在重组慢病毒载体的多克隆位点插入嵌合抗原受体序列。

4.根据权利要求书1、2、3所述的重组慢病毒载体所述的启动子序列如SeqID NO.1，Seq ID NO.2，Seq ID NO.3所示。

5.根据权利要求书2所述的Furin、间隔序列、2A肽序列如Seq ID NO.4，Seq ID NO.5，Seq ID NO.6所示。

6.一种重组慢病毒，其特征在于权利1至5任一所述重组慢病毒载体与慢病毒辅助包装质粒共转染宿主细胞得到的包装体。

7.根据权利要求书6所述的重组慢病毒，所述宿主细胞为293FT。

8.转染有权利要求6或7所述的重组慢病毒的基因修饰免疫细胞，包括NK细胞，T细胞等。

9.根据权利要求8所述的免疫细胞，来源于骨髓，外周血，组织等。