CN109415687A - 嵌合抗原受体t细胞组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于过继免疫效应细胞疗法的改进组合物以治疗、预防或改善包含但不限于以下的多种病症：传染病、自身免疫性疾病、炎症性疾病和免疫缺陷。

Description

嵌合抗原受体T细胞组合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年4月14日提交的美国临时申请号62/322,547以及于2016年4月7日提交的62/319,703的权益，所述美国临时申请中的每一个通过引用以其全部内容并入本文。
关于序列表的陈述
与本申请相关联的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用结合到本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是BLBD_067_02WO_ST25.txt。所述文本文件为61KB，于2017年4月7日创建并且在提交本说明书的同时通过EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本发明涉及用于过继细胞疗法的经改进的免疫效应细胞组合物。更具体地，本发明涉及经改进的嵌合抗原受体(CAR)T细胞组合物及其制造和使用方法。
背景技术
全球癌症负担在1975年与2000年之间翻了一番。癌症是全球范围内发病率和死亡率的第二主要起因，2012年就有约1410万新增病例和820万癌症相关死亡人数。最常见的癌症是乳腺癌、肺和支气管癌、前列腺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、皮肤黑色索瘤、非霍奇金淋巴瘤、甲状腺癌、肾和肾盂癌、子宫内膜癌、白血病以及胰腺癌。预计在接下来的二十年内新增癌症病例的数目将上升到2200万。
在早期临床试验中已经对基于T细胞分离、修饰、扩增和再输注的过继细胞免疫疗法策略进行了探索和测试。具体地，基于表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)的策略由于其选择性识别和强大的效应机理而正快速成为用于癌症免疫疗法的精选效应细胞。
然而，已经显示，当前治疗的成功率喜忧参半，仅少数患者经历持久缓解，从而突显出基于CAR T细胞的免疫疗法的迄今未实现的潜力。
发明内容
本发明总体上部分涉及经改进的免疫效应细胞组合物及其制造方法。在具体实施例中设想的免疫效应细胞包括嵌合抗原受体(CAR)和一个或多个T细胞受体基因座中导致TCR表达和信号传导破坏的精确破坏或修饰。令人惊讶的是，诸位发明人已经发现，包括一个或多个经修饰T细胞受体α(TCRα)等位基因的CAR T细胞分泌增加量的溶细胞细胞因子并且比缺少经修饰TCRα等位基因的CAR T细胞更具治疗疗效。
在各个实施例中，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)T细胞，其包括一个或多个经修饰的T细胞受体α(TCRα)等位基因，其中所述CAR T细胞在结合到靶抗原时相比于结合到所述靶抗原的缺少一个或多个经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的促炎性细胞因子。
在具体实施例中，所述CAR包括结合选自由以下组成的组的靶抗原的细胞外结构域：BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1和TAG72。
在某些实施例中，所述CAR包括从选自由以下组成的组的多肽中分离的跨膜结构域：所述T细胞受体的α或β链、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD-1。
在具体实施例中，所述CAR包括从选自由以下组成的组的多肽中分离的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM和ZAP70。
在另外的实施例中，所述CAR包括从选自由以下组成的组的多肽中分离的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
在一些实施例中，所述CAR包括从选自由以下组成的组的铰链区多肽：CD8α的铰链区、PD1的铰链区和CD152的铰链区。
在某些实施例中，所述CAR包括一个或多个接头多肽。
在具体实施例中，所述CAR包括间隔区多肽，所述间隔区多肽包括IgG1、IgG4或IgD的CH2区和CH3区。
在额外的实施例中，所述CAR包括从选自由以下组成的组的信号肽：IgG1重链信号多肽、CD8α信号多肽以及人类GM-CSF受体α信号多肽。
在具体实施例中，所述一个或多个经修饰的TCRα等位基因是非功能性的或者具有显著减少的功能。
在另外的实施例中，所述CAR T细胞包括一个或多个前病毒整合体，所述前病毒整合体包括对所述CAR进行编码的核酸。
在某些实施例中，所述CAR T细胞包括多核苷酸，所述多核苷酸包括可操作地连接到对所述CAR进行编码的核酸的启动子，其中所述多核苷酸已经通过同源定向修复插入到所述一个或多个TCRα等位基因中。
在额外的实施例中，所述一个或多个促炎性细胞因子选自由以下组成的组：IFNγ、IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α。
在各个实施例中，提供了一种CAR T细胞，其包括：一个或多个经修饰的TCRα等位基因；以及对结合靶抗原的CAR进行编码的核酸，其中所述CAR T细胞在与表达所述靶抗原的靶细胞接触时相比于结合到所述靶抗原的缺少一个或多个经修饰的TCRα等位基因的CART细胞分泌增加量的一个或多个促炎性细胞因子。
在各个实施例中，提供了一种CAR T细胞，其包括：一个或多个经修饰的TCRα等位基因；以及一个或多个前病毒整合体，所述前病毒整合体包括对结合靶抗原的CAR进行编码的核酸，其中所述CAR T细胞在结合到靶抗原时相比于结合到所述靶抗原的缺少一个或多个经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的一个或多个促炎性细胞因子。
在各个实施例中，提供了一种CAR T细胞，其包括：一个或多个经修饰的TCRα等位基因，其中包括对结合靶抗原的CAR进行编码的核酸的供体修复模板通过同源定向修复插入到所述一个或多个TCRα等位基因中，并且其中所述CAR T细胞在结合到靶抗原时相比于结合到所述靶抗原的缺少一个或多个经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的一个或多个促炎性细胞因子。
在某些实施例中，所述核酸进一步包括可操作地连接到对所述CAR进行编码的所述多核苷酸的RNA聚合酶II启动子。
在一些实施例中，所述RNA聚合酶II启动子选自由以下组成的组：短EF1α启动子、长EF1α启动子、人类ROSA 26基因座、泛素C(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增殖性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失的d1587rev引物结合位点取代的(MND)启动子。
在具体实施例中，所述CAR包括结合选自由以下组成的组的抗原的细胞外结构域：BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1和TAG72。
在一些实施例中，所述CAR进一步包括跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。
在另外的实施例中，所述CAR包括抗跨膜结构域、共刺激结构域以及初级信号传导结构域。
在具体实施例中，所述CAR进一步包括信号肽、一个或多个接头肽以及一个或多个铰链肽以及任选地一个或多个间隔肽。
在额外的实施例中，所述CAR包括抗BCMA scFv、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在某些实施例中，所述CAR包括抗CD19 scFv、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在一些实施例中，所述CAR包括抗CSPG4 scFv、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在具体实施例中，所述CAR包括抗ROR1 scFv、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在另外的实施例中，所述CAR包括抗PSCA scFv、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在具体实施例中，所述CAR包括抗TAG72 scFv、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在额外的实施例中，所述一个或多个促炎性细胞因子选自由以下组成的组：IFNγ、IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α。
在各个实施例中，提供了一种组合物，其包括本文设想的CAR T细胞。
在各个实施例中，提供了一种组合物，其包括本文设想的CAR T细胞和生理学上可接受的赋形剂。
在各个实施例中，提供了一种制造CAR T细胞的方法，其包括：在TCRα等位基因中的靶位点处工程化双链断裂，其中所述断裂通过非同源性末端接合(NHEJ)修复，由此产生经修饰的TCRα等位基因；以及使用对CAR进行编码的病毒载体转导所述T细胞；其中所述CART细胞在结合到靶抗原时相比于结合到所述靶抗原的缺少经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的一个或多个促炎性细胞因子。
在某些实施例中，所述经修饰的TCRα等位基因是非功能性的或具有显著减少的功能。
在具体实施例中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。
在一些实施例中，所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。
在各个实施例中，提供了一种制造CAR T细胞的方法，其包括：在TCRα等位基因中的靶位点处工程化双链断裂；以及使用包括供体修复模板的病毒载体转导所述T细胞，所述供体修复模板包括可操作地连接到对CAR进行编码的核酸的RNA聚合酶II启动子；其中所述供体修复模板在所述双链断裂(DSB)的所述位点处通过同源定向修复结合到所述TCRα等位基因中；并且其中所述CAR T细胞在结合到靶抗原时相比于结合到所述靶抗原的缺少经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的一个或多个促炎性细胞因子。
在某些实施例中，所述供体修复模板包括与所述DSB的5′处的TCRα序列同源的5′同源臂；以及与所述DSB的3′处的TCRα序列同源的3′同源臂。
在额外的实施例中，所述病毒载体是重组腺相关病毒载体(rAAV)或逆转录病毒。
在具体实施例中，所述rAAV具有来自AAV2的一个或多个ITR。
在具体实施例中，所述rAAV具有选自由以下组成的组的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV10。
在另外的实施例中，所述逆转录病毒是慢病毒。
在一些实施例中，所述慢病毒是整合酶缺陷型慢病毒。
在具体实施例中，所述双链断裂是使用工程化核酸酶来产生的。
在某些实施例中，所述工程化核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN或CRISPR/Cas核酸酶。
在某些实施例中，所述大范围核酸酶是由I-OnuI LHE工程化而来的。
在一些实施例中，所述工程化核酸酶是包括TALE DNA结合结构域和工程化的大范围核酸酶的megaTAL。
在另外的实施例中，所述双链断裂是通过工程化核酸内切酶和末端加工酶产生的。
在具体实施例中，对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA和对所述末端加工酶进行编码的mRNA被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
在额外的实施例中，对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA、病毒自切割肽和末端加工酶被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
在具体实施例中，对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA、IRES元件和末端加工酶被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
在另外的实施例中，融合到末端加工酶或其具有生物活性的片段的、对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
在某些实施例中，所述末端加工酶展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性。
在具体实施例中，所述末端加工酶包括Trex2或其具有生物活性的片段。
在一些实施例中，所述一个或多个促炎性细胞因子选自由以下组成的组：IFNγ、IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α。
在各个实施例中，提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，其包括：对所述受试者施用本文设想的CAR T细胞或组合物。
在额外的实施例中，施用给所述受试者的包括经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞的治疗有效量小于施用给所述受试者的缺少经修饰的TCRα的CAR T细胞的所述治疗有效量以清除所述肿瘤。
在另外的实施例中，所述癌症是实体癌。
在某些实施例中，所述癌症是液体癌。
在具体实施例中，所述液体癌是选自由以下组成的组的血液恶性肿瘤：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病、毛细胞白血病(HCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性粒细胞白血病(CML)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)和真性红细胞增多症、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、塞扎里氏综合征(Sézary syndrome)、前体T淋巴母细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、明显多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨的孤立性浆细胞瘤以及髓外浆细胞瘤。
在额外的实施例中，所述血液恶性肿瘤是多发性骨髓瘤。
在某些实施例中，所述血液恶性肿瘤是CLL。
在各个实施例中，提供了一种治疗有需要的受试者中的B细胞相关病症的方法，其包括：对所述受试者施用治疗有效量的本文设想的CAR T细胞或者对所述受试者施用治疗有效量的本文设想的组合物。
在具体实施例中，所述B细胞相关病症是多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、恶性可能性不确定的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴增殖性障碍、免疫调节障碍、类风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征、恰加斯氏病(Chagas′disease)、格雷夫氏病(Grave′s disease)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)、结节性多动脉炎、舍格伦综合征(Sjogren′s syndrome)、寻常性天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、抗磷脂综合征、ANCA相关血管炎、古德帕斯丘氏病(Goodpasture′sdisease)、川崎氏病(Kawasaki disease)、自身免疫性溶血性贫血和急进性肾小球肾炎、重链疾病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性或显著性未确定的单克隆性丙种球蛋白病。
在某些实施例中，所述B细胞相关病症是B细胞恶性肿瘤。
在具体实施例中，所述B细胞相关病症是浆细胞恶性肿瘤。
在一些实施例中，所述B细胞相关病症是自身免疫性疾病。
在各个实施例中，提供了一种增加CAR T细胞的疗效的方法，其包括：通过引入工程化核酸酶降低CAR T细胞表面上的TCRα信号传导组分的可用性，所述工程化核酸酶在TCRα等位基因中的靶位点处产生双链断裂(DSB)以修饰所述TCRα等位基因。
在额外的实施例中，所述CAR T细胞包括对所述CAR进行编码的一个或多个前病毒整合体，并且其中所述DSB通过非同源性末端接合(NHEJ)修复。
在另外的实施例中，所述CAR T细胞包括RNA聚合酶II启动子，所述RNA聚合酶II启动子可操作地连接到对通过在所述DSB处进行的同源定向修复而结合到所述TCRα等位基因中的CAR进行编码的核酸。
在一些实施例中，所述工程化核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN或CRISPR/Cas核酸酶。
在具体实施例中，所述大范围核酸酶是由I-OnuI LHE工程化而来的。
在另外的实施例中，所述工程化核酸酶是包括TALE DNA结合结构域和工程化的大范围核酸酶的megaTAL。
在某些实施例中，所述双链断裂是通过工程化核酸内切酶和末端加工酶产生的。
在具体实施例中，对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA和对所述末端加工酶进行编码的mRNA被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
在一些实施例中，对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA、病毒自切割肽和末端加工酶被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
在某些实施例中，对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA、IRES元件和末端加工酶被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
在具体实施例中，融合到末端加工酶或其具有生物活性的片段的、对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。在额外的实施例中，所述末端加工酶展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性。
在另外的实施例中，所述末端加工酶包括Trex2或其具有生物活性的片段。
在具体实施例中，结合到靶抗原的所述CAR T细胞相比于结合到所述靶抗原的缺少经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的选自由以下组成的组的一个或多个促炎性细胞因子：IFNγ、IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α。
附图说明
图1示出了在大规模和小规模情况下使用标准培养过程培养的抗BCMA CAR T细胞(无EP)、被电穿孔但未接收mRNA的细胞(仅EP)以及使用对靶向TCRα基因的megaTAL进行编码的mRNA进行电穿孔的细胞(TCRαKO)的两个代表性供体在第10天的VCN。
图2示出了在大规模和小规模情况下使用标准培养过程培养的抗BCMA CAR T细胞(无EP)、被电穿孔但未接收mRNA的细胞(仅EP)以及使用对靶向TCRα基因的megaTAL进行编码的mRNA进行电穿孔的细胞(TCRαKO)在10天内的代表性生长曲线。
图3示出了用于抗BCMA CAR表达和TCRα破坏的两个供体的代表性FACS图。通过使用缀合到PE荧光团的BCMA抗原将细胞染色来确定抗BCMA CAR表达。通过抗CD3染色确定TCRα破坏。
图4示出了图3中所示的FACS数据的图形表示。
图5A示出了使用标准培养过程培养的抗BCMA CAR T细胞(无EP)、被电穿孔但未接收mRNA的细胞(仅EP)以及使用对靶向TCRα基因的megaTAL进行编码的mRNA进行电穿孔的在存在BCMA阳性和BCMA阴性细胞系的情况下培养的细胞(TCRαKO)的抗原依赖性IFNγ释放的代表性数据。
图5B示出了使用标准培养过程培养的抗BCMA CAR T细胞(无EP)和使用对靶向TCRα基因+/-Trex2的megaTAL进行编码的mRNA进行电穿孔的在存在BCMA阳性和BCMA阴性细胞系的情况下培养的细胞(TCRαKO)的IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α的抗原依赖性释放的代表性数据。
图6A示出了在Daudi异种移植模型中使用标准过程(无EP)、仅EP和TCRαKO处理制造的抗BCMA CAR T细胞一直到第27天的体内疗效。
图6B示出了在Daudi异种移植模型中使用标准过程(无EP)、仅EP和TCRαKO处理制造的抗BCMA CAR T细胞一直到第43天的体内疗效。
图7示出了使用对抗CD19 CAR进行编码的慢病毒转导的T细胞(LV-T细胞)和其中已经使用同源定向修复将抗CD19 CAR插入到TCRα基因中的T细胞(HR-T细胞)的抗CD19 CAR表达的代表性FACS图。
图8A示出了由两个供体制备的抗CD19 CAR T细胞(LV-T细胞)和抗CD19 CAR T细胞(LV-T细胞)在以1∶1的E∶T比例与表达Nalm-6细胞的CD19的共培养测定中的体外细胞毒性。
图8B示出了未转导的对照T细胞和由两个供体制备的抗CD19 CAR T细胞(LV-T细胞)和抗CD19 CAR T细胞(LV-T细胞)在以1∶1的E∶T比例与表达Nalm-6细胞的CD19共培养24小时之后的抗原依赖性IFNγ释放的代表性数据。
图9示出了使用对抗CD19 CAR进行编码的慢病毒转导的T细胞和其中已经使用同源定向修复将抗CD19 CAR插入到TCRα基因中的T细胞的抗CD19 CAR表达的代表性FACS图。
图10A示出了由两个供体制备的抗CD19 CAR T细胞(LV-T细胞)和抗CD19 CAR T细胞(LV-T细胞)在以1∶1的E∶T比例与表达Nalm-6细胞的CD19的共培养测定中的体外细胞毒性。
图10B示出了由两个供体制备的抗CD19 CAR T细胞(LV-T细胞)和抗CD19 CAR T细胞(LV-T细胞)在以1∶1的E∶T比例与表达Nalm-6细胞的CD19共培养24小时之后的抗原依赖性IFNγ、IL-2、IL-4和TNFα释放的代表性数据。
图11A示出了通过慢病毒转导(LV-CAR T细胞)或通过同源重组(HR-CAR T细胞)产生的在存在表达Nalm-6的CD19细胞的情况下培养24小时的抗CD19 CAR T细胞的T细胞耗竭标记物的表达。
图11B示出了通过慢病毒转导(LV-CAR T细胞)或通过同源重组(HR-CAR T细胞)产生的在存在表达Nalm-6的CD19细胞的情况下培养72小时的抗CD19 CAR T细胞的T细胞耗竭标记物的表达。
序列标识简要说明
SEQ ID NO：1阐述了I-OnuI的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：2阐述了通过SEQ ID NO：1编码的多肽序列。
SEQ ID NO：3和4阐述了用于基因组编辑的TCRα靶位点的说明性实例。
SEQ ID NO：5到7阐述了工程化的I-OnuI变体的多肽序列。
SEQ ID NO：8阐述了抗CD19 CAR的多肽序列。
SEQ ID NO：9阐述了质粒pBW1021的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：10阐述了TCRαI-OnuI megaTAL靶位点。
SEQ ID NO：11阐述了TCRαI-OnuI megaTAL的说明性实例的多肽序列。
SEQ ID NO：12阐述了抗BCMA CAR的说明性实例的多肽序列。
SEQ ID NO：13阐述了质粒pBW400的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：14到24阐述了各种接头的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25到49阐述了蛋白酶切割位点和自切割多肽切割位点的氨基酸序列。
具体实施方式
A.概述
本发明总体上部分涉及经改进的免疫效应细胞组合物及其制造方法。在具体实施例中设想的免疫效应细胞包括嵌合抗原受体(CAR)和一个或多个T细胞受体基因座中导致TCR表达和信号传导破坏的精确破坏或修饰。令人惊讶的是，诸位发明人已经发现，通过本文设想的方法制造的包括一个或多个经修饰的TCRα等位基因的经基因组编辑的CAR T细胞具有增加的治疗疗效，例如，促炎性细胞因子和其它分子的增加的抗原依赖性分泌，所述促炎性细胞因子例如IFNγ、TNFα、IL-2，所述其它分子包含增加CAR T细胞对肿瘤细胞的溶细胞活性的细胞毒素，例如，穿孔素、粒酶A、粒酶B。
在各个实施例中，CAR T细胞包括对T细胞受体α(TCRα)基因的一个或多个等位基因的修饰。在具体实施例中，对一个或多个TCRα等位基因的修饰消除或基本上消除一个或多个TCRα等位基因的表达，减少一个或多个TCRα等位基因的表达和/或损害、基本上损害或消除一个或多个TCRα等位基因的一个或多个功能或使一个或多个TCRα等位基因无功能。在具体实施例中，TCRα功能包含但不限于：将CD3募集到细胞表面、抗原的MHC依赖性识别和结合、TCRαβ信号传导的激活。
在于细胞的TCRα基因中产生DNA断裂的各个实施例中，经切割的基因组序列末端的NHEJ可以导致具有正常TCR表达的细胞、功能丧失或功能获得性TCR的表达或优选地缺乏功能性TCR表达的细胞，例如，缺乏将CD3募集到细胞表面、激活TCRαβ信号传导、识别和结合MHC-抗原络合物的能力。在一个优选实施例中，通过使用工程化核酸内切酶和末端加工酶例如3′-5′核酸外切酶(Trex2)或其具有生物活性的片段来使修复偏向于NHEJ和功能丧失。
在提供了用于修复经切割的TCRα基因组序列的供体模板的各个其它实施例中，通过在DNA断裂位点处的同源重组使用模板的序列修复TCRα等位基因。在优选实施例中，修复模板包括对CAR进行编码的多核苷酸序列。
因此，相比于现有的过继细胞疗法，本文设想的方法和组合物表示重大改进。
除非特别相反地指出，否则具体实施例的实践将采用本领域技术范围内的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，出于说明的目的，以下描述所述方法中的许多方法。这种技术在文献中得到充分解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)》(第3版，2001年)；Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(第2版，1989年)；Maniatis等人，《分子克隆：实验室手册》(1982年)；Ausubel等人，《当代分子生物学实验手册(Current Protocols in Molecular Biology)》(约翰威利父子公司(John Wiley andSons)，2008年七月更新)；《精编分子生物学实验指南：当代分子生物学实验手册的方法概要(Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology)》，格林出版协会和威利跨学科出版社(GreenePub.Associates and Wiley-Interscience)；Glover，《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning：APractical Approach)》第I卷和第II卷(IRL出版社(IRL Press)，牛津，1985年)；Anand，《复杂基因组分析技术(Techniques for the Analysis of Complex Genomes)》，(学术出版社(Academic Press)，纽约，1992年)；《转录和翻译(Transcription and Translation)》(编辑：B.Hames和S.Higgins，1984年)；Perbal，《分子克隆的实用指南(A Practical Guide toMolecular Cloning)》(1984年)；Harlow和Lane，《抗体(Antibodies)》(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港，1998年)、《当代免疫学指南(Current Protocols in Immunology)》(编辑：Q.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach和W.Strober，1991年)；《免疫学年度评论(Annual Review ofImmunology)》；以及如《免疫学进展(Advances in Immunology)》等期刊中的专著。
B.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管类似于或等效于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料可以用于实践或测试具体实施例，但本文描述了组合物、方法和材料的优选实施例。出于本公开的目的，以下术语定义如下。
本文使用的冠词“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种，或一个/种或多个/种)所述冠词的语法宾语。举例来说，“元件”意指一个元件或者一个或多个元件。
对可替代(例如，“或”)的使用应当被理解为意指替代方案中的一种、两种或其任何组合。
术语“和/或”应被理解为意指替代方案中的一种或两种。
如本文所使用的，术语“约(about或approximately)”是指与参考量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比，变化幅度高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”是指参考量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的约±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
在一个实施例中，范围例如1到5、约1到5或约1到约5是指所述范围所涵盖的每个数值。例如，在一个非限制性且仅仅是说明性的实施例中，范围“1到5”相当于表达1、2、3、4、5；或1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0；或1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或元件或步骤或元件组，但不排除任何其它步骤或元件或步骤或元件组。“由...组成”意指包含但不限于，无论在短语“由...组成”之后是什么。因此，短语“由...组成”表示所列元件是必需的或强制性的，并且可以不存在其它元件。“基本上由...组成”意指包含在所述短语后列出的任何元件，并且限于不干扰或促进在本公开中针对所列元件指定的活动或动作的其它元件。因此，短语“基本上由...组成”表示所列元件是必需的或强制性的，但不存在对所列元件的活动或动作产生重大影响其它元件。
贯穿本说明书对“一个实施例”、“实施例”、“具体实施例”、“相关实施例”、“某个实施例”、“额外的实施例”或“另外的实施例”或其组合的引用意味着结合所述实施例描述的特定特征、结构或特性包含在至少一个实施例中。因此，上述短语在贯穿本说明书的各个地方的出现不必全部指代同一个实施例。此外，在一个或多个实施例中，可以以任何适当的方式组合特定特征、结构或特性。还应理解，在一个实施例中对特征的肯定叙述充当在特定实施例中排除所述特征的基础。
“免疫效应细胞”是免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导ADCC和/或CDC)的任何细胞。在具体实施例中设想的说明性免疫效应细胞是T淋巴细胞，具体地是细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、TIL和辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)。在一个实施例中，免疫效应细胞包含自然杀伤(NK)细胞。在一个实施例中，免疫效应细胞包含自然杀伤T(NKT)细胞。在优选实施例中，免疫效应细胞是CAR T细胞。
术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的并且旨在包含胸腺细胞、初始T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th)细胞，例如T辅助1(Th1)细胞或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)、CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、肿瘤浸润细胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或任何其它T细胞亚群。在一个实施例中，T细胞是NKT细胞。适合于在具体实施例中使用的其它说明性T细胞群包含初始T细胞和记忆T细胞。在优选实施例中，T细胞被修饰以表达CAR。
“潜能T细胞(potent T cell)”和“年轻T细胞(young T cell)”在具体实施例中可互换地使用，并且指其中T细胞能够增殖并实现伴随的分化减少的T细胞表型。在具体实施例中，年轻T细胞具有“初始T细胞”的表型。在具体实施例中，年轻T细胞包括以下生物标记物中的一个或多个或全部：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197和CD38。在一个实施例中，年轻T细胞包括以下生物标记物中的一个或多个或全部：CD62L、CD127、CD197和CD38。在一个实施例中，年轻T细胞缺乏CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3和LAG3的表达。
如本文所使用的，术语“增殖”是指细胞分裂(细胞的对称或不对称分裂)的增加。在具体实施例中，“增殖”是指T细胞的对称或不对称分裂。“增殖增加”在以下情况下发生：与未处理的样本中的细胞相比，经处理的样本中的细胞数目增加。
如本文所使用的，术语“分化”是指降低细胞的潜能或增殖或将细胞移动到更具发育限制状态的方法。在具体实施例中，分化的T细胞获得免疫效应细胞功能。
如本文所使用的，术语“T细胞制造”或“制造T细胞的方法”或类似术语是指产生T细胞治疗组合物的过程，所述制造方法可以包括以下步骤中的一个或多个或全部：收集、刺激、活化、基因组编辑和扩增。
术语“离体”通常是指在有机体外部发生的活动，如在生物体外部的人工环境中的活组织中或上进行的实验或测量，优选地具有最小的自然条件改变。在具体实施例中，“离体”程序涉及从生物体取得并在实验室设备中通常在无菌条件下并且通常在几小时或高达约24小时但包含高达48小时或72小时(视情况而定)内培养或调节的活细胞或活组织。在某些实施例中，可以收集和冷冻这种组织或细胞，并且稍后将其解冻用于离体治疗。使用活细胞或活组织进行的持续时间超过几天的组织培养实验或程序通常被认为是“体外”，但在某些实施例中，此术语可以与离体可互换地使用。
术语“体内”通常是指在生物体内部发生的活动，如细胞自我更新和细胞增殖或扩增。在一个实施例中，术语“体内扩增”是指细胞群增加体内数目的能力。在一个实施例中，细胞在体内被工程化或修饰。
术语“刺激”是指通过以下诱导的初次应答：刺激分子(例如，TCR/CD3络合物)与其同源配体结合由此介导信号转导事件，包含但不限于通过TCR/CD3络合物进行的信号转导。
“刺激分子”是指T细胞上与同源刺激配体特异性结合的分子。
如本文所使用的，“刺激配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上时可以与T细胞上的同源结合配偶体(本文中被称为“刺激分子”)特异性结合由此介导T细胞的初次应答，包含但不限于活化、免疫应答的启动、增殖等的配体。刺激配体包含但不限于CD3配体，例如，抗CD3抗体；和CD2配体，例如，抗CD2抗体；以及肽，例如，CMV、HPV、EBV肽。
术语“活化”是指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。在具体实施例中，活化还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关联。除了其它之外，术语“活化的T细胞”是指正增殖的T细胞。仅通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要一种或多种次级或共刺激信号。因此，T细胞活化包括通过TCR/CD3络合物进行的初级刺激信号以及一个或多个次级共刺激信号。共刺激可以通过已经接收初级活化信号如通过CD3/TCR络合物或通过CD2进行的刺激的T细胞进行的增殖和/或细胞因子产生来证明。
“共刺激信号”是指与如TCR/CD3连接等初级信号组合导致T细胞增殖、细胞因子产生和/或特定分子(例如，CD28)的上调或下调的信号。
“共刺激配体”是指结合共刺激分子的分子。共刺激配体可以是可溶的或在表面上提供。“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体(例如，抗CD28抗体)特异性结合的同源结合配偶体。
如本文所使用的，“自体的”是指其中供体和接受者是同一受试者的细胞。
如本文所使用的，“同种异体的”是指其中供体和接受者物种相同的细胞，但细胞在基因上不同。
如本文所使用的，“同基因的”是指其中供体和接受者物种相同，供体和接受者是不同个体，并且供体细胞和接受者细胞在基因上完全相同的细胞。
如本文所使用的，“异种的”是指其中供体和接受者物种不同的细胞。
如本文所使用的，术语“个体”和“受试者”通常可以互换地使用，并且是指展现出可以使用基因疗法载体、基于细胞的治疗剂和本文其它地方设想的方法治疗的癌症或其它免疫失调的症状的任何动物。适当的受试者(例如，患者)包含实验室动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物以及家畜或宠物(如猫或狗)。包含非人类灵长类动物以及优选地人类患者。典型的受试者包含患有、已经被诊断为患有或有风险患有癌症或另一种免疫失调的人类患者。
如本文所使用的，术语“患者”是指已经被诊断为患有癌症或可以使用本文其它地方公开的组合物和方法治疗的另一种免疫失调的受试者。
如本文所使用的，“治疗(treatment或treating)”包含对疾病或病理状况的症状或病理的任何有益或期望作用，并且甚至可以包含被治疗的疾病或病症例如癌症、自身免疫性疾病、免疫失调等的一个或多个可测量标记物的最低限度的减少。治疗可以任选地涉及延迟疾病或病症的进展。“治疗”不一定表示完全根除或治愈疾病或病症或其相关联症状。
如本文所使用的，“预防(prevent)”和类似的词语如“预防(prevention、prevented和preventing)”等表示用于对疾病或病症例如癌症、自身免疫性疾病、免疫失调等进行预防、抑制或降低其发生或复发可能性的方法。其还指延迟疾病或病症的发作或复发或者延迟疾病或病症的症状的发生或复发。如本文所使用的，“预防”和类似词语还包含在疾病或病症发作或复发之前降低疾病或病症的强度、作用、症状和/或负担。
如本文所使用的，短语“减轻...的至少一种症状”是指减少针对其而正对受试者进行治疗的疾病或病症的一种或多种症状，所述疾病或病症例如癌症、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫缺陷。在具体实施例中，被治疗的疾病或病症是癌症，其中所减轻的所述一种或多种症状包含但不限于虚弱、疲劳、呼吸短促、容易挫伤和出血、频繁感染、淋巴结肿大、腹部肿胀或疼痛(由于腹部器官肿大)、骨骼或关节疼痛、骨折、意外体重减轻、食欲不振、盗汗、持续性轻度发烧以及排尿减少(由于肾功能受损)。
如本文所使用的，术语“量”是指经基因组编辑的CAR T细胞的足以实现包含临床效果在内的有益或期望的预防或治疗效果的“有效量”或“有效量”。
“预防有效量”是指经基因组编辑的CAR T细胞的有效实现期望预防效果的量。通常，但不一定，因为预防剂量是在疾病之前或早期用于受试者的，所以预防有效量小于治疗有效量。
经基因组编辑的CART细胞的“治疗有效量”可以根据多种因素而变化，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重；以及经基因组编辑的CAR T细胞在个体中引发期望反应的能力。治疗有效量还是这样的量：病毒或经转导的治疗细胞的任何毒性或不利作用劣于治疗有益作用。术语“治疗有效量”包含有效“治疗”受试者(例如，患者)的量。当指示治疗量时，待施用的具体实施例中设想的组合物的精确量可以由内科医生根据说明书并考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)的病症的个体差异来确定。
“免疫失调”是指引起免疫系统应答的疾病。在具体实施例中，术语“免疫失调”是指癌症、自身免疫性疾病或免疫缺陷。在一个实施例中，免疫失调涵盖传染病。
如本文所使用的，术语“癌症”通常涉及其中异常细胞在没有控制的情况下分裂并且可能侵入附近组织的一类疾病或病症。
如本文所使用的，术语“恶性”是指其中一组肿瘤细胞显示出不受控制生长(即，超出正常限度的分裂)、侵入(即，侵入和破坏附近组织)和转移(即，通过淋巴或血液扩散到身体内的其它位置)中的一种或多种的癌症。
如本文所使用的，术语“转移”是指癌症从身体的一个部位扩散到另一个部位。由已经扩散的细胞形成的肿瘤被称为“转移性肿瘤”或“转移”。转移性肿瘤含有与原始(原发性)肿瘤中的细胞相似的细胞。
如本文所使用的，术语“良性”或“非恶性”是指可以长得更大但不扩散到身体的其它部位的肿瘤。良性肿瘤是自限性的，并且通常不会侵入或转移。
“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指癌性生长或组织的单个细胞。肿瘤通常是指由细胞的异常生长形成的肿胀或病变，其可以是良性的、恶化前的或恶性的。大多数癌症形成肿瘤，但是一些例如白血病不一定形成肿瘤。对于形成肿瘤的那些癌症，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)可互换地使用。个体中的肿瘤的量是可以按肿瘤的数目、体积或重量来测量的“肿瘤负担”。
“自身免疫性疾病”是指其中身体对其自身组织的某个成分产生免疫性(即，免疫系统)反应的疾病。换句话说，免疫系统失去了其将身体内的某个组织或系统识别为“自我”的能力并且靶向并攻击所述组织或系统，好像它是外来的一样。自身免疫性疾病可以分为其中主要是一个器官受影响的疾病(例如，溶血性贫血和抗免疫性甲状腺炎)，以及其中自身免疫性疾病过程通过许多组织扩散的疾病(例如，全身性红斑狼疮)。例如，多发性硬化症被认为是由T细胞攻击围绕脑和脊髓的神经纤维的鞘而引起的。这导致协调障碍、虚弱和视力模糊。自身免疫性疾病在本领域中是已知的，并且包含例如：桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、格雷夫氏病(Grave′s disease)、狼疮、多发性硬化症、风湿性关节炎、溶血性贫血、抗免疫性甲状腺炎、全身性红斑狼疮、乳糜泻、克罗恩氏病(Crohn′sdisease)、结肠炎、糖尿病、硬皮病、牛皮癣等。
“免疫缺陷”是指免疫系统已经被疾病或化学品施用损害的患者的状态。此病症使系统缺乏防御外来物质所需数目和类型的血细胞。免疫缺陷病症或疾病本领域中是已知的，并且包含例如：AIDS(获得性免疫缺陷综合症)、SCID(严重联合免疫缺陷病)、选择性IgA缺乏症、常见变异型免疫缺陷、X连锁无丙种球蛋白血症、慢性肉芽肿病、高IgM综合症和糖尿病。
“传染病”是指可以从人到人或从生物体到生物体传播并且由微生物或病毒剂引起的疾病(例如，普通感冒)。传染病在本领域中是已知的，并且包含例如：肝炎、性传播疾病(例如，衣原体、淋病)、结核病、HIV/AIDS、白喉、B型肝炎、C型肝炎、霍乱和流感。
“增强”或“促进”或“增加”或“扩增”或“加强”通常是指相比表达相同或基本相同CAR的但其中TCRα等位基因未被修饰的CAR T细胞(对照组合物)引起的反应，本文设想的组合物例如包括一个或多个经修饰TCRα等位基因的经基因组编辑的CAR T细胞产生、引发或引起更大的反应(即，生理反应)的能力。可测量的反应可以包含：增加的促炎性细胞因子例如IFNγ释放、溶细胞活性增加或CAR表达增加，以及根据本领域的理解和本文的描述中显而易见的其它可测量的反应。“增加的”或“增强的”量通常是“统计上显著的”量，并且可以包含1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含所有整数以及其之间且超过1的小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)于由媒剂或对照组合物产生的反应的增加。
“减少(decrease或lower或lessen或reduce)”或“减轻(abate)”或“消除(ablate)”或“抑制(inhibit或dampen)”通常是指相比由媒剂或对照分子/组合物引起的反应，本文设想的组合物产生、引发或引起更小的反应(即，生理反应)的能力。可测量的反应可以包含内源性TCR表达或功能的减少等。“减少的(decrease或reduced)”量通常是“统计上显著的”量，并且可以包含1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含所有整数以及其之间且超过1的小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)于由媒剂或对照组合物产生的反应(参考反应)的减少。
“维持(maintain或maintenance)”或“保持”或“无变化”或“无实质变化”或“无实质减少”通常是指相比由媒剂、对照分子/组合物或特定细胞谱系中的反应引起的反应，本文设想的组合物在细胞中产生、引发或引起基本上类似或相当的生理反应(即，下游作用)的能力。相当的反应是与参考反应没有显著差异或可测量的差异的反应。
如本文所用，术语“特异性结合亲和力”或“特异性结合(specifically binds或specifically bound或specific binding)”或“特异性靶向”描述了相比于背景结合，一个分子以更大的结合亲和力结合到另一个分子。如果结合结构域以例如大于或等于约105M-1的亲和力或Ka(即，特定结合相互作用的以1/M为单位的平衡缔合常数)结合到靶分子或与其相关联，则所述结合结构域“特异性结合”到靶分子。在某些实施例中，结合结构域以大于或等于约106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1的Ka结合到靶标。“高亲和力”结合结构域是指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更高的那些结合结构域。
可替代地，亲和力可以被定义为特定结合相互作用的以M为单位的平衡解离常数(Kd)(例如，10-5M到10-13M或更低)。具体实施例中设想的结合结构域多肽的亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如，通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)；或通过结合关联；或使用经标记配体的置换测定；或使用表面等离子体共振装置如可从新泽西州皮斯卡塔韦Biacore，Inc.获得的Biacore T100，或光学生物传感器技术如分别可从康宁(Corning)和珀金埃尔默(Perkin Elmer)获得的EPIC系统或EnSpire(还参见例如Scatchard等人，(1949年)《纽约科学学术年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》51：660；以及美国专利号5,283,173；5,468,614或等效物)。
在一个实施例中，特异性结合的亲和力为背景结合的约2倍、背景结合的约5倍、背景结合的约10倍、背景结合的约20倍、背景结合的约50倍、背景结合的约100倍或者背景结合的约1000倍或更多。
“抗原(Ag)”是指可以在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，例如，脂质、碳水化合物、多糖、糖蛋白、肽或核酸，包含注射或吸收到动物内的组合物(如包含肿瘤特异性蛋白质的组合物)。抗原与具有特定体液或细胞免疫的产物反应，包含由如所公开的抗原等异源抗原诱导的产物。“靶抗原”或“兴趣靶抗原”是本文设想的工程化抗原受体的结合结构域被设计成与其结合的抗原。在一个实施例中，抗原是MHC-肽络合物，如I类MHC-肽络合物或II类MHC-肽络合物。
“表位”或“抗原决定簇”是指结合剂与其结合的抗原的区。
如本文所用，“分离的多核苷酸”是指已经从其两侧的处于天然存在状态的序列纯化的多核苷酸，例如，已经从通常与其相邻的序列移除的DNA片段。“分离的多核苷酸”还指互补DNA(cDNA)、重组DNA或自然中不存在并且已经通过人手制造的其它多核苷酸。
如本文所用，“分离的蛋白质”、“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从细胞环境中并且根据与细胞的其它组分的关联进行体外合成、分离和/或纯化而来的肽或多肽分子，即，其与体内物质没有显著关联。
“分离的细胞”是指已经从体内组织或器官中获得并且基本上不含细胞外基质的非天然存在的细胞，例如，自然中不存在的T细胞、经修饰的T细胞、工程化的T细胞等。
“重组”是指在两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程，包含但不限于通过非同源末端接合(NHEJ)和同源重组进行的供体捕获。出于本公开的目的，“同源重组(HR)”是指在例如通过同源定向修复(HDR)机制修复细胞中的双链断裂期间发生的这种交换的专门形式。此过程需要核苷酸序列同源性、使用“供体”分子作为模板以修复“靶”分子(即，经历双链断裂的分子)并且以各种方式被称为“非交叉基因转换”或“短程基因转换”，因为其导致遗传信息从供体转移到靶。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，这种转移可以涉及在断裂的靶与供体之间形成的异源双链DNA的失配校正，和/或“合成依赖性链退火”，其中供体用于重新合成将称为靶的一部分的遗传信息和/或相关过程。这种专门的HR通常导致靶分子序列的改变，使得供体多核苷酸的序列的一部分或全部并入靶多核苷酸中。
“切割”是指DNA分子的共价骨架的断裂。切割可以通过多种方法启动，包含但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和双链切割两者都是可能的。可能由于两个不同的单链切割事件而发生双链切割。DNA切割可以导致平末端或交错末端的产生。在某些实施例中，本文设想的多肽用于靶向双链DNA切割。
“靶位点”或“靶序列”是染色体或染色体外核酸序列，其限定核酸的结合分子将与其结合和/或将切割的一部分，条件是存在充分的结合和/或切割条件。
“外源”分子是通常不存在于细胞中但通过一种或多种遗传、生物化学或其它方法引入到细胞中的分子。示例性外源分子包含但不限于：小型有机分子、蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何经修饰衍生物或包括上述分子中的一个或多个的任何络合物。用于将外源分子引入到细胞中的方法对于本领域的技术人员来说是已知的，并且包含但不限于：脂质介导的转移(即，脂质体，包含中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、生物聚合物纳米颗粒、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。
“内源”分子是通常在特定环境条件下在特定发育阶段存在于特定细胞中的分子。例如，内源核酸可以包括染色体、线粒体的基因组或其它细胞器，或天然存在的附加型核酸。额外的内源分子可以包含蛋白质，例如内源性TCR。
“基因”是指对基因产物进行编码的DNA区，以及调控基因产物的产生的所有DNA区，无论这种调控序列是否与编码和/或经转录序列相邻。基因包含但不限于：启动子序列、终止子、翻译调控序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附接位点以及基因座控制区。
“基因表达”是指基因中含有的信息转换为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其它类型的RNA)或通过mRNA的翻译产生的蛋白质。基因产物还包含通过如封端、多腺苷酸化、甲基化和编辑等过程修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、遍在蛋白化、ADP-核糖基化、十四烷基化和糖基化修饰的蛋白质。
如本文所用，术语“基因组编辑”是指在细胞的基因组中的靶位点处对遗传材料进行的取代、缺失和/或引入，其恢复、校正和/或修饰基因的表达。在具体实施例中设想的基因组编辑包括将一个或多个工程化的核酸酶引入到细胞中以在细胞的基因组中的靶位点处产生DNA病变，任选地在存在供体修复模板的情况下。
如本文所用，术语“基因工程化的”或“基因修饰的”是指以DNA或RNA的形式将额外的遗传材料的染色体或染色体外添加到细胞中的总遗传材料中。基因修饰可以靶向或不靶向细胞的基因组中的特定位点。在一个实施例中，基因修饰是位点特定的。在一个实施例中，基因修饰不是位点特定的。
C.经基因组编辑的CAR T细胞
通过具体实施例中设想的方法制造的经基因组编辑的细胞包括经改进的CAR T细胞组合物。在一个实施例中，CAR T细胞包括一个或多个经修饰的TCRα等位基因。令人惊讶的是，诸位发明人已经发现，通过本文设想的方法制造的包括一个或多个经修饰的TCRα等位基因的经基因组编辑的CAR T细胞具有增加的治疗疗效，例如，促炎性细胞因子和其它分子的增加的抗原依赖性分泌，所述促炎性细胞因子例如IFNγ、TNFα、IL-2，所述其它分子包含增加CAR T细胞对肿瘤细胞的溶细胞活性的细胞毒素，例如，穿孔素、粒酶A、粒酶B。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，设想的是，增加的CAR T细胞疗效部分地由于释放CAR的辅助信号传导组分的TCRαβ受体表达的减少、细胞因子分泌的增加和强直信号传导的减少。
在各个实施例中，经基因组编辑的CAR T细胞包括通过本文设想的基因编辑组合物和方法修饰的一个或多个TCRα等位基因。
在一个实施例中，经基因组编辑的CAR T细胞包括一个或多个经修饰的TCRα等位基因；以及对CAR进行编码的核酸。
在一个实施例中，经基因组编辑的CAR T细胞包括一个或多个经修饰的TCRα等位基因；以及一个或多个前病毒整合体，其包括对CAR进行编码的核酸。在一个实施例中，前病毒整合体是基于逆转录病毒或基于慢病毒的前病毒整合体。
在一个实施例中，经基因组编辑的CAR T细胞包括一个或多个经修饰的TCRα等位基因；其中所述一个或多个TCRα等位基因已经通过以下方式修饰：通过同源定向修复将包括对CAR进行编码的核酸的供体修复模板插入到所述一个或多个TCRα等位基因中。
在具体实施例中，一种制备包括一个或多个经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞的方法包括：活化T细胞群并刺激T细胞群增殖；将工程化的核酸酶引入到T细胞群中以在TCRα等位基因处产生双链断裂；以及将对嵌合抗原受体(CAR)进行编码的核酸引入到T细胞中。
在某些实施例中，一种制备包括一个或多个经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞的方法包括：活化T细胞群并刺激T细胞群增殖；以及使用对CAR进行编码的病毒载体转导所述T细胞。工程化的核酸酶的表达在TCRα等位基因中的靶位点处产生双链断裂，所述双链断裂优先通过NHEJ修复。在一个实施例中，使用3′末端加工酶例如如Trex2等3′-5′核酸外切酶将工程化的核酸内切酶引入到细胞中以增加通过NHEJ修复双链断裂的偏向。在一个实施例中，使用对CAR进行编码的逆转录病毒载体例如γ逆转录病毒载体或慢病毒载体转导T细胞。在一个实施例中，使用对CAR进行编码的慢病毒载体转导T细胞。
在一些实施例中，一种制备包括一个或多个经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞的方法包括：活化T细胞群并刺激T细胞群增殖；以及使用包括供体修复模板的病毒载体转导所述T细胞，所述供体修复模板包括对CAR进行编码的核酸；其中工程化的核酸酶的表达在TCRα等位基因中的靶位点处产生双链断裂，并且所述供体修复模板通过双链断裂(DSB)的位点处进行的同源定向修复(HDR)并入TCRα等位基因中。在一个实施例中，供体模板进一步包括可操作地连接到对CAR进行编码的核酸的RNApol II启动子。
在具体实施例中设想的经基因组编辑的CAR T细胞可以是自体/自身的(“自我”)或非自体的(“非自我的”，例如，同种异体的、同基因的或异种的)。如本文所用，“自体的”是指来自同一一受试者的细胞。如本文所用，“同种异体的”是指同一物种的在基因上与比较细胞不同的细胞。如本文所用，“同基因的”是指不同受试者的在基因上与比较细胞完全相同的细胞。如本文所用，“异种的”是指与比较细胞属于不同物种的细胞。在优选实施例中，从哺乳动物受试者获得T细胞。在更优选的实施例中，从灵长类动物受试者获得T细胞。在最优选的实施例中，从人类受试者获得T细胞。
可以从许多来源获得T细胞，包含但不限于：外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施例中，可以使用技术人员已知的任何数目的技术从采集自受试者的单位血液中获得T细胞，所述技术如沉降，例如FICOLLTM分离。
在其它实施例中，使用分离的或纯化的T细胞群。在一些实施例中，在PBMC的分离之后，可以在活化、扩增和/或基因修饰之前或之后将细胞毒性和辅助T淋巴细胞分类为初始、记忆和效应T细胞亚群。
可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达以下标记物中的一个或多个的特定T细胞亚群：CD3、CD4、CD8、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62、CD127和HLA-DR。在一个实施例中，通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达选自由以下组成的组的标记物中的一个或多个的特定T细胞亚群：CD62L、CCR7、CD28、CD27、CD122、CD127、CD197；或CD38或CD62L、CD127、CD197和CD38。在各个实施例中，所制造的T细胞组合物不表达或基本上不表达以下标记物中的一个或多个：CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、TIM3和LAG3。
在一个实施例中，分离的或纯化的T细胞群表达包含但不限于以下的标记物中的一个或多个：CD3+、CD4+、CD8+或其组合。
在某些实施例中，T细胞从个体分离，并且在经历基因组编辑之前首先进行体外活化和刺激以增殖。
为了实现足够治疗剂量的T细胞组合物，通常对T细胞进行一轮或多轮刺激、活化和/或扩增。通常可以使用如例如以下美国专利中所述的方法使T细胞活化和扩增：6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；以及6,867,041，所述美国专利中的每一个通过引用以其全部内容结合在本文中。在具体实施例中，在将基因组编辑组合物引入到T细胞中之前，使T细胞活化和扩增约1天到约4天、约1天到约3天、约1天到约2天、约2天到约3天、约2天到约4天、约3天到约4天、或约1天、约2天、约3天或约4天。
在具体实施例中，在将基因组编辑组合物引入到T细胞中之前，使T细胞活化和扩增约6小时、约12小时、约18小时或约24小时。
在一个实施例中，在将基因组编辑组合物引入到T细胞中的同时活化T细胞。
在一个实施例中，共刺激配体被呈现于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上，所述抗原呈递细胞特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，由此提供除了通过例如TCR/CD3络合物的结合提供的初级信号外，介导期望的T细胞应答的信号。适当的共刺激配体包含但不限于：CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。
在具体实施例中，共刺激配体包括特异性结合到存在于T细胞上的共刺激分子的抗体或其抗原结合片段，包含但不限于：CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体。
适当的共刺激配体进一步包含靶抗原，所述靶抗原可以以可溶形式提供或在APC或aAPC上表达，所述APC或aAPC结合在经基因组编辑的T细胞上表达的工程化的抗原受体。
在各个实施例中，一种产生经基因组编辑的CAR T细胞的方法包括：活化包括T细胞的细胞群以及扩增所述T细胞群。T细胞活化可以通过以下方式实现：通过T细胞TCR/CD3络合物提供初级刺激信号以及通过辅助分子例如CD28提供次级共刺激信号。
可以通过使T细胞与适当的CD3结合剂例如CD3配体或抗CD3单克隆抗体接触来刺激TCR/CD3络合物。CD3抗体的说明性实例包含但不限于：OKT3、G19-4、BC3和64.1。
除了通过TCR/CD3络合物提供的初级刺激信号外，T细胞应答的诱导还需要第二共刺激信号。在具体实施例中，CD28结合剂可以用于提供共刺激信号。CD28结合剂的说明性实例包含但不限于：天然CD28配体，例如CD28的天然配体(例如，B7蛋白家族的成员，如B7-1(CD80)和B7-2(CD86)；以及能够交联CD28分子的抗CD28单克隆抗体或其片段，例如，单克隆抗体9.3、B-T3、XR-CD28、KOLT-2、15E8、248.23.2和EX5.3D10。
在一个实施例中，提供初级刺激信号的分子例如通过TCR/CD3络合物提供刺激的分子以及共刺激分子偶联到同一表面。
在某些实施例中，提供刺激和共刺激信号的结合剂定位于细胞的表面上。这可以通过以下方式实现：使用以适合于结合剂在细胞表面上的表达的形式对结合剂进行编码的核酸转染或转导细胞，或者可替代地将结合剂偶联到细胞表面。
在另一个实施例中，提供初级刺激信号的分子例如通过TCR/CD3络合物提供刺激的分子以及共刺激分子显示于抗原呈递细胞上。
在一个实施例中，提供初级刺激信号的分子例如通过TCR/CD3络合物提供刺激的分子以及共刺激分子提供于单独的表面上。
在某个实施例中，所述结合剂中提供刺激信号和共刺激信号的一个结合剂是可溶的(在溶液中提供)，而另一个或其它结合剂提供于一个或多个表面上。
在具体实施例中，提供刺激信号和共刺激信号的结合剂两者均以可溶形式(在溶液中提供)提供。
在各个实施例中，本文设想的用于制备经基因组编辑的CAR T细胞的方法包括：使用抗CD3和抗CD28抗体活化T细胞。
在一个实施例中，扩增通过本文设想的方法活化的T细胞进一步包括：培养包括T细胞的细胞群若干小时(约3小时)到约7天到约28天或其间的任何小时整数值。在另一个实施例中，可以将T细胞组合物培养14天。在具体实施例中，将T细胞培养约21天。在另一个实施例中，将T细胞组合物培养约2到3天。还可以期望若干刺激/活化/扩增循环，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。
在具体实施例中，适合T细胞培养的条件包含适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))和增殖和活力所必需的一个或多个因子，包含但不限于：血清(例如，胎牛血清或人类血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、IL-21、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域的技术人员已知的适合于细胞生长的任何其它添加剂。
细胞培养基的另外的说明性实例包含但不限于：RPMI 1640、Clicks、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，其添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，其无血清或补充有适量血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使T细胞生长和扩增的量的一个或多个细胞因子。
抗生素例如青霉素和链霉素仅在实验培养时包含，而在培养待注入受试者体内的细胞时不被包含。靶细胞保持处于支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％的CO2)。
在具体实施例中，在具有适当细胞因子如IL-2、IL-7和/或IL-15的培养基中使PBMC或分离的T细胞与通常附接到珠粒或其它表面的刺激剂和共刺激剂如抗CD3和抗CD28抗体接触。
在其它实施例中，通过工程化K562、U937、721.221、T2和C1R细胞制备人工APC(aAPC)以引导各种共刺激分子和细胞因子的稳定表达和分泌。在具体实施例中，K32或U32aAPC用于引导一个或多个基于抗体的刺激分子在AAPC细胞表面上显示。T细胞群可以通过表达各种共刺激分子的aAPC扩增，包含但不限于CD137L(4-1BBL)、CD134L(OX40L)和/或CD80或CD86。最后，aAPC提供用于扩增经基因修饰的T细胞并且保持CD8T细胞上的CD28表达的高效平台。WO 03/057171和US2003/0147869中提供的aAPC特此通过引用以其全部内容并入。
在各个实施例中，一种用于产生包括经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞的方法包括：将本文设想的一个或多个工程化的核酸酶引入到T细胞群中以在TCRα等位基因中产生双链断裂。
在一个实施例中，在活化和刺激之前将本文设想的所述一个或多个核酸酶引入到T细胞中。
在另一个实施例中，大约在刺激T细胞的同时将本文设想的所述一个或多个核酸酶引入到T细胞中。
在优选实施例中，在T细胞活化和刺激之后例如在约1天、2天、3天或4天后将本文设想的所述一个或多个核酸酶引入到T细胞中。在具体实施例中引入到T细胞中的核酸酶包含但不限于核酸内切酶，例如，大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN或CRISPR/Cas核酸酶；以及任选地末端加工核酸酶或其具有生物活性的片段，例如，5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶(例如，Trex2)、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板-独立的DNA聚合酶活性。核酸内切酶和末端加工核酸酶可以被表达为融合蛋白、可以从多顺反子mRNA表达或者从一个或多个mRNA或表达盒独立表达。
在具体实施例中，使用载体将所述一个或多个核酸酶引入到T细胞中。在其它实施例中，优选地将所述一个或多个核酸酶作为mRNA引入到T细胞中。可以通过显微注射、转染、脂质转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转移等将核酸酶引入到T细胞中。
在具体实施例中设想的基因组编辑方法包括：将本文设想的一个或多个工程化的核酸酶引入到经活化和经刺激的T细胞群中以在靶位点处产生优先通过NHEJ修复的DSB，以及随后使用对CAR进行编码的载体转导所述T细胞群。
在具体实施例中设想的基因组编辑方法包括：将本文设想的一个或多个工程化的核酸酶引入到经活化和经刺激的T细胞群中以在靶位点处产生DSB，以及任选地随后将一个或多个供体修复模板引入到所述T细胞群中，所述供体修复模板将通过同源重组并入DSB位点处的细胞基因组中。
在具体实施例中，将包括对CAR进行编码的多核苷酸的一个或多个供体模板引入到T细胞群中。可以通过显微注射、转染、脂质转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射、DEAE-葡聚糖介导的转移等将供体模板引入到T细胞中。
在优选实施例中，通过mRNA电穿孔将所述一个或多个核酸酶引入到T细胞中，并通过病毒转导将所述一个或多个供体修复模板引入到T细胞中。
在另一优选实施例中，通过mRNA电穿孔将所述一个或多个核酸酶引入到T细胞中，并通过AAV转导将所述一个或多个供体修复模板引入到T细胞中。AAV载体可以包括来自AAV2的ITR以及来自以下中的任何一个的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10。在优选实施例中，AAV载体可以包括来自AAV2的ITR和来自AAV6的血清型。
在具体实施例中，供体修复模板包括一个或多个同源臂。如本文所用，术语“同源臂”是指供体模板中与通过核酸酶在靶位点处引入的DNA断裂两侧的DNA序列完全相同或几乎完全相同的核酸序列。在一个实施例中，供体模板包括5′同源臂，所述5′同源臂包括与DNA断裂位点的5′处的DNA序列完全相同或几乎完全相同的核酸。在一个实施例中，供体模板包括3′同源臂，所述3′同源臂包括与DNA断裂位点的3′处的DNA序列完全相同或几乎完全相同的核酸。在优选实施例中，供体模板包括5′同源臂和3′同源臂。
在具体实施例中设想适当长度的同源臂的说明性实例可以独立选择并且包含但不限于：约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp、约1500bp、约1600bp、约1700bp、约1800bp、约1900bp、约2000bp、约2100bp、约2200bp、约2300bp、约2400bp、约2500bp、约2600bp、约2700bp、约2800bp、约2900bp或约3000bp或更长的同源臂，包含所有中间长度的同源臂。
适当的同源臂长度的额外说明性实例包含但不限于：约100bp到约3000bp、约200bp到约3000bp、约300bp到约3000bp、约400bp到约3000bp、约500bp到约3000bp、约500bp到约2500bp、约500bp到约2000bp、约750bp到约2000bp、约750bp到约1500bp或约1000bp到约1500bp，包含所有中间长度的同源臂。
在具体实施例中，5′同源臂和3′同源臂的长度独立地选自约500bp到约1500bp。在一个实施例中，5′同源臂为约1500bp，并且3′同源臂为约1000bp。在一个实施例中，5′同源臂为约600bp，并且3′同源臂为约600bp。
供体修复模板可以进一步包括一个或多个多核苷酸，如启动子和/或增强子、非翻译区(UTR)、Kozak序列、多腺苷酸化信号、额外的限制酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如，LoxP、FRT和Att位点)、终止密码子、转录终止信号以及本文中其它地方设想的对自切割多肽、表位标记进行编码的多核苷酸。
在各个实施例中，供体修复模板包括5′同源臂、RNA聚合酶II启动子、CAR以及3′同源臂。
在另一优选实施例中，通过mRNA电穿孔将所述一个或多个核酸酶引入到T细胞中，并通过慢病毒转导将所述一个或多个供体修复模板引入到T细胞中。慢病毒载体骨架可以衍生自HIV-1、HIV-2、维斯那-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体可以具有整合能力或可以是整合酶缺陷型慢病毒载体(IDLV)。在一个实施例中，包括基于HIV的载体骨架(即，HIV顺式作用序列元件)的IDLV载体是优选的。
可以在将所述一个或多个工程化的核酸酶引入到细胞中之前、同时或之后递送所述一个或多个供体修复模板。在某些实施例中，所述一个或多个供体修复模板与所述一个或多个工程化的核酸酶同时递送。在其它实施例中，在所述一个或多个工程化的核酸酶之前递送所述一个或多个供体修复模板，例如，在所述一个或多个供体修复模板之前数秒到数小时到数天，包含但不限于在所述一个或多个工程化的核酸酶之前约1分钟到约30分钟、约1分钟到约60分钟、约1分钟到约90分钟、约1小时到约24小时，或在所述一个或多个工程化的核酸酶之前超过24小时。在某些实施例中，所述一个或多个供体修复模板在核酸酶之后优选地在约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时内；更优选地在约1小时、2小时、3小时或4小时内；或更优选地在约4小时内递送。
可以使用与所述一个或多个工程化的核酸酶相同的递送系统递送所述一个或多个供体修复模板。通过非限制性实例，当同时递送时，供体修复模板和工程化的核酸酶可以通过同一载体例如IDLV慢病毒载体或AAV载体(例如，AAV6)编码。在特定优选实施例中，通过mRNA电穿孔递送一种个或多个工程化的核酸酶，并使用AAV载体通过转导递送供体修复模板。
在具体实施例中，产生具有一个或多个经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞的方法包括：在具有适当细胞因子如IL-2、IL-7和/或IL-15和/或调节PI3K细胞信号传导途径的一个或多个试剂的培养基中使细胞与刺激剂和共刺激剂如可溶抗CD3和抗CD28抗体或附接到珠粒或其它表面的抗体接触。
如本文所用，术语“PI3K抑制剂”是指结合到PI3K并抑制其至少一种活性的核酸、肽、化合物或小型有机分子。PI3K蛋白可以分为三类：1类PI3K、2类PI3K和3类PI3K。1类PI3K作为由四个p110催化亚基(p110α、p110β、p110δ和p110γ)之一和两个调控亚基家族之一组成的异二聚体存在。在具体实施例中，PI3K抑制剂靶向1类PI3K抑制剂。在一个实施例中，PI3K抑制剂将显示出对1类PI3K抑制剂的一个或多个同种型的选择性(即对p110α、p110β、p110δ和p110γ或p110α、p110β、p110δ和p110γ中的一个或多个的选择性)。另一方面，PI3K抑制剂将不显示出同种型选择性并被认为是“泛PI3K抑制剂”。在一个实施例中，PI3K抑制剂将与ATP竞争结合到PI3K催化结构域。
适合于在具体实施例中使用的PI3K抑制剂的说明性实例包含但不限于：BKM120(1类PI3K抑制剂，诺华(Novartis))、XL147(1类PI3K抑制剂，Exelixis)、(泛PI3K抑制剂，葛兰素史克(GlaxoSmithKline))和PX-866(1类PI3K抑制剂；p110α、p110β和p110γ同种型，Oncothyreon)。
选择性PI3K抑制剂的其它说明性实例包含但不限于：BYL719、GSK2636771、TGX-221、AS25242、CAL-101、ZSTK474和IPI-145。
泛PI3K抑制剂的另外的说明性实例包含但不限于：BEZ235、LY294002、GSK1059615、TG100713和GDC-0941。
在优选实施例中，PI3K抑制剂是ZSTK474。
D.核酸酶
具体实施例中设想的免疫效应细胞组合物通过使用靶向一个或多个TCRα等位基因的工程化核酸酶实现的基因组编辑产生。
在各个实施例中，使用工程化核酸酶编辑CAR T细胞，所述工程化核酸酶被设计成结合和切割T细胞受体α(TCRα)基因中的靶DNA序列。在具体实施例中设想的工程化核酸酶可以用于在靶多核苷酸序列中引入双链断裂，所述双链断裂可以在不存在多核苷酸模板例如供体修复模板的情况下通过非同源性末端接合(NHEJ)进行修复并且随后使用对CAR进行编码的病毒进行转导；或者在存在对CAR进行编码的供体修复模板的情况下通过同源定向修复(HDR)即同源重组进行修复。在某些实施例中设想的工程化核酸酶还可以被工程化为切口酶，所述切口酶产生单链DNA断裂，所述单链DNA断裂可以在存在供体修复模板的情况下使用细胞的碱基切除修复(BER)机器或同源重组进行修复。NHEJ是一种经常导致形成破坏基因功能的小型插入和缺失的容易出错的过程。同源重组需要同源DNA作为修复模板并且可以被用来通过以下方式创建无限种类的指定修饰：在靶位点处引入含有期望序列的两侧具有与靶位点两侧的区同源的序列的供体DNA。
“工程化核酸酶”是指包括一个或多个DNA结合结构域和一个或多个DNA切割结构域的核酸酶，其中核酸酶已经被设计和/或修饰成结合与DNA切割靶序列相邻的DNA结合靶序列。工程化核酸酶可以是由天然存在的核酸酶或由之前工程化的核酸酶设计和/或修饰而来。在具体实施例中设想的工程化核酸酶可以进一步包括一个或多个额外的功能结构域，例如，展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶(例如，Trex2)、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶结构域。在具体实施例中，使用展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶(例如，Trex2)、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性的末端加工酶将工程化HE引入到T细胞中。HE和3′加工酶可以单独地引入例如在不同的载体或单独的mRNA中或一起引入例如作为融合蛋白，或者引入在由病毒自切割肽或IRES元件分离的多顺反子构建体中。
可以被工程化成结合和切割靶序列的核酸酶的说明性实例包含但不限于：归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)、megaTALs、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)以及成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas核酸酶系统。
在具体实施例中，本文设想的核酸酶包括一个或多个异源DNA结合结构域和切割结构域(例如，ZFN、TALEN、megaTAL)，(Boissel等人，2014年；Christian等人，2010年)。在其它实施例中，可以改变天然存在的核酸酶的DNA结合结构域以结合到选定的靶位点(例如，已经被工程化为结合到不同于同源结合位点的位点的大范围核酸酶)。例如，大范围核酸酶已经被设计成结合不同于其同源结合位点的靶位点(Boissel等人，2014年)。在具体实施例中，核酸酶需要核酸序列以将核酸酶靶向靶位点(例如，CRISPR/Cas)。
在各个实施例中，归巢核酸内切酶或大范围核酸酶被工程化为结合到TCRα基因座并且在TCRα基因座中引入单链切口或双链断裂(DSB)。“归巢核酸内切酶”和“大范围核酸酶”可以互换使用，并且指识别12个到45个碱基对切割位点并且通常基于序列和结构基序分组为以下五个家族的天然存在的核酸酶或工程化的大范围核酸酶：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒和PD-(D/E)XK。
工程化的HE不存在于自然中，并且可以通过重组DNA技术或通过随机诱变获得。工程化的HE可以通过在天然存在的HE或之前工程化的HE中进行一种或多种氨基酸改变例如突变、取代、添加或缺失一个或多个氨基酸来获得。在具体实施例中，工程化的HE包括DNA识别界面的一种或多种氨基酸改变。
“DNA识别界面”是指与核酸靶碱基相互作用的HE氨基酸残基以及相邻的那些残基。对于每个HE，DNA识别界面包括侧链到侧链和侧链到DNA接触的广泛网络，所述接触中的大多数必定对识别特定核酸靶序列来说是唯一的。因此，DNA识别界面的对应于特定核酸序列的氨基酸序列显著变化，并且是任何天然HE或工程化的HE的特征。通过非限制性实例，可以通过构造HE变体库来得到具体实施例中设想的工程化的HE，在所述库中，定位在天然HE(或之前工程化的HE)的DNA识别界面中的一个或多个氨基酸残基是变化的。可以使用切割测定从所述库中筛选针对每个预测TCRα基因座靶位点的靶切割活性(参见例如，Jarjour等人，2009年，《核酸研究(Nuc.Acids Res.)》，37(20)：6871-6880)。
LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)是最充分研究的大范围核酸酶家族，主要编码于古生菌以及绿藻和真菌中的细胞器DNA中并且显示出最高的整体DNA识别特异性。LHE包括每蛋白质链一个或两个LAGLIDADG催化基序，并且分别起同源二聚体或单链单体的作用。对LAGLIDADG蛋白的结构研究识别了高度保守的核心结构(Stoddard，2005年)，其特征在于αββαββα折叠，其中LAGLIDADG基序属于此折叠的第一螺旋。LHE的高效和特异性切割表示用于衍生新颖的高度特异性的核酸内切酶的蛋白质支架。然而，将LHE工程化为结合和切割非天然或非典型靶位点需要选择适当的LHE支架、检查靶基因座、选择推定靶位点以及广泛改变LHE以改变其DNA接触点和靶向位点中多达三分之二的碱基对位置处的切割特异性。
可以由其设计出工程化的LHE的LHE的说明性实例包含但不限于：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI以及I-Vdi141I。
在一个实施例中，工程化的LHE选自由以下组成的组：I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI以及SmaMI。
在一个实施例中，工程化的LHE是I-OnuI。参见例如，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
在一个实施例中，靶向人类TCRα基因的工程化的I-OnuI LHE由天然I-OnuI产生。在优选实施例中，靶向人类TCRα基因的工程化的I-OnuI LHE由之前工程化的I-OnuI产生。在一个实施例中，针对SEQ ID NO：3中阐述的人类TCRα基因靶位点产生工程化的I-OnuILHE。在一个实施例中，针对SEQ ID NO：4中阐述的人类TCRα基因靶位点产生工程化的I-OnuI LHE。
在具体实施例中，工程化的I-OnuI LHE在DNA识别界面中包括一个或多个氨基酸取代。在具体实施例中，I-OnuI LHE包括与I-OnuI或与如SEQ ID NO：5、6或7中阐述的I-OnuI的工程化的变体或其另外的工程化的变体的DNA识别界面至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性(Taekuchi等人，2011年，《美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci U.S.A.)》，2011年8月9日；108(32)：13077-13082)。
在一个实施例中，I-OnuI LHE包括与I-OnuI或与如SEQ ID NO：5、6或7中阐述的I-OnuI的工程化的变体或其另外的工程化的变体的DNA识别界面至少70％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少95％、更优选地至少97％、更优选地至少99％的序列同一性(Taekuchi等人，2011年，《美国国家科学院院刊》，2011年8月9日；108(32)：13077-13082)。
在具体实施例中，工程化的I-OnuI LHE在DNA识别界面中包括一个或多个氨基酸取代或修饰，特别是在位于I-OnuI(SEQ ID NO：2)或如SEQ ID NO：5、6或7中阐述的I-OnuI的工程化的变体或其另外的工程化的变体的位置24到50、68到82、180到203以及223到240中的子结构域中。
在一个实施例中，工程化的I-OnuI LHE在位于整个I-OnuI序列内任何位置的额外位置处包括一个或多个氨基酸取代或修饰。可以被取代和/或修饰的残基包含但不限于与核酸靶接触或直接地或通过水分子与核酸骨架或与核苷酸碱基相互作用的氨基酸。在一个非限制性实例中，本文设想的工程化的I-OnuI LHE在选自由I-OnuI(SEQ ID NO：2)或如SEQID NO：5、6或7中阐述的I-OnuI的工程化的变体或其另外的工程化的变体的以下位置组成的位置组的至少一个位置中包括一个或多个取代和/或修饰、优选地至少5个、优选地至少10个、优选地至少15个、更优选地至少20个、甚至更优选地至少25个：19、24、26、28、30、32、34、35、36、37、38、40、42、44、46、48、68、70、72、75、76、77、78、80、82、168、180、182、184、186、188、189、190、191、192、193、195、197、199、201、203、223、225、227、229、231、232、234、236、238、240。
在具体实施例中，本文设想的工程化的I-OnuI LHE包括选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代和/或修饰：L26I、R28D、N32R、K34N、S35E、V37N、G38R、S40R、E42S、G44R、V68K、A70T、N75R、S78M、K80R、L138M、S159P、E178D、C180Y、F182G、I186K、S188V、S190G、K191N、L192A、G193K、Q195Y、Q197G、V199R、T203S、K207R、Y223S、K225W以及D236E。
在一个实施例中，I-OnuI LHE具有如SEQ ID NO：5、6或7中阐述的氨基酸序列或其另外的工程化的变体。
各个示例性实施例设想了结合到并且切割TCRα基因座的靶区的megaTAL核酸酶。“megaTAL”是指包括工程化的TALE DNA结合结构域和工程化的大范围核酸酶的工程化的核酸酶，并且任选地包括一个或多个接头和/或额外的功能结构域，例如，展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶(例如，Trex2)、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶结构域。在具体实施例中，可以使用展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶(例如，Trex2)、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性的末端加工酶将megaTAL引入到T细胞中。megaTAL和3′加工酶可以单独地引入例如在不同的载体或单独的mRNA中或一起引入例如作为融合蛋白，或者引入在由病毒自切割肽或IRES元件分离的多顺反子构建体中。
“TALE DNA结合结构域”是转录激活子样效应子(TALE或TAL效应子)的DNA结合部分，其模拟植物转录激活子以操纵植物转录组(参见例如，Kay等人，2007年，《科学(Science)》，318：648-651)。具体实施例中设想的TALE DNA结合结构域是重新被工程化的或来自天然存在的TALE，例如，来自野油菜黄单胞菌辣椒斑点致病变种(Xanthomonascampestris pv.vesicatoria)、加德纳黄单胞菌(Xanthomonas gardneri)、雀麦褐条病菌(Xanthomonas translucens)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、番茄黄单胞菌(Xanthomonas perforans)、苜蓿黄单胞杆菌(Xanthomonas alfalfa)、柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citri)、番茄细菌性斑点致病黄单胞菌(Xanthomonas euvesicatoria)和白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)的AvrBs3以及来自青枯雷尔氏菌(Rantstoniasolanacearum)的brg11和hpx17。在美国专利号9,017,967和其中引用的参考文献中公开了用于衍生和设计DNA结合结构域的TALE蛋白的说明性实例，所有所述文献都通过引用以其全部内容并入本文。
在具体实施例中，megaTAL包括TALE DNA结合结构域，其包括参与TALE DNA结合结构域结合到其对应靶DNA序列的一个或多个重复单元。单个“重复单元”(也被称为“重复”)的长度通常为33个到35个氨基酸。每个TALE DNA结合结构域重复单元包含构成重复可变二残基(RVD)的1个或2个DNA结合残基，通常在重复的位置12和/或13处。已经确定了用于DNA识别这些TALE DNA结合结构域的天然(典型)代码，使得位置12和13处的HD序列导致结合到胞嘧啶(C)、NG结合到T、NI结合到A、NN结合到G或A并且NG结合到T。在某些实施例中，设想了非典型(不典型)RVD。
适合于在于具体实施例中设想的特定megaTAL中使用的非典型RVD的说明性实例包含但不限于用于识别鸟嘌呤(G)的HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS、NN、SN、KN；用于识别腺嘌呤(A)的NI、KI、RI、HI、SI；用于识别胸腺嘧啶(T)的NG、HG、KG、RG；用于识别胞嘧啶(C)的RD、SD、HD、ND、KD、YG；用于识别A或G的NV、HN；以及用于识别A或T或G或C的H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*，其中(*)表示在位置13处的氨基酸不存在。适合于在于具体实施例中设想的特定megaTAL中使用的RVD的额外的说明性实例进一步包含美国专利号8,614,092中公开的RVD，所述美国专利通过引用以其全部内容并入本文。
在具体实施例中，本文设想的megaTAL包括TALE DNA结合结构域，其包括3个到30个重复单元。在某些实施例中，megaTAL包括3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24，25个、26个、27个、28个、29个或30个TALE DNA结合结构域重复单元。在优选实施例中，本文设想的megaTAL包括TALE DNA结合结构域，其包括5个到13个重复单元、更优选地7个到12个重复单元、更优选地9个到11个重复单元、并且更优选地9个、10个或11个重复单元。
在具体的实施例中，本文设想的megaTAL包括TALE DNA结合结构域，其包括3个到30个重复单元和额外的单个截短的TALE重复单元，所述单个截短的TALE重复单元包括位于一组TALE重复单元的C末端处的20个氨基酸，即额外的C-末端半TALE DNA结合结构域重复单元(本文下文其它地方公开的C-帽的氨基酸-20到-1)。在具体实施例中，本文设想的megaTAL包括TALE DNA结合结构域，其包括3.5个到30.5个重复单元。在某些实施例中，megaTAL包括3.5个、4.5个、5.5个、6.5个、7.5个、8.5个、9.5个、10.5个、11.5个、12.5个、13.5个、14.5个、15.5个、16.5个、17.5个、18.5个、19.5个、20.5个、21.5个、22.5个、23.5个、24.5，25.5个、26.5个、27.5个、28.5个、29.5个或30.5个TALE DNA结合结构域重复单元。在优选实施例中，本文设想的megaTAL包括TALE DNA结合结构域，其包括5.5个到13.5个重复单元、更优选地7.5个到12.5个重复单元、更优选地9.5个到11.5个重复单元、并且更优选地9.5个、10.5个或11.5个重复单元。
在具体实施例中，megaTAL包括“N-末端结构域(NTD)”多肽、一个或多个TALE重复结构域/单元、“C-末端结构域(CTD)”多肽以及工程化的大范围核酸酶。
如本文所使用的，术语“N-末端结构域(NTD)”多肽是指天然存在的TALE DNA结合结构域的N-末端部分或片段两侧的序列。NTD序列(如果存在的话)可以具有任何长度，只要TALE DNA结合结构域重复单元保留结合DNA的能力即可。在具体实施例中，NTD多肽在TALEDNA结合结构域的N末端处包括至少120个到至少140个或更多个氨基酸(0是最N末端重复单元的氨基酸1)。在具体实施例中，NTD多肽在TALE DNA结合结构域的N-末端处包括至少约120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个或至少140个氨基酸。在一个实施例中，本文设想的megaTAL包括黄单胞菌属TALE蛋白的至少约氨基酸+1到+122到至少约+1到+137的NTD多肽(0是最N末端重复单元的氨基酸1)。在具体实施例中，NTD多肽在黄单胞菌属TALE蛋白的TALE DNA结合结构域的N-末端处包括至少约122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个或137个氨基酸。在一个实施例中，本文设想的megaTAL包括雷氏菌属TALE蛋白的至少氨基酸+1到+121的NTD多肽(0是最N末端重复单元的氨基酸1)。在具体实施例中，NTD多肽在雷氏菌属TALE蛋白的TALEDNA结合结构域的N-末端处包括至少约121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个或137个氨基酸。
如本文所使用的，术语“C-末端结构域(CTD)”多肽是指天然存在的TALE DNA结合结构域的C-末端部分或片段两侧的序列。CTD序列(如果存在的话)可以具有任何长度，只要TALE DNA结合结构域重复单元保留结合DNA的能力即可。在具体实施例中，CTD多肽在TALEDNA结合结构域的最后一个完整重复的C末端处包括至少20个到至少85个或更多个氨基酸(前20个氨基酸是最后一个C-末端完整重复单元的C-末端处的半重复单元)。在具体实施例中，CTD多肽在TALE DNA结合结构域的最后一个完整重复的C-末端处包括至少约20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、443个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个或至少85个氨基酸。在一个实施例中，本文设想的megaTAL包括黄单胞菌属TALE蛋白的至少约氨基酸-20到-1的CTD多肽(-20是最后一个C-末端完全重复单元C-末端处的半重复单元的氨基酸1)。在具体实施例中，CTD多肽在黄单胞菌属TALE蛋白的TALEDNA结合结构域的最后一个完整重复的C-末端处包括至少约20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2或1个氨基酸。在一个实施例中，本文设想的megaTAL包括雷氏菌属TALE蛋白的至少约氨基酸-20到-1的CTD多肽(-20是最后一个C-末端完全重复单元C-末端处的半重复单元的氨基酸1)。在具体实施例中，CTD多肽在雷氏菌属TALE蛋白的TALE DNA结合结构域的最后一个完整重复的C-末端处包括至少约20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2或1个氨基酸。
在具体的实施例中，本文设想的megaTAL包括融合多肽，其包括被工程化成结合靶序列的TALE DNA结合结构域、被工程化成结合并且切割靶序列的大范围核酸酶以及任选地NTD和/或CTD多肽，其任选地通过本文其它地方设想的一个或多个接头多肽彼此连接。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，设想的是，包括TALE DNA结合结构域以及任选地NTD和/或CTD多肽的megaTAL与接头多肽融合，所述接头多肽进一步与工程化的大范围核酸酶融合。因此，TALE DNA结合结构域结合DNA靶序列，所述DNA靶序列位于距离与大范围核酸酶的DNA结合结构域结合的靶序列约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个核苷酸内。以此方式，本文设想的megaTAL增加了基因组编辑的特异性和效率。
在具体实施例中，本文设想的megaTAL包括一个或多个TALE DNA结合重复单元以及选自由以下组成的组的工程化的LHE：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI以及I-Vdi141I或优选地I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI以及SmaMI或更优选地I-OnuI。
在具体实施例中，本文设想的megaTAL包括NTD、一个或多个TALE DNA结合重复单元、CTD以及选自由以下组成的组的工程化的LHE：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI以及I-Vdi141I或优选地I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI以及SmaMI或更优选地I-OnuI。
在具体实施例中，本文设想的megaTAL包括NTD、约9.5个到约11.5个TALE DNA结合重复单元以及选自由以下组成的组的工程化的LHE：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI以及I-Vdi141I或优选地I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI以及SmaMI或更优选地I-OnuI。
在具体实施例中，本文设想的megaTAL包括约122个氨基酸到137个氨基酸的NTD；约9.5个、约10.5个或约11.5个结合重复单元；约20个氨基酸到约85个氨基酸的CTD；以及选自由以下组成的组的工程化的LHE：I-AabMI、I-AaeMI、I-AniI、I-ApaMI、I-CapIII、I-CapIV、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CpaMII、I-CpaMIII、I-CpaMIV、I-CpaMV、I-CpaV、I-CraMI、I-EjeMI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeMI、I-GzeMII、I-GzeMIII、I-HjeMI、I-LtrII、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MveMI、I-NcrII、I-Ncrl、I-NcrMI、I-OheMI、I-OnuI、I-OsoMI、I-OsoMII、I-OsoMIII、I-OsoMIV、I-PanMI、I-PanMII、I-PanMIII、I-PnoMI、I-ScuMI、I-SmaMI、I-SscMI以及I-Vdi141I或优选地I-CpaMI、I-HjeMI、I-OnuI、I-PanMI以及SmaMI或更优选地I-OnuI。
在具体实施例中，设想了结合到并且切割TCRα基因座的靶区的TALEN。“TALEN”是指包括本文其它地方设想的工程化的TALE DNA结合结构域和核酸内切酶结构域(或其核酸内切酶半结构域)的工程化的核酸酶，并且任选地包括一个或多个接头和/或额外的功能结构域，例如，展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶(例如，Trex2)、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶结构域。在具体实施例中，可以使用展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶(例如，Trex2)、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性的末端加工酶将TALEN引入到T细胞中。TALEN和3′加工酶可以单独地引入例如在不同的载体或单独的mRNA中或一起引入例如作为融合蛋白，或者引入在由病毒自切割肽或IRES元件分离的多顺反子构建体中。
在一个实施例中，使用两个TALEN实现靶向双链切割，每个TALEN包括可以用于重组具有催化活性的切割结构域的核酸内切酶半结构域。在另一个实施例中，使用包括一个TALE DNA结合结构域和两个核酸内切酶半结构域的单个多肽实现靶向双链切割。
在具体实施例中设想的TALEN包括NTD；包括约3个到30个重复单元例如约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个重复单元的TALE DNA结合结构域；以及核酸内切酶结构域或半结构域。
在具体实施例中设想的TALEN包括NTD；包括约3.5个到30.5个重复单元例如约3.5个、4.5个、5.5个、6.5个、7.5个、8.5个、9.5个、10.5个、11.5个、12.5个、13.5个、14.5个、15.5个、16.5个、17.5个、18.5个、19.5个、20.5个、21.5个、22.5个、23.5个、24.5个、25.5个、26.5个、27.5个、28.5个、29.5个或30.5个重复单元的TALE DNA结合结构域；CTD；以及核酸内切酶结构域或半结构域。
在具体实施例中设想的TALEN包括如本文其它地方所公开的约121个氨基酸到约137个氨基酸的NTD；包括约9.5个到约11.5个重复单元(即，约9.5个、约10.5个或约11.5个重复单元)的TALE DNA结合结构域；约20个氨基酸到约85个氨基酸的CTD；以及核酸内切酶结构域或半结构域。
在具体实施例中，TALEN包括类型限制性核酸内切酶型的核酸内切酶结构域。限制性核酸内切酶(限制酶)存在于许多物种中，并且能够与DNA(在识别位点处)进行序列特异性结合并且能够在结合位点处或附近切割DNA。某些限制酶(例如，IIS型)在从识别位点移除的位点处切割DNA，并且具有可分离的结合和核酸内切酶结构域。在一个实施例中，TALEN包括来自至少一个IIS型限制酶的核酸内切酶结构域(或核酸内切酶半结构域)以及本文其它地方设想的一个或多个TALE DNA结合结构域。
适合于在于具体实施例中设想的TALEN中使用的IIS型限制性核酸内切酶结构域的说明性实例包含在“rebase.neb.com/cgi-bin/sublist？S”处公开的至少1633种IIS型限制性核酸内切酶的核酸内切酶结构域。
适合于在于具体实施例中设想的TALEN中使用的IIS型限制性核酸内切酶结构域的额外的说明性实例包含选自由以下组成的组的核酸内切酶的核酸内切酶结构域：Aar I、Ace III、Aci I、Alo I、Alw26 I、Bae I、Bbr7 I、Bbv I、Bbv II、BbvC I、Bcc I、Bce83 I、BceA I、Bcef I、Bcg I、BciV I、Bfi I、Bin I、Bmg I、Bpu10 I、BsaX I、Bsb I、BscA I、BscGI、BseR I、BseY I、Bsi I、Bsm I、BsmA I、BsmF I、Bsp24 I、BspG I、BspM I、BspNC I、BsrI、BsrB I、BsrD I、BstF5 I、Btr I、Bts I、Cdi I、CjeP I、Drd II、EarI、Eci I、Eco31 I、Eco57 I、Eco57M I、Esp3 I、Fau I、Fin I、Fok I、Gdi II，Gsu I、Hga I、Hin4 II、Hph I、Ksp632 I，Mbo II、Mly I、Mme I、Mnl I、Pfl1108、I Ple I、Ppi I Psr I、RleA I、Sap I、SfaN I、Sim I、SspD5 I、Sth132 I、Sts I、TspDT I、TspGW I、Tth111 II、UbaP I、Bsa I以及BsmB I。
在一个实施例中，本文设想的TALEN包括Fok I IIS型限制性核酸内切酶的核酸内切酶结构域。
在一个实施例中，本文设想的TALEN包括TALE DNA结合结构域和来自至少一个IIS型限制性核酸内切酶的核酸内切酶半结构域以增强切割特异性，任选地其中核酸内切酶半结构域包括最小化或防止同源二聚化的一个或多个氨基酸取代或修饰。
适合于在于具体实施例中设想的具体实施例中使用的切割半结构域的说明性实例包含以下美国专利公开号中公开的切割半结构域：20050064474、20060188987、20080131962、20090311787；20090305346；20110014616以及20110201055，所述专利公开中的每一个通过引用以其全部内容并入本文。
在具体实施例中，设想了结合到并且切割TCRα基因座的靶位点的锌指核酸酶(ZFN)。“ZFN”是指包括一个或多个锌指DNA结合结构域和核酸内切酶结构域(或其核酸内切酶半结构域)的工程化的核酸酶，并且任选地包括一个或多个接头和/或额外的功能结构域，例如，展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶(例如，Trex2)、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶结构域。
在具体实施例中，可以使用展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶(例如，Trex2)、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性的末端加工酶将ZFN引入到T细胞中。ZFN和3′加工酶可以单独地引入例如在不同的载体或单独的mRNA中或一起引入例如作为融合蛋白，或者引入在由病毒自切割肽或IRES元件分离的多顺反子构建体中。
在一个实施例中，使用两个ZFN实现靶向双链切割，每个ZFN包括可以用于重组具有催化活性的切割结构域的核酸内切酶半结构域。在另一个实施例中，使用包括一个或多个锌指DNA结合结构域和两个核酸内切酶半结构域的单个多肽实现靶向双链切割。
在一个实施例中，ZNF包括本文其它地方设想的TALE DNA结合结构域、锌指DNA结合结构域以及本文其它地方设想的核酸内切酶结构域(或核酸内切酶半结构域)。
在一个实施例中，ZNF包括锌指DNA结合结构域以及本文其它地方设想的大范围核酸酶。
在具体实施例中，ZFN包括具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个或更多个锌指基序和一个核酸内切酶结构域(或核酸内切酶半结构域)的锌指DNA结合结构域。通常，单个锌指基序的长度为约30个氨基酸。锌指基序包含典型的C2H2锌指和如例如C3H锌指和C4锌指等非典型的锌指。
锌指结合结构域可以被工程化为结合任何DNA序列。已经识别了给定3 bp DNA靶序列的候选锌指DNA结合结构域，并且已经设计了用于将多个结构域连接成靶向对应复合DNA靶序列的多指肽的模块化装配策略。本领域已知的其它适当方法还可以用于设计和构造对锌指DNA结合结构域进行编码的核酸，例如，噬菌体展示、随机诱变、组合库、计算机/合理设计、亲和力选择、PCR、从cDNA或基因组库克隆、合成构造等。(参见例如美国专利号5,786,538；Wu等人，《美国国家科学院刊(PNAS)》92：344-348(1995年)；Jamieson等人，《生物化学(Biochemistry)》，33：5689-5695(1994年)；Rebar和Pabo，《科学》，263：671-673(1994年)；Choo和Klug，《美国国家科学院刊》91：11163-11167(1994年)；Choo和Klug，《美国国家科学院刊》91：11168-11172(1994年)；Desjarlais和Berg，《美国国家科学院刊》90：2256-2260(1993年)；Desjarlais和Berg，《美国国家科学院刊》89：7345-7349(1992年)；Pomerantz等人，《科学》267：93-96(1995年)；Pomerantz等人，《美国国家科学院刊》92：9752-9756(1995年)；Liu等人，《美国国家科学院刊》94：5525-5530(1997年)；Griesman和Pabo，《科学》，275：657-661(1997年)；Desjarlais和Berg，《美国国家科学院刊》91：11-99-11103(1994年))。
单独的锌指基序结合到三或四核苷酸序列。锌指结合结构域被工程化成与其结合的序列(例如，靶序列)的长度将决定工程化的锌指结合结构域中的锌指基序的数目。例如，对于其中锌指基序不结合到重叠子位点的ZFN，六核苷酸靶序列由双指结合结构域结合；九核苷酸靶序列由三指结合结构域等结合。在具体实施例中，靶位点中的单独锌指基序的DNA结合位点不需要是连续的，而是可以被一个或几个核苷酸分开，这取决于多指结合结构域中的锌指基序之间的接头序列的长度和性质。
在具体实施例中，本文设想的ZNF包括：锌指DNA结合结构域，其包括两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个或更多个锌指基序；以及来自至少一个IIS型限制性酶的核酸内切酶结构域或半结构域；以及本文其它地方设想的一个或多个TALE DNA结合结构域。
在具体实施例中，本文设想的ZNF包括：锌指DNA结合结构域，其包括三个、四个、五个、六个、七个或八个或更多个锌指基序；以及来自选自由以下组成的组的至少一个IIS型限制性酶的核酸内切酶结构域或半结构域：Aar I、Ace III、Aci I、Alo I、Alw26 I、Bae I、Bbr7 I、Bbv I、Bbv II、BbvC I、Bcc I、Bce83 I、BceA I、Bcef I、Bcg I、BciV I、Bfi I、BinI、Bmg I、Bpu10 I、BsaX I、Bsb I、BscA I、BscG I、BseR I、BseY I、Bsi I、Bsm I、BsmA I、BsmF I、Bsp24 I、BspG I、BspM I、BspNC I、Bsr I、BsrB I、BsrD I、BstF5 I、Btr I、Bts I、Cdi I、CjeP I、Drd II、EarI、Eci I、Eco31 I、Eco57 I、Eco57M I、Esp3 I、Fau I、Fin I、Fok I、Gdi II，Gsu I、Hga I、Hin4 II、Hph I、Ksp632 I，Mbo II、Mly I、Mme I、Mnl I、Pfl1108、I Ple I、Ppi I Psr I、RleA I、Sap I、SfaN I、Sim I、SspD5 I、Sth132 I、Sts I、TspDT I、TspGW I、Tth111 II、UbaP I、Bsa I以及BsmB I。
在具体实施例中，本文设想的ZNF包括：锌指DNA结合结构域，其包括三个、四个、五个、六个、七个或八个或更多个锌指基序；以及来自Fok I IIS型限制性核酸内切酶的核酸内切酶结构域或半结构域。
在一个实施例中，本文设想的ZFN包括锌指DNA结合结构域和来自至少一个IIS型限制性核酸内切酶的核酸内切酶半结构域以增强切割特异性，任选地其中核酸内切酶半结构域包括最小化或防止同源二聚化的一个或多个氨基酸取代或修饰。
在各个实施例中，CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关联的)核酸酶系统被工程化成结合到一个或多个TCRα基因座并且在一个或多个TCRα基因座中引入单链切口或双链断裂(DSB)。CRISPR/Cas核酸酶系统是一种基于可以用于哺乳动物基因组工程的细菌系统的最近工程化的核酸酶系统。参见例如Jinek等人(2012年)《科学》337：816-821；Cong等人(2013年)《科学》339：819-823；Mali等人(2013年)《科学》339：823-826；Qi等人(2013年)《细胞(Cell)》152：1173-1183；Jinek等人(2013年)《e生命(eLife)》2：e00471；David Segal(2013年)《e生命》2：e00563；Ran等人(2013年)《自然实验手册(NatureProtocols)》8(11)：2281-2308；Zetsche等人(2015年)《细胞》163(3)：759-771，所述文献中的每一个通过引用以其全部内容并入本文。
在一个实施例中，CRISPR/Cas核酸酶系统包括Cas核酸酶和将Cas核酸酶募集到靶位点的一个或多个RNA，例如反式活化cRNA(tracrRNA)和CRISPR RNA(crRNA)或单向导RNA(sgRNA)。crRNA和tracrRNA可以被工程化成在本文中被称为“单向导RNA”或“sgRNA”的一个多核苷酸序列。
在一个实施例中，Cas核酸酶被工程化为双链DNA核酸内切酶或切口酶或催化死亡的Cas，并且与crRNA和tracrRNA或sgRNA形成靶络合物以便对位于TCRα基因座内的原型间隔靶序列进行位点特异性DNA识别和和位点特异性切割。原型间隔基序邻接短的原型间隔相邻基序(PAM)，其在募集Cas/RNA络合物中起作用。Cas多肽识别对Cas多肽具有特异性的PAM基序。因此，CRISPR/Cas系统可以用于靶向和切割两侧为对特定Cas多肽具有特异性的特定3′PAM序列的双链多核苷酸序列的一条链或两条链。可以使用生物信息学或使用实验方法识别PAM。Esvelt等人，2013年，《自然方法(Nature Methods)》，10(11)：1116-1121，所述文献通过引用以其全部内容并入本文。
在一个实施例中，Cas核酸酶包括一个或多个异源DNA结合结构域，例如TALE DNA结合结构域或锌指DNA结合结构域。Cas核酸酶与TALE或锌指DNA结合结构域的融合增加了DNA切割效率和特异性。在一个具体实施例中，Cas核酸酶任选地包括一个或多个接头和/或额外的功能结构域，例如，展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶(例如，Trex2)、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性的末端加工酶的末端加工酶结构域。在具体实施例中，可以使用展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶(例如，Trex2)、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性的末端加工酶将Cas核酸酶引入到T细胞中。Cas核酸酶和3′加工酶可以单独地引入例如在不同的载体或单独的mRNA中或一起引入例如作为融合蛋白，或者引入在由病毒自切割肽或IRES元件分离的多顺反子构建体中。
在各个实施例中，Cas核酸酶是Cas9或Cpf1。
适合于在于具体实施例中设想的具体实施例中使用的Cas9多肽的说明性实例可以从包括但不限于以下的细菌物种获得：屎肠球菌、肠球菌、无害学斯特菌、单核细胞增生李斯特氏菌、斯氏利斯特菌、伊氏利斯特菌、无乳链球菌、咽峡炎链球菌、牛链球菌、停乳链球菌、马肠链球菌、解没食子酸链球菌、猕猴链环菌、变异链球菌、假链球菌、酿脓链球菌、嗜热链球菌、格氏链球菌、婴儿链球菌、马链球菌、缓症链球菌、巴氏链球菌、猪链球菌、前庭链球菌、血链球菌、道恩链球菌、杆状奈瑟菌、灰色奈瑟菌、浅黄色奈瑟菌、乳糖奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、浅黄奈瑟菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸菌、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瘤胃乳酸杆菌、唾液乳杆菌、旧金山乳杆菌、拥挤棒杆菌、白喉杆菌、马氏棒状杆菌、空肠弯曲杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌、文氏密螺旋体、蚀疮溃疡密螺旋体以及齿垢密螺旋体。
适合于在于具体实施例中设想的具体实施例中使用的Cpf1多肽的说明性实例可以从包括但不限于以下的细菌物种获得：弗朗西斯菌属、氨基酸球菌属、普鲁氏杆菌属、毛螺科菌属等。
Cas9直系同源物的保守区包含中心HNH核酸内切酶结构域和分裂的RuvC/RNAaseH结构域。Cpf1直系同源物具有RuvC/RNase H结构域但没有可辨别的HNH结构域。HNH和RuvC样结构域各自负责切割双链DNA靶序列的一条链。Cas9核酸酶多肽的HNH结构域切割与tracrRNA：crRNA或sgRNA互补的DNA链。Cas9核酸酶的RuvC样结构域切割不与tracrRNA：crRNA或sgRNA互补的DNA链。预测Cpf1充当二聚体，其中Cpf1的每个RuvC样结构域切割靶位点的互补链或非互补链。在具体实施例中，设想了Cas9核酸酶变体(例如，Cas9切口酶)，其在HNH或RuvC样核酸内切酶结构域中包括降低或消除变体结构域的核酸酶活性的一个或多个氨基酸添加、缺失、突变或取代。
降低或消除结构域中的核酸酶活性的Cas9HNH突变的说明性实例包含但不限于：酿脓链球菌(D10A)；嗜热链球菌(D9A)；齿垢密螺旋体(D13A)；以及脑膜炎双球菌(D16A)。
降低或消除结构域中的核酸酶活性的Cas9RuvC样结构域突变的说明性实例包含但不限于：酿脓链球菌(D839A、H840A或N863A)；嗜热链球菌(D598A、H599A或N622A)；齿垢密螺旋体(D878A、H879A或N902A)；以及脑膜炎双球菌(D587A、H588A或N611A)。
E.嵌合抗原受体(CAR)
在具体实施例中，包括一个或多个经修饰的TCRα等位基因的T细胞被工程化为表达一个或多个嵌合抗原受体(CAR)。
在一个实施例中，通过在一个或多个TCRα等位基因中引入DSB并且随后使用对CAR进行编码的载体转导T细胞来工程化T细胞。
在一个实施例中，通过在存在对CAR进行编码的供体修复模板的情况下在一个或多个TCRα等位基因中引入DSB来工程化T细胞。在具体实施例中，CAR被插入在单个TCRα等位基因中的DSB处。
在一个实施例中，本文设想的工程化的T细胞包括未插入在TCRα等位基因处的CAR。
在各个实施例中，经基因组编辑的T细胞表达将细胞毒性重定向朝向肿瘤细胞的CAR。CAR是将针对靶抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体的特异性与T细胞受体活化细胞内结构域组合以产生嵌合蛋白的分子，所述嵌合蛋白展现出特异性抗肿瘤细胞免疫活性。如本文所使用的，术语“嵌合”描述由不同蛋白质的部分或来自不同来源的DNA构成。
在各个实施例中，CAR包括结合到特异性靶抗原的细胞外结构域(也被称为结合结构域或抗原特异性结合结构域)、跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域。CAR的主要特性是其能够重定向免疫效应细胞特异性，由此触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用或产生可以以主要组织相容性(MHC)独立的方式介导靶抗原表达细胞的细胞死亡的分子，利用单克隆抗体、可溶配体或细胞特异性共同受体的细胞特异性靶向能力。
在具体实施例中，CAR包括特异性结合到在肿瘤细胞上表达的靶多肽例如靶抗原的细胞外结合结构域。如本文所使用的，术语“结合结构域”、“细胞外结构域”、“细胞外结合结构域”、“抗原结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”以及“细胞外抗原特异性结合结构域”被互换使用，并且为CAR提供特异性结合到兴趣靶抗原的能力。结合结构域可以包括拥有特异性识别和结合到生物分子(例如，细胞表面受体或肿瘤蛋白、脂质、多糖或其它细胞表面靶分子或其组分)的能力的任何蛋白质、多肽、寡肽或肽。结合结构域包含兴趣生物分子的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的结合配偶体。
在具体实施例中，细胞外结合结构域包括抗体或其抗原结合片段。
“抗体”是指作为包括至少轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽的结合剂，所述轻链或重链免疫球蛋白可变区特异性识别和结合靶抗原的表位，如肽、脂质、多糖或含有抗原决定簇的核酸，如由免疫细胞识别的核酸。抗体包含抗原结合片段，例如，骆驼Ig(骆驼科抗体或其VHH片段)、Ig NAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、bis-scFv、(scFv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)以及单结构域抗体(sdAb、纳米抗体)或其其它抗体片段。所述术语还包含基因工程形式，如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异缀合抗体(如双特异性抗体)及其抗原结合片段。还参见，《皮尔斯目录和手册(Pierce Catalog and Handbook)》，1994年到1995年(伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.))；Kuby，《免疫学期刊(J.，Immunology)》，第3版，纽约W.H.Freeman&Co.，1997年。
在一个优选实施例中，结合结构域是scFv。
在另一个优选实施例中，结合结构域是骆驼科抗体。
在具体实施例中，所述CAR包括结合选自由以下组成的组的抗原的细胞外结构域：α叶酸受体、5T4、αvβ6整联蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包含ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、存活蛋白、TAG72、TEM、VEGFR2以及WT-1。
在具体实施例中，所述CAR包括结合选自由以下组成的组的抗原的细胞外结构域：BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1和TAG72。
在具体实施例中，CAR包括细胞外结合结构域，例如抗体或结合抗原的其抗原结合片段，其中抗原是MHC-肽络合物，如I类MHC-肽络合物或II类MHC-肽络合物。
在某些实施例中，CAR在各个结构域之间包括接头残基。“可变区连接序列”是将重链可变区连接到轻链可变区，并且提供与所述两个子结合结构域的相互作用相容的间隔功能的氨基酸序列，使得所得多肽保留与包括相同轻链可变区和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和力。在具体实施例中，接头分离一个或多个重链可变结构域或轻链可变结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。在具体实施例中，CAR包括一个、两个，三个、四个或五个或更多个接头。在具体实施例中，接头的长度为约1个氨基酸到约25个氨基酸、约5个氨基酸到约20个氨基酸、或约10个氨基酸到约20个氨基酸或任何中间长度的氨基酸。在一些实施例中，接头的长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25或更多个氨基酸。
在具体实施例中，CAR的结合结构域之后是一个或多个“间隔结构域”，所述间隔结构域是指使抗原结合结构域移动远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化的区(Patel等人，《基因疗法(Gene Therapy)》，1999年；6：412-419)。间隔结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施例中，间隔结构域是免疫球蛋白的一部分，包含但不限于一个或多个重链恒定区，例如CH2和CH3。间隔结构域可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
在一个实施例中，间隔结构域包括IgG1、IgG4或IgD的CH2和CH3。
在一个实施例中，CAR的结合结构域连接到一个或多个“铰链结构域”，这起到将抗原结合结构域定位成远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化的作用。CAR通常在结合结构域与跨膜结构域(TM)之间包括一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
适合于在本文所描述的CAR中使用的示例性铰链结构域包含衍生自如CD8α和CD4等1型膜蛋白的细胞外区的铰链区，所述铰链区可以是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。在另一个实施例中，铰链结构域包括CD8α铰链区。
在一个实施例中，铰链是PD-1铰链或CD152铰链。
“跨膜结构域”是CAR的一部分，所述一部分融合细胞外结合部分和细胞内信号传导结构域并且将CAR锚定到免疫效应细胞的质膜上。TM结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。
示例性TM结构域可以衍生自以下(即，至少包括以下的一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α或β链、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154以及PD-1。
在一个实施例中，CAR包括衍生自CDSα的TM结构域。在另一个实施例中，本文设想的CAR包括衍生自CD8α的TM结构域和优选地长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸之间的连接TM结构域和CAR的细胞内信号传导结构域的短的寡肽接头或多肽接头。甘氨酸-丝氨酸接头提供特别合适的接头。
在具体实施例中，CAR包括细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指CAR的一部分，所述一部分参与将有效CAR结合靶抗原的信息转导到免疫效应细细胞内部以引发效应细胞功能，例如，活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒活性，包含向CAR结合的靶细胞释放细胞毒性因子或使用与细胞外CAR结构域进行的抗原结合引发的其它细胞应答。
因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，所述一部分转导效应子功能信号并且引导细胞执行专门功能。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个结构域。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度上，可以使用这种截短的部分代替整个结构域，只要其转导效应子功能信号即可。术语细胞内信号传导结构域意在包含细胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
已知的是，仅通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，T细胞活化可以说成是由两种不同类别的细胞内信号传导结构域介导的：初级信号传导结构域，其通过TCR(例如，TCR/CD3络合物)启动抗原依赖性初级活化；以及共刺激信号传导结构域，其是以抗原非依赖性方式起作用以提供次级信号或共刺激信号。在优选实施例中，CAR包括细胞内信号传导结构域，其包括一个或多个“共刺激信号传导结构域”和一个“初级信号传导结构域”。
初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调控TCR络合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。
含有适合于在于具体实施例中设想的CAR中使用的初级信号传导结构域的ITAM的说明性实例包含衍生自以下的ITAM：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d。在具体地优选实施例中，CAR包括一个CD3ζ初级信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。细胞内初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以以任何顺序与跨膜结构域的羧基末端串联连接。
在具体实施例中，CAR包括用于增强表达CAR受体的T细胞的疗效和扩增的一个或多个共刺激信号传导结构域。如本文所使用的，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。
适合于在于具体实施例中设想的CAR中使用的这种共刺激分子的说明性实例包含：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM以及ZAP70。在一个实施例中，CAR包括选自由CD28、CD137和CD134组成的组的一个或多个共刺激信号传导结构域以和一个CD3ζ初级信号传导结构域。
在各个实施例中，CAR包括：结合选自由以下组成的组的抗原的细胞外结构域：BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1和TAG72；从选自由以下组成的组的多肽中分离的跨膜结构域：CD4、CD8α、CD154和PD-1；从选自由以下组成的组的多肽中分离的一个或多个细胞内共刺激信号结构域：CD28、CD134和CD137；以及从选自由以下组成的组的多肽中分离的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
F.多肽
本文设想了各种多肽，包含但不限于CAR、大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN和Cas核酸酶、融合多肽以及表达多肽的载体。
除非相反地指出，否则“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”被互换使用，并且根据常规含义，即作为氨基酸序列。在一个实施例中，“多肽”包含融合多肽和其它变体。可以使用各种熟知的重组和/或合成技术制备多肽。多肽不限于特定长度，例如，其可以包括全长蛋白质序列、全长蛋白质片段或融合蛋白质，并且可以包含多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等以及本领域已知的其它修饰，不论其是天然存在的还是非天然存在的。
如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从细胞环境中并且根据与细胞的其它组分的关联进行体外分离和/或纯化而来的肽或多肽分子，即，其与体内物质没有显著关联。
在具体实施例中设想的多肽的说明性实例包含但不限于大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN、Cas核酸酶、末端加工核酸酶、治疗性多肽以及融合多肽及其变体。
多肽变体包含具有生物活性的“多肽片段”。如本文所使用的，术语“具有生物活性的片段”或“具有最小生物活性的片段”是指保留天然存在的多肽活性的至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％的多肽片段。多肽片段是指多肽，所述多肽可以是具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或天然存在的或重组产生的多肽的一个或多个氨基酸的内部缺失或取代的单体或多聚体。在某些实施例中，多肽片段可以包括长度为至少5个到约1700个氨基酸的氨基酸链。应理解的是，在某些实施例中，片段长度为至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个、1600个、1700个或更多个氨基酸。
多肽片段的说明性实例包含DNA结合结构域、核酸酶结构域、抗体片段、细胞外配体结合结构域、信号传导结构域、跨膜结构域、多聚化结构域等。
多肽包含“多肽变体”。多肽变体与天然存在的多肽的不同之处可以在于一个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入。这些变体可以是天然存在的或可以通过合成产生，例如，通过修饰上述多肽序列的一个或多个氨基酸。例如，在具体实施例中，可能期望通过向将一个或多个取代、缺失、添加和/或插入引入到多肽中来改善多肽的生物学特性。在具体实施例中，多肽包含与本文设想的任何参考序列具有至少约65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的多肽，通常其中变体保持参考序列的至少一种生物活性活性。
如上文所述，可以以各种方式改变多肽，包含氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于这种操纵的方法是本领域中所公知的。例如，参考多肽的氨基酸序列变体可以通过DNA的突变制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中是熟知的。参见例如Kunkel(1985年，《美国国家科学院院刊》，82：488-492)，Kunkel等人(1987年，《酶学方法(Methods inEnzymol)》，154：367-382)，美国专利号4,873,192，Watson，J.D.等人(《基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》，第四版，Benjamin/Cummings，加利福尼亚州门洛帕克市，1987年)以及其中引用的参考文献。关于不影响兴趣蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人，(1978年)《蛋白序列和结构图谱(Atlas of ProteinSequence and Structure)》(美国国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.)华盛顿特区)的模型中找到。
在某些实施例中，变体将含有一个或多个保守取代。“保守取代”是其中氨基酸被具有相似特性的另一氨基酸取代使得肽化学领域的技术人员将预期多肽的次级结构和亲水性性质基本上不变的保守取代。可以在于具体实施例中设想的多核苷酸和多肽的结构中进行修饰，多肽包含具有至少约并且仍然获得对具有所需特征的变体或衍生多肽进行编码的功能分子的多肽。当期望改变多肽的氨基酸序列以产生等同的或甚至改进的变体多肽时，本领域技术人员例如可以例如根据表1改变对DNA序列进行编码的密码子中的一个或多个。
表1：氨基酸密码子
可以使用本领域熟知的计算机程序如DNASTAR、DNA Strider、Geneious、MacVector或Vector NTI软件找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除生物活性的指南。优选地，本文公开的蛋白质变体的氨基酸变化是保守氨基酸变化，即带相似电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守氨基酸改变涉及取代与其侧链相关的氨基酸家族中的之一。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在肽或蛋白质中，适当的氨基酸保守取代对于本领域的技术人员来说是已知的，并且通常可以在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。本领域的技术人员认识到，一般而言，多肽的非必需区的单氨基酸取代基本上不更改生物活性(参见，例如，Watson等人，《基因的分子生物学》，第4版，1987年，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页)。
多肽变体进一步包含糖基化形式，与其它分子的聚集缀合物以及与不相关化学部分(例如，聚乙二醇化分子)的共价缀合物。如本领域已知的，可以通过将官能团连接到存在于氨基酸链中或N-末端残基或C-末端残基处的基团来制备共价变体。变体还包含等位基因变体、物种变体和突变蛋白。不影响蛋白质功能活性的区的截短或缺失也是变体。
在一个实施例中，在期望表达两个或更多个多肽的情况下，如本文其它地方所公开的，对其进行编码的多核苷酸序列可以通过IRES序列分开。
具体实施例中设想的多肽包含融合多肽。在具体实施例中，提供了融合多肽和对融合多肽进行编码的多核苷酸。融合多肽和融合蛋白是指具有至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多肽片段的多肽。
在另一个实施例中，两个或更多个多肽可以被表达为融合蛋白，所述融合蛋白包括本文其它地方公开的一个或多个自切割多肽序列。
在一个实施例中，本文设想的融合蛋白包括一个或多个DNA结合结构域和一个或多个核酸酶，以及一个或多个接头和/或自切割多肽。
在一个实施例中，本文设想的融合蛋白包括一个或多个细胞外结构域、细胞外配体结合结构域或抗原结合结构域、跨膜结构域和/或一个或多个细胞内信号传导结构域，以及任选地一个或多个多聚化结构域。
在具体实施例中设想的融合蛋白的说明性实例，多肽包含具有至少约的多肽，包含但不限于：megaTAL、TALEN、ZFN、Cas核酸酶、末端加工核酸酶、CAR以及其它多肽。
融合多肽通常使C-末端连接到N-末端，但是其还可以是C-末端连接到C-末端、N-末端连接到N-末端或N-末端连接到C-末端。在具体实施例中，融合蛋白的多肽可以呈任何顺序。融合多肽或融合蛋白还可以包含保守修饰的变体、多态变体、等位基因、突变体、子序列以及种间同源物，只要保留融合多肽的期望活性即可。融合多肽可以通过化学合成方法或通过两个部分之间的化学连接产生，或者通常可以使用其它标准技术制备。包括融合多肽的连接DNA序列可操作地连接到如本文其它地方所公开的适当的转录或翻译控制元件。
融合多肽可以任选地包括可以用于连接多肽内的一个或多个多肽或结构域的接头。肽接头序列可以用于将任何两个或更多个多肽组分分开足够的距离，以确保每个多肽折叠成其适当的次级结构和三级结构，以便使多肽结构域发挥其期望功能。使用本领域的标准技术将这种肽接头序列并入到融合多肽中。可以基于以下因素选择适当的肽接头序列：(1)其能够采用灵活的扩展构象；(2)其不能采用可以与第一多肽和第二多肽上的功能性表位相互作用的次级结构；以及(3)缺乏可以与多肽功能性表位反应的疏水残基或带电残基。优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。还可以在接头序列中使用其它近中性氨基酸，如Thr和Ala。可以有效地用作接头的氨基酸序列包含在Maratea等人，《基因(Gene)》，40：39-46，1985年；Murphy等人，《美国国家科学院院刊》，83：8258-8262，1986年；美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180中公开的氨基酸序列。当特定融合多肽片段含有可以用于分离功能结构域和防止空间干扰的非必需N-末端氨基酸区时，不需要接头序列。优选的接头通常是被合成为重组融合蛋白的一部分的柔性氨基酸子序列。接头多肽的长度可以为1个与200个氨基酸之间、长度可以为1个与100个氨基酸之间或者长度可以为1个与50个氨基酸之间，包含其间的所有整数值。
示例性接头包含但不限于以下氨基酸序列：甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n，其中n是至少为一、二、三、四或五的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；GGG(SEQ ID NO：14)；GGG(SEQ ID NO：15)；TGEKP(SEQ ID NO：16)(参见例如Liu等人，《美国国家科学院刊》5525-5530(1997年))；GGRR(SEQ ID NO：17)(Pomerantz等人，1995年，同上)；(GGGGS)n(SEQ ID NO：18)(Kim等人，《美国国家科学院刊》93，1156-1160(1996年)；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO：19)(Chaudhary等人，1990年，《美国国家科学院院刊》，87：1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：20)(Bird等人，1988年，《科学》，242：423-426)，GGRRGGGS(SEQ ID NO：21)；LRQRDGERP(SEQ ID NO：22)；LRQKDGGGSERP(SEQID NO：23)；LRQKD(GGGS)2ERP(SEQ ID NO：24)。可替代地，可以使用能够对DNA结合位点和肽本身两者进行建模的计算机程序或通过噬菌体展示方法合理地设计柔性接头(Desjarlais和Berg，《美国国家科学院刊》90：2256-2260(1993年)《美国国家科学院刊》91：11099-11103(1994年))。
融合多肽可以进一步在本文所描述的多肽结构域中的每一个之间或在内源性开放阅读框与由供体修复模板编码的多肽之间包括多肽切割信号。另外，可以将多肽切割位点置于任何接头肽序列中。示例性多肽切割信号包含多肽切割识别位点，如蛋白酶切割位点、核酸酶切割位点(例如，稀有限制酶识别位点、自切割核酶识别位点)和自切割病毒寡肽(参见，Felipe和Ryan，2004年，《转运(Traffic)》，5(8)；616-26)。
适当的蛋白酶切割位点和自切割肽对于本领域的技术人员来说是已知的(参见例如，Ryan等人，1997年，《普通病毒学期刊(J.Gener.Virol.)》78：699-722；Scymczak等人，(2004年)，《自然生物技术(Nature Biotech.)》，5，589-594)。示例性蛋白酶切割位点包含但不限于马铃薯Y病毒酶(例如，烟草蚀刻病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒P1(p35)蛋白酶、副病毒Na蛋白酶、副病毒RNA-2编码蛋白酶、口疮病毒L蛋白酶、肠道病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、核糖酸3C蛋白酶、豇豆花叶病毒24K蛋白酶、线虫传多面体病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球形病毒)3C样蛋白酶、PYVF(欧洲防风黄色病毒)3C样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa以及肠激酶的切割位点。由于其高的切割严格性，在一个实施例中优选的是TEV(烟草蚀刻病毒)蛋白酶切割位点，例如EXXYXQ(G/S)(SEQ ID NO：25)，例如ENLYFQG(SEQ ID NO：26)和ENLYFQS(SEQ ID NO：27)，其中X表示任何氨基酸(通过TEV进行的切割发生在Q与G或Q与S之间)。
在某些实施例中，自切割多肽位点包括2A或2A样位点、序列或结构域(Donnelly等人，2001年，《普通病毒学期刊》82：1027-1041)。在具体实施例中，病毒2A肽是口疮病毒2A肽、马铃薯Y病毒2A肽或心脏病毒2A肽。
在一个实施例中，病毒2A肽选自由以下组成的组：口蹄疫病毒(FMDV)2A肽、马A型鼻炎病毒(EARV)2A肽、天牛亚种病毒(TAV)2A肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)2A肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。
表2中提供了2A位点的说明性实例。
表2：示例性2A位点包含以下序列：
SEQ ID NO：28 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO：29 ATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO：30 LLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO：31 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO：32 EGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO：33 LLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO：34 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：35 QCTNYALLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：36 LLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：37 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：38 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：39 LLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：40 LLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：41 TLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：42 LLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：43 NFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：44 QLLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：45 APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：46 VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQT
SEQ ID NO：47 LNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：48 LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：49 EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
G.多核苷酸
在具体实施例中，提供了对本文设想的多肽或融合多肽进行编码的多核苷酸。如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和DNA/RNA杂合体。多核苷酸可以是单链或双链的。多核苷酸包含但不限于：前信使RNA(前-mRNA)、信使RNA(mRNA)、RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、合成RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、tracrRNA、crRNA、单向导RNA(sgRNA)、合成RNA、基因组DNA(gDNA)、PCR扩增DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA或重组DNA。
多核苷酸是指长度为至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少5000个、至少10000或至少15000或更多个核苷酸的核苷酸的聚合形式，或者时核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者是任一类型核苷酸的修饰形式，以及所有中间长度。容易理解的是，在此上下文中，“中间长度”是指所引用值之间的任何长度，如6、7、8、9等，101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。在具体实施例中，多核苷酸或变体与参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在各个说明性实施例中，本文设想的多核苷酸包含但不限于对大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN、Cas核酸酶、末端加工核酸酶、CAR、治疗性多肽进行编码的多核苷酸以及包括表达载体、病毒载体和转移质粒的多核苷酸。
如本文所使用的，术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指显示出与参考多核苷酸序列或在下文限定的严格条件下和参考序列杂交的多核苷酸具有实质性序列同一性的多核苷酸。这些术语还涵盖通过至少一个核苷酸的添加、缺失、取代或修饰而区别于参考多核苷酸的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包含其中已经添加或缺失、或修饰或用不同核苷酸代替一个或多个核苷酸的多核苷酸。在这方面，本领域中充分理解的是，可以对参考多核苷酸作出包括突变、添加、缺失以及取代在内的某些改变，由此所改变的多核苷酸保留所述参考多核苷酸的生物功能或活性。
在一个实施例中，多核苷酸包括在严格条件下与靶核酸序列杂交的核苷酸序列。在“严格条件”下杂交描述了其中彼此至少60％完全相同的核苷酸序列保持杂交的杂交方案。通常，严格条件在限定的离子强度和pH下被选择为比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)，在所述温度下，与靶序列互补的探针中的50％在处于平衡时与靶序列杂交。由于靶序列在Tm下通常过量存在，所以所述探针中的50％在处于平衡时被占据。
叙述“序列同一性”或例如包括如本文所使用的“与...50％完全相同的序列”是指在一个比较窗口内，序列在逐核苷酸的基础上或在逐氨基酸的基础上完全相同的程度。因此，“序列一致性百分比”可以通过以下方式计算：在所述比较窗口内比较两个经最佳比对的序列，确定在这两个序列中出现完全相同的核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或一完全相同的氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys以及Met)的位置的数目，从而得到匹配位置的数目，将所述匹配位置的数目除以所述比较窗口中的位置的总数目(即，窗口大小)，并且将结果乘以100以得到序列一致性百分比。包含了与本文所描述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物活性。
用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包含“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“实质性同一性”。“参考序列”的长度为至少12个、但通常为15个到18个，并且通常为至少25个单体单元，包含核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸各自可以包括(1)在所述两个多核苷酸之间类似的序列(即，完整多核苷酸序列的一部分)，以及(2)在所述两个多核苷酸之间存在差异的序列，通常通过在“比较窗”内比较两个(或更多个)多核苷酸的序列执行所述两个多核苷酸间的序列比较以识别和比较具有序列相似性的局部区。“比较窗口”是指至少6个连续位置的概念性片段，通常为约50个到约100个，更通常为约100个到约150个，其中在所述两个序列最佳比对后将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。比较窗口可以包括与参考序列(其不包括添加或缺失)相比约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)以实现所述两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实施方式(美国威斯康星州575Science Drive Madison，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)，威斯康星遗传学软件包发布(Wisconsin Genetics Software Package Release)7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过检查和由所选择的各种方法中的任何一种产生的最佳比对(即，导致比较窗口的最高百分比同源性)来进行。还可以参考如例如在Altschul等人，1997年，《核酸研究》，25：3389中公开的BLAST程序家族。序列分析的详细论述可以见于Ausubel等人，《当代分子生物学实验手册》，约翰威立父子公司(John Wiley&Sons，Inc.)，1994年到1998年，第15章的第19.3单元。
如本文所用，“分离的多核苷酸”是指已经从其两侧的处于天然存在状态的序列纯化的多核苷酸，例如，已经从通常与其相邻的序列移除的DNA片段。在具体的实施例中，“分离的多核苷酸”是指互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、合成多核苷酸或自然中不存在并且已经通过人手制造的其它多核苷酸。
描述多核苷酸朝向的术语包含：5′(通常是具有游离磷酸基团的多核苷酸的末端)和3′(通常是具有游离羟基(OH)基团的多核苷酸的末端)。多核苷酸序列可以以5′-3′朝向或3′-5′朝向注释。对于DNA和mRNA，5′-3′链被指定为“有义”链、“加”链或“编码”链，因为其序列与前信使(前mRNA)[除了RNA中的尿嘧啶(U)，而不是DNA中的胸腺嘧啶(T)]的序列相同。对于DNA和mRNA，作为由RNA聚合酶转录的链的互补3′-5′链被称为“模板”链、“反义”链、“负”链或“非编码”链。如本文所使用的，术语“相反朝向”是指以3′-5′朝向书写的5′-3′序列或以5′-3′朝向书写的3′-5′序列。
术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，DNA序列5′A G T C A T G 3′的互补链是3′T C A G T A C 5′。后一序列通常被书写为左边是5′端并且右边是3′端的相反互补物5′C A T G A C T 3′。与其相反互补物相等的序列被称为回文序列。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则是匹配的。或者，在核酸之间可以存在“完全”或“全部”的互补性。
如本文所使用的术语“核酸盒”是指可以在载体内表达一个或多个RNA的基因序列。在一个实施例中，核酸盒含有一个或多个兴趣多核苷酸。在另一个实施例中，核酸盒含有与一个或多个兴趣多核苷酸可操作地连接的一个或多个表达控制序列。载体可以包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核酸盒。盒可以作为单个单元从其它多核苷酸序列中移除或插入到其它多核苷酸序列中，例如质粒或病毒载体。
多核苷酸包含一个或多个兴趣多核苷酸。如本文所使用的，术语“兴趣多核苷酸”是指对多肽或融合多肽进行编码的多核苷酸或充当用于转录抑制性多核苷酸的模板的多核苷酸，如本文所设想的。
此外，本领域的普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在许多可以对多肽或其变体进行编码的片段的核苷酸序列，如本文所设想的。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，在具体实施例中特别设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人类和/或灵长类动物密码子选择而优化的多核苷酸。在一个实施例中，提供了包括特定等位基因序列的多核苷酸。等位基因是内源多核苷酸序列，所述内源多核苷酸序列由于如核苷酸的缺失、添加和/或取代等一个或多个突变而改变。
在某个实施例中，兴趣多核苷酸包括对CAR进行编码的供体修复模板。
在某个实施例中，兴趣多核苷酸包括抑制性多核苷酸，包含但不限于crRNA、tracrRNA、单向导RNA(sgRNA)、siRNA、miRNA、shRNA、核酶或另一种抑制性RNA。
如本文所使用的，术语“siRNA”或“短干扰RNA”是指在动物中介导序列特异性转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传RNAi的过程的短多核苷酸序列(Zamore等人，2000年，《细胞》，101，25-33；Fire等人，1998年，《自然(Nature)》，391，806；Hamilton等人，1999年，《科学》，286，950-951；Lin等人，1999年，《自然》，402，128-129；Sharp，1999年，《基因与发育(Genes&Dev.)》，13，139-141；以及Strauss，1999年，《科学》，286，886)。
如本文所使用的，术语“miRNA”或“微RNA”是指20个到22个核苷酸的小型非编码RNA，通常从被称为前miRNA的约70个核苷酸折回RNA前体结构切除。miRNA以两种方式中的之一负面地调控其靶，这取决于miRNA与靶之间的互补程度。
如本文所使用的，术语“shRNA”或“短发夹RNA”是指由单个自互补RNA链形成的双链结构。
如本文所使用的，术语“核酶”是指能够对靶mRNA进行位点特异性切割的催化活性RNA分子。
在一个实施例中，供体修复模板包括抑制性RNA，所述抑制性RNA包括一个或多个调节序列，如例如强组成性pol III，例如，如本文其它地方所描述的人类或小鼠U6 snRNA启动子、人类和小鼠H1 RNA启动子、或人类tRNA-val启动子或强组成性pol II启动子。
如本文其它地方所公开的或如本领域已知的，无论编码序列本身的长度如何，具体实施例中设想的多核苷酸可以与其它DNA序列组合，如启动子和/或增强子、非翻译区(UTR)、Kozak序列、多腺苷酸化信号、额外的限制酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如，LoxP位点、FRT位点和Att位点)、终止密码子、转录终止信号以及对自切割多肽、表位标记进行编码的多核苷酸，使得所述多核苷酸的总长度可以显著变化。因此，在具体的实施例中设想了可以采用几乎任何长度的多核苷酸片段，其总长度优选地受制备的容易性和在预期的重组DNA方案中的使用的限制。
可以使用本领域中已知和可获得的各种既定技术中的任何一种来制备、操纵、表达和/或递送多核苷酸。为了表达期望多肽，可以将对多肽进行编码的核苷酸序列插入到适当的载体中。
载体的说明性实例包含但不限于：质粒、自主复制序列和转座元件，例如睡美人(Sleeping Beauty)、PiggyBac。
载体的另外的说明性实例包含但不限于：质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、如λ噬菌体或M13噬菌体等噬菌体以及动物病毒。
可以用作载体的病毒的说明性实例包含但不限于：逆转录病毒(包含慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒以及乳多空病毒(例如SV40)。
表达载体的说明性实例包含但不限于用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体(Promega)；用于在哺乳动物细胞中进行慢病毒介导的基因转移和表达的pLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(英杰公司(Invitrogen))。在具体实施例中，本文公开的多肽的编码序列可以连接到用于在哺乳动物细胞中表达多肽的这种表达载体中。
在具体实施例中，载体是附加型载体或在染色体外维持的载体。如本文所使用的，术语“附加型”是指能够复制而不整合到宿主的染色体DNA中并且不会从分裂的宿主细胞中逐渐丧失的载体，这也意味着所述载体在染色体外或附加地复制。所述载体被工程化成含有DNA复制起点的编码序列或来自α、β或γ疱疹病毒的“ori”、腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒或酵母。通常，宿主细胞包括激活复制的病毒复制反式激活蛋白。α疱疹病毒具有相对短的生殖周期、变化的宿主范围，有效地破坏受感染的细胞并且主要在感觉神经节中建立潜伏感染。α疱疹病毒的说明性实例包含HSV 1、HSV 2和VZV。β疱疹病毒具有长的生殖周期和受限的宿主范围。受感染的细胞通常会扩大。可以在血液、肾脏、分泌腺和其它组织的白细胞中维持潜伏期。β疱疹病毒的说明性实例包含CMV、HHV-6和HHV-7。γ-疱疹病毒对T淋巴细胞或B淋巴细胞具有特异性，并且通常在淋巴组织中展示出潜伏期。γ疱疹病毒的说明性实例包含EBV和HHV-8。
表达载体中存在的“表达控制序列”、“控制元件”或“调控序列”是载体——复制起点——的那些非翻译区、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)内含子、多腺苷酸化序列、5′和3′非翻译区——其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。这些元件的强度和特异性可能不同。取决于所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数目的适当转录和翻译元件，包含普遍存在的启动子和诱导型启动子。
在具体实施例中，多核苷酸是载体，包含但不限于表达载体和病毒载体，并且包含外源控制序列、内源控制序列或异源控制序列，如启动子和/或增强子。“内源控制序列”是与基因组中的给定基因天然连接的序列。“外源控制序列”是通过基因操纵(即，分子生物学技术)与被放置成与基因并置使得此基因的转录由所连接的增强子/启动子引导的序列。“异源控制序列”是与遗被基因操纵的细胞来自不同物种的外源序列。
如本文所使用的术语“启动子”是指与RNA聚合酶结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶启动并且转录与可操作地连接到启动子的多核苷酸。在具体实施例中，在哺乳动物细胞中起作用的启动子包括位于转录启动位点上游大约25个到30个碱基的富含AT的区和/或存在于转录起始上游70个到80个碱基处的另一序列，其中N可以是任何核苷酸的CNCAAT区。
术语“增强子”是指含有能够提供增强的转录的序列并且在某些情况下可以独立于其相对于另一控制序列的朝向而起作用的DNA片段。增强子可以与启动子和/或其它增强子元件协同地或相加地起作用。术语“启动子/增强子”是指含有能够提供启动子和增强子功能的序列的DNA片段。
术语“可操作地连接”是指并置，其中所描述的组分处于允许其以其预期方式起作用的关系。在一个实施例中，所述术语是指核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)与第二多核苷酸序列例如兴趣多核苷酸之间的功能性连接，其中表达控制序列引导对应于第二序列的核酸的转录。
如本文所使用的，术语“组成性表达控制序列”是指连续地或连续不断地允许可操作地连接的序列的转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成性表达控制序列可以是允许在各种各样的细胞和组织类型中表达的“普遍存在的”启动子、增强子或启动子/增强子或分别允许在受限种类的细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子。
适合于在具体实施例中使用的示例性普遍存在的表达控制序列包含但不限于：巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、H5、来自牛痘病毒的P7.5启动子和P11启动子、延伸因子1-α(EF1α)启动子、早期生长应答1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ、成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人类ROSA26基因座(Irions等人，《自然生物技术》，25，1477-1482(2007年))、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增殖性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失的d1587rev引物结合位点取代的(MND)启动子(Challita等人，《病毒学期刊(J Virol.)》，69(2)：748-55(1995年))。
在具体实施例中，可能期望使用细胞、细胞类型、细胞谱系或组织特异性表达控制序列来实现期望多核苷酸序列的细胞类型特异性、谱系特异性或组织特异性表达(例如，仅在细胞类型、细胞谱系或组织的亚群中或在发育的特定阶段表达编码多肽的特定核酸)。
如本文所使用的，“条件表达”可以指任何类型的条件表达，包含但不限于诱导型表达；可抑制的表达；在具有特定生理、生物或疾病状态等的细胞或组织中表达。此定义不旨在排除细胞类型或组织特异性表达。某些实施例提供了兴趣多核苷酸的条件表达，例如，通过使细胞、组织、生物等受到导致多核苷酸被表达或导致由兴趣多核苷酸编码的多核苷酸的表达增加或减少的处理或条件来控制表达。
诱导型启动子/系统的说明性实例包含但不限于：类固醇诱导型启动子如编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(通过用对应的激素处理可诱导)、金属硫蛋白启动子(可通过各种重金属处理诱导)、MX-1启动子(可通过干扰素诱导)、“基因开关(GeneSwitch)”米非司酮可调节系统(Sirin等人，2003年，《基因》，323：67)、cumate诱导型基因开关(WO 2002/088346)、四环素依赖性调节系统等。
还可以通过使用位点特异性DNA重组酶实现条件表达。根据某些实施例，多核苷酸包括用于由位点特异性重组酶介导的重组的至少一个(通常两个)位点。如本文所使用的，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包含参与重组反应的切除或整合蛋白、酶、辅因子或相关联的蛋白，所述重组反应涉及一个或多个重组位点(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)，所述重组位点可以是野生型蛋白质(参见，Landy，《生物技术当前述评(Current Opinion in Biotechnology)》，3：699-707(1993年))或突变体、衍生物(例如，含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段及其变体。适合于在具体实施例中使用的重组酶的说明性实例包含但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3游离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1以及ParA。
多核苷酸可以包括各种各样的位点特异性重组酶中的任何一种的一个或多个重组位点。应当理解的是，位点特异性重组酶的靶位点是整合载体例如逆转录病毒载体或慢病毒载体所需的任何一个或多个位点的补充。如本文所使用的，术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指重组酶识别和结合到的特定核酸序列。
例如，Cre重组酶的一个重组位点是loxP，其是34碱基对序列，所述碱基对序列包括8碱基对核心序列两侧的两个13碱基对反向重复序列(用作重组酶结合位点)(参见图1中Sauer，B.，《生物技术当前述评》，5：521-527(1994年))。其它示例性loxP位点包含但不限于：lox511(Hoess等人，1996年；Bethke和Sauer，1997年)、lox5171(Lee和Saito，1998年)、lox2272(Lee和Saito，1998年)、m2(Langer等人，2002年)、lox71(Albert等人，1995年)以及lox66(Albert等人，1995年)。
FLP重组酶的适当识别位点包含但不限于：FRT(McLeod等人，1996年)、F1，F2，F3(Schlake和Bode，1994年)、F4，F5(Schlake和Bode，1994年)、FRT(LE)(Senecoff等人，1988年)、FRT(RE)(Senecoff等人，1988年)。
识别序列的其它实例是attB序列、attP序列、attL序列和attR序列，其被重组酶λ整合酶识别，例如phi-c31。SSR仅介导异型位点attB(长度为34bp)与attP(长度为39bp)之间的重组(Groth等人，2000年)。attB和attP分别以细菌和噬菌体基因组上用于噬菌体整合酶的附接位点命名，均含有可能由同源二聚体结合的不完全反向重复序列(Groth等人，2000年)。产物位点attL和attR对进一步的介导的重组具有有效惰性(Belteki等人，2003年)，从而使反应不可逆。对于催化插入，已经发现，携带attB的DNA插入基因组attP位点比attP位点插入基因组attB位点更容易(Thyagarajan等人，2001年；Belteki等人，2003年)。因此，典型的策略通过同源重组将带有attP的“对接位点”定位到限定的基因座中，然后所述基因座与带有attB的进入序列配合进行插入。
在一个实施例中，本文设想的多核苷酸包括两侧为一对重组酶识别位点的修复模板多核苷酸。在具体实施例中，修复模板多核苷酸两侧为LoxP位点、FRT位点或att位点。
在具体实施例中，本文设想的多核苷酸包含对一个或多个多肽进行编码的一个或多个兴趣多核苷酸。在具体实施例中，为了实现多个多肽中的每一个的有效翻译，可以通过一个或多个IRES序列或对自切割多肽进行编码的多核苷酸序列分离多核苷酸序列。
如本文所使用的，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指促进直接内部核糖体进入顺反子(蛋白质编码区)的如ATG等起始密码子的元件，由此导致基因的帽非依赖性翻译。参见例如，Jackson等人，1990年，《生物化学科学趋势(Trends Biochem Sci)》，15(12)：477-83以及Jackson和Kaminski，1995年《RNA》1(10)：985-1000。本领域的技术人员通常采用的IRES的实例包含美国专利号6,692,736中所描述的IRES。本领域已知的“IRES”的另外的实例包含但不限于可从小核糖核酸病毒(Jackson等人，1990年)获得的IRES以及可从病毒或细胞mRNA来源获得的IRES，如例如免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)、血管内皮生长因子(VEGF)(Huez等人，1998年《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》，18(11)：6178-6190)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)和胰岛素样生长因子(IGFII)、翻译起始因子eIF4G和酵母转录因子TFIID和HAP4、可从Novagen商购获得的脑心肌炎病毒(EMCV)(Duke等人，1992年，《病毒学期刊》66(3)：1602-9)以及VEGF IRES(Huez等人，1998年，《分子与细胞生物学》，18(11)：6178-90)。在小核糖核酸病毒科、二顺反子病毒科和黄病毒科物种的病毒基因组中以及HCV、小鼠白血病病毒(FrMLV)和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)中也报道了IRES。
在一个实施例中，本文设想的多核苷酸中使用的IRES是EMCV IRES。
在具体实施例中，多核苷酸包括共有Kozak序列。如本文所使用的，术语“Kozak序列”是指极大地促进mRNA与核糖体的小亚基的初始结合并且增加翻译的短核苷酸序列。共有Kozak序列是(GCC)RCCATGG(SEQ ID NO：50)，其中R是嘌呤(A或G)(Kozak，1986年，《细胞》，44(2)：283-92和Kozak，1987年，《核酸研究》，15(20)：8125-48)。
引导异源核酸转录物的有效终止和多腺苷酸化的元件增加异源基因表达。转录终止信号通常存在于多腺苷酸化信号的下游。在具体实施例中，载体包括对待表达多肽进行编码的多核苷酸的3′处的多腺苷酸化序列。本文所使用的术语“polyA位点”或“polyA序列”表示通过RNA聚合酶II指导新生RNA转录物的终止和多多腺苷酸化的DNA序列。多腺苷酸化序列可以通过向编码序列的3′末端添加polyA尾来促进mRNA稳定性，并且因此有助于提高翻译效率。重组转录物的高效多腺苷酸化是期望的，因为缺乏polyA尾的转录物不稳定并且被快速降解。可以在载体中使用的polyA信号的说明性实例包含：理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-珠蛋白polyA序列(rβgpA)或本领域已知的另一种适当的异源polyA序列或内源polyA序列。
在一些实施例中，含有多核苷酸的多核苷酸或细胞利用包含诱导型自杀基因在内的自杀基因以降低直接毒性和/或不受控制增殖的风险。在具体实施例中，自杀基因对含有多核苷酸或细胞的宿主没有免疫原性。可以使用的自杀基因的某个实例是胱天蛋白酶-9或胱天蛋白酶-8或胞嘧啶脱氨酶。胱天蛋白酶-9可以使用特定的二聚化学诱导剂(CID)活化。
在某些实施例中，多核苷酸包括导致本文设想的基因修饰的细胞易于在体内经历阴性选择的基因片段。“阴性选择”是指由于个体的体内病症的改变而可以消除的输注细胞。阴性可选择表型可以由插入赋予对所施用药剂例如化合物的敏感行的基因而产生。阴性选择基因在本领域中是已知的，并且包含但不限于：赋予更昔洛韦敏感性的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因和细菌胞嘧啶脱氨酶。
在一些实施例中，基因修饰的细胞包括多核苷酸，所述多核苷酸进一步包括能够在体外选择阴性可选择表型的细胞的阳性标记物。阳性选择标记物可以是在被引入到宿主细胞中后表达允许阳性选择携带基因的细胞的显性表型的基因。此类型的基因在本领域中是已知的，并且包含但不限于：赋予对潮霉素B的抗性的潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)、来自编码对抗生素G418的抗性的Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、腺苷脱氨酶基因(ADA)以及多耐药性(MDR)基因。
在一个实施例中，阳性可选择标记物和阴性可选择元件连接，使得阴性可选择元件的损失也必然伴随着阳性可选择标记物的丧失。在具体实施例中，阳性可选择标记和阴性可选择标记物融合，使得一个的丧失必然导致另一个的丧失。作为表达产物产生赋予上文所描述的期望阳性和阴性选择特征的多肽的融合多核苷酸的实例是潮霉素磷酸转移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)。此基因的表达产生赋予对体外阳性选择的潮霉素B抗性以及对体内阴性选择的更昔洛韦敏感性的多肽。还参见S.D.Lupton的PCT US91/08442和PCT/US94/05601的出版物，其描述了对由显性阳性可选择标记物与阴性可选择标记物的融合衍生的双功能可选择融合基因的使用。
优选的阳性可选择标记物衍生自选自由以下组成的组的基因：hph、nco和gpt，并且优选的阴性可选择标记物衍生自选自由以下组成的组的基因：胞嘧啶脱氨酶、HSV-1TK、VZV TK、HPRT、APRT以及gpt。在具体实施例中设想的示例性双功能可选择融合基因包含但不限于其中阳性可选择标记物衍生自hph或neo，并且阴性可选择标记衍生自胞嘧啶脱氨酶或TK基因或可选择标记物的基因。
在具体实施例中，可以通过非病毒和病毒方法将对一个或多个大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN、Cas核酸酶、末端加工核酸酶、CARs、治疗性多肽以及融合多肽进行编码的多核苷酸引入到免疫效应细胞中，例如T细胞。在具体实施例中，可以通过相同的方法或通过不同的方法，和/或通过相同的载体或通过不同的载体提供对核酸酶和/或供体修复模板进行编码的一个或多个多核苷酸的递送。
术语“载体”在本文中用于指能够转移或转运一个核酸分子的另一个核酸分子。转移的核酸通常连接到载体核酸分子，例如插入到中。载体可以包含引导细胞中自主复制的序列或者可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。在具体实施例中，非病毒载体用于将本文设想的一个或多个多核苷酸递送至T细胞。
非病毒载体的说明性实例包含但不限于质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。
在具体实施例中设想的非病毒递送多核苷酸的说明性方法包含但不限于：电穿孔、声致穿孔、脂质体转染、显微注射、基因枪法、病毒体、脂质体、免疫脂质体、纳米颗粒、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、DEAE-葡聚糖介导的转移、基因枪和热休克。
适合于在于具体实施例中设想的具体实施例中使用的多核苷酸递送系统的说明性实例包含但不限于由Amaxa Biosystems、Maxcyte，Inc.、BTX Molecular DeliverySystems和Copernicus Therapeutics Inc提供的系统。脂质转染试剂是商业销售的(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。适合于多核苷酸的高效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质已经在文献中进行了描述。参见例如，Liu等人(2003年)《基因疗法》，10：180-187；和Balazs等人(2011年)《药物递送期刊(Journal of Drug Delivery)》，2011：1-12。在具体实施例中还设想了抗体靶向的、细菌衍生的、非生物的基于纳米细胞的递送。
如下文所描述的，包括在具体实施例中设想的多核苷酸的病毒载体可以通过施用给个体患者进行体内递送，通常通过全身施用(例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部应用。可替代地，可以将载体离体递送至细胞，如从个体患者(例如，动员的外周血、淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检等)或通用供体造血干细胞移出的细胞，然后将细胞再植入患者体内。
在一个实施例中，将包括工程化的核酸酶和/或供体修复模板的病毒载体直接施用给生物体以在体内转导细胞。可替代地，可以施用裸DNA。通过通常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径施用，包含但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。施用这种核酸的适当方法对于本领域的技术人员来说是可获得的并且是公知的，并且尽管可以使用多于一种途径来施用特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。
适合于在于具体实施例中设想的具体实施例中使用的病毒载体系统的说明性实例包含但不限于腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、用于基因转移的痘苗病毒载体。
在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)转导细胞，将对工程化的核酸酶和/或供体修复模板进行编码的一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中，例如T细胞。
AAV是一种小型(约26nm)复制缺陷型、主要是附加型无包膜病毒。AAV可以感染分裂和非分裂细胞，并且可以将其基因组并入到宿主细胞的基因组中。重组AAV(rAAV)通常至少由转基因及其调节序列和5′和3′AAV反向末端重复序列(ITR)构成。ITR序列长约145bp。在具体实施例中，rAAV包括从AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10分离的ITR和衣壳序列。
在一些实施例中，使用嵌合rAAV，从一种AAV血清型分离ITR序列，并且从不同的AAV血清型分离衣壳序列。例如，具有衍生自AAV2的ITR序列和源自AAV6的衣壳序列的rAAV被称为AAV2/AAV6。在具体实施例中，rAAV载体可以包括来自AAV2的ITR和来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中任一种的衣壳蛋白。在优选实施例中，rAAV包括衍生自AAV2的ITR序列和衍生自AAV6的衣壳序列。
在一些实施例中，可以将工程和选择方法应用于AAV衣壳以使其更有可能转导兴趣细胞。
rAAV载体的构造、其生产和纯化已经公开于例如美国专利号9,169,494；9,169,492；9,012,224；8,889,641；8,809,058；以及8,784,799中，所述美国专利中的每一个通过引用以其全文并入本文中。
在各个实施例中，通过使用包括一个或多个多核苷酸的逆转录病毒，例如慢病毒转导细胞，将对CAR、工程化的核酸酶或供体修复模板进行编码的一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中，例如T细胞。
如本文所使用的，术语“逆转录病毒”是指RNA病毒，所述RNA病毒将其基因组RNA逆转录为直线型双链DNA拷贝，并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。适合于在具体实施例中使用的说明性逆转录病毒包含但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德小鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))以及慢病毒。
如本文所使用的，术语“慢病毒”是指复杂逆转录病毒的组(或属)。说明性慢病毒包含但不限于：HIV(人类免疫缺陷病毒；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯那-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎/脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施例中，优选基于HIV的载体骨架(即，HIV顺式作用序列元件)。
在各个实施例中，本文设想的慢病毒载体包括一个或多个LTR，以及以下辅助元件中的一个或多个或全部：cPPT/FLAP、Psi(Ψ)包装信号、输出元件、poly(A)序列，并且可以任选地包括WPRE或HPRE、绝缘子元件、选择标记物和细胞自杀基因，如本文其它地方所讨论的。
在具体实施例中，本文设想的慢病毒载体可以是整合的或非整合的或整合缺陷型慢病毒。如本文所使用的，术语“整合缺陷型慢病毒”是指具有整合酶的慢病毒，所述整合酶缺乏将病毒基因组整合到宿主细胞基因组中的能力。在专利申请WO 2006/010834中已经描述了不具整合潜能的病毒载体，所述专利申请通过引用以其全部内容并入本文。
适合于降低整合酶活性的HIV-1 pol基因中的说明性突变包含但不限于：H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A以及K264H。
术语“长末端重复序列(LTR)”是指位于逆转录病毒DNA末端的碱基对的结构域，其在其天然序列环境中是直接重复并且含有U3区、R区和U5区。
如本文所使用的，术语“FLAP元件”或“cPPT/FLAP”是指其序列包含逆转录病毒的中央多嘌呤管道和中枢终止序列(cPPT和CTS)例如HIV-1或HIV-2的核酸。适当的FLAP元件描述于美国专利号6,682,907中和Zennou等人，2000年，《细胞》，101：173中。
如本文所使用的，术语“包装信号”或“包装序列”是指位于逆转录病毒基因组内的psi[Ψ]序列，所述序列是将病毒RNA插入病毒衣壳或颗粒中所需的，参见例如，Clever等人，1995年，《病毒学期刊》，第69卷，第4期；第2101到2109页。
术语“输出元件”是指顺式作用的转录后调控元件，其调控RNA转录物从细胞核到细胞质的转运。RNA输出元件的实例包含但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)(参见例如，Culle等人，1991年，《病毒学期刊》，65：1053；和Cullen等人，1991年，《细胞》，58：423)，以及乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)。
在具体实施例中，通过将转录后调控元件、有效的多腺苷酸化位点和任选地转录终止信号结合到载体中来增加病毒载体中异源序列的表达。各种转录后调控元件可以增加异源核酸在蛋白质上的表达，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE；Zufferey等人，1999年，《病毒学期刊》，73：2886)；乙型肝炎病毒(HPRE)中存在的转录后调控元件(Huang等人，《分子与细胞生物学》，5：3864)；等等(Liu等人，1995年，《基因与发育》，9：1766)。
由于修饰LTR，慢病毒载体优选地含有几种安全性增强作用。“自失活”(SIN)载体是指复制缺陷型载体，例如，其中被称为U3区的右(3′)LTR增强子-启动子区已经被修饰(例如，通过缺失或取代)以防止病毒转录超过第一轮病毒复制。通过用异源启动子替换5′LTR的U3区来提供额外的安全性增强以在病毒颗粒的产生过程中驱动病毒基因组的转录。可以使用的异源启动子的实例包含，例如，病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)以及单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。
本文所使用的术语“假型”或“假型分型”是指其病毒包膜蛋白已经被具有优选特征的另一种病毒的病毒包膜蛋白取代的病毒。例如，HIV可以用水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白假型化，这允许HIV感染更广泛的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常将病毒靶向CD4+呈递细胞。
在某些实施例中，根据已知方法产生慢病毒载体。参见例如，Kutner等人，《BMC生物技术(BMC Biotechnol.)》，2009年；9：10.doi：10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等人，《自然实验手册》，2009年；4(4)：495-505.doi：10.1038/nprot.2009.22。
根据本文设想的某些具体实施例，大多数或所有病毒载体骨架序列衍生自慢病毒，例如HIV-1。然而，应当理解的是，可以使用或组合许多不同的逆转录病毒和/或慢病毒序列来源，并且可以适应某些慢病毒序列中的许多取代和更改而不损害用于执行本文所描述功能的转移载体的能力。此外，本领域已知多种慢病毒载体，参见，Naldini等人，(1996a、1996b和1998)；Zufferey等人，(1997年)；Dull等人，1998年，美国专利号6,013,516；和美国专利号5,994,136，其中许多可以适用于产生本文设想的病毒载体或转移质粒。
在各个实施例中，通过使用包括一个或多个多核苷酸的腺病毒转导细胞，将对CAR、工程化的核酸酶或供体修复模板进行编码的一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中。
基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率并且不需要细胞分裂。使用这种载体，已经获得了高滴度和高水平的表达。此载体可以在相对简单的系统中大量产生。大多数腺病毒载体被工程化为使得转基因取代Ad E1a基因、E1b基因和/或E3基因；随后，复制缺陷型载体在人类293细胞中繁殖，所述细胞反式提供缺失的基因功能。Ad载体可以在体内转导多种类型的组织，包含如存在于肝、肾和肌肉中的非分裂的分化细胞。常规Ad载体具有大的承载能力。
复制缺陷的当前腺病毒载体的产生和繁殖可以利用命名为293的独特辅助细胞系，所述辅助细胞系通过Ad5 DNA片段从人类胚肾细胞转化并且组成性地表达E1蛋白(Graham等人，1977年)。由于E3区可以从腺病毒基因组中分配出来(Jones和Shenk，1978年)，所以目前的腺病毒载体在293细胞的帮助下在E1区、D3区或两个区中携带外源DNA(Graham和Prevec，1991年)。腺病毒载体已经用于真核基因表达(Levrero等人，1991年；Gomez-Foix等人，1992年)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992年；Graham和Prevec，1992年)。将重组腺病毒施用于不同组织的研究包含气管滴注(Rosenfeld等人，1991年；Rosenfeld等人，1992年)、肌肉注射(Ragot等人，1993年)、外周静脉注射(Herz和Gerard，1993年)以及立体定向脑内接种(Le Gal La Salle等人，1993年)。在临床试验中使用Ad载体的实例涉及用于肌内注射的抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法(Sterman等人，《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》，7：1083-9(1998年))。
在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的单纯疱疹病毒，例如HSV-1、HSV-2转导细胞，将对CAR、工程化的核酸酶或供体修复模板进行编码的一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中。
成熟的HSV病毒粒子由包膜的二十面体衣壳组成，而病毒基因组由152kb的线性双链DNA分子组成。在一个实施例中，基于HSV的病毒载体缺乏一个或多个必需或非必需的HSV基因。在一个实施例中，基于HSV的病毒载体是复制缺陷型。大多数复制缺陷型HSV载体含有用于去除一个或多个中早期HSV基因、早期HSV基因或晚期HSV基因的缺失以防止复制。例如，HSV载体可能缺乏选自由以下组成的组的立即早期基因：ICP4、ICP22、ICP27、ICP47及其组合。HSV载体的优点是其进入潜伏期的能力，所述潜伏期可以导致长期DNA表达以及其大的病毒DNA基因组，所述病毒DNA基因组可以容纳高达25kb的外源DNA插入物。基于HSV的载体描述于例如美国专利号5,837,532、5,846,782和5,804,413，以及国际专利申请WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637和WO 99/06583中，所述专利中的每一个通过引用以其全部内容并入本文中。
H.组合物和配制品
具体实施例中设想的组合物可以包括如本文所设想的一个或多个多肽、多核苷酸、包括其的载体和免疫效应细胞组合物。组合物包含但不限于药物组合物。“药物组合物”是指在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中配制的组合物，其单独或与一种或多种其它治疗方式组合施用于细胞或动物。还应理解的是，如果需要，组合物也可以与其它药剂组合施用，例如细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其它各种药物活性剂。对组合物中也可以包含的其它组分实际上不存在限制，条件是额外的药剂不会不利地影响组合物递送预期疗法的能力。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人类和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包含但不限于任何已经被美国食品和药品管理局批准为可用于人类或家畜的佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。示例性药学上可接受的载体包含但不限于糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂、蜡、动植物油脂、石蜡、有机硅、膨润土、硅酸、氧化锌；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、以及聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer′s solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及在药物配制品中采用的任何其它相容物质。
在具体实施例中，组合物包括通过本文设想的方法制备的量的经基因组编辑的CAR T细胞。在优选实施例中，药物组合物包括CAR T细胞，所述CAR T细胞包括一个或多个修饰的和/或非功能性TCRα等位基因并且表达一个或多个CAR。
通常可以说，包括通过具体实施例中设想的方法制备的CAR T细胞的药物组合物可以以约102到约1010细胞/kg体重、约105到约109细胞/kg体重、约105到约108细胞/kg体重、约105到约107细胞/kg体重、约107到约109细胞/kg体重或约107到约108细胞/kg体重的剂量施用，包含这些范围内的所有整数值。细胞的数目将取决于组合物的最终用途以及其中包含的细胞的类型。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为1升或更少，可以为500mL或更少，甚至250mL或100mL或更少。因此，期望细胞的密度通常大于约106个细胞/mL，并且通常大于约107个细胞/mL，通常约108个细胞/mL或更大。临床相关数目的免疫细胞可以分配到累积等于或超过约105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个或1012个细胞的多次输注中。
在一些实施例中，特别是因为所有输注的细胞将被重新定向到特定的靶抗原，所以可以施用范围在106/千克(每患者106到1011)的较低数目的细胞。而被修饰成表达CAR的T细胞可以在这些范围内的剂量下多次施用。对于接受治疗的患者，细胞可以是同种异体的、同基因的、异种的或自体的。如果需要，治疗还可以包含施用如本文所描述的有丝分裂原(例如PHA)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、TNF-α、IL-18和TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α等)以增强输注的T细胞的植入和功能。
通常，包括如本文所描述的活化和扩增的细胞的组合物可以用于治疗和预防免疫受损个体中出现的疾病。具体地，包括通过本文设想的方法制备的经修饰的T细胞的组合物用于治疗癌症。在具体实施例中设想的经基因组编辑的CAR T细胞可以单独施用或作为药物组合物与载体、稀释剂、赋形剂和/或与如IL-2、IL-7和/或IL-15等其它组分或其它细胞因子或细胞群组合施用。在具体实施例中，本文设想的药物组合物包括与一个或多个药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的一定量的CAR T细胞，所述CAR T细胞包括一个或多个经修饰的TCRα等位基因。
包括在具体实施例中设想的经基因组编辑的CAR T细胞的药物组合物可以进一步包括缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物、如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或如甘氨酸等氨基酸；抗氧化剂；如EDTA或谷胱甘肽等螯合剂；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。具体实施例中设想的组合物优选地被配制用于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌肉内施用。
液体药物组合物，无论其是溶液、悬浮液或其它类似形式，可以包含以下中的一种或多种：如注射用水等无菌稀释剂、盐水溶液、优选地生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、如可以用作溶剂或悬浮培养基的合成甘油单酯或甘油二酯等固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选地是无菌的。
在一个实施例中，在药学上可接受的细胞培养基中配制经基因组编辑的CAR T细胞组合物。这种组合物适合于施用给人类受试者。在具体实施例中，药学上可接受的细胞培养基是无血清培养基。
与含有血清的培养基相比，无血清培养基具有几个优点：包含简化和更明确的组合物、降低的污染程度、消除潜在的传染剂来源和更低的成本。在各个实施例中，无血清培养基是无动物的，并且可以任选地不含蛋白质。任选地，培养基可以含有生物药学上可接受的重组蛋白质。“无动物”培养基是指其中组分来源于非动物来源的培养基。重组蛋白质在无动物培养基中代替天然动物蛋白质，并且营养物质来自合成、植物或微生物来源。相反，“无蛋白”培养基被定义为基本上不含蛋白质。
用于特定组合物的无血清培养基的说明性实例包含但不限于QBSF-60(QualityBiological，Inc.)、StemPro-34(Life Technologies)和X-VIVO 10。
在一个优选实施例中，在包括PlasmaLyte A的溶液中配制包括本文设想的经基因组编辑的CAR T细胞的组合物。
在另一个优选实施例中，在包括冷冻保存培养基的溶液中配制包括本文设想的经基因组编辑的CAR T细胞的组合物。例如，具有冷冻保存剂的冷冻保存培养基可以用于在解冻后维持高细胞活力结果。用于特定组合物的冷冻保存培养基的说明性实例包含但不限于CryoStor CS10、CryoStor CS5和CryoStor CS2。
在更优选的实施例中，在包括50∶50 PlasmaLyte A：CryoStor CS10的溶液中配制包括本文设想的经基因组编辑的CAR T细胞的组合物。
在具体实施例中，本文设想的组合物仅包括有效量的扩增的经基因组编辑的CART细胞组合物或与一种或多种治疗剂组合。因此，CAR T细胞组合物可以单独施用或与其它已知的癌症治疗组合施用，如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等。组合物还可以与抗生素组合施用。本领域可接受这种治疗剂作为如本文所描述的如特定癌症等特定疾病状态的标准治疗。在具体实施例中设想的示例性治疗剂包含细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂、治疗性抗体或其它活性剂和辅助剂。
在某些实施例中，本文设想的包括CAR T细胞的组合物可以与任何数目的化学治疗剂结合施用。化学治疗剂的说明性实例包含烷化剂，如硫柳汞和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，如苯佐多巴、卡波醌、美妥多巴、和脲多巴；亚乙基亚胺和甲基胺类(methylamelamines)，包含六甲蜜胺、曲他胺、替派、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲密胺(trimethylolomelamine)；氮芥类(nitrogen mustard)，如瘤可宁、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝脲类，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡拉比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、去甲氧基柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素类、菌酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物类，如甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗-肾上腺类，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；百垂布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三环乙亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；盖克托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；诺维本；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，如TargretinTM(贝沙罗汀)、PanretinTM(阿利维A酸)；ONTAKTM(地尼白介素-毒素连接物)；埃斯波霉素；卡培他滨；以及药学上可接受的盐、酸或以上任一种的衍生物。此定义还包含用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素，包含例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；和抗雄激素类，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及药学上可接受的盐、酸或以上任一种的衍生物。
多种其它治疗剂可以与本文设想的组合物结合使用。在一个实施例中，包括CAR T细胞的组合物与抗炎剂一起施用。抗炎剂或药物包含但不限于类固醇和糖皮质激素(包含倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安奈德)、包含阿司匹林的非甾体类抗炎药(NSAIDS)、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、抗TNF药物、环磷酰胺和霉酚酸酯。
其它示例性NSAID选自由以下组成的组：布洛芬、萘普生、萘普生钠、如(罗非昔布)和(塞来昔布)等Cox-2抑制剂以及唾液酸盐。示例性镇痛药选自由以下组成的组：对乙酰氨基酚、羟考酮、盐酸丙氧芬的曲马多。示例性糖皮质激素选自由以下组成的组：可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙或泼尼松。示例性生物应答调节剂包含针对细胞表面标记物(例如CD4、CD5等)的分子，细胞因子抑制剂如TNF拮抗剂(例如依那西普)、阿达木单抗和英夫利昔单抗趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物应答调节剂包含单克隆抗体以及重组形式的分子。示例性DMARD包含硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、金(口服(金诺芬)和肌内)和米诺环素。
适合与具体实施例中设想的经基因组编辑的T细胞组合的治疗性抗体的说明性实例包含但不限于：阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿托珠单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、阿托昔单抗、马安那莫单抗、阿西莫单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝伐单抗、比伐珠单抗、比纳托单抗、布妥昔单抗、坎妥珠单抗、卡妥索单抗、西妥昔单抗、西他珠单抗、西妥木单抗、利伐珠单抗(clivatuzumab)、坎妥木单抗(conatumumab)、达妥木单抗(daratumumab)、曲兹妥单抗(drozitumab)、杜利妥单抗(duligotumab)、杜昔妥单抗(dusigitumab)、地莫单抗、达西珠单抗、多妥珠单抗(dalotuzumab)、依美昔单抗、艾妥珠单抗(elotuzumab)、恩脱昔单抗(ensituximab)、厄妥索单抗、达珠单抗、法妥珠单抗(farletuzumab)、拉妥珠单抗(ficlatuzumab)、费妥木单抗(figitumumab)、法伏妥单抗(flanvotumab)、弗妥昔单抗(futuximab)、加尼妥单抗(ganitumab)、吉妥珠单抗、吉瑞昔单抗、来巴妥单抗(glembatumumab)、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、麦妥珠单抗(imgatuzumab)、印妥昔单抗(indatuximab)、伊珠单抗、英妥木单抗、伊匹单抗、伊妥木单抗、拉贝珠单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、洛伐珠单抗(lorvotuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、曼妥木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗、米妥珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫妥木单抗(moxetumomab)、那妥单抗(narnatumab)、那莫单抗、尼妥木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗、若莫单抗(nofetumomabn)、卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗、奥拉妥单抗(olaratumab)、昂妥珠单抗(onartuzumab)、奥妥珠单抗(oportuzumab)、瑞戈伏单抗(oregovomab)、盘尼图单抗、帕图珠单抗(parsatuzumab)、帕托单抗(patritumab)、盘图莫单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗、平妥单抗、普托木单抗、拉妥木单抗(racotumomab)、拉图单抗(radretumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗、罗妥木单抗、沙妥莫单抗、昔洛珠单抗、司妥昔单抗、司妥佐单抗(simtuzumab)、索利图单抗(solitomab)、他妥珠单抗(tacatuzumab)、他妥莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替普莫单抗(teprotumumab)、加珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、托卡珠单抗(tucotuzumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、沃妥珠单抗(vorsetuzumab)、沃图莫单抗(votumumab)、扎鲁木单抗、CC49和3E8。
在某些实施例中，本文设想的组合物与细胞因子结合施用。本文所使用的“细胞因子”是指由一个细胞群释放的蛋白质的通用术语，所述细胞群作用于另一个作为细胞间介质的细胞。这些细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子、趋化因子和传统的多肽激素。细胞因子中包含生长激素，如人类生长激素、N-甲硫氨酰人类生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺氨酸；胰岛素；胰岛素原；松弛肽；松弛素(prorelaxin)；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体产生素(LH)；肝细胞生长因子；纤维母细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β；副中肾管抑制物质；小鼠促性腺激素关连肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板产生素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；促红细胞产生素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、干扰素β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；以及粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15，一种肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其它包含LIF和试剂盒配体(KL)的多肽因子。如本文所使用的，术语细胞因子包含来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
I.靶细胞
在具体实施例中，预期被重新定向到靶细胞例如肿瘤或癌细胞的经基因组编辑的CAR T细胞具有结合到细胞上靶抗原的结合结构域。
在一个实施例中，靶细胞表达抗原，例如基本上不存在于其它正常(期望)细胞表面上的靶抗原。
在一个实施例中，靶细胞是骨细胞，骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、软骨细胞、肌细胞、骨骼肌细胞、成肌细胞、肌细胞、平滑肌细胞、膀胱细胞、骨髓细胞、中枢神经系统(CNS)细胞、周围神经系统(PNS)细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、色素细胞、上皮细胞、皮肤细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、乳腺细胞、结肠细胞、食道细胞、胃肠细胞、胃细胞、结肠细胞、头细胞、颈细胞、胶质细胞、舌细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、鼻咽细胞、卵巢细胞、滤泡细胞、宫颈细胞、阴道细胞、子宫细胞、胰腺细胞、胰腺实质细胞、胰管细胞、胰岛细胞、前列腺细胞、阴茎细胞、性腺细胞、睾丸细胞、造血细胞、淋巴细胞或骨髓细胞。
在一个实施例中，靶细胞是实体癌细胞。
可以通过具体实施例中设想的组合物和方法靶向的细胞的说明性实例包含但不限于以下实体癌的细胞：肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/中枢神经系统癌、乳腺癌、支气管肿瘤、心脏肿瘤、宫颈癌、胆管癌、软骨肉瘤、脊索瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、原位导管癌(DCIS)子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、雌激素母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞瘤、眼癌、输卵管癌、纤维组织肉瘤、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、头颈癌、血管母细胞瘤、肝细胞癌、下咽癌、眼内黑色素瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌肉瘤、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺类癌、恶性间皮瘤、髓样癌、成神经管细胞瘤、血管瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、中线癌、口腔癌、粘液瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、少突神经胶质瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰岛细胞瘤、乳头状癌、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃癌、汗腺癌、滑膜瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、血管癌、外阴癌以及肾母细胞瘤。
在一个实施例中，靶细胞是液体癌症细胞或血液癌症细胞。
血液癌症的说明性实例包含但不限于：白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
可以通过具体实施例中设想的组合物和方法靶向的细胞的说明性实例包含但不限于以下白血病的细胞：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞、红白血病、毛细胞白血病(HCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性粒细胞白血病(CML)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)和真性红细胞增多症。
可以通过具体实施例中设想的组合物和方法靶向的细胞的说明性实例包含但不限于以下淋巴瘤的细胞：霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包含但不限于B细胞非霍奇金淋巴瘤：伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤和套细胞淋巴瘤；以及T细胞非霍奇金淋巴瘤：蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、塞扎里氏综合征和前体T淋巴母细胞淋巴瘤。。
可以通过具体实施例中设想的组合物和方法靶向的细胞的说明性实例包含但不限于以下多发性骨髓瘤的细胞：明显多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨的孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。
在另一个具体实施例中，靶细胞是癌细胞，如患有癌症的患者的细胞。
在一个实施例中，靶细胞是包含但不限于CMV、HPV和EBV的细胞，例如被病毒感染的癌细胞。
在一个实施例中，靶抗原是以下的表位：α叶酸受体、5T4、αvβ6整联蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包含ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、存活蛋白、TAG72、TEM、VEGFR2以及WT-1。
J.治疗方法
通过本文设想的组合物和方法制备的经基因组编辑的CAR T细胞提供改进的过继细胞疗法，用于治疗各种病症，包含但不限于癌症、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫缺陷。在具体实施例中，通过用本文设想的CAR基因修饰原代T细胞将原代T细胞的特异性重新定向到肿瘤细胞或癌细胞。在一个实施例中，将经基因组编辑的CAR T细胞输注给有需要的接受者。所输注的细胞能够杀死接受者中的肿瘤细胞。
在具体实施例中，本文设想的经基因组编辑的CAR T细胞用于治疗实体瘤或癌症。
在具体实施例中，本文设想的经基因组编辑的CAR T细胞用于治疗实体瘤或癌症，包含但不限于：肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/中枢神经系统癌、乳腺癌、支气管肿瘤、心脏肿瘤、宫颈癌、胆管癌、软骨肉瘤、脊索瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、原位导管癌(DCIS)子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、雌激素母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞瘤、眼癌、输卵管癌、纤维组织肉瘤、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、头颈癌、血管母细胞瘤、肝细胞癌、下咽癌、眼内黑色素瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌肉瘤、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺类癌、恶性间皮瘤、髓样癌、成神经管细胞瘤、血管瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、中线癌、口腔癌、粘液瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、少突神经胶质瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰岛细胞瘤、乳头状癌、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃癌、汗腺癌、滑膜瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、血管癌、外阴癌以及肾母细胞瘤。
在具体实施例中，本文设想的经基因组编辑的CAR T细胞用于治疗实体瘤或癌症，包含但不限于肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、骨癌、甲状腺癌、肾癌或皮肤癌。
在具体实施例中，本文设想的经基因组编辑的CAR T细胞用于治疗各种癌症，包含但不限于胰腺癌、膀胱癌和肺癌。
在具体实施例中，本文设想的经基因组编辑的CAR T细胞用于治疗液体癌症或血液癌症。
在具体实施例中，本文设想的经基因组编辑的CAR T细胞用于治疗B细胞恶性肿瘤，包含但不限于：白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在具体实施例中，本文设想的经基因组编辑的CAR T细胞用于治疗液体癌症，包含但不限于以下白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病、毛细胞白血病(HCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性粒细胞白血病(CML)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)和真性红细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、塞扎里氏综合征、前体T淋巴母细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、明显多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨的孤立性浆细胞瘤以及髓外浆细胞瘤。
在具体实施例中，提供了包括以下的方法：将治疗有效量的本文设想的经基因组编辑的T细胞或包括上述T细胞的组合物单独施用或与一种或多种治疗剂组合施用给有需要的患者。在某些实施例中，上述细胞用于治疗患有癌症风险的患者。因此，具体实施例包括治疗或预防或改善癌症的至少一种症状，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文设想的经基因组编辑的T细胞。
在一个实施例中，在有需要的受试者中治疗癌症的方法包括施用有效量例如治疗有效量的包括本文设想的经基因组编辑的CAR T细胞的组合物。施用的数目和频率将由如患者的病症以及患者的疾病的类型和严重性等因素确定，但是适当的剂量可以通过临床试验确定。
在一个实施例中，施用给受试者的组合物中的T细胞的量为至少0.1x105个细胞、至少0.5x105个细胞、至少1x105个细胞、至少5x105个细胞、至少1x106个细胞、至少0.5x107个细胞、至少1x107个细胞、至少0.5x108个细胞、至少1x108个细胞、至少0.5x109个细胞、至少1x109个细胞、至少2x109个细胞、至少3x109个细胞、至少4x109个细胞、至少5x109个细胞或至少1x1010个细胞。
在具体实施例中，向受试者施用约1x107个T细胞到约1x109个T细胞、约2x107个T细胞到约0.9x109个T细胞、约3x107个T细胞到约0.8x109个T细胞、约4x107个T细胞到约0.7x109个T细胞、约5x107个T细胞到约0.6x109个T细胞或约5x107个T细胞到约0.5x109个T细胞。
在一个实施例中，施用于受试者的组合物中的T细胞的量为至少0.1x104个细胞/kg体重、至少0.5x104个细胞/kg体重、至少1x104个细胞/kg体重、至少5x104个细胞/kg体重、至少1x105个细胞/kg体重、至少0.5x106个细胞/kg体重、至少1x106个细胞/kg体重、至少0.5x107个细胞/kg体重、至少1x107个细胞/kg体重、至少0.5x108个细胞/kg体重、至少1x108个细胞/kg体重、至少2x108个细胞/kg体重、至少3x108个细胞/kg体重、至少4x108个细胞/kg体重、至少5x108个细胞/kg体重或至少1x109个细胞/kg体重。
在具体实施例中，向受试者施用约1x106个T细胞/kg体重到约1x108个T细胞/kg体重、约2x106个T细胞/kg体重到约0.9x108个T细胞/kg体重、约3x106个T细胞/kg体重到约0.8x108个T细胞/kg体重、约4x106个T细胞/kg体重到约0.7x108个T细胞/kg体重、约5x106个T细胞/kg体重到约0.6x108个T细胞/kg体重或约5x106个T细胞/kg体重到约0.5x108个T细胞/kg体重。
本领域普通技术人员将认识到，可能需要多次施用具体实施例中设想的组合物以实现期望的疗法。例如，组合物可以在1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长的跨度内施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次。
在某些实施例中，可能需要将活化的T细胞施用给受试者，并且随后重新产生血液(或执行清血法)，从中活化T细胞，并且用这些活化的T细胞和扩增的T细胞对患者进行重新输注。此过程可以每隔几周进行多次。在某些实施例中，T细胞可以从10cc到400cc的抽血活化。在某些实施例中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc或400cc或更高的抽血活化。不受理论束缚，使用此多抽血/多重新输注方案可以用于选出某些T细胞群。
具体实施例中设想的组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包含通过气溶胶吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。在优选的实施例中，肠胃外施用组合物。本文所使用的短语“肠胃外施用(parenteral administration和administered parenterally)”意指除了肠内施用和局部施用以外的通常通过注射进行的施用方式，并且包含但不限于：血管内、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、瘤内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内以及胸骨内注射和输注。在一个实施例中，通过直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位将本文设想的组合物施用给受试者。
在一个实施例中，向有需要的受试者施用有效量的组合物以增加对受试者中癌症的细胞免疫应答。免疫应答可以包含由能够杀死感染细胞、调节性T细胞和辅助性T细胞应答的细胞毒性T细胞介导的细胞免疫应答。还可以诱导主要由能够活化B细胞从而导致抗体产生的辅助T细胞介导的体液免疫应答。可以使用在本领域中详细描述的多种技术来分析由组合物诱导的免疫应答的类型；例如，《当代免疫学手册(Current Protocols inImmunology)》，由：纽约州纽约市约翰威立父子公司的John E.Coligan、Ada M.Kruisbeek、David H.Margulies、Ethan M.Shevach、Warren Strober(2001年)编辑。
在一个实施例中，治疗诊断患有癌症的受试者的方法包括：从受试者中除去免疫效应细胞，编辑所述免疫效应细胞的基因组并且产生基因组编辑的免疫效应细胞群，将对CAR进行编码的核酸引入到细胞中，并且将基因组编辑的免疫效应细胞群施用给同一受试者。在优选的实施例中，免疫效应细胞包括T细胞。
用于施用具体实施例中设想的细胞组合物的方法包含任何有效导致重新引入离体基因组编辑的免疫效应细胞或重新引入免疫效应细胞的基因组编辑祖细胞的方法，所述免疫效应细胞在引入受试者时分化成成熟免疫效应细胞。一种方法包括：基因组编辑外周血T细胞并且将对CAR进行编码的核酸离体引入细胞中以及将转导的细胞返回到受试者中。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请和授权专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或授权专利被具体地和单独地指示通过引用并入本文。
尽管以上实施例已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式进行了一些详细的描述，但是对于本领域的普通技术人员而言根据本文预期的教导应该容易清楚的是，在不偏离随附权利要求书的精神或范围下可以对其进行某些改变和变更。通过说明的方式而不是通过限制的方式提供以下实例。本领域的技术人员将易于认识到多种可以改变或变更以产生本质上相似结果的非关键参数。
实施例
实施例1
具有破坏TCRα等位基因的抗BCMA CAR T细胞
培养方法
使用菲科(Ficoll)梯度从两个不同的健康供体中分离冷冻保存的外周血单个核细胞(PBMC)，将其解冻并且将其与抗CD3和抗CD28 T细胞刺激抗体一起培养。抗体刺激后二十四小时，使用对包括抗BCMA scFv、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域的第二代嵌合抗原受体(CAR)进行编码的慢病毒以MOI 10对细胞进行转导。抗体刺激后七十二小时，使用Maxcyte电穿孔装置、用对靶向TCRα基因座的megaTAL进行编码的50μg/mL体外转录的mRNA对100x106个转导后细胞(大规模)或5x106个转导后细胞(小规模)进行电穿孔。在电穿孔之后立即再次对细胞进行培养并且在30℃下孵育24小时，将其返回到37℃孵育器中并且在含有IL-2的新鲜培养基中培养总共十天。在第10天，将细胞冷冻保存以供未来分析。
载体拷贝数分析
通过q-PCR确定整合的慢病毒颗粒的数目并且将其呈现为载体拷贝数(VCN)。通过以下确定VCN：使用可商购获得的gDNA分离试剂盒从细胞中分离基因组DNA；使用taqMan探针对整合的前病毒的Psi/Gag区执行定量PCR测定；以及使用通过基于质粒的阳性对照产生的标准曲线将Psi/Gag信号与内源性RNAseP拷贝数进行比较。对于以下的每个供体来说，VCN类似：使用标准培养过程培养的抗BCMA CAR T细胞(无EP)、被电穿孔但未接收mRNA的细胞(仅EP)以及使用对靶向TCRα基因的megaTAL进行编码的mRNA电穿孔的细胞(TCRαKO)。图1。
细胞生长
在10天培养过程期间使用Nexcelom计数装置和台盼蓝排除法(trypan blueexclusion)对两种供体执行活细胞计数以确定电穿孔方案对细胞扩增的影响。仅被电穿孔(仅EP)或使用TCRαmegaTAL mRNA进行电穿孔(TCRαKO)并且在30℃下孵育过夜的细胞相对于使用标准过程培养的细胞展现出延迟的扩增，但是在PBMC培养开始之后第5天与第10天之间恢复类似的生长动力学。图2。
抗BCMA CAR表达和TCRα靶向效率(CD3阴性细胞)
在第10天通过流式细胞术分析确定抗BCMA CAR表达和TCRα破坏效率。通过用缀合到PE荧光团的BCMA抗原将细胞染色来确定CAR表达。在电穿孔组和非电穿孔组中，抗BCMACAR表达类似。图3，最右象限。通过CD3表面染色确定megaTAL介导的TCRα破坏。可检测的CD3表达需要TCRα链迁移到细胞表面并且之前已经显示其与TCRα破坏的遗传分析充分关联。数据显示，从使用megaTAL mRNA大规模电穿孔的T细胞中的～50％和小规模电穿孔的细胞中的～60％的表面移除了CD3。图3，最低象限。CAR阳性细胞和CAR阴性细胞之间，TCRα破坏类似。图3将左下象限(CAR阴性)与右下象限(CAR阳性)进行比较。图4示出了图3中所示的FACS数据的图形表示。
抗原依赖性细胞因子释放
使用干扰素γ(IFNγ)释放测定评估具有破坏的TCRα等位基因(TCRαKO)的抗BCMACAR T细胞对BCMA阳性细胞系和BCMA阴性细胞系的生物活性。在37℃下以1∶1的比例将使用如上所述的标准过程(无EP)、仅EP和TCRαKO扩增的5x104个T细胞与BCMA阳性细胞系和BCMA阴性细胞系共培养24小时。收集培养基上清液，并且执行标准路明克斯测定(luminexassay)以评估不同细胞类型进行的相对细胞因子产生。TCRαKO细胞以抗原依赖性方式分泌较高水平的关键免疫刺激细胞因子。图5A。
使用细胞因子释放测定评估具有破坏的TCRα等位基因(TCRαKO+/-Trex2)的抗BCMA CAR T细胞对BCMA阳性细胞系和BCMA阴性细胞系的生物活性。使用标准过程(无EP)、TCRαKO或使用Trex2产生的TCRαKO扩增5x104个T细胞。在37℃下以1∶1的比例将抗BCMA CART细胞与T细胞或BCMA阳性细胞系和BCMA阴性细胞系共培养24小时。收集培养基上清液，并且执行标准路明克斯测定以评估不同细胞类型进行的IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α产生。所有抗BCMA CAR T细胞都以抗原依赖性方式产生细胞因子。图5B。
TCRαKO细胞的体内疗效
使用Daudi肿瘤异种移植模型测试使用以上所述的标准过程(无EP)、仅EP和TCRαKO处理制造的抗BCMA CAR T细胞的体内疗效。将组成性地表达荧光素酶的2x106个Daudi细胞注射到NSG小鼠体内并且使其进行异种移植和生长直到荧光素酶信号达到如通过Xenogen IVIS成像器评估的～1x107p/秒/cm2/sr(约肿瘤细胞注射后11天)。此时，使用10x106个、5x106个或2.5x106个抗BCMA CAR T细胞(n＝5个每组)对小鼠进行注射。通过借助于Xenogen荧光素酶成像一周两次地对小鼠进行连续成像来跟踪肿瘤生长。在第27天，针对所有剂量，TCRαKO细胞优于使用标准过程培养的抗BCMA CAR T细胞和未使用mRNA进行电穿孔的细胞。图6A。
在第43天，TCRαKO细胞继续优于其它抗BCMA CAR T细胞。图6B。
实施例2
TCRα破坏增强细胞因子从抗CD19 CAR T细胞释放
对使用对抗CD19 CAR进行编码的慢病毒转导的T细胞中的抗原依赖性细胞因子产生与含有整合到TCRα基因座中的抗CD19 CAR的经基因组编辑的T细胞中的抗原依赖性细胞因子产生进行比较。
慢病毒抗CD19 CAR
在第0天使用可溶的抗CD3抗体和抗CD28抗体(50ng/mL)活化人类PBMC(1x106细胞/mL)。在24小时孵育之后，使用抗CD19 CAR慢病毒(LV-T细胞；pBB146，SEQ ID NO：8)转导1x106个细胞。慢病毒载体含有CAR表达盒，所述CAR表达盒包括MND启动子，所述MND启动子可操作地连接到包括以下的CAR：CD8α衍生的信号肽、抗CD19 scFv、CD8α衍生的铰链区和跨膜结构域、细胞内4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ信号传导结构域。使用既定方案制备慢病毒。参见例如，Kutner等人，《BMC生物技术》，2009年；9：10.doi：10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等人，《自然实验手册》，2009年；4(4)：495-505.doi：10.1038/nprot.2009.22。
整合到TCRα基因座中的抗CD19 CAR
设计、构造和验证了含有抗CD19 CAR的腺相关病毒(AAV)质粒(pBW1021，SEQ IDNO：9)。供体修复模板含有CAR表达盒，所述CAR表达盒包括MND启动子，所述MND启动子可操作地连接到包括以下的CAR：CD8α衍生的信号肽、抗CD19 scFv、CD8α衍生的铰链区和跨膜结构域、细胞内4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ信号传导结构域。供体修复模板的5′和3′同源区各自约为650bp。
通过使用提供必要的复制、衣壳和腺病毒辅助元件的一个或多个质粒共转染HEK293T细胞来制备重组AAV(rAAV)。在基于碘克沙醇的梯度中使用超速离心从经共转染的HEK293T细胞中纯化rAAV。
在第0天使用可溶的抗CD3抗体和抗CD28抗体(50ng/mL)活化人类PBMC(1x106细胞/mL)。在活化后第3天，仅使用缓冲液(UTD对照)或使用对TCRα靶向的megaTAL多肽进行编码的mRNA(SEQ ID NO：11)对细胞进行电穿孔。在30℃下对经电穿孔的细胞进行孵育一小时，并且使用对抗CD19 CAR供体修复模板进行编码的rAAV对其进行转染以驱动TCRα基因座处的同源重组(HR-T细胞)。在30℃下对经基因组编辑的细胞进行孵育24小时并且然后回收并且在37℃下使用含有IL-2的培养基对其进行培养5天。
抗CD19 CAR表达和TCRα靶向效率(CD3阴性细胞)
在活化后第10天，通过流式细胞术分析抗CD19 CAR T细胞以检测CD3和抗CD19CAR表面表达。慢病毒转染产生72％CD3+抗CD19-CAR+ T细胞，而28％到40％的HR-T细胞是CD3-抗CD19 CAR+。图7。
抗原依赖性细胞毒性
通过以1∶1的效应子∶靶标(E∶T)比例将T细胞与50∶50混合的CD19+ Nalm-6(GFP)和K562(BFP)靶细胞进行共孵育24小时来分析LV-T细胞和HR-T细胞的细胞毒性潜力。T细胞共培养之后的Nalm-6与K562的比例是T细胞的细胞毒性的直接表示。在LV-T细胞和HR-T细胞共培养中观察到类似水平的CD19特异性细胞毒性。图8A。
抗原依赖性细胞因子释放
通过以1∶1的E∶T比例将LV-T细胞或HR-T细胞与CD19+ Nalm-6细胞共培养24小时来分析抗原依赖性细胞因子释放。收集培养上清液，并且使用流式微珠阵列(CytometricBead Array，CBA)(BD生物科学(BD biosciences))分析IFNγ释放。相比于LV-T细胞，所释放的HR-T细胞增加了IFNγ的量。图8B。
实施例3
TCRα破坏增强细胞因子从抗CD19 CAR T细胞释放
对使用对抗CD19 CAR进行编码的慢病毒转导的T细胞中的抗原依赖性细胞因子产生与含有整合到TCRα基因座中的抗CD19 CAR的经基因组编辑的T细胞中的抗原依赖性细胞因子产生进行比较。
慢病毒抗CD19 CAR
在第0天使用可溶的抗CD3抗体和抗CD28抗体(50ng/mL)活化人类PBMC(1x106细胞/mL)。在24小时孵育之后，使用抗CD19 CAR慢病毒(LV-T细胞；pBB146，SEQ ID NO：8)转导1x106个细胞。慢病毒载体含有CAR表达盒，所述CAR表达盒包括MND启动子，所述MND启动子可操作地连接到包括以下的CAR：CD8α衍生的信号肽、抗CD19 scFv、CD8α衍生的铰链区和跨膜结构域、细胞内4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ信号传导结构域。使用既定方案制备慢病毒。参见例如，Kutner等人，《BMC生物技术》，2009年；9：10.doi：10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等人，《自然实验手册》，2009年；4(4)：495-505.doi：10.1038/nprot.2009.22。
整合到TCRα基因座中的抗CD19 CAR
设计、构造和验证了含有抗CD19 CAR的腺相关病毒(AAV)质粒(pBW400，SEQ IDNO：13)。供体修复模板含有CAR表达盒，所述CAR表达盒包括MND启动子，所述MND启动子可操作地连接到包括以下的CAR：CD8α衍生的信号肽、抗CD19scFv、CD8α衍生的铰链区和跨膜结构域、细胞内4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域以及土拔鼠转录后调控区(WPRE)。供体修复模板的5′和3′同源区各自约为650bp。
通过使用提供必要的复制、衣壳和腺病毒辅助元件的一个或多个质粒共转染HEK293T细胞来制备重组AAV(rAAV)。在基于碘克沙醇的梯度中使用超速离心从经共转染的HEK 293T细胞中纯化rAAV。
在第0天使用可溶的抗CD3抗体和抗CD28抗体(50ng/mL)活化人类PBMC(1x106细胞/mL)。在活化后第3天，仅使用缓冲液(UTD对照)或使用对TCRα靶向的megaTAL多肽进行编码的mRNA(SEQ ID NO：11)对细胞进行电穿孔。在30℃下对经电穿孔的细胞进行孵育一小时，并且使用对抗CD19 CAR供体修复模板进行编码的rAAV对其进行转染以驱动TCRα基因座处的同源重组(HR-T细胞)。在30℃下对经基因组编辑的细胞进行孵育24小时并且然后回收并且在37℃下使用含有IL-2的培养基对其进行培养5天。
抗CD19 CAR表达和TCRα靶向效率(CD3阴性细胞)
在活化后第10天，通过流式细胞术分析抗CD19 CAR T细胞以检测CD3和抗CD19CAR表面表达。慢病毒转染产生85％CD3+抗CD19-CAR+T细胞，而49％的HR-T细胞是CD3-抗CD19CAR+。图9。
抗原依赖性细胞毒性
通过以1∶1的效应子∶靶标(E∶T)比例将T细胞与50∶50混合的CD19+Nalm-6(GFP)和K562(BFP)靶细胞进行共孵育24小时来分析LV-T细胞和HR-T细胞的细胞毒性潜力。T细胞共培养之后的Nalm-6与K562的比例是T细胞的细胞毒性的直接表示。在LV-T细胞和HR-T细胞共培养中观察到类似水平的CD19特异性细胞毒性。图10A。
抗原依赖性细胞因子释放
通过以1∶1的E∶T比例将LV-T细胞或HR-T细胞与CD19+Nalm-6细胞共培养24小时来分析抗原依赖性细胞因子释放。收集培养上清液，并且使用流式微珠阵列(CBA)(BD生物科学)分析IFNγ、IL-2、IL-4和TNFα释放。相比于LV-T细胞，所释放的HR-T细胞增加了细胞因子的量。图10B。
实施例4
抗CD19 CAR转基因同源重组到TCRα基因座中与T细胞耗竭标记物的表达减少相关联
对使用对抗CD19 CAR进行编码的慢病毒转导的T细胞中的T细胞耗竭与含有整合到TCRα基因座中的抗CD19 CAR的经基因组编辑的T细胞中的T细胞耗竭进行比较。
设计、构造并验证了含有启动子、编码抗CD19 CAR的转基因和多腺苷酸化信号的腺相关病毒(AAV)质粒。通过使用提供必要的复制、衣壳和腺病毒辅助元件的一个或多个质粒共转染HEK 293T细胞来制备重组AAV(rAAV)。在基于碘克沙醇的梯度中使用超速离心从经共转染的HEK 293T细胞中纯化rAAV。
慢病毒载体含有CAR表达盒，所述CAR表达盒包括MND启动子，所述MND启动子可操作地连接到包括以下的CAR：CD8α衍生的信号肽、抗CD19scFv、CD8α衍生的铰链区和跨膜结构域、细胞内4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ信号传导结构域。使用既定方案制备慢病毒。参见例如，Kutner等人，《BMC生物技术》，2009年；9：10.doi：10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等人，《自然实验手册》，2009年；4(4)：495-505.doi：10.1038/nprot.2009.22。
使用CD3和CD28活化原代人类T细胞，如实例1所述。使用体外转录的megaTAL mRNA对经活化的原代人类T细胞进行电穿孔并且使用对抗CD19 CAR转基因进行编码的rAAV靶向载体(HR-CAR T细胞)对其进行转导；或者使用对抗CD19 CAR进行编码的慢病毒(LV-CAR T细胞)对经活化的原代人类T细胞进行转导。
以1∶1的效应(E)细胞∶靶标(T)细胞比例将LV-T细胞和HR-T细胞与CD19表达的Nalm-6细胞进行共培养。在共培养的24小时和72小时时测量T细胞耗竭标记物表达(PD-L1、PD-1和Tim-3)。在24小时时，相比于LV-CAR T细胞，HR-CAR T细胞显示出对PD-1和PD-L1的上调减少。图11A。在72小时时，相比于LV-CAR T细胞，HR-CAR T细胞显示出对PD-1和Tim-3的上调减少。图11B。
一般而言，在以下权利要求书中，所使用的术语不应解释为将权利要求书限制于本说明书和权利要求中公开的特定实施例，而应当解释为包括所有可能实施例，连同此权利要求书有权获得的等效物的整个范围。因此，权利要求书不受本公开限制。

Claims (80)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)T细胞，其包括一个或多个经修饰的T细胞受体α(TCRα)等位基因，其中所述CAR T细胞在结合到靶抗原时相比于结合到所述靶抗原的缺少一个或多个经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的促炎性细胞因子。
2.根据权利要求1所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括结合选自由以下组成的组的靶抗原的细胞外结构域：BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1和TAG72。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括从选自由以下组成的组的多肽中分离的跨膜结构域：所述T细胞受体的α或β链、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD-1。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括从选自由以下组成的组的多肽中分离的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM和ZAP70。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括从选自由以下组成的组的多肽中分离的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括选自由以下组成的组的铰链区多肽：CD8α的铰链区、PD1的铰链区和CD152的铰链区。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括一个或多个接头多肽。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括间隔区多肽，所述间隔区多肽包括IgG1、IgG4或IgD的CH2区和CH3区。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括选自由以下组成的组的信号肽：IgG1重链信号多肽、CD8α信号多肽以及人类GM-CSF受体α信号多肽。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的CAR T细胞，其中所述一个或多个经修饰的TCRα等位基因是非功能性的或者具有显著减少的功能。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包括一个或多个前病毒整合体，所述前病毒整合体包括对所述CAR进行编码的核酸。
12.根据权利要求1到10中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包括多核苷酸，所述多核苷酸包括可操作地连接到对所述CAR进行编码的核酸的启动子，其中所述多核苷酸已经通过同源定向修复插入到所述一个或多个TCRα等位基因中。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的CAR T细胞，其中所述一个或多个促炎性细胞因子选自由以下组成的组：IFNγ、IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α。
14.一种CAR T细胞，其包括：
a)一个或多个经修饰的TCRα等位基因；以及
b)对结合靶抗原的CAR进行编码的核酸；
其中所述CAR T细胞在与表达所述靶抗原的靶细胞接触时相比于结合到所述靶抗原的缺少一个或多个经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的一个或多个促炎性细胞因子。
15.一种CAR T细胞，其包括：
a)一个或多个经修饰的TCRα等位基因；以及
b)一个或多个前病毒整合体，其包括对结合靶抗原的CAR进行编码的核酸；
其中所述CAR T细胞在结合到靶抗原时相比于结合到所述靶抗原的缺少一个或多个经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的一个或多个促炎性细胞因子。
16.一种CAR T细胞，其包括一个或多个经修饰的TCRα等位基因，其中包括对结合靶抗原的CAR进行编码的核酸的供体修复模板通过同源定向修复插入到所述一个或多个TCRα等位基因中，并且其中所述CAR T细胞在结合到靶抗原时相比于结合到所述靶抗原的缺少一个或多个经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的一个或多个促炎性细胞因子。
17.根据权利要求14到16中任一项所述的CAR T细胞，其中所述核酸进一步包括可操作地连接到对所述CAR进行编码的所述多核苷酸的RNA聚合酶II启动子。
18.根据权利要求17所述的CAR T细胞，其中所述RNA聚合酶II启动子选自由以下组成的组：短EF1α启动子、长EF1α启动子、人类ROSA 26基因座、泛素C(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增殖性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失的dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子。
19.根据权利要求14到18中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括结合选自由以下组成的组的抗原的细胞外结构域：BCMA、CD19、CSPG4、PSCA、ROR1和TAG72。
20.根据权利要求14到19中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR进一步包括跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。
21.根据权利要求14到20中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括跨膜结构域、共刺激结构域和初级信号传导结构域。
22.根据权利要求14到21中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR进一步包括信号肽、一个或多个接头肽以及一个或多个铰链肽以及任选地一个或多个间隔肽。
23.根据权利要求14到21中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括抗BCMA scFv、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
24.根据权利要求14到21中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括抗CD19 scFv、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
25.根据权利要求14到21中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括抗CSPG4 scFv、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
26.根据权利要求14到21中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括抗ROR1 scFv、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
27.根据权利要求14到21中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括抗PSCA scFv、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
28.根据权利要求14到21中任一项所述的CAR T细胞，其中所述CAR包括抗TAG72 scFv、CD8α跨膜结构域、CD137共刺激结构域以及CD3ζ初级信号传导结构域。
29.根据权利要求14到28中任一项所述的CAR T细胞，其中所述一个或多个促炎性细胞因子选自由以下组成的组：IFNγ、IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α。
30.一种组合物，其包括根据权利要求1到29中任一项所述的CAR T细胞。
31.一种组合物，其包括根据权利要求1到29中任一项所述的CAR T细胞以及生理学上可接受的赋形剂。
32.一种制造CAR T细胞的方法，其包括：
a)在TCRα等位基因中的靶位点处工程化双链断裂，其中所述断裂通过非同源性末端接合(NHEJ)修复，由此产生经修饰的TCRα等位基因；以及
b)使用对CAR进行编码的病毒载体转导所述T细胞；
其中所述CAR T细胞在结合到靶抗原时相比于结合到所述靶抗原的缺少经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的一个或多个促炎性细胞因子。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述经修饰的TCRα等位基因是非功能性的或具有显著减少的功能。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。
36.一种制造CAR T细胞的方法，其包括：
a)在TCRα等位基因中的靶位点处工程化双链断裂；以及
b)使用包括供体修复模板的病毒载体转导所述T细胞，所述供体修复模板包括可操作地连接到对CAR进行编码的核酸的RNA聚合酶II启动子；
其中所述供体修复模板在所述双链断裂(DSB)的所述位点处通过同源定向修复结合到所述TCRα等位基因中；并且
其中所述CAR T细胞在结合到靶抗原时相比于结合到所述靶抗原的缺少经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的一个或多个促炎性细胞因子。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述供体修复模板包括与所述DSB的5′处的TCRα序列同源的5′同源臂；以及与所述DSB的3′处的TCRα序列同源的3′同源臂。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述病毒载体是重组腺相关病毒载体(rAAV)或逆转录病毒。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述rAAV具有来自AAV2的一个或多个ITR。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述rAAV具有选自由以下组成的组的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV10。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述逆转录病毒是慢病毒。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述慢病毒是整合酶缺陷型慢病毒。
43.根据权利要求32到42中任一项所述的方法，其中所述双链断裂是使用工程化核酸酶来产生的。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述工程化核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN或CRISPR/Cas核酸酶。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，其中所述大范围核酸酶是由I-OnuILHE工程化而来的。
46.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，其中所述工程化核酸酶是包括TALEDNA结合结构域和工程化的大范围核酸酶的megaTAL。
47.根据权利要求32到46中任一项所述的方法，其中所述双链断裂是通过工程化核酸内切酶和末端加工酶产生的。
48.根据权利要求47所述的方法，其中对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA和对所述末端加工酶进行编码的mRNA被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
49.根据权利要求47所述的方法，其中对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA、病毒自切割肽和末端加工酶被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
50.根据权利要求47所述的方法，其中对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA、IRES元件和末端加工酶被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
51.根据权利要求47所述的方法，其中融合到末端加工酶或其具有生物活性的片段的、对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
52.根据权利要求47到51中任一项所述的方法，其中所述末端加工酶展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性。
53.根据权利要求47到52中任一项所述的方法，其中所述末端加工酶包括Trex2或其具有生物活性的片段。
54.根据权利要求32到53中任一项所述的方法，其中所述一个或多个促炎性细胞因子选自由以下组成的组：IFNγ、IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α。
55.一种治疗受试者中的癌症的方法，其包括：对所述受试者施用根据权利要求1到29中任一项所述的CAR T细胞或根据权利要求30或权利要求31所述的组合物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中施用给所述受试者的包括经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞的治疗有效量小于施用给所述受试者的缺少经修饰的TCRα的CAR T细胞的所述治疗有效量以清除所述肿瘤。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述癌症是实体癌。
58.根据权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述癌症是液体癌。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述液体癌是选自由以下组成的组的血液恶性肿瘤：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病、毛细胞白血病(HCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性粒细胞白血病(CML)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)和真性红细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、塞扎里氏综合征、前体T淋巴母细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、明显多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨的孤立性浆细胞瘤以及髓外浆细胞瘤。
60.根据权利要求56所述的方法，其中所述血液恶性肿瘤是多发性骨髓瘤。
61.根据权利要求56所述的方法，其中所述血液恶性肿瘤是CLL。
62.一种治疗有需要的受试者中的B细胞相关病症的方法，其包括：对所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1到29中任一项所述的CAR T细胞或者对所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求30或权利要求31所述的组合物。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述B细胞相关病症是多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、恶性可能性不确定的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴增殖性障碍、免疫调节障碍、类风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征、恰加斯氏病、格雷夫氏病、韦格纳氏肉芽肿病、结节性多动脉炎、舍格伦综合征、寻常性天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、抗磷脂综合征、ANCA相关血管炎、古德帕斯丘氏病、川崎氏病、自身免疫性溶血性贫血和急进性肾小球肾炎、重链疾病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性或显著性未确定的单克隆性丙种球蛋白病。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述B细胞相关病症是B细胞恶性肿瘤。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述B细胞相关病症是浆细胞恶性肿瘤。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述B细胞相关病症是自身免疫性疾病。
67.一种增加CAR T细胞的疗效的方法，其包括：通过引入工程化核酸酶降低CAR T细胞表面上的TCRα信号传导组分的可用性，所述工程化核酸酶在TCRα等位基因中的靶位点处产生双链断裂(DSB)以修饰所述TCRα等位基因。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述CAR T细胞包括对所述CAR进行编码的一个或多个前病毒整合体，并且其中所述DSB通过非同源性末端接合(NHEJ)修复。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述CART细胞包括RNA聚合酶II启动子，所述RNA聚合酶II启动子可操作地连接到对通过在所述DSB处进行的同源定向修复而结合到所述TCRα等位基因中的CAR进行编码的核酸。
70.根据权利要求67到69中任一项所述的方法，其中所述工程化核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶、megaTAL、TALEN、ZFN或CRISPR/Cas核酸酶。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述大范围核酸酶是由I-OnuI LHE工程化而来的。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述工程化核酸酶是包括TALE DNA结合结构域和工程化的大范围核酸酶的megaTAL。
73.根据权利要求67到69中任一项所述的方法，其中所述双链断裂是通过工程化核酸内切酶和末端加工酶产生的。
74.根据权利要求73所述的方法，其中对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA和对所述末端加工酶进行编码的mRNA被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
75.根据权利要求73所述的方法，其中对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA、病毒自切割肽和末端加工酶被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
76.根据权利要求73所述的方法，其中对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA、IRES元件和末端加工酶被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
77.根据权利要求73所述的方法，其中融合到末端加工酶或其具有生物活性的片段的、对所述工程化核酸内切酶进行编码的mRNA被引入到所述T细胞中以产生所述双链断裂。
78.根据权利要求74到77中任一项所述的方法，其中所述末端加工酶展现出5′-3′核酸外切酶、5′-3′碱性核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶、5′侧翼核酸内切酶、解旋酶或模板独立的DNA聚合酶活性。
79.根据权利要求74到78中任一项所述的方法，其中所述末端加工酶包括Trex2或其具有生物活性的片段。
80.根据权利要求67到78中任一项所述的方法，其中结合到靶抗原的所述CAR T细胞相比于结合到所述靶抗原的缺少经修饰的TCRα等位基因的CAR T细胞分泌增加量的选自由以下组成的组的一个或多个促炎性细胞因子：IFNγ、IL-4、IL-10、TNFα、IL-8、IL-5、IL-6、GM-CSF和MIP-1α。
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