ES2911015T3 - Receptores quiméricos de antígeno anti-sialil Tn - Google Patents

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Abstract

Un receptor quimérico de antígeno (CAR) que comprende: a) un dominio extracelular que comprende un anticuerpo anti-sialil Tn (STn) o un fragmento de unión al antígeno de este que se une a uno o más epítopos de un antígeno STn expresado en una glucoproteína, en donde el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno de este comprende una secuencia de cadena ligera variable que comprende las secuencias CDRL1-CDRL3 establecidas en las SEQ ID NO: 9- 11, y una secuencia de cadena pesada variable que comprende las secuencias CDRH1-CDRH3 establecidas en las SEQ ID NO: 12-14; b) un dominio bisagra de CD8α; c) un dominio transmembrana de CD8α; d) un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD137; y e) un dominio de señalización primaria de CD3ζ.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores quiméricos de antígeno anti-sialil Tn
Antecedentes de la invención
Campo técnico
La presente invención se refiere a las composiciones y los métodos mejorados para tratar el cáncer. Más particularmente, la invención se refiere a los receptores quiméricos de antígenos (CAR) mejorados que comprenden anticuerpos anti-STn o fragmentos de unión al antígeno de estos, las células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente para expresar estos CAR y el uso de estas composiciones para tratar eficazmente los cánceres que expresan STn.
Descripción de la técnica relacionada
El antígeno sialil-Tn (STn) es un O-glucano corto que contiene un residuo de ácido siálico a2,6 unido a GalNAca-O-Ser/Thr. La biosíntesis de STn está mediada por una sialiltransferasa específica denominada ST6GalNAc I, que compite con los O-glucanos que alargan las glucosiltransferasas y evita que las células cancerosas muestren O-glucanos más largos. Varios epítopos del antígeno STn se expresan en glucoproteínas, que incluyen mucinas y proteínas similares a mucinas, tales como mucina 1 (MUC1), mucina 16 (MUC16) y glucoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72).
El STn se expresa débilmente en tejidos fetales y adultos normales, pero también se expresa en más del 80 % de los carcinomas humanos. La detección de STn generalmente se asocia con un resultado adverso y una disminución de la supervivencia general de los pacientes con cáncer. Debido a su expresión de pancarcinoma asociada con un resultado adverso, se ha diseñado una vacuna contra el cáncer, denominada Theratope, contra el antígeno STn. A pesar del gran entusiasmo en torno a esta inmunoterapia, Theratope fracasó en el ensayo clínico de fase III.
Otro ensayo clínico fallido para el tratamiento de cánceres que expresan STn usó linfocitos T diseñados genéticamente con receptores quiméricos de antígenos (CAR). Los científicos de Cell Genesys usaron linfocitos T con CAR anti-STn que se unen al antígeno STn expresado en la glucoproteína TAG-72 en pacientes con cáncer de colon metastásico. Los pacientes recibieron infusiones intravenosas o intrahepáticas de linfocitos T con CAR anti-STn. Los CAR anti-STn no indujeron ninguna actividad antitumoral.
Hombach y otros, International Journal of Molecular Medicine, vol. 2, núm. 1, págs. 99-103, 1998, describen los receptores quiméricos anti-TAG72. Hombach y otros, Gasteroenterology, vol. 113, núm. 4, págs. 1163-1170, 1997, describen el direccionamiento de linfocitos T de células tumorales TAG72+ por un receptor quimérico. McArthur y otros, American Association for Cancer Research, vol. 38, pág. 37, 1997 describen el direccionamiento de células tumorales por linfocitos T transducidos con receptores quiméricos de linfocitos T. McGuinness y otros, Human Gene Therapy, vol. 10, núm. 2, 1999, describen la actividad antitumoral de los linfocitos T humanos que expresan un receptor quimérico inmunitario.
En consecuencia, el potencial de estrategias de inmunoterapia eficaces dirigidas a STn aún no se ha realizado. Resumen de la invención
La invención se define en las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a los métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico)
La invención generalmente proporciona vectores mejorados para generar terapias con linfocitos T y métodos para usar los mismos. Más particularmente, la invención proporciona moléculas CAR anti-antígeno sialil Tn (sTn) y su uso en el tratamiento, la prevención o la mejora de cánceres que expresan glucoproteínas que expresan sTn.
En varios aspectos, se proporciona un receptor quimérico de antígeno (CAR) que comprende: un dominio extracelular que comprende: a) un anticuerpo anti-STn o un fragmento de unión al antígeno de este que se une a uno o más epítopos de un antígeno STn o un antígeno STn expresado en una glucoproteína, en donde el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno de este comprenden una secuencia de cadena ligera variable que comprende secuencias CDRL1-CDRL3 establecidas en las SEQ ID NO: 1-3, 9-11 o 17-19, y una secuencia de cadena pesada variable que comprende las secuencias CDRH1-CDRH3 establecidas en las SEQ ID NO: 4-6, 12-14 o 20-22; b) un dominio transmembrana; c) uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares; y d) un dominio de señalización primaria.
En varios aspectos, el antígeno STn se expresa en una glucoproteína que se selecciona del grupo que consiste en mucinas o glucoproteínas similares a mucinas.
En aspectos particulares, el antígeno STn se expresa en una mucina que se selecciona del grupo que consiste en: mucina 1 y mucina 16.
En determinados aspectos, el antígeno STn se expresa en una proteína similar a mucina.
En varios aspectos, la proteína similar a mucina es TAG-72.
En aspectos particulares, el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno que se une al antígeno STn se selecciona del grupo que consiste en: una Ig de camello, IgNAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, anticuerpo Fv de cadena simple ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, proteína Fv estabilizada con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de dominio único (sdAb, nanocuerpo).
En determinados aspectos, el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno que se une al antígeno STn es un scFv.
En aspectos particulares, el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno de este comprenden una o más CDR de la cadena ligera como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3 y/o una o más CDR de la cadena pesada como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 4-6.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno de este comprende una o más CDR de la cadena ligera como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 9-11 y/o una o más CDR de la cadena pesada como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 12-14.
En aspectos adicionales, el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno de este comprende una o más CDR de la cadena ligera como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 17-19 y/o una o más CDR de la cadena pesada como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 20-22.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno de este comprende una secuencia de cadena ligera variable como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 15 o 23, y/o una secuencia de cadena pesada variable como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 8, 16 o 24.
En determinados aspectos, el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno de este comprende una secuencia de cadena ligera variable como se establece en la SEQ ID NO: 7 y/o una secuencia de cadena pesada variable como se establece en la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos, el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno de este comprende una secuencia de cadena ligera variable como se establece en la SEQ ID NO: 15 y/o una secuencia de cadena pesada variable como se establece en la SEQ ID NO: 16.
En aspectos particulares, el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno de este comprende una secuencia de cadena ligera variable como se establece en la SEQ ID NO: 23 y/o una secuencia de cadena pesada variable como se establece en la SEQ ID NO: 24.
En otros aspectos, el dominio transmembrana es de un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en: cadena alfa o beta del receptor de linfocitos T, CD8, c D3e, CDy, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, Cd9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154 y PD1.
En aspectos adicionales, el dominio transmembrana es de un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en: CD8a; CD4, CD45, PD1 y CD152.
En algunos aspectos, el dominio transmembrana es de CD8a.
En otros aspectos, el dominio transmembrana es de PD1.
En aspectos particulares, el dominio transmembrana es de CD152.
En otros aspectos, uno o más dominios de señalización coestimuladores son de una molécula coestimuladora que se selecciona del grupo que consiste en: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70.
En determinados aspectos, uno o más dominios de señalización coestimuladores son de una molécula coestimuladora que se selecciona del grupo que consiste en: CD28, CD134 y CD137.
En algunos aspectos, uno o más dominios de señalización coestimuladores son de CD28.
En algunos aspectos, uno o más dominios de señalización coestimuladores son de CD134.
En algunos aspectos, uno o más dominios de señalización coestimuladores son de CD137.
En aspectos particulares, el dominio de señalización primaria se aísla de un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en: FcRy, FcRp, CD3y, CD38, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.
En aspectos particulares, el dominio de señalización primaria se aísla de CD3Z.
En aspectos adicionales, el CAR comprende además un polipéptido de la región bisagra.
En determinados aspectos, el polipéptido de la región bisagra comprende una región bisagra de CD8a.
En otros aspectos, el polipéptido de la región bisagra comprende una región bisagra de PD1.
En aspectos particulares, el polipéptido de la región bisagra comprende una región bisagra de CD152.
En aspectos adicionales, el CAR comprende además una región espaciadora.
En otros aspectos, el polipéptido de la región espaciadora comprende regiones CH2 y CH3 de IgG1, IgG4 o IgD. En otros aspectos, el CAR comprende además un péptido señal.
En aspectos particulares, el péptido señal comprende un polipéptido señal de cadena pesada de IgG1, un polipéptido señal de CD8a o un polipéptido señal del receptor alfa de GM-CSF humano.
En aspectos particulares, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 25-27.
En aspectos particulares, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 25. En aspectos particulares, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 26. En aspectos particulares, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 27. En varios aspectos, se proporciona un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del CAR contemplado en la presente descripción.
En varios aspectos, se proporciona un polinucleótido que codifica un CAR contemplado en la presente descripción. En varios aspectos, se proporciona un vector que comprende un polinucleótido que codifica un CAR contemplado en la presente descripción.
En determinados aspectos, el vector es un vector de expresión.
En aspectos particulares, el vector es un vector episomal.
En otros aspectos, el vector es un vector viral.
En otros aspectos, el vector es un vector retroviral.
En aspectos particulares, el vector es un vector lentiviral.
En otros aspectos, el vector lentiviral se selecciona del grupo que consiste esencialmente en: virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1); virus de la inmunodeficiencia humana 2 (VIH-2), virus del virus visnamaedi (VMV); virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV); virus de la anemia infecciosa equina (EIAV); virus de la inmunodeficiencia felina (FIV); virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB); y el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV).
En aspectos particulares, el vector comprende una LTR retroviral izquierda (5'), una señal de empaquetamiento Psi (V), un tramo de polipurina central/ADN flap (cPPT/FLAP), un elemento de exportación retroviral; un promotor operativamente unido al polinucleótido; y una LTR retroviral derecha (3').
En otros aspectos, el vector comprende además una secuencia de poliadenilación heteróloga.
En aspectos particulares, el vector comprende además un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (HPRE) o un elemento regulador postranscripcional de la marmota (WPRE).
En aspectos adicionales, el promotor de la LTR 5' se reemplaza con un promotor heterólogo.
En otros aspectos, el promotor heterólogo es un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) o un promotor del virus de simio 40 (SV40).
En algunos aspectos, la LTR 5' o la LTR 3' es una LTR de lentivirus.
En determinados aspectos, la LTR 3' comprende una o más modificaciones.
En determinados aspectos, la LTR 3' comprende una o más eliminaciones.
En aspectos particulares, la LTR 3' es una LTR autoinactivante (SIN).
En aspectos particulares, la secuencia de poliadenilación es una poliadenilación de hormona de crecimiento bovina o una secuencia señal de poliadenilación de p-globina de conejo.
En aspectos adicionales, el polinucleótido comprende una secuencia de Kozak optimizada.
En aspectos adicionales, el promotor operativamente unido al polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en: un promotor génico temprano inmediato (CMV) de citomegalovirus, un promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1-a), un promotor de fosfoglicerato cinasa-1 (PGK), un promotor de ubiquitina-C (UBQ-C), un potenciador de citomegalovirus/promotor de beta-actina de pollo (CAG), un potenciador de polioma/promotor de timidina cinasa del herpes simple (MC1), un promotor de beta actina (p-ACT), un promotor de virus de simio 40 (SV40) y un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativa eliminada, promotor sustituido en el sitio de unión al cebador (MND) dl587rev.
En varios aspectos, se proporciona una célula efectora inmunitaria que comprende un vector que codifica un CAR contemplado en la presente descripción.
En aspectos particulares, la célula efectora inmunitaria se selecciona del grupo que consiste en: un linfocito T, un linfocito T citolítico natural (NKT) y una célula citolítica natural (NK).
En algunos aspectos, la célula efectora inmunitaria se transduce con un vector contemplado en la presente descripción y se activa y estimula en presencia de un inhibidor de la vía PI3K, lo que mantiene de este modo la proliferación de las células efectoras inmunitarias transducidas en comparación con la proliferación de las células efectoras inmunitarias transducidas que se activaron y estimularon en ausencia del inhibidor de la vía PI3K.
En aspectos particulares, la célula efectora inmunitaria activada y estimulada en presencia del inhibidor de la vía PI3K tiene expresión aumentada de i) uno o más marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en: CD62L, CD127, CD197 y CD38 o ii) todos los marcadores CD62L, CDl27, CD197 y CD38 en comparación con una célula efectora inmunitaria activada y estimulada en ausencia del inhibidor de la vía PI3K.
En aspectos particulares, la célula efectora inmunitaria activada y estimulada en presencia del inhibidor de la vía PI3K tiene expresión aumentada de i) uno o más marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en: CD62L, CD127, CD27 y CD8 o ii) todos los marcadores CD62L, CD127, CD27 y CD8 en comparación con una célula efectora inmunitaria activada y estimulada en ausencia del inhibidor de la vía PI3K.
En un aspecto, el inhibidor de PI3K es ZSTK474.
En varios aspectos, se proporciona una composición que comprende la célula efectora inmunitaria contemplada en la presente descripción y un excipiente fisiológicamente aceptable.
En varios aspectos, se proporciona un método para generar una célula efectora inmunitaria que comprende un CAR contemplado en la presente descripción que comprende introducir en una célula efectora inmunitaria un vector que codifica un CAR contemplado en la presente descripción.
En aspectos particulares, el método comprende además estimular la célula efectora inmunitaria e inducir la proliferación de la célula al poner en contacto la célula con anticuerpos que se unen a CD3 y anticuerpos que se unen a CD28; lo que genera de este modo una población de células efectoras inmunitarias.
En determinados aspectos, la célula efectora inmunitaria se estimula e induce a proliferar antes de introducir el vector.
En aspectos adicionales, las células efectoras inmunitarias comprenden linfocitos T.
En algunos aspectos, los linfocitos T comprenden linfocitos T citolíticos naturales (NKT).
En algunos aspectos, las células efectoras inmunitarias comprenden células NK.
En aspectos particulares, las células se activan y estimulan en presencia de un inhibidor de la vía PI3K, lo que mantiene de este modo la proliferación de las células efectoras inmunitarias transducidas en comparación con la proliferación de células efectoras inmunitarias que se activan y estimulan en ausencia del inhibidor de la vía PI3K En algunos aspectos, las células efectoras inmunitarias activadas y estimuladas en presencia del inhibidor de la vía PI3K tienen expresión aumentada de i) uno o más marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en: CD62L, CD127, CD197 y CD38 o ii) todos los marcadores CD62L, CD127, CD197 y CD38 en comparación con las células efectoras inmunitarias activadas y estimuladas en ausencia del inhibidor de la vía PI3K.
En aspectos particulares, la célula efectora inmunitaria activada y estimulada en presencia del inhibidor de la vía PI3K tiene expresión aumentada de i) uno o más marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en: CD62L, CD127, CD27 y CD8 o ii) todos los marcadores CD62L, CD127, CD27 y CD8 en comparación con una célula efectora inmunitaria activada y estimulada en ausencia del inhibidor de la vía PI3K.
En un aspecto, el inhibidor de PI3K es ZSTK474.
En varios aspectos, se proporciona un método para aumentar la citotoxicidad en células cancerosas que expresan STn en glucoproteína en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición contemplada en la presente descripción suficiente para aumentar la citotoxicidad en células cancerosas que expresan STn en comparación con la citotoxicidad de las células cancerosas que expresan STn antes de la administración.
En varios aspectos, se proporciona un método para disminuir el número de células cancerosas que expresan STn en una glucoproteína en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición contemplada en la presente descripción suficiente para disminuir el número de células cancerosas que expresan STn en comparación con el número de células cancerosas que expresan STn antes de la administración.
En varios aspectos, se proporciona un método para tratar un cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición contemplada en la presente descripción.
En aspectos particulares, el cáncer es un cáncer sólido.
En otros aspectos, el cáncer es cáncer de esófago, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de páncreas, colangiocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de colon o cáncer de mama.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de esófago.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de vejiga.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de riñón.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de pulmón.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de ovario.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de cuello uterino.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de páncreas.
En un aspecto, el cáncer es un colangiocarcinoma.
En un aspecto, el cáncer es cáncer gástrico.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de colon.
En un aspecto, el cáncer es cáncer de mama.
En aspectos particulares, el cáncer es un cáncer líquido.
En un aspecto, el cáncer líquido es una neoplasia hematológica.
En un aspecto, la neoplasia hematológica se selecciona del grupo que consiste en: leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de células pilosas (HCL), mieloma múltiple (MM), leucemia mieloide aguda (AML) o leucemia mieloide crónica (CML).
En un aspecto, la neoplasia hematológica es CLL.
En varios aspectos, se proporciona un método para mejorar al menos uno o más síntomas asociados con un cáncer que expresa STn en una glucoproteína en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de una composición contemplada en la presente descripción suficiente para mejorar al menos un síntoma asociado con células cancerosas que expresan STn.
En aspectos particulares, uno o más síntomas mejorados se seleccionan del grupo que consiste en: debilidad, fatiga, dificultad para respirar, moretones y sangrado fáciles, infecciones frecuentes, ganglios linfáticos agrandados, abdomen distendido o doloroso, dolor de huesos o articulaciones, fracturas, pérdida de peso no planificada, falta de apetito, sudores nocturnos, fiebre leve persistente y disminución de la micción.
En cualquiera de los aspectos anteriores, el antígeno STn se expresa en la glucoproteína TAG-72.
Breve descripción de varias vistas de los dibujos
La Figura 1 muestra un esquema de construcciones de CAR anti-STn.
La Figura 2 muestra linfocitos T con CAR anti-STn (E), pero no linfocitos T de control no transducidos que eliminan células LS174T que expresan STn (T) en cultivo conjunto en varias relaciones E:T.
La Figura 3A muestra el número de copias del vector (VCN) en linfocitos T transducidos con un vector lentiviral que codifica un CAR anti-STn.
La Figura 3B muestra la expresión en la superficie celular de un CAR anti-STn en linfocitos T transducidos con un vector lentiviral que codifica el CAR anti-STn.
La Figura 4 muestra la actividad anticancerígena de un CAR anti-STn ilustrativo. Figura 4A: Los linfocitos T con CAR anti-STn secretan IFNy cuando se cultivan conjuntamente con líneas celulares Jurkat y LS174T que expresan STn en TAG72. Figura 4B: Los linfocitos T con CAR anti-STn, pero no los linfocitos T no transducidos, eliminan la línea celular LS174T en cultivo conjunto. Figura 4C: Los linfocitos T con CAR anti-STn (E) muestran una citotoxicidad dependiente de la dosis cuando se cultivan conjuntamente con células LS174T (T) en varias relaciones E:T.
La Figura 5 muestra que la administración de linfocitos T con CAR anti-STn retrasa el crecimiento del tumor en ratones NOD scid gamma (NSG) que recibieron células de adenocarcinoma de colon subcutáneo (LS174T). Breve descripción de los identificadores de secuencia
Las SEQ ID NO: 1-24 establecen las secuencias de aminoácidos de las secuencias ilustrativas de CDR de la cadena ligera, las secuencias de CDR de la cadena pesada, las cadenas ligeras de dominio variable y las cadenas pesadas de dominio variable para los CAR anti-STn contemplados en la presente descripción.
Las SEQ ID NO: 25-27 establecen la secuencia de aminoácidos para los CAR anti-STn ilustrativos.
Las SEQ ID NO: 28-38 establecen las secuencias de aminoácidos de varios enlazadores.
Las SEQ ID NO: 39-51 establecen las secuencias de aminoácidos de los sitios de escisión de proteasas y los sitios de escisión de polipéptidos de autoescisión.
La SEQ ID NO: 52 establece la secuencia de aminoácidos para la glucoproteína asociada a tumores humanos (TAG-72).
La SEQ ID NO: 53 establece la secuencia de aminoácidos de una regla ilustrativa para determinar una CDR-L3. La SEQ ID NO: 54 establece la secuencia de aminoácidos de una regla ilustrativa para determinar una CDR-H 1. La SEQ ID NO: 55 establece la secuencia de aminoácidos de una regla ilustrativa para determinar una CDR-H2. La SEQ ID NO: 56 establece la secuencia de aminoácidos de una regla ilustrativa para determinar una CDR-H3. La SEQ ID NO: 57 establece la secuencia de nucleótidos para la secuencia consenso de Kozak.
Descripción detallada
A. Visión general
La invención generalmente se refiere a las composiciones y los métodos mejorados para prevenir o tratar cánceres que expresan el antígeno STn en una glucoproteína o prevenir, tratar o mejorar al menos un síntoma asociado con un cáncer que expresa STn. En aspectos particulares, la descripción se refiere a la terapia celular adoptiva mejorada de cánceres que expresan el antígeno STn en una glucoproteína mediante el uso de células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente. Los enfoques genéticos ofrecen un medio potencial para mejorar el reconocimiento inmunológico y la eliminación de las células cancerosas. Una estrategia prometedora es diseñar genéticamente células efectoras inmunitarias para expresar receptores quiméricos de antígenos (CAR) que redirigen la citotoxicidad hacia las células cancerosas.
Las composiciones y los métodos mejorados de la terapia celular adoptiva contemplados en la presente descripción proporcionan células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente que pueden expandirse fácilmente, exhiben persistencia a largo plazo in vivo y demuestran citotoxicidad dependiente del antígeno para células que expresan antígeno sialil Tn (STn) en una glucoproteína.
El STn (Neu5Aca2-6GalNAca-O-Ser/Thr) también se conoce como CD175 y es el O-glucano de tipo mucina sialilado más simple. El STn es un disacárido formado por un residuo de N-acetilgalactosamina (GalNAc) alfa-O unido a un residuo de serina o treonina, y sustituido por un ácido siálico (Neu5Ac en humanos) en el carbono 6. Esta sialilación previene la formación de varias estructuras centrales que de otro modo se encuentran en los O-glucanos de tipo mucina.
El STn se expresa en tejidos fetales tales como esófago, estómago, páncreas, colon (células caliciformes), pulmón, glándula mamaria y tejidos gonadales de fetos de ambos sexos. Sin embargo, no se sabe mucho sobre el papel biológico de STn durante el desarrollo embrionario.
Se han realizado varios estudios que informan que la expresión de STn en tejidos normales es rara y/o baja en comparación con los tejidos cancerosos. La inmunohistoquímica demostró la expresión excesiva de STn en las células cancerosas en comparación con las células sanas correspondientes. Por lo tanto, STn se describió como un antígeno oncofetal. Se informó una expresión excesiva o una expresión nueva de STn en muchos cánceres epiteliales con frecuencias más altas en cánceres de páncreas, vejiga, pulmón, colorrectal y ovario. Al principio de la carcinogénesis, se informó que STn estaba expresado excesivamente en varias lesiones epiteliales benignas consideradas precursoras potenciales de cánceres, tales como el epitelio escamoso displásico esofágico, la metaplasia intestinal gástrica, la displasia colónica moderada, la hiperplasia adematosa atípica pulmonar, la hiperplasia ductal mamaria y la metaplasia apocrina. La expresión de STn también se informó en lesiones benignas en el páncreas y los ovarios, dos tejidos que carecen de expresión de STn en estado saludable.
También hay informes que relacionan la expresión de STn con enfermedades inflamatorias del estómago (gastritis) o del colon (colitis ulcerosa y colitis de Crohn). En la gastritis, se detectó STn en el 50-100 % de los casos. En la colitis ulcerosa, la STn des-O-acetilada demostró ser un marcador independiente de la secuencia displasia-carcinoma. También se detectó STn des-O-acetilada en el 44 % de los casos de colitis de Crohn, otra enfermedad inflamatoria asociada con riesgos de cáncer de colon.
En varios aspectos, los CAR que comprenden secuencias de anticuerpos anti-STn son muy eficaces; experimentan una fuerte expansión in vivo; y reconocen las células cancerosas que expresan STn en glucoproteínas y muestran actividad citotóxica contra las células cancerosas que expresan STn. El antígeno STn se expresa en gran medida en una amplia variedad de tumores sólidos que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de páncreas, colangiocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de colon y cáncer de mama.
En un aspecto, se proporciona un CAR que comprende un anticuerpo anti-STn o un fragmento de unión al antígeno, un dominio transmembrana y uno o más dominios de señalización intracelular.
En un aspecto, una célula efectora inmunitaria se modifica genéticamente para expresar un CAR. Los linfocitos T que expresan un CAR se denominan en la presente descripción linfocitos T con CAR o linfocitos T modificados con CAR.
En diversos aspectos, las células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente se administran a un paciente con células cancerosas que expresan STn en glucoproteínas que incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos y neoplasias hematológicas.
La práctica de los aspectos particulares empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, química orgánica, biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante, genética, inmunología y biología celular que estén dentro del conocimiento de la técnica, muchas de las cuales se describen más abajo con fines ilustrativos. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Consulte, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición, 2001)); Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, 1989)); Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)); Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, actualizado en julio de 2008)); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, Nueva York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow y Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach y W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; así como también monografías en revistas tales como Advances in Immunology.
B. Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comúnmente entienden los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción pueden usarse en la práctica o prueba de aspectos particulares, en la presente descripción se describen aspectos preferidos de composiciones, métodos y materiales. A los efectos de la presente descripción, los siguientes términos se definen más abajo.
Los artículos "un", "una" y "el" se usan en la presente descripción para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos a uno, o a uno o más) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o uno o más elementos.
El uso de la alternativa (por ejemplo, "o") debe entenderse como una, ambas o cualquier combinación de las alternativas.
Debe entenderse que el término "y/o" significa una o ambas alternativas.
Como se usa en la presente descripción, el término "alrededor de" o "aproximadamente" se refiere a una magnitud, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía tanto como 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % a una magnitud, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. En un aspecto, el término "alrededor de" o "aproximadamente" se refiere a un intervalo de magnitud, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud ± 15 %, ± 10 %, ± 9 %, ± 8 %, ± 7 %, ± 6 %, ± 5 %, ± 4 %, ± 3 %, ± 2 % o ± 1 % sobre una magnitud, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.
A lo largo de esta especificación, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que las palabras "comprenden", "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, todo lo que sigue a la frase "que consiste en". Por lo tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, y que no puede haber otros elementos presentes. Por "que consiste esencialmente en" se entiende que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase, y se limita a otros elementos que no interfieren ni contribuyen a la actividad o la acción especificada en la descripción de los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que no hay otros elementos presentes que afecten materialmente la actividad o la acción de los elementos enumerados.
La referencia a lo largo de esta especificación a "algún aspecto", "un aspecto", "un aspecto particular", "un aspecto relacionado", "un determinado aspecto", "un aspecto adicional" u "otro aspecto" o las combinaciones de estos significan que un rasgo, una estructura o una característica particular descritos en relación con el aspecto están incluidos en al menos un aspecto. Por lo tanto, las apariciones de las frases anteriores en varios lugares a lo largo de esta especificación no necesariamente se refieren todas al mismo aspecto. Además, los rasgos, las estructuras o las características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en uno o más aspectos. También se entiende que la recitación positiva de un rasgo en un aspecto sirve como base para excluir el rasgo en un aspecto particular.
El STn (Neu5Aca2-6GalNAca-O-Ser/Thr) también se conoce como CD175 y es el O-glucano de tipo mucina sialilado más simple. El STn es un disacárido formado por un residuo de N-acetilgalactosamina (GalNAc) alfa-O unido a un residuo de serina o treonina, y sustituido por un ácido siálico (Neu5Ac en humanos) en el carbono 6. Esta sialilación previene la formación de varias estructuras centrales que de otro modo se encuentran en los O-glucanos de tipo mucina.
En varios aspectos, el antígeno STn se expresa en una glucoproteína que se selecciona del grupo que consiste en mucinas o glucoproteínas similares a mucinas.
En aspectos particulares, el antígeno STn se expresa en una mucina que se selecciona del grupo que consiste en: mucina 1 y mucina 16.
En determinados aspectos, el antígeno STn se expresa en una proteína similar a mucina.
En varios aspectos, la proteína similar a mucina es TAG-72.
C. Receptores quiméricos de antígenos
En varios aspectos, se proporcionan receptores diseñados genéticamente que redirigen la citotoxicidad de las células efectoras inmunitarias hacia las células cancerosas y un antígeno STn. Estos receptores diseñados genéticamente se denominan en la presente descripción receptores quiméricos de antígenos (CAR). Los CAR son moléculas que combinan la especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, STn expresado en una glucoproteína) con un dominio intracelular activador del receptor de linfocitos T para generar una proteína quimérica que muestra una actividad inmunitaria celular específica anti-STn. Como se usa en la presente descripción, el término "quimérico" describe estar compuesto por partes de diferentes proteínas o ADN de diferentes orígenes.
En aspectos particulares, los CAR comprenden un dominio extracelular (también denominado dominio de unión o dominio de unión específico al antígeno) que se une a STn, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. La unión del dominio de unión al antígeno anti-STn de CAR con la glucoproteína unida a STn, por ejemplo, TAG-72, en la superficie de una célula diana da como resultado la agrupación de CAR y proporciona un estímulo de activación a la célula que contiene CAR. La principal característica de los CAR es su capacidad para redirigir la especificidad de las células efectoras inmunitarias, lo que desencadena la proliferación, la producción de citocinas, la fagocitosis o la producción de moléculas que pueden mediar en la muerte celular de la célula que expresa el antígeno diana de manera independiente de la histocompatibilidad mayor (MHC), lo que explota la capacidades de direccionamiento específico a células de los anticuerpos monoclonales, los ligandos solubles o los correceptores específicos a células.
En varios aspectos, un CAR comprende un dominio de unión extracelular que comprende un dominio de unión específico a STn; un dominio transmembrana; uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelular; y un dominio de señalización primaria.
En aspectos particulares, un CAR comprende un dominio de unión extracelular que comprende un anticuerpo anti-STn o un fragmento de unión al antígeno de este; uno o más dominios bisagra o dominios espaciadores; un dominio transmembrana que incluye; uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelular; y un dominio de señalización primaria.
1. Dominio de unión
En aspectos particulares, los CAR comprenden un dominio de unión extracelular que comprende un anticuerpo anti-STn o un fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente a una glucoproteína unida a STn humana expresada en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa. Como se usa en la presente descripción, los términos "dominio de unión", "dominio extracelular", "dominio de unión extracelular", "dominio de unión específico al antígeno" y "dominio de unión específico al antígeno extracelular" se usan indistintamente y proporcionan un CAR con la capacidad para unirse específicamente al antígeno diana de interés, por ejemplo, STn. El dominio de unión puede derivar de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante.
Los términos "afinidad de unión específica" o "se une específicamente" o "específicamente unido" o "unión específica" o "dianas específicas" como se usan en la presente descripción, describen la unión de un anticuerpo anti-STn o un fragmento de unión al antígeno de este (o un CAR que comprende el mismo) a STn con mayor afinidad de unión que la unión de referencia. Un dominio de unión (o un CAR que comprende un dominio de unión o una proteína de fusión que contiene un dominio de unión) "se une específicamente" a una glucoproteína unida a STn, tal como TAG-72, si se une o se asocia con STn con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación de equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) de, por ejemplo, mayor o igual a aproximadamente 105 M-1. En determinados aspectos, un dominio de unión (o una proteína de fusión de este) se une a una diana con una K mayor o igual a aproximadamente 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1 o 1013 M-1. Los dominios de unión de "alta afinidad" (o las proteínas de fusión de cadena simple de estos) se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 1013 M-1, o mayor.
Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación de equilibrio (Kd) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, de 10-5 M a 10-13 M, o menos). Las afinidades de los polipéptidos del dominio de unión y las proteínas CAR de acuerdo con la presente descripción pueden determinarse fácilmente mediante el uso de técnicas convencionales, por ejemplo, mediante ELISA competitivo (ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas), o mediante asociación de unión o ensayos de desplazamiento mediante el uso de ligandos marcados, o mediante el uso de un dispositivo de resonancia de plasmones de superficie tal como el Biacore T100, que está disponible en Biacore, Inc., Piscataway, NJ, o tecnología de biosensor óptico tales como el sistema EPIC o EnSpire que están disponibles en Corning y Perkin Elmer respectivamente (consulte también, por ejemplo, Scatchard y otros (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; y las patentes de Estados Unidos núms. 5,283,173; 5,468,614, o el equivalente).
En un aspecto, la afinidad de la unión específica es aproximadamente 2 veces mayor que la unión de referencia, aproximadamente 5 veces mayor que la unión de referencia, aproximadamente 10 veces mayor que la unión de referencia, aproximadamente 20 veces mayor que la unión de referencia, aproximadamente 50 veces mayor que la unión de referencia, aproximadamente 100 veces mayor que la unión de referencia, o aproximadamente 1000 veces mayor que la unión de referencia o superior.
En aspectos particulares, el dominio de unión extracelular de un CAR comprende un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este. Un "anticuerpo" se refiere a un agente de unión que es un polipéptido que comprende al menos una región variable de inmunoglobulina de la cadena ligera o de la cadena pesada que reconoce y se une específicamente a un epítopo de un antígeno, tales como un lípido, carbohidrato, polisacárido, glucoproteína, péptido o ácido nucleico que contiene un determinante antigénico, tales como los reconocidos por una célula inmunitaria.
Un "antígeno (Ag)" se refiere a un compuesto, composición o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de linfocitos T en un animal, que incluye las composiciones (tal como una que incluye una proteína específica de cáncer) que se inyectan o se absorben por un animal. Los antígenos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, lípidos, carbohidratos, polisacáridos, glucoproteínas, péptidos o ácidos nucleicos. Un antígeno reacciona con los productos de la inmunidad celular o humoral específica, que incluyen los inducidos por antígenos heterólogos, tales como los antígenos descritos. En aspectos particulares, el antígeno diana es un antígeno STn. Un "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a la región de un antígeno a la que se une un agente de unión. Los anticuerpos incluyen fragmentos de unión al antígeno de estos, tales como Ig de camello, IgNAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, proteínas Fv de cadena simple ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, proteínas Fv estabilizadas con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de dominio único (sdAb, nanocuerpo) y las partes de anticuerpos de longitud completa responsables de la unión al antígeno. El término también incluye las formas diseñadas genéticamente tales como anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (tales como anticuerpos biespecíficos) y los fragmentos de unión al antígeno de estos. Consulte también, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3ra Edición, W. H. Freeman & Co., Nueva York, 1997.
Como entenderá el experto en la técnica y como se describe en otra parte de la presente descripción, un anticuerpo completo comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada consiste en una región variable y una primera, segunda y tercera región constante, mientras que cada cadena ligera consiste en una región variable y una región constante. Las cadenas pesadas de los mamíferos se clasifican en a, 8, £, y y H. Las cadenas ligeras de mamíferos se clasifican como A o k. Las inmunoglobulinas que comprenden las cadenas pesadas a, 8, £, y y h se clasifican como inmunoglobulina (Ig)A, IgD, IgE, IgG e IgM. El anticuerpo completo forma una "Y". El tallo de la Y consiste en la segunda y la tercera regiones constantes (y para IgE e IgM, la cuarta región constante) de dos cadenas pesadas unidas entre sí y se forman enlaces disulfuro (entre cadenas) en la bisagra. Las cadenas pesadas Y, a y 8 tienen una región constante compuesta por tres dominios Ig en tándem (en una línea) y una región bisagra para mayor flexibilidad; las cadenas pesadas h y £ tienen una región constante compuesta por cuatro dominios de inmunoglobulina. La segunda y la tercera regiones constantes se denominan "dominio CH2" y "dominio CH3", respectivamente. Cada brazo de la Y incluye la región variable y la primera región constante de una cadena pesada simple unida a las regiones variable y constante de una cadena ligera simple. Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada son responsables de la unión al antígeno.
Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada contienen una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "c Dr ". Las CDR pueden definirse o identificarse mediante métodos convencionales, tales como por secuencia de acuerdo con Kabat y otros (Wu, TT y Kabat, EA, JExp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. y Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987); (consulte, Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991), o por estructura de acuerdo con Chothia y otros (Chothia, C. y Lesk, A.M., JMol. Biol., 196(4): 901­ 917 (1987), Chothia, C. y otros, Nature, 342: 877-883 (1989)).
Los ejemplos ilustrativos de las reglas para predecir las CDR de la cadena ligera incluyen: CDR-L1 comienza aproximadamente en el residuo 24, está precedido por Cys, tiene aproximadamente 10-17 residuos y es seguido por un Trp (típicamente Trp-Tyr-Gln, pero también, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu); CDR-L2 comienza aproximadamente 16 residuos después del final de CDR-L1, generalmente está precedida por Ile-Tyr, pero también Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe y tiene 7 residuos; y CDR-L3 comienza aproximadamente 33 residuos después del final de CDR-L2, está precedida por Cys, tiene 7-11 residuos y es seguida por Phe-Gly-XXX-Gly (XXX es cualquier aminoácido, SEQ ID NO: 53).
Los ejemplos ilustrativos de las reglas para predecir las CDR de la cadena pesada incluyen: CDR-H1 comienza aproximadamente en el residuo 26, está precedido por Cys-XXX-XXX-XXX (SEQ ID NO: 54), tiene 10-12 residuos y es seguido por un Trp (típicamente Trp-Val, pero también Trp-Ile, Trp-Ala); CDR-H2 comienza aproximadamente 15 residuos después del final de CDR-H1, generalmente está precedida por Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (SEQ ID NO: 55), o una serie de variaciones, tiene 16-19 residuos y es seguida de Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala; y CDR-H3 comienza aproximadamente 33 residuos después del final de CDR-H2, está precedida por Cys-XXX-XXX (típicamente Cys-Ala-Arg), tiene de 3 a 25 residuos y es seguida por Trp-Gly-XXX-Gly (SEQ ID NO: 56).
En un aspecto, las CDR de la cadena ligera y las CDR de la cadena pesada se determinan de acuerdo con el método de Kabat.
En un aspecto, las CDR de la cadena ligera y las CDR2 y CDR3 de la cadena pesada se determinan de acuerdo con el método de Kabat, y la CDR1 de la cadena pesada se determina de acuerdo con el método AbM, que es un componente entre los métodos de Kabat y Clotia, consulte, por ejemplo, Whitelegg N & Rees AR, Protein Eng., Diciembre de 2000;13(12):819-24 y Methods Mol Biol. 2004;248:51-91. Los programas para predecir CDR están disponibles públicamente, por ejemplo, AbYsis (www.bioinf.org.uk/abysis/).
Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie, tales como los humanos. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligera y pesada constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR en un espacio tridimensional. Las CDR son las principales responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan típicamente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente comenzando desde el extremo N, y también se identifican típicamente por la cadena en la que se encuentra la CDR particular. Por lo tanto, las CDR ubicadas en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3, mientras que las CDR ubicadas en el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo se denominan CDRL1, CDRL2, y CDRL3. Los anticuerpos con diferentes especificidades (es decir, diferentes sitios de combinación para diferentes antígenos) tienen diferentes CDR. Aunque son las CDR las que varían de un anticuerpo a otro, solo un número limitado de posiciones de aminoácidos dentro de las CDR están directamente involucradas en la unión al antígeno. Estas posiciones dentro de las CDR se denominan residuos determinantes de la especificidad (SDR). Los ejemplos ilustrativos de las CDR de la cadena ligera que son adecuados para construir los CAR anti-STn contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de CDR establecidas en las SEQ ID NO: 1-3, 9-11 y 17-19. Los ejemplos ilustrativos de las CDR de la cadena pesada que son adecuados para construir los CAR anti-STn contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de CDR establecidas en las SEQ ID NO: 4-6, 12-14 y 20-22.
Las referencias a "Vl" o "VL" se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, incluida la de un anticuerpo, Fv, scFv, dsFv, Fab u otro fragmento de anticuerpo como se describe en la presente descripción. Los ejemplos ilustrativos de las regiones variables de la cadena ligera que son adecuadas para construir los CAR anti-STn contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de regiones variables de la cadena ligera establecidas en las SEQ ID NO: 7, 15 y 23.
Las referencias a "Vh" o "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye la de un anticuerpo, Fv, scFv, dsFv, Fab u otro fragmento de anticuerpo como se describe en la presente descripción. Los ejemplos ilustrativos de las regiones variables de la cadena pesada que son adecuadas para construir los CAR anti-STn contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de regiones variables de la cadena pesada establecidas en las SEQ ID NO: 8, 16 y 24.
Un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B o por una célula en la que se han transfectado los genes de la cadena ligera y pesada de un solo anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales se producen mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, al hacer las células formadoras de anticuerpos híbridos a partir de una fusión de células de mieloma con células inmunitarias del bazo. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanizados.
Un "anticuerpo quimérico" tiene los residuos marco de una especie, tal como el humano, y las CDR (que generalmente confieren unión al antígeno) de otra especie, tal como el ratón. En aspectos particularmente preferidos, un CAR comprende un dominio de unión específico al antígeno que es un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión al antígeno de este.
En aspectos preferidos, el anticuerpo es un anticuerpo humano (tal como un anticuerpo monoclonal humano) o un fragmento de este que se une específicamente a una glucoproteína que expresa STn humano. Los anticuerpos humanos pueden construirse mediante la combinación de la(s) secuencia(s) del dominio variable del clon Fv que se selecciona(n) de colecciones de expresión en fagos derivadas de humanos con secuencia(s) del dominio constante humano conocido como se describió anteriormente. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse mediante el método de hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos, por ejemplo, mediante Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner y otros, J. Immunol., 147: 86 (1991). Además, pueden usarse animales transgénicos (por ejemplo, ratones) para producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Consulte, por ejemplo, Jakobovits y otros, PNAS de Estados Unidos, 90: 2551 (1993); Jakobovits y otros, Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann y otros, Year in Immunol., 7: 33 (1993). La transposición de genes también puede usarse para obtener anticuerpos humanos a partir de anticuerpos no humanos, por ejemplo, de roedores, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares a las del anticuerpo no humano de partida. (Consulte el documento núm. PCT WO 93/06213, publicado el 1 de abril de 1993). A diferencia de la humanización tradicional de los anticuerpos no humanos mediante el injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos de FR o CDR de origen no humano.
En un aspecto, un CAR comprende un anticuerpo "humanizado". Un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina que incluye una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, de ratón, de rata o sintética). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptor". En un aspecto, todas las CDR son de la inmunoglobulina del donante en una inmunoglobulina humanizada. No es necesario que estén presentes regiones constantes, pero si lo están, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente 85-90 %, tal como aproximadamente 95 % o más idénticas. Por tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de las secuencias de inmunoglobulina humana natural. Los anticuerpos humanizados u otros anticuerpos monoclonales pueden tener sustituciones de aminoácidos conservadoras adicionales, que sustancialmente no tienen efecto sobre la unión al antígeno u otras funciones de inmunoglobulina. Los anticuerpos humanizados pueden construirse mediante diseño genético (consulte, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,585,089).
En aspectos particulares, un anticuerpo anti-STn o un fragmento de unión al antígeno de este incluye, pero no se limita a, una Ig de camello (un anticuerpo de camélido (VHH)), IgNAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, anticuerpo Fv de cadena simple ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, proteína Fv estabilizada con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de dominio único (sdAb, nanocuerpo).
"Ig de camello" o "VHH de camélido", como se usa en la presente descripción, se refiere a la unidad de unión al antígeno más pequeña conocida de un anticuerpo de cadena pesada (Koch-Nolte y otros, FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)). Un "anticuerpo de cadena pesada" o un "anticuerpo de camélido" se refieren a un anticuerpo que contiene dos dominios VH y ninguna cadena ligera (Riechmann L. y otros, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999); documentos núms. WO94/04678; WO94/25591; patente de Estados Unidos núm. 6,005,079).
"IgNAR" de " nuevo receptor de antígeno de inmunoglobulina" se refiere a la clase de anticuerpos del repertorio inmunitario de tiburón que consiste en homodímeros de un dominio de nuevo receptor de antígeno variable (VNAR) y cinco dominios de nuevos receptores de antígeno constantes (CNAR). Los IgNAR representan algunos de los andamios de proteínas basados en inmunoglobulinas más pequeños conocidos y son muy estables y poseen características de unión eficaces. La estabilidad inherente puede atribuirse tanto a (i) el armazón de Ig subyacente, que presenta un número considerable de residuos expuestos en la superficie hidrófilos y cargados en comparación con los dominios VH y VL de anticuerpos convencionales que se encuentran en los anticuerpos murinos; y (ii) los rasgos estructurales estabilizadores en los bucles de la región determinante de la complementariedad (CDR), que incluyen los puentes disulfuro entre bucles y patrones de enlaces de hidrógeno dentro del bucle.
La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de unión al antígeno único, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y todavía es capaz de entrecruzar el antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión al antígeno completo. En un aspecto, una especie de Fv de dos cadenas consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera en una estrecha asociación no covalente. En una especie de Fv de cadena simple (scFv), un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera pueden unirse covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada puedan asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables (HVR) de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis HVR le confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVR específicos para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab contiene los dominios variables de la cadena ligera y pesada y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente descripción para Fab' en la que el o los residuos de cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tenían cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y generar dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más detalladamente en, por ejemplo, los documentos núms. EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson y otros, Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger y otros, PNAS de Estados Unidos 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y los tetracuerpos también se describen en Hudson y otros, Nat. Med.
9:129-134 (2003).
"Anticuerpo de dominio único" o "sdAb" o "nanocuerpo" se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en la región variable de una cadena pesada de anticuerpo (dominio VH) o la región variable de una cadena ligera de anticuerpo (dominio VL) (Holt, L., y otros, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena simple" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica simple y en cualquier orientación (por ejemplo, VL-VH o VH-VL). Generalmente, el polipéptido scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, consulte, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), págs. 269-315.
En aspectos preferidos, un CAR comprende un dominio de unión específico al antígeno que es un scFv y puede ser un scFv murino, humano o humanizado. Los anticuerpos de cadena simple pueden clonarse a partir de los genes de la región V de un hibridoma específico para una diana deseada. La producción de tales hibridomas se ha convertido en rutina. Se ha descrito una técnica que puede usarse para clonar la cadena pesada de la región variable (Vh) y la cadena ligera de la región variable (Vl), por ejemplo, en Orlandi y otros, PNAS, 1989; 86: 3833-3837.
En aspectos particulares, el dominio de unión específico al antígeno que es un scFv que se une a una glucoproteína humana que expresa STn.
Los ejemplos ilustrativos de las cadenas ligeras variables que son adecuadas para construir los CAR anti-STn contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 7, 15 y 23.
Los ejemplos ilustrativos de las cadenas pesadas variables que son adecuadas para construir los CAR anti-STn contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 8, 16 y 24.
Un dominio de unión específico a STn ilustrativo es una región variable de inmunoglobulina específica para STn que comprende al menos una región marco humana. Una "región marco humana" se refiere a una región marco de tipo salvaje (es decir, de origen natural) de una región variable de inmunoglobulina humana, una región marco alterada de una región variable de inmunoglobulina humana con menos del 50 % (por ejemplo, preferentemente menos del 45 %, 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o 1 %) de los aminoácidos en la región se eliminan o se sustituyen (por ejemplo, con uno o más residuos de aminoácidos de un región marco de inmunoglobulina no humana en las posiciones correspondientes), o una región marco alterada de una región variable de inmunoglobulina no humana con menos del 50 % (por ejemplo, menos del 45 %, 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 %) de los aminoácidos en la región eliminada o sustituida (por ejemplo, en las posiciones de los residuos expuestos y/o con uno o más residuos de aminoácidos de una región marco de inmunoglobulina humana en las posiciones correspondientes) de modo que, en un aspecto, la inmunogenicidad se reduce.
En determinados aspectos, una región marco humana es una región marco de tipo salvaje de una región variable de inmunoglobulina humana. En determinados otros aspectos, una región marco humana es una región marco alterada de una región variable de inmunoglobulina humana con eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más posiciones. En otros aspectos, una región marco humana es una región marco alterada de una región variable de inmunoglobulina no humana con eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más posiciones.
En aspectos particulares, un dominio de unión específico a STn comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho regiones marco humanas (FR) que se seleccionan de FR1 de la cadena ligera humana, FR1 de la cadena pesada humana, FR2 de la cadena ligera humana, FR2 de la cadena pesada humana, FR3 de la cadena ligera humana, FR3 de la cadena pesada humana, FR4 de la cadena ligera humana y FR4 de la cadena pesada humana.
Las FR humanas que pueden estar presentes en los dominios de unión específicos a STn también incluyen variantes de las FR ilustrativas proporcionadas en la presente descripción en los que uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos de las FR ilustrativas se han sustituido o eliminado.
En determinados aspectos, un dominio de unión específico a STn comprende (a) una región variable de la cadena ligera humanizada que comprende una FR1 de la cadena ligera humana, una FR2 de la cadena ligera humana, una FR3 de la cadena ligera humana y una FR4 de la cadena ligera humana, y (b) una región variable de la cadena pesada humanizada que comprende una FR1 de la cadena pesada humana, una FR2 de la cadena pesada humana, una FR3 de la cadena pesada humana y una FR4 de la cadena pesada humana.
Los dominios de unión específicos a STn proporcionados en la presente descripción también comprenden una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR. Dichas CDR pueden ser CDR no humanas o CDR no humanas alteradas que se seleccionan de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de la cadena ligera y CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de la cadena pesada. En determinados aspectos, un dominio de unión específico a STn comprende (a) una región variable de la cadena ligera que comprende una CDRL1 de la cadena ligera, una CDRL2 de la cadena ligera y una CDRL3 de la cadena ligera, y (b) una región variable de la cadena pesada que comprende una CDRH1 de la cadena pesada, una CDRH2 de la cadena pesada y una CDRH3 de la cadena pesada.
En un aspecto, un dominio de unión específico a STn comprende secuencias de CDR de la cadena ligera establecidas en las SEQ ID NO: 1-3, 9-11 o 17-19. En un aspecto particular, un dominio de unión específico a STn comprende secuencias de CDR de la cadena ligera con al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de aminoácidos con las secuencias de CDR de la cadena ligera establecidas en las SEQ ID NO: 1-3, 9-11 o 17-19.
En un aspecto, un dominio de unión específico a STn comprende secuencias de CDR de la cadena pesada establecidas en las SEQ ID NO: 4-6, 12-14 o 20-22. En un aspecto particular, un dominio de unión específico a STn comprende secuencias de CDR de la cadena pesada con al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de aminoácidos con las secuencias de CDR de la cadena pesada establecidas en las SEQ ID NO: 4-6, 12-14 o 20-22.
Las referencias a "Vl " o "VL" se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, que incluyen la de un anticuerpo, Fv, scFv, dsFv, Fab u otro fragmento de anticuerpo como se describe en la presente descripción. Los ejemplos ilustrativos de las regiones variables de la cadena ligera que son adecuadas para construir los CAR anti-STn contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de regiones variables de la cadena ligera establecidas en las SEQ ID NO: 7, 15 o 23.
Las referencias a "Vh" o "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye la de un anticuerpo, Fv, scFv, dsFv, Fab u otro fragmento de anticuerpo como se describe en la presente descripción. Los ejemplos ilustrativos de las regiones variables de la cadena pesada que son adecuadas para construir los CAR anti-STn contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de regiones variables de la cadena pesada establecidas en las SEQ ID NO: 8, 16 o 24.
2. Enlazadores
En determinados aspectos, los CAR comprenden residuos enlazadores entre los diversos dominios, por ejemplo, entre los dominios Vh y Vl, añadidos para el espaciado y la conformación apropiados de la molécula. En aspectos particulares, el enlazador es una secuencia de enlace de región variable. Una "secuencia de enlace de región variable" es una secuencia de aminoácidos que conecta los dominios Vh y Vl y proporciona una función espaciadora compatible con la interacción de los dos subdominios de unión para que el polipéptido resultante conserve una afinidad de unión específica con la misma molécula diana como un anticuerpo que comprende las mismas regiones variables de la cadena ligera y pesada. En aspectos particulares, un enlazador separa uno o más dominios variables de la cadena ligera o pesada, dominios bisagra, dominios transmembrana, dominios coestimuladores y/o dominios de señalización primaria. Los CAR comprenden uno, dos, tres, cuatro o cinco o más enlazadores. En aspectos particulares, la longitud de un enlazador es de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 aminoácidos, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos, o cualquier longitud intermedia de aminoácidos. En algunos aspectos, el enlazador es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 o más aminoácidos de longitud.
Los ejemplos ilustrativos de los enlazadores incluyen polímeros de glicina (G)n; polímeros de glicina-serina (G1-5S1-5)n, donde n es un número entero de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco; polímeros de glicina alanina; polímeros de alanina-serina; y otros enlazadores flexibles conocidos en la técnica. Los polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como una cadena neutral entre dominios de proteínas de fusión como los CAR descritos en la presente descripción. La glicina accede significativamente a más espacio phi-psi que incluso la alanina, y está mucho menos restringida que los residuos con cadenas laterales más largas (consulte Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). El experto en la técnica reconocerá que el diseño de un CAR en aspectos particulares puede incluir enlazadores que son total o parcialmente flexibles, de modo que el enlazador puede incluir un enlazador flexible, así como también una o más partes que confieren una estructura menos flexible para proporcionar una estructura de CAR deseada.
Otros enlazadores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, las siguientes secuencias de aminoácidos: GGG; DGGGS (SEQ ID NO: 28); TGEKP (SEQ ID NO: 29) (consulte, por ejemplo, Liu y otros, PNAS 5525-5530 (1997)); GGRR (SEQ ID NO: 30) (Pomerantz y otros 1995, arriba); (GGGGS)n en donde = 1, 2, 3, 4 o 5 (SEQ ID NO: 31) (Kim y otros, PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: 32) (Chaudhary y otros, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. de Estados Unidos 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 33) (Bird y otros, 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (SEQ ID NO: 34); LRQRDGERP (SEQ ID NO: 35); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: 36); LRQKD(GGGS)2 ERP (SeQ ID NO: 37). Alternativamente, los enlazadores flexibles pueden diseñarse racionalmente mediante el uso de un programa informático capaz de modelar tanto los sitios de unión al ADN como los péptidos mismos (Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994) o por métodos de presentación de fagos. En un aspecto, el enlazador comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 38) (Cooper y otros, Blood, 101(4): 1637-1644 (2003)).
3. Dominio espaciador
En aspectos particulares, el dominio de unión del CAR va seguido de uno o más "dominios espaciadores", que se refiere a la región que mueve el dominio de unión al antígeno de la superficie de la célula efectora para permitir el contacto célula/célula, la unión al antígeno y la activación adecuados (Patel y otros, Gene Therapy, 1999; 6: 412­ 419). El dominio espaciador puede derivar de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. En determinados aspectos, un dominio espaciador es una parte de una inmunoglobulina que incluye, pero no se limita a, una o más regiones constantes de la cadena pesada, por ejemplo, CH2 y CH3. El dominio espaciador puede incluir la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de inmunoglobulina de origen natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada.
En un aspecto, el dominio espaciador comprende los dominios CH2 y CH3 de IgG1, IgG4 o IgD.
4. Dominio bisagra
El dominio de unión de CAR generalmente va seguido de uno o más "dominios bisagra", que desempeñan un papel en el posicionamiento del dominio de unión al antígeno lejos de la superficie de la célula efectora para permitir el contacto célula/célula, la unión al antígeno y la activación adecuados. Un CAR generalmente comprende uno o más dominios bisagra entre el dominio de unión y el dominio transmembrana (TM). El dominio bisagra puede derivar de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. El dominio bisagra puede incluir la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de inmunoglobulina de origen natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada.
Una "región bisagra alterada" se refiere a (a) una región bisagra de origen natural con hasta un 30 % de cambios de aminoácidos (por ejemplo, hasta un 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de sustituciones o eliminaciones de aminoácidos), (b) una parte de una región bisagra de origen natural que tiene al menos 10 aminoácidos (por ejemplo, al menos 12, 13, 14 o 15 aminoácidos) de longitud con hasta un 30 % de cambios de aminoácidos (por ejemplo, hasta 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de sustituciones o eliminaciones de aminoácidos), o (c) una parte de una región bisagra de origen natural que comprende la región bisagra central (que puede ser 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos de longitud). En determinados aspectos, uno o más residuos de cisteína en una región bisagra de inmunoglobulina de origen natural pueden sustituirse por uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, uno o más residuos de serina). Una región bisagra de inmunoglobulina alterada puede tener alternativa o adicionalmente un resto de prolina de una región bisagra de inmunoglobulina de tipo salvaje sustituido por otro residuo de aminoácido (por ejemplo, un resto de serina).
Los dominios bisagra ilustrativos adecuados para su uso en los CAR descritos en la presente descripción incluyen la región bisagra derivada de las regiones extracelulares de proteínas de membrana tipo 1 tales como CD8a y CD4, que pueden ser regiones bisagra de tipo salvaje de estas moléculas o pueden estar alteradas. En otro aspecto, el dominio bisagra comprende una región bisagra CD8a.
En un aspecto, la bisagra es una bisagra PD-1 o una bisagra CD152.
5. Dominio transmembrana (TM)
El "dominio transmembrana" es la parte del CAR que fusiona la parte de unión extracelular y el dominio de señalización intracelular y ancla el cAr a la membrana plasmática de la célula efectora inmunitaria. El dominio TM puede derivar de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. El dominio TM puede derivar de, es decir, comprender al menos la(s) región(es) transmembrana(s) de la cadena alfa o beta del receptor de linfocitos T, CD6, CD3£, CDy, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154 y PD1. En un aspecto particular, el dominio TM es sintético y comprende predominantemente residuos hidrófobos tales como leucina y valina.
En un aspecto, los CAR comprenden un dominio TM derivado de PD1, CD152 o CD8a. En otro aspecto, un CAR comprende un dominio TM derivado de PD1, CD152 o CD8a y un enlazador oligopeptídico o polipeptídico corto, preferentemente entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud que une el dominio Tm y el dominio de señalización intracelular del CAR. Un enlazador basado en glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado.
6. Dominio de señalización intracelular
En aspectos particulares, los CAR comprenden un dominio de señalización intracelular. Un "dominio de señalización intracelular" se refiere a la parte de un CAR que participa en la transducción del mensaje de unión eficaz de CAR anti-STn a un polipéptido tAG-72 humano en el interior de la célula efectora inmunitaria para provocar la función de la célula efectora, por ejemplo, la activación, la producción de citocinas, la proliferación y la actividad citotóxica, que incluyen la liberación de factores citotóxicos a la célula diana unida a CAR, u otras respuestas celulares provocadas con la unión al antígeno al dominio de CAR extracelular.
El término "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula efectora inmunitaria. La función efectora del linfocito T, por ejemplo, puede ser actividad o ayuda citolítica o actividad que incluye la secreción de una citocina. Por lo tanto, el término "dominio de señalización intracelular" se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal de la función efectora y que dirige a la célula para que realice una función especializada. Aunque normalmente puede emplearse todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario usar todo el dominio. En la medida en que se use una parte truncada de un dominio de señalización intracelular, dicha parte truncada puede usarse en lugar del dominio completo siempre que transduzca la señal de la función efectora. El término dominio de señalización intracelular pretende incluir cualquier parte truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de la función efectora.
Se sabe que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para la activación completa del linfocito T y que también se requiere una señal secundaria o coestimuladora. Por lo tanto, puede decirse que la activación de los linfocitos T está mediada por dos clases distintas de dominios de señalización intracelular: dominios de señalización primaria que inician la activación primaria dependiente del antígeno a través del TCR (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) y dominios de señalización coestimuladores que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. En aspectos preferidos, un CAR comprende un dominio de señalización intracelular que comprende uno o más "dominios de señalización coestimuladores" y un "dominio de señalización primaria".
Los dominios de señalización primaria regulan la activación primaria del complejo TCR ya sea de forma estimuladora o inhibidora. Los dominios de señalización primaria que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación inmunorreceptores basados en tirosina o ITAM.
Los ejemplos ilustrativos de los dominios de señalización primaria que contienen ITAM que son adecuados para su uso en aspectos particulares incluyen los derivados de FcRy, FcRp, CD3y, CD35, c D3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En aspectos preferidos en particular, un CAR comprende un dominio de señalización primaria de CD3Z y uno o más dominios de señalización coestimuladores. Los dominios de señalización coestimuladores y señalización primaria intracelular pueden unirse en cualquier orden en tándem al extremo carboxilo del dominio transmembrana.
En aspectos particulares, los CAR comprenden uno o más dominios de señalización coestimuladores para mejorar la eficacia y la expansión de los linfocitos T que expresan los receptores CAR. Como se usa en la presente descripción, el término "dominio de señalización coestimulador" o "dominio coestimulador" se refiere a un dominio de señalización intracelular de una molécula coestimuladora. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígeno o los receptores Fc que proporcionan una segunda señal requerida para la activación y la función eficaces de los linfocitos T al unirse al antígeno. Los ejemplos ilustrativos de dichas moléculas coestimuladoras incluyen TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TlR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70. En un aspecto, un CAR comprende uno o más dominios de señalización coestimuladores que se seleccionan del grupo que consiste en CD28, CD137 y CD134, y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En otro aspecto, un CAR comprende dominios de señalización coestimuladores de CD28 y CD137 y un dominio de señalización primaria de CD3Z
En otro aspecto más, un CAR comprende dominios de señalización coestimuladores de CD28 y CD134 y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En un aspecto, un CAR comprende dominios de señalización coestimuladores de CD137 y CD134 y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En un aspecto, un CAR comprende un dominio de señalización coestimulador de CD137 y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En un aspecto, un CAR comprende un dominio de señalización coestimulador de CD134 y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En un aspecto, un CAR comprende un dominio de señalización coestimulador de CD28 y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En aspectos particulares, los CAR comprenden un anticuerpo anti-STn o un fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente a una glucoproteína que expresa STn en una célula cancerosa.
En un aspecto, un CAR comprende un scFv anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en: cadena alfa o beta del receptor de linfocitos T, CD5, CD3e, CDy, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD154 y PD1; y uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelular de una molécula coestimuladora que se selecciona del grupo que consiste en: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70; y un dominio de señalización primaria de FcRy, FcRp, CD3y, CD38, Cd3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En un aspecto, un CAR comprende un scFv anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio bisagra que se selecciona del grupo que consiste en: bisagra de IgG1/CH2/CH3, bisagra de IgG4/CH2/CH3, una bisagra de PD1, una bisagra de CD152 y una bisagra de CD8a; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en: cadena alfa o beta del receptor de linfocitos T, CDS, CD3e, CDy, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, c D152, CD154 y PD1; y uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelular de una molécula coestimuladora que se selecciona del grupo que consiste en: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70; y un dominio de señalización primaria de FcRy, FcRp, CD3y, CD38, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.
En un aspecto, un CAR comprende un scFv anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio bisagra que se selecciona del grupo que consiste en: bisagra de IgG1/CH2/CH3, bisagra de IgG4/CH2/CH3, una bisagra de PD1, una bisagra de CD152 y una bisagra de CD8a; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste en: cadena alfa o beta del receptor de linfocitos T, CDS, CD3e, CDy, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, c D152, CD154 y PD1; un enlazador oligopeptídico o polipeptídico corto, preferentemente entre 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud que une el dominio TM al dominio de señalización intracelular del CAR; y uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelular de una molécula coestimuladora que se selecciona del grupo que consiste en: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70; y un dominio de señalización primaria de FcRy, FcRp, CD3y, CD38, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.
En un aspecto particular, un CAR comprende un scFv anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio bisagra que comprende un polipéptido bisagra de IgG1/CH2/CH3 y un polipéptido de CD8a; un dominio transmembrana de CD8a que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD137; y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En un aspecto particular, un CAR comprende un scFv anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio bisagra que comprende un polipéptido de CD8a; un dominio transmembrana de CD8a que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD134; y un dominio de señalización primaria de CD3Z
En un aspecto particular, un CAR comprende un scFv anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio bisagra que comprende un polipéptido de CD8a; un dominio transmembrana de CD8a que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular de c D28; y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En un aspecto particular, un CAR comprende un scFv anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio bisagra que comprende un polipéptido bisagra de PD1; un dominio transmembrana de PD1 o CD152 que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD137; y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En un aspecto particular, un CAR comprende un scFv anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio bisagra que comprende un polipéptido bisagra de PD1; un dominio transmembrana de PD1 o CD152 que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD134; y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En un aspecto particular, un CAR comprende un scFv anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio bisagra que comprende un polipéptido bisagra de PD1; un dominio transmembrana de PD1 o CD152 que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular de c D28; y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En un aspecto particular, un CAR comprende un scFv anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio bisagra que comprende un polipéptido bisagra de CD152; un dominio transmembrana de PD1 o CD152 que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD137; y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En un aspecto particular, un CAR comprende un scFv anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio bisagra que comprende un polipéptido bisagra de CD152; un dominio transmembrana de PD1 o CD152 que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD134; y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
En un aspecto particular, un CAR comprende un scFv anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio bisagra que comprende un polipéptido bisagra de CD152; un dominio transmembrana de PD1 o CD152 que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD28; y un dominio de señalización primaria de CD3Z.
Además, el diseño de los CAR contemplados en la presente descripción permite mejorar la expansión, la persistencia a largo plazo y las propiedades citotóxicas en los linfocitos T que expresan los cAr en comparación con los linfocitos T no modificados o los linfocitos T modificados para expresar otros CAR.
D. Polipéptidos
En la presente descripción se contemplan diversos polipéptidos, que incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos CAR y fragmentos de estos, células y composiciones que comprenden los mismos y vectores que expresan polipéptidos. En aspectos preferidos, se proporciona un polipéptido que comprende uno o más CAR. En aspectos particulares, el CAR es un CAR anti-STn que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 25-27.
"Polipéptido", "fragmento de polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente, a menos que se especifique lo contrario, y de acuerdo con el significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos pueden sintetizarse o producirse de forma recombinante. Los polipéptidos no se limitan a una longitud específica, por ejemplo, pueden comprender una secuencia de proteína de longitud completa o un fragmento de una proteína de longitud completa, y pueden incluir modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como también otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como no natural. En varios aspectos, los polipéptidos CAR comprenden una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, que dirige la transferencia de la proteína cotraduccional o postraduccionalmente. Los ejemplos ilustrativos de las secuencias señal adecuadas útiles en los CAR contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, el polipéptido señal de la cadena pesada de IgG1, un polipéptido señal de CD8a o un polipéptido señal del receptor alfa de GM-CSF humano. Los polipéptidos pueden prepararse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas recombinantes y/o sintéticas bien conocidas. Los polipéptidos contemplados en la presente descripción abarcan específicamente los CAR de la presente descripción, o las secuencias que tienen eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de un CAR como se contempla en la presente descripción.
Un "péptido aislado" o un "polipéptido aislado" y similares, como se usa en la presente descripción, se refieren al aislamiento y/o purificación in vitro de un péptido o molécula de polipéptido de un entorno celular, y de la asociación con otros componentes de la célula, es decir, no se asocia significativamente con sustancias in vivo. De manera similar, una "célula aislada" se refiere a una célula que se ha obtenido de un tejido u órgano in vivo y está sustancialmente libre de matriz extracelular.
Los polipéptidos incluyen "variantes de polipéptidos". Las variantes de polipéptidos pueden diferir de un polipéptido de origen natural en una o más sustituciones, eliminaciones, adiciones y/o inserciones. Dichas variantes pueden ocurrir de origen natural o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, mediante la modificación de una o más de las secuencias de polipéptidos anteriores. Por ejemplo, en aspectos particulares, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de los CAR mediante la introducción de una o más sustituciones, eliminaciones, adiciones y/o inserciones en un dominio de unión, bisagra, dominio TM, dominio de señalización coestimulador o dominio de señalización primaria de un polipéptido CAR. En aspectos particulares, los polipéptidos incluyen polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de aminoácidos con cualquiera de las secuencias de referencia contempladas en la presente descripción, típicamente donde la variante mantiene al menos una actividad biológica de la secuencia de referencia.
Los polipéptidos incluyen "fragmentos de polipéptido". Los fragmentos de polipéptidos se refieren a un polipéptido, que puede ser monomérico o multimérico que tiene una eliminación en el extremo amino, una eliminación en el extremo carboxilo y/o una eliminación o sustitución interna de un polipéptido de origen natural o producido de forma recombinante. En determinados aspectos, un fragmento de polipéptido puede comprender una cadena de aminoácidos de al menos 5 a aproximadamente 500 aminoácidos de longitud. Se apreciará que en determinados aspectos, los fragmentos son al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoácidos de longitud. Los fragmentos de polipéptido particularmente útiles incluyen dominios funcionales, que incluyen dominios de unión al antígeno o fragmentos de anticuerpos. En el caso de un anticuerpo anti-STn, los fragmentos útiles incluyen, pero no se limitan a: una región CDR, una región CDR3 de la cadena pesada o ligera; una región variable de una cadena pesada o ligera; una parte de una cadena de anticuerpo o región variable que incluye dos CDR; y similares.
El polipéptido también puede fusionarse en marco o conjugarse con un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, la purificación o la identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His) o para mejorar la unión del polipéptido a un soporte sólido.
Como se indicó anteriormente, los polipéptidos pueden alterarse de diversas maneras, que incluyen sustituciones, eliminaciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para dichas manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para la mutagénesis y las alteraciones de la secuencia de nucleótidos se conocen bien en la técnica. Consulte, por ejemplo, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos. 82: 488-492), Kunkel y otros, (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), patente de Estados Unidos núm. 4,873,192, Watson, J. D. y otros, (Molecular Biology of the Gene, cuarta edición, Benjamin/Cummings, Menlo Park, California, 1987) y las referencias allí citadas. Puede encontrarse una orientación sobre la sustitución de aminoácidos adecuada que no afecta la actividad biológica de la proteína de interés en el modelo de Dayhoff y otros, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).
En determinados aspectos, una variante de polipéptido comprende una o más sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de modo que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente sin cambios. Pueden realizarse modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y los polipéptidos contemplados en aspectos particulares y aun así obtener una molécula funcional que codifique una variante o polipéptido derivado con características convenientes. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para generar un polipéptido variante equivalente, o incluso mejorado, un experto en la técnica, por ejemplo, puede cambiar uno o más de los codones de la secuencia de ADN codificante, por ejemplo, de acuerdo con la Tabla 1.
TABLA 1- Codones de aminoácidos
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Puede encontrarse una orientación para determinar qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o eliminarse sin suprimir la actividad biológica mediante el uso de programas informáticos bien conocidos en la técnica, tales como el programa DNASTAR, DNA Strider, Geneious, Mac Vector o Vector NTI. Preferentemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteínas descritas en la presente descripción son cambios de aminoácidos conservadores, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o sin carga de manera similar. Un cambio conservador de aminoácido implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural generalmente se dividen en cuatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares sin carga (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En un péptido o una proteína, los expertos en esta técnica conocen las sustituciones conservadoras adecuadas de aminoácidos y, en general, pueden realizarse sin alterar la actividad biológica de una molécula resultante. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de un solo aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (consulte, por ejemplo, Watson y otros, Molecular Biology of the Gene, 4ta edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224).
Al realizar dichos cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína generalmente se entiende en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de su hidrofobicidad y características de carga (Kyte y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (­ 0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se conoce en la técnica que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tengan una puntuación o índice hidropático similar y todavía dar como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, aún obtener una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al realizar dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2, se prefieren particularmente aquellos dentro de ±1, y se prefieren incluso más particularmente aquellos dentro de ±0,5. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse de forma eficaz sobre la base de la hidrofilicidad. Como se detalla en la patente de Estados Unidos núm. 4,554,101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y todavía obtener una proteína biológicamente equivalente y, en particular, inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, se prefieren particularmente aquellos dentro de ±1, y se prefieren incluso más particularmente aquellos dentro de ±0,5.
Como se ha esbozado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos pueden basarse en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares.
Las variantes de polipéptidos incluyen además formas glucosiladas, conjugados agregativos con otras moléculas y conjugados covalentes con restos químicos sin relacionar (por ejemplo, moléculas pegiladas). Las variantes covalentes pueden prepararse mediante la unión de funcionalidades a grupos que se encuentran en la cadena de aminoácidos o en el residuo del extremo N o C, como se conoce en la técnica. Las variantes también incluyen variantes alélicas, variantes de especies y muteínas. Los truncamientos o las eliminaciones de regiones que no afectan la actividad funcional de las proteínas también son variantes.
En un aspecto, cuando se desea la expresión de dos o más polipéptidos, las secuencias de polinucleótidos que los codifican pueden separarse mediante una secuencia IRES como se analiza en otra parte en la presente descripción. En otro aspecto, pueden expresarse dos o más polipéptidos como una proteína de fusión que comprende una o más secuencias de polipéptidos de autoescisión.
Los polipéptidos contemplados en aspectos particulares incluyen polipéptidos de fusión. En aspectos preferidos, se proporcionan polipéptidos de fusión y polinucleótidos que codifican polipéptidos de fusión, por ejemplo, los CAR. Los polipéptidos de fusión y las proteínas de fusión se refieren a un polipéptido que tiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez o más segmentos de polipéptidos. Los polipéptidos de fusión normalmente están unidos del extremo C al extremo N, aunque también pueden estar unidos del extremo C al extremo C, del extremo N al extremo N o del extremo N al extremo C. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden o en un orden específico. Los polipéptidos de fusión o las proteínas de fusión también pueden incluir variantes modificadas de forma conservadora, variantes polimórficas, alelos, mutantes, subsecuencias y homólogos entre especies, siempre que se conserve la actividad transcripcional deseada del polipéptido de fusión. Los polipéptidos de fusión pueden producirse mediante métodos de síntesis química o mediante enlace químico entre los dos restos o, en general, pueden prepararse mediante el uso de otras técnicas estándar. Las secuencias de ADN unidas que comprenden el polipéptido de fusión se unen operativamente a elementos de control de la transcripción o de la traducción adecuados, como se analiza en otra parte en la presente descripción.
En un aspecto, una pareja de fusión comprende una secuencia que ayuda a expresar la proteína (un potenciador de la expresión) con mayores rendimientos que la proteína recombinante natural. Pueden seleccionarse otras parejas de fusión para aumentar la solubilidad de la proteína o para permitir que la proteína se dirija a los compartimentos intracelulares deseados o para facilitar el transporte de la proteína de fusión a través de la membrana celular.
Los polipéptidos de fusión pueden comprender además una señal de escisión de polipéptidos entre cada uno de los dominios de polipéptidos descritos en la presente descripción. Además, puede ponerse un sitio de escisión de polipéptidos en cualquier secuencia del péptido enlazador. Las señales de escisión de polipéptidos ilustrativas incluyen sitios de reconocimiento de escisión de polipéptidos tales como sitios de escisión de proteasas, sitios de escisión de nucleasas (por ejemplo, sitios de reconocimiento de enzimas de restricción raras, sitios de reconocimiento de ribozimas de autoescisión) y oligopéptidos virales de autoescisión (consulte deFelipe y Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26).
El experto en la técnica conoce los sitios de escisión de proteasas y los péptidos de autoescisión adecuados (consulte, por ejemplo, en Ryan y otros, 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak y otros (2004) Nature Biotech.
5, 589-594). Los sitios de escisión de proteasas ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, los sitios de escisión de proteasas NIa de potyvirus (por ejemplo, proteasa del virus del grabado del tabaco), proteasas HC de potyvirus, proteasas PI (P35) de potyvirus, proteasas NIa de biovirus, proteasas codificadas con a RN-2 de byovirus, proteasas L de aftovirus, proteasas 2A de enterovirus, s proteasas 2A de rhinovirus, proteasas 3C de picorna, proteasas 24K de comovirus, proteasas 24K de nepovirus, proteasa similar a 3C de RTSV (virus esférico del tungro del arroz), proteasa similar a 3C de PYVF (virus de la mancha amarilla de la pastinaca), heparina, trombina, factor Xa y enterocinasa. Debido a su alta rigurosidad de escisión, los sitios de escisión de la proteasa de TEV (virus del grabado del tabaco) se prefieren en un aspecto, por ejemplo, EXXYXQ(G/S) (SEQ ID NO: 39), por ejemplo, ENLYFQG (SEQ ID NO: 40) y ENLYFQS (SeQ ID nO: 41), en donde X representa cualquier aminoácido (la escisión por TEV se produce entre Q y G o Q y S).
En un aspecto particular, los péptidos de autoescisión incluyen aquellas secuencias de polipéptidos obtenidas a partir de péptidos 2A de potyvirus y cardiovirus, FMDV (virus de la fiebre aftosa), virus de la rinitis equina A, virus de Thesea asigna y teschovirus porcino.
En determinados aspectos, el sitio de polipéptido de autoescisión comprende un sitio, secuencia o dominio 2A o similar a 2A (Donnelly y otros, 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041). Los sitios 2A ilustrativos se muestran en la Tabla 2.
TABLA 2:
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En aspectos preferidos, un polipéptido comprende un polipéptido CAR.
E. Polinudeótidos
En aspectos preferidos, se proporciona un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos CAR. Como se usa en la presente descripción, los términos "polinucleótido" o "ácido nucleico" se refieren a a Rn mensajero (ARNm), ARN, a Rn genómico (ARNg), ARN de cadena positiva (ARN(+)), ARN de cadena negativa (ARN(-)), Ad N genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc) o ADN recombinante. Los polinucleótidos incluyen polinucleótidos de doble y simple cadena. En aspectos particulares, los polinucleótidos incluyen polinucleótidos o variantes que tienen al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de referencia contempladas en la presente descripción. En varios aspectos ilustrativos, los polinucleótidos incluyen vectores de expresión, vectores virales y plásmidos de transferencia, y composiciones y células que comprenden los mismos. En varios aspectos ilustrativos, los polinucleótidos codifican un polipéptido contemplado en la presente descripción, que incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de polipéptidos establecidas en las SEQ ID NO: 1-51.
En aspectos particulares, se proporcionan polinucleótidos que codifican al menos aproximadamente 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 o más residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido, así como también todas las longitudes intermedias. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, tales como 6, 7, 8, 9, etc., 101, 102, 103, etc.; 151, 152, 153, etc.; 201, 202, 203, etc.
Como se usa en la presente descripción, los términos "variante de polinucleótido" y "variante", y similares se refieren a polinucleótidos que muestran una identidad de secuencia sustancial con una secuencia de polinucleótidos de referencia o polinucleótidos que se hibridan con una secuencia de referencia en condiciones estrictas que se definen más adelante. Estos términos incluyen polinucleótidos en los que se han añadido o eliminado uno o más nucleótidos, o se han reemplazado con nucleótidos diferentes en comparación con un polinucleótido de referencia. En este sentido, se entiende bien en la técnica que pueden realizarse determinadas alteraciones que incluyen mutaciones, adiciones, eliminaciones y sustituciones en un polinucleótido de referencia, por lo que el polinucleótido alterado conserva la función o la actividad biológica del polinucleótido de referencia.
Las menciones "identidad de secuencia" o, por ejemplo, que comprende una "secuencia 50 % idéntica a", como se usa en la presente descripción, se refieren a la medida en que las secuencias son idénticas en una base de nucleótido por nucleótido o una base de aminoácido por aminoácido sobre una ventana de comparación. Por lo tanto, puede calcularse un "porcentaje de identidad de secuencia" al comparar dos secuencias alineadas de forma óptima en la ventana de comparación, determinar el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) aparecen en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Se incluyen nucleótidos y polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de referencia descritas en la presente descripción, típicamente donde la variante de polipéptido mantiene al menos una actividad biológica del polipéptido de referencia.
Los términos usados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene una longitud de al menos 12 pero frecuentemente de 15 a 18 y a menudo al menos 25 unidades monoméricas, incluidos los nucleótidos y los residuos de aminoácidos. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solo una parte de la secuencia de polinucleótidos completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente mediante la comparación de secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, normalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más normalmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en el que una secuencia se compara con una secuencia de referencia de este número de posiciones contiguas después que las dos secuencias están óptimamente alineadas. La ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, espacios) de aproximadamente un 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni eliminaciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse mediante implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, Estados Unidos) o mediante inspección y la mejor alineación (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generada por cualquiera de los diversos métodos seleccionados. También puede hacerse referencia a la familia de programas BLAST como, por ejemplo, los descritos por Altschul y otros, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Puede encontrarse una discusión detallada del análisis de secuencias en la Unidad 19.3 de Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15.
Como se usa en la presente descripción, "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido que se ha purificado de las secuencias que lo flanquean en un estado de origen natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha eliminado de las secuencias que normalmente son adyacentes al fragmento. Un "polinucleótido aislado" también se refiere a un ADN complementario (ADNc), un ADN recombinante u otro polinucleótido que no existe en la naturaleza y que se ha fabricado por la mano del hombre.
Los términos que describen la orientación de los polinucleótidos incluyen: 5' (normalmente el extremo del polinucleótido que tiene un grupo fosfato libre) y 3' (normalmente el extremo del polinucleótido que tiene un grupo hidroxilo (OH) libre). Las secuencias de polinucleótidos pueden anotarse en la orientación de 5' a 3' o en la orientación de 3' a 5'. Para el ADN y el ARNm, la cadena de 5' a 3' se denomina cadena "sentido", "posita" o "codificante" porque su secuencia es idéntica a la secuencia del premensajero (preARNm) [excepto para el uracilo (U) en ARN, en lugar de timina (T) en el ADN]. Para el ADN y el ARNm, la cadena complementaria de 3' a 5' que es la cadena transcrita por la ARN polimerasa se designa como cadena "molde", "antisentido", "menos" o "no codificante". Como se usa en la presente descripción, el término "orientación inversa" se refiere a una secuencia de 5' a 3' escrita en la orientación de 3' a 5' o una secuencia de 3' a 5' escrita en la orientación de 5' a 3'.
Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la cadena complementaria de la secuencia de ADN 5' AGTCATG 3' es 3' TCAGTAC 5'. La última secuencia a menudo se escribe como el complemento inverso con el extremo 5' a la izquierda y el extremo 3' a la derecha, 5' CATGACT 3'. Una secuencia que es igual a su complemento inverso se dice que es una secuencia palindrómica. La complementariedad puede ser "parcial", en la que solo algunas de las bases de los ácidos nucleicos se emparejan de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases. O puede haber una complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos.
Además, los expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido, o fragmento de variante de este, como se describe en la presente descripción. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen natural. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente en aspectos particulares, por ejemplo, polinucleótidos que están optimizados para la selección de codones en humanos y/o primates. En aspectos particulares, los polinucleótidos tienen codones optimizados para la expresión y/o la estabilidad. Además, también pueden usarse los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en la presente descripción. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, tales como eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos.
El término "casete de ácido nucleico" como se usa en la presente descripción se refiere a secuencias genéticas dentro de un vector que puede expresar un ARN y, posteriormente, una proteína. El casete de ácido nucleico contiene el gen de interés, por ejemplo, un CAR. El casete de ácido nucleico se orienta posicional y secuencialmente dentro del vector de modo que el ácido nucleico en el casete pueda transcribirse en ARN y, cuando sea necesario, traducirse en una proteína o un polipéptido, sufrir las modificaciones postraduccionales apropiadas requeridas para la actividad en la célula transformada, y translocarse al compartimiento apropiado para la actividad biológica dirigiéndose a los compartimientos intracelulares apropiados o la secreción en los compartimientos extracelulares. Preferentemente, el casete tiene sus extremos 3' y 5' adaptados para una fácil inserción en un vector, por ejemplo, tiene sitios de endonucleasas de restricción en cada extremo. En un aspecto preferido, el casete de ácido nucleico contiene la secuencia de un receptor quimérico de antígeno usado para aumentar la citotoxicidad de las células cancerosas que expresan una glucoproteína unida a STn, por ejemplo, TAG-72. El casete puede retirarse e insertarse en un plásmido o vector viral como una sola unidad.
En aspectos particulares, los polinucleótidos incluyen al menos un polinucleótido de interés. Como se usa en la presente descripción, el término "polinucleótido de interés" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido (es decir, un polipéptido de interés), insertado en un vector de expresión que se desea expresar. Un vector puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 polinucleótidos de interés. En determinados aspectos, el polinucleótido de interés codifica un polipéptido que proporciona un efecto terapéutico en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o un trastorno. Los polinucleótidos de interés y los polipéptidos codificados a partir de ellos incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos de tipo salvaje, así como también variantes funcionales y fragmentos de estos. En aspectos particulares, una variante funcional tiene al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad con una secuencia de polipéptido o polinucleótido de referencia de tipo salvaje correspondiente. En determinados aspectos, una variante o fragmento funcional tiene al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % de una actividad biológica de un polipéptido de tipo salvaje correspondiente.
En un aspecto, el polinucleótido de interés es un molde para transcribir ARNmi, ARNic o ARNhc, ribozima u otro ARN inhibidor. En varios otros aspectos, un polinucleótido comprende un polinucleótido de interés que codifica un CAR y uno o más polinucleótidos de interés adicionales que incluyen, pero no se limitan a, una secuencia de ácido nucleico inhibidor que incluye, sin limitación: un ARNic, un ARNmi, un ARNhc y una ribozima.
Como se usa en la presente descripción, los términos "ARNic" o "ARN de interferencia corto" se refieren a una secuencia de polinucleótidos corta que media un proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia, inhibición traduccional, inhibición transcripcional o ARNi epigenético en animales (Zamore y otros, 2000, Cell, 101, 25-33; Fire y otros, 1998, Nature, 391, 806; Hamilton y otros, 1999, Science, 286, 950-951; Lin y otros, 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13, 139-141; y Strauss, 1999, Science, 286, 886). En determinados aspectos, un ARNic comprende una primera cadena y una segunda cadena que tienen el mismo número de nucleósidos; sin embargo, la primera y la segunda cadena están desplazadas de modo que los dos nucleósidos terminales de la primera y la segunda cadena no se emparejan con un residuo de la cadena complementaria. En determinados casos, los dos nucleósidos que no están emparejados residen en timidina. El ARNic debería incluir una región de suficiente homología con el gen diana, y tener una longitud suficiente en términos de nucleótidos, de modo que el ARNic, o un fragmento de este, puedan mediar en la regulación por disminución del gen diana. Por lo tanto, un ARNic incluye una región que es al menos parcialmente complementaria al ARN diana. No es necesario que haya una complementariedad perfecta entre el ARNic y la diana, pero la correspondencia debe ser suficiente para permitir que el ARNic, o un producto de escisión de este, dirija el silenciamiento específico de la secuencia, tal como mediante la escisión por ARNi del ARN diana. La complementariedad, o grado de homología con la cadena diana, es más crítica en la cadena antisentido. Aunque a menudo se desea una complementariedad perfecta, particularmente en la cadena antisentido, algunos aspectos incluyen uno o más, pero preferentemente 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o menos emparejamiento erróneo con respecto al ARN diana. Los emparejamientos erróneos se toleran más en las regiones terminales y, si están presentes, están preferentemente en una región o regiones terminales, por ejemplo, dentro de 6, 5, 4 o 3 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'. La cadena con sentido solo necesita ser suficientemente complementaria con la cadena antisentido para mantener el carácter global de doble cadena de la molécula.
Además, un ARNic puede modificarse o incluir análogos de nucleósidos. Las regiones de cadena simple de un ARNic pueden modificarse o incluir análogos de nucleósidos, por ejemplo, la región o las regiones no emparejadas de una estructura de horquilla, por ejemplo, una región que une dos regiones complementarias, puede tener modificaciones o análogos de nucleósidos. También es útil la modificación para estabilizar uno o más extremos 3' o 5' de un ARNic, por ejemplo, contra exonucleasas, o para favorecer que el agente ARNic antisentido entre en RISC. Las modificaciones pueden incluir enlazadores amino C3 (o C6, C7, C12), enlazadores tiol, enlazadores carboxilo, espaciadores no nucleotídicos (C3, C6, C9, C12, abásico, trietilenglicol, hexaetilenglicol), biotina especial o reactivos de fluoresceína que vienen como fosforamiditas y que tienen otro grupo hidroxilo protegido por DMT, lo que permite múltiples acoplamientos durante la síntesis de ARN. Cada cadena de un ARNic puede tener una longitud igual o inferior a 30, 25, 24, 23, 22, 21 o 20 nucleótidos. La cadena tiene preferentemente al menos 19 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada cadena puede tener entre 21 y 25 nucleótidos de longitud. Los ARNic preferidos tienen una región dúplex de 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 o 25 pares de nucleótidos, y uno o más salientes de 2-3 nucleótidos, preferentemente uno o dos salientes 3', de 2- 3 nucleótidos.
Como se usa en la presente descripción, los términos "ARNmi" o "ARNmicro" se refieren a pequeños ARN no codificantes de 20-22 nucleótidos, típicamente extraídos de estructuras precursoras de ARN plegadas de ~70 nucleótidos conocidas como preARNmi. Los ARNmi regulan negativamente sus dianas en una de dos formas en dependencia del grado de complementariedad entre el ARNmi y la diana. En primer lugar, los ARNmi que se unen con una complementariedad perfecta o casi perfecta a las secuencias de ARNm que codifican proteínas inducen la vía de interferencia mediada por ARN (ARNi). Los ARNmi que ejercen sus efectos reguladores al unirse a sitios complementarios imperfectos dentro de las regiones sin traducir 3' (UTR) de sus dianas de ARNm, reprimen la expresión del gen diana postranscripcionalmente, aparentemente al nivel de la traducción, a través de un complejo RISC que es similar a, o posiblemente idéntico al que se usa para la vía de ARNi. De acuerdo con el control de la traducción, los ARNmi que usan este mecanismo reducen los niveles de proteína de sus genes diana, pero los niveles de ARNm de estos genes solo se ven mínimamente afectados. Los ARNmi abarcan los ARNmi de origen natural así como también los ARNmi diseñados artificialmente que pueden dirigirse específicamente a cualquier secuencia de ARNm. Por ejemplo, en un aspecto, el experto en la técnica puede diseñar construcciones de ARN de horquilla corta expresadas como transcritos primarios de ARNmi humano (por ejemplo, miR-30 o miR-21). Este diseño añade un sitio de procesamiento de Drosha a la construcción de la horquilla y se ha demostrado que aumenta en gran medida la eficiencia de eliminación (Pusch y otros, 2004). El tallo de la horquilla consta de 22 nt de ARNds (por ejemplo, antisentido tiene una complementariedad perfecta con la diana deseada) y un bucle de 15-19 nt de un miR humano. Añadir el bucle miR y las secuencias flanqueantes de miR30 en uno o ambos lados de la horquilla da como resultado un aumento de más de 10 veces en el procesamiento de Drosha y Dicer de las horquillas expresadas en comparación con los diseños de ARNhc convencionales sin ARNmicro. El aumento del procesamiento de Drosha y Dicer se traduce en una mayor producción de ARNic/ARNmi y una mayor potencia para las horquillas expresadas.
Como se usa en la presente descripción, los términos "ARNhc" o "ARN de horquilla corta" se refieren a una estructura de doble cadena que está formada por una cadena simple de ARN autocomplementario. Se prefieren para la inhibición las construcciones de ARNhc que contienen una secuencia de nucleótidos idéntica a una parte, ya sea de una secuencia codificante o no codificante, del gen diana. También se ha encontrado que las secuencias de ARN con inserciones, eliminaciones y mutaciones de un solo punto en relación con la secuencia diana son eficaces para la inhibición. Se prefiere una identidad de secuencia superior al 90 %, o incluso una identidad de secuencia del 100 %, entre el ARN inhibidor y la parte del gen diana. En determinados aspectos preferidos, la longitud de la parte que forma dúplex de un ARNhc es de al menos 20, 21 o 22 nucleótidos de longitud, por ejemplo, correspondiente en tamaño a los productos de ARN producidos por escisión dependiente de Dicer. En determinados aspectos, la construcción de ARNhc tiene una longitud de al menos 25, 50, 100, 200, 300 o 400 bases. En determinados aspectos, la construcción de ARNhc tiene una longitud de 400-800 bases. Las construcciones de ARNhc son altamente tolerantes a la variación en la secuencia y el tamaño del bucle.
Como se usa en la presente descripción, el término "ribozima" se refiere a una molécula de ARN catalíticamente activa capaz de escindir el ARNm diana en un sitio específico. Se han descrito varios subtipos, por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo y de horquilla. La actividad catalítica y la estabilidad de la ribozima pueden mejorarse mediante la sustitución de los ribonucleótidos por desoxirribonucleótidos en las bases no catalíticas. Mientras que las ribozimas que escinden el ARNm en secuencias de reconocimiento específicas del sitio pueden usarse para destruir ARNm particulares, se prefiere el uso de ribozimas de cabeza de martillo. Las ribozimas de cabeza de martillo escinden los ARNm en ubicaciones dictadas por regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarios con el ARNm diana. El único requisito es que el ARNm diana tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y la producción de ribozimas de cabeza de martillo se conocen bien en la técnica.
Un método preferido de suministro de un polinucleótido de interés que comprende un ARNic, un ARNmi, un ARNhc o una ribozima comprende una o más secuencias reguladoras, tales como, por ejemplo, una pol III constitutiva fuerte, por ejemplo, el promotor de ARNsn U6 humano, el promotor de ARNsn U6 de ratón, el promotor de ARN HI humano y de ratón y el promotor tARNval humano, o un promotor pol II constitutivo fuerte, como se describe en otra parte en la presente descripción.
Los polinucleótidos contemplados en la presente descripción, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de a Dn , tales como promotores y/o potenciadores, regiones sin traducir (UTR), secuencias señal, secuencias de Kozak, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, múltiples sitios de clonación, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), sitios de reconocimiento de recombinasa (por ejemplo, sitios LoxP, FRT y Att), codones de terminación, señales de terminación transcripcional y polinucleótidos que codifican polipéptidos de autoescisión, marcadores de epítopos, como se describe en otra parte en la presente descripción o como se sabe en la técnica, de modo que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que puede emplearse un fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud, estando limitada la longitud total preferentemente por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido.
Los polinucleótidos pueden prepararse, manipularse y/o expresarse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas conocidas y disponibles en la técnica. Para expresar un polipéptido deseado, puede insertarse una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en el vector apropiado.
Los ejemplos de vectores son plásmidos, secuencias de replicación autónoma y elementos transponibles. Los vectores adicionales ilustrativos incluyen, sin limitación, plásmidos, fagémidos, cósmidos, transposones, cromosomas artificiales tales como cromosoma artificial de levadura (YAC), cromosoma artificial bacteriano (BAC) o cromosoma artificial derivado de P1 (PAC), bacteriófagos tales como fago lambda o fago M13 y virus animales. Los ejemplos de categorías de virus animales útiles como vectores incluyen, sin limitación, retrovirus (que incluyen lentivirus), adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple), poxvirus, baculovirus, papilomavirus y papovavirus (por ejemplo, SV40). Los ejemplos de vectores de expresión son vectores pCIneo (Promega) para la expresión en células de mamífero; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ y pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) para la transferencia y la expresión de genes mediada por lentivirus en células de mamífero. En aspectos particulares, las secuencias codificantes de las proteínas quiméricas descritas en la presente descripción pueden ligarse en dichos vectores de expresión para la expresión de la proteína quimérica en células de mamífero.
En aspectos particulares, el vector es un vector que no se integra, que incluye pero no se limita a un vector episomal o un vector que se mantiene extracromosómicamente. Como se usa en la presente descripción, el término "episomal" se refiere a un vector que es capaz de replicarse sin integración en el ADN cromosómico del huésped y sin pérdida gradual de una célula huésped en división, lo que también significa que dicho vector se replica extracromosómicamente o episomalmente. El vector está diseñado genéticamente para albergar la secuencia que codifica el origen de la replicación del ADN u "ori" de un virus del herpes linfotrófico o un herpesvirus gamma, un adenovirus, SV40, un virus del papiloma bovino o una levadura, específicamente un origen de replicación de un virus del herpes linfotrófico o un herpesvirus gamma correspondiente a oriP de EBV. En un aspecto particular, el virus del herpes linfotrófico puede ser el virus de Epstein Barr (EBV), el virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KSHV), el virus del herpes saimiri (HS) o el virus de la enfermedad de Marek (MDV). El virus de Epstein Barr (EBV) y el virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KSHV) también son ejemplos de un herpesvirus gamma. Típicamente, la célula huésped comprende la proteína transactivadora de la replicación viral que activa la replicación.
En aspectos particulares, un polinucleótido se introduce en una célula huésped o diana mediante el uso de un sistema de vector de transposón. En determinados aspectos, el sistema de vector transposón comprende un vector que comprende elementos transponibles y un polinucleótido contemplado en la presente descripción; y una transposasa. En un aspecto, el sistema de vector de transposón es un sistema de vector de transposasa único, consulte, por ejemplo, la solicitud internacional núm. US2011/047635. Las transposasas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a: piggyBac, Bella Durmiente, Mos1, Tc1/mariner, Tol2, mini-Tol2, Tc3, MuA, Himar I, Frog Prince y los derivados de estos. El transposón y la transposasa piggyBac se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 6,962,810. El transposón y la transposasa Bella Durmiente se describen, por ejemplo, en Izsvak y otros, J. Mol. Biol. 302: 93-102 (2000). El transposón Tol2 que se aisló por primera vez del pez medaka Oryzias latipes y pertenece a la familia de transposones hAT se describe en Kawakami y otros (2000). Mini-Tol2 es una variante de Tol2 y se describe en Balciunas y otros (2006). Los transposones Tol2 y Mini-Tol2 facilitan la integración de un transgén en el genoma de un organismo cuando actúan conjuntamente con la transposasa Tol2. El transposón y la transposasa Frog Prince se describen, por ejemplo, en Miskey y otros, Nucleic Acids Res. 31:6873-6881 (2003)).
Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son aquellas regiones sin traducir del vector: origen de la replicación, casetes de selección, promotores, potenciadores, señales de iniciación de la traducción (secuencia Shine Dalgarno o secuencia de Kozak), intrones, una secuencia de poliadenilación, regiones sin traducir 5' y 3', que interactúan con las proteínas celulares del huésped para realizar la transcripción y la traducción. Tales elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. En dependencia del sistema de vector y el huésped usado, puede usarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, que incluyen los promotores ubicuos y los promotores inducibles.
En aspectos particulares, los vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión y vectores virales, incluirán secuencias de control exógenas, endógenas o heterólogas, tales como promotores y/o potenciadores. Una secuencia de control "endógena" es aquella que está unida naturalmente con un gen dado en el genoma. Una secuencia de control "exógena" es una que se coloca en yuxtaposición a un gen por medio de manipulación genética (es decir, técnicas de biología molecular) de modo que la transcripción de ese gen está dirigida por el potenciador/promotor vinculado. Una secuencia de control "heteróloga" es una secuencia exógena que es de una especie diferente a la célula que se está manipulando genéticamente.
El término "promotor", como se usa en la presente descripción, se refiere a un sitio de reconocimiento de un polinucleótido (ADN o ARN) al que se une una ARN polimerasa. Una ARN polimerasa inicia y transcribe polinucleótidos operativamente unidos al promotor. En aspectos particulares, los promotores operativos en células de mamífero comprenden una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases en dirección 5' del sitio donde se inicia la transcripción y/u otra secuencia que se encuentra de 70 a 80 bases en dirección 5' del inicio de la transcripción, una región CnCAAt donde N puede ser cualquier nucleótido.
El término "potenciador" se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar una transcripción mejorada y, en algunos casos, puede funcionar independientemente de su orientación con respecto a otra secuencia de control. Un potenciador puede funcionar de forma cooperativa o aditiva con promotores y/u otros elementos potenciadores. El término "promotor/potenciador" se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar funciones tanto de promotor como de potenciador.
El término "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. En un aspecto, el término se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de la expresión del ácido nucleico (tales como un promotor y/o un potenciador) y una segunda secuencia de polinucleótidos, por ejemplo, un polinucleótido de interés, en donde la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
Como se usa en la presente descripción, el término "secuencia de control de la expresión constitutiva" se refiere a un promotor, potenciador o promotor/potenciador que permite de forma constante o continua la transcripción de una secuencia operativamente unida. Una secuencia de control de la expresión constitutiva puede ser un promotor, potenciador o promotor/potenciador "ubicuo" que permite la expresión en una amplia variedad de tipos de células y tejidos o un promotor, potenciador o promotor/potenciador "específico de células", "específico de tipo de células", "específico de linaje celular" o "específico de tejidos" que permite la expresión en una variedad restringida de tipos de células y tejidos, respectivamente.
Las secuencias de control de la expresión ubicuas ilustrativas adecuadas para su uso en aspectos particulares incluyen, pero no se limitan a, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un virus de simio 40 viral (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), un promotor LTR virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), una LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), un promotor del virus del herpes simple (HSV) (timidina cinasa), promotores H5, P7.5 y P11 del virus vaccinia, un promotor del factor de elongación 1 -alfa (EF1a), respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1), ferritina H (FerH), ferritina L (FerL), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), factor de iniciación de la traducción eucariota 4A1 (EIF4A1), proteína 5 de choque térmico de 70 kDa (HSPA5), proteína beta de choque térmico de 90 kDa, miembro 1 (HSP90B1), proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP70), p-quinesina (p-KIN), el locus ROSA 26 humano (Irions y otros, Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), un promotor de ubiquitina C (UBC), un promotor de fosfoglicerato cinasa-1 (PGK), un potenciador de citomegalovirus/promotor de p-actina de pollo (CAG), un promotor de p-actina y un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativa eliminada, promotor del sitio sustituido de unión al cebador dl587rev (MND) (Challita y otros, J Virol. 69(2):748-55 (1995)).
En un aspecto, un vector comprende un promotor MND.
En un aspecto, un vector comprende un promotor EF1a que comprende el primer intrón del gen EF1a humano. En un aspecto, un vector comprende un promotor EF1a que carece del primer intrón del gen EF1a humano.
En un aspecto particular, puede ser conveniente expresar un polinucleótido que comprende un CAR de un promotor específico de linfocitos T.
Como se usa en la presente descripción, "expresión condicional" puede referirse a cualquier tipo de expresión condicional que incluye, pero no se limita a, expresión inducible; expresión reprimible; expresión en células o tejidos que tienen un estado fisiológico, biológico o de enfermedad particular, etc. Esta definición no pretende excluir el tipo de célula o la expresión específica de tejido. Determinados aspectos proporcionan la expresión condicional de un polinucleótido de interés, por ejemplo, la expresión se controla al someter a una célula, tejido, organismo, etc., a un tratamiento o condición que provoca que se exprese el polinucleótido o que provoca un aumento o disminución de la expresión del polinucleótido codificado por el polinucleótido de interés.
Los ejemplos ilustrativos de sistemas/promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles por esteroides tales como promotores de genes que codifican receptores de estrógenos o glucocorticoides (inducibles mediante tratamiento con la hormona correspondiente), promotores de metalotionina (inducibles mediante tratamiento con varios metales pesados), promotor de MX-1 (inducible por interferón), el sistema de regulación de mifepristona "GeneSwitch" (Sirin y otros, 2003, Gene, 323:67), el interruptor genético inducible cumate (documento núm. WO 2002/088346), sistemas reguladores dependientes de tetraciclina, etc.
La expresión condicional también puede lograrse mediante el uso de una recombinasa de ADN específica del sitio. De acuerdo con determinados aspectos, el vector comprende al menos un sitio (típicamente dos) para la recombinación mediada por una recombinasa específica del sitio. Como se usa en la presente descripción, los términos "recombinasa" o "recombinasa específica del sitio" incluyen proteínas, enzimas, cofactores o proteínas asociadas excesivas o integradoras que están involucradas en reacciones de recombinación que involucran uno o más sitios de recombinación (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, siete, diez, doce, quince, veinte, treinta, cincuenta, etc.), que pueden ser proteínas de tipo salvaje (consulte Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)), o mutantes, derivados (por ejemplo, proteínas de fusión que contienen las secuencias de proteínas de recombinación o fragmentos de estas), fragmentos y variantes de estas. Los ejemplos ilustrativos de recombinasas adecuadas para su uso en aspectos particulares incluyen, entre otros: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, OC31, Cin, Tn3 resolvasa, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 y ParA.
Los vectores pueden comprender uno o más sitios de recombinación para cualquiera de una amplia variedad de recombinasas específicas del sitio. Debe entenderse que el sitio diana para una recombinasa específica del sitio se suma a cualquier sitio requerido para la integración de un vector, por ejemplo, un vector retroviral o un vector lentiviral. Como se usa en la presente descripción, los términos "secuencia de recombinación", "sitio de recombinación" o "sitio de recombinación específico del sitio" se refieren a una secuencia de ácido nucleico particular a la que una recombinasa reconoce y se une.
Por ejemplo, un sitio de recombinación para la recombinasa Cre es loxP, que es una secuencia de 34 pares de bases que comprende dos repeticiones invertidas de 13 pares de bases (que sirven como sitios de unión de la recombinasa) que flanquean una secuencia central de 8 pares de bases (consulte la Figura 1 de Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)). Otros sitios loxP ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: lox511 (Hoess y otros, 1996; Bethke y Sauer, 1997), lox5171 (Lee y Saito, 1998), lox2272 (Lee y Saito, 1998), m2 (Langer y otros, 2002), lox71 (Albert y otros, 1995) y lox66 (Albert y otros, 1995).
Los sitios de reconocimiento adecuados para la recombinasa FLP incluyen, pero no se limitan a: FRT (McLeod, y otros, 1996), F -^ F a (Schlake y Bode, 1994), F4,Fa (Schlake y Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff y otros, 1988), FRT(RE) (Senecoff y otros, 1988).
Otros ejemplos de secuencias de reconocimiento son las secuencias attB, attP, attL y attR, que se reconocen por la enzima recombinasa A Integrasa, por ejemplo, phi-c31. El 0C31 SSR media la recombinación solo entre los sitios heterotípicos attB (34 pb de longitud) y attP (39 pb de longitud) (Groth y otros, 2000). El attB y attP, llamados así para los sitios de unión para la integrasa del fago en los genomas bacteriano y fago, respectivamente, contienen repeticiones invertidas imperfectas que probablemente están unidas por homodímeros 0C31 (Groth y otros, 2000). Los sitios de producto, attL y attR, son eficazmente inertes para una mayor recombinación mediada por 0C31 (Belteki y otros, 2003), lo que hace que la reacción sea irreversible. Para catalizar las inserciones, se ha encontrado que el ADN que tiene attB se inserta en un sitio attP genómico más fácilmente que un sitio attP en un sitio attB genómico (Thyagarajan y otros, 2001; Belteki y otros, 2003). Por lo tanto, las estrategias típicas colocan mediante recombinación homóloga un "sitio de acoplamiento" que tiene attP en un locus definido, que luego se asocia con una secuencia entrante que tiene attB para la inserción.
Tal como se usa en la presente descripción, un "sitio interno de entrada al ribosoma" o "IRES" se refiere a un elemento que promueve la entrada interna al ribosoma directo al codón de iniciación, tal como ATG, de un cistrón (una región que codifica una proteína), lo que conduce a la traducción independiente de casquete del gen. Consulte, por ejemplo, Jackson y otros, 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) y Jackson y Kaminsky. 1995. RNA 1(10):985-1000. En aspectos particulares, los vectores incluyen uno o más polinucleótidos de interés que codifican uno o más polipéptidos. En aspectos particulares, para lograr una traducción eficaz de cada uno de la pluralidad de polipéptidos, las secuencias de polinucleótidos pueden separarse mediante una o más secuencias IRES o secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos de autoescisión.
Como se usa en la presente descripción, el término "secuencia de Kozak" se refiere a una secuencia de nucleótidos corta que facilita en gran medida la unión inicial del ARNm a la subunidad pequeña del ribosoma y aumenta la traducción. La secuencia consenso de Kozak es (GCC)RCCATGG (SEQ ID NO: 57), donde R es una purina (A o G) (Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92, y Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48). En aspectos particulares, los vectores comprenden polinucleótidos que tienen una secuencia consenso de Kozak y que codifican un polipéptido deseado, por ejemplo, un CAR.
En algunos aspectos, un polinucleótido o célula que alberga el polinucleótido usa un gen suicida, que incluye un gen suicida inducible para reducir el riesgo de toxicidad directa y/o proliferación incontrolada. En aspectos específicos, el gen suicida no es inmunogénico para el huésped que alberga el polinucleótido o la célula. Un determinado ejemplo de un gen suicida que puede usarse es caspasa-9 o caspasa-8 o citosina desaminasa. La caspasa-9 puede activarse mediante el uso de un inductor químico de dimerización (CID) específico.
En determinados aspectos, los vectores comprenden segmentos génicos que provocan que las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, los linfocitos T, sean susceptibles a la selección negativa in vivo. Por "selección negativa" se entiende que la célula infundida puede eliminarse como resultado de un cambio en la condición in vivo del individuo. El fenotipo seleccionable negativo puede resultar de la inserción de un gen que confiere sensibilidad a un agente administrado, por ejemplo, un compuesto. Los genes seleccionables negativos se conocen en la técnica e incluyen, entre otros, los siguientes: el gen de la timidina cinasa del virus del herpes simple tipo I (HSV-I TK) (Wigler y otros, Cell 11:223, 1977) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de la hipoxantina fosforribosiltransferasa celular (HPRT), el gen de la adenina fosforribosiltransferasa celular (APRT) y la citosina desaminasa bacteriana, (Mullen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos. 89:33 (1992)).
En algunos aspectos, las células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente, como los linfocitos T, comprenden un polinucleótido que comprende además un marcador positivo que permite la selección de células del fenotipo seleccionable negativo in vitro. El marcador seleccionable positivo puede ser un gen que, al ser introducido en la célula huésped, exprese un fenotipo dominante que permita la selección positiva de células que portan el gen. Los genes de este tipo se conocen en la técnica e incluyen, entre otros, el gen de la higromicina-B fosfotransferasa (hph) que confiere resistencia a la higromicina B, el gen de la aminoglucósido fosfotransferasa (neo o aph) de Tn5 que codifica la resistencia al antibiótico G418, el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen de la adenosina desaminasa (ADA) y el gen de resistencia a múltiples fármacos (MDR).
Preferentemente, el marcador seleccionable positivo y el elemento seleccionable negativo están unidos de modo que la pérdida del elemento seleccionable negativo también necesariamente va acompañada de la pérdida del marcador seleccionable positivo. Aún con mayor preferencia, los marcadores seleccionables positivos y negativos se fusionan de modo que la pérdida de uno conduce obligatoriamente a la pérdida del otro. Un ejemplo de un polinucleótido fusionado que produce como un producto de expresión un polipéptido que confiere tanto los rasgos de selección positiva como negativa deseadas descritas anteriormente es un gen de fusión de higromicina fosfotransferasa timidina cinasa (HyTK). La expresión de este gen produce un polipéptido que confiere resistencia a la higromicina B para la selección positiva in vitro y sensibilidad al ganciclovir para la selección negativa in vivo. Consulte Lupton S. D., y otros, Mol. and Cell. Biology 11:3374-3378, 1991. Además, en aspectos preferidos, los polinucleótidos que codifican los receptores quiméricos están en vectores retrovirales que contienen el gen fusionado, particularmente aquellos que confieren resistencia a la higromicina B para la selección positiva in vitro, y sensibilidad al ganciclovir para la selección negativa in vivo, por ejemplo, el vector retrovira1HyTK descrito en Lupton, S. D. y otros (1991), arriba. Consulte también las publicaciones de PCT US91/08442 y pCt /US94/05601, por S. D. Lupton, que describe el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de marcadores seleccionables positivos dominantes con marcadores seleccionables negativos.
Los marcadores seleccionables positivos preferidos se derivan de genes que se seleccionan del grupo que consiste en hph, nco y gpt, y los marcadores seleccionables negativos preferidos se derivan de genes que se seleccionan del grupo que consiste en citosina desaminasa, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT y gpt. Los marcadores especialmente preferidos son genes de fusión seleccionables bifuncionales en donde el marcador seleccionable positivo deriva de hph o neo, y el marcador seleccionable negativo deriva de citosina desaminasa o un gen TK o marcador seleccionable.
En varios aspectos, el polinucleótido es un ARNm que se introduce en una célula para expresar transitoriamente un polipéptido deseado. Como se usa en la presente descripción, "transitorio" se refiere a la expresión de un transgén no integrado durante un período de horas, días o semanas, en donde el período de tiempo de la expresión es menor que el período de tiempo para la expresión del polinucleótido si está integrado en el genoma o contenido dentro de un vector o plásmido estable en la célula.
En aspectos particulares, el ARNm que codifica un polipéptido es un ARNm transcrito in vitro. Como se usa en la presente descripción, "ARN transcrito in vitro" se refiere a ARN, preferentemente ARNm, que se ha sintetizado in vitro. Generalmente, el ARN transcrito in vitro se genera a partir de un vector de transcripción in vitro. El vector de transcripción in vitro comprende un molde que se usa para generar el ARN transcrito in vitro.
En aspectos particulares, los ARNm comprenden además un casquete en 5' o un casquete en 5' modificado y/o una secuencia poli(A). Tal como se usa en la presente descripción, un casquete en 5' (también denominado casquete de ARN, casquete de 7-metilguanosina de ARN o casquete de ARN m7G) es un nucleótido de guanina modificado que se ha añadido al extremo "frontal" o 5' de un ARN mensajero eucariótico poco después del inicio de la transcripción. El casquete en 5' comprende un grupo terminal que está unido al primer nucleótido transcrito y reconocido por el ribosoma y protegido de las ARNasas. El resto de protección puede modificarse para modular la funcionalidad del ARNm, tales como su estabilidad o eficiencia de traducción. En un aspecto particular, el ARNm comprende una secuencia poli(A) de entre unas 50 y unas 5000 adeninas. En un aspecto, el ARNm comprende una secuencia poli(A) de entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000 bases, entre aproximadamente 200 y aproximadamente 500 bases, o entre aproximadamente 300 y aproximadamente 400 bases. En un aspecto, el ARNm comprende una secuencia poli(A) de aproximadamente 65 bases, aproximadamente 100 bases, aproximadamente 200 bases, aproximadamente 300 bases, aproximadamente 400 bases, aproximadamente 500 bases, aproximadamente 600 bases, aproximadamente 700 bases, aproximadamente 800 bases, aproximadamente 900 bases o aproximadamente 1000 o más bases. Las secuencias de poli(A) pueden modificarse química o enzimáticamente para modular la funcionalidad del ARNm, tales como la localización, la estabilidad o la eficacia de la traducción.
F. Vectores virales
En aspectos particulares, una célula (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria) se transduce con un vector retroviral, por ejemplo, un vector lentiviral, que codifica un CAR. Por ejemplo, una célula efectora inmunitaria se transduce con un vector que codifica un CAR que comprende un anticuerpo anti-STn o un fragmento de unión al antígeno de este que se une a una glucoproteína que expresa STn, por ejemplo, TAG-72, con un dominio de señalización intracelular de CD3Z, CD28, 4-1BB, OX40 o cualquier combinación de estos. Por tanto, estas células transducidas pueden provocar una respuesta citotóxica mediada por CAR.
Los retrovirus son una herramienta común para el suministro de genes (Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). En aspectos particulares, se usa un retrovirus para suministrar un polinucleótido que codifica un receptor quimérico de antígeno (CAR) a una célula. Como se usa en la presente descripción, el término "retrovirus" se refiere a un virus de ARN que transcribe inversamente su ARN genómico en una copia de ADN lineal de doble cadena y posteriormente integra covalentemente su ADN genómico en un genoma huésped. Una vez que el virus se integra en el genoma del huésped, se lo denomina "provirus". El provirus sirve como un molde para la ARN polimerasa II y dirige la expresión de moléculas de ARN que codifican las proteínas estructurales y las enzimas necesarias para producir nuevas partículas virales.
Los retrovirus ilustrativos adecuados para su uso en aspectos particulares incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV), virus del sarcoma murino de Moloney (MoMSV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), virus de la leucemia del simio gibón (GaLV), virus de la leucemia felina (FLV), spumavirus, virus de la leucemia murina Friend, virus de células madre murinas (MSCV) y virus del sarcoma de Rous (RSV)) y lentivirus.
Como se usa en la presente descripción, el término "lentivirus" se refiere a un grupo (o género) de retrovirus complejos. Los lentivirus ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: VIH (virus de inmunodeficiencia humana; que incluye VIH tipo 1 y VIH tipo 2); virus de visna-maedi (VMV); el virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV); virus de la anemia infecciosa equina (EIAV); virus de la inmunodeficiencia felina (FIV); virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB); y el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV). En un aspecto, se prefieren las cadenas principales de los vectores basados en VIH (es decir, elementos de secuencia que actúan en cis de VIH). En aspectos particulares, se usa un lentivirus para suministrar un polinucleótido que comprende un CAR a una célula.
Los vectores retrovirales y más particularmente los vectores lentivirales pueden usarse en la práctica de aspectos particulares. En consecuencia, el término "retrovirus" o "vector retroviral", como se usa en la presente descripción, incluye "lentivirus" y "vectores lentivirales", respectivamente.
El término "vector" se usa en la presente descripción para referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transferir o transportar otra molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico transferido generalmente se une, por ejemplo, se inserta en la molécula de ácido nucleico del vector. Un vector puede incluir secuencias que dirigen la replicación autónoma en una célula o puede incluir secuencias suficientes para permitir la integración en el ADN de la célula huésped. Los vectores útiles incluyen, por ejemplo, plásmidos (por ejemplo, plásmidos de ADN o plásmidos de ARN), transposones, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos y vectores virales. Los vectores virales útiles incluyen, por ejemplo, retrovirus y lentivirus defectuosos en la replicación.
Como será evidente para un experto en la técnica, el término "vector viral" se usa ampliamente para referirse a una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido de transferencia) que incluye elementos de ácido nucleico derivados de virus que típicamente facilitan la transferencia de la molécula de ácido nucleico o la integración en el genoma de una célula o en una partícula viral que media en la transferencia de ácido nucleico. Las partículas virales incluirán típicamente varios componentes virales y, a veces, también componentes de células huésped además de ácido(s) nucleico(s).
El término vector viral puede referirse a un virus o partícula viral capaz de transferir un ácido nucleico a una célula o al propio ácido nucleico transferido. Los vectores virales y los plásmidos de transferencia contienen elementos genéticos estructurales y/o funcionales que se derivan principalmente de un virus. El término "vector retroviral" se refiere a un vector viral o plásmido que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales, o partes de estos, que se derivan principalmente de un retrovirus. El término "vector lentiviral" se refiere a un vector viral o plásmido que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales, o partes de estos, que incluyen las LTR que se derivan principalmente de un lentivirus. El término "vector híbrido" se refiere a un vector, LTR u otro ácido nucleico que contiene tanto secuencias retrovirales, por ejemplo, lentivirales, como secuencias virales no lentivirales. En un aspecto, un vector híbrido se refiere a un vector o plásmido de transferencia que comprende secuencias retrovirales, por ejemplo, lentivirales, para transcripción inversa, replicación, integración y/o empaquetamiento.
En aspectos particulares, los términos "vector lentiviral", "vector de expresión lentiviral" pueden usarse para referirse a plásmidos de transferencia lentiviral y/o partículas lentivirales infecciosas. Cuando se hace referencia en la presente descripción a elementos tales como sitios de clonación, promotores, elementos reguladores, ácidos nucleicos heterólogos, etc., debe entenderse que las secuencias de estos elementos están presentes en forma de ARN en las partículas lentivirales y están presentes en forma de ADN en los plásmidos de ADN.
En cada extremo del provirus hay estructuras llamadas "repeticiones terminales largas" o "LTR". El término "repetición terminal larga (LTR)" se refiere a dominios de pares de bases ubicados en los extremos de los ADN retrovirales que, en su contexto de secuencia natural, son repeticiones directas y contienen regiones U3, R y U5. Las LTR generalmente proporcionan funciones fundamentales para la expresión de genes retrovirales (por ejemplo, promoción, iniciación y poliadenilación de transcritos de genes) y para la replicación viral. La LTR contiene numerosas señales reguladoras que incluyen elementos de control transcripcional, señales de poliadenilación y secuencias necesarias para la replicación y la integración del genoma viral. La LTR viral se divide en tres regiones denominadas U3, R y U5. La región U3 contiene los elementos potenciadores y promotores. La región U5 es la secuencia entre el sitio de unión del cebador y la región R y contiene la secuencia de poliadenilación. La región R (repetición) está flanqueada por las regiones U3 y U5. La LTR está compuesta por las regiones U3, R y U5 y aparece en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Adyacentes a la LTR 5' hay secuencias necesarias para la transcripción inversa del genoma (el sitio de unión del cebador de ARNt) y para el empaquetamiento eficaz del ARN viral en partículas (el sitio Psi).
Como se usa en la presente descripción, el término "señal de empaquetamiento" o "secuencia de empaquetamiento" se refiere a secuencias ubicadas dentro del genoma retroviral que se requieren para la inserción del ARN viral en la cápside o partícula viral, consulte, por ejemplo, Clever y otros, 1995. J. of Virology, vol. 69, núm. 4; págs. 2101-2109. Varios vectores retrovirales usan la señal de empaquetamiento mínima (también denominada secuencia psi [V]) necesaria para la encapsidación del genoma viral. Por lo tanto, como se usa en la presente descripción, los términos "secuencia de empaquetamiento", "señal de empaquetamiento", "psi" y el símbolo "V" se usan en referencia a la secuencia no codificante requerida para la encapsidación de las cadenas de ARN retrovirales durante la formación de las partículas virales.
En varios aspectos, los vectores comprenden LTR 5' y/o LTR 3' modificadas. Cualquiera o ambas LTR pueden comprender una o más modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, una o más eliminaciones, inserciones o sustituciones. A menudo se realizan modificaciones de la LTR 3' para mejorar la seguridad de los sistemas lentivirales o retrovirales al hacer proporcionar virus defectuosos para la replicación. Como se usa en la presente descripción, el término "defectuoso para la replicación" se refiere a un virus que no es capaz de una replicación completa y eficaz de modo que no se produzcan viriones infecciosos (por ejemplo, progenie lentiviral defectuosa para la replicación). El término "competente para la replicación" se refiere a virus de tipo salvaje o virus mutante que es capaz de replicarse, de modo que la replicación viral del virus es capaz de producir viriones infecciosos (por ejemplo, progenie lentiviral competente para la replicación).
Los vectores "autoinactivantes" (SIN) se refieren a vectores defectuosos para la replicación, por ejemplo, vectores retrovirales o lentivirales, en los que la región promotora potenciadora LTR derecha (3'), conocida como región U3, se ha modificado (por ejemplo, por eliminación o sustitución) para prevenir la transcripción viral más allá de la primera ronda de la replicación viral. Esto se debe a que la región LTR U3 derecha (3') se usa como molde para la región LTR U3 izquierda (5') durante la replicación viral y, por lo tanto, la transcripción viral no puede hacerse sin el potenciador-promotor U3. En otro aspecto, la LTR 3' se modifica de modo que la región U5 se reemplaza, por ejemplo, con una secuencia poli(A) ideal. Cabe señalar que también se incluyen modificaciones en las LTR, tales como modificaciones en la LTR 3', la LTR 5' o las LTR 3' y 5'.
Se proporciona una mejora de seguridad adicional al reemplazar la región U3 de la LTR 5' con un promotor heterólogo para impulsar la transcripción del genoma viral durante la producción de partículas virales. Los ejemplos de promotores heterólogos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, promotores de virus de simio 40 viral (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, temprano inmediato), virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), virus de sarcoma de Rous (RSV) y virus del herpes simple (HSV) (timidina cinasa). Los promotores típicos pueden impulsar altos niveles de transcripción de una manera independiente de Tat. Este reemplazo reduce la posibilidad de recombinación para generar virus competentes para la replicación porque no hay una secuencia U3 completa en el sistema de producción de virus. En determinados aspectos, el promotor heterólogo tiene ventajas adicionales en el control de la forma en que se transcribe el genoma viral. Por ejemplo, el promotor heterólogo puede ser inducible, de modo que la transcripción de todo o parte del genoma viral ocurrirá solo cuando estén presentes los factores de inducción. Los factores de inducción incluyen, pero no se limitan a, uno o más compuestos químicos o las condiciones fisiológicas tales como la temperatura o el pH, en las que se cultivan las células huésped.
En algunos aspectos, los vectores virales comprenden un elemento TAR. El término "TAR" se refiere al elemento genético de "respuesta de transactivación" ubicado en la región R de las LTR lentivirales (por ejemplo, VIH). Este elemento interactúa con el elemento genético lentiviral transactivador (tat) para mejorar la replicación viral. Sin embargo, este elemento no se requiere en aspectos en donde la región U3 de la LTR 5' se reemplaza por un promotor heterólogo.
La "región R" se refiere a la región dentro de las LTR retrovirales que comienza al inicio del grupo de protección (es decir, el inicio de la transcripción) y termina inmediatamente antes del inicio del tramo poli(A). La región R también se define como flanqueada por las regiones U3 y U5. La región R juega un papel durante la transcripción inversa al permitir la transferencia de ADN naciente de un extremo del genoma al otro.
Como se usa en la presente descripción, el término "elemento FLAP" se refiere a un ácido nucleico cuya secuencia incluye el tramo de polipurina central y las secuencias de terminación central (cPPT y CTS) de un retrovirus, por ejemplo, VIH-1 o VIH-2. En algunos aspectos, los términos "elemento FLAP" y "cPPT/FLAP" se usan indistintamente para referirse al elemento FLAP anterior. Los elementos FLAP adecuados se describen en la patente de Estados Unidos núm. 6,682,907 y en Zennou, y otros, 2000, Cell, 101:173. Durante la transcripción inversa del VIH-1, la iniciación central del ADN de cadena positiva en el tramo de polipurina central (cPPT) y la terminación central en la secuencia de terminación central (CTS) conducen a la formación de una estructura de ADN de tres cadenas: ADN FLAP central de VIH-1. Si bien no se desea estar atado a ninguna teoría, el ADN FLAP puede actuar como un determinante activo en cis de la importación nuclear del genoma lentiviral y/o puede aumentar el título del virus. En aspectos particulares, las cadenas principales de los vectores retrovirales o lentivirales comprenden uno o más elementos FLAP en dirección 5' o en dirección 3' de los genes heterólogos de interés en los vectores. Por ejemplo, en aspectos particulares, un plásmido de transferencia incluye un elemento FLAP. En un aspecto, un vector comprende un elemento FLAP aislado de VIH-1.
En un aspecto, los vectores de transferencia retroviral o lentiviral comprenden uno o más elementos de exportación. El término "elemento de exportación" se refiere a un elemento regulador postranscripcional que actúa en cis que regula el transporte de un transcrito de ARN desde el núcleo hasta el citoplasma de una célula. Los ejemplos de elementos de exportación de ARN incluyen, pero no se limitan a, el elemento de respuesta rev (RRE) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (consulte, por ejemplo, Cullen y otros, 1991. J. Virol. 65: 1053; y Cullen y otros, 1991. Cell 58: 423), y el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (HPRE). Generalmente, el elemento de exportación de ARN se coloca dentro de la UTR 3' de un gen y puede insertarse como una o varias copias.
En aspectos particulares, la expresión de secuencias heterólogas en vectores virales aumenta mediante la incorporación de elementos reguladores postranscripcionales, sitios de poliadenilación eficaces y, opcionalmente, señales de terminación de la transcripción en los vectores. Una variedad de elementos reguladores postranscripcionales pueden aumentar la expresión de un ácido nucleico heterólogo en la proteína, por ejemplo, el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE); Zufferey y otros, 1999, J. Virol., 73:2886); el elemento regulador postranscripcional presente en el virus de la hepatitis B (HPRE) (Huang y otros, Mol. Cell. Biol., 5:3864); y similares (Liu y otros, 1995, Genes Dev., 9:1766). En aspectos particulares, los vectores comprenden un elemento regulador postranscripcional tal como un WPRE o HPRE.
En aspectos particulares, los vectores carecen o no comprenden un elemento regulador postranscripcional tales como WPRE o HPRE porque en algunos casos estos elementos aumentan el riesgo de transformación celular y/o no aumentan de manera sustancial o significativa la cantidad de transcrito de ARNm o aumentan la estabilidad del ARNm. Sin embargo, el efecto de incluir un WPRE en un vector dado puede ser impredecible en algunos aspectos. Por lo tanto, en algunos aspectos, los vectores carecen o no comprenden un WPRE o HPRE.
Los elementos que dirigen la terminación eficaz y la poliadenilación de los transcritos de ácidos nucleicos heterólogos aumentan la expresión de genes heterólogos. Las señales de terminación de la transcripción generalmente se encuentran en dirección de la señal de poliadenilación.
En aspectos particulares, los vectores comprenden una secuencia de poliadenilación en 3' de un polinucleótido que codifica un polipéptido a expresar. El término "sitio poli(A)" o "secuencia poli(A)", tal como se usa en la presente descripción, indica una secuencia de ADN que dirige tanto la terminación como la poliadenilación del transcrito de ARN naciente por la ARN polimerasa II. Las secuencias de poliadenilación pueden promover la estabilidad del ARNm mediante la adición de una cola poli(A) al extremo 3' de la secuencia codificante y, por lo tanto, contribuir a aumentar la eficacia de la traducción. La escisión y la poliadenilación están dirigidas por una secuencia poli(A) en el ARN. La secuencia poli(A) central para los pre-ARNm de mamíferos tiene dos elementos de reconocimiento que flanquean un sitio de escisión-poliadenilación. Por lo general, un hexámero AAUAAA casi invariable se encuentra 20-50 nucleótidos en dirección 5' de un elemento más variable rico en residuos U o GU. La escisión del transcrito naciente se produce entre estos dos elementos y se acopla a la adición de hasta 250 adenosinas al producto de escisión en 5'. En aspectos particulares, la secuencia poli(A) central es una secuencia poli(A) ideal (por ejemplo, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA). En aspectos particulares, la secuencia poli(A) es una secuencia poli(A) de SV40, una secuencia poli(A) de hormona de crecimiento bovina (BGHpA), una secuencia poli(A) de p-globina de conejo (rpgpA), u otra secuencia poli(A) heteróloga o endógena conocida en la técnica.
En determinados aspectos, un vector retroviral o lentiviral comprende además uno o más elementos aisladores. Los elementos aisladores pueden contribuir a proteger secuencias expresadas por lentivirus, por ejemplo, polipéptidos terapéuticos, de los efectos del sitio de integración, que pueden estar mediados por elementos que actúan en cis presentes en el ADN genómico y conducir a una expresión desregulada de secuencias transferidas (es decir, efecto de posición; consulte, por ejemplo, Burgess-Beusse y otros, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos, 99:16433; y Zhan y otros, 2001, Hum. Genet., 109:471). En algunos aspectos, los vectores de transferencia comprenden uno o más elementos aisladores, la LTR 3' y tras la integración del provirus en el genoma huésped, el provirus comprende uno o más aisladores tanto en la LTR 5' como en la LTR 3', en virtud de la duplicación la LTR 3'. Los aisladores adecuados para su uso en aspectos particulares incluyen, pero no se limitan a, el aislador de globina p de pollo (consulte Chung y otros, 1993. Cell 74:505; Chung y otros, 1997. PNAS 94:575; y Bell y otros, 1999. Cell 98:387). Los ejemplos de elementos aisladores incluyen, pero no se limitan a, un aislador de un locus de globina p, tal como HS4 de pollo.
De acuerdo con determinados aspectos específicos, la mayoría o todas las secuencias de la cadena principal del vector viral se derivan de un lentivirus, por ejemplo, VIH-1. Sin embargo, debe entenderse que pueden usarse, o combinarse, muchas fuentes diferentes de secuencias retrovirales y/o lentivirales y pueden acomodarse numerosas sustituciones y alteraciones en determinadas secuencias lentivirales sin afectar la capacidad de un vector de transferencia para realizar las funciones descritas en la presente descripción. Además, se conocen en la técnica una variedad de vectores lentivirales, consulte Naldini y otros, (1996a, 1996b y 1998); Zufferey y otros, (1997); Dull y otros, 1998, patentes de Estados Unidos núms. 6,013,516; y 5,994,136, muchos de los cuales pueden adaptarse para producir un vector viral o un plásmido de transferencia.
En varios aspectos, los vectores comprenden un promotor operativamente unido a un polinucleótido que codifica un polipéptido CAR. Los vectores pueden tener una o más LTR, en donde cualquiera de las LTR comprende una o más modificaciones, tales como una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos. Los vectores pueden comprender además uno o más elementos accesorios para aumentar la eficiencia de la transducción (por ejemplo, un cPPT/FLAP), empaquetamiento viral (por ejemplo, una señal de empaquetamiento Psi (V), RRE) y/u otros elementos que aumentan la expresión génica terapéutica (por ejemplo, secuencias poli(A)), y puede comprender opcionalmente un WPRE o HPRE.
En un aspecto particular, un vector de transferencia comprende una LTR retroviral izquierda (5'); un tramo de polipurina central/ADN flap (cPPT/FLAP); un elemento de exportación retroviral; un promotor activo en un linfocito T, operativamente unido a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; y una LTR retroviral derecha (3'); y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En un aspecto particular, un vector de transferencia comprende una LTR retroviral izquierda (5'); un elemento de exportación retroviral; un promotor activo en un linfocito T, operativamente unido a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; una LTR retroviral derecha (3'); y una secuencia poli(A); y opcionalmente un WPRE o HPRE. En otro aspecto particular, un vector lentiviral comprende: una LTR izquierda (5'); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor activo en un linfocito T, operativamente unido a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; una LTR derecha (3'); y una secuencia de poliadenilación; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En determinado aspecto, un vector lentiviral comprende: una LTR izquierda (5') de VIH-1; una señal de empaquetamiento Psi (V); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor activo en un linfocito T, operativamente unido a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; una LTR derecha (3') autoinactivante (SIN) de HIV-1; y una secuencia de poliadenilación de p-globina de conejo; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En otro aspecto, un vector comprende: al menos una LTR; un tramo de polipurina central/ADN flap (cPPT/FLAP); un elemento de exportación retroviral; y un promotor activo en un linfocito T, operativamente unido a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En un aspecto particular, un vector comprende al menos una LTR; un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor activo en un linfocito T, operativamente unido a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; y una secuencia de poliadenilación; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En determinado aspecto, un vector comprende al menos una LTR SIN de HIV-1; una señal de empaquetamiento Psi (V); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor activo en un linfocito T, operativamente unido a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; y una secuencia de poliadenilación de p-globina de conejo; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
Una "célula huésped" incluye células sometidas a electroporación, transfectadas, infectadas o transducidas in vivo, ex vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleótido. Las células huésped pueden incluir células de empaquetamiento, células productoras y células infectadas con vectores virales. En aspectos particulares, las células huésped infectadas con el vector viral se administran a un sujeto que necesita terapia. En determinados aspectos, el término "célula diana" se usa indistintamente con célula huésped y se refiere a células transfectadas, infectadas o transducidas de un tipo de célula deseado. En aspectos preferidos, la célula diana es un linfocito T. A menudo es necesaria la producción de partículas virales a gran escala para lograr un título viral razonable. Las partículas virales se producen mediante la transfección de un vector de transferencia en una línea celular de empaquetamiento que comprenden genes estructurales y/o accesorios virales, por ejemplo, genes gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx o nef u otros genes retrovirales.
Como se usa en la presente descripción, el término "vector de empaquetamiento" se refiere a un vector de expresión o vector viral que carece de una señal de empaquetamiento y comprende un polinucleótido que codifica uno, dos, tres, cuatro o más genes estructurales y/o accesorios virales. Típicamente, los vectores de empaquetamiento se incluyen en una célula de empaquetamiento y se introducen en la célula mediante la transfección, la transducción o la infección. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para la transfección, la transducción o la infección. En aspectos particulares, un vector de transferencia retroviral/lentiviral se introduce en una línea celular de empaquetamiento, mediante la transfección, la transducción o la infección, para generar una célula o una línea celular productora. En aspectos particulares, los vectores de empaquetamiento se introducen en células o líneas celulares humanas mediante métodos estándar que incluyen, por ejemplo, la transfección con fosfato de calcio, la lipofección o la electroporación. En algunos aspectos, los vectores de empaquetamiento se introducen en las células junto con un marcador seleccionable dominante, tales como neomicina, higromicina, puromicina, blastocidina, zeocina, timidina cinasa, DHFR, Gln sintetasa o ADA, seguido de una selección en presencia del fármaco apropiado y el aislamiento de clones. Un gen marcador seleccionable puede unirse físicamente a los genes que se codifican por el vector de empaquetamiento, por ejemplo, por IRES o péptidos virales de autoescisión.
Las proteínas de la envoltura viral (env) determinan el intervalo de las células huésped que finalmente pueden infectarse y transformarse mediante retrovirus recombinantes generados a partir de las líneas celulares. En el caso de los lentivirus, tales como HIV-1, HIV-2, SIV, FIV y EIV, las proteínas env incluyen gp41 y gp120. Preferentemente, las proteínas env virales expresadas por las células de empaquetamiento se codifican en un vector separado de los genes gag y pol virales, como se ha descrito previamente.
Los ejemplos ilustrativos de genes env derivados de retrovirus que pueden emplearse en aspectos particulares incluyen, pero no se limitan a: envolturas MLV, envoltura 10A1, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, Ébola, Sendai, FPV (virus de la peste aviar), y envolturas de virus de la influenza. De manera similar, pueden usarse los genes que codifican las envolturas de virus de ARN (por ejemplo, familias de virus de ARN de Picomaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae) así como también de los virus de ADN (familias de Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxyiridae e Iridoviridae). Los ejemplos representativos de estos virus incluyen, pero no se limitan a, FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, Rabies, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 y EIAV.
En otros aspectos, las proteínas de la envoltura para seudotipificar un virus incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los siguientes virus: influenza A tal como H1N1, H1N2, H3N2 y H5N1 (gripe aviar), influenza B, virus de la influenza C, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D, virus de la hepatitis E, rotavirus, cualquier virus del grupo de virus de Norwalk, adenovirus entéricos, parvovirus, virus de la fiebre del dengue, viruela del mono, mononegavirales, Lyssavirus tales como el virus de la rabia, virus del murciélago de Lagos, virus de Mokola, virus Duvenhage, virus del murciélago europeo 1 y 2 y virus del murciélago australiano, Ephemerovirus, Vesiculovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV), herpesvirus tales como el virus de herpes simple tipos 1 y 2, varicela zoster, citomegalovirus, virus de Epstein-Bar (EBV)), herpesvirus humanos (HHV), herpesvirus humanos tipo 6 y 8, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma, gammaherpesvirus murino, arenavirus tales como el virus de la fiebre hemorrágica argentina, el virus de la fiebre hemorrágica boliviana, el virus de la hemorragia asociada a Sabia, virus de la fiebre hemorrágica venezolana, virus de la fiebre de Lassa, virus de Machupo, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), Bunyaviridiae tales como el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, Hantavirus, virus que provoca la fiebre hemorrágica con síndrome renal, virus de la fiebre del Valle del Rift, Filoviridae (filovirus), que incluyen la fiebre hemorrágica del Ébola y la fiebre hemorrágica de Marburg, Flaviviridae que incluyen el virus de la enfermedad del bosque de Kaysanur, el virus de la fiebre hemorrágica de Omsk, el virus que provoca la encefalitis transmitida por garrapatas y Paramyxoviridae tales como el virus Hendra y el virus Nipah, la variola mayor y la variola menor (viruela), alfavirus tales como el virus de la encefalitis equina venezolana, el virus de la encefalitis equina del este, el virus de la encefalitis equina del oeste, el coronavirus asociado al SARS (SARS-CoV), el virus del Nilo Occidental, cualquier virus que provoque encefalitis.
En un aspecto, las células de empaquetamiento producen un retrovirus recombinante, por ejemplo, lentivirus, seudotipificado con la glucoproteína VSV-G.
Los términos "seudotipo" o "seudotipificación", tal como se usan en la presente descripción, se refieren a un virus cuyas proteínas de la envoltura viral se han sustituido por las de otro virus que posee características preferibles. Por ejemplo, el VIH puede seudotipificarse con proteínas de la envoltura de la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), lo que permite que el VIH infecte una gama más amplia de células porque las proteínas de la envoltura del VIH (codificadas por el gen env) normalmente dirigen el virus a las células que presentan CD4+. En un aspecto preferido, las proteínas de la envoltura lentiviral se seudotipifican con VSV-G. En un aspecto, las células de empaquetamiento producen un retrovirus recombinante, por ejemplo, lentivirus, seudotipificado con la glucoproteína de la envoltura VSV-G.
Como se usa en la presente descripción, el término "líneas celulares de empaquetamiento" se usa en referencia a líneas celulares que no contienen una señal de empaquetamiento, pero expresan de forma estable o transitoria proteínas estructurales virales y enzimas de replicación (por ejemplo, gag, pol y env) que son necesarios para el correcto empaquetamiento de las partículas virales. Puede emplearse cualquier línea celular adecuada para preparar células de empaquetamiento. Generalmente, las células son células de mamífero. En un aspecto particular, las células usadas para producir la línea celular de empaquetamiento son células humanas. Las líneas celulares adecuadas que pueden usarse incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células MDCK, células C3H 10T1/2, células FlY, células Psi-2, células BOSC 23, células PA317, células WEHI, células COS, células BSC 1, células BSC 40, células BMT 10, células VERO, células W138, células MRC5, células A549, células HT1080, células 293, células 293T, células B-50, células 3T3, células NIH3T3, células HepG2, células Saos-2, células Huh7, células HeLa, células W163, células 211 y células 211A. En aspectos preferidos, las células de empaquetamiento son células 293, células 293T o células A549. En otro aspecto preferido, las células son células A549.
Como se usa en la presente descripción, el término "línea celular productora" se refiere a una línea celular que es capaz de producir partículas retrovirales recombinantes, que comprende una línea celular de empaquetamiento y una construcción de vector de transferencia que comprende una señal de empaquetamiento. La producción de partículas virales infecciosas y soluciones concentradas virales puede realizarse mediante el uso de técnicas convencionales. Los métodos para preparar soluciones concentradas virales se conocen en la técnica y se ilustran, por ejemplo, por Y. Soneoka y otros (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, y N. R. Landau y otros, (l992) J. Virol.
66:5110-5113. Las partículas de virus infecciosos pueden recogerse de las células de empaquetamiento mediante el uso de técnicas convencionales. Por ejemplo, las partículas infecciosas pueden recogerse mediante lisis celular o recogida del sobrenadante del cultivo celular, como se conoce en la técnica. Opcionalmente, las partículas de virus recogidas pueden purificarse si se desea. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas de purificación adecuadas.
El suministro de un gen o genes u otra secuencia de polinucleótidos mediante el uso de un vector retroviral o lentiviral por medio de una infección viral en lugar de una transfección se denomina "transducción". En un aspecto, los vectores retrovirales se transducen en una célula mediante la infección y la integración de provirus. En determinados aspectos, una célula diana, por ejemplo, un linfocito T, se "transduce" si comprende un gen u otra secuencia de polinucleótidos suministrada a la célula por la infección mediante el uso de un vector viral o retroviral. En aspectos particulares, una célula transducida comprende uno o más genes u otras secuencias de polinucleótidos suministrados por un vector retroviral o lentiviral en su genoma celular.
En aspectos particulares, las células huésped transducidas con un vector viral que expresa uno o más polipéptidos se administran a un sujeto para tratar y/o prevenir una neoplasia de linfocitos B. Otros métodos relacionados con el uso de vectores virales en la terapia génica, que pueden usarse de acuerdo con determinados aspectos, pueden encontrarse en, por ejemplo, Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. y Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. y otros, (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. y otros, (2000) Curr. Opin. Lipidol.
11:179-86; Thule, P. M. y Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. y Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. y Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; y Lee, H. C. y otros, (2000) Nature 408:483-8.
G. Células genéticamente modificadas
En varios aspectos, se proporcionan células genéticamente modificadas para expresar los CAR contemplados en la presente descripción, para su uso en el tratamiento del cáncer. Como se usa en la presente descripción, el término "diseñado genéticamente" o "modificado genéticamente" se refiere a la adición de material genético adicional en forma de ADN o ARN al material genético total de una célula. Los términos "células modificadas genéticamente", "células modificadas" y "células redirigidas" se usan indistintamente. Como se usa en la presente descripción, el término "terapia génica" se refiere a la introducción de material genético adicional en forma de ADN o ARN en el material genético total en una célula que restaura, corrige o modifica la expresión de un gen, o con el propósito de expresar un polipéptido terapéutico, por ejemplo, un CAR.
En aspectos particulares, los CAR contemplados en la presente descripción se introducen y se expresan en las células efectoras inmunitarias para redirigir su especificidad a un antígeno diana de interés, por ejemplo, una glucoproteína que expresa STn. Una "célula efectora inmunitaria" es cualquier célula del sistema inmunitario que tiene una o más funciones efectoras (por ejemplo, actividad destructora de células citotóxicas, secreción de citocinas, inducción de ADCC y/o CDC). Las células efectoras inmunitarias ilustrativas contempladas en la presente descripción son linfocitos T, en particular linfocitos T citotóxicas (CTL; linfocitos T CD8+), TIL y linfocitos T colaboradores (HTL; linfocitos T c D4+). En un aspecto, las células efectoras inmunitarias incluyen células citolíticas naturales (NK). En un aspecto, las células efectoras inmunitarias incluyen linfocitos T citolíticos naturales (NKT). Las células efectoras inmunitarias pueden ser autólogas/autogénicas ("propias") o no autólogas ("no propias", por ejemplo, alogénicas, singénicas o xenogénicas).
"Autólogo", como se usa en la presente descripción, se refiere a células del mismo sujeto.
"Alogénico", como se usa en la presente descripción, se refiere a células de la misma especie que difieren genéticamente de la célula en comparación.
"Singénico", como se usa en la presente descripción, se refiere a células de un sujeto diferente que son genéticamente idénticas a la célula en comparación.
"Xenogénico", como se usa en la presente descripción, se refiere a células de una especie diferente a la célula en comparación. En aspectos preferidos, las células son alogénicas.
Las células efectoras inmunitarias ilustrativas usadas con los CAR contemplados en la presente descripción incluyen linfocitos T. Los términos "célula T" o "linfocito T" se reconocen en la técnica y pretenden incluir timocitos, linfocitos T inmaduros, linfocitos T maduros, linfocitos T en reposo o linfocitos T activados. Un linfocito T puede ser un linfocito T colaborador (Th), por ejemplo, un linfocito T colaborador 1 (Th1) o un linfocito T colaborador 2 (Th2). El linfocito T puede ser un linfocito T colaborador (HTL; linfocito T CD4+), un linfocito T CD4+, un linfocito T citotóxico (CTL; linfocito T CD8+), un linfocito T CD4+CD8+, un linfocito T CD4'CD8‘ o cualquier otro subconjunto de linfocitos T. Otras poblaciones ilustrativas de linfocitos T adecuados para su uso en aspectos particulares incluyen linfocitos T vírgenes y linfocitos T de memoria.
Como entenderá el experto en la técnica, también pueden usarse otras células como las células efectoras inmunitarias con los CAR como se describe en la presente descripción. En particular, las células efectoras inmunitarias también incluyen células NK, células NKT, neutrófilos y macrófagos. Las células efectoras inmunitarias también incluyen progenitores de células efectoras en donde tales células progenitoras pueden inducirse a diferenciarse en células efectoras inmunitarias in vivo o in vitro. Por lo tanto, en aspectos particulares, la célula efectora inmunitaria incluye progenitores de células efectoras inmunitarias tales como células madre hematopoyéticas (HSC) contenidas dentro de la población de células CD34+ derivadas de sangre del cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica movilizada que tras la administración en un sujeto se diferencian en células efectoras inmunitarias maduras, o que pueden inducirse in vitro para diferenciarse en células efectoras inmunitarias maduras.
Como se usa en la presente descripción, las células efectoras inmunitarias diseñadas genéticamente para contener un CAR específico a STn pueden denominarse "células efectoras inmunitarias redirigidas específicas a STn".
El término "célula CD34+", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa la proteína CD34 en su superficie celular. "CD34", como se usa en la presente descripción, se refiere a una glucoproteína de superficie celular (por ejemplo, proteína sialomucina) que a menudo actúa como factor de adhesión célula-célula y está implicada en la entrada de linfocitos T en los ganglios linfáticos. La población de células CD34+ contiene células madre hematopoyéticas (HSC), que al administrarse a un paciente se diferencian y contribuyen a todos los linajes hematopoyéticos, que incluyen linfocitos T, células NK, células NKT, neutrófilos y células del linaje de monocitos/macrófagos.
Los métodos para fabricar las células efectoras inmunitarias que expresan el CAR contemplados en la presente descripción se proporcionan en aspectos particulares. En un aspecto, el método comprende transfectar o transducir células efectoras inmunitarias aisladas de un individuo de modo que las células efectoras inmunitarias expresen uno o más CAR como se describe en la presente descripción. En determinados aspectos, las células efectoras inmunitarias se aíslan de un individuo y se modifican genéticamente sin manipulación adicional in vitro. A continuación, dichas células pueden volver a administrarse directamente al individuo. En otros aspectos, las células efectoras inmunitarias primero se activan y se estimulan para proliferar in vitro antes de modificarse genéticamente para expresar un CAR. En este sentido, las células efectoras inmunitarias pueden cultivarse antes y/o después de modificarse genéticamente (es decir, transducirse o transfectarse para expresar un CAR contemplado en la presente descripción).
En aspectos particulares, antes de la manipulación o la modificación genética in vitro de las células efectoras inmunitarias descritas en la presente descripción, la fuente de células se obtiene de un sujeto. En aspectos particulares, las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR comprenden linfocitos T.
En aspectos particulares, las PBMC pueden modificarse genéticamente directamente para expresar CAR mediante el uso de los métodos contemplados en la presente descripción. En determinados aspectos, después del aislamiento de PBMC, los linfocitos T se aíslan aún más y, en determinados aspectos, tanto los linfocitos T colaboradores como los citotóxicos pueden clasificarse en subpoblaciones de linfocitos T vírgenes, de memoria y efectores antes o después de la modificación y/o la expansión genética.
Las células efectoras inmunitarias, tales como los linfocitos T, pueden modificarse genéticamente después del aislamiento mediante el uso de métodos conocidos, o las células efectoras inmunitarias pueden activarse y expandirse (o diferenciarse en el caso de progenitores) in vitro antes de modificarse genéticamente. En un aspecto particular, las células efectoras inmunitarias, tales como los linfocitos T, se modifican genéticamente con los receptores quiméricos de antígenos contemplados en la presente descripción (por ejemplo, se transducen con un vector viral que comprende un ácido nucleico que codifica un CAR) y luego se activan y se expanden in vitro. En varios aspectos, los linfocitos T pueden activarse y expandirse antes o después de la modificación genética para expresar un CAR, mediante el uso de métodos como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos núms. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7, 144,575; 7,067,318; 7, 172,869; 7,232,566; 7, 175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20060121005.
En un aspecto, las células CD34+ se transducen con una construcción de ácido nucleico contemplada en la presente descripción. En determinados aspectos, las células CD34+ transducidas se diferencian en células efectoras inmunitarias maduras in vivo después de la administración a un sujeto, generalmente el sujeto del que se aislaron originalmente las células. En otro aspecto, las células CD34+ pueden estimularse in vitro antes de la exposición o después de modificarse genéticamente con un CAR como se describe en la presente descripción, con una o más de las siguientes citocinas: ligando Flt-3 (FLT3), factor de células madre (SCF), factor de diferenciación y crecimiento de megacariocitos (TPO), IL-3 e IL-6 de acuerdo con los métodos descritos anteriormente (Asheuer y otros, 2004; Imren, y otros, 2004).
En aspectos particulares, una población de células efectoras inmunitarias modificadas para el tratamiento del cáncer comprende un CAR como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, se prepara una población de células efectoras inmunitarias modificadas a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de un paciente diagnosticado con una neoplasia de linfocitos B descrita en la presente descripción (donantes autólogos). Las PBMC forman una población heterogénea de linfocitos T que pueden ser CD4+, CD8+ o CD4+ y CD8+.
Las PBMC también pueden incluir otros linfocitos citotóxicos, tales como células NK o células NKT. Un vector de expresión que porta la secuencia codificante de un CAR contemplado en la presente descripción puede introducirse en una población de linfocitos T, células NK o células NKT de un donante humano. En aspectos particulares, los linfocitos T transducidos con éxito que portan el vector de expresión pueden clasificarse mediante citometría de flujo para aislar los linfocitos T positivos para CD3 y luego propagarse para aumentar el número de estos linfocitos T que expresan proteína CAR además de la activación celular mediante el uso de anticuerpos anti-CD3 y/o anticuerpos anti-CD28 e IL-2 o cualquier otro método conocido en la técnica como se describe en otra parte en la presente descripción. Se usan procedimientos estándar para la crioconservación de linfocitos T que expresan los linfocitos T con proteína CAR para el almacenamiento y/o la preparación para su uso en un sujeto humano. En un aspecto, la transducción, el cultivo y/o la expansión in vitro de linfocitos T se realizan en ausencia de productos derivados de animales no humanos tales como suero de ternero fetal y suero bovino fetal. Dado que se modifica genéticamente una población heterogénea de PBMC, las células transducidas resultantes son una población heterogénea de células modificadas que comprenden una glucoproteína que expresa STn que se dirige a CAR como se contempla en la presente descripción.
En otro aspecto, puede usarse una mezcla de, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o más vectores de expresión diferentes para modificar genéticamente una población donante de células efectoras inmunitarias en donde cada vector codifica una proteína receptora quimérica de antígeno diferente como se contempla en la presente descripción. Las células efectoras inmunitarias modificadas resultantes forman una población mixta de células modificadas, con una proporción de células modificadas que expresan más de una proteína CAR diferente. H. Métodos de fabricación de linfocitos T
En varios aspectos, los linfocitos T modificados genéticamente se expanden por contacto con un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3 TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de los linfocitos T.
En aspectos particulares, las PBMC o los linfocitos T aislados se ponen en contacto con un agente estimulador y un agente coestimulador, tales como anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 solubles, o anticuerpos adheridos a una perla u otra superficie, en un medio de cultivo con citocinas apropiadas, tales como como IL-2, IL-7 y/o IL-15.
En aspectos particulares, las PBMC o los linfocitos T aislados se ponen en contacto con un agente estimulador y un agente coestimulador, tales como anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 solubles, o anticuerpos adheridos a una perla u otra superficie, en un medio de cultivo con citocinas apropiadas, tales como como IL-2, IL-7 y/o IL-15 y/o uno o más agentes que modulan una vía de señalización celular PI3K/Akt/mTOR.
En aspectos preferidos, los linfocitos T fabricados mediante los métodos contemplados en la presente descripción proporcionan composiciones de inmunoterapia adoptiva mejoradas. Sin desear estar atado a ninguna teoría en particular, se cree que las composiciones de linfocitos T fabricados por los métodos en aspectos particulares contemplados en la presente descripción están imbuidas de propiedades superiores, que incluyen una mayor supervivencia, expansión en ausencia relativa de diferenciación y persistencia in vivo. En un aspecto, un método para fabricar linfocitos T comprende poner en contacto las células con uno o más agentes que modulan una vía de señalización celular PI3K. En un aspecto, un método para fabricar linfocitos T comprende poner en contacto las células con uno o más agentes que modulan una vía de señalización celular PI3K/Akt/mTOR. En varios aspectos, los linfocitos T pueden obtenerse de cualquier fuente y ponerse en contacto con el agente durante las fases de activación y/o expansión del proceso de fabricación. Las composiciones de linfocitos T resultantes están enriquecidas en linfocitos T potentes desde el punto de vista del desarrollo que tienen la capacidad de proliferar y expresar uno o más de los siguientes biomarcadores: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197, CD38 y c D8. En un aspecto, las poblaciones de células que comprenden linfocitos T, que se han tratado con uno o más inhibidores de PI3K, se enriquecen para una población de linfocitos T CD8+ que coexpresan uno o más, o todos, los siguientes biomarcadores: CD62L, CD127, c D197 y CD38.
En un aspecto, las poblaciones de células que comprenden linfocitos T, que se han tratado con uno o más inhibidores de PI3K, se enriquecen para una población de linfocitos T CD8+ que coexpresan uno o más, o todos, los siguientes biomarcadores: CD62L, CD127, c D27 y CD8.
En un aspecto, se fabrican linfocitos T modificados que comprenden niveles mantenidos de proliferación y diferenciación disminuida. En un aspecto particular, los linfocitos T se fabrican mediante la estimulación de los linfocitos T para que se activen y proliferen en presencia de una o más señales estimuladoras y un agente que es un inhibidor de una vía de señalización celular PI3K.
A continuación, los linfocitos T pueden modificarse para expresar un CAR anti-STn. En un aspecto, los linfocitos T se modifican mediante la transducción de los linfocitos T con un vector viral que comprende un CAR anti-STn contemplado en la presente descripción. En determinado aspecto, los linfocitos T se modifican antes de la estimulación y la activación en presencia de un inhibidor de una vía de señalización celular PI3K. En otro aspecto, los linfocitos T se modifican después de la estimulación y la activación en presencia de un inhibidor de una vía de señalización celular PI3K. En un aspecto particular, los linfocitos T se modifican dentro de las 12 horas, 24 horas, 36 horas o 48 horas de estimulación y activación en presencia de un inhibidor de una vía de señalización celular PI3K. Después de activar los linfocitos T, las células se cultivan para proliferar. Los linfocitos T pueden cultivarse durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, al menos 2 semanas, al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses o más con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más rondas de expansión.
En varios aspectos, las composiciones de linfocitos T se fabrican en presencia de uno o más inhibidores de una vía de señalización celular PI3K/Akt/mTOR. Los inhibidores pueden tener como diana una o más actividades en la vía o una sola actividad. Sin pretender estar atado a ninguna teoría en particular, se contempla que el tratamiento o el contacto de linfocitos T con uno o más inhibidores de la vía PI3K durante las fases de estimulación, activación y/o expansión del proceso de fabricación preferentemente aumentan los linfocitos T jóvenes, lo que produce de este modo composiciones de linfocitos T terapéuticos superiores.
En un aspecto particular, se proporciona un método para aumentar la proliferación de linfocitos T que expresan un receptor de linfocitos T diseñado genéticamente. Dichos métodos pueden comprender, por ejemplo, recoger una fuente de linfocitos T de un sujeto, estimular y activar los linfocitos T en presencia de uno o más inhibidores de la vía PI3K, modificar los linfocitos T para expresar un CAR anti-STn, y expandir los linfocitos T en el cultivo.
En determinado aspecto, se contempla un método para producir poblaciones de linfocitos T enriquecidos para la expresión de uno o más de los siguientes biomarcadores: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197, CD38 y CD8. En un aspecto, los linfocitos T jóvenes comprenden uno o más, o todos los siguientes marcadores biológicos: CD62L, CD127, CD197 y CD38.
En un aspecto, los linfocitos T jóvenes comprenden uno o más, o todos los siguientes marcadores biológicos: CD62L, CD127, CD27 y CD8.
En un aspecto, los linfocitos T jóvenes carecen de expresión de CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3. Como se discute en otra en la presente descripción, los niveles de expresión de biomarcadores de linfocitos T jóvenes son relativos a los niveles de expresión de dichos marcadores en linfocitos T más diferenciados o poblaciones de células efectoras inmunitarias.
En un aspecto, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se usan como fuente de linfocitos T en los métodos de fabricación de linfocitos T contemplados en la presente descripción. Las PBMC forman una población heterogénea de linfocitos T que pueden ser CD4+, c D8+ o CD4+ y CD8+ y pueden incluir otras células mononucleares tales como monocitos, células B, células NK y células NKT. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un TCR o CAR diseñado genéticamente contemplado en la presente descripción puede introducirse en una población de linfocitos T, células NK o células NKT de donantes humanos. En un aspecto particular, los linfocitos T transducidos con éxito que portan el vector de expresión pueden clasificarse mediante el uso de la citometría de flujo para aislar los linfocitos T positivos para CD3 y luego propagarse para aumentar el número de linfocitos T modificados además de la activación celular mediante el uso de anticuerpos anti-CD3 y o anticuerpos anti-CD28 e IL-2, IL-7 y/o IL-15.
Los métodos de fabricación contemplados en la presente descripción pueden comprender además la crioconservación de linfocitos T modificados para su almacenamiento y/o preparación para su uso en un sujeto humano. En un aspecto, se proporciona un método para almacenar células efectoras inmunitarias que expresan proteína CAR humanizada, humana o murina modificada genéticamente que se dirigen a una glucoproteína que expresa STn que comprende crioconservar las células efectoras inmunitarias de modo que las células permanezcan viables tras la descongelación. Una fracción de las células efectoras inmunitarias que expresan las proteínas CAR puede crioconservarse mediante métodos conocidos en la técnica para proporcionar una fuente permanente de tales células para el tratamiento futuro de pacientes afectados con una glucoproteína que expresa STn expresada en una célula cancerosa. Los linfocitos T se crioconservan de modo que las células permanezcan viables tras la descongelación. Cuando sea necesario, las células efectoras inmunitarias transformadas crioconservadas pueden descongelarse, cultivarse y expandirse para obtener más células de este tipo. Como se usa en la presente descripción, "crioconservación" se refiere a la preservación de células enfriándolas a temperaturas bajo cero, tales como (típicamente) 77 K o -196 °C (el punto de ebullición del nitrógeno líquido). Los agentes crioprotectores a menudo se usan a temperaturas bajo cero para evitar que las células se dañen debido a la congelación a bajas temperaturas o al calentamiento a temperatura ambiente. Los agentes crioconservadores y las velocidades de enfriamiento óptimas pueden proteger contra el daño celular. Los agentes crioprotectores que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Lovelock y Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirrolidina (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576), y polietilenglicol (Sloviter y Ravdin, Nature, 1962; 196: 48). La velocidad de enfriamiento preferida es de 1° a 3° C/minuto. Después de al menos dos horas, los linfocitos T han alcanzado una temperatura de -80 °C y pueden colocarse directamente en nitrógeno líquido (-196 °C) para el almacenamiento permanente tal como en un recipiente de almacenamiento criogénico a largo plazo.
1. Linfocitos T
La fabricación de composiciones de linfocitos T con CAR mejorados se proporciona en aspectos particulares. Los linfocitos T usados para la producción de linfocitos T con CAR pueden ser autólogos/autogénicos ("propios") o no autólogos ("no propios", por ejemplo, alogénicos, singénicos o xenogénicos). En aspectos preferidos, los linfocitos T se obtienen de un sujeto mamífero. En un aspecto más preferido, los linfocitos T se obtienen de un primate. En el aspecto más preferido, los linfocitos T se obtienen de un sujeto humano.
Los linfocitos T pueden obtenerse de varias fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En determinados aspectos, los linfocitos T pueden obtenerse a partir de una unidad de sangre extraída de un sujeto mediante el uso de cualquier número de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como la sedimentación, por ejemplo, la separación FICOLL™. En un aspecto, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen por aféresis. El producto de aféresis típicamente contiene linfocitos, que incluyen linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En un aspecto, las células recogidas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un amortiguador o medio apropiado para el procesamiento posterior. Las células pueden lavarse con PBS o con otra solución adecuada que carezca de calcio, magnesio y la mayoría, si no todos los demás, cationes divalentes. Como apreciarán los expertos en la técnica, una etapa de lavado puede realizarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como mediante el uso de una centrífuga semiautomática de flujo continuo. Por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, el Baxter CytoMate o similares. Después del lavado, las células pueden resuspenderse en una variedad de amortiguadores biocompatibles u otra solución salina con o sin amortiguador. En determinados aspectos, los componentes indeseables de la muestra de aféresis pueden eliminarse directamente en los medios de cultivo de células resuspendidas.
En aspectos particulares, se usa una población de células que comprende linfocitos T, por ejemplo, PBMC, en los métodos de fabricación contemplados en la presente descripción. En otros aspectos, se usa una población aislada o purificada de linfocitos T en los métodos de fabricación contemplados en la presente descripción. Las células pueden aislarse a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante la lisis de los glóbulos rojos y el agotamiento de los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLL™. En algunos aspectos, después del aislamiento de PBMC, tanto los linfocitos T colaboradores como los citotóxicos pueden clasificarse en subpoblaciones de linfocitos T vírgenes, de memoria y efectores antes o después de la activación, la expansión y/o la modificación genética.
En aspectos particulares, se usa una población de células que comprende linfocitos T, por ejemplo, PBMC, en los métodos de fabricación contemplados en la presente descripción. En otros aspectos, se usa una población aislada o purificada de linfocitos T en los métodos de fabricación contemplados en la presente descripción. Las células pueden aislarse a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante la lisis de los glóbulos rojos y el agotamiento de los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLL™. En algunos aspectos, después del aislamiento de PBMC, tanto los linfocitos T colaboradores como los citotóxicos pueden clasificarse en subpoblaciones de linfocitos T vírgenes, de memoria y efectores antes o después de la activación, la expansión y/o la modificación genética.
En aspectos particulares, la población de células efectoras inmunitarias se fabrica a partir de PBMC que se modifican genéticamente para expresar los CAR mediante el uso de los métodos contemplados en la presente descripción, pero que no se someten a la selección positiva o negativa. En determinados aspectos, después del aislamiento de PBMC, los linfocitos T se aíslan más y, en determinados aspectos, tanto los linfocitos T colaboradores como los citotóxicos pueden clasificarse en subpoblaciones de linfocitos T vírgenes, de memoria y efectores antes o después de la modificación y/o la expansión genética.
En determinados aspectos, la subpoblación específica de linfocitos T que expresan uno o más de los siguientes marcadores: CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, CD127 y HlA-DR pueden aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. En un aspecto, una subpoblación específica de linfocitos T, que expresa uno o más de los marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en i) CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; ii) CD62L, CD127, CD197 y CD38 o iii) CD62L, CD127, CD27 y CD8, se aísla además mediante técnicas de selección positiva o negativa. En varios aspectos, las composiciones de linfocitos T fabricadas no expresan o no expresan sustancialmente uno o más de los siguientes marcadores: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3.
En un aspecto, la expresión de uno o más de los marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en i) CD62L, CD127, CD197 y CD38 o ii) CD62L, CD127, CD27 y CD8 aumenta al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, o más en comparación a una población de linfocitos T activados y expandidos sin un inhibidor de PI3K. En un aspecto, los linfocitos T comprenden linfocitos T CD8+. En un aspecto, la expresión de uno o más de los marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3 disminuye al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces o más en comparación con una población de linfocitos T activados y expandidos con un inhibidor de PI3K. En un aspecto, los linfocitos T comprenden linfocitos T CD8+.
En un aspecto, los métodos de fabricación contemplados en la presente descripción aumentan el número de linfocitos T con CAR que comprenden uno o más marcadores de linfocitos T vírgenes o potentes desde el punto de vista del desarrollo. Sin desear estar atado a ninguna teoría en particular, los presentes inventores creen que el tratamiento de una población de células que comprende linfocitos T con uno o más inhibidores de PI3K da como resultado un aumento y una expansión de linfocitos T potentes desde el punto de vista del desarrollo y proporciona una inmunoterapia con linfocitos T con CAR adoptiva más sólida y eficaz en comparación con las terapias con linfocitos T con CAR existentes.
Los ejemplos ilustrativos de marcadores de linfocitos T vírgenes o potentes desde el punto de vista del desarrollo aumentados en linfocitos T fabricados mediante el uso de los métodos contemplados en el presente incluyen, pero no se limitan a, i) CD62L, CD127, CD197 y CD38 o ii) CD62L, CD127, CD27 y CD8. En aspectos particulares, los linfocitos T vírgenes no expresan o no expresan sustancialmente uno o más de los siguientes marcadores: CD57, CD244, CD160, PD-1, BTLA, CD45RA, CTLA4, TIM3 y LAG3.
Con respecto a los linfocitos T, las poblaciones de linfocitos T resultantes de las diversas metodologías de expansión contempladas en la presente descripción pueden tener una variedad de propiedades fenotípicas específicas, en dependencia de las condiciones empleadas. En varios aspectos, las poblaciones de linfocitos T expandidos comprenden uno o más de los siguientes marcadores fenotípicos: CD62L, CD27, CD127, CD197, CD38, CD8 y HLA-DR.
En un aspecto, dichos marcadores fenotípicos incluyen una expresión potenciada de uno o más, o todos, CD62L, CD127, CD197 y CD38. En aspectos particulares, se expanden los linfocitos T CD8+ caracterizados por la expresión de marcadores fenotípicos de linfocitos T vírgenes que incluyen CD62L, CD127, CD197 y CD38.
En un aspecto, dichos marcadores fenotípicos incluyen una expresión potenciada de uno o más, o todos, CD62L, CD127, CD27 y CD8. En aspectos particulares, se expanden los linfocitos T CD8+ caracterizados por la expresión de marcadores fenotípicos de linfocitos T vírgenes que incluyen CD62L, CD127, CD27 y CD8.
En aspectos particulares, se expanden los linfocitos T caracterizados por la expresión de marcadores fenotípicos de linfocitos T de memoria central que incluyen CD45RO, CD62L, CD127, CD197 y CD38 y negativos para granzima B. En algunos aspectos, los linfocitos T de memoria central son linfocitos T CD45RO+, CD62L+, CD8+.
En determinados aspectos, se expanden los linfocitos T CD4+ caracterizados por la expresión de marcadores fenotípicos de células CD4+ vírgenes que incluyen CD62L y negativos para la expresión de CD45RA y/o CD45RO. En algunos aspectos, las células CD4+ se caracterizan por la expresión de marcadores fenotípicos de células de memoria central CD4+, que incluyen CD62L y CD45RO positivas. En algunos aspectos, las células efectoras CD4+ son CD62L positivas y CD45RO negativas.
En determinados aspectos, los linfocitos T se aíslan de un individuo y se activan y estimulan para que proliferen in vitro antes de modificarse genéticamente para expresar un CAR anti-STn. En este sentido, los linfocitos T pueden cultivarse antes y/o después de modificarse genéticamente (es decir, transducirse o transfectarse para expresar un CAR anti-STn contemplado en la presente descripción).
2. Activación y expansión
Con el fin de lograr dosis terapéuticas suficientes de composiciones de linfocitos T, los linfocitos T a menudo se someten a una o más rondas de estimulación, activación y/o expansión. Los linfocitos T pueden activarse y expandirse generalmente mediante el uso de métodos como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos núms. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514 y 6,867,041. Los linfocitos T modificados para expresar un CAR anti-STn pueden activarse y expandirse antes y/o después de que se modifiquen los linfocitos T. Además, los linfocitos T pueden ponerse en contacto con uno o más agentes que modulan una vía de señalización celular PI3K/Akt/mTOR antes, durante y/o después de la activación y/o la expansión. En un aspecto, los linfocitos T fabricados por los métodos contemplados en la presente descripción se someten a una, dos, tres, cuatro o cinco o más rondas de activación y expansión, cada una de las cuales puede incluir uno o más agentes que modulan una vía de señalización celular PI3K/Akt/mTOR.
Las células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) soportan el crecimiento ex vivo y la expansión a largo plazo de linfocitos T CD8 humanos funcionales sin necesidad de añadir citocinas exógenas, en contraste con el uso de APC naturales. En aspectos particulares, las PBMC o los linfocitos T aislados se ponen en contacto con un agente estimulador y un agente coestimulador, tales como anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, generalmente adheridos a una perla u otra superficie, en un medio de cultivo con citocinas apropiadas, tales como IL-2, IL-7 y/o IL-15.
En otros aspectos, la APC artificial (aAPC) se fabrica mediante el diseño genético de células K562, U937, 721.221, T2 y C1R para dirigir la expresión y la secreción estables de una variedad de moléculas coestimuladoras y citocinas. En un aspecto particular, las aAPC K32 o U32 se usan para dirigir la visualización de una o más moléculas estimuladoras basadas en anticuerpos en la superficie celular de AAPC. Las poblaciones de linfocitos T pueden expandirse mediante aAPC que expresan una variedad de moléculas coestimuladoras que incluyen, pero no se limitan a, CD137L (4-1BBL), CD134L (OX40L) y/o CD80 o CD86. Las aAPC proporcionan una plataforma eficaz para expandir los linfocitos T modificados genéticamente y mantener la expresión de CD28 en los linfocitos T CD8+. Las aAPC se proporcionan en los documentos núms. WO 03/057171 y US2003/0147869.
En un aspecto, se presenta un ligando coestimulador en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una aAPC, célula dendrítica, linfocito B y similares) que se une específicamente a una molécula coestimuladora afín en un linfocito T, que proporciona de este modo una señal que, además a la señal primaria proporcionada, por ejemplo, por la unión de un complejo TCR/CD3, media una respuesta deseada de linfocitos T. Los ligandos coestimuladores adecuados incluyen, pero no se limitan a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICa M), CD30L, c D40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3.
En un aspecto particular, un ligando coestimulador comprende un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente a una molécula coestimuladora presente en un linfocito T, que incluye, pero no se limita a, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83.
Los ligandos coestimuladores adecuados incluyen además antígenos diana, que pueden proporcionarse en forma soluble o expresarse en APC o aAPC que se unen a TCR diseñados genéticamente o CAR expresados en linfocitos T modificados.
En varios aspectos, un método para fabricar linfocitos T contemplado en la presente descripción comprende activar una población de células que comprende linfocitos T y expandir la población de linfocitos T. La activación de linfocitos T puede lograrse al proporcionar una señal de estimulación primaria a través del complejo TCR/CD3 de linfocitos T o mediante la estimulación de la proteína de superficie CD2 y al proporcionar una señal de coestimulación secundaria a través de una molécula accesoria, por ejemplo, CD28.
El complejo TCR/CD3 puede estimularse al poner en contacto el linfocito T con un agente de unión a CD3 adecuado, por ejemplo, un ligando de CD3 o un anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos CD3 incluyen, pero no se limitan a, OKT3, G19-4, BC3 y 64.1.
En otro aspecto, puede usarse un agente de unión a CD2 para proporcionar una señal de estimulación primaria a los linfocitos T. Los ejemplos ilustrativos de agentes de unión a CD2 incluyen, pero no se limitan a, ligandos de CD2 y anticuerpos anti-CD2, por ejemplo, el anticuerpo T11.3 en combinación con el anticuerpo T11.1 o T11.2 (Meuer, S. C. y otros (1984) Cell 36:897-906) y el anticuerpo 9.6 (que reconoce el mismo epítopo que TI 1.1) en combinación con el anticuerpo 9-1 (Yang, S. Y. y otros (1986) J. Immunol. 137:1097-1100). También pueden usarse otros anticuerpos que se unen a los mismos epítopos que cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. Pueden prepararse e identificarse anticuerpos adicionales, o combinaciones de anticuerpos, mediante técnicas estándar como se describe en otra parte en la presente descripción.
Además de la señal de estimulación primaria proporcionada a través del complejo TCR/CD3, o a través de CD2, la inducción de respuestas de linfocitos T requiere una segunda señal coestimuladora. En aspectos particulares, puede usarse un agente de unión a CD28 para proporcionar una señal coestimuladora. Los ejemplos ilustrativos de agentes de unión a CD28 incluyen, pero no se limitan a: ligandos naturales de CD28, por ejemplo, un ligando natural para CD28 (por ejemplo, un miembro de la familia de proteínas B7, tales como B7-1(CD80) y B7-2 (CD86); y anticuerpo monoclonal anti-CD28 o fragmento de este capaz de reticular la molécula CD28, por ejemplo, anticuerpos monoclonales 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2 y EX5.3D10.
En un aspecto, la molécula que proporciona la señal de estimulación primaria, por ejemplo, una molécula que proporciona estimulación a través del complejo TCR/CD3 o CD2, y la molécula coestimuladora se acoplan a la misma superficie.
En determinados aspectos, los agentes de unión que proporcionan señales estimuladoras y coestimuladoras se localizan en la superficie de una célula. Esto puede lograrse al transfectar o transducir una célula con un ácido nucleico que codifica el agente de unión en una forma adecuada para su expresión en la superficie celular o, alternativamente, al acoplar un agente de unión a la superficie celular.
En otro aspecto, la molécula que proporciona la señal de estimulación primaria, por ejemplo, una molécula que proporciona estimulación a través del complejo TCR/CD3 o CD2, y la molécula coestimuladora se muestran en las células presentadoras de antígeno.
En un aspecto, la molécula que proporciona la señal de estimulación primaria, por ejemplo, una molécula que proporciona estimulación a través del complejo TCR/CD3 o CD2, y la molécula coestimuladora se proporcionan en superficies separadas.
En determinado aspecto, uno de los agentes de unión que proporcionan señales estimuladoras y coestimuladoras es soluble (proporcionado en solución) y el(los) otro(s) agente(s) se proporciona(n) en una o más superficies.
En un aspecto particular, los agentes de unión que proporcionan señales estimuladoras y coestimuladoras se proporcionan en una forma soluble (proporcionados en solución).
En varios aspectos, los métodos para fabricar linfocitos T contemplados en la presente descripción comprenden la activación de linfocitos T con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28.
Las composiciones de linfocitos T fabricadas por los métodos contemplados en la presente descripción comprenden linfocitos T activados y/o expandidos en presencia de uno o más agentes que inhiben una vía de señalización celular PI3K. Los linfocitos T modificados para expresar un CAR anti-STn pueden activarse y expandirse antes y/o después de que se modifiquen los linfocitos T. En aspectos particulares, una población de linfocitos T se activa, se modifica para expresar un CAR anti-STn y luego se cultiva para su expansión.
En un aspecto, los linfocitos T fabricados por los métodos contemplados en la presente descripción comprenden un mayor número de linfocitos T que expresan marcadores indicativos de alto potencial proliferativo y la capacidad de autorrenovación pero que no expresan o expresan sustancialmente indetectable marcadores de diferenciación de linfocitos T. Estos linfocitos T pueden activarse repetidamente y expandirse de manera robusta y, por lo tanto, proporcionar una composición de linfocitos T terapéuticos mejorada.
En un aspecto, una población de linfocitos T activados y expandidos en presencia de uno o más agentes que inhiben una vía de señalización celular PI3K se expande al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 250 veces, al menos al menos 500 veces, al menos 1000 veces o más en comparación con una población de linfocitos T activados y expandidos sin un inhibidor de PI3K.
En un aspecto, una población de linfocitos T caracterizada por la expresión de linfocitos T jóvenes marcadores se activan y se expanden en presencia de uno o más agentes que inhiben una vía de señalización celular PI3K se expande al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, en al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos al menos 100 veces, al menos 250 veces, al menos 500 veces, al menos 1000 veces o más en comparación con la población de linfocitos T activados y expandidos sin un inhibidor de PI3K.
En un aspecto, expandir los linfocitos T activados por los métodos contemplados en la presente descripción comprende además cultivar una población de células que comprende linfocitos T durante varias horas (aproximadamente 3 horas) a de aproximadamente 7 días a aproximadamente 28 días o cualquier valor entero por hora en el medio. En otro aspecto, la composición de linfocitos T puede cultivarse durante 14 días. En un aspecto particular, los linfocitos T se cultivan durante aproximadamente 21 días. En otro aspecto, las composiciones de linfocitos T se cultivan durante aproximadamente 2-3 días. También pueden desearse varios ciclos de estimulación/activación/expansión de modo que el tiempo de cultivo de los linfocitos T pueda ser de 60 días o más. En aspectos particulares, las condiciones apropiadas para el cultivo de linfocitos T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, medio mínimo esencial o medio RPMI 1640 o X-vivo 15, (Lonza)) y uno o más factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, que incluyen, pero no se limitan a, al suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-y, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL-10, IL- 12, IL-15, TGFp y TNF-a o cualquier otro aditivo adecuado para el crecimiento de células conocido por el experto en la técnica.
Otros ejemplos ilustrativos de medios de cultivo celular incluyen, pero no se limitan a, RPMI 1640, Clicks, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o complementados con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de linfocitos T Los ejemplos ilustrativos de otros aditivos para la expansión de linfocitos T incluyen, pero no se limitan a, tensioactivo, piasmanato, amortiguadores de pH tales como HEPES y agentes reductores tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol.
Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se van a infundir en un sujeto. Las células diana se mantienen en las condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura adecuada (por ejemplo, 37 °C) y una atmósfera (por ejemplo, aire más 5 % de C02).
3. Agentes
En varios aspectos, se proporciona un método para fabricar linfocitos T que expande linfocitos T indiferenciados o potentes desde el punto de vista del desarrollo que comprende poner en contacto los linfocitos T con un agente que modula una vía PI3K en las células. En varios aspectos, se proporciona un método para fabricar linfocitos T que expande linfocitos T indiferenciados o potentes desde el punto de vista del desarrollo que comprende poner en contacto los linfocitos T con un agente que modula una vía PI3K/AKT/mTOR en las células. Las células pueden ponerse en contacto antes, durante y/o después de la activación y la expansión. Las composiciones de linfocitos T retienen suficiente potencia de linfocitos T de modo que puedan experimentar múltiples rondas de expansión sin un aumento sustancial en la diferenciación.
Como se usa en la presente descripción, los términos "modular", "modulador" o "agente modulador" o un término comparable se refieren a la capacidad de un agente para provocar un cambio en una vía de señalización celular. Un modulador puede aumentar o disminuir una cantidad, la actividad de un componente de la vía o aumentar o disminuir un efecto o resultado deseado de una vía de señalización celular. En un aspecto, el modulador es un inhibidor. En otro aspecto, el modulador es un activador.
Un "agente" se refiere a un compuesto, molécula pequeña, por ejemplo, molécula orgánica pequeña, ácido nucleico, polipéptido o un fragmento, isoforma, variante, análogo o derivado de este usado en la modulación de una vía PI3K/AKT/mTOR.
Una "molécula pequeña" se refiere a una composición que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD, menos de aproximadamente 4 kD, menos de aproximadamente 3 kD, menos de aproximadamente 2 kD, menos de aproximadamente 1 kD o menos de aproximadamente 5kD. Las moléculas pequeñas pueden comprender ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, peptoides, carbohidratos, lípidos, componentes de estos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas. Las colecciones de mezclas químicas y/o biológicas, tales como extractos fúngicos, bacterianos o de algas, se conocen en la técnica y pueden examinarse con cualquiera de los ensayos. Pueden encontrarse ejemplos de métodos para la síntesis de colecciones moleculares en: (Carell y otros, 1994a; Carell y otros, 1994b; Cho y otros, 1993; DeWitt y otros, 1993; Gallop y otros, 1994; Zuckerman y otros, 1994).
Un "análogo" se refiere a un compuesto orgánico pequeño, un nucleótido, una proteína o un polipéptido que posee actividad o funciones similares o idénticas a las del compuesto, nucleótido, proteína o polipéptido o compuesto que tiene la actividad deseada, pero no necesita necesariamente comprender una secuencia o estructura que sea similar o idéntica a la secuencia o estructura del aspecto preferido.
Un "derivado" se refiere a un compuesto, una proteína o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido original que se ha alterado mediante la introducción de sustituciones, eliminaciones o adiciones de residuos de aminoácidos, o un ácido nucleico o nucleótido que se ha modificado por la introducción de sustituciones o eliminaciones de nucleótidos, adiciones o mutaciones. El ácido nucleico, nucleótido, proteína o polipéptido derivado posee una función similar o idéntica a la del polipéptido original.
En varios aspectos, el agente que modula una vía PI3K activa un componente de la vía. Un "activador" o "agonista" se refiere a un agente que promueve, aumenta o induce una o más actividades de una molécula en una vía PI3K/AKT/mTOR que incluye, sin limitación, una molécula que activa una o más actividades de una PI3K.
En varios aspectos, el agente que modula una vía PI3K inhibe un componente de la vía. Un "inhibidor" o "antagonista" se refiere a un agente que inhibe, disminuye o reduce una o más actividades de una molécula en una vía PI3K/AKT/mTOR que incluye, sin limitación, una molécula que inhibe una o más actividades de una PI3K. En un aspecto, el inhibidor es un inhibidor doble de una molécula. En un aspecto particular, el inhibidor puede inhibir una clase de moléculas que tienen actividades iguales o sustancialmente similares (un inhibidor pan) o puede inhibir específicamente la actividad de una molécula (un inhibidor selectivo o específico). La inhibición también puede ser irreversible o reversible.
En un aspecto, el inhibidor tiene una IC50 de al menos 1 nM, al menos 2 nM, al menos 5 nM, al menos 10 nM, al menos 50 nM, al menos 100 nM, al menos 200 nM, al menos 500 nM, al menos 1 j M, al menos 10 j M, al menos 50 j M o al menos 100 j M. Las determinaciones de IC50 pueden lograrse mediante el uso de cualquier técnica convencional conocida en la técnica. Por ejemplo, una IC50 puede determinarse al medir la actividad de una enzima dada en presencia de un intervalo de concentraciones del inhibidor en estudio. Los valores de actividad enzimática obtenidos experimentalmente se representan luego frente a las concentraciones de inhibidor usadas. La concentración del inhibidor que muestra una actividad enzimática del 50 % (en comparación con la actividad en ausencia de cualquier inhibidor) se toma como el valor "IC50". Análogamente, pueden definirse otras concentraciones inhibidoras mediante determinaciones de actividad apropiadas.
En varios aspectos, los linfocitos T se ponen en contacto, se tratan o se cultivan con uno o más moduladores de una vía PI3K/AKT/mTOR a una concentración de al menos 1 nM, al menos 2 nM, al menos 5 nM, al menos 10 nM, al menos 50 nM, al menos 100 nM, al menos 200 nM, al menos 500 nM, al menos 1 j M, al menos 10 j M, al menos 50 j M, al menos 100 j M o al menos 1 M.
En aspectos particulares, los linfocitos T pueden ponerse en contacto o tratarse o cultivarse con uno o más moduladores de una vía PI3K/AKT/mTOR durante al menos 12 horas, 18 horas, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, al menos 2 semanas, al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses o más con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más rondas de expansión.
La vía de la fosfatidil-inositol-3 cinasa/Akt/diana de la rapamicina en mamíferos sirve como un conducto para integrar la señalización del factor de crecimiento con la proliferación celular, la diferenciación, el metabolismo y la supervivencia. Las PI3K son una familia de cinasas de lípidos intracelulares altamente conservadas. Las PI3K de clase IA son activadas por tirosina cinasas receptoras del factor de crecimiento (RTK), ya sea directamente o a través de la interacción con la familia de moléculas adaptadoras del sustrato del receptor de insulina. Esta actividad da como resultado la producción de fosfatidil-inositol-3,4,5-trifosfato (PIP3), un regulador de la serina/treonina cinasa Akt. La mTOR actúa a través de la vía PI3K canónica a través de 2 complejos distintos, cada uno caracterizado por diferentes parejas de unión que confieren actividades distintas. La mTORC1 (mTOR en complejo con PRAS40, raptor y mLST8/GbL) actúa como un efector posterior de la señalización de PI3K/Akt, al vincular las señales del factor de crecimiento con la traducción de proteínas, el crecimiento celular, la proliferación y la supervivencia. La mTORC2 (mTOR en complejo con rictor, mSIN1, protor y mLST8) actúa como un activador anterior de Akt.
Tras la activación de PI3K mediada por el receptor del factor de crecimiento, Akt se recluta en la membrana a través de la interacción de su dominio de homología pleckstrina con PIP3, lo que expone de este modo su ciclo de activación y permite la fosforilación en la treonina 308 (Thr308) por la proteína cinasa dependiente de fosfoinositido constitutivamente activa 1 (PDK1). Para una activación máxima, Akt también se fosforila por mTORC2, en la serina 473 (Ser473) de su motivo hidrófobo en el extremo C. También se ha demostrado que DNA-PK y HSP son importantes en la regulación de la actividad de Akt. La Akt activa mTORC1 a través de la fosforilación inhibidora de TSC2, que junto con TSC1 regula negativamente mTORC1 al inhibir Rheb GTPasa, un regulador positivo de mTORC1. La mTORC1 tiene 2 sustratos bien definidos, p70S6K (en adelante, S6K1) y 4E-BP1, los cuales regulan de manera crítica la síntesis de proteínas. Por lo tanto, mTORC1 es un importante efector posterior de PI3K, que vincula la señalización del factor de crecimiento con la traducción de proteínas y la proliferación celular.
a. Inhibidores de PI3K
Como se usa en la presente descripción, el término "inhibidor de PI3K" se refiere a un ácido nucleico, péptido, compuesto o molécula orgánica pequeña que se une e inhibe al menos una actividad de PI3K. Las proteínas PI3K pueden dividirse en tres clases, PI3K de clase 1, PI3K de clase 2 y PI3K de clase 3. Las PI3K de clase 1 existen como heterodímeros que consisten en una de cuatro subunidades catalíticas p110 (p110a, p100p, p1105 y p100Y) y una de dos familias de subunidades reguladoras. En aspectos particulares, un inhibidor de PI3K se dirige preferentemente a los inhibidores de PI3K de clase 1. En un aspecto, un inhibidor de PI3K mostrará selectividad por una o más isoformas de los inhibidores de PI3K de clase 1 (es decir, selectividad por p110a, p100p, p1105 y p110Y o uno o más de p110a, p110p, p1105 y p110Y). En otro aspecto, un inhibidor de PI3K no mostrará selectividad de isoformas y se considerará un "inhibidor pan-PI3K". En un aspecto, un inhibidor de PI3K competirá por la unión con ATP al dominio catalítico de PI3K.
En determinados aspectos, un inhibidor de PI3K puede, por ejemplo, dirigirse a PI3K así como también a proteínas adicionales en la vía PI3K-AKT-mTOR. En aspectos particulares, un inhibidor de PI3K que se dirige tanto a mTOR como a PI3K puede denominarse un inhibidor de mTOR o un inhibidor de PI3K. Un inhibidor de PI3K que solo se dirige a PI3K puede denominarse inhibidor selectivo de PI3K. En un aspecto, puede entenderse que un inhibidor selectivo de PI3K se refiere a un agente que muestra una concentración inhibidora del 50 % con respecto a PI3K que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces, o más, inferior a la IC50 del inhibidor con respecto a mTOR y/u otras proteínas en la vía.
En un aspecto particular, los inhibidores de PI3K ilustrativos inhiben PI3K con una IC50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferentemente aproximadamente 100 nm o menos, incluso con mayor preferencia aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 j i M, 50 j i M, 25 j i M, 10 j i M, 1 j i M o menos. En un aspecto, un inhibidor de PI3K inhibe PI3K con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nm, con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM
Los ejemplos ilustrativos de inhibidores de PI3K adecuados para su uso en los métodos de fabricación de linfocitos T contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, BKM120 (inhibidor de PI3K de clase 1, Novartis), XL147 (inhibidor de PI3K de clase 1, Exelixis), (inhibidor de pan-PI3K, GlaxoSmithKline) y PX-866 (inhibidor de PI3K de clase 1; isoformas p110a, p100p y p110Y, Oncothyreon).
Otros ejemplos ilustrativos de inhibidores selectivos de PI3K incluyen, pero no se limitan a, BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, ZSTK474 e IPI-145.
Otros ejemplos ilustrativos de inhibidores de pan-PI3K incluyen, pero no se limitan a, BEZ235, LY294002, GSK1059615, TG100713 y GDC-0941.
En un aspecto preferido, el inhibidor de PI3K es ZSTK474.
b. Inhibidores de AKT
Como se usa en la presente descripción, el término "inhibidor de AKT" se refiere a un ácido nucleico, péptido, compuesto o molécula orgánica pequeña que inhibe al menos una actividad de AKT. Los inhibidores de AKT pueden agruparse en varias clases, que incluyen los inhibidores basados en lípidos (por ejemplo, inhibidores que se dirigen al dominio de homología pleckstrina de AKT que evita que AKT se localice en las membranas plasmáticas), inhibidores competitivos de ATP e inhibidores alostéricos. En un aspecto, los inhibidores de AKT actúan mediante la unión al sitio catalítico de AKT. En un aspecto particular, los inhibidores de Akt actúan mediante la inhibición de la fosforilación de las dianas de AKT posteriores, tales como mTOR. En otro aspecto, la actividad de AKT se inhibe al inhibir las señales de entrada para activar Akt al inhibir, por ejemplo, la activación de AKT por ADN-PK, la activación de AKT por PDK-1 y/o la activación de Akt por mTORC2.
Los inhibidores de AKT pueden dirigirse a las tres isoformas de AKT, AKT1, AKT2, AKT3 o pueden ser selectivos de isoforma y dirigirse solo a una o dos de las isoformas de AKT. En un aspecto, un inhibidor de AKT puede dirigirse a AKT así como también a proteínas adicionales en la vía PI3K-AKT-mTOR. Un inhibidor de AKT que solo se dirige a AKT puede denominarse inhibidor selectivo de AKT. En un aspecto, puede entenderse que un inhibidor selectivo de AKT se refiere a un agente que presenta una concentración inhibidora del 50 % con respecto a AKT que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces, o más bajo que la IC50 del inhibidor con respecto a otras proteínas en la vía.
En un aspecto particular, los inhibidores de AKT ilustrativos inhiben AKT con una IC50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferentemente aproximadamente 100 nm o menos, incluso con mayor preferencia aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 jiM, 50 jiM, 25 jiM, 10 jiM, 1 jiM o menos. En un aspecto, una AKT inhibe la AKT con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nm, con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
Los ejemplos ilustrativos de inhibidores de AKT para su uso en combinación con conjugados de fármaco-anticuerpo basados en auristatina incluyen, por ejemplo, perifosina (Keryx), MK2206 (Merck), VQD-002 (VioQuest), XL418 (Exelixis), GSK690693, GDC-0068 y PX316 (PROLX Pharmaceuticals).
Un ejemplo ilustrativo no limitante de un inhibidor selectivo de Akt1 es A-674563.
Un ejemplo ilustrativo no limitante de un inhibidor selectivo de Akt2 es CCT128930.
En aspectos particulares, la activación de Akt por DNA-PK del inhibidor de Akt, la activación de Akt por PDK-1, la activación de Akt por mTORC2 o la activación de Akt por HSP.
Los ejemplos ilustrativos de inhibidores de DNA-PK incluyen, pero no se limitan a, NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75 y PP-121.
c. Inhibidores de mTOR
Los términos "inhibidor de mTOR" o "agente que inhibe mTOR" se refieren a un ácido nucleico, péptido, compuesto 0 molécula orgánica pequeña que inhibe al menos una actividad de una proteína mTOR, tal como, por ejemplo, la actividad de serina/treonina proteína cinasa sobre al menos uno de sus sustratos (por ejemplo, p70S6 cinasa 1, 4E-BP1, AKT/PKB y eEF2). Los inhibidores de mTOR pueden unirse directamente e inhibir mTORC1, mTORC2 o ambos, mTORC1 y mTORC2.
La inhibición de la actividad de mTORC1 y/o mTORC2 puede determinarse mediante una reducción en la transducción de señales de la vía PI3K/Akt/mTOR. Puede usarse una amplia variedad de lecturas para establecer una reducción de la salida de dicha vía de señalización. Algunas lecturas ilustrativas no limitantes incluyen (1) una disminución en la fosforilación de Akt en los residuos, que incluyen, pero no se limitan a, 5473 y T308; (2) una disminución en la activación de Akt como se evidencia, por ejemplo, por una reducción de la fosforilación de sustratos de Akt que incluyen pero no se limitan a Fox0l/O3a T24/32, GSK3a/p; S21/9 y TSC2 T1462; (3) una disminución en la fosforilación de las moléculas de señalización posterior de mTOR, que incluyen, pero no se limitan a, S6 S240/244 ribosomal, 70S6K T389 y 4EBP1 T37/46; y (4) una inhibición de la proliferación de células cancerosas.
En un aspecto, los inhibidores de mTOR son inhibidores del sitio activo. Estos son inhibidores de mTOR que se unen al sitio de unión de ATP (también conocido como bolsillo de unión de ATP) de mTOR e inhiben la actividad catalítica de mTORCI y mTORC2. Una clase de inhibidores del sitio activo adecuados para su uso en los métodos de fabricación de linfocitos T contemplados en la presente descripción son los inhibidores de doble especificidad que se dirigen e inhiben directamente tanto PI3K como mTOR. Los inhibidores de doble especificidad se unen tanto al sitio de unión de ATP de mTOR como a PI3K. Los ejemplos ilustrativos de dichos inhibidores incluyen, pero no se limitan a: imidazoquinazolinas, wortmannina, LY294002, PI-103 (Cayman Chemical), SF1126 (Semafore), BGT226 (Novartis), XL765 (Exelixis) y NVP-BEZ235 (Novartis).
Otra clase de inhibidores del sitio activo de mTOR adecuados para su uso en los métodos contemplados en la presente descripción inhiben selectivamente la actividad de mTORC1 y mTORC2 en relación con una o más fosfatidilinositol 3-cinasas de tipo I, por ejemplo, PI3 cinasa a, p, y o 8. Estos inhibidores del sitio activo se unen al sitio activo de mTOR pero no a PI3K. Los ejemplos ilustrativos de dichos inhibidores incluyen, pero no se limitan a: pirazolopirimidinas, Torinl (Guertin y Sabatini), PP242 (2-(4-amino-1-isopropiMH-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)-1H-indol-5-ol), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth) y AZD8055 (Liu y otros, Nature Review, 8, 627-644, 2009). I
En un aspecto, un inhibidor selectivo de mTOR se refiere a un agente que muestra una concentración inhibidora del 50 % (IC50) con respecto a mTORCI y/o mTORC2, que es al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 1000 veces, o más, menor que la IC50 del inhibidor con respecto a una, dos, tres o más PI3-cinasas de tipo I o a todas las PI3-cinasas de tipo I.
Otra clase de inhibidores de mTOR para su uso en aspectos particulares se denominan en la presente descripción "rapálogos". Como se usa en la presente descripción, el término "rapálogos" se refiere a los compuestos que se unen específicamente al dominio FRB de mTOR (dominio de unión a rapamicina FKBP), están relacionados estructuralmente con la rapamicina y retienen las propiedades inhibidoras de mTOR. El término rapálogos excluye la rapamicina. Los rapálogos incluyen ésteres, éteres, oximas, hidrazonas e hidroxilaminas de rapamicina, así como también compuestos en los que se han modificado los grupos funcionales de la estructura central de la rapamicina, por ejemplo, por reducción u oxidación. Las sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos también se consideran derivados de la rapamicina. Los ejemplos ilustrativos de los rapálogos adecuados para su uso en los métodos contemplados en la presente descripción incluyen, sin limitación, temsirolimus (CC1779), everolimus (RAD001), deforolimus (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca) y OSI-027 (OSI).
En un aspecto, el agente es el inhibidor de rapamicina mTOR (sirolimus).
En un aspecto particular, los inhibidores de mTOR ilustrativos inhiben mTORC1, mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 con una IC50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferentemente aproximadamente 100 nm o menos, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 |j M, 50 |j M, 25 |j M, 10 |j M, 1 |j M o menos. En un aspecto, un inhibidor de mTOR inhibe mTORC1, mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nm, con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
En un aspecto, los inhibidores de mTOR ilustrativos inhiben PI3K y mTORC1 o mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 y PI3K con una IC50 (concentración que inhibe el 50 % de la actividad) de aproximadamente 200 nM o menos, preferentemente de aproximadamente 100 nm o menos, incluso con mayor preferencia aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, 100 jiM, 50 jiM, 25 jiM, 10 jiM, 1 jiM o menos. En un aspecto, un inhibidor de mTOR inhibe PI3K y mTORC1 o mTORC2 o tanto mTORC1 como mTORC2 y PI3K con una IC50 de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 100 nm, con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 15 nM.
Otros ejemplos ilustrativos de inhibidores de mTOR adecuados para su uso en aspectos particulares incluyen, pero no se limitan a, AZD8055, INK128, rapamicina, PF-04691502 y everolimus.
Se ha demostrado que mTOR demuestra una actividad catalítica sólida y específica hacia las proteínas del sustrato fisiológico, la proteína cinasa ribosomal I p70 S6 (p70S6K1) y la proteína de unión a eIF4E 1 (4EBP1) según lo medido por anticuerpos específicos a fósforo en inmunotransferencia.
En un aspecto, el inhibidor de la vía PI3K/AKT/mTOR es un inhibidor de la cinasa s6 que se selecciona del grupo que consiste en: BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK y AT7867.
I. Composiciones y formulaciones
Las composiciones contempladas en la presente descripción pueden comprender uno o más polipéptidos, polinucleótidos, vectores que los comprenden, células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente, etc., como se contempla en la presente descripción. Las composiciones incluyen, pero no se limitan a, composiciones farmacéuticas. Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición formulada en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para la administración a una célula o un animal, ya sea sola o en combinación con una o más modalidades de terapia. También se entenderá que, si se desea, las composiciones también pueden administrarse en combinación con otros agentes, tales como, por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, moléculas pequeñas, agentes quimioterapéuticos, profármacos, fármacos, anticuerpos u otros diversos agentes farmacéuticamente activos. Prácticamente no hay límite para otros componentes que también pueden incluirse en las composiciones, siempre que los agentes adicionales no afecten negativamente a la capacidad de la composición para administrar la terapia prevista.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente descripción para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosis que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin una excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación razonable de beneficio/riesgo.
Como se usa en la presente descripción, "portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye, pero no se limita a, cualquier adyuvante, portador, excipiente, deslizante, agente edulcorante, diluyente, conservante, tinte/colorante, potenciador del sabor, tensioactivo, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, estabilizador, agente isotónico, disolvente, tensioactivo o emulsionante que se ha aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos como aceptable para su uso en humanos o animales domésticos. Los portadores farmacéuticamente aceptables ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; la celulosa y sus derivados, tales como la carboximetilcelulosa de sodio, la etilcelulosa y el acetato de celulosa; tragacanto; malta; gelatina; talco; manteca de cacao, ceras, grasas animales y vegetales, parafinas, siliconas, bentonitas, ácido silícico, óxido de zinc; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones amortiguador de fosfato; y cualquier otra sustancia compatible empleada en formulaciones farmacéuticas.
En aspectos particulares, las composiciones comprenden una cantidad de células efectoras inmunitarias que expresan CAR contempladas en la presente descripción. Como se usa en la presente descripción, el término "cantidad" se refiere a "una cantidad eficaz" o "una eficaz cantidad" de una célula terapéutica modificada genéticamente, por ejemplo, un linfocito T, para lograr un resultado terapéutico o profiláctico beneficioso o deseado, que incluyen los resultados clínicos.
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una célula terapéutica genéticamente modificada eficaz para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz es menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una célula terapéutica modificada genéticamente puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de las células madre y progenitoras para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del virus o de las células terapéuticas transducidas se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" incluye una cantidad que es eficaz para "tratar" a un sujeto (por ejemplo, un paciente). Cuando se indica una cantidad terapéutica, un médico puede determinar la cantidad precisa de las composiciones a administrar al tener en cuenta las diferencias individuales de la edad, el peso, el tamaño del tumor, la extensión de la infección o las metástasis y el estado del paciente (sujeto). En general, puede afirmarse que una composición farmacéutica que comprende los linfocitos T descritos en la presente descripción puede administrarse a una dosis de 102 a 1010 células/kg de peso corporal, preferentemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal, que incluyen todos los valores enteros dentro de esos intervalos. El número de células dependerá del uso final para el que se pretenda la composición, al igual que el tipo de células incluidas en la misma. Para los usos proporcionados en la presente descripción, las células generalmente tienen un volumen de un litro o menos, pueden ser de 500 ml o menos, incluso de 250 ml o 100 ml o menos. Por lo tanto, la densidad de las células deseadas es típicamente superior a 106 células/ml y generalmente es superior a 107 células/ml, generalmente 108 células/ml o superior. El número clínicamente relevante de células inmunitarias puede repartirse en infusiones múltiples que acumulativamente igualan o superan 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 o 1012 células. En algunos aspectos, particularmente debido a que todas las células infundidas se redirigirán a un antígeno diana particular, pueden administrarse cantidades más bajas de células, en el intervalo de 106/kilogramo (106-1011 por paciente). Las composiciones de células que expresan CAR pueden administrarse múltiples veces en dosis dentro de estos intervalos. Las células pueden ser alogénicas, singénicas, xenogénicas o autólogas del paciente que se somete a la terapia. Si se desea, el tratamiento también puede incluir la administración de mitógenos (por ejemplo, PHA) o linfocinas, citocinas y/o quimiocinas (por ejemplo, IFN-y, IL-2, IL-12, TNF-alfa, IL-18 y TNF-beta, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1a, etc.) como se describe en la presente descripción para potenciar la inducción de la respuesta inmunitaria.
En general, las composiciones que comprenden las células activadas y expandidas como se describe en la presente descripción pueden usarse en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en individuos inmunocomprometidos. En particular, las composiciones que comprenden los linfocitos T modificados con CAR contemplado en la presente descripción se usan en el tratamiento del cáncer. En aspectos particulares, los linfocitos T modificados con CAR pueden administrarse solos o como una composición farmacéutica en combinación con portadores, diluyentes, excipientes y/o con otros componentes, tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares. En aspectos particulares, las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad de linfocitos T genéticamente modificados, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden una población de células efectoras inmunitarias que expresan CAR, tales como linfocitos T, pueden comprender amortiguadores, tales como solución salina amortiguada neutra, solución salina amortiguada con fosfato y similares; carbohidratos, tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos, tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes, tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. En aspectos particulares, las composiciones se formulan preferentemente para la administración parenteral, por ejemplo, la administración intravascular (intravenosa o intraarterial), intraperitoneal o intramuscular.
Las composiciones farmacéuticas líquidas, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético; amortiguadores, tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. Una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.
En un aspecto, las composiciones de linfocitos T contempladas en la presente descripción se formulan en un medio de cultivo celular farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones son adecuadas para la administración a sujetos humanos. En aspectos particulares, el medio de cultivo celular farmacéuticamente aceptable es un medio sin suero.
El medio sin suero tiene varias ventajas sobre el medio que contiene suero, que incluyen una composición simplificada y mejor definida, un grado reducido de contaminantes, la eliminación de una fuente potencial de agentes infecciosos y un costo más bajo. En varios aspectos, el medio sin suero no tiene animales y, opcionalmente, puede estar sin proteínas. Opcionalmente, el medio puede contener proteínas recombinantes biofarmacéuticamente aceptables. El medio "sin animales" se refiere a un medio en donde los componentes se derivan de fuentes no animales. Las proteínas recombinantes reemplazan las proteínas animales naturales en un medio sin animales y los nutrientes se obtienen de fuentes sintéticas, vegetales o microbianas. El medio "sin proteínas", por el contrario, se define como sustancialmente libre de proteínas.
Los ejemplos ilustrativos de medios sin suero usados en las composiciones particulares incluyen, pero no se limitan a, QBSF-60 (Quality Biological, Inc.), StemPro-34 (Life Technologies) y X-VIVO 10.
En un aspecto preferido, las composiciones que comprenden linfocitos T contempladas en la presente descripción se formulan en una solución que comprende PlasmaLyte A.
En otro aspecto preferido, las composiciones que comprenden linfocitos T contempladas en la presente descripción se formulan en una solución que comprende un medio de crioconservación. Por ejemplo, pueden usarse medios de crioconservación con agentes de crioconservación para mantener un resultado de alta viabilidad celular después de la descongelación. Los ejemplos ilustrativos de medios de crioconservación usados en las composiciones particulares incluyen, pero no se limitan a, CryoStor CS10, CryoStor CS5 y CryoStor CS2.
En un aspecto más preferido, las composiciones que comprenden linfocitos T contempladas en la presente descripción se formulan en una solución que comprende 50:50 de PlasmaLyte A y CryoStor CS10.
En un aspecto particular, las composiciones comprenden una cantidad eficaz de células efectoras inmunitarias que expresan CAR, solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. Por tanto, las composiciones de células efectoras inmunitarias que expresan CAR pueden administrarse solas o en combinación con otros tratamientos contra el cáncer conocidos, tales como radioterapia, quimioterapia, trasplante, inmunoterapia, terapia hormonal, terapia fotodinámica, etc. Las composiciones también pueden administrarse en combinación con antibióticos Dichos agentes terapéuticos pueden aceptarse en la técnica como un tratamiento estándar para un estado de enfermedad particular como se describe en la presente descripción, tal como un cáncer particular. Los agentes terapéuticos ilustrativos contemplados incluyen citocinas, factores de crecimiento, esteroides, AINE, DMARD, antiinflamatorios, agentes quimioterapéuticos, radioterapéuticos, anticuerpos terapéuticos u otros agentes activos y auxiliares.
En determinados aspectos, las composiciones que comprenden las células efectoras inmunitarias que expresan CAR descritas en la presente descripción pueden administrarse junto con cualquier número de agentes quimioterapéuticos. Los ejemplos ilustrativos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tales como aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinán; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOl®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados del ácido retinoico tales como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™ (alitretinoína), ONTAK™ (denileukin diftitox), esperamicinas, capecitabina y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre el cáncer, tales como los antiestrógenos, que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, aromatasa que inhibe 4(5)-imidazoles, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Puede usarse una variedad de otros agentes terapéuticos junto con las composiciones descritas en la presente descripción. En un aspecto, la composición que comprende células efectoras inmunitarias que expresan CAR se administra con un agente antiinflamatorio. Los agentes o los fármacos antiinflamatorios incluyen, pero no se limitan a, esteroides y glucocorticoides (que incluyen betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) que incluyen aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato.
Otros AINE ilustrativos se eligen del grupo que consiste en ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inhibidores de Cox-2 tales como VIOXX® (rofecoxib) y CELEBREX® (celecoxib), y sialilatos. Los analgésicos ilustrativos se eligen del grupo que consiste en acetaminofeno, oxicodona, tramadol o clorhidrato de proporxifeno. Los glucocorticoides ilustrativos se eligen del grupo que consiste en cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. Los modificadores de la respuesta biológica ilustrativos incluyen moléculas dirigidas contra marcadores de la superficie celular (por ejemplo, CD4, CD5, etc.), inhibidores de citocinas, tales como los antagonistas del TNF (por ejemplo, etanercept (ENBREL®), adalimumab (HUMIRA®) e infliximab (REMICADE®), inhibidores de quimiocinas e inhibidores de moléculas de adhesión. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos monoclonales así como también formas recombinantes de moléculas. Los DMARD ilustrativos incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, Gold (oral (auranofina) e intramuscular) y minociclina.
Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos terapéuticos adecuados para la combinación con los linfocitos T modificados con CAR contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, bavituximab, bevacizumab (avastin), bivatuzumab, blinatumomab, conatumumab, daratumumab, duligotumab, dacetuzumab, dalotuzumab, elotuzumab (HuLuc63), gemtuzumab, ibritumomab, indatuximab, inotuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, milatuzumab, moxetumomab, ocaratuzumab, ofatumumab, rituximab, siltuximab, teprotumumab y ublituximab.
En determinados aspectos, las composiciones descritas en la presente descripción se administran junto con una citocina. Por "citocina", como se usa en la presente descripción, se entiende un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen hormonas de crecimiento, tales como hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana N-metionil y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glucoproteína, tales como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora de Müller; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformantes (TGF), tales como TGF alfa y TGF beta; factor de crecimiento tipo insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones, tales como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), tales como macrófagos-CSF (M-CSF); granulocitos-macrófagos-CSF (GM-CSF); y granulocitos-CSF (G-CSF); interleucinas (IL), tales como IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral, tales como TNF alfa o TNF beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando kit (KL). Como se usa en la presente descripción, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia natural. En aspectos particulares, una composición comprende linfocitos T con CAR contemplados en la presente descripción que se cultivan en presencia de un inhibidor de PI3K como se describe en la presente descripción y expresan uno o más de los siguientes marcadores: CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127 y HLA-DR pueden aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. En un aspecto, una composición comprende una subpoblación específica de linfocitos T, que expresa uno o más de los marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en i) CD62L, CCR7, CD28, CD27, c D122, CD127, CD197; ii) CD62L, CD127, CD197, CD38; y iii) c D62L, CD27, CD127 y CD8, se aísla además mediante técnicas de selección positiva o negativa. En varios aspectos, las composiciones no expresan o no expresan sustancialmente uno o más de los siguientes marcadores: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3.
En un aspecto, la expresión de uno o más de los marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en CD62L, CD127, CD197 y c D38 aumenta al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces o más en comparación con una población de linfocitos T activados y expandidos sin un inhibidor de PI3K.
En un aspecto, la expresión de uno o más de los marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en CD62L, CD127, CD27 y CD8 aumenta al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces o más en comparación con una población de linfocitos T activados y expandidos sin un inhibidor de PI3K. En un aspecto, la expresión de uno o más de los marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 y LAG3 disminuye al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces o más en comparación con una población de linfocitos T activado y expandido con un inhibidor de PI3K.
J. Células diana y antígenos
Las células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente redirigidas a una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa, y que comprenden los CAR que tienen un dominio de unión que se une a una glucoproteína que expresa STn, por ejemplo, TAG-72, en las células diana.
Como se usa en la presente descripción, el término "cáncer" se refiere generalmente a una clase de enfermedades o afecciones en las que las células anormales se dividen sin control y pueden invadir los tejidos cercanos.
Como se usa en la presente descripción, el término "maligno" se refiere a un cáncer en el que un grupo de células tumorales muestran uno o más de crecimiento descontrolado (es decir, división más allá de los límites normales), invasión (es decir, intrusión y destrucción de tejidos adyacentes) y metástasis (es decir, propagación a otros lugares del cuerpo a través de la linfa o la sangre). Como se usa en la presente descripción, el término "metástasis" se refiere a la propagación del cáncer de una parte del cuerpo a otra. Un tumor formado por células que se han diseminado se denomina "tumor metastásico" o "metástasis". El tumor metastásico contiene células que son como las del tumor original (primario).
Como se usa en la presente descripción, el término "benigno" o "no maligno" se refiere a tumores que pueden aumentar de tamaño pero que no se diseminan a otras partes del cuerpo. Los tumores benignos son autolimitados y, por lo general, no invaden ni hacen metástasis.
Una "célula cancerosa" se refiere a una célula individual de un crecimiento o tejido canceroso. Las células cancerosas incluyen tanto cánceres sólidos como cánceres líquidos. Un "tumor" o "célula tumoral" se refiere generalmente a una hinchazón o lesión formada por un crecimiento anormal de células, que puede ser benigno, premaligno o maligno. La mayoría de los cánceres forman tumores, pero los cánceres líquidos, por ejemplo, la leucemia, no forman necesariamente tumores. Para aquellos cánceres que forman tumores, los términos cáncer (célula) y tumor (célula) se usan indistintamente. La cantidad de un tumor en un individuo es la "carga tumoral" que puede medirse como el número, volumen o peso del tumor.
En un aspecto, la célula diana expresa un antígeno, por ejemplo, un antígeno diana que no se encuentra sustancialmente en la superficie de otras células normales (deseadas).
En un aspecto, la célula diana es una célula ósea, osteocito, osteoblasto, célula adiposa, condrocito, condroblasto, célula muscular, célula del músculo esquelético, mioblasto, miocito, célula del músculo liso, célula de la vejiga, célula de la médula ósea, célula del sistema nervioso central (SNC), célula del sistema nervioso periférico (SNP), célula glial, célula de astrocito, neurona, célula pigmentaria, célula epitelial, célula de la piel, célula endotelial, célula endotelial vascular, célula mamaria, célula del colon, célula del esófago, célula gastrointestinal, célula del estómago, célula del colon, célula de la cabeza, célula del cuello, célula de las encías, célula de la lengua, célula renal, célula hepática, célula pulmonar, célula nasofaríngea, célula ovárica, célula folicular, célula de cuello uterino, célula vaginal, célula uterina, célula pancreática, célula parenquimatosa pancreática, célula del conducto pancreático, célula de los islotes pancreáticos, célula prostática, célula del pene, célula gonadal, célula testicular, célula hematopoyética, célula linfoide o célula mieloide.
En un aspecto, la célula diana expresa una glucoproteína que expresa STn. En un aspecto, la célula diana es una célula hematopoyética, una célula esofágica, una célula pulmonar, una célula ovárica, una célula del cuello uterino, una célula pancreática, una célula de la vesícula biliar o del conducto biliar, una célula del estómago, una célula del colon, una célula mamaria, una célula caliciforme, un enterocito, una célula madre, una célula endotelial, una célula epitelial o cualquier célula que exprese un glucoepítopo, por ejemplo, ST6GALNAC1.
En determinados aspectos, la célula diana es parte de un revestimiento del intestino (por ejemplo, esófago, estómago, colon), un tejido mamario, un tejido pulmonar, un tejido de colon, un tejido pancreático, una vesícula biliar o tejido del conducto biliar, un tejido de ovario, un tejido de cuello uterino, un tejido de vejiga, un tejido de riñón o un tejido epitelial.
En un aspecto particular, la célula diana es una célula cancerosa o una célula madre cancerosa que expresa una glucoproteína que expresa STn.
En un aspecto, la célula diana es una célula cancerosa sólida que expresa una glucoproteína que expresa STn. Los ejemplos ilustrativos de las células a las que pueden dirigirse las composiciones y los métodos contemplados en aspectos particulares incluyen, pero no se limitan a, los de los siguientes cánceres sólidos: cáncer suprarrenal, carcinoma adrenocortical, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor teratoideo/rabdoideo atípico, carcinoma de células basales, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de cerebro/SNC, cáncer de mama, tumores bronquiales, tumores cardíacos, cáncer de cuello uterino, colangiocarcinoma, condrosarcoma, cordoma, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, carcinoma ductal in situ (DCIS) cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de ojo, cáncer de trompa de Falopio, histiosarcoma fibroso, fibrosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumores carcinoides gastrointestinales, tumor de estroma gastrointestinal (GIST), tumores de células germinales, glioma, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, hemangioblastoma, cáncer hepatocelular, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, sarcoma de kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leiomiosarcoma, cáncer de labio, liposarcoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, tumor carcinoide de pulmón, mesotelioma maligno, carcinoma medular, meduloblastoma, menangioma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, carcinoma de línea media, cáncer de boca, mixosarcoma, síndrome mielodisplásico, neoplasias mieloproliferativas, cáncer de cavidad nasal y senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, oligodendroglioma, cáncer oral, cáncer de cavidad oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, tumores de células de los islotes pancreáticos, carcinoma papilar, paraganglioma, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, pinealoma, tumor hipofisario, blastoma pleuropulmonar, cáncer peritoneal primario, cáncer de próstata, cáncer de recto, retinoblastoma, carcinoma de células renales, pelvis renal y cáncer de uréter, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivares, carcinoma de glándulas sebáceas, cáncer de piel, sarcoma de tejido blando, carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, carcinoma de glándulas sudoríparas, sinovioma, cáncer testicular, cáncer de garganta, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer uretral, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vascular, cáncer de vulva y tumor de Wilms.
En otro aspecto, la célula es una célula cancerosa sólida que expresa glucoproteína que expresa STn. Las células cancerosas sólidas que expresan STn ilustrativas que pueden prevenirse, tratarse o mejorarse con las composiciones incluyen, pero no se limitan a: cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de páncreas, colangiocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de vejiga cáncer, cáncer de riñón y cáncer de mama.
En un aspecto particular, la célula diana es una célula de cáncer líquido o de cáncer hematológico que expresa una glucoproteína que expresa STn.
Los ejemplos ilustrativos de cánceres líquidos o cánceres hematológicos que pueden prevenirse, tratarse o mejorarse con las composiciones contempladas en aspectos particulares incluyen, pero no se limitan a: leucemias, linfomas y mieloma múltiple.
Los ejemplos ilustrativos de las células a las que pueden dirigirse los CAR anti-STN contemplados en aspectos particulares incluyen, pero no se limitan a, los de las siguientes leucemias: leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T, leucemia mieloide aguda (AML), mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, eritroleucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocítica crónica (CLL) y leucemia mieloide crónica (CML), leucemia mielomonocítica crónica (CMML) y policitemia vera.
Los ejemplos ilustrativos de las células a las que pueden dirigirse las composiciones y los métodos contemplados en aspectos particulares incluyen, pero no se limitan a, los de los siguientes linfomas: linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares y linfoma no Hodgkin, que incluyen, pero no se limitan a, linfomas no Hodgkin de linfocitos B: linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeño (SLL), linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico precursor de linfocitos B y linfoma de células del manto; y linfomas no Hodgkin de linfocitos T: micosis fungoide, linfoma anaplásico de células grandes, síndrome de Sezary y linfoma linfoblástico precursor de linfocitos T.
Los ejemplos ilustrativos de las células a las que pueden dirigirse las composiciones y los métodos contemplados en aspectos particulares incluyen, pero no se limitan a los de los siguientes mielomas múltiples: mieloma múltiple manifiesto, mieloma múltiple latente, leucemia de células plasmáticas, mieloma no secretor, mieloma de IgD, mieloma osteoesclerótico, plasmocitoma solitario de hueso y plasmocitoma extramedular.
En un aspecto particular, la célula diana es una célula cancerosa o una célula madre cancerosa que expresa glucoproteína que expresa STn.
En otro aspecto particular, la célula diana es una célula cancerosa, tal como por ejemplo una célula de un paciente con cáncer.
K. Métodos terapéuticos
Las células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente contempladas en la presente descripción proporcionan métodos mejorados de inmunoterapia adoptiva para su uso en la prevención, el tratamiento y la mejora de los cánceres que expresan una glucoproteína que expresa STn, por ejemplo, TAG-72, o para prevenir, tratar o mejorar al menos un síntoma asociado con un cáncer que expresa STn.
En varios aspectos, las células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente contempladas en la presente descripción proporcionan métodos mejorados de inmunoterapia adoptiva para su uso para aumentar la citotoxicidad en las células cancerosas que expresan una glucoproteína que expresa STn en un sujeto o para su uso para disminuir el número de células cancerosas que expresan STn en un sujeto.
En aspectos particulares, la especificidad de una célula efectora inmunitaria primaria se redirige a las células que expresan glucoproteínas que expresan STn, por ejemplo, células cancerosas, al modificar genéticamente la célula efectora inmunitaria primaria con un CAR contemplado en la presente descripción. En varios aspectos, se usa un vector viral para modificar genéticamente una célula efectora inmunitaria con un polinucleótido particular que codifica un CAR que comprende un dominio de unión al antígeno anti-STn que se une a STn expresado en una glucoproteína; un dominio bisagra; un dominio transmembrana (TM), un enlazador oligopeptídico o polipeptídico corto, que une el dominio TM con el dominio de señalización intracelular de CAR; y uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelular; y un dominio de señalización primaria.
En un aspecto, se proporciona un tipo de terapia celular en la que los linfocitos T se modifican genéticamente para expresar un CAR que se dirige a las células cancerosas que expresan una glucoproteína que expresa STn, y se infunde el linfocito T con CAR a un receptor que lo necesita. La célula infundida es capaz de destruir las células que provocan enfermedades en el receptor. A diferencia de las terapias con anticuerpos, los linfocitos T con CAR pueden replicarse in vivo, lo que da como resultado una persistencia a largo plazo que puede conducir a una terapia sostenida contra el cáncer.
En un aspecto, los linfocitos T con CAR pueden experimentar una fuerte expansión de linfocitos T in vivo y pueden persistir durante un período de tiempo prolongado. En otro aspecto, los linfocitos T con CAR evolucionan hacia linfocitos T de memoria específicos que pueden reactivarse para inhibir cualquier formación o crecimiento del tumor adicional.
En aspectos particulares, las composiciones que comprenden las células efectoras inmunitarias que comprenden los CAR contemplados en la presente descripción se usan en el tratamiento de afecciones asociadas con células cancerosas o células madre cancerosas que expresan una glucoproteína que expresa STn.
Los ejemplos ilustrativos de afecciones que pueden tratarse, prevenirse o mejorarse mediante el uso de las células efectoras inmunitarias que comprenden los CAR contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a: cáncer hematológico, cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de páncreas, colangiocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y cáncer de mama.
En aspectos particulares, las composiciones que comprenden los linfocitos T modificados con CAR contempladas en la presente descripción se usan en el tratamiento de cánceres sólidos. En determinados aspectos, el cáncer sólido se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de páncreas, colangiocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de riñón y cáncer de mama.
En un aspecto particular, las composiciones que comprenden los linfocitos T modificadas con CAR contempladas en la presente descripción se usan en el tratamiento de cánceres líquidos o hematológicos.
En determinados aspectos, el cáncer líquido o hematológico se selecciona del grupo que consiste en: leucemias, linfomas y mielomas múltiples.
En determinados aspectos, el cáncer líquido o hematológico se selecciona del grupo que consiste en: leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, eritroleucemia, leucemia de células pilosas (HCL), leucemia linfocítica crónica (LLC) y leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia mielomonocítica crónica (LMMC) y policitemia vera, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares, linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeño (SLL), linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico precursor de linfocitos B, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, micosis fungoide, linfoma anaplásico de células grandes, síndrome de Sezary, linfoma linfoblástico precursor de linfocitos T, mieloma múltiple, mieloma múltiple manifiesto, mieloma múltiple latente, leucemia de células plasmáticas, mieloma no secretor, mieloma de IgD, mieloma osteoesclerótico, plasmocitoma solitario de hueso y plasmocitoma extramedular.
En determinados aspectos, el cáncer líquido o hematológico se selecciona del grupo que consiste en: leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas (h c L), mieloma múltiple (MM), leucemia mieloide aguda (LMA) o leucemia mieloide crónica (LMC).
En determinados aspectos, el cáncer líquido o hematológico es CLL.
En aspectos particulares, se proporcionan los métodos que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de células efectoras inmunitarias que expresan CAR contempladas en la presente descripción o una composición que comprende las mismas, a un paciente que lo necesite, solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. En determinados aspectos, las células se usan en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar una afección asociada con células cancerosas que expresan una glucoproteína que expresa STn. Así, en aspectos particulares, los métodos para el tratamiento o la prevención o la mejora de al menos un síntoma de cáncer comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de las células modificadas con CAR contempladas en la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, los términos "individuo" y "sujeto" a menudo se usan indistintamente y se refieren a cualquier animal que muestre un síntoma de una enfermedad, trastorno o afección que pueda tratarse con vectores de terapia génica, agentes terapéuticos basados en células y métodos contemplados en otra parte en la presente descripción. En aspectos preferidos, un sujeto incluye cualquier animal que muestre síntomas de una enfermedad, trastorno o afección relacionada con el cáncer que pueda tratarse con vectores de terapia génica, agentes terapéuticos basados en células y métodos contemplados en otra parte en la presente descripción. Los sujetos adecuados (por ejemplo, pacientes) incluyen animales de laboratorio (tales como ratón, rata, conejo o conejillo de indias), animales de granja y animales domésticos o mascotas (tales como un gato o un perro). Se incluyen primates no humanos y, preferentemente, pacientes humanos. Los sujetos típicos incluyen pacientes humanos que tienen, se han diagnosticado o están en riesgo o tienen un cáncer que expresa STn en una glucoproteína.
Como se usa en la presente descripción, el término "paciente" se refiere a un sujeto que se ha diagnosticado con una enfermedad, trastorno o afección particular que puede tratarse con vectores de terapia génica, agentes terapéuticos basados en células y métodos descritos en otra parte en la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, "tratamiento" o "tratar" incluye cualquier efecto beneficioso o deseable sobre los síntomas o patología de una enfermedad o afección patológica, y puede incluir incluso reducciones mínimas en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o la afección que se está tratando. El tratamiento puede implicar opcionalmente la reducción de la enfermedad o la afección, o el retraso de la progresión de la enfermedad o la afección, por ejemplo, mediante el retraso del crecimiento del tumor. "Tratamiento" no indica necesariamente la erradicación o cura completa de la enfermedad o la afección, o los síntomas asociados a esta. Como se usa en la presente descripción, "prevenir" y palabras similares tales como "prevenido", "prevención", etc., indican un enfoque para prevenir, inhibir o reducir la probabilidad de aparición o recurrencia de una enfermedad o una afección. También se refiere a retrasar la aparición o la recurrencia de una enfermedad o una afección o retrasar la aparición o la recurrencia de los síntomas de una enfermedad o una afección. Como se usa en la presente descripción, "prevención" y las palabras similares también incluyen reducir la intensidad, el efecto, los síntomas y/o la carga de una enfermedad o una afección antes del inicio o la recurrencia de la enfermedad o la afección.
Como se usa en la presente descripción, la frase "mejorar al menos un síntoma de" se refiere a disminuir uno o más síntomas de la enfermedad o la afección por la que se está tratando al sujeto. En aspectos particulares, la enfermedad o la afección que se está tratando es un cáncer, en donde uno o más síntomas mejorados incluyen, pero no se limitan a, debilidad, fatiga, dificultad para respirar, hematomas y sangrado fáciles, infecciones frecuentes, ganglios linfáticos agrandados, abdomen distendido o doloroso (debido a órganos abdominales agrandados), dolor de huesos o articulaciones, fracturas, pérdida de peso no planificada, falta de apetito, sudores nocturnos, fiebre leve persistente y disminución de la micción (debido a una función renal alterada).
Por "mejorar" o "promover", o "aumentar" o "expandir" se refiere generalmente a la capacidad de una composición contemplada en la presente descripción, por ejemplo, un linfocito T modificado genéticamente o un vector que codifica un CAR, para producir, propiciar o provocar una mayor respuesta fisiológica (es decir, efectos posteriores) en comparación con la respuesta provocada por el vehículo o una molécula/composición de control. Una respuesta fisiológica medible puede incluir un aumento en la expansión, la activación, la persistencia y/o un aumento en la capacidad de destrucción de células cancerosas de los linfocitos T, entre otras cosas evidentes a partir de la comprensión en la técnica y la descripción en la presente descripción. Una cantidad "aumentada" o "mejorada" suele ser una cantidad "estadísticamente significativa" y puede incluir un aumento de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (que incluyen todos los números enteros y puntos decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7) 1,8, etc.) la respuesta que produce el vehículo o una composición de control.
Por "disminuir" o "bajar" o "disminuir" o "reducir" o "atenuar" se refiere generalmente a la capacidad de la composición contemplada en la presente descripción para producir, propiciar o provocar una respuesta fisiológica menor (es decir, efectos posteriores) en comparación a la respuesta provocada por el vehículo o por una molécula/composición de control. Una cantidad "disminuida" o "reducida" suele ser una cantidad "estadísticamente significativa" y puede incluir una disminución de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (que incluyen todos los números enteros y puntos decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7). 1,8, etc.) la respuesta (respuesta de referencia) producida por el vehículo, una composición de control o la respuesta en un linaje celular particular.
Por "mantener", o "preservar", o "mantener", o "sin cambio", o "sin cambio sustancial" o "sin disminución sustancial" se refiere generalmente a la capacidad de una composición contemplada en la presente descripción para producir, propiciar o provocar una respuesta fisiológica sustancialmente similar o comparable (es decir, efectos posteriores) en una célula, en comparación con la respuesta provocada por el vehículo, una molécula/composición de control o la respuesta en un linaje celular particular. Una respuesta comparable es aquella que no es significativamente diferente 0 medible diferente de la respuesta de referencia.
En un aspecto, un método para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesita comprende administrar una cantidad eficaz, por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende células efectoras inmunitarias modificadas genéticamente contempladas en la presente descripción. La magnitud y la frecuencia de administración estarán determinadas por factores tales como la condición del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque las dosis apropiadas pueden determinarse mediante ensayos clínicos.
En un aspecto, la cantidad de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T, en la composición administrada a un sujeto es de al menos 0,1 * 105 células, al menos 0,5 * 105 células, al menos 1 * 105 células, al menos 5 * 105 células, al menos 1 * 106 células, al menos 0,5 * 107 células, al menos 1 * 107 células, al menos 0,5 * 108 células, al menos 1 * 108 células, al menos 0,5 * 109 células, al menos 1 * 109 células, al menos 2 * 109 células, al menos 3 * 109 células, al menos 4 * 109 células, al menos 5 * 109 células o al menos 1 * 1010 células. En aspectos particulares, se administran a un sujeto de aproximadamente 1 * 107 linfocitos T a aproximadamente 1 * 109 linfocitos T, de aproximadamente 2 * 107 linfocitos T a aproximadamente 0,9 * 109 linfocitos T, de aproximadamente 3 * 107 linfocitos T a aproximadamente 0,8 * 109 linfocitos T, de aproximadamente 4 * 107 linfocitos T a aproximadamente 0,7 * 109 linfocitos T, de aproximadamente 5 * 107 linfocitos T a aproximadamente 0,6 * 109 linfocitos T, o de aproximadamente 5 * 107 linfocitos T a aproximadamente 0,5 * 109 linfocitos T.
En un aspecto, la cantidad de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T, en la composición administrada a un sujeto es de al menos 0,1 * 104 células/kg de peso corporal, al menos 0,5 * 104 células/kg de peso corporal, al menos 1 * 104 células/kg de peso corporal, al menos 5 * 104 células/kg de peso corporal, al menos 1 * 105 células/kg de peso corporal, al menos 0,5 * 106 células/kg de peso corporal, al menos 1 * 106 células/kg de peso corporal, al menos 0,5 * 107 células/kg de peso corporal, al menos 1 * 107 células/kg de peso corporal, al menos 0,5 * 108 células/kg de peso corporal, al menos 1 * 108 células/kg de peso corporal, al menos 2 * 108 células/kg de peso corporal, al menos 3 * 108 células/kg de peso corporal, al menos 4 * 108 células/kg de peso corporal, al menos 5 * 108 células/kg de peso corporal o al menos 1 * 109 células/kg de peso corporal. En aspectos particulares, se administran a un sujeto de aproximadamente 1 * 106 linfocitos T/kg de peso corporal a aproximadamente 1 * 108 linfocitos T/kg de peso corporal, de aproximadamente 2 * 106 linfocitos T/kg de peso corporal a aproximadamente 0,9 * 108 linfocitos T/kg de peso corporal, de aproximadamente 3 * 106 linfocitos T/kg de peso corporal a aproximadamente 0,8 * 108 linfocitos T/kg de peso corporal, de aproximadamente 4 * 106 linfocitos T/kg de peso corporal a aproximadamente 0,7 * 108 linfocitos T/kg de peso corporal, de aproximadamente 5 * 106 linfocitos T/kg de peso corporal a aproximadamente 0,6 * 108 linfocitos T/kg de peso corporal, o de aproximadamente 5 * 106 linfocitos T/kg de peso corporal a aproximadamente 0,5 * 108 linfocitos T/kg de peso corporal.
Un experto en la técnica reconocería que pueden ser necesarias múltiples administraciones de las composiciones contempladas en la presente descripción para efectuar la terapia deseada. Por ejemplo, una composición puede administrarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces en un lapso de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 1 año, 2 años, 5 años, 10 años o más.
En determinados aspectos, puede ser conveniente administrar las células efectoras inmunitarias activadas a un sujeto y luego volver a extraer sangre (o realizar una aféresis), activar las células efectoras inmunitarias a partir de ellas y volver a infundir al paciente con estas células efectoras inmunitarias activadas y expandidas. Este proceso puede realizarse varias veces cada pocas semanas. En determinados aspectos, las células efectoras inmunitarias pueden activarse a partir de extracciones de sangre de 10 cc a 400 cc. En determinados aspectos, las células efectoras inmunitarias se activan a partir de extracciones de sangre de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 100 cc, 150 cc, 200 cc, 250 cc, 300 cc, 350 cc o 400 cc o más. Para no atarse a la teoría, el uso de este protocolo de múltiples extracciones de sangre/múltiples reinfusiones puede servir para seleccionar determinadas poblaciones de células efectoras inmunitarias.
La administración de las composiciones contempladas en la presente descripción puede realizarse de cualquier manera conveniente, que incluye la inhalación de aerosol, la inyección, la ingestión, la transfusión, la implantación o el trasplante. En un aspecto preferido, las composiciones se administran por vía parenteral. Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", tal como se usan en la presente descripción, se refieren a los modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravascular, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbitaria, intratumoral, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal. En un aspecto, las composiciones contempladas en la presente descripción se administran a un sujeto mediante inyección directa en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.
En un aspecto, a un sujeto que lo necesita se le administra una cantidad eficaz de una composición para aumentar una respuesta inmunitaria celular a un cáncer en el sujeto. La respuesta inmunitaria puede incluir respuestas inmunitarias celulares mediadas por los linfocitos T citotóxicos capaces de destruir las células infectadas, los linfocitos T reguladores y las respuestas de los linfocitos T colaboradores. También pueden inducirse respuestas inmunitarias humorales, mediadas principalmente por linfocitos T colaboradores capaces de activar linfocitos B, lo que conduce a la producción de anticuerpos. Puede usarse una variedad de técnicas para analizar el tipo de respuestas inmunitarias inducidas por las composiciones, que están bien descritas en la técnica; por ejemplo, Current Protocols in Immunology, editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y.
En el caso de la destrucción mediada por linfocitos T, la unión del ligando CAR inicia la señalización de CAR al linfocito T, lo que da como resultado la activación de una variedad de vías de señalización de linfocitos T que inducen al linfocito T a producir o liberar proteínas capaces de inducir la apoptosis de la célula diana por varios mecanismos. Estos mecanismos mediados por linfocitos T incluyen (pero no se limitan a) la transferencia de gránulos citotóxicos intracelulares desde el linfocito T a la célula diana, la secreción de linfocitos T de citocinas proinflamatorias que pueden inducir la destrucción de células diana directamente (o indirectamente a través del reclutamiento de otras células efectoras citolíticas) y la regulación positiva de los ligandos del receptor de muerte (por ejemplo, FasL) en la superficie de los linfocitos T que inducen la apoptosis de la célula diana después de unirse a su receptor de muerte afín (por ejemplo, Fas) en la célula diana.
En un aspecto, se proporciona un método para tratar a un sujeto diagnosticado con un cáncer que expresa STn en una glucoproteína que comprende eliminar las células efectoras inmunitarias de un sujeto diagnosticado con un cáncer que expresa STn, modificar genéticamente dichas células efectoras inmunitarias con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un CAR como se contempla en la presente descripción, lo que produce de este modo una población de células efectoras inmunitarias modificadas y administrar la población de células efectoras inmunitarias modificadas al mismo sujeto. En un aspecto preferido, las células efectoras inmunitarias comprenden linfocitos T.
En determinados aspectos, se proporcionan métodos para estimular una respuesta inmunomoduladora mediada por células efectoras inmunitarias a una población de células diana en un sujeto que comprende las etapas de administrar al sujeto una población de células efectoras inmunitarias que expresa una construcción de ácido nucleico que codifica una molécula CAR.
Los métodos para administrar las composiciones de células contempladas en aspectos particulares incluyen cualquier método que sea eficaz para dar como resultado la reintroducción de células efectoras inmunitarias genéticamente modificadas ex vivo que expresan directamente un CAR en el sujeto o en la reintroducción de progenitores modificados genéticamente de células efectoras inmunitarias que al introducirse en un sujeto se diferencian en células efectoras inmunitarias maduras que expresan el CAR. Un método comprende transducir los linfocitos T de sangre periférica ex vivo con una construcción de ácido nucleico de acuerdo con lo contemplado en la presente descripción y devolver las células transducidas al sujeto.
Aunque los aspectos anteriores se han descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad de comprensión, será evidente para un experto en la técnica a la luz de las enseñanzas contempladas en la presente descripción que determinados cambios y modificaciones pueden ser necesarios hacer al mismo sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para producir resultados esencialmente similares dentro de las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1
Construcción de CAR anti-STn
Los CAR que contienen anticuerpos scFv humanizados anti-STn se diseñaron para contener un promotor MND operativamente unido a scFv anti-STn, un dominio transmembrana y bisagra de CD8a y dominios coestimuladores de CD137 seguidos por el dominio de señalización intracelular de la cadena CD3Z. Figura 1. Los CAR anti-STn comprenden una secuencia de péptido señal (SP) de CD8a para la expresión en la superficie en las células efectoras inmunitarias. La Tabla 3 muestra la identidad, la referencia de GenBank, el nombre de la fuente y la cita para los diversos segmentos de nucleótidos de un vector lentiviral CAR anti-STn ilustrativo.
Tabla 3
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Ejemplo 2
Citotoxicidad de los linfocitos T con CAR anti-STn en un modelo in vitro de cáncer colorrectal humano
Los linfocitos T con CAR que comprenden un CAR anti-STn que tiene una región variable de la cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 15 y una región variable de la cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 16 mostraron una destrucción selectiva de células LS174T en un modelo in vitro de carcinoma colorrectal. Las células LS174T son una línea celular de cáncer colorrectal humano que expresa altos niveles de glucoproteína TAG-72 que expresa STn.
La expresión de glucoproteína TAG-72 que expresa STn en las células LS174T se confirmó mediante inmunohistoquímica. Se suspendieron 5 * 105 células LS174T en 100 pl de PBS que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 1 % y 5 pg de anticuerpo específico a STn (3E8). La reacción se incubó durante 30 minutos a 4 °C, luego las células se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA al 1 %. Luego, se añadió 1 pl de anti-IgG humana de ratón-PE (Southern Biotech) y la mezcla se incubó durante 30 minutos a 4 °C. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA al 1 %. La expresión de glucoproteína TAG-72 que expresa STn se confirmó con citometría de flujo. El 98 % de las células LS174T expresaron glucoproteína TAG-72 que expresa STn. El 95 % de las células de la línea celular de cáncer de estómago humano también mostró expresión de STn. Por el contrario, solo aproximadamente el 2 % de las células de endoteliocito de vena umbilical humana negativas para TAG-72 (HUVEC) expresaron STn.
La actividad citotóxica de los linfocitos T con CAR anti-STn en las células LS174T se analizó mediante el uso de CellTox™ Green. Se suspendieron 1 * 104 células LS174T en 50 pl de medio de cultivo y se combinaron con 2,0 pl de CellTox™ Green. La mezcla se dividió en alícuotas en una placa negra de 96 pocillos y las alícuotas se combinaron con 5 * 104, 1 * 105, 2 * 105 o 3 * 105 linfocitos T con CAR anti-STn en 50 pl de medio de cultivo que contenía suero e IL-2 (relación E:T = 5, 10, 20, 30). Después de 24 horas de cultivo a 37 °C, la citotoxicidad se calculó como sigue.
Fluorescencia con CellTox™ Green (RFU) = {Reacción de linfocitos T y células E}
- (Reacción de células E)} - (reacción de linfocitos T, fondo)
Los resultados mostraron que los linfocitos T con CAR anti-STn eliminan eficazmente las células cancerosas LS174T que expresan STn-TAG-72 en comparación con las HUVEC sin STn o en comparación con los linfocitos T de control que no expresan un CAR anti-STn.
Ejemplo 3
Expresión de CAR anti-STn y número de copias del vector en los linfocitos T transducidos
Los cultivos de linfocitos T con CAR se establecieron mediante el uso de un sistema escalable directamente a grandes procesos de fabricación clínica. Brevemente, se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en matraces estáticos en medios que contenían IL-2 (Cell Genix), anticuerpos específicos para CD3 y CD28 (Miltenyi Biotec) y ZSTK474 (Selleckchem). Un día después del inicio del cultivo se añadieron 2*108 unidades transductoras de lentivirus que codifican un CAR anti-STn que tiene una región variable de la cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 15 y una región variable de la cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 16. Los linfocitos T con CAR anti-STN se mantuvieron en fase logarítmica al añadir medio fresco que contenía IL-2 y ZSTK474 durante un total de diez días de cultivo. Al final del cultivo, se midió la expresión en la superficie celular de CAR anti-STN y el número de copias del vector (VCN) en los linfocitos T transducidos obtenidos de tres donantes. El VCN se evaluó mediante PCR cuantitativa al final del cultivo mediante el uso de cebadores que detectan el vector o el control genómico RNAseP. Los datos del VCN de CAR anti-STn en los linfocitos T transducidos de los tres donantes en comparación con los linfocitos T no transducidos se muestran en la Figura 3A. Los linfocitos T transducidos tenían un VCN de aproximadamente 4,5 en comparación con el VCN indetectable en las células de control no transducidas.
La expresión de CAR anti-STn en la superficie de los linfocitos T se evaluó mediante citometría de flujo al final del cultivo. Los linfocitos T con CAR anti-STn se identificaron específicamente mediante el uso de un método de detección de dos etapas de proteína L biotinilada seguida de estreptavidina-PE. Los linfocitos T de tres donantes normales mostraron una alta expresión de CAR anti-STn. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 3B.
Ejemplo 4
Citotoxicidad específica al antígeno de los linfocitos T con CAR anti-STn

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor quimérico de antígeno (CAR) que comprende:
a) un dominio extracelular que comprende un anticuerpo anti-sialil Tn (STn) o un fragmento de unión al antígeno de este que se une a uno o más epítopos de un antígeno STn expresado en una glucoproteína, en donde el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno de este comprende una secuencia de cadena ligera variable que comprende las secuencias CDRL1-CDRL3 establecidas en las SEQ ID NO: 9­ 11, y una secuencia de cadena pesada variable que comprende las secuencias CDRH1-CDRH3 establecidas en las SEQ ID NO: 12-14;
b) un dominio bisagra de CD8a;
c) un dominio transmembrana de CD8a;
d) un dominio de señalización coestimulador intracelular de CD137; y
e) un dominio de señalización primaria de CD3Z.
2. El CAR de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antígeno STn:
(a) se expresa en una glucoproteína que se selecciona del grupo que consiste en mucinas o glucoproteínas similares a mucinas;
(b) se expresa en una mucina que se selecciona del grupo que consiste en: mucina 1 y mucina 16;
(c) se expresa en una proteína similar a mucina; o
(d) se expresa en la glucoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72).
3. El CAR de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno es un scFv.
4. El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno de este comprende
una secuencia de cadena ligera variable como se establece en la SEQ ID NO: 15 y/o una secuencia de cadena pesada variable como se establece en la SEQ ID NO: 16.
5. El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el CAR comprende además un péptido señal.
6. El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el CAR comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 26.
7. El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, en donde el anticuerpo anti-STn o el fragmento de unión al antígeno de este comprende
una secuencia de cadena ligera variable como se establece en la SEQ ID NO: 23 y/o una secuencia de cadena pesada variable como se establece en la SEQ ID NO: 24
8. El CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 5 o 7, en donde el CAR comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 27.
9. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
10. Un polinucleótido que codifica un CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Un vector que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 10.
12. El vector de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el vector es un vector de expresión, un vector episomal, un vector viral, un vector retroviral o un vector lentiviral.
13. Una célula efectora inmunitaria que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12.
14. La célula efectora inmunitaria de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la célula efectora inmunitaria se selecciona del grupo que consiste en: un linfocito T, un linfocito T citolítico natural (NKT) y una célula citolítica natural (NK).
15. Una composición que comprende la célula efectora inmunitaria de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14 y un excipiente fisiológicamente aceptable.
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